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È necessario un sistema in vitro affidabile in grado di riprodurre accuratamente l'ambiente fisiologico del cuore per i test farmacologici. La limitata disponibilità di sistemi di coltura di tessuto cardiaco umano ha portato a interpretazioni imprecise degli effetti dei farmaci cardiaci. In questo studio, abbiamo sviluppato un modello di coltura di tessuto cardiaco (CTCM) che stimola elettromeccanicamente le sezioni di cuore e subisce uno stiramento fisiologico durante le fasi sistolica e diastolica del ciclo cardiaco. Dopo 12 giorni di coltura, questo approccio ha parzialmente migliorato la vitalità delle sezioni di cuore, ma non ne ha preservato completamente l'integrità strutturale. Pertanto, dopo lo screening di piccole molecole, abbiamo scoperto che l'aggiunta di 100 nM di triiodotironina (T3) e 1 μM di desametasone (Dex) al nostro terreno di coltura ha mantenuto la microstruttura delle sezioni per 12 giorni. In combinazione con il trattamento con T3/Dex, il sistema CTCM ha mantenuto profili trascrizionali, vitalità, attività metabolica e integrità strutturale allo stesso livello del tessuto cardiaco fresco per 12 giorni. Inoltre, l'eccessivo allungamento del tessuto cardiaco in coltura induce una segnalazione cardiaca ipertrofica, a dimostrazione della capacità del CTCM di imitare le condizioni ipertrofiche indotte dallo stiramento cardiaco. In conclusione, il CTCM può modellare la fisiologia e la fisiopatologia del cuore in coltura per lunghi periodi di tempo, consentendo uno screening farmacologico affidabile.
Prima della ricerca clinica, sono necessari sistemi in vitro affidabili in grado di riprodurre accuratamente l'ambiente fisiologico del cuore umano. Tali sistemi dovrebbero imitare le alterazioni dello stiramento meccanico, della frequenza cardiaca e delle proprietà elettrofisiologiche. I modelli animali sono comunemente utilizzati come piattaforma di screening per la fisiologia cardiaca, con un'affidabilità limitata nel riflettere gli effetti dei farmaci sul cuore umano1,2. In definitiva, il modello sperimentale ideale di coltura tissutale cardiaca (CTCM) è un modello altamente sensibile e specifico per vari interventi terapeutici e farmacologici, che riproduce accuratamente la fisiologia e la fisiopatologia del cuore umano3. L'assenza di un tale sistema limita la scoperta di nuovi trattamenti per l'insufficienza cardiaca4,5 e ha portato la cardiotossicità dei farmaci a essere una delle principali cause di uscita dal mercato6.
Nell'ultimo decennio, otto farmaci non cardiovascolari sono stati ritirati dall'uso clinico perché causano un prolungamento dell'intervallo QT con conseguente aritmie ventricolari e morte improvvisa7. Pertanto, vi è una crescente necessità di strategie di screening preclinico affidabili per valutare l'efficacia e la tossicità cardiovascolare. Il recente utilizzo di cardiomiociti derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPS-CM) nello screening farmacologico e nei test di tossicità fornisce una soluzione parziale a questo problema. Tuttavia, la natura immatura degli hiPS-CM e la mancanza di complessità multicellulare del tessuto cardiaco rappresentano i principali limiti di questo metodo. Studi recenti hanno dimostrato che questa limitazione può essere in parte superata utilizzando hiPS-CM in fase precoce per formare idrogel di tessuto cardiaco subito dopo l'inizio delle contrazioni spontanee e aumentando gradualmente la stimolazione elettrica nel tempo. Tuttavia, questi microtessuti hiPS-CM non possiedono le proprietà elettrofisiologiche e contrattili mature del miocardio adulto. Inoltre, il tessuto cardiaco umano presenta una struttura più complessa, costituita da una miscela eterogenea di diversi tipi cellulari, tra cui cellule endoteliali, neuroni e fibroblasti stromali, interconnessi da specifici insiemi di proteine ​​della matrice extracellulare. Questa eterogeneità delle popolazioni non cardiomiocitarie11,12,13 nel cuore dei mammiferi adulti rappresenta un importante ostacolo alla modellizzazione del tessuto cardiaco utilizzando singoli tipi cellulari. Queste importanti limitazioni sottolineano l'importanza di sviluppare metodi per la coltura di tessuto miocardico intatto in condizioni fisiologiche e patologiche.
Le sezioni sottili (300 µm) coltivate di cuore umano si sono dimostrate un modello promettente di miocardio umano intatto. Questo metodo fornisce l'accesso a un sistema multicellulare 3D completo, simile al tessuto cardiaco umano. Tuttavia, fino al 2019, l'uso di sezioni cardiache coltivate era limitato dalla breve sopravvivenza della coltura (24 ore). Ciò è dovuto a una serie di fattori, tra cui la mancanza di allungamento fisico-meccanico, l'interfaccia aria-liquido e l'uso di terreni di coltura semplici che non supportano le esigenze del tessuto cardiaco. Nel 2019, diversi gruppi di ricerca hanno dimostrato che l'integrazione di fattori meccanici nei sistemi di coltura di tessuto cardiaco può prolungare la vita della coltura, migliorare l'espressione cardiaca e imitare la patologia cardiaca. Due eleganti studi 17 e 18 dimostrano che il carico meccanico uniassiale ha un effetto positivo sul fenotipo cardiaco durante la coltura. Tuttavia, questi studi non hanno utilizzato il carico fisico-meccanico tridimensionale dinamico del ciclo cardiaco, poiché le sezioni cardiache venivano caricate con forze di trazione isometriche 17 o con un carico auxotonico lineare 18. Questi metodi di stiramento tissutale hanno portato alla soppressione di molti geni cardiaci o alla sovraespressione di geni associati a risposte anomale allo stiramento. In particolare, Pitoulis et al. 19 hanno sviluppato un bagno di coltura dinamico per sezioni di cuore per la ricostruzione del ciclo cardiaco utilizzando il feedback del trasduttore di forza e i dispositivi di tensionamento. Sebbene questo sistema consenta una modellazione in vitro del ciclo cardiaco più accurata, la complessità e la bassa produttività del metodo ne limitano l'applicazione. Il nostro laboratorio ha recentemente sviluppato un sistema di coltura semplificato che utilizza la stimolazione elettrica e un terreno di coltura ottimizzato per mantenere la vitalità di sezioni di tessuto cardiaco suino e umano fino a 6 giorni20,21.
Nel presente manoscritto, descriviamo un modello di coltura tissutale cardiaca (CTCM) che utilizza sezioni di cuore suino e che incorpora segnali umorali per ricapitolare la fisiologia cardiaca tridimensionale e la distensione patofisiologica durante il ciclo cardiaco. Questo CTCM può aumentare l'accuratezza della previsione preclinica dei farmaci a un livello mai raggiunto prima, fornendo un sistema cardiaco a media produttività ed economicamente vantaggioso che imita la fisiologia/patofisiologia del cuore dei mammiferi per i test preclinici sui farmaci.
I segnali meccanici emodinamici svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento della funzione dei cardiomiociti in vitro 22,23,24. Nel presente manoscritto, abbiamo sviluppato un CTCM (Figura 1a) in grado di imitare l'ambiente cardiaco dell'adulto inducendo stimolazione sia elettrica che meccanica a frequenze fisiologiche (1,2 Hz, 72 battiti al minuto). Per evitare un eccessivo stiramento dei tessuti durante la diastole, è stato utilizzato un dispositivo di stampa 3D per aumentare le dimensioni del tessuto del 25% (Fig. 1b). La stimolazione elettrica indotta dal sistema C-PACE è stata temporizzata per iniziare 100 ms prima della sistole utilizzando un sistema di acquisizione dati per riprodurre completamente il ciclo cardiaco. Il sistema di coltura tissutale utilizza un attuatore pneumatico programmabile (LB Engineering, Germania) per espandere ciclicamente una membrana flessibile in silicone, causando l'espansione delle fette di cuore nella camera superiore. Il sistema è stato collegato a una linea d'aria esterna tramite un trasduttore di pressione, che ha permesso di regolare con precisione la pressione (± 1 mmHg) e il tempo (± 1 ms) (Fig. 1c).
a Fissare la sezione di tessuto all'anello di supporto da 7 mm, mostrato in blu, all'interno della camera di coltura del dispositivo. La camera di coltura è separata dalla camera d'aria da una sottile membrana flessibile in silicone. Posizionare una guarnizione tra ciascuna camera per evitare perdite. Il coperchio del dispositivo contiene elettrodi di grafite che forniscono la stimolazione elettrica. b Rappresentazione schematica del dispositivo per tessuti di grandi dimensioni, dell'anello guida e dell'anello di supporto. Le sezioni di tessuto (marroni) vengono posizionate sul dispositivo sovradimensionato con l'anello guida inserito nella scanalatura sul bordo esterno del dispositivo. Utilizzando la guida, posizionare con cura l'anello di supporto rivestito con adesivo acrilico per tessuti sulla sezione di tessuto cardiaco. c Grafico che mostra il tempo di stimolazione elettrica in funzione della pressione della camera d'aria controllata da un attuatore pneumatico programmabile (PPD). È stato utilizzato un dispositivo di acquisizione dati per sincronizzare la stimolazione elettrica tramite sensori di pressione. Quando la pressione nella camera di coltura raggiunge la soglia impostata, un segnale a impulsi viene inviato al C-PACE-EM per attivare la stimolazione elettrica. d Immagine di quattro CTCM posizionati su un ripiano dell'incubatrice. Quattro dispositivi sono collegati a un PPD tramite un circuito pneumatico e sensori di pressione sono inseriti nella valvola emostatica per monitorare la pressione nel circuito pneumatico. Ogni dispositivo contiene sei sezioni di tessuto.
