د Nature.com د لیدنې لپاره مننه. هغه براوزر نسخه چې تاسو یې کاروئ محدود CSS ملاتړ لري. د غوره تجربې لپاره، موږ سپارښتنه کوو چې تاسو یو تازه شوی براوزر وکاروئ (یا په انټرنیټ اکسپلورر کې د مطابقت حالت غیر فعال کړئ). په عین حال کې، د دوامداره ملاتړ ډاډ ترلاسه کولو لپاره، موږ به سایټ پرته له سټایلونو او جاواسکریپټ څخه وړاندې کړو.
د یو باوري ان ویټرو سیسټم ته اړتیا ده چې د درملو ازموینې لپاره د زړه فزیولوژیکي چاپیریال په سمه توګه تولید کړي. د انسان د زړه د نسجونو کلتور سیسټمونو محدود شتون د زړه د درملو اغیزو غلط تفسیر لامل شوی. دلته، موږ د زړه د نسجونو کلتور ماډل (CTCM) رامینځته کړی چې په الکترو میخانیکي ډول د زړه ټوټې هڅوي او د زړه دورې د سیسټولیک او ډیسټولیک مرحلو په جریان کې فزیولوژیکي فشار څخه تیریږي. د 12 ورځو کلتور وروسته، دې طریقې د زړه برخو د ژوند وړتیا په جزوي ډول ښه کړه، مګر د دوی جوړښتي بشپړتیا یې په بشپړه توګه نه ده ساتلې. له همدې امله، د کوچني مالیکول سکرینینګ وروسته، موږ وموندله چې زموږ میډیم ته د 100 nM ټرای آیوډوتیرونین (T3) او 1 μM ډیکسامیتازون (Dex) اضافه کول د 12 ورځو لپاره د برخو مایکرو جوړښت ساتلی. د T3/Dex درملنې سره په ترکیب کې، د CTCM سیسټم د 12 ورځو لپاره د تازه زړه نسج په څیر په ورته کچه د ټرانسکرپشن پروفایلونه، ژوند وړتیا، میټابولیک فعالیت، او جوړښتي بشپړتیا ساتلې. برسېره پردې، په کلتور کې د زړه د نسجونو ډیر غځیدل د هایپرټروفیک زړه سیګنالینګ هڅوي، چې د CTCM وړتیا لپاره شواهد چمتو کوي چې د زړه غځیدلو لخوا رامینځته شوي هایپرټروفیک شرایطو تقلید وکړي. په پایله کې، CTCM کولی شي د اوږدې مودې لپاره په کلتور کې د زړه فزیولوژي او پیتوفیزیولوژي ماډل کړي، د باور وړ درملو سکرینینګ ته اجازه ورکوي.
د کلینیکي څیړنو دمخه، د باور وړ ان ویټرو سیسټمونو ته اړتیا ده چې کولی شي د انسان د زړه فزیولوژیکي چاپیریال په سمه توګه تولید کړي. دا ډول سیسټمونه باید بدل شوي میخانیکي فشار، د زړه ضربان، او الکترو فزیولوژیکي ملکیتونه تقلید کړي. د څارویو ماډلونه معمولا د زړه فزیولوژی لپاره د سکرینینګ پلیټ فارم په توګه کارول کیږي چې د انسان په زړه کې د درملو اغیزو منعکس کولو کې محدود اعتبار لري 1,2. په نهایت کې، د مثالي زړه نسج کلتور تجربوي ماډل (CTCM) یو ماډل دی چې د مختلفو معالجوي او فارماسولوژیکي مداخلو لپاره خورا حساس او ځانګړی دی، د انسان د زړه فزیولوژي او پیتو فزیولوژي په سمه توګه تولیدوي 3. د داسې سیسټم نشتوالی د زړه د ناکامۍ لپاره د نوي درملنې کشف محدودوي 4,5 او د بازار څخه د وتلو لپاره د لوی دلیل په توګه د درملو کارډیوټوکسیکیت لامل شوی 6.
په تیرو لسو کلونو کې، اته غیر زړه او رګونو درمل د کلینیکي کارونې څخه ایستل شوي دي ځکه چې دوی د QT وقفې اوږدوالي لامل کیږي چې د وینټریکولر اریتیمیا او ناڅاپي مړینې لامل کیږي. په دې توګه، د زړه او رګونو اغیزمنتوب او زهرجنیت ارزولو لپاره د باور وړ پری کلینیکي سکرینینګ ستراتیژیو ته اړتیا مخ په زیاتیدو ده. د درملو سکرینینګ او زهرجنیت ازموینې کې د انسان لخوا هڅول شوي پلوریپوټینټ سټیم حجرو څخه اخیستل شوي کارډیومیوسایټس (hiPS-CM) وروستی کارول د دې ستونزې لپاره جزوي حل چمتو کوي. په هرصورت، د hiPS-CMs ناپاک طبیعت او د زړه د نسجونو د څو حجروي پیچلتیا نشتوالی د دې میتود لوی محدودیتونه دي. وروستیو مطالعاتو ښودلې چې دا محدودیت په جزوي ډول د لومړني hiPS-CM په کارولو سره د زړه د نسج هایدروجیلونو جوړولو لپاره د ناڅاپي انقباض له پیل څخه لږ وروسته او د وخت په تیریدو سره په تدریجي ډول د بریښنایی محرک زیاتولو سره له منځه وړل کیدی شي. په هرصورت، دا hiPS-CM مایکرو نسجونه د بالغ مایوکارډیم بالغ الیکټرو فزیولوژیکي او انقباضي ملکیتونه نلري. برسېره پردې، د انسان د زړه نسج یو ډیر پیچلی جوړښت لري، چې د مختلفو حجرو ډولونو متفاوت مخلوط څخه جوړ دی، پشمول د انډوتیلیل حجرو، نیورونونو، او سټرومل فایبروبلاستونو، چې د خارجي حجرو میټریکس پروټینونو ځانګړو سیټونو لخوا سره وصل شوي دي. د بالغ تی لرونکي زړه کې د غیر کارډیومیوسایټ نفوس 11,12,13 دا متفاوتیت د انفرادي حجرو ډولونو په کارولو سره د زړه نسج ماډل کولو لپاره یو لوی خنډ دی. دا لوی محدودیتونه د فزیولوژیکي او رنځپوهنیز شرایطو لاندې د سالم مایوکارډیال نسج د کلتور کولو لپاره د میتودونو پراختیا اهمیت ټینګار کوي.
د انسان د زړه د نازکو (۳۰۰ µm) برخو کلتوري بڼه د انسان د زړه د نسجونو د بشپړې ودې یوه هیله بښونکې نمونه ثابته شوې ده. دا طریقه د انسان د زړه نسجونو ته ورته بشپړ درې بعدي څو حجروي سیسټم ته لاسرسی برابروي. په هرصورت، تر ۲۰۱۹ پورې، د کلتوري زړه برخو کارول د لنډ (۲۴ ساعتونو) کلتوري بقا لخوا محدود وو. دا د یو شمیر فکتورونو له امله دی پشمول د فزیکي-میخانیکي غځولو نشتوالی، د هوا-مایع انٹرفیس، او د ساده رسنیو کارول چې د زړه د نسجونو اړتیاوې نه پوره کوي. په ۲۰۱۹ کې، څو څیړنیزو ډلو وښودله چې د زړه د نسجونو کلتور سیسټمونو کې د میخانیکي فکتورونو شاملول کولی شي د کلتور ژوند وغځوي، د زړه څرګندونه ښه کړي، او د زړه رنځپوهنه نقل کړي. دوه ښکلي مطالعات ۱۷ او ۱۸ ښیي چې غیر محوري میخانیکي بار کول د کلتور په جریان کې د زړه فینوټایپ باندې مثبت اغیزه لري. په هرصورت، دې مطالعاتو د زړه د دورې متحرک درې اړخیزه فزیکو-میخانیکي بار کول نه دي کارولي، ځکه چې د زړه برخې د ایزومیټریک تناسلي ځواکونو ۱۷ یا خطي آکسوټونک بار کولو ۱۸ سره بار شوي وې. د نسجونو د غځولو دا طریقې د زړه د ډیری جینونو د فشار یا د غیر معمولي غځولو غبرګونونو سره تړلي جینونو د ډیر څرګندیدو لامل شوې. د پام وړ، پیټولیس او نور. 19 د زړه د دورې د بیارغونې لپاره د زړه د ټوټې کلتور یو متحرک حمام رامینځته کړ چې د ځواک ټرانسډوسر فیډبیک او د فشار ډرایو په کارولو سره کارول کیږي. که څه هم دا سیسټم د ویټرو د زړه د دورې ماډلینګ ډیر دقیق کولو ته اجازه ورکوي، د میتود پیچلتیا او ټیټ تروپټ د دې سیسټم پلي کول محدودوي. زموږ لابراتوار پدې وروستیو کې د بریښنایی محرک او غوره شوي میډیم په کارولو سره یو ساده کلتور سیسټم رامینځته کړی ترڅو د خنزیر او د انسان د زړه نسجونو برخو د ژوند وړتیا تر 6 ورځو پورې وساتي20,21.
په اوسني لاسوند کې، موږ د زړه د نسجونو د کلتور ماډل (CTCM) تشریح کوو چې د خنزیر د زړه د برخو څخه کار اخلي چې د زړه د دورې په جریان کې د درې اړخیزه زړه فزیولوژي او پیتوفیزیولوژیکي پراخوالي بیاکتنې لپاره د هیمورل اشارو سره یوځای کوي. دا CTCM کولی شي د کلینیکي درملو دمخه وړاندوینې دقت هغه کچې ته لوړ کړي چې هیڅکله یې د ارزانه، منځني تروپټ زړه سیسټم چمتو کولو سره ترلاسه نه شو چې د تی لرونکو زړه فزیولوژي/پیتوفیزیولوژي تقلید کوي د کلینیکي درملو دمخه ازموینې لپاره.
د هیموډینامیک میخانیکي سیګنالونه په ویټرو 22,23,24 کې د کارډیومیوسایټ فعالیت ساتلو کې مهم رول لوبوي. په اوسني لاسوند کې، موږ یو CTCM (شکل 1a) رامینځته کړی چې کولی شي د فزیولوژیکي فریکونسیو (1.2 Hz، په یوه دقیقه کې 72 وهل) کې د بریښنایی او میخانیکي محرک دواړه هڅولو سره د لویانو د زړه چاپیریال تقلید وکړي. د ډیسټول په جریان کې د ډیر نسجونو د غځولو څخه مخنیوي لپاره، د 3D چاپ کولو وسیله کارول شوې ترڅو د نسج اندازه 25٪ زیاته کړي (شکل 1b). د C-PACE سیسټم لخوا هڅول شوی بریښنایی سرعت د سیسټول څخه 100 ms پیل کولو لپاره وخت ټاکل شوی و چې د معلوماتو ترلاسه کولو سیسټم په کارولو سره د زړه دورې په بشپړ ډول بیا تولید کړي. د نسج کلتور سیسټم د پروګرام وړ نیوماتیک عمل کوونکی (LB انجینرۍ، جرمني) کاروي ترڅو په سایکل ډول د انعطاف وړ سیلیکون غشا پراخه کړي ترڅو په پورتنۍ خونه کې د زړه ټوټې پراخې کړي. سیسټم د فشار ټرانسډوسر له لارې د بهرني هوایی کرښې سره وصل شوی و، کوم چې دا ممکنه کړه چې فشار (± 1 mmHg) او وخت (± 1 ms) په سمه توګه تنظیم کړي (شکل 1c).
a د نسج برخه د 7 ملي میتر ملاتړ حلقې سره وصل کړئ، چې په نیلي رنګ کې ښودل شوي، د وسیلې د کلتور خونې دننه. د کلتور خونه د هوا خونې څخه د یو پتلي انعطاف وړ سیلیکون غشا لخوا جلا شوې ده. د لیکیدو مخنیوي لپاره د هر خونې ترمنځ ګازکیټ ځای په ځای کړئ. د وسیلې پوښ ګرافیټ الکترودونه لري چې بریښنایی محرک چمتو کوي. b د لوی نسج وسیلې، لارښود حلقه او ملاتړ حلقه سکیماتیک استازیتوب. د نسج برخې (نسواري) په لوی وسیله کې ځای په ځای شوي چې لارښود حلقه د وسیلې په بهرنۍ څنډه کې په نالی کې ځای په ځای شوې ده. د لارښود په کارولو سره، د ملاتړ حلقه په احتیاط سره د زړه د نسج برخې باندې د نسج اکریلیک چپکونکي سره پوښل شوې ځای په ځای کړئ. c ګراف د بریښنایی محرک وخت د هوا چیمبر فشار فعالیت په توګه ښیې چې د پروګرام وړ نیوماتیک عمل کونکي (PPD) لخوا کنټرول کیږي. د فشار سینسرونو په کارولو سره د بریښنایی محرک همغږي کولو لپاره د معلوماتو ترلاسه کولو وسیله کارول شوې. کله چې د کلتور خونه کې فشار ټاکل شوي حد ته ورسیږي، د نبض سیګنال C-PACE-EM ته لیږل کیږي ترڅو بریښنایی محرک رامینځته کړي. d د څلورو CTCMs انځور چې په انکیوبیټر شیلف کې ځای په ځای شوی. څلور وسایل د نیوماتیک سرکټ له لارې له یو PPD سره وصل دي، او د فشار سینسرونه د هیموسټاتیک والو ته داخل شوي ترڅو په نیوماتیک سرکټ کې فشار وڅاري. هر وسیله شپږ نسج برخې لري.
