Děkujeme za návštěvu webu Nature.com. Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS. Pro dosažení nejlepšího zážitku doporučujeme používat aktualizovaný prohlížeč (nebo v aplikaci Internet Explorer vypnout režim kompatibility). Mezitím budeme web vykreslovat bez stylů a JavaScriptu, abychom zajistili jeho nepřetržitou podporu.
Existuje potřeba spolehlivého in vitro systému, který dokáže přesně reprodukovat fyziologické prostředí srdce pro testování drog. Omezená dostupnost systémů pro kultivaci lidské srdeční tkáně vedla k nepřesným interpretacím účinků léků na srdce. V této studii jsme vyvinuli model pro kultivaci srdeční tkáně (CTCM), který elektromechanicky stimuluje srdeční řezy a podléhá fyziologickému roztahování během systolické a diastolické fáze srdečního cyklu. Po 12 dnech kultivace tento přístup částečně zlepšil životaschopnost srdečních řezů, ale plně nezachoval jejich strukturální integritu. Po screeningu malých molekul jsme proto zjistili, že přidání 100 nM trijodthyroninu (T3) a 1 μM dexamethasonu (Dex) do našeho média udrželo mikrostrukturu řezů po dobu 12 dnů. V kombinaci s ošetřením T3/Dex si systém CTCM udržel transkripční profily, životaschopnost, metabolickou aktivitu a strukturální integritu na stejné úrovni jako čerstvá srdeční tkáň po dobu 12 dnů. Nadměrné roztahování srdeční tkáně v kultuře navíc indukuje hypertrofickou srdeční signalizaci, což svědčí o schopnosti CTCM napodobovat hypertrofické stavy vyvolané roztahováním srdce. Závěrem lze říci, že CTCM dokáže modelovat fyziologii a patofyziologii srdce v kultuře po dlouhou dobu, což umožňuje spolehlivý screening léků.
Před klinickým výzkumem jsou zapotřebí spolehlivé in vitro systémy, které dokáží přesně reprodukovat fyziologické prostředí lidského srdce. Takové systémy by měly napodobovat změněné mechanické roztažení, srdeční frekvenci a elektrofyziologické vlastnosti. Zvířecí modely se běžně používají jako screeningová platforma pro srdeční fyziologii s omezenou spolehlivostí při odrážení účinků léků v lidském srdci1,2. Ideální experimentální model srdeční tkáňové kultury (CTCM) je model, který je vysoce citlivý a specifický pro různé terapeutické a farmakologické intervence a přesně reprodukuje fyziologii a patofyziologii lidského srdce3. Absence takového systému omezuje objevování nových léčebných postupů pro srdeční selhání4,5 a vedla ke kardiotoxicitě léků jako hlavnímu důvodu pro odchod z trhu6.
Během posledního desetiletí bylo z klinického užívání staženo osm léků, které nejsou kardiovaskulární, protože způsobují prodloužení QT intervalu, což vede k ventrikulárním arytmiím a náhlé smrti7. Proto roste potřeba spolehlivých preklinických screeningových strategií pro posouzení kardiovaskulární účinnosti a toxicity. Nedávné použití kardiomyocytů odvozených z lidských pluripotentních kmenových buněk (hiPS-CM) při screeningu léků a testování toxicity poskytuje částečné řešení tohoto problému. Hlavními omezeními této metody jsou však nezralá povaha hiPS-CM a nedostatek mnohobuněčné komplexnosti srdeční tkáně. Nedávné studie ukázaly, že toto omezení lze částečně překonat použitím časných hiPS-CM k vytvoření hydrogelů srdeční tkáně krátce po nástupu spontánních kontrakcí a postupným zvyšováním elektrické stimulace v průběhu času. Tyto mikrotkáně hiPS-CM však postrádají zralé elektrofyziologické a kontraktilní vlastnosti dospělého myokardu. Lidská srdeční tkáň má navíc složitější strukturu, která se skládá z heterogenní směsi různých typů buněk, včetně endotelových buněk, neuronů a stromálních fibroblastů, které jsou vzájemně propojeny specifickými sadami proteinů extracelulární matrix. Tato heterogenita populací jiných než kardiomyocytů11,12,13 v srdci dospělých savců je hlavní překážkou modelování srdeční tkáně s využitím jednotlivých typů buněk. Tato hlavní omezení zdůrazňují důležitost vývoje metod pro kultivaci intaktní myokardiální tkáně za fyziologických i patologických podmínek.
Kultivované tenké (300 µm) řezy lidského srdce se ukázaly jako slibný model intaktního lidského myokardu. Tato metoda poskytuje přístup ke kompletnímu 3D mnohobuněčnému systému podobnému lidské srdeční tkáni. Až do roku 2019 však bylo použití kultivovaných srdečních řezů omezeno krátkou dobou přežití (24 hodin). To je způsobeno řadou faktorů, včetně nedostatečného fyzikálně-mechanického roztažení, rozhraní vzduch-kapalina a použití jednoduchých médií, která nepodporují potřeby srdeční tkáně. V roce 2019 několik výzkumných skupin prokázalo, že začlenění mechanických faktorů do systémů kultivace srdeční tkáně může prodloužit životnost kultury, zlepšit srdeční expresi a napodobit srdeční patologii. Dvě elegantní studie 17 a 18 ukazují, že jednoosé mechanické zatížení má pozitivní vliv na srdeční fenotyp během kultivace. Tyto studie však nepoužívaly dynamické trojrozměrné fyzikálně-mechanické zatížení srdečního cyklu, protože srdeční řezy byly zatěžovány buď izometrickými tahovými silami 17, nebo lineárním auxotonickým zatížením 18. Tyto metody natahování tkáně vedly k potlačení mnoha srdečních genů nebo k nadměrné expresi genů spojených s abnormálními natahovacími reakcemi. Zejména Pitoulis a kol.19 vyvinuli dynamickou kultivační lázeň srdečních řezů pro rekonstrukci srdečního cyklu s využitím zpětné vazby silového snímače a napínacích pohonů. Ačkoli tento systém umožňuje přesnější modelování srdečního cyklu in vitro, složitost a nízká propustnost metody omezují použití tohoto systému. Naše laboratoř nedávno vyvinula zjednodušený kultivační systém využívající elektrickou stimulaci a optimalizované médium pro udržení životaschopnosti řezů prasečí a lidské srdeční tkáně po dobu až 6 dnů20,21.
V tomto rukopisu popisujeme model srdeční tkáňové kultury (CTCM) s využitím řezů prasečího srdce, který zahrnuje humorální signály pro rekapitulaci trojrozměrné srdeční fyziologie a patofyziologické distenze během srdečního cyklu. Tento CTCM může zvýšit přesnost preklinické predikce léčiv na úroveň, která dosud nebyla dosažena, a to poskytnutím cenově dostupného srdečního systému se středním výkonem, který napodobuje fyziologii/patofyziologii savčího srdce pro preklinické testování léčiv.
Hemodynamické mechanické signály hrají klíčovou roli v udržování funkce kardiomyocytů in vitro 22,23,24. V tomto rukopisu jsme vyvinuli CTCM (obrázek 1a), který dokáže napodobit srdeční prostředí dospělého jedince indukcí elektrické i mechanické stimulace na fyziologických frekvencích (1,2 Hz, 72 tepů za minutu). Aby se zabránilo nadměrnému natahování tkáně během diastoly, bylo použito 3D tiskové zařízení ke zvětšení velikosti tkáně o 25 % (obr. 1b). Elektrická stimulace indukovaná systémem C-PACE byla načasována tak, aby začala 100 ms před systolou, a to pomocí systému pro sběr dat, aby se plně reprodukoval srdeční cyklus. Systém pro tkáňové kultury používá programovatelný pneumatický aktuátor (LB Engineering, Německo) k cyklickému roztahování flexibilní silikonové membrány, což způsobuje roztahování srdečních plátků v horní komoře. Systém byl připojen k externímu vzduchovému potrubí pomocí tlakového převodníku, což umožnilo přesně nastavit tlak (± 1 mmHg) a čas (± 1 ms) (obr. 1c).
a Připevněte tkáňový řez k 7mm nosnému kroužku, znázorněnému modře, uvnitř kultivační komory zařízení. Kultivační komora je od vzduchové komory oddělena tenkou pružnou silikonovou membránou. Mezi jednotlivé komory umístěte těsnění, aby se zabránilo únikům. Víko zařízení obsahuje grafitové elektrody, které zajišťují elektrickou stimulaci. b Schematické znázornění velkého tkáňového zařízení, vodicího kroužku a nosného kroužku. Tkáňové řezy (hnědé) jsou umístěny na nadrozměrném zařízení s vodicím kroužkem umístěným v drážce na vnějším okraji zařízení. Pomocí vodítka opatrně umístěte nosný kroužek potažený tkáňovým akrylovým lepidlem na řez srdeční tkáně. c Graf znázorňující dobu elektrické stimulace jako funkci tlaku ve vzduchové komoře řízeného programovatelným pneumatickým aktuátorem (PPD). K synchronizaci elektrické stimulace pomocí tlakových senzorů bylo použito zařízení pro sběr dat. Když tlak v kultivační komoře dosáhne nastavené prahové hodnoty, je do C-PACE-EM odeslán pulzní signál ke spuštění elektrické stimulace. d Obrázek čtyř CTCM umístěných na polici inkubátoru. Čtyři zařízení jsou připojena k jednomu PPD prostřednictvím pneumatického obvodu a tlakové senzory jsou vloženy do hemostatického ventilu pro monitorování tlaku v pneumatickém obvodu. Každé zařízení obsahuje šest tkáňových řezů.
