Děkujeme, že jste navštívili Nature.com.Verze prohlížeče, kterou používáte, má omezenou podporu CSS.Chcete-li dosáhnout nejlepšího výsledku, doporučujeme použít aktualizovaný prohlížeč (nebo vypnout režim kompatibility v aplikaci Internet Explorer).Mezitím, abychom zajistili nepřetržitou podporu, vykreslíme web bez stylů a JavaScriptu.
Existuje potřeba spolehlivého systému in vitro, který dokáže přesně reprodukovat fyziologické prostředí srdce pro testování léků.Omezená dostupnost systémů kultivace lidské srdeční tkáně vedla k nepřesným interpretacím účinků léků na srdce.Zde jsme vyvinuli model srdeční tkáňové kultury (CTCM), který elektromechanicky stimuluje srdeční řezy a podstupuje fyziologické protažení během systolické a diastolické fáze srdečního cyklu.Po 12 dnech kultivace tento přístup částečně zlepšil životaschopnost srdečních řezů, ale nezachoval plně jejich strukturální integritu.Proto jsme po screeningu malých molekul zjistili, že přidání 100 nM trijodthyroninu (T3) a 1 μM dexamethasonu (Dex) do našeho média udrželo mikrostrukturu řezů po dobu 12 dnů.V kombinaci s léčbou T3/Dex udržoval systém CTCM transkripční profily, životaschopnost, metabolickou aktivitu a strukturální integritu na stejné úrovni jako čerstvá srdeční tkáň po dobu 12 dnů.Kromě toho nadměrné napínání srdeční tkáně v kultuře indukuje hypertrofickou srdeční signalizaci, což poskytuje důkaz o schopnosti CTCM napodobovat hypertrofické stavy vyvolané srdečním natažením.Závěrem lze říci, že CTCM může modelovat fyziologii a patofyziologii srdce v kultuře po dlouhou dobu, což umožňuje spolehlivý screening léků.
Před klinickým výzkumem jsou zapotřebí spolehlivé systémy in vitro, které dokážou přesně reprodukovat fyziologické prostředí lidského srdce.Takové systémy by měly napodobovat změněné mechanické natažení, srdeční frekvenci a elektrofyziologické vlastnosti.Zvířecí modely se běžně používají jako screeningová platforma pro srdeční fyziologii s omezenou spolehlivostí při odrážení účinků léků na lidské srdce1,2.V konečném důsledku je ideální experimentální model srdeční tkáně (CTCM) modelem, který je vysoce citlivý a specifický pro různé terapeutické a farmakologické intervence a přesně reprodukuje fyziologii a patofyziologii lidského srdce3.Absence takového systému omezuje objevování nových způsobů léčby srdečního selhání4,5 a vedla ke kardiotoxicitě léků jako hlavnímu důvodu odchodu z trhu6.
Během posledního desetiletí bylo z klinického používání staženo osm nekardiovaskulárních léků, protože způsobují prodloužení QT intervalu vedoucí ke komorovým arytmiím a náhlé smrti7.Existuje tedy rostoucí potřeba spolehlivých preklinických screeningových strategií pro hodnocení kardiovaskulární účinnosti a toxicity.Částečné řešení tohoto problému poskytuje nedávné použití pluripotentních kardiomyocytů odvozených z lidských kmenových buněk (hiPS-CM) při screeningu léků a testování toxicity.Hlavními omezeními této metody jsou však nezralá povaha hiPS-CM a nedostatek mnohobuněčné složitosti srdeční tkáně.Nedávné studie ukázaly, že toto omezení lze částečně překonat použitím časného hiPS-CM k vytvoření hydrogelů srdeční tkáně krátce po nástupu spontánních kontrakcí a postupným zvyšováním elektrické stimulace v průběhu času.Tyto mikrotkáně hiPS-CM však postrádají zralé elektrofyziologické a kontraktilní vlastnosti dospělého myokardu.Kromě toho má lidská srdeční tkáň složitější strukturu, která se skládá z heterogenní směsi různých typů buněk, včetně endoteliálních buněk, neuronů a stromálních fibroblastů, propojených specifickými sadami proteinů extracelulární matrix.Tato heterogenita nekardiomyocytových populací11,12,13 v srdci dospělého savce je hlavní překážkou pro modelování srdeční tkáně pomocí jednotlivých typů buněk.Tato hlavní omezení zdůrazňují důležitost vývoje metod pro kultivaci intaktní tkáně myokardu za fyziologických a patologických podmínek.
Kultivované tenké (300 µm) řezy lidského srdce se ukázaly být slibným modelem neporušeného lidského myokardu.Tato metoda poskytuje přístup ke kompletnímu 3D mnohobuněčnému systému podobnému lidské srdeční tkáni.Do roku 2019 však bylo použití kultivovaných srdečních řezů omezeno krátkým (24 hodinovým) přežitím kultivace.To je způsobeno řadou faktorů, včetně nedostatku fyzikálně-mechanického roztažení, rozhraní vzduch-kapalina a použití jednoduchých médií, která nepodporují potřeby srdeční tkáně.V roce 2019 několik výzkumných skupin prokázalo, že začlenění mechanických faktorů do systémů kultivace srdeční tkáně může prodloužit životnost kultury, zlepšit srdeční expresi a napodobit srdeční patologii.Dvě elegantní studie 17 a 18 ukazují, že jednoosé mechanické zatížení má pozitivní vliv na srdeční fenotyp během kultivace.Tyto studie však nepoužívaly dynamické trojrozměrné fyzikálně-mechanické zatížení srdečního cyklu, protože srdeční části byly zatíženy buď izometrickými tahovými silami 17 nebo lineárním auxotonickým zatížením 18.Tyto metody protahování tkání vedly k supresi mnoha srdečních genů nebo k nadměrné expresi genů spojených s abnormálními reakcemi na natahování.Zejména Pitoulis a kol.19 vyvinuli dynamickou kultivační lázeň srdečních plátků pro rekonstrukci srdečního cyklu s využitím zpětné vazby siloměru a napětí.Ačkoli tento systém umožňuje přesnější modelování srdečního cyklu in vitro, složitost a nízká propustnost metody omezuje použití tohoto systému.Naše laboratoř nedávno vyvinula zjednodušený kultivační systém využívající elektrickou stimulaci a optimalizované médium pro udržení životaschopnosti řezů prasečí a lidské srdeční tkáně po dobu až 6 dnů20,21.
V současném rukopisu popisujeme model srdeční tkáňové kultury (CTCM) využívající řezy prasečího srdce, které zahrnuje humorální podněty k rekapitulaci trojrozměrné srdeční fyziologie a patofyziologické distenze během srdečního cyklu.Tento CTCM může zvýšit přesnost předklinické predikce léků na úroveň, která nebyla dosud dosažena, tím, že poskytuje cenově efektivní, středně výkonný srdeční systém, který napodobuje fyziologii/patofyziologii srdce savců pro předklinické testování léků.
Hemodynamické mechanické signály hrají kritickou roli při udržování funkce kardiomyocytů in vitro 22,23,24.V současném rukopisu jsme vyvinuli CTCM (obrázek 1a), který dokáže napodobit srdeční prostředí dospělých indukcí elektrické i mechanické stimulace na fyziologických frekvencích (1,2 Hz, 72 tepů za minutu).Aby se zabránilo nadměrnému natažení tkáně během diastoly, bylo použito zařízení pro 3D tisk ke zvětšení velikosti tkáně o 25 % (obr. 1b).Elektrická stimulace vyvolaná systémem C-PACE byla načasována tak, aby začala 100 ms před systolou pomocí systému sběru dat, aby se plně reprodukoval srdeční cyklus.Systém tkáňových kultur používá programovatelný pneumatický pohon (LB Engineering, Německo) k cyklickému roztahování flexibilní silikonové membrány, aby došlo k expanzi srdečních plátků v horní komoře.Systém byl připojen k externímu vedení vzduchu přes tlakový převodník, který umožňoval přesné nastavení tlaku (± 1 mmHg) a času (± 1 ms) (obr. 1c).
a Připojte tkáňový řez k 7mm podpůrnému kroužku, znázorněnému modře, uvnitř kultivační komory zařízení.Kultivační komora je oddělena od vzduchové komory tenkou pružnou silikonovou membránou.Mezi každou komoru umístěte těsnění, abyste zabránili úniku.Víko přístroje obsahuje grafitové elektrody, které zajišťují elektrickou stimulaci.b Schematické znázornění velkého tkáňového zařízení, vodícího kroužku a opěrného kroužku.Tkáňové řezy (hnědé) jsou umístěny na nadrozměrném zařízení s vodicím kroužkem umístěným v drážce na vnějším okraji zařízení.Pomocí vodítka opatrně umístěte podpůrný kroužek potažený tkáňovým akrylovým lepidlem na část srdeční tkáně.c Graf zobrazující čas elektrické stimulace jako funkci tlaku ve vzduchové komoře řízeného programovatelným pneumatickým pohonem (PPD).Pro synchronizaci elektrické stimulace pomocí tlakových senzorů bylo použito zařízení pro sběr dat.Když tlak v kultivační komoře dosáhne nastavené prahové hodnoty, je do C-PACE-EM vyslán pulzní signál ke spuštění elektrické stimulace.d Obrázek čtyř CTCM umístěných na polici inkubátoru.K jednomu PPD jsou přes pneumatický okruh připojeny čtyři přístroje a do hemostatického ventilu jsou vloženy tlakové senzory pro monitorování tlaku v pneumatickém okruhu.Každé zařízení obsahuje šest tkáňových řezů.
