Eskerrik asko Nature.com bisitatzeagatik. Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSS laguntza mugatua du. Esperientzia onena lortzeko, arakatzaile eguneratua erabiltzea gomendatzen dizugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desgaitzea). Bitartean, laguntza jarraitua bermatzeko, gunea estilo eta JavaScript gabe errendatuko dugu.
Bihotzaren ingurune fisiologikoa zehatz-mehatz erreproduzitu dezakeen in vitro sistema fidagarri baten beharra dago, sendagaien probak egiteko. Gizakien bihotzeko ehunen kultura-sistemen eskuragarritasun mugatuak bihotzeko sendagaien efektuen interpretazio okerrak ekarri ditu. Hemen, bihotzeko ehunen kultura-eredu bat (CTCM) garatu dugu, bihotz-xerra elektromekanikoki estimulatzen dituena eta bihotz-zikloaren fase sistoliko eta diastolikoetan luzapen fisiologikoa jasaten duena. 12 eguneko kultura-egunaren ondoren, ikuspegi honek bihotz-zatietan bideragarritasuna hobetu zuen partzialki, baina ez zuen haien egitura-osotasuna guztiz mantendu. Beraz, molekula txikien baheketaren ondoren, ikusi genuen 100 nM triiodotironina (T3) eta 1 μM dexametasona (Dex) gure inguruneari gehitzeak sekzioen mikroegitura 12 egunez mantendu zuela. T3/Dex tratamenduarekin konbinatuta, CTCM sistemak transkripzio-profilak, bideragarritasuna, jarduera metabolikoa eta egitura-osotasuna bihotz-ehun freskoaren maila berean mantendu zituen 12 egunez. Gainera, ehun kardiakoaren gehiegizko luzapenak bihotzeko seinaleztapen hipertrofikoa eragiten du, eta horrek frogatzen du CTCM-k bihotzeko luzapenak eragindako baldintza hipertrofikoak imitatzeko duen gaitasuna. Ondorioz, CTCM-k bihotzaren fisiologia eta patofisiologia modelatu dezake kulturan denbora luzez, eta horrek sendagaien baheketa fidagarria ahalbidetzen du.
Ikerketa klinikoa egin aurretik, in vitro sistema fidagarriak behar dira, giza bihotzaren ingurune fisiologikoa zehatz-mehatz erreproduzitu dezaketenak. Sistema horiek luzapen mekaniko aldatua, bihotz-maiztasuna eta propietate elektrofisiologikoak imitatu beharko lituzkete. Animalia-ereduak normalean erabiltzen dira bihotzeko fisiologiarako bahetze-plataforma gisa, baina fidagarritasun mugatua dute sendagaiek giza bihotzean dituzten efektuak islatzeko orduan1,2. Azken finean, Bihotzeko Ehunen Kultura Esperimentaleko Eredu Ideala (CTCM) oso sentikorra eta espezifikoa den eredua da hainbat esku-hartze terapeutiko eta farmakologikotarako, giza bihotzaren fisiologia eta patofisiologia zehatz-mehatz erreproduzitzen duena3. Sistema horren faltak bihotz-gutxiegitasunerako tratamendu berrien aurkikuntza mugatzen du4,5, eta sendagaien kardiotoxikotasuna merkatutik irteteko arrazoi nagusietako bat izan da6.
Azken hamarkadan, zortzi botika ez-kardiobaskular kendu dira erabilera klinikotik, QT tartearen luzapena eragiten dutelako, bentrikuluetako arritmiak eta bat-bateko heriotza eraginez7. Beraz, gero eta behar handiagoa dago eraginkortasun eta toxikotasun kardiobaskularra ebaluatzeko baheketa preklinikoko estrategia fidagarrien erabilera. Gizakiak eragindako zelula ama pluripotenteetatik eratorritako kardiomiozitoen (hiPS-CM) erabilera berriak botiken baheketan eta toxikotasun probetan irtenbide partziala eskaintzen dio arazo honi. Hala ere, hiPS-CM-en izaera heldugabea eta bihotzeko ehunaren konplexutasun multizelularrik eza metodo honen muga nagusiak dira. Azken ikerketek erakutsi dute muga hori neurri batean gainditu daitekeela hiPS-CM goiztiarra erabiliz bihotzeko ehunaren hidrogelak sortzeko, uzkurdura espontaneoak hasi eta gutxira, eta denboran zehar estimulazio elektrikoa pixkanaka handituz. Hala ere, hiPS-CM mikroehun hauek ez dituzte helduen miokardioaren propietate elektrofisiologiko eta uzkurgarri helduak. Gainera, gizakien bihotzeko ehunak egitura konplexuagoa du, zelula mota desberdinen nahasketa heterogeneo batez osatua, zelula endotelialak, neuronak eta fibroblasto estromalak barne, matrize estrazelularreko proteinen multzo espezifikoek elkarri lotuta. Ugaztun helduen bihotzean kardiomiozito ez diren populazioen heterogeneotasun hau11,12,13 oztopo handia da zelula mota indibidualak erabiliz bihotzeko ehuna modelatzeko. Muga nagusi hauek azpimarratzen dute miokardioko ehun osoa baldintza fisiologiko eta patologikoetan hazteko metodoak garatzearen garrantzia.
Giza bihotzaren hazitako sekzio meheak (300 µm) gizakiaren miokardio osoaren eredu itxaropentsua direla frogatu da. Metodo honek giza bihotzeko ehunaren antzeko 3D sistema multizelular oso baterako sarbidea ematen du. Hala ere, 2019ra arte, hazitako bihotz-sekzioen erabilera mugatua zen kulturaren biziraupen laburragatik (24 ordu). Hori hainbat faktoreren ondorioz gertatzen da, besteak beste, luzapen fisiko-mekaniko falta, aire-likido interfazea eta bihotzeko ehunaren beharrak asetzen ez dituzten medio sinpleen erabilera. 2019an, hainbat ikerketa-taldek frogatu zuten faktore mekanikoak bihotzeko ehunen kultura-sistemetan sartzeak kultura-bizitza luzatu, bihotz-adierazpena hobetu eta bihotzeko patologia imitatu dezakeela. Bi ikerketa dotorek 17 eta 18 erakusten dute karga mekaniko uniaxialak eragin positiboa duela bihotzeko fenotipoan kulturan zehar. Hala ere, ikerketa hauek ez zuten erabili bihotzeko zikloaren hiru dimentsioko karga fisiko-mekaniko dinamikoa, bihotz-sekzioei indar tentsio isometrikoak 17 edo karga auxotoniko lineala 18 kargatzen zitzaielako. Ehunen luzatze-metodo hauek bihotzeko gene askoren ezabapena edo luzatze-erantzun anormalekin lotutako geneen gehiegizko adierazpena eragin zuten. Aipagarria da Pitoulis et al. 19 bihotz-xerra-kultura-bainu dinamiko bat garatu zutela bihotz-zikloaren berreraikuntzarako, indar-transduktorearen feedbacka eta tentsio-bulkadak erabiliz. Sistema honek in vitro bihotzeko zikloaren modelizazio zehatzagoa ahalbidetzen badu ere, metodoaren konplexutasunak eta errendimendu txikiak sistema honen aplikazioa mugatzen dute. Gure laborategiak duela gutxi kultura-sistema sinplifikatu bat garatu du estimulazio elektrikoa eta medio optimizatu bat erabiliz, txerri- eta giza bihotz-ehunen atalen bideragarritasuna 6 egunez mantentzeko20,21.
Eskuizkribu honetan, txerri-bihotzaren atalak erabiltzen dituen bihotz-ehunen kultura-eredu bat (CTCM) deskribatzen dugu, eta seinale humoralak barneratzen ditu bihotz-zikloan zehar hiru dimentsioko bihotz-fisiologia eta distentsio patofisiologikoa laburbiltzeko. CTCM honek sendagai preklinikoen iragarpenaren zehaztasuna inoiz lortu ez den mailara handitu dezake, ugaztunen bihotzaren fisiologia/patologia imitatzen duen kostu-eraginkorra den erdi-errendimenduko bihotz-sistema bat eskainiz sendagai preklinikoen probak egiteko.
Seinale mekaniko hemodinamikoek funtsezko zeregina dute kardiomiozitoen funtzioa in vitro mantentzeko 22,23,24. Eskuizkribu honetan, CTCM bat (1a irudia) garatu dugu, helduen bihotzeko ingurunea imitatu dezakeena, maiztasun fisiologikoetan (1,2 Hz, 72 taupada minutuko) estimulazio elektrikoa eta mekanikoa eraginez. Diastolean ehunen gehiegizko luzapena saihesteko, 3D inprimaketa-gailu bat erabili zen ehunen tamaina % 25 handitzeko (1b irudia). C-PACE sistemak eragindako taupada elektrikoa sistolea baino 100 ms lehenago hasteko denboratu zen, datuak eskuratzeko sistema bat erabiliz, bihotzeko zikloa guztiz erreproduzitzeko. Ehunen kultura-sistemak aktuadore pneumatiko programagarri bat erabiltzen du (LB Engineering, Alemania) silikonazko mintz malgu bat ziklikoki zabaltzeko, bihotz-xerren hedapena eragiteko goiko ganberan. Sistema kanpoko aire-hodi batera konektatuta zegoen presio-transduktore baten bidez, eta horrek presioa (± 1 mmHg) eta denbora (± 1 ms) zehaztasunez doitzea ahalbidetu zuen (1c irudia).
a Lotu ehun-atala 7 mm-ko euskarri-eraztunari, urdinez erakusten dena, gailuaren kultura-ganberaren barruan. Kultura-ganbera aire-ganberatik silikonazko mintz mehe eta malgu batek bereizten du. Jarri junta bat ganbera bakoitzaren artean ihesak saihesteko. Gailuaren estalkiak estimulazio elektrikoa ematen duten grafitozko elektrodoak ditu. b Ehun-gailu handiaren, gida-eraztunaren eta euskarri-eraztunaren irudikapen eskematikoa. Ehun-atalak (marroiak) tamaina handiko gailuan jartzen dira, gida-eraztuna gailuaren kanpoko ertzean dagoen ildoan jarrita. Gida erabiliz, jarri kontu handiz ehun-akriliko itsasgarriz estalitako euskarri-eraztuna bihotz-ehunaren atalaren gainean. c Estimulazio elektrikoaren denbora erakusten duen grafikoa, aktuadore pneumatiko programagarri batek (PPD) kontrolatutako aire-ganberaren presioaren arabera. Datuak eskuratzeko gailu bat erabili zen estimulazio elektrikoa sinkronizatzeko presio-sentsoreak erabiliz. Kultura-ganberako presioa ezarritako atalasea iristen denean, pultsu-seinale bat bidaltzen zaio C-PACE-EM-ri estimulazio elektrikoa abiarazteko. d Inkubagailu-apal batean jarritako lau CTCMren irudia. Lau gailu PPD batera konektatuta daude zirkuitu pneumatiko baten bidez, eta presio-sentsoreak balbula hemostatikoan sartzen dira zirkuitu pneumatikoko presioa kontrolatzeko. Gailu bakoitzak sei ehun-atal ditu.