Pomocí jediného pneumatického aktuátoru jsme byli schopni ovládat 4 zařízení CTCM, z nichž každé mohlo pojmout 6 řezů tkáně (obr. 1d). V CTCM se tlak vzduchu ve vzduchové komoře převádí na synchronní tlak v komoře s tekutinou a indukuje fyziologickou expanzi srdečního řezu (obrázek 2a a doplňkový film 1). Vyhodnocení natažení tkáně při tlaku 80 mm Hg. Art. ukázalo natažení řezů tkáně o 25 % (obr. 2b). Toto procentuální natažení odpovídá fyziologické délce sarkomery 2,2–2,3 µm pro normální kontraktilitu srdečního řezu17,19,25. Pohyb tkáně byl hodnocen pomocí vlastního nastavení kamery (doplňkový obrázek 1). Amplituda a rychlost pohybu tkáně (obr. 2c, d) odpovídaly natažení během srdečního cyklu a času během systoly a diastoly (obr. 2b). Natažení a rychlost srdeční tkáně během kontrakce a relaxace zůstaly v kultuře konstantní po dobu 12 dnů (obr. 2f). Pro vyhodnocení vlivu elektrické stimulace na kontraktilitu během kultivace jsme vyvinuli metodu pro stanovení aktivní deformity pomocí algoritmu stínování (doplňkový obr. 2a,b) a byli jsme schopni rozlišit mezi deformacemi s elektrickou stimulací a bez ní. Stejná část srdce (obr. 2f). V pohyblivé oblasti řezu (R6-9) bylo napětí během elektrické stimulace o 20 % vyšší než bez elektrické stimulace, což naznačuje příspěvek elektrické stimulace ke kontraktilní funkci.
Reprezentativní křivky měření tlaku ve vzduchové komoře, tlaku v tekutinové komoře a pohybu tkáně potvrzují, že tlak v komoře mění tlak v tekutinové komoře, což způsobuje odpovídající pohyb řezu tkáně. b Reprezentativní křivky procentuálního natažení (modré) řezů tkáně odpovídající procentuálnímu natažení (oranžové). c Naměřený pohyb řezu srdce je v souladu s naměřenou rychlostí pohybu. (d) Reprezentativní trajektorie cyklického pohybu (modrá čára) a rychlosti (oranžová tečkovaná čára) v řezu srdce. e Kvantifikace doby cyklu (n = 19 řezů na skupinu, od různých prasat), doby kontrakce (n = 19 řezů na skupinu), doby relaxace (n = 19 řezů na skupinu, od různých prasat), pohybu tkáně (n = 25 řezů)/skupina od různých prasat), maximální systolické rychlosti (n = 24(D0), 25(D12) řezů/skupina od různých prasat) a maximální relaxační rychlosti (n = 24(D0), 25(D12) řezů/skupina od různých prasat). Dvoustranný Studentův t-test neprokázal žádný významný rozdíl v žádném parametru. f Reprezentativní záznamy analýzy napětí tkáňových řezů s (červená) a bez (modrá) elektrické stimulace, deset regionálních oblastí tkáňových řezů ze stejného řezu. Spodní panely ukazují kvantifikaci procentuálního rozdílu v napětí v tkáňových řezech s elektrickou stimulací a bez ní v deseti oblastech z různých řezů. (n = 8 řezů/skupina z různých prasat, byl proveden oboustranný Studentův t-test; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 řezů/skupina z různých prasat, byl proveden oboustranný Studentův t-test; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Сттьюде00н11а,****00н11 **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 řezů/skupina z různých prasat, oboustranný Studentův t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，5*p < （ （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，5*p < （ (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; *****p <0,005 <0,001,0,01,01, 01 (n = 8 řezů/skupina, z různých prasat, oboustranný Studentův t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Chybové úsečky představují průměr ± směrodatnou odchylku.
V našem předchozím statickém biomimetickém kultivačním systému srdečních řezů [20, 21] jsme udržovali životaschopnost, funkci a strukturální integritu srdečních řezů po dobu 6 dnů aplikací elektrické stimulace a optimalizací složení média. Po 10 dnech však tyto hodnoty prudce klesly. Budeme se odkazovat na řezy kultivované v našem předchozím statickém biomimetickém kultivačním systému 20, 21 za kontrolních podmínek (Ctrl) a naše dříve optimalizované médium použijeme jako MC podmínky a kultivaci za současné mechanické a elektrické stimulace (CTCM). Nejprve jsme zjistili, že mechanická stimulace bez elektrické stimulace nebyla dostatečná k udržení životaschopnosti tkáně po dobu 6 dnů (doplňkový obrázek 3a,b). Je zajímavé, že se zavedením fyzikálně-mechanické a elektrické stimulace pomocí STCM zůstala životaschopnost 12denních srdečních řezů stejná jako u čerstvých srdečních řezů za podmínek MS, ale ne za podmínek Ctrl, jak ukazuje MTT analýza (obr. 1). 3a). To naznačuje, že mechanická stimulace a simulace srdečního cyklu mohou udržet životaschopnost tkáňových řezů dvakrát déle, než bylo zaznamenáno v našem předchozím statickém kultivačním systému. Hodnocení strukturální integrity tkáňových řezů imunoznačením srdečního troponinu T a konexinu 43 však ukázalo, že exprese konexinu 43 byla v tkáních srdečního karcinomu (MC) 12. den významně vyšší než v kontrolních řezech ve stejný den. Rovnoměrná exprese konexinu 43 a tvorba Z-disku však nebyly plně zachovány (obr. 3b). Pro kvantifikaci strukturální integrity tkáně používáme rámec umělé inteligence (AI)26, pro automatickou kvantifikaci strukturální integrity tkáně z hlediska síly lokalizace používáme systém hlubokého učení založený na zobrazování troponinu-T a barvení konexinu43. Tato metoda využívá konvoluční neuronovou síť (CNN) a rámec hlubokého učení ke spolehlivé kvantifikaci strukturální integrity srdeční tkáně automatizovaným a nezaujatým způsobem, jak je popsáno v referenci.26. Tkáň MC vykazovala zlepšenou strukturální podobnost s 0. dnem ve srovnání se statickými kontrolními řezy. Massonovo trichromové barvení navíc odhalilo významně nižší procento fibrózy za podmínek MS ve srovnání s kontrolními podmínkami 12. den kultivace (obr. 3c). Zatímco CTCM zvýšila životaschopnost řezů srdeční tkáně 12. den na úroveň podobnou čerstvé srdeční tkáni, významně nezlepšila strukturální integritu řezů srdce.
