Gratias tibi ago quod Nature.com invisisti. Versio navigatri quam uteris limitatam sustentationem CSS habet. Pro optima experientia, commendamus ut navigatro recentiore utaris (vel Modum Compatibilitatis in Internet Explorer deactivare). Interea, ut sustentationem continuam praestemus, situm sine stylis et JavaScript reddemus.
Opus est systemate *in vitro* fidissimo quod accurate ambitum physiologicum cordis ad probationes medicamentorum reproducere possit. Limitata copia systematum culturae textuum cordis humani ad interpretationes falsas effectuum medicamentorum cardiacorum duxit. Hic, exemplar culturae textuum cardiacorum (CTCM) elaboravimus quod segmenta cordis electromechanice stimulat et distensionem physiologicam subit per phases systoles et diastoles cycli cardiaci. Post duodecim dies culturae, haec methodus viabilitatem sectionum cordis partim auxit, sed integritatem structuralem earum non plene servavit. Ergo, post examinationem parvarum moleculorum, invenimus additionem 100 nM triiodothyronini (T3) et 1 μM dexamethasoni (Dex) ad medium nostrum microstructuram sectionum per duodecim dies conservavisse. In combinatione cum curatione T3/Dex, systema CTCM perfiles transcriptionales, viabilitatem, actionem metabolicam, et integritatem structuralem in eodem gradu ac textus cordis recentis per duodecim dies conservavit. Praeterea, extensio nimia textus cardiaci in cultura signala cardiaca hypertrophica inducit, testimonium praebens facultatis CTCM ad condiciones hypertrophicas a distensione cardiaca inductas imitandas. In conclusione, CTCM physiologiam et pathophysiologiam cordis in cultura per longa temporis spatia imitari potest, permittens certam medicamentorum examinationem.
Ante investigationem clinicam, systemata *in vitro* certa necessaria sunt quae accurate ambitum physiologicum cordis humani reproducere possint. Talia systemata extensionem mechanicam, frequentiam cordis, et proprietates electrophysiologicas mutatas imitari debent. Modela animalium vulgo ut suggestum examinationis pro physiologia cardiaca adhibentur, cum fide limitata in reflectendis effectibus medicamentorum in corde humano1,2. Denique, Modelum Experimentale Culturae Textus Cardiaci Ideale (CTCM) est exemplar valde sensibile et specificum pro variis interventionibus therapeuticis et pharmacologicis, accurate reproducens physiologiam et pathophysiologiam cordis humani3. Absentia talis systematis inventionem novarum curationum pro insufficientia cardiaca4,5 limitat et ad cardiotoxicitatem medicamentorum ut causam principalem exitus e foro6 duxit.
Per decennium proximum, octo medicamenta non-cardiovascularia ex usu clinico sublata sunt quia prolongationem intervalli QT efficiunt, quae ad arrhythmias ventriculares et mortem subitam ducit7. Itaque crescit necessitas strategiarum prae-clinicarum certarum ad efficaciam et toxicitatem cardiovascularem aestimandam. Recens usus cardiomyocytorum pluripotentium humanis inductorum e cellulis primordialibus derivatorum (hiPS-CM) in examine medicamentorum et probatione toxicitatis solutionem partialem huic problemati praebet. Attamen, natura immatura hiPS-CM et carentia complexitatis multicellularis textus cardiaci sunt limitationes maiores huius methodi. Studia recentiora demonstraverunt hanc limitationem partim superari posse utendo hiPS-CM praematura ad formanda hydrogela textus cardiaci paulo post initium contractionum spontanearum et gradatim augendo stimulationem electricam per tempus. Attamen, his microtextibus hiPS-CM carent proprietatibus electrophysiologicis et contractilibus maturis myocardii adulti. Praeterea, textus cardiacus humanus structuram complexiorem habet, constantem ex mixtura heterogenea diversorum generum cellularum, inter quas cellulae endotheliales, neuronae et fibroblastae stromales, inter se conexae per series specificas proteinorum matricis extracellularis. Haec heterogeneitas populationum non-cardiomyocytorum11,12,13 in corde mammalium adultorum impedimentum magnum est ad modelandum textum cardiacum utens singulis generibus cellularum. Hae limitationes maiores momentum illustrant methodos evolvendas ad colendum textum myocardialem integrum sub condicionibus physiologicis et pathologicis.
Sectiones tenues (300 µm) cordis humani cultae exemplar promittens myocardii humani integri esse probatae sunt. Haec methodus aditum ad systema multicellulare tridimensionale completum, simile textui cordis humani, praebet. Attamen, usque ad annum 2019, usus sectionum cordis cultarum brevi superviventia culturae (24 h) limitatus erat. Hoc ob plures factores, inter quos defectus extensionis physico-mechanicae, interfacies aeris-liquidi, et usus mediorum simplicium quae necessitates textus cardiaci non sustinent, fit. Anno 2019, plures greges investigationis demonstraverunt incorporationem factorum mechanicorum in systemata culturae textus cardiaci vitam culturae extendere, expressionem cardiacam emendare, et pathologiam cardiacam imitari posse. Duo studia elegantia 17 et 18 ostendunt onerationem mechanicam uniaxialem effectum positivum in phaenotypo cardiacum per culturam habere. Attamen, haec studia onerationem physico-mechanicam tridimensionalem dynamicam cycli cardiaci non adhibuerunt, cum sectiones cordis vel viribus tensilibus isometricis 17 vel onere auxotonico lineari 18 oneratae sint. Hae methodi extensionis textuum suppressionem multorum genorum cardiacorum vel expressionem excessivam genorum cum responsionibus extensionis abnormalibus consociatorum effecerunt. Praesertim, Pitoulis et al. [19] balneum culturae segmentorum cordis dynamicum ad reconstructionem cycli cardiaci utens retroactione transductoris vis et impulsionibus tensionis excogitaverunt. Quamquam hoc systema accuratiorem in vitro modellationem cycli cardiaci permittit, complexitas et humilis productio methodi applicationem huius systematis limitant. Laboratorium nostrum nuper systema culturae simplificatum excogitavit utens stimulatione electrica et medio optimizato ad vitalitatem sectionum textus cordis porcini et humani usque ad 6 dies conservandam [20,21].
In hoc manuscripto, exemplar culturae textus cardiaci (CTCM) describimus, utens sectionibus cordis porcini, quod signa humoralia incorporat ad recapitulandum physiologiam cardiacam tridimensionalem et distensionem pathophysiologicam per cyclum cardiacum. Hoc CTCM accuratiam praedictionis medicamentorum prae-clinicorum ad gradum numquam antea consecutum augere potest, systema cardiacum mediocriter peragendum et sumptibus efficax praebendo, quod physiologiam/pathophysiologiam cordis mammalium ad probationes medicamentorum prae-clinicas imitatur.
Signa mechanica haemodynamica munus criticum agunt in functione cardiomyocytorum in vitro conservanda [22,23,24]. In hoc manuscripto, CTCM (Figura 1a) elaboravimus quod ambitum cardiacum adultum imitari potest, stimulationem electricam et mechanicam ad frequentias physiologicas (1.2 Hz, 72 pulsus per minutum) inducendo. Ad excessivam distensionem textus durante diastole vitandam, instrumentum impressionis tridimensionalis adhibitum est ad magnitudinem textus 25% augendam (Fig. 1b). Stimulatio electrica a systemate C-PACE inducta temporata est ut 100 ms ante systole inciperet, systemate acquisitionis datorum utens ad cyclum cardiacum plene reproducendum. Systema culturae textus actuatorem pneumaticum programmabilem (LB Engineering, Germania) utitur ad membranam siliconeam flexibilem cyclice expandendam, ut expansionem segmentorum cordis in camera superiore efficiat. Systema cum linea aeris externa per transductorem pressionis connexum erat, quod pressionem (± 1 mmHg) et tempus (± 1 ms) accurate adaptare permisit (Fig. 1c).
a Sectionem textus anulo sustentatorio 7 mm, caeruleo colore depicto, intra cameram culturae instrumenti adfige. Camera culturae a camera aeris tenui membrana siliconica flexibili separatur. Inter singulas cameras anulum obturatorium pone ne effluant. Operculum instrumenti electrodos graphitos continet qui stimulationem electricam praebent. b Repraesentatio schematica instrumenti textus magni, anuli ductoris et anuli sustentatorii. Sectiones textus (fuscae) in instrumento maiori ponuntur, anulo ductore in sulco in margine exteriori instrumenti posito. Duce utens, anulum sustentatorium glutino acrylico textus obductum diligenter super sectionem textus cardiaci pone. c Graphica ostendens tempus stimulationis electricae ut functionem pressionis camerae aeris a actuatore pneumatico programmabili (PPD) moderatae. Instrumentum acquisitionis datorum ad synchronizandam stimulationem electricam sensoribus pressionis adhibitum est. Cum pressio in camera culturae limen statutum attingit, signum impulsuum ad C-PACE-EM mittitur ad stimulationem electricam incitandam. d Imago quattuor CTCM in pluteo incubatoris positorum. Quattuor instrumenta per circuitum pneumaticum uni PPD connectuntur, et sensoria pressionis in valvulam haemostaticam inseritur ut pressionem in circuitu pneumatico observet. Quodque instrumentum sex sectiones textus continet.
