Kea leboha ha le etetse Nature.com. Mofuta wa sebatli seo o se sebedisang o na le tshehetso e fokolang ya CSS. Bakeng sa boiphihlelo bo botle ka ho fetisisa, re kgothaletsa hore o sebedise sebatli se ntjhafaditsweng (kapa o tima Mokgwa wa ho Kopana ho Internet Explorer). Ho sa le jwalo, ho netefatsa tshehetso e tswelang pele, re tla etsa sebaka sena sa marang-rang ntle le mekgwa le JavaScript.
Ho hlokahala sistimi e tšepahalang ea in vitro e ka hlahisang tikoloho ea 'mele ea pelo ka nepo bakeng sa liteko tsa lithethefatsi. Ho fumaneha ho fokolang ha litsamaiso tsa setso sa lisele tsa pelo tsa batho ho lebisitse litlhalosong tse fosahetseng tsa litlamorao tsa lithethefatsi tsa pelo. Mona, re qapile mohlala oa setso sa lisele tsa pelo (CTCM) o hlasimollang likarolo tsa pelo ka motlakase 'me o feta ka mokhoa o otlolohileng nakong ea mekhahlelo ea systolic le diastolic ea potoloho ea pelo. Kamora matsatsi a 12 a setso, mokhoa ona o ntlafalitse karolo ea bophelo ba likarolo tsa pelo, empa ha oa ka oa boloka botšepehi ba tsona ka botlalo. Ka hona, kamora tlhahlobo e nyane ea limolek'hule, re fumane hore ho eketsoa ha 100 nM triiodothyronine (T3) le 1 μM dexamethasone (Dex) setsing sa rona ho bolokile sebopeho sa likarolo ka matsatsi a 12. Hammoho le kalafo ea T3/Dex, sistimi ea CTCM e bolokile liprofaele tsa transcriptional, bophelo, ts'ebetso ea metabolism, le botšepehi ba sebopeho boemong bo tšoanang le ba lisele tse ncha tsa pelo ka matsatsi a 12. Ho phaella moo, ho otlolla haholo ha dinama tsa pelo setsong ho baka letshwao la hypertrophic cardiac, e leng se fanang ka bopaki ba bokgoni ba CTCM ba ho etsisa maemo a hypertrophic a bakwang ke ho otlolla ha pelo. Ha re phethela, CTCM e ka etsa mohlala wa fisioloji le pathophysiology ya pelo setsong ka nako e telele, e leng se nolofalletsang tlhahlobo e tshepahalang ya dithethefatsi.
Pele ho dipatlisiso tsa bongaka, ho hlokahala ditsamaiso tse tshepahalang tsa in vitro tse ka hlahisang tikoloho ya mmele ya pelo ya motho ka nepo. Ditsamaiso tse jwalo di lokela ho etsisa ho otlolla ha metjhini, sekgahla sa pelo, le thepa ya electrophysiological e fetotsweng. Dikai tsa diphoofolo di sebediswa hangata e le sethala sa tlhahlobo bakeng sa mmele ya pelo ka botshepehi bo fokolang ho bontsheng ditlamorao tsa dithethefatsi pelong ya motho1,2. Qetellong, Mohlala wa Teko ya Tekolo ya Setso sa Dinama tsa Pelo o Loketseng (CTCM) ke mohlala o nang le kutlwisiso e kgolo le o ikgethang bakeng sa diketso tse fapaneng tsa kalafo le tsa meriana, o hlahisa ka nepo mmele le pathophysiology ya pelo ya motho3. Ho ba siyo ha sistimi e jwalo ho fokotsa ho sibollwa ha dikalafo tse ntjha bakeng sa ho hloleha ha pelo4,5 mme ho lebisitse ho chefo ya pelo le dithethefatsi e le lebaka le leholo la ho tswa mmarakeng6.
Lilemong tse leshome tse fetileng, meriana e robeli e seng ea pelo le methapo ea mali e tlositsoe tšebelisong ea bongaka hobane e baka ho lelefatsa nako ea QT ho lebisang ho arrhythmias ea ventricular le lefu la tšohanyetso7. Kahoo, ho na le tlhoko e ntseng e eketseha ea maano a tšepahalang a tlhahlobo ea pele ho kliniki ho lekola katleho ea pelo le chefo ea eona. Tšebeliso ea morao tjena ea li-cardiomyocyte tse entsoeng ke lisele tse ngata tse bakoang ke batho (hiPS-CM) tlhahlobong ea lithethefatsi le litekong tsa chefo e fana ka tharollo e sa fellang bothateng bona. Leha ho le joalo, tlhaho e sa butsoang ea li-hiPS-CM le ho hloka ho rarahana ha lisele tse ngata tsa pelo ke mefokolo e meholo ea mokhoa ona. Lithuto tsa morao tjena li bontšitse hore moeli ona o ka hlōloa ka karolo e itseng ka ho sebelisa li-hiPS-CM tsa pele ho theha li-hydrogel tsa lisele tsa pelo nakoana ka mor'a ho qala ho honyela ho sa reroang le ho eketsa butle-butle ts'usumetso ea motlakase ha nako e ntse e ea. Leha ho le joalo, li-microtissue tsena tsa hiPS-CM ha li na thepa ea electrophysiological le contratile e holileng ea myocardium ea batho ba baholo. Ho phaella moo, dinama tsa pelo tsa motho di na le sebopeho se rarahaneng haholoanyane, se nang le motswako o fapaneng wa mefuta e fapaneng ya disele, ho kenyeletswa disele tsa endothelial, di-neuron, le di-fibroblast tsa stromal, tse hokahantsweng ke dihlopha tse ikgethang tsa diprotheine tsa extracellular matrix. Ho se tshwane hona ha dipalopalo tse seng tsa cardiomyocyte11,12,13 pelong ya dinama tse anyesang tse hodileng ke tshitiso e kgolo ho etsetseng mohlala dinama tsa pelo ho sebediswa mefuta ya disele ka bomong. Meedi ena e meholo e totobatsa bohlokwa ba ho ntshetsa pele mekgwa ya ho hodisa dinama tsa pelo tse sa senyehang tlasa maemo a mmele le a pathological.
Likarolo tse tšesaane tse holisitsoeng (300 µm) tsa pelo ea motho li ipakile e le mohlala o tšepisang oa myocardium ea motho e sa senyehang. Mokhoa ona o fana ka phihlello tsamaisong e felletseng ea lisele tse ngata tsa 3D e tšoanang le lisele tsa pelo ea motho. Leha ho le joalo, ho fihlela ka 2019, tšebeliso ea likarolo tsa pelo tse holisitsoeng e ne e lekanyelitsoe ke ho phela ha nako e khuts'oane (lihora tse 24) ea ho hola. Sena se bakoa ke mabaka a 'maloa ho kenyeletsoa ho hloka ho otlolla ha' mele-mechanical, sebopeho sa moea-metsi, le ts'ebeliso ea mecha e bonolo e sa tšehetseng litlhoko tsa lisele tsa pelo. Ka 2019, lihlopha tse 'maloa tsa lipatlisiso li bontšitse hore ho kenyelletsa lintlha tsa mechini tsamaisong ea ho hola ha lisele tsa pelo ho ka eketsa bophelo ba ho hola, ho ntlafatsa polelo ea pelo, le ho etsisa lefu la pelo. Lithuto tse peli tse ntle tsa 17 le 18 li bontša hore ho jara ha 'mele o le mong ho na le phello e ntle ho phenotype ea pelo nakong ea ho hola. Leha ho le joalo, lithuto tsena ha lia ka tsa sebelisa ho jara ha 'mele o nang le mahlakore a mararo oa potoloho ea pelo, kaha likarolo tsa pelo li ne li jere matla a isometric tensile force 17 kapa linear auxotonic loading 18. Mekhoa ena ea ho otlolla lisele e ile ea fella ka ho hatelloa ha liphatsa tse ngata tsa lefutso tsa pelo kapa ho pepeseha ho feteletseng ha liphatsa tsa lefutso tse amanang le likarabelo tse sa tloaelehang tsa ho otlolla. Haholo-holo, Pitoulis le ba bang ba 19 ba thehile bate ea setso sa pelo e matla bakeng sa ho tsosolosa potoloho ea pelo ba sebelisa karabelo ea matla ea transducer le li-drive tsa khatello. Le hoja sistimi ena e lumella mohlala o nepahetseng haholoanyane oa potoloho ea pelo ea in vitro, ho rarahana le ho feta ha mokhoa ona ho fokotsa ts'ebeliso ea sistimi ena. Laboratori ea rona e sa tsoa nts'etsapele sistimi e nolofalitsoeng ea setso e sebelisang tlhohlelletso ea motlakase le mokhoa o ntlafalitsoeng oa ho boloka likarolo tsa nama ea kolobe le lisele tsa pelo tsa batho li phela matsatsi a 6.
Sengoliloeng sa hona joale, re hlalosa mohlala oa setso sa lisele tsa pelo (CTCM) re sebelisa likarolo tsa pelo ea kolobe tse kenyelletsang matšoao a humoral ho pheta-pheta fisioloji ea pelo ea mahlakore a mararo le ho ata ha pathophysiological nakong ea potoloho ea pelo. CTCM ena e ka eketsa ho nepahala ha ho bolela esale pele meriana ea pele ho kliniki ho isa boemong boo ho seng mohla bo kileng ba finyelloa ka ho fana ka sistimi ea pelo e theko e tlaase, e bohareng ba phallo e etsisang fisioloji/pathophysiology ea pelo ea liphoofolo tse anyesang bakeng sa liteko tsa meriana ea pele ho kliniki.
Matshwao a mechine a Hemodynamic a bapala karolo ya bohlokwa ho bolokeng tshebetso ya cardiomyocyte ka hara vitro 22,23,24. Sengolweng sa hajwale, re ntsheditse CTCM (Setshwantsho sa 1a) e ka etsisang tikoloho ya pelo ya motho e moholo ka ho susumetsa bobedi motlakase le mechine maqhubung a mmele (1.2 Hz, di-beats tse 72 ka motsotso). Ho qoba ho otlolla ho feteletseng ha dinama nakong ya diastole, sesebediswa sa khatiso sa 3D se sebedisitswe ho eketsa boholo ba dinama ka 25% (Setshwantsho sa 1b). Ho potlakisa ha motlakase ho bakwang ke sistimi ya C-PACE ho ile ha bewa nako ya ho qala 100 ms pele systole e qala ho sebedisa sistimi ya ho fumana data ho hlahisa potoloho ya pelo ka botlalo. Sistimi ya setso sa dinama e sebedisa actuator ya pneumatic e ka hlophiswang (LB Engineering, Germany) ho atolosa lera la silicone le tenyetsehang ka potoloho ho baka katoloso ya dikotwana tsa pelo ka kamoreng e ka hodimo. Sistimi e ne e hokahantswe le mohala wa moya o kantle ka transducer ya kgatello, e leng se ileng sa etsa hore ho kgonehe ho fetola kgatello ka nepo (± 1 mmHg) le nako (± 1 ms) (Setshwantsho sa 1c).
a Hokela karolo ea lisele lesale la tšehetso la 7 mm, le bontšitsoeng ka boputsoa, ​​ka hare ho kamore ea tlhahiso ea sesebelisoa. Kamore ea tlhahiso e arotsoe ho tloha kamoreng ea moea ka lera le lesesaane la silicone le tenyetsehang. Beha gasket pakeng tsa kamore ka 'ngoe ho thibela ho lutla. Sekoahelo sa sesebelisoa se na le li-electrode tsa graphite tse fanang ka ts'usumetso ea motlakase. b Setšoantšetso sa sebopeho sa sesebelisoa se seholo sa lisele, lesale la tataiso le lesale la tšehetso. Likarolo tsa lisele (tse sootho) li behiloe sesebelisoa se seholo ka lesale la tataiso le behiloeng ka har'a groove moeling o ka ntle oa sesebelisoa. U sebelisa tataiso, beha ka hloko lesale la tšehetso le koahetsoeng ka sekhomaretsi sa acrylic sa lisele holim'a karolo ea lisele tsa pelo. c Graph e bontšang nako ea ts'usumetso ea motlakase e le mosebetsi oa khatello ea kamore ea moea e laoloang ke actuator ea pneumatic e ka programmable (PPD). Sesebelisoa sa ho fumana data se sebelisitsoe ho hokahanya ts'usumetso ea motlakase ho sebelisoa li-sensor tsa khatello. Ha khatello ka kamoreng ea tlhahiso e fihla moeling o behiloeng, lets'oao la pulse le romeloa ho C-PACE-EM ho qala ts'usumetso ea motlakase. d Setšoantšo sa li-CTCM tse 'ne tse behiloeng shelefong ea incubator. Disebediswa tse nne di hokahantswe le PPD e le nngwe ka potoloho ya pneumatic, mme di-sensor tsa kgatello di kenngwa ka hara valve ya hemostatic ho lekola kgatello potolohong ya pneumatic. Sesebediswa se seng le se seng se na le dikarolo tse tsheletseng tsa dinama.