Sloupcový graf ukazuje kvantifikaci životaschopnosti MTT čerstvých srdečních řezů (D0) nebo kultury srdečních řezů po dobu 12 dnů buď ve statické kultuře (D12 Ctrl), nebo v CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) řezů/skupina od různých prasat, je proveden jednosměrný ANOVA test; ####p < 0,0001 ve srovnání s D0 a **p < 0,01 ve srovnání s D12 Ctrl). Sloupcový graf ukazuje kvantifikaci životaschopnosti MTT čerstvých srdečních řezů (D0) nebo kultury srdečních řezů po dobu 12 dnů buď ve statické kultuře (D12 Ctrl), nebo v CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) řezů/skupina od různých prasat, je proveden jednosměrný ANOVA test; ####p < 0,0001 ve srovnání s D0 a **p < 0,01 ve srovnání s D12 Ctrl).Histogram ukazuje kvantifikaci životaschopnosti čerstvých srdečních řezů MTT (D0) nebo kultivace srdečních řezů po dobu 12 dnů buď ve statické kultuře (kontrola D12), nebo CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrola D12). ) ), 12 (D12 MC) řezů/skupina od různých prasat, je proveden jednocestný ANOVA test;####p < 0,0001 по сравнению с D0 a **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 ve srovnání s D0 a **p < 0,01 ve srovnání s D12 (kontrola). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/軡－ANOVA 向测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001相比，**p。)histogram znázorňující kvantifikaci životaschopnosti MTT v čerstvých srdečních řezech (D0) nebo srdečních řezech kultivovaných po dobu 12 dnů ve statické kultuře (kontrola D12) nebo CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrola D12)), 12 (D12 MC) řezů/skupina od různých prasat, jednocestný ANOVA test;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 ve srovnání s D0, **p < 0,01 ve srovnání s D12 (kontrola).b Troponin-T (zelený), konexin 43 (červený) a DAPI (modrý) v čerstvě izolovaných srdečních řezech (D0) nebo srdečních řezech kultivovaných za statických podmínek (Ctrl) nebo CTCM podmínek (MC) po dobu 12 dnů) reprezentativních imunofluorescenčních snímků (měřítko slepé vzorky = 100 µm). Kvantifikace strukturální integrity srdeční tkáně pomocí umělé inteligence (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) řezů/skupin, každý z různých prasat, proveden jednocestný ANOVA test; ####p < 0,0001 ve srovnání s D0 a ****p < 0,0001 ve srovnání s D12 Ctrl). Kvantifikace strukturální integrity srdeční tkáně pomocí umělé inteligence (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) řezů/skupin od různých prasat, proveden jednocestný ANOVA test; ####p < 0,0001 ve srovnání s D0 a ****p < 0,0001 ve srovnání s D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллек7 = интеллек7 интелелек7 5 (D12 MC) срезов/групп z разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA ####p < 0,0вн0#p < 0,0вн0 a ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Kvantifikace strukturální integrity srdeční tkáně pomocí umělé inteligence (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) řezů/skupin z různých prasat, proveden jednocestný ANOVA test; ####p < 0,0001 vs. s D0 a ****p < 0,0001 v porovnání s D12 Ctrl).人工智能量化心脏组组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) řezů/skupina každého z různých prasat, jednosměrný test ANOVA <00;#0.#p相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) řezů/skupina každého z různých prasat, jednosměrný test ANOVA <00##.与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердеткан7й = 10D сердечной Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Umělá inteligence pro kvantifikaci strukturální integrity srdeční tkáně (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) řezů/skupina od různých prasat, jednocestný ANOVA test; ####p<0,0001 vs .D0 Pro srovnání ****p < 0,0001 ve srovnání s D12 Ctrl). c Reprezentativní snímky (vlevo) a kvantifikace (vpravo) pro řezy srdce obarvené Massonovým trichromovým barvivem (měřítko bez tloušťky = 500 µm) (n = 10 řezů/skupina, každý z různých prasat, proveden jednocestný ANOVA test; ####p < 0,0001 ve srovnání s D0 a ***p < 0,001 ve srovnání s D12 Ctrl). c Reprezentativní snímky (vlevo) a kvantifikace (vpravo) řezů srdce obarvených Massonovým trichromovým barvivem (měřítko bez tloušťky = 500 µm) (n = 10 řezů/skupina, každý z různých prasat, proveden jednocestný ANOVA test; #### p < 0,0001 ve srovnání s D0 a ***p < 0,001 ve srovnání s D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) a количественная оценка (справа) срезов сердшена, трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезнов/гсрутранпухрутранпухсовипе выполняется односторонний тест ANOVA; c Reprezentativní snímky (vlevo) a kvantifikace (vpravo) srdečních řezů barvených Massonovým trichromovým barvivem (nepotažené měřítko = 500 µm) (n = 10 řezů/skupina od různých prasat, proveden jednocestný ANOVA test; #### p < 0,0001 ve srovnání s D0 a ***p < 0,001 ve srovnání s D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺尺度=0 Přibližné/nákresy/obrázky，překlady přidané hodnoty，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 绎D010 p <10 ，相比）. C 用 zedník 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裣帺度 裸帺度 壸裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切 片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单拕向 #### p 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) a количественный анализ (справа) срезов сердшны, сердшена, трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/групдпа, кайтудыйгруппа, кайтурый свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #0ионс 0,0,0 D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Reprezentativní snímky (vlevo) a kvantifikace (vpravo) srdečních řezů barvených Massonovým trichromovým barvivem (slepý vzorek = 500 µm) (n = 10 řezů/skupina, každý z jiného prasete, testováno jednocestnou analýzou rozptylu;### # p < 0,0001 ve srovnání s D0, ***p < 0,001 ve srovnání s D12 Ctrl).Chybové úsečky představují průměr ± směrodatnou odchylku.
Předpokládali jsme, že přidáním malých molekul do kultivačního média by se mohla zlepšit integrita kardiomyocytů a snížit rozvoj fibrózy během kultivace CTCM. Proto jsme provedli screening malých molekul pomocí našich statických kontrolních kultur20,21 kvůli malému počtu matoucích faktorů. Pro tento screening byly vybrány dexamethason (Dex), trijodthyronin (T3) a SB431542 (SB). Tyto malé molekuly byly dříve použity v kulturách hiPSC-CM k indukci zrání kardiomyocytů zvýšením délky sarkomer, T-tubulů a rychlosti vedení vzruchů. Kromě toho je známo, že Dex (glukokortikoid) i SB potlačují zánět29,30. Proto jsme testovali, zda by zahrnutí jedné nebo kombinace těchto malých molekul zlepšilo strukturální integritu srdečních řezů. Pro počáteční screening byla dávka každé sloučeniny vybrána na základě koncentrací běžně používaných v modelech buněčných kultur (1 μM Dex27, 100 nM T327 a 2,5 μM SB31). Po 12 dnech kultivace vedla kombinace T3 a Dex k optimální strukturální integritě kardiomyocytů a minimální fibrózní remodelaci (doplňkové obrázky 4 a 5). Použití dvojnásobných nebo dvojnásobných koncentrací T3 a Dex mělo navíc škodlivé účinky ve srovnání s normálními koncentracemi (doplňkový obrázek 6a,b).
Po počátečním screeningu jsme provedli přímé srovnání 4 kultivačních podmínek (obrázek 4a): Ctrl: srdeční řezy kultivované v naší dříve popsané statické kultuře s použitím našeho optimalizovaného média; 20.21 TD: T3 a Ctrl s přidáním Dex ve středu; MC: srdeční řezy kultivované v CTCM s použitím našeho dříve optimalizovaného média; a MT: CTCM s přidáním T3 a Dex do média. Po 12 dnech kultivace zůstala životaschopnost tkání MS a MT stejná jako v čerstvých tkáních hodnocených MTT testem (obr. 4b). Je zajímavé, že přidání T3 a Dex do transwell kultur (TD) nevedlo k významnému zlepšení životaschopnosti ve srovnání s podmínkami Ctrl, což naznačuje důležitou roli mechanické stimulace v udržování životaschopnosti srdečních řezů.
Schéma experimentálního návrhu znázorňující čtyři kultivační podmínky použité k vyhodnocení účinků mechanické stimulace a suplementace T3/Dex na médium po dobu 12 dnů. b Sloupcový graf ukazuje kvantifikaci životaschopnosti 12 dní po kultivaci za všech 4 kultivačních podmínek (Ctrl, TD, MC a MT) ve srovnání s čerstvými řezy srdce (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a D12 MT), 12 (D12 MC) řezů/skupina od různých prasat, je proveden jednocestný ANOVA test; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 ve srovnání s D0 a **p < 0,01 ve srovnání s D12 Ctrl). b Sloupcový graf ukazuje kvantifikaci životaschopnosti 12 dní po kultivaci ve všech 4 kultivačních podmínkách (Ctrl, TD, MC a MT) ve srovnání s čerstvými řezy srdce (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a D12 MT), 12 (D12 MC) řezů/skupina od různých prasat, je proveden jednocestný ANOVA test; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 ve srovnání s D0 a **p < 0,01 ve srovnání s D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней посенку культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC a MT) по сравнсривиюжжо сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, пой односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D). b Sloupcový graf ukazuje kvantifikaci životaschopnosti 12 dní po kultivaci ve všech 4 kultivačních podmínkách (kontrola, TD, MC a MT) ve srovnání s čerstvými srdečními řezy (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a D12 MT), 12 (D12 MC) řezů/skupina od různých prasat, jednocestný ANOVA test; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 vs. D0 a **p < 0,01 ve srovnání s D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D2TD、15)D12TD和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0,0001 0,0001 0,0001，D##相比，**p < 0,01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC a MT) поцижмая срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/пару односторонний тест ANOVA; b Histogram znázorňující všechny 4 kultivační podmínky (kontrola, TD, MC a MT) ve srovnání s čerstvými srdečními řezy (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a D12 MT), z různých prasat, 12 (D12 MC) řezů/skupina, jednocestný ANOVA test; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. kontrola D12). c Sloupcový graf ukazuje kvantifikaci toku glukózy 12 dní po kultivaci za všech 4 kultivačních podmínek (Ctrl, TD, MC a MT) ve srovnání s čerstvými řezy srdce (D0) (n = 6 řezů/skupina od různých prasat, proveden jednocestný ANOVA test; ###p < 0,001 ve srovnání s D0 a ***p < 0,001 ve srovnání s D12 Ctrl). c Sloupcový graf ukazuje kvantifikaci toku glukózy 12 dní po kultivaci za všech 4 kultivačních podmínek (Ctrl, TD, MC a MT) ve srovnání s čerstvými řezy srdce (D0) (n = 6 řezů/skupina od různých prasat, proveden jednocestný ANOVA test; ###p < 0,001 ve srovnání s D0 a ***p < 0,001 ve srovnání s D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 днейвикивиос во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC a MT) по сравнению со свежид со свежима = сри0зарма сри0зарь срезов/группу от разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA ###p < 0,001 вне*** D 0,001 поно; 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogram ukazuje kvantifikaci toku glukózy 12 dní po kultivaci za všech 4 kultivačních podmínek (kontrola, TD, MC a MT) ve srovnání s čerstvými srdečními řezy (D0) (n = 6 řezů/skupina od různých prasat, proveden jednocestný ANOVA test; ###p < 0,001 ve srovnání s D0 a ***p < 0,001 ve srovnání s D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，后天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；##0#p < 0.相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt ） 新鲜 心脏 切牸 切牸 切牸 切牸培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 поней культивирования для всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC a MT) сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены тестедены тес# сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram znázorňující kvantifikaci toku glukózy 12 dní po kultivaci pro všechny 4 kultivační podmínky (kontrola, TD, MC a MT) ve srovnání s čerstvými srdečními řezy (D0) (n = 6 řezů/skupina, od různých prasat, jednostranné). Pokud byly provedeny ANOVA testy, ###p < 0,001 ve srovnání s D0, ***p < 0,001 ve srovnání s D12 (kontrola).d Kmenové analýzy čerstvých (modré), 12denních MC (zelené) a 12denních MT (červené) tkání v deseti regionálních řezech tkání (n = 4 řezy/skupina, jednocestný ANOVA test; mezi skupinami nebyl zjištěn žádný významný rozdíl). e Volcano plot zobrazující diferencovaně exprimované geny v čerstvých řezech srdce (D0) ve srovnání s řezy srdce kultivovanými za statických podmínek (Ctrl) nebo za MT podmínek (MT) po dobu 10–12 dnů. f Teplotní mapa genů sarkomer pro řezy srdce kultivované za jednotlivých kultivačních podmínek. Chybové úsečky představují průměr ± směrodatnou odchylku.
