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Per i test farmacologici è necessario un sistema in vitro affidabile in grado di riprodurre accuratamente l'ambiente fisiologico del cuore. La limitata disponibilità di sistemi di coltura di tessuto cardiaco umano ha portato a interpretazioni imprecise degli effetti dei farmaci sul cuore. In questo studio, abbiamo sviluppato un modello di coltura di tessuto cardiaco (CTCM) che stimola elettromeccanicamente le sezioni di cuore e le sottopone a stiramento fisiologico durante le fasi sistolica e diastolica del ciclo cardiaco. Dopo 12 giorni di coltura, questo approccio ha parzialmente migliorato la vitalità delle sezioni di cuore, ma non ne ha preservato completamente l'integrità strutturale. Pertanto, dopo uno screening di piccole molecole, abbiamo scoperto che l'aggiunta di 100 nM di triiodotironina (T3) e 1 μM di desametasone (Dex) al nostro mezzo di coltura ha mantenuto la microstruttura delle sezioni per 12 giorni. In combinazione con il trattamento T3/Dex, il sistema CTCM ha mantenuto i profili trascrizionali, la vitalità, l'attività metabolica e l'integrità strutturale allo stesso livello del tessuto cardiaco fresco per 12 giorni. Inoltre, un eccessivo stiramento del tessuto cardiaco in coltura induce una segnalazione cardiaca ipertrofica, fornendo prove della capacità del CTCM di mimare le condizioni ipertrofiche indotte dallo stiramento cardiaco. In conclusione, il CTCM può modellare la fisiologia e la fisiopatologia del cuore in coltura per lunghi periodi di tempo, consentendo uno screening farmacologico affidabile.
Prima di avviare la ricerca clinica, sono necessari sistemi in vitro affidabili in grado di riprodurre accuratamente l'ambiente fisiologico del cuore umano. Tali sistemi dovrebbero simulare alterazioni dello stiramento meccanico, della frequenza cardiaca e delle proprietà elettrofisiologiche. I modelli animali sono comunemente utilizzati come piattaforma di screening per la fisiologia cardiaca, ma presentano un'affidabilità limitata nel riflettere gli effetti dei farmaci sul cuore umano1,2. In definitiva, il modello sperimentale ideale di coltura di tessuto cardiaco (CTCM) è un modello altamente sensibile e specifico per diversi interventi terapeutici e farmacologici, in grado di riprodurre accuratamente la fisiologia e la fisiopatologia del cuore umano3. L'assenza di un sistema di questo tipo limita la scoperta di nuovi trattamenti per l'insufficienza cardiaca4,5 e ha portato alla cardiotossicità dei farmaci come una delle principali cause di interruzione della commercializzazione6.
Nel corso dell'ultimo decennio, otto farmaci non cardiovascolari sono stati ritirati dall'uso clinico perché causano un prolungamento dell'intervallo QT, con conseguenti aritmie ventricolari e morte improvvisa7. Pertanto, vi è una crescente necessità di strategie di screening preclinico affidabili per valutare l'efficacia e la tossicità cardiovascolare. Il recente utilizzo di cardiomiociti derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPS-CM) nello screening farmacologico e nei test di tossicità fornisce una soluzione parziale a questo problema. Tuttavia, la natura immatura degli hiPS-CM e la mancanza della complessità multicellulare del tessuto cardiaco rappresentano i principali limiti di questo metodo. Studi recenti hanno dimostrato che tale limitazione può essere parzialmente superata utilizzando hiPS-CM in fase precoce per formare idrogel di tessuto cardiaco subito dopo l'inizio delle contrazioni spontanee e aumentando gradualmente la stimolazione elettrica nel tempo. Tuttavia, questi microtessuti di hiPS-CM non possiedono le proprietà elettrofisiologiche e contrattili mature del miocardio adulto. Inoltre, il tessuto cardiaco umano presenta una struttura più complessa, costituita da una miscela eterogenea di diversi tipi cellulari, tra cui cellule endoteliali, neuroni e fibroblasti stromali, interconnessi da specifici set di proteine ​​della matrice extracellulare. Questa eterogeneità delle popolazioni di cellule non cardiomiocitarie11,12,13 nel cuore adulto dei mammiferi rappresenta un ostacolo importante alla modellizzazione del tessuto cardiaco utilizzando singoli tipi cellulari. Queste importanti limitazioni sottolineano l'importanza di sviluppare metodi per la coltura di tessuto miocardico intatto in condizioni fisiologiche e patologiche.
Le sezioni sottili (300 µm) di cuore umano coltivate in vitro si sono dimostrate un modello promettente di miocardio umano intatto. Questo metodo consente di accedere a un sistema multicellulare 3D completo, simile al tessuto cardiaco umano. Tuttavia, fino al 2019, l'utilizzo di sezioni cardiache coltivate era limitato dalla breve durata della coltura (24 ore). Ciò è dovuto a diversi fattori, tra cui la mancanza di stiramento fisico-meccanico, l'interfaccia aria-liquido e l'utilizzo di terreni di coltura semplici che non soddisfano le esigenze del tessuto cardiaco. Nel 2019, diversi gruppi di ricerca hanno dimostrato che l'integrazione di fattori meccanici nei sistemi di coltura del tessuto cardiaco può prolungare la durata della coltura, migliorare l'espressione cardiaca e mimare la patologia cardiaca. Due eleganti studi 17 e 18 mostrano che il carico meccanico uniassiale ha un effetto positivo sul fenotipo cardiaco durante la coltura. Tuttavia, questi studi non hanno utilizzato il carico fisico-meccanico dinamico tridimensionale del ciclo cardiaco, poiché le sezioni cardiache sono state caricate con forze di trazione isometriche 17 o con un carico auxotonico lineare 18. Questi metodi di stiramento dei tessuti hanno portato alla soppressione di molti geni cardiaci o alla sovraespressione di geni associati a risposte anomale allo stiramento. In particolare, Pitoulis et al. 19 hanno sviluppato un bagno di coltura dinamico per fette di cuore per la ricostruzione del ciclo cardiaco utilizzando il feedback del trasduttore di forza e azionamenti di tensione. Sebbene questo sistema consenta una modellazione del ciclo cardiaco in vitro più accurata, la complessità e la bassa produttività del metodo ne limitano l'applicazione. Il nostro laboratorio ha recentemente sviluppato un sistema di coltura semplificato che utilizza la stimolazione elettrica e un mezzo ottimizzato per mantenere la vitalità di sezioni di tessuto cardiaco suino e umano fino a 6 giorni20,21.
Nel presente manoscritto, descriviamo un modello di coltura di tessuto cardiaco (CTCM) che utilizza sezioni di cuore suino e incorpora segnali umorali per riprodurre la fisiologia cardiaca tridimensionale e la distensione patofisiologica durante il ciclo cardiaco. Questo CTCM può aumentare l'accuratezza della previsione preclinica dei farmaci a un livello mai raggiunto prima, fornendo un sistema cardiaco economico e ad alta produttività che mima la fisiologia/patofisiologia del cuore dei mammiferi per i test farmacologici preclinici.
I segnali meccanici emodinamici svolgono un ruolo critico nel mantenimento della funzione dei cardiomiociti in vitro 22,23,24. Nel presente manoscritto, abbiamo sviluppato un CTCM (Figura 1a) in grado di mimare l'ambiente cardiaco adulto inducendo stimolazione sia elettrica che meccanica a frequenze fisiologiche (1,2 Hz, 72 battiti al minuto). Per evitare un eccessivo stiramento del tessuto durante la diastole, è stato utilizzato un dispositivo di stampa 3D per aumentare le dimensioni del tessuto del 25% (Fig. 1b). La stimolazione elettrica indotta dal sistema C-PACE è stata temporizzata per iniziare 100 ms prima della sistole utilizzando un sistema di acquisizione dati per riprodurre completamente il ciclo cardiaco. Il sistema di coltura tissutale utilizza un attuatore pneumatico programmabile (LB Engineering, Germania) per espandere ciclicamente una membrana flessibile in silicone e causare l'espansione delle fette di cuore nella camera superiore. Il sistema è stato collegato a una linea d'aria esterna tramite un trasduttore di pressione, che ha permesso di regolare con precisione la pressione (± 1 mmHg) e il tempo (± 1 ms) (Fig. 1c).
a Fissare la sezione di tessuto all'anello di supporto da 7 mm, mostrato in blu, all'interno della camera di coltura del dispositivo. La camera di coltura è separata dalla camera d'aria da una sottile membrana flessibile in silicone. Posizionare una guarnizione tra le due camere per evitare perdite. Il coperchio del dispositivo contiene elettrodi in grafite che forniscono stimolazione elettrica. b Rappresentazione schematica del dispositivo per tessuti di grandi dimensioni, dell'anello guida e dell'anello di supporto. Le sezioni di tessuto (marrone) vengono posizionate sul dispositivo sovradimensionato con l'anello guida inserito nella scanalatura sul bordo esterno del dispositivo. Utilizzando la guida, posizionare con cura l'anello di supporto rivestito con adesivo acrilico per tessuti sopra la sezione di tessuto cardiaco. c Grafico che mostra il tempo di stimolazione elettrica in funzione della pressione della camera d'aria controllata da un attuatore pneumatico programmabile (PPD). Un dispositivo di acquisizione dati è stato utilizzato per sincronizzare la stimolazione elettrica tramite sensori di pressione. Quando la pressione nella camera di coltura raggiunge la soglia impostata, un segnale a impulsi viene inviato al C-PACE-EM per attivare la stimolazione elettrica. d Immagine di quattro CTCM posizionati su un ripiano dell'incubatrice. Quattro dispositivi sono collegati a un PPD tramite un circuito pneumatico, e dei sensori di pressione sono inseriti nella valvola emostatica per monitorare la pressione nel circuito pneumatico. Ciascun dispositivo contiene sei sezioni di tessuto.