Re sebelisa sesebelisoa se le seng sa ho tsamaisa mesifa, re khonne ho laola lisebelisoa tse 4 tsa CTCM, tseo e 'ngoe le e 'ngoe ea tsona e neng e ka tšoara likarolo tse 6 tsa lisele (Setšoantšo sa 1d). Ho CTCM, khatello ea moea ka kamoreng ea moea e fetoloa khatello e lumellanang ka kamoreng ea mokelikeli 'me e baka katoloso ea 'mele ea selae sa pelo (Setšoantšo sa 2a le Movie e Eketsehileng ea 1). Tlhahlobo ea ho otlolla lisele ho 80 mm Hg. Art. e bontšitse ho otlolla likarolo tsa lisele ka 25% (Setšoantšo sa 2b). Ho otlolla hona ha peresente ho bontšitsoe ho tsamaisana le bolelele ba sarcomere ea 'mele ea 2.2–2.3 µm bakeng sa ho koaleha ho tloaelehileng ha karolo ea pelo17,19,25. Motsamao oa lisele o ile oa hlahlojoa ho sebelisoa litlhophiso tsa khamera e ikhethileng (Setšoantšo se Eketsehileng sa 1). Boholo le lebelo la motsamao oa lisele (Setšoantšo sa 2c, d) li tsamaisana le ho otlolla nakong ea potoloho ea pelo le nako nakong ea systole le diastole (Setšoantšo sa 2b). Ho otlolla le lebelo la lisele tsa pelo nakong ea ho koaleha le ho phomola li ile tsa lula li sa fetohe matsatsi a 12 ka har'a setso (Setšoantšo sa 2f). Ho lekola phello ea ho hlohlelletsa motlakase ho ho koaleha ha mesifa nakong ea temo, re qapile mokhoa oa ho fumana ho hokahana ho sebetsang re sebelisa algorithm ea moriti (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 2a,b) 'me ra khona ho khetholla pakeng tsa ho hokahana le ho se hlohlelletse motlakase. Karolo e tšoanang ea pelo (Setšoantšo sa 2f). Sebakeng se tsamaeang sa sehiloeng (R6-9), motlakase nakong ea ho hlohlelletsa motlakase o ne o le holimo ka 20% ho feta ha ho se na ho hlohlelletsa motlakase, e leng se bontšang monehelo oa ho hlohlelletsa motlakase mosebetsing oa ho koaleha.
Mehlala e emelang khatello ea kamore ea moea, khatello ea kamore ea mokelikeli, le litekanyo tsa motsamao oa lisele li tiisa hore khatello ea kamore e fetola khatello ea kamore ea mokelikeli, e leng se bakang motsamao o tsamaellanang oa selae sa lisele. b Mehlala e emelang karolo ea ho otlolla (e putsoa) ea likarolo tsa lisele tse tsamaellanang le karolo ea ho otlolla (e lamunu). c Motsamao o lekantsoeng oa selae sa pelo o tsamaellana le lebelo le lekantsoeng la motsamao. (d) Litsela tse emelang tsa motsamao oa potoloho (mola o moputsoa) le lebelo (mola o nang le matheba a lamunu) selaeeng sa pelo. e Tekanyo ea nako ea potoloho (n = 19 slices ka sehlopha, ho tsoa likolobeng tse fapaneng), nako ea ho honyela (n = 19 slices ka sehlopha), nako ea ho phomola (n = 19 slices ka sehlopha, ho tsoa likolobeng tse fapaneng), motsamao oa lisele (n = 25 ). slices)/sehlopha ho tsoa likolobeng tse fapaneng), lebelo la systolic le phahameng (n = 24(D0), 25(D12) slices/sehlopha ho tsoa likolobeng tse fapaneng) le sekhahla sa ho phomola se phahameng (n = 24(D0), 25(D12) slices/sehlopha ho tsoa likolobeng tse fapaneng). Teko ea t ea Seithuti se nang le mehatla e 'meli ha ea ka ea bontša phapang e kholo ho paramethara efe kapa efe. f Mehlala ea tlhahlobo ea khatello e emelang ea likarolo tsa lisele tse nang le ts'usumetso ea motlakase (e khubelu) le e se nang (e putsoa), libaka tse leshome tsa libaka tsa likarolo tsa lisele tse tsoang karolong e le 'ngoe. Liphanele tse ka tlase li bontša tekanyo ea phapang ea peresente khatellong likarolong tsa lisele tse nang le ts'usumetso ea motlakase le e se nang eona libakeng tse leshome tse tsoang likarolong tse fapaneng. (n = dilae tse 8/sehlopha ho tswa dikolobeng tse fapaneng, Teko ya t ya Seithuti se nang le mehatla e mmedi e etswa; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = dilae tse 8/sehlopha ho tswa dikolobeng tse fapaneng, Teko ya t ya Seithuti se nang le mehatla e mmedi e etswa; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = dikarolo tse 8/sehlopha ho tswa dikolobeng tse fapaneng, teko ya t ya Seithuti e nang le mehatla e mmedi; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，來自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05）. （n = 8 片/组，來自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05）. (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = dikarolo tse 8/sehlopha, ho tswa dikolobeng tse fapaneng, teko ya t ya Seithuti e nang le mehatla e mmedi; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Mehala ea liphoso e emela karolelano ea ± ho kheloha ho tloaelehileng.
Tsamaisong ea rona ea pele ea ho lema li-heart slice tsa biomimetic tse sa fetoheng [20, 21], re bolokile ho phela, ts'ebetso, le botšepehi ba sebopeho sa li-heart slices ka matsatsi a 6 ka ho sebelisa ts'usumetso ea motlakase le ho ntlafatsa sebopeho sa mahareng. Leha ho le joalo, kamora matsatsi a 10, lipalo tsena li ile tsa theoha haholo. Re tla bua ka likarolo tse lengoang tsamaisong ea rona ea pele ea ho lema li-heart slice tsa biomimetic tse sa fetoheng 20, maemo a taolo (Ctrl) 'me re tla sebelisa mokhoa oa rona oa pele o ntlafalitsoeng e le maemo a MC le setso tlas'a ts'usumetso ea mechini le motlakase ka nako e le' ngoe (CTCM). e bitsoang . Taba ea pele, re fumane hore ts'usumetso ea mechini ntle le ts'usumetso ea motlakase e ne e sa lekana ho boloka ts'ebetso ea lisele ka matsatsi a 6 (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 3a,b). Hoa thahasellisa hore ka ho hlahisoa ha ts'usumetso ea 'mele le ea motlakase ho sebelisoa STCM, ts'ebetso ea likarolo tsa pelo tsa matsatsi a 12 e ile ea lula e tšoana le likarolong tsa pelo tse ncha tlas'a maemo a MS, empa eseng tlas'a maemo a Ctrl, joalo ka ha ho bontšitsoe ke tlhahlobo ea MTT (Setšoantšo sa 1). 3a). Sena se fana ka maikutlo a hore ts'usumetso ea mechini le ketsiso ea potoloho ea pelo li ka boloka likarolo tsa lisele li phela habeli ho feta kamoo ho tlalehiloeng tsamaisong ea rona ea pele ea ho lema li-heart slice. Leha ho le jwalo, tlhahlobo ya botshepehi ba sebopeho sa dikarolo tsa dinama ka ho immunolabeling ya cardiac troponin T le connexin 43 e bontshitse hore tlhahiso ya connexin 43 e ne e le hodimo haholo dinama tsa MC ka letsatsi la 12 ho feta ditaolong tsa letsatsi lona leo. Leha ho le jwalo, tlhahiso e tshwanang ya connexin 43 le sebopeho sa Z-disc ha di a ka tsa bolokwa ka botlalo (Setshwantsho sa 3b). Re sebedisa moralo wa bohlale ba maiketsetso (AI) ho lekanya botshepehi ba sebopeho sa dinama tsa ... Ho phaella moo, ho daea ha Masson ka trichrome ho senotse peresente e tlase haholo ea fibrosis tlas'a maemo a MS ha ho bapisoa le maemo a taolo letsatsing la 12 la temo (Setšoantšo sa 3c). Leha CTCM e ekelitse ho phela ha likarolo tsa lisele tsa pelo letsatsing la 12 ho ea boemong bo tšoanang le ba lisele tse ncha tsa pelo, ha ea ka ea ntlafatsa haholo botšepehi ba sebopeho sa likarolo tsa pelo.