Uno actuatore pneumatico utentes, quattuor instrumenta CTCM moderari potuimus, quorum unumquodque sex sectiones textus tenere poterat (Fig. 1d). In CTCM, pressio aeris in camera aeris in pressionem synchronam in camera fluidi convertitur et expansionem physiologicam segmenti cordis inducit (Figura 2a et Pellicula Suppletoria 1). Aestimatio extensionis textus ad 80 mm Hg. Art. extensionem sectionum textus per 25% ostendit (Fig. 2b). Haec extensio percentualis longitudini sarcomeri physiologicae 2.2–2.3 µm pro contractilitate sectionis cardiacae normali respondere demonstrata est17,19,25. Motus textus utens configurationibus camerae consuetudinariis aestimatus est (Figura Suppletoria 1). Amplitudo et velocitas motus textus (Fig. 2c, d) extensioni per cyclum cardiacum et tempori per systolen et diastolen correspondebant (Fig. 2b). Extensio et velocitas textus cardiaci per contractionem et relaxationem constantes per 12 dies in cultura manserunt (Fig. 2f). Ad effectum stimulationis electricae in contractilitatem per culturam aestimandum, methodum ad deformitatem activam determinandam algorithmo umbrae utens (Figura Supplementaria 2a,b) elaboravimus et distinguere potuimus inter deformitates cum et sine stimulatione electrica. Eadem sectio cordis (Figura 2f). In regione mobili incisionis (R6-9), tensio electrica per stimulationem electricam 20% altior erat quam absente stimulatione electrica, quod contributionem stimulationis electricae ad functionem contractilem indicat.
Vestigia repraesentativa pressionis camerae aeris, pressionis camerae fluidi, et mensurarum motus textus confirmant pressionem camerae pressionem camerae fluidi mutare, motum correspondentem sectionis textus causando. b Vestigia repraesentativa extensionis percentualis (caerulea) sectionum textus correspondentium extensioni percentuali (aurantiaca). c Motus mensuratus sectionis cardiacae congruit cum celeritate motus mensurata. (d) Traiectoriae repraesentativae motus cyclici (linea caerulea) et velocitatis (linea punctata aurantiaca) in sectione cordis. e Quantificatio temporis cycli (n = 19 sectiones per gregem, ex porcis diversis), temporis contractionis (n = 19 sectiones per gregem), temporis relaxationis (n = 19 sectiones per gregem, ex porcis diversis), motus textus (n = 25 sectiones per gregem)/grex ex porcis diversis), velocitatis systolicae maximae (n = 24(D0), 25(D12) sectiones/grex ex porcis diversis) et celeritatis relaxationis maximae (n=24(D0), 25(D12) sectiones/grex ex porcis diversis). Probatio t Studentis bicaudata nullam differentiam significantem in ullo parametro ostendit. f Vestigia repraesentativa analysis deformationis sectionum textus cum (rubra) et sine (caerulea) stimulatione electrica, decem areae regionales sectionum textus ex eadem sectione. Pars inferior quantificationem differentiae percentualis in deformatione in sectionibus textus cum et sine stimulatione electrica in decem areis ex sectionibus diversis ostendunt. (n = 8 segmenta/coetus ex porcis diversis, probatio t Studentis bicaudata peracta est; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 segmenta/coetus ex porcis diversis, probatio t Studentis bicaudata peracta est; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,05). (n = 8 sectiones/coetus ex porcis diversis, probatio t Studentis bilateralis; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). n = 8 /组，来自不同的猪，进行双尾学生t ****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 n = 8 /组，来自不同的猪，进行双尾学生t ****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий тьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 sectiones/coetus, ex porcis diversis, probatio t Studentis bilateralis; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Vecticulae errorum mediam ± deviationem standardem repraesentant.
In priore nostro systemate culturae segmentorum cordis staticorum biomimetici [20, 21], viabilitatem, functionem, et integritatem structuralem segmentorum cordis per sex dies conservavimus, stimulatione electrica adhibita et compositione medii optimizata. Post decem dies autem, hae figurae acriter deciderunt. Ad sectiones cultas in priore nostro systemate culturae biomimetici statici 20, 21 sub condicionibus moderandis (Ctrl) referemus, et medium nostrum prius optimizatum ut condiciones MC et culturam sub stimulatione mechanica et electrica simultanea (CTCM) utemur, quae appellantur. Primo, determinavimus stimulationem mechanicam sine stimulatione electrica insufficientem esse ad viabilitatem textuum per sex dies conservandam (Figura Supplementaria 3a,b). Curiose, cum introductione stimulationis physio-mechanicae et electricae utens STCM, viabilitatem sectionum cordis duodecim dierum eadem mansit ac in sectionibus cordis recentibus sub condicionibus MS, sed non sub condicionibus Ctrl, ut demonstratum est per analysin MTT (Figura 1). 3a). Hoc suggerit stimulationem mechanicam et simulationem cycli cardiaci sectiones textuum viabiles servare posse bis tam diu quam in priore nostro systemate culturae statici relatum est. Aestimatio autem integritatis structuralis sectionum textuum per immunomarcationem troponini T cardiaci et connexini 43 ostendit expressionem connexini 43 significanter altiorem fuisse in textibus MC die duodecimo quam in controlibus eodem die. Nihilominus, uniformis expressio connexini 43 et formatio disci Z non plene conservatae sunt (Fig. 3b). Utimur structura intelligentiae artificialis (IA) ad quantificandam integritatem structuralem textuum26, canali discendi profundi imaginibus fundato, in tinctione troponini-T et connexini43 fundato, ad quantificandam integritatem structuralem et fluorescentiam segmentorum cordis secundum vim localizationis automatice. Haec methodus utitur Rete Neurali Convolutionali (CNN) et structura discendi profundi ad quantificandam integritatem structuralem textus cardiaci modo automatico et impartiali certo, ut in referentia describitur.26. Textus MC similitudinem structuralem emendatam ad diem 0 comparatus cum sectionibus controlibus staticis ostendit. Praeterea, tinctio trichromatis Masson significanter minorem proportionem fibrosis sub condicionibus MS comparatus cum condicionibus controlibus die duodecimo culturae revelavit (Fig. 3c). Quamquam CTCM vitalitatem sectionum textus cordis die duodecimo ad gradum similem textui cordis recenti auxit, integritatem structuralem sectionum cordis non significanter emendavit.
Diagramma columnare quantificationem viabilitatis MTT segmentorum cordis recentium (D0) vel culturae segmentorum cordis per 12 dies sive in cultura statica (D12 Ctrl) sive in CTCM (D12 MC) ostendit (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) segmenta/grex ex porcis diversis, probatio ANOVA una via peracta; ####p < 0.0001 comparatum cum D0 et **p < 0.01 comparatum cum D12 Ctrl). Diagramma columnare quantificationem viabilitatis MTT segmentorum cordis recentium (D0) vel culturae segmentorum cordis per 12 dies sive in cultura statica (D12 Ctrl) sive in CTCM (D12 MC) ostendit (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) segmenta/grex ex porcis diversis, probatio ANOVA una via peracta; ####p < 0.0001 comparatum cum D0 et **p < 0.01 comparatum cum D12 Ctrl).Histogramma quantificationem viabilitatis sectionum cordis recentium MTT (D0) vel culturae sectionum cordis per 12 dies in cultura statica (D12 control) vel CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 control). ) ostendit, 12 (D12 MC) sectiones/grex ex porcis diversis, probatio ANOVA unidirectionalis perficitur;####p <0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 comparatum ad D0 et **p < 0.01 comparatum ad D12 (Ctrl). a (D12 Ctrl) CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) (D0) 12 MTT )，来自不同猪的12 (D12 MC) /组，进行单向ANOVA D0 #### p < 0.0001，与D12 Ctrl. **p < 0.01)。 a (D12 Ctrl) CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) (D0) 12 (D12 MC) /组，进行单向ANOVA D0 #### p < 0.0001，与D12 Ctrl **p。)Histogramma ostendens quantificationem viabilitatis MTT in sectionibus cordis recentibus (D0) vel sectionibus cordis per 12 dies in cultura statica (D12 control) vel CTCM (D12 MC) cultarum (n = 18 (D0), 15 (D12 control)), 12 (D12 MC) sectiones/grex ex porcis diversis, probatione ANOVA unidirectionali;####p <0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 comparatum cum D0, **p < 0.01 comparatum cum D12 (Ctrl). (Nota: "Praeter D12" hic non est textus corruptus.)b Troponinum-T (viridis), connexinum 43 (rubrum) et DAPI (caeruleum) in sectionibus cordis recens isolatis (D0) vel sectionibus cordis sub condicionibus staticis (Ctrl) vel condicionibus CTCM (MC) per 12 dies cultarum) imaginum immunofluorescentiae repraesentativarum (scala vacua = 100 µm). Quantificatio integritatis structuralis textus cordis per intelligentiam artificialem (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) segmenta/coetus, singula ex porcis diversis, probatio ANOVA unidirectionalis peracta; ####p < 0.0001 comparatum cum D0 et ****p < 0.0001 comparatum cum D12 Ctrl). Quantificatio integritatis structuralis textus cordis per intelligentiam artificialem (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) segmenta/coetus ex diversis porcis, probatio ANOVA unidirectionalis peracta; ####p < 0.0001 comparatum cum D0 et ****p < 0.0001 comparatum cum D12 Ctrl). оличественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0); от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; Quantificatio integritatis structuralis textus cardiaci per intelligentiam artificialem (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sectiones/coetus ex porcis diversis, probatio ANOVA unidirectionalis peracta; ####p < 0.0001 contra cum D0 et ****p < 0.0001 comparatum cum D12 Ctrl).n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) crustae/singulorum inter se diversorum porcorum, uno modo test ANOVA;####p< 0.0001 与D0 ****p< 0.0001 与D12 Ctrln = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) crustae/singulorum diversorum porcorum, uno modo test ANOVA;####p <0.0001 与D0相比，****p< 0.0001 与D12 Ctrl скусственный интеллект для количественной оценки структурной елостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl); срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; Intelligentia artificialis ad integritatem structuralem textus cardiaci quantificandam (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sectiones/coetus pro singulis porcis diversis, probatio ANOVA unidirectionalis; ####p<0.0001 vs .D0 Ad comparationem ****p < 0.0001 comparatum cum D12 Ctrl). c Imagines repraesentativae (sinistra) et quantificatio (dextra) segmentorum cordis tinctorum tinctura trichroma Massoniana (Scala nuda = 500 µm) (n = 10 segmenta/grex, singula ex porco diverso, probatio ANOVA unidirectionalis peracta; ####p < 0.0001 comparatum cum D0 et ***p < 0.001 comparatum cum D12 Ctrl). c Imagines repraesentativae (sinistra) et quantificatio (dextra) segmentorum cordis tinctorum tinctura trichroma Massoniana (Scala nuda = 500 µm) (n = 10 segmenta/grex singula ex porcis diversis, probatio ANOVA unidirectionalis peracta; #### p < 0.0001 comparatum cum D0 et ***p < 0.001 comparatum cum D12 Ctrl). c епрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенелем трашенелем траенеле траенеле ти справа) срезов ассона (масштаб ез покрытия = 500 км) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется <односторонний однотест руппу от разных свиней, выполняется<односторонний односторонний одностороний# отороний #потест; сравнению с D0 и ***p< 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Imagines repraesentativae (sinistra) et quantificatio (dextra) sectionum cordis tinctarum tinctura trichroma Masson (scala non obducta = 500 µm) (n = 10 sectiones/grex ex porcis diversis, probatio ANOVA unidirectionalis peracta; #### p < 0.0001 comparatum cum D0 et ***p < 0.001 comparatum cum D12 Ctrl). c Masson = 500 µm）（n = 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA #### p < 0.0001 D0 ***p < 0.001 D12 Ctrl C massan = 500 µm） n = 10 Anova #### p < 0.0001 D0 ***p< 0.001 与D12 Ctrl c епрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрасенных трихенных трихенных трихеннле. ассона (чистая кала = 500 км) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью о помощью о свиньи, протестировано с помощью о помощью дисперсионного анализа ;### #p<0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Imagines repraesentativae (sinistra) et quantificatio (dextra) sectionum cordis tinctarum tinctura trichroma Masson (vacuum = 500 µm) (n = 10 sectiones/grex, unaquaeque ex porco diverso, probatae per analysin variantiae unidirectionalem; ### # p < 0.0001 comparatum cum D0, ***p < 0.001 comparatum cum D12 Ctrl).Vecticulae errorum mediam ± deviationem standardem repraesentant.
Hypothesim fecimus, additis moleculis parvis in medium culturae, integritatem cardiomyocytorum augeri posse et progressionem fibrosis minui durante cultura CTCM. Ideo moleculas parvas, culturis nostris staticis moderantibus utens, examinavimus20,21 propter paucitatem factorum confundentium. Dexamethasonum (Dex), triiodothyroninum (T3), et SB431542 (SB) ad hoc examen electa sunt. Hae moleculae parvae antea in culturis hiPSC-CM adhibitae sunt ad maturationem cardiomyocytorum inducendam per longitudinem sarcomerorum, tubulos T, et velocitatem conductionis augendas. Praeterea, et Dex (glucocorticoidum) et SB inflammationem supprimere noti sunt29,30. Ideo probavimus utrum inclusio unius vel combinatio harum molecularum parvarum integritatem structuralem sectionum cordis emendaret. Ad examen initiale, dosis cuiusque compositi selecta est secundum concentrationes vulgo adhibitas in exemplaribus culturae cellularum (1 μM Dex27, 100 nM T327, et 2.5 μM SB31). Post duodecim dies culturae, combinatio T3 et Dex optimam integritatem structurae cardiomyocytorum et minimam remodellationem fibrosam effecit (Figurae Suppletoriae 4 et 5). Praeterea, usus duplarum vel duplarum harum concentrationum T3 et Dex effectus deleterios produxit comparatus cum concentrationibus normalibus (Figura Suppletoria 6a,b).
Post primam examinationem, comparationem directam quattuor condicionum culturae (Figura 4a) perfecimus: Ctrl: sectiones cordis in cultura statica antea descripta utens medio nostro optimizato cultae; 20.21 TD: T3 et Ctrl cum Dex addito die Mercurii; MC: sectiones cordis in CTCM utens medio nostro antea optimizato cultae; et MT: CTCM cum T3 et Dex medio additis. Post duodecim dies culturae, viabilitas textuum MS et MT eadem mansit ac in textibus recentibus per experimentum MTT aestimatis (Figura 4b). Curiose, additio T3 et Dex culturis transwell (TD) non ad meliorationem significantem in viabilitate comparata cum condicionibus Ctrl effecit, quod munus magnum stimulationis mechanicae in viabilitate sectionum cordis conservanda indicat.
Diagramma delineationis experimentalis quattuor condiciones culturae depingens, quae ad effectus stimulationis mechanicae et supplementi T3/Dex in medio per duodecim dies aestimandos adhibitae sunt. b Diagramma columnarium quantificationem viabilitatis 12 dies post culturam in omnibus 4 condicionibus culturae (Ctrl, TD, MC, et MT) ostendit comparatis cum segmentis cordis recentibus (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD et D12 MT), 12 (D12 MC) segmentis/grege ex porcis diversis, probatio ANOVA unidirectionalis peracta; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 comparatum cum D0 et **p < 0.01 comparatum cum D12 Ctrl). b Diagramma columnarium quantificationem viabilitatis 12 dies post culturam in omnibus 4 condicionibus culturae (Ctrl, TD, MC, et MT) ostendit comparatam cum segmentis cordis recentibus (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD et D12 MT), 12 (D12 MC) segmentis/grege ex porcis diversis, probatio ANOVA unidirectionalis peracta; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 comparatum cum D0 et **p < 0.01 comparatum cum D12 ctrl). b истограмма показывает количественную оценку жизнеспособности ерез 12 дней после культивирования 4 во всобности ерез 12 дней после культивирования 4 во виния во вония 4 культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 MT) срезов/группу от разных свиней; проводится односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Diagramma columnare quantificationem viabilitatis ostendit post dies 12 post culturam in omnibus 4 condicionibus culturae (controllo, TD, MC, et MT) comparatis cum sectionibus cordis recentibus (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, et D12 MT), 12 (D12 MC) sectiones/grex ex porcis diversis, probatione ANOVA unidirectionali; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 contra D0 et **p < 0.01 comparatum cum D12 Ctrl). b 4 Ctrl、TD、MC MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) /组，进行单向ANOVA ####p <0.0001，### p < 0.001 D0 **p < 0.01 D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b истограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со (свежамии(свежамии) = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; <0.01 по сравнению с контролем D12). b Histogramma ostendens omnes quattuor condiciones culturae (control, TD, MC et MT) comparatas cum sectionibus cordis recentibus (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD et D12 MT), ex porcis diversis 12 (D12 MC) sectiones/grex, probatio ANOVA unidirectionalis; ####p<0.0001, ###p<0.001 contra D0, **p<0.01 contra control D12). c Diagramma columnare quantificationem fluxus glucosii 12 dies post culturam in omnibus 4 condicionibus culturae (Ctrl, TD, MC, et MT) comparatum cum segmentis cordis recentibus (D0) ostendit (n = 6 segmenta/grex ex porcis diversis, probatio ANOVA unidirectionalis peracta est; ###p < 0.001, comparatum cum D0 et ***p < 0.001 comparatum cum D12 Ctrl). c Diagramma columnare quantificationem fluxus glucosii 12 dies post culturam in omnibus 4 condicionibus culturae (Ctrl, TD, MC, et MT) comparatum cum segmentis cordis recentibus (D0) ostendit (n = 6 segmenta/grex ex porcis diversis, probatio ANOVA unidirectionalis peracta est; ###p < 0.001, comparatum cum D0 et ***p < 0.001 comparatum cum D12 Ctrl). c истограмма показывает количественную оценку потока люкозы через 12 дней после культивирования во во вования 4 культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/групрз пов/групрз пов/групр срезами односторонний Выполняется тест ANOVA; сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). Histogramma quantificationem fluxus glucosii 12 dies post culturam sub omnibus 4 condicionibus culturae (controllo, TD, MC et MT) comparatis cum sectionibus cordis recentibus (D0) ostendit (n = 6 sectiones/grex ex porcis diversis, probatio ANOVA unidirectionalis peracta; ###p < 0.001 comparatum cum D0 et ***p < 0.001 comparatum cum D12 Ctrl). c 4 Ctrl、TD、MC (D0) 12 n = 6 /组，来自不同猪，单向执行ANOVA ###p <0.001，与D0 ***p < 0.001 D12 Ctrl C 4 ctrl td mc mt） 12 n = 6 /组 12 n = 6 /组 ? 0.001 与D12 Ctrl c истограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы ерез 12 дней после культиввирования для лкозы культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/вит . односторонний Были проведены тесты ANOVA; 0,001 по сравнению с D0, ***p< 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogramma ostendens quantificationem fluxus glucosii post dies 12 post culturam pro omnibus 4 condicionibus culturae (controllo, TD, MC, et MT) comparatis cum sectionibus cordis recentibus (D0) (n = 6 sectiones/grex, ex porcis diversis, unilaterales) Ubi probationes ANOVA peractae sunt, ###p < 0.001 comparatum cum D0, ***p < 0.001 comparatum cum D12 (controllo).d Diagrammata analysis deformationis textuum recentium (caeruleorum), diei 12 MC (viridium), et diei 12 MT (rubrorum) in decem punctis sectionum textuum regionalium (n = 4 segmenta/grex, probatio ANOVA unidirectionalis; nulla differentia significativa inter greges erat). e Diagramma Volcano ostendens genes differentialiter expressas in sectionibus cordis recentibus (D0) comparatis cum sectionibus cordis cultarum sub condicionibus staticis (Ctrl) vel sub condicionibus MT (MT) per 10-12 dies. f Tabula caloris genorum sarcomerorum pro sectionibus cordis cultarum sub unaquaque conditione culturae. Vectes errorum repraesentant mediam ± deviationem standardem.
