Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik.Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSS laguntza mugatua du.Esperientzia onena lortzeko, eguneratutako arakatzailea erabiltzea gomendatzen dugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea).Bitartean, laguntza etengabea bermatzeko, gunea estilorik eta JavaScript gabe errendatuko dugu.
Droga probak egiteko bihotzeko ingurune fisiologikoa zehaztasunez erreproduzitzeko in vitro sistema fidagarri baten beharra dago.Giza bihotzeko ehunen hazkuntza sistemen erabilgarritasun mugatuak bihotzeko sendagaien efektuen interpretazio okerra ekarri du.Hemen, bihotz-ehunen hazkuntza-eredu bat (CTCM) garatu dugu, elektromekanikoki bihotz-xerrak estimulatzen dituena eta bihotz-zikloaren fase sistoliko eta diastolikoetan tarte fisiologikoa jasaten duena.12 eguneko kulturaren ondoren, hurbilketa honek bihotz-atalen bideragarritasuna partzialki hobetu zuen, baina ez zuen guztiz kontserbatu haien egitura-osotasuna.Hori dela eta, molekula txikien baheketa egin ondoren, gure medioari 100 nM triiodotironina (T3) eta 1 μM dexametasona (Dex) gehitzeak atalen mikroegitura mantentzen duela ikusi dugu 12 egunez.T3/Dex tratamenduarekin batera, CTCM sistemak transkripzio-profilak, bideragarritasuna, jarduera metabolikoa eta egitura-osotasuna mantendu zituen bihotzeko ehun freskoaren maila berean 12 egunez.Gainera, kultura-ehunaren gehiegizko luzatzeak bihotz-seinale hipertrofikoa eragiten du, eta CTCM-k bihotz-eremuak eragindako baldintza hipertrofikoak imitatzeko duen gaitasunaren froga ematen du.Ondorioz, CTCMk bihotzaren fisiologia eta fisiopatologia eredu ditzake kulturan denbora luzez, sendagaien baheketa fidagarria ahalbidetuz.
Ikerketa klinikoaren aurretik, giza bihotzaren ingurune fisiologikoa zehaztasunez erreproduzitzeko in vitro sistema fidagarriak behar dira.Sistema horiek aldatutako tarte mekanikoa, bihotz-maiztasuna eta propietate elektrofisiologikoak imitatu behar dituzte.Animalia-ereduak normalean bihotz-fisiologiarako baheketa-plataforma gisa erabiltzen dira fidagarritasun mugatua duten sendagaien efektuak giza bihotzean islatzeko1,2.Azken batean, Bihotz Ehun Kulturaren Eredu Esperimental Ideala (CTCM) oso sentikorra eta espezifikoa den eredua da hainbat esku-hartze terapeutiko eta farmakologikotarako, giza bihotzaren fisiologia eta fisiopatologia zehaztasunez erreproduzitzen dituena3.Sistema hori ez egoteak bihotz-gutxiegitasunaren aurkako tratamendu berriak aurkitzea mugatzen du4,5 eta sendagaien kardiotoxikotasuna ekarri du merkatutik irteteko arrazoi nagusi gisa6.
Azken hamarkadan, kardiobaskularrak ez diren zortzi sendagai erabilera klinikotik kendu dira QT tartearen luzapena eragiten dutelako, arritmia bentrikularrak eta bat-bateko heriotza eraginez7.Beraz, gero eta premia handiagoa dago baheketa preklinikoko estrategia fidagarrien eraginkortasun kardiobaskularra eta toxikotasuna ebaluatzeko.Gizakiek eragindako zelula am pluripotenteak eratorritako kardiomiozitoen (hiPS-CM) azken erabilerak sendagaien baheketa eta toxikotasun probetan arazo honi irtenbide partziala ematen dio.Hala ere, hiPS-CMen izaera heldugabea eta bihotz-ehunaren konplexutasun zelulanitzeko eza metodo honen muga nagusiak dira.Azken ikerketek erakutsi dute muga hori hein batean gaindi daitekeela hiPS-CM goiztiarra erabiliz bihotz-ehunen hidrogelak osatzeko uzkurdura espontaneoak hasi eta gutxira eta pixkanaka estimulazio elektrikoa handituz denboran zehar.Hala ere, hiPS-CM mikroehun hauek helduen miokardioaren propietate elektrofisiologiko eta uzkurgarri helduak ez dituzte.Gainera, giza bihotz-ehunak egitura konplexuagoa du, zelula-mota ezberdinen nahasketa heterogeneo batez osatua, zelula endotelialak, neuronak eta fibroblasto estromalak barne, zelula kanpoko matrize proteina multzo espezifikoek elkarri lotuta.Ugaztun helduen bihotzean ez diren kardiomiozitoen populazioen heterogeneotasun hori11,12,13 oztopo nagusia da zelula mota indibidualak erabiliz bihotz-ehuna modelatzeko.Muga handi hauek baldintza fisiologiko eta patologikoetan miokardio-ehuna osorik hazteko metodoak garatzearen garrantzia azpimarratzen dute.
Giza bihotzaren atal mehe (300 µm) haziak frogatu dute giza miokardio osorik eredu itxaropentsu bat direla.Metodo honek giza bihotz-ehunaren antzeko 3D sistema zelulaniztun osorako sarbidea eskaintzen du.Hala ere, 2019ra arte, kulturako bihotz-atalen erabilera mugatu egin zen kulturaren biziraupen laburra (24 ordu).Hainbat faktoreren ondorioz gertatzen da tarte fisiko-mekanikorik eza, aire-likidoaren interfazea eta bihotz-ehunen beharrak onartzen ez dituzten euskarri sinpleak erabiltzea.2019an, hainbat ikerketa-taldek frogatu zuten bihotzeko ehunen laborantza sistemetan faktore mekanikoak txertatzeak kultura-bizitza luzatu, bihotz-adierazpena hobetu eta bihotz-patologia imitatu dezakeela.Bi ikerketa dotorek 17 eta 18 erakusten dute karga mekaniko uniaxialak eragin positiboa duela bihotz-fenotipoan kulturan zehar.Hala ere, ikerketa hauek ez zuten bihotzeko zikloaren hiru dimentsioko karga fisiko-mekaniko dinamikorik erabili, bihotz-atalak trakzio-indar isometrikoekin 17 edo karga auxotoniko linealarekin kargatzen baitziren 18 .Ehunak luzatzeko metodo hauek bihotz-gene asko ezabatzea edo luzatze-erantzun anormalekin lotutako geneen gehiegizko adierazpena eragin zuten.Aipagarria da Pitoulis et al.19-k bihotz-xerra-kultura-bainu dinamiko bat garatu zuen bihotz-zikloa berreraikitzeko indar-transduktorearen feedbacka eta tentsio-unitateak erabiliz.Sistema honek in vitro ziklo kardiakoaren modelizazioa zehatzagoa ahalbidetzen badu ere, metodoaren konplexutasunak eta errendimendu txikiak sistema honen aplikazioa mugatzen du.Gure laborategiak kultura-sistema sinplifikatu bat garatu berri du estimulazio elektrikoa eta medio optimizatu bat erabiliz, txerri eta giza bihotz-ehunen atalen bideragarritasuna 6 egun arte mantentzeko20,21.
Egungo eskuizkribuan, bihotz-ehunen kultura-eredua (CTCM) deskribatzen dugu txerri-bihotzaren atalak erabiliz, bihotz-zikloan zehar hiru dimentsioko bihotz-fisiologia eta distentsio fisiopatologikoa birkapitulatzeko seinale humoralak biltzen dituena.CTCM honek sendagai preklinikoen iragarpenaren zehaztasuna areagotu dezake inoiz lortu ez den mailara, ugaztunen bihotzaren fisiologia/patofisiologia imitatzen duen errendimendu ertaineko bihotz-sistema errentagarria eskainiz, droga-proba klinikoetarako.
Seinale mekaniko hemodinamikoek paper garrantzitsua dute in vitro kardiomiozitoen funtzioa mantentzeko 22,23,24.Egungo eskuizkribuan, CTCM (1a irudia) garatu dugu helduen bihotz-ingurunea imitatu dezakeena, estimulazio elektrikoa eta mekanikoa maiztasun fisiologikoetan (1,2 Hz, 72 taupada minutuko) eraginez.Diastolean zehar ehunen gehiegizko luzapena saihesteko, 3D inprimatzeko gailu bat erabili zen ehunen tamaina % 25 handitzeko (1b. irudia).C-PACE sistemak eragindako taupada elektrikoa sistolearen aurretik 100 ms abiarazteko tenporizatu zuten datuak eskuratzeko sistema baten bidez bihotz-zikloa guztiz erreproduzitzeko.Ehun-hazkuntza sistemak eragingailu pneumatiko programagarri bat erabiltzen du (LB Engineering, Alemania) silikonazko mintz malgu bat ziklikoki zabaltzeko goiko ganberan bihotz-xerren hedapena eragiteko.Sistema kanpoko aire-lerro batera konektatu zen presio-transduktore baten bidez, eta horri esker, presioa (± 1 mmHg) eta denbora (± 1 ms) zehaztasunez doitzea posible zen (1c. irudia).
a Lotu ehun-atala 7 mm-ko euskarri-eraztunari, urdinez ageri den, gailuaren kultura-ganberaren barruan.Kultura-ganbera aire-ganberatik bereizten da silikonazko mintz mehe eta malgu baten bidez.Jarri juntura bat ganbera bakoitzaren artean ihesak saihesteko.Gailuaren estalkiak estimulazio elektrikoa ematen duten grafitozko elektrodoak ditu.b Ehun-gailu handiaren, gida-eraztunaren eta euskarri-eraztunaren irudikapen eskematikoa.Ehun-atalak (marroiak) tamaina handiko gailuan jartzen dira gida-eraztunarekin gailuaren kanpoko ertzean dagoen zirrikituan jarrita.Gida erabiliz, jarri arretaz ehuneko itsasgarri akrilikoz estalitako euskarri-eraztuna bihotz-ehunaren atalaren gainean.c Eragingailu pneumatiko programagarri batek (PPD) kontrolatutako aire-ganberaren presioaren arabera estimulazio elektrikoaren denbora erakusten duen grafikoa.Datuak eskuratzeko gailu bat erabili zen presio sentsoreen bidez estimulazio elektrikoa sinkronizatzeko.Kultura-ganberaren presioa ezarritako atalasea iristen denean, pultsu-seinale bat bidaltzen da C-PACE-EM-ra estimulazio elektrikoa abiarazteko.d Inkubagailuko apal batean jarritako lau CTCMren irudia.Lau gailu PPD batera konektatzen dira zirkuitu pneumatiko baten bidez, eta presio sentsoreak balbula hemostatikoan sartzen dira zirkuitu pneumatikoko presioa kontrolatzeko.Gailu bakoitzak sei ehun atal ditu.