Metabolická závislost na přechodu z oxidace mastných kyselin na glykolýzu je charakteristickým znakem dediferenciace kardiomyocytů. Nezralé kardiomyocyty primárně využívají glukózu k produkci ATP a mají hypoplastické mitochondrie s malým počtem krist5,32. Analýzy využití glukózy ukázaly, že za podmínek MC a MT bylo využití glukózy podobné jako v tkáních z 0. dne (obrázek 4c). Vzorky Ctrl však vykazovaly významné zvýšení využití glukózy ve srovnání s čerstvou tkání. To naznačuje, že kombinace CTCM a T3/Dex zvyšuje životaschopnost tkání a zachovává metabolický fenotyp 12denních kultivovaných řezů srdce. Analýza kmenů navíc ukázala, že hladiny kmenů zůstaly po dobu 12 dnů za podmínek MT a MS stejné jako v čerstvé srdeční tkáni (obr. 4d).
Pro analýzu celkového dopadu CTCM a T3/Dex na globální transkripční krajinu tkáně srdečních řezů jsme provedli RNAseq na srdečních řezech ze všech čtyř různých kultivačních podmínek (doplňková data 1). Je zajímavé, že MT řezy vykazovaly vysokou transkripční podobnost s čerstvou srdeční tkání, přičemž pouze 16 z 13 642 genů bylo diferencovaně exprimováno. Jak jsme však ukázali dříve, Ctrl řezy vykazovaly po 10–12 dnech v kultuře 1229 diferencovaně exprimovaných genů (obr. 4e). Tato data byla potvrzena qRT-PCR srdečních a fibroblastových genů (doplňkový obr. 7a-c). Je zajímavé, že Ctrl řezy vykazovaly downregulaci srdečních a buněčných genů a aktivaci zánětlivých genových programů. Tato data naznačují, že dediferenciace, ke které normálně dochází po dlouhodobé kultivaci, je za MT podmínek zcela utlumena (doplňkový obr. 8a,b). Pečlivé studium genů sarkomer ukázalo, že pouze za podmínek MT jsou geny kódující sarkomeru (obr. 4f) a iontový kanál (doplňkový obr. 9) zachovány, což je chrání před potlačením za podmínek Ctrl, TD a MC. Tato data ukazují, že kombinací mechanické a humorální stimulace (T3/Dex) může transkriptom srdečního řezu zůstat podobný čerstvým srdečním řezům i po 12 dnech v kultivaci.
Tyto transkripční nálezy jsou podpořeny skutečností, že strukturální integrita kardiomyocytů v srdečních řezech je nejlépe zachována za podmínek MT po dobu 12 dnů, jak ukazuje intaktní a lokalizovaný konexin 43 (obr. 5a). Kromě toho byla fibróza v srdečních řezech za podmínek MT významně snížena ve srovnání s Ctrl a podobná čerstvým srdečním řezům (obr. 5b). Tato data ukazují, že kombinace mechanické stimulace a léčby T3/Dex účinně zachovává srdeční strukturu v srdečních řezech v kultuře.
Reprezentativní imunofluorescenční snímky troponinu-T (zeleně), konexinu 43 (červeně) a DAPI (modře) v čerstvě izolovaných srdečních řezech (D0) nebo kultivovaných po dobu 12 dnů za všech čtyř kultivačních podmínek srdečních řezů (měřítko = 100 µm). Kvantifikace strukturální integrity srdeční tkáně pomocí umělé inteligence (n = 7 (D0 a D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC a D12 MT) řezů/skupina z různých prasat, proveden jednocestný ANOVA test; ####p < 0,0001 ve srovnání s D0 a *p < 0,05, nebo ****p < 0,0001 ve srovnání s D12 Ctrl). Kvantifikace strukturální integrity srdeční tkáně pomocí umělé inteligence (n = 7 (D0 a D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC a D12 MT) řezů/skupina z různých prasat, proveden jednocestný ANOVA test; #### p < 0,0001 ve srovnání s D0 a *p < 0,05, nebo ****p < 0,0001 ve srovnání s D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искустственной =D. a D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC a D12 MT) срезов/группу z разных свиней, проведен однофакторный, #100AN, ##100 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Kvantifikace strukturální integrity srdeční tkáně pomocí umělé inteligence (n = 7 (D0 a D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC a D12 MT) řezů/skupina z různých prasat, proveden jednocestný ANOVA test; #### p < 0,0001 ve srovnání s D0 a *p < 0,05 nebo ****p < 0,0001 ve srovnání s D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和5* p < 0,0001 与 D0 和 5 p < 0 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc组） 人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与 D0 < 0 和*相比，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.Kvantifikace strukturální integrity srdeční tkáně s využitím umělé inteligence u různých prasat (n = 7 (D0 a D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC a D12 MT) řezů/skupina) s jednofaktorovým ANOVA testem;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 ve srovnání s D0 a *p < 0,05 nebo ****p < 0,0001 ve srovnání s D12 (kontrola). b Reprezentativní snímky a kvantifikace řezů srdce obarvených Massonovým trichromovým barvivem (měřítko = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD a D12 MC), 9 (D12 MT) řezů/skupina od různých prasat, proveden jednocestný ANOVA test; ####p < 0,0001 ve srovnání s D0 a ***p < 0,001 nebo ****p < 0,0001 ve srovnání s D12 Ctrl). b Reprezentativní snímky a kvantifikace řezů srdce obarvených Massonovým trichromovým barvivem (měřítko = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD a D12 MC), 9 (D12 MT) řezů/skupina od různých prasat, proveden jednocestný ANOVA test; ####p < 0,0001 ve srovnání s D0 a ***p < 0,001 nebo ****p < 0,0001 ve srovnání s D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения a количественная оценка срезов сердца, окрашенных тромтренка красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD a D12 MC), 9 (D12 MT)пгпуровсрепуровсрепуровсрепуровсрем разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; přes сравнению с D12 Ctrl). b Reprezentativní snímky a kvantifikace řezů srdce obarvených Massonovým trichromovým barvivem (měřítko = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD a D12 MC), 9 (D12 MT) řezů/skupina od různých prasat, provedeno jednocestnou ANOVA; ####p < 0,0001 vs. D0 a ***p < 0,001 nebo ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量像和量化（比例尺！= 500 µm） 〼D 100 µm） （n D = 1 Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）片/组，进行单因素素方差001#####与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺、 = 500 µmn＀ = 500 µm ＀ d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切刉切片 切片 切的切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组 ， 进行单因素方差分析； #### P <0,0001与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения a количественная оценка срезов сердца, окрашеннихомартр (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD a D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разныпыр, свуниех один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению). b Reprezentativní snímky a kvantifikace řezů srdce barvených Massonovým trichromem (měřítko = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD a D12 MC), 9 (D12 MT) řezů z různých prasat/skupina, jedna metoda ANOVA; ####p < 0,0001 ve srovnání s D0, ***p < 0,001 nebo ****p < 0,0001 ve srovnání s D12 Ctrl).Chybové úsečky představují průměr ± směrodatnou odchylku.
Nakonec byla schopnost CTCM napodobit srdeční hypertrofii hodnocena zvýšením protažení srdeční tkáně. V CTCM se maximální tlak ve vzduchové komoře zvýšil z 80 mmHg na 80 mmHg. Art. (normální protažení) až na 140 mmHg. Art. (obr. 6a). To odpovídá 32% nárůstu protažení (obr. 6b), které bylo dříve ukázáno jako odpovídající procentuální protažení potřebné pro dosažení délky sarkomery podobné té, která je pozorována při hypertrofii. Protažení a rychlost srdeční tkáně během kontrakce a relaxace zůstaly během šesti dnů kultivace konstantní (obr. 6c). Srdeční tkáň z podmínek MT byla vystavena normálnímu protažení (MT (normální)) nebo nadměrnému protažení (MT (OS)) po dobu šesti dnů. Již po čtyřech dnech kultivace byl hypertrofický biomarker NT-ProBNP v médiu za podmínek MT (OS) významně zvýšen ve srovnání s podmínkami MT (normální) (obr. 7a). Kromě toho se po šesti dnech kultivace velikost buněk v MT (OS) (obr. 7b) významně zvýšila ve srovnání s řezy srdce MT (normální). Kromě toho byla v přetažených tkáních významně zvýšena jaderná translokace NFATC4 (obr. 7c). Tyto výsledky ukazují progresivní vývoj patologické remodelace po hyperdistenzi a podporují koncept, že zařízení CTCM lze použít jako platformu pro studium signalizace srdeční hypertrofie indukované protažením.