Dependentia metabolica a transitione ab oxidatione acidorum pinguium ad glycolysim est signum dedifferentiationis cardiomyocytorum. Cardiomyocyti immaturi praecipue glucosum ad productionem ATP utuntur et mitochondria hypoplastica cum paucis cristis habent5,32. Analyses utilizationis glucosi demonstraverunt sub condicionibus MC et MT, utilizationem glucosi similem fuisse illi in textibus diei 0 (Figura 4c). Attamen, exempla Ctrl augmentum significantem in utilizatione glucosi comparata cum textu recenti ostenderunt. Hoc indicat combinationem CTCM et T3/Dex vitalitatem textuum augere et phaenotypum metabolicum sectionum cordis cultarum 12 dierum conservare. Praeterea, analysis deformationis ostendit gradus deformationis eosdem mansisse ac in textu cordis recenti per 12 dies sub condicionibus MT et MS (Figura 4d).
Ad effectum generalem CTCM et T3/Dex in scaenam transcriptionalem globalem textus cardiaci segmentorum investigandum, RNAseq in segmentis cardiacis ex omnibus quattuor condicionibus culturae diversis perfecimus (Data Suppletoria 1). Curiose, sectiones MT similitudinem transcriptionalem magnam cum textu cardiaco recenti demonstraverunt, cum solum 16 genis differentialiter expressis ex 13,642. Tamen, ut antea demonstravimus, segmenta Ctrl 1229 gena differentialiter expressa post 10-12 dies in cultura ostenderunt (Fig. 4e). Haec data per qRT-PCR genorum cardiacorum et fibroblastorum confirmata sunt (Fig. Suppletoria 7a-c). Curiose, sectiones Ctrl deregulationem genorum cardiacorum et cycli cellularis et activationem programmatum genorum inflammatoriorum demonstraverunt. Haec data suggerunt dedifferentiationem, quae normaliter post culturam diuturnam fit, sub condicionibus MT omnino attenuari (Fig. Suppletoria 8a,b). Studium accuratum genorum sarcomerorum demonstravit solum sub condicionibus MT gena sarcomerum (Fig. 4f) et canalem ionicum (Fig. Supplementaria 9) codificantia conservari, ea a suppressione sub condicionibus Ctrl, TD, et MC protegentes. Haec data demonstrant, cum combinatione stimulationis mechanicae et humoralis (T3/Dex), transcriptoma segmenti cordis simile segmentis cordis recentibus post 12 dies in cultura manere posse.
Haec inventa transcriptionalia confirmantur eo facto quod integritas structuralis cardiomyocytorum in sectionibus cordis sub condicionibus MT per 12 dies optime conservatur, ut demonstrat connexin 43 integrum et localizatum (Fig. 5a). Praeterea, fibrosis in sectionibus cordis sub condicionibus MT significanter redacta est comparata cum Ctrl et similiter cum sectionibus cordis recentibus (Fig. 5b). Haec data demonstrant combinationem stimulationis mechanicae et curationis T3/Dex structuram cardiacam in sectionibus cordis in cultura efficaciter conservare.
Imagines immunofluorescentes repraesentativae troponini-T (viridis), connexini 43 (rubri), et DAPI (caerulei) in sectionibus cordis recens isolatis (D0) vel per 12 dies cultae in omnibus quattuor condicionibus culturae sectionum cordis (scala = 100 µm). Quantificatio integritatis structuralis textus cordis per intelligentiam artificialem (n = 7 (D0 et D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC et D12 MT) segmenta/coetus ex porcis diversis, probatio ANOVA unidirectionalis peracta; ####p < 0.0001 comparatum cum D0 et *p < 0.05, vel ****p < 0.0001 comparatum cum D12 Ctrl). Quantificatio integritatis structuralis textus cordis per intelligentiam artificialem (n = 7 (D0 et D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC et D12 MT) segmenta/coetus ex porcis diversis, probatio ANOVA unidirectionalis peracta; #### p < 0.0001 comparatum cum D0 et *p < 0.05, vel ****p < 0.0001 comparatum cum D12 Ctrl). оличественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интелноо интелллекта (n = 7 (D0 )(D0)(D0) (n = 7 (D0) (D0 )(D0) (n = 7 (D0) (D0) (D0) (n = 7 (D0) (D0, D0) (n = 7 (D0) (D0) (D0) (n = 7 (D0) (D0) (n = 7 (D0) (D0) (n = 7 (D0 )? D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; сравнению с D12 Ctrl). Quantificatio integritatis structuralis textus cordis utens intelligentia artificiali (n = 7 (D0 et D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC et D12 MT) sectiones/coetus ex porcis diversis, probatio ANOVA unidirectionalis peracta; #### p < 0.0001 comparatum cum D0 et *p < 0.05 vel ****p < 0.0001 comparatum cum D12 Ctrl).n = 7（D0 D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA #### p < 0.0001 D0 *p <0.05 ****p < 0.0001 与D12 Ctrln = 7 （d0 d12 ctrl） （5 d12 td 、 d12 mc d12 mt） ######### p < 0.0001 D0 *p < 0.0001 D0 *p <0.Quantificatio integritatis structuralis textus cardiaci per intelligentiam artificialem in porcis diversis (n = 7 (D0 et D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC et D12 MT) sectiones/coetus) cum probatione ANOVA unidirectionali;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 comparatum cum D0 et *p < 0.05 vel ****p < 0.0001 comparatum cum D12 (Ctrl). b Imagines repraesentativae et quantificatio segmentorum cordis tinctorum tinctura trichroma Massoniana (scala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, et D12 MC), 9 (D12 MT) segmenta/grex ex porcis diversis, probatio ANOVA unidirectionalis peracta est; ####p < 0.0001 comparatum cum D0 et ***p < 0.001, vel ****p < 0.0001 comparatum cum D12 Ctrl). b Imagines repraesentativae et quantificatio segmentorum cordis tinctorum tinctura trichroma Massoniana (scala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, et D12 MC), 9 (D12 MT) segmenta/grex ex porcis diversis, probatio ANOVA unidirectionalis peracta est; ####p < 0.0001 comparatum cum D0 et ***p < 0.001, vel ****p < 0.0001 comparatum cum D12 Ctrl). b епрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красите (масштабная линейка = 500 км) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12; ANOVA; 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Imagines repraesentativae et quantificatio sectionum cordis tinctarum tinctura trichroma Masson (scalae linea = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD et D12 MC), 9 (D12 MT) sectiones/grex ex porcis diversis, ANOVA unidirectionalis peracta; ####p < 0.0001 vs. D0 et ***p < 0.001 vel ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl). b Masson =D µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD D12 MC），来自不同猪的9 D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；###p < 0.0001 D0 ***p < 0.001，或****** p < 0.0001 D12 Ctrl b massaon = 500 µm） n = 10 d0 d12 accidit d12 td d12 mc） 9 d12 mt /组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 D0 ***p < 0.001，或****p < 0.0001 D12 Ctrl b епрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромкам (лисштная = ластная = астная = асненая = лиенн км) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / руппы, один- способ ANOVA;###< свине; или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Imagines repraesentativae et quantificatio sectionum cordis trichroma Masson tinctarum (scala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD et D12 MC), 9 (D12 MT) sectiones ex diversis porcis/grege, una methodus ANOVA; ####p < 0.0001 comparatum cum D0, ***p < 0.001 vel ****p < 0.0001 comparatum cum D12 Ctrl).Vecticulae errorum mediam ± deviationem standardem repraesentant.