Utilizzando un singolo attuatore pneumatico, siamo stati in grado di controllare 4 dispositivi CTCM, ognuno dei quali poteva contenere 6 sezioni di tessuto (Fig. 1d). Nel CTCM, la pressione dell'aria nella camera d'aria viene convertita in pressione sincrona nella camera del fluido e induce l'espansione fisiologica della sezione di cuore (Figura 2a e Video supplementare 1). La valutazione dello stiramento del tessuto a 80 mm Hg. Art. ha mostrato uno stiramento delle sezioni di tessuto del 25% (Fig. 2b). È stato dimostrato che questa percentuale di stiramento corrisponde a una lunghezza fisiologica del sarcomero di 2,2-2,3 µm per la normale contrattilità della sezione cardiaca17,19,25. Il movimento del tessuto è stato valutato utilizzando impostazioni personalizzate della telecamera (Figura supplementare 1). L'ampiezza e la velocità del movimento del tessuto (Fig. 2c, d) corrispondevano allo stiramento durante il ciclo cardiaco e al tempo durante la sistole e la diastole (Fig. 2b). L'allungamento e la velocità del tessuto cardiaco durante la contrazione e il rilassamento sono rimasti costanti per 12 giorni in coltura (Fig. 2f). Per valutare l'effetto della stimolazione elettrica sulla contrattilità durante la coltura, abbiamo sviluppato un metodo per determinare la deformità attiva utilizzando un algoritmo di ombreggiatura (Fig. supplementare 2a,b) e siamo stati in grado di distinguere tra deformità con e senza stimolazione elettrica. La stessa sezione del cuore (Fig. 2f). Nella regione mobile del taglio (R6-9), la tensione durante la stimolazione elettrica era superiore del 20% rispetto all'assenza di stimolazione elettrica, il che indica il contributo della stimolazione elettrica alla funzione contrattile.
Tracce rappresentative della pressione della camera d'aria, della pressione della camera del fluido e delle misurazioni del movimento del tessuto confermano che la pressione della camera modifica la pressione della camera del fluido, causando un movimento corrispondente della sezione di tessuto. b Tracce rappresentative della percentuale di allungamento (blu) delle sezioni di tessuto corrispondenti alla percentuale di allungamento (arancione). c Il movimento misurato della sezione cardiaca è coerente con la velocità di movimento misurata. (d) Traiettorie rappresentative del movimento ciclico (linea blu) e della velocità (linea tratteggiata arancione) in una sezione del cuore. e Quantificazione del tempo del ciclo (n = 19 sezioni per gruppo, da suini diversi), tempo di contrazione (n = 19 sezioni per gruppo), tempo di rilassamento (n = 19 sezioni per gruppo, da suini diversi), movimento del tessuto (n = 25 sezioni/gruppo da suini diversi), velocità sistolica di picco (n = 24(D0), 25(D12) sezioni/gruppo da suini diversi) e velocità di rilassamento di picco (n = 24(D0), 25(D12) sezioni/gruppo da suini diversi). Il test t di Student a due code non ha mostrato differenze significative in alcun parametro. f Tracce rappresentative dell'analisi della deformazione di sezioni di tessuto con (rosso) e senza (blu) stimolazione elettrica, dieci aree regionali di sezioni di tessuto dalla stessa sezione. I pannelli inferiori mostrano la quantificazione della differenza percentuale di deformazione in sezioni di tessuto con e senza stimolazione elettrica in dieci aree di sezioni diverse. (n = 8 fette/gruppo provenienti da suini diversi, è stato eseguito un test t di Student a due code; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 fette/gruppo provenienti da suini diversi, è stato eseguito un test t di Student a due code; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-criterio Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 sezioni/gruppo provenienti da suini diversi, test t di Student a due code; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组,来自不同的猪,进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001,**p < 0,01,*p < 0,05）. （n = 8 片/组,来自不同的猪,进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001,**p < 0,01,*p < 0,05）. (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 sezioni/gruppo, provenienti da suini diversi, test t di Student a due code; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Le barre di errore rappresentano la media ± deviazione standard.
Nel nostro precedente sistema di coltura statica biomimetica di fette di cuore [20, 21], abbiamo mantenuto la vitalità, la funzione e l'integrità strutturale delle fette di cuore per 6 giorni applicando la stimolazione elettrica e ottimizzando la composizione del mezzo. Tuttavia, dopo 10 giorni, questi valori sono diminuiti drasticamente. Faremo riferimento alle sezioni coltivate nel nostro precedente sistema di coltura statica biomimetica 20, 21 in condizioni di controllo (Ctrl) e useremo il nostro mezzo precedentemente ottimizzato come condizioni MC e coltura sotto stimolazione meccanica ed elettrica simultanea (CTCM). In primo luogo, abbiamo determinato che la stimolazione meccanica senza stimolazione elettrica era insufficiente a mantenere la vitalità del tessuto per 6 giorni (Figura supplementare 3a,b). È interessante notare che, con l'introduzione della stimolazione fisio-meccanica ed elettrica utilizzando STCM, la vitalità delle sezioni di cuore di 12 giorni è rimasta la stessa delle sezioni di cuore fresche in condizioni MS, ma non in condizioni Ctrl, come mostrato dall'analisi MTT (Figura 1). 3a). Ciò suggerisce che la stimolazione meccanica e la simulazione del ciclo cardiaco possono mantenere le sezioni di tessuto vitali per un tempo doppio rispetto a quanto riportato nel nostro precedente sistema di coltura statica. Tuttavia, la valutazione dell'integrità strutturale delle sezioni di tessuto mediante immunomarcatura della troponina T cardiaca e della connessina 43 ha mostrato che l'espressione della connessina 43 era significativamente più alta nei tessuti MC al giorno 12 rispetto ai controlli allo stesso giorno. Tuttavia, l'espressione uniforme della connessina 43 e la formazione del disco Z non sono state completamente mantenute (Fig. 3b). Utilizziamo un framework di intelligenza artificiale (IA) per quantificare l'integrità strutturale del tessuto26, una pipeline di apprendimento profondo basata su immagini basata sulla colorazione della troponina-T e della connessina43 per quantificare automaticamente l'integrità strutturale e la fluorescenza delle sezioni di cuore in termini di forza di localizzazione. Questo metodo utilizza una rete neurale convoluzionale (CNN) e un framework di apprendimento profondo per quantificare in modo affidabile l'integrità strutturale del tessuto cardiaco in modo automatizzato e imparziale, come descritto nel riferimento. 26. Il tessuto MC ha mostrato una migliore somiglianza strutturale al giorno 0 rispetto alle sezioni di controllo statiche. Inoltre, la colorazione tricromica di Masson ha rivelato una percentuale di fibrosi significativamente inferiore nelle condizioni MS rispetto alle condizioni di controllo al dodicesimo giorno di coltura (Fig. 3c). Sebbene il CTCM abbia aumentato la vitalità delle sezioni di tessuto cardiaco al dodicesimo giorno a un livello simile a quello del tessuto cardiaco fresco, non ha migliorato significativamente l'integrità strutturale delle sezioni cardiache.
Un grafico a barre mostra la quantificazione della vitalità MTT di fette di cuore fresche (D0) o di fette di cuore coltivate per 12 giorni in coltura statica (D12 Ctrl) o in CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) fette/gruppo da suini diversi, è stato eseguito un test ANOVA a una via; ####p < 0,0001 rispetto a D0 e **p < 0,01 rispetto a D12 Ctrl). Un grafico a barre mostra la quantificazione della vitalità MTT di fette di cuore fresche (D0) o di fette di cuore coltivate per 12 giorni in coltura statica (D12 Ctrl) o in CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) fette/gruppo da suini diversi, è stato eseguito un test ANOVA a una via; ####p < 0,0001 rispetto a D0 e **p < 0,01 rispetto a D12 Ctrl).l'istogramma mostra la quantificazione della vitalità delle sezioni di cuore fresco MTT (D0) o della coltura di sezioni di cuore per 12 giorni in coltura statica (controllo D12) o CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (controllo D12). ) ), 12 (D12 MC) sezioni/gruppo da suini diversi, viene eseguito un test ANOVA a una via;####p < 0,0001 по сравнению с D0 è **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 rispetto a D0 e **p < 0,01 rispetto a D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化), 来自不同猪的12 (D12 MC) 切foto/组,进行单向ANOVA 测试；与D0相比,####p < 0.0001, 与D12 Ctrl 相比,**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) , 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组, 进行单向ANOVA 测试；与D0 相比,####p < 0.0001,与D12 Ctrl 相比,**p。)Istogramma che mostra la quantificazione della vitalità MTT in sezioni di cuore fresco (D0) o sezioni di cuore coltivate per 12 giorni in coltura statica (controllo D12) o CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (controllo D12)) , 12 (D12 MC) sezioni/gruppo da suini diversi, test ANOVA a una via;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 rispetto a D0, **p < 0,01 rispetto a D12 Ctrl).b Troponina-T (verde), connessina 43 (rosso) e DAPI (blu) in sezioni di cuore appena isolate (D0) o sezioni di cuore coltivate in condizioni statiche (Ctrl) o in condizioni CTCM (MC) per 12 giorni) di immagini di immunofluorescenza rappresentative (scala del bianco = 100 µm). Quantificazione dell'integrità strutturale del tessuto cardiaco tramite intelligenza artificiale (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sezioni/gruppo, ciascuna proveniente da un maiale diverso; viene eseguito un test ANOVA a una via; ####p < 0,0001 rispetto a D0 e ****p < 0,0001 rispetto a D12 Ctrl). Quantificazione dell'integrità strutturale del tessuto cardiaco mediante intelligenza artificiale (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sezioni/gruppo provenienti da suini diversi, viene eseguito un test ANOVA a una via; ####p < 0,0001 rispetto a D0 e ****p < 0,0001 rispetto a D12 Ctrl). Combinazione di strutture cinematografiche intelligenti (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, роводится однофакторный test ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 è ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Quantificazione dell'integrità strutturale del tessuto cardiaco mediante intelligenza artificiale (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sezioni/gruppi provenienti da suini diversi, test ANOVA a una via eseguito; ####p < 0,0001 rispetto a D0 e ****p < 0,0001 rispetto a D12 Ctrl).n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fette/gruppo ciascuno di suini diversi, test ANOVA unidirezionale;####p < 0,0001 与D0相比,****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fette/gruppo ciascuno di suini diversi, test ANOVA unidirezionale;####p < 0,0001与D0相比,****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. Intellettuale di sicurezza per la combinazione di tasti di scelta rapida (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний test ANOVA; ####p <0,0001 rispetto a D0 per la risoluzione ****p < 0,0001 per la risoluzione con D12 Ctrl). Intelligenza artificiale per quantificare l'integrità strutturale del tessuto cardiaco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sezioni/gruppo ciascuno di suini diversi, test ANOVA a una via; ####p<0,0001 vs .D0 Per confronto ****p < 0,0001 rispetto a D12 Ctrl). c Immagini rappresentative (a sinistra) e quantificazione (a destra) di sezioni di cuore colorate con la colorazione tricromica di Masson (scala = 500 µm) (n = 10 sezioni/gruppo ciascuna da un maiale diverso, viene eseguito un test ANOVA a una via; ####p < 0,0001 rispetto a D0 e ***p < 0,001 rispetto a D12 Ctrl). c Immagini rappresentative (a sinistra) e quantificazione (a destra) di sezioni di cuore colorate con la colorazione tricromica di Masson (scala = 500 µm) (n = 10 sezioni/gruppo ciascuna da suini diversi, viene eseguito un test ANOVA a una via; #### p < 0,0001 rispetto a D0 e ***p < 0,001 rispetto a D12 Ctrl). c Rappresentazione rappresentativa (sleva) e combinazione di colori (sprava) di seta, ocrashenных трихромным красителем Массона (maschtab без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/groppo di разных свиней, выполняется односторонний test ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Immagini rappresentative (a sinistra) e quantificazione (a destra) di sezioni cardiache colorate con la colorazione tricromica di Masson (scala non rivestita = 500 µm) (n = 10 sezioni/gruppo da suini diversi, test ANOVA a una via eseguito; #### p < 0,0001 rispetto a D0 e ***p < 0,001 rispetto a D12 Ctrl). c = 500 µm）（n = 10个切片/组,每组来自不同的猪,进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比,***p < 0.001 与D12 Ctrl相比）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切foto 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0.0001与D0 相比,***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Analisi rappresentativa (sleva) e analisi comparativa (sprava) del rapporto qualità/prezzo, triturazione visiva красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/groppa, каждый от другой свиньи, protetto con помощью однофакторного Analisi dispersionale ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Immagini rappresentative (a sinistra) e quantificazione (a destra) di sezioni cardiache colorate con la colorazione tricromica di Masson (bianco = 500 µm) (n = 10 sezioni/gruppo, ciascuna proveniente da un maiale diverso, testate mediante analisi della varianza a una via; ### # p < 0,0001 rispetto a D0, ***p < 0,001 rispetto a D12 Ctrl).Le barre di errore rappresentano la media ± deviazione standard.
