Благодарим ви, че посетихте Nature.com.Версията на браузъра, която използвате, има ограничена поддръжка на CSS.За най-добро изживяване ви препоръчваме да използвате актуализиран браузър (или да деактивирате режима на съвместимост в Internet Explorer).Междувременно, за да осигурим постоянна поддръжка, ние ще визуализираме сайта без стилове и JavaScript.
Има нужда от надеждна in vitro система, която може точно да възпроизведе физиологичната среда на сърцето за тестване на лекарства.Ограничената наличност на системи за култура на човешка сърдечна тъкан е довела до неточни интерпретации на сърдечните лекарствени ефекти.Тук разработихме модел на сърдечна тъканна култура (CTCM), който електромеханично стимулира сърдечните срезове и претърпява физиологично разтягане по време на систолната и диастолната фаза на сърдечния цикъл.След 12 дни култура, този подход частично подобри жизнеспособността на сърдечните участъци, но не запази напълно тяхната структурна цялост.Следователно, след скрининг на малки молекули, открихме, че добавянето на 100 nM трийодтиронин (T3) и 1 μM дексаметазон (Dex) към нашата среда поддържа микроструктурата на срезовете в продължение на 12 дни.В комбинация с T3/Dex лечение, системата CTCM поддържа транскрипционни профили, жизнеспособност, метаболитна активност и структурна цялост на същото ниво като прясна сърдечна тъкан в продължение на 12 дни.В допълнение, прекомерното разтягане на сърдечна тъкан в културата индуцира хипертрофична сърдечна сигнализация, предоставяйки доказателства за способността на CTCM да имитира хипертрофични състояния, предизвикани от сърдечно разтягане.В заключение, CTCM може да моделира физиологията и патофизиологията на сърцето в култура за дълги периоди от време, позволявайки надежден скрининг на лекарства.
Преди клиничните изследвания са необходими надеждни in vitro системи, които могат точно да възпроизведат физиологичната среда на човешкото сърце.Такива системи трябва да имитират променено механично разтягане, сърдечен ритъм и електрофизиологични свойства.Животинските модели обикновено се използват като скринингова платформа за сърдечна физиология с ограничена надеждност при отразяване на ефектите на лекарствата в човешкото сърце1,2.В крайна сметка, експерименталният модел на идеалната сърдечна тъканна култура (CTCM) е модел, който е силно чувствителен и специфичен за различни терапевтични и фармакологични интервенции, възпроизвеждайки точно физиологията и патофизиологията на човешкото сърце3.Липсата на такава система ограничава откриването на нови лечения за сърдечна недостатъчност4,5 и доведе до кардиотоксичността на лекарството като основна причина за излизане от пазара6.
През последното десетилетие осем не-сърдечно-съдови лекарства бяха изтеглени от клинична употреба, тъй като причиняват удължаване на QT интервала, водещо до камерни аритмии и внезапна смърт7.Следователно, има нарастваща нужда от надеждни предклинични скринингови стратегии за оценка на сърдечно-съдовата ефикасност и токсичност.Неотдавнашното използване на индуцирани от човека плурипотентни кардиомиоцити, получени от стволови клетки (hiPS-CM) при скрининг на лекарства и тестове за токсичност, предоставя частично решение на този проблем.Въпреки това, незрелият характер на hiPS-CM и липсата на многоклетъчна сложност на сърдечната тъкан са основни ограничения на този метод.Последните проучвания показват, че това ограничение може да бъде частично преодоляно чрез използване на ранен hiPS-CM за образуване на хидрогелове на сърдечната тъкан малко след началото на спонтанните контракции и постепенно увеличаване на електрическата стимулация с течение на времето.Тези hiPS-CM микротъкани обаче нямат зрелите електрофизиологични и контрактилни свойства на възрастния миокард.В допълнение, човешката сърдечна тъкан има по-сложна структура, състояща се от хетерогенна смес от различни типове клетки, включително ендотелни клетки, неврони и стромални фибробласти, свързани помежду си чрез специфични набори от извънклетъчни матрични протеини.Тази хетерогенност на некардиомиоцитни популации 11, 12, 13 в сърцето на възрастни бозайници е основна пречка за моделиране на сърдечна тъкан с помощта на отделни типове клетки.Тези основни ограничения подчертават значението на разработването на методи за култивиране на интактна миокардна тъкан при физиологични и патологични условия.
Култивираните тънки (300 µm) срезове от човешкото сърце са доказали, че са обещаващ модел на непокътнат човешки миокард.Този метод осигурява достъп до пълна 3D многоклетъчна система, подобна на човешка сърдечна тъкан.Въпреки това, до 2019 г. използването на култивирани сърдечни срезове беше ограничено от краткото (24 часа) оцеляване на културата.Това се дължи на редица фактори, включително липсата на физико-механично разтягане, интерфейса въздух-течност и използването на прости среди, които не поддържат нуждите на сърдечната тъкан.През 2019 г. няколко изследователски групи демонстрираха, че включването на механични фактори в системите за култура на сърдечна тъкан може да удължи живота на културата, да подобри сърдечната експресия и да имитира сърдечна патология.Две елегантни проучвания 17 и 18 показват, че едноосното механично натоварване има положителен ефект върху сърдечния фенотип по време на културата.Въпреки това, тези проучвания не използват динамичното триизмерно физико-механично натоварване на сърдечния цикъл, тъй като сърдечните участъци са натоварени или с изометрични сили на опън 17, или с линейно ауксотонично натоварване 18.Тези методи на тъканно разтягане доведоха до потискане на много сърдечни гени или свръхекспресия на гени, свързани с анормални реакции на разтягане.По-специално, Pitoulis et al.19 разработиха вана за култура на динамичен сърдечен срез за реконструкция на сърдечния цикъл, използвайки обратна връзка на преобразувателя на силата и задвижвания на напрежението.Въпреки че тази система позволява по-точно in vitro моделиране на сърдечния цикъл, сложността и ниската производителност на метода ограничават приложението на тази система.Нашата лаборатория наскоро разработи опростена система за култивиране, използваща електрическа стимулация и оптимизирана среда за поддържане на жизнеспособността на срезове от свинска и човешка сърдечна тъкан до 6 дни20,21.
В настоящия ръкопис ние описваме модел на сърдечна тъканна култура (CTCM), използвайки участъци от свинско сърце, което включва хуморални сигнали за рекапитулация на триизмерната сърдечна физиология и патофизиологично раздуване по време на сърдечния цикъл.Този CTCM може да повиши точността на предклиничното предсказване на лекарства до ниво, което никога досега не е достигано чрез осигуряване на рентабилна сърдечна система със средна производителност, която имитира физиологията/патофизиологията на сърцето на бозайник за предклинично изпитване на лекарства.
Хемодинамичните механични сигнали играят критична роля в поддържането на функцията на кардиомиоцитите in vitro 22,23,24.В настоящия ръкопис ние разработихме CTCM (Фигура 1а), който може да имитира сърдечната среда на възрастни чрез индуциране на електрическа и механична стимулация при физиологични честоти (1, 2 Hz, 72 удара в минута).За да се избегне прекомерното разтягане на тъканта по време на диастола, беше използвано устройство за 3D принтиране за увеличаване на размера на тъканта с 25% (фиг. 1b).Електрическата стимулация, предизвикана от системата C-PACE, беше настроена да започне 100 ms преди систола, като се използва система за събиране на данни за пълно възпроизвеждане на сърдечния цикъл.Системата за тъканна култура използва програмируем пневматичен задвижващ механизъм (LB Engineering, Германия) за циклично разширяване на гъвкава силиконова мембрана, за да предизвика разширяване на сърдечните срезове в горната камера.Системата беше свързана към външна въздушна линия чрез датчик за налягане, което направи възможно точното регулиране на налягането (± 1 mmHg) и времето (± 1 ms) (фиг. 1c).
a Прикрепете секцията тъкан към 7 mm поддържащ пръстен, показан в синьо, вътре в камерата за култура на устройството.Културалната камера е отделена от въздушната с тънка гъвкава силиконова мембрана.Поставете уплътнение между всяка камера, за да предотвратите течове.Капакът на устройството съдържа графитни електроди, които осигуряват електрическа стимулация.b Схематично представяне на голямо устройство за тъкани, водещ пръстен и поддържащ пръстен.Тъканните срезове (кафяви) се поставят върху голямото устройство с водещия пръстен, поставен в жлеба на външния ръб на устройството.Като използвате водача, внимателно поставете поддържащия пръстен, покрит с акрилно лепило за тъкани, върху участъка от сърдечна тъкан.c Графика, показваща времето на електрическа стимулация като функция от налягането във въздушната камера, контролирано от програмируем пневматичен задвижващ механизъм (PPD).Използвано е устройство за събиране на данни за синхронизиране на електрическа стимулация с помощта на сензори за налягане.Когато налягането в културалната камера достигне зададения праг, към C-PACE-EM се изпраща импулсен сигнал, за да се задейства електрическа стимулация.d Изображение на четири CTCM, поставени на рафт на инкубатор.Четири устройства са свързани към един PPD чрез пневматична верига, а в хемостатичната клапа са поставени сензори за налягане, за да следят налягането в пневматичната верига.Всяко устройство съдържа шест тъканни секции.