Reprezentativní záznamy měření tlaku ve vzduchové komoře, tlaku v tekutinové komoře a pohybu tkáně potvrzují, že tlak v komoře mění tlak v tekutinové komoře, což způsobuje odpovídající pohyb řezu tkáně. b Reprezentativní křivky procentuálního natažení a rychlosti natažení pro normálně natažené (oranžové) a přetažené (modré) řezy tkáně. c Sloupcový graf znázorňující dobu cyklu (n = 19 řezů na skupinu, od různých prasat), dobu kontrakce (n = 18–19 řezů na skupinu, od různých prasat), dobu relaxace (n = 19 řezů na skupinu, od různých prasat)), amplitudu pohybu tkáně (n = 14 řezů/skupina, od různých prasat), maximální systolickou rychlost (n = 14 řezů/skupina, od různých prasat) a maximální rychlost relaxace (n = 14 (D0), 15 (D6) řezů/skupin) od různých prasat), oboustranný Studentův t-test neprokázal žádný významný rozdíl v žádném parametru, což naznačuje, že tyto parametry zůstaly konstantní během 6 dnů kultivace s přepětím. Chybové úsečky představují průměr ± směrodatnou odchylku.
Sloupcový graf kvantifikace koncentrace NT-ProBNP v kultivačním médiu ze srdečních řezů kultivovaných za podmínek normálního natažení MT (Norm) nebo nadměrného natažení (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm a D4 MTOS) řezy/skupina od různých prasat, provedena obousměrná ANOVA; **p < 0,01 ve srovnání s normálním natažením). Sloupcový graf kvantifikace koncentrace NT-ProBNP v kultivačním médiu ze srdečních řezů kultivovaných za podmínek normálního natažení MT (Norm) nebo nadměrného natažení (OS) (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm a D4 MTOS) řezy/skupina od různých prasat, provedena obousměrná ANOVA; **p < 0,01 ve srovnání s normálním natažením).Kvantitativní histogram koncentrace NT-ProBNP v kultivačním médiu ze srdečních řezů kultivovaných za podmínek normálního MT natažení (norma) nebo nadměrného natažení (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm a D4 MTOS) řezy/skupina z různých prasat, je provedena dvoufaktorová analýza rozptylu;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 ve srovnání s normálním protažením). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01). a Kvantifikace koncentrace NT-ProBNP v řezech srdce kultivovaných za podmínek normálního natažení MT (Norm) nebo přetažení (OS) (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm 和D4 MTOS) z různých猪的切片/组，可以双向方方发发动 **v porovnání s normálním protahováním, p < 0,01);histogram Kvantifikace koncentrací NT-ProBNP v řezech srdce kultivovaných za podmínek normálního natažení MT (norma) nebo nadměrného natažení (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) a D4 MTOS) řezy/skupina od různých prasat, obousměrná analýza rozptylu;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 ve srovnání s normálním protažením). b Reprezentativní snímky srdečních řezů barvených troponinem-T a WGA (vlevo) a kvantifikace velikosti buněk (vpravo) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) buněk/skupina z 10 různých řezů od různých prasat, byl proveden oboustranný Studentův t-test; ****p < 0,0001 ve srovnání s normálním roztažením). b Reprezentativní snímky srdečních řezů barvených troponinem-T a WGA (vlevo) a kvantifikace velikosti buněk (vpravo) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) buněk/skupina z 10 různých řezů od různých prasat, je proveden oboustranný Studentův t-test; ****p < 0,0001 ve srovnání s normálním roztažením). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗПвиекнева) определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разезох равс свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнениьм с; растяжением). b Reprezentativní snímky srdečních řezů barvených troponinem-T a AZP (vlevo) a kvantifikace velikosti buněk (vpravo) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) buněk/skupina z 10 různých řezů od různých prasat, byl proveden oboustranný Studentův t-test; ****p < 0,0001 ve srovnání s normálním kmenem). b MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）。 b Reprezentativní snímky řezů srdce obarvených kalkareinem-T a WGA (vlevo) a velikost buněk (vpravo) (n = 330 (D6 MTOS), 369 z 10 různých řezů (D6 MTNorm)) Buňky/组，两方法有尾学生 t-test；v porovnání s normálním protažením, ****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т a АЗПвиекнева) оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных разных Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормемьнормемальнормемальнормемальнормемальнормемальнормальнта; b Reprezentativní snímky srdečních řezů barvených troponinem-T a AZP (vlevo) a kvantifikace velikosti buněk (vpravo) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) z 10 různých řezů od různých prasat) Buňky/skupina, oboustranné kritérium Studentova t; ****p < 0,0001 ve srovnání s normálním kmenem). c Reprezentativní snímky srdečních řezů imunoznačených pro troponin-T a NFATC4 v den 0 a den 6 po MTOS a kvantifikace translokace NFATC4 do jader CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) řezy/skupina od různých prasat, je proveden oboustranný Studentův t-test; *p < 0,05). c Reprezentativní snímky srdečních řezů imunoznačených pro troponin-T a NFATC4 v den 0 a den 6 po MTOS a kvantifikace translokace NFATC4 do jader CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) řezy/skupina od různých prasat, je proveden oboustranný Studentův t-test; *p < 0,05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 a 6 дней MTOS, Тммуномечиноныя NFATC4, a количественная оценка транслокации NFATC4 v ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6зпоговововурнознозных клеток) разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента *p < 0,05). c Reprezentativní snímky srdečních řezů v 0. a 6. dni MTOS, imunoznačených na troponin-T a NFATC4, a kvantifikace translokace NFATC4 v jádře kavernózních buněk (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) řezy/skupina od různých prasat) provedená oboustranným Studentovým t-testem; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化！D0n (MT) 量化！D0n切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)。 c Reprezentativní snímky imunoznačení calcanin-T a NFATC4 第0天和第6天MTOS srdeční řezy a NFATC4 z různých NFATC4 易位至CM buněčného jádra 的množství 化 (n = 4 (D0), 3 (D6/MTOS) 的时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS na 0 a 6 Тдень для иммпуномаркитировиров NFATC4 a количественная оценка транслокации NFATC4 v ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6-пггдус) хвостатый t-критерий Стьюдента *p < 0,05). c Reprezentativní snímky srdečních řezů MTOS v den 0 a 6 pro imunoznačení troponinu-T a NFATC4 a kvantifikaci translokace NFATC4 v jádře CM u různých prasat (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) řezy/skupina, oboustranné t-kritérium Studentovo; *p < 0,05).Chybové úsečky představují průměr ± směrodatnou odchylku.
Translační kardiovaskulární výzkum vyžaduje buněčné modely, které přesně reprodukují srdeční prostředí. V této studii bylo vyvinuto a charakterizováno zařízení CTCM, které dokáže stimulovat ultratenké řezy srdce. Systém CTCM zahrnuje fyziologicky synchronizovanou elektromechanickou stimulaci a obohacení tekutinou T3 a Dex. Když byly řezy prasečího srdce vystaveny těmto faktorům, jejich životaschopnost, strukturální integrita, metabolická aktivita a transkripční exprese zůstaly po 12 dnech kultivace stejné jako v čerstvé srdeční tkáni. Nadměrné protahování srdeční tkáně může navíc způsobit hypertrofii srdce způsobenou hyperextenzí. Celkově tyto výsledky podporují klíčovou roli fyziologických kultivačních podmínek v udržení normálního srdečního fenotypu a poskytují platformu pro screening léků.
K vytváření optimálního prostředí pro fungování a přežití kardiomyocytů přispívá mnoho faktorů. Nejzřejmější z těchto faktorů souvisí s (1) mezibuněčnými interakcemi, (2) elektromechanickou stimulací, (3) humorálními faktory a (4) metabolickými substráty. Fyziologické interakce mezi buňkami vyžadují komplexní trojrozměrné sítě více buněčných typů podporovaných extracelulární matricí. Takové komplexní buněčné interakce je obtížné rekonstruovat in vitro kokultivací jednotlivých buněčných typů, ale lze jich snadno dosáhnout s využitím organotypové povahy srdečních řezů.
Mechanické protažení a elektrická stimulace kardiomyocytů jsou zásadní pro udržení srdečního fenotypu33,34,35. Zatímco mechanická stimulace se široce používá pro kondicionování a zrání hiPSC-CM, několik elegantních studií se nedávno pokusilo o mechanickou stimulaci srdečních řezů v kultuře pomocí jednoosého zatížení. Tyto studie ukazují, že 2D jednoosé mechanické zatížení má pozitivní vliv na fenotyp srdce během kultivace. V těchto studiích byly řezy srdce buď zatíženy izometrickými tahovými silami17, lineárním auxotonickým zatížením18, nebo byl srdeční cyklus znovu vytvořen pomocí zpětné vazby silového snímače a pohonů napětí. Tyto metody však používají jednoosé protažení tkáně bez optimalizace prostředí, což vede k potlačení mnoha srdečních genů nebo k nadměrné expresi genů spojených s abnormálními protahovacími reakcemi. Zde popsaný CTCM poskytuje 3D elektromechanický stimul, který napodobuje přirozený srdeční cyklus z hlediska doby cyklu a fyziologického protažení (25% protažení, 40% systola, 60% diastola a 72 tepů za minutu). Ačkoli tato trojrozměrná mechanická stimulace sama o sobě nestačí k udržení integrity tkáně, je pro adekvátní udržení životaschopnosti, funkce a integrity tkáně nutná kombinace humorální a mechanické stimulace pomocí T3/Dex.