Pomocí jediného pneumatického aktuátoru jsme byli schopni ovládat 4 přístroje CTCM, z nichž každý pojal 6 tkáňových řezů (obr. 1d).V CTCM se tlak vzduchu ve vzduchové komoře převádí na synchronní tlak v tekutinové komoře a vyvolává fyziologickou expanzi srdečního řezu (obrázek 2a a doplňkový film 1).Hodnocení natažení tkáně při 80 mm Hg.Umění.ukázaly natažení tkáňových řezů o 25 % (obr. 2b).Ukázalo se, že toto procentuální natažení odpovídá fyziologické délce sarkomery 2,2–2,3 µm pro normální kontraktilitu srdečního úseku17,19,25.Pohyb tkáně byl hodnocen pomocí vlastního nastavení kamery (doplňkový obrázek 1).Amplituda a rychlost pohybu tkáně (obr. 2c, d) odpovídala protažení během srdečního cyklu a času během systoly a diastoly (obr. 2b).Natažení a rychlost srdeční tkáně během kontrakce a relaxace zůstaly konstantní po dobu 12 dnů v kultuře (obr. 2f).Abychom vyhodnotili vliv elektrické stimulace na kontraktilitu během kultivace, vyvinuli jsme metodu pro stanovení aktivní deformity pomocí stínovacího algoritmu (doplňkový obr. 2a,b) a byli jsme schopni rozlišit mezi deformacemi s elektrickou stimulací a bez ní.Stejný řez srdcem (obr. 2f).V pohyblivé oblasti řezu (R6-9) bylo napětí během elektrické stimulace o 20 % vyšší než při absenci elektrické stimulace, což ukazuje na příspěvek elektrické stimulace ke kontraktilní funkci.
Reprezentativní stopy tlaku ve vzduchové komoře, tlaku v komoře tekutiny a měření pohybu tkáně potvrzují, že tlak v komoře mění tlak v komoře tekutiny, což způsobuje odpovídající pohyb řezu tkáně.b Reprezentativní stopy procenta roztažení (modrá) tkáňových řezů odpovídající procentu roztažení (oranžová).c Naměřený pohyb srdečního řezu je konzistentní s naměřenou rychlostí pohybu.(d) Reprezentativní trajektorie cyklického pohybu (modrá čára) a rychlosti (oranžová tečkovaná čára) v řezu srdce.e Kvantifikace doby cyklu (n = 19 řezů na skupinu, od různých prasat), doby kontrakce (n = 19 řezů na skupinu), relaxační doby (n = 19 řezů na skupinu, od různých prasat), pohybu tkáně (n = 25 ).řezy)/skupina od různých prasat), maximální systolická rychlost (n = 24(D0), 25(D12) řezů/skupina od různých prasat) a maximální relaxační rychlost (n=24(D0), 25(D12) řezů/skupina od různých prasat).Dvoustranný Studentův t-test neukázal žádný významný rozdíl v žádném parametru.f Reprezentativní záznamy kmenové analýzy tkáňových řezů s (červenou) a bez (modré) elektrické stimulace, deset regionálních oblastí tkáňových řezů ze stejného řezu.Spodní panely ukazují kvantifikaci procentuálního rozdílu v namáhání v řezech tkání s a bez elektrické stimulace v deseti oblastech z různých řezů. (n = 8 řezů/skupina z různých prasat, provádí se dvoustranný Studentův t-test; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 řezů/skupina z různých prasat, provádí se dvoustranný Studentův t-test; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий ,**p0<,0н1 Стью,**p00<,1тьюде 0,05). (n = 8 sekcí/skupina z různých prasat, dvoustranný Studentův t-test; ****p<0,0001,**p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，5*p < （ （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，5*p < （ (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; *****p <0,005 <0,001,0,01,01, 01 (n = 8 sekcí/skupina, z různých prasat, dvoustranný Studentův t-test; ****p<0,0001,**p<0,01, *p<0,05).Chybové úsečky představují průměr ± standardní odchylku.
V našem předchozím statickém biomimetickém kultivačním systému srdečních řezů [20, 21] jsme udržovali životaschopnost, funkci a strukturální integritu srdečních řezů po dobu 6 dnů aplikací elektrické stimulace a optimalizací složení média.Po 10 dnech však tato čísla prudce klesla.Budeme odkazovat na řezy kultivované v našem předchozím statickém biomimetickém kultivačním systému 20, 21 kontrolních podmínek (Ctrl) a použijeme naše dříve optimalizované médium jako podmínky MC a kultivaci za současné mechanické a elektrické stimulace (CTCM).volal .Nejprve jsme zjistili, že mechanická stimulace bez elektrické stimulace byla nedostatečná k udržení životaschopnosti tkáně po dobu 6 dnů (doplňkový obrázek 3a, b).Zajímavé je, že se zavedením fyziomechanické a elektrické stimulace pomocí STCM zůstala životaschopnost 12denních srdečních řezů stejná jako u čerstvých srdečních řezů za podmínek MS, ale nikoli za podmínek Ctrl, jak ukazuje analýza MTT (obr. 1).3a).To naznačuje, že mechanická stimulace a simulace srdečního cyklu mohou udržet tkáňové řezy životaschopné dvakrát tak dlouho, než bylo popsáno v našem předchozím statickém kultivačním systému.Hodnocení strukturní integrity tkáňových řezů pomocí imunoznačení srdečního troponinu T a konexinu 43 však ukázalo, že exprese konexinu 43 byla významně vyšší v tkáních MC v den 12 než u kontrol ve stejný den.Jednotná exprese konexinu 43 a tvorba Z-disku však nebyly plně zachovány (obr. 3b).Ke kvantifikaci strukturální integrity tkáně používáme rámec umělé inteligence (AI)26, potrubí hlubokého učení založeného na obrázcích založené na barvení troponinem-T a konexinem43 k automatické kvantifikaci strukturální integrity a fluorescence srdečních řezů z hlediska síly lokalizace.Tato metoda využívá konvoluční neuronovou síť (CNN) a rámec hlubokého učení ke spolehlivé kvantifikaci strukturální integrity srdeční tkáně automatizovaným a nezaujatým způsobem, jak je popsáno v odkazu.26. MC tkáň vykazovala zlepšenou strukturní podobnost ke dni 0 ve srovnání se statickými kontrolními řezy.Kromě toho Massonovo trichromové barvení odhalilo významně nižší procento fibrózy za podmínek MS ve srovnání s kontrolními podmínkami 12. den kultivace (obr. 3c).Zatímco CTCM zvýšila životaschopnost řezů srdeční tkáně v den 12 na úroveň podobnou té, kterou má tkáň čerstvého srdce, nezlepšila významně strukturální integritu řezů srdce.
