Nature.com-এ আসার জন্য আপনাকে ধন্যবাদ। আপনি যে ব্রাউজার সংস্করণটি ব্যবহার করছেন তাতে CSS-এর সমর্থন সীমিত। সর্বোত্তম অভিজ্ঞতার জন্য, আমরা আপনাকে একটি হালনাগাদ ব্রাউজার ব্যবহার করার পরামর্শ দিচ্ছি (অথবা ইন্টারনেট এক্সপ্লোরারে কম্প্যাটিবিলিটি মোড নিষ্ক্রিয় করুন)। আপাতত, নিরবচ্ছিন্ন সমর্থন নিশ্চিত করার জন্য, আমরা স্টাইল এবং জাভাস্ক্রিপ্ট ছাড়াই সাইটটি রেন্ডার করব।
ঔষধ পরীক্ষার জন্য হৃৎপিণ্ডের শারীরবৃত্তীয় পরিবেশকে নির্ভুলভাবে পুনরুৎপাদন করতে পারে এমন একটি নির্ভরযোগ্য ইন ভিট্রো সিস্টেমের প্রয়োজন রয়েছে। মানব হৃৎপিণ্ডের টিস্যু কালচার সিস্টেমের সীমিত প্রাপ্যতার কারণে হৃৎপিণ্ডের উপর ঔষধের প্রভাবের ব্যাখ্যায় ভুলত্রুটি দেখা দিয়েছে। এখানে, আমরা একটি কার্ডিয়াক টিস্যু কালচার মডেল (CTCM) তৈরি করেছি যা হৃৎপিণ্ডের স্লাইসগুলোকে ইলেক্ট্রোমেকানিক্যালি উদ্দীপিত করে এবং কার্ডিয়াক সাইকেলের সিস্টোলিক ও ডায়াস্টোলিক পর্যায়ে শারীরবৃত্তীয় প্রসারণের মধ্য দিয়ে যায়। ১২ দিন কালচারের পর, এই পদ্ধতিটি হৃৎপিণ্ডের অংশগুলোর কার্যক্ষমতা আংশিকভাবে উন্নত করেছিল, কিন্তু তাদের কাঠামোগত অখণ্ডতা সম্পূর্ণরূপে রক্ষা করতে পারেনি। তাই, ক্ষুদ্র অণু স্ক্রিনিংয়ের পর আমরা দেখতে পাই যে, আমাদের মিডিয়ামে ১০০ nM ট্রাইআয়োডোথাইরোনিন (T3) এবং ১ μM ডেক্সামেথাসোন (Dex) যোগ করলে তা অংশগুলোর মাইক্রোস্ট্রাকচার ১২ দিন পর্যন্ত বজায় রাখে। T3/Dex চিকিৎসার সাথে মিলিতভাবে, CTCM সিস্টেমটি ট্রান্সক্রিপশনাল প্রোফাইল, কার্যক্ষমতা, বিপাকীয় কার্যকলাপ এবং কাঠামোগত অখণ্ডতাকে ১২ দিন পর্যন্ত তাজা হৃৎপিণ্ডের টিস্যুর সমপর্যায়ে বজায় রেখেছিল। এছাড়াও, কালচারে কার্ডিয়াক টিস্যুর অতিরিক্ত প্রসারণ হাইপারট্রফিক কার্ডিয়াক সিগন্যালিং প্ররোচিত করে, যা কার্ডিয়াক স্ট্রেচ দ্বারা সৃষ্ট হাইপারট্রফিক পরিস্থিতি অনুকরণ করার ক্ষেত্রে CTCM-এর সক্ষমতার প্রমাণ দেয়। উপসংহারে বলা যায়, CTCM দীর্ঘ সময় ধরে কালচারে হৃৎপিণ্ডের শারীরবৃত্ত ও রোগ-শারীরবৃত্তের মডেল তৈরি করতে পারে, যা নির্ভরযোগ্য ড্রাগ স্ক্রিনিং-কে সম্ভব করে তোলে।
ক্লিনিক্যাল গবেষণার আগে, এমন নির্ভরযোগ্য ইন ভিট্রো সিস্টেমের প্রয়োজন যা মানব হৃদপিণ্ডের শারীরবৃত্তীয় পরিবেশকে সঠিকভাবে পুনরুৎপাদন করতে পারে। এই ধরনের সিস্টেমগুলিতে পরিবর্তিত যান্ত্রিক প্রসারণ, হৃদস্পন্দন এবং ইলেক্ট্রোফিজিওলজিক্যাল বৈশিষ্ট্যগুলোর অনুকরণ করা উচিত। কার্ডিয়াক ফিজিওলজি স্ক্রিনিং প্ল্যাটফর্ম হিসেবে সাধারণত অ্যানিমেল মডেল ব্যবহার করা হয়, তবে মানব হৃদপিণ্ডে ওষুধের প্রভাব প্রতিফলিত করার ক্ষেত্রে এর নির্ভরযোগ্যতা সীমিত¹,²। পরিশেষে, আদর্শ কার্ডিয়াক টিস্যু কালচার এক্সপেরিমেন্টাল মডেল (CTCM) হলো এমন একটি মডেল যা বিভিন্ন থেরাপিউটিক এবং ফার্মাকোলজিক্যাল হস্তক্ষেপের জন্য অত্যন্ত সংবেদনশীল ও সুনির্দিষ্ট এবং যা মানব হৃদপিণ্ডের ফিজিওলজি ও প্যাথোফিজিওলজিকে সঠিকভাবে পুনরুৎপাদন করে³। এই ধরনের সিস্টেমের অনুপস্থিতি হার্ট ফেইলিওরের নতুন চিকিৎসা আবিষ্কারকে সীমিত করে⁴,⁵ এবং ওষুধের কার্ডিওটক্সিসিটিকে বাজার থেকে বেরিয়ে যাওয়ার একটি প্রধান কারণ হিসেবে দাঁড় করিয়েছে⁶।
গত দশকে, আটটি নন-কার্ডিওভাসকুলার ওষুধ ক্লিনিকাল ব্যবহার থেকে প্রত্যাহার করা হয়েছে কারণ সেগুলি QT ব্যবধান দীর্ঘায়িত করে, যা ভেন্ট্রিকুলার অ্যারিথমিয়া এবং আকস্মিক মৃত্যুর কারণ হয়। সুতরাং, কার্ডিওভাসকুলার কার্যকারিতা এবং বিষাক্ততা মূল্যায়নের জন্য নির্ভরযোগ্য প্রি-ক্লিনিকাল স্ক্রিনিং কৌশলের প্রয়োজনীয়তা বাড়ছে। ড্রাগ স্ক্রিনিং এবং বিষাক্ততা পরীক্ষায় মানব-প্ররোচিত প্লুরিপোটেন্ট স্টেম সেল-উদ্ভূত কার্ডিওমায়োসাইট (hiPS-CM) এর সাম্প্রতিক ব্যবহার এই সমস্যার একটি আংশিক সমাধান প্রদান করে। তবে, hiPS-CM-এর অপরিণত প্রকৃতি এবং কার্ডিয়াক টিস্যুর বহু-কোষীয় জটিলতার অভাব এই পদ্ধতির প্রধান সীমাবদ্ধতা। সাম্প্রতিক গবেষণায় দেখা গেছে যে স্বতঃস্ফূর্ত সংকোচনের সূত্রপাতের অল্প সময়ের মধ্যে প্রাথমিক hiPS-CM ব্যবহার করে কার্ডিয়াক টিস্যু হাইড্রোজেল তৈরি করে এবং সময়ের সাথে সাথে ধীরে ধীরে বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা বাড়িয়ে এই সীমাবদ্ধতা আংশিকভাবে কাটিয়ে ওঠা যায়। তবে, এই hiPS-CM মাইক্রোটিস্যুগুলিতে প্রাপ্তবয়স্ক মায়োকার্ডিয়ামের পরিণত ইলেক্ট্রোফিজিওলজিক্যাল এবং সংকোচনশীল বৈশিষ্ট্যের অভাব রয়েছে। এছাড়াও, মানব হৃৎপিণ্ডের টিস্যুর গঠন আরও জটিল, যা এন্ডোথেলিয়াল কোষ, নিউরন এবং স্ট্রোমাল ফাইব্রোব্লাস্ট সহ বিভিন্ন ধরণের কোষের একটি ভিন্নধর্মী মিশ্রণ নিয়ে গঠিত, যা নির্দিষ্ট সেট এক্সট্রা সেলুলার ম্যাট্রিক্স প্রোটিন দ্বারা আন্তঃসংযুক্ত। প্রাপ্তবয়স্ক স্তন্যপায়ী প্রাণীর হৃৎপিণ্ডে নন-কার্ডিওমায়োসাইট পপুলেশনের এই ভিন্নধর্মিতা¹¹,¹²,¹³ একক কোষের প্রকার ব্যবহার করে হৃৎপিণ্ডের টিস্যুর মডেলিং করার ক্ষেত্রে একটি প্রধান বাধা। এই প্রধান সীমাবদ্ধতাগুলি শারীরবৃত্তীয় এবং রোগাক্রান্ত পরিস্থিতিতে অক্ষত মায়োকার্ডিয়াল টিস্যু কালচার করার পদ্ধতি বিকাশের গুরুত্ব তুলে ধরে।
মানব হৃৎপিণ্ডের কালচার করা পাতলা (৩০০ µm) অংশগুলো অক্ষত মানব মায়োকার্ডিয়ামের একটি সম্ভাবনাময় মডেল হিসেবে প্রমাণিত হয়েছে। এই পদ্ধতিটি মানব হৃৎপিণ্ডের টিস্যুর অনুরূপ একটি সম্পূর্ণ ত্রিমাত্রিক (3D) বহু-কোষীয় সিস্টেম ব্যবহারের সুযোগ করে দেয়। তবে, ২০১৯ সাল পর্যন্ত, কালচার করা হৃৎপিণ্ডের অংশগুলোর ব্যবহার স্বল্প (২৪ ঘণ্টা) কালচার সারভাইভালের কারণে সীমিত ছিল। এর কারণগুলোর মধ্যে রয়েছে ভৌত-যান্ত্রিক প্রসারণের অভাব, বায়ু-তরল ইন্টারফেস এবং এমন সাধারণ মিডিয়ার ব্যবহার যা কার্ডিয়াক টিস্যুর চাহিদা পূরণ করে না। ২০১৯ সালে, বেশ কয়েকটি গবেষণা দল দেখিয়েছে যে কার্ডিয়াক টিস্যু কালচার সিস্টেমে যান্ত্রিক উপাদান অন্তর্ভুক্ত করলে কালচারের জীবনকাল বাড়ানো যায়, কার্ডিয়াক এক্সপ্রেশন উন্নত করা যায় এবং কার্ডিয়াক প্যাথলজির অনুকরণ করা যায়। দুটি চমৎকার গবেষণা 17 এবং 18 দেখায় যে কালচারের সময় একাক্ষীয় যান্ত্রিক লোডিং কার্ডিয়াক ফেনোটাইপের উপর একটি ইতিবাচক প্রভাব ফেলে। তবে, এই গবেষণাগুলোতে কার্ডিয়াক সাইকেলের গতিশীল ত্রিমাত্রিক ভৌত-যান্ত্রিক লোডিং ব্যবহার করা হয়নি, কারণ হৃৎপিণ্ডের অংশগুলোকে হয় আইসোমেট্রিক টেনসাইল ফোর্স 17 অথবা লিনিয়ার অক্সোটোনিক লোডিং 18 দিয়ে লোড করা হয়েছিল। টিস্যু প্রসারিত করার এই পদ্ধতিগুলির ফলে অনেক কার্ডিয়াক জিনের দমন অথবা অস্বাভাবিক প্রসারণ প্রতিক্রিয়ার সাথে সম্পর্কিত জিনগুলির অতি-প্রকাশ ঘটে। উল্লেখযোগ্যভাবে, পিটুলিস এবং তার সহকর্মীরা¹⁹ ফোর্স ট্রান্সডিউসার ফিডব্যাক এবং টেনশন ড্রাইভ ব্যবহার করে কার্ডিয়াক সাইকেল পুনর্গঠনের জন্য একটি ডায়নামিক হার্ট স্লাইস কালচার বাথ তৈরি করেছেন। যদিও এই সিস্টেমটি আরও নির্ভুল ইন ভিট্রো কার্ডিয়াক সাইকেল মডেলিংয়ের সুযোগ দেয়, তবে এই পদ্ধতির জটিলতা এবং কম উৎপাদন ক্ষমতা এর প্রয়োগকে সীমিত করে। আমাদের গবেষণাগার সম্প্রতি বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা এবং একটি অপ্টিমাইজড মিডিয়াম ব্যবহার করে একটি সরলীকৃত কালচার সিস্টেম তৈরি করেছে যা শূকর এবং মানুষের হৃৎপিণ্ডের টিস্যুর অংশগুলির সজীবতা ৬ দিন পর্যন্ত বজায় রাখতে পারে²⁰,²¹।
বর্তমান পাণ্ডুলিপিতে, আমরা শূকরের হৃৎপিণ্ডের অংশ ব্যবহার করে একটি কার্ডিয়াক টিস্যু কালচার মডেল (CTCM) বর্ণনা করেছি, যা হৃৎচক্র চলাকালীন ত্রিমাত্রিক হৃৎশারীরবৃত্ত এবং রোগ-শারীরবৃত্তীয় প্রসারণকে পুনরুৎপাদন করার জন্য হিউমোরাল সংকেত অন্তর্ভুক্ত করে। এই CTCM প্রাক-ক্লিনিক্যাল ঔষধ পরীক্ষার জন্য স্তন্যপায়ী প্রাণীর হৃৎপিণ্ডের শারীরবৃত্ত ও রোগ-শারীরবৃত্তকে অনুকরণকারী একটি সাশ্রয়ী ও মধ্যম-উৎপাদনশীল কার্ডিয়াক সিস্টেম প্রদানের মাধ্যমে প্রাক-ক্লিনিক্যাল ঔষধ পূর্বাভাসের নির্ভুলতাকে এমন এক স্তরে উন্নীত করতে পারে যা আগে কখনও অর্জিত হয়নি।
ইন ভিট্রোতে কার্ডিওমায়োসাইটের কার্যকারিতা বজায় রাখতে হিমোডাইনামিক যান্ত্রিক সংকেত একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে 22,23,24। বর্তমান গবেষণাপত্রে, আমরা একটি CTCM (চিত্র 1a) তৈরি করেছি যা শারীরবৃত্তীয় ফ্রিকোয়েন্সিতে (1.2 Hz, প্রতি মিনিটে 72 বার স্পন্দন) বৈদ্যুতিক এবং যান্ত্রিক উভয় উদ্দীপনা প্ররোচিত করে প্রাপ্তবয়স্ক হৃৎপিণ্ডের পরিবেশ অনুকরণ করতে পারে। ডায়াস্টোলের সময় টিস্যুর অতিরিক্ত প্রসারণ এড়াতে, টিস্যুর আকার 25% বাড়ানোর জন্য একটি 3D প্রিন্টিং ডিভাইস ব্যবহার করা হয়েছিল (চিত্র 1b)। কার্ডিয়াক চক্র সম্পূর্ণরূপে পুনরুৎপাদন করার জন্য, একটি ডেটা অধিগ্রহণ সিস্টেম ব্যবহার করে C-PACE সিস্টেম দ্বারা প্ররোচিত বৈদ্যুতিক পেসিং সিস্টোলের 100 ms আগে শুরু করার জন্য সময় নির্ধারণ করা হয়েছিল। টিস্যু কালচার সিস্টেমটি একটি প্রোগ্রামেবল নিউম্যাটিক অ্যাকচুয়েটর (LB Engineering, জার্মানি) ব্যবহার করে যা উপরের প্রকোষ্ঠে হৃৎপিণ্ডের স্লাইসগুলির প্রসারণ ঘটাতে একটি নমনীয় সিলিকন ঝিল্লিকে চক্রাকারে প্রসারিত করে। সিস্টেমটি একটি প্রেশার ট্রান্সডিউসারের মাধ্যমে বাহ্যিক এয়ার লাইনের সাথে সংযুক্ত ছিল, যার ফলে চাপ (± ১ mmHg) এবং সময় (± ১ ms) নির্ভুলভাবে সমন্বয় করা সম্ভব হয়েছিল (চিত্র ১গ)।