Chate ea Bar e bontša tekanyo ea ho phela ha MTT ha likarolo tsa pelo tse foreshe (D0) kapa setso sa likarolo tsa pelo matsatsi a 12 ebang ke setsong se sa fetoheng (D12 Ctrl) kapa ho CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) likarolo/sehlopha ho tsoa likolobeng tse fapaneng, tsela e le 'ngoe eo tlhahlobo ea ANOVA e etsoang ka eona; ####p < 0.0001 ha e bapisoa le D0 le **p < 0.01 ha e bapisoa le D12 Ctrl). Chate ea Bar e bontša tekanyo ea ho phela ha MTT ha likarolo tsa pelo tse foreshe (D0) kapa setso sa likarolo tsa pelo matsatsi a 12 ebang ke setsong se sa fetoheng (D12 Ctrl) kapa ho CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), likarolo/sehlopha sa 12 (D12 MC) ho tsoa likolobeng tse fapaneng, tsela e le 'ngoe eo tlhahlobo ea ANOVA e etsoang ka eona; ####p < 0.0001 ha e bapisoa le D0 le **p < 0.01 ha e bapisoa le D12 Ctrl).Histogram e bonts'a tekanyo ea ho phela ha likarolo tsa pelo tse ncha tsa MTT (D0) kapa setso sa likarolo tsa pelo matsatsi a 12 ho setso se sa fetoheng (taolo ea D12) kapa CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (taolo ea D12). ) ), likarolo/sehlopha sa 12 (D12 MC) ho tsoa likolobeng tse fapaneng, ho etsoa tlhahlobo ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 ha e bapisoa le D0 le **p < 0.01 ha e bapisoa le D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 新鲜心脏切片(D0) 或軇片(D0) 18 (D0), 15 (D12 Ctrl)天的MTT 活力的量化)，來自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p <2比 10D1 < 0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 新鲜心脏切片(D0)2 (MCD1) ， MCD1切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p <0.0001, 与D12 Ctrl 相比，**p.)histogram e bonts'ang tekanyo ea ho phela ha MTT likarolong tsa pelo e ncha (D0) kapa likarolong tsa pelo tse lengoang matsatsi a 12 ka har'a setso se sa fetoheng (taolo ea D12) kapa CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (taolo ea D12)), 12 (D12 MC) likarolo/sehlopha ho tsoa likolobeng tse fapaneng, teko ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 ha e bapisoa le D0, **p < 0.01 ha e bapisoa le D12 Ctrl).b Troponin-T (e tala), connexin 43 (e khubelu) le DAPI (e putsoa) likarolong tsa pelo tse sa tsoa aroloa (D0) kapa likarolong tsa pelo tse lengoang tlas'a maemo a sa fetoheng (Ctrl) kapa maemo a CTCM (MC) matsatsi a 12) a litšoantšo tse emelang immunofluorescence (sekala se se nang letho = 100 µm). Tekanyo ea bohlale ba maiketsetso ea botšepehi ba sebopeho sa lisele tsa pelo (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) likotoana/sehlopha ka seng ho tsoa kolobeng e fapaneng, teko ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe e etsoa; ####p < 0.0001 ha e bapisoa le D0 le ****p < 0.0001 ha e bapisoa le D12 Ctrl). Tekanyo ea bohlale ba maiketsetso ea botšepehi ba sebopeho sa lisele tsa pelo (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) likotoana/sehlopha ka seng ho tsoa likolobeng tse fapaneng, tlhahlobo ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe e etsoa; ####p < 0.0001 ha e bapisoa le D0 le ****p < 0.0001 ha e bapisoa le D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) сруправи/ проводится однофакторный тест ANOVA < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Tekanyo ea botšepehi ba sebopeho sa lisele tsa pelo ka bohlale ba maiketsetso (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), likarolo/lihlopha tse 5 (D12 MC) tse tsoang likolobeng tse fapaneng, tlhahlobo ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe e entsoe; ####p < 0.0001 khahlano le D0 le ****p < 0.0001 ha e bapisoa le D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) lilae/hlopha e 'ngoe le e 'ngoe ea likolobe tse fapaneng, teko ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe;##0#0D0D010. Tlanya, ****p <0.0001 ho tobetsa D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) lilae/hlopha e 'ngoe le e 'ngoe ea likolobe tse fapaneng, tlhahlobo ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe;##0#0D0D0 **** **** <0.0001 Tlanya D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC/грейн) скар разных свиней, односторонний тест ANOVA <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Bohlale ba maiketsetso ho lekanya botšepehi ba sebopeho sa lisele tsa pelo (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) likarolo/sehlopha ka seng sa likolobe tse fapaneng, teko ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe; ####p<0.0001 vs .D0 Bakeng sa papiso ****p < 0.0001 ha e bapisoa le D12 Ctrl). c Litšoantšo tse emelang (ka letsohong le letšehali) le tekanyo (ka letsohong le letona) bakeng sa likotoana tsa pelo tse dailoeng ka letheba la Masson la trichrome (Sekala se se nang letho = 500 µm) (n = likotoana tse 10/sehlopha ka seng ho tsoa kolobeng e fapaneng, ho etsoa teko ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe; ####p < 0.0001 ha e bapisoa le D0 le ***p < 0.001 ha e bapisoa le D12 Ctrl). c Litšoantšo tse emelang (ka letsohong le letšehali) le tekanyo (ka letsohong le letona) bakeng sa likotoana tsa pelo tse dailoeng ka letheba la Masson la trichrome (Sekala se se nang letho = 500 µm) (n = likotoana tse 10/sehlopha ka seng ho tsoa likolobeng tse fapaneng, ho etsoa teko ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe; #### p < 0.0001 ha e bapisoa le D0 le ***p < 0.001 ha e bapisoa le D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Масязкен Масябо 5 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p <0,0001 по сравнению с D0 и ***p 0,0001 по сравнению с D0 и ***p 0,000 c Litšoantšo tse emelang (ka letsohong le letšehali) le tekanyo (ka letsohong le letona) ea likarolo tsa pelo tse nang le letheba la Masson la trichrome (sekala se sa koaheloang = 500 µm) (n = likarolo/sehlopha tse 10 ho tsoa likolobeng tse fapaneng, tlhahlobo ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe e entsoe; #### p < 0 .0001 ha e bapisoa le D0 le ***p < 0.001 ha e bapisoa le D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 1m） 100 =个切片/组，每组來自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p <0.0001 与D0 相比，***p <0.001 Ctrl ）D12 . C 用 mason 三 色 染料的 心脏 切片的 代表性 （左 左） 量化= 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 來自 不同 猪 , 进行 单向 单向 Anova 测试；####D0 p 10 <0.001 Tobetsa konopo ea D12 Ctrl. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массом Массона =0 (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;####p <0,000,000 tobetsa D12 Ctrl). c Litšoantšo tse emelang (ka letsohong le letšehali) le tekanyo (ka letsohong le letona) ea likarolo tsa pelo tse nang le letheba la Masson's trichrome (le se nang letho = 500 µm) (n = likarolo/sehlopha tse 10, e 'ngoe le e 'ngoe e tsoa kolobeng e fapaneng, e lekiloeng ka tlhahlobo ea tsela e le 'ngoe ea phapang ;### # p < 0.0001 ha e bapisoa le D0, ***p < 0.001 ha e bapisoa le D12 Ctrl).Mehala ea liphoso e emela karolelano ea ± ho kheloha ho tloaelehileng.
Re ile ra nahana hore ka ho eketsa limolek'hule tse nyane setsing sa tlhahiso, botšepehi ba cardiomyocyte bo ka ntlafala mme ntshetsopele ya fibrosis ya fokotseha nakong ya tlhahiso ya CTCM. Ka hona, re ile ra hlahloba limolek'hule tse nyane re sebedisa ditso tsa rona tsa taolo e sa fetoheng20,21 ka lebaka la palo e nyane ya mabaka a ferekanyang. Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), le SB431542 (SB) di ile tsa kgethwa bakeng sa tlhahlobo ena. Limolek'hule tsena tse nyane di kile tsa sebediswa ditso tsa hiPSC-CM ho susumetsa kgolo ya cardiomyocyte ka ho eketsa bolelele ba sarcomere, T-tubules, le lebelo la ho tsamaisa. Ho phaella moo, Dex (glucocorticoid) le SB di tsebahala ka ho thibela ho ruruha29,30. Ka hona, re ile ra leka hore na ho kenyeletswa ha e le nngwe kapa motswako wa dimolek'hule tsena tse nyane ho tla ntlafatsa botsitso ba sebopeho sa dikarolo tsa pelo. Bakeng sa tlhahlobo ya pele, tekanyo ya motsoako ka mong e kgethilwe ho latela maemo a sebediswang hangata mehlaleng ya tlhahiso ya sele (1 μM Dex27, 100 nM T327, le 2.5 μM SB31). Kamora matsatsi a 12 a ho lema, motsoako oa T3 le Dex o ile oa fella ka botsitso bo botle ba sebopeho sa pelo le ho nchafatsoa ho fokolang ha likhoele (Litšoantšo tse Tlatsetsang 4 le 5). Ho phaella moo, tšebeliso ea makhetlo a mabeli kapa a mabeli a mahloriso ana a T3 le Dex e hlahisitse liphello tse kotsi ha li bapisoa le mahloriso a tloaelehileng (Setšoantšo se Tlatsetsang 6a,b).
Kamora tlhahlobo ea pele, re entse papiso ea maemo a 4 a setso ka hlooho (Setšoantšo sa 4a): Ctrl: likarolo tsa pelo tse lengoang setsong sa rona se sa fetoheng se hlalositsoeng pele ho sebelisoa mokhoa oa rona o ntlafalitsoeng; 20.21 TD: T3 le Ctrl s Added Dex ka Laboraro; MC: likarolo tsa pelo tse lengoang ho CTCM ho sebelisoa mokhoa oa rona o ntlafalitsoeng pele; le MT: CTCM e nang le T3 le Dex e ekelitsoeng setsing. Kamora matsatsi a 12 a temo, ho phela ha lisele tsa MS le MT ho ile ha lula ho tšoana le liseleng tse foreshe tse hlahlobiloeng ke teko ea MTT (Setšoantšo sa 4b). Hoa thahasellisa hore ho eketsoa ha T3 le Dex ho litso tsa transwell (TD) ha hoa ka ha fella ka ntlafatso e kholo ea ho phela ha ho bapisoa le maemo a Ctrl, e leng se bontšang karolo ea bohlokoa ea ho hlasimolla ha mechine ho bolokeng ho phela ha likarolo tsa pelo.
Setšoantšo sa moralo oa liteko se bontšang maemo a mane a setso a sebelisitsoeng ho lekola liphello tsa ho hlohlelletsa ka mechine le tlatsetso ea T3/Dex holim'a seaplane matsatsi a 12. b Grafo ea bare e bontša tekanyo ea ho phela matsatsi a 12 kamora ho lengoa maemong 'ohle a mane a ho lengoa (Ctrl, TD, MC, le MT) ha ho bapisoa le likotoana tsa pelo tse foreshe (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD le D12 MT), likotoana/sehlopha tse 12 (D12 MC) tse tsoang likolobeng tse fapaneng, ho etsoa teko ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 ha ho bapisoa le D0 le **p < 0.01 ha ho bapisoa le D12 Ctrl). b Grafo ea bare e bontša tekanyo ea ho phela matsatsi a 12 kamora ho lengoa maemong 'ohle a mane a ho lengoa (Ctrl, TD, MC, le MT) ha ho bapisoa le likotoana tsa pelo tse foreshe (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD le D12 MT), likotoana/sehlopha tse 12 (D12 MC) tse tsoang likolobeng tse fapaneng, tlhahlobo ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe e etsoa; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 ha ho bapisoa le D0 le **p < 0.01 ha ho bapisoa le D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования во всех 4 сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разнстрой свинство, ANOVA; ####p <0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Chate ea bare e bontša tekanyo ea ho phela matsatsing a 12 kamora ho lengoa maemong 'ohle a mane a ho lengoa (taolo, TD, MC, le MT) ha ho bapisoa le likarolo tsa pelo e ncha (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, le D12 MT), likarolo/sehlopha sa 12 (D12 MC) ho tsoa likolobeng tse fapaneng, teko ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 khahlano le D0 le **p < 0.01 ka ha ho bapisoa le D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl 、D12 TD) MT)，來自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p <0.0001,###p <0.001 与D0 相比，*0p. Setšoantšo sa D12控制.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению свежими TD срезами сердца (D0) (n = 15,D12), Ctrl (D12) MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; b Histogram e bonts'ang maemo ohle a 4 a setso (taolo, TD, MC le MT) ha e bapisoa le likarolo tsa pelo e ncha (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD le D12 MT), ho tsoa likolobeng tse fapaneng likarolo/sehlopha sa 12 (D12 MC), teko ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe; ####p<0.0001, ###p<0.001 khahlano le D0, **p<0.01 khahlano le taolo D12). c Grafo ea bare e bontša tekanyo ea phallo ea glucose matsatsi a 12 kamora ho lengoa maemong 'ohle a 4 a ho lengoa (Ctrl, TD, MC, le MT) ha ho bapisoa le likotoana tsa pelo tse foreshe (D0) (n = likotoana tse 6/sehlopha ho tsoa likolobeng tse fapaneng, ho etsoa tlhahlobo ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe; ###p < 0.001, ha ho bapisoa le D0 le ***p < 0.001 ha ho bapisoa le D12 Ctrl). c Grafo ea bare e bontša tekanyo ea phallo ea glucose matsatsi a 12 kamora ho lengoa maemong 'ohle a 4 a ho lengoa (Ctrl, TD, MC, le MT) ha ho bapisoa le likotoana tsa pelo tse foreshe (D0) (n = likotoana tse 6/sehlopha ho tsoa likolobeng tse fapaneng, ho etsoa tlhahlobo ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe; ###p < 0.001, ha ho bapisoa le D0 le ***p < 0.001 ha ho bapisoa le D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования, което сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; ##не#p 0,00 <0,00 tlhophiso ka D12 Ctrl). c Histogram e bonts'a tekanyo ea phallo ea tsoekere matsatsing a 12 kamora ho lengoa tlas'a maemo 'ohle a 4 a ho lengoa (taolo, TD, MC le MT) ha ho bapisoa le likarolo tsa pelo e ncha (D0) (n = likarolo tse 6/sehlopha ho tsoa likolobeng tse fapaneng, tlhahlobo ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe e entsoe; ###p < 0.001 ha e bapisoa le D0 le ***p < 0.001 ha e bapisoa le D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试;相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （ctrl 、 td 、 mc 和 mt) 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 來自 猪 , , , , , , , , 猪 猪单向执行ANOVA 测试；#0#01, .相比,***p < 0.001 ho tsoa ho D12 Ctrl 相比). c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех 4 условий культивирования сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###0p1 <0,0 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram e bonts'ang tekanyo ea phallo ea tsoekere matsatsing a 12 kamora ho lengoa bakeng sa maemo 'ohle a 4 a ho lengoa (taolo, TD, MC, le MT) ha ho bapisoa le likarolo tsa pelo e ncha (D0) (n = likarolo tse 6/sehlopha, ho tsoa likolobeng tse fapaneng, tse le 'ngoe. Haeba liteko tsa ANOVA li entsoe, ###p < 0.001 ha li bapisoa le D0, ***p < 0.001 ha li bapisoa le D12 (taolo).d Dipontsho tsa tlhahlobo ya kgatello ya dinama tse foreshe (tse putswa), tsa letsatsi la 12 MC (tse tala), le tsa letsatsi la 12 MT (tse kgubedu) dintlheng tse leshome tsa karolo ya dinama tsa dibaka (n = dilae tse 4/sehlopha, teko ya ANOVA ya tsela e le nngwe; ho ne ho se na phapang e kgolo pakeng tsa dihlopha). e Pontsho ya seretse se chesang e bontshang dijini tse hlahisitsweng ka tsela e fapaneng dikarolong tsa pelo e foreshe (D0) ha e bapiswa le dikarolo tsa pelo tse hodisitsweng tlasa maemo a sa fetoheng (Ctrl) kapa tlasa maemo a MT (MT) matsatsi a 10-12. f 'Mapa wa mocheso wa dijini tsa sarcomere bakeng sa dikarolo tsa pelo tse hodisitsweng tlasa maemo ka nngwe a setso. Dipontsho tsa diphoso di emela karolelano ya ± ho kheloha ho tloaelehileng.