Aktuadore pneumatiko bakarra erabiliz, 4 CTCM gailu kontrolatu ahal izan genituen, eta bakoitzak 6 ehun-atal eduki zitzakeen (1d irudia). CTCM-n, aire-ganberako aire-presioa fluido-ganberan presio sinkrono bihurtzen da eta bihotz-xerraren hedapen fisiologikoa eragiten du (2a irudia eta 1. osagarriko bideoa). Ehunen luzapenaren ebaluazioak 80 mm Hg-tan. Art.-ek ehunen atalen % 25eko luzapena erakutsi zuen (2b irudia). Ehunen luzapen ehuneko honek 2,2-2,3 µm-ko sarkomero-luzera fisiologiko bati dagokiola frogatu da bihotz-atalaren uzkurdura normalarentzat17,19,25. Ehunen mugimendua kameraren ezarpen pertsonalizatuak erabiliz ebaluatu zen (1. osagarriko irudia). Ehunen mugimenduaren anplitudea eta abiadura (2c eta d irudiak) bihotz-zikloan zeharreko luzapenari eta sistole eta diastolean zeharreko denborari zegozkien (2b irudia). Bihotzeko ehunaren luzapena eta abiadura uzkurdura eta erlaxazioan konstante mantendu ziren 12 egunez kulturan (2f irudia). Estimulazio elektrikoak kultura-prozesuan uzkurduran duen eragina ebaluatzeko, itzaldura-algoritmo bat erabiliz deformazio aktiboa zehazteko metodo bat garatu genuen (2a eta 2b irudi osagarriak) eta estimulazio elektrikoarekin eta gabe dauden deformazioak bereizteko gai izan ginen. Bihotzaren atal bera (2f irudia). Ebakiaren eskualde mugikorrean (R6-9), estimulazio elektrikoan zeharreko tentsioa % 20 handiagoa izan zen estimulazio elektrikorik gabe baino, eta horrek estimulazio elektrikoak uzkurdura-funtzioari egiten dion ekarpena adierazten du.
Aire-ganberaren presioaren, fluido-ganberaren presioaren eta ehunen mugimenduaren neurketen arrasto adierazgarriek baieztatzen dute ganberaren presioak fluido-ganberaren presioa aldatzen duela, ehun-xerraren mugimendu dagokiona eraginez. b Ehun-sekzioen ehuneko luzapenaren arrasto adierazgarriak (urdina), luzapen ehunekoari dagozkionak (laranja). c Bihotzeko xerraren mugimendu neurtua mugimendu-abiadura neurtuarekin bat dator. (d) Bihotzaren xerra batean mugimendu ziklikoaren (lerro urdina) eta abiaduraren (lerro puntu laranja) ibilbide adierazgarriak. e Ziklo-denboraren kuantifikazioa (n = 19 xerra talde bakoitzeko, txerri desberdinetatik), uzkurdura-denboraren (n = 19 xerra talde bakoitzeko), erlaxazio-denboraren (n = 19 xerra talde bakoitzeko, txerri desberdinetatik), ehunen mugimenduaren (n = 25 xerra/talde/txerri desberdinetatik), abiadura sistoliko maximoa (n = 24(D0), 25(D12) xerra/talde/txerri desberdinetatik) eta erlaxazio-tasa maximoa (n=24(D0), 25(D12) xerra/talde/txerri desberdinetatik). Bi aldeetako Student-en t probak ez zuen parametro bakar batean ere alde esanguratsurik erakutsi. f Ehun-sekzioen tentsio-analisi adierazgarriak, estimulazio elektrikoa duten (gorria) eta estimulaziorik gabeko (urdina), sekzio bereko ehun-sekzioen hamar eskualde. Beheko panelek ehun-sekzioetan estimulazio elektrikoa duten eta gabeko ehun-sekzioetan tentsioaren ehuneko-diferentziaren kuantifikazioa erakusten dute, sekzio ezberdinetako hamar eremutan. (n = 8 xerra/talde txerri ezberdinetatik, Bi isatseko Student t-testa egin da; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 xerra/talde txerri ezberdinetatik, Bi isatseko Student t-testa egin da; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; *****p<0,1, **p<0,00,
Aurreko bihotz-xerra estatiko biomimetikoen hazkuntza-sisteman [20, 21], bihotz-xerren bideragarritasuna, funtzioa eta egitura-osotasuna mantendu genituen 6 egunez estimulazio elektrikoa aplikatuz eta medioaren konposizioa optimizatuz. Hala ere, 10 egun igaro ondoren, zifra horiek nabarmen jaitsi ziren. Aurreko biomimetikoen hazkuntza-sistema estatiko 20, 21 kontrol-baldintzetan (Ctrl) hazitako atalak aipatuko ditugu eta aurretik optimizatutako medioa MC baldintza gisa erabiliko dugu eta aldibereko estimulazio mekaniko eta elektrikopean (CTCM) hazkuntza egingo dugu. deiturikoa . Lehenik eta behin, zehaztu genuen estimulazio elektrikorik gabeko estimulazio mekanikoa ez zela nahikoa ehunen bideragarritasuna 6 egunez mantentzeko (3a,b irudi osagarria). Interesgarria da, STCM erabiliz estimulazio fisio-mekanikoa eta elektrikoa sartu ondoren, 12 eguneko bihotz-sekzioen bideragarritasuna MS baldintzetan bihotz-sekzio freskoetan bezalakoa izan zela, baina ez Ctrl baldintzetan, MTT analisiak erakusten duen bezala (1. irudia). 3a). Horrek iradokitzen du estimulazio mekanikoak eta bihotz-zikloaren simulazioak ehunen sekzioak bideragarri mantendu ditzakeela gure aurreko hazkuntza-sistema estatikoan jakinarazitakoaren bikoitza denboran. Hala ere, ehun-sekzioen egitura-osotasuna ebaluatzeak, bihotzeko troponina T eta konexina 43 immunomarkaketaren bidez, erakutsi zuen konexina 43 adierazpena nabarmen handiagoa zela MC ehunetan 12. egunean, egun berean kontrol-taldeetan baino. Hala ere, konexina 43 adierazpen uniformea eta Z-diskoen eraketa ez ziren guztiz mantendu (3b irudia). Adimen artifizialeko (AA) esparru bat erabiltzen dugu ehunen egitura-osotasuna kuantifikatzeko26, troponina-T eta konexina tindaketan oinarritutako irudietan oinarritutako ikaskuntza sakoneko hodi bat43 bihotz-xerren egitura-osotasuna eta fluoreszentzia automatikoki kuantifikatzeko, lokalizazio-indarraren arabera. Metodo honek Sare Neuronal Konboluzional bat (CNN) eta ikaskuntza sakoneko esparru bat erabiltzen ditu bihotzeko ehunaren egitura-osotasuna modu automatizatu eta alboragabean kuantifikatzeko, erreferentzian deskribatzen den bezala.26. MC ehunak egitura-antzekotasun hobea erakutsi zuen 0 egunarekin alderatuta, kontrol-sekzio estatikoekin alderatuta. Gainera, Massonen trikromo-tindaketak fibrosi ehuneko nabarmen txikiagoa erakutsi zuen MS baldintzetan, kulturaren 12. egunean kontrol-baldintzekin alderatuta (3c irudia). CTCM-k bihotz-ehunaren atalen bideragarritasuna 12. egunean bihotz-ehun freskoaren antzeko mailara handitu zuen arren, ez zuen bihotz-atalen egitura-osotasuna nabarmen hobetu.