د یو واحد نیوماتیک ایکچویټر په کارولو سره، موږ وکولای شو چې د CTCM 4 وسایل کنټرول کړو، چې هر یو یې کولی شي 6 نسج برخې وساتي (انځور 1d). په CTCM کې، د هوا په خونه کې د هوا فشار د مایع خونې کې همغږي فشار ته بدلیږي او د زړه د ټوټې فزیولوژیکي پراختیا هڅوي (شکل 2a او ضمیمه فلم 1). د نسجونو د غځولو ارزونه په 80 mm Hg کې. هنر د نسجونو د غځولو 25٪ ښودلې (شکل 2b). دا سلنه غځیدل د زړه د برخې د نورمال انقباض لپاره د 2.2-2.3 µm د فزیولوژیکي سارکومیر اوږدوالي سره مطابقت لري ښودل شوي 17,19,25. د نسج حرکت د دودیز کیمرې ترتیباتو په کارولو سره ارزول شوی (ضمیمه شکل 1). د نسج حرکت طول او سرعت (شکل 2c، d) د زړه د دورې په جریان کې غځیدل او د سیسټول او ډیسټول په جریان کې وخت سره مطابقت لري (شکل 2b). د انقباض او آرامۍ په جریان کې د زړه د نسج غځیدل او سرعت د کلتور په جریان کې د 12 ورځو لپاره ثابت پاتې شو (شکل 2f). د کلتور په جریان کې د انقباض په اړه د بریښنایی محرک اغیز ارزولو لپاره، موږ د سیوري الګوریتم په کارولو سره د فعال انقباض ټاکلو لپاره یوه میتود رامینځته کړ (ضمیمه انځور 2a، b) او د بریښنایی محرک سره او پرته د انقباض ترمنځ توپیر کولو توان درلود. د زړه ورته برخه (انقباض 2f). د کټ په حرکت وړ سیمه کې (R6-9)، د بریښنایی محرک په جریان کې ولټاژ د بریښنایی محرک نشتوالي په پرتله 20٪ لوړ و، کوم چې د انقباض فعالیت ته د بریښنایی محرک ونډه په ګوته کوي.
د هوا د چیمبر فشار، د مایع چیمبر فشار، او د نسجونو د حرکت اندازه کولو نماینده نښې تاییدوي چې د چیمبر فشار د مایع چیمبر فشار بدلوي، چې د نسج ټوټې ورته حرکت رامینځته کوي. b د نسج برخو د سلنې پراخوالي (نارنج) استازي نښې. c د زړه د ټوټې اندازه شوی حرکت د حرکت د اندازه شوي سرعت سره مطابقت لري. (d) د زړه په یوه ټوټه کې د سایکلیک حرکت (نیلي کرښه) او سرعت (نارنج نقطه شوی کرښه) استازي ټراجیکټرونه. e د دورې وخت اندازه کول (n = په هر ګروپ کې 19 ټوټې، د مختلفو خنزیرونو څخه)، د انقباض وخت (n = په هر ګروپ کې 19 ټوټې، د مختلفو خنزیرونو څخه)، د نسج حرکت (n = 25). ټوټې)/ګروپ د مختلفو خنزیرونو څخه)، د لوړ سیسټولیک سرعت (n = 24(D0)، 25(D12) ټوټې/ګروپ د مختلفو خنزیرونو څخه) او د لوړ آرام کچه (n=24(D0)، 25(D12) ټوټې/ګروپ د مختلفو خنزیرونو څخه). د دوه لکۍ لرونکي زده کونکي ټي-ټیسټ په هیڅ پیرامیټر کې د پام وړ توپیر ونه ښود. د (سور) او (نیلي) بریښنایی محرک پرته د نسج برخو د استازي فشار تحلیل نښې، د ورته برخې څخه د نسج برخو لس سیمه ایزې سیمې. لاندې پینلونه د مختلفو برخو څخه په لسو برخو کې د بریښنایی محرک سره او پرته د نسج برخو کې د فشار د فیصدي توپیر اندازه کول ښیې. (n = د مختلفو خنزیرانو څخه 8 ټوټې/ګروپ، د دوه لکۍ لرونکي زده کونکي t-ټیسټ ترسره کیږي؛ ****p < 0.0001، **p < 0.01، *p < 0.05). (n = د مختلفو خنزیرانو څخه 8 ټوټې/ګروپ، د دوه لکۍ لرونکي زده کونکي t-ټیسټ ترسره کیږي؛ ****p < 0.0001، **p < 0.01، *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,00, *p<0,001). (n = د مختلفو خنزیرانو څخه 8 برخې/ګروپ، د دوه لکۍ لرونکي زده کونکي t-ټیسټ؛ ****p<0.0001، **p<0.01، *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；**p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05）. （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；**p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05）. (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 برخې/ګروپ، د مختلفو خنزیرانو څخه، د دوه لکۍ لرونکي زده کونکي t-ټیسټ؛ ****p<0.0001، **p<0.01، *p<0.05).د تېروتنې بارونه د اوسط ± معیاري انحراف استازیتوب کوي.
زموږ په پخواني جامد بایومیومیټیک زړه سلائس کلچر سیسټم [20، 21] کې، موږ د زړه سلائسونو وړتیا، فعالیت، او جوړښتي بشپړتیا د 6 ورځو لپاره د بریښنایی محرک پلي کولو او د منځني جوړښت غوره کولو سره ساتلې. په هرصورت، د 10 ورځو وروسته، دا ارقام په چټکۍ سره راټیټ شول. موږ به زموږ د پخواني جامد بایومیومیټیک کلتور سیسټم 20، 21 کنټرول شرایطو (Ctrl) کې کلتور شوي برخو ته مراجعه وکړو او موږ به خپل پخوانی مطلوب میډیم د MC شرایطو او کلتور په توګه د یو وخت میخانیکي او بریښنایی محرک (CTCM) لاندې وکاروو. نومیږي. لومړی، موږ معلومه کړه چې د بریښنایی محرک پرته میخانیکي محرک د 6 ورځو لپاره د نسجونو وړتیا ساتلو لپاره کافي نه و (ضمیمه انځور 3a، b). په زړه پورې خبره دا ده چې د STCM په کارولو سره د فزیو-میخانیکي او بریښنایی محرک معرفي کولو سره، د 12 ورځو زړه برخو وړتیا د MS شرایطو لاندې د تازه زړه برخو په څیر پاتې شوه، مګر د Ctrl شرایطو لاندې نه، لکه څنګه چې د MTT تحلیل لخوا ښودل شوي (شکل 1). 3a). دا وړاندیز کوي چې د زړه د دورې میخانیکي محرک او سمولیشن کولی شي د نسج برخې د دوه چنده اوږدې مودې لپاره د اعتبار وړ وساتي لکه څنګه چې زموږ په تیرو جامد کلتور سیسټم کې راپور شوي. په هرصورت، د زړه د ټروپونین T او کونیکسین 43 د معافیتي لیبل کولو له لارې د نسج برخو د جوړښتي بشپړتیا ارزونه ښودلې چې د کانیکسین 43 څرګندونه په 12 ورځ د MC نسجونو کې د ورته ورځې کنټرولونو په پرتله د پام وړ لوړه وه. په هرصورت، یونیفورم کونیکسین 43 څرګندونه او Z-ډیسک جوړښت په بشپړ ډول نه دی ساتل شوی (انځور 3b). موږ د نسج جوړښتي بشپړتیا اندازه کولو لپاره د مصنوعي استخباراتو (AI) چوکاټ کاروو26، د ټروپونین-T او کونیکسین سټینینګ43 پراساس د عکس پر بنسټ ژور زده کړې پایپ لاین ترڅو په اتوماتیک ډول د ځایی کولو ځواک له مخې د زړه د ټوټو جوړښتي بشپړتیا او فلوروسینس اندازه کړي. دا میتود د کنولوشنل نیورل شبکې (CNN) او ژورې زده کړې چوکاټ کاروي ترڅو د زړه د نسج جوړښتي بشپړتیا په اتوماتیک او بې طرفه ډول په باوري ډول اندازه کړي، لکه څنګه چې په حواله کې تشریح شوی. 26. د MC نسج د جامد کنټرول برخو په پرتله د ورځې 0 سره ښه جوړښتي ورته والی ښودلی. برسېره پردې، د میسن ټرایکروم سټینینګ د MS شرایطو لاندې د فایبروسس د پام وړ ټیټ سلنه د کلتور د 12مې ورځې د کنټرول شرایطو په پرتله څرګنده کړه (انځور 3c). پداسې حال کې چې CTCM د 12مې ورځې د زړه د نسجونو برخو وړتیا د تازه زړه نسجونو سره ورته کچې ته لوړه کړه، دا د زړه د برخو ساختماني بشپړتیا ته د پام وړ وده نه ده ورکړې.