ক) ডিভাইসের কালচার চেম্বারের ভিতরে, নীল রঙে দেখানো ৭ মিমি সাপোর্ট রিং-এর সাথে টিস্যু সেকশনটি সংযুক্ত করুন। কালচার চেম্বারটি একটি পাতলা নমনীয় সিলিকন মেমব্রেন দ্বারা এয়ার চেম্বার থেকে পৃথক করা থাকে। লিকেজ প্রতিরোধ করার জন্য প্রতিটি চেম্বারের মধ্যে একটি গ্যাসকেট রাখুন। ডিভাইসের ঢাকনায় গ্রাফাইট ইলেকট্রোড থাকে যা বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা প্রদান করে। খ) বড় টিস্যু ডিভাইস, গাইড রিং এবং সাপোর্ট রিং-এর পরিকল্পিত চিত্র। টিস্যু সেকশনগুলো (বাদামী) বড় আকারের ডিভাইসের উপর রাখা হয় এবং গাইড রিংটি ডিভাইসের বাইরের প্রান্তের খাঁজে স্থাপন করা হয়। গাইড ব্যবহার করে, টিস্যু অ্যাক্রাইলিক আঠা দিয়ে প্রলেপ দেওয়া সাপোর্ট রিংটি কার্ডিয়াক টিস্যুর সেকশনের উপর সাবধানে স্থাপন করুন। গ) একটি গ্রাফ যা একটি প্রোগ্রামেবল নিউম্যাটিক অ্যাকচুয়েটর (PPD) দ্বারা নিয়ন্ত্রিত এয়ার চেম্বারের চাপের ফাংশন হিসাবে বৈদ্যুতিক উদ্দীপনার সময় দেখাচ্ছে। চাপ সেন্সর ব্যবহার করে বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা সিঙ্ক্রোনাইজ করার জন্য একটি ডেটা অ্যাকুইজিশন ডিভাইস ব্যবহার করা হয়েছিল। যখন কালচার চেম্বারের চাপ নির্ধারিত থ্রেশহোল্ডে পৌঁছায়, তখন বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা চালু করার জন্য C-PACE-EM-এ একটি পালস সিগন্যাল পাঠানো হয়। ঘ) একটি ইনকিউবেটর শেলফে রাখা চারটি CTCM-এর ছবি। একটি নিউম্যাটিক সার্কিটের মাধ্যমে চারটি ডিভাইস একটি পিপিডি-র সাথে সংযুক্ত থাকে এবং নিউম্যাটিক সার্কিটের চাপ নিরীক্ষণের জন্য হিমোস্ট্যাটিক ভালভে প্রেশার সেন্সর স্থাপন করা হয়। প্রতিটি ডিভাইসে ছয়টি টিস্যু সেকশন থাকে।
একটিমাত্র নিউম্যাটিক অ্যাকচুয়েটর ব্যবহার করে, আমরা ৪টি সিটিসিএম ডিভাইস নিয়ন্ত্রণ করতে সক্ষম হয়েছিলাম, যার প্রত্যেকটিতে ৬টি টিস্যু সেকশন রাখা যেত (চিত্র ১ডি)। সিটিসিএম-এ, এয়ার চেম্বারের বায়ুচাপ ফ্লুইড চেম্বারের সিনক্রোনাস চাপে রূপান্তরিত হয় এবং হার্ট স্লাইসের শারীরবৃত্তীয় প্রসারণ ঘটায় (চিত্র ২এ এবং সাপ্লিমেন্টারি মুভি ১)। ৮০ মিমি এইচজি চাপে টিস্যুর প্রসারণ মূল্যায়নে দেখা গেছে যে টিস্যু সেকশনগুলো ২৫% প্রসারিত হয়েছে (চিত্র ২বি)। এই শতাংশ প্রসারণ স্বাভাবিক কার্ডিয়াক সেকশনের সংকোচনশীলতার জন্য ২.২–২.৩ µm-এর একটি শারীরবৃত্তীয় সারকোমিয়ার দৈর্ঘ্যের সাথে সঙ্গতিপূর্ণ বলে দেখানো হয়েছে¹⁷,¹⁹,²⁵। কাস্টম ক্যামেরা সেটিংস ব্যবহার করে টিস্যুর নড়াচড়া মূল্যায়ন করা হয়েছিল (সাপ্লিমেন্টারি চিত্র ১)। টিস্যুর নড়াচড়ার বিস্তার এবং বেগ (চিত্র ২সি, ডি) কার্ডিয়াক চক্রের সময়কার প্রসারণ এবং সিস্টোল ও ডায়াস্টোলের সময়কালের সাথে সঙ্গতিপূর্ণ ছিল (চিত্র ২বি)। সংকোচন এবং প্রসারণের সময় কার্ডিয়াক টিস্যুর প্রসারণ এবং বেগ কালচারে ১২ দিন ধরে স্থির ছিল (চিত্র ২এফ)। কালচার চলাকালীন সংকোচনশীলতার উপর বৈদ্যুতিক উদ্দীপনার প্রভাব মূল্যায়ন করার জন্য, আমরা একটি শেডিং অ্যালগরিদম ব্যবহার করে সক্রিয় বিকৃতি নির্ণয়ের একটি পদ্ধতি তৈরি করেছি (পরিপূরক চিত্র ২ক,খ) এবং বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা সহ ও ছাড়া বিকৃতির মধ্যে পার্থক্য করতে সক্ষম হয়েছি। হৃৎপিণ্ডের একই অংশ (চিত্র ২চ)। কর্তনের সচল অঞ্চলে (R6-9), বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা চলাকালীন ভোল্টেজ, বৈদ্যুতিক উদ্দীপনার অনুপস্থিতির তুলনায় ২০% বেশি ছিল, যা সংকোচনমূলক কার্যকারিতায় বৈদ্যুতিক উদ্দীপনার অবদান নির্দেশ করে।
বায়ু চেম্বারের চাপ, তরল চেম্বারের চাপ এবং টিস্যুর নড়াচড়ার পরিমাপের প্রতিনিধিত্বমূলক রেখাচিত্র নিশ্চিত করে যে চেম্বারের চাপ তরল চেম্বারের চাপকে পরিবর্তন করে, যার ফলে টিস্যু স্লাইসের একটি অনুরূপ নড়াচড়া ঘটে। খ) শতাংশ প্রসারণের (কমলা) সাথে সঙ্গতিপূর্ণ টিস্যু অংশের শতাংশ প্রসারণের (নীল) প্রতিনিধিত্বমূলক রেখাচিত্র। গ) কার্ডিয়াক স্লাইসের পরিমাপকৃত গতি, গতির পরিমাপকৃত বেগের সাথে সামঞ্জস্যপূর্ণ। (ঘ) হৃৎপিণ্ডের একটি স্লাইসে চক্রীয় গতি (নীল রেখা) এবং বেগের (কমলা ডটেড রেখা) প্রতিনিধিত্বমূলক গতিপথ। ঙ) চক্রের সময় (প্রতি গ্রুপে n = ১৯টি স্লাইস, বিভিন্ন শূকর থেকে), সংকোচনের সময় (প্রতি গ্রুপে n = ১৯টি স্লাইস), শিথিলতার সময় (প্রতি গ্রুপে n = ১৯টি স্লাইস, বিভিন্ন শূকর থেকে), টিস্যুর নড়াচড়া (প্রতি গ্রুপে n = ২৫টি স্লাইস, বিভিন্ন শূকর থেকে), সর্বোচ্চ সিস্টোলিক বেগ (প্রতি গ্রুপে n = ২৪(D0), ২৫(D12) স্লাইস, বিভিন্ন শূকর থেকে) এবং সর্বোচ্চ শিথিলতার হার (প্রতি গ্রুপে n=২৪(D0), ২৫(D12) স্লাইস, বিভিন্ন শূকর থেকে) এর পরিমাণ নির্ধারণ। দ্বি-পুচ্ছ স্টুডেন্ট'স টি-টেস্ট কোনো প্যারামিটারে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য দেখায়নি। f একই সেকশন থেকে নেওয়া টিস্যু সেকশনের দশটি আঞ্চলিক এলাকার বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা সহ (লাল) এবং ছাড়া (নীল) টিস্যু সেকশনের প্রতিনিধিত্বমূলক স্ট্রেইন বিশ্লেষণ ট্রেস। নিচের প্যানেলগুলো বিভিন্ন সেকশনের দশটি এলাকায় বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা সহ এবং ছাড়া টিস্যু সেকশনের স্ট্রেইনের শতাংশ পার্থক্যের পরিমাণ দেখায়। (ভিন্ন ভিন্ন শূকর থেকে সংগৃহীত প্রতি গ্রুপে ৮টি স্লাইস, দ্বিমুখী স্টুডেন্ট টি-টেস্ট করা হয়েছে; ****পি < ০.০০০১, **পি < ০.০১, *পি < ০.০৫)। (ভিন্ন ভিন্ন শূকর থেকে সংগৃহীত প্রতি গ্রুপে ৮টি স্লাইস, দ্বিমুখী স্টুডেন্ট টি-টেস্ট করা হয়েছে; ****পি < ০.০০০১, **পি < ০.০১, *পি < ০.০৫)। (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,01, *p<00,5)। (ভিন্ন ভিন্ন শূকর থেকে প্রতিটি গ্রুপের ৮টি করে অংশ, দ্বিমুখী স্টুডেন্ট টি-টেস্ট; ****পি<০.০০০১, **পি<০.০১, *পি<০.০৫)। （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；**p <0.0001，**p < 0.01,*p < 0.05）। （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；**p <0.0001，**p < 0.01,*p < 0.05）। (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05)। (প্রতি গ্রুপে ৮টি অংশ, ভিন্ন ভিন্ন শূকর থেকে সংগৃহীত, দ্বিমুখী স্টুডেন্ট টি-টেস্ট; ****পি<০.০০০১, **পি<০.০১, *পি<০.০৫)।এরর বারগুলো গড় ± আদর্শ বিচ্যুতি নির্দেশ করে।
আমাদের পূর্ববর্তী স্ট্যাটিক বায়োমিমেটিক হার্ট স্লাইস কালচার সিস্টেমে [২০, ২১], আমরা বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা প্রয়োগ করে এবং মিডিয়ামের গঠন অপ্টিমাইজ করে ৬ দিন পর্যন্ত হার্ট স্লাইসের কার্যক্ষমতা, কার্যকারিতা এবং কাঠামোগত অখণ্ডতা বজায় রেখেছিলাম। তবে, ১০ দিন পর, এই সংখ্যাগুলো তীব্রভাবে হ্রাস পায়। আমরা আমাদের পূর্ববর্তী স্ট্যাটিক বায়োমিমেটিক কালচার সিস্টেম ২০, ২১-এ কালচার করা সেকশনগুলোকে কন্ট্রোল কন্ডিশন (Ctrl) হিসেবে উল্লেখ করব এবং আমাদের পূর্বে অপ্টিমাইজ করা মিডিয়ামকে MC কন্ডিশন হিসেবে ব্যবহার করব এবং যুগপৎ যান্ত্রিক ও বৈদ্যুতিক উদ্দীপনার (CTCM) অধীনে কালচার করব। প্রথমে, আমরা নির্ধারণ করেছিলাম যে বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা ছাড়া শুধুমাত্র যান্ত্রিক উদ্দীপনা ৬ দিন ধরে টিস্যুর কার্যক্ষমতা বজায় রাখার জন্য অপর্যাপ্ত ছিল (পরিপূরক চিত্র ৩ক,খ)। মজার বিষয় হলো, STCM ব্যবহার করে ফিজিও-মেকানিক্যাল এবং বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা প্রয়োগের ফলে, ১২-দিনের হার্ট সেকশনের কার্যক্ষমতা MS কন্ডিশনের অধীনে থাকা তাজা হার্ট সেকশনের মতোই ছিল, কিন্তু Ctrl কন্ডিশনের অধীনে নয়, যা MTT বিশ্লেষণে দেখানো হয়েছে (চিত্র ১, ৩ক)। এটি ইঙ্গিত দেয় যে যান্ত্রিক উদ্দীপনা এবং কার্ডিয়াক চক্রের সিমুলেশন আমাদের পূর্ববর্তী স্ট্যাটিক কালচার সিস্টেমে রিপোর্ট করা সময়ের চেয়ে দ্বিগুণ সময় ধরে টিস্যু সেকশনগুলিকে কার্যকর রাখতে পারে। যাইহোক, কার্ডিয়াক ট্রোপোনিন টি এবং কনেক্সিন ৪৩-এর ইমিউনোলেবেলিং দ্বারা টিস্যু সেকশনগুলির কাঠামোগত অখণ্ডতা মূল্যায়নে দেখা গেছে যে, ১২তম দিনে এমসি টিস্যুতে কনেক্সিন ৪৩-এর এক্সপ্রেশন একই দিনের কন্ট্রোলের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বেশি ছিল। তবে, কনেক্সিন ৪৩-এর অভিন্ন এক্সপ্রেশন এবং জেড-ডিস্ক গঠন সম্পূর্ণরূপে বজায় থাকেনি (চিত্র ৩বি)। আমরা টিস্যুর কাঠামোগত অখণ্ডতা পরিমাপ করার জন্য একটি কৃত্রিম বুদ্ধিমত্তা (এআই) ফ্রেমওয়ার্ক ব্যবহার করি, যা ট্রোপোনিন-টি এবং কনেক্সিন স্টেইনিং-এর উপর ভিত্তি করে একটি ইমেজ-ভিত্তিক ডিপ লার্নিং পাইপলাইন, যা স্থানীয়করণের শক্তির পরিপ্রেক্ষিতে হার্ট স্লাইসের কাঠামোগত অখণ্ডতা এবং ফ্লুরোসেন্স স্বয়ংক্রিয়ভাবে পরিমাপ করে। এই পদ্ধতিটি একটি কনভল্যুশনাল নিউরাল নেটওয়ার্ক (সিএনএন) এবং একটি ডিপ লার্নিং ফ্রেমওয়ার্ক ব্যবহার করে, যা রেফারেন্সে বর্ণিত স্বয়ংক্রিয় এবং নিরপেক্ষ পদ্ধতিতে কার্ডিয়াক টিস্যুর কাঠামোগত অখণ্ডতা নির্ভরযোগ্যভাবে পরিমাপ করে। স্ট্যাটিক কন্ট্রোল সেকশনের তুলনায় এমসি টিস্যু ০ দিনের সাথে উন্নত কাঠামোগত সাদৃশ্য দেখিয়েছে। এছাড়াও, ম্যাসন'স ট্রাইক্রোম স্টেইনিং থেকে দেখা যায় যে, কালচারের ১২তম দিনে কন্ট্রোল কন্ডিশনের তুলনায় এমএস কন্ডিশনে ফাইব্রোসিসের হার উল্লেখযোগ্যভাবে কম ছিল (চিত্র ৩সি)। যদিও সিটিসিএম ১২তম দিনে হৃৎপিণ্ডের টিস্যু সেকশনের কার্যক্ষমতা তাজা হৃৎপিণ্ডের টিস্যুর অনুরূপ স্তরে বৃদ্ধি করেছিল, এটি হৃৎপিণ্ডের সেকশনগুলির কাঠামোগত অখণ্ডতার উল্লেখযোগ্য উন্নতি ঘটাতে পারেনি।