Abbiamo ipotizzato che, aggiungendo piccole molecole al mezzo di coltura, l'integrità dei cardiomiociti potesse essere migliorata e lo sviluppo della fibrosi ridotto durante la coltura di CTCM. Pertanto, abbiamo effettuato uno screening di piccole molecole utilizzando le nostre colture di controllo statiche20,21 a causa del numero limitato di fattori confondenti. Il desametasone (Dex), la triiodotironina (T3) e l'SB431542 (SB) sono stati scelti per questo screening. Queste piccole molecole sono state precedentemente utilizzate nelle colture di hiPSC-CM per indurre la maturazione dei cardiomiociti aumentando la lunghezza del sarcomero, i tubuli T e la velocità di conduzione. Inoltre, sia il Dex (un glucocorticoide) che l'SB sono noti per sopprimere l'infiammazione29,30. Pertanto, abbiamo verificato se l'inclusione di una o di una combinazione di queste piccole molecole potesse migliorare l'integrità strutturale delle sezioni cardiache. Per lo screening iniziale, la dose di ciascun composto è stata selezionata in base alle concentrazioni comunemente utilizzate nei modelli di coltura cellulare (1 μM Dex27, 100 nM T327 e 2,5 μM SB31). Dopo 12 giorni di coltura, la combinazione di T3 e Dex ha determinato un'integrità strutturale ottimale dei cardiomiociti e un rimodellamento fibroso minimo (Figure supplementari 4 e 5). Inoltre, l'utilizzo di concentrazioni doppie o superiori a queste di T3 e Dex ha prodotto effetti deleteri rispetto alle concentrazioni normali (Figura supplementare 6a,b).
Dopo lo screening iniziale, abbiamo effettuato un confronto diretto di 4 condizioni di coltura (Figura 4a): Ctrl: sezioni di cuore coltivate nella nostra coltura statica precedentemente descritta utilizzando il nostro terreno ottimizzato; 20.21 TD: T3 e Ctrl aggiunti Dex mercoledì; MC: sezioni di cuore coltivate in CTCM utilizzando il nostro terreno precedentemente ottimizzato; e MT: CTCM con T3 e Dex aggiunti al terreno. Dopo 12 giorni di coltura, la vitalità dei tessuti MS e MT è rimasta la stessa dei tessuti freschi valutata mediante test MTT (Fig. 4b). È interessante notare che l'aggiunta di T3 e Dex alle colture transwell (TD) non ha comportato un miglioramento significativo della vitalità rispetto alle condizioni Ctrl, indicando un ruolo importante della stimolazione meccanica nel mantenimento della vitalità delle sezioni di cuore.
Schema sperimentale che illustra le quattro condizioni di coltura utilizzate per valutare gli effetti della stimolazione meccanica e dell'integrazione di T3/Dex sul terreno di coltura per 12 giorni. b Il grafico a barre mostra la quantificazione della vitalità 12 giorni dopo la coltura in tutte e 4 le condizioni di coltura (Ctrl, TD, MC e MT) rispetto alle fette di cuore fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC) fette/gruppo da suini diversi, viene eseguito un test ANOVA a una via; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 rispetto a D0 e **p < 0,01 rispetto a D12 Ctrl). b Il grafico a barre mostra la quantificazione della vitalità 12 giorni dopo la coltura in tutte e 4 le condizioni di coltura (Ctrl, TD, MC e MT) rispetto alle fette di cuore fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC) fette/gruppo da suini diversi, viene eseguito un test ANOVA a una via; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 rispetto a D0 e **p < 0,01 rispetto a D12 ctrl). b Il registro mostra la raccolta ogni volta che si desidera coltivare per 12 giorni dopo la coltivazione di tutti 4 istruzioni cultura (controllo, TD, MC e MT) per la creazione di diversi gruppi di comando (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, esegue il test ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 è **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Il grafico a barre mostra la quantificazione della vitalità a 12 giorni dalla coltura in tutte e 4 le condizioni di coltura (controllo, TD, MC e MT) rispetto alle sezioni di cuore fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC) sezioni/gruppo da suini diversi, test ANOVA a una via; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 vs. D0 e **p < 0,01 rispetto a D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD和D12 MT),来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组,进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001,###p < 0.001 与D0 相比,**p < 0,01 与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Elenco completo di 4 opzioni culturali (controllo, TD, MC e MT) per la registrazione delle rispettive schede сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), dalla sezione 12 (D12 MC) del test/gruppi, test ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 per la regolazione con D0, **p <0,01 per la regolazione con D12). b Istogramma che mostra tutte e 4 le condizioni di coltura (controllo, TD, MC e MT) rispetto a sezioni di cuore fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), da suini diversi 12 (D12 MC) sezioni/gruppo, test ANOVA a una via; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. controllo D12). c Il grafico a barre mostra la quantificazione del flusso di glucosio 12 giorni dopo la coltura in tutte e 4 le condizioni di coltura (Ctrl, TD, MC e MT) rispetto alle fette di cuore fresche (D0) (n = 6 fette/gruppo da suini diversi, viene eseguito un test ANOVA a una via; ###p < 0,001, rispetto a D0 e ***p < 0,001 rispetto a D12 Ctrl). c Il grafico a barre mostra la quantificazione del flusso di glucosio 12 giorni dopo la coltura in tutte e 4 le condizioni di coltura (Ctrl, TD, MC e MT) rispetto alle fette di cuore fresche (D0) (n = 6 fette/gruppo da suini diversi, viene eseguito un test ANOVA a una via; ###p < 0,001, rispetto a D0 e ***p < 0,001 rispetto a D12 Ctrl). c Il registro contiene la raccolta degli zuccheri ogni 12 giorni dopo la coltivazione di tutti 4 educazione culturale (controllo, TD, MC e MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c L'istogramma mostra la quantificazione del flusso di glucosio 12 giorni dopo la coltura in tutte e 4 le condizioni di coltura (controllo, TD, MC e MT) rispetto alle sezioni di cuore fresco (D0) (n = 6 sezioni/gruppo da suini diversi, test ANOVA a una via eseguito; ###p < 0,001 rispetto a D0 e ***p < 0,001 rispetto a D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切foto(D0) 相比,培养后12天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组,来自不同猪,单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001,与D0 相比,***p < 0,001与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切foto 切foto 切foto 相比, 培养后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0相比,***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Impostazione della dieta per la cottura di 12 giorni dopo la coltivazione tutto 4 coltivazione (controllo, TD, MC e MT) per la selezione dei risultati di serie (D0) (n = 6 selezioni/gruppi, dalla selezione сviney, односторонний Были test provati ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (controllo). c Istogramma che mostra la quantificazione del flusso di glucosio a 12 giorni dalla coltura per tutte e 4 le condizioni di coltura (controllo, TD, MC e MT) rispetto alle sezioni di cuore fresco (D0) (n = 6 sezioni/gruppo, da suini diversi, unilaterale). Sono stati eseguiti test ANOVA, ###p < 0,001 rispetto a D0, ***p < 0,001 rispetto a D12 (controllo).d Grafici di analisi della deformazione di tessuti freschi (blu), MC al giorno 12 (verde) e MT al giorno 12 (rosso) in dieci punti di sezione tissutale regionali (n = 4 sezioni/gruppo, test ANOVA a una via; non c'era alcuna differenza significativa tra i gruppi). e Grafico a vulcano che mostra i geni espressi in modo differenziale nelle sezioni di cuore fresche (D0) rispetto alle sezioni di cuore coltivate in condizioni statiche (Ctrl) o in condizioni MT (MT) per 10-12 giorni. f Mappa di calore dei geni del sarcomero per le sezioni di cuore coltivate in ciascuna delle condizioni di coltura. Le barre di errore rappresentano la media ± deviazione standard.