د بار ګراف د تازه زړه ټوټې (D0) یا د زړه ټوټې کلتور د MTT د وړتیا اندازه کول د 12 ورځو لپاره یا په جامد کلتور (D12 Ctrl) یا په CTCM (D12 MC) کې ښیې (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl)، 12 (D12 MC) ټوټې/ګروپ د مختلفو خنزیرونو څخه، د ANOVA ازموینه په یوه لاره ترسره کیږي؛ ####p < 0.0001 د D0 په پرتله او **p < 0.01 د D12 Ctrl په پرتله). د بار ګراف د تازه زړه ټوټې (D0) یا د زړه ټوټې کلتور د MTT د وړتیا اندازه کول د 12 ورځو لپاره یا په جامد کلتور (D12 Ctrl) یا په CTCM (D12 MC) کې ښیې (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl)، 12 (D12 MC) ټوټې/ګروپ د مختلفو خنزیرونو څخه، د ANOVA ازموینه په یوه لاره ترسره کیږي؛ ####p < 0.0001 د D0 په پرتله او **p < 0.01 د D12 Ctrl په پرتله).هسټوګرام د MTT تازه زړه برخو (D0) یا د زړه برخو کلتور د 12 ورځو لپاره په جامد کلتور (D12 کنټرول) یا CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)، 15 (D12 کنټرول))، 12 (D12 MC) برخو/ګروپ کې د مختلفو خنزیرونو څخه د وړتیا اندازه کول ښیي، د ANOVA یو اړخیزه ازموینه ترسره کیږي؛####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 د D0 په پرتله او **p < 0.01 د D12 په پرتله Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单启曼朕启ANOVA相比,####p < 0.0001، 与D12 Ctrl 相比، **p <0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比,###p <0.0001，CtrlD12)هسټوګرام چې د زړه په تازه برخو (D0) یا د زړه په برخو کې د MTT د وړتیا اندازه کول ښیې چې د 12 ورځو لپاره په جامد کلتور (D12 کنټرول) یا CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)، 15 (D12 کنټرول)) کې کرل شوي، 12 (D12 MC) برخې/ګروپ د مختلفو خنزیرونو څخه، یو طرفه ANOVA ازموینه؛####p <0,0001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 د D0 په پرتله، **p < 0.01 د D12 په پرتله Ctrl).b ټروپونین-ټي (شنه)، کونیکسین ۴۳ (سور) او DAPI (آبي) د زړه په تازه جلا شویو برخو (D0) یا د زړه په هغو برخو کې چې د جامد شرایطو (Ctrl) یا CTCM شرایطو (MC) لاندې د ۱۲ ورځو لپاره کرل شوي د امیونو فلوروسینس عکسونو (خالي پیمانه = ۱۰۰ µm). د زړه د نسجونو د جوړښت بشپړتیا مصنوعي استخباراتو اندازه کول (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) ټوټې/ګروپ هر یو د مختلف خنزیر څخه، یو طرفه ANOVA ازموینه ترسره کیږي؛ ####p < 0.0001 د D0 په پرتله او ****p < 0.0001 د D12 Ctrl په پرتله). د زړه د نسجونو د جوړښت بشپړتیا مصنوعي استخباراتو اندازه کول (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) ټوټې/ګروپ هر یو د مختلفو خنزیرونو څخه، یو طرفه ANOVA ازموینه ترسره کیږي؛ ####p < 0.0001 د D0 په پرتله او ****p < 0.0001 د D12 Ctrl په پرتله). Количественная оценка структурной целостности селостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0) , 7 (D12 Ctrl) , 5/12 MC2 разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению). د زړه د نسجونو د جوړښتي بشپړتیا اندازه کول د مصنوعي استخباراتو لخوا (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) برخې/ګروپونه د مختلفو خنزیرانو څخه، د ANOVA یو اړخیزه ازموینه ترسره شوه؛ ####p < 0.0001 د D0 او ****p < 0.0001 سره د D12 Ctrl په پرتله).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) ټوټې/ ګروپ هر یو مختلف سور، یو طرفه ANOVA #0#0p. <#0#0p.相比,****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) ټوټې/ هر یو د مختلف خنزیرونو ګروپ، یو طرفه ANOVA test.##0p.与D0相比,****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0) , 7 (D12 Ctrl/D05) , каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению сl12). مصنوعي استخبارات د زړه د نسجونو د جوړښت بشپړتیا اندازه کولو لپاره (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) برخې/ګروپ د مختلفو خنزیرونو هر یو، یو طرفه ANOVA ازموینه؛ ####p<0.0001 vs .D0 د پرتله کولو لپاره ****p < 0.0001 د D12 Ctrl په پرتله). c د زړه د هغو ټوټو لپاره چې د ماسن د ټرایکروم داغ سره رنګ شوي دي (پیمانه بره = 500 µm) استازي انځورونه (کیڼ اړخ ته) او اندازه کول (ښي اړخ ته) (n = 10 ټوټې/ګروپ هر یو د مختلف سور څخه، یو طرفه ANOVA ازموینه ترسره کیږي؛ ####p < 0.0001 د D0 په پرتله او ***p < 0.001 د D12 په پرتله Ctrl). c د زړه د هغو ټوټو لپاره چې د ماسن د ټرایکروم داغ سره رنګ شوي دي (پیمانه بره = 500 µm) استازي انځورونه (کیڼ اړخ ته) او اندازه کول (ښي اړخ ته) (n = د مختلفو خنزیرانو څخه 10 ټوټو/ګروپ، یو طرفه ANOVA ازموینه ترسره کیږي؛ #### p < 0.0001 د D0 په پرتله او ***p < 0.001 د D12 په پرتله Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красибаслева покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA؛ #### p < 0,000p *** D 0,000p 0,001 پو сравнению с D12 Ctrl). c د زړه د هغو برخو استازي انځورونه (کیڼ اړخ ته) او اندازه کول (ښي اړخ ته) چې د ماسن د ټرایکروم داغ سره رنګ شوي دي (غیر پوښل شوی پیمانه = 500 µm) (n = د مختلفو خنزیرانو څخه 10 برخې/ډله، د ANOVA یو طرفه ازموینه ترسره شوې؛ #### p < 0 .0001 د D0 په پرتله او ***p < 0.001 د D12 Ctrl په پرتله). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度=0µm0个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向انووا 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p <0.0.1 د . د ‏‎C 用 masson 三色染料的心脏切片的代表性 （左左）量化（右）裸尺度度度带度度度度度度度度度度度表性‎‏ پاڼې اړوند نور معلومات په فسبوک کې اوګورئ裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ，进行 单向 单勛 اناوا 0.0001 与D0 相比,***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным (слева) 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного дисперсион; ##### 0,0001 PO сравнению с D0, ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c د زړه د هغو برخو استازي انځورونه (کیڼ اړخ ته) او اندازه کول (ښي اړخ ته) چې د میسن د ټرایکروم داغ سره رنګ شوي دي (خالي = 500 µm) (n = 10 برخې/ګروپ، هر یو د مختلف سور څخه، د توپیر د یو اړخیز تحلیل لخوا ازمول شوی ;### # p < 0.0001 د D0 په پرتله، ***p < 0.001 د D12 په پرتله Ctrl).د تېروتنې بارونه د اوسط ± معیاري انحراف استازیتوب کوي.
موږ فرضیه وکړه چې د کلتور په منځ کې د کوچنیو مالیکولونو په اضافه کولو سره، د CTCM کلتور په جریان کې د کارډیومایوسایټ بشپړتیا ښه کیدی شي او د فایبروسس پراختیا کمه کیدی شي. له همدې امله موږ د کوچني مالیکولونو لپاره زموږ د جامد کنټرول کلتورونو په کارولو سره سکرینینګ وکړ20,21 د لږ شمیر مغشوش عواملو له امله. ډیکسامیتازون (ډیکس)، ټرای آیوډوتیرونین (T3)، او SB431542 (SB) د دې سکرین لپاره غوره شوي. دا کوچني مالیکولونه دمخه په hiPSC-CM کلتورونو کې کارول شوي ترڅو د سارکومیر اوږدوالی، T-ټیوبونو، او د لیږد سرعت زیاتولو سره د کارډیومایوسایټونو پختوالي هڅوي. سربیره پردې، دواړه ډیکس (یو ګلوکوکورټیکایډ) او SB د سوزش د مخنیوي لپاره پیژندل شوي29,30. له همدې امله، موږ ازموینه وکړه چې ایا د دې کوچنیو مالیکولونو یو یا ترکیب شاملول به د زړه برخو جوړښتي بشپړتیا ته وده ورکړي. د لومړني سکرینینګ لپاره، د هر مرکب خوراک د هغه غلظت پراساس غوره شوی چې معمولا د حجرو کلتور ماډلونو کې کارول کیږي (1 μM Dex27، 100 nM T327، او 2.5 μM SB31). د ۱۲ ورځو کلتور وروسته، د T3 او Dex ترکیب د غوره کارډیومایوسایټ جوړښت بشپړتیا او لږترلږه فایبروس بیا رغونه پایله درلوده (ضمیمه شکلونه ۴ او ۵). سربیره پردې، د T3 او Dex د دې غلظت دوه چنده یا دوه چنده کارول د نورمال غلظت په پرتله زیان رسونکي اغیزې رامینځته کړې (ضمیمه شکل ۶a، ب).
د لومړني سکرینینګ وروسته، موږ د 4 کلتور شرایطو سره مخامخ پرتله کول ترسره کړل (شکل 4a): Ctrl: د زړه برخې چې زموږ په مخکې تشریح شوي جامد کلتور کې زموږ د مطلوب میډیم په کارولو سره کرل شوي؛ 20.21 TD: T3 او Ctrl د چهارشنبې په ورځ اضافه شوي Dex؛ MC: د زړه برخې چې زموږ په مخکې اصلاح شوي میډیم په کارولو سره په CTCM کې کرل شوي؛ او MT: CTCM د T3 او Dex سره چې میډیم ته اضافه شوي. د 12 ورځو کښت وروسته، د MS او MT نسجونو وړتیا د MTT ازموینې لخوا ارزول شوي تازه نسجونو په څیر پاتې شوه (شکل 4b). په زړه پورې خبره دا ده چې د ټرانس ویل کلتورونو (TD) ته د T3 او Dex اضافه کول د Ctrl شرایطو په پرتله د وړتیا کې د پام وړ پرمختګ پایله نه درلوده، چې د زړه برخو د وړتیا ساتلو کې د میخانیکي محرک مهم رول په ګوته کوي.
د تجربوي ډیزاین ډیاګرام چې د څلورو کلتوري شرایطو انځور کوي چې د 12 ورځو لپاره په میډیم باندې د میخانیکي محرک او T3/Dex ضمیمه اغیزو ارزولو لپاره کارول کیږي. b د بار ګراف د ټولو څلورو کلتوري شرایطو (Ctrl، TD، MC، او MT) کې د تازه زړه ټوټو (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD او D12 MT)، 12 (D12 MC) ټوټو/ګروپ په پرتله د کلتور وروسته د 12 ورځو د ژوندي پاتې کیدو اندازه ښیي. د مختلفو خنزیرانو څخه، یو طرفه ANOVA ازموینه ترسره کیږي؛ ####p < 0.0001، ###p < 0.001 د D0 په پرتله او **p < 0.01 د D12 Ctrl په پرتله). b د بار ګراف د ټولو څلورو کلتوري شرایطو (Ctrl، TD، MC، او MT) کې د تازه زړه ټوټو (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD او D12 MT)، 12 (D12 MC) ټوټو/ګروپ په پرتله د کلتور وروسته د 12 ورځو د ژوندي پاتې کیدو اندازه ښیي. د مختلفو خنزیرانو څخه، یو طرفه ANOVA ازموینه ترسره کیږي؛ ####p < 0.0001، ###p < 0.001 د D0 په پرتله او **p < 0.01 د D12 ctrl په پرتله). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 усеховирования (CONTROL, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD او D12 MT) разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0 и **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b د بار ګراف د ټولو څلورو کلتوري شرایطو (کنټرول، TD، MC، او MT) کې د تازه زړه برخو (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD، او D12 MT)، 12 (D12 MC) برخو/ګروپ په پرتله د کلتور وروسته د 12 ورځو کې د ژوندي پاتې کیدو اندازه ښیي چې د مختلفو خنزیرانو څخه، یو طرفه ANOVA ازموینه؛ ####p < 0.0001، ###p < 0.001 د D0 او **p < 0.01 په پرتله د D12 Ctrl په پرتله). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片、D0) (n = 18 (D10D5) TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 0.01 د 12 ډی 控制).ب ۴ ۱۲ (D۱۲ ایم سي) b Гистограма, показывающая все 4 условия культивирования (controll, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами (d0dn) = серзами (серзами) 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, #0001, D0، **p <0,01 по сравнению د D12 کنټرول سره). b هسټوګرام د تازه زړه برخو (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD او D12 MT) په پرتله د ټولو 4 کلتور شرایطو (کنټرول، TD، MC او MT) ښیي، د مختلفو خنزیرونو 12 (D12 MC) برخو/ګروپ څخه، یو طرفه ANOVA ازموینه؛ ####p<0.0001، ###p<0.001 vs. D0، **p<0.01 vs. کنټرول D12). c بار ګراف د ټولو څلورو کلتوري شرایطو (Ctrl، TD، MC، او MT) کې د تازه زړه سلائسونو (D0) په پرتله د 12 ورځو وروسته د ګلوکوز فلکس اندازه کول ښیې (n = د مختلفو خنزیرونو څخه 6 سلائسونه / ګروپ، یو طرفه ANOVA ازموینه ترسره کیږي؛ ###p < 0.001، د D0 په پرتله او ***p < 0.001 د D12 Ctrl په پرتله). c بار ګراف د ټولو څلورو کلتوري شرایطو (Ctrl، TD، MC، او MT) کې د تازه زړه سلائسونو (D0) په پرتله د 12 ورځو وروسته د ګلوکوز فلکس اندازه کول ښیې (n = د مختلفو خنزیرونو څخه 6 سلائسونه / ګروپ، یو طرفه ANOVA ازموینه ترسره کیږي؛ ###p < 0.001، د D0 په پرتله او ***p < 0.001 د D12 Ctrl په پرتله). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 усех усеховирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, однолостый свиней ANOVA; ###p <0,001 по сравнению с D0 او ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c هسټوګرام د ټولو څلورو کلتوري شرایطو (کنټرول، TD، MC او MT) لاندې د تازه زړه برخو (D0) په پرتله د 12 ورځو وروسته د ګلوکوز جریان اندازه کول ښیې (n = د مختلفو خنزیرانو څخه 6 برخې/ګروپ، یو طرفه ANOVA ازموینه ترسره شوې؛ ###p < 0.001 د D0 په پرتله او ***p < 0.001 د D12 په پرتله Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比养切片天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行انووا 测试；###p <0.001,.0*0p <0.0* د D12 Ctrl په اړه. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片切片片培养 后 12 天的 通量 定量 （n = 6 片/组，来自猪，猪猪单吡后测试；###p <0.001，与D0 相比,***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех 4ивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, одроных свиней, одновежими сердца) тесты ANOVA; ###p <0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c هسټوګرام د ټولو څلورو کلتوري شرایطو (کنټرول، TD، MC، او MT) لپاره د 12 ورځو وروسته د ګلوکوز جریان اندازه کول ښیې چې د تازه زړه برخو (D0) په پرتله (n = 6 برخې/ګروپ، د مختلفو خنزیرونو څخه، یو اړخیزه ایا د ANOVA ازموینې ترسره شوې، ###p < 0.001 د D0 په پرتله، ***p < 0.001 د D12 په پرتله (کنټرول).د تازه (آبي)، د ورځې ۱۲ MC (شنه)، او د ورځې ۱۲ MT (سور) نسجونو د فشار تحلیل پلاټونه په لسو سیمه ایزو نسجونو برخو کې (n = ۴ ټوټې/ګروپ، یو طرفه ANOVA ازموینه؛ د ډلو ترمنځ هیڅ د پام وړ توپیر نه و). د آتش فشان پلاټ د زړه د تازه برخو (D0) کې د جامد شرایطو (Ctrl) یا د MT شرایطو (MT) لاندې د ۱۰-۱۲ ورځو لپاره کلتور شوي برخو په پرتله په توپیر سره څرګند شوي جینونه ښیې. f د زړه د برخو لپاره د سارکومیر جینونو تودوخه نقشه چې د هر کلتور شرایطو لاندې کلتور شوي دي. د غلطۍ بارونه د اوسط ± معیاري انحراف استازیتوب کوي.