Използвайки един пневматичен задвижващ механизъм, успяхме да контролираме 4 CTCM устройства, всяко от които можеше да побере 6 тъканни секции (фиг. 1d).В CTCM въздушното налягане във въздушната камера се преобразува в синхронно налягане в флуидната камера и предизвиква физиологично разширяване на сърдечния срез (Фигура 2а и допълнителен филм 1).Оценка на тъканното разтягане при 80 mm Hg.Изкуство.показаха разтягане на тъканните срезове с 25% (фиг. 2b).Доказано е, че този процент на разтягане съответства на физиологична дължина на саркомера от 2,2–2,3 µm за нормална контрактилност на сърдечната секция17,19,25.Движението на тъканта беше оценено с помощта на персонализирани настройки на камерата (допълнителна фигура 1).Амплитудата и скоростта на движение на тъканите (фиг. 2c, d) съответстват на разтягане по време на сърдечния цикъл и време по време на систола и диастола (фиг. 2b).Разтягането и скоростта на сърдечната тъкан по време на свиване и отпускане остават постоянни в продължение на 12 дни в култура (фиг. 2f).За да оценим ефекта на електрическата стимулация върху контрактилитета по време на културата, ние разработихме метод за определяне на активна деформация, използвайки алгоритъм за засенчване (допълнителна фигура 2a, b) и успяхме да разграничим деформациите със и без електрическа стимулация.Същата част на сърцето (фиг. 2f).В подвижната област на среза (R6-9) напрежението по време на електрическа стимулация е с 20% по-високо, отколкото при липса на електрическа стимулация, което показва приноса на електрическата стимулация за контрактилната функция.
Представителни следи от измервания на налягането във въздушната камера, налягането в флуидната камера и движението на тъканта потвърждават, че налягането в камерата променя налягането в флуидната камера, причинявайки съответното движение на тъканния срез.b Представителни следи от процентно разтягане (синьо) на тъканни участъци, съответстващо на процентно разтягане (оранжево).c Измереното движение на сърдечния срез е в съответствие с измерената скорост на движение.(d) Представителни траектории на циклично движение (синя линия) и скорост (оранжева пунктирана линия) в част от сърцето.e Количествено определяне на времето на цикъла (n = 19 среза на група, от различни прасета), времето на свиване (n = 19 среза на група), времето на релаксация (n = 19 среза на група, от различни прасета), движение на тъканите (n = 25).срезове)/група от различни прасета), пикова систолна скорост (n = 24(D0), 25(D12) срезове/група от различни прасета) и пикова скорост на релаксация (n=24(D0), 25(D12) срезове/група от различни прасета).Двустранният t-тест на Стюдънт не показва значима разлика в нито един параметър.f Представителни следи от анализ на напрежението на тъканни срезове с (червено) и без (синьо) електрическа стимулация, десет регионални области на тъканни срезове от една и съща секция.Долните панели показват количественото определяне на процентната разлика в напрежението в тъканни срезове с и без електрическа стимулация в десет области от различни срезове. (n = 8 резена/група от различни прасета, изпълнява се двустранен t-тест на Student; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 резена/група от различни прасета, изпълнява се двустранен t-тест на Student; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 среза/група от различни свине, се провежда двустранен t-критерий Стюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 секции/група от различни прасета, двустранен t-тест на Student; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）. （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）. (n = 8 среза/група, от различни свине, двустранен критерий Стюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 секции/група, от различни прасета, двустранен t-тест на Student; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Лентите за грешки представляват средното ± стандартно отклонение.
В предишната ни статична биомиметична система за култивиране на срезове на сърцето [20, 21] поддържахме жизнеспособността, функцията и структурната цялост на срезовете на сърцето в продължение на 6 дни чрез прилагане на електрическа стимулация и оптимизиране на състава на средата.След 10 дни обаче тези цифри рязко спаднаха.Ще се позоваваме на секции, култивирани в нашата предишна статична система за биомиметична култура 20, 21 контролни условия (Ctrl) и ще използваме нашата предварително оптимизирана среда като MC условия и култура при едновременна механична и електрическа стимулация (CTCM).Наречен .Първо, ние установихме, че механичната стимулация без електрическа стимулация е недостатъчна за поддържане на жизнеспособността на тъканите в продължение на 6 дни (допълнителна фигура 3a, b).Интересното е, че с въвеждането на физио-механична и електрическа стимулация с помощта на STCM, жизнеспособността на 12-дневните сърдечни срезове остава същата като в пресни сърдечни срезове при условия на MS, но не и при условия на Ctrl, както е показано от MTT анализ (фиг. 1).3а).Това предполага, че механичната стимулация и симулацията на сърдечния цикъл могат да поддържат тъканните участъци жизнеспособни два пъти по-дълго, отколкото е докладвано в нашата предишна система за статична култура.Въпреки това, оценката на структурната цялост на тъканните срезове чрез имуномаркиране на сърдечен тропонин Т и конексин 43 показа, че експресията на конексин 43 е значително по-висока в MC тъканите на 12-ия ден, отколкото в контролите на същия ден.Обаче, равномерната експресия на конексин 43 и образуването на Z-диск не се поддържат напълно (фиг. 3b).Ние използваме рамка за изкуствен интелект (AI) за количествено определяне на структурната цялост на тъканите26, тръбопровод за дълбоко обучение, базиран на изображения, базиран на оцветяване с тропонин-Т и конексин43, за автоматично количествено определяне на структурната цялост и флуоресценцията на сърдечни срезове по отношение на силата на локализация.Този метод използва конволюционна невронна мрежа (CNN) и рамка за дълбоко обучение за надеждно количествено определяне на структурната цялост на сърдечната тъкан по автоматизиран и безпристрастен начин, както е описано в препратката.26. MC тъканта показа подобрено структурно сходство с ден 0 в сравнение със статични контролни секции.В допълнение, трихромното оцветяване на Masson разкри значително по-нисък процент на фиброза при условия на МС в сравнение с контролните условия на 12-ия ден от културата (фиг. 3c).Докато CTCM повишава жизнеспособността на срезовете на сърдечната тъкан на 12-ия ден до ниво, подобно на това на прясната сърдечна тъкан, той не подобрява значително структурната цялост на сърдечните срезове.
лентова графика показва количествено определяне на жизнеспособността на MTT на пресни срезове от сърце (D0) или култура на срезове от сърце за 12 дни или в статична култура (D12 Ctrl), или в CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) срезове/група от различни прасета, извършва се еднопосочен ANOVA тест; ####p < 0,0001 в сравнение с D0 и **p < 0,01 в сравнение с D12 Ctrl). лентова графика показва количествено определяне на жизнеспособността на МТТ на пресни резени от сърце (D0) или култура от резени от сърце за 12 дни или в статична култура (D12 Ctrl), или в CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) срезове/група от различни прасета, извършва се еднопосочен ANOVA тест; ####p < 0,0001 в сравнение до D0 и **p < 0,01 в сравнение с D12 Ctrl).хистограмата показва количественото определяне на жизнеспособността на МТТ пресни сърдечни срезове (D0) или култура на сърдечни срезове за 12 дни или в статична култура (D12 контрола), или CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 контрола). ), 12 (D12 MC) срезове/група от различни прасета, извършва се еднопосочен ANOVA тест;####p < 0,0001 в сравнение с D0 и **p < 0,01 в сравнение с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 в сравнение с D0 и **p < 0,01 в сравнение с D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) 或心脏切片培养12天的MTT 活力的量化), 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001 ，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比；**p。)хистограма, показваща количественото определяне на жизнеспособността на МТТ в свежи сърдечни срезове (D0) или сърдечни срезове, култивирани в продължение на 12 дни в статична култура (D12 контрола) или CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 контрола)), 12 (D12 MC) срезове/група от различни прасета, еднопосочен ANOVA тест;####p < 0,0001 в сравнение с D0, **p < 0,01 в сравнение с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 в сравнение с D0, **p < 0,01 в сравнение с D12 Ctrl).b Тропонин-Т (зелен), конексин 43 (червен) и DAPI (син) в прясно изолирани сърдечни срезове (D0) или сърдечни срезове, култивирани при статични условия (Ctrl) или условия на CTCM (MC) в продължение на 12 дни) на представителни имунофлуоресцентни изображения (празна скала = 100 µm). Количествено определяне чрез изкуствен интелект на структурната цялост на сърдечната тъкан (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезове/група всеки от различно прасе, извършва се еднопосочен ANOVA тест; ####p < 0,0001 в сравнение с D0 и ****p < 0,0001 в сравнение с D12 Ctrl). Количествено определяне чрез изкуствен интелект на структурната цялост на сърдечната тъкан (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезове/група всеки от различни прасета, извършва се еднопосочен ANOVA тест; ####p < 0,0001 в сравнение с D0 и ****p < 0,0001 в сравнение с D12 Ctrl). Количествена оценка на структурната целостност на сърдечната тъкан с изкуствен интелект (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезове/групи от различни свине, се провежда еднофакторен тест ANOVA; ####p < 0,0001 в сравнение с D0 и ****p < 0,0001 в сравнение с D12 Ctrl). Количествено определяне на структурната цялост на сърдечната тъкан чрез изкуствен интелект (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) секции/групи от различни прасета, извършен еднопосочен ANOVA тест; ####p < 0,0001 спрямо D0 и ****p < 0,0001 в сравнение с D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезове/група всеки от различно прасе, еднопосочен ANOVA тест; ####p < 0,0001 与D0 相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезове/група всяко от различни прасета, еднопосочен ANOVA тест;####p < 0,0001 