sloupcový graf ukazuje kvantifikaci životaschopnosti MTT řezů čerstvého srdce (D0) nebo kultury srdečních řezů po dobu 12 dnů buď ve statické kultuře (D12 Ctrl) nebo v CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) řezy prasete, jedna skupina provedený test z jiného způsobu <00. ve srovnání s D0 a **p < 0,01 ve srovnání s D12 Ctrl). sloupcový graf ukazuje kvantifikaci životaschopnosti MTT řezů čerstvého srdce (D0) nebo kultury srdečních řezů po dobu 12 dnů buď ve statické kultuře (D12 Ctrl) nebo v CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC proveden) # řezy#0#/skupina test z jiného způsobu testu <000; 1 ve srovnání s D0 a **p < 0,01 ve srovnání s D12 Ctrl).histogram ukazuje kvantifikaci životaschopnosti řezů čerstvého srdce MTT (D0) nebo kultivace řezů srdce po dobu 12 dnů buď ve statické kultuře (kontrola D12) nebo CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrola D12). ) ), 12 (D12 MC) řezů/skupina provedených testů z různých prasat, ANOVA####p < 0,0001 по сравнению с D0 a **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 ve srovnání s D0 a **p < 0,01 ve srovnání s D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏埈扇12切文12天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试#####00000 ，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养 (D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切2心脏切22 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**phistogram ukazující kvantifikaci životaschopnosti MTT v řezech čerstvého srdce (D0) nebo řezech srdce kultivovaných po dobu 12 dnů ve statické kultuře (kontrola D12) nebo CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrola D12)), 12 (D12 MC) řezů/skupina z různých prasat, jednocestný test ANOVA;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 ve srovnání s D0, **p < 0,01 ve srovnání s D12 Ctrl).b Troponin-T (zelená), konexin 43 (červená) a DAPI (modrá) v čerstvě izolovaných srdečních řezech (D0) nebo srdečních řezech kultivovaných za statických podmínek (Ctrl) nebo CTCM (MC) po dobu 12 dnů) reprezentativních imunofluorescenčních snímků (slepá stupnice = 100 µm). Kvantifikace strukturální integrity srdeční tkáně umělou inteligencí (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) řezů/skupina každý z jiného prasete, je proveden jednosměrný test ANOVA; ####p < 0,0001 ve srovnání s D0 a ****p < 0,0001 ve srovnání s D12 Ctrl). Kvantifikace strukturální integrity srdeční tkáně pomocí umělé inteligence (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) řezů/skupina, každý z různých prasat, je proveden jednosměrný test ANOVA; ####p < 0,0001 ve srovnání s D0 a ****p < 0,0001 ve srovnání s D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектой интелель искуственным интелелек2 инто7 2 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный **** тест ANOVA; ####p < 0,00001 ранвпю 01 по сравнению с D12 Ctrl). Kvantifikace strukturální integrity srdeční tkáně umělou inteligencí (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) řezů/skupin z různých prasat, proveden jednocestný test ANOVA; ####p < 0,0001 vs. s D0 a ****p < 0,0001 ve srovnání s D12 Ctrl).人工智能量化心脏组组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) řezy/skupina každého z různých prasat, jednosměrný test ANOVA <00;#0.#p ****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) řezy/skupina různých prasat, jednosměrný test ANOVA <00. ****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердетканой (20D1 2007) (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001,01 vs. 01 по сравнению с D12 Ctrl). Umělá inteligence pro kvantifikaci strukturální integrity srdeční tkáně (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) řezů/skupina různých prasat, jednocestný test ANOVA; ####p<0,0001 vs .D0 Pro srovnání ****p < 0,0001 ve srovnání s D12 Ctrl). c Reprezentativní snímky (vlevo) a kvantifikace (vpravo) pro řezy srdce obarvené Massonovým trichromovým barvením (holé měřítko = 500 µm) (n = 10 řezů/skupina každý z jiného prasete, je proveden jednosměrný test ANOVA; ####p < 0,0001 ve srovnání s D0 a ***p < 0,0001 ve srovnání s D100). c Reprezentativní snímky (vlevo) a kvantifikace (vpravo) pro řezy srdce obarvené Massonovým trichromovým barvením (holé měřítko = 500 µm) (n = 10 řezů/skupina každý z různých prasat, je proveden jednosměrný test ANOVA; #### p < 0,0001 ve srovnání s D0 a ***01 ve srovnání s D10Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сертрдшнах, цердшнаца красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от ратсвиныневе раствылыневе расителем Массона носторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 a ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Reprezentativní snímky (vlevo) a kvantifikace (vpravo) řezů srdce obarvených Massonovým trichromovým barvivem (nepotažená škála = 500 µm) (n = 10 řezů/skupina z různých prasat, proveden jednocestný test ANOVA; #### p < 0,0001 ve srovnání s D0 a ***p < 0,0001 ve srovnání s D). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 µm）（n = 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸帰度 裸帰度 裣帺度 裣帺度 裣帺度 裣帺度度 = 500 µm） （n = 10 个 切 片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单吕 0.0D 001. Anova 捕向 0.0D相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сертрдшма, резова сертрдшнрова красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый, от дрвотиониой дрвотиониой помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с с D0, 0202 Ctrl праю с D0, 0201 Ctrl <p ра ). c Reprezentativní snímky (vlevo) a kvantifikace (vpravo) řezů srdce obarvených Massonovým trichromem (blank = 500 µm) (n = 10 řezů/skupina, každý z jiného prasete, testováno jednosměrnou analýzou rozptylu ;### # p < 0,0001 ve srovnání s D0, ***p < 0,0001 ve srovnání s Ctrl).Chybové úsečky představují průměr ± standardní odchylku.
Předpokládali jsme, že přidáním malých molekul do kultivačního média by se mohla zlepšit integrita kardiomyocytů a snížit rozvoj fibrózy během kultivace CTCM.Proto jsme provedli screening na malé molekuly pomocí našich statických kontrolních kultur20,21 kvůli malému počtu matoucích faktorů.Pro tento screening byly vybrány dexamethason (Dex), trijodtyronin (T3) a SB431542 (SB).Tyto malé molekuly byly dříve používány v kulturách hiPSC-CM k indukci zrání kardiomyocytů zvýšením délky sarkomer, T-tubulů a rychlosti vedení.Kromě toho je známo, že jak Dex (glukokortikoid), tak SB potlačují zánět29,30.Proto jsme testovali, zda by zahrnutí jedné nebo kombinace těchto malých molekul zlepšilo strukturální integritu srdečních řezů.Pro počáteční screening byla dávka každé sloučeniny vybrána na základě koncentrací běžně používaných v modelech buněčných kultur (1 uM Dex27, 100 nM T327 a 2,5 uM SB31).Po 12 dnech kultivace vedla kombinace T3 a Dex k optimální strukturální integritě kardiomyocytů a minimální vláknité remodelaci (doplňkové obrázky 4 a 5).Kromě toho použití dvojnásobných nebo dvojnásobných koncentrací T3 a Dex vyvolalo škodlivé účinky ve srovnání s normálními koncentracemi (doplňkový obr. 6a, b).
Po počátečním screeningu jsme provedli přímé srovnání 4 kultivačních podmínek (obrázek 4a): Ctrl: řezy srdce kultivované v naší dříve popsané statické kultuře s použitím našeho optimalizovaného média;20.21 TD: T3 a Ctrl s Přidán Dex ve středu;MC: řezy srdce kultivované v CTCM za použití našeho dříve optimalizovaného média;a MT: CTCM s T3 a Dex přidanými do média.Po 12 dnech kultivace zůstala životaschopnost MS a MT tkání stejná jako v čerstvých tkáních hodnocených MTT testem (obr. 4b).Je zajímavé, že přidání T3 a Dex do transwell kultur (TD) nevedlo k významnému zlepšení životaschopnosti ve srovnání s podmínkami Ctrl, což ukazuje na důležitou roli mechanické stimulace při udržování životaschopnosti srdečních řezů.
diagram experimentálního návrhu znázorňující čtyři kultivační podmínky použité k vyhodnocení účinků mechanické stimulace a suplementace T3/Dex na médiu po dobu 12 dnů. b Sloupcový graf ukazuje kvantifikaci životaschopnosti 12 dní po kultivaci ve všech 4 kultivačních podmínkách (Ctrl, TD, MC a MT) ve srovnání s řezy čerstvého srdce (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a D12 MT), 12 (D12 MC) provedených řezů #0OVA #00- skupina z různých testů <0 0 0-skupina z různých 1, ###p < 0,001 ve srovnání s D0 a **p < 0,01 ve srovnání s D12 Ctrl). b Sloupcový graf ukazuje kvantifikaci životaschopnosti 12 dní po kultivaci ve všech 4 kultivačních podmínkách (Ctrl, TD, MC a MT) ve srovnání s řezy čerstvého srdce (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a D12 MT), 12 (D12 MC) provedených řezů #0OVA #00- skupina z různých testů <0 0 0-skupina z různých 1, ###p < 0,001 ve srovnání s D0 a **p < 0,01 ve srovnání s D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 поднированую всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC a MT) по сравнению со сравнению со со свнению со (1 свежима свежима срезад8 D18 = 0000 D) срезади 2 Ctrl, D12 TD a D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится однодится однодност 000, <; 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Sloupcový graf ukazuje kvantifikaci životaschopnosti 12 dní po kultivaci ve všech 4 kultivačních podmínkách (kontrola, TD, MC a MT) ve srovnání s řezy čerstvého srdce (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a D12 MT), 12 (D12 MC#) prasečími řezy#01-skupina, <pAN skupina z různých testů ###p < 0,001 vs. D0 a **p < 0,01 ve srovnání s D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D12D　TD、12D2TD) MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0,0001，###1 < **0,01 p0与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC a MT) ами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезты/тгрутипропа ###p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram zobrazující všechny 4 kultivační podmínky (kontrola, TD, MC a MT) ve srovnání s čerstvými řezy srdce (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a D12 MT), od různých prasat 12 (D12 MC) řezů/skupina, jednocestný test ANOVA; #0#0#01#p<0.0.0. 0,01 vs. kontrola D12). c Sloupcový graf ukazuje kvantifikaci toku glukózy 12 dní po kultivaci ve všech 4 kultivačních podmínkách (Ctrl, TD, MC a MT) ve srovnání s řezy čerstvého srdce (D0) (n = 6 řezů/skupina z různých prasat, je proveden jednosměrný test ANOVA; ###p < 0,001, ve srovnání s D0 a ***p <0,001 ve srovnání s D0. c Sloupcový graf ukazuje kvantifikaci toku glukózy 12 dní po kultivaci ve všech 4 kultivačních podmínkách (Ctrl, TD, MC a MT) ve srovnání s řezy čerstvého srdce (D0) (n = 6 řezů/skupina z různých prasat, je proveden jednosměrný test ANOVA; ###p < 0,001, ve srovnání s D0 a ***p <0,001 ve srovnání s D0. c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 днейоавивосвой ех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC a MT) по сравнению со свежими срезадоца срезадоцарезадоцарезадоцарезадоцарезадоцарезами ппу от разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению по сравнению опонс 010 ран D12 Ctrl). c Histogram ukazuje kvantifikaci toku glukózy 12 dní po kultivaci za všech 4 kultivačních podmínek (kontrola, TD, MC a MT) ve srovnání s řezy čerstvého srdce (D0) (n = 6 řezů/skupina z různých prasat, proveden jednocestný test ANOVA; ###p < 0,001 ve srovnání s D0 a ***p < 0,001 ve srovnání s D1201). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片片(D0) 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片片(D0) 种培养条件，夎条12夤通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p*** 与D02 猛D 0,001 < 与D02 猛縸縸比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt ） 新鲜 心脏 切牸 切牸 切牸 切牸养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， 引 ANOVA 猪 弍 ANOVA 琑 猡测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 пионей 12 потоку для всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC a MT) по сравнению со свежима сри0сеза =ми сререза ​​ов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по <,0 равне равнению с D12 (контроль). c Histogram ukazující kvantifikaci toku glukózy 12 dní po kultivaci pro všechny 4 kultivační podmínky (kontrola, TD, MC a MT) ve srovnání s čerstvými řezy srdce (D0) (n = 6 řezů/skupina, z různých prasat, byly provedeny jednostranné testy ANOVA, ###p < 0,001 ve srovnání s D0, ***p1 ve srovnání s D0).d Grafy kmenové analýzy čerstvých (modrá), MC dne 12 (zelená) a MT (červená) tkání 12. dne v deseti bodech regionálních řezů tkání (n = 4 řezy/skupina, jednosměrný test ANOVA; mezi skupinami nebyl žádný významný rozdíl).e Vulkánový graf ukazující odlišně exprimované geny v řezech čerstvého srdce (D0) ve srovnání s řezy srdce kultivovanými za statických podmínek (Ctrl) nebo za podmínek MT (MT) po dobu 10-12 dnů.f Tepelná mapa sarkomerových genů pro srdeční řezy kultivované za každé z kultivačních podmínek.Chybové úsečky představují průměr ± standardní odchylku.