Eragingailu pneumatiko bakarra erabiliz, 4 CTCM gailu kontrolatu ahal izan genituen, eta horietako bakoitzak 6 ehun-atal eduki ditzake (1d. irudia).CTCM-n, aire-ganberako aire-presioa presio sinkrono bihurtzen da fluido-ganberan eta bihotz-xerraren hedapen fisiologikoa eragiten du (2a irudia eta 1. film osagarria).80 mm Hg-ko ehunen luzaketaren ebaluazioa.art.ehunen atalen luzapena %25ean agertu zen (2b. irudia).Ehuneko tarte hori 2,2-2,3 µm-ko sarkomero fisiologikoaren luzerari dagokiola frogatu da bihotz-atalaren uzkurgarritasun arrunterako17,19,25.Ehunen mugimendua kameraren ezarpen pertsonalizatuak erabiliz ebaluatu zen (1. irudi osagarria).Ehun-mugimenduaren anplitudea eta abiadura (2c, d irudiak) bihotz-zikloan eta sistolean eta diastolean zehar luzatutako denborari zegokion (2b. irudia).Bihotz-ehunaren luzapena eta abiadura uzkurduran eta erlaxazioan konstante mantendu ziren 12 egunez kulturan (2f. irudia).Kulturan zehar estimulazio elektrikoak uzkurgarritasunean duen eragina ebaluatzeko, deformazio aktiboa zehazteko metodo bat garatu dugu itzal-algoritmo bat erabiliz (2a, b irudi osagarria) eta estimulazio elektrikoarekin eta ez duten deformazioak bereizteko gai izan ginen.Bihotzaren atal bera (2f. irudia).Ebaki-eskualde mugikorra (R6-9), estimulazio elektrikoan tentsioa estimulazio elektrikorik ezean baino %20 handiagoa izan zen, eta horrek estimulazio elektrikoaren ekarpena funtzio uzkurgarrirako adierazten du.
Aire-ganberaren presioaren, fluido-ganberaren presioaren eta ehun-mugimenduaren neurketen aztarna adierazgarriek baieztatzen dute ganberako presioak fluido-ganberaren presioa aldatzen duela, eta ehun zatiaren dagokion mugimendua eragiten du.b Ehuneko luzamenduaren (urdina) ehuneko atalen aztarna adierazgarriak (laranja) ehuneko tarteari dagozkionak.c Bihotz zatiaren neurtutako higidura bat dator neurtutako mugimenduaren abiadurarekin.(d) Bihotzaren zati batean mugimendu ziklikoaren (lerro urdina) eta abiaduraren (lerro puntu laranja) ibilbide adierazgarriak.e Ziklo-denboraren kuantifikazioa (n = 19 xerra talde bakoitzeko, txerri ezberdinetatik), uzkurdura-denbora (n = 19 xerra talde bakoitzeko), erlaxazio-denbora (n = 19 xerra talde bakoitzeko, txerri ezberdinetatik), ehunen mugimendua (n = 25 ).xerra)/talde desberdinetako txerri), abiadura sistolikoaren gailurra (n = 24(D0), 25(D12) xerra/talde desberdinetako txerrietatik) eta erlaxazio-tasa gailurra (n=24(D0), 25(D12) xerra/talde desberdinetako txerrietatik).Student bi buztanen t-testak ez zuen desberdintasun handirik erakutsi inongo parametrotan.f Estimulazio elektrikoa (gorria) eta (urdina) gabea duten ehun-atalen tentsio-analisiaren arrasto adierazgarriak, atal bereko ehun-atalen hamar eskualde-eremu.Beheko panelek ehuneko tentsio-diferentziaren kuantifikazioa erakusten dute estimulazio elektrikoarekin eta estimulazio elektrikorik gabe ehun ataletan atal ezberdinetako hamar eremutan. (n = txerri ezberdinetako 8 xerra/talde, Bi isatseko Student t-testa egiten da; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = txerri ezberdinetako 8 xerra/talde, Bi isatseko Student t-testa egiten da; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; *****p<0,1, **p<0,00,<p<0,1**p). (n = txerri ezberdinetako 8 atal/talde, bi isatseko Student-en t-testa; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,01，*p < 0,0001， （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,01，*p < 0,0001， (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,01, *p). (n = 8 atal/talde, txerri ezberdinetakoak, bi isatseko Student-en t-testa; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Errore-barrak batez bestekoa ± desbideratze estandarra adierazten dute.
Gure aurreko bihotz-xerren biomimetiko estatikoan [20, 21] bihotz-xerren bideragarritasuna, funtzioa eta egitura-osotasuna mantendu genuen 6 egunez estimulazio elektrikoa aplikatuz eta konposizio ertaina optimizatuz.Hala ere, 10 egun igaro ondoren, kopuru horiek nabarmen jaitsi ziren.Gure aurreko kultura biomimetiko estatikoko sistema 20, 21 kontrol-baldintzetan (Ctrl) landutako atalak aipatuko ditugu eta aurrez optimizatutako medioa erabiliko dugu MC baldintza gisa eta aldi berean estimulazio mekaniko eta elektrikoarekin (CTCM).izenekoa.Lehenik eta behin, estimulazio elektrikorik gabeko estimulazio mekanikoa nahikoa ez zela zehaztu genuen ehunen bideragarritasuna mantentzeko 6 egunez (3a, b irudi osagarria).Interesgarria da, STCM erabiliz estimulazio fisio-mekaniko eta elektrikoaren sarrerarekin, 12 eguneko bihotz-atalen bideragarritasuna MS baldintzetan bihotz-atal freskoetan bezala mantendu zen, baina ez Ctrl baldintzetan, MTT analisiak erakusten duen moduan (1. irudia).3a).Horrek iradokitzen du bihotz-zikloaren estimulazio mekanikoak eta simulazioak ehun-atalak bideragarriak izan ditzaketela gure aurreko kultura-sistema estatikoan jakinarazitakoaren bi aldiz gehiagoz.Hala ere, troponina T kardiakoaren eta 43. konexinaren immunomarkaketaren bidez ehun-atalen egitura-osotasunaren ebaluazioak erakutsi zuen 43-ren adierazpena nabarmen handiagoa zela MC ehunetan 12 egunean egun bereko kontroletan baino.Hala ere, connexin 43 adierazpen uniformea ​​eta Z-diskoaren eraketa ez ziren guztiz mantendu (3b. irudia).Adimen artifizialaren (AI) esparru bat erabiltzen dugu ehunen egitura-osotasuna kuantifikatzeko26, troponina-T eta konexina tindaketa-n oinarritutako irudietan oinarritutako ikaskuntza sakoneko kanalizazioa43, bihotz-xerren egitura-osotasuna eta fluoreszentzia automatikoki kuantifikatzeko lokalizazioaren indarrari dagokionez.Metodo honek Sare Neuronal Konvoluzional bat (CNN) eta ikasketa-esparru sakon bat erabiltzen ditu bihotz-ehunaren egitura-osotasuna modu automatizatuan eta alboragabean modu fidagarri batean kuantifikatzeko, erreferentzian deskribatzen den moduan.26. MC ehunak 0 egunarekiko egitura-antzekotasuna hobetu zuen kontrol estatikoko atalekin alderatuta.Horrez gain, Masson-en trikromiaren tindaketak fibrosi-portzentaje nabarmen txikiagoa erakutsi zuen MS baldintzetan kontrol-baldintzekin alderatuta, kulturaren 12. egunean (3c. irudia).CTCMk 12. egunean bihotz-ehunen atalen bideragarritasuna areagotu zuen bihotz-ehun freskoaren antzeko mailara arte, ez zuen nabarmen hobetu bihotz-atalen egitura-osotasuna.