Barra-grafiko batek bihotz-xerra freskoen (D0) edo bihotz-xerren kultiboen MTT bideragarritasunaren kuantifikazioa erakusten du, kultibo estatikoan (D12 Ctrl) edo CTCM-n (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) xerra/talde txerri ezberdinetatik, ANOVA proba norabide bakarrean eginda; ####p < 0,0001 D0-rekin alderatuta eta **p < 0,01 D12 Ctrl-rekin alderatuta). Barra-grafiko batek bihotz-xerra freskoen (D0) edo bihotz-xerren kultiboen 12 egunez MTT bideragarritasunaren kuantifikazioa erakusten du, kultibo estatikoan (D12 Ctrl) edo CTCM-n (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) xerra/talde txerri ezberdinetatik, ANOVA proba norabide bakarrean eginda; ####p < 0,0001 D0-rekin alderatuta eta **p < 0,01 D12 Ctrl-rekin alderatuta).Histogramak MTT bihotz-sekzio freskoen (D0) edo bihotz-sekzioen kultibazioaren kuantifikazioa erakusten du, bai kultura estatikoan (D12 kontrola) bai CTCMn (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrola). ) , txerri ezberdinetako 12 (D12 MC) sekzio/talde, ANOVA proba unidirekzionala egiten da;####p < 0,0001 по сравнению с D0 eta **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 D0-rekin alderatuta eta **p < 0,01 D12 Ctrl-rekin alderatuta). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组葌啛啛化，ANOVA测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.00rlD12相比，**p。)MTT bideragarritasunaren kuantifikazioa erakusten duen histograma bihotz-sekzio freskoetan (D0) edo 12 egunez kultura estatikoan (D12 kontrola) edo CTCMn (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrola)) hazitako bihotz-sekzioetan, txerri ezberdinetako 12 (D12 MC) sekzio/talde, ANOVA proba unidirekzionala;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 D0-rekin alderatuta, **p < 0,01 D12 Ktrl-rekin alderatuta).b Troponina-T (berdea), konexina 43 (gorria) eta DAPI (urdina) bihotzeko atal berri isolatuetan (D0) edo baldintza estatikoetan (Ctrl) edo CTCM baldintzetan (MC) 12 egunez hazitako bihotzeko ataletan (immunofluoreszentzia irudi adierazgarrien eskala hutsa = 100 µm). Bihotzeko ehunaren egitura-osotasunaren kuantifikazio adimen artifiziala (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) xerra/talde txerri desberdinetatik, ANOVA proba unidirekzionala egin da; ####p < 0,0001 D0-rekin alderatuta eta ****p < 0,0001 D12 Ctrl-rekin alderatuta). Bihotzeko ehunaren egitura-osotasunaren kuantifikazio adimen artifiziala (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) xerra/talde txerri desberdinetatik, ANOVA proba unidirekzionala egin da; ####p < 0,0001 D0-rekin alderatuta eta ****p < 0,0001 D12 Ctrl-rekin alderatuta). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (D1), Количной ткани искусственным интеллектом (n = 5) (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA ####p < 0,0001 по сни сра в сно сра; 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Bihotzeko ehunaren egitura-osotasunaren kuantifikazioa adimen artifizialaren bidez (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) atal/talde txerri ezberdinetatik, ANOVA proba unidirekzionala eginda; ####p < 0,0001 D0-rekin eta ****p < 0,0001 D12 Ctrl-rekin alderatuta).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) xerra/talde bakoitza txerri desberdinetako bakoitza, norabide bakarreko ANOVA proba <1#0#0#0p0;相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) xerra/talde bakoitza txerri ezberdinetako bakoitza, norabide bakarreko ANOVA proba <10###0#0;与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной тка7н (D12), =77нl (D12), (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001 vs. сравнению с D12 Ctrl). Adimen artifiziala bihotzeko ehunaren egitura-osotasuna kuantifikatzeko (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) atal/talde txerri desberdin bakoitzeko, noranzko bakarreko ANOVA testa; ####p<0.0001 vs .D0 Alderatzeko ****p < 0.0001 D12 Ctrl-rekin alderatuta). c Masson-en trikromozko tindaketarekin tindatutako bihotz-xerren irudi adierazgarriak (ezkerrean) eta kuantifikazioa (eskuinean) (Eskala hutsa = 500 µm) (n = 10 xerra/talde bakoitza txerri ezberdinetik, ANOVA proba unidirekzionala egin da; ####p < 0,0001 D0-rekin alderatuta eta ***p < 0,001 D12 Ctrl-rekin alderatuta). c Masson-en trikromozko tindaketarekin tindatutako bihotz-xerren irudi adierazgarriak (ezkerrean) eta kuantifikazioa (eskuinean) (Eskala hutsa = 500 µm) (n = 10 xerra/talde bakoitzeko txerri desberdinetatik, ANOVA proba unidirekzionala egin da; #### p < 0,0001 D0-rekin alderatuta eta ***p < 0,001 D12 Ctrl-rekin alderatuta). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрезнаш трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разнынх разниным выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по; сравнению с D12 Ctrl). c Masson-en trikromozko tindaketarekin tindatutako bihotz-atalen irudi adierazgarriak (ezkerrean) eta kuantifikazioa (eskuinean) (estaldurarik gabeko eskala = 500 µm) (n = 10 atal/talde txerri ezberdinetatik, ANOVA proba unidirekzionala eginda; #### p < 0,0001 D0-rekin alderatuta eta ***p < 0,001 D12 Ctrl-rekin alderatuta). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺（裸尺）（右）（裸尺（10µ=m=（裸尺）个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比 相比 ，D1 测试；相比）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 尺度 尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 切片 向 向### 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) eta количественный анализ (справа) срезов сердца, окрезов сердцашественный анализ (справа) трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой другой протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Masson-en trikromozko tindaketarekin tindatutako bihotz-atalen irudi adierazgarriak (ezkerrean) eta kuantifikazioa (eskuinean) (hutsune = 500 µm) (n = 10 atal/talde, bakoitza txerri desberdin batetik, bariantzaren analisi unidirekzionalaren bidez probatua ;### # p < 0,0001 D0-rekin alderatuta, ***p < 0,001 D12 Ctrl-rekin alderatuta).Errore-barrek batez bestekoa ± desbideratze estandarra adierazten dute.
Hipotesi bat egin genuen: molekula txikiak hazkuntza-ingurunera gehituz, kardiomiozitoen osotasuna hobetu eta fibrosiaren garapena murriztu zitekeela CTCM hazkuntzan zehar. Beraz, molekula txikiak aztertu genituen gure kontrol-kultura estatikoak erabiliz20,21, nahasteko faktore gutxi zeudelako. Dexametasona (Dex), triiodotironina (T3) eta SB431542 (SB) aukeratu ziren baheketa honetarako. Molekula txiki hauek lehenago erabili izan dira hiPSC-CM kulturetan kardiomiozitoen heltzea eragiteko, sarkomeroaren luzera, T-tubuluak eta eroapen-abiadura handituz. Gainera, bai Dex-ek (glukokortikoide bat) bai SB-k hantura murrizten dutela ezagutzen da29,30. Beraz, molekula txiki hauen konbinazio bat edo bat sartzeak bihotz-atalen egitura-osotasuna hobetuko lukeen aztertu genuen. Hasierako baheketarako, konposatu bakoitzaren dosia hautatu zen zelula-kultura-ereduetan erabili ohi diren kontzentrazioetan oinarrituta (1 μM Dex27, 100 nM T327 eta 2,5 μM SB31). 12 eguneko kulturaren ondoren, T3 eta Dex konbinazioak kardiomiozitoen egitura-osotasun optimoa eta zuntz-birmoldaketa minimoa lortu zituen (4. eta 5. irudi osagarriak). Gainera, T3 eta Dex kontzentrazio horien bikoitza edo bikoitza erabiltzeak efektu kaltegarriak sortu zituen kontzentrazio normalekin alderatuta (6a eta 6b irudi osagarriak).
Hasierako baheketaren ondoren, 4 hazkuntza-baldintzen buruz buruko konparaketa egin genuen (4a irudia): Ctrl: aurretik deskribatutako hazkuntza estatikoan hazitako bihotz-sekzioek gure ingurune optimizatua erabiliz; 20.21 TD: T3 eta Ctrl s Dex gehituta asteazkenean; MC: aurretik optimizatutako hazkuntza-sekzioek CTCM-n hazitako bihotz-sekzioek gure ingurune optimizatua erabiliz; eta MT: T3 eta Dex inguruneari gehitutako CTCM. 12 eguneko hazkuntza-egunen ondoren, MS eta MT ehunen bideragarritasuna MTT analisi bidez ebaluatutako ehun freskoetan bezalakoa izan zen (4b irudia). Interesgarria da, T3 eta Dex transwell kulturei (TD) gehitzeak ez zuela bideragarritasunean hobekuntza nabarmenik ekarri Ctrl baldintzekin alderatuta, eta horrek adierazten du estimulazio mekanikoak zeregin garrantzitsua duela bihotz-sekzioen bideragarritasuna mantentzeko.
12 egunez hazkuntza-ingurunean estimulazio mekanikoaren eta T3/Dex osagarriaren efektuak ebaluatzeko erabilitako lau hazkuntza-baldintzak erakusten dituen esperimentu-diseinu diagrama. b Barra-grafikoak bideragarritasunaren kuantifikazioa erakusten du hazkuntza egin eta 12 egunera, 4 hazkuntza-baldintzetan (Ctrl, TD, MC eta MT), bihotz-xerra freskoekin alderatuta (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD eta D12 MT), 12 (D12 MC) xerra/talde txerri desberdinetatik, ANOVA proba unidirekzionala eginda; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 D0-rekin alderatuta eta **p < 0,01 D12 Ctrl-rekin alderatuta). b Barra-grafikoak bideragarritasunaren kuantifikazioa erakusten du 4 hazkuntza-baldintzetan (Ctrl, TD, MC eta MT) hazkuntza egin eta 12 egunera, bihotz-xerra freskoekin alderatuta (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD eta D12 MT), 12 (D12 MC) xerra/talde txerri desberdinetatik, ANOVA proba unidirekzionala eginda; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 D0-rekin alderatuta eta **p < 0,01 D12 ctrl-rekin alderatuta). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней посленку кулрьта кулрез всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC eta MT) по сравнению со свежими срезами срезами серезами серезами серодц1 (D1) (D1) (D1) (D12 Ctrl, D12 TD eta D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 eta **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Barra-grafikoak bideragarritasunaren kuantifikazioa erakusten du hazkuntza egin eta 12 egunera, 4 hazkuntza-baldintzetan (kontrola, TD, MC eta MT), bihotz-sekzio freskoekin (D0) alderatuta (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD eta D12 MT), 12 (D12 MC) sekzio/talde txerri desberdinetatik, ANOVA testa norabide bakarrekoa; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 D0-rekin alderatuta eta **p < 0,01 D12 Ctrl-rekin alderatuta). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D150)、D12、D12、D12、 TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，##01，##D01，##01，相比，**p < 0,01 与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнен исве сравнения сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD eta D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, одннос#тороднос#той <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histograma, 4 hazkuntza-baldintzak (kontrola, TD, MC eta MT) erakusten dituena, bihotz-sekzio freskoekin (D0) alderatuta (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD eta D12 MT), txerri desberdinetatik 12 (D12 MC) sekzio/talde, noranzko bakarreko ANOVA testa; ####p<0.0001, ###p<0.001 D0-ren aurka, **p<0.01 D12-ren aurka). c Barra-grafikoak glukosa-fluxuaren kuantifikazioa erakusten du hazkuntza egin eta 12 egunera, 4 hazkuntza-baldintzetan (Ctrl, TD, MC eta MT), bihotz-xerra freskoekin alderatuta (D0) (n = 6 xerra/talde, txerri desberdinetatik, ANOVA proba unidirekzionala egin da; ###p < 0,001, D0-rekin alderatuta eta ***p < 0,001 D12 Ctrl-rekin alderatuta). c Barra-grafikoak glukosa-fluxuaren kuantifikazioa erakusten du hazkuntza egin eta 12 egunera, 4 hazkuntza-baldintzetan (Ctrl, TD, MC eta MT), bihotz-xerra freskoekin alderatuta (D0) (n = 6 xerra/talde, txerri desberdinetatik, ANOVA proba unidirekzionala egin da; ###p < 0,001, D0-rekin alderatuta eta ***p < 0,001 D12 Ctrl-rekin alderatuta). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после кульвтани кульвта 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC eta MT) по сравнению со свежими срезами сердца = (D0 псрению) от разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0 eta ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogramak glukosa-fluxuaren kuantifikazioa erakusten du hazkuntza egin eta 12 egunera, 4 hazkuntza-baldintza guztietan (kontrola, TD, MC eta MT), bihotz-sekzio freskoekin alderatuta (D0) (n = 6 sekzio/talde txerri desberdinetatik, ANOVA proba unidirekzionala eginda; ###p < 0,001 D0-rekin alderatuta eta ***p < 0,001 D12 Ctrl-rekin alderatuta). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 盌柯1％）天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；####p < 0.0.001相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切縇片扇培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， ， ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней послетвиле верез всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC eta MT) по сравнению со свежими срезами сердца = (D60) срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histograma, glukosa-fluxuaren kuantifikazioa erakusten duena hazkuntza egin eta 12 egunera, 4 hazkuntza-baldintza guztietan (kontrola, TD, MC eta MT), bihotz-sekzio freskoekin alderatuta (D0) (n = 6 sekzio/talde, txerri desberdinetatik, aldebakarreko ANOVA probak egin ziren, ###p < 0,001 D0rekin alderatuta, ***p < 0,001 D12rekin alderatuta (kontrola).d Ehun freskoen (urdina), 12. eguneko MC (berdea) eta 12. eguneko MT (gorria) tentsio-analisi grafikoak, hamar eskualde-ehunen sekzio-puntutan (n = 4 xerra/talde, noranzko bakarreko ANOVA testa; ez zegoen alde esanguratsurik taldeen artean). e Sumendi-grafikoa, bihotz-sekzio freskoetan (D0) espresio desberdineko geneak erakusten dituena, baldintza estatikoetan (Ctrl) edo MT baldintzetan (MT) 10-12 egunez landutako bihotz-sekzioekin alderatuta. f Kultura-baldintza bakoitzean landutako bihotz-sekzioetarako sarkomero-genen bero-mapa. Errore-barrek batez bestekoa ± desbideratze estandarra adierazten dute.