与D0相比， ****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусствен интелект за количествена оценка на структурната целостност на сърдечната тъкан (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезове/група на всяка от различни свине, едностранен тест ANOVA; ####p <0,0001 спрямо D0 За сравняване ****p < 0,0001 в сравнение с D12 Ctrl). Изкуствен интелект за количествено определяне на структурната цялост на сърдечната тъкан (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) секции/група всяка от различни прасета, еднопосочен ANOVA тест; ####p<0,0001 срещу .D0 За сравнение ****p < 0,0001 в сравнение с D12 Ctrl). c Представителни изображения (вляво) и количествено определяне (вдясно) за срезове от сърце, оцветени с трихромно оцветяване на Masson (гола скала = 500 µm) (n = 10 среза/група всеки от различно прасе, извършва се еднопосочен ANOVA тест; ####p <0,0001 в сравнение с D0 и ***p <0,001 в сравнение с D12 Ctrl). c Представителни изображения (вляво) и количествено определяне (вдясно) за сърдечни срезове, оцветени с трихромно оцветяване на Masson (гола скала = 500 µm) (n = 10 среза/група всеки от различни прасета, извършва се еднопосочен ANOVA тест; #### p <0,0001 в сравнение с D0 и ***p <0,001 в сравнение с D12 Ctrl). c Представителни изображения (слева) и количествена оценка (справа) на сърдечен срез, украсен с трихромен красител Масона (масштаб без покритие = 500 мкм) (n = 10 среза/група от различни свине, изпълнява се едностранен тест ANOVA; #### p < 0,0001 в сравнение с D0 и ***p < 0,001 в сравнение с D12 Ctrl). c Представителни изображения (вляво) и количествено определяне (вдясно) на сърдечни срезове, оцветени с трихромно оцветяване на Masson (мащаб без покритие = 500 µm) (n = 10 среза/група от различни прасета, извършен еднопосочен ANOVA тест; #### p < 0,0001 в сравнение с D0 и ***p < 0,001 в сравнение с D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 µm）（n = 10个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比） 。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0,0001 与D0相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Представителни изображения (слева) и количествен анализ (справа) на сърдечен срез, оцветен с трихромен красител на Масона (чиста скала = 500 мкм) (n = 10 среза/група, всяка от друга свиня, протестирано с помощта на еднофакторния дисперсионен анализ ;### #p < 0,0001 в сравнение с D0, ***p < 0,001 в сравнение с D12 Ctrl). c Представителни изображения (вляво) и количествено определяне (вдясно) на сърдечни срезове, оцветени с трихромно оцветяване на Masson (празно = 500 µm) (n = 10 среза/група, всеки от различно прасе, тествани чрез еднопосочен дисперсионен анализ; ### # p < 0,0001 в сравнение с D0, ***p < 0,001 в сравнение с D12 Ctrl).Лентите за грешки представляват средното ± стандартно отклонение.
Ние предположихме, че чрез добавяне на малки молекули към културалната среда, целостта на кардиомиоцитите може да се подобри и развитието на фиброза да се намали по време на културата на CTCM.Затова ние скринирахме за малки молекули, използвайки нашите статични контролни култури20,21 поради малкия брой объркващи фактори.Дексаметазон (Dex), трийодтиронин (Т3) и SB431542 (SB) бяха избрани за този скрининг.Тези малки молекули преди са били използвани в hiPSC-CM култури за индуциране на съзряване на кардиомиоцити чрез увеличаване на дължината на саркомера, Т-тубулите и скоростта на проводимост.Освен това е известно, че както Dex (глюкокортикоид), така и SB потискат възпалението29,30.Затова тествахме дали включването на една или комбинация от тези малки молекули би подобрило структурната цялост на сърдечните участъци.За първоначален скрининг, дозата на всяко съединение беше избрана въз основа на концентрациите, които обикновено се използват в модели на клетъчни култури (1 μM Dex27, 100 nM T327 и 2,5 μM SB31).След 12 дни култура, комбинацията от Т3 и Dex доведе до оптимална структурна цялост на кардиомиоцитите и минимално фиброзно ремоделиране (допълнителни фигури 4 и 5).В допълнение, използването на двойни или двойни тези концентрации на T3 и Dex доведе до вредни ефекти в сравнение с нормалните концентрации (допълнителна фигура 6a, b).
След първоначалния скрининг, направихме директно сравнение на 4 условия на култивиране (Фигура 4а): Ctrl: сърдечни участъци, култивирани в нашата по-рано описана статична култура, използвайки нашата оптимизирана среда;20.21 TD: T3 и Ctrl s Добавен Dex в сряда;MC: сърдечни срезове, култивирани в CTCM, използвайки нашата предварително оптимизирана среда;и MT: CTCM с Т3 и Dex, добавени към средата.След 12 дни култивиране, жизнеспособността на MS и MT тъканите остава същата като в пресни тъкани, оценени чрез MTT анализ (Фиг. 4b).Интересно е, че добавянето на Т3 и Dex към трансуелни култури (TD) не доведе до значително подобрение на жизнеспособността в сравнение с условията на Ctrl, което показва важна роля на механичната стимулация за поддържане на жизнеспособността на сърдечните участъци.
диаграма на експериментален дизайн, изобразяваща четирите условия на култивиране, използвани за оценка на ефектите от механична стимулация и добавяне на T3/Dex върху среда за 12 дни. b Стълбовата графика показва количествено определяне на жизнеспособността 12 дни след култивиране във всичките 4 условия на култивиране (Ctrl, TD, MC и MT) в сравнение с резени от прясно сърце (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезове/група от различни прасета, извършва се еднопосочен ANOVA тест; ####p < 0,0001 , ###p < 0,001 в сравнение с D0 и **p < 0,01 в сравнение с D12 Ctrl). b Стълбовата графика показва количествено определяне на жизнеспособността 12 дни след култивиране във всичките 4 условия на култивиране (Ctrl, TD, MC и MT) в сравнение с резени от прясно сърце (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезове/група от различни прасета, извършва се еднопосочен ANOVA тест; ####p < 0,0001 , ###p < 0,001 в сравнение с D0 и **p < 0,01 в сравнение с D12 ctrl). b Гистограммата показва количествена оценка на работоспособността през 12 дни след култивиране при всички 4 условия на култивиране (контрол, TD, MC и MT) в сравнение със свежи сърдечни срезове (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезове/група от различни свине, провежда едностранен тест ANOVA ; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 в сравнение с D0 и **p < 0,01 в сравнение с D12 Ctrl). b Стълбовидната графика показва количественото определяне на жизнеспособността на 12-ия ден след култивиране във всичките 4 условия на култивиране (контрола, TD, MC и MT) в сравнение с пресни сърдечни срезове (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезове/група от различни прасета, еднопосочен ANOVA тест; ####p < 0,0 001, ###p < 0,001 спрямо D0 и **p < 0,01 в сравнение с D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0,0001，###p < 0,001 与D0 相比，**p < 0,01与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показваща всички 4 условия за култивиране (контрол, TD, MC и MT) в сравнение със свежи сърдечни срезове (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от различни свине 12 (D12 MC) срезове/група, едностранен тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p < 0,001 в сравнение с D0, **p <0,01 в сравнение с контрол D12). b Хистограма, показваща всичките 4 условия на култура (контрола, TD, MC и MT) в сравнение с пресни сърдечни срезове (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от различни прасета 12 (D12 MC) срезове/група, еднопосочен ANOVA тест; ####p<0,0001, ###p<0,001 спрямо D0 , **p<0,01 спрямо контрола D12). c Стълбовата графика показва количественото определяне на глюкозния поток 12 дни след култивиране във всичките 4 условия на култивиране (Ctrl, TD, MC и MT) в сравнение с резени от прясно сърце (D0) (n = 6 среза/група от различни прасета, извършва се еднопосочен ANOVA тест; ###p < 0,001, в сравнение с D0 и ***p < 0,001 в сравнение с D12 Ctrl). c Стълбовата графика показва количественото определяне на глюкозния поток 12 дни след култивиране във всичките 4 условия на култивиране (Ctrl, TD, MC и MT) в сравнение с резени от прясно сърце (D0) (n = 6 среза/група от различни прасета, извършва се еднопосочен ANOVA тест; ###p < 0,001, в сравнение с D0 и ***p < 0,001 в сравнение с D12 Ctrl). c Гистограммата показва количествена оценка на глюкозния поток през 12 дни след култивиране при всички 4 условия на култивиране (контрол, TD, MC и MT) в сравнение със свежи сърдечни срезове (D0) (n = 6 среза/група от различни свине, едностранно Извършва се тест ANOVA; ###p < 0,001 в сравнение с D0 и ***p < 0,001 в сравнение с D12 Ctrl). c Хистограмата показва количествено определяне на глюкозния поток 12 дни след култивиране при всички 4 условия на култивиране (контрола, TD, MC и MT) в сравнение с пресни сърдечни срезове (D0) (n = 6 срези/група от различни прасета, извършен еднопосочен ANOVA тест; ###p < 0,001 в сравнение с D0 и ***p < 0,001 в сравнение с D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12 天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 ， 培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показваща количествена оценка на глюкозния поток през 12 дни след култивиране за всички 4 условия на култивиране (контрол, TD, MC и MT) в сравнение със свежи срезове на сърцето (D0) (n = 6 среза/група, от различни свине, едностранни Бяха проведени ANOVA тестове; ###p < 0,001 в сравнение с D0, ***p < 0,001 в сравнение с D12 (контрол). c Хистограма, показваща количествено определяне на глюкозния поток на 12-ия ден след култивиране за всичките 4 условия на култивиране (контрола, TD, MC и MT) в сравнение с пресни сърдечни срезове (D0) (n = 6 срези/група, от различни прасета, едностранно. Когато са извършени ANOVA тестове, ###p < 0,001 в сравнение с D0, ***p < 0,001 в сравнение с D12 (контрола).d Графики за анализ на щама на пресни (сини), ден 12 MC (зелени) и ден 12 MT (червени) тъкани в десет регионални точки на тъканни срезове (n = 4 среза/група, еднопосочен ANOVA тест; няма значителна разлика между групите).e График на вулкан, показващ диференциално експресирани гени в свежи сърдечни срезове (D0) в сравнение със сърдечни срезове, култивирани при статични условия (Ctrl) или при МТ условия (MT) за 10-12 дни.f Топлинна карта на саркомерни гени за сърдечни участъци, култивирани при всяко от условията на културата.Лентите за грешки представляват средното ± стандартно отклонение.