একটি বার গ্রাফে তাজা হৃৎপিণ্ডের স্লাইস (D0) অথবা ১২ দিন ধরে স্ট্যাটিক কালচারে (D12 Ctrl) বা CTCM-এ (D12 MC) কালচার করা হৃৎপিণ্ডের স্লাইসের MTT ভাইয়াবিলিটির পরিমাণ দেখানো হয়েছে (বিভিন্ন শূকর থেকে সংগৃহীত প্রতি গ্রুপে যথাক্রমে ১৮ (D0), ১৫ (D12 Ctrl), ১২ (D12 MC) টি স্লাইস, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়েছে; ####p < 0.0001 D0 এর তুলনায় এবং **p < 0.01 D12 Ctrl এর তুলনায়)। একটি বার গ্রাফে তাজা হৃৎপিণ্ডের স্লাইস (D0) অথবা ১২ দিন ধরে স্ট্যাটিক কালচারে (D12 Ctrl) বা CTCM-এ (D12 MC) কালচার করা হৃৎপিণ্ডের স্লাইসের MTT ভাইয়াবিলিটির পরিমাণ দেখানো হয়েছে (বিভিন্ন শূকর থেকে সংগৃহীত প্রতি গ্রুপে n = ১৮ (D0), ১৫ (D12 Ctrl), ১২ (D12 MC) স্লাইস; একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়েছে; ####p < ০.০০০১ D0-এর তুলনায় এবং **p < ০.০১ D12 Ctrl-এর তুলনায়)।হিস্টোগ্রামটি বিভিন্ন শূকর থেকে সংগৃহীত MTT তাজা হৃৎপিণ্ডের খণ্ডাংশ (D0) অথবা স্ট্যাটিক কালচারে (D12 কন্ট্রোল) বা CTCM-এ (D12 MC) ১২ দিন ধরে কালচার করা হৃৎপিণ্ডের খণ্ডাংশের কার্যক্ষমতার পরিমাণ দেখায় (n = ১৮ (D0), ১৫ (D12 কন্ট্রোল)), প্রতিটি গ্রুপ থেকে ১২টি (D12 MC) খণ্ডাংশ নিয়ে একটি একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়েছে;####p < 0,0001 по сравнению с D0 এবং **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl)। ####p < 0.0001 (D0 এর তুলনায়) এবং **p < 0.01 (D12 কন্ট্রোল এর তুলনায়)। একটি 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单单 曯曯ANOVA相比，####p < 0.0001,与D12 Ctrl 相比,**p <0.01)। একটি 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，###p < 0.0001，Ctrl.12)তাজা হৃৎপিণ্ডের অংশ (D0) অথবা স্থির কালচারে (D12 কন্ট্রোল) বা CTCM-এ (D12 MC) ১২ দিন ধরে কালচার করা হৃৎপিণ্ডের অংশে MTT কার্যকারিতার পরিমাণ দেখানো হিস্টোগ্রাম (n = বিভিন্ন শূকর থেকে সংগৃহীত প্রতি গ্রুপে ১৮ (D0), ১৫ (D12 কন্ট্রোল)), ১২ (D12 MC) টি অংশ, একমুখী ANOVA পরীক্ষা;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl)। ####p < 0.0001 (D0-এর তুলনায়), **p < 0.01 (D12 Ctrl-এর তুলনায়)।b সদ্য বিচ্ছিন্ন হৃৎপিণ্ডের অংশ (D0) অথবা ১২ দিন ধরে স্থির অবস্থায় (Ctrl) বা CTCM অবস্থায় (MC) কালচার করা হৃৎপিণ্ডের অংশে ট্রোপোনিন-টি (সবুজ), কানেক্সিন ৪৩ (লাল) এবং ডিপিআই (নীল)-এর প্রতিনিধিত্বমূলক ইমিউনোফ্লুরেসেন্স চিত্র (ব্ল্যাঙ্ক স্কেল = ১০০ µm)। কৃত্রিম বুদ্ধিমত্তার সাহায্যে হৃৎপিণ্ডের টিস্যুর কাঠামোগত অখণ্ডতার পরিমাণ নির্ণয় (প্রতিটি গ্রুপ থেকে ভিন্ন ভিন্ন শূকরের ৭টি (D0), ৭টি (D12 Ctrl), ৫টি (D12 MC) স্লাইস নিয়ে একমুখী অ্যানোভা (one-way ANOVA) পরীক্ষা করা হয়েছে; ####p < 0.0001 D0-এর তুলনায় এবং ****p < 0.0001 D12 Ctrl-এর তুলনায়)। কৃত্রিম বুদ্ধিমত্তার সাহায্যে হৃৎপিণ্ডের টিস্যুর কাঠামোগত অখণ্ডতার পরিমাণ নির্ণয় (প্রতিটি গ্রুপ থেকে ভিন্ন ভিন্ন শূকরের ৭টি (D0), ৭টি (D12 Ctrl), ৫টি (D12 MC) স্লাইস নিয়ে একমুখী অ্যানোভা (one-way ANOVA) পরীক্ষা করা হয়েছে; ####p < 0.0001 D0-এর তুলনায় এবং ****p < 0.0001 D12 Ctrl-এর তুলনায়)। Количественная оценка структурной целостности селостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5/12/MC разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 এবং ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)। কৃত্রিম বুদ্ধিমত্তার সাহায্যে হৃৎপিণ্ডের টিস্যুর কাঠামোগত অখণ্ডতার পরিমাণ নির্ণয় (বিভিন্ন শূকর থেকে সংগৃহীত ৭টি (D0), ৭টি (D12 Ctrl), ৫টি (D12 MC) সেকশন/গ্রুপ, একমুখী অ্যানোভা (one-way ANOVA) পরীক্ষা সম্পাদিত; ####p < ০.০০০১ D0-এর তুলনায় এবং ****p < ০.০০০১ D12 Ctrl-এর তুলনায়)।人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) বিভিন্ন শূকরের প্রতিটি স্লাইস/গ্রুপ, ওয়ান-ওয়ে ANOVA পরীক্ষা।相比,****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）।人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) বিভিন্ন শূকরের প্রতিটি স্লাইস/গ্রুপ, একমুখী ANOVA পরীক্ষা। ##0p.与D0相比，****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）। Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl/D05), каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 বনাম D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)। হৃৎপিণ্ডের টিস্যুর কাঠামোগত অখণ্ডতা পরিমাপ করার জন্য কৃত্রিম বুদ্ধিমত্তা (প্রতিটি ভিন্ন শূকরের গ্রুপ থেকে n = ৭ (D0), ৭ (D12 Ctrl), ৫ (D12 MC) সেকশন, একমুখী অ্যানোভা পরীক্ষা; ####p<0.0001 বনাম D0; তুলনার জন্য ****p < 0.0001, D12 Ctrl-এর সাথে তুলনীয়)। গ) ম্যাসন'স ট্রাইক্রোম স্টেইন দিয়ে রঞ্জিত হৃৎপিণ্ডের স্লাইসের প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র (বামে) এবং পরিমাণ নির্ধারণ (ডানে) (স্কেল বেয়ার = ৫০০ µm) (প্রতিটি ভিন্ন শূকর থেকে নেওয়া প্রতি গ্রুপে n = ১০টি স্লাইস, একমুখী অ্যানোভা পরীক্ষা করা হয়েছে; ####p < ০.০০০১ D0 এর তুলনায় এবং ***p < ০.০০১ D12 Ctrl এর তুলনায়)। গ) ম্যাসন'স ট্রাইক্রোম স্টেইন দিয়ে রঞ্জিত হৃৎপিণ্ডের স্লাইসের প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র (বামে) এবং পরিমাণ নির্ধারণ (ডানে) (স্কেল বেয়ার = ৫০০ µm) (প্রতিটি ভিন্ন শূকর থেকে নেওয়া গ্রুপ প্রতি n = ১০টি স্লাইস, একমুখী অ্যানোভা পরীক্ষা করা হয়েছে; #### p < ০.০০০১ D0 এর তুলনায় এবং ***p < ০.০০১ D12 Ctrl এর তুলনায়)। গ Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным краситеслева (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #0#01; сравнению с D0 এবং ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl)। গ) ম্যাসন'স ট্রাইক্রোম স্টেইন (আনকোটেড স্কেল = ৫০০ µm) দিয়ে রঞ্জিত হৃৎপিণ্ডের অংশের প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র (বামে) এবং পরিমাণ নির্ধারণ (ডানে) (বিভিন্ন শূকর থেকে প্রতিটি গ্রুপ থেকে ১০টি করে অংশ, একমুখী অ্যানোভা পরীক্ষা করা হয়েছে; #### p < ০.০০০১ D0 এর তুলনায় এবং ***p < ০.০০১ D12 Ctrl এর তুলনায়)। c 用ম্যাসন 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度=0m0µm0个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p0r1 <0.0.相比)। সি 用 ম্যাসন 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度度度度带裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单勐 单勐 单勐 单勐আনোভা 0.0001 与D0 相比,***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）। c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным краситенных шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного диспозов##; < 0,0001 po сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl)। গ) ম্যাসন'স ট্রাইক্রোম স্টেইন দিয়ে রঞ্জিত হৃৎপিণ্ডের খণ্ডাংশের প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র (বামে) এবং পরিমাণ নির্ণয় (ডানে) (ব্ল্যাঙ্ক = ৫০০ µm) (প্রতি গ্রুপে n = ১০টি খণ্ডাংশ, প্রতিটি ভিন্ন ভিন্ন শূকর থেকে নেওয়া, একমুখী ভেদাঙ্ক বিশ্লেষণ দ্বারা পরীক্ষিত; ### # p < ০.০০০১ D0-এর তুলনায়, ***p < ০.০০১ D12 Ctrl-এর তুলনায়)।এরর বারগুলো গড় ± আদর্শ বিচ্যুতি নির্দেশ করে।
আমরা অনুমান করেছিলাম যে কালচার মিডিয়ামে ছোট অণু যোগ করার মাধ্যমে, CTCM কালচারের সময় কার্ডিওমায়োসাইটের অখণ্ডতা উন্নত করা যেতে পারে এবং ফাইব্রোসিসের বিকাশ হ্রাস করা যেতে পারে। তাই, বিভ্রান্তিকর কারণের সংখ্যা কম থাকায় আমরা আমাদের স্ট্যাটিক কন্ট্রোল কালচার ব্যবহার করে ছোট অণুগুলির জন্য স্ক্রিনিং করেছিলাম। এই স্ক্রিনিংয়ের জন্য ডেক্সামেথাসোন (Dex), ট্রাইআয়োডোথাইরোনিন (T3), এবং SB431542 (SB) নির্বাচন করা হয়েছিল। এই ছোট অণুগুলি পূর্বে hiPSC-CM কালচারে সারকোমিয়ারের দৈর্ঘ্য, টি-টিউবুল এবং পরিবাহী বেগ বৃদ্ধির মাধ্যমে কার্ডিওমায়োসাইটের পরিপক্কতা আনতে ব্যবহৃত হয়েছে। এছাড়াও, Dex (একটি গ্লুকোকর্টিকয়েড) এবং SB উভয়ই প্রদাহ দমন করতে পরিচিত। তাই, আমরা পরীক্ষা করে দেখেছি যে এই ছোট অণুগুলির একটি বা একাধিকের সংমিশ্রণ অন্তর্ভুক্ত করলে হৃৎপিণ্ডের অংশের কাঠামোগত অখণ্ডতা উন্নত হয় কিনা। প্রাথমিক স্ক্রিনিংয়ের জন্য, প্রতিটি যৌগের মাত্রা সেল কালচার মডেলে সাধারণত ব্যবহৃত ঘনত্বের (১ μM Dex27, ১০০ nM T327, এবং ২.৫ μM SB31) উপর ভিত্তি করে নির্বাচন করা হয়েছিল। ১২ দিন কালচারের পর, T3 এবং Dex-এর সংমিশ্রণ কার্ডিওমায়োসাইটের সর্বোত্তম কাঠামোগত অখণ্ডতা এবং ন্যূনতম ফাইব্রাস রিমডেলিং ঘটিয়েছে (পরিশিষ্ট চিত্র ৪ এবং ৫)। এছাড়াও, T3 এবং Dex-এর এই ঘনত্বগুলির দ্বিগুণ বা তারও বেশি ব্যবহার স্বাভাবিক ঘনত্বের তুলনায় ক্ষতিকর প্রভাব সৃষ্টি করেছে (পরিশিষ্ট চিত্র ৬ক,খ)।
প্রাথমিক স্ক্রিনিংয়ের পর, আমরা ৪টি কালচার কন্ডিশনের মধ্যে সরাসরি তুলনা করেছি (চিত্র ৪ক): Ctrl: আমাদের অপ্টিমাইজ করা মিডিয়াম ব্যবহার করে পূর্বে বর্ণিত স্ট্যাটিক কালচারে কালচার করা হার্টের অংশ; TD: T3 এবং Ctrl-এর সাথে বুধবার Dex যোগ করা; MC: আমাদের পূর্বে অপ্টিমাইজ করা মিডিয়াম ব্যবহার করে CTCM-এ কালচার করা হার্টের অংশ; এবং MT: CTCM-এর সাথে মিডিয়ামে T3 এবং Dex যোগ করা। ১২ দিন কালচারের পর, MTT অ্যাসে দ্বারা মূল্যায়ন করে দেখা গেছে যে MS এবং MT টিস্যুর ভাইয়াবিলিটি তাজা টিস্যুর মতোই ছিল (চিত্র ৪খ)। মজার বিষয় হলো, ট্রান্সওয়েল কালচারে (TD) T3 এবং Dex যোগ করার ফলে Ctrl কন্ডিশনের তুলনায় ভাইয়াবিলিটিতে উল্লেখযোগ্য কোনো উন্নতি হয়নি, যা হার্টের অংশের ভাইয়াবিলিটি বজায় রাখতে যান্ত্রিক উদ্দীপনার একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা নির্দেশ করে।