Denique, facultas CTCM ad hypertrophiam cardiacam imitandam per extensionem textus cardiaci aucta aestimata est. In CTCM, pressio maxima camerae aeris ab 80 mmHg ad 80 mmHg (extensio normalis) usque ad 140 mmHg (Fig. 6a) aucta est. Hoc incremento 32% in extensione respondet (Fig. 6b), quod antea demonstratum est ut extensionis percentualis correspondens necessaria pro sectionibus cordis ad longitudinem sarcomeri similem ei quae in hypertrophia visa est assequendam. Extensio et velocitas textus cardiaci per contractionem et relaxationem constantes manserunt per sex dies culturae (Fig. 6c). Textus cardiacus ex condicionibus MT extensioni normali (MT (Normalis)) vel condicionibus superextensionis (MT (OS)) per sex dies subiectus est. Iam post quattuor dies in cultura, biomarker hypertrophicus NT-ProBNP significanter elevatus est in medio sub condicionibus MT (OS) comparatus cum condicionibus MT (normalibus) (Fig. 7a). Praeterea, post sex dies culturae, magnitudo cellularum in MT (OS) (Fig. 7b) significanter aucta est comparata cum sectionibus cordis MT (normalis). Accedit quod translocatio nuclearis NFATC4 significanter aucta est in textibus nimis extensis (Fig. 7c). Haec eventa ostendunt progressionem progressivam remodellationis pathologicae post hyperdistensionem et confirmant notionem instrumentum CTCM adhiberi posse ut suggestum ad investigandum signalationem hypertrophiae cardiacae extensione inductam.
Vestigia repraesentativa pressionis camerae aeris, pressionis camerae fluidi, et mensurarum motus textus confirmant pressionem camerae pressionem camerae fluidi mutare, motum correspondentem segmenti textus causando. b Curvae repraesentativae extensionis percentationis et extensionis celeritatis pro sectionibus textus normaliter extensis (aurantiacis) et nimis extensis (caeruleis). c Diagramma columnare ostendens tempus cycli (n = 19 segmenta per gregem, ex porcis diversis), tempus contractionis (n = 18-19 segmenta per gregem, ex porcis diversis), tempus relaxationis (n = 19 segmenta per gregem, ex porcis diversis)), amplitudinem motus textus (n = 14 segmenta/grex, ex porcis diversis), velocitatem systoles maximam (n = 14 segmenta/grex, ex porcis diversis) et velocitatem relaxationis maximam (n = 14 (D0), 15 (D6)) sectiones/greges) ex porcis diversis), probatio t Studentis bilateralis nullam differentiam significantem in ullo parametro ostendit, indicando hos parametros constantes mansisse per 6 dies culturae cum overvoltage. Vectae erroris repraesentant mediam ± deviationem standardem.
Quantificatio concentrationis NT-ProBNP in mediis culturae, per graphum columnarium, ex segmentis cordis sub condicionibus extensionis normalis MT (Norm) vel extensionis superfluae (OS) cultae (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, et D4 MTOS) segmenta/grex ex porcis diversis. ANOVA bidirectionalis peracta est; **p < 0.01 comparatum cum extensione normali). Quantificatio concentrationis NT-ProBNP in mediis culturae ex segmentis cordis sub condicionibus extensionis normalis MT (Norm) vel extensionis superfluae (OS) cultae (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, et D4 MTOS) segmenta/grex ex porcis diversis, ANOVA bidirectionalis peracta; **p < 0.01 comparatum cum extensione normali).Histogramma quantitativum concentrationis NT-ProBNP in medio culturae ex segmentis cordis cultae sub condicionibus extensionis MT normalis (norma) vel extensionis superfluae (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, et D4).MTOS) segmenta/coetus ex porcis diversis, analysis variantiae duorum factorum peracta;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 comparatum cum extensione normali.** a (Norm) (OS) NT-ProBNP n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0.01）。 Quantitas concentrationis NT-ProBNP in corde squamorum excultorum sub MT protentu normali (Norm) vel conditiones (n = 4 (D2 MTNorm) 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) a diversis /组，可以双向方方发发动 comparatis cum normali extensione p < 0.01).Histogramma quantificatio concentrationum NT-ProBNP in segmentis cordis sub condicionibus extensionis MT normalis (norma) vel extensionis superfluae (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) et D4 MTOS) segmenta/grex ex porcis diversis culta, analysis variantiae bidirectionalis;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 comparatum cum extensione normali.** b Imagines repraesentativae segmentorum cordis troponino-T et WGA tinctorum (sinistra) et quantificationis magnitudinis cellularum (dextra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellulae/grex ex 10 segmentis diversis ex porcis diversis, probatio t Studentis bicaudata peracta est; ****p < 0.0001 comparatum cum extensione normali). b Imagines repraesentativae segmentorum cordis troponino-T et WGA tinctorum (sinistra) et quantificationis magnitudinis cellularum (dextra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellulae/grex ex 10 segmentis diversis ex porcis diversis, probatio t Studentis bicaudata peracta est; ****p < 0.0001 comparatum cum extensione normali). b епрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и (слева) и колиественного . клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 тьюдента; ****p< 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Imagines repraesentativae sectionum cordis troponino-T et AZP tinctarum (sinistra) et quantificationis magnitudinis cellularum (dextra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellulae/grex ex 10 sectionibus diversis ex porcis diversis, probatio t Studentis bicaudata peracta est; ****p < 0.0001 comparatum cum stirpe normali). b -T WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS），来自不同猪的10 369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t ****p < 0.0001）。 b Imagines repraesentativae segmentorum cordis tinctorum calcareino-T et WGA (sinistra) et magnitudinis cellularum (dextra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 ex 10 segmentis diversis (D6 MTNorm)). Cellulae/mm, probatio t ad mensuram normalem perveniendi; comparatae cum extensione normali, ****p < 0.0001). b епрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и (слева) и колиественная копониная (Справа) (n = CCCXXX (D6 MTOS), CCCLXIX (D6 Mtnorm) из X различх срезов от разных Свитерий клетор / гритерий квустои / критерий Стьюдента, **** P <0-201 по сравнению с нормальным (or) deflatio. b Imagines repraesentativae sectionum cordis troponino-T et AZP tinctarum (sinistra) et quantificatio magnitudinis cellularum (dextra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ex 10 sectionibus diversis ex porcis diversis) Cellulae/grex, criterium bicaudum t Studentis; ****p < 0.0001 comparatum cum stirpe normali). c Imagines repraesentativae pro segmentis cordis MTOS diei 0 et diei 6, troponino-T et NFATC4 immunosignatis, et quantificatio translocationis NFATC4 ad nucleos CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) segmenta/grex ex porcis diversis, probatio t Studentis bicaudata peracta est; *p < 0.05). c Imagines repraesentativae pro segmentis cordis MTOS diei 0 et diei 6, troponino-T et NFATC4 immunosignatis, et quantificatio translocationis NFATC4 ad nucleos CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) segmenta/grex ex porcis diversis, Probatio t Studentis bicaudata peracta est; *p < 0.05). c епрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и клиста- и NFATC4, и NFATC4, иуномееных оценка транслокации NFATC4 в дра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней; двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Imagines repraesentativae sectionum cordis post 0 et 6 dies MTOS, immunosignatae pro troponino-T et NFATC4, et quantificatio translocationis NFATC4 in nucleo cellularum cavernosarum (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) segmenta/grex ex porcis diversis) probationem t Studentis bilateralem peractam; *p < 0.05). c -T NFATC4 0 6 MTOS NFATC4 CM n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) /组, t *p < 0.05)。 c Repraesentativarum imagines calcanin-T et NFATC4 0天和第6天MTOS crustae cordis immunolae, et NFATC4 e diversis NFATC4 CM cellae nuclei quantitatis (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) /组, et *p < 0,05). c епрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином- и NFA оценка транслокации NFATC4 в дра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- востатый t-критатый t-критат. c Imagines repraesentativae segmentorum cordis MTOS diebus 0 et 6 ad immunosignationem troponini-T et NFATC4 et quantificationem translocationis NFATC4 in nucleo CM ex porcis diversis (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) segmenta/grex, criterium t bicaudum Studentis; *p < 0.05).Vectigalia errorum mediam ± deviationem standardem repraesentant.
Investigatio cardiovascularis translationalis exempla cellularia requirit quae accurate ambitum cardiacum reproducunt. In hoc studio, instrumentum CTCM elaboratum et descriptum est quod sectiones tenuissimas cordis stimulare potest. Systema CTCM stimulationem electromechanicam physiologice synchronizatam et locupletationem fluidorum T3 et Dex includit. Cum sectiones cordis porcini his factoribus expositae sunt, eorum viabilitas, integritas structuralis, activitas metabolica, et expressio transcriptionalis post duodecim dies culturae eaedem manebant ac in textu cordis recenti post duodecim dies culturae. Praeterea, extensio excessiva textus cardiaci hypertrophiam cordis, hyperextensione causatam, causare potest. Summa summarum, haec eventa munus criticum condicionum culturae physiologicarum in conservando phaenotypo cardiaco normali confirmant et suggestum pro examine medicamentorum praebent.
Multi factores ad creandum ambitum optimum functioni et superviventiae cardiomyocytorum conferunt. Ex his factoribus manifestissimi ad (1) interactiones intercellulares, (2) stimulationem electromechanicam, (3) factores humorales, et (4) substrata metabolica pertinent. Interactiones physiologicae inter cellulas requirunt complexas retia tridimensionalia plurium generum cellularum sustentata matrice extracellulari. Tales interactiones cellulares complexae difficile est reconstruere in vitro per co-culturam singularum generum cellularum, sed facile effici possunt utens natura organotypica sectionum cordis.