Метаболитната зависимост от преминаването от окисление на мастни киселини към гликолиза е отличителен белег на дедиференциацията на кардиомиоцитите.Незрелите кардиомиоцити използват главно глюкоза за производството на АТФ и имат хипопластични митохондрии с малко кристи5,32.Анализите на използването на глюкозата показват, че при условия на MC и MT, използването на глюкоза е подобно на това в тъканите от ден 0 (Фигура 4в).Обаче Ctrl пробите показват значително увеличение на усвояването на глюкоза в сравнение с прясна тъкан.Това показва, че комбинацията от CTCM и T3/Dex повишава жизнеспособността на тъканите и запазва метаболитния фенотип на 12-дневни култивирани сърдечни срезове.В допълнение, анализът на щама показа, че нивата на щам остават същите като в прясна сърдечна тъкан в продължение на 12 дни при условия на MT и MS (фиг. 4d).
За да анализираме цялостното въздействие на CTCM и T3/Dex върху глобалния транскрипционен пейзаж на тъканта на сърдечния срез, ние извършихме RNAseq върху сърдечни срезове от всичките четири различни условия на култура (допълнителни данни 1).Интересно е, че МТ секциите показват високо транскрипционно сходство с прясна сърдечна тъкан, като само 16 диференциално експресирани от 13 642 гена.Въпреки това, както показахме по-рано, Ctrl срезовете показват 1229 диференциално експресирани гени след 10-12 дни в култура (фиг. 4e).Тези данни бяха потвърдени от qRT-PCR на сърдечни и фибробластни гени (допълнителна фигура 7a-c).Интересното е, че секциите Ctrl показват понижена регулация на гените на сърдечния и клетъчния цикъл и активиране на възпалителни генни програми.Тези данни предполагат, че дедиференциацията, която обикновено се случва след дългосрочно култивиране, е напълно отслабена при условия на МТ (допълнителна фигура 8a, b).Внимателното изследване на саркомерните гени показа, че само при условия на МТ са запазени гените, кодиращи саркомера (фиг. 4f) и йонния канал (допълнителна фигура 9), предпазвайки ги от потискане при условия на Ctrl, TD и MC.Тези данни показват, че с комбинация от механична и хуморална стимулация (T3/Dex), транскриптомът на сърдечния срез може да остане подобен на свежи сърдечни срезове след 12 дни в култура.
Тези транскрипционни находки се подкрепят от факта, че структурната цялост на кардиомиоцитите в сърдечните участъци се запазва най-добре при условия на МТ в продължение на 12 дни, както е показано от непокътнатия и локализиран конексин 43 (фиг. 5а).В допълнение, фиброзата в сърдечните участъци при условия на МТ беше значително намалена в сравнение с Ctrl и подобно на пресни сърдечни участъци (фиг. 5b).Тези данни показват, че комбинацията от механична стимулация и T3/Dex лечение ефективно запазва сърдечната структура в сърдечните участъци в културата.
a Представителни имунофлуоресцентни изображения на тропонин-Т (зелено), конексин 43 (червено) и DAPI (синьо) в прясно изолирани сърдечни срезове (D0) или култивирани в продължение на 12 дни при всички четири условия на култивиране на сърдечни срезове (мащабна лента = 100 µm).). Количествено определяне чрез изкуствен интелект на структурната цялост на сърдечната тъкан (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезове/група от различни прасета, извършва се еднопосочен ANOVA тест; ####p < 0,0001 в сравнение с D0 и *p < 0,05, или ****p < 0,0001 в сравнение с D 12 Ctrl). Количествено определяне чрез изкуствен интелект на структурната цялост на сърдечната тъкан (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезове/група от различни прасета, извършва се еднопосочен ANOVA тест; #### p < 0,0001 в сравнение с D0 и *p < 0,05, или ****p < 0,0001 в сравнение с D 12 Ctrl). Количествена оценка на структурната целостност на тъканите на сърцето с помощта на изкуствен интелект (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезове/група от различни свине, проведен еднофакторен тест ANOVA; #### p < 0,0001 в сравнение с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 в сравнение с D1 2 Ctrl). Количествено определяне на структурната цялост на сърдечна тъкан с помощта на изкуствен интелект (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) секции/група от различни прасета, извършен еднопосочен ANOVA тест; #### p < 0,0001 в сравнение с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 в сравнение с D1 2 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组） 人工智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl相比）。Количествено определяне на структурната цялост на сърдечната тъкан с помощта на изкуствен интелект при различни прасета (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) секции/група) с еднопосочен ANOVA тест;#### p < 0,0001 в сравнение с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 в сравнение с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 в сравнение с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 в сравнение с D12 Ctrl). b Представителни изображения и количествено определяне за сърдечни срезове, оцветени с трихромно оцветяване на Masson (мащабна лента = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезове/група от различни прасета, извършва се еднопосочен ANOVA тест; ####p < 0,0001 в сравнение с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 в сравнение с D12 Ctrl). b Представителни изображения и количествено определяне за сърдечни срезове, оцветени с трихромно оцветяване на Masson (мащабна лента = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезове/група от различни прасета, извършва се еднопосочен ANOVA тест; ####p < 0,0001 в сравнение с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 в сравнение с D12 Ctrl). b Представителни изображения и количествена оценка на сърдечни срезове, украсени с трихромен красител Масона (масштабна линия = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезове/група от различни свине, изпълнява се едностранен тест ANOVA; ####p < 0,0001 в сравнение с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 в сравнение с D12 Ctrl). b Представителни изображения и количествено определяне на сърдечни срезове, оцветени с трихромно оцветяване на Masson (мащабна лента = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезове/група от различни прасета, извършена еднопосочна ANOVA; ####p < 0,0001 спрямо D0 и ***p < 0,00 1 или ****p < 0,0001 спрямо D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 mason 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001 与D0 相比， ***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Представителни изображения и количествена оценка на сърдечни срезове, оцветени с трихром Масона (масштабна линия = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезове от различни свине / групи, един-способ ANOVA; ####p < 0,0001 в сравнение с D0, ***p < 0, 001 или ****p < 0,0001 в сравнение с D12 Ctrl). b Представителни изображения и количествено определяне на сърдечни срезове, оцветени с трихром на Masson (мащабна лента = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срези от различни прасета/група, един ANOVA метод; ####p < 0,0001 в сравнение с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 в сравнение с D12 Ctrl).Лентите за грешки представляват средното ± стандартно отклонение.
И накрая, способността на CTCM да имитира сърдечна хипертрофия беше оценена чрез увеличаване на разтягането на сърдечната тъкан.В CTCM пиковото налягане във въздушната камера се повишава от 80 mmHg на 80 mmHg.Изкуство.(нормално разтягане) до 140 mmHg чл.(фиг. 6а).Това съответства на 32% увеличение на разтягането (фиг. 6b), което преди това беше показано като съответния процент на разтягане, необходим за сърдечните участъци за постигане на дължина на саркомера, подобна на тази, наблюдавана при хипертрофия.Разтягането и скоростта на сърдечната тъкан по време на свиване и отпускане остават постоянни по време на шест дни култура (Фиг. 6с).Сърдечната тъкан от състоянията на МТ беше подложена на нормално разтягане (MT (нормално)) или условия на свръхразтягане (MT (OS)) в продължение на шест дни.Още след четири дни в култура, хипертрофичният биомаркер NT-ProBNP беше значително повишен в средата при условия на МТ (OS) в сравнение с МТ (нормални) условия (Фиг. 7а).В допълнение, след шест дни култивиране, размерът на клетките в МТ (OS) (Фиг. 7b) значително се увеличава в сравнение със секциите на МТ сърце (нормално).В допълнение, ядрената транслокация на NFATC4 беше значително повишена в преразтегнати тъкани (фиг. 7в).Тези резултати показват прогресивното развитие на патологично ремоделиране след хипердистензия и подкрепят концепцията, че устройството CTCM може да се използва като платформа за изследване на сигнализиране за индуцирана от разтягане сърдечна хипертрофия.