Metabolická závislost na přechodu z oxidace mastných kyselin na glykolýzu je charakteristickým znakem dediferenciace kardiomyocytů.Nezralé kardiomyocyty primárně využívají glukózu k produkci ATP a mají hypoplastické mitochondrie s několika kristami5,32.Analýzy utilizace glukózy ukázaly, že za podmínek MC a MT byla utilizace glukózy podobná jako ve tkáních dne 0 (obrázek 4c).Vzorky Ctrl však vykazovaly významné zvýšení využití glukózy ve srovnání s čerstvou tkání.To ukazuje, že kombinace CTCM a T3/Dex zvyšuje životaschopnost tkání a zachovává metabolický fenotyp 12denních kultivovaných srdečních řezů.Kromě toho analýza kmenů ukázala, že hladiny kmenů zůstaly stejné jako v čerstvé srdeční tkáni po dobu 12 dnů za podmínek MT a MS (obr. 4d).
Abychom analyzovali celkový dopad CTCM a T3/Dex na globální transkripční krajinu tkáně srdečních řezů, provedli jsme RNAseq na srdečních řezech ze všech čtyř různých kultivačních podmínek (doplňková data 1).Je zajímavé, že řezy MT vykazovaly vysokou transkripční podobnost s čerstvou srdeční tkání, přičemž pouze 16 bylo odlišně exprimováno z 13 642 genů.Jak jsme však ukázali dříve, řezy Ctrl vykazovaly 1229 odlišně exprimovaných genů po 10–12 dnech v kultuře (obr. 4e).Tato data byla potvrzena qRT-PCR srdečních a fibroblastových genů (doplňkový obr. 7a-c).Je zajímavé, že sekce Ctrl ukázaly downregulaci srdečních genů a genů buněčného cyklu a aktivaci zánětlivých genových programů.Tato data naznačují, že dediferenciace, ke které normálně dochází po dlouhodobé kultivaci, je za MT podmínek zcela oslabena (doplňkový obr. 8a,b).Pečlivé studium genů sarkomer ukázalo, že pouze za podmínek MT jsou geny kódující sarkomeru (obr. 4f) a iontový kanál (doplňkový obr. 9) zachovány a chrání je před supresí za podmínek Ctrl, TD a MC.Tato data ukazují, že při kombinaci mechanické a humorální stimulace (T3/Dex) může transkriptom srdečního řezu zůstat podobný čerstvým srdečním řezům po 12 dnech v kultuře.
Tyto transkripční nálezy jsou podpořeny skutečností, že strukturální integrita kardiomyocytů v srdečních řezech je nejlépe zachována za podmínek MT po dobu 12 dnů, jak ukazuje intaktní a lokalizovaný konexin 43 (obr. 5a).Kromě toho byla fibróza v řezech srdce za podmínek MT významně snížena ve srovnání s Ctrl a podobně jako u čerstvých řezů srdce (obr. 5b).Tato data ukazují, že kombinace mechanické stimulace a léčby T3/Dex účinně zachovává srdeční strukturu v srdečních řezech v kultuře.
a Reprezentativní imunofluorescenční snímky troponinu-T (zelená), konexinu 43 (červená) a DAPI (modrá) v čerstvě izolovaných srdečních řezech (D0) nebo kultivovaných po dobu 12 dnů ve všech čtyřech podmínkách kultivace srdečních řezů (stupnice = 100 µm).). Kvantifikace strukturální integrity srdeční tkáně umělou inteligencí (n = 7 (D0 a D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC a D12 MT) řezů/skupina z různých prasat, je proveden jednosměrný test ANOVA; ####p < 0,0001 ve srovnání s D0 a *p < **** až D1001 < 0 Ctrl ve srovnání. Kvantifikace strukturální integrity srdeční tkáně umělou inteligencí (n = 7 (D0 a D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC a D12 MT) řezů/skupina z různých prasat, je proveden jednosměrný test ANOVA; #### p < 0,0001 ve srovnání s D0 a *p < **** až D0,0105 ve srovnání. Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искустствен12й =D. Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC a D12 MT) срезов/группу z разных свиней, проведен однофакторный т01# # # # # # # 1 нию с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Kvantifikace strukturální integrity srdeční tkáně pomocí umělé inteligence (n = 7 (D0 a D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC a D12 MT) řezů/skupina z různých prasat, proveden jednocestný test ANOVA; #### p < 0,0001 ve srovnání s D0 a *p < 0,05 nebo D12 Ctrl < 0,05 nebo D100p).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 脼仇仇仇仇仇仇丛工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,0001 相D11对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 伻 d12 m工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p <  0 新斸 斸 0,05 Dp1 Ctrl 相比）.Kvantifikace strukturální integrity srdeční tkáně pomocí umělé inteligence u různých prasat (n = 7 (D0 a D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC a D12 MT) řezů/skupina) s jednocestným testem ANOVA;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 ve srovnání s D0 a *p < 0,05 nebo ****p < 0,0001 ve srovnání s D12 Ctrl). b Reprezentativní snímky a kvantifikace pro řezy srdce obarvené Massonovým trichromovým barvivem (měřítko = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD a D12 MC), 9 (D12 MT) řezů/skupina z různých prasat, je proveden jednosměrný test ANOVA <# D00 a <00; #p 1 nebo ****p < 0,0001 ve srovnání s D12 Ctrl). b Reprezentativní snímky a kvantifikace pro řezy srdce obarvené Massonovým trichromovým barvivem (měřítko = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD a D12 MC), 9 (D12 MT) řezů/skupina z různých prasat, je proveden jednosměrný test ANOVA <# D00 a <00; #p 1 nebo ****p < 0,0001 ve srovnání s D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения a количественная оценка срезов сердца, окрахленныхмантрентренка ссона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD a D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/гсрутранпухгсвытранпухгсовиповхусрутранпухгсовипове лняется односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,00001 Ctrlю). b Reprezentativní snímky a kvantifikace řezů srdce obarvených Massonovým trichromovým barvivem (stupnice = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD a D12 MC), 9 (D12 MT) řezů/skupina od různých prasat, provedená jednocestná ANOVA; .0001 vs. D12 Ctrl). b Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量像和量化（比例尺（比例尺（比例尺（比例尺（比例尺（比例尺（比例尺（比例尺（比例尺（比例尺= 500 µm）20〼D 0D1TD10（n=D10和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切/组，进行单因素方差分析；0#.0p##p 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切 片 的 代表性 和 量化 （比例 尉ﰺ 尺、 = 500 µm n ＀ ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 刉片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek Obrázek obrázek比，***p < 0,001, 或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения a количественная оценка срезов сердца, окрашенныхоманнах табная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, Ctrl D12, D12 TD a D12 MC), 9 (D12 MT) ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Reprezentativní snímky a kvantifikace řezů srdce obarvených Massonovým trichromem (měřítko = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD a D12 MC), 9 (D12 MT) řezů od různých prasat/skupinu, jedna metoda ANOVA; ## <##p < 0,0000**** p001 ve srovnání s D00001***. ve srovnání s D12 Ctrl).Chybové úsečky představují průměr ± standardní odchylku.
Nakonec byla schopnost CTCM napodobovat srdeční hypertrofii hodnocena zvýšením roztažení srdeční tkáně.U CTCM se maximální tlak ve vzduchové komoře zvýšil z 80 mmHg na 80 mmHg.Umění.(normální roztažnost) až 140 mmHg Art.(obr. 6a).To odpovídá 32% nárůstu natažení (obr. 6b), které bylo dříve ukázáno jako odpovídající procentuální natažení potřebné pro srdeční řezy k dosažení délky sarkomery podobné délce pozorované u hypertrofie.Natažení a rychlost srdeční tkáně během kontrakce a relaxace zůstaly konstantní během šesti dnů kultivace (obr. 6c).Srdeční tkáň z MT podmínek byla vystavena normálnímu natažení (MT (Normal)) nebo nadměrnému natažení (MT (OS)) po dobu šesti dnů.Již po čtyřech dnech v kultuře byl hypertrofický biomarker NT-ProBNP významně zvýšen v médiu za podmínek MT (OS) ve srovnání s podmínkami MT (normální) (obr. 7a).Navíc po šesti dnech kultivace se velikost buněk v MT (OS) (obr. 7b) významně zvýšila ve srovnání s řezy srdce MT (normální).Kromě toho byla nukleární translokace NFATC4 významně zvýšena v přetažených tkáních (obr. 7c).Tyto výsledky ukazují progresivní vývoj patologické remodelace po hyperdistenzi a podporují koncept, že zařízení CTCM lze použít jako platformu pro studium signalizace srdeční hypertrofie vyvolané roztažením.