Extensio mechanica et stimulatio electrica cardiomyocytorum necessariae sunt ad phaenotypum cardiacum conservandum33,34,35. Dum stimulatio mechanica late adhibita est ad hiPSC-CM condicionem et maturationem, nonnulla studia elegantia nuper stimulationem mechanicam segmentorum cordis in cultura utens onere uniaxiali tentaverunt. Haec studia ostendunt onere mechanico uniaxiali bidimensionali (2D) effectum positivum habere in phaenotypum cordis per culturam. In his studiis, sectiones cordis vel viribus tensilibus isometricis17, onere auxotonico lineari18 oneratae sunt, vel cyclus cardiacus recreatus est utens retroactione transductoris vis et impulsionibus tensionis. Attamen hae methodi extensionem textus uniaxialem sine optimizatione environmentali utuntur, quod suppressionem multorum genorum cardiacorum vel superexpressionem genorum cum responsionibus extensionis abnormalibus consociatorum efficit. CTCM hic descriptum stimulum electromechanicum tridimensionalem praebet qui cyclum cardiacum naturalem imitatur secundum tempus cycli et extensionem physiologicam (25% extensio, 40% systole, 60% diastole, et 72 pulsus per minutum). Quamquam haec stimulatio mechanica tridimensionalis sola non sufficit ad integritatem textus conservandam, combinatio stimulationis humoralis et mechanicae utens T3/Dex requiritur ad vitalitatem, functionem et integritatem textus rite conservandam.
Factores humorales magnum momentum habent in modulando phaenotypo cordis adulti. Hoc illustratum est in studiis HiPS-CM, in quibus T3 et Dex additi sunt mediis culturae ad accelerandam maturationem cellularum. T3 potest translationem aminoacidorum, saccharorum et calcii trans membranas cellularum afficere36. Praeterea, T3 expressionem MHC-α et deminutionem MHC-β promovet, formationem myofibrillarum celeris contractionis in cardiomyocytis maturis promovens, comparatis cum myofibrillis lentis contractionis in CM fetali. Defectus T3 in aegris hypothyroideis in amissione fasciarum myofibrillarium et reductione evolutionis toni37 efficit. Dex in receptoria glucocorticoidum agit et contractilitatem myocardialem augere demonstratum est in cordibus perfusis isolatis;38 haec emendatio putatur coniuncta esse cum effectu in ingressum a deposito calcii impulsum (SOCE)39,40. Praeterea, Dex receptoribus suis se iungit, latam responsionem intracellularem causans quae functionem immunem et inflammationem reprimit30.
Nostrae conclusiones indicant stimulationem physico-mechanicam (MS) culturae efficaciam generalem emendavisse comparata cum Ctrl, sed viabilitatem, integritatem structuralem, et expressionem cardiacam per duodecim dies in cultura conservare non potuisse. Comparata cum Ctrl, additio T3 et Dex culturis CTCM (MT) viabilitatem auxit et similes transcriptionis perfiles, integritatem structuralem, et actionem metabolicam cum recenti textu cordis per duodecim dies conservavit. Praeterea, gradu extensionis textus moderando, exemplar hypertrophiae cardiacae hyperextensione inductae creatum est utens STCM, versatilitatem systematis STCM illustrans. Notandum est, quamquam remodellatio cardiaca et fibrosis plerumque organa integra implicant quorum cellulae circulantes cytokinas idoneas necnon phagocytosin et alios factores remodellationis praebere possunt, sectiones cordis adhuc processum fibroticum in responsione ad accentum et trauma imitari possunt. in myofibroblastas. Hoc antea in hoc exemplo sectionis cardiacae aestimatum est. Notandum est parametros CTCM modulari posse mutando pressionem/amplitudinem electricam et frequentiam ad simulandas multas condiciones ut tachycardiam, bradycardiam, et subsidium circulatorium mechanicum (cor mechanice exoneratus). Hoc systema medium processum ad probationes medicamentorum efficit. Facultas CTCM ad hypertrophiam cardiacam ex labore nimio inductam simulandam viam sternit ad hoc systema probandum ad therapiam personalizatam. In conclusione, hoc studium demonstrat extensionem mechanicam et stimulationem humoralem necessarias esse ad culturam sectionum textus cardiaci conservandam.
Quamquam data hic exhibita suggerunt CTCM esse suggestum valde promittens ad myocardium integrum simulandum, haec methodus culturae nonnullas limitationes habet. Limitatio principalis culturae CTCM est quod continuas tensiones mechanicas dynamicas in segmenta imponit, quod facultatem impedit active contractiones segmentorum cardiacorum per singulos cyclos monitorandi. Praeterea, propter parvam magnitudinem sectionum cardiacarum (7 mm), facultas functionem systoleticam extra systemata culturae utens sensoribus vis traditionalibus aestimandi limitata est. In hoc manuscripto, hanc limitationem partim superamus aestimando tensionem opticam ut indicatorem functionis contractilis. Tamen, haec limitatio ulteriorem laborem requiret et in futuro tractari potest introducendo methodos ad monitorationem opticam functionis segmentorum cordis in cultura, ut mappationem opticam utens calcio et tincturis tensioni sensibilibus. Alia limitatio CTCM est quod exemplar operans tensionem physiologicam (praeonus et postonus) non manipulat. In CTCM, pressio in directionibus oppositis inducta est ad reproducendum 25% extensionem physiologicam in diastole (extensione plena) et systole (longitudo contractionis per stimulationem electricam) in textibus magnis. Haec limitatio in futuris consiliis CTCM removenda est per pressionem idoneam in textum cardiacum ex utraque parte et per applicationem exactarum relationum pressionis et voluminis quae in cameris cordis occurrunt.
Remodellatio ab hypertensione inducta, quae in hoc manuscripto descripta est, ad imitationem signorum hypertensionis hypertrophicae limitatur. Ergo, hoc exemplar auxilium ferre potest in studio signalationis hypertrophicae ab hypertensione inductae sine necessitate factorum humoralium vel neuralum (qui in hoc systemate non existunt). Studia ulteriora necessaria sunt ad multiplicitatem CTCM augendam, exempli gratia, co-cultura cum cellulis immunibus, factoribus humoralibus plasmatis circulantis, et innervatione cum co-cultura cum cellulis neuronalibus possibilitates modellationis morborum cum CTCM emendabunt.
Tredecim porci in hoc studio adhibiti sunt. Omnes curationes in animalibus secundum normas institutionales peractae sunt et a Commissione Curae et Usus Animalium Institutionalis Universitatis Ludovicopolitanae probatae sunt. Arcus aortae compressus est et cor uno litro cardioplegiae sterilis (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparini, pH usque ad 7.4) perfusum est; Corda in solutione cardioplegica glaciali conservata sunt donec ad laboratorium super glaciem transportata sunt, quod plerumque <10 min. fit. Corda in solutione cardioplegica glaciali conservata sunt donec ad laboratorium super glaciem transportata sunt, quod plerumque <10 min. fit. сердца ранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льорию на льорию на льдебычноти льорию на льорию оти льорию ин. Corda in solutione cardioplegica glaciali conservata sunt usque ad transportationem ad laboratorium in glacie, quod plerumque <10 min durat.<10分钟。<10分钟。 ержите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 ин. Corda in glacie, cardioplegiae causa, serva donec ad laboratorium in glacie transportentur, plerumque <10 min.
Instrumentum CTCM programmate SolidWorks ad designandum adiuvandum computatrum (CAD) elaboratum est. Camerae culturae, divisores et camerae aeris ex plastica acrylica perspicua CNC fabricatae sunt. Anulus subsidiarius 7mm diametro ex polyethylene altae densitatis (HDPE) in centro factus est et sulcum anuli toriformis habet ad anulum toriformem siliconis, qui ad obsignandum medium subterraneum adhibetur, recipiendum. Membrana siliconis tenuis cameram culturae a lamina separationis separat. Membrana siliconis ex lamina siliconis 0.02″ crassitudinis laser-excisa est et duritiem 35A habet. Obturamenta siliconis inferiora et superiora ex lamina siliconis 1/16″ crassitudinis laser-excisa sunt et duritiem 50A habent. Cochleae et nuces alatae chalybis inoxidabilis 316L ad figendum massam et obsignationem hermeticam creandam adhibentur.
Tabula circuiti impressi (PCB) dedicata ad integrationem cum systemate C-PACE-EM destinata est. Connectores machinae Helveticae in PCB cum electrodis graphitis filis cupreis argenteis obductis et cochleis aeneis 0-60 in electrodos affixis connectuntur. Tabula circuiti impressi in operculo impressoris tridimensionalis collocatur.
Instrumentum CTCM a actuatore pneumatico programmabili (PPD) regitur, qui pressionem circulatoriam moderatam, similem cyclo cardiaco, creat. Cum pressio intra cameram aeris crescit, membrana flexibilis siliconea sursum expandit, medium sub locum textus cogens. Area textus deinde hac expulsione fluidi distendatur, expansionem physiologicam cordis per diastolem imitans. Ad culmen relaxationis, stimulatio electrica per electrodos graphitos applicata est, quae pressionem in camera aeris minuerunt et contractionem sectionum textus effecerunt. Intra tubum valvula haemostatica cum sensore pressionis est ad pressionem in systemate aeris detegendam. Pressio a sensore pressionis percepta ad collectorem datorum, computatro portatili connexum, applicatur. Hoc permittit continuam monitorationem pressionis intra cameram gasis. Cum maxima pressio camerae pervenisset (normalis 80 mmHg, 140 mmHg OS), instrumentum acquisitionis datorum iussum est signum ad systema C-PACE-EM mittere ad signum tensionis biphasicum per 2 ms generandum, ad 4 V positum.