Ho itshetleha ka metabolism ho phetoho ho tloha ho oxidation ya mafura a acid ho ya ho glycolysis ke letshwao la ho senyeha ha cardiomyocyte. Di-cardiomyocyte tse sa holang haholoholo di sebedisa glucose bakeng sa tlhahiso ya ATP mme di na le mitochondria e sa plastic e nang le cristae e fokolang5,32. Ditshekatsheko tsa tshebediso ya glucose di bontshitse hore tlasa maemo a MC le MT, tshebediso ya glucose e ne e tshwana le ya dinama tse foreshe tsa letsatsi la 0 (Setshwantsho sa 4c). Leha ho le jwalo, disampole tsa Ctrl di bontshitse keketseho e kgolo tshebedisong ya glucose ha e bapiswa le dinama tse foreshe. Sena se bontsha hore motswako wa CTCM le T3/Dex o ntlafatsa matla a dinama mme o boloka phenotype ya metabolism ya dikarolo tsa pelo tse hodisitsweng tsa matsatsi a 12. Ho feta moo, tlhahlobo ya khatello e bontshitse hore maemo a khatello a ntse a tshwana le a dinama tse foreshe tsa pelo ka matsatsi a 12 tlasa maemo a MT le MS (Setshwantsho sa 4d).
Ho sekaseka tšusumetso e akaretsang ea CTCM le T3/Dex holim'a sebaka sa lefats'e sa transcriptional sa lisele tsa pelo, re entse RNAseq holim'a likotoana tsa pelo tse tsoang maemong 'ohle a mane a fapaneng a setso (Tlhahiso ea Tlatsetso 1). Hoa thahasellisa hore likarolo tsa MT li bontšitse ho tšoana ho hoholo ha transcriptional le lisele tsa pelo tse ncha, ka liphatsa tsa lefutso tse 16 feela tse hlahisitsoeng ka mokhoa o fapaneng ho tsoa ho tse 13,642. Leha ho le joalo, joalo ka ha re bontšitse pejana, likarolo tsa Ctrl li bontšitse liphatsa tsa lefutso tse 1229 tse hlahisitsoeng ka mokhoa o fapaneng kamora matsatsi a 10-12 a setso (Setšoantšo sa 4e). Lintlha tsena li tiisitsoe ke qRT-PCR ea liphatsa tsa lefutso tsa pelo le fibroblast (Setšoantšo sa Tlatsetso 7a-c). Hoa thahasellisa hore likarolo tsa Ctrl li bontšitse ho fokotseha ha liphatsa tsa lefutso tsa potoloho ea pelo le sele le ts'ebetso ea mananeo a liphatsa tsa lefutso tse ruruhang. Lintlha tsena li bontša hore ho fetoha ha phapang, hoo hangata ho etsahalang kamora ho holisa nako e telele, ho fokotseha ka botlalo tlas'a maemo a MT (Setšoantšo sa Tlatsetso 8a,b). Phuputso e hlokolosi ea liphatsa tsa lefutso tsa sarcomere e bontšitse hore ke tlas'a maemo a MT feela moo liphatsa tsa lefutso tse kenyang sarcomere (Setšoantšo sa 4f) le kanale ea ion (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 9) li bolokiloeng, li li sireletsa khatellong tlas'a maemo a Ctrl, TD, le MC. Lintlha tsena li bontša hore ka motsoako oa ho hlohlelletsa ka mechine le humoral (T3/Dex), transcriptome ea karolo ea pelo e ka lula e tšoana le likarolo tsa pelo tse ncha kamora matsatsi a 12 a ho hola.
Liphihlelo tsena tsa transcription li tšehetsoa ke taba ea hore botšepehi ba sebopeho sa li-cardiomyocyte likarolong tsa pelo bo bolokoa hantle tlas'a maemo a MT matsatsi a 12, joalo ka ha ho bontšitsoe ke connexin e sa senyehang le e fumanehang sebakeng se le seng 43 (Setšoantšo sa 5a). Ho phaella moo, fibrosis likarolong tsa pelo tlas'a maemo a MT e fokotsehile haholo ha e bapisoa le Ctrl 'me e tšoana le likarolo tsa pelo e ncha (Setšoantšo sa 5b). Lintlha tsena li bontša hore motsoako oa ho hlasimolla ha mechine le kalafo ea T3/Dex li boloka sebopeho sa pelo ka katleho likarolong tsa pelo setsong.
Litšoantšo tse emelang immunofluorescence tsa troponin-T (e tala), connexin 43 (e khubelu), le DAPI (e putsoa) likarolong tsa pelo tse sa tsoa aroloa (D0) kapa tse lengoang matsatsi a 12 maemong 'ohle a mane a ho lema a karolo ea pelo (sekala sa bar = 100 µm). Tekanyo ea bohlale ba maiketsetso ea botšepehi ba sebopeho sa lisele tsa pelo (n = 7 (D0 le D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC le D12 MT) likarolo/sehlopha ho tsoa likolobeng tse fapaneng, tlhahlobo ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe e etsoa; ####p < 0.0001 ha e bapisoa le D0 le *p < 0.05, kapa ****p < 0.0001 ha e bapisoa le D12 Ctrl). Tekanyo ea bohlale ba maiketsetso ea botšepehi ba sebopeho sa lisele tsa pelo (n = 7 (D0 le D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC le D12 MT) likarolo/sehlopha ho tsoa likolobeng tse fapaneng, tlhahlobo ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe e etsoa; #### p < 0.0001 ha e bapisoa le D0 le *p < 0.05, kapa ****p < 0.0001 ha e bapisoa le D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MT/ D12 MT) le Dпре от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA Tekanyo ea botšepehi ba sebopeho sa lisele tsa pelo ho sebelisoa bohlale ba maiketsetso (n = 7 (D0 le D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC le D12 MT) likarolo/sehlopha ho tsoa likolobeng tse fapaneng, tlhahlobo ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe e entsoe; #### p < 0.0001 ha e bapisoa le D0 le *p < 0.05 kapa ****p < 0.0001 ha e bapisoa le D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试;相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 (d0 和 d12 ctrl)智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试相比）.Tekanyo ea botšepehi ba sebopeho sa lisele tsa pelo ho sebelisoa bohlale ba maiketsetso likolobeng tse fapaneng (n = 7 (D0 le D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC le D12 MT) likarolo/sehlopha) ka teko ea ANOVA ea tsela e le 'ngoe;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 ha e bapiswa le D0 le *p < 0.05 kapa ****p < 0.0001 ha e bapiswa le D12 Ctrl). b Litšoantšo tse emelang le ho lekanya dikotwana tsa pelo tse daeditsweng ka letheba la Masson la trichrome (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, le D12 MC), dikotwana/sehlopha sa 9 (D12 MT) tse tswang dikolobeng tse fapaneng, teko ya ANOVA ya tsela e le nngwe e etswa; ####p < 0.0001 ha e bapiswa le D0 le ***p < 0.001, kapa ****p < 0.0001 ha e bapiswa le D12 Ctrl). b Litšoantšo tse emelang le ho lekanya dikotwana tsa pelo tse daeditsweng ka letheba la Masson la trichrome (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, le D12 MC), dikotwana/sehlopha sa 9 (D12 MT) tse tswang dikolobeng tse fapaneng, teko ya ANOVA ya tsela e le nngwe e etswa; ####p < 0.0001 ha e bapiswa le D0 le ***p < 0.001, kapa ****p < 0.0001 ha e bapiswa le D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная 10) = 10 = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA < ####p0p 0,0 0,001 kapa ****p <0,0001 по tobetsa D12 Ctrl). b Litšoantšo tse emelang le ho lekanya likarolo tsa pelo tse nang le letheba la Masson's trichrome (sekala sa bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD le D12 MC), likarolo/sehlopha tse 9 (D12 MT) tse tsoang likolobeng tse fapaneng, li entsoe ka tsela e le 'ngoe ANOVA; ####p < 0.0001 khahlanong le D0 le ***p < 0.001 kapa ****p < 0.0001 khahlanong le D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D2D,D 、 D10（D2D0 MC. 0.0001 ho tsoa ho D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的心脏 切片 的 代表性 和 量化 (比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （ d 1 d 2), d d 1 = d 1 = d d 1 d12 td 和 d12 mc） 來自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析; 0.0001 ho tsoa ho D12 Ctrl 相比). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500, D1 = 500, D1 = 500 D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; D12 Ctrl). b Litšoantšo tse emelang le ho lekanya likarolo tsa pelo tse nang le Masson's trichrome (sekala sa bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD le D12 MC), likarolo tse 9 (D12 MT) tse tsoang likolobeng/sehlopheng se fapaneng, mokhoa o le mong oa ANOVA; ####p < 0.0001 ha e bapisoa le D0, ***p < 0.001 kapa ****p < 0.0001 ha e bapisoa le D12 Ctrl).Mehala ea liphoso e emela karolelano ea ± ho kheloha ho tloaelehileng.
Qetellong, bokgoni ba CTCM ba ho etsisa hypertrophy ya pelo bo ile ba lekolwa ka ho eketsa ho otlolla ha dinama tsa pelo. Ho CTCM, kgatello ya kamore ya moya e phahameng e eketsehile ho tloha ho 80 mmHg ho ya ho 80 mmHg. Art. (ho otlolla ho tlwaelehileng) ho fihlela ho 140 mmHg Art. (Setshwantsho sa 6a). Sena se tsamaellana le keketseho ya 32% ya ho otlolla (Setshwantsho sa 6b), e neng e bontshitswe pele e le peresente e tsamaellanang ya ho otlolla e hlokahalang bakeng sa dikarolo tsa pelo ho fihlella bolelele ba sarcomere bo tshwanang le bo bonwang ho hypertrophy. Ho otlolla le lebelo la dinama tsa pelo nakong ya ho honyela le ho phomola di ile tsa dula di tsitsitse nakong ya matsatsi a tsheletseng a ho hola (Setshwantsho sa 6c). Dinama tsa pelo tse tswang maemong a MT di ile tsa otlollwa ho tlwaelehileng (MT (Normal)) kapa maemo a ho otlolla ho feteletseng (MT (OS)) ka matsatsi a tsheletseng. Kamora matsatsi a mane a ho hola, biomarker ya hypertrophic NT-ProBNP e ile ya phahamiswa haholo maemong a mahareng tlasa maemo a MT (OS) ha e bapiswa le maemo a MT (normal) (Setshwantsho sa 7a). Ho phaella moo, kamora matsatsi a tsheletseng a ho lema, boholo ba sele ho MT (OS) (Setshwantsho sa 7b) bo ile ba eketseha haholo ha bo bapiswa le dikarolo tsa pelo ya MT (e tlwaelehileng). Ho feta moo, phetisetso ya nyutlelie ya NFATC4 e ile ya eketseha haholo dinama tse otlolohileng haholo (Setshwantsho sa 7c). Diphetho tsena di bontsha ntshetsopele e tswelang pele ya ho ntjhafatsa pathological kamora hyperdistension mme di tshehetsa mohopolo wa hore sesebediswa sa CTCM se ka sebediswa e le sethala sa ho ithuta matshwao a hypertrophy ya pelo a bakwang ke ho otlollwa.