Gantz-azidoen oxidaziotik glukolisira igarotzean gertatzen den menpekotasun metabolikoa kardiomiozitoen dediferentziazioaren ezaugarri bat da. Kardiomiozito heldugabeek batez ere glukosa erabiltzen dute ATP ekoizpenerako eta mitokondrio hipoplasikoak dituzte, kristala gutxirekin5,32. Glukosaren erabileraren analisiak erakutsi zuen MC eta MT baldintzetan glukosaren erabilera 0 eguneko ehunen antzekoa zela (4c irudia). Hala ere, Ctrl laginek glukosaren erabilera nabarmen handitu zutela erakutsi zuten ehun freskoarekin alderatuta. Horrek adierazten du CTCM eta T3/Dex konbinazioak ehunen bideragarritasuna hobetzen duela eta 12 eguneko bihotz-sekzio landuen fenotipo metabolikoa mantentzen duela. Gainera, deformazio-analisiak erakutsi zuen deformazio-mailak bihotz-ehun freskoan bezalakoak izan zirela 12 egunez MT eta MS baldintzetan (4d irudia).
CTCM eta T3/Dex-ek bihotzeko ehunaren transkripzio-paisaia globalean duten eragin orokorra aztertzeko, RNAseq egin genuen lau hazkuntza-baldintza desberdinetako bihotzeko xerratan (1. datu osagarria). Interesgarria da, MT sekzioek transkripzio-antzekotasun handia erakutsi zuten bihotzeko ehun freskoarekin, 13.642 geneetatik 16 bakarrik adierazita desberdin. Hala ere, lehenago erakutsi genuen bezala, Ctrl xerratan 1229 gene adierazita desberdin agertu ziren hazkuntzan 10-12 egun igaro ondoren (4e irudia). Datu hauek bihotzeko eta fibroblasto geneen qRT-PCR bidez berretsi ziren (7a-c irudi osagarria). Interesgarria da, Ctrl sekzioek bihotzeko eta ziklo zelularreko geneen beherakada eta hanturazko geneen programen aktibazioa erakutsi zuten. Datu hauek iradokitzen dute desdiferentziazioa, normalean hazkuntza luzearen ondoren gertatzen dena, guztiz ahuldu egiten dela MT baldintzetan (8a eta b irudi osagarria). Sarkomeroen geneen azterketa zainduak erakutsi zuen MT baldintzetan bakarrik kontserbatzen direla sarkomeroa (4f irudia) eta ioi-kanala (9. irudi osagarria) kodetzen dituzten geneak, Ctrl, TD eta MC baldintzetan zapalkuntzatik babestuz. Datu hauek erakusten dute estimulazio mekaniko eta humoralaren (T3/Dex) konbinazio batekin, bihotz-xerra transkriptoma bihotz-xerra freskoen antzekoa izan daitekeela 12 egunez kulturan egon ondoren.
Transkripzio-aurkikuntza hauek babesten dituzte bihotz-ataletako kardiomiozitoen egitura-osotasuna MT baldintzetan hobekien kontserbatzen dela 12 egunez, konexina 43 osorik eta lokalizatuak erakusten duen bezala (5a irudia). Gainera, MT baldintzetan bihotz-ataletako fibrosia nabarmen murriztu zen Ctrl-rekin alderatuta eta bihotz-atal freskoekin antzera (5b irudia). Datu hauek erakusten dute estimulazio mekanikoaren eta T3/Dex tratamenduaren konbinazioak eraginkortasunez kontserbatzen duela bihotz-ataletako egitura kardiakoa kulturan.
a Troponina-T (berdea), konexina 43 (gorria) eta DAPI (urdina) immunofluoreszentzia irudi adierazgarriak bihotzeko atal berrietan (D0) edo bihotzeko atalen lau hazkuntza-baldintzetan 12 egunez hazitakoetan (eskala-barra = 100 µm). Bihotzeko ehunaren egitura-osotasunaren kuantifikazio adimen artifiziala (n = 7 (D0 eta D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC eta D12 MT) xerra/talde txerri ezberdinetatik, ANOVA proba unidirekzionala egin da; ####p < 0,0001 D0-rekin alderatuta eta *p < 0,05, edo ****p < 0,0001 D12 Ctrl-rekin alderatuta). Bihotzeko ehunen egitura-osotasunaren kuantifikazio adimen artifiziala (n = 7 (D0 eta D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC eta D12 MT) xerra/talde txerri ezberdinetatik, ANOVA testa norabide bakarrean eginda; #### p < 0,0001 D0-rekin alderatuta eta *p < 0,05, edo ****p < 0,0001 D12 Ctrl-rekin alderatuta). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного = D01 (D01) Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA <1 п#,#0 p сравнению с D0 eta *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Bihotzeko ehunaren egitura-osotasunaren kuantifikazioa adimen artifiziala erabiliz (n = 7 (D0 eta D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC eta D12 MT) atal/talde txerri ezberdinetatik, ANOVA proba unidirekzionala eginda; #### p < 0,0001 D0-rekin alderatuta eta *p < 0,05 edo ****p < 0,0001 D12 Ctrl-rekin alderatuta).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p （05*p （测试； 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc （12 mc）（d12 mc）人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p ，斌*p < 0.05****p < 0.05 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。Bihotzeko ehunaren egitura-osotasunaren kuantifikazioa adimen artifiziala erabiliz txerri desberdinetan (n = 7 (D0 eta D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC eta D12 MT) sekzio/taldea) ANOVA proba unidirekzional batekin;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 eta *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 D0-rekin alderatuta eta *p < 0,05 edo ****p < 0,0001 D12 Ctrl-rekin alderatuta). b Masson-en trikromozko tindaketarekin tindatutako bihotz-xerren irudi adierazgarriak eta kuantifikazioa (Eskala-barra = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD eta D12 MC), 9 (D12 MT) xerra/talde txerri desberdinetatik, ANOVA proba unidirekzionala egin da; ####p < 0,0001 D0-rekin alderatuta eta ***p < 0,001, edo ****p < 0,0001 D12 Ctrl-rekin alderatuta). b Masson-en trikromozko tindaketarekin tindatutako bihotz-xerren irudi adierazgarriak eta kuantifikazioa (Eskala-barra = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD eta D12 MC), 9 (D12 MT) xerra/talde txerri desberdinetatik, ANOVA proba unidirekzionala egin da; ####p < 0,0001 D0-rekin alderatuta eta ***p < 0,001, edo ****p < 0,0001 D12 Ctrl-rekin alderatuta). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных трашенных траственная оценка срезов сердца Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD eta D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/групапу, срезов/грунхпу, срезов/грунхпу выполняется односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p <; 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Masson-en trikromozko tindaketarekin tindatutako bihotz-atalen irudi adierazgarriak eta kuantifikazioa (eskala-barra = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD eta D12 MC), 9 (D12 MT) atal/talde txerri ezberdinetatik, ANOVA norabide bakarrekoa eginda; ####p < 0,0001 vs. D0 eta ***p < 0,001 edo ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）㼈D12010（D12010 Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单单同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单单同素方#单同猪的9＆#0.#0.#创#0.#单与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm = 500 µmd d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,000p < 0,00 < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных тросонная оценка срезов сердца (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD eta D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свинодипы /-гнудпы способ ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001; по сравнению с D12 Ctrl). b Masson-en trikromoarekin tindatutako bihotz-atalen irudi adierazgarriak eta kuantifikazioa (eskala-barra = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD eta D12 MC), 9 (D12 MT) atal txerri/talde ezberdinetatik, ANOVA metodo bat; ####p < 0,0001 D0-rekin alderatuta, ***p < 0,001 edo ****p < 0,0001 D12 Ctrl-rekin alderatuta).Errore-barrek batez bestekoa ± desbideratze estandarra adierazten dute.
Azkenik, CTCM-k bihotzeko hipertrofia imitatzeko duen gaitasuna ebaluatu zen bihotzeko ehunaren luzapena handituz. CTCM-n, aire-ganberaren presio maximoa 80 mmHg-tik 80 mmHg-ra igo zen. Art. (luzapen normala) 140 mmHg-raino Art. (6a irudia). Honek luzapenaren % 32ko igoerari dagokio (6b irudia), aurretik bihotz-atalek hipertrofian ikusten denaren antzeko sarkomero-luzera lortzeko behar duten luzapen ehuneko gisa erakutsi zena. Bihotzeko ehunaren luzapena eta abiadura uzkurdura eta erlaxazioan konstante mantendu ziren sei eguneko hazkuntza-egunean zehar (6c irudia). MT baldintzetako bihotzeko ehuna luzapen normalaren (MT (Normala)) edo gehiegizko luzapen-baldintzen (MT (OS)) menpe egon zen sei egunez. Lau egun hazkuntzan egon ondoren, NT-ProBNP biomarkatzaile hipertrofikoa nabarmen handitu zen MT (OS) baldintzetako ingurunean, MT (normal) baldintzarekin alderatuta (7a irudia). Gainera, sei eguneko hazkuntzaren ondoren, MT-ko (OS) zelulen tamaina (7b irudia) nabarmen handitu zen MT bihotzeko (normala) sekzioekin alderatuta. Horrez gain, NFATC4 nukleoaren translokazioa nabarmen handitu zen gehiegi luzatutako ehunetan (7c irudia). Emaitza hauek hiperdistentsioaren ondoren birmoldaketa patologikoaren garapen progresiboa erakusten dute eta CTCM gailua luzapenak eragindako bihotzeko hipertrofia seinaleztapena aztertzeko plataforma gisa erabil daitekeela dioen kontzeptua babesten dute.