Представителни следи от измервания на налягането във въздушната камера, налягането в флуидната камера и движението на тъканта потвърждават, че налягането в камерата променя налягането в флуидната камера, причинявайки съответното движение на тъканния срез.b Представителни криви на процент на разтягане и скорост на разтягане за нормално разтегнати (оранжеви) и свръхразтегнати (сини) тъканни участъци.c Стълбова графика, показваща време на цикъл (n = 19 среза на група, от различни прасета), време на свиване (n = 18-19 среза на група, от различни прасета), време на релаксация (n = 19 среза на група, от различни прасета)), амплитуда на движение на тъканите (n = 14 среза/група, от различни прасета), пикова систолна скорост (n = 14 среза/група, от различни прасета) и пикова релаксация скорост на ионизация (n = 14 (D0), 15 (D6) ) секции/групи) от различни прасета), двустранният t-тест на Student не показва значителна разлика в който и да е параметър, което показва, че тези параметри са останали постоянни по време на 6 дни култура с пренапрежение.Лентите за грешки представляват средното ± стандартно отклонение.
Количествено определяне на лентова графика на концентрацията на NT-ProBNP в хранителна среда от сърдечни срезове, култивирани при условия на МТ нормално разтягане (Norm) или свръхразтягане (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm и D4 MTOS) срезове/група от различни прасета, Извършва се двупосочен ANOVA; **p <0,01 в сравнение с нормалното разтягане). Количествено определяне на лентова графика на концентрацията на NT-ProBNP в културална среда от срезове на сърцето, култивирани при условия на МТ нормално разтягане (Norm) или свръхразтягане (OS) (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm и D4 MTOS) срезове/група от различни прасета, извършва се двупосочна ANOVA; **p <0,01 в сравнение с нормално разтягане).Количествена хистограма на концентрацията на NT-ProBNP в културална среда от сърдечни срезове, култивирани при условия на нормално МТ разтягане (норма) или свръхразтягане (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm и D4).MTOS) срезове/група от различни прасета, извършва се двуфакторен анализ на дисперсията;**p < 0,01 в сравнение с нормалното разтягане). **p <0,01 в сравнение с нормално разтягане). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比, p < 0,01). Количествено определяне на концентрацията на NT-ProBNP в сърдечни срезове, култивирани при МТ нормално разтягане (Norm) или свръхразтягане (OS) условия (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) от различни 猪的切片/组，可以双向方方发发动; **в сравнение с нормално разтягане, p <0,01).хистограма Количествено определяне на концентрациите на NT-ProBNP в сърдечни срезове, култивирани при условия на нормално разтягане на МТ (норма) или свръхразтягане (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) и D4 MTOS) срезове/група от различни прасета, двупосочен анализ на дисперсията;**p < 0,01 в сравнение с нормалното разтягане). **p <0,01 в сравнение с нормално разтягане). b Представителни изображения за сърдечни срезове, оцветени с тропонин-Т и WGA (вляво) и количествено определяне на размера на клетките (вдясно) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клетки/група от 10 различни среза от различни прасета, изпълнява се t-тест на Student с две опашки; ****p <0,0001 в сравнение с нормалното разтягане). b Представителни изображения за сърдечни срезове, оцветени с тропонин-Т и WGA (вляво) и количествено определяне на размера на клетките (вдясно) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клетки/група от 10 различни среза от различни прасета, изпълнява се двустранен t-тест на Student; ****p <0,0001 в сравнение с нормалното разтягане). b Представителни изображения на сърдечни срезове, оцветени с тропонином-Т и АЗП (слева) и количествено определение на размера на клетките (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клетки/група от 10 различни среза от различни свине, два-провежда хвостовия t-критерий Стюдента; ****p < 0,0001 в сравнение с нормалното разтягане ). b Представителни изображения на сърдечни участъци, оцветени с тропонин-Т и AZP (вляво) и количествено определяне на размера на клетките (вдясно) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клетки/група от 10 различни участъка от различни прасета, извършен е двустранен t-тест на Student; ****p <0,0001 в сравнение с нормален щам). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS ），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）. b Представителни изображения на сърдечни срезове, оцветени с калкареин-Т и WGA (вляво) и размер на клетката (вдясно) (n = 330 (D6 MTOS), 369 от 10 различни среза (D6 MTNorm)) Клетки/组，两方法有尾学生t тест；в сравнение с нормално разтягане，****p < 0,00 01). b Представителни изображения на сърдечни срезове, оцветени тропонином-Т и АЗП (слева) и количествена оценка на размера на клетките (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) от 10 различни среза от различни свински клетки/група, двустранни критерии Стюдента; ****p < 0,0001 при сравнение с нормално разпределение). b Представителни изображения на сърдечни участъци, оцветени с тропонин-Т и AZP (вляво) и количествено определяне на размера на клетките (вдясно) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) от 10 различни участъка от различни прасета) Клетки/група, двустранен критерий t на Student;****p < 0,0001 в сравнение с нормален щам). c Представителни изображения за ден 0 и ден 6 MTOS сърдечни срезове, имуномаркирани за тропонин-Т и NFATC4 и количествено определяне на транслокацията на NFATC4 към ядрата на CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) среза/група от различни прасета, изпълнява се двустранен t-тест на Student; *p <0,05). c Представителни изображения за ден 0 и ден 6 MTOS сърдечни срезове, имуномаркирани за тропонин-Т и NFATC4 и количествено определяне на транслокацията на NFATC4 към ядрата на CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) среза/група от различни прасета, изпълнява се двустранен t-тест на Student; *p <0,05). c Представителни изображения за сърдечни срезове 0 и 6 дни MTOS, имунообусловени за тропонина-Т и NFATC4, и количествена оценка на транслокациите на NFATC4 в ядрото на кавернозните клетки (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезове/група от различни свине, изпълнява се двустранен t-критерий Стюдента; *p < 0,05). c Представителни изображения за сърдечни срезове на 0 и 6 дни MTOS, имуномаркирани за тропонин-Т и NFATC4, и количествено определяне на NFATC4 транслокация в ядрото на кавернозни клетки (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) среза/група от различни прасета), извършен двустранен t-тест на Student;*p <0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)。 c Представителни изображения на калканин-Т и NFATC4 имуномаркирани 第0天和第6天MTOS сърдечни срезове и NFATC4 от различни NFATC4 易位至CM клетъчно ядро的количество化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组, 时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Представителни изображения на сърдечен срез MTOS на 0 и 6 дни за имуномаркировка на тропонином-Т и NFATC4 и количествена оценка на транслокацията на NFATC4 в ядра CM от различни свине (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/група, два-хвостати t-критерия Стюдента; *p <0,05). c Представителни изображения на MTOS сърдечни срезове на ден 0 и 6 за имуномаркиране на тропонин-Т и NFATC4 и количествено определяне на транслокацията на NFATC4 в ядрото на CM от различни прасета (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) среза/група, двустранен t -критерий на Student; *p <0,05).Лентите за грешки представляват средно ± стандартно отклонение.
Транслационните сърдечно-съдови изследвания изискват клетъчни модели, които точно възпроизвеждат сърдечната среда.В това проучване е разработено и характеризирано устройство CTCM, което може да стимулира ултратънки участъци от сърцето.Системата CTCM включва физиологично синхронизирана електромеханична стимулация и обогатяване с течности T3 и Dex.Когато срезовете на свинското сърце бяха изложени на тези фактори, тяхната жизнеспособност, структурна цялост, метаболитна активност и транскрипционна експресия останаха същите като в свежа сърдечна тъкан след 12 дни култивиране.В допълнение, прекомерното разтягане на сърдечната тъкан може да причини хипертрофия на сърцето, причинена от хиперекстензия.Като цяло, тези резултати подкрепят критичната роля на условията на физиологична култура за поддържане на нормален сърдечен фенотип и осигуряват платформа за скрининг на лекарства.
Много фактори допринасят за създаването на оптимална среда за функциониране и оцеляване на кардиомиоцитите.Най-очевидните от тези фактори са свързани с (1) междуклетъчни взаимодействия, (2) електромеханична стимулация, (3) хуморални фактори и (4) метаболитни субстрати.Физиологичните взаимодействия клетка към клетка изискват сложни триизмерни мрежи от множество типове клетки, поддържани от извънклетъчна матрица.Такива сложни клетъчни взаимодействия са трудни за реконструиране in vitro чрез съвместно култивиране на отделни типове клетки, но могат лесно да бъдат постигнати с помощта на органотипния характер на сърдечните участъци.
Механичното разтягане и електрическата стимулация на кардиомиоцитите са критични за поддържане на сърдечния фенотип33,34,35.Докато механичната стимулация е била широко използвана за кондициониране и узряване на hiPSC-CM, няколко елегантни проучвания наскоро са се опитали да механично стимулират сърдечни резени в култура, използвайки едноосно натоварване.Тези проучвания показват, че 2D едноосно механично натоварване има положителен ефект върху фенотипа на сърцето по време на културата.В тези проучвания секциите на сърцето са или натоварени с изометрични сили на опън17, линейно ауксотонично натоварване18, или сърдечният цикъл е пресъздаден с помощта на обратна връзка на преобразувателя на силата и задвижвания на напрежението.Въпреки това, тези методи използват едноосно тъканно разтягане без оптимизиране на околната среда, което води до потискане на много сърдечни гени или свръхекспресия на гени, свързани с анормални реакции на разтягане.Описаният тук CTCM предоставя 3D електромеханичен стимул, който имитира естествения сърдечен цикъл по отношение на времето на цикъла и физиологичното разтягане (25% разтягане, 40% систола, 60% диастола и 72 удара в минута).Въпреки че тази триизмерна механична стимулация сама по себе си не е достатъчна за поддържане целостта на тъканта, е необходима комбинация от хуморална и механична стимулация с помощта на T3/Dex за адекватно поддържане на жизнеспособността, функцията и целостта на тъканта.