ক) ১২ দিন ধরে মিডিয়ামের উপর যান্ত্রিক উদ্দীপনা এবং T3/Dex সম্পূরকের প্রভাব মূল্যায়নের জন্য ব্যবহৃত চারটি কালচার কন্ডিশন চিত্রিতকারী পরীক্ষামূলক নকশার ডায়াগ্রাম। b বার গ্রাফটি তাজা হৃৎপিণ্ডের স্লাইসের (D0) তুলনায় ৪টি কালচার কন্ডিশনের (Ctrl, TD, MC, এবং MT) সবকটিতে কালচারের ১২ দিন পর কার্যক্ষমতার পরিমাণ দেখায় (বিভিন্ন শূকর থেকে সংগৃহীত প্রতি গ্রুপে n = ১৮ (D0), ১৫ (D12 Ctrl, D12 TD এবং D12 MT), ১২ (D12 MC) স্লাইস; একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়েছে; ####p < ০.০০০১, ###p < ০.০০১ D0-এর তুলনায় এবং **p < ০.০১ D12 Ctrl-এর তুলনায়)। b বার গ্রাফটি তাজা হৃৎপিণ্ডের স্লাইসের (D0) তুলনায় ৪টি কালচার কন্ডিশনের (Ctrl, TD, MC, এবং MT) সবকটিতে কালচারের ১২ দিন পর কার্যক্ষমতার পরিমাণ দেখায় (বিভিন্ন শূকর থেকে সংগৃহীত প্রতি গ্রুপে n = ১৮ (D0), ১৫ (D12 Ctrl, D12 TD এবং D12 MT), ১২ (D12 MC) স্লাইস; একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়েছে; ####p < ০.০০০১, ###p < ০.০০১ D0-এর তুলনায় এবং **p < ০.০১ D12 ctrl-এর তুলনায়)। b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 усех культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12) D12MCTD (D12MT) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 এবং **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl)। বার গ্রাফটি তাজা হৃৎপিণ্ডের অংশের (D0) তুলনায় ৪টি কালচার কন্ডিশনের (কন্ট্রোল, TD, MC, এবং MT) সবকটিতে কালচারের ১২ দিন পর কার্যক্ষমতার পরিমাণ দেখায় (বিভিন্ন শূকর থেকে সংগৃহীত প্রতি গ্রুপে n = ১৮ (D0), ১৫ (D12 Ctrl, D12 TD, এবং D12 MT), ১২ (D12 MC) টি অংশ, একমুখী ANOVA পরীক্ষা; ####p < ০.০০০১, ###p < ০.০০১ বনাম D0 এবং **p < ০.০১ বনাম D12 Ctrl)। b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D1r1D0) TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p <0p <0.0** 0.01 与D12控制)।b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (কোনট্রোল, টিডি, এমসি এবং এমটি) 15 (D12 Ctrl, D12 TD এবং D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12)। b তাজা হৃৎপিণ্ডের খণ্ডাংশের (D0) সাথে তুলনা করে চারটি কালচার কন্ডিশনের (কন্ট্রোল, TD, MC এবং MT) হিস্টোগ্রাম দেখানো হয়েছে (প্রতি গ্রুপে n = ১৮ (D0), ১৫ (D12 Ctrl, D12 TD এবং D12 MT), ভিন্ন ভিন্ন শূকর থেকে সংগৃহীত ১২টি (D12 MC) খণ্ডাংশ, একমুখী অ্যানোভা পরীক্ষা; ####p<0.0001, ###p<0.001 বনাম D0, **p<0.01 বনাম কন্ট্রোল D12)। c বার গ্রাফটি তাজা হৃৎপিণ্ডের স্লাইসের (D0) তুলনায় ৪টি কালচার কন্ডিশনের (Ctrl, TD, MC, এবং MT) সবকটিতে কালচারের ১২ দিন পর গ্লুকোজ ফ্লাক্সের পরিমাণ দেখায় (প্রতি গ্রুপে বিভিন্ন শূকর থেকে নেওয়া ৬টি স্লাইস, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়েছে; ###p < 0.001, D0-এর তুলনায় এবং ***p < 0.001, D12 Ctrl-এর তুলনায়)। c বার গ্রাফটি তাজা হৃৎপিণ্ডের স্লাইসের (D0) তুলনায় ৪টি কালচার কন্ডিশনের (Ctrl, TD, MC, এবং MT) সবকটিতে কালচারের ১২ দিন পর গ্লুকোজ ফ্লাক্সের পরিমাণ দেখায় (প্রতি গ্রুপে বিভিন্ন শূকর থেকে নেওয়া ৬টি স্লাইস, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়েছে; ###p < 0.001, D0-এর তুলনায় এবং ***p < 0.001, D12 Ctrl-এর তুলনায়)। c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 усех усех 4 усеховирования (CONTROL, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, одоноляйней свиней тест ANOVA; ###p <0,001 по сравнению с D0 এবং ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl)। গ) হিস্টোগ্রামটি তাজা হৃৎপিণ্ডের অংশের (D0) তুলনায় ৪টি কালচার অবস্থার (কন্ট্রোল, TD, MC এবং MT) অধীনে কালচারের ১২ দিন পর গ্লুকোজ প্রবাহের পরিমাণ দেখায় (প্রতি গ্রুপে বিভিন্ন শূকর থেকে নেওয়া ৬টি অংশ, একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়েছে; ###p < 0.001 D0-এর তুলনায় এবং ***p < 0.001 D12 Ctrl-এর তুলনায়)। c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比养切片(D0)天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p <0.001，.0p <0.*0p <0.0**与D12 Ctrl 相比)। সি 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片戇片培养 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， A NOVA 测试；###p <0.001，与D0 相比,***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）। c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех 4иуй культивирования (контроль, TD, MC এবং MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разновный срезов/группа Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль)। গ) তাজা হৃৎপিণ্ডের অংশের (D0) তুলনায় ৪টি কালচার অবস্থার (কন্ট্রোল, TD, MC, এবং MT) জন্য কালচারের ১২ দিন পর গ্লুকোজ প্রবাহের পরিমাণ দেখানো হিস্টোগ্রাম (প্রতি গ্রুপে n = ৬টি অংশ, বিভিন্ন শূকর থেকে সংগৃহীত, একতরফা)। অ্যানোভা পরীক্ষা করা হয়েছিল, ###p < ০.০০১ D0-এর তুলনায়, ***p < ০.০০১ D12 (কন্ট্রোল)-এর তুলনায়।d দশটি আঞ্চলিক টিস্যু সেকশন পয়েন্টে তাজা (নীল), ১২ দিনের MC (সবুজ), এবং ১২ দিনের MT (লাল) টিস্যুর স্ট্রেইন বিশ্লেষণ প্লট (প্রতি গ্রুপে n = ৪ স্লাইস, একমুখী ANOVA পরীক্ষা; গ্রুপগুলোর মধ্যে কোনো উল্লেখযোগ্য পার্থক্য ছিল না)। e ১০-১২ দিন ধরে স্থির অবস্থায় (Ctrl) বা MT অবস্থায় (MT) কালচার করা হার্ট সেকশনের তুলনায় তাজা হার্ট সেকশনে (D0) ভিন্নভাবে প্রকাশিত জিন দেখানো ভলকানো প্লট। f প্রতিটি কালচার অবস্থার অধীনে কালচার করা হার্ট সেকশনের সারকোমিয়ার জিনের হিটম্যাপ। এরর বারগুলো গড় ± স্ট্যান্ডার্ড ডেভিয়েশন নির্দেশ করে।
ফ্যাটি অ্যাসিড জারণ থেকে গ্লাইকোলাইসিসে রূপান্তরের উপর বিপাকীয় নির্ভরতা হলো কার্ডিওমায়োসাইট ডিডিফারেনসিয়েশনের একটি প্রধান বৈশিষ্ট্য। অপরিণত কার্ডিওমায়োসাইটগুলো প্রাথমিকভাবে ATP উৎপাদনের জন্য গ্লুকোজ ব্যবহার করে এবং এদের হাইপোপ্লাস্টিক মাইটোকন্ড্রিয়া থাকে যেখানে ক্রিস্টির সংখ্যা কম থাকে৫,৩২। গ্লুকোজ ব্যবহারের বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে MC এবং MT উভয় অবস্থাতেই গ্লুকোজ ব্যবহারের পরিমাণ ০ দিনের টিস্যুর মতোই ছিল (চিত্র ৪গ)। তবে, তাজা টিস্যুর তুলনায় Ctrl নমুনাগুলোতে গ্লুকোজ ব্যবহারের পরিমাণ উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে। এটি নির্দেশ করে যে CTCM এবং T3/Dex-এর সংমিশ্রণ টিস্যুর কার্যক্ষমতা বৃদ্ধি করে এবং ১২ দিন ধরে কালচার করা হৃৎপিণ্ডের অংশের বিপাকীয় ফেনোটাইপকে অক্ষুণ্ণ রাখে। এছাড়াও, স্ট্রেইন বিশ্লেষণে দেখা গেছে যে MT এবং MS উভয় অবস্থাতেই ১২ দিন পর্যন্ত স্ট্রেইনের মাত্রা তাজা হৃৎপিণ্ডের টিস্যুর মতোই ছিল (চিত্র ৪ঘ)।
কার্ডিয়াক স্লাইস টিস্যুর গ্লোবাল ট্রান্সক্রিপশনাল ল্যান্ডস্কেপের উপর CTCM এবং T3/Dex-এর সামগ্রিক প্রভাব বিশ্লেষণ করার জন্য, আমরা চারটি ভিন্ন কালচার কন্ডিশন থেকে প্রাপ্ত কার্ডিয়াক স্লাইসের উপর RNAseq সম্পাদন করেছি (সাপ্লিমেন্টারি ডেটা ১)। মজার বিষয় হলো, MT সেকশনগুলো তাজা হার্ট টিস্যুর সাথে উচ্চ ট্রান্সক্রিপশনাল সাদৃশ্য দেখিয়েছে, যেখানে ১৩,৬৪২টি জিনের মধ্যে মাত্র ১৬টি ভিন্নভাবে প্রকাশিত হয়েছে। তবে, যেমনটি আমরা আগে দেখিয়েছি, কালচারে ১০-১২ দিন পর Ctrl স্লাইসগুলোতে ১২২৯টি ভিন্নভাবে প্রকাশিত জিন দেখা গেছে (চিত্র ৪e)। এই ডেটা হার্ট এবং ফাইব্রোব্লাস্ট জিনের qRT-PCR দ্বারা নিশ্চিত করা হয়েছে (সাপ্লিমেন্টারি চিত্র ৭a-c)। মজার বিষয় হলো, Ctrl সেকশনগুলোতে কার্ডিয়াক এবং সেল সাইকেল জিনের ডাউনরেগুলেশন এবং প্রদাহজনক জিন প্রোগ্রামের অ্যাক্টিভেশন দেখা গেছে। এই ডেটা থেকে বোঝা যায় যে ডিডিফারেন্সিয়েশন, যা সাধারণত দীর্ঘমেয়াদী কালচারিংয়ের পরে ঘটে, তা MT কন্ডিশনের অধীনে সম্পূর্ণরূপে প্রশমিত হয় (সাপ্লিমেন্টারি চিত্র ৮a,b)। সারকোমিয়ার জিনগুলির সতর্কতামূলক অধ্যয়নে দেখা গেছে যে শুধুমাত্র MT পরিস্থিতিতেই সারকোমিয়ার (চিত্র ৪চ) এবং আয়ন চ্যানেল (পরিপূরক চিত্র ৯) এনকোডিংকারী জিনগুলি সংরক্ষিত থাকে, যা Ctrl, TD, এবং MC পরিস্থিতিতে তাদের দমন থেকে রক্ষা করে। এই তথ্য প্রমাণ করে যে যান্ত্রিক এবং হিউমোরাল উদ্দীপনার (T3/Dex) সংমিশ্রণে, কালচারে ১২ দিন পরেও হার্ট স্লাইসের ট্রান্সক্রিপ্টোম তাজা হার্ট স্লাইসের মতোই থাকতে পারে।
এই ট্রান্সক্রিপশনাল ফলাফলগুলো এই সত্য দ্বারা সমর্থিত যে, হৃৎপিণ্ডের খণ্ডাংশে কার্ডিওমায়োসাইটের কাঠামোগত অখণ্ডতা ১২ দিনের জন্য এমটি (MT) পরিস্থিতিতে সবচেয়ে ভালোভাবে সংরক্ষিত থাকে, যা অক্ষত এবং স্থানীয়কৃত কানেক্সিন ৪৩ (connexin 43) দ্বারা প্রদর্শিত হয়েছে (চিত্র ৫ক)। এছাড়াও, এমটি (MT) পরিস্থিতিতে হৃৎপিণ্ডের খণ্ডাংশে ফাইব্রোসিস কন্ট্রোল (Ctrl)-এর তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে হ্রাস পেয়েছিল এবং তাজা হৃৎপিণ্ডের খণ্ডাংশের অনুরূপ ছিল (চিত্র ৫খ)। এই তথ্যগুলো প্রমাণ করে যে, যান্ত্রিক উদ্দীপনা এবং টি৩/ডেক্স (T3/Dex) চিকিৎসার সংমিশ্রণ কালচারে থাকা হৃৎপিণ্ডের খণ্ডাংশে কার্ডিয়াক কাঠামোকে কার্যকরভাবে সংরক্ষণ করে।
ক) সদ্য বিচ্ছিন্ন হৃৎপিণ্ডের অংশ (D0) অথবা চারটি ভিন্ন হার্ট সেকশন কালচার কন্ডিশনে ১২ দিন ধরে কালচার করা অংশের ট্রোপোনিন-টি (সবুজ), কানেক্সিন ৪৩ (লাল) এবং ডিপিআই (নীল)-এর প্রতিনিধিত্বমূলক ইমিউনোফ্লুরেসেন্স চিত্র (স্কেল বার = ১০০ µm)। কৃত্রিম বুদ্ধিমত্তার সাহায্যে হৃৎপিণ্ডের টিস্যুর গাঠনিক অখণ্ডতার পরিমাণ নির্ণয় (বিভিন্ন শূকর থেকে সংগৃহীত প্রতি গ্রুপে n = ৭ (D0 এবং D12 Ctrl), ৫ (D12 TD, D12 MC এবং D12 MT) স্লাইস; একমুখী অ্যানোভা (one-way ANOVA) পরীক্ষা করা হয়েছে; ####p < ০.০০০১ D0-এর তুলনায় এবং *p < ০.০৫, অথবা ****p < ০.০০০১ D12 Ctrl-এর তুলনায়)। কৃত্রিম বুদ্ধিমত্তার সাহায্যে হৃৎপিণ্ডের টিস্যুর গাঠনিক অখণ্ডতার পরিমাণ নির্ণয় (বিভিন্ন শূকর থেকে সংগৃহীত প্রতি গ্রুপে n = ৭ (D0 এবং D12 Ctrl), ৫ (D12 TD, D12 MC এবং D12 MT) স্লাইস; একমুখী অ্যানোভা (one-way ANOVA) পরীক্ষা করা হয়েছে; #### p < ০.০০০১ D0-এর তুলনায় এবং *p < ০.০৫, অথবা ****p < ০.০০০১ D12 Ctrl-এর তুলনায়)। Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 এবং D12 Ctrl12, DMCTD22, DMCTD22), MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 এবং *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)। কৃত্রিম বুদ্ধিমত্তা ব্যবহার করে হৃৎপিণ্ডের টিস্যুর কাঠামোগত অখণ্ডতার পরিমাণ নির্ণয় (বিভিন্ন শূকর থেকে সংগৃহীত প্রতি গ্রুপে n = ৭ (D0 এবং D12 Ctrl), ৫ (D12 TD, D12 MC এবং D12 MT) সেকশন; একমুখী ANOVA পরীক্ষা করা হয়েছে; #### p < ০.০০০১ D0-এর তুলনায় এবং *p < ০.০৫ অথবা ****p < ০.০০০১ D12 Ctrl-এর তুলনায়)।对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p <0.0001 与D0 和*p <0.0.** 0.0001 与D12 Ctrl 相比）।对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.0001 与D0 和*p <0.05 0.0001 与D12 Ctrl 相比)।