Reprezentativní stopy tlaku ve vzduchové komoře, tlaku v komoře tekutiny a měření pohybu tkáně potvrzují, že tlak v komoře mění tlak v komoře tekutiny, což způsobuje odpovídající pohyb řezu tkáně.b Reprezentativní křivky procenta natažení a rychlosti natažení pro normálně natažené (oranžové) a přetažené (modré) řezy tkání.c Sloupcový graf znázorňující dobu cyklu (n = 19 řezů na skupinu, od různých prasat), dobu kontrakce (n = 18-19 řezů na skupinu, od různých prasat), relaxační čas (n = 19 řezů na skupinu, od různých prasat) , amplitudu pohybu tkáně (n = 14 řezů/skupinu, od různých prasat), 1 maximální rychlost systolické relaxace (různá systolická rychlost) a 1 maximální systolickou rychlost n = 14 (D0), 15 (D6) ) sekcí/skupin) od různých prasat), dvoustranný Studentův t-test neukázal žádný významný rozdíl v žádném parametru, což ukazuje, že tyto parametry zůstaly konstantní během 6 dnů kultivace s přepětím.Chybové úsečky představují průměr ± standardní odchylku.
a Sloupcový graf kvantifikace koncentrace NT-ProBNP v kultivačním médiu ze srdečních řezů kultivovaných za podmínek MT normálního natažení (Norm) nebo nadměrného natažení (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm a D4 MTOS) řezy/skupina z různých prasat, dvoucestná ANOVA je porovnána s normálním. a Sloupcový graf kvantifikace koncentrace NT-ProBNP v kultivačním médiu ze srdečních řezů kultivovaných za podmínek MT normálního natažení (Norm) nebo přetažení (OS) (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm a D4 MTOS) řezy/skupinu z různých prasat, je provedena dvoucestná **p10 normální ANOVA.Kvantitativní histogram koncentrace NT-ProBNP v kultivačním médiu ze srdečních řezů kultivovaných za podmínek normálního natažení MT (norma) nebo nadměrného natažení (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm a D4). MTOS) řezů/skupina od různých prasat, dvoufaktorová analýza rozptylu**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 ve srovnání s normálním roztažením). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度基中NT-ProBNP 浓度塼囚懾澾4 D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析書常渣游游游游游游游游游游渐猪的切片0,01). a Kvantifikace koncentrace NT-ProBNP v řezech srdce kultivovaných za podmínek normálního natažení MT (Norm) nebo přetažení (OS) (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm 和D4 MTOS) z různých podmínek; **ve srovnání s normálním protahováním, p < 0,01).histogram Kvantifikace koncentrací NT-ProBNP v řezech srdce kultivovaných za podmínek normálního natažení MT (norma) nebo nadměrného natažení (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) a D4 MTOS) řezů/skupina z různých prasat, dvoucestná analýza rozptylu;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 ve srovnání s normálním roztažením). b Reprezentativní snímky pro řezy srdce obarvené troponinem-T a WGA (vlevo) a kvantifikace velikosti buněk (vpravo) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) buněk/skupina z 10 různých řezů z různých prasat, je proveden dvoustranný Studentův t-test; ****p < 0,0001 ve srovnání s roztažením). b Reprezentativní snímky pro srdeční řezy obarvené troponinem-T a WGA (vlevo) a kvantifikace velikosti buněk (vpravo) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) buněk/skupina z 10 různých řezů od různých prasat, je proveden dvoustranný Studentův t-test; ****p < 0,0000 ve srovnání s normálním úsekem). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т a АЗговионерва) еделения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных сревзных среве - проводится хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальтныжемра). b Reprezentativní snímky srdečních řezů obarvených troponinem-T a AZP (vlevo) a kvantifikace velikosti buněk (vpravo) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) buněk/skupina z 10 různých řezů z různých prasat, byl proveden dvoustranný Studentův t-test; ****p < 0,0001 ve srovnání s normálním kmenem). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代3表惼的代3表怏），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾厉飛丼尾厭生縼下厣正生 下拣正生t 拣正生t 拣正生 t 掣正生t 掣正生，****p < 0,0001）. b Reprezentativní snímky srdečních řezů obarvených calcareinem-T a WGA (vlevo) a velikosti buněk (vpravo) (n = 330 (D6 MTOS), 369 z 10 různých řezů (D6 MTNorm)) Buňky/组，两方ﳕ有尾学生 1 test normální. b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗПвиекенена) ка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разныхт свивепай ронние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Reprezentativní snímky srdečních řezů obarvených troponinem-T a AZP (vlevo) a kvantifikace velikosti buněk (vpravo) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) z 10 různých řezů z různých prasat) Buňky/skupina, dvoustranné kritérium Studentovo t;****p < 0,0001 ve srovnání s normálním napětím). c Reprezentativní snímky pro den 0 a den 6 Řezy srdce MTOS imunoznačené pro troponin-T a NFATC4 a kvantifikace translokace NFATC4 do jader CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) řezy/skupina od různých prasat, je proveden dvoustranný Studentův t-test *5 <0.); c Reprezentativní snímky pro den 0 a den 6 Řezy srdce MTOS imunoznačené pro troponin-T a NFATC4 a kvantifikace translokace NFATC4 do jader CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) řezy/skupina od různých prasat, je proveden dvoustranný Studentův t-test; *p <0. je proveden). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномечиноя иммуномечиноя и количественная оценка транслокации NFATC4 v ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срапурвах ней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Reprezentativní snímky pro řezy srdce v 0 a 6 dnech MTOS, imunoznačené pro troponin-T a NFATC4, a kvantifikace translokace NFATC4 v jádře kavernózních buněk (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) řezy/skupina z různých prasat) provedly dvoustranný Studentův t-test;*p < 0,05). p的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生)〼p 0.05. c Reprezentativní snímky imunoznačení calcanin-T a NFATC4 第0天和第6天MTOS srdeční řezy a NFATC4 z různých NFATC4 易位至CM buněčného jádra (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 的množství 医叻受司受市学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS na 0 a 6 день для FATC иммуномаркитировов количественная оценка транслокации NFATC4 v ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срепапх/ t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Reprezentativní snímky srdečních řezů MTOS v den 0 a 6 pro imunoznačení troponinem-T a NFATC4 a kvantifikaci translokace NFATC4 v jádře KM od různých prasat (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) řezy/skupina, dvoustranné t-kritérium Student's. *5;Chybové úsečky představují průměr ± standardní odchylku.
Translační kardiovaskulární výzkum vyžaduje buněčné modely, které přesně reprodukují srdeční prostředí.V této studii bylo vyvinuto a charakterizováno zařízení CTCM, které dokáže stimulovat ultratenké části srdce.Systém CTCM zahrnuje fyziologicky synchronizovanou elektromechanickou stimulaci a obohacování tekutin T3 a Dex.Když byly řezy prasečího srdce vystaveny těmto faktorům, jejich životaschopnost, strukturální integrita, metabolická aktivita a transkripční exprese zůstaly stejné jako v čerstvé srdeční tkáni po 12 dnech kultivace.Navíc nadměrné natahování srdeční tkáně může způsobit hypertrofii srdce způsobenou hyperextenzí.Celkově tyto výsledky podporují kritickou roli fyziologických kultivačních podmínek při udržování normálního srdečního fenotypu a poskytují platformu pro screening léků.
K vytvoření optimálního prostředí pro fungování a přežití kardiomyocytů přispívá mnoho faktorů.Nejzřetelnější z těchto faktorů souvisí s (1) mezibuněčnými interakcemi, (2) elektromechanickou stimulací, (3) humorálními faktory a (4) metabolickými substráty.Fyziologické interakce mezi buňkami vyžadují složité trojrozměrné sítě více typů buněk podporované extracelulární matricí.Takové komplexní buněčné interakce je obtížné rekonstruovat in vitro společnou kultivací jednotlivých buněčných typů, ale lze jich snadno dosáhnout použitím organotypické povahy srdečních řezů.
Mechanické protažení a elektrická stimulace kardiomyocytů jsou rozhodující pro udržení srdečního fenotypu33,34,35.Zatímco mechanická stimulace byla široce používána pro kondicionování a zrání hiPSC-CM, několik elegantních studií se nedávno pokusilo o mechanickou stimulaci srdečních řezů v kultuře pomocí jednoosého zatížení.Tyto studie ukazují, že 2D jednoosé mechanické zatížení má pozitivní vliv na fenotyp srdce během kultivace.V těchto studiích byly části srdce buď zatíženy izometrickými tahovými silami17, lineárním auxotonickým zatížením18, nebo byl srdeční cyklus obnoven pomocí zpětné vazby siloměru a tahových pohonů.Tyto metody však využívají jednoosé natažení tkáně bez optimalizace prostředí, což vede k supresi mnoha srdečních genů nebo nadměrné expresi genů spojených s abnormálními reakcemi na natahování.Zde popsaný CTCM poskytuje 3D elektromechanický stimul, který napodobuje přirozený srdeční cyklus, pokud jde o dobu cyklu a fyziologické protažení (25 % protažení, 40 % systola, 60 % diastola a 72 tepů za minutu).I když tato trojrozměrná mechanická stimulace sama o sobě nestačí k udržení integrity tkáně, k adekvátnímu udržení životaschopnosti, funkce a integrity tkáně je nutná kombinace humorální a mechanické stimulace pomocí T3/Dex.