Humorální faktory hrají důležitou roli v modulaci fenotypu dospělého srdce. To bylo zdůrazněno ve studiích HiPS-CM, ve kterých byly T3 a Dex přidány do kultivačního média pro urychlení zrání buněk. T3 může ovlivňovat transport aminokyselin, cukrů a vápníku přes buněčné membrány36. Kromě toho T3 podporuje expresi MHC-α a downregulaci MHC-β, což podporuje tvorbu rychlých myofibril ve zralých kardiomyocytech ve srovnání s pomalými myofibrilami u fetálního CM. Deficit T3 u pacientů s hypotyreózou vede ke ztrátě myofibrilárních pásů a snížené rychlosti vývoje tonu37. Dex působí na glukokortikoidní receptory a bylo prokázáno, že zvyšuje kontraktilitu myokardu v izolovaných perfuzních srdcích;38 toto zlepšení pravděpodobně souvisí s účinkem na vstup řízený ukládáním vápníku (SOCE)39,40. Dex se navíc váže na své receptory, což způsobuje širokou intracelulární odpověď, která potlačuje imunitní funkci a zánět30.
Naše výsledky ukazují, že fyzikálně-mechanická stimulace (MS) zlepšila celkový výkon kultivace ve srovnání s Ctrl, ale nedokázala udržet životaschopnost, strukturální integritu a srdeční expresi po dobu 12 dnů v kultuře. Ve srovnání s Ctrl, přidání T3 a Dex do kultur CTCM (MT) zlepšilo životaschopnost a udrželo podobné transkripční profily, strukturální integritu a metabolickou aktivitu s čerstvou srdeční tkání po dobu 12 dnů. Kromě toho byl kontrolou stupně natažení tkáně vytvořen model srdeční hypertrofie indukované hyperextenzí pomocí STCM, který ilustruje všestrannost systému STCM. Je třeba poznamenat, že ačkoli srdeční remodelace a fibróza obvykle zahrnují intaktní orgány, jejichž cirkulující buňky mohou poskytovat vhodné cytokiny, stejně jako fagocytózu a další faktory remodelace, části srdce mohou stále napodobovat fibrotický proces v reakci na stres a trauma. do myofibroblastů. Toto bylo dříve hodnoceno v tomto modelu srdečního řezu. Je třeba poznamenat, že parametry CTCM lze modulovat změnou tlaku/elektrické amplitudy a frekvence pro simulaci mnoha stavů, jako je tachykardie, bradykardie a mechanická oběhová podpora (mechanicky nezatížené srdce). Díky tomu je systém středně výkonný pro testování drog. Schopnost CTCM modelovat srdeční hypertrofii vyvolanou nadměrnou zátěží otevírá cestu k testování tohoto systému pro personalizovanou terapii. Závěrem lze říci, že tato studie ukazuje, že mechanické protažení a humorální stimulace jsou klíčové pro udržení kultury řezů srdeční tkáně.
Ačkoli zde prezentovaná data naznačují, že CTCM je velmi slibnou platformou pro modelování intaktního myokardu, má tato kultivační metoda určitá omezení. Hlavním omezením kultury CTCM je, že na řezy působí kontinuální dynamické mechanické namáhání, což vylučuje schopnost aktivně monitorovat kontrakce srdečních řezů během každého cyklu. Navíc vzhledem k malé velikosti srdečních řezů (7 mm) je omezená schopnost vyhodnotit systolickou funkci mimo kultivační systémy pomocí tradičních silových senzorů. V tomto rukopisu toto omezení částečně překonáváme vyhodnocením optického napětí jako indikátoru kontraktilní funkce. Toto omezení však bude vyžadovat další práci a v budoucnu může být řešeno zavedením metod pro optické monitorování funkce srdečních řezů v kultuře, jako je optické mapování pomocí vápníku a napěťově citlivých barviv. Dalším omezením CTCM je, že pracovní model nemanipuluje s fyziologickým stresem (předtíží a dotížením). V CTCM byl tlak indukován v opačných směrech, aby se reprodukovalo 25% fyziologické protažení v diastole (plné protažení) a systole (délka kontrakce během elektrické stimulace) ve velmi velkých tkáních. Toto omezení by mělo být v budoucích návrzích CTCM odstraněno adekvátním tlakem na srdeční tkáň z obou stran a aplikací přesných vztahů tlak-objem, které se vyskytují v srdečních komorách.
Remodelace vyvolaná nadměrným protažením, o níž se v tomto rukopise píše, je omezena na napodobování hypertrofických hyperstretch signálů. Tento model tak může pomoci při studiu hypertrofické signalizace vyvolané protažením bez nutnosti humorálních nebo nervových faktorů (které v tomto systému neexistují). Pro zvýšení multiplicity CTCM jsou zapotřebí další studie, například kokultivace s imunitními buňkami, cirkulujícími plazmatickými humorálními faktory a inervace při kokultivaci s neuronálními buňkami zlepší možnosti modelování onemocnění pomocí CTCM.
V této studii bylo použito třináct prasat. Všechny postupy na zvířatech byly provedeny v souladu s institucionálními směrnicemi a byly schváleny Komisí pro péči o zvířata a jejich využití Univerzity v Louisville. Aortální oblouk byl uzavřen svorkou a srdce bylo perfuzováno 1 l sterilní kardioplegie (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/ml heparinu, pH do 7,4); Srdce byla uchovávána v ledově chladném kardioplegickém roztoku až do transportu do laboratoře na ledu, což je obvykle <10 minut. Srdce byla uchovávána v ledově chladném kardioplegickém roztoku až do transportu do laboratoře na ledu, což je obvykle <10 minut. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки, ладяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в ладяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в ладяном кардиоплегическом обычно занимает <10 мин. Srdce byla skladována v ledově chladném kardioplegickém roztoku až do transportu do laboratoře na ledu, což obvykle trvá <10 minut.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льбичном, ном Uchovávejte srdce na ledové kardioplegii až do transportu do laboratoře na ledu, obvykle <10 minut.
Zařízení CTCM bylo vyvinuto v softwaru SolidWorks pro počítačově podporované navrhování (CAD). Kultivační komory, dělicí přepážky a vzduchové komory jsou vyrobeny z čirého akrylového plastu obráběného CNC. Opěrný kroužek o průměru 7 mm je vyroben z polyethylenu s vysokou hustotou (HDPE) uprostřed a má drážku pro O-kroužek pro utěsnění média pod ním. Kultivační komoru od separační desky odděluje tenká křemičitá membrána. Silikonová membrána je laserově vyřezána ze silikonové fólie o tloušťce 0,02″ a má tvrdost 35A. Spodní a horní silikonové těsnění jsou laserově vyřezána ze silikonové fólie o tloušťce 1/16″ a mají tvrdost 50A. Pro upevnění bloku a vytvoření vzduchotěsného utěsnění se používají šrouby a křídlové matice z nerezové oceli 316L.
Pro integraci se systémem C-PACE-EM je navržena specializovaná deska plošných spojů (PCB). Zásuvky konektorů Swiss Machine na desce plošných spojů jsou připojeny k grafitovým elektrodám postříbřenými měděnými dráty a bronzovými šrouby 0-60 zašroubovanými do elektrod. Deska plošných spojů je umístěna v krytu 3D tiskárny.
Zařízení CTCM je řízeno programovatelným pneumatickým aktuátorem (PPD), který vytváří řízený oběhový tlak podobný srdečnímu cyklu. S rostoucím tlakem uvnitř vzduchové komory se flexibilní silikonová membrána roztahuje směrem nahoru a tlačí médium pod tkáň. Oblast tkáně se pak tímto vypuzováním tekutiny natahuje, čímž se napodobuje fyziologická expanze srdce během diastoly. Na vrcholu relaxace byla aplikována elektrická stimulace pomocí grafitových elektrod, která snížila tlak ve vzduchové komoře a způsobila kontrakci tkáňových úseků. Uvnitř trubice je hemostatický ventil s tlakovým senzorem pro detekci tlaku ve vzduchovém systému. Tlak snímaný tlakovým senzorem je přiveden do datového sběrače připojeného k notebooku. To umožňuje nepřetržité sledování tlaku uvnitř plynové komory. Po dosažení maximálního tlaku v komoře (standardně 80 mmHg, 140 mmHg OS) bylo zařízení pro sběr dat nařízeno, aby odeslalo signál do systému C-PACE-EM pro generování bifázického napěťového signálu po dobu 2 ms, nastaveného na 4 V.