একমুখী অ্যানোভা পরীক্ষার মাধ্যমে বিভিন্ন শূকরের হৃৎপিণ্ডের টিস্যুর কাঠামোগত অখণ্ডতার পরিমাণ নির্ণয় (প্রতি গ্রুপে n = ৭ (D0 এবং D12 Ctrl), ৫ (D12 TD, D12 MC এবং D12 MT) সেকশন);#### p < 0,0001 по сравнению с D0 এবং *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)। #### D0 এর তুলনায় p < 0.0001 এবং *p < 0.05 অথবা **** D12 (Ctrl) এর তুলনায় p < 0.0001। b ম্যাসন'স ট্রাইক্রোম স্টেইন দিয়ে রঞ্জিত হৃৎপিণ্ডের স্লাইসের প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র এবং পরিমাণ নির্ধারণ (স্কেল বার = ৫০০ µm) (n = ১০ (D0, D12 Ctrl, D12 TD, এবং D12 MC), বিভিন্ন শূকর থেকে প্রতিটি গ্রুপের ৯টি (D12 MT) স্লাইস, একমুখী অ্যানোভা পরীক্ষা করা হয়েছে; ####p < ০.০০০১ D0-এর তুলনায় এবং ***p < ০.০০১, অথবা ****p < ০.০০০১ D12 Ctrl-এর তুলনায়)। b ম্যাসন'স ট্রাইক্রোম স্টেইন দিয়ে রঞ্জিত হৃৎপিণ্ডের স্লাইসের প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র এবং পরিমাণ নির্ধারণ (স্কেল বার = ৫০০ µm) (n = ১০ (D0, D12 Ctrl, D12 TD, এবং D12 MC), বিভিন্ন শূকর থেকে প্রতিটি গ্রুপের ৯টি (D12 MT) স্লাইস, একমুখী অ্যানোভা পরীক্ষা করা হয়েছে; ####p < ০.০০০১ D0-এর তুলনায় এবং ***p < ০.০০১, অথবা ****p < ০.০০০১ D12 Ctrl-এর তুলনায়)। b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (массона) = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется одность #NOстой; 0,0001 по сравнению с D0 এবং ***p < 0,001 বা ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)। b ম্যাসন'স ট্রাইক্রোম স্টেইন দিয়ে রঞ্জিত হৃৎপিণ্ডের অংশের প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র এবং পরিমাণ নির্ণয় (স্কেল বার = ৫০০ µm) (n = ১০ (D0, D12 Ctrl, D12 TD এবং D12 MC), ৯ (D12 MT) টি অংশ/দল, বিভিন্ন শূকর থেকে সংগৃহীত, একমুখী অ্যানোভা (one-way ANOVA) প্রয়োগ করা হয়েছে; ####p < ০.০০০১ বনাম D0 এবং ***p < ০.০০১ অথবা ****p < ০.০০০১ বনাম D12 Ctrl)। b 用ম্যাসন 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺=500 µm）（n = 10D Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分曠00#0p相比，***p < 0.001,或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）। b 用 ম্যাসন 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） = 0 d0m） d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片切片切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；###与01 <0相比,***p <0.001,或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）। b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная =0макейнка =50менка) (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 বা ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)। b ম্যাসন'স ট্রাইক্রোম দিয়ে রঞ্জিত হৃৎপিণ্ডের অংশের প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র এবং পরিমাণ নির্ণয় (স্কেল বার = ৫০০ µm) (n = ১০টি (D0, D12 Ctrl, D12 TD এবং D12 MC), প্রতিটি গ্রুপ থেকে ভিন্ন ভিন্ন শূকরের ৯টি (D12 MT) অংশ, একটি অ্যানোভা পদ্ধতি; ####p < ০.০০০১ D0-এর তুলনায়, ***p < ০.০০১ অথবা ****p < ০.০০০১ D12 Ctrl-এর তুলনায়)।এরর বারগুলো গড় ± আদর্শ বিচ্যুতি নির্দেশ করে।
অবশেষে, কার্ডিয়াক টিস্যুর প্রসারণ বাড়িয়ে কার্ডিয়াক হাইপারট্রফি অনুকরণ করার জন্য CTCM-এর ক্ষমতা মূল্যায়ন করা হয়েছিল। CTCM-এ, সর্বোচ্চ এয়ার চেম্বার চাপ ৮০ mmHg (স্বাভাবিক প্রসারণ) থেকে ১৪০ mmHg পর্যন্ত বৃদ্ধি করা হয়েছিল (চিত্র ৬ক)। এটি প্রসারণে ৩২% বৃদ্ধির সমতুল্য (চিত্র ৬খ), যা পূর্বে হাইপারট্রফিতে দেখা সারকোমিয়ার দৈর্ঘ্যের অনুরূপ একটি দৈর্ঘ্য অর্জনের জন্য হৃৎপিণ্ডের অংশগুলির প্রয়োজনীয় প্রসারণের শতাংশ হিসাবে দেখানো হয়েছিল। সংকোচন এবং প্রসারণের সময় কার্ডিয়াক টিস্যুর প্রসারণ এবং বেগ ছয় দিনের কালচার জুড়ে স্থির ছিল (চিত্র ৬গ)। MT অবস্থা থেকে প্রাপ্ত কার্ডিয়াক টিস্যুকে ছয় দিনের জন্য স্বাভাবিক প্রসারণ (MT (Normal)) বা অতিরিক্ত প্রসারণ অবস্থায় (MT (OS)) রাখা হয়েছিল। কালচারে মাত্র চার দিন পরেই, MT (স্বাভাবিক) অবস্থার তুলনায় MT (OS) অবস্থার অধীনে মাধ্যমে হাইপারট্রফিক বায়োমার্কার NT-ProBNP উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছিল (চিত্র ৭ক)। এছাড়াও, ছয় দিন কালচার করার পর, MT (OS)-এর কোষের আকার (চিত্র 7b) MT হৃৎপিণ্ডের (স্বাভাবিক) অংশের তুলনায় উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে। এছাড়াও, অতিরিক্ত প্রসারিত টিস্যুতে NFATC4-এর নিউক্লিয়াসে স্থানান্তর উল্লেখযোগ্যভাবে বৃদ্ধি পেয়েছে (চিত্র 7c)। এই ফলাফলগুলি হাইপারডিসটেনশনের পরে প্যাথলজিকাল রিমডেলিং-এর ক্রমবর্ধমান বিকাশকে নির্দেশ করে এবং এই ধারণাটিকে সমর্থন করে যে CTCM ডিভাইসটি প্রসার-জনিত কার্ডিয়াক হাইপারট্রফি সিগন্যালিং অধ্যয়নের জন্য একটি প্ল্যাটফর্ম হিসাবে ব্যবহার করা যেতে পারে।
এয়ার চেম্বার প্রেশার, ফ্লুইড চেম্বার প্রেশার এবং টিস্যু মুভমেন্ট পরিমাপের প্রতিনিধিত্বমূলক ট্রেসগুলো নিশ্চিত করে যে চেম্বার প্রেশার ফ্লুইড চেম্বার প্রেশারকে পরিবর্তন করে, যার ফলে টিস্যু স্লাইসের একটি অনুরূপ মুভমেন্ট ঘটে। খ) স্বাভাবিকভাবে প্রসারিত (কমলা) এবং অতিরিক্ত প্রসারিত (নীল) টিস্যু সেকশনের জন্য প্রতিনিধিত্বমূলক স্ট্রেচ পার্সেন্টেজ এবং স্ট্রেচ রেট কার্ভ। গ) বার গ্রাফ যা সাইকেল টাইম (প্রতি গ্রুপে n = ১৯টি স্লাইস, বিভিন্ন শূকর থেকে), কন্ট্রাকশন টাইম (প্রতি গ্রুপে n = ১৮-১৯টি স্লাইস, বিভিন্ন শূকর থেকে), রিলাক্সেশন টাইম (প্রতি গ্রুপে n = ১৯টি স্লাইস, বিভিন্ন শূকর থেকে), টিস্যু মুভমেন্টের অ্যামপ্লিচিউড (প্রতি গ্রুপে n = ১৪টি স্লাইস, বিভিন্ন শূকর থেকে), পিক সিস্টোলিক ভেলোসিটি (প্রতি গ্রুপে n = ১৪টি স্লাইস, বিভিন্ন শূকর থেকে) এবং পিক রিলাক্সেশন রেট (প্রতি গ্রুপে n = ১৪ (D0), ১৫ (D6) সেকশন, বিভিন্ন শূকর থেকে) দেখাচ্ছে। টু-টেইলড স্টুডেন্টস টি-টেস্ট কোনো প্যারামিটারে উল্লেখযোগ্য পার্থক্য দেখায়নি, যা নির্দেশ করে যে ওভারভোল্টেজ সহ ৬ দিনের কালচার চলাকালীন এই প্যারামিটারগুলো অপরিবর্তিত ছিল। এরর বারগুলো গড় ± আদর্শ বিচ্যুতি নির্দেশ করে।
ক) এমটি নরমাল স্ট্রেচ (Norm) বা ওভারস্ট্রেচিং (OS) অবস্থায় কালচার করা হার্ট স্লাইসের কালচার মিডিয়াতে NT-ProBNP ঘনত্বের বার গ্রাফভিত্তিক পরিমাণ নির্ণয় (বিভিন্ন শূকর থেকে সংগৃহীত প্রতি গ্রুপে n = ৪ (D2 MTNorm), ৩ (D2 MTOS, D4 MTNorm, এবং D4 MTOS) স্লাইস; টু-ওয়ে অ্যানোভা (Two-way ANOVA) করা হয়েছে; **p < ০.০১, নরমাল স্ট্রেচের তুলনায়)। ক) এমটি নরমাল স্ট্রেচ (Norm) বা ওভারস্ট্রেচিং (OS) অবস্থার অধীনে কালচার করা হার্ট স্লাইসের কালচার মিডিয়াতে NT-ProBNP ঘনত্বের বার গ্রাফভিত্তিক পরিমাণ নির্ণয় (n = ৪ (D2 MTNorm), ৩ (D2 MTOS, D4 MTNorm, এবং D4 MTOS) স্লাইস/গ্রুপ, ভিন্ন ভিন্ন শূকর থেকে সংগৃহীত; টু-ওয়ে অ্যানোভা (Two-way ANOVA) করা হয়েছে; **p < ০.০১, নরমাল স্ট্রেচের তুলনায়)।স্বাভাবিক এমটি স্ট্রেচ (নর্ম) বা ওভারস্ট্রেচ (ওএস) অবস্থায় কালচার করা হার্ট স্লাইসের কালচার মিডিয়ামে এনটি-প্রোবিএনপি ঘনত্বের পরিমাণগত হিস্টোগ্রাম (বিভিন্ন শূকর থেকে প্রতি গ্রুপে n = ৪ (ডি২ এমটিনর্ম), ৩ (ডি২ এমটিওএস, ডি৪ এমটিনর্ম, এবং ডি৪).এমটিওএস) স্লাইস, দ্বি-উপাদান বৈশ্লেষিক ভেদাঙ্ক বিশ্লেষণ করা হয়েছে;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением)। স্বাভাবিক প্রসারণের তুলনায় p < ০.০১)। একটি 在MT 正常拉伸(নর্ম) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度曢坡離4 (D2 MTNorm) 、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比,p <0.01）। MT নরমাল স্ট্রেচ (নর্ম) বা ওভারস্ট্রেচ (OS) অবস্থার (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) এর অধীনে সংষ্কৃত হার্টের স্লাইসে NT-ProBNP ঘনত্বের পরিমাপ猪的切片/组，可以双向方方发发动;স্বাভাবিক এমটি স্ট্রেচ (নর্ম) বা ওভারস্ট্রেচ (ওএস) অবস্থায় কালচার করা হার্ট স্লাইসে এনটি-প্রোবিএনপি ঘনত্বের হিস্টোগ্রাম পরিমাণ নির্ধারণ (বিভিন্ন শূকর থেকে সংগৃহীত প্রতি গ্রুপে n = ৪ (ডি২ এমটিনর্ম), ৩ (ডি২ এমটিওএস, ডি৪ এমটিনর্ম) এবং ডি৪ এমটিওএস) স্লাইস, দ্বি-মুখী বৈশ্লেষিক ভেদ;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением)। স্বাভাবিক প্রসারণের তুলনায় p < ০.০১)। খ) ট্রোপোনিন-টি এবং ডাব্লিউজিএ দিয়ে রঞ্জিত হৃৎপিণ্ডের স্লাইসের প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র (বামদিকে) এবং কোষের আকার পরিমাপ (ডানদিকে) (বিভিন্ন শূকরের ১০টি ভিন্ন স্লাইস থেকে প্রতি গ্রুপে n = ৩৩০ (ডি৬ এমটিওএস), ৩৬৯ (ডি৬ এমটিনর্ম) কোষ; দ্বিমুখী স্টুডেন্ট টি-টেস্ট করা হয়েছে; ****p < ০.০০০১, স্বাভাবিক প্রসারণের তুলনায়)। খ) ট্রোপোনিন-টি এবং ডাব্লিউজিএ দিয়ে রঞ্জিত হৃৎপিণ্ডের স্লাইসের প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র (বামদিকে) এবং কোষের আকার পরিমাপ (ডানদিকে) (বিভিন্ন শূকরের ১০টি ভিন্ন স্লাইস থেকে প্রতি গ্রুপে n = ৩৩০ (ডি৬ এমটিওএস), ৩৬৯ (ডি৬ এমটিনর্ম) কোষ; দ্বিমুখী স্টুডেন্ট টি-টেস্ট করা হয়েছে; ****p < ০.০০০১, স্বাভাবিক প্রসারণের তুলনায়)। b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) এবং количественного определения разления (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится tовристи Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением)। খ) ট্রোপোনিন-টি এবং এজেডপি দিয়ে রঞ্জিত হৃৎপিণ্ডের অংশের প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র (বামে) এবং কোষের আকারের পরিমাণ নির্ণয় (ডানে) (বিভিন্ন শূকরের ১০টি ভিন্ন অংশ থেকে প্রতিটি গ্রুপে n = ৩৩০ (ডি৬ এমটিওএস), ৩৬৯ (ডি৬ এমটিনর্ম) কোষ; দ্বিমুখী স্টুডেন্ট'স টি-টেস্ট করা হয়েছে; ****পি < ০.