Barra-grafiko batek bihotz-xerra freskoen (D0) edo bihotz-xerren kulturaren MTT bideragarritasunaren kuantifikazioa erakusten du 12 egunez kultura estatikoan (D12 Ctrl) edo CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC/MC) modu desberdinetan egiten da. 0,0001 D0-rekin alderatuta eta **p < 0,01 D12 Ctrl-rekin alderatuta). Barra-grafiko batek bihotz-xerra freskoen (D0) edo bihotz-xerren kulturaren MTT bideragarritasunaren kuantifikazioa erakusten du 12 egunez kultura estatikoan (D12 Ctrl) edo CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 Ctrl / MC NOVA modu ezberdinean) < 0,0001 D0rekin alderatuta eta **p < 0,01 D12 Ctrlrekin alderatuta).histogramak MTT bihotz-atal freskoen (D0) edo bihotz-atalen kulturaren bideragarritasunaren kuantifikazioa erakusten du 12 egunez kultura estatikoan (D12 kontrola) edo CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrola). ) ), 12 (D12 MC) atal/taldea, AgNOVA modu bakarreko proba batetik egiten da;####p < 0,0001 по сравнению с D0 eta **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 D0-rekin alderatuta eta **p < 0,01 D12 Ctrl-rekin alderatuta). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏刿燉爇刿爇爿爇爇爇爇切牄养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA， 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA， 测#0. 001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏刌新鲜心脏刌媇琇心脏刌搇片才的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl ，**比。Histograma MTT bideragarritasunaren kuantifikazioa erakusten duen bihotz-atal freskoetan (D0) edo 12 egunez hazitako bihotz-ataletan kultura estatikoan (D12 kontrola) edo CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrol)), 12 (D12 MC) atal/talde, norabide bakarreko txerri ANOVA proba;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 D0-rekin alderatuta, **p < 0,01 D12 Ctrl-arekin alderatuta).b Troponina-T (berdea), connexin 43 (gorria) eta DAPI (urdina) bihotz-atal isolatu berrietan (D0) edo baldintza estatikoetan (Ctrl) edo CTCM baldintzetan (MC) 12 egunez hazitako bihotz-ataletan immunofluoreszentzia irudi adierazgarrien (eskala hutsa = 100 µm). Bihotz-ehunaren egituraren osotasunaren adimen artifizialaren kuantifikazioa (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) xerra/talde bakoitza txerri desberdinetatik, norabide bakarreko ANOVA proba egiten da; ####p < 0,0001 D0-rekin alderatuta eta ****p < 0,001 C-rekin alderatuta). Bihotz-ehunaren egitura-osotasunaren kuantifikazioa adimen artifiziala (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) xerra/talde bakoitza txerri ezberdinetatik, norabide bakarreko ANOVA proba egiten da; ####p < 0,0001 D0-rekin alderatuta eta ****p < 0,001 C-rekin alderatuta). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = D1), (n = 1) 77 (D1), (n = 177) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравненится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравненится однофакторный тест ANOVA; ию с D12 Ctrl). Bihotz-ehunaren egitura-osotasunaren kuantifikazioa adimen artifizialaren bidez (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) txerri ezberdinen atal/taldeak, norabide bakarreko ANOVA proba egina; ####p < 0,0001 vs. D0 eta ****p < 0,0001 C-rekin alderatuta).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) xerra/talde bakoitza txerri ezberdinetako bakoitza, norabide bakarreko ANOVA proba <1 䛔 䛔#0#0p 0 比 盔. ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) xerra/talde bakoitza txerri ezberdinetako bakoitza, norabide bakarreko ANOVA proba 曔##0 曔 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0; ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной тканой (D12), =77нl (D12), (D12) MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сран0вне1 <сран0вне1 с D12 Ctrl). Bihotz-ehunaren egitura-osotasuna kuantifikatzeko adimen artifiziala (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) atal/talde bakoitza txerri ezberdinetako bakoitza, norabide bakarreko ANOVA proba; ####p<0,0001 vs .D0 ****p < 0,0001 C-rekin alderatuta). c Irudi adierazgarriak (ezkerrean) eta kuantifikazioa (eskuinean) Masson-en trikromo orbanarekin tindatutako bihotz-xerren (Eskala biluzi = 500 µm) (n = 10 xerra/talde bakoitza txerri ezberdinetatik, norabide bakarreko ANOVA proba egiten da; ####p < 0,0001 < 0,0001 D0 eta D0, *** 1 2p < 0, 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 c Irudi adierazgarriak (ezkerrean) eta kuantifikazioa (eskuinean) Masson-en trikromo orbanarekin tindatutako bihotz xerretan (Eskala biluzi = 500 µm) (n = 10 xerra/talde bakoitza txerri ezberdinetatik, norabide bakarreko ANOVA proba egiten da; #### p < 0,0001 p < 0,0001 < D0 eta D0, 1 *** 0 1 0 1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца сердца, окрамынца оценка сителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свистоня, выпстоня свистоня ANOVA; #### p < 0,0001 сравнению с D0 eta ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Masson-en trikromoz tindatutako bihotz-atalen irudi adierazgarriak (ezkerrean) eta kuantifikazioa (eskuinean) (estaldurarik gabeko eskala = 500 µm) (n = txerri ezberdinetako 10 atal/talde, norabide bakarreko ANOVA proba egina; #### p < 0,0001 D0rekin alderatuta eta *** 2 Ctr. D0rekin alderatuta). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺化（右）（裸尪（裸尪（10µ=m = 5））切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比 与D0 相比，D***1 测试４，D***1 。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 尺 度 尺 度度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向#0 单向 Anova ．#0.#0 浛#0.0 浛#0.相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окричественный анализ (справа) срезов сердца, окрамынца сителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, просод свиньи, просод свиньи, просод протов факторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению Crсl D12). c Masson-en trikromoz tindatutako bihotz-atalen irudi adierazgarriak (ezkerrean) eta kuantifikazioa (eskuinean) (n = 10 atal/talde, bakoitza txerri ezberdin batekoa, bariantzaren norabide bakarreko analisiaren bidez probatua ;### # p < 0,0001 D0-rekin alderatuta, ***0 2 P < 0,0001 D0-rekin alderatuta).Errore-barrak batez bestekoa ± desbideratze estandarra adierazten dute.
Hipotesi genuen kultura-euskarriari molekula txikiak gehituz, kardiomiozitoen osotasuna hobetu eta fibrosiaren garapena murriztu zitekeela CTCM kulturan.Beraz, molekula txikiak aztertu genituen gure kontrol estatikoko kulturak erabiliz20,21 nahaste-faktore kopuru txikia zela eta.Pantaila honetarako dexametasona (Dex), triiodotironina (T3) eta SB431542 (SB) aukeratu dira.Molekula txiki hauek aurretik hiPSC-CM kulturetan erabili izan dira kardiomiozitoen heltzea eragiteko, sarkomeroen luzera, T-tubuluak eta kondukzio-abiadura handituz.Horrez gain, bai Dex (glukokortikoide bat) bai SB hantura kentzen dutela ezagutzen da29,30.Hori dela eta, molekula txiki horien bat edo konbinazio bat sartzeak bihotz-atalen egitura-osotasuna hobetuko ote zuen probatu genuen.Hasierako baheketa egiteko, konposatu bakoitzaren dosia zelula-kultura ereduetan erabili ohi diren kontzentrazioen arabera hautatu zen (1 μM Dex27, 100 nM T327 eta 2,5 μM SB31).12 eguneko kulturaren ondoren, T3 eta Dex konbinazioak kardiomiozitoen egitura-osotasun optimoa eta zuntz birmoldaketa minimoa eragin zuen (4 eta 5. irudi osagarriak).Horrez gain, T3 eta Dex-en kontzentrazio horiek bikoitzak edo bikoiztuak erabiltzeak efektu kaltegarriak eragin zituen kontzentrazio arruntekin alderatuta (6a, b irudi osagarriak).
Hasierako baheketaren ondoren, 4 kultura-baldintzen buruz buruko konparaketa egin genuen (4a irudia): Ctrl: aurrez deskribatutako gure kultura estatikoan hazitako bihotz-atalak gure euskarri optimizatua erabiliz;20.21 TD: T3 eta Ctrl s Added Dex asteazkenean;MC: CTCMn hazitako bihotz-atalak aldez aurretik optimizatutako euskarria erabiliz;eta MT: euskarriari T3 eta Dex gehituta CTCM.12 egun laborantzaren ondoren, MS eta MT ehunen bideragarritasuna MTT saiakeraren bidez ebaluatutako ehun freskoetan bezala mantendu zen (4b. irudia).Interesgarria da T3 eta Dex gehitzeak transwell-kulturetara (TD) ez zuen bideragarritasun hobekuntza nabarmenik eragin Ctrl baldintzekin alderatuta, estimulazio mekanikoak bihotz-atalen bideragarritasuna mantentzeko zeregin garrantzitsua duela adieraziz.
a Diseinu esperimentalaren diagrama, estimulazio mekanikoaren eta T3/Dex osagarriaren efektuak 12 egunez ertainean ebaluatzeko erabilitako lau kultura-baldintzak irudikatzen dituena. b Barra-grafikoak bideragarritasunaren kuantifikazioa erakusten du 12 egunetan kultibatzearen ondorengo 4 hazkuntza-baldintzetan (Ctrl, TD, MC eta MT) bihotz-xerra freskoekin alderatuta (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD eta D12 MT), 12 (D12 MC/Talde) modu desberdinetan egindako probak. 0.0001, ###p < 0.001 D0-rekin alderatuta eta **p < 0.01 D12 Ctrl-rekin alderatuta). b Barra-grafikoak bideragarritasunaren kuantifikazioa erakusten du 12 egunetan kultibatzearen ondorengo 4 hazkuntza-baldintzetan (Ctrl, TD, MC eta MT) bihotz-xerra freskoekin alderatuta (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD eta D12 MT), 12 (D12 MC/Talde) modu desberdinetan egindako probak. 0.0001, ###p < 0.001 D0-rekin alderatuta eta **p < 0.01 D12 ctrl-rekin alderatuta). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после венную оценку жизнеспособности через 12 дней после венную кулрьта ви4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (D0) (D01, D18 = D18) (D02, D18 = D1, D18 = D02, D18 = D02) 12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 спо, ## 0,0001 по, сторонний тест ANOVA; D0 eta **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Barra-grafikoan bideragarritasunaren kuantifikazioa erakusten du hazkuntzaren ondorengo 12 egunetan 4 hazkuntza-baldintzetan (kontrola, TD, MC eta MT) bihotz-atal freskoekin alderatuta (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD eta D12 MT), 12 (D12 MC) atal ezberdinetatik, #-0 moduko ANOVA ataletatik; 1, ###p < 0,001 vs D0 eta **p < 0,01 D12 Ctrl-rekin alderatuta). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D150)D1、tD12、D12、和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.0001，#，#0#p < 0.**D#0. 01 与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнения сравнения сравнения сравнения ца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD eta D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, одноппа, односторо,##0носторо,##0носторо,##00 p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histograma erakusten duen 4 hazkuntza-baldintzak (kontrola, TD, MC eta MT) bihotzeko atal freskoekin alderatuta (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD eta D12 MT), txerri ezberdinetako 12 (D12 MC) atal/talde, norabide bakarreko ANOVA proba <, ##0.<0, ##0. **p<0,01 vs kontrola D12). c Barra-grafikoak 4 hazkuntza-baldintzetan (Ctrl, TD, MC eta MT) glukosa-fluxuaren kuantifikazioa erakusten du (Ctrl, TD, MC eta MT) bihotz-xerra freskoekin alderatuta (D0) (n = txerri desberdinetako 6 xerra/talde, norabide bakarreko ANOVA proba egiten da; ###p < 0,001, ***0p < 0,001, D0 eta ***0 1 D0-rekin alderatuta). c Barra-grafikoak 4 hazkuntza-baldintzetan (Ctrl, TD, MC eta MT) glukosa-fluxuaren kuantifikazioa erakusten du (Ctrl, TD, MC eta MT) bihotz-xerra freskoekin alderatuta (D0) (n = txerri desberdinetako 6 xerra/talde, norabide bakarreko ANOVA proba egiten da; ###p < 0,001, ***0p < 0,001, D0 eta ***0 1 D0-rekin alderatuta). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после куль встани куль встает овиях культивирования (контроль, TD, MC eta MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 зруспо зами свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению Cdr D0). c Histogramak 12 egunetan glukosa-fluxuaren kuantifikazioa erakusten du 4 hazkuntza-baldintzetan (kontrola, TD, MC eta MT) bihotzeko atal freskoekin alderatuta (D0) (n = txerri ezberdinetako 6 atal/talde, norabide bakarreko ANOVA proba egin da; ###p < 0,001 D0 eta ***p < Ctrl-rekin alderatuta). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 盌柯1＄囌柯1）糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 ，与D0 ， ， ， ， ， ， ， ， 执l 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片片 新鲜后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， 啵 ， ， 啵 ， ， A试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней послед венную оценку 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0)/пра 6 в правнению со свежими срезами сердца (D0) ных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 псо снира по снию с D0, ***p < 0,001 псо снира псо свиней. c Histogramak 12 egunetan glukosa-fluxuaren kuantifikazioa erakusten duen 4 laborantza-baldintzetarako (kontrola, TD, MC eta MT) bihotz-atal freskoekin alderatuta (D0) (n = 6 atal/talde, txerri ezberdinetatik, aldebakarreko ANOVA probak egin ziren, ###p < 0,001 < 0,001 kontrolarekin alderatuta (D0, 1 *** 1 *** 0, 0 1 2 *** aldean).d Tentsioaren analisia ehun freskoen (urdina), 12 eguneko MC (berdea) eta eguneko 12 MT (gorria) ehun eskualdeko ehunen sekzio-puntutan (n = 4 xerra/talde, norabide bakarreko ANOVA proba; ez zen alde handirik egon taldeen artean).e Sumendien grafikoa bihotz-atal freskoetan (D0) modu desberdinean adierazitako geneak erakusten dituena, 10-12 egunetan baldintza estatikoetan (Ctrl) edo MT baldintzetan (MT) hazitako bihotz-atalen aldean.f Sarkomero-geneen bero-mapa kultura-baldintza bakoitzean hazitako bihotz-atalen ataletarako.Errore-barrak batez bestekoa ± desbideratze estandarra adierazten dute.