La dipendenza metabolica dal passaggio dall'ossidazione degli acidi grassi alla glicolisi è un segno distintivo della dedifferenziazione dei cardiomiociti. I cardiomiociti immaturi utilizzano principalmente il glucosio per la produzione di ATP e presentano mitocondri ipoplastici con poche creste5,32. Le analisi dell'utilizzo del glucosio hanno mostrato che in condizioni MC e MT, l'utilizzo del glucosio era simile a quello dei tessuti del giorno 0 (Figura 4c). Tuttavia, i campioni Ctrl hanno mostrato un aumento significativo dell'utilizzo del glucosio rispetto al tessuto fresco. Ciò indica che la combinazione di CTCM e T3/Dex migliora la vitalità del tessuto e preserva il fenotipo metabolico delle sezioni di cuore coltivate per 12 giorni. Inoltre, l'analisi della deformazione ha mostrato che i livelli di deformazione sono rimasti gli stessi del tessuto cardiaco fresco per 12 giorni in condizioni MT e MS (Fig. 4d).
Per analizzare l'impatto complessivo di CTCM e T3/Dex sul panorama trascrizionale globale del tessuto cardiaco, abbiamo eseguito RNAseq su sezioni cardiache provenienti da tutte e quattro le diverse condizioni di coltura (Dati supplementari 1). È interessante notare che le sezioni MT hanno mostrato un'elevata similarità trascrizionale con il tessuto cardiaco fresco, con solo 16 geni differenzialmente espressi su 13.642. Tuttavia, come abbiamo mostrato in precedenza, le sezioni Ctrl hanno mostrato 1229 geni differenzialmente espressi dopo 10-12 giorni di coltura (Fig. 4e). Questi dati sono stati confermati da qRT-PCR di geni cardiaci e fibroblasti (Figura supplementare 7a-c). È interessante notare che le sezioni Ctrl hanno mostrato una downregulation dei geni cardiaci e del ciclo cellulare e l'attivazione di programmi genici infiammatori. Questi dati suggeriscono che la dedifferenziazione, che normalmente si verifica dopo una coltura a lungo termine, è completamente attenuata in condizioni MT (Figura supplementare 8a,b). Un attento studio dei geni del sarcomero ha dimostrato che solo in condizioni MT i geni che codificano per il sarcomero (Fig. 4f) e per il canale ionico (Fig. supplementare 9) vengono preservati, proteggendoli dalla soppressione in condizioni Ctrl, TD e MC. Questi dati dimostrano che, con una combinazione di stimolazione meccanica e umorale (T3/Dex), il trascrittoma delle fette di cuore può rimanere simile a quello delle fette di cuore fresche dopo 12 giorni di coltura.
Questi risultati trascrizionali sono supportati dal fatto che l'integrità strutturale dei cardiomiociti nelle sezioni cardiache è preservata al meglio in condizioni MT per 12 giorni, come dimostrato dalla presenza di connessina 43 intatta e localizzata (Fig. 5a). Inoltre, la fibrosi nelle sezioni cardiache in condizioni MT è risultata significativamente ridotta rispetto al gruppo di controllo (Ctrl) e simile a quella osservata nelle sezioni cardiache fresche (Fig. 5b). Questi dati dimostrano che la combinazione di stimolazione meccanica e trattamento con T3/Dex preserva efficacemente la struttura cardiaca nelle sezioni cardiache in coltura.
a Immagini rappresentative di immunofluorescenza di troponina-T (verde), connessina 43 (rosso) e DAPI (blu) in sezioni di cuore appena isolate (D0) o coltivate per 12 giorni in tutte e quattro le condizioni di coltura delle sezioni di cuore (barra di scala = 100 µm). Quantificazione dell'integrità strutturale del tessuto cardiaco mediante intelligenza artificiale (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) sezioni/gruppo da suini diversi, viene eseguito un test ANOVA a una via; ####p < 0,0001 rispetto a D0 e *p < 0,05, oppure ****p < 0,0001 rispetto a D12 Ctrl). Quantificazione dell'integrità strutturale del tessuto cardiaco mediante intelligenza artificiale (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) sezioni/gruppo da suini diversi, viene eseguito un test ANOVA a una via; #### p < 0,0001 rispetto a D0 e *p < 0,05, oppure ****p < 0,0001 rispetto a D12 Ctrl). Combinazione di opzioni per la struttura della scheda telefonica (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) prodotti/prodotti da una selezione di animali, il test ANOVA è stato dimostrato; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 è *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Quantificazione dell'integrità strutturale del tessuto cardiaco mediante intelligenza artificiale (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) sezioni/gruppo da suini diversi, test ANOVA a una via eseguito; #### p < 0,0001 rispetto a D0 e *p < 0,05 o ****p < 0,0001 rispetto a D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化,进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比,或****p < 0.0001与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组） ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比,或****p < 0.0001与D12Ctrl 相比）.Quantificazione dell'integrità strutturale del tessuto cardiaco mediante intelligenza artificiale in diversi suini (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) sezioni/gruppo) con un test ANOVA a una via;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 è *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 rispetto a D0 e *p < 0,05 o ****p < 0,0001 rispetto a D12 Ctrl). b Immagini rappresentative e quantificazione di sezioni di cuore colorate con la colorazione tricromica di Masson (barra di scala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) sezioni/gruppo da suini diversi, viene eseguito un test ANOVA a una via; ####p < 0,0001 rispetto a D0 e ***p < 0,001, oppure ****p < 0,0001 rispetto a D12 Ctrl). b Immagini rappresentative e quantificazione di sezioni di cuore colorate con la colorazione tricromica di Masson (barra di scala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) sezioni/gruppo da suini diversi, viene eseguito un test ANOVA a una via; ####p < 0,0001 rispetto a D0 e ***p < 0,001, oppure ****p < 0,0001 rispetto a D12 Ctrl). b Rappresentazione rappresentativa e concentrazione di olio di semi di girasole, ocrashenny trихромным krasitelem Massonem (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний test ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 è ***p < 0,001 o ****p < 0,0001 tramite D12 Ctrl). b Immagini rappresentative e quantificazione di sezioni cardiache colorate con la colorazione tricromica di Masson (barra di scala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) sezioni/gruppo da suini diversi, eseguita ANOVA a una via; ####p < 0,0001 vs. D0 e ***p < 0,001 o ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切foto的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MC）,来自不同猪的9 个（D12 MT）切foto/组,进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比,***p < 0.001,或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切foto 切foto 切foto 切foto 切foto 切foto 切foto 切foto 切foto切片 foto相比,***p < 0,001,或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b Rappresentazione rappresentativa e combinazione di colori d'oro, ocrashenных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) tra i diversi gruppi / gruppi, odin- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Immagini rappresentative e quantificazione di sezioni cardiache colorate con tricromica di Masson (barra di scala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) sezioni provenienti da suini diversi/gruppo, un metodo ANOVA; ####p < 0,0001 rispetto a D0, ***p < 0,001 o ****p < 0,0001 rispetto a D12 Ctrl).Le barre di errore rappresentano la media ± deviazione standard.
Infine, la capacità del CTCM di mimare l'ipertrofia cardiaca è stata valutata aumentando lo stiramento del tessuto cardiaco. Nel CTCM, la pressione di picco della camera d'aria è aumentata da 80 mmHg a 80 mmHg Art. (stiramento normale) fino a 140 mmHg Art. (Fig. 6a). Ciò corrisponde a un aumento del 32% dello stiramento (Fig. 6b), che è stato precedentemente mostrato come la percentuale di stiramento corrispondente richiesta per le sezioni cardiache per raggiungere una lunghezza del sarcomero simile a quella osservata nell'ipertrofia. Lo stiramento e la velocità del tessuto cardiaco durante la contrazione e il rilassamento sono rimasti costanti durante sei giorni di coltura (Fig. 6c). Il tessuto cardiaco proveniente da condizioni MT è stato sottoposto a condizioni di stiramento normale (MT (Normale)) o di sovrastiramento (MT (OS)) per sei giorni. Già dopo quattro giorni di coltura, il biomarcatore ipertrofico NT-ProBNP era significativamente elevato nel mezzo in condizioni MT (OS) rispetto alle condizioni MT (normale) (Fig. 7a). Inoltre, dopo sei giorni di coltura, la dimensione cellulare in MT (OS) (Fig. 7b) è aumentata significativamente rispetto alle sezioni di cuore MT (normale). Inoltre, la traslocazione nucleare di NFATC4 è risultata significativamente aumentata nei tessuti iperdistesi (Fig. 7c). Questi risultati mostrano lo sviluppo progressivo del rimodellamento patologico dopo iperdistensione e supportano il concetto che il dispositivo CTCM può essere utilizzato come piattaforma per studiare la segnalazione dell'ipertrofia cardiaca indotta dallo stiramento.