Humorální faktory hrají důležitou roli v modulaci fenotypu dospělého srdce.To bylo zdůrazněno ve studiích HiPS-CM, ve kterých byly T3 a Dex přidány do kultivačního média pro urychlení zrání buněk.T3 může ovlivnit transport aminokyselin, cukrů a vápníku přes buněčné membrány36.Kromě toho T3 podporuje expresi MHC-α a downregulaci MHC-β, čímž podporuje tvorbu rychlých myofibril ve zralých kardiomyocytech ve srovnání s pomalými myofibrilami ve fetální CM.Nedostatek T3 u pacientů s hypotyreózou vede ke ztrátě myofibrilárních pruhů a snížené rychlosti rozvoje tonusu37.Dex působí na glukokortikoidní receptory a bylo prokázáno, že zvyšuje kontraktilitu myokardu u izolovaných perfundovaných srdcí;38 má se za to, že toto zlepšení souvisí s účinkem na vstup řízený ukládáním vápníku (SOCE) 39,40.Kromě toho se Dex váže na své receptory, což způsobuje širokou intracelulární odpověď, která potlačuje imunitní funkce a zánět30.
Naše výsledky ukazují, že fyzikálně mechanická stimulace (MS) zlepšila celkovou výkonnost kultivace ve srovnání s Ctrl, ale nedokázala udržet životaschopnost, strukturální integritu a srdeční expresi po dobu 12 dnů v kultuře.Ve srovnání s Ctrl přidání T3 a Dex ke kulturám CTCM (MT) zlepšilo životaschopnost a udrželo podobné transkripční profily, strukturální integritu a metabolickou aktivitu s čerstvou srdeční tkání po dobu 12 dnů.Navíc, řízením stupně natažení tkáně, byl vytvořen hyperextenzí indukovaný model srdeční hypertrofie pomocí STCM, ilustrující všestrannost systému STCM.Je třeba poznamenat, že ačkoli srdeční remodelace a fibróza obvykle zahrnují intaktní orgány, jejichž cirkulující buňky mohou poskytovat vhodné cytokiny, stejně jako fagocytózu a další remodelační faktory, části srdce mohou stále napodobovat fibrotický proces v reakci na stres a trauma.do myofibroblastů.To bylo dříve hodnoceno v tomto modelu srdečního řezu.Je třeba poznamenat, že parametry CTCM lze modulovat změnou tlaku/elektrické amplitudy a frekvence pro simulaci mnoha stavů, jako je tachykardie, bradykardie a mechanická oběhová podpora (mechanické nezatížené srdce).Díky tomu je systém středně výkonný pro testování léků.Schopnost CTCM modelovat srdeční hypertrofii vyvolanou nadměrnou námahou otevírá cestu pro testování tohoto systému pro personalizovanou terapii.Závěrem, tato studie ukazuje, že mechanické protažení a humorální stimulace jsou kritické pro udržení kultivace řezů srdeční tkáně.
Ačkoli zde prezentovaná data naznačují, že CTCM je velmi slibnou platformou pro modelování intaktního myokardu, má tato kultivační metoda určitá omezení.Hlavním omezením kultivace CTCM je to, že na řezy působí nepřetržité dynamické mechanické namáhání, což vylučuje schopnost aktivně monitorovat kontrakce srdečních řezů během každého cyklu.Navíc vzhledem k malé velikosti srdečních řezů (7 mm) je omezená možnost vyhodnotit systolickou funkci mimo kultivační systémy pomocí tradičních silových senzorů.V současném rukopisu toto omezení částečně překonáváme vyhodnocením optického napětí jako indikátoru kontraktilní funkce.Toto omezení si však vyžádá další práci a v budoucnu může být vyřešeno zavedením metod pro optické monitorování funkce srdečních řezů v kultuře, jako je optické mapování pomocí kalciových a napěťově citlivých barviv.Dalším omezením CTCM je, že pracovní model nemanipuluje s fyziologickým stresem (preload a afterload).V CTCM byl tlak indukován v opačných směrech, aby se reprodukovalo 25% fyziologické natažení v diastole (plné natažení) a systole (délka kontrakce během elektrické stimulace) ve velmi velkých tkáních.Toto omezení by mělo být v budoucích návrzích CTCM odstraněno adekvátním tlakem na srdeční tkáň z obou stran a aplikací přesných vztahů tlak-objem, které se vyskytují v srdečních komorách.
Remodelace vyvolaná přetažením uváděná v tomto rukopise je omezena na napodobování hypertrofických hypertenzních signálů.Tento model tedy může pomoci při studiu hypertrofické signalizace vyvolané roztažením bez potřeby humorálních nebo nervových faktorů (které v tomto systému neexistují).Ke zvýšení multiplicity CTCM jsou zapotřebí další studie, například společná kultivace s imunitními buňkami, cirkulující plazmatické humorální faktory a inervace při společné kultivaci s neuronálními buňkami zlepší možnosti modelování onemocnění pomocí CTCM.
V této studii bylo použito třináct prasat.Všechny procedury na zvířatech byly provedeny v souladu s institucionálními směrnicemi a byly schváleny Institucionálním výborem pro péči o zvířata a použití na univerzitě v Louisville.Aortální oblouk byl sevřen a srdce bylo perfundováno 1 1 sterilní kardioplegie (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCI, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHC03, 5 U/ml heparinu, pH do 7,4); srdce byla konzervována v ledově chladném kardioplegickém roztoku až do transportu do laboratoře na ledu, což je obvykle <10 min. srdce byla konzervována v ledově chladném kardioplegickém roztoku až do transportu do laboratoře na ledu, což je obvykle <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки, лабораториою в лабораториою занимает <10 мин. srdce byla uložena v ledově chladném kardioplegickém roztoku až do transportu do laboratoře na ledu, což obvykle trvá <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льбичном, ном Držte srdce na ledové kardioplegii až do transportu do laboratoře na ledu, obvykle <10 min.
Zařízení CTCM bylo vyvinuto v softwaru SolidWorks computer-aided design (CAD).Kultivační komory, děliče a vzduchové komory jsou vyrobeny z CNC čirého akrylového plastu.Záložní kroužek o průměru 7 mm je vyroben z polyethylenu s vysokou hustotou (HDPE) uprostřed a má drážku pro o-kroužek pro uložení silikonového o-kroužku použitého k utěsnění média pod ním.Kultivační komoru od separační desky odděluje tenká křemičitá membrána.Silikonová membrána je vyřezána laserem ze silikonové fólie o tloušťce 0,02″ a má tvrdost 35A.Spodní a horní silikonové těsnění jsou laserem vyřezány ze silikonové fólie o tloušťce 1/16″ a mají tvrdost 50A.Šrouby a křídlové matice z nerezové oceli 316L slouží k upevnění bloku a vytvoření vzduchotěsného těsnění.
Vyhrazená deska s plošnými spoji (PCB) je navržena pro integraci se systémem C-PACE-EM.Konektorové zdířky švýcarského stroje na DPS jsou spojeny s grafitovými elektrodami postříbřenými měděnými dráty a bronzovými šrouby 0-60 zašroubovanými do elektrod.Plošný spoj je umístěn v krytu 3D tiskárny.
Zařízení CTCM je řízeno programovatelným pneumatickým aktuátorem (PPD), který vytváří řízený oběhový tlak podobný srdečnímu cyklu.Jak se tlak uvnitř vzduchové komory zvyšuje, pružná silikonová membrána se rozšiřuje směrem nahoru a tlačí médium pod místo tkáně.Oblast tkáně se pak tímto vypuzením tekutiny natáhne, což napodobuje fyziologickou expanzi srdce během diastoly.Na vrcholu relaxace byla aplikována elektrická stimulace prostřednictvím grafitových elektrod, která snížila tlak ve vzduchové komoře a způsobila kontrakci tkáňových řezů.Uvnitř potrubí je hemostatický ventil s tlakovým senzorem pro detekci tlaku ve vzduchovém systému.Tlak snímaný tlakovým senzorem je aplikován na sběrač dat připojený k notebooku.To umožňuje nepřetržité sledování tlaku uvnitř plynové komory.Když bylo dosaženo maximálního tlaku v komoře (standardně 80 mmHg, 140 mmHg OS), bylo zařízení pro sběr dat nařízeno, aby odeslalo signál do systému C-PACE-EM, aby vygenerovalo dvoufázový napěťový signál po dobu 2 ms, nastavený na 4 V.