০০০১, স্বাভাবিক স্ট্রেইনের তুলনায়)। b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的心脏切片的代表性图n3） MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比,****p <0.0001）। খ) ক্যালকারিন-টি এবং ডাব্লিউজিএ দিয়ে রঞ্জিত হৃৎপিণ্ডের স্লাইসের প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র (বামদিকে) এবং কোষের আকার (ডানদিকে) (এন = ৩৩০ (ডি৬ এমটিওএস), ১০টি ভিন্ন স্লাইস থেকে ৩৬৯টি (ডি৬ এমটিনর্ম)) কোষ/দল, উভয় পদ্ধতিতেই টি-টেস্ট করা হয়েছে; সাধারণ প্রসারণের সাথে তুলনা করে, ****পি < ০.০০০১)। b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размева (30) (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). খ) ট্রোপোনিন-টি এবং এজেডপি দিয়ে রঞ্জিত হৃৎপিণ্ডের অংশের প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র (বামে) এবং কোষের আকারের পরিমাণ নির্ধারণ (ডানে) (n = ৩৩০ (ডি৬ এমটিওএস), ৩৬৯ (ডি৬ এমটিনর্ম), ভিন্ন ভিন্ন শূকরের ১০টি ভিন্ন অংশ থেকে সংগৃহীত) কোষ/দল, দ্বিমুখী মানদণ্ড স্টুডেন্ট'স টি; ****পি < ০.০০০১, স্বাভাবিক স্ট্রেইনের তুলনায়)। গ) ট্রোপোনিন-টি এবং এনএফএটিসি৪-এর জন্য ইমিউনোলেবেল করা ০ এবং ৬ দিনের এমটিওএস হৃৎপিণ্ডের স্লাইসের প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র এবং সিএম-এর নিউক্লিয়াসে এনএফএটিসি৪-এর স্থানান্তরের পরিমাণ নির্ধারণ (ভিন্ন ভিন্ন শূকর থেকে সংগৃহীত প্রতি গ্রুপে n = ৪ (০ দিন), ৩ (৬ দিন) এমটিওএস স্লাইস, দ্বিমুখী স্টুডেন্ট টি-টেস্ট করা হয়েছে; *পি < ০.০৫)। গ) ট্রোপোনিন-টি এবং এনএফএটিসি৪-এর জন্য ইমিউনোলেবেল করা ০ এবং ৬ দিনের এমটিওএস হৃৎপিণ্ডের স্লাইসের প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র এবং সিএম-এর নিউক্লিয়াসে এনএফএটিসি৪-এর স্থানান্তরের পরিমাণ নির্ধারণ (ভিন্ন ভিন্ন শূকর থেকে সংগৃহীত প্রতি গ্রুপে n = ৪ (০ দিন), ৩ (৬ দিন) এমটিওএস স্লাইস, দ্বিমুখী স্টুডেন্ট টি-টেস্ট করা হয়েছে; *পি < ০.০৫)। c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т এবং NFATC4, и конячена срезов сердца ট্র্যান্সলোকাসি NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонть Свиней; 0,05)। গ) ০ এবং ৬ দিন MTOS-এর হৃৎপিণ্ডের অংশের প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র, যা ট্রোপোনিন-টি এবং NFATC4-এর জন্য ইমিউনোলেবেল করা হয়েছে, এবং ক্যাভারনাস কোষের নিউক্লিয়াসে NFATC4 স্থানান্তরের পরিমাণ নির্ধারণ (বিভিন্ন শূকর থেকে সংগৃহীত প্রতি গ্রুপে n = ৪ (D0), ৩ (D6 MTOS) স্লাইস) দ্বিমুখী স্টুডেন্ট'স টি-টেস্টের মাধ্যমে করা হয়েছে; *p < ০.০৫)। c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0) ,3 (D0)进行双尾学生t 检验；*p <0.05)। c বিভিন্ন NFATC4 易位至CM কোষের নিউক্লিয়াসের পরিমাণ 化 (n = 4 (D0) 化 (n = 4 (D0) 化 (n = 4 (D0) 化 第0天和第6天MTOS হৃদপিণ্ডের টুকরো এবং NFATC4 ইমিউনোলেবেলিং 第0天和第6天MTOS হার্ট স্লাইস) এর প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র时间双尾学生et 电影；*p < ০.০৫)। c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и конличевкастев сердца TRANслокации NFATC4 via ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Сть;0pюдей গ) বিভিন্ন শূকরের CM থেকে প্রাপ্ত নিউক্লিয়াসে ট্রোপোনিন-টি এবং NFATC4-এর ইমিউনোলেবেলিং এবং NFATC4-এর ট্রান্সলোকেশন পরিমাপের জন্য ০ এবং ৬ দিনের MTOS হার্ট স্লাইসের প্রতিনিধিত্বমূলক চিত্র (প্রতি গ্রুপে n = ৪ (D0), ৩ (D6 MTOS) স্লাইস, দ্বিমুখী t-ক্রাইটেরিয়ন স্টুডেন্টস; *p < ০.০৫)।ত্রুটি দণ্ডগুলো গড় ± আদর্শ বিচ্যুতি নির্দেশ করে।
ট্রান্সলেশনাল কার্ডিওভাসকুলার গবেষণার জন্য এমন সেলুলার মডেল প্রয়োজন যা হৃৎপিণ্ডের পরিবেশকে নির্ভুলভাবে পুনরুৎপাদন করতে পারে। এই গবেষণায়, একটি CTCM ডিভাইস তৈরি ও এর বৈশিষ্ট্য নিরূপণ করা হয়েছে যা হৃৎপিণ্ডের অতি-পাতলা অংশকে উদ্দীপিত করতে পারে। CTCM সিস্টেমটিতে শারীরবৃত্তীয়ভাবে সমন্বিত ইলেক্ট্রোমেকানিক্যাল স্টিমুলেশন এবং T3 ও Dex ফ্লুইড এনরিচমেন্ট অন্তর্ভুক্ত রয়েছে। যখন শূকরের হৃৎপিণ্ডের অংশগুলিকে এই উপাদানগুলির সংস্পর্শে আনা হয়, তখন ১২ দিন কালচারের পরেও তাদের কার্যক্ষমতা, কাঠামোগত অখণ্ডতা, বিপাকীয় কার্যকলাপ এবং ট্রান্সক্রিপশনাল এক্সপ্রেশন তাজা হৃৎপিণ্ডের টিস্যুর মতোই ছিল। এছাড়াও, কার্ডিয়াক টিস্যুর অতিরিক্ত প্রসারণ হাইপারএক্সটেনশনের কারণে হৃৎপিণ্ডের হাইপারট্রফি ঘটাতে পারে। সামগ্রিকভাবে, এই ফলাফলগুলি একটি স্বাভাবিক কার্ডিয়াক ফেনোটাইপ বজায় রাখার ক্ষেত্রে শারীরবৃত্তীয় কালচার অবস্থার গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকাকে সমর্থন করে এবং ড্রাগ স্ক্রিনিংয়ের জন্য একটি প্ল্যাটফর্ম প্রদান করে।
কার্ডিওমায়োসাইটের কার্যকারিতা এবং বেঁচে থাকার জন্য একটি সর্বোত্তম পরিবেশ তৈরিতে অনেক কারণ অবদান রাখে। এই কারণগুলির মধ্যে সবচেয়ে সুস্পষ্টগুলি হল (১) আন্তঃকোষীয় মিথস্ক্রিয়া, (২) ইলেক্ট্রোমেকানিক্যাল উদ্দীপনা, (৩) হিউমোরাল ফ্যাক্টর, এবং (৪) মেটাবলিক সাবস্ট্রেট। শারীরবৃত্তীয় কোষ-থেকে-কোষ মিথস্ক্রিয়ার জন্য একটি এক্সট্রাসেলুলার ম্যাট্রিক্স দ্বারা সমর্থিত একাধিক কোষের জটিল ত্রিমাত্রিক নেটওয়ার্ক প্রয়োজন। এই ধরনের জটিল কোষীয় মিথস্ক্রিয়া ইন ভিট্রোতে পৃথক কোষের সহ-চাষের মাধ্যমে পুনর্গঠন করা কঠিন, কিন্তু হৃৎপিণ্ডের অংশের অর্গ্যানোটাইপিক প্রকৃতি ব্যবহার করে এটি সহজেই অর্জন করা যায়।
কার্ডিওমায়োসাইটের যান্ত্রিক প্রসারণ এবং বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা কার্ডিয়াক ফেনোটাইপ বজায় রাখার জন্য অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ³³,³⁴,³⁵। যদিও hiPSC-CM কন্ডিশনিং এবং পরিপক্কতার জন্য যান্ত্রিক উদ্দীপনা ব্যাপকভাবে ব্যবহৃত হয়েছে, সম্প্রতি বেশ কিছু চমৎকার গবেষণায় ইউনিঅ্যাক্সিয়াল লোডিং ব্যবহার করে কালচারে থাকা হার্ট স্লাইসের যান্ত্রিক উদ্দীপনা প্রয়োগের চেষ্টা করা হয়েছে। এই গবেষণাগুলো দেখায় যে কালচার চলাকালীন 2D ইউনিঅ্যাক্সিয়াল যান্ত্রিক লোডিং হার্টের ফেনোটাইপের উপর একটি ইতিবাচক প্রভাব ফেলে। এই গবেষণাগুলোতে, হার্টের অংশগুলোকে হয় আইসোমেট্রিক টেনসাইল ফোর্স¹⁷, লিনিয়ার অক্সোটোনিক লোডিং¹⁸ দ্বারা লোড করা হয়েছিল, অথবা ফোর্স ট্রান্সডিউসার ফিডব্যাক এবং টেনশন ড্রাইভ ব্যবহার করে কার্ডিয়াক সাইকেল পুনরায় তৈরি করা হয়েছিল। তবে, এই পদ্ধতিগুলো পরিবেশগত অপ্টিমাইজেশন ছাড়াই ইউনিঅ্যাক্সিয়াল টিস্যু প্রসারণ ব্যবহার করে, যার ফলে অনেক কার্ডিয়াক জিনের দমন ঘটে অথবা অস্বাভাবিক প্রসারণ প্রতিক্রিয়ার সাথে সম্পর্কিত জিনগুলোর অতি-প্রকাশ ঘটে। এখানে বর্ণিত CTCM একটি 3D ইলেক্ট্রোমেকানিক্যাল উদ্দীপনা প্রদান করে যা চক্রের সময় এবং শারীরবৃত্তীয় প্রসারণের (২৫% প্রসারণ, ৪০% সিস্টোল, ৬০% ডায়াস্টোল এবং প্রতি মিনিটে ৭২ বার স্পন্দন) দিক থেকে প্রাকৃতিক কার্ডিয়াক সাইকেলকে অনুকরণ করে। যদিও শুধুমাত্র এই ত্রিমাত্রিক যান্ত্রিক উদ্দীপনা টিস্যুর অখণ্ডতা বজায় রাখার জন্য যথেষ্ট নয়, টিস্যুর সজীবতা, কার্যকারিতা এবং অখণ্ডতা যথাযথভাবে বজায় রাখার জন্য T3/Dex ব্যবহার করে হিউমোরাল ও যান্ত্রিক উদ্দীপনার সমন্বয় প্রয়োজন।
প্রাপ্তবয়স্ক হৃৎপিণ্ডের ফেনোটাইপ পরিবর্তনে হিউমোরাল ফ্যাক্টরগুলো একটি গুরুত্বপূর্ণ ভূমিকা পালন করে। HiPS-CM গবেষণায় এটি বিশেষভাবে লক্ষণীয় ছিল, যেখানে কোষের পরিপক্কতা ত্বরান্বিত করার জন্য কালচার মিডিয়ামে T3 এবং Dex যোগ করা হয়েছিল। T3 কোষ পর্দা জুড়ে অ্যামিনো অ্যাসিড, শর্করা এবং ক্যালসিয়ামের পরিবহনকে প্রভাবিত করতে পারে। এছাড়াও, T3 MHC-α এক্সপ্রেশন এবং MHC-β ডাউনরেগুলেশনকে উৎসাহিত করে, যা ভ্রূণীয় CM-এর স্লো টুইচ মায়োফাইব্রিলের তুলনায় পরিণত কার্ডিওমায়োসাইটে ফাস্ট টুইচ মায়োফাইব্রিল গঠনে সহায়তা করে। হাইপোথাইরয়েড রোগীদের মধ্যে T3-এর ঘাটতির ফলে মায়োফাইব্রিলার ব্যান্ড নষ্ট হয়ে যায় এবং টোন বিকাশের হার কমে যায়। Dex গ্লুকোকর্টিকয়েড রিসেপ্টরের উপর কাজ করে এবং বিচ্ছিন্ন পারফিউজড হৃৎপিণ্ডে মায়োকার্ডিয়াল সংকোচনশীলতা বাড়াতে দেখা গেছে; এই উন্নতি ক্যালসিয়াম ডিপোজিট-চালিত এন্ট্রি (SOCE)-এর উপর প্রভাবের সাথে সম্পর্কিত বলে মনে করা হয়। এছাড়াও, Dex তার রিসেপ্টরের সাথে আবদ্ধ হয়, যা একটি বিস্তৃত আন্তঃকোষীয় প্রতিক্রিয়া সৃষ্টি করে এবং রোগ প্রতিরোধ ক্ষমতা ও প্রদাহকে দমন করে।
আমাদের ফলাফল নির্দেশ করে যে, ভৌত যান্ত্রিক উদ্দীপনা (MS) কন্ট্রোলের (Ctrl) তুলনায় সামগ্রিক কালচার কর্মক্ষমতা উন্নত করেছে, কিন্তু কালচারে ১২ দিন ধরে কার্যক্ষমতা, কাঠামোগত অখণ্ডতা এবং কার্ডিয়াক এক্সপ্রেশন বজায় রাখতে ব্যর্থ হয়েছে। কন্ট্রোলের (Ctrl) তুলনায়, CTCM (MT) কালচারে T3 এবং Dex যোগ করলে কার্যক্ষমতা উন্নত হয় এবং ১২ দিন ধরে তাজা হৃৎপিণ্ডের টিস্যুর মতো একই ট্রান্সক্রিপশন প্রোফাইল, কাঠামোগত অখণ্ডতা এবং বিপাকীয় কার্যকলাপ বজায় থাকে। এছাড়াও, টিস্যু প্রসারণের মাত্রা নিয়ন্ত্রণ করে, STCM ব্যবহার করে একটি হাইপারএক্সটেনশন-প্ররোচিত কার্ডিয়াক হাইপারট্রফি মডেল তৈরি করা হয়েছিল, যা STCM সিস্টেমের বহুমুখিতা প্রদর্শন করে। এটি উল্লেখ্য যে, যদিও কার্ডিয়াক রিমডেলিং এবং ফাইব্রোসিস সাধারণত অক্ষত অঙ্গের সাথে জড়িত, যার সঞ্চালনকারী কোষগুলি উপযুক্ত সাইটোকাইন, সেইসাথে ফ্যাগোসাইটোসিস এবং অন্যান্য রিমডেলিং ফ্যাক্টর সরবরাহ করতে পারে, তবুও হৃৎপিণ্ডের অংশগুলি চাপ এবং আঘাতের প্রতিক্রিয়ায় ফাইব্রোটিক প্রক্রিয়াকে অনুকরণ করতে পারে। মায়োফাইব্রোব্লাস্টে পরিণত হয়। এই কার্ডিয়াক স্লাইস মডেলে এটি পূর্বে মূল্যায়ন করা হয়েছে। উল্লেখ্য যে, ট্যাকিকার্ডিয়া, ব্র্যাডিকার্ডিয়া এবং যান্ত্রিক সংবহন সহায়ক ব্যবস্থা (যান্ত্রিক ভারমুক্ত হৃৎপিণ্ড)-এর মতো বিভিন্ন অবস্থা অনুকরণ করার জন্য চাপ/বৈদ্যুতিক বিস্তার এবং কম্পাঙ্ক পরিবর্তনের মাধ্যমে সিটিসিএম (CTCM) প্যারামিটারগুলো নিয়ন্ত্রণ করা যায়। এটি সিস্টেমটিকে ঔষধ পরীক্ষার জন্য একটি মাঝারি ক্ষমতাসম্পন্ন সিস্টেমে পরিণত করে। অতিরিক্ত পরিশ্রমজনিত কার্ডিয়াক হাইপারট্রফি মডেল করার ক্ষেত্রে সিটিসিএম-এর সক্ষমতা ব্যক্তিগতকৃত চিকিৎসার জন্য এই সিস্টেমটি পরীক্ষার পথ প্রশস্ত করে। পরিশেষে, বর্তমান গবেষণাটি প্রমাণ করে যে কার্ডিয়াক টিস্যু সেকশনের কালচার বজায় রাখার জন্য যান্ত্রিক প্রসারণ এবং হিউমোরাল স্টিমুলেশন অত্যন্ত গুরুত্বপূর্ণ।