Хуморалните фактори играят важна роля в модулирането на фенотипа на сърцето при възрастни.Това беше подчертано в проучванията на HiPS-CM, в които Т3 и Dex бяха добавени към хранителната среда за ускоряване на клетъчното съзряване.Т3 може да повлияе на транспорта на аминокиселини, захари и калций през клетъчните мембрани36.В допълнение, Т3 насърчава експресията на MHC-α и регулирането надолу на MHC-β, насърчавайки образуването на миофибрили с бързо потрепване в зрели кардиомиоцити в сравнение с миофибрили с бавно потрепване във фетална СМ.Дефицитът на Т3 при пациенти с хипотиреоидизъм води до загуба на миофибриларни ивици и намалена скорост на развитие на тонуса37.Dex действа върху глюкокортикоидните рецептори и е доказано, че повишава контрактилитета на миокарда в изолирани перфузирани сърца;38 се смята, че това подобрение е свързано с ефекта върху навлизането, управлявано от калциевите отлагания (SOCE) 39,40.В допълнение, Dex се свързва със своите рецептори, причинявайки широк вътреклетъчен отговор, който потиска имунната функция и възпалението30.
Нашите резултати показват, че физико-механичната стимулация (MS) подобрява цялостното представяне на културата в сравнение с Ctrl, но не успява да поддържа жизнеспособност, структурна цялост и сърдечна експресия в продължение на 12 дни в културата.В сравнение с Ctrl, добавянето на T3 и Dex към CTCM (MT) култури подобрява жизнеспособността и поддържа подобни профили на транскрипция, структурна цялост и метаболитна активност със свежа сърдечна тъкан за 12 дни.В допълнение, чрез контролиране на степента на разтягане на тъканта, беше създаден модел на сърдечна хипертрофия, предизвикан от хиперекстензия, използвайки STCM, илюстриращ гъвкавостта на системата STCM.Трябва да се отбележи, че въпреки че сърдечното ремоделиране и фиброзата обикновено включват непокътнати органи, чиито циркулиращи клетки могат да осигурят подходящите цитокини, както и фагоцитоза и други ремоделиращи фактори, участъци от сърцето все още могат да имитират фиброзния процес в отговор на стрес и травма.в миофибробластите.Това е оценено преди това в този модел на сърдечен срез.Трябва да се отбележи, че параметрите на CTCM могат да бъдат модулирани чрез промяна на налягането/електрическата амплитуда и честота, за да се симулират много състояния като тахикардия, брадикардия и механична циркулаторна подкрепа (механично ненатоварено сърце).Това прави системата със средна производителност за тестване на лекарства.Способността на CTCM да моделира сърдечна хипертрофия, предизвикана от свръхнапрежение, проправя пътя за тестване на тази система за персонализирана терапия.В заключение, настоящото проучване демонстрира, че механичното разтягане и хуморалната стимулация са критични за поддържане на културата на участъци от сърдечна тъкан.
Въпреки че представените тук данни предполагат, че CTCM е много обещаваща платформа за моделиране на непокътнат миокард, този метод на култура има някои ограничения.Основното ограничение на CTCM културата е, че тя налага непрекъснати динамични механични напрежения върху срезовете, което изключва възможността за активно наблюдение на контракциите на сърдечния срез по време на всеки цикъл.В допълнение, поради малкия размер на сърдечните участъци (7 mm), възможността за оценка на систолната функция извън системите за култура с помощта на традиционни сензори за сила е ограничена.В настоящия ръкопис ние частично преодоляваме това ограничение, като оценяваме оптичното напрежение като индикатор за контрактилната функция.Това ограничение обаче ще изисква по-нататъшна работа и може да бъде разгледано в бъдеще чрез въвеждане на методи за оптичен мониторинг на функцията на сърдечните резени в културата, като оптично картографиране с помощта на калций и чувствителни към напрежение багрила.Друго ограничение на CTCM е, че работният модел не манипулира физиологичния стрес (предварително натоварване и след натоварване).В CTCM налягането беше индуцирано в противоположни посоки, за да се възпроизведе 25% физиологично разтягане в диастола (пълно разтягане) и систола (дължина на свиване по време на електрическа стимулация) в много големи тъкани.Това ограничение трябва да бъде премахнато в бъдещите проекти на CTCM чрез адекватен натиск върху сърдечната тъкан от двете страни и чрез прилагане на точните отношения налягане-обем, които се срещат в камерите на сърцето.
Индуцираното от свръхразтягане ремоделиране, докладвано в този ръкопис, е ограничено до имитиране на хипертрофични сигнали за хиперразтягане.По този начин този модел може да помогне при изследването на индуцирано от разтягане хипертрофично сигнализиране без необходимост от хуморални или невронни фактори (които не съществуват в тази система).Необходими са допълнителни проучвания за увеличаване на множествеността на CTCM, например, съвместно култивиране с имунни клетки, циркулиращи плазмени хуморални фактори и инервация, когато съвместното култивиране с невронни клетки ще подобри възможностите за моделиране на заболяване с CTCM.
В това изследване са използвани тринадесет прасета.Всички процедури с животни бяха извършени в съответствие с институционалните насоки и бяха одобрени от Комитета за институционална грижа и използване на животните на университета в Луисвил.Аортната дъга беше клампирана и сърцето беше перфузирано с 1 L стерилна кардиоплегия (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHC03, 5 U/mL хепарин, рН до 7.4); сърцата се съхраняват в леденостуден кардиоплегичен разтвор, докато се транспортират до лабораторията върху лед, което обикновено е <10 минути. сърцата се съхраняват в леденостуден кардиоплегичен разтвор, докато се транспортират до лабораторията върху лед, което обикновено е <10 минути. сърцата се съхраняват в ледяном кардиоплегичен разтвор до транспортиране в лабораторията на лду, което обикновено отнема <10 минути. сърцата се съхраняват в леденостуден кардиоплегичен разтвор до транспортиране до лабораторията върху лед, което обикновено отнема <10 минути.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Задържайте сърцето в ледяната кардиоплегия до транспортиране в лаборатория на лду, обикновено <10 минути. Съхранявайте сърцата върху ледена кардиоплегия до транспортирането до лабораторията върху лед, обикновено <10 минути.
Устройството CTCM е разработено в софтуера за компютърно проектиране (CAD) SolidWorks.Културните камери, разделителите и въздушните камери са изработени от CNC прозрачна акрилна пластмаса.Поддържащият пръстен с диаметър 7 мм е направен от полиетилен с висока плътност (HDPE) в центъра и има жлеб за о-пръстен за поставяне на силиконовия о-пръстен, използван за уплътняване на носителя отдолу.Тънка силициева мембрана разделя културалната камера от разделителната плоча.Силиконовата мембрана е лазерно изрязана от силиконов лист с дебелина 0,02″ и има твърдост 35A.Долните и горните силиконови уплътнения са лазерно изрязани от силиконов лист с дебелина 1/16″ и имат твърдост 50A.Винтове от неръждаема стомана 316L и крилчати гайки се използват за закрепване на блока и създаване на херметично уплътнение.
Специална печатна платка (PCB) е проектирана да бъде интегрирана със системата C-PACE-EM.Гнездата на швейцарския машинен конектор на печатната платка са свързани към графитни електроди чрез посребрени медни проводници и бронзови винтове 0-60, завинтени в електродите.Печатната платка е поставена в капака на 3D принтера.
Устройството CTCM се управлява от програмируем пневматичен задвижващ механизъм (PPD), който създава контролирано циркулационно налягане, подобно на сърдечен цикъл.Тъй като налягането във въздушната камера се увеличава, гъвкавата силиконова мембрана се разширява нагоре, принуждавайки средата под мястото на тъканта.След това областта на тъканта ще бъде разтегната от това изхвърляне на течност, имитирайки физиологичното разширяване на сърцето по време на диастола.В пика на релаксация се прилага електрическа стимулация чрез графитни електроди, които намаляват налягането във въздушната камера и предизвикват свиване на тъканните участъци.Вътре в тръбата има хемостатична клапа със сензор за налягане за отчитане на налягането във въздушната система.Налягането, усетено от сензора за налягане, се прилага към колектор на данни, свързан към лаптопа.Това позволява непрекъснат мониторинг на налягането в газовата камера.Когато се достигне максималното налягане в камерата (стандартно 80 mmHg, 140 mmHg OS), на устройството за събиране на данни беше наредено да изпрати сигнал към системата C-PACE-EM, за да генерира двуфазен сигнал за напрежение за 2 ms, настроен на 4 V.