Aire-ganberaren presioaren, fluido-ganberaren presioaren eta ehunen mugimenduaren neurketen arrasto adierazgarriek baieztatzen dute ganberaren presioak fluido-ganberaren presioa aldatzen duela, ehun-xerraren mugimendu bera eraginez. b Luzaketa-ehuneko eta luzaketa-tasa kurba adierazgarriak normalean luzatutako (laranja) eta gehiegi luzatutako (urdina) ehun-ataletarako. c Barra-grafikoa, ziklo-denbora (n = 19 xerra taldeko, txerri desberdinetatik), uzkurdura-denbora (n = 18-19 xerra taldeko, txerri desberdinetatik), erlaxazio-denbora (n = 19 xerra taldeko, txerri desberdinetatik)), ehunen mugimenduaren anplitudea (n = 14 xerra/talde, txerri desberdinetatik), abiadura sistoliko maximoa (n = 14 xerra/talde, txerri desberdinetatik) eta erlaxazio-tasa maximoa (n = 14 (D0), 15 (D6)) atal/talde) txerri desberdinetatik erakusten duena, bi aldeko Student-en t-probak ez zuen alde esanguratsurik erakutsi parametro batean ere, eta horrek adierazten du parametro hauek konstante mantendu zirela gaintentsioarekin izandako 6 eguneko kultura-prozesuan. Errore-barrek batez bestekoa ± desbideratze estandarra adierazten dute.
NT-ProBNP kontzentrazioaren kuantifikazio barra-grafikoa MT luzapen normalaren (Norm) edo gehiegi luzapenaren (OS) baldintzetan hazitako bihotz-xerren hazkuntza-inguruneetan (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm eta D4 MTOS) xerra/talde txerri desberdinetatik. Bi norabideko ANOVA egin da; **p < 0,01 luzapen normalarekin alderatuta). NT-ProBNP kontzentrazioaren kuantifikazio barra-grafikoa MT luzapen normalaren (Norm) edo gehiegi luzapenaren (OS) baldintzetan hazitako bihotz-xerren hazkuntza-inguruneetan (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm eta D4 MTOS) xerra/talde txerri desberdinetatik. Bi norabideko ANOVA egin da; **p < 0,01 luzapen normalarekin alderatuta).NT-ProBNP kontzentrazioaren histograma kuantitatiboa MT luzapen (norma) edo gehiegi luzapen (OS) baldintzetan (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm eta D4) MTOS) xerra/talde txerri ezberdinetatik hazitako bihotz-xerren hazkuntza-ingurunean, bariantzaren bi faktoreko analisia egin da;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 luzaketa normalarekin alderatuta). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01） a NT-ProBNP kontzentrazioa kuantifikatzea MT luzapen normaletan (Norm) edo gainstretch (OS) baldintzetan (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) baldintza ezberdinetan hazitako bihotz xerretan.猪的切片/组，可以双向方方发发动 ** luzatze normalarekin alderatuta, p < 0,01).NT-ProBNP kontzentrazioen kuantifikazioa histograma MT luzapen (norma) edo gehiegi luzapen (OS) baldintzetan (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) eta D4 MTOS) xerra/talde txerri desberdinetatik hazitako bihotz-xerratan, bariantzaren bi norabideko analisia;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 luzaketa normalarekin alderatuta). b Troponina-T eta WGArekin tindatutako bihotz-xerren irudi adierazgarriak (ezkerrean) eta zelulen tamainaren kuantifikazioa (eskuinean) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) zelula/talde, txerri ezberdinetako 10 xerra ezberdinetatik, bi isatseko Student t-testa egin da; ****p < 0,0001 luzapen normalarekin alderatuta). b Troponina-T eta WGArekin tindatutako bihotz-xerren irudi adierazgarriak (ezkerrean) eta zelulen tamainaren kuantifikazioa (eskuinean) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) zelula/talde, txerri ezberdinetako 10 xerra ezberdinetatik, bi isatseko Student t-testa egin da; ****p < 0,0001 luzapen normalarekin alderatuta). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слестова) срезов сердца определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезных срезных срезных срезных срезок два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Troponina-T eta AZP-rekin tindatutako bihotz-atalen irudi adierazgarriak (ezkerrean) eta zelulen tamainaren kuantifikazioa (eskuinean) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) zelula/talde, txerri ezberdinetako 10 atal ezberdinetatik, bi isatseko Student-en t-testa egin zen; ****p < 0,0001 andui normalarekin alderatuta). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表倧左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性30表怏ﻣ表怏30 MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）. b Kalcareina-T eta WGArekin tindatutako bihotz-xerren irudi adierazgarriak (ezkerrean) eta zelulen tamaina (eskuinean) (n = 330 (D6 MTOS), 369 10 xerra desberdinetatik (D6 MTNorm)). Zelulak/zelulen tamaina, luzapen normalarekin alderatuta, ****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слества) ичнативные оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разныей разныей Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным; lausotzea). b Troponina-T eta AZP-rekin tindatutako bihotz-atalen irudi adierazgarriak (ezkerrean) eta zelulen tamainaren kuantifikazioa (eskuinean) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) txerri ezberdinetako 10 atal ezberdinetatik) Zelulak/taldea, bi isatseko irizpidea Student-en t; ****p < 0,0001 andui normalarekin alderatuta). c 0 eta 6 eguneko MTOS bihotz-xerren irudi adierazgarriak, troponina-T eta NFATC4rako immunomarkatuak, eta NFATC4ren translokazioaren kuantifikazioa CM-en nukleoetara (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) xerra/talde txerri desberdinetatik, Bi isatseko Student t-testa egin da; *p < 0,05). c 0 eta 6 eguneko MTOS bihotz-xerren irudi adierazgarriak, troponina-T eta NFATC4rako immunomarkatuak, eta NFATC4ren translokazioaren kuantifikazioa CM-en nukleoetara (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) xerra/talde, txerri desberdinetatik, bi isatseko Student t-testa egin da; *p < 0,05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 eta 6 дней MTOS, имуномеченых для тропон, инFA для тропон количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезнурапу/зорнозных клеток свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента *p < 0,05). c 0 eta 6 eguneko MTOS-tan dauden bihotz-sekzioen irudi adierazgarriak, troponina-T eta NFATC4-rentzat immunomarkatuak, eta NFATC4 translokazioaren kuantifikazioa zelula kavernosoen nukleoan (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) xerra/talde txerri desberdinetatik) bi isatseko Student-en t-testa eginda; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化 的量化 、（D06 = M4 (D0)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)。 c Calcanin-T eta NFATC4 immunomarking 第0天和第6天MTOS bihotz-xerren eta NFATC4 NFATC4 易位至CM zelula-nukleoaren 的kantitate desberdinen irudi adierazgarriak (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS, 爇绤,)时间双尾学生et 电影；*p <0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тромуномаркировки тром поТ 4 количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезных свиней срезных свиней t-критерий Стьюдента *p < 0,05). c MTOS bihotz-xerren irudi adierazgarriak 0 eta 6 egunetan troponina-T eta NFATC4 immunomarkaketarako eta NFATC4 translokazioaren kuantifikaziorako txerri ezberdinen CMren nukleoan (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) xerra/talde, bi isatseko t irizpidea Student-en; *p < 0,05).Errore-barrek batez bestekoa ± desbideratze estandarra adierazten dute.
Ikerketa kardiobaskular translazionalak bihotzeko ingurunea zehatz-mehatz erreproduzitzen duten zelula-ereduak behar ditu. Ikerketa honetan, bihotzeko atal ultrameheak estimula ditzakeen CTCM gailu bat garatu eta karakterizatu da. CTCM sistemak estimulazio elektromekaniko fisiologikoki sinkronizatua eta T3 eta Dex fluidoen aberastea barne hartzen ditu. Txerrien bihotz-atalak faktore horien eraginpean jarri zirenean, haien bideragarritasuna, egitura-osotasuna, jarduera metabolikoa eta transkripzio-adierazpena bihotz-ehun freskoan bezala mantendu ziren 12 eguneko hazkuntzaren ondoren. Gainera, bihotzeko ehunaren gehiegizko luzaketak bihotzaren hipertrofia eragin dezake hiperhedapenaren ondorioz. Oro har, emaitza hauek hazkuntza-baldintza fisiologikoek bihotzeko fenotipo normala mantentzeko duten funtsezko eginkizuna babesten dute eta sendagaien baheketarako plataforma bat eskaintzen dute.
Kardiomiozitoen funtzionamendu eta biziraupenerako ingurune optimoa sortzen laguntzen duten faktore askok faktore horiek erakusten dute: (1) zelula arteko elkarrekintzak, (2) estimulazio elektromekanikoa, (3) faktore humoralak eta (4) substratu metabolikoak. Zelula arteko elkarrekintza fisiologikoek zelulaz kanpoko matrize batek eusten dituen zelula mota anitzeko hiru dimentsioko sare konplexuak behar dituzte. Zelula elkarrekintza konplexu horiek zailak dira in vitro berreraikitzen zelula mota indibidualak ko-kultibatuz, baina erraz lor daitezke bihotzeko atalen izaera organotipikoa erabiliz.
Kardiomiozitoen luzaketa mekanikoa eta estimulazio elektrikoa funtsezkoak dira bihotzeko fenotipoa mantentzeko33,34,35. Estimulazio mekanikoa asko erabili izan den arren hiPSC-CM egokitzapenerako eta heltze-prozesurako, hainbat ikerketa dotorek azkenaldian bihotz-xerren estimulazio mekanikoa saiatu dute kulturan karga uniaxiala erabiliz. Ikerketa hauek erakusten dute 2Dko karga mekaniko uniaxialak eragin positiboa duela bihotzaren fenotipoan kulturan zehar. Ikerketa hauetan, bihotzaren atalak tentsio-indar isometrikoekin17, karga auxotoniko linealarekin18 kargatu ziren, edo bihotzeko zikloa birsortu zen indar-transduktorearen feedbacka eta tentsio-bulkadak erabiliz. Hala ere, metodo hauek ehunen luzaketa uniaxiala erabiltzen dute ingurumen-optimizaziorik gabe, eta horrek bihotzeko gene askoren ezabapena edo luzaketa-erantzun anormalekin lotutako geneen gehiegizko adierazpena eragiten du. Hemen deskribatutako CTCM-k 3Dko estimulu elektromekaniko bat eskaintzen du, bihotzeko ziklo naturala imitatzen duena ziklo-denborari eta luzaketa fisiologikoari dagokionez (% 25eko luzaketa, % 40eko sistolea, % 60eko diastolea eta minutuko 72 taupada). Hiru dimentsioko estimulazio mekaniko hau bakarrik ez da nahikoa ehunen osotasuna mantentzeko, baina T3/Dex erabiliz estimulazio humoral eta mekanikoaren konbinazioa beharrezkoa da ehunen bideragarritasuna, funtzioa eta osotasuna behar bezala mantentzeko.