Utilizzando un singolo attuatore pneumatico, siamo stati in grado di controllare 4 dispositivi CTCM, ciascuno dei quali poteva contenere 6 sezioni di tessuto (Fig. 1d). Nel CTCM, la pressione dell'aria nella camera d'aria viene convertita in pressione sincrona nella camera del fluido e induce l'espansione fisiologica della fetta di cuore (Figura 2a e Filmato supplementare 1). Valutazione dell'allungamento del tessuto a 80 mm Hg. L'art. ha mostrato un allungamento delle sezioni di tessuto del 25% (Fig. 2b). È stato dimostrato che questa percentuale di allungamento corrisponde a una lunghezza fisiologica del sarcomero di 2,2-2,3 µm per la normale contrattilità della sezione cardiaca17,19,25. Il movimento del tessuto è stato valutato utilizzando impostazioni personalizzate della telecamera (Figura supplementare 1). L'ampiezza e la velocità del movimento del tessuto (Fig. 2c, d) corrispondevano all'allungamento durante il ciclo cardiaco e al tempo durante la sistole e la diastole (Fig. 2b). L'allungamento e la velocità del tessuto cardiaco durante la contrazione e il rilassamento sono rimasti costanti per 12 giorni in coltura (Fig. 2f). Per valutare l'effetto della stimolazione elettrica sulla contrattilità durante la coltura, abbiamo sviluppato un metodo per determinare la deformità attiva utilizzando un algoritmo di ombreggiatura (Fig. 2a, b supplementari) e siamo stati in grado di distinguere tra deformità con e senza stimolazione elettrica. La stessa sezione del cuore (Fig. 2f). Nella regione mobile del taglio (R6-9), la tensione durante la stimolazione elettrica era superiore del 20% rispetto all'assenza di stimolazione elettrica, il che indica il contributo della stimolazione elettrica alla funzione contrattile.
Tracce rappresentative della pressione della camera d'aria, della pressione della camera del fluido e delle misurazioni del movimento dei tessuti confermano che la pressione della camera modifica la pressione della camera del fluido, causando un movimento corrispondente della fetta di tessuto. b Tracce rappresentative della percentuale di allungamento (blu) delle sezioni di tessuto corrispondenti alla percentuale di allungamento (arancione). c Il movimento misurato della fetta cardiaca è coerente con la velocità di movimento misurata. (d) Traiettorie rappresentative del movimento ciclico (linea blu) e della velocità (linea tratteggiata arancione) in una fetta del cuore. e Quantificazione del tempo di ciclo (n = 19 fette per gruppo, da maiali diversi), tempo di contrazione (n = 19 fette per gruppo), tempo di rilassamento (n = 19 fette per gruppo, da maiali diversi), movimento dei tessuti (n = 25 fette)/gruppo da maiali diversi), velocità sistolica di picco (n = 24(D0), 25(D12) fette/gruppo da maiali diversi) e velocità di rilassamento di picco (n=24(D0), 25(D12) fette/gruppo da maiali diversi). Il test t di Student a due code non ha mostrato differenze significative in alcun parametro. f Tracce rappresentative dell'analisi della deformazione di sezioni di tessuto con (rosso) e senza (blu) stimolazione elettrica, dieci aree regionali di sezioni di tessuto della stessa sezione. I pannelli inferiori mostrano la quantificazione della differenza percentuale di deformazione nelle sezioni di tessuto con e senza stimolazione elettrica in dieci aree di sezioni diverse. (n = 8 fette/gruppo da maiali diversi, viene eseguito il test t di Student a due code; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 fette/gruppo da maiali diversi, viene eseguito il test t di Student a due code; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-criterio Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 sezioni/gruppo da maiali diversi, test t di Student a due code; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组,来自不同的猪,进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001,**p < 0,01,*p < 0,05）. （n = 8 片/组,来自不同的猪,进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001,**p < 0,01,*p < 0,05）. (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 sezioni/gruppo, da maiali diversi, test t di Student a due code; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Le barre di errore rappresentano la media ± deviazione standard.
Nel nostro precedente sistema di coltura biomimetica statica di fette di cuore [20, 21], abbiamo mantenuto la vitalità, la funzionalità e l'integrità strutturale delle fette di cuore per 6 giorni applicando la stimolazione elettrica e ottimizzando la composizione del terreno di coltura. Tuttavia, dopo 10 giorni, questi valori sono diminuiti drasticamente. Faremo riferimento alle sezioni coltivate nel nostro precedente sistema di coltura biomimetica statica 20, 21 in condizioni di controllo (Ctrl) e utilizzeremo il nostro terreno di coltura precedentemente ottimizzato come condizioni MC e coltura sotto stimolazione meccanica ed elettrica simultanea (CTCM). In primo luogo, abbiamo determinato che la stimolazione meccanica senza stimolazione elettrica era insufficiente a mantenere la vitalità del tessuto per 6 giorni (Fig. 3a, b supplementare). È interessante notare che, con l'introduzione della stimolazione fisiomeccanica ed elettrica utilizzando STCM, la vitalità delle sezioni di cuore a 12 giorni è rimasta la stessa delle sezioni di cuore fresco in condizioni MS, ma non in condizioni Ctrl, come mostrato dall'analisi MTT (Fig. 1). 3a). Ciò suggerisce che la stimolazione meccanica e la simulazione del ciclo cardiaco possono mantenere le sezioni di tessuto vitali per un tempo doppio rispetto a quanto riportato nel nostro precedente sistema di coltura statica. Tuttavia, la valutazione dell'integrità strutturale delle sezioni di tessuto mediante immunomarcatura della troponina T cardiaca e della connessina 43 ha mostrato che l'espressione della connessina 43 era significativamente più elevata nei tessuti di MC al giorno 12 rispetto ai controlli nello stesso giorno. Tuttavia, l'espressione uniforme della connessina 43 e la formazione del disco Z non sono state completamente mantenute (Fig. 3b). Utilizziamo un framework di intelligenza artificiale (IA) per quantificare l'integrità strutturale del tessuto26, una pipeline di deep learning basata su immagini basata sulla colorazione della troponina T e della connessina43 per quantificare automaticamente l'integrità strutturale e la fluorescenza delle sezioni di cuore in termini di intensità di localizzazione. Questo metodo utilizza una rete neurale convoluzionale (CNN) e un framework di deep learning per quantificare in modo affidabile l'integrità strutturale del tessuto cardiaco in modo automatizzato e imparziale, come descritto nel riferimento bibliografico. 26. Il tessuto di MC ha mostrato una migliore similarità strutturale al giorno 0 rispetto alle sezioni di controllo statiche. Inoltre, la colorazione tricromica di Masson ha rivelato una percentuale significativamente inferiore di fibrosi in condizioni di MS rispetto alle condizioni di controllo al 12° giorno di coltura (Fig. 3c). Sebbene la CTCM abbia aumentato la vitalità delle sezioni di tessuto cardiaco al 12° giorno a un livello simile a quello del tessuto cardiaco fresco, non ha migliorato significativamente l'integrità strutturale delle sezioni cardiache.
Un grafico a barre mostra la quantificazione della vitalità MTT delle fette di cuore fresche (D0) o delle fette di cuore coltivate per 12 giorni in coltura statica (D12 Ctrl) o in CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) fette/gruppo da suini diversi, viene eseguito il test ANOVA unidirezionale; ####p < 0,0001 rispetto a D0 e **p < 0,01 rispetto a D12 Ctrl). Un grafico a barre mostra la quantificazione della vitalità MTT delle fette di cuore fresche (D0) o delle fette di cuore coltivate per 12 giorni in coltura statica (D12 Ctrl) o in CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) fette/gruppo da suini diversi, viene eseguito il test ANOVA unidirezionale; ####p < 0,0001 rispetto a D0 e **p < 0,01 rispetto a D12 Ctrl).l'istogramma mostra la quantificazione della vitalità delle sezioni di cuore fresco MTT (D0) o della coltura di sezioni di cuore per 12 giorni in coltura statica (controllo D12) o CTCM (MC D12) (n = 18 (D0), 15 (controllo D12). ) ), 12 (MC D12) sezioni/gruppo da suini diversi, viene eseguito un test ANOVA unidirezionale;####p < 0,0001 по сравнению с D0 è **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 rispetto a D0 e **p < 0,01 rispetto a D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化), 来自不同猪的12 (D12 MC) 切foto/组,进行单向ANOVA 测试；与D0相比,####p < 0,0001, 与D12 Ctrl 相比,**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) , 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组, 进行单向ANOVA 测试；与D0 相比,####p < 0.0001,与D12 Ctrl 相比,**p。)istogramma che mostra la quantificazione della vitalità dell'MTT in sezioni di cuore fresco (D0) o sezioni di cuore coltivate per 12 giorni in coltura statica (controllo D12) o CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (controllo D12)), 12 (D12 MC) sezioni/gruppo da suini diversi, test ANOVA unidirezionale;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 rispetto a D0, **p < 0,01 rispetto a D12 Ctrl).b Troponina-T (verde), connessina 43 (rosso) e DAPI (blu) in sezioni cardiache appena isolate (D0) o sezioni cardiache coltivate in condizioni statiche (Ctrl) o condizioni CTCM (MC) per 12 giorni di immagini di immunofluorescenza rappresentative (scala vuota = 100 µm). Quantificazione mediante intelligenza artificiale dell'integrità strutturale del tessuto cardiaco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fette/gruppo ciascuna da maiali diversi, viene eseguito il test ANOVA unidirezionale; ####p < 0,0001 rispetto a D0 e ****p < 0,0001 rispetto a D12 Ctrl). Quantificazione mediante intelligenza artificiale dell'integrità strutturale del tessuto cardiaco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fette/gruppo ciascuna da maiali diversi, viene eseguito il test ANOVA unidirezionale; ####p < 0,0001 rispetto a D0 e ****p < 0,0001 rispetto a D12 Ctrl). Combinazione di strutture cinematografiche intelligenti (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, роводится однофакторный test ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 è ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Quantificazione dell'integrità strutturale del tessuto cardiaco mediante intelligenza artificiale (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sezioni/gruppi da suini diversi, eseguito test ANOVA unidirezionale; ####p < 0,0001 rispetto a D0 e ****p < 0,0001 rispetto a D12 Ctrl).n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fette/gruppo ciascuno di suini diversi, test ANOVA unidirezionale;####p < 0,0001 与D0相比,****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fette/gruppo ciascuno di suini diversi, test ANOVA unidirezionale;####p < 0,0001与D0相比,****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. Intellettuale di sicurezza per la combinazione di tasti di scelta rapida (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний test ANOVA; ####p <0,0001 rispetto a D0 per la risoluzione ****p < 0,0001 per la risoluzione con D12 Ctrl). Intelligenza artificiale per quantificare l'integrità strutturale del tessuto cardiaco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sezioni/gruppo di maiali diversi, test ANOVA unidirezionale; ####p<0,0001 vs .D0 Per confronto ****p < 0,0001 rispetto a D12 Ctrl). c Immagini rappresentative (sinistra) e quantificazione (destra) per fette di cuore colorate con la colorazione tricromica di Masson (scala nuda = 500 µm) (n = 10 fette/gruppo ciascuna da maiali diversi, viene eseguito il test ANOVA unidirezionale; ####p < 0,0001 rispetto a D0 e ***p < 0,001 rispetto a D12 Ctrl). c Immagini rappresentative (sinistra) e quantificazione (destra) per fette di cuore colorate con la colorazione tricromica di Masson (scala nuda = 500 µm) (n = 10 fette/gruppo ciascuna da maiali diversi, viene eseguito il test ANOVA unidirezionale; #### p < 0,0001 rispetto a D0 e ***p < 0,001 rispetto a D12 Ctrl). c Rappresentazione rappresentativa (sleva) e combinazione di colori (sprava) di seta, ocrashenных трихромным красителем Массона (maschtab без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/groppo di разных свиней, выполняется односторонний test ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Immagini rappresentative (sinistra) e quantificazione (destra) di sezioni cardiache colorate con la colorazione tricromica di Masson (scala non rivestita = 500 µm) (n = 10 sezioni/gruppo da maiali diversi, eseguito test ANOVA unidirezionale; #### p < 0,0001 rispetto a D0 e ***p < 0,001 rispetto a D12 Ctrl). c = 500 µm）（n = 10个切片/组,每组来自不同的猪,进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比,***p < 0.001 与D12 Ctrl相比）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切foto 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0.0001与D0 相比,***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Analisi rappresentativa (sleva) e analisi comparativa (sprava) del rapporto qualità/prezzo, triturazione visiva красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью analisi di dispersione del medico ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Immagini rappresentative (sinistra) e quantificazione (destra) di sezioni cardiache colorate con la colorazione tricromica di Masson (vuoto = 500 µm) (n = 10 sezioni/gruppo, ciascuna da un maiale diverso, testate mediante analisi della varianza unidirezionale; ### # p < 0,0001 rispetto a D0, ***p < 0,001 rispetto a D12 Ctrl).Le barre di errore rappresentano la media ± deviazione standard.