Gantz-azidoen oxidaziotik glukolisira aldatzearen menpekotasun metabolikoa kardiomiozitoen desdiferentziazioaren ezaugarria da.Heldu gabeko kardiomiozitoek glukosa erabiltzen dute batez ere ATP ekoizteko eta mitokondrio hipoplasikoak dituzte kristae gutxirekin5,32.Glukosaren erabileraren analisiek erakutsi zuten MC eta MT baldintzetan, glukosaren erabilera 0 eguneko ehunetakoaren antzekoa zela (4c irudia).Hala ere, Ctrl laginek glukosaren erabileraren igoera nabarmena erakutsi zuten ehun freskoarekin alderatuta.Horrek adierazten du CTCM eta T3/Dex konbinazioak ehunen bideragarritasuna hobetzen duela eta 12 eguneko hazitako bihotz-atalen fenotipo metabolikoa mantentzen duela.Horrez gain, tentsioaren analisiak erakutsi zuen tentsio-mailak 12 egunez bihotz-ehun freskoetan bezala mantentzen zirela MT eta MS baldintzetan (4d. irudia).
CTCM eta T3/Dex-ek bihotz-xerra ehunen transkripzio-paisaia globalean duten eragin orokorra aztertzeko, RNAseq egin dugu lau kultura-baldintza desberdinetako bihotz-xerretan (Datu osagarriak 1).Interesgarria da, MT sekzioek transkripzio-antzekotasun handia erakutsi zuten bihotzeko ehun freskoarekin, 13.642 genetik 16 bakarrik adierazita.Hala ere, lehen erakutsi dugun bezala, Ctrl xerrek 1229 modu ezberdinean adierazitako gene bistaratzen zituzten kulturan 10-12 egun igaro ondoren (4e. irudia).Datu hauek bihotzaren eta fibroblastoen geneen qRT-PCR bidez baieztatu ziren (7a-c irudia osagarria).Interesgarria da Ctrl atalek bihotzeko eta ziklo zelularreko geneen beherakada eta hanturazko gene programen aktibazioa erakutsi zuten.Datu hauek iradokitzen dute epe luzeko hazkuntzaren ondoren normalean gertatzen den desdiferentziazioa MT baldintzetan guztiz arintzen dela (8a, b irudi osagarria).Sarkomero-geneen azterketa arretatsuak erakutsi zuen MT baldintzetan soilik sarkomeroa (4f. irudia) eta ioi-kanala (9. irudia osagarria) kodetzen duten geneak gordetzen direla, Ctrl, TD eta MC baldintzetan zapalkuntzatik babestuz.Datu hauek frogatzen dute estimulazio mekanikoaren eta humoralaren (T3/Dex) konbinazioarekin, bihotz-xerren transkriptoma bihotz-xerren antzekoa izan daitekeela kulturan 12 egun igaro ondoren.
Transkripzio-aurkikuntza hauek bihotz-ataletako kardiomiozitoen egitura-osotasuna 12 egunez MT baldintzetan hobekien kontserbatzen dela onartzen dute, 43 konekxina osorik eta lokalizatuak erakusten duen moduan (5a. irudia).Gainera, MT baldintzetan bihotz-ataletan fibrosia nabarmen murriztu zen Ctrl-ekin alderatuta eta bihotz-atal freskoekin alderatuta (5b. irudia).Datu hauek frogatzen dute estimulazio mekanikoaren eta T3/Dex tratamenduaren konbinazioak modu eraginkorrean gordetzen duela bihotz-egitura bihotz-ataletan kulturan.
a Troponina-T (berdea), 43 konexina (gorria) eta DAPI (urdina) immunofluoreszentzia-irudi adierazgarriak bihotz-atal isolatu berrietan (D0) edo 12 egunez hazitako lau bihotz-atalen hazkuntza-baldintzetan (eskala barra = 100 µm).). Bihotz-ehunaren egitura-osotasunaren (n = 7 (D0 eta D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC eta D12 MT) txerri ezberdinetako 5 (D12 TD, D12 MC eta D12 MT) xerra/taldearen kuantifikazioa adimen artifiziala, norabide bakarreko ANOVA proba egiten da; ####p < 0.0001 D0 eta * 1.0.0.0.0.0.0.0.0.0, < 5.0 ****-rekin alderatuta. trl). Bihotz-ehunaren egitura-osotasunaren (n = 7 (D0 eta D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC eta D12 MT) txerri ezberdinetako xerra/taldearen kuantifikazioa adimen artifiziala, norabide bakarreko ANOVA proba egiten da; #### p < 0,0001 D0 eta * 5 1, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1 trl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного = интел 1 (D01) 5 (D12 TD, D12 MC eta D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### срезов/группу от разных свиней; 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Bihotz-ehunaren egiturazko inteligentzia artifiziala erabilita kuantifikatzea, 5 (D12 TD, D12 MC eta D12 MC).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和/D12 MT 和/D12 和艺绿艺纛（MT工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p 或****p < 0,00001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,00001 或****p对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc＼ 、 d12 mc） 对 d12 mc） 和 d12 ctrl）智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相戸0 且 0,05 相戸0 且 0p < 0,05相比）.Bihotz-ehunaren egitura-osotasunaren kuantifikazioa txerri ezberdinetan adimen artifiziala erabiliz (n = 7 (D0 eta D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC eta D12 MT) sekzio/talde) norabide bakarreko ANOVA proba batekin;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 eta *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 D0-rekin alderatuta eta *p < 0,05 edo ****p < 0,0001 D12 Ctrl-rekin alderatuta). b Masson-en trikromo orbanarekin tindatutako bihotz-xerren irudi adierazgarriak eta kuantifikazioa (Eskala barra = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD eta D12 MC), 9 (D12 MT) txerri ezberdinetako xerra/taldea, norabide bakarreko proba <***0##0-rekin alderatuta. < 0,001, edo ****p < 0,0001 D12 Ctrl-arekin alderatuta). b Masson-en trikromo orbanarekin tindatutako bihotz-xerren irudi adierazgarriak eta kuantifikazioa (Eskala barra = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD eta D12 MC), 9 (D12 MT) txerri ezberdinetako xerra/taldea, norabide bakarreko proba <***0##0-rekin alderatuta. < 0,001, edo ****p < 0,0001 D12 Ctrl-arekin alderatuta). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных трашенных трашенных траственная оценка срезов сердца а (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD eta D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разно разнот разноя сторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению сl D12 Ct). b Masson-en trikromoz tindatutako bihotz-atalen kuantifikazioa eta irudi adierazgarriak (eskala barra = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD eta D12 MC), 9 (D12 MT) atal/talde txerri ezberdinetatik, norabide bakarreko ANOVA eginda <; ###0.0p0. ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）㼈D1 TD10）（D1 TD1010（D1 〧图像和量化（比例尺和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析； 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析； 个析； 个 析； 个 析； 个 析； 个 析； 个 析； 个 析； 析； 切片）切片/组， 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （ 500 （ （ （ （ ） （ （ （ （ ） rl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析，片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析， 析 析， 析 枑< 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных трашенных тросо ая линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD eta D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусней 01 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Masson-en trikromoz tindatutako bihotz-atalen irudi adierazgarriak eta kuantifikazioa (eskala barra = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD eta D12 MC), txerri/talde ezberdinetako 9 (D12 MT) atal, ANOVA metodo bat; ####p, < *** 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0. 0,0001 D12 Ctrl-rekin alderatuta).Errore-barrak batez bestekoa ± desbideratze estandarra adierazten dute.
Azkenik, CTCM-k bihotz-hipertrofia imitatzeko duen gaitasuna ebaluatu zen, bihotz-ehunaren luzapena handituz.CTCM-n, aire-ganberaren presioa 80 mmHg-tik 80 mmHg-ra igo zen.art.(tarte normala) 140 mmHg arte.(6a. irudia).Hau luzamenduaren %32ko gehikuntzari dagokio (6b. irudia), aurretik hipertrofian ikusten denaren antzeko sarkomero-luzera lortzeko bihotz-ataleek behar zuten portzentaje-tarte gisa agertzen zena.Bihotz-ehunaren luzapena eta abiadura uzkurduran eta erlaxazioan konstante mantendu ziren sei egunetan zehar (6c. irudia).MT baldintzetako bihotz-ehunak luzapen normala (MT (Normal)) edo gehiegizko luzapena (MT (OS)) jasan zuen sei egunez.Dagoeneko lau egunez kulturan egon ondoren, NT-ProBNP biomarkatzaile hipertrofikoa nabarmen igo zen ertainean MT (OS) baldintzetan MT (normal) baldintzekin alderatuta (7a. irudia).Horrez gain, sei egunen hazkuntzaren ondoren, MT (OS) zelulen tamaina (7b. irudia) nabarmen handitu zen MT bihotzaren atalekin alderatuta (normala).Gainera, NFATC4 translokazio nuklearra nabarmen handitu zen gehiegizko ehunetan (7c. irudia).Emaitza hauek hiperdistentsioaren ondoren birmoldaketa patologikoaren garapen progresiboa erakusten dute eta CTCM gailua tarteak eragindako bihotz-hipertrofiaren seinaleztapena aztertzeko plataforma gisa erabil daitekeen kontzeptua onartzen dute.