Faktore humoralek zeregin garrantzitsua dute helduen bihotzaren fenotipoa modulatzean. Hau HiPS-CM ikerketetan nabarmendu zen, non T3 eta Dex gehitu ziren hazkuntza-inguruneetara zelulen heltze bizkortzeko. T3-k aminoazidoen, azukreen eta kaltzioaren garraioan eragina izan dezake zelula-mintzetan zehar36. Gainera, T3-k MHC-α espresioa eta MHC-β beheranzko erregulazioa sustatzen ditu, uzkurdura azkarreko miofibrilen eraketa sustatuz kardiomiozito helduetan, CM fetaleko uzkurdura moteleko miofibrilekin alderatuta. Hipotiroidismoa duten pazienteetan T3 gabeziak miofibrilar banden galera eta tonuaren garapen-tasa murriztua eragiten ditu37. Dex-ek glukokortikoideen hartzaileetan eragiten du eta miokardioaren uzkurdura handitzen duela frogatu da bihotz perfusatu isolatuetan;38 hobekuntza hau kaltzio-gordailuen bidezko sarreran (SOCE) duen efektuarekin lotuta dagoela uste da39,40. Gainera, Dex-ek bere hartzaileei lotzen zaie, erantzun intrazelular zabal bat eraginez, funtzio immunologikoa eta hantura kentzen dituena30.
Gure emaitzek adierazten dute estimulazio mekaniko fisikoak (MS) kultura-errendimendu orokorra hobetu duela Ctrl-ekin alderatuta, baina ez duela bideragarritasuna, egitura-osotasuna eta bihotz-adierazpena mantendu 12 egunez kulturan. Ctrl-ekin alderatuta, T3 eta Dex CTCM (MT) kulturei gehitzeak bideragarritasuna hobetu du eta transkripzio-profilak, egitura-osotasuna eta jarduera metaboliko antzekoak mantendu ditu bihotz-ehun freskoarekin 12 egunez. Gainera, ehunen luzapen-maila kontrolatuz, hiperextentsioak eragindako bihotz-hipertrofia eredu bat sortu zen STCM erabiliz, STCM sistemaren moldakortasuna ilustratuz. Kontuan izan behar da bihotzaren birmoldaketak eta fibrosiak normalean organo osoak inplikatzen dituzten arren, eta horien zirkulazio-zelulek zitokina egokiak, fagozitosia eta beste birmoldaketa-faktore batzuk eman ditzakete, bihotzaren atal batzuek oraindik ere prozesu fibrotikoa imitatu dezaketela estresari eta traumari erantzunez. miofibroblastoetan. Hau aurretik ebaluatu da bihotz-xerra eredu honetan. Kontuan izan behar da CTCM parametroak presioa/anplitude elektrikoa eta maiztasuna aldatuz modula daitezkeela, takikardia, bradikardia eta zirkulazio-laguntza mekanikoa (bihotz mekanikoki deskargatua). Horrek sistema ertaineko errendimendu bihurtzen du sendagaien probak egiteko. CTCM-k gehiegizko ahaleginak eragindako bihotzeko hipertrofia modelatzeko duen gaitasunak bidea zabaltzen du sistema hau terapia pertsonalizaturako probatzeko. Ondorioz, egungo ikerketak erakusten du luzaketa mekanikoa eta estimulazio humorala funtsezkoak direla bihotzeko ehunen sekzioen kultura mantentzeko.
Hemen aurkeztutako datuek iradokitzen duten arren CTCM miokardio osorik modelatzeko plataforma oso itxaropentsua dela, kultura-metodo honek muga batzuk ditu. CTCM kulturaren muga nagusia da tentsio mekaniko dinamiko jarraituak ezartzen dizkiela xerrei, eta horrek ziklo bakoitzean bihotz-xerren uzkurdurak aktiboki monitorizatzeko gaitasuna eragozten du. Gainera, bihotz-sekzioen tamaina txikia dela eta (7 mm), indar-sentsore tradizionalak erabiliz kultura-sistemetatik kanpo funtzio sistolikoa ebaluatzeko gaitasuna mugatua da. Eskuizkribu honetan, muga hori partzialki gainditzen dugu tentsio optikoa uzkurdura-funtzioaren adierazle gisa ebaluatuz. Hala ere, muga honek lan gehiago beharko du eta etorkizunean konpondu daiteke bihotz-xerren funtzioaren monitorizazio optikoa kulturan egiteko metodoak sartuz, hala nola kaltzio eta tentsioarekiko sentikorrak diren koloratzaileak erabiliz mapatze optikoa. CTCMren beste muga bat da lan-ereduak ez duela tentsio fisiologikoa manipulatzen (aurrekarga eta ondorengo karga). CTCMn, presioa kontrako noranzkoetan induzitu zen diastolean (luzapen osoa) eta sistolean (uzkurduraren iraupena estimulazio elektrikoan) ehun oso handietan % 25eko luzaketa fisiologikoa erreproduzitzeko. Muga hau kendu beharko litzateke etorkizuneko CTCM diseinuetan, bi aldeetatik bihotz-ehunean presio egokia eginez eta bihotzeko ganberetan gertatzen diren presio-bolumen erlazio zehatzak aplikatuz.
Eskuizkribu honetan aipatutako gehiegizko luzapenak eragindako birmoldaketa hiperluzapen hipertrofikoaren seinaleak imitatzera mugatzen da. Beraz, eredu honek luzapenak eragindako seinaleztapen hipertrofikoaren azterketan lagun dezake faktore humoral edo neuronalak behar izan gabe (sistema honetan ez daudenak). Ikerketa gehiago behar dira CTCMren aniztasuna handitzeko, adibidez, zelula immuneekin batera landuz, plasma zirkulatzailean dauden faktore humoralak eta zelula neuronalekin batera landuz inerbazioak CTCMrekin gaixotasunak modelatzeko aukerak hobetuko ditu.
Hamahiru txerri erabili ziren ikerketa honetan. Animalien prozedura guztiak erakundearen jarraibideen arabera egin ziren eta Louisvilleko Unibertsitateko Animalien Zaintza eta Erabilera Batzordeak onartu zituen. Aorta-arkua estali zen eta bihotza 1 L kardioplegia esterilarekin perfusatu zen (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparina, pH 7.4raino); Bihotzak izotzez hoztutako kardioplegiko soluzio batean gorde ziren laborategira izotzetan eraman arte, normalean <10 minutu irauten duena. Bihotzak izotzez hoztutako kardioplegiko soluzio batean gorde ziren laborategira izotzetan eraman arte, normalean <10 minutu irauten duena. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на, лчытон, льдон занимает <10 мин. Bihotzak izotzez hoztutako kardioplegiko soluzio batean gorde ziren laborategira izotzetan garraiatu arte, normalean 10 minutu baino gutxiago irauten duena.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычмно <10. Mantendu bihotzak izotzetan kardioplegiaz laborategira izotzetan eraman arte, normalean <10 min.
CTCM gailua SolidWorks ordenagailuz lagundutako diseinu (CAD) softwarean garatu zen. Kultura-ganberak, zatitzaileak eta aire-ganberak CNC plastiko akriliko gardenez eginda daude. 7 mm-ko diametroko euskarri-eraztuna dentsitate handiko polietilenoz (HDPE) egina dago erdian eta o-ring ildaska bat du azpiko medioa zigilatzeko erabiltzen den silikonazko o-ringa hartzeko. Siliziozko mintz mehe batek bereizten du kultura-ganbera bereizketa-plakatik. Silikonazko mintza 0,02″-ko lodierako silikonazko xafla batetik laserrez moztuta dago eta 35A-ko gogortasuna du. Beheko eta goiko silikonazko junturak 1/16″-ko lodierako silikonazko xafla batetik laserrez moztuta daude eta 50A-ko gogortasuna dute. 316L altzairu herdoilgaitzezko torlojuak eta hegal-azkoinak erabiltzen dira blokea lotzeko eta zigilu hermetiko bat sortzeko.
Zirkuitu inprimatuko plaka (PCB) dedikatu bat diseinatu da C-PACE-EM sistemarekin integratzeko. PCBko swiss machine konektore-entzungailuak grafitozko elektrodoetara konektatuta daude zilarrez estalitako kobrezko harien eta elektrodoetan sartutako brontzezko 0-60 torlojuen bidez. Zirkuitu inprimatuko plaka 3D inprimagailuaren azalean jartzen da.
CTCM gailua aktuadore pneumatiko programagarri (PPD) batek kontrolatzen du, eta honek bihotz-ziklo baten antzeko zirkulazio-presio kontrolatua sortzen du. Aire-ganberaren barruko presioa handitzen den heinean, silikonazko mintz malgua gorantz hedatzen da, medioa ehunaren azpian sartuz. Fluidoaren kanporatze horrek ehunaren eremua luzatuko du, diastolean zehar bihotzaren hedapen fisiologikoa imitatuz. Erlaxazio-punturik gorenean, estimulazio elektrikoa aplikatu zen grafitozko elektrodoen bidez, eta horrek aire-ganberaren presioa murriztu eta ehun-atalen uzkurdura eragin zuen. Hodiaren barruan balbula hemostatiko bat dago, aire-sistemaren presioa detektatzeko presio-sentsore batekin. Presio-sentsoreak hautematen duen presioa ordenagailu eramangarrira konektatutako datu-biltzaile bati aplikatzen zaio. Horri esker, gas-ganberaren barruko presioaren etengabeko monitorizazioa egin daiteke. Ganberako presio maximoa lortu zenean (80 mmHg estandarra, 140 mmHg OS), datuak eskuratzeko gailuari C-PACE-EM sistemari seinalea bidaltzeko agindu zitzaion, 4 V-tan ezarrita 2 ms-ko tentsio-seinale bifasiko bat sortzeko.
Bihotz-ebakiak lortu ziren eta 6 putzutan hazkuntza-baldintzak honela egin ziren: bildutako bihotzak transferentzia-ontzitik kardioplegia hotza (4° C) zuen erretilu batera eraman. Ezkerreko bentrikulua xafla esteril batekin isolatu eta 1-2 cm3-ko zatitan moztu zen. Ehun-bloke hauek ehun-euskarrietan itsatsi ziren ehun-itsasgarriarekin eta Tyrode-ren disoluzioa zuen mikrotomo bibratzaile batean jarri ziren, eta etengabe oxigenatu ziren (3 g/L 2,3-butanedione monooxima (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glukosa (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M disoluzio), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M disoluzio), 1 L ddH2O arte). Mikrotomo bibratzailea 300 µm-ko lodierako xerra mozteko konfiguratu zen, 80 Hz-ko maiztasunean, 2 mm-ko bibrazio horizontalaren anplitudearekin eta 0,03 mm/s-ko aurrerapen-abiadurarekin. Ehun-bainua izotzez inguratu zen disoluzioa fresko mantentzeko eta tenperatura 4 °C-tan mantendu zen. Ehun-sekzioak mikrotomo-bainutik izotzean etengabe oxigenatutako Tyrode disoluzioa duen inkubazio-bainu batera eraman, hazkuntza-plaka baterako nahikoa sekzio lortu arte. Transwell kulturetarako, ehun-sekzioak 6 mm-ko zabalerako poliuretanozko euskarri esterilei lotu zitzaizkien eta 6 ml-ko medio optimizatuan jarri ziren (199 medioa, 1x ITS osagarria, % 10 FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalinoa eta 2X antibiotiko-antifungikoa). Estimulazio elektrikoa (10 V, maiztasuna 1,2 Hz) ehun-sekzioei C-Pace-ren bidez aplikatu zitzaien. TD baldintzetarako, T3 eta Dex freskoa gehitu ziren 100 nM-tan eta 1 μM-tan medio-aldaketa bakoitzean. Ingurunea oxigenoz saturatzen da egunean 3 aldiz ordezkatu aurretik. Ehun-atalak 37 °C-tan eta % 5eko CO2-tan inkubagailu batean landu ziren.