Бяха получени сърдечни срезове и условията на култивиране в 6 ямки бяха извършени както следва: Прехвърлете събраните сърца от съда за прехвърляне в табла, съдържаща студена (4°С) кардиоплегия.Лявата камера се изолира със стерилно острие и се нарязва на парчета от 1-2 cm3.Тези тъканни блокове бяха прикрепени към тъканни опори с тъканно лепило и поставени във вибрираща микротомна тъканна вана, съдържаща разтвор на Tyrode и непрекъснато оксигенирана (3 g/L 2,3-бутандион монооксим (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g).), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-глюкоза (1,86 g), 1 0 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M разтвор), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M разтвор), до 1 L ddH2O).Вибриращият микротом беше настроен да реже резени с дебелина 300 µm при честота от 80 Hz, хоризонтална амплитуда на вибрация от 2 mm и скорост на напредване от 0.03 mm/s.Тъканната баня беше заобиколена от лед, за да се запази разтворът хладен и температурата беше поддържана при 4°С.Прехвърлете тъканните срезове от банята на микротома в инкубационна баня, съдържаща непрекъснато окислен разтвор на Tyrode върху лед, докато се получат достатъчно срезове за една културална плака.За трансуелни култури тъканните срезове бяха прикрепени към стерилни 6 mm широки полиуретанови опори и поставени в 6 ml оптимизирана среда (199 среда, 1x ITS добавка, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-алкален и 2X антибиотик-противогъбичен).Електрическа стимулация (10 V, честота 1.2 Hz) се прилага към тъканните срезове чрез C-Pace.За TD условия се добавят пресни T3 и Dex при 100 nM и 1 μM при всяка промяна на средата.Средата се насища с кислород преди смяна 3 пъти на ден.Тъканните срезове се култивират в инкубатор при 37°C и 5% CO2.
За CTCM култури, тъканните срезове бяха поставени на специално изработен 3D принтер в петриево блюдо, съдържащо модифициран разтвор на Tyrode.Устройството е предназначено да увеличи размера на среза на сърцето с 25% от площта на опорния пръстен.Това се прави, така че участъците на сърцето да не се разтягат след прехвърляне от разтвора на Tyrode в средата и по време на диастола.Използвайки хистоакрилно лепило, секции с дебелина 300 µm бяха фиксирани върху опорен пръстен с диаметър 7 mm.След като прикрепите тъканните срезове към опорния пръстен, отрежете излишните тъканни срезове и поставете прикрепените тъканни срезове обратно във ваната с разтвор на Tyrode върху лед (4°C), докато се подготвят достатъчно срезове за едно устройство.Общото време за обработка на всички устройства не трябва да надвишава 2 часа.След като 6 тъканни секции бяха прикрепени към техните опорни пръстени, устройството CTCM беше сглобено.Камерата за култура на CTCM е предварително напълнена с 21 ml предварително наситена с кислород среда.Прехвърлете тъканните срезове в камерата за култивиране и внимателно отстранете всички въздушни мехурчета с пипета.След това тъканният участък се насочва в отвора и внимателно се притиска на място.Накрая поставете капачката на електрода върху устройството и прехвърлете устройството в инкубатора.След това свържете CTCM към въздушната тръба и системата C-PACE-EM.Пневматичният задвижващ механизъм се отваря и въздушният клапан отваря CTCM.Системата C-PACE-EM е конфигурирана да доставя 4 V при 1,2 Hz по време на бифазно пейсиране за 2 ms.Средата се сменя два пъти на ден и електродите се сменят веднъж на ден, за да се избегне натрупването на графит върху електродите.Ако е необходимо, тъканните срезове могат да бъдат отстранени от техните културални ямки, за да се изгонят всички въздушни мехурчета, които може да са попаднали под тях.За условията на лечение с МТ, T3/Dex се добавя прясно с всяка промяна на средата със 100 nM T3 и 1 μM Dex.CTCM устройствата се култивират в инкубатор при 37°C и 5% CO2.
За да се получат разтегнати траектории на срезове на сърцето, е разработена специална система от камери.Използван е SLR фотоапарат (Canon Rebel T7i, Canon, Токио, Япония) с макрообектив Navitar Zoom 7000 18-108 mm (Navitar, Сан Франциско, Калифорния).Визуализацията се извършва при стайна температура след замяна на средата със свежа среда.Камерата е разположена под ъгъл от 51° и видеото се записва с 30 кадъра в секунда.Първо, софтуер с отворен код (MUSCLEMOTION43) беше използван с Image-J за количествено определяне на движението на сърдечните резени.Маската е създадена с помощта на MATLAB (MathWorks, Natick, Масачузетс, САЩ), за да се определят региони от интерес за биещи сърдечни резени, за да се избегне шум.Ръчно сегментирани маски се прилагат към всички изображения в последователност от кадри и след това се предават на приставката MUSCLEMOTION.Muscle Motion използва средния интензитет на пикселите във всеки кадър, за да определи количествено движението си спрямо референтния кадър.Данните бяха записани, филтрирани и използвани за количествено определяне на времето на цикъла и оценка на разтягането на тъканите по време на сърдечния цикъл.Записаното видео беше последващо обработено с помощта на цифров филтър с нулева фаза от първи ред.За да се определи количествено тъканното разтягане (от пик до пик), беше извършен анализ от пик до пик, за да се направи разлика между пикове и спадове в записания сигнал.Освен това премахването на тренда се извършва с помощта на полином от 6-ти ред, за да се елиминира отклонението на сигнала.Програмният код е разработен в MATLAB за определяне на глобалното движение на тъканите, времето на цикъла, времето за релаксация и времето на свиване (допълнителен програмен код 44).
За анализ на напрежението, използвайки същите видеоклипове, създадени за оценка на механично разтягане, първо проследихме две изображения, представящи пикове на движение (най-високата (горна) и най-ниската (долна) точки на движение) според софтуера MUSCLEMOTION.След това сегментирахме тъканните области и приложихме форма на алгоритъм за засенчване към сегментираната тъкан (допълнителна фигура 2а).След това сегментираната тъкан беше разделена на десет подповърхности и напрежението върху всяка повърхност беше изчислено с помощта на следното уравнение: Напрежение = (Sup-Sdown)/Sdown, където Sup и Sdown са разстоянията на формата съответно от горната и долната сенки на тъканта (допълнителна фигура .2b).
Сърдечните срезове се фиксират в 4% параформалдехид за 48 часа.Фиксираните тъкани се дехидратират в 10% и 20% захароза за 1 час, след това в 30% захароза за една нощ.След това срезовете се поставят в съединение с оптимална температура на рязане (OCT съединение) и постепенно се замразяват в баня с изопентан/сух лед.Съхранявайте блоковете за вграждане на OCT при -80 °C до разделянето.Слайдовете се приготвят като срезове с дебелина 8 μm.
За да отстраните OCT от сърдечните срезове, загрейте предметните стъкла върху нагревателен блок при 95 °C за 5 минути.Добавете 1 ml PBS към всяко предметно стъкло и инкубирайте за 30 минути при стайна температура, след това проникнете в срезовете чрез поставяне на 0,1% Triton-X в PBS за 15 минути при стайна температура.За да предотвратите свързването на неспецифични антитела с пробата, добавете 1 ml 3% разтвор на BSA към предметните стъкла и инкубирайте за 1 час при стайна температура.След това BSA се отстранява и предметните стъкла се промиват с PBS.Маркирайте всяка проба с молив.Първични антитела (разредени 1:200 в 1% BSA) (конексин 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) и тропонин-Т (Thermo Scientific; #MA5-12960) бяха добавени за 90 минути, след това вторични антитела (разредени 1:200 в 1% BSA) срещу мишка Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), срещу заек Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) за допълнителни 90 минути Промива се 3 пъти с PBS За да се разграничи целевото оцветяване от фона, ние използвахме само вторичното антитяло като контрола. Накрая беше добавено DAPI ядрено оцветяване и предметните стъкла бяха поставени във vectashield (Vector Laboratories) и запечатан с лак за нокти.-x ​​увеличение) и микроскоп Keyence с 40x увеличение.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) при 5 μg/ml в PBS се използва за WGA оцветяване и се прилага върху фиксирани срезове за 30 минути при стайна температура.След това слайдовете се промиват с PBS и към всеки слайд се добавя суданово черно и се инкубират за 30 минути.След това слайдовете се промиват с PBS и се добавя среда за вграждане vectashield.Слайдовете се визуализират на микроскоп Keyence при 40x увеличение.
OCT беше отстранен от пробите, както е описано по-горе.След като извадите OCT, потопете слайдовете в разтвора на Bouin за една нощ.След това предметните стъкла се изплакват с дестилирана вода за 1 час и след това се поставят в разтвор на Bibrich алое киселина фуксин за 10 минути.След това слайдовете се промиват с дестилирана вода и се поставят в разтвор от 5% фосфомолибден/5% фосфоволфрамова киселина за 10 минути.Без изплакване, прехвърлете предметните стъкла директно в разтвора на анилиново синьо за 15 минути.След това слайдовете се промиват с дестилирана вода и се поставят в 1% разтвор на оцетна киселина за 2 минути.Предметните стъкла се сушат в 200 N етанол и се прехвърлят в ксилен.Оцветените слайдове се визуализират с помощта на микроскоп Keyence с 10x обектив.Процентът на площта на фиброзата се определя количествено с помощта на софтуер Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), каталожен номер V13154, съгласно протокола на производителя с някои модификации.По-специално, беше използван хирургически удар с диаметър 6 mm, за да се осигури еднакъв размер на тъканта по време на MTT анализ.Тъканите се посяват индивидуално в ямките на 12-ямкова плака, съдържаща МТТ субстрат, съгласно протокола на производителя.Срезовете се инкубират при 37°С в продължение на 3 часа и живата тъкан метаболизира МТТ субстрата, за да образува лилаво формазаново съединение.Заменете разтвора на МТТ с 1 ml DMSO и инкубирайте при 37 °C за 15 минути, за да извлечете лилав формазан от сърдечните срезове.Пробите се разреждат 1:10 в DMSO в плаки с прозрачно дъно с 96 ямки и интензитетът на лилав цвят се измерва при 570 nm с помощта на четец на плаки Cytation (BioTek).Отчитанията бяха нормализирани спрямо теглото на всяка част от сърцето.