د غوړ اسید اکسیډیشن څخه ګلایکولیسس ته د سویچ په اړه میټابولیک انحصار د کارډیومیوسایټ ډیفرینټییشن یوه نښه ده. نابالغ کارډیومیوسایټونه په عمده توګه د ATP تولید لپاره ګلوکوز کاروي او د څو کریسټای 5,32 سره هایپوپلاستیک مایټوکونډریا لري. د ګلوکوز کارولو تحلیلونو ښودلې چې د MC او MT شرایطو لاندې، د ګلوکوز کارول د ورځې 0 نسجونو سره ورته وو (شکل 4c). په هرصورت، د Ctrl نمونو د تازه نسجونو په پرتله د ګلوکوز کارولو کې د پام وړ زیاتوالی ښودلی. دا په ګوته کوي چې د CTCM او T3/Dex ترکیب د نسجونو وړتیا لوړوي او د 12 ورځو کلتور شوي زړه برخو میټابولیک فینوټایپ ساتي. سربیره پردې، د فشار تحلیل ښودلې چې د فشار کچه د MT او MS شرایطو لاندې د 12 ورځو لپاره د تازه زړه نسجونو په څیر پاتې شوه (شکل 4d).
د زړه د ټوټې نسجونو په نړیوال ټرانسکرپشنل منظره کې د CTCM او T3/Dex ټولیز اغیز تحلیل کولو لپاره، موږ د ټولو څلورو مختلفو کلتوري شرایطو څخه د زړه په ټوټو کې RNAseq ترسره کړ (ضمیمه معلومات 1). په زړه پورې خبره دا ده چې د MT برخو د تازه زړه نسجونو سره لوړ ټرانسکرپشنل ورته والی ښودلی، چې له 13,642 جینونو څخه یوازې 16 په توپیر سره څرګند شوي. په هرصورت، لکه څنګه چې موږ مخکې وښودله، د Ctrl ټوټې د 10-12 ورځو په کلتور کې وروسته 1229 په توپیر سره څرګند شوي جینونه ښودلي (انځور 4e). دا معلومات د زړه او فایبروبلاست جینونو د qRT-PCR لخوا تایید شوي (ضمیمه انځور 7a-c). په زړه پورې خبره دا ده چې د Ctrl برخو د زړه او حجرو دورې جینونو کم تنظیم او د التهابي جین پروګرامونو فعالول ښودلي. دا معلومات وړاندیز کوي چې جلا کول، کوم چې معمولا د اوږدې مودې کلتور کولو وروسته پیښیږي، په بشپړ ډول د MT شرایطو لاندې کم شوی (ضمیمه انځور 8a، b). د سارکومیر جینونو په دقت سره مطالعې ښودلې چې یوازې د MT شرایطو لاندې هغه جینونه چې سارکومیر (انځور 4f) او د آیون چینل (ضمیمه شکل 9) کوډ کوي خوندي دي، دوی د Ctrl، TD، او MC شرایطو لاندې د فشار څخه ساتي. دا معلومات ښیې چې د میخانیکي او هیمورل محرک (T3/Dex) ترکیب سره، د زړه سلائس ټرانسکرپټوم کولی شي د 12 ورځو په کلتور کې وروسته د تازه زړه سلائسونو ته ورته پاتې شي.
دا نقل موندنې د دې حقیقت لخوا ملاتړ کیږي چې د زړه په برخو کې د کارډیومایوسایتونو جوړښتي بشپړتیا د MT شرایطو لاندې د 12 ورځو لپاره غوره ساتل کیږي، لکه څنګه چې د سالم او ځایی شوي کنیکسین 43 لخوا ښودل شوي (انځور 5a). سربیره پردې، د MT شرایطو لاندې د زړه په برخو کې فایبروسس د Ctrl په پرتله د پام وړ کم شوی او د تازه زړه برخو سره ورته دی (انځور 5b). دا معلومات ښیې چې د میخانیکي محرک او T3/Dex درملنې ترکیب په مؤثره توګه د زړه په برخو کې د زړه جوړښت په کلتور کې ساتي.
د ټروپونین-T (شنه)، کونیکسین 43 (سور)، او DAPI (نیلي) د امیونو فلوروسینس انځورونه چې په تازه جلا شوي زړه برخو (D0) کې یا د 12 ورځو لپاره د زړه د څلورو برخو کلتور شرایطو کې کرل شوي (د پیمانه بار = 100 µm). د زړه د نسجونو د جوړښت بشپړتیا مصنوعي استخباراتو اندازه کول (n = 7 (D0 او D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC او D12 MT) ټوټې/ډله د مختلفو خنزیرانو څخه، یو طرفه ANOVA ازموینه ترسره کیږي؛ ####p < 0.0001 د D0 په پرتله او *p < 0.05، یا ****p < 0.0001 د D12 Ctrl په پرتله). د زړه د نسجونو د جوړښت بشپړتیا مصنوعي استخباراتو اندازه کول (n = 7 (D0 او D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC او D12 MT) ټوټې/ډله د مختلفو خنزیرانو څخه، یو طرفه ANOVA ازموینه ترسره کیږي؛ #### p < 0.0001 د D0 په پرتله او *p < 0.05، یا ****p < 0.0001 د D12 Ctrl په پرتله). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12 Ctrl12)، DMCTD12، DMCTD12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA ; сравнению с D12 Ctrl). د زړه د نسجونو د جوړښتي بشپړتیا اندازه کول د مصنوعي استخباراتو (n = 7 (D0 او D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC او D12 MT) برخو/ګروپ څخه د مختلفو خنزیرانو څخه، د ANOVA یو اړخیزه ازموینه ترسره شوه؛ #### p < 0.0001 د D0 په پرتله او *p < 0.05 یا ****p < 0.0001 د D12 Ctrl په پرتله).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 減**p < 減**p <0. 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc）＄td人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.0001 与D0 和*p <0.05 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.د زړه د نسجونو د جوړښت بشپړتیا اندازه کول د مصنوعي استخباراتو په کارولو سره په مختلفو خنزیرونو (n = 7 (D0 او D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC او D12 MT) برخو/ګروپ) کې د یو اړخیز ANOVA ازموینې سره؛#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 یا ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 د D0 په پرتله او *p < 0.05 یا ****p < 0.0001 د D12 په پرتله Ctrl). b د زړه د هغو ټوټو لپاره استازي انځورونه او اندازه کول چې د میسن د ټرایکروم داغ سره رنګ شوي دي (د پیمانه بار = 500 µm) (n = 10 (D0، D12 Ctrl، D12 TD، او D12 MC)، 9 (D12 MT) ټوټې/ډله د مختلفو خنزیرونو څخه، یو طرفه ANOVA ازموینه ترسره کیږي؛ ####p < 0.0001 د D0 په پرتله او ***p < 0.001، یا ****p < 0.0001 د D12 Ctrl په پرتله). b د زړه د هغو ټوټو لپاره استازي انځورونه او اندازه کول چې د میسن د ټرایکروم داغ سره رنګ شوي دي (د پیمانه بار = 500 µm) (n = 10 (D0، D12 Ctrl، D12 TD، او D12 MC)، 9 (D12 MT) ټوټې/ډله د مختلفو خنزیرونو څخه، یو طرفه ANOVA ازموینه ترسره کیږي؛ ####p < 0.0001 د D0 په پرتله او ***p < 0.001، یا ****p < 0.0001 د D12 Ctrl په پرتله). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона = красителем Массона ( мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC) , 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторон; #100тется односторон; по сравнению с D0 او ***p < 0,001 یا ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b د زړه د هغو برخو استازي انځورونه او اندازه کول چې د ماسن د ټرایکروم داغ سره رنګ شوي (پیمانه بار = 500 µm) (n = 10 (D0، D12 Ctrl، D12 TD او D12 MC)، 9 (D12 MT) برخې/ګروپ د مختلفو خنزیرونو څخه، چې یو طرفه ANOVA ترسره شوي؛ ####p < 0.0001 vs. D0 او ***p < 0.001 یا ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10D CTRL相比,***p <0.001,或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三色染料的心脏切片的代表性和量化（比例尺尼尺 = 500 µm） = 500 µm） d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片切片切片切片‎‏ پاڼې اړوند نور معلومات په فسبوک کې اوګورئ د ‏‎切片 切片 切片‎‏ پاڼې اړوند نور معلومات په فسبوک کې اوګورئ دا 0.001، 或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная =0менка =0менка) (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней/группы, один- способ ANOVA; 0,001 یا ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b د زړه د هغو برخو استازي انځورونه او اندازه کول چې د ماسن ټرای کروم سره رنګ شوي دي (د پیمانه بار = 500 µm) (n = 10 (D0، D12 Ctrl، D12 TD او D12 MC)، د مختلفو خنزیرانو/ګروپ څخه 9 (D12 MT) برخې، د ANOVA یوه طریقه؛ ####p < 0.0001 د D0 په پرتله، ***p < 0.001 یا ****p < 0.0001 د D12 Ctrl په پرتله).د تېروتنې بارونه د اوسط ± معیاري انحراف استازیتوب کوي.
په پای کې، د زړه د هایپرټروفي تقلید کولو لپاره د CTCM وړتیا د زړه د نسجونو د غځولو په زیاتوالي سره ارزول شوې. په CTCM کې، د هوا د خونې لوړ فشار له 80 mmHg څخه 80 mmHg ته لوړ شو. (عادي غځول) تر 140 mmHg پورې. (انځور 6a). دا د غځولو (انځور 6b) کې د 32٪ زیاتوالي سره مطابقت لري، کوم چې دمخه د زړه برخو لپاره د اړونده سلنې غځولو په توګه ښودل شوی و ترڅو د هایپرټروفي کې لیدل شوي ورته سارکومیر اوږدوالی ترلاسه کړي. د انقباض او آرامۍ پرمهال د زړه د نسج غځول او سرعت د شپږو ورځو کلتور (انځور 6c) په جریان کې ثابت پاتې شو. د MT شرایطو څخه د زړه نسج د شپږو ورځو لپاره د عادي غځولو (MT (نورمال)) یا ډیر غځولو شرایطو (MT (OS)) تابع شو. دمخه په کلتور کې د څلورو ورځو وروسته، د هایپرټروفیک بایومارکر NT-ProBNP د MT (عادي) شرایطو (انځور 7a) په پرتله د MT (OS) شرایطو لاندې په مینځ کې د پام وړ لوړ شوی و. سربیره پردې، د شپږو ورځو کلچر کولو وروسته، په MT (OS) (شکل 7b) کې د حجرو اندازه د MT زړه د برخو (نورمال) په پرتله د پام وړ لوړه شوه. سربیره پردې، د NFATC4 اټومي لیږد په ډیر غځیدلي نسجونو کې د پام وړ زیات شو (شکل 7c). دا پایلې د هایپرډیسټینشن وروسته د رنځپوهنې بیا جوړونې پرمختللی پرمختګ ښیې او د دې مفکورې ملاتړ کوي چې د CTCM وسیله د غځیدلي زړه هایپرټروفي سیګنالینګ مطالعې لپاره د پلیټ فارم په توګه کارول کیدی شي.
د هوا د چیمبر فشار، د مایع چیمبر فشار، او د نسجونو د حرکت اندازه کولو نماینده نښې تاییدوي چې د چیمبر فشار د مایع چیمبر فشار بدلوي، چې د نسج ټوټې ورته حرکت رامینځته کوي. b د نورمال غځیدلي (نارنج) او ډیر غځیدلي (نیلي) نسج برخو لپاره د نماینده غځیدلو سلنه او د غځیدلو کچه منحني. c بار ګراف د دورې وخت ښیې (n = په هر ګروپ کې 19 ټوټې، د مختلفو خنزیرونو څخه)، د انقباض وخت (n = په هر ګروپ کې 18-19 ټوټې، د مختلفو خنزیرونو څخه)، د آرام وخت (n = په هر ګروپ کې 19 ټوټې، د مختلفو خنزیرونو څخه)، د نسج حرکت طول (n = 14 ټوټې/ګروپ، د مختلفو خنزیرونو څخه)، د لوړ سیسټولیک سرعت (n = 14 ټوټې/ګروپ، د مختلفو خنزیرونو څخه) او د لوړ آرام کچه (n = 14 (D0)، 15 (D6)) برخې/ګروپونه) د مختلفو خنزیرونو څخه)، د دوه لکۍ لرونکي زده کونکي t-ټیسټ په هیڅ پیرامیټر کې د پام وړ توپیر نه وښود، دا په ګوته کوي چې دا پیرامیټرونه د ډیر ولټاژ سره د کلتور په 6 ورځو کې ثابت پاتې شوي. د غلطۍ بارونه د اوسط ± معیاري انحراف استازیتوب کوي.