Tracce rappresentative della pressione della camera d'aria, della pressione della camera del fluido e delle misurazioni del movimento del tessuto confermano che la pressione della camera modifica la pressione della camera del fluido, causando un corrispondente movimento della sezione di tessuto. b Curve rappresentative della percentuale di allungamento e della velocità di allungamento per sezioni di tessuto normalmente allungate (arancione) e sovraallungate (blu). c Grafico a barre che mostra il tempo di ciclo (n = 19 sezioni per gruppo, da suini diversi), il tempo di contrazione (n = 18-19 sezioni per gruppo, da suini diversi), il tempo di rilassamento (n = 19 sezioni per gruppo, da suini diversi), l'ampiezza del movimento del tessuto (n = 14 sezioni/gruppo, da suini diversi), la velocità sistolica di picco (n = 14 sezioni/gruppo, da suini diversi) e la velocità di rilassamento di picco (n = 14 (D0), 15 (D6) sezioni/gruppi) da suini diversi), il test t di Student a due code non ha mostrato differenze significative in nessun parametro, indicando che questi parametri sono rimasti costanti durante 6 giorni di coltura con sovratensione. Le barre di errore rappresentano la media ± deviazione standard.
a Quantificazione tramite grafico a barre della concentrazione di NT-ProBNP nei terreni di coltura di fette di cuore coltivate in condizioni di stiramento normale (Norm) o di sovrastiramento (OS) del muscolo massetere (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm e D4 MTOS) fette/gruppo da suini diversi, è stata eseguita un'ANOVA a due vie; **p < 0,01 rispetto allo stiramento normale). a Quantificazione tramite grafico a barre della concentrazione di NT-ProBNP nei terreni di coltura di fette di cuore coltivate in condizioni di stiramento normale (Norm) o di sovrastiramento (OS) del muscolo massetere (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm e D4 MTOS) fette/gruppo da suini diversi, è stata eseguita un'ANOVA a due vie; **p < 0,01 rispetto allo stiramento normale).Istogramma quantitativo della concentrazione di NT-ProBNP nel mezzo di coltura da fette di cuore coltivate in condizioni di normale allungamento del MT (norm) o di sovra-allungamento (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm e D4).MTOS) fette/gruppo da suini diversi, viene eseguita un'analisi della varianza a due fattori;**p < 0,01 rispetto alla prestazione normale). **p < 0,01 rispetto allo stiramento normale). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切foto/组,进行双向方差分析；**与正常拉伸相比,p < 0,01)。 a Quantificazione della concentrazione di NT-ProBNP in fettine cardiache coltivate in condizioni di allungamento normale (Norma) o allungamento eccessivo (OS) MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) da diversi 猪的切片/组,可以双向方方发发动; **rispetto allo stretching normale, p < 0,01).Istogramma Quantificazione delle concentrazioni di NT-ProBNP in fette di cuore coltivate in condizioni di normale allungamento del MT (norm) o di sovra-allungamento (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) e D4 MTOS) fette/gruppo provenienti da suini diversi, analisi della varianza a due vie;**p < 0,01 rispetto alla prestazione normale). **p < 0,01 rispetto allo stiramento normale). b Immagini rappresentative di sezioni di cuore colorate con troponina-T e WGA (a sinistra) e quantificazione delle dimensioni cellulari (a destra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellule/gruppo da 10 diverse sezioni di diversi suini, è stato eseguito un test t di Student a due code; ****p < 0,0001 rispetto allo stiramento normale). b Immagini rappresentative di sezioni di cuore colorate con troponina-T e WGA (a sinistra) e quantificazione delle dimensioni cellulari (a destra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellule/gruppo da 10 diverse sezioni di diversi suini, è stato eseguito un test t di Student a due code; ****p < 0,0001 rispetto allo stiramento normale). b Rappresentazione dell'immagine del gioco, del troponino visivo-Т e АЗП (sleva) e della composizione adattamento della dimensione del gancio (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) kletok/groppup из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-criterio Стьюдента ****p < 0,0001 по растяжением). b Immagini rappresentative di sezioni cardiache colorate con troponina-T e AZP (a sinistra) e quantificazione delle dimensioni cellulari (a destra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellule/gruppo da 10 diverse sezioni di diversi suini, è stato eseguito il test t di Student a due code; ****p < 0,0001 rispetto al ceppo normale). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS）,来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组,两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比,****p < 0,0001)。 b Immagini rappresentative di sezioni di cuore colorate con calcareina-T e WGA (a sinistra) e dimensioni cellulari (a destra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 da 10 sezioni diverse (D6 MTNorm)) Cellule/组，两方法有尾学生t test;rispetto allo stiramento normale，****p < 0,0001). b Rappresentazione rappresentativa del segnale, del troponino visivo-Т e АЗП (sleva) e della collina размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) su 10 diversi tipi di gruppi/gruppi, criteri di protezione; ****p < 0,0001 rispetto alla norma растяжением). b Immagini rappresentative di sezioni cardiache colorate con troponina-T e AZP (a sinistra) e quantificazione delle dimensioni cellulari (a destra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) da 10 diverse sezioni di diversi suini) Cellule/gruppo, test t di Student a due code; ****p < 0,0001 rispetto al ceppo normale). c Immagini rappresentative di sezioni cardiache MTOS al giorno 0 e al giorno 6 immunomarcate per troponina-T e NFATC4 e quantificazione della traslocazione di NFATC4 nei nuclei dei CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) sezioni/gruppo da suini diversi, è stato eseguito un test t di Student a due code; *p < 0,05). c Immagini rappresentative di sezioni cardiache MTOS al giorno 0 e al giorno 6 immunomarcate per troponina-T e NFATC4 e quantificazione della traslocazione di NFATC4 nei nuclei dei CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) sezioni/gruppo da suini diversi, è stato eseguito un test t di Student a due code; *p < 0,05). c Immagine rappresentativa per la sequenza di rendimento da 0 a 6 giorni MTOS, immunitaria per la troponina-T e NFATC4, e количественная оценка транслокации NFATC4 nella sua classe di carte (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-criterio Стьюдента *p < 0,05). c Immagini rappresentative di sezioni cardiache a 0 e 6 giorni MTOS, immunomarcate per troponina-T e NFATC4, e quantificazione della traslocazione di NFATC4 nel nucleo delle cellule cavernose (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) sezioni/gruppo da suini diversi) eseguito test t di Student a due code; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像,以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0.05)。 c Immagini rappresentative di fettine cardiache immunomarcate con calcanina-T e NFATC4 第0天和第6天MTOS e NFATC4 da diverse quantità di nuclei cellulari NFATC4 易位至CM的 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组,时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Rappresentazione dell'immagine del valore MTOS da 0 a 6 giorni per l'immunodeficienza troponino-T e NFATC4 e количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-criteriй Стьюдента; *p < 0,05). c Immagini rappresentative di sezioni cardiache MTOS al giorno 0 e 6 per l'immunomarcatura della troponina-T e di NFATC4 e la quantificazione della traslocazione di NFATC4 nel nucleo del CM di diversi suini (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) sezioni/gruppo, test t di Student a due code; *p < 0,05).Le barre di errore rappresentano la media ± deviazione standard.
La ricerca cardiovascolare traslazionale richiede modelli cellulari che riproducano accuratamente l'ambiente cardiaco. In questo studio, è stato sviluppato e caratterizzato un dispositivo CTCM in grado di stimolare sezioni ultrasottili del cuore. Il sistema CTCM include una stimolazione elettromeccanica sincronizzata fisiologicamente e un arricchimento del fluido con T3 e Dex. Quando sezioni di cuore suino sono state esposte a questi fattori, la loro vitalità, integrità strutturale, attività metabolica ed espressione trascrizionale sono rimaste invariate rispetto al tessuto cardiaco fresco dopo 12 giorni di coltura. Inoltre, un eccessivo stiramento del tessuto cardiaco può causare ipertrofia cardiaca dovuta a iperestensione. Nel complesso, questi risultati supportano il ruolo cruciale delle condizioni di coltura fisiologiche nel mantenimento di un normale fenotipo cardiaco e forniscono una piattaforma per lo screening farmacologico.
Molti fattori contribuiscono a creare un ambiente ottimale per il funzionamento e la sopravvivenza dei cardiomiociti. I fattori più evidenti sono legati a (1) interazioni intercellulari, (2) stimolazione elettromeccanica, (3) fattori umorali e (4) substrati metabolici. Le interazioni fisiologiche cellula-cellula richiedono complesse reti tridimensionali di molteplici tipi cellulari supportate da una matrice extracellulare. Tali complesse interazioni cellulari sono difficili da ricostruire in vitro mediante la co-coltura di singoli tipi cellulari, ma possono essere facilmente ottenute utilizzando la natura organotipica delle sezioni cardiache.
Lo stiramento meccanico e la stimolazione elettrica dei cardiomiociti sono fondamentali per il mantenimento del fenotipo cardiaco33,34,35. Sebbene la stimolazione meccanica sia stata ampiamente utilizzata per il condizionamento e la maturazione dei cardiomiociti derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte (hiPSC-CM), diversi studi di rilievo hanno recentemente tentato la stimolazione meccanica di sezioni di cuore in coltura mediante carico uniassiale. Questi studi dimostrano che il carico meccanico uniassiale bidimensionale ha un effetto positivo sul fenotipo del cuore durante la coltura. In questi studi, le sezioni di cuore sono state caricate con forze di trazione isometriche17, carico auxotonico lineare18, oppure il ciclo cardiaco è stato ricreato utilizzando il feedback del trasduttore di forza e azionamenti di tensione. Tuttavia, questi metodi utilizzano lo stiramento uniassiale del tessuto senza ottimizzazione ambientale, con conseguente soppressione di molti geni cardiaci o sovraespressione di geni associati a risposte anomale allo stiramento. Il CTCM qui descritto fornisce uno stimolo elettromeccanico tridimensionale che imita il ciclo cardiaco naturale in termini di tempo di ciclo e stiramento fisiologico (25% di stiramento, 40% di sistole, 60% diastole e 72 battiti al minuto). Sebbene questa stimolazione meccanica tridimensionale da sola non sia sufficiente a mantenere l'integrità dei tessuti, è necessaria una combinazione di stimolazione umorale e meccanica mediante T3/Dex per preservare adeguatamente la vitalità, la funzione e l'integrità dei tessuti.