যদিও এখানে উপস্থাপিত তথ্য থেকে বোঝা যায় যে অক্ষত মায়োকার্ডিয়ামের মডেলিংয়ের জন্য সিটিসিএম একটি অত্যন্ত সম্ভাবনাময় প্ল্যাটফর্ম, এই কালচার পদ্ধতির কিছু সীমাবদ্ধতা রয়েছে। সিটিসিএম কালচারের প্রধান সীমাবদ্ধতা হলো এটি স্লাইসগুলোর উপর ক্রমাগত গতিশীল যান্ত্রিক চাপ প্রয়োগ করে, যা প্রতিটি চক্রের সময় কার্ডিয়াক স্লাইসের সংকোচন সক্রিয়ভাবে পর্যবেক্ষণ করার ক্ষমতাকে বাধা দেয়। এছাড়াও, কার্ডিয়াক সেকশনের ছোট আকারের (৭ মিমি) কারণে, প্রচলিত ফোর্স সেন্সর ব্যবহার করে কালচার সিস্টেমের বাইরে সিস্টোলিক ফাংশন মূল্যায়ন করার ক্ষমতা সীমিত। বর্তমান পাণ্ডুলিপিতে, আমরা সংকোচনমূলক ফাংশনের সূচক হিসেবে অপটিক্যাল ভোল্টেজ মূল্যায়ন করে এই সীমাবদ্ধতা আংশিকভাবে কাটিয়ে উঠেছি। তবে, এই সীমাবদ্ধতার জন্য আরও গবেষণার প্রয়োজন হবে এবং ভবিষ্যতে কালচারে থাকা হার্ট স্লাইসের ফাংশন অপটিক্যালি পর্যবেক্ষণের পদ্ধতি, যেমন ক্যালসিয়াম এবং ভোল্টেজ-সংবেদনশীল ডাই ব্যবহার করে অপটিক্যাল ম্যাপিং প্রবর্তনের মাধ্যমে এর সমাধান করা যেতে পারে। সিটিসিএম-এর আরেকটি সীমাবদ্ধতা হলো এই ওয়ার্কিং মডেলটি শারীরবৃত্তীয় চাপ (প্রিলোড এবং আফটারলোড) নিয়ন্ত্রণ করে না। সিটিসিএম-এ, খুব বড় টিস্যুতে ডায়াস্টোল (পূর্ণ প্রসারণ) এবং সিস্টোলে (বৈদ্যুতিক উদ্দীপনার সময় সংকোচনের দৈর্ঘ্য) ২৫% শারীরবৃত্তীয় প্রসারণ পুনরুৎপাদন করার জন্য বিপরীত দিকে চাপ প্রয়োগ করা হয়েছিল। ভবিষ্যতের সিটিসিএম ডিজাইনগুলিতে উভয় দিক থেকে কার্ডিয়াক টিস্যুর উপর পর্যাপ্ত চাপ প্রয়োগ করে এবং হৃৎপিণ্ডের প্রকোষ্ঠগুলিতে বিদ্যমান সঠিক চাপ-আয়তন সম্পর্ক প্রয়োগের মাধ্যমে এই সীমাবদ্ধতা দূর করা উচিত।
এই পাণ্ডুলিপিতে বর্ণিত অতিরিক্ত প্রসারণ-প্ররোচিত পুনর্গঠন শুধুমাত্র হাইপারট্রফিক হাইপারস্ট্রেচ সংকেত অনুকরণের মধ্যেই সীমাবদ্ধ। সুতরাং, এই মডেলটি হিউমোরাল বা নিউরাল ফ্যাক্টরের (যা এই সিস্টেমে বিদ্যমান নেই) প্রয়োজন ছাড়াই প্রসারণ-প্ররোচিত হাইপারট্রফিক সিগন্যালিং অধ্যয়নে সহায়তা করতে পারে। CTCM-এর সংখ্যাবৃদ্ধি করার জন্য আরও গবেষণার প্রয়োজন রয়েছে; উদাহরণস্বরূপ, ইমিউন কোষের সাথে সহ-চাষ, সঞ্চালনশীল প্লাজমা হিউমোরাল ফ্যাক্টর এবং নিউরোনাল কোষের সাথে সহ-চাষের সময় ইননারভেশন CTCM দ্বারা রোগ মডেলিংয়ের সম্ভাবনাকে উন্নত করবে।
এই গবেষণায় তেরোটি শূকর ব্যবহার করা হয়েছিল। প্রাণীদের উপর সমস্ত পদ্ধতি প্রাতিষ্ঠানিক নির্দেশিকা অনুসারে সম্পাদিত হয়েছিল এবং ইউনিভার্সিটি অফ লুইসভিল ইনস্টিটিউশনাল অ্যানিমেল কেয়ার অ্যান্ড ইউজ কমিটি কর্তৃক অনুমোদিত ছিল। অ্যাওর্টিক আর্চ ক্ল্যাম্প করা হয়েছিল এবং হৃৎপিণ্ডকে ১ লিটার জীবাণুমুক্ত কার্ডিওপ্লেজিয়া (১১০ mM NaCl, ১.২ mM CaCl2, ১৬ mM KCl, ১৬ mM MgCl2, ১০ mM NaHCO3, ৫ U/mL হেপারিন, pH ৭.৪ পর্যন্ত) দিয়ে পারফিউজ করা হয়েছিল; হৃৎপিণ্ডগুলোকে বরফ-ঠান্ডা কার্ডিওপ্লেজিক দ্রবণে সংরক্ষণ করা হয়েছিল এবং বরফের উপর রেখে পরীক্ষাগারে পরিবহন করতে সাধারণত ১০ মিনিটেরও কম সময় লাগে। হৃৎপিণ্ডগুলোকে বরফ-ঠান্ডা কার্ডিওপ্লেজিক দ্রবণে সংরক্ষণ করা হয়েছিল এবং বরফের উপর রেখে পরীক্ষাগারে পরিবহন করতে সাধারণত ১০ মিনিটেরও কম সময় লাগে। сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. হৃৎপিণ্ডগুলোকে পরীক্ষাগারে বরফের উপর পরিবহন করার আগ পর্যন্ত বরফ-ঠান্ডা কার্ডিওপ্লেজিক দ্রবণে সংরক্ষণ করা হয়েছিল, যাতে সাধারণত ১০ মিনিটেরও কম সময় লাগে।将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟. Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min. ল্যাবরেটরিতে পরিবহনের আগ পর্যন্ত হৃৎপিণ্ডগুলোকে কার্ডিওপ্লেজিয়া পদ্ধতিতে বরফের উপর রাখুন, সাধারণত ১০ মিনিটেরও কম সময় লাগে।
সিটিসিএম ডিভাইসটি সলিডওয়ার্কস কম্পিউটার-এইডেড ডিজাইন (CAD) সফটওয়্যারে তৈরি করা হয়েছে। কালচার চেম্বার, ডিভাইডার এবং এয়ার চেম্বারগুলো সিএনসি ক্লিয়ার অ্যাক্রিলিক প্লাস্টিক দিয়ে তৈরি। ৭ মিমি ব্যাসের ব্যাক-আপ রিংটির কেন্দ্রে উচ্চ ঘনত্বের পলিইথিলিন (HDPE) রয়েছে এবং এর নিচে মিডিয়া সিল করার জন্য ব্যবহৃত সিলিকন ও-রিং বসানোর জন্য একটি ও-রিং খাঁজ আছে। একটি পাতলা সিলিকা মেমব্রেন কালচার চেম্বারকে সেপারেশন প্লেট থেকে আলাদা করে। সিলিকন মেমব্রেনটি ০.০২ ইঞ্চি পুরু সিলিকন শিট থেকে লেজার কাটিংয়ের মাধ্যমে তৈরি এবং এর কাঠিন্য ৩৫এ। নিচের ও উপরের সিলিকন গ্যাসকেটগুলো ১/১৬ ইঞ্চি পুরু সিলিকন শিট থেকে লেজার কাটিংয়ের মাধ্যমে তৈরি এবং এর কাঠিন্য ৫০এ। ব্লকটি আটকানো এবং একটি বায়ুরোধী সিল তৈরির জন্য ৩১৬এল স্টেইনলেস স্টিলের স্ক্রু এবং উইং নাট ব্যবহার করা হয়।
C-PACE-EM সিস্টেমের সাথে সমন্বিত করার জন্য একটি বিশেষ প্রিন্টেড সার্কিট বোর্ড (PCB) ডিজাইন করা হয়েছে। PCB-তে থাকা সুইস মেশিন কানেক্টর সকেটগুলো রুপার প্রলেপযুক্ত তামার তার এবং ইলেকট্রোডে লাগানো ব্রোঞ্জের ০-৬০ স্ক্রু দ্বারা গ্রাফাইট ইলেকট্রোডের সাথে সংযুক্ত থাকে। প্রিন্টেড সার্কিট বোর্ডটি ৩ডি প্রিন্টারের কভারে রাখা হয়।
সিটিসিএম ডিভাইসটি একটি প্রোগ্রামেবল নিউম্যাটিক অ্যাকচুয়েটর (পিপিডি) দ্বারা নিয়ন্ত্রিত হয়, যা হৃদচক্রের অনুরূপ একটি নিয়ন্ত্রিত সঞ্চালন চাপ তৈরি করে। এয়ার চেম্বারের ভেতরের চাপ বাড়ার সাথে সাথে, নমনীয় সিলিকন মেমব্রেনটি উপরের দিকে প্রসারিত হয়ে টিস্যুর নিচের মাধ্যমটিকে ঠেলে বের করে দেয়। এরপর এই তরল নির্গমনের ফলে টিস্যুর ওই অংশটি প্রসারিত হয়, যা ডায়াস্টোলের সময় হৃৎপিণ্ডের শারীরবৃত্তীয় প্রসারণের অনুকরণ করে। শিথিলতার সর্বোচ্চ পর্যায়ে, গ্রাফাইট ইলেকট্রোডের মাধ্যমে বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা প্রয়োগ করা হয়, যা এয়ার চেম্বারের চাপ কমিয়ে দেয় এবং টিস্যুর অংশগুলোর সংকোচন ঘটায়। পাইপের ভেতরে একটি হিমোস্ট্যাটিক ভালভ রয়েছে, যার সাথে একটি প্রেশার সেন্সর সংযুক্ত থাকে, যা এয়ার সিস্টেমের চাপ শনাক্ত করে। প্রেশার সেন্সর দ্বারা অনুভূত চাপটি ল্যাপটপের সাথে সংযুক্ত একটি ডেটা কালেক্টরে পাঠানো হয়। এর ফলে গ্যাস চেম্বারের ভেতরের চাপ ক্রমাগত পর্যবেক্ষণ করা সম্ভব হয়। যখন চেম্বারের সর্বোচ্চ চাপে পৌঁছানো হয় (প্রমিত ৮০ mmHg, ১৪০ mmHg OS), তখন ডেটা অ্যাকুইজিশন ডিভাইসকে C-PACE-EM সিস্টেমে একটি সংকেত পাঠানোর নির্দেশ দেওয়া হয়, যাতে ২ মিলিসেকেন্ডের জন্য ৪ ভোল্টে সেট করা একটি বাইফেজিক ভোল্টেজ সংকেত তৈরি হয়।
হৃৎপিণ্ডের অংশ সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং ৬টি ওয়েলে নিম্নলিখিতভাবে কালচার করা হয়েছিল: সংগৃহীত হৃৎপিণ্ডগুলোকে ট্রান্সফার ভেসেল থেকে ঠান্ডা (৪° সে.) কার্ডিওপ্লেজিয়াযুক্ত একটি ট্রে-তে স্থানান্তর করা হয়। একটি জীবাণুমুক্ত ব্লেড দিয়ে বাম নিলয়কে আলাদা করে ১-২ ঘন সেন্টিমিটারের টুকরো করে কাটা হয়। এই টিস্যু ব্লকগুলোকে টিস্যু আঠা দিয়ে টিস্যু সাপোর্টের সাথে সংযুক্ত করে একটি ভাইব্রেটিং মাইক্রোটোম টিস্যু বাথে রাখা হয়, যেখানে টাইরোডের দ্রবণ ছিল এবং ক্রমাগত অক্সিজেন সরবরাহ করা হচ্ছিল (৩ গ্রাম/লিটার ২,৩-বিউটানেডিওন মনোঅক্সিম (বিডিএম), ১৪০ মিলিমিটার সোডিয়াম ক্লোরাইড (৮.১৮ গ্রাম), ৬ মিলিমিটার পটাশিয়াম ক্লোরাইড (০.৪৪৭ গ্রাম), ১০ মিলিমিটার ডি-গ্লুকোজ (১.৮৬ গ্রাম), ১০ মিলিমিটার এইচইপিইএস (২.৩৮ গ্রাম), ১ মিলিমিটার ম্যাগনেসিয়াম ক্লোরাইড (১ মিলি ১ মোলার দ্রবণ), ১.৮ মিলিমিটার ক্যালসিয়াম ক্লোরাইড (১.৮ মিলি ১ মোলার দ্রবণ), যা ১ লিটার পর্যন্ত ডিডিএইচ২ও)। ভাইব্রেটিং মাইক্রোটোমটি ৮০ হার্জ কম্পাঙ্ক, ২ মিমি আনুভূমিক কম্পন বিস্তার এবং ০.০৩ মিমি/সেকেন্ড অগ্রগমন হারে ৩০০ µm পুরু স্লাইস কাটার জন্য সেট করা হয়েছিল। দ্রবণটিকে ঠান্ডা রাখার জন্য টিস্যু বাথটি বরফ দিয়ে ঘিরে রাখা হয়েছিল এবং তাপমাত্রা ৪° সেলসিয়াসে বজায় রাখা হয়েছিল। একটি কালচার প্লেটের জন্য পর্যাপ্ত সেকশন না পাওয়া পর্যন্ত মাইক্রোটোম বাথ থেকে টিস্যু সেকশনগুলিকে বরফের উপর রাখা একটি ইনকিউবেশন বাথে স্থানান্তর করুন, যেখানে ক্রমাগত অক্সিজেনযুক্ত টাইরোড দ্রবণ ছিল। ট্রান্সওয়েল কালচারের জন্য, টিস্যু সেকশনগুলিকে জীবাণুমুক্ত ৬ মিমি চওড়া পলিইউরেথেন সাপোর্টের সাথে সংযুক্ত করা হয়েছিল এবং ৬ মিলি অপ্টিমাইজড মিডিয়ামে (১৯৯ মিডিয়াম, ১x আইটিএস সাপ্লিমেন্ট, ১০% এফবিএস, ৫ ন্যানোগ্রাম/মিলি ভিইজিএফ, ১০ ন্যানোগ্রাম/মিলি এফজিএফ-অ্যালকালাইন এবং ২x অ্যান্টিবায়োটিক-অ্যান্টিফাঙ্গাল) রাখা হয়েছিল। সি-পেজের মাধ্যমে টিস্যু সেকশনগুলিতে বৈদ্যুতিক উদ্দীপনা (১০ ভোল্ট, কম্পাঙ্ক ১.২ হার্জ) প্রয়োগ করা হয়েছিল। TD অবস্থার জন্য, প্রতিবার মিডিয়াম পরিবর্তনের সময় ১০০ nM এবং ১ μM মাত্রায় নতুন T3 এবং Dex যোগ করা হয়েছিল। দিনে ৩ বার মিডিয়াম প্রতিস্থাপনের আগে এটিকে অক্সিজেন দ্বারা সম্পৃক্ত করা হয়। টিস্যু সেকশনগুলো একটি ইনকিউবেটরে ৩৭°C তাপমাত্রা এবং ৫% CO2-তে কালচার করা হয়েছিল।