CTCM kulturetarako, ehun-atalak neurrira egindako 3D inprimagailu batean jarri ziren, Tyrode-ren soluzio aldatua zuen Petri plaka batean. Gailua bihotzaren xerra-tamaina euskarri-eraztunaren azaleraren % 25ean handitzeko diseinatuta dago. Hori egiten da bihotzaren atalak Tyrode-ren soluziotik mediora transferitu ondoren eta diastolean zehar luzatu ez daitezen. Kola histoakrilikoa erabiliz, 300 µm-ko lodierako atalak 7 mm-ko diametroko euskarri-eraztun batean finkatu ziren. Ehun-atalak euskarri-eraztunari lotu ondoren, soberako ehun-atalak moztu eta erantsitako ehun-atalak berriro jarri Tyrode-ren soluzioko bainuan izotzean (4°C), gailu bakar baterako atal nahikoa prestatu arte. Gailu guztien prozesatzeko denbora osoa ez da 2 ordu baino gehiago izan behar. 6 ehun-atalak euskarri-eraztunetan lotu ondoren, CTCM gailua muntatu zen. CTCM kultura-ganbera 21 ml aurrez oxigenatutako medioz beteta dago. Ehun-atalak kultura-ganberara eraman eta arretaz kendu aire-burbuilak pipeta batekin. Ehun-atala zulora gidatzen da eta astiro-astiro bere lekuan sakatzen da. Azkenik, jarri elektrodoaren tapoia gailuan eta eraman gailua inkubagailura. Ondoren, konektatu CTCM aire-hodira eta C-PACE-EM sistemara. Aktuadore pneumatikoak irekitzen du eta aire-balbulak CTCM irekitzen du. C-PACE-EM sistema 4 V 1,2 Hz-tan emateko konfiguratu zen, 2 ms-ko bifaseko taupada-prozesuan zehar. Medioa egunean bi aldiz aldatu zen eta elektrodoak egunean behin aldatu ziren, elektrodoetan grafitoa pilatzea saihesteko. Beharrezkoa bada, ehun-atalak beren hazkuntza-putzuetatik atera daitezke haien azpian erori diren aire-burbuilak kanporatzeko. MT tratamendu-baldintzetarako, T3/Dex fresko gehitu zen medio-aldaketa bakoitzean, 100 nM T3 eta 1 μM Dex-ekin. CTCM gailuak 37 °C-tan eta % 5eko CO2-tan hazkuntza-inkubagailu batean landu ziren.
Bihotz-xerren ibilbide luzatuak lortzeko, kamera-sistema berezi bat garatu zen. SLR kamera bat (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japonia) erabili zen Navitar Zoom 7000 18-108 mm-ko makro lente batekin (Navitar, San Francisco, CA). Bistaratzea giro-tenperaturan egin zen, medioa medio fresko batekin ordezkatu ondoren. Kamera 51°-ko angeluan kokatzen da eta bideoa segundoko 30 fotogramatan grabatzen da. Lehenik eta behin, software irekia (MUSCLEMOTION43) erabili zen Image-J-rekin bihotz-xerren mugimendua kuantifikatzeko. Maskara MATLAB (MathWorks, Natick, MA, AEB) erabiliz sortu zen, bihotz-xerren taupada egiteko intereseko eskualdeak definitzeko, zarata saihesteko. Eskuz segmentatutako maskarak fotograma-sekuentzia bateko irudi guztiei aplikatzen zaizkie eta gero MUSCLEMOTION plugin-era pasatzen dira. Muscle Motion-ek fotograma bakoitzeko pixelen batez besteko intentsitatea erabiltzen du erreferentzia-fotogramarekiko mugimendua kuantifikatzeko. Datuak grabatu, iragazi eta ziklo-denbora kuantifikatzeko eta ehunen luzapena ebaluatzeko erabili ziren bihotz-zikloan zehar. Grabatutako bideoa lehen ordenako zero faseko iragazki digital bat erabiliz prozesatu zen ondoren. Ehunen luzapena kuantifikatzeko (gailur-gailur), gailur-gailur analisia egin zen grabatutako seinalearen gailurrak eta sakonuneak bereizteko. Horrez gain, joera-kentzea 6. ordenako polinomio bat erabiliz egiten da seinalearen desbideratzea ezabatzeko. Programaren kodea MATLABen garatu zen ehunen mugimendu globala, ziklo-denbora, erlaxazio-denbora eta uzkurdura-denbora zehazteko (44. Programaren Kode Osagarria).
Tentsio-analisia egiteko, luzapen mekanikoaren ebaluaziorako sortutako bideo berdinak erabiliz, lehenik eta behin mugimendu-puntuak (mugimendu-puntu altuenak (goikoak) eta baxuenak (behekoak) irudikatzen dituzten bi irudi marraztu genituen MUSCLEMOTION softwarearen arabera. Ondoren, ehun-eskualdeak segmentatu eta itzaldura-algoritmo mota bat aplikatu genion segmentatutako ehunari (2a irudi osagarria). Segmentatutako ehuna hamar azpiazaleratan banatu zen, eta gainazal bakoitzeko tentsioa ekuazio hau erabiliz kalkulatu zen: Tentsioa = (Sup-Sdown)/Sdown, non Sup eta Sdown formaren distantziak ehunaren goiko eta beheko itzaletatik diren, hurrenez hurren (2b irudi osagarria).
Bihotzeko atalak % 4ko paraformaldehidoan finkatu ziren 48 orduz. Finkatutako ehunak % 10eko eta % 20ko sakarosan deshidratatu ziren ordubetez, eta ondoren % 30eko sakarosan gau osoan. Ondoren, atalak ebaketa-tenperatura optimoko konposatuan (OCT konposatua) txertatu eta pixkanaka isopentano/izotz lehorreko bainu batean izoztu ziren. OCT txertatze-blokeak -80 °C-tan gorde ziren bereizi arte. Diapositibak 8 μm-ko lodierako atal gisa prestatu ziren.
Bihotzeko ataletatik OCT kentzeko, berotu portaobjektuak berogailu-bloke batean 95 °C-tan 5 minutuz. Gehitu 1 ml PBS portaobjektu bakoitzari eta inkubatu 30 minutuz giro-tenperaturan, ondoren iragazi atalak % 0,1eko Triton-X PBS-n jarriz 15 minutuz giro-tenperaturan. Antigorputz ez-espezifikoak laginari lotzea saihesteko, gehitu 1 ml % 3ko BSA disoluzio portaobjektuei eta inkubatu ordubetez giro-tenperaturan. Ondoren, BSA kendu eta portaobjektuak PBS-rekin garbitu ziren. Markatu lagin bakoitza arkatz batekin. Lehen mailako antigorputzak (% 1eko BSA-tan 1:200 diluituta) (konexina 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) eta troponina-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) gehitu ziren 90 minutuz, eta ondoren bigarren mailako antigorputzak (% 1eko BSA-tan 1:200 diluituta) saguaren Alexa Fluor 488-ren (Thermo Scientific; #A16079) aurkakoak, untxiaren Alexa Fluor 594-ren (Thermo Scientific; #T6391) aurkakoak beste 90 minutuz. 3 aldiz garbitu zen PBS-rekin. Helburuaren tindaketa atzeko planotik bereizteko, bigarren mailako antigorputza bakarrik erabili genuen kontrol gisa. Azkenik, DAPI tindaketa nuklearra gehitu zen eta portaobjektuak vectashield batean (Vector Laboratories) jarri eta azazkal-bernizarekin zigilatu ziren. -x handitzea) eta Keyence mikroskopioa 40x handitzearekin.
WGA tindatzeko, WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) 5 μg/ml-tan PBS-tan erabili zen eta finkatutako sekzioetan aplikatu zen 30 minutuz giro-tenperaturan. Ondoren, portaobjektuak PBS-rekin garbitu ziren eta Sudan beltza gehitu zitzaien portaobjektu bakoitzari eta 30 minutuz inkubatu ziren. Ondoren, portaobjektuak PBS-rekin garbitu ziren eta vectashield txertatze-euskarria gehitu zitzaien. Portaobjektuak Keyence mikroskopio batean bistaratu ziren 40x handitze-mailan.
OCT laginetatik goian deskribatutako moduan kendu zen. OCT kendu ondoren, portaobjektuak Bouin-en disoluzioan murgildu gau osoan. Ondoren, portaobjektuak ur destilatuarekin garbitu ziren ordubetez eta gero Bibrich aloe azido fuksina disoluzio batean jarri ziren 10 minutuz. Ondoren, portaobjektuak ur destilatuarekin garbitu eta % 5eko fosfomolibdeno/% 5eko azido fosfotungstikoaren disoluzio batean jarri ziren 10 minutuz. Garbitu gabe, portaobjektuak zuzenean anilina urdinaren disoluziora eraman 15 minutuz. Ondoren, portaobjektuak ur destilatuarekin garbitu eta % 1eko azido azetiko disoluzio batean jarri ziren 2 minutuz. Portaobjektuak 200 N etanolean lehortu eta xilenora eraman ziren. Tindatutako portaobjektuak Keyence mikroskopio bat erabiliz bistaratu ziren 10x objektibo batekin. Fibrosi azaleraren ehunekoa Keyence Analyzer softwarea erabiliz kuantifikatu zen.
CyQUANT™ MTT Zelulen Bideragarritasun Saiakuntza (Invitrogen, Carlsbad, CA), katalogo zenbakia V13154, fabrikatzailearen protokoloaren arabera, aldaketa batzuekin. Bereziki, 6 mm-ko diametroa zuen kirurgia-zulo bat erabili zen MTT analisian ehunaren tamaina uniformea bermatzeko. Ehunak banan-banan jarri ziren MTT substratua zuen 12 putzuko plaka baten putzuetan, fabrikatzailearen protokoloaren arabera. Atalak 37 °C-tan inkubatzen dira 3 orduz eta ehun bizidunak MTT substratua metabolizatzen du formazano konposatu more bat osatzeko. Ordezkatu MTT disoluzioa 1 ml DMSOrekin eta inkubatu 37 °C-tan 15 minutuz bihotzeko ataletatik formazano morea ateratzeko. Laginak 1:10 proportzioan diluitu ziren DMSO-tan 96 putzuko hondo gardeneko plaketan eta kolore morearen intentsitatea 570 nm-tan neurtu zen Cytation plaka irakurgailu bat erabiliz (BioTek). Irakurketak bihotzaren xerra bakoitzaren pisura normalizatu ziren.