Aire-ganberaren presioaren, fluido-ganberaren presioaren eta ehun-mugimenduaren neurketen aztarna adierazgarriek baieztatzen dute ganberako presioak fluido-ganberaren presioa aldatzen duela, eta ehun zatiaren dagokion mugimendua eragiten du.b Luzatze-ehuneko eta luzatze-abiaduraren kurba adierazgarriak normalean luzatutako (laranja) eta gehiegi luzatutako (urdina) ehun-ataletarako.c Barra-grafikoa ziklo-denbora (n = 19 xerra talde bakoitzeko, txerri ezberdinetatik), uzkurdura-denbora (n = 18-19 xerra talde bakoitzeko, txerri ezberdinetatik), erlaxazio-denbora (n = 19 xerra talde bakoitzeko, txerri ezberdinetatik), ehunen mugimenduaren anplitudea (n = 14 xerra/talde ezberdinetakoa), (n = 14 xerra xerra/talde ezberdinetatik), (sistogaren abiadura, 14 xerra/taldetik, 4 systog-en abiadura). txerri desberdinetatik) eta erlaxazio-tasa gailurra (n = 14 (D0), 15 (D6) ) atal/taldeak) txerri ezberdinetatik), bi isatseko Student-en t-testak ez zuen alde handirik erakutsi inongo parametrotan, parametro hauek konstante mantendu zirela gaintentsioarekin 6 egunetan zehar.Errore-barrak batez bestekoa ± desbideratze estandarra adierazten dute.
a NT-ProBNP kontzentrazioaren kuantifikazioa MT normal (Norm) edo overstretching (OS) baldintzetan (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm eta D4 MTOS) txerri desberdinetatik 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm eta D4 MTOS) xerra/taldea txerri ezberdinetatik hazitako bihotz-xerra, Bi norabideko ANOVA < 0 tarte normalarekin alderatuta.**1p egiten da. a Barra grafikoan NT-ProBNP kontzentrazioa kuantifikatzea MT tarte normal (Norm) edo overstretching (OS) baldintzetan (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm eta D4 MTOS) txerri ezberdinetatik 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm eta D4 MTOS) xerra/taldeetatik hazitako bihotz-xerretatik, Bi norabideko ANOVA < 0 **1p tarte normalarekin alderatzen da.NT-ProBNP kontzentrazioaren histograma kuantitatiboa laborantza medioan MT luzamendu normala (araua) edo gehiegizko luzapena (OS) baldintzetan (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm eta D4).MTOS) txerri ezberdinetako 3 xerra /taldea / taldean hazitako txerri ezberdinetatik, bi faktoreen analisia egiten da;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 tarte normalarekin alderatuta). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓坡度拉伸(OS) 在(D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析方差分析）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析方差分析；丣析；攸攛攸攛攸攛攛攛0,01). a NT-ProBNP kontzentrazioa kuantifikatzea MT luzamendu normala (Norm) edo gehiegizko luzapena (OS) baldintzetan (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) 猪的切片/的切片/组切片/组切片/组切片/组切片/组切片/组切片/组切片/组切片/组切片/组切片/组切片/组切片/组切片/组，可䐑卥叹抏滄揹抏滄揹抏滄揹抏滄揹滄揹luzatze normalarekin alderatuta, p < 0,01).histograma NT-ProBNP kontzentrazioen kuantifikazioa txerri ezberdinetako MT normal (araua) edo overstretch (OS) baldintzetan (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) eta D4 MTOS) xerra/taldeetan hazitako txerri ezberdinetako xerra/taldea, bariantza bi norabideko analisia;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 tarte normalarekin alderatuta). b Troponina-T eta WGArekin (ezkerrean) eta zelulen tamainaren kuantifikazioarekin (eskuinean) tindatutako bihotz-xerren irudi adierazgarriak (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) zelula/talde txerri ezberdinetako 10 xerra ezberdinetatik, Bi isatseko Student t-testa egiten da; ****p00 normalarekin alderatuta. b Troponina-T eta WGArekin (ezkerrean) eta zelulen tamainaren kuantifikazioarekin (eskuinean) tindatutako bihotz-xerren irudi adierazgarriak (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) zelula/taldea txerri ezberdinetako 10 xerra ezberdinetatik, Bi isatseko Student t-testa egiten da; **** p < 10 normalarekin alderatuta. b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слестова) срезов сердца ения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезных срезов от срезов от-виры от вира тся хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Troponin-T eta AZPrekin (ezkerrean) eta zelulen tamainaren kuantifikazioarekin (eskuinean) tindatutako bihotz-atalen irudi adierazgarriak (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) txerri ezberdinetako 10 atal ezberdinetako zelula/taldea, bi isatseko Student-en t-testa egin zen; ****p < 0 000 normalarekin alderatuta). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性左）和细胞大小量化（右) ，来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生有尾学生切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生有尾学生 有尾学生t （D6 MTNorm ，****p <0,0001）。 b Kalcarein-T eta WGArekin (ezkerrean) eta zelulen tamainarekin (eskuinean) tindatutako bihotz-xerren irudi adierazgarriak (n = 330 (D6 MTOS), 369 10 xerra ezberdinetatik (D6 MTNorm)) Zelulak/组，两方法有尾学✉尾学✉尾学✉尾学✉尾学✉尾学✉尾学✉尾学，000000000000000100000010 ). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слестнава) и слестнава размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свируней пи, Клих свируней пи критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Troponin-T eta AZPrekin tindatutako bihotz-atalen irudi adierazgarriak (ezkerrean) eta zelulen tamainaren kuantifikazioa (eskuinean) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) txerri ezberdinetako 10 atal ezberdinetatik) Zelula/taldea, bi isatseko irizpidea Ikaslearen t;****p < 0,0001 tentsio normalarekin alderatuta). c Troponina-T eta NFATC4-rako immunomarkatutako MTOS bihotz-xerren 0. eguneko eta 6. eguneko irudi adierazgarriak eta NFATC4-ren translokazioaren kuantifikazioa CM-en nukleoetara (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) txerri ezberdinetako xerra/taldea, Bi isatseko Student t-testa egiten da.005*). c Troponina-T eta NFATC4-rako immunomarkatutako MTOS bihotz-xerren 0. eta 6. eguneko irudi adierazgarriak eta NFATC4-ren translokazioa CM-en nukleoetara kuantifikatzea (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) txerri ezberdinetako xerra/taldea, * Bi isatseko Student t-testa egiten da.00;5. c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 eta 6 дней MTOS, имуномеченых для тропон и тропон тропон енная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу срезов/группу овся нырта овся нырток я двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c MTOS 0 eta 6 eguneko bihotz-atalen irudi adierazgarriak, troponina-T eta NFATC4-rako immunomarkatuak eta NFATC4-ren translokzioaren kuantifikazioa haitzuloetako zelulen nukleoan (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) txerri ezberdinetako xerra/taldea) bi buztanen azterketa egin zuten;*p < 0,05). c.的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生双尾学生t 5锟t .*锟t 0. c Calcanin-T eta NFATC4 immunomarking 第0天和第6天MTOS bihotz-xerren eta NFATC4 NFATC4 易位至CM zelula-nukleoaren 的kantitate desberdinen irudi adierazgarriak (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS 天天, 化天,)学生et 电影；*p <0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки троповки троповки троповки троповки тропон 4 енная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два-статры срез юдента; *p <0,05). c MTOS bihotz-xerren irudi adierazgarriak 0 eta 6 egunetan troponina-T eta NFATC4 immunomarking eta CM-ren nukleoan NFATC4 translokazioa kuantifikatzeko txerri desberdinetatik (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) xerra/taldea, bi isatseko t-irizpidea Ikaslearena.;05).Errore-barrak batez bestekoa ± desbideratze estandarra adierazten dute.
Translazio kardiobaskularren ikerketak bihotz-ingurunea zehaztasunez erreproduzitzen duten eredu zelularrak behar ditu.Ikerketa honetan, bihotzeko atal ultrameheak estimula ditzakeen CTCM gailu bat garatu eta ezaugarritu zen.CTCM sistemak fisiologikoki sinkronizatutako estimulazio elektromekanikoa eta T3 eta Dex fluidoen aberastea barne hartzen ditu.Txerri-bihotzaren atalak faktore horien eraginpean egon zirenean, haien bideragarritasuna, egitura-osotasuna, jarduera metabolikoa eta transkripzio-adierazpena bihotz-ehun freskoetan bezala mantendu ziren 12 egunetan hazi ondoren.Horrez gain, bihotz-ehunaren gehiegizko luzatzeak bihotzaren hipertrofia eragin dezake hiperextensioak eragindakoa.Orokorrean, emaitza hauek kultura fisiologikoen baldintzek funtsezko eginkizuna onartzen dute bihotz-fenotipo normala mantentzeko eta drogak bahetzeko plataforma bat eskaintzen dute.
Faktore askok kardiomiozitoen funtzionamendurako eta biziraupenerako ingurune optimoa sortzen laguntzen dute.Faktore hauetatik agerikoenak (1) zelulen arteko elkarrekintzarekin, (2) estimulazio elektromekanikoarekin, (3) faktore humoralekin eta (4) substratu metabolikoekin lotuta daude.Zelulaz zelula arteko interakzio fisiologikoek zelula-mota anitzeko hiru dimentsioko sare konplexuak behar dituzte zelula kanpoko matrize batek lagunduta.Horrelako zelula-interakzio konplexuak zailak dira in vitro berreraikitzea zelula mota indibidualen kolaborazioaren bidez, baina erraz lor daitezke bihotz-atalen izaera organotipikoa erabiliz.
Kardiomiozitoen luzapen mekanikoa eta estimulazio elektrikoa funtsezkoak dira bihotz-fenotipoa mantentzeko33,34,35.Estimulazio mekanikoa hiPSC-CM girotzeko eta heltzeko oso erabilia izan den arren, azkenaldian hainbat ikerketa dotorek bihotz-xerren estimulazio mekanikoa saiatu dira kulturan karga uniaxiala erabiliz.Ikerketa hauek erakusten dute 2D karga mekaniko uniaxialak eragin positiboa duela bihotzaren fenotipoan kulturan zehar.Azterketa horietan, bihotzaren atalak trakzio-indar isometrikoekin kargatu ziren17, karga auxotoniko linealarekin18 edo bihotz-zikloa birsortu zen indar-transduktorearen feedbacka eta tentsio-eraginak erabiliz.Hala ere, metodo hauek ehun uniaxialaren luzapena erabiltzen dute ingurumen-optimizaziorik gabe, eta ondorioz, bihotz-gene asko kentzen dira edo luzatze-erantzun anormalekin lotutako geneen gainespresioa.Hemen deskribatzen den CTCM-ak 3D elektromekanikoko estimulu bat eskaintzen du, bihotz-ziklo naturala imitatzen duena, ziklo-denborari eta tarte fisiologikoari dagokionez (% 25eko luzapena, % 40eko sistole, % 60eko diastole eta 72 taupada minutuko).Hiru dimentsioko estimulazio mekaniko hau bakarrik ehunen osotasuna mantentzeko nahikoa ez den arren, T3/Dex erabiliz estimulazio humoral eta mekanikoaren konbinazioa beharrezkoa da ehunen bideragarritasuna, funtzioa eta osotasuna behar bezala mantentzeko.