Mehlala e emelang khatello ea kamore ea moea, khatello ea kamore ea mokelikeli, le litekanyo tsa motsamao oa lisele li tiisa hore khatello ea kamore e fetola khatello ea kamore ea mokelikeli, e leng se bakang motsamao o tsamaellanang oa selae sa lisele. b Peresente e emelang peresente ea ho otlolla le sekhahla sa ho otlolla bakeng sa likarolo tsa lisele tse otlollotsoeng (lamunu) le tse otlollotsoeng haholo (putsoa). c Grafo ea bare e bonts'ang nako ea potoloho (n = 19 slices ka sehlopha, ho tsoa likolobeng tse fapaneng), nako ea ho honyela (n = 18-19 slices ka sehlopha, ho tsoa likolobeng tse fapaneng), nako ea ho phomola (n = 19 slices ka sehlopha, ho tsoa likolobeng tse fapaneng) ), boholo ba motsamao oa lisele (n = 14 slices/sehlopha, ho tsoa likolobeng tse fapaneng), lebelo la systolic le phahameng (n = 14 slices/sehlopha, ho tsoa likolobeng tse fapaneng) le sekhahla sa ho phomola se phahameng (n = 14 (D0), 15 (D6) ) likarolo/lihlopha) ho tsoa likolobeng tse fapaneng), teko ea t ea Moithuti ea mehatla e 'meli ha ea ka ea bontša phapang e kholo ho paramethara efe kapa efe, e bontšang hore liparamethara tsena li ile tsa lula li tsitsitse nakong ea matsatsi a 6 a ho lema ka overvoltage. Libara tsa liphoso li emela karolelano ± ho kheloha ho tloaelehileng.
Tekanyo ea graph ea Bar ea mahloriso a NT-ProBNP mecheng ea temo ho tsoa likotong tsa pelo tse lengoang tlas'a maemo a MT normal stretch (Norm) kapa overotching (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, le D4 MTOS) likoto/sehlopha ho tsoa likolobeng tse fapaneng, ANOVA ea litsela tse peli e etsoa; **p < 0.01 ha e bapisoa le stretch e tloaelehileng). Tekanyo ea graph ea Bar ea mahloriso a NT-ProBNP mecheng ea temo ho tsoa likotong tsa pelo tse lengoang tlas'a maemo a MT normal stretch (Norm) kapa overotching (OS) (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, le D4 MTOS) likoto/sehlopha ho tsoa likolobeng tse fapaneng, ANOVA ea litsela tse peli e etsoa; **p < 0.01 ha e bapisoa le stretch e tloaelehileng).Histogram ea bongata ba mahloriso a NT-ProBNP setsing sa temo ho tsoa likotong tsa pelo tse lengoang tlas'a maemo a MT stretch e tloaelehileng (norm) kapa overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, le D4).MTOS) likoto / sehlopha ho tsoa likolobeng tse fapaneng, tlhahlobo ea lintlha tse peli ea phapang e etsoa;**p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 ha e bapisoa le ho otlolla ho tloaelehileng). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓麦的条彈2 浓麦的条彈2 = MTNorm)、 3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）來自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸1 . A Quantification ea NT-ProBNP mahloriso ka lilae tsa pelo tse hlahisitsoeng tlas'a maemo a tloaelehileng a MT (Norm) kapa overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm pamwe D4 MTOS) ho tloha ho fapaneng 猪的切片/组，可以双向ka ho otlolla ho tloaelehileng, p <0.01).histogram Tekanyo ea mahloriso a NT-ProBNP likotong tsa pelo tse lengoang tlas'a maemo a MT stretch e tloaelehileng (norm) kapa overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) le D4 MTOS) likoto/sehlopha ho tsoa likolobeng tse fapaneng, tlhahlobo ea litsela tse peli ea phapang;**p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 ha e bapisoa le ho otlolla ho tloaelehileng). b Litšoantšo tse emelang dikotwana tsa pelo tse daeditsweng ka troponin-T le WGA (ka letsohong le letšehali) le tekanyo ya boholo ba sele (ka letsohong le letona) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) disele/sehlopha ho tswa dikotwaneng tse 10 tse fapaneng ho tswa dikolobeng tse fapaneng, Teko ya t ya Seithuti se nang le mehatla e mmedi e etswa; ****p < 0.0001 ha e bapiswa le ho otlolla ho tlwaelehileng). b Litšoantšo tse emelang dikotwana tsa pelo tse daetsweng ka troponin-T le WGA (ka letsohong le letšehali) le tekanyo ya boholo ba sele (ka letsohong le letona) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) disele/sehlopha ho tswa dikotwaneng tse 10 tse fapaneng ho tswa dikolobeng tse fapaneng, Teko ya t ya Seithuti se nang le mehatla e mmedi e etswa; ****p < 0.0001 ha e bapiswa le ho otlolla ho tlwaelehileng). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного определения размера клеток (с) = 6 = 6 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюноппу ****pыдента ****pыдента ****pымномнта , растяжением). b Litšoantšo tse emelang likarolo tsa pelo tse nang le troponin-T le AZP (ka letsohong le letšehali) le tekanyo ea boholo ba sele (ka letsohong le letona) (n = 330 (D6 MTOS), lisele/sehlopha sa 369 (D6 MTNorm) ho tsoa likarolong tse 10 tse fapaneng ho tsoa likolobeng tse fapaneng, tlhahlobo ea t ea Moithuti ea mehatla e 'meli e entsoe; ****p < 0.0001 ha e bapisoa le khatello e tloaelehileng). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（右）染色的心脏切片的代表性图像（D330) MTOS），來自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正弸0.0001). b Litšoantšo tse emelang tsa dikotwana tsa pelo tse nang le calcarein-T le WGA (ka letsohong le letšehali) le boholo ba sele (ka letsohong le letona) (n = 330 (D6 MTOS), 369 ho tsoa dikotwaneng tse 10 tse fapaneng (D6 MTNorm)) Disele/组，两方法有尾学生t test；ha e bapiswa le ho otlolla ho tloaelehileng，****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (с69 MT63) (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента; b Litšoantšo tse emelang likarolo tsa pelo tse nang le troponin-T le AZP (ka letsohong le letšehali) le tekanyo ea boholo ba sele (ka letsohong le letona) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ho tsoa likarolong tse 10 tse fapaneng ho tsoa likolobeng tse fapaneng) Lisele/sehlopha, tekanyetso ea mehatla e 'meli T ea seithuti; ****p < 0.0001 ha e bapisoa le khatello e tloaelehileng). c Litšoantšo tse emelang dikotwana tsa pelo tsa MTOS tsa letsatsi la 0 le la 6 tse nang le immunolabel bakeng sa troponin-T le NFATC4 le tekanyo ya ho fetisetswa ha NFATC4 ho ya ho di-nuclei tsa CM (n = 4 (D0), dikotwana/sehlopha sa 3 (D6 MTOS) ho tswa dikolobeng tse fapaneng, Teko ya t ya Moithuti ya mehatla e mmedi e etswa; *p < 0.05). c Litšoantšo tse emelang tsa letsatsi la 0 le la 6 la MTOS li-heart slices tse nang le immunolabeled bakeng sa troponin-T le NFATC4 le tekanyo ea ho fetisetsoa ha NFATC4 ho ea ho li-nuclei tsa CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) li-slices/sehlopha ho tsoa likolobeng tse fapaneng, Teko ea t ea seithuti e nang le mehatla e 'meli e etsoa; *p < 0.05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, ммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, и количественная оцнска кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента, *50; c Litšoantšo tse emelang likarolo tsa pelo matsatsing a 0 le a 6 a MTOS, e nang le immunolabel bakeng sa troponin-T le NFATC4, le tekanyo ea phetisetso ea NFATC4 khubung ea lisele tsa cavernous (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) likotoana/sehlopha ho tsoa likolobeng tse fapaneng) li entse teko ea t ea Moithuti ea mehatla e 'meli; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性图像，以及來自萌TC4细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p <0.05). c Moemeli oa litšoantšo tsa calcanin-T le NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS lilae tsa pelo, le NFATC4 ho tsoa ho NFATC4 e fapaneng 易位至CM cell nucleus的quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) /时间双尾学生et 电影；*p <0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и количественная оценспенка от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p <0,05). c Litšoantšo tse emelang likarolo tsa pelo tsa MTOS letsatsing la 0 le la 6 bakeng sa ho ngola immunolabeling ea troponin-T le NFATC4 le ho lekanya ho fetisetsoa ha NFATC4 khubung ea CM ho tsoa likolobeng tse fapaneng (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) likarolo/sehlopha, t-criterion e nang le mehatla e 'meli. Liithuti; *p < 0.05).Mehala ea liphoso e emela karolelano ea ± ho kheloha ho tloaelehileng.
Patlisiso ea phetolelo ea pelo le methapo ea mali e hloka mehlala ea lisele tse hlahisang tikoloho ea pelo ka nepo. Phuputsong ena, sesebelisoa sa CTCM se ile sa hlahisoa 'me sa hlalosoa se ka hlakisang likarolo tse tšesaane haholo tsa pelo. Sistimi ea CTCM e kenyelletsa ho hlohlelletsa ha motlakase ka mokhoa o lumellanang le 'mele le ho ntlafatsa mokelikeli oa T3 le Dex. Ha likarolo tsa pelo ea kolobe li ne li pepesetsoa lintlha tsena, ho phela ha tsona, botšepehi ba sebopeho, ts'ebetso ea metabolism le polelo ea mongolo li ile tsa lula li tšoana le liseleng tse ncha tsa pelo kamora matsatsi a 12 a ho hola. Ho phaella moo, ho otlolla ho feteletseng ha lisele tsa pelo ho ka baka hypertrophy ea pelo e bakoang ke hyperextension. Ka kakaretso, liphetho tsena li tšehetsa karolo ea bohlokoa ea maemo a setso sa 'mele ho boloka phenotype e tloaelehileng ea pelo le ho fana ka sethala sa tlhahlobo ea lithethefatsi.
Mabaka a mangata a tlatsetsa ho theheng tikoloho e ntle bakeng sa ts'ebetso le ho phela ha li-cardiomyocyte. Mabaka a totobetseng ka ho fetisisa ho ana a amana le (1) likamano tsa lisele, (2) khothatso ea motlakase, (3) mabaka a humoral, le (4) li-substrate tsa metabolism. Likamano tsa fisioloji tsa sele ho ea ho sele li hloka marang-rang a rarahaneng a mahlakore a mararo a mefuta e mengata ea lisele tse tšehetsoang ke matrix ea kantle ho sele. Likamano tse rarahaneng joalo tsa sele li thata ho li haha ​​​​bocha ka vitro ka ho sebelisana ha mefuta ea sele ka 'ngoe, empa li ka finyelloa habonolo ka ho sebelisa tlhaho ea organotypic ea likarolo tsa pelo.
Ho otlolla ka mechine le ho hlohlelletsa motlakase ha pelo ho bohlokoa bakeng sa ho boloka phenotype ea pelo33,34,35. Le hoja ho hlohlelletsa ka mechine ho sebelisitsoe haholo bakeng sa ho lokisa le ho holisa ha hiPSC-CM, lithuto tse 'maloa tse ntle li sa tsoa leka ho hlohlelletsa ka mechine ha likarolo tsa pelo ka har'a setso ho sebelisoa ho kenya letsoho ka uniaxial. Lithuto tsena li bontša hore ho kenya letsoho ka uniaxial ka 2D ho na le phello e ntle ho phenotype ea pelo nakong ea setso. Lithutong tsena, likarolo tsa pelo li ne li tlatsitsoe ka matla a ho hula ka isometric17, ho kenya letsoho ka uxutonic ka linear18, kapa potoloho ea pelo e ile ea etsoa bocha ho sebelisoa maikutlo a matla a transducer le li-drive tsa khatello ea maikutlo. Leha ho le joalo, mekhoa ena e sebelisa ho otlolla ha lisele tsa uniaxial ntle le ntlafatso ea tikoloho, e leng se fellang ka ho hatelloa ha liphatsa tse ngata tsa lefutso kapa ho pepeseha ho feteletseng ha liphatsa tsa lefutso tse amanang le likarabelo tse sa tloaelehang tsa ho otlolla. CTCM e hlalositsoeng mona e fana ka stimulus ea 3D ea electromechanical e etsisang potoloho ea tlhaho ea pelo mabapi le nako ea potoloho le ho otlolla ha 'mele (ho otlolla ha 25%, 40% systole, 60% diastole, le li-beats tse 72 ka motsotso). Leha tlhohlelletso ena ea mechine ea mahlakore a mararo feela e sa lekana ho boloka botsitso ba lisele, motsoako oa tlhohlelletso ea humoral le ea mechine o sebelisang T3/Dex oa hlokahala ho boloka matla a lisele, ts'ebetso le botsitso ba tsona ka ho lekaneng.