د زړه د سلائسونو څخه چې د MT نورمال اسټریچ (Norm) یا overstretching (OS) شرایطو لاندې کلچر شوي دي (n = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm، او D4 MTOS) سلائسونه/ګروپ د مختلفو خنزیرونو څخه، د کلتور رسنیو کې د NT-ProBNP غلظت د بار ګراف اندازه کول، دوه اړخیزه ANOVA ترسره کیږي؛ **p < 0.01 د نورمال اسټریچ په پرتله). د زړه د سلائسونو څخه چې د MT نورمال سټرچ (Norm) یا overstretching (OS) شرایطو لاندې کلچر شوي دي (n = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm، او D4 MTOS) سلائسونه/ګروپ د مختلفو خنزیرونو څخه، د کلتور رسنیو کې د NT-ProBNP غلظت د بار ګراف اندازه کول، دوه اړخیزه ANOVA ترسره کیږي؛ **p < 0.01 د نورمال سټرچ په پرتله).د زړه د سلائسونو څخه د کلتور په منځ کې د NT-ProBNP غلظت کمیتي هسټوګرام چې د نورمال MT stretch (نورمال) یا overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm، او D4).MTOS) سلائسونو / ګروپ څخه د مختلفو خنزیرونو څخه د کلچر میډیم کې ترسره کیږي، د توپیر دوه فکتور تحلیل ترسره کیږي؛**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 د نورمال غځولو په پرتله). یو 在MT 正常拉伸(نورم) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度曢4 (D2 MTNorm) 、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比,p < ۰.۰۱). د زړه په ټوټو کې د NT-ProBNP غلظت اندازه کول د MT نورمال سټریټ (نورم) یا اوورسټریچ (OS) شرایطو لاندې کلتور شوي (n = 4 (D2 MTNorm) ، 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) له مختلف څخه猪的切片/组，可以双向方方发发动;د زړه په ټوټو کې د NT-ProBNP غلظت اندازه کول چې د زړه په ټوټو کې د نورمال MT stretch (نورمال) یا overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm) او D4 MTOS) ټوټو/ګروپ د مختلفو خنزیرونو څخه کرل شوي، د توپیر دوه اړخیز تحلیل؛**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 د نورمال غځولو په پرتله). b د زړه د ټوټو لپاره د ټروپونین-T او WGA (کیڼ اړخ) سره رنګ شوي او د حجرو د اندازې اندازه کول (ښي اړخ) (n = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) حجرې/ګروپ د مختلفو خنزیرونو څخه د 10 مختلفو ټوټو څخه، د دوه لکۍ لرونکي زده کونکي t-ټیسټ ترسره کیږي؛ ****p < 0.0001 د نورمال اوږدوالي په پرتله). b د زړه د ټوټو لپاره د ټروپونین-T او WGA (کیڼ اړخ) سره رنګ شوي او د حجرو د اندازې اندازه کول (ښي اړخ) (n = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) حجرې/ګروپ د مختلفو خنزیرونو څخه د 10 مختلفو ټوټو څخه، د دوه لکۍ لرونکي زده کونکي t-ټیسټ ترسره کیږي؛ ****p < 0.0001 د نورمال اوږدوالي په پرتله). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного определения (разов сердца) 330 (D6 MTOS) , 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой;***Свостовой; 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b د زړه د برخو استازي انځورونه چې د ټروپونین-T او AZP سره رنګ شوي (کیڼ اړخ ته) او د حجرو د اندازې اندازه کول (ښي اړخ ته) (n = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) حجرې/ګروپ د مختلفو خنزیرونو څخه د 10 مختلفو برخو څخه، د دوه لکۍ لرونکي زده کونکي t-ټیسټ ترسره شو؛ ****p < 0.0001 د نورمال فشار په پرتله). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图n3） MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比,****p <0.0001）. b د زړه د ټوټو استازي انځورونه چې د کلکارین-T او WGA سره رنګ شوي (کیڼ اړخ ته) او د حجرو اندازه (ښي اړخ ته) (n = 330 (D6 MTOS)، د 10 مختلفو ټوټو څخه 369 (D6 MTNorm)) حجرې/د بدن د حرکت لپاره د ازموینې ځانګړتیاوې؛ د نورمال غځولو سره پرتله شوي، ****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размена (30D) MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента , ***0*p0p нормальным (د ژوند کولو لپاره). b د زړه د برخو استازي انځورونه چې د ټروپونین-T او AZP سره رنګ شوي (کیڼ اړخ ته) او د حجرو د اندازې اندازه کول (ښي اړخ ته) (n = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) د مختلفو خنزیرانو څخه د 10 مختلفو برخو څخه) حجرې/ګروپ، دوه لکۍ معیار د زده کونکي t؛ ****p < 0.0001 د نورمال فشار په پرتله). c د ورځې 0 او ورځ 6 MTOS د زړه سلائسونو لپاره استازي انځورونه چې د ټروپونین-T او NFATC4 لپاره معافیتي لیبل شوي او د CMs (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) سلائسونو/ګروپ څخه د مختلفو خنزیرونو څخه د NFATC4 د لیږد اندازه کول، د دوه لکۍ لرونکي زده کونکي t-ټیسټ ترسره کیږي؛ *p < 0.05). c د ورځې 0 او ورځ 6 MTOS د زړه سلائسونو لپاره استازي انځورونه چې د ټروپونین-T او NFATC4 لپاره معافیتي لیبل شوي او د CMs (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) سلائسونو/ګروپ څخه د مختلفو خنزیرونو څخه د NFATC4 د لیږد اندازه کول، د دوه لکۍ لرونکي زده کونکي t-ټیسټ ترسره کیږي؛ *p < 0.05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS، иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4، и коняченачения. TRANслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0) , 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняеветрийсторийсов سټيوډنټ؛ *p <0,05). c د زړه د برخو لپاره د 0 او 6 ورځو MTOS کې د استازو انځورونه، د ټروپونین-T او NFATC4 لپاره معافیتي لیبل شوي، او د غار حجرو په هسته کې د NFATC4 لیږد اندازه کول (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) ټوټې/ډله د مختلفو خنزیرونو څخه) د دوه لکۍ لرونکي زده کونکي t-ټیسټ ترسره کړ؛ *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS NFATC4进行双尾学生 نه 检验；*p <0.05). c د calcanin-T او NFATC4 امیونولابیلینګ 第0天和第6天MTOS د زړه ټوټې، او د NFATC4 د مختلفو NFATC4 څخه 易位至CM حجرو نیوکلیوس کم مقدار 化 (n = 4 (D0) 化 (n = 4 (D0) 廄燄 燄 礩 4 (D0) ،时间双尾学生et 电影；*p <0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 TRANслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0) , 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Сть;0p c د مختلفو خنزیرانو څخه د CM په هسته کې د ټروپونین-T او NFATC4 امونولابلینګ او NFATC4 لیږدونې اندازه کولو لپاره د 0 او 6 ورځې کې د MTOS زړه سلائسونو نماینده ګي انځورونه (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) سلائسونه/ګروپ، دوه لکۍ لرونکي t-معیار زده کونکي؛ *p < 0.05).د تېروتنې بارونه د اوسط ± معیاري انحراف استازیتوب کوي.
د زړه او رګونو د ژباړې په اړه څېړنې د حجروي ماډلونو ته اړتیا لري چې د زړه چاپیریال په سمه توګه تولید کړي. پدې څیړنه کې، د CTCM وسیله رامینځته شوې او مشخص شوې چې کولی شي د زړه الټرا پتلي برخې هڅوي. د CTCM سیسټم کې د فیزولوژیکي پلوه همغږي شوي الیکټرو میخانیکي محرک او T3 او ډیکس مایع بډایه کول شامل دي. کله چې د خنزیر د زړه برخې د دې فکتورونو سره مخ شوې، د دوی وړتیا، جوړښتي بشپړتیا، میټابولیک فعالیت، او د ټرانسکرپشنل څرګندونه د 12 ورځو کلتور وروسته د تازه زړه نسج په څیر پاتې شوه. سربیره پردې، د زړه د نسج ډیر غځیدل کولی شي د هایپر ایکسټینشن له امله د زړه هایپرټروفي لامل شي. په ټولیز ډول، دا پایلې د زړه د نورمال فینوټایپ ساتلو کې د فزیولوژیکي کلتور شرایطو مهم رول ملاتړ کوي او د درملو سکرینینګ لپاره یو پلیټ فارم چمتو کوي.
ډیری عوامل د کارډیومایوسایتونو د فعالیت او بقا لپاره د غوره چاپیریال په رامینځته کولو کې مرسته کوي. د دې عواملو څخه ترټولو څرګند د (1) انټر سیلولر تعاملاتو، (2) الیکټرو میخانیکي محرک، (3) هیمورل عوامل، او (4) میټابولیک سبسټریټ پورې اړه لري. د حجرو څخه حجرو ته فزیولوژیکي تعاملات د څو حجرو ډولونو پیچلي درې اړخیزه شبکې ته اړتیا لري چې د خارج حجروي میټریکس لخوا ملاتړ کیږي. دا ډول پیچلي حجروي تعاملات د انفرادي حجرو ډولونو د ګډ کلتور له لارې په ویټرو کې بیا رغونه ستونزمنه ده، مګر د زړه برخو د ارګانوټایپیک طبیعت په کارولو سره په اسانۍ سره ترلاسه کیدی شي.
د زړه د فینوټایپ ساتلو لپاره د زړه د مایکرو سایټونو میخانیکي غځیدل او بریښنایی محرک خورا مهم دي 33,34,35. پداسې حال کې چې میخانیکي محرک په پراخه کچه د hiPSC-CM کنډیشن او پختګۍ لپاره کارول شوی ، ډیری ښکلي مطالعاتو پدې وروستیو کې د غیر محوري بارولو په کارولو سره په کلتور کې د زړه د ټوټو میخانیکي محرک هڅه کړې. دا مطالعات ښیې چې د 2D غیر محوري میخانیکي بار کول د کلتور په جریان کې د زړه په فینوټایپ باندې مثبت اغیزه لري. پدې مطالعاتو کې ، د زړه برخې یا د isometric tensile forces17 ، خطي auxotonic loading18 سره بار شوي ، یا د زړه دوره د ځواک ټرانسډوسر فیډبیک او فشار ډرایو په کارولو سره بیا جوړه شوې وه. په هرصورت ، دا میتودونه د چاپیریال اصلاح پرته غیر محوري نسج غځیدل کاروي ، چې پایله یې د ډیری زړه جینونو فشار یا د غیر معمولي غځیدل غبرګونونو سره تړلي جینونو ډیر څرګندیدل دي. دلته تشریح شوی CTCM یو 3D الیکټرو میخانیکي محرک چمتو کوي چې د دورې وخت او فزیولوژیکي غځیدلو له مخې د زړه طبیعي دورې تقلید کوي (25٪ غځیدل ، 40٪ سیسټول ، 60٪ ډیسټول ، او په یوه دقیقه کې 72 وهل). که څه هم دا درې بعدي میخانیکي محرک یوازې د نسجونو بشپړتیا ساتلو لپاره کافي ندي، د T3/Dex په کارولو سره د هیمورل او میخانیکي محرک ترکیب د نسجونو د ژوند وړتیا، فعالیت او بشپړتیا په مناسب ډول ساتلو لپاره اړین دی.
د لویانو د زړه د فینوټایپ په تعدیل کې مهم رول لوبوي. دا د HiPS-CM مطالعاتو کې روښانه شوی چې پکې T3 او Dex د حجرو د پخیدو د ګړندي کولو لپاره د کلتور رسنیو ته اضافه شوي. T3 ممکن د حجرو غشاګانو په اوږدو کې د امینو اسیدونو، شکرو او کلسیم لیږد اغیزه وکړي 36. سربیره پردې، T3 د MHC-α څرګندونه او MHC-β ښکته کول هڅوي، د جنین CM کې د ورو ټویچ مایو فایبریلونو په پرتله په بالغ کارډیومایوسایټونو کې د ګړندي ټویچ مایو فایبریلونو جوړښت هڅوي. د هایپوتیرایډ ناروغانو کې د T3 کمښت د میو فایبریل بانډونو له لاسه ورکولو او د ټون پراختیا کموالي لامل کیږي 37. ډیکس په ګلوکوکورټیکایډ ریسیپټرونو عمل کوي او ښودل شوي چې په جلا شوي پرفیوز شوي زړونو کې د مایوکارډیال انقباض زیاتوي؛ 38 دا پرمختګ د کلسیم زیرمو پرمختللو ننوتلو (SOCE) 39,40 باندې اغیزې سره تړاو لري. سربیره پردې، ډیکس د خپلو ریسیپټرونو سره تړل کیږي، د پراخ انټراسیلولر غبرګون لامل کیږي چې د معافیت فعالیت او سوزش 30 فشاروي.