I fattori umorali svolgono un ruolo importante nella modulazione del fenotipo del cuore adulto. Ciò è stato evidenziato negli studi HiPS-CM in cui T3 e Dex sono stati aggiunti ai terreni di coltura per accelerare la maturazione cellulare. Il T3 può influenzare il trasporto di aminoacidi, zuccheri e calcio attraverso le membrane cellulari36. Inoltre, il T3 promuove l'espressione di MHC-α e la down-regulation di MHC-β, favorendo la formazione di miofibrille a contrazione rapida nei cardiomiociti maturi rispetto alle miofibrille a contrazione lenta nei cardiomiociti fetali. La carenza di T3 nei pazienti ipotiroidei determina la perdita di bande miofibrillari e una ridotta velocità di sviluppo del tono37. Il Dex agisce sui recettori dei glucocorticoidi e ha dimostrato di aumentare la contrattilità miocardica nei cuori isolati perfusi;38 si ritiene che questo miglioramento sia correlato all'effetto sull'ingresso guidato dal deposito di calcio (SOCE)39,40. Inoltre, il desametasone si lega ai suoi recettori, provocando un'ampia risposta intracellulare che sopprime la funzione immunitaria e l'infiammazione30.
I nostri risultati indicano che la stimolazione meccanica fisica (MS) ha migliorato le prestazioni complessive della coltura rispetto al Ctrl, ma non è riuscita a mantenere la vitalità, l'integrità strutturale e l'espressione cardiaca per 12 giorni in coltura. Rispetto al Ctrl, l'aggiunta di T3 e Dex alle colture CTCM (MT) ha migliorato la vitalità e mantenuto profili di trascrizione, integrità strutturale e attività metabolica simili a quelli del tessuto cardiaco fresco per 12 giorni. Inoltre, controllando il grado di stiramento del tessuto, è stato creato un modello di ipertrofia cardiaca indotta da iperestensione utilizzando STCM, illustrando la versatilità del sistema STCM. Va notato che, sebbene il rimodellamento cardiaco e la fibrosi di solito coinvolgano organi intatti le cui cellule circolanti possono fornire le citochine appropriate, nonché la fagocitosi e altri fattori di rimodellamento, le sezioni del cuore possono comunque mimare il processo fibrotico in risposta a stress e traumi. in miofibroblasti. Questo è stato precedentemente valutato in questo modello di fette cardiache. Va notato che i parametri del CTCM possono essere modulati modificando la pressione/ampiezza elettrica e la frequenza per simulare molte condizioni come tachicardia, bradicardia e supporto circolatorio meccanico (cuore meccanicamente scaricato). Ciò rende il sistema a media produttività per i test farmacologici. La capacità del CTCM di modellare l'ipertrofia cardiaca indotta da sforzo eccessivo apre la strada alla sperimentazione di questo sistema per la terapia personalizzata. In conclusione, il presente studio dimostra che lo stiramento meccanico e la stimolazione umorale sono fondamentali per il mantenimento della coltura di sezioni di tessuto cardiaco.
Sebbene i dati qui presentati suggeriscano che la CTCM sia una piattaforma molto promettente per la modellazione del miocardio intatto, questo metodo di coltura presenta alcune limitazioni. La principale limitazione della coltura CTCM è che impone continue sollecitazioni meccaniche dinamiche alle sezioni, il che impedisce di monitorare attivamente le contrazioni delle sezioni cardiache durante ogni ciclo. Inoltre, a causa delle piccole dimensioni delle sezioni cardiache (7 mm), la possibilità di valutare la funzione sistolica al di fuori dei sistemi di coltura utilizzando i tradizionali sensori di forza è limitata. Nel presente manoscritto, superiamo parzialmente questa limitazione valutando la tensione ottica come indicatore della funzione contrattile. Tuttavia, questa limitazione richiederà ulteriori studi e potrebbe essere affrontata in futuro introducendo metodi per il monitoraggio ottico della funzione delle sezioni cardiache in coltura, come la mappatura ottica utilizzando coloranti sensibili al calcio e alla tensione. Un'altra limitazione della CTCM è che il modello di lavoro non manipola lo stress fisiologico (precarico e postcarico). Nella CTCM, la pressione è stata indotta in direzioni opposte per riprodurre un allungamento fisiologico del 25% in diastole (allungamento massimo) e sistole (durata della contrazione durante la stimolazione elettrica) in tessuti molto grandi. Nei futuri progetti di CTCM, questa limitazione dovrebbe essere eliminata esercitando una pressione adeguata sul tessuto cardiaco da entrambi i lati e applicando le esatte relazioni pressione-volume che si verificano nelle camere del cuore.
Il rimodellamento indotto da iperestensione descritto in questo manoscritto si limita a mimare i segnali di iperestensione ipertrofica. Pertanto, questo modello può essere utile nello studio della segnalazione ipertrofica indotta da estensione senza la necessità di fattori umorali o neurali (che non sono presenti in questo sistema). Ulteriori studi sono necessari per aumentare la molteplicità del CTCM, ad esempio, la co-coltura con cellule immunitarie, fattori umorali plasmatici circolanti e l'innervazione durante la co-coltura con cellule neuronali miglioreranno le possibilità di modellazione delle malattie con il CTCM.
In questo studio sono stati utilizzati tredici maiali. Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali e sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Louisville. L'arco aortico è stato clampato e il cuore è stato perfuso con 1 L di cardioplegia sterile (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL eparina, pH fino a 7,4); I cuori sono stati conservati in soluzione cardioplegica ghiacciata fino al trasporto in laboratorio su ghiaccio, che di solito richiede meno di 10 minuti. I cuori sono stati conservati in soluzione cardioplegica ghiacciata fino al trasporto in laboratorio su ghiaccio, che di solito richiede meno di 10 minuti. un lavoratore cardiovascolare in un centro di lavoro cardioplegico per i trasporti in un laboratorio a casa, questo è ciò che è ovvio si accende <10 minuti. I cuori sono stati conservati in soluzione cardioplegica ghiacciata fino al trasporto in laboratorio, che avviene su ghiaccio e richiede solitamente meno di 10 minuti.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟. Prestare attenzione alla cardioplegia lesionale per il trasporto in laboratorio a domicilio, preferibilmente <10 minuti. Mantenere i cuori in ghiaccio con soluzione cardioplegica fino al trasporto in laboratorio, solitamente entro 10 minuti.
Il dispositivo CTCM è stato sviluppato utilizzando il software di progettazione assistita da computer (CAD) SolidWorks. Le camere di coltura, i divisori e le camere d'aria sono realizzati in plastica acrilica trasparente lavorata a CNC. L'anello di supporto di 7 mm di diametro è realizzato in polietilene ad alta densità (HDPE) al centro e presenta una scanalatura per l'O-ring in silicone utilizzato per sigillare il terreno di coltura sottostante. Una sottile membrana di silice separa la camera di coltura dalla piastra di separazione. La membrana di silicone è tagliata al laser da un foglio di silicone di 0,02" di spessore e ha una durezza di 35A. Le guarnizioni in silicone inferiore e superiore sono tagliate al laser da un foglio di silicone di 1/16" di spessore e hanno una durezza di 50A. Viti e dadi a farfalla in acciaio inossidabile 316L sono utilizzati per fissare il blocco e creare una tenuta ermetica.
È stata progettata una scheda a circuito stampato (PCB) dedicata per essere integrata con il sistema C-PACE-EM. I connettori a vite presenti sulla PCB sono collegati agli elettrodi di grafite tramite fili di rame argentato e viti in bronzo 0-60 avvitate agli elettrodi stessi. La scheda a circuito stampato è alloggiata nel coperchio della stampante 3D.
Il dispositivo CTCM è controllato da un attuatore pneumatico programmabile (PPD) che crea una pressione circolatoria controllata simile a quella di un ciclo cardiaco. All'aumentare della pressione all'interno della camera d'aria, la membrana flessibile in silicone si espande verso l'alto, spingendo il fluido sotto il tessuto. L'area del tessuto viene quindi stirata da questa espulsione di fluido, mimando l'espansione fisiologica del cuore durante la diastole. Al culmine del rilassamento, viene applicata una stimolazione elettrica tramite elettrodi di grafite, che riduce la pressione nella camera d'aria e provoca la contrazione delle sezioni di tessuto. All'interno del tubo è presente una valvola emostatica con un sensore di pressione per rilevare la pressione nel sistema dell'aria. La pressione rilevata dal sensore viene inviata a un raccoglitore di dati collegato al laptop. Ciò consente il monitoraggio continuo della pressione all'interno della camera del gas. Al raggiungimento della pressione massima nella camera (standard 80 mmHg, 140 mmHg OS), il dispositivo di acquisizione dati invia un segnale al sistema C-PACE-EM per generare un segnale di tensione bifasico per 2 ms, impostato a 4 V.
Sono state ottenute sezioni di cuore e le condizioni di coltura in 6 pozzetti sono state eseguite come segue: Trasferire i cuori prelevati dal recipiente di trasferimento a un vassoio contenente cardioplegia fredda (4 °C). Il ventricolo sinistro è stato isolato con una lama sterile e tagliato in pezzi di 1-2 cm³. Questi blocchi di tessuto sono stati fissati a supporti per tessuti con adesivo tissutale e posti in un bagno per tessuti di un microtomo vibrante contenente soluzione di Tyrode e continuamente ossigenato (3 g/L 2,3-butanedione monoossima (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glucosio (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl₂ (1 ml di soluzione 1 M), 1,8 mM CaCl₂ (1,8 ml di soluzione 1 M), fino a 1 L ddH₂O). Il microtomo vibrante è stato impostato per tagliare sezioni di 300 µm di spessore a una frequenza di 80 Hz, un'ampiezza di vibrazione orizzontale di 2 mm e una velocità di avanzamento di 0,03 mm/s. Il bagno per tessuti era circondato da ghiaccio per mantenere la soluzione fredda e la temperatura è stata mantenuta a 4 °C. Le sezioni di tessuto sono state trasferite dal bagno del microtomo a un bagno di incubazione contenente soluzione di Tyrode continuamente ossigenata su ghiaccio fino a ottenere un numero sufficiente di sezioni per una piastra di coltura. Per le colture transwell, le sezioni di tessuto sono state fissate a supporti sterili in poliuretano larghi 6 mm e poste in 6 ml di terreno ottimizzato (terreno 199, supplemento ITS 1x, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alcalino e 2X antibiotico-antifungino). La stimolazione elettrica (10 V, frequenza 1,2 Hz) è stata applicata alle sezioni di tessuto tramite il C-Pace. Per le condizioni TD, T3 e Dex freschi sono stati aggiunti a concentrazioni di 100 nM e 1 μM rispettivamente, ad ogni cambio di terreno di coltura. Il terreno di coltura è stato saturato con ossigeno prima della sostituzione, 3 volte al giorno. Le sezioni di tessuto sono state coltivate in un incubatore a 37 °C e 5% di CO2.