Mabaka a metlae a bapala karolo ea bohlokoa ho fetoleng phenotype ea pelo ea motho e moholo. Sena se totobalitsoe lithutong tsa HiPS-CM moo T3 le Dex li ileng tsa eketsoa mecheng ea temo ho potlakisa kholo ea lisele. T3 e ka susumetsa ho tsamaisoa ha li-amino acid, tsoekere le calcium ho pholletsa le lera la sele36. Ho phaella moo, T3 e khothalletsa tlhahiso ea MHC-α le ho fokotseha ha MHC-β, e khothalletsang ho thehoa ha myofibrils e potlakileng ea ho sisinyeha ka har'a li-cardiomyocyte tse hōlileng tsebong ha ho bapisoa le myofibrils e liehang ea ho sisinyeha ka har'a CM ea lesea. Khaello ea T3 ho bakuli ba nang le hypothyroidism e fella ka tahlehelo ea lihlopha tsa myofibrillar le sekhahla se fokotsehileng sa nts'etsopele ea molumo37. Dex e sebetsa ho li-receptor tsa glucocorticoid 'me e bontšitsoe e eketsa ho kokotseha ha pelo lipelong tse arohaneng tse senyehileng; 38 ntlafatso ena ho nahanoa hore e amana le phello ea ho kena ha calcium deposit-driven (SOCE) 39,40. Ho feta moo, Dex e tlama ho li-receptor tsa eona, e baka karabelo e pharaletseng ea kahare ho sele e hatellang ts'ebetso ea' mele ea ho itšireletsa mafung le ho ruruha30.
Liphetho tsa rona li bontša hore ho hlohlelletsa 'mele ka mechine (MS) ho ntlafalitse ts'ebetso ea ho holisa ka kakaretso ha ho bapisoa le Ctrl, empa ho hlōlehile ho boloka ho phela, botšepehi ba sebopeho, le polelo ea pelo ka matsatsi a 12 ka har'a setso. Ha ho bapisoa le Ctrl, ho eketsoa ha litso tsa T3 le Dex ho CTCM (MT) ho ntlafalitse ho phela 'me ha boloka liprofaele tse tšoanang tsa mongolo, botšepehi ba sebopeho, le ts'ebetso ea metabolism ka lisele tse ncha tsa pelo ka matsatsi a 12. Ho phaella moo, ka ho laola tekanyo ea ho otlolla ha lisele, mohlala oa hyperextension-induced cardiac hypertrophy o ile oa etsoa ho sebelisoa STCM, o bontšang ho feto-fetoha ha sistimi ea STCM. Ho lokela ho hlokomeloa hore le hoja ho tsosolosoa ha pelo le fibrosis hangata li kenyelletsa litho tse sa senyehang tseo lisele tsa tsona tse potolohang li ka fanang ka li-cytokine tse loketseng hammoho le phagocytosis le lintlha tse ling tsa ho tsosolosa, likarolo tsa pelo li ntse li ka etsisa ts'ebetso ea fibrotic ho arabela khatellong le kotsi. ho ea ho myofibroblasts. Sena se se se hlahlobiloe pele mohlaleng ona oa cardiac slice. Ho lokela ho hlokomeloa hore liparamente tsa CTCM li ka fetoloa ka ho fetola khatello/motlakase le maqhubu ho etsisa maemo a mangata a kang tachycardia, bradycardia, le tšehetso ea potoloho ea mali ea mechine (pelo e sa jarolloang ka mechine). Sena se etsa hore sistimi e be mokhoa o mahareng oa ho etsa liteko tsa meriana. Bokhoni ba CTCM ba ho etsa mohlala oa hypertrophy ea pelo e bakoang ke ho ikitlaetsa ho feteletseng bo bula tsela ea ho leka sistimi ena bakeng sa phekolo ea motho ka mong. Qetellong, phuputso ea hona joale e bontša hore ho otlolla ha mechine le ho hlohlelletsa ha humoral li bohlokoa bakeng sa ho boloka setso sa likarolo tsa lisele tsa pelo.
Leha data e hlahisitsoeng mona e bontša hore CTCM ke sethala se tšepisang haholo bakeng sa ho etsa mohlala oa myocardium e sa senyehang, mokhoa ona oa temo o na le mefokolo e itseng. Moeli o moholo oa temo ea CTCM ke hore o beha likhatello tse tsoelang pele tsa mechine holim'a li-slices, e leng se thibelang bokhoni ba ho lekola ka mafolofolo ho honyela ha li-slices tsa pelo nakong ea potoloho e 'ngoe le e 'ngoe. Ho feta moo, ka lebaka la boholo bo bonyenyane ba likarolo tsa pelo (7 mm), bokhoni ba ho lekola ts'ebetso ea systolic ka ntle ho litsamaiso tsa temo ho sebelisoa li-sensor tsa matla a setso bo lekanyelitsoe. Sengoliloeng sa hajoale, re hlola moeli ona ka karolo e itseng ka ho lekola motlakase oa optical e le sesupo sa ts'ebetso ea ho honyela. Leha ho le joalo, moeli ona o tla hloka mosebetsi o mong hape 'me o ka rarolloa nakong e tlang ka ho hlahisa mekhoa ea ho lekola ts'ebetso ea li-slices tsa pelo ka har'a setso, joalo ka 'mapa oa optical o sebelisang calcium le dae tse utloang motlakase. Moeli o mong oa CTCM ke hore mohlala o sebetsang ha o laole khatello ea 'mele (preload le afterload). Ho CTCM, khatello e ile ea hlahisoa ka mahlakoreng a fapaneng ho hlahisa 25% ea ho otlolla ha 'mele ka har'a diastole (ho otlolla ho felletseng) le systole (bolelele ba ho honyela nakong ea ho hlasimolla motlakase) liseleng tse kholo haholo. Moedi ona o lokela ho tlosoa meralong ea CTCM ea nakong e tlang ka khatello e lekaneng holim'a lisele tsa pelo ho tsoa mahlakoreng ka bobeli le ka ho sebelisa likamano tse nepahetseng tsa khatello le bophahamo ba modumo tse etsahalang likamoreng tsa pelo.
Ho ntjhafatswa ho feteletseng ho tlalehilweng sengolweng sena ho lekanyelitsoe ho etsisang matshwao a hypertrophic hyperstretch. Kahoo, mohlala ona o ka thusa thutong ya matshwao a hypertrophic a bakwang ke ho otlollwa ntle le tlhoko ya dintlha tsa humoral kapa neural (tseo di seng teng tsamaisong ena). Diphuputso tse ding di a hlokahala ho eketsa bongata ba CTCM, mohlala, ho lema mmoho le disele tsa mmele tse lwantshang mafu, dintlha tsa humoral tse potolohang plasma, le ho boloka mmele ha ho lema mmoho le disele tsa neuronal ho tla ntlafatsa menyetla ya ho etsa mohlala wa lefu ka CTCM.
Ho sebelisitsoe likolobe tse leshome le metso e meraro thutong ena. Mekhoa eohle ea liphoofolo e entsoe ho latela litataiso tsa mekhatlo 'me e amohetsoe ke Komiti ea Tlhokomelo le Tšebeliso ea Liphoofolo ea Univesithi ea Louisville. Sekoti sa aorta se ile sa koaloa 'me pelo ea tlatsoa ka 1 L ea sterile cardioplegia (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH ho fihlela ho 7.4); Lipelo li ile tsa bolokoa ka har'a tharollo ea pelo e batang joaloka leqhoa ho fihlela li isoa laboratoring e leqhoa eo hangata e leng ka tlase ho metsotso e 10. Lipelo li ile tsa bolokoa ka har'a tharollo ea pelo e batang joaloka leqhoa ho fihlela li isoa laboratoring e leqhoa eo hangata e leng ka tlase ho metsotso e 10. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. Lipelo li ile tsa bolokoa ka har'a tharollo ea pelo e batang joaloka leqhoa ho fihlela li isoa laboratoring ka leqhoa, e leng se atisang ho nka metsotso e ka tlase ho 10.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟. Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию льду, обычно <10 мин. Boloka lipelo li le leqhoa cardioplegia ho fihlela li isoa laboratoring leqhoa, hangata li le ka tlase ho metsotso e 10.
Sesebediswa sa CTCM se ntshetsitswe pele ka software ya moralo o thuswang ke khomphutha ya SolidWorks (CAD). Dikamore tsa temo, dikarohano le dikamore tsa moya di entswe ka polasetiki ya acrylic e hlakileng ya CNC. Lesale la ho boloka la bophara ba 7mm le entswe ka polyethylene e nang le bongata bo hodimo (HDPE) bohareng mme le na le mokoti wa o-ring ho amohela lesale la o-silicone le sebediswang ho kwala media e ka tlase. Lera le lesesaane la silica le arola kamore ya temo ho tloha poleiting ya karohano. Lera la silicone le kgaotswe ka laser ho tloha ho lakane ya silicone e teteaneng ya 0.02″ mme le na le boima ba 35A. Digasket tsa silicone tse ka tlase le tse hodimo di kgaotswe ka laser ho tloha ho lakane ya silicone e teteaneng ya 1/16″ mme di na le boima ba 50A. Dikurufu tsa tshepe e sa ruseng ya 316L le dinate tsa mapheo di sebedisetswa ho tiisa boloko le ho etsa tiiso e sa keneng moya.
Boto ea potoloho e hatisitsoeng (PCB) e etselitsoe ho kopanngoa le sistimi ea C-PACE-EM. Li-socket tsa sehokelo sa mochini oa swiss ho PCB li hokahantsoe le li-electrode tsa graphite ka lithapo tsa koporo tse koahetsoeng ka silevera le li-screw tsa boronse tsa 0-60 tse kentsoeng ka har'a li-electrode. Boto ea potoloho e hatisitsoeng e behiloe sekoahelong sa printa ea 3D.
Sesebelisoa sa CTCM se laoloa ke actuator ea pneumatic e ka hlophisoang (PPD) e hlahisang khatello e laoloang ea potoloho ea mali e tšoanang le potoloho ea pelo. Ha khatello e ka hare ho kamore ea moea e ntse e eketseha, lera la silicone le tenyetsehang lea atoloha ho ea holimo, le qobella seaplane tlas'a sebaka sa lisele. Sebaka sa lisele se tla otlolloa ke ho ntšoa ha mokelikeli ona, ho etsisa katoloso ea 'mele ea pelo nakong ea diastole. Sehlohlolong sa ho phomola, tlhohlelletso ea motlakase e ile ea sebelisoa ka li-electrode tsa graphite, tse ileng tsa fokotsa khatello ka kamoreng ea moea 'me tsa baka ho honyela ha likarolo tsa lisele. Ka hare ho phaephe ho na le valve ea hemostatic e nang le sensor ea khatello ho lemoha khatello tsamaisong ea moea. Khatello e utloiloeng ke sensor ea khatello e sebelisoa ho pokello ea data e hokahantsoeng le laptop. Sena se lumella ho beha leihlo khafetsa ha khatello ka hare ho kamore ea khase. Ha khatello e phahameng ka ho fetisisa ea kamore e fihletsoe (e tloaelehileng ea 80 mmHg, 140 mmHg OS), sesebelisoa sa ho fumana data se ile sa laeloa ho romela lets'oao tsamaisong ea C-PACE-EM ho hlahisa lets'oao la motlakase oa biphasic bakeng sa 2 ms, le behiloeng ho 4 V.