زموږ پایلې ښیي چې فزیکي میخانیکي محرک (MS) د Ctrl په پرتله د ټولیز کلتور فعالیت ښه کړی، مګر د کلتور په اوږدو کې د 12 ورځو لپاره د ژوند وړتیا، ساختماني بشپړتیا، او د زړه څرګندونه ساتلو کې پاتې راغلی. د Ctrl په پرتله، د CTCM (MT) کلتورونو ته د T3 او Dex اضافه کول د ژوند وړتیا ښه کړې او د 12 ورځو لپاره د تازه زړه نسج سره ورته د نقل پروفایلونه، ساختماني بشپړتیا، او میټابولیک فعالیت ساتلی. برسېره پردې، د نسجونو د غځولو درجې کنټرولولو سره، د STCM په کارولو سره د هایپر ایکسټینشن هڅول شوي زړه هایپرټروفي ماډل رامینځته شو، چې د STCM سیسټم استعداد څرګندوي. دا باید په پام کې ونیول شي چې که څه هم د زړه بیا رغونه او فایبروسس معمولا د هغو ارګانونو سره تړاو لري چې د گردش حجرې کولی شي مناسب سایټوکینونه او همدارنګه فاګوسیټوسس او نور بیا رغونه عوامل چمتو کړي، د زړه برخې لاهم کولی شي د فشار او صدمې په ځواب کې د فایبروټیک پروسې تقلید وکړي. په مایو فایبروبلاستونو کې. دا دمخه پدې زړه سلائس ماډل کې ارزول شوی. دا باید په یاد ولرئ چې د CTCM پیرامیټرې د فشار / بریښنایی طول او فریکونسۍ بدلولو سره تعدیل کیدی شي ترڅو ډیری شرایط لکه ټیککارډیا، بریډی کارډیا، او میخانیکي دوران ملاتړ (میخانیکي خلاص شوی زړه) تقلید کړي. دا سیسټم د درملو ازموینې لپاره یو منځنی تروپټ جوړوي. د CTCM وړتیا چې د ډیر فشار له امله رامینځته شوي د زړه هایپرټروفي ماډل کړي د شخصي درملنې لپاره د دې سیسټم ازموینې ته لاره هواروي. په پایله کې، اوسنۍ څیړنه ښیي چې میخانیکي غځیدل او هیمورل محرک د زړه د نسج برخو د کلتور ساتلو لپاره خورا مهم دي.
که څه هم دلته وړاندې شوي معلومات ښیي چې CTCM د سالم مایوکارډیم ماډل کولو لپاره یو ډیر امید لرونکی پلیټ فارم دی، دا د کلتور طریقه ځینې محدودیتونه لري. د CTCM کلتور اصلي محدودیت دا دی چې دا په سلائسونو باندې دوامداره متحرک میخانیکي فشارونه وضع کوي، کوم چې د هر دورې په جریان کې د زړه د ټوټې انقباضاتو په فعاله توګه د څارنې وړتیا منع کوي. سربیره پردې، د زړه د برخو د کوچنۍ اندازې (7 ملي میتر) له امله، د دودیز ځواک سینسرونو په کارولو سره د کلتور سیسټمونو څخه بهر د سیسټولیک فعالیت ارزولو وړتیا محدوده ده. په اوسني لاسوند کې، موږ د انقباض فعالیت شاخص په توګه د نظری ولټاژ ارزولو سره په جزوي ډول دا محدودیت لرې کوو. په هرصورت، دا محدودیت به نور کار ته اړتیا ولري او ممکن په راتلونکي کې په کلتور کې د زړه د ټوټې فعالیت د نظری څارنې لپاره میتودونو معرفي کولو سره حل شي، لکه د کلسیم او ولټاژ حساس رنګونو په کارولو سره نظری نقشه کول. د CTCM یو بل محدودیت دا دی چې کاري ماډل فزیولوژیکي فشار (پریلوډ او افټرلوډ) نه اداره کوي. په CTCM کې، فشار په مخالفو لارښوونو کې هڅول شوی و ترڅو په ډیرو لویو نسجونو کې په ډیسټول (بشپړ اوږدوالی) او سیسټول (د بریښنایی محرک په جریان کې د انقباض اوږدوالی) کې 25٪ فیزیولوژیکي فشار تولید کړي. دا محدودیت باید په راتلونکي CTCM ډیزاینونو کې د زړه په نسجونو باندې د دواړو خواوو څخه د کافي فشار او د زړه په چیمبرونو کې د فشار او حجم دقیق اړیکو پلي کولو سره لرې شي.
په دې لاسوند کې راپور شوي د اوور سټرچ-انډیوسډ ریموډلینګ د هایپرټروفیک هایپر سټرچ سیګنالونو تقلید کولو پورې محدود دی. په دې توګه، دا ماډل کولی شي د هیمورل یا عصبي فکتورونو اړتیا پرته د سټرچ-انډیوسډ هایپرټروفیک سیګنالینګ مطالعې کې مرسته وکړي (کوم چې پدې سیسټم کې شتون نلري). د CTCM د ضرب الاجل زیاتولو لپاره نورو مطالعاتو ته اړتیا ده، د مثال په توګه، د معافیت حجرو سره ګډ کلتور کول، د پلازما هیمورل فکتورونو گردش کول، او د نیورونال حجرو سره ګډ کلتور کولو په وخت کې انرویشن به د CTCM سره د ناروغۍ ماډلینګ امکانات ښه کړي.
په دې څیړنه کې دیارلس خنزیرونه کارول شوي وو. د څارویو ټولې کړنلارې د اداري لارښوونو سره سم ترسره شوې او د لویسویل پوهنتون د اداري څارویو پاملرنې او کارونې کمیټې لخوا تصویب شوې. د اورتیک آرچ بند شو او زړه د 1 لیتر جراثیم لرونکي کارډیوپلجیا سره خوشبو شو (110 mM NaCl، 1.2 mM CaCl2، 16 mM KCl، 16 mM MgCl2، 10 mM NaHCO3، 5 U/mL هیپرین، pH تر 7.4 پورې)؛ زړونه د یخ په سړه زړه محلول کې ساتل شوي وو تر هغه چې لابراتوار ته په یخ کې ولیږدول شي چې معمولا <10 دقیقې وي. زړونه د یخ په سړه زړه محلول کې ساتل شوي وو تر هغه چې لابراتوار ته په یخ کې ولیږدول شي چې معمولا <10 دقیقې وي. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. زړونه د یخ په سړه زړه محلول کې ساتل کېدل تر هغه چې په یخ کې لابراتوار ته ولیږدول شي، چې معمولا <10 دقیقې وخت نیسي.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室,通常<10分钟.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室,通常<10分钟. Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min. زړه په یخ کارډیوپلجیا کې وساتئ تر هغه چې لابراتوار ته په یخ کې لیږدول کیږي، معمولا د یخ څخه کم نه وي.
د CTCM وسیله د سولیډ ورکس کمپیوټر په مرسته ډیزاین (CAD) سافټویر کې رامینځته شوې. د کلتور خونې، ویشونکي او هوایی خونې د CNC روښانه اکریلیک پلاستیک څخه جوړ شوي دي. د 7 ملي میتر قطر بیک اپ حلقه په مرکز کې د لوړ کثافت پالیتیلین (HDPE) څخه جوړه شوې ده او د سیلیکون O- حلقه ځای په ځای کولو لپاره د O- حلقه لري چې د میډیا لاندې مهر کولو لپاره کارول کیږي. یو پتلی سیلیکا جھلی د کلتور خونه د جلا کولو پلیټ څخه جلا کوي. د سیلیکون جھلی د 0.02 انچ ضخامت سیلیکون شیټ څخه لیزر پرې شوی او د 35A سختوالی لري. ښکته او پورته سیلیکون ګازکیټونه د 1/16 انچ ضخامت سیلیکون شیټ څخه لیزر پرې شوي او د 50A سختوالی لري. د 316L سټینلیس سټیل پیچونه او د وزر مغز د بلاک د ټینګولو او د هوا بند مهر جوړولو لپاره کارول کیږي.
یو وقف شوی چاپ شوی سرکټ بورډ (PCB) د C-PACE-EM سیسټم سره د مدغم کولو لپاره ډیزاین شوی. په PCB کې د سویس ماشین نښلونکي ساکټونه د سپینو زرو پوښل شوي مسو تارونو او د برونزو 0-60 پیچونو په واسطه چې په الکترودونو کې پیچ شوي دي د ګرافایټ الکترودونو سره وصل دي. چاپ شوی سرکټ بورډ د 3D پرنټر په پوښ ​​کې ځای په ځای شوی.
د CTCM وسیله د پروګرام وړ نیوماتیک ایکچویټر (PPD) لخوا کنټرول کیږي چې د زړه د دورې په څیر کنټرول شوی دوراني فشار رامینځته کوي. لکه څنګه چې د هوا چیمبر دننه فشار زیاتیږي، د انعطاف وړ سیلیکون غشا پورته پراخیږي، چې د نسج سایټ لاندې منځنی فشار راوړي. بیا به د نسج ساحه د مایع د دې اخراج له لارې غځول کیږي، چې د ډیسټول په جریان کې د زړه د فزیولوژیکي پراختیا تقلید کوي. د آرامۍ په اوج کې، بریښنایی محرک د ګرافیټ الکترودونو له لارې پلي شو، کوم چې د هوا چیمبر کې فشار کم کړ او د نسج برخو انقباض یې رامینځته کړ. د پایپ دننه یو هیموسټاتیک والو دی چې د فشار سینسر سره د هوا سیسټم کې فشار کشف کوي. د فشار سینسر لخوا احساس شوی فشار د لیپ ټاپ سره وصل شوي ډیټا راټولونکي ته پلي کیږي. دا د ګاز چیمبر دننه د فشار دوامداره څارنې ته اجازه ورکوي. کله چې د چیمبر اعظمي فشار ته ورسید (معیاري 80 mmHg، 140 mmHg OS)، د معلوماتو ترلاسه کولو وسیله ته امر شوی و چې د C-PACE-EM سیسټم ته سیګنال واستوي ترڅو د 2 ms لپاره د بایفاسیک ولټاژ سیګنال تولید کړي، چې 4 V ته ټاکل شوی.
د زړه برخې ترلاسه شوې او په شپږو څاګانو کې د کلتور شرایط په لاندې ډول ترسره شول: راټول شوي زړونه د لیږدونکي رګ څخه هغه ټری ته انتقال کړئ چې سړه (4° C.) کارډیوپلیجیا لري. کیڼ وینټریکل د جراثیمي تیغ سره جلا شو او د 1-2 سانتي مترو په ټوټو کې پرې شو. دا نسج بلاکونه د نسج ملاتړ سره د نسج چپکونکي سره وصل شوي او د ټایرډ محلول لرونکي مایکروټوم نسج حمام کې ځای په ځای شوي او په دوامداره توګه اکسیجن شوي (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM)، 140 mM NaCl (8.18 g). )، 6 mM KCl (0.447 g)، 10 mM D-ګلوکوز (1.86 g)، 10 mM HEPES (2.38 g)، 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M محلول)، 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M محلول)، تر 1 L ddH2O پورې. د وایبریشن مایکروټوم د 80 هرټز فریکونسۍ، د 2 ملي میتر افقي وایبریشن طول او د 0.03 ملي میتر/سیکنډ د مخکینۍ کچې سره د 300 µm ضخامت ټوټې پرې کولو لپاره ټاکل شوی و. د نسج حمام د یخ سره محاصره شوی و ترڅو محلول یخ وساتي او تودوخه په 4 درجو سانتي ګراد کې ساتل شوې وه. د مایکروټوم حمام څخه د نسج برخې د انکیوبیشن حمام ته انتقال کړئ چې په دوامداره توګه اکسیجن شوي ټایرډ محلول په یخ باندې لري تر هغه چې د یو کلتور پلیټ لپاره کافي برخې ترلاسه شي. د ټرانس ویل کلتورونو لپاره، د نسج برخې د 6 ملي میتر پراخ پولی یوریتان ملاتړ سره وصل شوې او په 6 ملی لیتر مطلوب میډیم کې ځای په ځای شوې (199 میډیم، 1x ITS ضمیمه، 10٪ FBS، 5 ng/ml VEGF، 10 ng/ml FGF-alkaline او 2X انټي بیوټیک-انټي فنګس). بریښنایی محرک (10 V، فریکونسي 1.2 Hz) د C-Pace له لارې د نسج برخو ته تطبیق شو. د TD شرایطو لپاره، تازه T3 او Dex په هر منځني بدلون کې په 100 nM او 1 μM کې اضافه شوي. منځنۍ برخه په ورځ کې 3 ځله د بدلولو دمخه د اکسیجن سره مشبوع کیږي. د نسج برخې په انکیوبیټر کې په 37 درجو سانتی ګراد او 5٪ CO2 کې کرل شوي.