Byly získány řezy srdce a kultivační podmínky v 6 jamkách byly provedeny následujícím způsobem: Odebraná srdce byla přenesena z přenosové nádoby na podnos obsahující chladnou (4 °C) kardioplegii.Levá komora byla izolována sterilní čepelí a nařezána na kousky o velikosti 1-2 cm3.Tyto tkáňové bloky byly připevněny k tkáňovým podložkám tkáňovým adhezivem a umístěny do vibrační mikrotomové tkáňové lázně obsahující Tyrodův roztok a kontinuálně okysličované (3 g/l 2,3-butandionmonooximu (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g) . ), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM 102 mMEP. ), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M roztoku), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M roztoku), až do 1 1 ddH20).Vibrační mikrotom byl nastaven tak, aby řezal plátky o tloušťce 300 um při frekvenci 80 Hz, amplitudě horizontálních vibrací 2 mm a rychlosti posuvu 0,03 mm/s.Tkáňová lázeň byla obklopena ledem, aby se roztok udržel chladný, a teplota byla udržována na 4 °C.Přeneste tkáňové řezy z mikrotomové lázně do inkubační lázně obsahující kontinuálně okysličený roztok Tyrode na ledu, dokud nezískáte dostatek řezů pro jednu kultivační plotnu.Pro transwell kultury byly tkáňové řezy připojeny ke sterilním 6 mm širokým polyuretanovým nosičům a umístěny do 6 ml optimalizovaného média (199 médium, 1x doplněk ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalický a 2X antibiotikum-antimykotikum).Elektrická stimulace (10 V, frekvence 1,2 Hz) byla aplikována na tkáňové řezy přes C-Pace.Pro podmínky TD byly přidány čerstvé T3 a Dex při 100 nM a 1 uM při každé výměně média.Médium je nasyceno kyslíkem před výměnou 3krát denně.Tkáňové řezy byly kultivovány v inkubátoru při 37 °C a 5 % CO2.
Pro CTCM kultury byly tkáňové řezy umístěny na zakázkově vyrobené 3D tiskárně v Petriho misce obsahující modifikovaný Tyrodův roztok.Zařízení je navrženo tak, aby zvětšilo velikost řezu srdce o 25% plochy opěrného kroužku.Děje se tak proto, aby se úseky srdce po přenesení z Tyrodova roztoku do média a během diastoly neprotahovaly.S použitím histoakrylového lepidla byly řezy o tloušťce 300 um upevněny na nosném kroužku o průměru 7 mm.Po připevnění tkáňových řezů k podpůrnému kroužku odřízněte přebytečné tkáňové řezy a umístěte připojené tkáňové řezy zpět do lázně s roztokem Tyrode na ledu (4°C), dokud nebude připraven dostatek řezů pro jedno zařízení.Celková doba zpracování pro všechna zařízení by neměla přesáhnout 2 hodiny.Poté, co bylo 6 tkáňových řezů připojeno k jejich podpůrným kroužkům, bylo zařízení CTCM sestaveno.Kultivační komora CTCM je předem naplněna 21 ml předem okysličeného média.Přeneste tkáňové řezy do kultivační komory a opatrně odstraňte případné vzduchové bubliny pomocí pipety.Tkáňový řez se pak zavede do otvoru a jemně přitlačí na místo.Nakonec nasaďte kryt elektrody na zařízení a přeneste zařízení do inkubátoru.Poté připojte CTCM ke vzduchové trubici a systému C-PACE-EM.Pneumatický pohon se otevře a vzduchový ventil otevře CTCM.Systém C-PACE-EM byl nakonfigurován tak, aby dodával 4 V při 1,2 Hz během dvoufázové stimulace po dobu 2 ms.Médium bylo měněno dvakrát denně a elektrody byly měněny jednou denně, aby se zabránilo hromadění grafitu na elektrodách.V případě potřeby lze z kultivačních jamek vyjmout tkáňové řezy, aby se odstranily všechny vzduchové bubliny, které pod nimi mohly spadnout.Pro podmínky ošetření MT byl T3/Dex přidán čerstvý s každou výměnou média s 100 nM T3 a 1 uM Dex.Zařízení CTCM byla kultivována v inkubátoru při 37 °C a 5 % CO2.
Pro získání natažených trajektorií srdečních řezů byl vyvinut speciální kamerový systém.Byla použita zrcadlovka (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japonsko) s makroobjektivem Navitar Zoom 7000 18-108 mm (Navitar, San Francisco, CA).Vizualizace byla provedena při pokojové teplotě po nahrazení média čerstvým médiem.Kamera je umístěna v úhlu 51° a video se nahrává rychlostí 30 snímků za sekundu.Nejprve byl s Image-J použit software s otevřeným zdrojovým kódem (MUSCLEMOTION43) ke kvantifikaci pohybu řezů srdce.Maska byla vytvořena pomocí MATLABu (MathWorks, Natick, MA, USA) k definování oblastí zájmu pro tlukot srdce, aby se zabránilo šumu.Manuálně segmentované masky jsou aplikovány na všechny obrázky v sekvenci snímků a poté předány do zásuvného modulu MUSCLEMOTION.Pohyb svalů používá průměrnou intenzitu pixelů v každém snímku ke kvantifikaci jeho pohybu vzhledem k referenčnímu snímku.Data byla zaznamenána, filtrována a použita ke kvantifikaci doby cyklu a posouzení natažení tkáně během srdečního cyklu.Zaznamenané video bylo následně zpracováno pomocí digitálního filtru s nulovou fází prvního řádu.Pro kvantifikaci protažení tkáně (peak-to-peak) byla provedena analýza od vrcholu k vrcholu pro rozlišení mezi vrcholy a minimy v zaznamenaném signálu.Kromě toho se detrendování provádí pomocí polynomu 6. řádu, aby se eliminoval drift signálu.Programový kód byl vyvinut v MATLABu pro určení globálního pohybu tkáně, doby cyklu, relaxační doby a doby kontrakce (doplňkový programový kód 44).
Pro analýzu deformace pomocí stejných videí vytvořených pro posouzení mechanického roztažení jsme nejprve sledovali dva obrázky představující vrcholy pohybu (nejvyšší (horní) a nejnižší (dolní) body pohybu) podle softwaru MUSCLEMOTION.Poté jsme segmentovali oblasti tkáně a aplikovali jsme na segmentovanou tkáň formu stínovacího algoritmu (doplňkový obrázek 2a).Segmentovaná tkáň byla poté rozdělena do deseti dílčích povrchů a napětí na každém povrchu bylo vypočteno pomocí následující rovnice: Deformace = (Sup-Sdown)/Sdown, kde Sup a Sdown jsou vzdálenosti tvaru od horního a spodního stínu tkaniny (doplňkový obr. .2b).
Srdeční řezy byly fixovány ve 4% paraformaldehydu po dobu 48 hodin.Fixované tkáně byly dehydratovány v 10% a 20% sacharóze po dobu 1 hodiny, poté ve 30% sacharóze přes noc.Řezy byly poté vloženy do směsi pro optimální teplotu řezání (sloučenina OCT) a postupně zmraženy v lázni isopentan/suchý led.Zalévací bloky OCT skladujte při -80 °C až do oddělení.Sklíčka byla připravena jako řezy o tloušťce 8 μm.
Chcete-li odstranit OCT z řezů srdce, zahřívejte sklíčka na topném bloku na 95 °C po dobu 5 minut.Přidejte 1 ml PBS na každé sklíčko a inkubujte po dobu 30 minut při teplotě místnosti, poté proveďte permeaci řezů nastavením 0,1% Triton-X v PBS po dobu 15 minut při teplotě místnosti.Aby se zabránilo navázání nespecifických protilátek na vzorek, přidejte na sklíčka 1 ml 3% roztoku BSA a inkubujte 1 hodinu při pokojové teplotě.BSA byl poté odstraněn a sklíčka byla promyta PBS.Každý vzorek označte tužkou.Primární protilátky (zředěné 1:200 v 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) a troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) byly přidány během 90 minut, poté 1 sekundární protilátky: 81% myší (200% zředěný BSA rmo Scientific; #A16079), proti králíkovi Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) po dobu dalších 90 minut Promyto 3krát PBS Pro odlišení cílového barvení od pozadí jsme jako kontrolu použili pouze sekundární protilátku. Nakonec bylo přidáno nukleární barvivo DAPI a sklíčka byla umístěna do navektorového mikroskopu a leštěného mikroskopu (Vectorashield) a Keytashield. se zvětšením 40x.
Pro barvení WGA byl použit WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) v 5 ug/ml v PBS a aplikován na fixované řezy po dobu 30 minut při pokojové teplotě.Sklíčka byla poté promyta PBS a na každé sklíčko byla přidána sudánská čerň a inkubována po dobu 30 minut.Sklíčka pak byla promyta PBS a bylo přidáno zalévací médium vectashield.Sklíčka byla vizualizována na mikroskopu Keyence při 40x zvětšení.
OCT byla ze vzorků odstraněna, jak je popsáno výše.Po vyjmutí OCT ponořte sklíčka přes noc do Bouinova roztoku.Sklíčka byla poté oplachována destilovanou vodou po dobu 1 hodiny a poté umístěna do roztoku Bibrich aloe acid fuchsin na 10 minut.Poté byla sklíčka promyta destilovanou vodou a umístěna do roztoku 5% fosfomolybden/5% kyselina fosfowolframová na 10 minut.Bez oplachování přeneste sklíčka přímo do roztoku anilinové modři na 15 minut.Poté byla sklíčka promyta destilovanou vodou a umístěna do 1% roztoku kyseliny octové na 2 minuty.Sklíčka byla vysušena v 200 N ethanolu a přenesena do xylenu.Obarvená sklíčka byla vizualizována pomocí mikroskopu Keyence s objektivem 10x.Procento plochy fibrózy bylo kvantifikováno pomocí softwaru Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), katalogové číslo V13154, podle protokolu výrobce s některými úpravami.Konkrétně byl použit chirurgický děrovač o průměru 6 mm k zajištění jednotné velikosti tkáně během MTT analýzy.Tkáně byly jednotlivě umístěny do jamek 12-jamkové destičky obsahující MTT substrát podle protokolu výrobce.Řezy se inkubují při 37 °C po dobu 3 hodin a živá tkáň metabolizuje MTT substrát za vzniku purpurové formazanové sloučeniny.Nahraďte roztok MTT 1 ml DMSO a inkubujte při 37 °C po dobu 15 minut, aby se extrahoval purpurový formazan z řezů srdce.Vzorky byly zředěny 1:10 v DMSO v 96-jamkových destičkách s čirým dnem a intenzita purpurové barvy byla měřena při 570 nm pomocí čtečky destiček Cytation (BioTek).Hodnoty byly normalizovány na hmotnost každého řezu srdce.