Likarolo tsa pelo li fumanoe 'me maemo a setso a liliba tse 6 a etsoa ka tsela e latelang: Fetisetsa lipelo tse kotutsoeng ho tloha sejaneng sa phetisetso ho ea tereing e nang le serame sa pelo (4° C.). Ventricle e ka letsohong le letšehali e ile ea aroloa ka lehare le se nang mafura 'me ea khaoloa likotoana tsa 1-2 cm3. Li-block tsena tsa lisele li ile tsa hokeloa ho tšehetso ea lisele ka sekhomaretsi sa lisele 'me tsa beoa ka bateng ea lisele tse thothomelang tse nang le tharollo ea Tyrode' me tsa tšeloa oksijene khafetsa (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g). ), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-glucose (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M tharollo), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M tharollo), ho fihlela ho 1 L ddH2O). Microtome e thothomelang e ne e behiloe ho seha dilae tse teteaneng tsa 300 µm ka maqhubu a 80 Hz, bophahamo ba ho thothomela bo rapameng ba 2 mm, le lebelo le etelletseng pele la 0.03 mm/s. Bate ea lisele e ne e pota-potiloe ke leqhoa ho boloka tharollo e pholile 'me mocheso o ne o bolokoa ho 4°C. Fetisetsa likarolo tsa lisele ho tloha bate ea microtome ho ea bate ea ho incubation e nang le tharollo ea Tyrode e nang le oksijene e tsoelang pele leqhoeng ho fihlela likarolo tse lekaneng li fumanoa bakeng sa poleiti e le 'ngoe ea temo. Bakeng sa limela tsa transwell, likarolo tsa lisele li ne li khomaretsoe ho tšehetso ea polyurethane e se nang manyolo ea 6 mm bophara 'me li beoa ka har'a 6 ml ea medium e ntlafalitsoeng (medium ea 199, 1x ITS supplement, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkaline le 2X antibacterial-antifungal-antifungal). Ho hlasimolla motlakase (10 V, maqhubu a 1.2 Hz) ho ile ha sebelisoa likarolong tsa lisele ka C-Pace. Bakeng sa maemo a TD, T3 e foreshe le Dex di ile tsa eketsoa ho 100 nM le 1 μM phetohong e nngwe le e nngwe ya mahareng. Metsi a tlatswa ka oksijene pele a nkelwa sebaka ka makgetlo a 3 ka letsatsi. Dikarolo tsa dinama di ile tsa hodiswa ka hara incubator mochesong wa 37°C le 5% CO2.
Bakeng sa dikokwana-hloko tsa CTCM, dikarolo tsa dinama di ile tsa bewa hodima printare ya 3D e entsweng ka sejaneng sa Petri se nang le tharollo ya Tyrode e fetotsweng. Sesebediswa sena se etseditswe ho eketsa boholo ba selae sa pelo ka 25% ya sebaka sa lesale la tshehetso. Sena se etswa e le hore dikarolo tsa pelo di se ke tsa otloloha kamora ho fetisetswa ho tloha tharollong ya Tyrode ho ya ho sehare le nakong ya diastole. Ka ho sebedisa sekhomaretsi sa histoacrylic, dikarolo tse botenya ba 300 µm di ile tsa kenngwa hodima lesale la tshehetso la bophara ba 7 mm. Kamora ho hokela dikarolo tsa dinama lesale la tshehetso, kgaola dikarolo tse feteletseng tsa dinama mme o behe dikarolo tsa dinama tse hoketsweng ka hara bate ya tharollo ya Tyrode leqhoeng (4°C) ho fihlela dikarolo tse lekaneng di se di lokisitswe bakeng sa sesebediswa se le seng. Nako yohle ya tshebetso bakeng sa disebediswa tsohle ha ya lokela ho feta dihora tse 2. Kamora hore dikarolo tse 6 tsa dinama di hokelwe masaleng a tsona a tshehetso, sesebediswa sa CTCM se ile sa kopanngwa. Kamore ya temo ya CTCM e tlatsitswe ka 21 ml ya sehare se nang le oksijene pele. Fetisetsa dikarolo tsa dinama ka kamoreng ya temo mme o tlose dipululana tsa moya ka hloko ka pipette. Karolo ea lisele e ntan'o tataisoa ka lesobeng ebe e hatelloa butle sebakeng sa eona. Qetellong, beha sekoahelo sa elektrode sesebelisoa 'me u fetisetse sesebelisoa ho incubator. Ebe u hokela CTCM ho tube ea moea le sistimi ea C-PACE-EM. Sesebelisoa sa ho hema sea buleha 'me valve ea moea e bula CTCM. Sistimi ea C-PACE-EM e hlophisitsoe ho fana ka 4 V ho 1.2 Hz nakong ea ho potoloha ha biphasic ka 2 ms. Sesebelisoa se fetotsoe habeli ka letsatsi 'me li-electrode li fetotsoe hang ka letsatsi ho qoba ho bokellana ha graphite ho li-electrode. Haeba ho hlokahala, likarolo tsa lisele li ka tlosoa lilibeng tsa tsona tsa ho holisa ho ntša lipululana leha e le life tsa moea tse ka 'nang tsa oela tlas'a tsona. Bakeng sa maemo a kalafo ea MT, T3/Dex e ile ea eketsoa e le foreshe ka phetoho e 'ngoe le e 'ngoe ea bohareng ka 100 nM T3 le 1 μM Dex. Lisebelisoa tsa CTCM li ile tsa lengoa ka incubator ho 37°C le 5% CO2.
Ho fumana litsela tse otlolohileng tsa likarolo tsa pelo, ho ile ha etsoa sistimi e khethehileng ea khamera. Khamera ea SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japane) e sebelisitsoe le lense ea macro ea Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA). Pono e entsoe mochesong oa kamore kamora ho nkela sebaka ka sebaka se secha. Khamera e behiloe ka lehlakoreng la 51° 'me video e rekotoa liforeiming tse 30 ka motsotsoana. Taba ea pele, software ea mohloli o bulehileng (MUSCLEMOTION43) e sebelisitsoe le Image-J ho lekanya motsamao oa likarolo tsa pelo. Maske e entsoe ho sebelisoa MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) ho hlalosa libaka tse khahlisang bakeng sa ho otla likarolo tsa pelo ho qoba lerata. Maske e arotsoeng ka letsoho e sebelisoa litšoantšong tsohle ka tatellano ea foreimi ebe e fetisetsoa ho plug-in ea MUSCLEMOTION. Muscle Motion e sebelisa matla a tloaelehileng a li-pixels foreiming ka 'ngoe ho lekanya motsamao oa eona ha e bapisoa le foreimi ea litšupiso. Lintlha li ile tsa tlalehoa, tsa sefshoa 'me tsa sebelisoa ho lekanya nako ea potoloho le ho hlahloba ho otlolla ha lisele nakong ea potoloho ea pelo. Video e rekotiloeng e ile ea sebetsoa ka mor'a moo ho sebelisoa sefe sa dijithale sa mohato oa pele oa lefela. Ho lekanya ho otlolla ha lisele (tlhōrō ho ea ho tlhōrō), tlhahlobo ea tlhōrō ho ea ho tlhōrō e ile ea etsoa ho khetholla lipakeng tsa litlhōrō le li-troughs lets'oong le rekotiloeng. Ho phaella moo, ho fokotsa ho etsoa ho sebelisoa polynomial ea tatellano ea bo6 ho felisa ho kheloha ha lets'oao. Khoutu ea lenaneo e ntlafalitsoe ho MATLAB ho fumana motsamao oa lisele tsa lefats'e, nako ea potoloho, nako ea phomolo, le nako ea ho honyela (Khoutu ea Lenaneo le Tlatsetsang 44).
Bakeng sa tlhahlobo ea khatello, re sebelisa livideo tse tšoanang tse entsoeng bakeng sa tlhahlobo ea ho otlolla ka mechine, re qalile ka ho latela litšoantšo tse peli tse emelang litlhōrō tsa motsamao (lintlha tse phahameng ka ho fetisisa (tse ka holimo) le tse tlase ka ho fetisisa (tse ka tlase) tsa motsamao) ho latela software ea MUSCLEMOTION. Eaba re arola libaka tsa lisele 'me ra sebelisa mokhoa oa algorithm oa ho shading ho lisele tse arotsoeng (Setšoantšo se Tlatsetsang sa 2a). Lisele tse arotsoeng ka likarolo li ile tsa aroloa ka libaka tse leshome tse ka tlase, 'me khatello holim'a bokaholimo ka bong e ile ea baloa ho sebelisoa equation e latelang: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, moo Sup le Sdown e leng libaka tsa sebopeho ho tloha meriting e ka holimo le e ka tlase ea lesela, ka ho latellana (Setšoantšo se Tlatsetsang sa .2b).
Likarolo tsa pelo li ile tsa lokisoa ka har'a 4% ea paraformaldehyde ka lihora tse 48. Li-tissue tse tsitsitseng li ile tsa omisoa ke metsi ka har'a 10% le 20% ea sucrose ka hora e le 'ngoe, eaba li kenngoa ka har'a 30% ea sucrose bosiu bohle. Likarolo li ile tsa kenngoa ka har'a motsoako o motle oa mocheso oa ho seha (OCT compound) 'me butle-butle tsa hoamisoa ka bateng ea leqhoa e omileng ea isopentane. Boloka li-block tsa OCT embedding ho -80 °C ho fihlela li arohane. Li-slide li ile tsa lokisoa e le likarolo tse nang le botenya ba 8 μm.
Ho tlosa OCT likarolong tsa pelo, futhumatsa li-slide holim'a sekontiri se futhumatsang ka 95 °C metsotso e 5. Kenya 1 ml PBS ho slide ka 'ngoe 'me u e futhumale metsotso e 30 mochesong oa kamore, ebe u kenella likarolong ka ho beha 0.1% Triton-X ho PBS metsotso e 15 mochesong oa kamore. Ho thibela li-antibodies tse sa tobang ho tlama sampole, eketsa 1 ml ea tharollo ea 3% ea BSA ho li-slide ebe u e futhumala hora e le 'ngoe mochesong oa kamore. BSA e ile ea tlosoa 'me li-slide tsa hlatsuoa ka PBS. Tšoaea sampole ka 'ngoe ka pentšele. Li-antibodies tsa mantlha (tse hlapolotsoeng ka 1:200 ho 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) le troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) li ile tsa eketsoa ka metsotso e 90, eaba li-antibodies tsa bobeli (tse hlapolotsoeng ka 1:200 ho 1% BSA) khahlanong le toeba Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), khahlanong le mmutla Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) metsotso e meng e 90. Li ile tsa hlatsuoa ka makhetlo a 3 ka PBS. Ho khetholla ho daea ho reretsoeng ho tloha ka morao, re sebelisitse antibody ea bobeli feela e le taolo. Qetellong, ho ile ha eketsoa letheba la nyutlelie la DAPI 'me li-slide tsa beoa ka har'a vectashield (Vector Laboratories) 'me tsa tiisoa ka pentšele ea manala. -x ho holisa) le microscope ea Keyence e nang le ho holisa ka 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) ho 5 μg/ml ho PBS e sebediseditswe ho taka WGA mme ya sebediswa dikarolong tse tsitsitseng metsotso e 30 mochesong wa kamore. Diselaete di ile tsa hlatsuwa ka PBS mme Sudan black ya eketswa ho slide ka nngwe mme ya futhumatswa metsotso e 30. Diselaete di ile tsa hlatsuwa ka PBS mme vectashield embedding medium ya eketswa. Diselaete di ile tsa bontshwa ka microscope ya Keyence ka kgolo ya 40x.
OCT e tlositsoe disampoleng joalo ka ha ho hlalositsoe kaholimo. Kamora ho tlosa OCT, qoelisa li-slide ka har'a tharollo ea Bouin bosiu bohle. Li-slide li ile tsa hlatsuoa ka metsi a hloekisitsoeng ka hora e le 'ngoe ebe li kenngoa ka har'a tharollo ea Bibrich aloe acid fuchsin metsotso e 10. Ebe li-slide li ile tsa hlatsuoa ka metsi a hloekisitsoeng 'me tsa kenngoa ka har'a tharollo ea 5% phosphomolybdenum/5% phosphotungstic acid metsotso e 10. Ntle le ho hlatsoa, ​​​​fetisetsa li-slide ka kotloloho ka har'a tharollo ea aniline blue metsotso e 15. Ebe li-slide li ile tsa hlatsuoa ka metsi a hloekisitsoeng 'me tsa kenngoa ka har'a tharollo ea 1% acetic acid metsotso e 2. Li-slide li ile tsa omisoa ka 200 N ethanol 'me tsa fetisetsoa ho xylene. Li-slide tse nang le matheba li ile tsa bonoa ka mahlo ho sebelisoa microscope ea Keyence e nang le sepheo sa makhetlo a 10. Peresente ea sebaka sa Fibrosis e ile ea lekanngoa ho sebelisoa software ea Keyence Analyzer.