د CTCM کلتورونو لپاره، د نسج برخې په یوه دودیز جوړ شوي 3D پرنټر کې په پیټري ډش کې ځای پر ځای شوي چې د ترمیم شوي ټایرود محلول لري. دا وسیله د زړه د ټوټې اندازه د ملاتړ حلقې د ساحې 25٪ پورې زیاتولو لپاره ډیزاین شوې. دا کار د دې لپاره ترسره کیږي چې د زړه برخې د ټایرود محلول څخه میډیم ته لیږدولو وروسته او د ډیسټول په جریان کې پراخه نشي. د هسټوکرایلیک ګلو په کارولو سره، 300 µm ضخامت برخې د 7 ملي میتر قطر ملاتړ حلقې کې تنظیم شوې. د ملاتړ حلقې سره د نسج برخې نښلولو وروسته، اضافي نسج برخې پرې کړئ او ضمیمه شوي نسج برخې بیرته د یخ (4°C) په ټایرود محلول حمام کې ځای په ځای کړئ تر هغه چې د یوې وسیلې لپاره کافي برخې چمتو نه شي. د ټولو وسیلو لپاره د پروسس کولو ټول وخت باید له 2 ساعتونو څخه ډیر نه وي. وروسته له هغه چې د نسج 6 برخې د دوی د ملاتړ حلقو سره وصل شي، د CTCM وسیله راټوله شوه. د CTCM کلتور خونه د 21 ملی لیتر دمخه اکسیجن شوي میډیم سره دمخه ډکه شوې ده. د نسج برخې د کلچر خونې ته انتقال کړئ او په احتیاط سره د پایپټ سره هر ډول هوایی بلبلونه لرې کړئ. د نسج برخه بیا سوري ته لارښوونه کیږي او په نرمۍ سره ځای په ځای کیږي. په پای کې، د الکترود کیپ په وسیله کې ځای په ځای کړئ او وسیله انکیوبیټر ته انتقال کړئ. بیا CTCM د هوا ټیوب او C-PACE-EM سیسټم سره وصل کړئ. نیوماتیک ایکچویټر خلاصیږي او د هوا والو CTCM خلاصوي. د C-PACE-EM سیسټم د 2 ms لپاره د بایفاسیک پیسینګ په جریان کې په 1.2 Hz کې 4 V رسولو لپاره تنظیم شوی و. میډیم په ورځ کې دوه ځله بدل شوی و او الیکټروډونه په ورځ کې یو ځل بدل شوي ترڅو په الیکټروډونو کې د ګرافایټ راټولیدو مخه ونیسي. که اړتیا وي، د نسج برخې د دوی د کلتور څاګانو څخه لرې کیدی شي ترڅو هر هغه هوایی بلبلونه چې ممکن د دوی لاندې راوتلي وي وباسي. د MT درملنې شرایطو لپاره، T3/Dex د هر میډیم بدلون سره د 100 nM T3 او 1 μM Dex سره تازه اضافه شوی. د CTCM وسایل په 37°C او 5% CO2 کې په انکیوبیټر کې کلچر شوي وو.
د زړه د ټوټو د غځیدلي ټراجیکټوریو ترلاسه کولو لپاره، د کیمرې یو ځانګړی سیسټم رامینځته شو. د SLR کیمره (کینن ریبل T7i، کینن، ټوکیو، جاپان) د نیویټار زوم 7000 18-108 ملي میتر میکرو لینز (نیویټار، سان فرانسسکو، CA) سره کارول شوې. لید د خونې په تودوخه کې د تازه میډیم سره د میډیم بدلولو وروسته ترسره شو. کیمره په 51 درجې زاویه کې موقعیت لري او ویډیو په هر ثانیه کې 30 چوکاټونو کې ثبت کیږي. لومړی، د خلاصې سرچینې سافټویر (MUSCLEMOTION43) د Image-J سره کارول شوی ترڅو د زړه ټوټو حرکت اندازه کړي. ماسک د MATLAB (MathWorks، Natick، MA، USA) په کارولو سره رامینځته شوی ترڅو د زړه ټوټو د وهلو لپاره د علاقې سیمې تعریف کړي ترڅو د شور څخه مخنیوی وشي. په لاسي ډول قطع شوي ماسکونه په ټولو عکسونو کې د چوکاټ ترتیب کې پلي کیږي او بیا د MUSCLEMOTION پلگ ان ته لیږدول کیږي. د عضلاتو حرکت په هر چوکاټ کې د پکسلونو اوسط شدت کاروي ترڅو د حوالې چوکاټ سره پرتله خپل حرکت اندازه کړي. معلومات ثبت شوي، فلټر شوي او د زړه د دورې په جریان کې د دورې وخت اندازه کولو او د نسجونو د غځولو ارزولو لپاره کارول شوي. ثبت شوې ویډیو د لومړي ترتیب صفر پړاو ډیجیټل فلټر په کارولو سره وروسته پروسس شوه. د نسجونو د غځولو (چوکی څخه تر چوکۍ پورې) اندازه کولو لپاره، د ثبت شوي سیګنال کې د څوکو او ټروفونو ترمنځ توپیر کولو لپاره د چوکۍ څخه تر چوکۍ پورې تحلیل ترسره شو. سربیره پردې، ډیټرینډینګ د سیګنال ډرافټ له منځه وړلو لپاره د شپږم ترتیب پولینومیل په کارولو سره ترسره کیږي. د پروګرام کوډ په MATLAB کې رامینځته شوی ترڅو د نړیوال نسج حرکت، د دورې وخت، د آرام وخت، او انقباض وخت وټاکي (د اضافي پروګرام کوډ 44).
د فشار تحلیل لپاره، د میخانیکي فشار ارزونې لپاره جوړ شوي ورته ویډیوګانو په کارولو سره، موږ لومړی د MUSCLEMOTION سافټویر سره سم د حرکت څوکو (د حرکت ترټولو لوړ (پورته) او ټیټ (ټیټ) ټکي) استازیتوب کولو دوه عکسونه تعقیب کړل. بیا موږ د نسجونو سیمې وویشلې او د سیګمینټ شوي نسج لپاره د سیګمینټ الګوریتم یوه بڼه پلي کړه (ضمیمه انځور 2a). بیا موږ قطع شوي نسج په لسو فرعي سطحو ویشل شو، او په هر سطح باندې فشار د لاندې معادلې په کارولو سره محاسبه شو: فشار = (Sup-Sdown)/Sdown، چیرې چې Sup او Sdown د ټوکر د پورتنۍ او ښکته سیوري څخه د شکل واټن دی، په ترتیب سره (ضمیمه انځور .2b).
د زړه برخې د ۴۸ ساعتونو لپاره په ۴٪ پارافارمالډیهایډ کې تنظیم شوې. ثابت نسجونه د ۱ ساعت لپاره په ۱۰٪ او ۲۰٪ سوکروز کې ډیهایډریټ شوي، بیا د شپې په ۳۰٪ سوکروز کې. برخې بیا د مطلوب پرې کولو تودوخې مرکب (OCT مرکب) کې ځای پرځای شوي او په تدریجي ډول په ایزوپینټین / وچ یخ حمام کې کنګل شوي. د OCT ایمبیډینګ بلاکونه په -۸۰ °C کې تر جلا کیدو پورې ذخیره کړئ. سلایډونه د ۸ μm ضخامت سره د برخو په توګه چمتو شوي.
د زړه له برخو څخه د OCT لرې کولو لپاره، سلایډونه په 95 درجو سانتی ګراد کې د 5 دقیقو لپاره ګرم کړئ. په هر سلایډ کې 1 ملی لیتر PBS اضافه کړئ او د خونې په تودوخه کې د 30 دقیقو لپاره انکیوبیټ کړئ، بیا د خونې په تودوخه کې د 15 دقیقو لپاره په PBS کې د 0.1٪ Triton-X په تنظیمولو سره برخو ته ننوځي. د نمونې سره د غیر مشخص انټي باډیزونو د تړلو مخنیوي لپاره، سلایډونو ته د 3٪ BSA محلول 1 ملی لیتر اضافه کړئ او د خونې په تودوخه کې د 1 ساعت لپاره انکیوبیټ کړئ. بیا BSA لرې شو او سلایډونه د PBS سره ومینځل شول. هر نمونه د پنسل سره په نښه کړئ. لومړني انټي باډي (په 1% BSA کې 1:200 کم شوي) (connexin 43 (Abcam; #AB11370)، NFATC4 (Abcam; #AB99431) او ټروپونین-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) د 90 دقیقو په اوږدو کې اضافه شول، بیا ثانوي انټي باډي (په 1% BSA کې 1:200 کم شوي) د موږک الیکسا فلور 488 (Thermo Scientific; #A16079) په وړاندې، د خرگوش الیکسا فلور 594 (Thermo Scientific; #T6391) په وړاندې د 90 دقیقو لپاره د PBS سره 3 ځله مینځل شوي د هدف داغ د شالید څخه توپیر کولو لپاره، موږ یوازې ثانوي انټي باډي د کنټرول په توګه کارولې. په پای کې، د DAPI اټومي داغ اضافه شو او سلایډونه په ویکټاشیلډ (ویکٹر لابراتوارونو) کې ځای په ځای شول او د نیل پالش سره مهر شول. -x میګنیفیکیشن) او کینس مایکروسکوپ د 40x میګنیفیکیشن سره.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) په PBS کې په 5 μg/ml کې د WGA داغ کولو لپاره کارول شوی و او د خونې په تودوخه کې د 30 دقیقو لپاره په ثابت برخو کې پلي شوی و. بیا سلایډونه د PBS سره مینځل شوي او سوډان تور په هر سلایډ کې اضافه شوی او د 30 دقیقو لپاره انکیوبیټ شوی و. بیا سلایډونه د PBS سره مینځل شوي او د ویکټاشیلډ سرایت کولو میډیم اضافه شوی و. سلایډونه د کینس مایکروسکوپ په 40x لویوالي کې لیدل شوي.
OCT د پورته تشریح شوي نمونو څخه لرې شو. د OCT لرې کولو وروسته، سلایډونه د شپې لپاره د بوین محلول کې ډوب کړئ. بیا سلایډونه د یو ساعت لپاره د تشو اوبو سره مینځل شوي او بیا د 10 دقیقو لپاره د بیبریچ الو اسید فوچین محلول کې ځای په ځای شوي. بیا سلایډونه د تشو اوبو سره مینځل شوي او د 5٪ فاسفومولیبډینم / 5٪ فاسفوټنګسټیک اسید په محلول کې د 10 دقیقو لپاره ځای په ځای شوي. پرته له مینځلو، سلایډونه د 15 دقیقو لپاره مستقیم د انیلین نیلي محلول ته انتقال کړئ. بیا سلایډونه د تشو اوبو سره مینځل شوي او د 1٪ اسټیک اسید محلول کې د 2 دقیقو لپاره ځای په ځای شوي. سلایډونه په 200 N ایتانول کې وچ شوي او زایلین ته لیږدول شوي. رنګ شوي سلایډونه د 10x هدف سره د کینس مایکروسکوپ په کارولو سره لیدل شوي. د فایبروسس ساحې سلنه د کینس تحلیل کونکي سافټویر په کارولو سره اندازه شوې.
د CyQUANT™ MTT حجرو د وابستګۍ ارزونه (انویټروجن، کارلسباد، CA)، د کتلاګ شمیره V13154، د جوړونکي پروتوکول سره سم د ځینو تعدیلاتو سره. په ځانګړې توګه، د MTT تحلیل په جریان کې د نسجونو د یونیفورم اندازې ډاډ ترلاسه کولو لپاره د 6 ملي میتر قطر سره جراحي پنچ کارول شوی و. نسجونه په انفرادي ډول د 12 څاه پلیټ په څاه ګانو کې پلیټ شوي وو چې د تولیدونکي پروتوکول سره سم MTT سبسټریټ لري. برخې د 3 ساعتونو لپاره په 37 درجو سانتي ګراد کې انکیوبیټ کیږي او ژوندی نسج د MTT سبسټریټ میټابولیز کوي ترڅو ارغواني فارمازان مرکب جوړ کړي. د MTT محلول د 1 ملی لیتر DMSO سره بدل کړئ او د 15 دقیقو لپاره په 37 درجو سانتي ګراد کې انکیوبیټ کړئ ترڅو د زړه له برخو څخه ارغواني فارمازان راوباسئ. نمونې په 96 ښه روښانه لاندې پلیټونو کې په DMSO کې 1:10 حل شوي او د ارغواني رنګ شدت د Cytation پلیټ ریډر (BioTek) په کارولو سره په 570 nm کې اندازه شوی. لوستل د زړه د هرې ټوټې وزن سره نورمال شوي.