Médium na plátky srdce bylo nahrazeno médiem obsahujícím 1 μCi/ml [5-3H]-glukózy (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) pro test využití glukózy, jak bylo popsáno dříve.Po 4 hodinách inkubace přidejte 100 µl média do otevřené mikrocentrifugační zkumavky obsahující 100 µl 0,2 N HCl.Poté byla zkumavka umístěna do scintilační zkumavky obsahující 500 ul dH2O k odpařování [3H]2O po dobu 72 hodin při 37 °C.Poté vyjměte mikrocentrifugační zkumavku ze scintilační zkumavky a přidejte 10 ml scintilační kapaliny.Scintilační počty byly prováděny za použití kapalinového scintilačního analyzátoru Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA).Využití glukózy bylo poté vypočteno s přihlédnutím k aktivitě specifické pro [5-3H]-glukózu, neúplné rovnováze a pozadí, zředění [5-3H]-na neznačenou glukózu a účinnosti scintilačního počítače.Data jsou normalizována na hmotnost řezů srdce.
Po homogenizaci tkáně v Trizolu byla RNA izolována ze srdečních řezů pomocí Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 podle protokolu výrobce.Příprava knihovny RNAsec, sekvenování a analýza dat byly provedeny následovně:
1 μg RNA na vzorek byl použit jako výchozí materiál pro přípravu RNA knihovny.Sekvenační knihovny byly vytvořeny pomocí NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit for Illumina (NEB, USA) podle doporučení výrobce a indexové kódy byly přidány k sekvencím atributů pro každý vzorek.Stručně, mRNA byla purifikována z celkové RNA pomocí magnetických kuliček připojených s poly-T oligonukleotidy.Fragmentace se provádí za použití dvojmocných kationtů při vysoké teplotě v NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).První vlákno cDNA bylo syntetizováno pomocí náhodných hexamerových primerů a M-MuLV reverzní transkriptázy (RNáza H-).Druhý řetězec cDNA je pak syntetizován pomocí DNA polymerázy I a RNázy H. Zbývající přesahy jsou převedeny na tupé konce exonukleázovou/polymerázovou aktivitou.Po adenylaci 3′ konce fragmentu DNA se k němu připojí adaptér NEBNext se strukturou vlásenkové smyčky, aby se připravil na hybridizaci.Pro selekci cDNA fragmentů výhodné délky 150-200 bp.fragmenty knihovny byly purifikovány pomocí systému AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA).Poté byly před PCR použity 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) s velikostí vybranou cDNA ligovanou s adaptérem po dobu 15 minut při 37 °C a poté po dobu 5 minut při 95 °C.PCR byla poté provedena pomocí Phusion High-Fidelity DNA polymerázy, univerzálních PCR primerů a indexových (X) primerů.Nakonec byly produkty PCR purifikovány (systém AMPure XP) a kvalita knihovny byla hodnocena na systému Agilent Bioanalyzer 2100.Knihovna cDNA byla poté sekvenována pomocí sekvenátoru Novaseq.Nezpracované obrazové soubory z Illumina byly převedeny na nezpracované čtení pomocí CASAVA Base Calling.Nezpracovaná data jsou uložena v souborech formátu FASTQ(fq), které obsahují sekvence čtení a odpovídající základní kvality.Vyberte HISAT2, aby odpovídaly filtrované sekvenační čtení referenčnímu genomu Sscrofa11.1.Obecně platí, že HISAT2 podporuje genomy jakékoli velikosti, včetně genomů větších než 4 miliardy bází, a pro většinu parametrů jsou nastaveny výchozí hodnoty.Čtení sestřihu z dat RNA Seq lze efektivně zarovnat pomocí HISAT2, nejrychlejšího systému, který je v současné době k dispozici, se stejnou nebo lepší přesností než jakákoli jiná metoda.
Množství transkriptů přímo odráží úroveň genové exprese.Úrovně genové exprese se hodnotí podle množství transkriptů (počet sekvencí) spojených s genomem nebo exony.Počet čtení je úměrný hladinám genové exprese, délce genu a hloubce sekvenování.Byly vypočteny FPKM (fragmenty na tisíc párů bází transkriptu sekvenované na milion párů bází) a pomocí balíčku DESeq2 byly určeny P-hodnoty diferenciální exprese.Poté jsme vypočítali míru falešného objevu (FDR) pro každou hodnotu P pomocí Benjamini-Hochbergovy metody9 založené na vestavěné R-funkci „p.adjust“.
RNA izolovaná ze srdečních řezů byla převedena na cDNA v koncentraci 200 ng/μl pomocí SuperScript IV Vilo Master mix od Thermo (Thermo, kat. č. 11756050).Kvantitativní RT-PCR byla provedena s použitím 384jamkové transparentní reakční destičky Applied Biosystems Endura Plate Microamp (Thermo, kat. č. 4483319) a optického adheziva microamp (Thermo, kat. č. 4311971).Reakční směs sestávala z 5 ul Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, kat # 4444557), 0,5 ul Taqman Primer a 3,5 ul H2O smíchaných na jamku.Proběhly standardní cykly qPCR a hodnoty CT byly měřeny pomocí přístroje Applied Biosystems Quantstudio 5 PCR v reálném čase (384-jamkový modul; produkt # A28135).Primery Taqman byly zakoupeny od Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss01_m9589), AC01m9508, AC01m9508 4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588 normalizováno na hodnoty GDH ​​všech genomů GDH)
Uvolňování NT-ProBNP z média bylo hodnoceno pomocí soupravy NT-ProBNP (prase) (kat. č. MBS2086979, MyBioSource) podle protokolu výrobce.Stručně, 250 ul každého vzorku a standardu bylo přidáno duplikátně do každé jamky.Ihned po přidání vzorku přidejte 50 µl testovacího činidla A do každé jamky.Desku jemně protřepejte a utěsněte tmelem.Poté byly tablety inkubovány při 37 °C po dobu 1 hodiny.Poté roztok odsajte a promyjte jamky 4krát 350 µl 1X promývacího roztoku, přičemž promývací roztok inkubujte pokaždé 1-2 minuty.Poté přidejte 100 µl testovacího činidla B na jamku a utěsněte tmelem na destičky.Tableta byla jemně protřepána a inkubována při 37 °C po dobu 30 minut.Nasajte roztok a promyjte jamky 5krát 350 µl 1X promývacího roztoku.Přidejte 90 µl roztoku substrátu do každé jamky a destičku uzavřete.Inkubujte destičku při 37 °C po dobu 10-20 minut.Do každé jamky přidejte 50 µl zastavovacího roztoku.Destička byla okamžitě změřena pomocí čtečky destiček Cytation (BioTek) nastavené na 450 nm.
Byly provedeny analýzy výkonu, aby se vybraly velikosti skupin, které poskytnou >80% výkon pro detekci 10% absolutní změny v parametru s 5% chybovostí typu I. Byly provedeny analýzy výkonu, aby se vybraly velikosti skupin, které poskytnou >80% výkon pro detekci 10% absolutní změny v parametru s 5% chybovostí typu I. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечатянспечат > 80% nanometru ия 10 % абсолютного изменения параметра с 5 % частотой ошибок типа I. Analýza výkonu byla provedena pro výběr velikostí skupin, které by poskytly >80% výkon pro detekci 10% absolutní změny parametru s 5% chybovostí typu I.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和的 绅I型和皎玄 寂备鄎玄进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和的 绅I型和皎玄 寂备鄎玄 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил былонор% 80% ужения 10% абсолютного изменения параметров a 5% частоты ошибок типа I. Byla provedena analýza výkonu za účelem výběru velikosti skupiny, která by poskytla > 80 % výkonu pro detekci 10 % absolutní změny parametrů a 5 % chybovosti typu I.Před experimentem byly náhodně vybrány tkáňové řezy.Všechny analýzy byly slepé a vzorky byly dekódovány až poté, co byla analyzována všechna data.K provedení všech statistických analýz byl použit software GraphPad Prism (San Diego, CA). Pro všechny statistiky byly p-hodnoty považovány za významné při hodnotách <0,05. Pro všechny statistiky byly p-hodnoty považovány za významné při hodnotách <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Pro všechny statistiky byly p-hodnoty považovány za významné při hodnotách <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Pro všechny statistiky byly p-hodnoty považovány za významné při hodnotách <0,05.Dvoustranný Studentův t-test byl proveden na datech pouze se 2 srovnáními.K určení významnosti mezi více skupinami byla použita jednocestná nebo dvoucestná ANOVA.Při provádění post hoc testů byla použita Tukeyova korekce, aby se zohlednilo více srovnání.Data RNAsec mají zvláštní statistické úvahy při výpočtu FDR a p.adjust, jak je popsáno v části Metody.
Další informace o designu studie najdete v abstraktu Nature Research Report propojeném s tímto článkem.