Teko ea ho Phela ha Sele ea CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), nomoro ea kataloge V13154, ho latela mokhoa oa moetsi ka liphetoho tse ling. Haholo-holo, ho ile ha sebelisoa ho phunya ka opereishene e bophara ba 6 mm ho netefatsa boholo bo lekanang ba lisele nakong ea tlhahlobo ea MTT. Lisele li ile tsa penta ka bonngoe ka har'a liliba tsa poleiti ea liliba tse 12 e nang le substrate ea MTT ho latela mokhoa oa moetsi. Likarolo li beoa mochesong oa 37° C. ka lihora tse 3 'me lisele tse phelang li fetola substrate ea MTT ho etsa motsoako o pherese oa formazan. Nkela tharollo ea MTT sebaka ka 1 ml DMSO 'me u beoa mochesong oa 37°C metsotso e 15 ho ntša formazan e pherese likarolong tsa pelo. Lisampole li ile tsa hlapolloa ka 1:10 ho DMSO ka lipoleiti tse tlase tse hlakileng tsa liliba tse 96 le matla a 'mala o pherese a lekantsoeng ho 570 nm ho sebelisoa Cytation plate reader (BioTek). Litekanyo li ile tsa fetoloa hore li be boima ba sekhechana se seng le se seng sa pelo.
Sekotwana sa pelo se ile sa nkeloa sebaka ke sekotwana se nang le 1 μCi/ml [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) bakeng sa teko ea tšebeliso ea tsoekere joalo ka ha ho hlalositsoe pele. Kamora lihora tse 4 tsa ho ikatisa, eketsa 100 µl ea seaplane ho tube e bulehileng ea microcentrifuge e nang le 100 µl ea 0.2 N HCl. Eaba tube e kenngoa ka tube ea scintillation e nang le 500 μl ea dH2O ho mouoane [3H]2O ka lihora tse 72 mochesong oa 37°C. Ebe u tlosa tube ea microcentrifuge ho tube ea scintillation 'me u kenye 10 ml ea mokelikeli oa scintillation. Lipalo tsa scintillation li entsoe ho sebelisoa Tri-Carb 2900TR liquid scintillation analyzer (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). Tšebeliso ea tsoekere e ile ea baloa ho nahanoa ka ts'ebetso e ikhethileng ea tsoekere [5-3H], tekano e sa fellang le semelo, ho hlapolloa ha [5-3H] ho ea ho tsoekere e sa ngoloang, le ts'ebetso e khahlanong le ho phatloha ha scintillation. Lintlha li lekanngoa ho ea boima ba likarolo tsa pelo.
Kamora ho kopana ha dinama ho Trizol, RNA e ile ya arolwa dikarolong tsa pelo ho sebediswa Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 ho ya ka protocol ya moetsi. Tokisetso ya laeborari ya RNAsec, tatellano le tlhahlobo ya data di entswe ka tsela e latelang:
1 μg ea RNA ka sampole e sebelisitsoe e le thepa ea ho qala bakeng sa ho lokisa laeborari ea RNA. Lilaeborari tsa tatellano li hlahisitsoe ho sebelisoa NEBHext UltraTM RNA Library Preparation Kit bakeng sa Illumina (NEB, USA) ho latela likhothaletso tsa moetsi, 'me likhoutu tsa index li ile tsa eketsoa ho tatellano ea litšobotsi bakeng sa sampole ka 'ngoe. Ka bokhutšoanyane, mRNA e ile ea hloekisoa ho tsoa ho RNA eohle ho sebelisoa li-magnetic beads tse hoketsoeng ka poly-T oligonucleotides. Ho aroha ho etsoa ho sebelisoa divalent cations mochesong o phahameng ho NEBHext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). CDNA ea khoele ea pele e entsoe ho sebelisoa li-primer tsa random hexamer le M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-). CDNA ea khoele ea bobeli e etsoa ho sebelisoa DNA polymerase I le RNase H. Li-overhang tse setseng li fetoloa lipheletsong tse bosootho ke ts'ebetso ea exonuclease/polymerase. Kamora ho adenylation ea pheletso ea 3′ ea karolo ea DNA, ADAPTER ea NEBHext e nang le sebopeho sa loop ea hairpin e hokelloa ho eona ho e lokisetsa ho kopanngoa. Bakeng sa ho kgetha dikotwana tsa cDNA tse bolelele bo kgethilweng, dikotwana tsa laeborari tse 150-200 bp. di ile tsa hlwekiswa ho sebediswa sistimi ya AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA). Yaba, 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) e nang le cDNA e kgethilweng ka boholo e nang le adaptara e ile ya sebediswa metsotso e 15 mochesong wa 37°C mme ya sebediswa metsotso e 5 mochesong wa 95°C pele ho PCR. PCR e ile ya etswa ho sebediswa Phusion High-Fidelity DNA polymerase, di-primer tsa PCR tsa universal, le di-primer tsa Index (X). Qetellong, dihlahiswa tsa PCR di ile tsa hlwekiswa (system ya AMPure XP) mme boleng ba laeborari ba lekolwa tsamaisong ya Agilent Bioanalyzer 2100. Laeborari ya cDNA e ile ya hlophiswa ka tatellano ho sebediswa sequencer sa Novaseq. Difaele tsa ditshwantsho tse tala tse tswang ho Illumina di ile tsa fetolwa ho di-read tse tala ho sebediswa CASAVA Base Calling. Data e tala e bolokwa difaeleng tsa sebopeho sa FASTQ(fq) tse nang le di-read tatelano le boleng ba motheo bo tsamaellanang. Kgetha HISAT2 ho bapisa di-read tsa tatellano tse sefilweng le genome ya referense ya Sscrofa11.1. Ka kakaretso, HISAT2 e tshehetsa di-genome tsa boholo bofe kapa bofe, ho kenyeletswa le di-genome tse fetang dibase tse dibilione tse 4, mme boleng ba kamehla bo setilwe bakeng sa diparamitha tse ngata. Ho kopanya di-read ho tswa ho data ya RNA Seq ho ka tsamaiswa ka katleho ho sebediswa HISAT2, sistimi e potlakileng ka ho fetisisa e fumanehang hajwale, ka ho nepahala ho tshwanang kapa ho betere ho feta mokhoa ofe kapa ofe o mong.
Bongata ba dingolwa bo bontsha ka ho toba boemo ba tlhahiso ya dijini. Maemo a tlhahiso ya dijini a lekolwa ka bongata ba dingolwa (palo ya tatellano) e amanang le genome kapa di-exons. Palo ya dipalo e lekana le maemo a tlhahiso ya dijini, bolelele ba dijini, le botebo ba tatellano. FPKM (dikarolo ka dipara tse sekete tsa motheo tsa dingolwa tse latellanang ka dipara tse milione tsa motheo) di ile tsa balwa mme boleng ba P ba tlhahiso e fapaneng bo ile ba lekolwa ho sebediswa sephutheloana sa DESeq2. Yaba re bala sekgahla sa ho sibolla bohata (FDR) bakeng sa boleng bo bong le bo bong ba P re sebedisa mokgwa wa Benjamini-Hochberg9 ho latela mosebetsi wa R o kentsweng kahare "p.adjust".
RNA e arotsweng dikarolong tsa pelo e ile ya fetolelwa ho cDNA ka tekanyo ya 200 ng/μl ho sebediswa motswako wa SuperScript IV Vilo Master ho tswa ho Thermo (Thermo, cat. no. 11756050). RT-PCR ya Bongata e entswe ho sebediswa poleiti ya karabelo e bonaletsang ya Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well (Thermo, cat. no. 4483319) le sekgomaretsi sa optical sa microamp (Thermo, cat. no. 4311971). Motswako wa karabelo o ne o entswe ka motswako wa 5 µl Taqman Fast Advanced Master (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer le 3.5 µl H2O e tswakilweng ka seliba. Dipotoloho tse tloaelehileng tsa qPCR di ile tsa tsamaiswa mme boleng ba CT bo ile ba lekanngwa ho sebediswa sesebediswa sa Applied Biosystems Quantstudio 5 real-time PCR (mojule wa 384-well; sehlahiswa # A28135). Li-primer tsa Taqman li rekiloe ho Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) Boleng ba CT ba disampole tsohle bo ile ba lekanngoa ho ea ka gene ea housekeeping GAPDH.
Phatlalatso ea mecha ea phatlalatso ea NT-ProBNP e hlahlobiloe ho sebelisoa kit ea NT-ProBNP (kolobe) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) ho latela mokhoa oa moetsi. Ka bokhutšoanyane, 250 µl ea sampole ka 'ngoe le maemo a tloaelehileng li ile tsa eketsoa habeli selibeng ka seng. Hang ka mor'a ho eketsa sampole, eketsa 50 µl ea Assay Reagent A selibeng ka seng. Hlohlelletsa poleiti ka bonolo 'me u e koale ka sealant. Ebe matlapa a kenngoa ka mocheso oa 37°C ka hora e le 'ngoe. Ebe u hema tharollo 'me u hlatsoe liliba ka makhetlo a 4 ka 350 µl ea tharollo ea ho hlatsoa ea 1X, u kenya tharollo ea ho hlatsoa metsotso e 1-2 nako le nako. Ebe u eketsa 100 µl ea Assay Reagent B ka seliba 'me u e koale ka sealant ea poleiti. Letlapa le ile la sisinngoa butle 'me la kenngoa ka mocheso oa 37°C metsotso e 30. Hlatsoa tharollo 'me u hlatsoe liliba ka makhetlo a 5 ka 350 µl ea tharollo ea ho hlatsoa ea 1X. Kenya 90 µl ea tharollo ea substrate selibeng ka seng 'me u koale poleiti. Beha poleiti mochesong oa 37°C metsotso e 10-20. Kenya 50 µl Stop Solution selibeng ka seng. Poleiti e ile ea lekanngoa hang-hang ho sebelisoa sebali sa poleiti sa Cytation (BioTek) ho 450 nm.
Ho ile ha etsoa tlhahlobo ea matla ho khetha boholo ba sehlopha bo tla fana ka matla a >80% ho lemoha phetoho e felletseng ea 10% paramethareng ka sekhahla sa phoso ea Mofuta oa I sa 5%. Ho ile ha etsoa tlhahlobo ea matla ho khetha boholo ba sehlopha bo tla fana ka matla a >80% ho lemoha phetoho e felletseng ea 10% paramethareng ka sekhahla sa phoso ea Mofuta oa I sa 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% беспечат частотой ошибок типа I. Tlhahlobo ea matla e entsoe ho khetha boholo ba lihlopha tse tla fana ka matla a >80% ho lemoha phetoho e felletseng ea liparamente tse 10% ka sekhahla sa phoso ea Mofuta oa I sa 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаружения 10% абеспечил бы 5% частоты ошибок типа I. Tlhahlobo ea matla e entsoe ho khetha boholo ba sehlopha bo tla fana ka matla a >80% ho lemoha phetoho e felletseng ea liparamente tse 10% le sekhahla sa phoso ea mofuta oa I sa 5%.Likarolo tsa dinama di kgethilwe ka mokhoa o sa reroang pele ho teko. Ditshekatsheko tsohle di ne di sa bone boemo mme disampole di ne di hlahlojwa feela ka mora hore data yohle e hlahlojwe. Software ya GraphPad Prism (San Diego, CA) e sebediseditswe ho etsa ditshekatsheko tsohle tsa dipalopalo. Bakeng sa lipalo-palo tsohle, boleng ba p bo ne bo nkoa bo le bohlokoa ho boleng ba <0.05. Bakeng sa lipalo-palo tsohle, boleng ba p bo ne bo nkoa bo le bohlokoa ho boleng ba <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Bakeng sa lipalo-palo tsohle, boleng ba p bo ne bo nkoa bo le bohlokoa ho boleng ba <0.05.對于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认為是显着的。對于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认為是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Bakeng sa lipalo-palo tsohle, boleng ba p bo ne bo nkoa bo le bohlokoa ho boleng ba <0.05.Teko ea t ea Seithuti se nang le mehatla e 'meli e entsoe holim'a data ka lipapiso tse 2 feela. ANOVA ea tsela e le 'ngoe kapa ea tsela e le 'ngoe e sebelisitsoe ho fumana bohlokoa pakeng tsa lihlopha tse ngata. Ha ho etsoa liteko tsa posthoc, tokiso ea Tukey e sebelisitsoe ho ikarabella bakeng sa lipapiso tse ngata. Lintlha tsa RNAsec li na le lintlha tse khethehileng tsa lipalo-palo ha ho baloa FDR le p.adjust joalo ka ha ho hlalositsoe karolong ea Mekhoa.
Bakeng sa tlhahisoleseding e batsi mabapi le moralo oa thuto, bona kakaretso ea Tlaleho ea Lipatlisiso tsa Tlhaho e hokahaneng le sengoloa sena.