Per le colture CTCM, le sezioni di tessuto sono state posizionate su una stampante 3D personalizzata in una piastra di Petri contenente soluzione di Tyrode modificata. Il dispositivo è progettato per aumentare le dimensioni della sezione di cuore del 25% rispetto all'area dell'anello di supporto. Questo accorgimento impedisce che le sezioni di cuore si allunghino dopo il trasferimento dalla soluzione di Tyrode al terreno di coltura e durante la diastole. Utilizzando colla istoacrilica, sezioni di 300 µm di spessore sono state fissate su un anello di supporto di 7 mm di diametro. Dopo aver fissato le sezioni di tessuto all'anello di supporto, si tagliano le sezioni di tessuto in eccesso e si ripongono le sezioni fissate nel bagno di soluzione di Tyrode su ghiaccio (4°C) fino a ottenere un numero sufficiente di sezioni per un dispositivo. Il tempo totale di elaborazione per tutti i dispositivi non deve superare le 2 ore. Dopo aver fissato 6 sezioni di tessuto ai rispettivi anelli di supporto, si procede all'assemblaggio del dispositivo CTCM. La camera di coltura CTCM viene pre-riempita con 21 ml di terreno di coltura pre-ossigenato. Trasferire le sezioni di tessuto nella camera di coltura e rimuovere con cura eventuali bolle d'aria con una pipetta. La sezione di tessuto viene quindi guidata nel foro e delicatamente premuta in posizione. Infine, posizionare il cappuccio dell'elettrodo sul dispositivo e trasferire il dispositivo nell'incubatore. Quindi collegare il CTCM al tubo dell'aria e al sistema C-PACE-EM. L'attuatore pneumatico si apre e la valvola dell'aria apre il CTCM. Il sistema C-PACE-EM è stato configurato per erogare 4 V a 1,2 Hz durante la stimolazione bifasica per 2 ms. Il mezzo di coltura è stato cambiato due volte al giorno e gli elettrodi una volta al giorno per evitare l'accumulo di grafite sugli elettrodi. Se necessario, le sezioni di tessuto possono essere rimosse dai pozzetti di coltura per espellere eventuali bolle d'aria che potrebbero essersi depositate al di sotto di esse. Per le condizioni di trattamento MT, T3/Dex è stato aggiunto fresco ad ogni cambio di mezzo di coltura con 100 nM di T3 e 1 μM di Dex. I dispositivi CTCM sono stati coltivati ​​in un incubatore a 37 °C e 5% di CO2.
Per ottenere traiettorie allungate di sezioni di cuore, è stato sviluppato un sistema di telecamere speciale. È stata utilizzata una fotocamera reflex (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Giappone) con un obiettivo macro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA). La visualizzazione è stata effettuata a temperatura ambiente dopo aver sostituito il mezzo di coltura con uno fresco. La telecamera è posizionata con un'angolazione di 51° e il video viene registrato a 30 fotogrammi al secondo. In primo luogo, è stato utilizzato un software open source (MUSCLEMOTION43) con Image-J per quantificare il movimento delle sezioni di cuore. La maschera è stata creata utilizzando MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) per definire le regioni di interesse per le sezioni di cuore pulsante al fine di evitare il rumore. Le maschere segmentate manualmente vengono applicate a tutte le immagini di una sequenza di fotogrammi e quindi passate al plug-in MUSCLEMOTION. Muscle Motion utilizza l'intensità media dei pixel in ciascun fotogramma per quantificarne il movimento rispetto al fotogramma di riferimento. I dati sono stati registrati, filtrati e utilizzati per quantificare il tempo di ciclo e valutare lo stiramento del tessuto durante il ciclo cardiaco. Il video registrato è stato post-elaborato utilizzando un filtro digitale a fase zero del primo ordine. Per quantificare lo stiramento del tessuto (picco-picco), è stata eseguita un'analisi picco-picco per distinguere tra picchi e avvallamenti nel segnale registrato. Inoltre, è stata eseguita una rimozione del trend utilizzando un polinomio di sesto ordine per eliminare la deriva del segnale. È stato sviluppato un codice di programma in MATLAB per determinare il movimento globale del tessuto, il tempo di ciclo, il tempo di rilassamento e il tempo di contrazione (Codice di programma supplementare 44).
Per l'analisi della deformazione, utilizzando gli stessi video creati per la valutazione dell'allungamento meccanico, abbiamo innanzitutto tracciato due immagini che rappresentano i picchi di movimento (i punti di movimento più alto (superiore) e più basso (inferiore)) secondo il software MUSCLEMOTION. Abbiamo quindi segmentato le regioni di tessuto e applicato una forma di algoritmo di ombreggiatura al tessuto segmentato (Figura supplementare 2a). Il tessuto segmentato è stato quindi diviso in dieci sottosuperfici e lo stress su ciascuna superficie è stato calcolato utilizzando la seguente equazione: Deformazione = (Sup-Sdown)/Sdown, dove Sup e Sdown sono le distanze della forma dalle ombre superiore e inferiore del tessuto, rispettivamente (Figura supplementare 2b).
Le sezioni cardiache sono state fissate in paraformaldeide al 4% per 48 ore. I tessuti fissati sono stati disidratati in saccarosio al 10% e al 20% per 1 ora, quindi in saccarosio al 30% per tutta la notte. Le sezioni sono state poi incluse in un composto per criosezione (composto OCT) e congelate gradualmente in un bagno di isopentano/ghiaccio secco. Conservare i blocchi di inclusione OCT a -80 °C fino al momento della separazione. I vetrini sono stati preparati come sezioni con uno spessore di 8 μm.
Per rimuovere l'OCT dalle sezioni cardiache, riscaldare i vetrini su un blocco riscaldante a 95 °C per 5 minuti. Aggiungere 1 ml di PBS a ciascun vetrino e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi permeare le sezioni con Triton-X allo 0,1% in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente. Per impedire il legame di anticorpi non specifici al campione, aggiungere 1 ml di soluzione di BSA al 3% ai vetrini e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. Successivamente, rimuovere la BSA e lavare i vetrini con PBS. Contrassegnare ciascun campione con una matita. Anticorpi primari (diluiti 1:200 in BSA all'1%) (connessina 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) e troponina-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) sono stati aggiunti per 90 minuti, quindi anticorpi secondari (diluiti 1:200 in BSA all'1%) contro Alexa Fluor 488 di topo (Thermo Scientific; #A16079), contro Alexa Fluor 594 di coniglio (Thermo Scientific; #T6391) per ulteriori 90 minuti Lavati 3 volte con PBS Per distinguere la colorazione target dallo sfondo, abbiamo usato solo l'anticorpo secondario come controllo. Infine, è stata aggiunta la colorazione nucleare DAPI e i vetrini sono stati posizionati in un vectashield (Vector Laboratories) e sigillati con smalto per unghie. -ingrandimento x) e microscopio Keyence con ingrandimento 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) a 5 μg/ml in PBS è stato utilizzato per la colorazione WGA ed è stato applicato alle sezioni fissate per 30 minuti a temperatura ambiente. I vetrini sono stati quindi lavati con PBS e a ciascun vetrino è stato aggiunto Sudan nero e incubato per 30 minuti. Successivamente, i vetrini sono stati lavati nuovamente con PBS e a ciascun vetrino è stato aggiunto il mezzo di inclusione Vectashield. I vetrini sono stati visualizzati al microscopio Keyence con un ingrandimento di 40x.
L'OCT è stato rimosso dai campioni come descritto in precedenza. Dopo la rimozione dell'OCT, i vetrini sono stati immersi nella soluzione di Bouin per tutta la notte. I vetrini sono stati quindi risciacquati con acqua distillata per 1 ora e poi immersi in una soluzione di fucsina acida di aloe di Bibrich per 10 minuti. Successivamente, i vetrini sono stati lavati con acqua distillata e immersi in una soluzione di fosfomolibdeno al 5%/acido fosfotungstico al 5% per 10 minuti. Senza risciacquare, i vetrini sono stati trasferiti direttamente nella soluzione di blu di anilina per 15 minuti. Infine, i vetrini sono stati lavati con acqua distillata e immersi in una soluzione di acido acetico all'1% per 2 minuti. I vetrini sono stati asciugati in etanolo 200 N e trasferiti in xilene. I vetrini colorati sono stati visualizzati utilizzando un microscopio Keyence con un obiettivo 10x. La percentuale di area fibrotica è stata quantificata utilizzando il software Keyence Analyzer.
Il test di vitalità cellulare CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), numero di catalogo V13154, è stato eseguito secondo il protocollo del produttore con alcune modifiche. In particolare, è stato utilizzato un punch chirurgico con un diametro di 6 mm per garantire una dimensione uniforme del tessuto durante l'analisi MTT. I tessuti sono stati piastrati singolarmente nei pozzetti di una piastra a 12 pozzetti contenente il substrato MTT secondo il protocollo del produttore. Le sezioni sono state incubate a 37 °C per 3 ore e il tessuto vivente ha metabolizzato il substrato MTT per formare un composto di formazano viola. La soluzione di MTT è stata sostituita con 1 ml di DMSO e incubata a 37 °C per 15 minuti per estrarre il formazano viola dalle sezioni di cuore. I campioni sono stati diluiti 1:10 in DMSO in piastre a 96 pozzetti con fondo trasparente e l'intensità del colore viola è stata misurata a 570 nm utilizzando un lettore di piastre Cytation (BioTek). Le letture sono state normalizzate rispetto al peso di ciascuna sezione di cuore.