د زړه د ټوټې کولو رسنۍ د ګلوکوز کارولو ارزونې لپاره د 1 μCi/ml [5-3H]-ګلوکوز لرونکي رسنیو سره بدله شوه (موراویک بایوکیمیکلز، بریا، CA، USA) لکه څنګه چې مخکې تشریح شوي. د 4 ساعتونو انکیوبیشن وروسته، 100 μl میډیم په خلاص مایکرو سینټرفیوج ټیوب کې اضافه کړئ چې 100 μl 0.2 N HCl لري. بیا ټیوب په یوه سینټرفیوج ټیوب کې کیښودل شو چې 500 μl dH2O لري ترڅو د 72 ساعتونو لپاره په 37 درجو سانتی ګراد کې تبخیر شي. بیا مایکرو سینټرفیوج ټیوب د سینټرفیوج ټیوب څخه لرې کړئ او 10 ملی لیتر سینټرفیوج مایع اضافه کړئ. د سینټرفیوج شمیرنې د ټرای کارب 2900TR مایع سینټرفیوج تحلیل کونکي (پیکارډ بایو ساینس شرکت، میریډن، CT، USA) په کارولو سره ترسره شوې. بیا د ګلوکوز کارول د [5-3H] - ګلوکوز ځانګړي فعالیت، نامکمل توازن او شالید، د [5-3H] - غیر لیبل شوي ګلوکوز ته د کمولو، او د سینټیلیشن ضد موثریت په پام کې نیولو سره محاسبه شول. معلومات د زړه د برخو د ډله ایزې کچې سره نورمال شوي دي.
په ټریزول کې د نسجونو د همجنس کولو وروسته، د جوړونکي پروتوکول سره سم د Qiagen miRNeasy مایکرو کټ #210874 په کارولو سره RNA د زړه له برخو څخه جلا شو. د RNAsec کتابتون چمتو کول، ترتیب کول او د معلوماتو تحلیل په لاندې ډول ترسره شو:
د RNA کتابتون د چمتو کولو لپاره د پیل موادو په توګه د هر نمونې لپاره 1 μg RNA کارول شوی و. د ترتیب کتابتونونه د NEBNext UltraTM RNA کتابتون د چمتووالي کټ په کارولو سره د Illumina (NEB، USA) لپاره د جوړونکي سپارښتنو په تعقیب تولید شوي، او د هر نمونې لپاره د ځانګړتیا ترتیبونو ته د شاخص کوډونه اضافه شوي. په لنډه توګه، mRNA د ټول RNA څخه پاک شو چې د پولی-T اولیګونیوکلیوټایډونو سره وصل شوي مقناطیسي موتیو په کارولو سره. ټوټه کول د NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) کې په لوړه تودوخه کې د دوه اړخیزو کیشنونو په کارولو سره ترسره کیږي. لومړی سټرینډ cDNA د تصادفي هیکسامر پرائمرونو او M-MuLV ریورس ټرانسکرپټیس (RNase H-) په کارولو سره ترکیب شوی و. دوهم سټرینډ cDNA بیا د DNA پولیمیرز I او RNase H په کارولو سره ترکیب کیږي. پاتې اوور هینګونه د exonuclease/polymerase فعالیت لخوا بلنټ پایونو ته بدلیږي. د DNA ټوټې د 3′ پای د اډینیلیشن وروسته، د ویښتو د لوپ جوړښت سره یو NEBNext اډاپټر د هایبرډیزیشن لپاره چمتو کولو لپاره ورسره وصل دی. د غوره اوږدوالي 150-200 bp د cDNA ټوټو د انتخاب لپاره. د کتابتون ټوټې د AMPure XP سیسټم (بیکمن کولټر، بیورلي، امریکا) په کارولو سره پاکې شوې. بیا، د 3 μl USER انزایم (NEB، امریکا) د اندازې غوره شوي cDNA سره د اډاپټر سره تړل شوی د 15 دقیقو لپاره په 37 درجو سانتي ګراد کې او بیا د PCR دمخه د 95 درجو سانتي ګراد کې د 5 دقیقو لپاره کارول شوی. PCR بیا د فیوژن لوړ وفاداري DNA پولیمریز، یونیورسل PCR پرائمرز، او انډیکس (X) پرائمرز په کارولو سره ترسره شو. په پای کې، د PCR محصولات پاک شول (AMPure XP سیسټم) او د کتابتون کیفیت په Agilent Bioanalyzer 2100 سیسټم کې ارزول شوی. د cDNA کتابتون بیا د نوواسیک سیکوینسر په کارولو سره ترتیب شو. د Illumina څخه خام عکس فایلونه د CASAVA بیس کالینګ په کارولو سره خام لوستلو ته بدل شوي. خام معلومات په FASTQ(fq) فارمیټ فایلونو کې زیرمه شوي چې د لوستلو ترتیبونه او اړونده اساس کیفیتونه لري. د فلټر شوي ترتیب لوستلو سره د Sscrofa11.1 حوالې جینوم سره سمون لپاره HISAT2 غوره کړئ. په عمومي توګه، HISAT2 د هر اندازې جینومونو ملاتړ کوي، په شمول د 4 ملیارد بیسونو څخه لوی جینومونه، او ډیفالټ ارزښتونه د ډیری پیرامیټرو لپاره ټاکل شوي. د RNA Seq ډیټا څخه د لوستلو جلا کول د HISAT2 په کارولو سره په مؤثره توګه تنظیم کیدی شي، چې اوس مهال ترټولو ګړندی سیسټم شتون لري، د بل هر میتود په پرتله ورته یا غوره دقت سره.
د ټرانسکرپټونو کثرت په مستقیم ډول د جین د څرګندولو کچه منعکس کوي. د جین د څرګندولو کچه د جینوم یا ایکسون سره تړلي د ټرانسکرپټونو (د ترتیب شمیرې) د کثرت له مخې ارزول کیږي. د لوستلو شمیر د جین د څرګندولو کچې، د جین اوږدوالی، او د ترتیب ژوروالي سره متناسب دی. FPKM (د هر ملیون بیس جوړو ترتیب شوي ټرانسکرپټ په هر زره بیس جوړو کې ټوټې) محاسبه شوې او د توپیري اظهار P- ارزښتونه د DESeq2 پیکج په کارولو سره ټاکل شوي. بیا موږ د جوړ شوي R-فعال "p.adjust" پراساس د بینجامیني-هچبرګ میتود9 په کارولو سره د هر P ارزښت لپاره د غلط کشف کچه (FDR) محاسبه کړه.
د زړه له برخو څخه جلا شوی RNA د ترمو (ترمو، بلی. نمبر 11756050) څخه د سوپر سکریپټ IV ویلو ماسټر مخلوط په کارولو سره د 200 ng/μl غلظت سره cDNA ته بدل شو. مقداري RT-PCR د اپلایډ بایو سیسټم انډورا پلیټ مایکرو امپ 384-ښه شفاف غبرګون پلیټ (ترمو، بلی. نمبر 4483319) او مایکرو امپ آپټیکل چپکونکي (ترمو، بلی. نمبر 4311971) په کارولو سره ترسره شو. د غبرګون مخلوط د 5 µl تاقمان فاسټ اډوانسډ ماسټر مخلوط (ترمو، بلی # 4444557)، 0.5 µl تاقمان پرائمر او 3.5 µl H2O مخلوط په هر څاه کې شامل و. معیاري qPCR دورې چلول شوې او د CT ارزښتونه د اپلایډ بایو سیسټم کوانټ سټوډیو 5 ریښتیني وخت PCR وسیلې (384-ښه ماډل؛ محصول # A28135) په کارولو سره اندازه شوي. د تاقمان پرائمرونه د ترمو (GAPDH (Ss03375629_u1)، PARP12 (Ss06908795_m1)، PKDCC (Ss06903874_m1)، CYGB (Ss06900188_m1)، RGL1 (Ss06868890_m1)، ACTN1 (Ss01009508_mH)، GATA4 (Ss03383805_u1)، GJA1 (Ss03374839_u1)، COL1A2 (Ss03375009_u1)، COL3A1 (Ss04323794_m1)، ACTA2 (Ss04245588_m1) څخه اخیستل شوي وو. د ټولو نمونو CT ارزښتونه د کور ساتنې جین GAPDH ته نورمال شوي وو.
د NT-ProBNP د رسنیو خپریدل د NT-ProBNP کټ (سور) (د پیشو شمیره MBS2086979، MyBioSource) په کارولو سره د جوړونکي د پروتوکول سره سم ارزول شوي. په لنډه توګه، د هرې نمونې او معیار 250 µl په هر څاه کې په دوه ګوني ډول اضافه شوي. د نمونې اضافه کولو سمدلاسه وروسته، په هر څاه کې د Assay Reagent A 50 µl اضافه کړئ. په نرمۍ سره پلیټ وخورئ او د سیلینټ سره مهر کړئ. بیا ټابلیټونه د 1 ساعت لپاره په 37 درجو سانتي ګراد کې انکیوبیټ شوي. بیا محلول اسپیریټ کړئ او څاهګانې 4 ځله د 350 µl 1X واش محلول سره ومینځئ، هر ځل د واش محلول د 1-2 دقیقو لپاره انکیوبیټ کړئ. بیا په هر څاه کې 100 µl Assay Reagent B اضافه کړئ او د پلیټ سیلینټ سره مهر کړئ. ټابلیټ په نرمۍ سره ولړزول شو او د 30 دقیقو لپاره په 37 درجو سانتي ګراد کې انکیوبیټ شو. محلول په اسپریټ کړئ او څاګانې د 350 µl 1X واش محلول سره 5 ځله ومینځئ. په هر څاه کې 90 µl سبسټریټ محلول اضافه کړئ او پلیټ مهر کړئ. پلیټ په 37 درجو سانتی ګراد کې د 10-20 دقیقو لپاره واچوئ. په هر څاه کې 50 µl سټاپ محلول اضافه کړئ. پلیټ سمدلاسه د سایټیشن (بایوټیک) پلیټ ریډر په کارولو سره اندازه شو چې په 450 nm کې تنظیم شوی و.
د بریښنا تحلیلونه د ګروپ اندازو غوره کولو لپاره ترسره شول کوم چې به د 80٪ څخه ډیر ځواک چمتو کړي ترڅو په پیرامیټر کې د 10٪ مطلق بدلون کشف کړي د 5٪ ډول I غلطۍ کچه سره. د بریښنا تحلیلونه د ګروپ اندازو غوره کولو لپاره ترسره شول کوم چې به د 80٪ څخه ډیر ځواک چمتو کړي ترڅو په پیرامیټر کې د 10٪ مطلق بدلون کشف کړي د 5٪ ډول I غلطۍ نرخ سره. اناالیز мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% абнаружения параметра с 5% частотой ошибок типа I. د بریښنا تحلیل د ګروپ اندازو غوره کولو لپاره ترسره شو چې د 5٪ ډول I غلطی نرخ سره د 10٪ مطلق پیرامیټر بدلون کشف کولو لپاره 80٪ څخه ډیر ځواک چمتو کړي.دیدی Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаружения 10% параметров и 5% частоты ошибок типа I. د بریښنا تحلیل ترسره شو ترڅو د ګروپ اندازه غوره کړي چې د 10٪ مطلق پیرامیټر بدلون او 5٪ ډول I غلطۍ کچه کشف کولو لپاره 80٪ څخه ډیر ځواک چمتو کړي.د تجربې څخه مخکې د نسج برخې په ناڅاپي ډول غوره شوې وې. ټولې تحلیلونه د حالت ړانده وو او نمونې یوازې د ټولو معلوماتو تحلیل وروسته کوډ شوي وې. د ګراف پیډ پریزم سافټویر (سان ډیاګو، CA) د ټولو احصایوي تحلیلونو ترسره کولو لپاره کارول شوی و. د ټولو احصایو لپاره، د p-ارزښتونه د <0.05 ارزښتونو کې د پام وړ ګڼل شوي. د ټولو احصایو لپاره، د p-ارزښتونه د <0.05 ارزښتونو کې د پام وړ ګڼل شوي. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. د ټولو احصایو لپاره، د p-ارزښتونه د <0.05 ارزښتونو کې د پام وړ ګڼل شوي.对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的.对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. د ټولو احصایو لپاره، د p-ارزښتونه د <0.05 ارزښتونو کې د پام وړ ګڼل شوي.د دوه لکۍ لرونکي زده کونکي t-ټیسټ په معلوماتو کې یوازې د 2 پرتله کولو سره ترسره شو. یو اړخیز یا دوه اړخیز ANOVA د څو ډلو ترمنځ د اهمیت ټاکلو لپاره کارول کیده. کله چې د پوسټ هاک ازموینې ترسره کول، د ټوکی سمون د څو پرتله کولو لپاره په حساب کې پلي شو. د RNAsec ډاټا د FDR او p.adjust محاسبه کولو پرمهال ځانګړي احصایوي ملاحظات لري لکه څنګه چې د میتودونو برخه کې تشریح شوي.
د مطالعې ډیزاین په اړه د نورو معلوماتو لپاره، د طبیعت څیړنې راپور لنډیز وګورئ چې د دې مقالې سره تړاو لري.