Sectiones cordis obtentae sunt et condiciones culturae in sex puteis hoc modo peractae sunt: ​​corda collecta e vase translationis in alveum continentem cardioplegiam frigidam (4° C.) transferuntur. Ventriculus sinister lamina sterili segregatus et in frusta 1-2 cm3 sectus est. Hae frustae textus fulcris textus glutino textus adfixae et in balneo textu microtomi vibranti cum solutione Tyrode positae sunt et continue oxygenatae (3 g/L 2,3-butanedionis monooximi (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-glucosi (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml solutionis 1 M), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml solutionis 1 M), usque ad 1 L ddH2O). Microtomum vibrans ita aptatum est ut segmenta 300 µm crassa secaret, frequentia 80 Hz, amplitudine vibrationis horizontalis 2 mm, et celeritate progressionis 0.03 mm/s. Balneum textus glacie circumdatum est ut solutio frigida maneret, et temperatura ad 4°C conservata est. Sectiones textus e balneo microtomi ad balneum incubationis, quod solutionem Tyrode continue oxygenatam in glacie continebat, transferantur, donec satis sectionum pro una lamina culturae obtineantur. Pro culturis transwell, sectiones textus ad sustentacula polyurethana sterilia 6 mm lata adnexae et in 6 ml medii optimizati (medium 199, supplementum ITS 1x, FBS 10%, VEGF 5 ng/ml, FGF-alcalinum 10%, antibioticum-antifungal 2X) collocatae sunt. Stimulatio electrica (10 V, frequentia 1.2 Hz) sectionibus textus per C-Pace applicata est. Pro condicionibus TD, T3 et Dex recens ad 100 nM et 1 μM ad singulas mutationes medii additi sunt. Medium oxygenio saturatur ante substitutionem ter in die. Sectiones textus in incubatore ad 37°C et 5% CO2 cultae sunt.
Ad culturas CTCM, sectiones textuum in impressore tridimensionali ad usum fabricato in patella Petri solutionem Tyrode modificatam continente collocatae sunt. Instrumentum designatum est ad magnitudinem segmenti cordis 25% areae anuli sustentantis augendam. Hoc fit ne sectiones cordis post translationem ex solutione Tyrode in medium et per diastolem extendantur. Glutine histoacrylico utens, sectiones 300 µm crassae anulo sustentanti 7 mm diametro fixae sunt. Postquam sectiones textuum anulo sustentanti affixae sunt, sectiones superfluae textuum abscindentur et sectiones textuum adnexae in balneum solutionis Tyrode in glacie (4°C) repone donec satis sectionum pro uno instrumento praeparatae sint. Tempus processus totale pro omnibus instrumentis duas horas non excedere debet. Postquam sex sectiones textuum anulis sustentantibus affixae sunt, instrumentum CTCM compositum est. Camera culturae CTCM 21 ml medii prae-oxygenati praeimpleta est. Sectiones textuum in cameram culturae transfer et bullas aeris pipetta diligenter remove. Pars textus deinde in foramen ducitur et leniter in locum suum premitur. Denique, operculum electrodi in instrumento pone et instrumentum in incubatorem transfer. Tum CTCM tubo aereo et systemati C-PACE-EM coniunge. Actuator pneumaticus aperit et valvula aereus CTCM aperit. Systema C-PACE-EM ita configuratum est ut 4 V ad 1.2 Hz per stimulationem biphasicam per 2 ms traderet. Medium bis in die mutatum est et electrodi semel in die mutati sunt ne accumulatio graphiti in electrodis fieret. Si opus est, partes textus e puteis culturae removeri possunt ut bullae aereas quae sub eis ceciderunt expellantur. Pro condicionibus curationis MT, T3/Dex recens additum est cum singulis mutationibus medii cum 100 nM T3 et 1 μM Dex. Instrumenta CTCM in incubatore ad 37°C et 5% CO2 culta sunt.
Ad trajectorias extensas segmentorum cordis obtinendas, systema camerae speciale elaboratum est. Camera SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Iaponia) cum lente macro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA) adhibita est. Visualizatio temperatura ambiente peracta est postquam medium novo medio substitutum est. Camera ad angulum 51° posita est et video 30 imaginibus per secundum captatur. Primo, programmatura aperta (MUSCLEMOTION43) cum Image-J adhibita est ad motum segmentorum cordis quantificandum. Larva creata est utens MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) ad regiones interessantes pro segmentis cordis pulsante definiendas ad strepitum vitandum. Larvae manu segmentatae omnibus imaginibus in sequentia imaginum applicantur et deinde ad extensionem MUSCLEMOTION traduntur. Muscle Motion intensitatem mediam pixelorum in unoquoque imagine utitur ad motum suum relativum ad imaginem referentialem quantificandum. Data capta, filtrata et ad tempus cycli quantificandum et extensionem textus per cyclum cardiacum aestimandam adhibita sunt. Video captum post-processum est utens filtro digitali primi ordinis phasis zero. Ad quantificandam extensionem textus (a culmine ad culmen), analysis a culmine ad culmen peracta est ad distinguendum inter culmina et valles in signo capto. Praeterea, detrending perficitur utens polynomio sexti ordinis ad tollendam deviationem signalis. Codex programmatis elaboratus est in MATLAB ad determinandum motum globalem textus, tempus cycli, tempus relaxationis, et tempus contractionis (Codex Programmatis Supplementi 44).
Ad analysin deformationis, utens eisdem videos creatis ad aestimationem extensionis mechanicae, primum duas imagines delineavimus, quae cacumina motus (summa (superiora) et infima (inferiora) puncta motus) repraesentabant, secundum programmatum MUSCLEMOTION. Deinde regiones textus segmentavimus et formam algorithmi umbrae textui segmentato adhibuimus (Figura Suppletoria 2a). Textus segmentatus deinde in decem subsuperficies divisus est, et tensio in utraque superficie calculata est utens aequatione sequenti: Deformatio = (Sup-Sdown)/Sdown, ubi Sup et Sdown sunt distantiae formae ab umbris superioribus et inferioribus textili, respective (Figura Suppletoria 2b).
Sectiones cordis in paraformaldehydo 4% per horas 48 fixae sunt. Textus fixae in saccharo 10% et 20% per horam unam dehydratae sunt, deinde in saccharo 30% per noctem. Sectiones deinde in composito temperaturae optimae sectionis (compositum OCT) inclusae et gradatim in balneo isopentano/glaciei siccae congelatae sunt. Quadra inclusionis OCT ad -80°C usque ad separationem servanda sunt. Laminae ut sectiones crassitudine 8 μm praeparatae sunt.
Ad OCT e sectionibus cordis removendum, laminas in blocco calefaciente ad 95°C per 5 min calefac. Adde 1 ml PBS singulis laminis et incuba per 30 min temperatura ambiente, deinde sectiones permeare ponendo 0.1% Triton-X in PBS per 15 min temperatura ambiente. Ad prohibendum ne anticorpora non specifica cum exemplo se adhaereant, adde 1 ml solutionis 3% BSA laminis et incuba per 1 h temperatura ambiente. Deinde BSA remota est et laminae PBS lavatae sunt. Singula exempla graphio nota. Anticorpora primaria (dilutio 1:200 in 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) et troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) per 90 minuta addita sunt, deinde anticorpora secundaria (dilutio 1:200 in 1% BSA) contra Alexa Fluor 488 murinum (Thermo Scientific; #A16079), contra Alexa Fluor 594 leporinum (Thermo Scientific; #T6391) per 90 minuta addita. Ter PBS abluta sunt. Ad distinguendam tinctionem scopi a fundo, solum anticorpus secundarium ut exemplar testium usi sumus. Denique, tinctura nuclearis DAPI addita est et laminae in vectashield (Vector Laboratories) positae et pigmento unguium obsignatae sunt. (amplificatione -x) et microscopio Keyence cum amplificatione 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) ad 5 μg/ml in PBS ad tinctionem WGA adhibitum est et sectionibus fixis per 30 minuta ad temperaturam ambientem applicatum est. Laminae deinde PBS ablutae sunt et Sudan nigrum singulis laminis additum et per 30 minuta incubatae sunt. Deinde PBS ablutae sunt et medium inclusionis Vectashield additum est. Laminae in microscopio Keyence ad magnificationem 40x visualizatae sunt.
OCT ex exemplaribus sicut supra descriptum est remotum est. Post OCT remotionem, laminae in solutione Bouin per noctem immerguntur. Deinde laminae aqua destillata per horam unam ablutae sunt, deinde in solutione Bibrich aloe acidi fuchsini per decem minuta positae. Tum laminae aqua destillata ablutae et in solutione 5% phosphomolybdeni/5% acidi phosphotungstici per decem minuta positae sunt. Sine ablutione, laminae directe in solutionem anilini caerulei per quindecim minuta transferuntur. Deinde laminae aqua destillata ablutae et in solutione 1% acidi acetici per duas minutas positae sunt. Laminae in ethanolo 200 N siccatae et in xylenum translatae sunt. Laminae tinctae microscopio Keyence cum obiectivo 10x visualizatae sunt. Percentatio areae fibrosis programmate Keyence Analyzer quantificata est.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), numero catalogi V13154, secundum protocollum fabricatoris cum quibusdam modificationibus. Praesertim, punctum chirurgicum diametro 6 mm adhibitum est ad magnitudinem textus uniformem per analysin MTT curandam. Textus singillatim in puteos laminae 12 puteorum substratum MTT continentis secundum protocollum fabricatoris collocati sunt. Sectiones ad 37° C per 3 horas incubantur et textus vivus substratum MTT metabolizat ad compositum formazani purpurei formandum. Solutionem MTT cum 1 ml DMSO substitue et ad 37°C per 15 minuta incuba ad formazanum purpureum ex sectionibus cordis extrahendum. Exempla in DMSO 1:10 diluta sunt in laminis 96 puteorum fundo perspicuo et intensitas coloris purpurei ad 570 nm mensurata est utens lectore laminae Cytation (BioTek). Lectiones ad pondus cuiusque segmenti cordis normalizatae sunt.