Bihotz-xerra medioa 1 μCi/ml [5-3H]-glukosa (Moravek Biochemicals, Brea, CA, AEB) zuen medioarekin ordezkatu zen, glukosaren erabileraren analisia egiteko, aurretik deskribatu bezala. 4 orduko inkubazioaren ondoren, gehitu 100 µl medio 0,2 N HCl 100 µl dituen mikrozentrifugazio-hodi ireki batera. Ondoren, hodia 500 μl dH2O dituen zintilazio-hodi batean jarri zen [3H]2O lurruntzeko 72 orduz 37 °C-tan. Ondoren, kendu mikrozentrifugazio-hodia zintilazio-hoditik eta gehitu 10 ml zintilazio-fluido. Zintilazio-zentzuak Tri-Carb 2900TR likido-zintilazio-analizatzaile bat erabiliz egin ziren (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, AEB). Glukosaren erabilera kalkulatu zen ondoren, [5-3H]-glukosaren jarduera espezifikoa, oreka osatugabea eta atzeko planoa, [5-3H]-ren diluzioa glukosa markatu gabean eta zintillazio-kontagailuaren eraginkortasuna kontuan hartuta. Datuak bihotzaren sekzioen masarekiko normalizatu dira.
Trizol-en ehunen homogeneizazioa egin ondoren, RNA bihotzeko ataletatik isolatu zen Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 erabiliz, fabrikatzailearen protokoloaren arabera. RNAsec liburutegiaren prestaketa, sekuentziazioa eta datuen analisia honela egin ziren:
RNA liburutegia prestatzeko lagin bakoitzeko 1 μg RNA erabili zen abiapuntu gisa. Sekuentziazio liburutegiak Illuminarako NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit erabiliz sortu ziren (NEB, AEB), fabrikatzailearen gomendioak jarraituz, eta indize kodeak gehitu zitzaizkien lagin bakoitzerako atributu sekuentziei. Laburbilduz, mRNA RNA osotik purifikatu zen poli-T oligonukleotidoekin lotutako ale magnetikoak erabiliz. Fragmentazioa tenperatura altuan katioi dibalenteak erabiliz egiten da NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer-ean (5X). Lehen kateko cDNA ausazko hexamero primerrak eta M-MuLV alderantzizko transkriptasa (RNase H-) erabiliz sintetizatu zen. Ondoren, bigarren kateko cDNA DNA polimerasa I eta RNase H erabiliz sintetizatzen da. Gainerako irtenguneak mutur kamuts bihurtzen dira exonukleasa/polimerasa jardueraren bidez. DNA zatiaren 3′ muturraren adenilazioaren ondoren, ile-orratz begizta egitura duen NEBNext egokitzaile bat lotzen zaio hibridaziorako prestatzeko. 150-200 bp-ko luzera hobetsiko duten cDNA zatiak hautatzeko. Liburutegi zatiak AMPure XP sistema (Beckman Coulter, Beverly, AEB) erabiliz purifikatu ziren. Ondoren, 3 μl USER Enzyme (NEB, AEB) egokitzaile batekin lotutako tamaina hautatutako cDNArekin erabili ziren 15 minutuz 37 °C-tan eta gero 5 minutuz 95 °C-tan PCR egin aurretik. Ondoren, PCR Phusion High-Fidelity DNA polimerasa, PCR primer unibertsalak eta Index (X) primerrak erabiliz egin zen. Azkenik, PCR produktuak purifikatu ziren (AMPure XP sistema) eta liburutegiaren kalitatea Agilent Bioanalyzer 2100 sistema batean ebaluatu zen. Ondoren, cDNA liburutegia Novaseq sekuentziadore bat erabiliz sekuentziatu zen. Illumina-ko irudi gordinak irakurketa gordinak bihurtu ziren CASAVA Base Calling erabiliz. Datu gordinak FASTQ(fq) formatuko fitxategietan gordetzen dira, irakurritako sekuentziak eta dagokien base kalitateak dituztenak. Hautatu HISAT2 iragazitako sekuentziazio irakurketak Sscrofa11.1 erreferentziazko genomarekin bat etortzeko. Oro har, HISAT2-k edozein tamainatako genomak onartzen ditu, 4.000 milioi base baino gehiagoko genomak barne, eta balio lehenetsiak ezarrita daude parametro gehienentzat. RNA Seq datuetatik irakurketak splicing bidez modu eraginkorrean lerrokatu daitezke HISAT2 erabiliz, gaur egun eskuragarri dagoen sistemarik azkarrena, beste edozein metodo baino zehaztasun berdinarekin edo hobeagoarekin.
Transkripzioen ugaritasunak zuzenean islatzen du geneen adierazpen maila. Geneen adierazpen mailak genomarekin edo exoiekin lotutako transkripzioen ugaritasunaren (sekuentziazio zenbaketaren) bidez ebaluatzen dira. Irakurketa kopurua geneen adierazpen mailen, geneen luzeraren eta sekuentziazio sakoneraren proportzionala da. FPKM (mila base pareko transkripzio sekuentziatutako zatiak milioi base pareko) kalkulatu ziren eta adierazpen diferentzialaren P-balioak DESeq2 paketea erabiliz zehaztu ziren. Ondoren, aurkikuntza faltsuen tasa (FDR) kalkulatu genuen P balio bakoitzerako Benjamini-Hochberg metodoa9 erabiliz, "p.adjust" R funtzio integratuan oinarrituta.
Bihotzeko ataletatik isolatutako RNA 200 ng/μl-ko kontzentrazioan cDNA bihurtu zen Thermo-ren SuperScript IV Vilo Master nahasketa erabiliz (Thermo, 11756050 kat. zk.). RT-PCR kuantitatiboa Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-putzuko erreakzio-plaka garden bat (Thermo, 4483319 kat. zk.) eta microamp itsasgarri optiko bat (Thermo, 4311971 kat. zk.) erabiliz egin zen. Erreakzio-nahasteak 5 µl Taqman Fast Advanced Master nahasketa (Thermo, 4444557 kat. zk.), 0,5 µl Taqman Primer eta 3,5 µl H2O zituen putzu bakoitzeko nahastuta. qPCR ziklo estandarrak egin ziren eta CT balioak Applied Biosystems Quantstudio 5 denbora errealeko PCR tresna bat erabiliz neurtu ziren (384-putzuko modulua; A28135 produktua). Taqman primerrak Thermo-tik erosi ziren (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Lagin guztien CT balioak GAPDH etxeko genearekiko normalizatu ziren.
NT-ProBNP-ren medio-askapena NT-ProBNP kit-a (pig) (Kat. zk. MBS2086979, MyBioSource) erabiliz ebaluatu zen, fabrikatzailearen protokoloaren arabera. Laburbilduz, lagin eta estandar bakoitzetik 250 µl gehitu ziren bikoiztuta putzu bakoitzean. Lagina gehitu bezain laster, gehitu 50 µl A analisi erreaktiboaren putzu bakoitzean. Astindu plaka astiro-astiro eta itxi zigilatzailearekin. Ondoren, tabletak 37 °C-tan inkubatu ziren ordubetez. Ondoren, aspiratu disoluzioa eta garbitu putzuak 4 aldiz 350 µl 1X garbiketa-disoluzioarekin, garbiketa-disoluzioa 1-2 minutuz inkubatuz aldi bakoitzean. Ondoren, gehitu 100 µl B analisi erreaktiboaren putzu bakoitzeko eta itxi plaka zigilatzailearekin. Tableta astiro-astiro astindu eta 37 °C-tan inkubatu zen 30 minutuz. Aspiratu disoluzioa eta garbitu putzuak 5 aldiz 350 µl 1X garbiketa-disoluzioarekin. Gehitu 90 µl substratu-disoluzio putzu bakoitzera eta zigilatu plaka. Inkubatu plaka 37 °C-tan 10-20 minutuz. Gehitu 50 µl gelditze-disoluzio putzu bakoitzera. Plaka berehala neurtu zen 450 nm-tan ezarritako Cytation (BioTek) plaka-irakurgailu bat erabiliz.
Potentzia-analisiak egin ziren parametroan % 10eko aldaketa absolutua eta % 5eko I. motako errore-tasa detektatzeko % 80ko potentzia baino handiagoa emango zuten talde-tamainak aukeratzeko. Potentzia-analisiak egin ziren parametroan % 10eko aldaketa absolutua eta % 5eko I. motako errore-tasa detektatzeko % 80ko potentzia baino handiagoa emango zuten talde-tamainak aukeratzeko. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >% 80 мощноя тиборнос групп % 10 абсолютного изменения параметра с % 5 частотой ошибок типа I. Potentziaren analisia egin zen parametroen % 10eko aldaketa absolutua eta % 5eko I. motako errore-tasa detektatzeko % 80ko potentzia baino handiagoa emango zuten talde-tamainak hautatzeko.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощдно обнаружения % 10 абсолютного изменения параметров eta % 5 частоты ошибок типа I. Potentzia-analisi bat egin zen parametroen % 10eko aldaketa absolutua eta % 5eko I. motako errore-tasa detektatzeko % 80ko potentzia baino handiagoa emango zuen talde-tamaina bat hautatzeko.Ehun-sekzioak ausaz hautatu ziren esperimentuaren aurretik. Analisi guztiak baldintza itsuetan egin ziren eta laginak datu guztiak aztertu ondoren bakarrik deskodetu ziren. GraphPad Prism softwarea (San Diego, CA) erabili zen analisi estatistiko guztiak egiteko. Estatistika guztietarako, p-balioak esanguratsutzat jo ziren <0,05eko balioetan. Estatistika guztietarako, p-balioak esanguratsutzat jo ziren <0,05 balioetan. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Estatistika guztietarako, p-balioak esanguratsutzat jo ziren <0,05 balioetan.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Estatistika guztietarako, p-balioak esanguratsutzat jo ziren <0,05 balioetan.Bi aldeetako Student-en t-testa egin zen datuetan, 2 konparaketa baino ez zirela egin. ANOVA norabide bakarrekoa edo bikoitza erabili zen hainbat talderen arteko esangura zehazteko. Post hoc probak egiterakoan, Tukey-ren zuzenketa aplikatu zen konparaketa anitzak kontuan hartzeko. RNAsec datuek kontuan hartu beharreko alderdi estatistiko bereziak dituzte FDR eta p.doiketa kalkulatzerakoan, Metodoen atalean azaltzen den bezala.
Ikerketaren diseinuari buruzko informazio gehiago lortzeko, ikus artikulu honekin lotutako Nature Research Report laburpena.
Argitaratze data: 2022ko irailaren 28a