Řezy srdce byly získány a kultivační podmínky v 6 jamkách byly provedeny následovně: Odebraná srdce byla přenesena z transferové nádoby do misky obsahující studenou (4 °C) kardioplegickou nádobu. Levá komora byla izolována sterilní čepelí a nakrájena na kousky o objemu 1-2 cm3. Tyto tkáňové bloky byly připevněny k tkáňovým podložkám pomocí tkáňového lepidla a umístěny do vibrační mikrotomové tkáňové lázně obsahující Tyrodův roztok a kontinuálně okysličeny (3 g/l 2,3-butandionemonooximu (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g)). ), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glukózy (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M roztoku), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M roztoku), až do objemu 1 l ddH2O). Vibrační mikrotom byl nastaven na řezání řezů o tloušťce 300 µm při frekvenci 80 Hz, horizontální amplitudě vibrací 2 mm a rychlosti posuvu 0,03 mm/s. Tkáňová lázeň byla obklopena ledem, aby se roztok udržel v chladu, a teplota byla udržována na 4 °C. Tkáňové řezy byly přeneseny z mikrotomové lázně do inkubační lázně obsahující kontinuálně okysličený roztok Tyrode na ledu, dokud nebylo získáno dostatečné množství řezů pro jednu kultivační destičku. Pro transwell kultury byly tkáňové řezy připevněny ke sterilním 6 mm širokým polyuretanovým podložkám a umístěny do 6 ml optimalizovaného média (médium 199, 1x doplněk ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalický a 2X antibiotikum-antimykotikum). Na tkáňové řezy byla aplikována elektrická stimulace (10 V, frekvence 1,2 Hz) pomocí C-Pace. Pro podmínky TD byly při každé výměně média přidány čerstvé T3 a Dex v koncentraci 100 nM a 1 μM. Médium je před výměnou nasyceno kyslíkem 3krát denně. Tkáňové řezy byly kultivovány v inkubátoru při 37 °C a 5 % CO2.
Pro kultury CTCM byly tkáňové řezy umístěny na zakázkovou 3D tiskárnu do Petriho misky obsahující modifikovaný Tyrodův roztok. Zařízení je navrženo tak, aby zvětšilo velikost řezu srdce o 25 % plochy nosného kroužku. To se provádí proto, aby se řezy srdce po přenosu z Tyrodova roztoku do média a během diastoly neroztáhly. Pomocí histoakrylového lepidla byly řezy o tloušťce 300 µm upevněny na nosný kroužek o průměru 7 mm. Po připevnění tkáňových řezů k nosnému kroužku byly přebytečné tkáňové řezy odříznuty a připojené tkáňové řezy umístěny zpět do lázně s Tyrodovým roztokem na ledu (4 °C), dokud nebylo připraveno dostatečné množství řezů pro jedno zařízení. Celková doba zpracování pro všechna zařízení by neměla překročit 2 hodiny. Po připevnění 6 tkáňových řezů k jejich nosným kroužkům bylo zařízení CTCM sestaveno. Kultivační komora CTCM je předem naplněna 21 ml předoxygenovaného média. Tkáňové řezy přeneste do kultivační komory a opatrně odstraňte všechny vzduchové bubliny pipetou. Řez tkáně se poté zavede do otvoru a jemně se zatlačí na místo. Nakonec se na zařízení nasadí krytka elektrody a zařízení se přenese do inkubátoru. Poté se CTCM připojí ke vzduchové trubici a systému C-PACE-EM. Pneumatický aktuátor se otevře a vzduchový ventil otevře CTCM. Systém C-PACE-EM byl nakonfigurován tak, aby dodával 4 V při 1,2 Hz během bifázické stimulace po dobu 2 ms. Médium se měnilo dvakrát denně a elektrody se měnily jednou denně, aby se zabránilo hromadění grafitu na elektrodách. V případě potřeby lze řezy tkáně vyjmout z kultivačních jamek, aby se odstranily všechny vzduchové bubliny, které se pod ně mohly dostat. Pro podmínky léčby MT byl T3/Dex přidán čerstvý s každou výměnou média se 100 nM T3 a 1 μM Dex. Zařízení CTCM byla kultivována v inkubátoru při 37 °C a 5 % CO2.
Pro získání roztažených trajektorií srdečních řezů byl vyvinut speciální kamerový systém. Byla použita zrcadlovka (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japonsko) s makro objektivem Navitar Zoom 7000 18-108 mm (Navitar, San Francisco, CA). Vizualizace byla provedena při pokojové teplotě po výměně média za čerstvé. Kamera byla umístěna v úhlu 51° a video bylo nahráváno rychlostí 30 snímků za sekundu. Nejprve byl použit software s otevřeným zdrojovým kódem (MUSCLEMOTION43) s programem Image-J pro kvantifikaci pohybu srdečních řezů. Maska byla vytvořena pomocí MATLABu (MathWorks, Natick, MA, USA) pro definování oblastí zájmu pro tlukoucí srdeční řezy, aby se zabránilo šumu. Ručně segmentované masky byly aplikovány na všechny snímky v sekvenci snímků a poté přeneseny do pluginu MUSCLEMOTION. Muscle Motion využívá průměrnou intenzitu pixelů v každém snímku ke kvantifikaci jeho pohybu vzhledem k referenčnímu snímku. Data byla zaznamenána, filtrována a použita ke kvantifikaci doby cyklu a posouzení protažení tkáně během srdečního cyklu. Nahrané video bylo následně zpracováno pomocí digitálního filtru s nulovou fází prvního řádu. Pro kvantifikaci natažení tkáně (peak-to-peak) byla provedena analýza peak-to-peak, aby se rozlišily vrcholy a minima v zaznamenaném signálu. Kromě toho byl proveden detrending pomocí polynomu 6. řádu pro eliminaci driftu signálu. Programový kód byl vyvinut v MATLABu pro určení globálního pohybu tkáně, doby cyklu, doby relaxace a doby kontrakce (doplňkový programový kód 44).
Pro analýzu deformace jsme s využitím stejných videí vytvořených pro posouzení mechanického roztažení nejprve pomocí softwaru MUSCLEMOTION obkreslili dva snímky představující vrcholy pohybu (nejvyšší (horní) a nejnižší (dolní) bod pohybu). Poté jsme segmentovali oblasti tkáně a na segmentovanou tkáň aplikovali určitý algoritmus stínování (doplňkový obrázek 2a). Segmentovaná tkáň byla poté rozdělena do deseti podploch a napětí na každé ploše bylo vypočítáno pomocí následující rovnice: Deformace = (Sup-Sdown)/Sdown, kde Sup a Sdown jsou vzdálenosti tvaru od horního a dolního stínu tkaniny (doplňkový obrázek .2b).
Řezy srdce byly fixovány ve 4% paraformaldehydu po dobu 48 hodin. Fixované tkáně byly dehydratovány v 10% a 20% sacharóze po dobu 1 hodiny a poté přes noc v 30% sacharóze. Řezy byly poté zality do směsi pro optimální řeznou teplotu (OCT směs) a postupně zmrazeny v lázni isopentanu a suchého ledu. Zalévací bloky OCT skladujte při teplotě -80 °C do separace. Sklíčka byla připravena jako řezy o tloušťce 8 μm.
Pro odstranění OCT z řezů srdce zahřívejte sklíčka na topném bloku při 95 °C po dobu 5 minut. Na každé sklíčko přidejte 1 ml PBS a inkubujte 30 minut při pokojové teplotě, poté řezy propermeabilte nastavením 0,1% Triton-X do PBS po dobu 15 minut při pokojové teplotě. Abyste zabránili vazbě nespecifických protilátek na vzorek, přidejte na sklíčka 1 ml 3% roztoku BSA a inkubujte 1 hodinu při pokojové teplotě. BSA byl poté odstraněn a sklíčka byla promyta PBS. Každý vzorek označte tužkou. Primární protilátky (ředěné 1:200 v 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) a troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) byly přidány během 90 minut, poté sekundární protilátky (ředěné 1:200 v 1% BSA) proti myší Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079) a proti králičí Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) po dobu dalších 90 minut. Promytí 3krát PBS. Pro odlišení cílového barvení od pozadí jsme jako kontrolu použili pouze sekundární protilátku. Nakonec bylo přidáno jaderné barvivo DAPI a sklíčka byla umístěna do ochranné fólie Vectashield (Vector Laboratories) a zapečetěna lakem na nehty. (-x zvětšení) a mikroskopu Keyence se 40x zvětšením.
Pro barvení WGA byl použit WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) v koncentraci 5 μg/ml v PBS a aplikován na fixované řezy po dobu 30 minut při pokojové teplotě. Sklíčka byla poté promyta PBS a na každé sklíčko byla přidána Sudan čerň a inkubována po dobu 30 minut. Sklíčka byla poté promyta PBS a přidáno zalévací médium vectashield. Sklíčka byla vizualizována na mikroskopu Keyence při 40násobném zvětšení.
OCT byl ze vzorků odstraněn výše popsaným způsobem. Po odstranění OCT byla sklíčka přes noc ponořena do Bouinova roztoku. Sklíčka byla poté na 1 hodinu opláchnuta destilovanou vodou a poté na 10 minut umístěna do roztoku Bibrich aloe acid fuchsin. Poté byla sklíčka promyta destilovanou vodou a na 10 minut umístěna do roztoku 5% fosfomolybdenu/5% kyseliny fosfowolframové. Bez oplachování byla sklíčka přenesena přímo na 15 minut do roztoku anilinové modři. Poté byla sklíčka promyta destilovanou vodou a na 2 minuty umístěna do 1% roztoku kyseliny octové. Sklíčka byla sušena v 200N ethanolu a přenesena do xylenu. Obarvená sklíčka byla vizualizována pomocí mikroskopu Keyence s objektivem 10x. Procento fibrózy bylo kvantifikováno pomocí softwaru Keyence Analyzer.