Abbiamo ipotizzato che l'aggiunta di piccole molecole al terreno di coltura potesse migliorare l'integrità dei cardiomiociti e ridurre lo sviluppo di fibrosi durante la coltura di CTCM. Abbiamo quindi effettuato lo screening per le piccole molecole utilizzando le nostre colture di controllo statiche20,21 a causa del numero limitato di fattori confondenti. Per questo screening sono stati scelti desametasone (Dex), triiodotironina (T3) e SB431542 (SB). Queste piccole molecole sono state precedentemente utilizzate nelle colture di hiPSC-CM per indurre la maturazione dei cardiomiociti aumentando la lunghezza del sarcomero, i tubuli T e la velocità di conduzione. Inoltre, sia il Dex (un glucocorticoide) che l'SB sono noti per sopprimere l'infiammazione29,30. Pertanto, abbiamo testato se l'inclusione di una o di una combinazione di queste piccole molecole avrebbe migliorato l'integrità strutturale delle sezioni cardiache. Per lo screening iniziale, la dose di ciascun composto è stata selezionata in base alle concentrazioni comunemente utilizzate nei modelli di coltura cellulare (1 μM di Dex27, 100 nM di T327 e 2,5 μM di SB31). Dopo 12 giorni di coltura, la combinazione di T3 e Dex ha determinato un'integrità strutturale ottimale dei cardiomiociti e un minimo rimodellamento fibroso (Figure supplementari 4 e 5). Inoltre, l'uso di concentrazioni doppie o doppie di T3 e Dex ha prodotto effetti deleteri rispetto alle concentrazioni normali (Figure supplementari 6a, b).
Dopo lo screening iniziale, abbiamo eseguito un confronto diretto di 4 condizioni di coltura (Figura 4a): Ctrl: sezioni cardiache coltivate nella nostra coltura statica precedentemente descritta utilizzando il nostro terreno ottimizzato; 20.21 TD: T3 e Ctrl aggiunti Dex mercoledì; MC: sezioni cardiache coltivate in CTCM utilizzando il nostro terreno precedentemente ottimizzato; e MT: CTCM con T3 e Dex aggiunti al terreno. Dopo 12 giorni di coltura, la vitalità dei tessuti MS e MT è rimasta la stessa dei tessuti freschi valutati mediante test MTT (Fig. 4b). È interessante notare che l'aggiunta di T3 e Dex alle colture transwell (TD) non ha comportato un miglioramento significativo della vitalità rispetto alle condizioni Ctrl, indicando un ruolo importante della stimolazione meccanica nel mantenimento della vitalità delle sezioni cardiache.
uno schema di progettazione sperimentale che illustra le quattro condizioni di coltura utilizzate per valutare gli effetti della stimolazione meccanica e dell'integrazione di T3/Dex sul terreno di coltura per 12 giorni. b Il grafico a barre mostra la quantificazione della vitalità 12 giorni dopo la coltura in tutte e 4 le condizioni di coltura (Ctrl, TD, MC e MT) rispetto alle fette di cuore fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC) fette/gruppo da suini diversi, viene eseguito il test ANOVA unidirezionale; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 rispetto a D0 e **p < 0,01 rispetto a D12 Ctrl). b Il grafico a barre mostra la quantificazione della vitalità 12 giorni dopo la coltura in tutte e 4 le condizioni di coltura (Ctrl, TD, MC e MT) rispetto alle fette di cuore fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC) fette/gruppo da suini diversi, viene eseguito il test ANOVA unidirezionale; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 rispetto a D0 e **p < 0,01 rispetto a D12 ctrl). b Il registro mostra la raccolta ogni volta che si desidera coltivare per 12 giorni dopo la coltivazione di tutti 4 istruzioni cultura (controllo, TD, MC e MT) per la creazione di diversi gruppi di comando (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, esegue il test ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 è **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Il grafico a barre mostra la quantificazione della vitalità a 12 giorni dalla coltura in tutte e 4 le condizioni di coltura (controllo, TD, MC e MT) rispetto alle sezioni di cuore fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC) sezioni/gruppo da suini diversi, test ANOVA unidirezionale; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 rispetto a D0 e **p < 0,01 rispetto a D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD和D12 MT),来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组,进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001,###p < 0.001 与D0 相比,**p < 0,01 与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Elenco completo di 4 opzioni culturali (controllo, TD, MC e MT) per la registrazione delle rispettive schede сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), dalla sezione 12 (D12 MC) del test/gruppi, test ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 per la regolazione con D0, **p <0,01 per la regolazione con D12). b Istogramma che mostra tutte e 4 le condizioni di coltura (controllo, TD, MC e MT) confrontate con sezioni di cuore fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), da suini diversi 12 (D12 MC) sezioni/gruppo, test ANOVA unidirezionale; ####p<0,0001, ###p<0,001 rispetto a D0, **p<0,01 rispetto al controllo D12). c Il grafico a barre mostra la quantificazione del flusso di glucosio 12 giorni dopo la coltura in tutte e 4 le condizioni di coltura (Ctrl, TD, MC e MT) rispetto alle fette di cuore fresco (D0) (n = 6 fette/gruppo da suini diversi, viene eseguito il test ANOVA unidirezionale; ###p < 0,001, rispetto a D0 e ***p < 0,001 rispetto a D12 Ctrl). c Il grafico a barre mostra la quantificazione del flusso di glucosio 12 giorni dopo la coltura in tutte e 4 le condizioni di coltura (Ctrl, TD, MC e MT) rispetto alle fette di cuore fresco (D0) (n = 6 fette/gruppo da suini diversi, viene eseguito il test ANOVA unidirezionale; ###p < 0,001, rispetto a D0 e ***p < 0,001 rispetto a D12 Ctrl). c Il registro contiene la raccolta degli zuccheri ogni 12 giorni dopo la coltivazione di tutti 4 условиях coltivazione (controllo, TD, MC e MT) per la selezione dei risultati di serie (D0) (n = 6 selezioni/gruppi di combinazioni свиней, односторонний Viene utilizzato il test ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 è ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c L'istogramma mostra la quantificazione del flusso di glucosio 12 giorni dopo la coltura in tutte e 4 le condizioni di coltura (controllo, TD, MC e MT) rispetto alle sezioni di cuore fresco (D0) (n = 6 sezioni/gruppo da suini diversi, eseguito test ANOVA unidirezionale; ###p < 0,001 rispetto a D0 e ***p < 0,001 rispetto a D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切foto(D0) 相比,培养后12天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组,来自不同猪,单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001,与D0 相比,***p < 0,001与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切foto 切foto 切foto 相比, 培养后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比,***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Impostazione della dieta per la cottura di 12 giorni dopo la coltivazione tutto 4 coltivazione (controllo, TD, MC e MT) per la selezione dei risultati di serie (D0) (n = 6 selezioni/gruppi, dalla selezione сviney, односторонний Были test provati ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (controllo). c Istogramma che mostra la quantificazione del flusso di glucosio a 12 giorni dalla coltura per tutte e 4 le condizioni di coltura (controllo, TD, MC e MT) rispetto alle sezioni di cuore fresco (D0) (n = 6 sezioni/gruppo, da suini diversi, sono stati eseguiti test ANOVA unilaterali, ###p < 0,001 rispetto a D0, ***p < 0,001 rispetto a D12 (controllo).d Grafici di analisi del ceppo di tessuti freschi (blu), MC al giorno 12 (verde) e MT al giorno 12 (rosso) in dieci punti di sezione tissutale regionale (n = 4 fette/gruppo, test ANOVA a un fattore; non vi era alcuna differenza significativa tra i gruppi). e Grafico a vulcano che mostra i geni differenzialmente espressi nelle sezioni di cuore fresche (D0) rispetto alle sezioni di cuore coltivate in condizioni statiche (Ctrl) o in condizioni MT (MT) per 10-12 giorni. f Mappa di calore dei geni del sarcomero per le sezioni di cuore coltivate in ciascuna delle condizioni di coltura. Le barre di errore rappresentano la media ± deviazione standard.