Umore faktoreek zeregin garrantzitsua dute helduen bihotzaren fenotipoa modulatzeko.Hori nabarmendu zen HiPS-CM ikerketetan, non T3 eta Dex gehitu zitzaizkion hazkuntza-euskarriei zelulen heltze bizkortzeko.T3-k aminoazidoen, azukreen eta kaltzioaren garraioan eragin dezake zelula-mintzetan zehar36.Horrez gain, T3-k MHC-α adierazpena eta MHC-β beheranzko erregulazioa sustatzen ditu, kardiomiozito helduetan uzkurdura bizkorreko miofibrilen sorrera sustatuz, fetuko CMko moteleko miofibrilekin alderatuta.Paziente hipotiroideen T3 gabeziak banda miofibrilarren galera eta tonuaren garapen-tasa murriztea eragiten du37.Dex-ek glukokortikoideen errezeptoreetan jarduten du eta miokardioaren uzkurkortasuna areagotzen duela frogatu da perfusitutako bihotz isolatuetan;38 hobekuntza hau kaltzio-gordailuen sarreran (SOCE) eraginarekin lotuta dagoela uste da 39,40.Horrez gain, Dex bere errezeptoreetara lotzen da, funtzio immunea eta hantura kentzen dituen zelula barneko erantzun zabala eragiten du30.
Gure emaitzek adierazten dute estimulazio fisiko mekanikoak (MS) kulturaren errendimendu orokorra hobetu zuela Ctrl-ekin alderatuta, baina ez zituen bideragarritasuna, egitura-osotasuna eta bihotz-adierazpena mantendu kulturan 12 egunetan.Ctrl-ekin alderatuta, CTCM (MT) kulturei T3 eta Dex gehitzeak bideragarritasuna hobetu zuen eta antzeko transkripzio-profilak, egitura-osotasuna eta jarduera metabolikoa mantendu zituen bihotzeko ehun freskoarekin 12 egunez.Horrez gain, ehunen luzapen-maila kontrolatuz, hiperextensioak eragindako bihotz-hipertrofia-eredu bat sortu zen STCM erabiliz, STCM sistemaren aldakortasuna erakutsiz.Kontuan izan behar da bihotzaren birmoldaketak eta fibrosiak normalean zirkulatzen duten zelulek zitokina egokiak eta fagozitosia eta beste birmoldatze-faktore batzuk eman ditzaketen organo osoak izan ohi dituzten arren, bihotzaren atalek oraindik ere prozesu fibrotikoa imitatu dezaketela estresari eta traumatismoei erantzunez.miofibroblastoetan sartu.Hori aldez aurretik ebaluatu da bihotz-xerra eredu honetan.Kontuan izan behar da CTCM parametroak presioa/anplitude elektrikoa eta maiztasuna aldatuz modulatu daitezkeela baldintza asko simulatzeko, hala nola, takikardia, bradikardia eta zirkulazio-euskarri mekanikoa (kargarik gabeko bihotz mekanikoa).Honek sistema droga-probak egiteko errendimendu ertaina bihurtzen du.Gehiegizko esfortzuak eragindako bihotz-hipertrofia modelatzeko CTCMk duen gaitasunak sistema hau terapia pertsonalizaturako probatzeko bidea zabaltzen du.Ondorioz, ikerketa honek frogatzen du tarte mekanikoa eta estimulazio humorala funtsezkoak direla bihotz-ehunen atalen kultura mantentzeko.
Hemen aurkezten diren datuek CTCM miokardio osorik modelatzeko plataforma oso itxaropentsua dela iradokitzen duten arren, laborantza metodo honek muga batzuk ditu.CTCM kulturaren muga nagusia xerretan etengabeko tentsio mekaniko dinamikoa ezartzen duela da, eta horrek ziklo bakoitzean zehar bihotz-xerren uzkurdurak aktiboki kontrolatzeko gaitasuna galarazten du.Horrez gain, bihotz-atalen tamaina txikia dela eta (7 mm), indar-sentsore tradizionalen bidez kultura-sistemetatik kanpo funtzio sistolikoa ebaluatzeko gaitasuna mugatua da.Egungo eskuizkribuan, muga hori partzialki gainditzen dugu tentsio optikoa funtzio uzkurgarriaren adierazle gisa ebaluatuz.Hala ere, muga honek lan gehiago eskatuko du eta etorkizunean bideratu ahal izango da kulturan bihotz-xerren funtzioaren monitorizazio optikorako metodoak sartuz, hala nola kaltzioa eta tentsioarekiko sentikorrak diren koloratzaileak erabiliz mapa optikoa.CTCMren beste muga bat da lan-ereduak ez duela estres fisiologikoa manipulatzen (aurrekarga eta ondorengo karga).CTCM-n, presioa kontrako noranzkoetan induzitu zen %25eko tarte fisiologikoa diastolean (tarte osoa) eta sistolean (estimulazio elektrikoan uzkurduraren iraupena) ehun handietan erreproduzitzeko.Muga hori etorkizuneko CTCM diseinuetan kendu beharko litzateke bi aldeetatik bihotz-ehunaren gaineko presio egokia eginez eta bihotzeko ganberetan gertatzen diren presio-bolumen erlazio zehatzak aplikatuz.
Gehiegizko luzamenduak eragindako birmoldaketa eskuizkribu honetan adierazten den hiperstretcharen seinale hipertrofikoak imitatzera mugatzen da.Horrela, eredu honek luzamenduak eragindako seinaleztapen hipertrofikoaren azterketan lagun dezake faktore humoral edo neuronalen beharrik gabe (sistema honetan existitzen ez direnak).Azterketa gehiago behar dira CTCM aniztasuna areagotzeko, adibidez, zelula immunologikoekin kolaboratzeak, zirkulazio plasmako faktore humoralak eta zelula neuronalekin kolaboratzeak gaixotasunak modelatzeko aukerak hobetuko ditu CTCMrekin.
Ikerketa honetan hamahiru txerri erabili ziren.Animalien prozedura guztiak erakundeen jarraibideen arabera egin ziren eta Louisvilleko Unibertsitateko Animalien Zainketa eta Erabilera Instituzionaleko Batzordeak onartu zituen.Arku aortikoa estutu eta bihotza 1 L kardioplegia esterilarekin (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparina, pH 7,4 arte); bihotzak izotz-hotzean soluzio kardioplegikoan kontserbatu ziren laborategira 10 min normalean izotz gainean garraiatu arte. bihotzak izotz-hotzean soluzio kardioplegikoan kontserbatu ziren laborategira 10 min normalean izotz gainean garraiatu arte. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на, льдон на ет <10 мин. bihotzak izotzezko soluzio kardioplegikoan gordetzen ziren laborategira izotz gainean garraiatu arte, eta horrek normalean <10 minutu behar ditu.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычмно <10. Mantendu bihotzak izotzean kardioplejia laborategira izotz gainean garraiatu arte, normalean <10 min.
CTCM gailua SolidWorks ordenagailuz lagundutako diseinua (CAD) softwarean garatu zen.Kultura-ganberak, banatzaileak eta aire-ganberak CNC plastiko akriliko argiz eginda daude.7 mm-ko diametroko babes-eraztuna dentsitate handiko polietilenoz (HDPE) eginda dago erdian eta euskarri zigilatzeko erabiltzen den silikonazko eraztunaren zirrikitua dauka azpian.Silizezko mintz mehe batek kultura-ganbera bereizten du bereizketa-plakatik.Silikonazko mintza laser bidez moztuta dago 0,02″ lodiko silikonazko xaflatik eta 35A-ko gogortasuna du.Beheko eta goiko silikonazko junturak laser bidez moztuta daude 1/16″-ko lodierako silikonazko xaflatik eta 50A-ko gogortasuna dute.316L altzairu herdoilgaitzezko torlojuak eta hegal-azkoinak blokea lotzeko eta zigilu hermetiko bat sortzeko erabiltzen dira.
Zirkuitu inprimatuko plaka (PCB) dedikatu bat diseinatuta dago C-PACE-EM sistemarekin integratzeko.Suitzako makina konektoreen entxufeak grafito-elektrodoetara konektatzen dira, zilarrez estalitako kobrezko hariekin eta brontzezko 0-60 torlojuekin elektrodoetan izorratuta.Zirkuitu inprimatua 3D inprimagailuaren estalkian jartzen da.
CTCM gailua eragingailu pneumatiko programagarri batek (PPD) kontrolatzen du, eta zirkulazio-presioa kontrolatutako zirkulazio-ziklo baten antzekoa sortzen du.Aire-ganberaren barruko presioa handitzen den heinean, silikonazko mintz malgua gorantz zabaltzen da, medioa ehun gunearen azpian behartuz.Ehun-eremua fluidoaren kanporaketa honen bidez luzatuko da, diastolean bihotzaren hedapen fisiologikoa imitatuz.Erlaxazio gailurrean, grafitozko elektrodoen bidez estimulazio elektrikoa aplikatu zen, eta horrek aire-ganberako presioa murrizten zuen eta ehun-atalen uzkurdura eragin zuen.Hodiaren barruan balbula hemostatiko bat dago, aire-sistemako presioa detektatzeko presio-sentsore batekin.Presio-sentsoreak hautematen duen presioa ordenagailu eramangarrira konektatutako datu-biltzaile bati aplikatzen zaio.Horrek gas-ganberaren barruko presioa etengabe kontrolatzeko aukera ematen du.Ganbara-presio maximoa lortu zenean (80 mmHg estandarra, 140 mmHg OS), datuak eskuratzeko gailuak C-PACE-EM sistemari seinale bat bidaltzeko agindu zitzaion 2 ms-ko tentsio-seinale bifasikoa sortzeko, 4 V-en ezarrita.