Medium segmentorum cordis medio continenti 1 μCi/ml [5-3H]-glucosi (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) substitutum est ad experimentum utilizationis glucosii, ut antea descriptum est. Post quattuor horas incubationis, 100 µl medii in tubulum microcentrifugum apertum, continentem 100 µl HCl 0.2 N, adde. Deinde tubus in tubulum scintillationis 500 μl dH₂O continentem positus est, ut [3H]₂O per 72 horas ad 37°C evaporaret. Tum tubulum microcentrifugum e tubo scintillationis remove et 10 ml fluidi scintillationis adde. Numerationes scintillationis per analysatorem scintillationis liquidi Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA) peractae sunt. Usus glucosi deinde calculatus est, rationibus habita actione specifica glucosi [5-3H], aequilibrio incompleto et fundamento, dilutione [5-3H] ad glucosum non designatum, et efficacia computatoris scintillationis. Data ad massam sectionum cordis normalizata sunt.
Post homogenizationem textuum in Trizol, RNA ex sectionibus cordis isolata est utens Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 secundum protocollum fabricatoris. Praeparatio bibliothecae RNAsec, sequentiatio et analysis datorum hoc modo peracta sunt:
Materia initialis ad bibliothecam RNA praeparandam adhibita est 1 μg RNA per specimen. Bibliothecae sequentiationis generatae sunt utens NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit pro Illumina (NEB, USA) secundum commendationes fabricatoris, et codices indices additi sunt sequentiis attributorum pro quolibet specimine. Breviter, mRNA ex RNA totali purificatum est utens globulis magneticis cum oligonucleotidis poly-T iunctis. Fragmentatio perficitur utens cationibus divalentibus ad altam temperaturam in NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). cDNA primi filamenti synthesizata est utens initiatoribus hexameris fortuitis et M-MuLV transcriptase inversa (RNase H-). cDNA secundi filamenti deinde synthesizata est utens DNA polymerase I et RNase H. Reliquae prominentiae in extremitates obtusas convertuntur per actionem exonucleasis/polymerasis. Post adenylationem extremitatis 3′ fragmenti DNA, Adaptor NEBNext cum structura ansarum capillatarum ei adnectitur ut illud ad hybridizationem paret. Ad selectionem fragmentorum cDNA longitudinis praeferentiae 150-200 bp. Fragmenta bibliothecae purificata sunt utens systemate AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA). Deinde, 3 μl USER Enzymi (NEB, USA) cum cDNA secundum magnitudinem selectam cum adaptatore ligato per 15 minuta ad 37°C et deinde per 5 minuta ad 95°C ante PCR adhibita sunt. PCR deinde peracta est utens Phusion High-Fidelity DNA polymerase, initia PCR universalia, et initia Index (X). Denique, producta PCR purificata sunt (systema AMPure XP) et qualitas bibliothecae aestimata est in systemate Agilent Bioanalyzer 2100. Bibliotheca cDNA deinde sequentiata est utens sequentiatore Novaseq. Fasciculi imaginum crudarum ex Illumina in lectiones crudas conversae sunt utens CASAVA Base Calling. Data cruda servantur in fasciculis formae FASTQ(fq) quae sequentias lectas et qualitates basium correspondentes continent. HISAT2 elige ut lectiones sequentiationis percolatae cum genoma referentiali Sscrofa11.1 congruant. In genere, HISAT2 genoma cuiuslibet magnitudinis sustinet, etiam genoma maiora quam quattuor miliarda basium, et valores praedefiniti pro plerisque parametris constituuntur. Lectiones splicing ex datis RNA Seq efficaciter ordinari possunt utens HISAT2, celerrimo systemate hodie praesto, cum eadem vel meliore accuratione quam ulla alia methodus.
Abundantia transcriptionum directe gradum expressionis genorum reflectit. Gradus expressionis genorum aestimantur per abundantiam transcriptionum (numerum sequentiationis) cum genoma vel exonibus associatarum. Numerus lectionum proportionalis est gradibus expressionis genorum, longitudini genorum, et profunditati sequentiationis. FPKM (fragmenta per mille paria basium transcriptionis sequentiata per decies centena milia parium basium) computata sunt et valores P expressionis differentialis determinati sunt utens fasciculo DESeq2. Deinde falsam inventionis ratem (FDR) pro quolibet valore P computavimus utens methodo Benjamini-Hochberg9 fundata in functione R insita "p.adjust".
RNA ex sectionibus cordis isolata in cDNA concentratione 200 ng/μl conversa est, mixtura SuperScript IV Vilo Master a Thermo (Thermo, cat. no. 11756050) utens. RT-PCR quantitativa peracta est utens lamina reactionis perspicua Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well (Thermo, cat. no. 4483319) et glutino optico microamp (Thermo, cat. no. 4311971). Mixtura reactionis constabat ex 5 µl mixturae Taqman Fast Advanced Master (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer et 3.5 µl H2O per puteum mixtis. Cycli qPCR normati cucurri sunt et valores CT mensi sunt utens instrumento PCR temporis realis Quantstudio 5 Applied Biosystems (modulo 384-well; product # A28135). Initiatores Taqman a Thermo empti sunt (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Valores CT omnium exemplorum ad gen domesticum GAPDH normalizati sunt.
Emissio NT-ProBNP in medium aestimata est utens apparatu NT-ProBNP (porco) (Numero Catalogi MBS2086979, MyBioSource) secundum protocollum fabricatoris. Breviter, 250 µl cuiusque exempli et normae duplicatim in singulos puteos additum est. Statim post additionem exempli, 50 µl Reagentis Experimentalis A in singulos puteos adde. Laminam leniter agita et obturante claude. Deinde tabulae ad 37°C per horam unam incubatae sunt. Tum solutionem aspira et puteos quater cum 350 µl solutionis lavacri 1X lava, solutionem lavacri per 1-2 minuta singulis vicibus incubando. Tum 100 µl Reagentis Experimentalis B per puteum adde et obturante laminae claude. Tabula leniter agitata et ad 37°C per 30 minuta incubata est. Solutionem aspira et puteos quinquies cum 350 µl solutionis lavacri 1X lava. Adde 90 µl solutionis substrati in singulos puteos et laminam claude. Incuba laminam ad 37°C per 10-20 minuta. Adde 50 µl Solutionis Sistendi in singulos puteos. Lamina statim mensurata est utens lectore laminarum Cytation (BioTek) ad 450 nm posito.
Analyses potentiae peractae sunt ad magnitudines coetuum eligendas quae potentiam >80% praebebunt ad mutationem absolutam 10% in parametro cum ratione erroris Typi I 5% detegendam. Analyses potentiae peractae sunt ad magnitudines coetuum eligendas quae potentiam >80% praebebunt ad mutationem absolutam 10% in parametro cum ratione erroris Typi I 5% detegendam. нализ ощности был выполнен для выбора размеров рупп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружаенитяов% изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Analysis potentiae peracta est ad magnitudines coetuum eligendas quae potentiam >80% praeberent ad detegendam mutationem parametrorum absolutorum 10% cum ratione erroris Typi I 5%.> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы> LXXX% Мощности для X% обнаружениени для Абсолютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Analysis potentiae peracta est ad magnitudinem coetus eligendam quae plus quam 80% potentiam praeberet ad 10% mutationem parametrorum absolutam et 5% erroris typi I detegendam.Sectiones textuum ante experimentum temere selectae sunt. Omnes analyses conditione caecae factae sunt et exempla solum postquam omnia data analysata sunt decodificata sunt. Programma GraphPad Prism (San Diego, CA) ad omnes analyses statisticas peragendas adhibitum est. Pro omnibus statisticis, valores p significativos aestimati sunt ad valores <0.05. Pro omnibus statisticis, valores p significantes aestimati sunt ad valores <0.05. ля всей статистики p-значения считались начимыми при начениях <0.05. Pro omnibus statisticis, valores p significantes aestimati sunt ad valores <0.05.p <0.05p <0.05 ля всей статистики p-значения считались начимыми при начениях <0.05. Pro omnibus statisticis, valores p significantes aestimati sunt ad valores <0.05.Examen t Studentis bicaudatum in datis cum duabus tantum comparationibus peractum est. ANOVA unidirectionalis vel bidirectionalis adhibita est ad significantiam inter plures greges determinandam. Cum probationes post hoc peragebantur, correctio Tukey adhibita est ad comparationes multiplices computandas. Data RNAsec considerationes statisticas speciales habent cum FDR et p.adjust computantur, ut in sectione Methodorum describitur.
Plura de consilio studii invenies in summario Relationis Investigationis Naturae, quod huic articulo coniunctum est.