La dipendenza metabolica dal passaggio dall'ossidazione degli acidi grassi alla glicolisi è un segno distintivo della dedifferenziazione dei cardiomiociti. I cardiomiociti immaturi utilizzano principalmente il glucosio per la produzione di ATP e presentano mitocondri ipoplastici con poche creste5,32. Le analisi dell'utilizzo del glucosio hanno mostrato che in condizioni di MC e MT, l'utilizzo del glucosio era simile a quello nei tessuti del giorno 0 (Figura 4c). Tuttavia, i campioni Ctrl hanno mostrato un aumento significativo nell'utilizzo del glucosio rispetto al tessuto fresco. Ciò indica che la combinazione di CTCM e T3/Dex migliora la vitalità tissutale e preserva il fenotipo metabolico delle sezioni cardiache coltivate a 12 giorni. Inoltre, l'analisi dello strain ha mostrato che i livelli di strain sono rimasti gli stessi del tessuto cardiaco fresco per 12 giorni in condizioni di MT e MS (Fig. 4d).
Per analizzare l'impatto complessivo di CTCM e T3/Dex sul panorama trascrizionale globale del tessuto cardiaco a fettine, abbiamo eseguito l'RNAseq su fettine cardiache provenienti da tutte e quattro le diverse condizioni di coltura (Dati Supplementari 1). È interessante notare che le sezioni MT hanno mostrato un'elevata similarità trascrizionale con il tessuto cardiaco fresco, con solo 16 geni differenzialmente espressi su 13.642. Tuttavia, come mostrato in precedenza, le sezioni Ctrl hanno mostrato 1229 geni differenzialmente espressi dopo 10-12 giorni di coltura (Fig. 4e). Questi dati sono stati confermati dalla qRT-PCR dei geni cardiaci e dei fibroblasti (Figure Supplementari 7a-c). È interessante notare che le sezioni Ctrl hanno mostrato una downregulation dei geni cardiaci e del ciclo cellulare e l'attivazione di programmi genici infiammatori. Questi dati suggeriscono che la dedifferenziazione, che normalmente si verifica dopo una coltura a lungo termine, è completamente attenuata in condizioni di MT (Figure Supplementari 8a,b). Uno studio approfondito dei geni del sarcomero ha dimostrato che solo in condizioni di MT i geni che codificano per il sarcomero (Fig. 4f) e il canale ionico (Fig. 9 supplementare) vengono preservati, proteggendoli dalla soppressione in condizioni di Ctrl, TD e MC. Questi dati dimostrano che con una combinazione di stimolazione meccanica e umorale (T3/Dex), il trascrittoma delle fette di cuore può rimanere simile a quello delle fette di cuore fresche dopo 12 giorni di coltura.
Questi risultati trascrizionali sono supportati dal fatto che l'integrità strutturale dei cardiomiociti nelle sezioni cardiache è meglio preservata in condizioni di MT per 12 giorni, come dimostrato dalla connessina 43 intatta e localizzata (Fig. 5a). Inoltre, la fibrosi nelle sezioni cardiache in condizioni di MT è risultata significativamente ridotta rispetto a Ctrl e simile a quella delle sezioni cardiache fresche (Fig. 5b). Questi dati dimostrano che la combinazione di stimolazione meccanica e trattamento con T3/Dex preserva efficacemente la struttura cardiaca nelle sezioni cardiache in coltura.
a Immagini rappresentative di immunofluorescenza di troponina-T (verde), connessina 43 (rosso) e DAPI (blu) in sezioni di cuore appena isolate (D0) o coltivate per 12 giorni in tutte e quattro le condizioni di coltura della sezione cardiaca (barra della scala = 100 µm). ). Quantificazione mediante intelligenza artificiale dell'integrità strutturale del tessuto cardiaco (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) fette/gruppo da maiali diversi, viene eseguito il test ANOVA unidirezionale; ####p < 0,0001 rispetto a D0 e *p < 0,05, o ****p < 0,0001 rispetto a D12 Ctrl). Quantificazione mediante intelligenza artificiale dell'integrità strutturale del tessuto cardiaco (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) fette/gruppo da maiali diversi, viene eseguito un test ANOVA unidirezionale; #### p < 0,0001 rispetto a D0 e *p < 0,05, o ****p < 0,0001 rispetto a D12 Ctrl). Combinazione di opzioni per la struttura della scheda telefonica (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) test/gruppo di lavoro di origine animale, test ANOVA testato; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 è *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Quantificazione dell'integrità strutturale del tessuto cardiaco mediante intelligenza artificiale (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) sezioni/gruppo da maiali diversi, eseguito test ANOVA unidirezionale; #### p < 0,0001 rispetto a D0 e *p < 0,05 o ****p < 0,0001 rispetto a D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化,进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比,或****p < 0.0001与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组） ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比,或****p < 0.0001与D12Ctrl 相比）.Quantificazione dell'integrità strutturale del tessuto cardiaco mediante intelligenza artificiale in diversi suini (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) sezioni/gruppo) con un test ANOVA unidirezionale;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 è *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 rispetto a D0 e *p < 0,05 o ****p < 0,0001 rispetto a D12 Ctrl). b Immagini rappresentative e quantificazione per fette di cuore colorate con la colorazione tricromica di Masson (barra della scala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) fette/gruppo da maiali diversi, viene eseguito il test ANOVA unidirezionale; ####p < 0,0001 rispetto a D0 e ***p < 0,001, o ****p < 0,0001 rispetto a D12 Ctrl). b Immagini rappresentative e quantificazione per fette di cuore colorate con la colorazione tricromica di Masson (barra della scala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) fette/gruppo da maiali diversi, viene eseguito il test ANOVA unidirezionale; ####p < 0,0001 rispetto a D0 e ***p < 0,001, o ****p < 0,0001 rispetto a D12 Ctrl). b Rappresentazione rappresentativa e concentrazione di olio di semi di girasole, ocrashenny trихромным krasitelem Massonem (linea di linea = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 è ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 tramite D12 Ctrl). b Immagini rappresentative e quantificazione delle sezioni cardiache colorate con la colorazione tricromica di Masson (scala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) sezioni/gruppo da maiali diversi, eseguita ANOVA unidirezionale; ####p < 0,0001 rispetto a D0 e ***p < 0,001 o ****p < 0,0001 rispetto a D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切foto的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MC）,来自不同猪的9 个（D12 MT）切foto/组,进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比,***p < 0.001,或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切foto 切foto 切foto 切foto 切foto 切foto 切foto 切foto 切foto ####p < 0.0001 与D0相比,***p < 0,001,或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b Rappresentazione rappresentativa e combinazione di colori d'oro, ocrashenных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Immagini rappresentative e quantificazione delle sezioni cardiache colorate con tricromica di Masson (scala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) sezioni da suini/gruppi diversi, un metodo ANOVA; ####p < 0,0001 rispetto a D0, ***p < 0,001 o ****p < 0,0001 rispetto a D12 Ctrl).Le barre di errore rappresentano la media ± deviazione standard.
Infine, la capacità del CTCM di imitare l'ipertrofia cardiaca è stata valutata aumentando lo stiramento del tessuto cardiaco. Nel CTCM, la pressione di picco della camera d'aria è aumentata da 80 mmHg a 80 mmHg (stiramento normale) fino a 140 mmHg (Fig. 6a). Ciò corrisponde a un aumento del 32% dello stiramento (Fig. 6b), precedentemente mostrato come la percentuale corrispondente di stiramento necessaria alle sezioni di cuore per raggiungere una lunghezza del sarcomero simile a quella osservata nell'ipertrofia. Lo stiramento e la velocità del tessuto cardiaco durante la contrazione e il rilassamento sono rimasti costanti durante i sei giorni di coltura (Fig. 6c). Il tessuto cardiaco proveniente da condizioni MT è stato sottoposto a stiramento normale (MT (Normale)) o a condizioni di stiramento eccessivo (MT (OS)) per sei giorni. Già dopo quattro giorni di coltura, il biomarcatore ipertrofico NT-ProBNP era significativamente elevato nel terreno di coltura in condizioni MT (OS) rispetto alle condizioni MT (normali) (Fig. 7a). Inoltre, dopo sei giorni di coltura, le dimensioni cellulari nel cuore di MT (OS) (Fig. 7b) sono aumentate significativamente rispetto alle sezioni di cuore di MT (normali). Anche la traslocazione nucleare di NFATC4 è risultata significativamente aumentata nei tessuti sottoposti a iperdistensione (Fig. 7c). Questi risultati mostrano il progressivo sviluppo di rimodellamento patologico dopo iperdistensione e supportano l'idea che il dispositivo CTCM possa essere utilizzato come piattaforma per studiare la segnalazione dell'ipertrofia cardiaca indotta da stiramento.
Tracce rappresentative della pressione della camera d'aria, della pressione della camera del fluido e delle misurazioni del movimento dei tessuti confermano che la pressione della camera modifica la pressione della camera del fluido, causando un movimento corrispondente della fetta di tessuto. b Curve rappresentative della percentuale di allungamento e della velocità di allungamento per sezioni di tessuto normalmente allungate (arancioni) e sovra allungate (blu). c Grafico a barre che mostra il tempo del ciclo (n = 19 fette per gruppo, da maiali diversi), il tempo di contrazione (n = 18-19 fette per gruppo, da maiali diversi), il tempo di rilassamento (n = 19 fette per gruppo, da maiali diversi), l'ampiezza del movimento del tessuto (n = 14 fette/gruppo, da maiali diversi), la velocità sistolica di picco (n = 14 fette/gruppo, da maiali diversi) e la velocità di rilassamento di picco (n = 14 (D0), 15 (D6) sezioni/gruppi) da maiali diversi), il test t di Student a due code non ha mostrato differenze significative in alcun parametro, indicando che questi parametri sono rimasti costanti durante 6 giorni di coltura con sovratensione. Le barre di errore rappresentano la media ± deviazione standard.