Bihotzeko atalak lortu eta 6 putzutan egindako hazkuntza-baldintzak honela egin dira: Bildutako bihotzak transferentzia-ontzitik kardioplegia hotza (4°C) duen erretilu batera eraman.Ezkerreko bentrikulua pala antzu batekin isolatu eta 1-2 cm3-ko zatietan moztu zen.Ehun-bloke hauek ehun-euskarrietara itsatsi zituzten ehun-itsasgarriarekin eta Tyrode-ren disoluzioa zuen mikrotomo bibraziozko ehun-bainu batean jarri eta etengabe oxigenatu ziren (3 g/L 2,3-butanodiona monooxima (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM (8,18 g). ), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M disoluzioa), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M disoluzioa), 1 L ddH2O arte).Mikrotomo dardaratzailea 300 µm-ko lodierako xerrak mozteko ezarri zen 80 Hz-ko maiztasunean, 2 mm-ko bibrazio-anplitudea horizontalean eta 0,03 mm/s-ko aurrerapen-abiaduran.Ehun-bainua izotzez inguratu zen disoluzioa hozten mantentzeko eta tenperatura 4°C-tan mantendu zen.Transferitu ehun-atalak mikrotomoko bainutik etengabe oxigenatutako Tyrode disoluzioa izotzean duen inkubazio-bainu batera harik eta harik eta atal nahikoa lortu arte.Transwell kulturetarako, ehun-atalak 6 mm-ko zabalerako poliuretano euskarri esterilari erantsi eta 6 ml-ko medio optimizatu batean jarri ziren (199 ertain, 1x ITS osagarria, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalinoa eta 2X antibiotiko-antifungikoa).Estimulazio elektrikoa (10 V, maiztasuna 1,2 Hz) ehunen ataletan aplikatu zen C-Pace-ren bidez.TD baldintzetarako, T3 eta Dex freskoak gehitu ziren 100 nM eta 1 μM bitarteko aldaketa bakoitzean.Erdigunea oxigenoz saturatuta dago egunean 3 aldiz ordezkatu aurretik.Ehun-atalak inkubagailu batean hazi ziren 37°C-tan eta %5 CO2-an.
CTCM kulturetarako, ehun-atalak neurrira egindako 3D inprimagailu batean jarri ziren, Tyrode-ren soluzio eraldatua zuen Petri plaka batean.Gailua bihotzaren xerraren tamaina euskarri-eraztunaren azaleraren %25 handitzeko diseinatuta dago.Hau egiten da bihotzaren atalak luzatzen ez daitezen Tyrode-ren soluziotik mediora transferitu ondoren eta diastolean zehar.Kola histoakrilikoa erabiliz, 300 µm-ko lodierako atalak 7 mm-ko diametroko euskarri-eraztun batean finkatu ziren.Ehun-atalak euskarri-eraztunari lotu ondoren, moztu gehiegizko ehun-atalak eta jarri erantsitako ehun-atalak berriro izotz gainean Tyrode soluzioaren bainuan (4 °C) gailu baterako atal nahikoa prestatu arte.Gailu guztien prozesatzeko denborak ez du 2 ordu baino gehiago izan behar.Euskarri-eraztunei 6 ehun-atalak erantsi ondoren, CTCM gailua muntatu zen.CTCM kultura-ganbera aurrez oxigenatutako 21 ml-ko medioz beteta dago.Transferitu ehun-atalak kultura-ganberara eta kendu arretaz aire-burbuilak pipeta batekin.Ondoren, ehun-atala zuloan sartzen da eta astiro-astiro sakatzen da.Azkenik, jarri elektrodoaren kapa gailuan eta transferitu gailua inkubagailura.Ondoren, konektatu CTCM aire-hodira eta C-PACE-EM sistemara.Eragingailu pneumatikoa irekitzen da eta aire-balbulak CTCM irekitzen du.C-PACE-EM sistema 4 V 1,2 Hz-tan emateko konfiguratu zen 2 ms-ko erritmo bifasikoetan.Medioa egunean bitan aldatzen zen eta elektrodoak egunean behin aldatzen ziren elektrodoetan grafitoa pilatzea ekiditeko.Beharrezkoa izanez gero, ehun-atalak kendu daitezke haien kultura-putzuetatik, haien azpian erori daitezkeen aire-burbuilak kanporatzeko.MT tratamendu-baldintzetarako, T3/Dex fresko gehitu zen ertain-aldaketa bakoitzean 100 nM T3 eta 1 μM Dex-ekin.CTCM gailuak inkubagailu batean hazi ziren 37 °C-tan eta %5 CO2-an.
Bihotzaren zatien ibilbide luzatuak lortzeko, kamera sistema berezi bat garatu zen.SLR kamera bat (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japonia) Navitar Zoom 7000 18-108 mm makro lente batekin (Navitar, San Francisco, CA) erabili zen.Bistaratzea giro-tenperaturan egin zen euskarri freskoarekin ordeztu ondoren.Kamera 51°-ko angeluan kokatzen da eta bideoa segundoko 30 fotogrametan grabatzen da.Lehenik, kode irekiko softwarea (MUSCLEMOTION43) Image-J-rekin erabili zen bihotz-xerren mugimendua kuantifikatzeko.Maskara MATLAB (MathWorks, Natick, MA, AEB) erabiliz sortu da bihotz-xerra taupak egiteko interes-eskualdeak definitzeko, zarata saihesteko.Eskuz segmentatutako maskarak fotograma-sekuentzia bateko irudi guztiei aplikatzen zaizkie eta, ondoren, MUSCLEMOTION plug-inera pasatzen dira.Muscle Motion-ek fotograma bakoitzeko pixelen batez besteko intentsitatea erabiltzen du erreferentziako markoarekiko mugimendua kuantifikatzeko.Datuak erregistratu, iragazi eta erabili ziren ziklo-denbora kuantifikatzeko eta bihotz-zikloan zehar ehunen luzapena ebaluatzeko.Grabatutako bideoa lehen mailako zero faseko iragazki digital baten bidez postprozesatu zen.Ehunaren luzapena (puntutik gailurrera) kuantifikatzeko, gailurtik gailurrerako analisia egin zen, grabatutako seinalean gailurrak eta hondoak bereizteko.Horrez gain, detrending 6. ordenako polinomio bat erabiliz egiten da seinaleen noraeza ezabatzeko.Programa-kodea MATLABen garatu zen ehunen mugimendu globala, ziklo-denbora, erlaxazio-denbora eta uzkurdura-denbora zehazteko (44. Programa Osagarria).
Tentsioaren analisirako, luzamendu mekanikorako ebaluaziorako sortutako bideo berberak erabiliz, lehenik eta behin mugimendu-gailurrak (mugimendu-puntu altuenak (goiko) eta baxuenak (beheko) irudikatzen zituzten bi irudi trazatu genituen MUSCLEMOTION softwarearen arabera.Ondoren, ehun-eskualdeak segmentatu ditugu eta itzal-algoritmo bat aplikatu diogu ehun segmentatuari (2a irudi osagarria).Segmentatutako ehuna hamar azpi-azaletan banatu zen gero, eta gainazal bakoitzaren tentsioa honako ekuazio hau erabiliz kalkulatu zen: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, non Sup eta Sdown ehunaren goiko eta beheko itzaletatik formaren distantziak diren, hurrenez hurren (2b irudi osagarria).
Bihotzeko atalak % 4ko paraformaldehidoan finkatu ziren 48 orduz.Ehun finkoak %10ean eta %20an sakarosatan deshidratatu ziren ordubetez, ondoren %30eko sakarosatan gau osoan zehar.Ondoren, atalak ebaketa-tenperatura optimoko konposatuan (OCT konposatu) txertatu ziren eta isopentano/izotz lehorreko bainu batean izoztu ziren pixkanaka.Gorde OCT txertatzeko blokeak -80 °C-tan bereizi arte.Diapositibak 8 μm-ko lodiera duten atal gisa prestatu ziren.
Bihotzeko ataletatik OCT kentzeko, berotu diapositibak berogailu-bloke batean 95 °C-tan 5 minutuz.Gehitu 1 ml PBS diapositiba bakoitzari eta inkubatu 30 minutuz giro-tenperaturan, ondoren atalak barneratu 0,1% Triton-X PBSn ezarriz 15 minutuz giro-tenperaturan.Antigorputz ez-espezifikoak laginarekin lotzea saihesteko, gehitu % 3ko BSA disoluzio 1 ml diapositibetan eta inkubatu ordubetez giro-tenperaturan.Ondoren, BSA kendu eta diapositibak PBSarekin garbitu ziren.Markatu lagin bakoitza arkatz batekin.Antigorputz primarioak (1:200 diluitua % 1 BSAn) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) eta troponina-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) 90 minututan gehitu ziren, gero bigarren mailako antigorputzak 14 BSAdilu-n (%820) Alexa-ren aurka (14 BSAdilu) (Thermo Scientific; #A16079), untxiaren Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) 90 minutu gehiagoz 3 aldiz garbitu PBSrekin Helburuko tindaketa atzealdetik bereizteko, bigarren mailako antigorputza bakarrik erabili dugu kontrol gisa. Azkenik, DAPI orban nuklearra gehitu eta diapositibak handitze-lanetan jarri ziren. eta Keyence mikroskopioa 40x handitzearekin.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) 5 μg/ml PBSn erabili zen WGA tindaketa egiteko eta sekzio finkoetan aplikatu zen giro-tenperaturan 30 minutuz.Diapositibak PBSrekin garbitu ziren eta Sudan beltza gehitu zen diapositiba bakoitzean eta 30 minutuz inkubatu zuten.Diapositibak PBSrekin garbitu ziren eta vectashield txertatzeko medioa gehitu zen.Diapositibak Keyence mikroskopioan ikusi ziren 40x handitzearekin.
OCT laginetatik kendu zen goian azaldu bezala.OCT kendu ondoren, murgildu diapositibak Bouin-en soluzioan gau osoan.Ondoren, diapositibak ur destilatuarekin garbitu ziren ordubetez eta gero Bibrich aloe azido fuksina disoluzio batean jarri ziren 10 minutuz.Ondoren, diapositibak ur destilatuarekin garbitu eta %5 fosfomolibdeno/%5 azido fosfotungstikoko disoluzio batean jarri ziren 10 minutuz.Garbitu gabe, transferitu diapositibak zuzenean anilina urdin disoluziora 15 minutuz.Ondoren, diapositibak ur destilatuarekin garbitu eta %1eko azido azetikoko disoluzio batean jarri ziren 2 minutuz.Diapositibak 200 N etanoletan lehortu eta xilenora transferitu ziren.Tindutako diapositibak Keyence mikroskopio baten bidez bistaratu ziren 10x helburua duen.Fibrosiaren eremuaren ehunekoa Keyence Analyzer softwarearen bidez kuantifikatu zen.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), V13154 katalogo zenbakia, fabrikatzailearen protokoloaren arabera, aldaketa batzuekin.Bereziki, 6 mm-ko diametroa duen puntzoi kirurgiko bat erabili zen MTT analisian ehunen tamaina uniformea ​​bermatzeko.Ehunak banan-banan plateratu ziren MTT substratua zuen 12 putzuko plaka baten putzuetan, fabrikatzailearen protokoloaren arabera.Sekzioak 37°C-tan inkubatzen dira 3 orduz eta ehun biziak MTT substratua metabolizatzen du formazan konposatu morea osatzeko.Ordeztu MTT disoluzioa 1 ml DMSOrekin eta inkubatu 37 °C-tan 15 minutuz bihotz-ataletatik formazan morea ateratzeko.Laginak DMSOn 1:10 diluitu ziren 96 hondoko plaka argietan eta kolore morearen intentsitatea 570 nm-tan neurtu zen Cytation plaka irakurgailu bat erabiliz (BioTek).Irakurketak bihotz zati bakoitzaren pisuaren arabera normalizatu ziren.