Test životaschopnosti buněk CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), katalogové číslo V13154, dle protokolu výrobce s určitými úpravami. Zejména byl použit chirurgický razník o průměru 6 mm k zajištění jednotné velikosti tkáně během analýzy MTT. Tkáně byly jednotlivě umístěny do jamek 12jamkové destičky obsahující substrát MTT dle protokolu výrobce. Řezy byly inkubovány při 37 °C po dobu 3 hodin a živá tkáň metabolizuje substrát MTT za vzniku fialové formazanové sloučeniny. Roztok MTT byl nahrazen 1 ml DMSO a inkubován při 37 °C po dobu 15 minut, aby se z řezů srdce extrahoval fialový formazan. Vzorky byly zředěny v poměru 1:10 v DMSO v 96jamkových destičkách s průhledným dnem a intenzita fialové barvy byla měřena při 570 nm pomocí čtečky destiček Cytation (BioTek). Naměřené hodnoty byly normalizovány na hmotnost každého řezu srdce.
Médium pro srdeční řezy bylo nahrazeno médiem obsahujícím 1 μCi/ml [5-3H]-glukózy (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) pro stanovení využití glukózy, jak bylo popsáno dříve. Po 4 hodinách inkubace bylo do otevřené mikrocentrifugační zkumavky obsahující 100 µl 0,2 N HCl přidáno 100 µl média. Poté byla zkumavka umístěna do scintilační zkumavky obsahující 500 μl dH2O, aby se [3H]2O odpařoval po dobu 72 hodin při teplotě 37 °C. Poté byla mikrocentrifugační zkumavka vyjmuta ze scintilační zkumavky a přidáno 10 ml scintilační kapaliny. Scintilační počty byly provedeny pomocí kapalinového scintilačního analyzátoru Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). Využití glukózy bylo následně vypočítáno s ohledem na specifickou aktivitu [5-3H]-glukózy, neúplnou rovnováhu a pozadí, ředění [5-3H]-neznačenou glukózou a účinnost scintilačního počítače. Data jsou normalizována na hmotnost řezů srdce.
Po homogenizaci tkáně v Trizolu byla RNA izolována z řezů srdce pomocí sady Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 dle protokolu výrobce. Příprava knihovny RNAsec, sekvenování a analýza dat byly provedeny následovně:
Jako výchozí materiál pro přípravu RNA knihovny byl použit 1 μg RNA na vzorek. Sekvenační knihovny byly generovány pomocí sady NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit pro Illumina (NEB, USA) podle doporučení výrobce a k atributovým sekvencím pro každý vzorek byly přidány indexové kódy. Stručně řečeno, mRNA byla purifikována z celkové RNA pomocí magnetických kuliček připojených k poly-T oligonukleotidům. Fragmentace se provádí pomocí dvojmocných kationtů při vysoké teplotě v NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). První řetězec cDNA byl syntetizován pomocí náhodných hexamerových primerů a reverzní transkriptázy M-MuLV (RNáza H-). Druhý řetězec cDNA je poté syntetizován pomocí DNA polymerázy I a RNázy H. Zbývající přesahy jsou převedeny na tupé konce exonukleázovou/polymerázovou aktivitou. Po adenylaci 3' konce fragmentu DNA je k němu připojen adaptér NEBNext se strukturou vlásenkové smyčky, aby se připravil na hybridizaci. Pro selekci fragmentů cDNA preferované délky 150-200 bp. Fragmenty knihovny byly purifikovány pomocí systému AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA). Poté byly 15 minut při 37 °C a poté 5 minut při 95 °C před PCR použity 3 μl enzymu USER (NEB, USA) s cDNA selektovanou podle velikosti, ligované pomocí adaptéru. PCR byla následně provedena za použití DNA polymerázy Phusion High-Fidelity, univerzálních PCR primerů a primerů Index (X). Nakonec byly produkty PCR purifikovány (systém AMPure XP) a kvalita knihovny byla posouzena na systému Agilent Bioanalyzer 2100. Knihovna cDNA byla následně sekvenována pomocí sekvenátoru Novaseq. Soubory s nezpracovanými obrazovými soubory od Illumina byly převedeny na nezpracované čtené sekvence pomocí CASAVA Base Calling. Zpracovaná data jsou uložena v souborech ve formátu FASTQ(fq), které obsahují sekvence čtených sekvencí a odpovídající kvality bází. Vyberte HISAT2 pro porovnání filtrovaných sekvenčních čtených sekvencí s referenčním genomem Sscrofa11.1. HISAT2 obecně podporuje genomy jakékoli velikosti, včetně genomů větších než 4 miliardy bází, a pro většinu parametrů jsou nastaveny výchozí hodnoty. Sestřihové čtení z dat RNA Seq lze efektivně zarovnat pomocí HISAT2, nejrychlejšího systému, který je v současnosti k dispozici, se stejnou nebo lepší přesností než jakákoli jiná metoda.
Množství transkriptů přímo odráží úroveň genové exprese. Hladiny genové exprese se hodnotí množstvím transkriptů (počet sekvenování) asociovaných s genomem nebo exony. Počet čtení je úměrný hladinám genové exprese, délce genu a hloubce sekvenování. Byly vypočítány FPKM (fragmenty na tisíc párů bází sekvenovaných transkriptů na milion párů bází) a P-hodnoty diferenciální exprese byly stanoveny pomocí balíčku DESeq2. Poté jsme pro každou hodnotu P vypočítali míru falešných objevů (FDR) pomocí metody Benjaminiho-Hochberga9 založené na vestavěné R-funkci „p.adjust“.
RNA izolovaná ze srdečních řezů byla převedena na cDNA v koncentraci 200 ng/μl za použití směsi SuperScript IV Vilo Master mix od společnosti Thermo (Thermo, kat. č. 11756050). Kvantitativní RT-PCR byla provedena za použití transparentní reakční destičky Applied Biosystems Endura Plate Microamp pro 384 jamek (Thermo, kat. č. 4483319) a optického lepidla Microamp (Thermo, kat. č. 4311971). Reakční směs se skládala z 5 µl směsi Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, kat. č. 4444557), 0,5 µl Taqman Primer a 3,5 µl H2O smíchaných na jamku. Byly provedeny standardní cykly qPCR a hodnoty CT byly měřeny za použití přístroje Applied Biosystems Quantstudio 5 pro real-time PCR (384jamkový modul; produkt č. A28135). Primery Taqman byly zakoupeny od společnosti Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Hodnoty CT všech vzorků byly normalizovány na housekeeping gen GAPDH.
Uvolňování NT-ProBNP z média bylo hodnoceno pomocí soupravy NT-ProBNP (pig) (kat. č. MBS2086979, MyBioSource) podle protokolu výrobce. Stručně řečeno, do každé jamky bylo duplicitně přidáno 250 µl každého vzorku a standardu. Ihned po přidání vzorku bylo do každé jamky přidáno 50 µl testovacího činidla A. Destičku jemně protřepejte a utěsněte tmelem. Tablety byly poté inkubovány při 37 °C po dobu 1 hodiny. Poté byl roztok odsát a jamky byly 4krát promyty 350 µl 1X promývacího roztoku, přičemž promývací roztok byl pokaždé inkubován 1-2 minuty. Poté bylo do každé jamky přidáno 100 µl testovacího činidla B a utěsněte tmelem. Tableta byla jemně protřepána a inkubována při 37 °C po dobu 30 minut. Roztok byl odsát a jamky byly 5krát promyty 350 µl 1X promývacího roztoku. Do každé jamky přidejte 90 µl roztoku substrátu a destičku uzavřete. Destičku inkubujte při 37 °C po dobu 10–20 minut. Do každé jamky přidejte 50 µl zastavovacího roztoku. Destička byla ihned změřena pomocí čtečky destiček Cytation (BioTek) nastavené na 450 nm.
Byly provedeny analýzy síly signálu za účelem výběru velikostí skupin, které poskytnou sílu >80 % pro detekci 10% absolutní změny parametru s 5% mírou chybovosti typu I. Byly provedeny analýzy síly signálu za účelem výběru velikostí skupin, které poskytnou sílu >80 % pro detekci 10% absolutní změny parametru s 5% mírou chybovosti typu I. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат > 80 % моторов обнаружения 10 % абсолютного изменения параметра с 5 % частотой ошибок типа I. Byla provedena analýza síly signálu za účelem výběru velikostí skupin, které by poskytovaly sílu signálu >80 % pro detekci 10% absolutní změny parametru s 5% mírou chyb typu I.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил былоя % 80% обнаружения 10% абсолютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Byla provedena analýza síly testu za účelem výběru velikosti skupiny, která by poskytla sílu testu >80 % pro detekci 10% absolutní změny parametru a 5% míry chyb typu I.Řezy tkání byly před experimentem náhodně vybrány. Všechny analýzy byly provedeny zaslepením a vzorky byly dekódovány až po analýze všech dat. Pro provedení všech statistických analýz byl použit software GraphPad Prism (San Diego, CA). Pro všechny statistiky byly p-hodnoty považovány za významné při hodnotách <0,05. Pro všechny statistiky byly p-hodnoty považovány za významné při hodnotách <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Pro všechny statistiky byly p-hodnoty považovány za významné při hodnotách <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Pro všechny statistiky byly p-hodnoty považovány za významné při hodnotách <0,05.Na datech byl proveden oboustranný Studentův t-test pouze se 2 porovnáními. Pro stanovení významnosti mezi více skupinami byla použita jednocestná nebo oboucestná ANOVA. Při provádění post hoc testů byla použita Tukeyho korekce k zohlednění vícenásobných porovnání. Data RNAsec mají zvláštní statistické aspekty při výpočtu FDR a p.adjust, jak je popsáno v části Metody.
Více informací o designu studie naleznete v abstraktu Nature Research Report, na který odkazuje tento článek.