Quantificazione mediante grafico a barre della concentrazione di NT-ProBNP nei terreni di coltura ottenuti da fette di cuore coltivate in condizioni di allungamento normale (Norm) o di allungamento eccessivo (OS) MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm e D4 MTOS) fette/gruppo da maiali diversi, è stata eseguita un'ANOVA bidirezionale; **p < 0,01 rispetto all'allungamento normale). Quantificazione mediante grafico a barre della concentrazione di NT-ProBNP nei terreni di coltura ottenuti da fette di cuore coltivate in condizioni di allungamento normale (Norm) o di allungamento eccessivo (OS) MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm e D4 MTOS) fette/gruppo da maiali diversi, è stata eseguita un'ANOVA bidirezionale; **p < 0,01 rispetto all'allungamento normale).Istogramma quantitativo della concentrazione di NT-ProBNP nel terreno di coltura da fette di cuore coltivate in condizioni di normale allungamento MT (norm) o di sovraallungamento (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm e D4).MTOS) fette/gruppo da suini diversi, è stata eseguita un'analisi della varianza a due fattori;**p < 0,01 rispetto alla prestazione normale). **p < 0,01 rispetto allo stretching normale). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切foto/组,进行双向方差分析；**与正常拉伸相比, p < 0,01） a Quantificazione della concentrazione di NT-ProBNP in fettine cardiache coltivate in condizioni di allungamento normale (Norma) o allungamento eccessivo (OS) MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) da diversi 猪的切片/组,可以双向方方发发动; **rispetto allo stretching normale, p < 0,01).istogramma Quantificazione delle concentrazioni di NT-ProBNP nelle fette di cuore coltivate in condizioni di normale allungamento MT (norm) o sovraallungamento (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) e D4 MTOS) fette/gruppo da suini diversi, analisi della varianza bidirezionale;**p < 0,01 rispetto alla prestazione normale). **p < 0,01 rispetto allo stretching normale). b Immagini rappresentative per fette di cuore colorate con troponina T e WGA (sinistra) e quantificazione delle dimensioni delle cellule (destra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellule/gruppo da 10 fette diverse da maiali diversi, è stato eseguito il test t di Student a due code; ****p < 0,0001 rispetto allo stretching normale). b Immagini rappresentative per fette di cuore colorate con troponina T e WGA (sinistra) e quantificazione delle dimensioni delle cellule (destra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellule/gruppo da 10 fette diverse da maiali diversi, è stato eseguito il test t di Student a due code; ****p < 0,0001 rispetto allo stretching normale). b Rappresentazione dell'immagine del gioco, del troponino visivo-Т e АЗП (sleva) e della composizione adattamento della dimensione del gancio (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) kletok/groppup из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-criterio Стьюдента ****p < 0,0001 по растяжением). b Immagini rappresentative di sezioni cardiache colorate con troponina T e AZP (sinistra) e quantificazione delle dimensioni delle cellule (destra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellule/gruppo da 10 sezioni diverse da maiali diversi, è stato eseguito il test t di Student a due code; ****p < 0,0001 rispetto al ceppo normale). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS）,来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组,两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比,****p < 0.0001）. b Immagini rappresentative di fette di cuore colorate con calcareina-T e WGA (sinistra) e dimensioni delle cellule (destra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 da 10 fette diverse (D6 MTNorm)) Cellule/Test t, confronto con allungamento normale, ****p < 0,0001). b Rappresentazione rappresentativa del segnale, del troponino visivo-Т e АЗП (sleva) e della collina размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) su 10 diversi tipi di cavi/gruppi, criteri di protezione Studente; ****p < 0,0001 rispetto alla norma (probabilmente si riferisce a qualcuno che ha già un'esperienza con noi). b Immagini rappresentative di sezioni cardiache colorate con troponina-T e AZP (sinistra) e quantificazione delle dimensioni delle cellule (destra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) da 10 sezioni diverse da maiali diversi) Cellule/gruppo, criterio a due code t di Student; ****p < 0,0001 rispetto al ceppo normale). c Immagini rappresentative per le fette di cuore MTOS del giorno 0 e del giorno 6 immunomarcate per troponina-T e NFATC4 e quantificazione della traslocazione di NFATC4 nei nuclei dei CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fette/gruppo da maiali diversi, viene eseguito il test t di Student a due code; *p < 0,05). c Immagini rappresentative per le fette di cuore MTOS del giorno 0 e del giorno 6 immunomarcate per troponina-T e NFATC4 e quantificazione della traslocazione di NFATC4 nei nuclei dei CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fette/gruppo da maiali diversi, viene eseguito il test t di Student a due code; *p < 0,05). c Immagine rappresentativa per la sequenza di rendimento da 0 a 6 giorni MTOS, immunitaria per la troponina-T e NFATC4, e количественная оценка транслокации NFATC4 in ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-criterio Стьюдента *p < 0,05). c Immagini rappresentative per sezioni cardiache a 0 e 6 giorni MTOS, immunomarcate per troponina-T e NFATC4 e quantificazione della traslocazione di NFATC4 nel nucleo delle cellule cavernose (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fette/gruppo da maiali diversi) hanno eseguito il test t di Student a due code; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像,以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0.05)。 c Immagini rappresentative di fettine cardiache immunomarcate con calcanina-T e NFATC4 第0天和第6天MTOS e NFATC4 da diverse quantità di nuclei cellulari NFATC4 易位至CM的 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组,时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Rappresentazione dell'immagine del valore MTOS da 0 a 6 giorni per l'immunodeficienza troponino-T e NFATC4 e количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-criteriй Стьюдента; *p < 0,05). c Immagini rappresentative di fette di cuore MTOS al giorno 0 e 6 per l'immunomarcatura della troponina T e NFATC4 e quantificazione della traslocazione di NFATC4 nel nucleo del CM da diversi maiali (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fette/gruppo, criterio t a due code di Student; *p < 0,05).Le barre di errore rappresentano la media ± la deviazione standard.
La ricerca cardiovascolare traslazionale richiede modelli cellulari che riproducano accuratamente l'ambiente cardiaco. In questo studio, è stato sviluppato e caratterizzato un dispositivo CTCM in grado di stimolare sezioni ultrasottili del cuore. Il sistema CTCM include una stimolazione elettromeccanica fisiologicamente sincronizzata e l'arricchimento dei fluidi T3 e Dex. Quando le sezioni di cuore suino sono state esposte a questi fattori, la loro vitalità, integrità strutturale, attività metabolica ed espressione trascrizionale sono rimaste le stesse del tessuto cardiaco fresco dopo 12 giorni di coltura. Inoltre, un eccessivo allungamento del tessuto cardiaco può causare ipertrofia cardiaca causata da iperestensione. Nel complesso, questi risultati supportano il ruolo cruciale delle condizioni fisiologiche di coltura nel mantenimento di un fenotipo cardiaco normale e forniscono una piattaforma per lo screening farmacologico.
Molti fattori contribuiscono a creare un ambiente ottimale per il funzionamento e la sopravvivenza dei cardiomiociti. I più evidenti di questi fattori sono correlati a (1) interazioni intercellulari, (2) stimolazione elettromeccanica, (3) fattori umorali e (4) substrati metabolici. Le interazioni fisiologiche cellula-cellula richiedono complesse reti tridimensionali di molteplici tipi cellulari supportate da una matrice extracellulare. Tali complesse interazioni cellulari sono difficili da ricostruire in vitro mediante co-coltura di singoli tipi cellulari, ma possono essere facilmente ottenute utilizzando la natura organotipica delle sezioni cardiache.
Lo stiramento meccanico e la stimolazione elettrica dei cardiomiociti sono fondamentali per il mantenimento del fenotipo cardiaco33,34,35. Sebbene la stimolazione meccanica sia stata ampiamente utilizzata per il condizionamento e la maturazione di hiPSC-CM, diversi studi di pregio hanno recentemente tentato la stimolazione meccanica di fette di cuore in coltura utilizzando un carico monoassiale. Questi studi dimostrano che il carico meccanico monoassiale 2D ha un effetto positivo sul fenotipo cardiaco durante la coltura. In questi studi, le sezioni del cuore sono state caricate con forze di trazione isometriche17, con un carico auxotonico lineare18, oppure il ciclo cardiaco è stato ricreato utilizzando il feedback del trasduttore di forza e azionamenti di tensione. Tuttavia, questi metodi utilizzano lo stiramento tissutale monoassiale senza ottimizzazione ambientale, con conseguente soppressione di molti geni cardiaci o sovraespressione di geni associati a risposte anomale allo stiramento. La CTCM qui descritta fornisce uno stimolo elettromeccanico tridimensionale che imita il ciclo cardiaco naturale in termini di durata del ciclo e allungamento fisiologico (25% allungamento, 40% sistole, 60% diastole e 72 battiti al minuto). Sebbene questa stimolazione meccanica tridimensionale da sola non sia sufficiente a mantenere l'integrità tissutale, è necessaria una combinazione di stimolazione umorale e meccanica con T3/Dex per preservare adeguatamente la vitalità, la funzionalità e l'integrità dei tessuti.
I fattori umorali svolgono un ruolo importante nella modulazione del fenotipo cardiaco adulto. Ciò è stato evidenziato negli studi HiPS-CM in cui T3 e Dex sono stati aggiunti ai terreni di coltura per accelerare la maturazione cellulare. T3 può influenzare il trasporto di aminoacidi, zuccheri e calcio attraverso le membrane cellulari36. Inoltre, T3 promuove l'espressione di MHC-α e la downregulation di MHC-β, favorendo la formazione di miofibrille a contrazione rapida nei cardiomiociti maturi rispetto alle miofibrille a contrazione lenta nei cardiomiociti fetali. La carenza di T3 nei pazienti ipotiroidei provoca la perdita delle bande miofibrillari e una riduzione della velocità di sviluppo del tono37. Dex agisce sui recettori dei glucocorticoidi e ha dimostrato di aumentare la contrattilità miocardica nei cuori isolati perfusi;38 si ritiene che questo miglioramento sia correlato all'effetto sull'ingresso guidato dal deposito di calcio (SOCE)39,40. Inoltre, il Dex si lega ai suoi recettori, provocando un'ampia risposta intracellulare che sopprime la funzione immunitaria e l'infiammazione30.