Средата за срез на сърцето беше заменена със среда, съдържаща 1 μCi/ml [5-3H]-глюкоза (Moravek Biochemicals, Brea, Калифорния, САЩ) за анализ на усвояване на глюкозата, както е описано по-горе.След 4 часа инкубация добавете 100 µl среда към отворена микроцентрофужна епруветка, съдържаща 100 µl 0,2 N HCl.След това епруветката се поставя в сцинтилационна епруветка, съдържаща 500 μl dH2O, за да се изпари [3H]2O за 72 часа при 37°C.След това отстранете микроцентрофужната епруветка от сцинтилационната епруветка и добавете 10 ml сцинтилационна течност.Сцинтилационните преброявания се извършват с помощта на течен сцинтилационен анализатор Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA).След това се изчислява използването на глюкоза, като се вземат предвид специфичната активност на [5-3H]-глюкоза, непълно равновесие и фон, разреждане на [5-3H]-до небелязана глюкоза и ефективност на сцинтилационния брояч.Данните се нормализират спрямо масата на участъците на сърцето.
След хомогенизиране на тъкан в Trizol, РНК се изолира от сърдечни срезове с помощта на Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 съгласно протокола на производителя.Подготовката на RNAsec библиотека, секвенирането и анализът на данните бяха извършени, както следва:
1 μg РНК на проба се използва като изходен материал за подготовката на РНК библиотеката.Библиотеките за секвениране бяха генерирани с помощта на NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit за Illumina (NEB, САЩ), следвайки препоръките на производителя, и индексните кодове бяха добавени към последователностите на атрибути за всяка проба.Накратко, иРНК се пречиства от общата РНК с помощта на магнитни перли, прикрепени с поли-Т олигонуклеотиди.Фрагментирането се извършва с помощта на двувалентни катиони при висока температура в NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).Първата верига cDNA беше синтезирана с помощта на произволни хексамерни праймери и M-MuLV обратна транскриптаза (RNase H-).Втората верига сДНК след това се синтезира с помощта на ДНК полимераза I и РНКаза Н. Останалите надвеси се превръщат в тъпи краища чрез екзонуклеазна/полимеразна активност.След аденилиране на 3'-края на ДНК фрагмента към него е прикрепен NEBNext адаптер със структура на примка с фиби, за да го подготви за хибридизация.За селекция на cDNA фрагменти с предпочитана дължина 150-200 bp.библиотечни фрагменти бяха пречистени с помощта на системата AMPure XP (Beckman Coulter, Бевърли, САЩ).След това, 3 μl USER Enzyme (NEB, САЩ) с подбрана по размер сДНК, лигирана с адаптер, се използва за 15 минути при 37°C и след това за 5 минути при 95°C преди PCR.След това се извършва PCR с помощта на Phusion High-Fidelity ДНК полимераза, универсални PCR праймери и Index (X) праймери.Накрая, PCR продуктите бяха пречистени (AMPure XP система) и качеството на библиотеката беше оценено на Agilent Bioanalyzer 2100 система.След това кДНК библиотеката беше секвенирана с помощта на секвенатор Novaseq.Необработените файлове с изображения от Illumina бяха преобразувани в необработени четения с помощта на CASAVA Base Calling.Необработените данни се съхраняват във файлове във формат FASTQ(fq), които съдържат последователности за четене и съответните базови качества.Изберете HISAT2, за да съпоставите филтрираните секвениращи четения с референтния геном Sscrofa11.1.Като цяло HISAT2 поддържа геноми от всякакъв размер, включително геноми, по-големи от 4 милиарда бази, и стойностите по подразбиране са зададени за повечето параметри.Снаждането на четения от RNA Seq данни може да бъде ефективно подравнено с помощта на HISAT2, най-бързата налична в момента система, със същата или по-добра точност от всеки друг метод.
Изобилието от транскрипти директно отразява нивото на генна експресия.Нивата на генна експресия се оценяват чрез изобилието от транскрипти (брой на секвениране), свързани с генома или екзоните.Броят на прочитанията е пропорционален на нивата на генна експресия, дължината на гена и дълбочината на секвениране.FPKM (фрагменти на хиляда базови двойки от транскрипт, секвениран на милион базови двойки) бяха изчислени и P-стойностите на диференциалната експресия бяха определени с помощта на пакета DESeq2.След това изчислихме степента на фалшиво откриване (FDR) за всяка P стойност, използвайки метода на Benjamini-Hochberg9 въз основа на вградената R-функция „p.adjust“.
РНК, изолирана от сърдечни участъци, се превръща в сДНК при концентрация от 200 ng/μl, като се използва SuperScript IV Vilo Master mix от Thermo (Thermo, кат. № 11756050).Количествената RT-PCR беше извършена с помощта на 384-ямкова прозрачна реакционна плака Applied Biosystems Endura Plate Microamp (Thermo, кат. № 4483319) и микроамп оптичен адхезив (Thermo, кат. № 4311971).Реакционната смес се състои от 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer и 3.5 µl H2O, смесени на ямка.Бяха проведени стандартни qPCR цикли и CT стойностите бяха измерени с помощта на Applied Biosystems Quantstudio 5 PCR инструмент в реално време (модул с 384 ямки; продукт # A28135).Праймерите Taqman бяха закупени от Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_m H), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) CT стойностите на всички проби бяха нормализирани към домакинския ген GAPDH.
Освобождаването на NT-ProBNP в медиите беше оценено с помощта на комплекта NT-ProBNP (прасе) (Кат. № MBS2086979, MyBioSource) съгласно протокола на производителя.Накратко, 250 µl от всяка проба и стандарт бяха добавени в два екземпляра към всяка ямка.Веднага след добавяне на пробата, добавете 50 µl реагент за анализ А към всяка ямка.Внимателно разклатете плочата и запечатайте с уплътнител.След това таблетките се инкубират при 37°С за 1 час.След това аспирирайте разтвора и измийте ямките 4 пъти с 350 µl 1X промивен разтвор, като инкубирате промивния разтвор за 1-2 минути всеки път.След това добавете 100 µl реагент за анализ B на ямка и запечатайте с уплътнител на плочата.Таблетката се разклаща внимателно и се инкубира при 37°С за 30 минути.Аспирирайте разтвора и измийте ямките 5 пъти с 350 µl от 1X промивен разтвор.Добавете 90 µl от субстратния разтвор към всяка ямка и запечатайте плаката.Инкубирайте блюдото при 37°C за 10-20 минути.Добавете 50 µl стоп разтвор към всяка ямка.Плаката беше незабавно измерена с помощта на четец на плаки Cytation (BioTek), настроен на 450 nm.
Бяха извършени анализи на мощността, за да се изберат размерите на групата, които ще осигурят >80% мощност за откриване на 10% абсолютна промяна в параметъра с 5% степен на грешка от тип I. Бяха извършени анализи на мощността, за да се изберат размерите на групата, които ще осигурят >80% мощност за откриване на 10% абсолютна промяна в параметъра с 5% степен на грешка от тип I. Анализът на мощностите е извършен за избор на размери на групата, които осигуряват >80% мощности за открити промени 10% абсолютно параметри с 5% честота на грешка тип I. Беше извършен анализ на мощността, за да се изберат размери на групите, които биха осигурили >80% мощност за откриване на 10% абсолютна промяна на параметъра с 5% процент на грешки от тип I.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Беше извършен анализ на мощността за избор на размер на групата, която осигуряваше > 80% мощност за открити промени, 10% абсолютно параметри и 5% честота на грешка тип I. Беше извършен анализ на мощността, за да се избере размер на групата, който би осигурил >80% мощност за откриване на 10% абсолютна промяна на параметъра и 5% процент на грешка тип I.Тъканните секции бяха избрани на случаен принцип преди експеримента.Всички анализи бяха слепи и пробите бяха декодирани само след като всички данни бяха анализирани.Софтуерът GraphPad Prism (Сан Диего, Калифорния) беше използван за извършване на всички статистически анализи. За всички статистики p-стойностите се считат за значими при стойности <0,05. За всички статистики p-стойностите се считат за значими при стойности <0,05. За цялата статистика p-значенията се считат за значими при стойности <0,05. За всички статистики p-стойностите се считат за значими при стойности <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 За цялата статистика p-значенията се считат за значими при стойности <0,05. За всички статистики p-стойностите се считат за значими при стойности <0,05.Двустранният t-тест на Student е извършен върху данните само с 2 сравнения.Използвана е еднопосочна или двупосочна ANOVA за определяне на значимостта между множество групи.При извършване на post hoc тестове корекцията на Tukey беше приложена за отчитане на множество сравнения.Данните за RNAsec имат специални статистически съображения при изчисляване на FDR и p.adjust, както е описано в раздела Методи.
За повече информация относно дизайна на изследването вижте резюмето на доклада за изследване на природата, свързано с тази статия.