Bihotz xerra bitartekoak 1 μCi/ml [5-3H]-glukosa (Moravek Biochemicals, Brea, CA, AEB) dituzten euskarriekin ordezkatu ziren, aurretik deskribatu bezala glukosaren erabilera saiakuntzarako.4 orduko inkubazioa igaro ondoren, gehitu 100 µl medio 0,2 N HCl dituen mikrozentrifuga-hodi ireki batean.Ondoren, hodia 500 μl dH2O dituen distira-hodi batean jarri zen [3H]2O 72 orduz 37°C-tan lurruntzeko.Ondoren, kendu mikrozentrifuga-hodia distira-hoditik eta gehitu 10 ml distira-fluido.Zintilazio-zenbaketak Tri-Carb 2900TR distira likidoaren analizagailu baten bidez egin ziren (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, AEB).Ondoren, glukosaren erabilera kalkulatu zen [5-3H]-glukosaren jarduera espezifikoa, oreka eta hondo osatugabeak, [5-3H]-etiketatu gabeko glukosaren diluzioa eta distira-kontagailuaren eraginkortasuna kontuan hartuta.Datuak bihotzaren atalen masarekin normalizatuta daude.
Ehunak Trizol-en homogeneizatu ondoren, RNA bihotzeko ataletatik isolatu zen Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 fabrikatzailearen protokoloaren arabera.RNAsec liburutegiaren prestaketa, sekuentziazioa eta datuen analisia honela egin ziren:
Lagin bakoitzeko 1 μg RNA erabili zen abiapuntu gisa RNA liburutegia prestatzeko.Sekuentziazio liburutegiak Illuminarako NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit (NEB, AEB) erabiliz sortu ziren fabrikatzailearen gomendioei jarraituz, eta indize kodeak gehitu zitzaizkien lagin bakoitzaren atributu-sekuentziari.Laburbilduz, mRNA RNA osotik araztu zen poli-T oligonukleotidoekin lotutako ale magnetikoak erabiliz.Fragmentazioa tenperatura altuan katioi dibalenteak erabiliz egiten da NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer-en (5X).Lehen katearen cDNA ausazko hexamer primer eta M-MuLV alderantzizko transkriptasa (RNase H-) erabiliz sintetizatu zen.Ondoren, cDNA bigarren katea sintetizatzen da ADN polimerasa I eta RNasa H erabiliz. Gainerako gainazaleak mutur kamuts bihurtzen dira exonukleasa/polimerasa jardueraren bidez.DNA zatiaren 3′ muturra adenilatu ondoren, ile-begizta-egitura duen NEBNext Egokigailu bat lotzen zaio hibridaziorako prestatzeko.150-200 bp-ko luzera hobetsia duten cDNA zatiak aukeratzeko.liburutegiko zatiak AMPure XP sistema erabiliz araztu ziren (Beckman Coulter, Beverly, AEB).Ondoren, 3 μl USER Enzyme (NEB, AEB) moldagailu batekin ligatutako cDNA tamainaz aukeratutako 15 minutuz erabili zen 37 °C-tan eta gero 5 minutuz 95 °C-tan PCR baino lehen.Ondoren, PCR Phusion High-Fidelity DNA polimerasa, PCR primer unibertsalak eta Index (X) abiarazleak erabiliz egin zen.Azkenik, PCR produktuak araztu ziren (AMPure XP sistema) eta liburutegiaren kalitatea ebaluatu zen Agilent Bioanalyzer 2100 sistema batean.Ondoren cDNA liburutegia sekuentziatu zen Novaseq sekuentziatzaile bat erabiliz.Illumina-ren irudi gordinaren fitxategiak irakurketa gordinetara bihurtu ziren CASAVA Base Calling erabiliz.Datu gordinak irakurtzeko sekuentziak eta dagozkien oinarri-kalitateak dituzten FASTQ(fq) formatuko fitxategietan gordetzen dira.Hautatu HISAT2 iragazitako sekuentziazio-irakurketak Sscrofa11.1 erreferentziako genomarekin lotzeko.Oro har, HISAT2-k edozein tamainatako genomak onartzen ditu, 4.000 milioi base baino gehiagoko genomak barne, eta parametro gehienetarako balio lehenetsiak ezartzen dira.RNA Seq datuen irakurketak modu eraginkorrean lerrokatu daitezke HISAT2 erabiliz, gaur egun dagoen sistemarik azkarrena, beste edozein metodo baino zehaztasun berdinarekin edo hobearekin.
Transkripzioen ugaritasunak zuzenean islatzen du geneen adierazpen maila.Genearen adierazpen-mailak genomarekin edo exoiekin lotutako transkripzioen (sekuentziazio-zenbaketa) ugaritasunaren arabera ebaluatzen dira.Irakurketa-kopurua gene-adierazpen-mailen, genearen luzeraren eta sekuentziazioaren sakoneraren proportzionala da.FPKM (milioi oinarri-pare bakoitzeko sekuentziatutako transkripzioko mila oinarri-pare bakoitzeko zatiak) kalkulatu ziren eta adierazpen diferentzialaren P balioak zehaztu ziren DESeq2 paketearen bidez.Ondoren, P balio bakoitzerako aurkikuntza faltsuaren tasa (FDR) kalkulatu dugu Benjamini-Hochberg metodoa9 erabiliz, integratutako R-funtzioan oinarritutako "p.adjust".
Bihotzeko ataletatik isolatutako RNA cDNA bihurtu zen 200 ng/μl-ko kontzentrazioan Thermo-ko SuperScript IV Vilo Master mixa erabiliz (Thermo, 11756050 kat. zk.).RT-PCR kuantitatiboa egin da Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384 putzuko erreakzio plaka gardena (Thermo, 4483319 kat. zk.) eta mikroamp itsasgarri optikoa (Thermo, 4311971 kat. zk.) erabiliz.Erreakzio-nahasketa 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat # 4444557), 0,5 µl Taqman Primer eta 3,5 µl H2O putzu bakoitzeko nahasten ziren.qPCR ziklo estandarrak egin ziren eta CT balioak neurtu ziren Applied Biosystems Quantstudio 5 denbora errealeko PCR tresna erabiliz (384 putzu modulua; produktu # A28135).Taqman lehengaiak Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss068680_m1), (Ss06900188_m1), (Ss06900188_m1), (Ss06900188_m1), (Ss06900188_m1), PKDCC (Ss06903874_m1) GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) CT lagin guztientzat normalizatu ziren.
NT-ProBNPren komunikabideen oharra NT-ProBNP kit (txerria) erabiliz (Kat. zk. MBS2086979, MyBioSource) fabrikatzailearen protokoloaren arabera ebaluatu zen.Laburbilduz, lagin eta estandar bakoitzeko 250 µl gehitu ziren bikoiztuta putzu bakoitzean.Lagina gehitu eta berehala, gehitu 50 µl A saiakera erreaktiboa putzu bakoitzean.Astindu astiro-astiro plaka eta zigilatu zigilatzailearekin.Ondoren, pilulak 37 °C-tan inkubatu ziren ordubetez.Ondoren, aspiratu disoluzioa eta garbitu hobiak 4 aldiz 350 µl 1X garbiketa-disoluzioarekin, garbiketa-soluzioa 1-2 minutuz inkubatuz.Ondoren, gehitu 100 µl Assay B erreaktiboa putzu bakoitzeko eta itxi plaka zigilatzailearekin.Tableta astiro-astiro astindu eta 37 °C-tan inkubatu zen 30 minutuz.Aspiratu disoluzioa eta garbitu putzuak 5 aldiz 350 µl 1X garbiketa-disoluzioarekin.Gehitu 90 µl substratu-soluzio putzu bakoitzean eta itxi plaka.Inkubatu plaka 37 °C-tan 10-20 minutuz.Gehitu 50 µl Stop soluzioa putzu bakoitzean.Plaka berehala neurtu zen 450 nm-an ezarritako Cytation (BioTek) plaka irakurgailua erabiliz.
Potentzia-analisiak egin dira, % 80ko potentzia emango duten taldeen tamainak aukeratzeko, parametroan % 10eko aldaketa absolutua detektatzeko I motako errore-tasa % 5 batekin. Potentzia-analisiak egin dira, % 80ko potentzia emango duten taldeen tamainak aukeratzeko, parametroan % 10eko aldaketa absolutua detektatzeko I motako errore-tasa % 5 batekin. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >% 80 мощноя ти 1 бора размеров групп солютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Potentzia-analisia egin da % 80ko potentzia emango luketen taldeen tamainak hautatzeko, % 10eko parametro aldaketa absolutua % 5 I motako errore-tasa batekin detektatzeko.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5选化和5％的垯和5％的炯玥检测参数中10％绝对变化和5提供进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5选化和5％的垯和5％的炯玥检测参数中10％绝对变化和5提供 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% моснощ% 1 бора группы абсолютного изменения параметров eta % 5 частоты ошибок типа I. Potentzia-analisi bat egin zen talde-tamaina hautatzeko, % 80ko potentzia emango lukeen parametroen aldaketa absolutua % 10 eta I motako errore-tasa % 5 detektatzeko.Ehun-atalak ausaz hautatu ziren esperimentua baino lehen.Azterketa guztiak baldintza itsuak ziren eta laginak datu guztiak aztertu ondoren soilik deskodetu ziren.GraphPad Prism softwarea (San Diego, CA) erabili zen analisi estatistiko guztiak egiteko. Estatistika guztietarako, p-balioak esanguratsutzat jo ziren <0,05 balioetan. Estatistika guztietarako, p-balioak esanguratsutzat jo ziren <0.05 balioetan. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Estatistika guztietarako, p-balioak esanguratsutzat jo ziren <0.05 balioetan.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Estatistika guztietarako, p-balioak esanguratsutzat jo ziren <0.05 balioetan.Bi isatseko Student-en t-testa datuetan egin zen 2 konparaziorekin soilik.Norabide bakarreko edo bi norabideko ANOVA erabili zen talde anitzen arteko esangura zehazteko.Post hoc probak egiterakoan, Tukeyren zuzenketa aplikatu zen konparazio anitz egiteko.RNAsec-ek datu estatistiko bereziak ditu FDR eta p.doitu kalkulatzerakoan Metodoak atalean deskribatzen den moduan.
Ikerketaren diseinuari buruzko informazio gehiago lortzeko, ikusi artikulu honi lotutako Nature Research Report laburpena.