I nostri risultati indicano che la stimolazione fisico-meccanica (MS) ha migliorato le prestazioni complessive della coltura rispetto a Ctrl, ma non è riuscita a mantenere la vitalità, l'integrità strutturale e l'espressione cardiaca per oltre 12 giorni di coltura. Rispetto a Ctrl, l'aggiunta di T3 e Dex alle colture CTCM (MT) ha migliorato la vitalità e mantenuto profili di trascrizione, integrità strutturale e attività metabolica simili con tessuto cardiaco fresco per 12 giorni. Inoltre, controllando il grado di allungamento del tessuto, è stato creato un modello di ipertrofia cardiaca indotta da iperestensione utilizzando STCM, a dimostrazione della versatilità del sistema STCM. È opportuno notare che, sebbene il rimodellamento cardiaco e la fibrosi coinvolgano solitamente organi intatti, le cui cellule circolanti possono fornire le citochine appropriate, nonché la fagocitosi e altri fattori di rimodellamento, alcune sezioni del cuore possono comunque imitare il processo fibrotico in risposta a stress e traumi, trasformandosi in miofibroblasti. Questo è stato precedentemente valutato in questo modello di fetta cardiaca. È importante notare che i parametri del CTCM possono essere modulati modificando la pressione/ampiezza elettrica e la frequenza per simulare numerose condizioni come tachicardia, bradicardia e supporto circolatorio meccanico (cuore meccanico senza carico). Questo rende il sistema di media produttività per i test farmacologici. La capacità del CTCM di modellare l'ipertrofia cardiaca indotta da sforzo eccessivo apre la strada alla sperimentazione di questo sistema per la terapia personalizzata. In conclusione, il presente studio dimostra che lo stiramento meccanico e la stimolazione umorale sono fondamentali per il mantenimento della coltura delle sezioni di tessuto cardiaco.
Sebbene i dati qui presentati suggeriscano che la CTCM sia una piattaforma molto promettente per la modellazione del miocardio intatto, questo metodo di coltura presenta alcune limitazioni. La principale limitazione della coltura CTCM è che impone continui stress meccanici dinamici alle fette, il che preclude la possibilità di monitorare attivamente le contrazioni cardiache delle fette durante ogni ciclo. Inoltre, a causa delle piccole dimensioni delle sezioni cardiache (7 mm), la capacità di valutare la funzione sistolica al di fuori dei sistemi di coltura utilizzando i tradizionali sensori di forza è limitata. Nel presente manoscritto, superiamo parzialmente questa limitazione valutando il voltaggio ottico come indicatore della funzione contrattile. Tuttavia, questa limitazione richiederà ulteriori studi e potrebbe essere affrontata in futuro introducendo metodi per il monitoraggio ottico della funzione delle fette cardiache in coltura, come la mappatura ottica utilizzando coloranti sensibili al calcio e al voltaggio. Un'altra limitazione della CTCM è che il modello di lavoro non manipola lo stress fisiologico (precarico e postcarico). Nella CTCM, la pressione veniva indotta in direzioni opposte per riprodurre un allungamento fisiologico del 25% in diastole (allungamento completo) e sistole (durata della contrazione durante la stimolazione elettrica) in tessuti molto grandi. Questa limitazione dovrebbe essere eliminata nei futuri progetti di CTCM applicando una pressione adeguata sul tessuto cardiaco da entrambi i lati e applicando le esatte relazioni pressione-volume che si verificano nelle camere cardiache.
Il rimodellamento indotto da iperallungamento riportato in questo manoscritto si limita a mimare i segnali di iperallungamento ipertrofico. Pertanto, questo modello può essere utile nello studio della segnalazione ipertrofica indotta da allungamento senza la necessità di fattori umorali o neurali (che non sono presenti in questo sistema). Sono necessari ulteriori studi per aumentare la molteplicità della CTCM, ad esempio, la co-coltura con cellule immunitarie, fattori umorali circolanti nel plasma e l'innervazione in caso di co-coltura con cellule neuronali miglioreranno le possibilità di modellazione della malattia con CTCM.
In questo studio sono stati utilizzati tredici maiali. Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali e approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Utilizzo degli Animali dell'Università di Louisville. L'arco aortico è stato clampato e il cuore è stato perfuso con 1 L di cardioplegia sterile (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl₂, 16 mM KCl, 16 mM MgCl₂, 10 mM NaHCO₂, 5 U/mL eparina, pH fino a 7,4); i cuori venivano conservati in una soluzione cardioplegica ghiacciata fino al trasporto in laboratorio su ghiaccio, solitamente per <10 minuti. i cuori venivano conservati in una soluzione cardioplegica ghiacciata fino al trasporto in laboratorio su ghiaccio, solitamente per <10 minuti. un lavoratore cardiovascolare in un centro di lavoro cardioplegico per i trasporti in un laboratorio a casa, che è ovvio si accende <10 minuti. i cuori venivano conservati in una soluzione cardioplegica ghiacciata fino al trasporto in laboratorio sotto ghiaccio, operazione che solitamente richiede meno di 10 minuti.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟. Prestare attenzione alla cardioplegia lesionale per il trasporto in laboratorio a domicilio, preferibilmente <10 minuti. Mantenere i cuori sotto ghiaccio per cardioplegia fino al trasporto in laboratorio sotto ghiaccio, solitamente <10 min.
Il dispositivo CTCM è stato sviluppato con il software di progettazione assistita da computer (CAD) SolidWorks. Le camere di coltura, i divisori e le camere d'aria sono realizzati in plastica acrilica trasparente lavorata a CNC. L'anello di supporto di 7 mm di diametro è realizzato in polietilene ad alta densità (HDPE) al centro e presenta una scanalatura per l'O-ring in silicone utilizzato per sigillare il terreno sottostante. Una sottile membrana di silice separa la camera di coltura dalla piastra di separazione. La membrana in silicone è tagliata al laser da un foglio di silicone spesso 0,02" e ha una durezza di 35A. Le guarnizioni in silicone inferiore e superiore sono tagliate al laser da un foglio di silicone spesso 1/16" e hanno una durezza di 50A. Viti e dadi ad alette in acciaio inossidabile 316L vengono utilizzati per fissare il blocco e creare una tenuta ermetica.
Un circuito stampato (PCB) dedicato è progettato per essere integrato con il sistema C-PACE-EM. Le prese del connettore Swiss Machine sul PCB sono collegate agli elettrodi di grafite tramite fili di rame argentati e viti in bronzo 0-60 avvitate agli elettrodi. Il circuito stampato è alloggiato nel coperchio della stampante 3D.
Il dispositivo CTCM è controllato da un attuatore pneumatico programmabile (PPD) che crea una pressione circolatoria controllata simile a quella di un ciclo cardiaco. All'aumentare della pressione all'interno della camera d'aria, la membrana flessibile in silicone si espande verso l'alto, spingendo il fluido sotto il sito di iniezione. L'area di tessuto verrà quindi stirata da questa espulsione di fluido, simulando la fisiologica espansione del cuore durante la diastole. Al culmine del rilassamento, è stata applicata una stimolazione elettrica tramite elettrodi di grafite, che ha ridotto la pressione nella camera d'aria e causato la contrazione delle sezioni di tessuto. All'interno del tubo è presente una valvola emostatica con un sensore di pressione per rilevare la pressione nel sistema di ventilazione. La pressione rilevata dal sensore di pressione viene trasmessa a un amplificatore di dati collegato al computer portatile. Ciò consente il monitoraggio continuo della pressione all'interno della camera a gas. Al raggiungimento della pressione massima della camera (standard 80 mmHg, 140 mmHg OS), il dispositivo di acquisizione dati ha ricevuto l'ordine di inviare un segnale al sistema C-PACE-EM per generare un segnale di tensione bifasico per 2 ms, impostato a 4 V.
Sono state ottenute sezioni cardiache e le condizioni di coltura in 6 pozzetti sono state eseguite come segue: trasferire i cuori prelevati dal recipiente di trasferimento a un vassoio contenente cardioplegia fredda (4 °C). Il ventricolo sinistro è stato isolato con una lama sterile e tagliato in pezzi di 1-2 cm3. Questi blocchi di tessuto sono stati attaccati a supporti tissutali con adesivo tissutale e posizionati in un bagno per tessuti al microtomo vibrante contenente soluzione di Tyrode e ossigenato continuamente (3 g/L 2,3-butandione monoossima (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glucosio (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml soluzione 1 M), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml soluzione 1 M), fino a 1 L ddH2O). Il microtomo vibrante è stato impostato per tagliare fette di 300 µm di spessore a una frequenza di 80 Hz, un'ampiezza di vibrazione orizzontale di 2 mm e una velocità di avanzamento di 0,03 mm/s. Il bagno di tessuto è stato circondato da ghiaccio per mantenere la soluzione fredda e la temperatura è stata mantenuta a 4 °C. Trasferire le sezioni di tessuto dal bagno del microtomo a un bagno di incubazione contenente soluzione Tyrode ossigenata in continuo su ghiaccio fino a ottenere sezioni sufficienti per una piastra di coltura. Per le colture transwell, le sezioni di tessuto sono state fissate a supporti sterili in poliuretano larghi 6 mm e posizionate in 6 ml di terreno ottimizzato (terreno 199, 1x supplemento ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alcalino e 2X antibiotico-antimicotico). La stimolazione elettrica (10 V, frequenza 1,2 Hz) è stata applicata alle sezioni di tessuto tramite il C-Pace. Per le condizioni di TD, T3 e Dex freschi sono stati aggiunti a 100 nM e 1 μM a ogni cambio di terreno. Il terreno viene saturato con ossigeno prima della sostituzione 3 volte al giorno. Le sezioni di tessuto sono state coltivate in un incubatore a 37 °C e al 5% di CO2.