Il terreno di coltura delle fette di cuore è stato sostituito con un terreno contenente 1 μCi/ml di [5-3H]-glucosio (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) per il test di utilizzo del glucosio, come precedentemente descritto. Dopo 4 ore di incubazione, aggiungere 100 µl di terreno di coltura a una provetta da microcentrifuga aperta contenente 100 µl di HCl 0,2 N. Quindi la provetta è stata posta in una provetta per scintillazione contenente 500 μl di dH2O per far evaporare [3H]2O per 72 ore a 37 °C. Successivamente, rimuovere la provetta da microcentrifuga dalla provetta per scintillazione e aggiungere 10 ml di liquido scintillante. I conteggi di scintillazione sono stati eseguiti utilizzando un analizzatore a scintillazione liquida Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). L'utilizzo del glucosio è stato quindi calcolato tenendo conto dell'attività specifica del [5-3H]-glucosio, dell'equilibrio incompleto e del background, della diluizione del [5-3H]-glucosio non marcato e dell'efficienza del contatore a scintillazione. I dati sono normalizzati rispetto alla massa delle sezioni del cuore.
Dopo l'omogeneizzazione del tessuto in Trizol, l'RNA è stato isolato da sezioni di cuore utilizzando il kit Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 secondo il protocollo del produttore. La preparazione della libreria RNAsec, il sequenziamento e l'analisi dei dati sono stati eseguiti come segue:
Per la preparazione della libreria di RNA è stato utilizzato 1 μg di RNA per campione come materiale di partenza. Le librerie di sequenziamento sono state generate utilizzando il kit NEBNext UltraTM RNA Library Preparation per Illumina (NEB, USA) seguendo le raccomandazioni del produttore, e sono stati aggiunti codici indice alle sequenze attributive per ciascun campione. In breve, l'mRNA è stato purificato dall'RNA totale utilizzando microsfere magnetiche legate a oligonucleotidi poli-T. La frammentazione è stata effettuata utilizzando cationi bivalenti ad alta temperatura nel tampone di reazione NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). Il cDNA del primo filamento è stato sintetizzato utilizzando primer esamerici casuali e trascrittasi inversa M-MuLV (RNasi H-). Il cDNA del secondo filamento è stato quindi sintetizzato utilizzando DNA polimerasi I e RNasi H. Le estremità sporgenti rimanenti sono state convertite in estremità piatte mediante attività esonucleasica/polimerasica. Dopo l'adenilazione dell'estremità 3' del frammento di DNA, un adattatore NEBNext con struttura a forcina viene attaccato ad esso per prepararlo all'ibridazione. Per la selezione di frammenti di cDNA della lunghezza preferita di 150-200 bp, i frammenti della libreria sono stati purificati utilizzando il sistema AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA). Successivamente, 3 μl di enzima USER (NEB, USA) con cDNA selezionato per dimensione e ligato con un adattatore sono stati utilizzati per 15 minuti a 37°C e poi per 5 minuti a 95°C prima della PCR. La PCR è stata quindi eseguita utilizzando la DNA polimerasi Phusion High-Fidelity, primer PCR universali e primer Index (X). Infine, i prodotti di PCR sono stati purificati (sistema AMPure XP) e la qualità della libreria è stata valutata su un sistema Agilent Bioanalyzer 2100. La libreria di cDNA è stata quindi sequenziata utilizzando un sequenziatore Novaseq. I file immagine grezzi di Illumina sono stati convertiti in letture grezze utilizzando CASAVA Base Calling. I dati grezzi sono memorizzati in file in formato FASTQ (fq) che contengono le sequenze di lettura e le corrispondenti qualità delle basi. Seleziona HISAT2 per allineare le letture di sequenziamento filtrate al genoma di riferimento Sscrofa11.1. In generale, HISAT2 supporta genomi di qualsiasi dimensione, inclusi genomi di dimensioni superiori a 4 miliardi di basi, e per la maggior parte dei parametri sono impostati valori predefiniti. Le letture di splicing dai dati RNA-Seq possono essere allineate in modo efficiente utilizzando HISAT2, il sistema più veloce attualmente disponibile, con la stessa precisione o superiore a qualsiasi altro metodo.
L'abbondanza di trascritti riflette direttamente il livello di espressione genica. I livelli di espressione genica vengono valutati in base all'abbondanza di trascritti (conteggio di sequenziamento) associati al genoma o agli esoni. Il numero di letture è proporzionale ai livelli di espressione genica, alla lunghezza del gene e alla profondità di sequenziamento. Sono stati calcolati i valori FPKM (frammenti per mille coppie di basi di trascritto sequenziato per milione di coppie di basi) e sono stati determinati i valori P dell'espressione differenziale utilizzando il pacchetto DESeq2. Abbiamo quindi calcolato il tasso di falsa scoperta (FDR) per ciascun valore P utilizzando il metodo di Benjamini-Hochberg9 basato sulla funzione integrata di R "p.adjust".
L'RNA isolato da sezioni di cuore è stato convertito in cDNA a una concentrazione di 200 ng/μl utilizzando il SuperScript IV Vilo Master mix di Thermo (Thermo, codice n. 11756050). La RT-PCR quantitativa è stata eseguita utilizzando una piastra di reazione trasparente a 384 pozzetti Applied Biosystems Endura Plate Microamp (Thermo, codice n. 4483319) e adesivo ottico microamp (Thermo, codice n. 4311971). La miscela di reazione era composta da 5 µl di Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, codice n. 4444557), 0,5 µl di Taqman Primer e 3,5 µl di H2O miscelati per pozzetto. Sono stati eseguiti cicli di qPCR standard e i valori di CT sono stati misurati utilizzando uno strumento per PCR in tempo reale Applied Biosystems Quantstudio 5 (modulo a 384 pozzetti; codice prodotto n. A28135). I primer Taqman sono stati acquistati da Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). I valori CT di tutti i campioni sono stati normalizzati al gene housekeeping GAPDH.
Il rilascio di NT-ProBNP nel mezzo di coltura è stato valutato utilizzando il kit NT-ProBNP (suino) (Cod. n. MBS2086979, MyBioSource) secondo il protocollo del produttore. In breve, 250 µl di ciascun campione e standard sono stati aggiunti in duplicato a ciascun pozzetto. Immediatamente dopo l'aggiunta del campione, sono stati aggiunti 50 µl di reagente A a ciascun pozzetto. La piastra è stata agitata delicatamente e sigillata con il sigillante. Le compresse sono state quindi incubate a 37 °C per 1 ora. Successivamente, la soluzione è stata aspirata e i pozzetti sono stati lavati 4 volte con 350 µl di soluzione di lavaggio 1X, incubando la soluzione di lavaggio per 1-2 minuti ogni volta. Infine, sono stati aggiunti 100 µl di reagente B per pozzetto e la piastra è stata sigillata con il sigillante. La compressa è stata agitata delicatamente e incubata a 37 °C per 30 minuti. Aspirare la soluzione e lavare i pozzetti 5 volte con 350 µl di soluzione di lavaggio 1X. Aggiungere 90 µl di soluzione di substrato a ciascun pozzetto e sigillare la piastra. Incubare la piastra a 37 °C per 10-20 minuti. Aggiungere 50 µl di soluzione di arresto a ciascun pozzetto. La piastra è stata immediatamente misurata utilizzando un lettore di piastre Cytation (BioTek) impostato a 450 nm.
Sono state eseguite analisi di potenza per scegliere le dimensioni del gruppo che garantiranno una potenza superiore all'80% per rilevare una variazione assoluta del 10% nel parametro con un tasso di errore di tipo I del 5%. Sono state eseguite analisi di potenza per scegliere le dimensioni dei gruppi che garantiranno una potenza superiore all'80% per rilevare una variazione assoluta del 10% nel parametro con un tasso di errore di tipo I del 5%. L'analisi della umidità è stata effettuata per le dimensioni del gruppo di lavoro che supera l'80% di umidità per l'aumento del 10% modifica completa parametro con 5% частотой ошибок типа I. È stata eseguita un'analisi di potenza per selezionare le dimensioni del gruppo che avrebbero fornito una potenza superiore all'80% per rilevare una variazione assoluta del parametro del 10% con un tasso di errore di tipo I del 5%.进行功效分析以选择将提供> 80% 功效以检测参数中10%绝对变化 e 5%I型错误率的组大小.进行功效分析以选择将提供> 80% 功效以检测参数中10%绝对变化 e 5%I型错误率的组大小. È stata effettuata un'analisi approfondita della velocità per la dimensione del gruppo di lavoro, il cui controllo è > 80% della velocità per l'ottimizzazione del 10% modifica completa parametri e 5% percentuale dell'apparecchio tipo I. È stata eseguita un'analisi di potenza per selezionare una dimensione del gruppo che fornisse una potenza superiore all'80% per rilevare una variazione assoluta del parametro del 10% e un tasso di errore di tipo I del 5%.Prima dell'esperimento, sono state selezionate casualmente sezioni di tessuto. Tutte le analisi sono state condotte in cieco rispetto alle condizioni sperimentali e i campioni sono stati decodificati solo dopo l'analisi di tutti i dati. Per tutte le analisi statistiche è stato utilizzato il software GraphPad Prism (San Diego, CA). Per tutte le analisi statistiche, i valori p sono stati considerati significativi per valori <0,05. Per tutte le analisi statistiche, i valori p sono stati considerati significativi per valori <0,05. Per tutte le statistiche i valori numerici sono inferiori a 0,05. Per tutte le analisi statistiche, i valori p sono stati considerati significativi per valori <0,05.对于所有统计数据, p 值在值<0.05 时被认为是显着的.对于所有统计数据, p 值在值<0.05 时被认为是显着的. Per tutte le statistiche i valori numerici sono inferiori a 0,05. Per tutte le analisi statistiche, i valori p sono stati considerati significativi per valori <0,05.Sui dati con solo 2 confronti è stato eseguito un test t di Student a due code. Per determinare la significatività tra più gruppi è stata utilizzata l'ANOVA a una o due vie. Nell'esecuzione dei test post hoc, è stata applicata la correzione di Tukey per tenere conto dei confronti multipli. I dati RNAsec presentano considerazioni statistiche specifiche per il calcolo di FDR e p.adjust, come descritto nella sezione Metodi.
Per maggiori informazioni sulla progettazione dello studio, si veda l'abstract del Nature Research Report collegato a questo articolo.