Per le colture di CTCM, le sezioni di tessuto sono state posizionate su una stampante 3D personalizzata in una capsula Petri contenente soluzione di Tyrode modificata. Il dispositivo è progettato per aumentare le dimensioni della fetta di cuore del 25% rispetto all'area dell'anello di supporto. Questo per evitare che le sezioni di cuore si allunghino dopo il trasferimento dalla soluzione di Tyrode al terreno di coltura e durante la diastole. Utilizzando colla istoacrilica, sezioni di 300 µm di spessore sono state fissate su un anello di supporto di 7 mm di diametro. Dopo aver fissato le sezioni di tessuto all'anello di supporto, tagliare le sezioni di tessuto in eccesso e riposizionare le sezioni di tessuto attaccate nel bagno di soluzione di Tyrode in ghiaccio (4 °C) fino a quando non sono state preparate sezioni sufficienti per un dispositivo. Il tempo di elaborazione totale per tutti i dispositivi non deve superare le 2 ore. Dopo aver fissato 6 sezioni di tessuto ai rispettivi anelli di supporto, il dispositivo CTCM è stato assemblato. La camera di coltura CTCM è preriempita con 21 ml di terreno di coltura pre-ossigenato. Trasferire le sezioni di tessuto nella camera di coltura e rimuovere con attenzione eventuali bolle d'aria con una pipetta. La sezione di tessuto viene quindi guidata nel foro e premuta delicatamente in posizione. Infine, posizionare il cappuccio dell'elettrodo sul dispositivo e trasferire il dispositivo nell'incubatrice. Quindi collegare il CTCM al tubo dell'aria e al sistema C-PACE-EM. L'attuatore pneumatico si apre e la valvola dell'aria apre il CTCM. Il sistema C-PACE-EM è stato configurato per erogare 4 V a 1,2 Hz durante la stimolazione bifasica per 2 ms. Il terreno di coltura è stato cambiato due volte al giorno e gli elettrodi sono stati cambiati una volta al giorno per evitare l'accumulo di grafite sugli elettrodi. Se necessario, le sezioni di tessuto possono essere rimosse dai rispettivi pozzetti di coltura per espellere eventuali bolle d'aria che potrebbero essere cadute sotto di essi. Per le condizioni di trattamento MT, T3/Dex è stato aggiunto fresco a ogni cambio di terreno di coltura con 100 nM di T3 e 1 μM di Dex. I dispositivi CTCM sono stati coltivati ​​in un incubatore a 37 °C e al 5% di CO2.
Per ottenere traiettorie allungate delle fette di cuore, è stato sviluppato uno speciale sistema di telecamere. È stata utilizzata una fotocamera reflex digitale (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Giappone) con un obiettivo macro Navitar Zoom 7000 18-108 mm (Navitar, San Francisco, CA). La visualizzazione è stata eseguita a temperatura ambiente dopo aver sostituito il mezzo di coltura con mezzo fresco. La fotocamera è posizionata a un'angolazione di 51° e il video viene registrato a 30 fotogrammi al secondo. Innanzitutto, è stato utilizzato il software open source (MUSCLEMOTION43) con Image-J per quantificare il movimento delle fette di cuore. La maschera è stata creata utilizzando MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) per definire le regioni di interesse per le fette di cuore pulsante al fine di evitare il rumore. Le maschere segmentate manualmente vengono applicate a tutte le immagini in una sequenza di fotogrammi e quindi passate al plug-in MUSCLEMOTION. Muscle Motion utilizza l'intensità media dei pixel in ciascun fotogramma per quantificarne il movimento rispetto al fotogramma di riferimento. I dati sono stati registrati, filtrati e utilizzati per quantificare il tempo di ciclo e valutare lo stiramento tissutale durante il ciclo cardiaco. Il video registrato è stato post-elaborato utilizzando un filtro digitale a fase zero del primo ordine. Per quantificare lo stiramento tissutale (picco-picco), è stata eseguita un'analisi picco-picco per distinguere tra picchi e depressioni nel segnale registrato. Inoltre, il detrending viene eseguito utilizzando un polinomio di sesto ordine per eliminare la deriva del segnale. Il codice di programma è stato sviluppato in MATLAB per determinare il movimento globale del tessuto, il tempo di ciclo, il tempo di rilassamento e il tempo di contrazione (Codice di programma supplementare 44).
Per l'analisi della deformazione, utilizzando gli stessi video creati per la valutazione dell'allungamento meccanico, abbiamo prima tracciato due immagini che rappresentano i picchi di movimento (il punto più alto (superiore) e quello più basso (inferiore) del movimento) secondo il software MUSCLEMOTION. Abbiamo quindi segmentato le regioni di tessuto e applicato un algoritmo di ombreggiatura al tessuto segmentato (Fig. 2a supplementare). Il tessuto segmentato è stato quindi suddiviso in dieci sottosuperfici e lo stress su ciascuna superficie è stato calcolato utilizzando la seguente equazione: Deformazione = (Sup-Sdown)/Sdown, dove Sup e Sdown sono le distanze della forma dalle ombre superiore e inferiore del tessuto, rispettivamente (Fig. 2b supplementare).
Le sezioni cardiache sono state fissate in paraformaldeide al 4% per 48 ore. I tessuti fissati sono stati disidratati in saccarosio al 10% e al 20% per 1 ora, quindi in saccarosio al 30% per una notte. Le sezioni sono state quindi incluse in un composto per temperatura di taglio ottimale (composto OCT) e gradualmente congelate in un bagno di isopentano/ghiaccio secco. Conservare i blocchi di inclusione OCT a -80 °C fino alla separazione. I vetrini sono stati preparati come sezioni con uno spessore di 8 μm.
Per rimuovere l'OCT dalle sezioni cardiache, riscaldare i vetrini su un blocco riscaldante a 95 °C per 5 minuti. Aggiungere 1 ml di PBS a ciascun vetrino e incubare per 30 minuti a temperatura ambiente, quindi permeare le sezioni immergendo Triton-X allo 0,1% in PBS per 15 minuti a temperatura ambiente. Per impedire il legame di anticorpi non specifici al campione, aggiungere 1 ml di soluzione di BSA al 3% ai vetrini e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. La BSA è stata quindi rimossa e i vetrini sono stati lavati con PBS. Contrassegnare ciascun campione con una matita. Anticorpi primari (diluiti 1:200 in BSA all'1%) (connessina 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) e troponina-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) sono stati aggiunti per 90 minuti, quindi anticorpi secondari (diluiti 1:200 in BSA all'1%) contro Alexa Fluor 488 di topo (Thermo Scientific; #A16079), contro Alexa Fluor 594 di coniglio (Thermo Scientific; #T6391) per altri 90 minuti Lavati 3 volte con PBS Per distinguere la colorazione del bersaglio da quella di fondo, abbiamo utilizzato solo l'anticorpo secondario come controllo. Infine, è stato aggiunto il colorante nucleare DAPI e i vetrini sono stati posizionati in un vectashield (Vector Laboratories) e sigillati con smalto per unghie. ingrandimento -x) e microscopio Keyence con ingrandimento 40x.
Per la colorazione WGA è stato utilizzato WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) a 5 μg/ml in PBS, applicato alle sezioni fissate per 30 minuti a temperatura ambiente. I vetrini sono stati quindi lavati con PBS e a ciascun vetrino è stato aggiunto il nero Sudan, incubati per 30 minuti. I vetrini sono stati quindi lavati con PBS e ad essi è stato aggiunto il terreno di inclusione Vectashield. I vetrini sono stati visualizzati al microscopio Keyence con ingrandimento 40x.
L'OCT è stato rimosso dai campioni come descritto sopra. Dopo la rimozione dell'OCT, immergere i vetrini nella soluzione di Bouin per una notte. I vetrini sono stati quindi risciacquati con acqua distillata per 1 ora e quindi immersi in una soluzione di aloe e fucsina acida Bibrich per 10 minuti. Successivamente, i vetrini sono stati lavati con acqua distillata e immersi in una soluzione di fosfomolibdeno al 5%/acido fosfotungstico al 5% per 10 minuti. Senza risciacquare, trasferire i vetrini direttamente nella soluzione di blu di anilina per 15 minuti. Quindi, i vetrini sono stati lavati con acqua distillata e immersi in una soluzione di acido acetico all'1% per 2 minuti. I vetrini sono stati asciugati in etanolo 200 N e trasferiti in xilene. I vetrini colorati sono stati visualizzati utilizzando un microscopio Keyence con obiettivo 10x. La percentuale di area fibrosa è stata quantificata utilizzando il software Keyence Analyzer.
Saggio di vitalità cellulare CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), numero di catalogo V13154, secondo il protocollo del produttore con alcune modifiche. In particolare, è stato utilizzato un punch chirurgico del diametro di 6 mm per garantire una dimensione uniforme del tessuto durante l'analisi MTT. I tessuti sono stati piastrati individualmente nei pozzetti di una piastra a 12 pozzetti contenente substrato MTT secondo il protocollo del produttore. Le sezioni vengono incubate a 37 °C per 3 ore e il tessuto vivo metabolizza il substrato MTT formando un composto di formazano viola. Sostituire la soluzione di MTT con 1 ml di DMSO e incubare a 37 °C per 15 minuti per estrarre il formazano viola dalle sezioni cardiache. I campioni sono stati diluiti 1:10 in DMSO in piastre a 96 pozzetti con fondo trasparente e l'intensità del colore viola è stata misurata a 570 nm utilizzando un lettore di piastre Cytation (BioTek). Le letture sono state normalizzate al peso di ciascuna fetta di cuore.
Il terreno di coltura per le fette di cuore è stato sostituito con terreno contenente 1 μCi/ml di [5-3H]-glucosio (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) per il test di utilizzazione del glucosio, come precedentemente descritto. Dopo 4 ore di incubazione, aggiungere 100 µl di terreno di coltura a una provetta da microcentrifuga aperta contenente 100 µl di HCl 0,2 N. Quindi, la provetta è stata inserita in una provetta a scintillazione contenente 500 µl di dH₂O per far evaporare [3H]₂O per 72 ore a 37 °C. Quindi, rimuovere la provetta da microcentrifuga dalla provetta a scintillazione e aggiungere 10 ml di liquido di scintillazione. I conteggi a scintillazione sono stati eseguiti utilizzando un analizzatore a scintillazione liquida Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). L'utilizzo del glucosio è stato quindi calcolato tenendo conto dell'attività specifica del [5-3H]-glucosio, dell'equilibrio incompleto e del fondo, della diluizione del [5-3H]-glucosio non marcato e dell'efficienza del contatore a scintillazione. I dati sono normalizzati alla massa delle sezioni cardiache.
Dopo l'omogeneizzazione del tessuto in Trizol, l'RNA è stato isolato dalle sezioni cardiache utilizzando il kit Qiagen miRNeasy Micro #210874 secondo il protocollo del produttore. La preparazione della libreria RNAsec, il sequenziamento e l'analisi dei dati sono stati eseguiti come segue:
1 μg di RNA per campione è stato utilizzato come materiale di partenza per la preparazione della libreria di RNA. Le librerie di sequenziamento sono state generate utilizzando il kit di preparazione per librerie di RNA NEBNext UltraTM per Illumina (NEB, USA) seguendo le raccomandazioni del produttore e i codici indice sono stati aggiunti alle sequenze attributo per ciascun campione. In breve, l'mRNA è stato purificato dall'RNA totale utilizzando biglie magnetiche legate con oligonucleotidi poli-T. La frammentazione è stata effettuata utilizzando cationi bivalenti ad alta temperatura nel tampone di reazione di sintesi del primo filamento NEBNext (5X). Il cDNA del primo filamento è stato sintetizzato utilizzando primer esamerici casuali e trascrittasi inversa M-MuLV (RNasi H-). Il cDNA del secondo filamento è stato quindi sintetizzato utilizzando DNA polimerasi I e RNasi H. Le estremità rimanenti vengono convertite in estremità smussate dall'attività esonucleasica/polimerasica. Dopo l'adenilazione dell'estremità 3' del frammento di DNA, un adattatore NEBNext con struttura a forcina viene fissato ad esso per prepararlo all'ibridazione. Per la selezione di frammenti di cDNA di lunghezza preferita, 150-200 bp, i frammenti della libreria sono stati purificati utilizzando il sistema AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA). Successivamente, 3 μl di enzima USER (NEB, USA) con cDNA di lunghezza selezionata, legato con un adattatore, sono stati utilizzati per 15 minuti a 37 °C e successivamente per 5 minuti a 95 °C prima della PCR. La PCR è stata quindi eseguita utilizzando la DNA polimerasi Phusion High-Fidelity, primer universali per PCR e primer Index (X). Infine, i prodotti di PCR sono stati purificati (sistema AMPure XP) e la qualità della libreria è stata valutata su un sistema Agilent Bioanalyzer 2100. La libreria di cDNA è stata quindi sequenziata utilizzando un sequenziatore Novaseq. I file di immagini grezze di Illumina sono stati convertiti in letture grezze utilizzando CASAVA Base Calling. I dati grezzi sono archiviati in file in formato FASTQ(fq) che contengono le sequenze di lettura e le corrispondenti qualità delle basi. Selezionare HISAT2 per abbinare le letture di sequenziamento filtrate al genoma di riferimento Sscrofa11.1. In generale, HISAT2 supporta genomi di qualsiasi dimensione, inclusi genomi con più di 4 miliardi di basi, e per la maggior parte dei parametri sono impostati valori predefiniti. Le letture di splicing dai dati di RNA Seq possono essere allineate in modo efficiente utilizzando HISAT2, il sistema più veloce attualmente disponibile, con la stessa o migliore accuratezza rispetto a qualsiasi altro metodo.
L'abbondanza di trascritti riflette direttamente il livello di espressione genica. I livelli di espressione genica sono valutati in base all'abbondanza di trascritti (conteggio del sequenziamento) associati al genoma o agli esoni. Il numero di letture è proporzionale ai livelli di espressione genica, alla lunghezza del gene e alla profondità di sequenziamento. È stato calcolato il numero di FPKM (frammenti per mille coppie di basi di trascritto sequenziato per milione di coppie di basi) e sono stati determinati i valori di p dell'espressione differenziale utilizzando il pacchetto DESeq2. Abbiamo quindi calcolato il tasso di falsi positivi (FDR) per ciascun valore di p utilizzando il metodo Benjamini-Hochberg9 basato sulla funzione R integrata "p.adjust".
L'RNA isolato dalle sezioni cardiache è stato convertito in cDNA a una concentrazione di 200 ng/μl utilizzando la miscela SuperScript IV Vilo Master Mix di Thermo (Thermo, n. cat. 11756050). La RT-PCR quantitativa è stata eseguita utilizzando una piastra di reazione trasparente a 384 pozzetti Endura Plate Microamp di Applied Biosystems (Thermo, n. cat. 4483319) e adesivo ottico microamp (Thermo, n. cat. 4311971). La miscela di reazione era composta da 5 µl di miscela Taqman Fast Advanced Master Mix (Thermo, n. cat. 4444557), 0,5 µl di Taqman Primer e 3,5 µl di H₂O miscelati per pozzetto. Sono stati eseguiti cicli di qPCR standard e sono stati misurati i valori CT utilizzando uno strumento PCR in tempo reale Applied Biosystems Quantstudio 5 (modulo a 384 pozzetti; prodotto n. A28135). I primer Taqman sono stati acquistati da Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). I valori CT di tutti i campioni sono stati normalizzati al gene housekeeping GAPDH.
Il rilascio di NT-ProBNP nel terreno è stato valutato utilizzando il kit NT-ProBNP (pig) (codice articolo MBS2086979, MyBioSource) secondo il protocollo del produttore. In breve, 250 µl di ciascun campione e standard sono stati aggiunti in duplicato a ciascun pozzetto. Subito dopo l'aggiunta del campione, aggiungere 50 µl di reagente di analisi A a ciascun pozzetto. Agitare delicatamente la piastra e sigillare con il sigillante. Quindi le compresse sono state incubate a 37 °C per 1 ora. Quindi, aspirare la soluzione e lavare i pozzetti 4 volte con 350 µl di soluzione di lavaggio 1X, incubando la soluzione di lavaggio per 1-2 minuti ogni volta. Quindi aggiungere 100 µl di reagente di analisi B per pozzetto e sigillare con il sigillante per piastra. La compressa è stata agitata delicatamente e incubata a 37 °C per 30 minuti. Aspirare la soluzione e lavare i pozzetti 5 volte con 350 µl di soluzione di lavaggio 1X. Aggiungere 90 µl di soluzione di substrato a ciascun pozzetto e sigillare la piastra. Incubare la piastra a 37 °C per 10-20 minuti. Aggiungere 50 µl di soluzione bloccante a ciascun pozzetto. La piastra è stata immediatamente misurata utilizzando un lettore di piastre Cytation (BioTek) impostato a 450 nm.
Sono state eseguite analisi di potenza per scegliere le dimensioni del gruppo che forniranno una potenza >80% per rilevare una variazione assoluta del 10% nel parametro con un tasso di errore di tipo I del 5%. Sono state eseguite analisi di potenza per scegliere le dimensioni del gruppo che forniranno una potenza >80% per rilevare una variazione assoluta del 10% nel parametro con un tasso di errore di tipo I del 5%. L'analisi della umidità è stata effettuata per le dimensioni del gruppo di lavoro che supera l'80% di umidità per l'aumento del 10% modifica completa parametro con 5% частотой ошибок типа I. È stata eseguita un'analisi di potenza per selezionare le dimensioni dei gruppi che avrebbero fornito una potenza >80% per rilevare una variazione assoluta del 10% dei parametri con un tasso di errore di tipo I del 5%.进行功效分析以选择将提供> 80% 功效以检测参数中10%绝对变化 e 5%I型错误率的组大小.进行功效分析以选择将提供> 80% 功效以检测参数中10%绝对变化 e 5%I型错误率的组大小. È stata effettuata un'analisi approfondita della velocità per la dimensione del gruppo di lavoro, il cui controllo è > 80% della velocità per l'ottimizzazione del 10% modifica completa parametri e 5% percentuale dell'apparecchio tipo I. È stata eseguita un'analisi di potenza per selezionare una dimensione del gruppo che avrebbe fornito >80% di potenza per rilevare una variazione assoluta del parametro del 10% e un tasso di errore di tipo I del 5%.Le sezioni di tessuto sono state selezionate casualmente prima dell'esperimento. Tutte le analisi sono state condotte in cieco e i campioni sono stati decodificati solo dopo l'analisi di tutti i dati. Per eseguire tutte le analisi statistiche è stato utilizzato il software GraphPad Prism (San Diego, CA). Per tutte le statistiche, i valori p sono stati considerati significativi a valori <0,05. Per tutte le statistiche, i valori p sono stati considerati significativi a valori <0,05. Per tutte le statistiche i valori numerici sono inferiori a 0,05. Per tutte le statistiche, i valori p sono stati considerati significativi a valori <0,05.对于所有统计数据, p 值在值<0.05 时被认为是显着的.对于所有统计数据, p 值在值<0.05 时被认为是显着的. Per tutte le statistiche i valori numerici sono inferiori a 0,05. Per tutte le statistiche, i valori p sono stati considerati significativi a valori <0,05.Il test t di Student a due code è stato eseguito sui dati con solo 2 confronti. L'ANOVA a una o due vie è stata utilizzata per determinare la significatività tra più gruppi. Durante l'esecuzione dei test post hoc, è stata applicata la correzione di Tukey per tenere conto dei confronti multipli. I dati RNAsec richiedono considerazioni statistiche specifiche per il calcolo di FDR e p.adjust, come descritto nella sezione Metodi.
Per maggiori informazioni sulla progettazione dello studio, consultare l'abstract del Nature Research Report collegato a questo articolo.