সিটিসিএম কালচারের জন্য, টিস্যু সেকশনগুলোকে একটি বিশেষভাবে তৈরি থ্রিডি প্রিন্টারে, পরিবর্তিত টাইরোড দ্রবণযুক্ত একটি পেট্রি ডিশে রাখা হয়েছিল। ডিভাইসটি এমনভাবে ডিজাইন করা হয়েছে যাতে সাপোর্ট রিং-এর ক্ষেত্রফলের ২৫% দ্বারা হৃৎপিণ্ডের স্লাইসের আকার বৃদ্ধি পায়। এটি করা হয় যাতে হৃৎপিণ্ডের সেকশনগুলো টাইরোড দ্রবণ থেকে মিডিয়ামে স্থানান্তরের পর এবং ডায়াস্টোলের সময় প্রসারিত না হয়। হিস্টোঅ্যাক্রাইলিক আঠা ব্যবহার করে, ৩০০ µm পুরু সেকশনগুলোকে ৭ মিমি ব্যাসের একটি সাপোর্ট রিং-এ স্থির করা হয়েছিল। টিস্যু সেকশনগুলোকে সাপোর্ট রিং-এ সংযুক্ত করার পর, অতিরিক্ত টিস্যু সেকশনগুলো কেটে ফেলা হয় এবং একটি ডিভাইসের জন্য পর্যাপ্ত সেকশন প্রস্তুত না হওয়া পর্যন্ত সংযুক্ত টিস্যু সেকশনগুলোকে বরফের উপর (৪°সে.) টাইরোড দ্রবণের পাত্রে ফিরিয়ে রাখা হয়। সমস্ত ডিভাইসের জন্য মোট প্রক্রিয়াকরণের সময় ২ ঘণ্টার বেশি হওয়া উচিত নয়। ৬টি টিস্যু সেকশন তাদের সাপোর্ট রিং-এ সংযুক্ত করার পর, সিটিসিএম ডিভাইসটি একত্রিত করা হয়েছিল। সিটিসিএম কালচার চেম্বারটি ২১ মিলি প্রাক-অক্সিজেনযুক্ত মিডিয়াম দিয়ে আগে থেকেই পূর্ণ করা থাকে। টিস্যু সেকশনগুলো কালচার চেম্বারে স্থানান্তর করুন এবং একটি পিপেট দিয়ে সাবধানে যেকোনো বায়ু বুদবুদ বের করে দিন। এরপর টিস্যু সেকশনটিকে গর্তের মধ্যে প্রবেশ করানো হয় এবং আলতো করে চেপে যথাস্থানে বসানো হয়। সবশেষে, ডিভাইসের উপর ইলেকট্রোড ক্যাপটি রাখুন এবং ডিভাইসটিকে ইনকিউবেটরে স্থানান্তর করুন। তারপর CTCM-কে এয়ার টিউব এবং C-PACE-EM সিস্টেমের সাথে সংযুক্ত করুন। নিউম্যাটিক অ্যাকচুয়েটরটি খোলে এবং এয়ার ভালভটি CTCM-কে খুলে দেয়। C-PACE-EM সিস্টেমটিকে ২ মিলিসেকেন্ডের জন্য বাইফেজিক পেসিং চলাকালীন ১.২ হার্জে ৪ ভোল্ট সরবরাহ করার জন্য কনফিগার করা হয়েছিল। ইলেকট্রোডের উপর গ্রাফাইট জমা হওয়া এড়ানোর জন্য দিনে দুবার মিডিয়াম এবং দিনে একবার ইলেকট্রোড পরিবর্তন করা হতো। প্রয়োজনে, টিস্যু সেকশনগুলোর নিচে জমে থাকা যেকোনো বায়ু বুদবুদ বের করে দেওয়ার জন্য সেগুলোকে তাদের কালচার ওয়েল থেকে বের করে আনা যেতে পারে। MT ট্রিটমেন্টের শর্তগুলোর জন্য, প্রতিটি মিডিয়াম পরিবর্তনের সাথে ১০০ nM T3 এবং ১ μM Dex সহ নতুন করে T3/Dex যোগ করা হয়েছিল। CTCM ডিভাইসগুলোকে একটি ইনকিউবেটরে ৩৭°C তাপমাত্রা এবং ৫% CO2-তে কালচার করা হয়েছিল।
হৃৎপিণ্ডের স্লাইসগুলোর প্রসারিত গতিপথ পাওয়ার জন্য একটি বিশেষ ক্যামেরা সিস্টেম তৈরি করা হয়েছিল। একটি SLR ক্যামেরা (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) একটি Navitar Zoom 7000 18-108mm ম্যাক্রো লেন্সের (Navitar, San Francisco, CA) সাথে ব্যবহার করা হয়েছিল। মিডিয়াম পরিবর্তন করে নতুন মিডিয়াম দেওয়ার পর ঘরের স্বাভাবিক তাপমাত্রায় ভিজ্যুয়ালাইজেশন করা হয়েছিল। ক্যামেরাটি ৫১° কোণে স্থাপন করা হয় এবং প্রতি সেকেন্ডে ৩০ ফ্রেমে ভিডিও রেকর্ড করা হয়। প্রথমে, হৃৎপিণ্ডের স্লাইসগুলোর গতি পরিমাপ করার জন্য Image-J-এর সাথে ওপেন সোর্স সফটওয়্যার (MUSCLEMOTION43) ব্যবহার করা হয়েছিল। নয়েজ এড়ানোর জন্য স্পন্দনরত হৃৎপিণ্ডের স্লাইসগুলোর আগ্রহের অঞ্চল (regions of interest) নির্ধারণ করতে MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) ব্যবহার করে মাস্ক তৈরি করা হয়েছিল। ম্যানুয়ালি সেগমেন্ট করা মাস্কগুলো একটি ফ্রেম সিকোয়েন্সের সমস্ত ছবিতে প্রয়োগ করা হয় এবং তারপর MUSCLEMOTION প্লাগ-ইন-এ পাঠানো হয়। Muscle Motion প্রতিটি ফ্রেমের পিক্সেলের গড় তীব্রতা ব্যবহার করে রেফারেন্স ফ্রেমের সাপেক্ষে এর গতি পরিমাপ করে। হৃদচক্র চলাকালীন চক্রের সময় পরিমাপ করতে এবং টিস্যুর প্রসারণ মূল্যায়ন করতে ডেটা রেকর্ড, ফিল্টার এবং ব্যবহার করা হয়েছিল। রেকর্ড করা ভিডিওটি একটি প্রথম-ক্রমের জিরো-ফেজ ডিজিটাল ফিল্টার ব্যবহার করে পোস্ট-প্রসেস করা হয়েছিল। টিস্যুর প্রসারণ (পিক-টু-পিক) পরিমাপ করার জন্য, রেকর্ড করা সিগন্যালের চূড়া এবং নিম্নবিন্দুগুলোর মধ্যে পার্থক্য করতে পিক-টু-পিক বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। এছাড়াও, সিগন্যাল ড্রিফট দূর করার জন্য একটি ৬ষ্ঠ-ক্রমের পলিনোমিয়াল ব্যবহার করে ডিট্রেন্ডিং করা হয়। সামগ্রিক টিস্যু গতি, চক্রের সময়, শিথিলতার সময় এবং সংকোচনের সময় নির্ধারণ করার জন্য MATLAB-এ প্রোগ্রাম কোড তৈরি করা হয়েছিল (পরিপূরক প্রোগ্রাম কোড ৪৪)।
স্ট্রেইন বিশ্লেষণের জন্য, যান্ত্রিক প্রসারণ মূল্যায়নের জন্য তৈরি করা একই ভিডিওগুলো ব্যবহার করে, আমরা প্রথমে MUSCLEMOTION সফটওয়্যার অনুসারে গতির শীর্ষবিন্দু (গতির সর্বোচ্চ (উপরের) এবং সর্বনিম্ন (নীচের) বিন্দু) প্রতিনিধিত্বকারী দুটি চিত্র ট্রেস করেছি। এরপর আমরা টিস্যু অঞ্চলগুলোকে সেগমেন্ট করেছি এবং সেগমেন্ট করা টিস্যুর উপর এক ধরনের শেডিং অ্যালগরিদম প্রয়োগ করেছি (পরিপূরক চিত্র ২ক)। এরপর সেগমেন্ট করা টিস্যুটিকে দশটি উপ-পৃষ্ঠে বিভক্ত করা হয়েছিল, এবং নিম্নলিখিত সমীকরণ ব্যবহার করে প্রতিটি পৃষ্ঠের উপর পীড়ন গণনা করা হয়েছিল: স্ট্রেইন = (Sup-Sdown)/Sdown, যেখানে Sup এবং Sdown হলো যথাক্রমে কাপড়ের উপরের এবং নীচের ছায়া থেকে আকৃতিটির দূরত্ব (পরিপূরক চিত্র ২খ)।
হৃৎপিণ্ডের অংশগুলো ৪৮ ঘণ্টার জন্য ৪% প্যারাফর্মালডিহাইডে স্থির করা হয়েছিল। স্থিরকৃত টিস্যুগুলোকে ১ ঘণ্টার জন্য ১০% ও ২০% সুক্রোজে এবং তারপর সারারাতের জন্য ৩০% সুক্রোজে পানিশূন্য করা হয়েছিল। এরপর অংশগুলোকে অপটিমাম কাটিং টেম্পারেচার কম্পাউন্ড (OCT কম্পাউন্ড)-এ স্থাপন করা হয় এবং একটি আইসোপেন্টেন/ড্রাই আইস বাথে ধীরে ধীরে হিমায়িত করা হয়। পৃথকীকরণের আগ পর্যন্ত OCT এমবেডিং ব্লকগুলোকে -৮০ °C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করুন। ৮ μm পুরুত্বের অংশ হিসেবে স্লাইড প্রস্তুত করা হয়েছিল।
হৃৎপিণ্ডের অংশ থেকে OCT অপসারণ করতে, স্লাইডগুলিকে একটি হিটিং ব্লকে ৯৫ °C তাপমাত্রায় ৫ মিনিটের জন্য গরম করুন। প্রতিটি স্লাইডে ১ মিলি PBS যোগ করুন এবং ঘরের তাপমাত্রায় ৩০ মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করুন, তারপর ঘরের তাপমাত্রায় ১৫ মিনিটের জন্য PBS-এ ০.১% Triton-X সেট করে অংশগুলিকে পারমিয়েট করুন। নমুনার সাথে নন-স্পেসিফিক অ্যান্টিবডির সংযুক্তি রোধ করতে, স্লাইডগুলিতে ১ মিলি ৩% BSA দ্রবণ যোগ করুন এবং ঘরের তাপমাত্রায় ১ ঘন্টার জন্য ইনকিউবেট করুন। এরপর BSA অপসারণ করা হয় এবং স্লাইডগুলি PBS দিয়ে ধুয়ে ফেলা হয়। প্রতিটি নমুনা পেন্সিল দিয়ে চিহ্নিত করুন। প্রাইমারি অ্যান্টিবডি (১% BSA-তে ১:২০০ অনুপাতে মিশ্রিত) (কনেক্সিন ৪৩ (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) এবং ট্রোপোনিন-টি (Thermo Scientific; #MA5-12960)) ৯০ মিনিট ধরে যোগ করা হয়েছিল, তারপর মাউস অ্যালেক্সা ফ্লুর ৪৮৮ (Thermo Scientific; #A16079) এবং র‍্যাবিট অ্যালেক্সা ফ্লুর ৫৯৪ (Thermo Scientific; #T6391)-এর বিরুদ্ধে সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি (১% BSA-তে ১:২০০ অনুপাতে মিশ্রিত) অতিরিক্ত ৯০ মিনিটের জন্য যোগ করা হয়েছিল। PBS দিয়ে ৩ বার ধোয়া হয়েছিল। ব্যাকগ্রাউন্ড থেকে টার্গেট স্টেইনিং আলাদা করার জন্য, আমরা কন্ট্রোল হিসেবে শুধুমাত্র সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি ব্যবহার করেছি। সবশেষে, DAPI নিউক্লিয়ার স্টেইন যোগ করা হয়েছিল এবং স্লাইডগুলো একটি ভেকটাশিল্ডে (Vector Laboratories) রেখে নেইল পলিশ দিয়ে সিল করা হয়েছিল। -x বিবর্ধন) এবং ৪০x বিবর্ধনসহ কিয়েন্স মাইক্রোস্কোপ।
WGA স্টেইনিং-এর জন্য PBS-এ ৫ μg/ml ঘনত্বের WGA-অ্যালেক্সা ফ্লুর 555 (থার্মো সায়েন্টিফিক; #W32464) ব্যবহার করা হয়েছিল এবং এটি স্থিরীকৃত সেকশনগুলিতে কক্ষ তাপমাত্রায় ৩০ মিনিটের জন্য প্রয়োগ করা হয়। এরপর স্লাইডগুলি PBS দিয়ে ধুয়ে প্রতিটি স্লাইডে সুদান ব্ল্যাক যোগ করে ৩০ মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়। এরপর স্লাইডগুলি PBS দিয়ে ধুয়ে ভেকটাশিল্ড এমবেডিং মিডিয়াম যোগ করা হয়। স্লাইডগুলি একটি কিয়েন্স মাইক্রোস্কোপে ৪০x বিবর্ধনে পর্যবেক্ষণ করা হয়।
উপরে বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে নমুনাগুলো থেকে OCT অপসারণ করা হয়েছিল। OCT অপসারণের পর, স্লাইডগুলোকে সারারাত Bouin's solution-এ ডুবিয়ে রাখা হয়। এরপর স্লাইডগুলোকে ১ ঘণ্টা ধরে পাতিত জল দিয়ে ধুয়ে ১০ মিনিটের জন্য একটি Bibrich aloe acid fuchsin solution-এ রাখা হয়। তারপর স্লাইডগুলোকে পাতিত জল দিয়ে ধুয়ে ১০ মিনিটের জন্য 5% phosphomolybdenum/5% phosphotungstic acid-এর একটি দ্রবণে রাখা হয়। না ধুয়ে, স্লাইডগুলোকে সরাসরি ১৫ মিনিটের জন্য aniline blue solution-এ স্থানান্তর করা হয়। এরপর স্লাইডগুলোকে পাতিত জল দিয়ে ধুয়ে ২ মিনিটের জন্য একটি 1% acetic acid solution-এ রাখা হয়। স্লাইডগুলোকে 200 N ethanol-এ শুকানো হয় এবং xylene-এ স্থানান্তর করা হয়। রঞ্জিত স্লাইডগুলোকে একটি 10x অবজেক্টিভসহ Keyence microscope ব্যবহার করে পর্যবেক্ষণ করা হয়। ফাইব্রোসিস এলাকার শতাংশ Keyence Analyzer সফটওয়্যার ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়।
CyQUANT™ MTT সেল ভায়াবিলিটি অ্যাসে (ইনভিট্রোজেন, কার্লসবাড, সিএ), ক্যাটালগ নম্বর V13154, প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুযায়ী কিছু পরিবর্তন সহ ব্যবহার করা হয়েছে। বিশেষত, MTT বিশ্লেষণের সময় টিস্যুর আকার অভিন্ন রাখার জন্য ৬ মিমি ব্যাসের একটি সার্জিক্যাল পাঞ্চ ব্যবহার করা হয়েছিল। প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুযায়ী টিস্যুগুলোকে MTT সাবস্ট্রেটযুক্ত একটি ১২-ওয়েল প্লেটের ওয়েলগুলোতে আলাদাভাবে স্থাপন করা হয়েছিল। সেকশনগুলোকে ৩৭° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় ৩ ঘন্টা ইনকিউবেট করা হয় এবং জীবন্ত টিস্যু MTT সাবস্ট্রেটকে মেটাবোলাইজ করে একটি বেগুনি ফরমেজ্যান যৌগ তৈরি করে। হার্টের সেকশন থেকে বেগুনি ফরমেজ্যান নিষ্কাশনের জন্য MTT দ্রবণের পরিবর্তে ১ মিলি DMSO ব্যবহার করে ৩৭° সেলসিয়াস তাপমাত্রায় ১৫ মিনিট ইনকিউবেট করা হয়। নমুনাগুলোকে ৯৬-ওয়েল ক্লিয়ার বটম প্লেটে DMSO-তে ১:১০ অনুপাতে লঘু করা হয়েছিল এবং একটি সাইটেশন প্লেট রিডার (বায়োটেক) ব্যবহার করে ৫৭০ nm-এ বেগুনি রঙের তীব্রতা পরিমাপ করা হয়েছিল। প্রাপ্ত রিডিংগুলোকে হার্টের প্রতিটি স্লাইসের ওজনের সাথে স্বাভাবিক করা হয়েছিল।
পূর্বে বর্ণিত পদ্ধতি অনুসারে গ্লুকোজ ব্যবহার পরীক্ষার জন্য হার্ট স্লাইস মিডিয়ার পরিবর্তে ১ μCi/ml [5-3H]-গ্লুকোজ (মোরাভেক বায়োকেমিক্যালস, ব্রেয়া, সিএ, ইউএসএ) যুক্ত মিডিয়া ব্যবহার করা হয়েছিল। ৪ ঘন্টা ইনকিউবেশনের পর, ১০০ µl ০.২ N HCl যুক্ত একটি খোলা মাইক্রোসেন্ট্রিফিউজ টিউবে ১০০ µl মিডিয়া যোগ করা হয়। এরপর টিউবটিকে ৩৭°C তাপমাত্রায় ৭২ ঘন্টা ধরে [3H]2O বাষ্পীভূত করার জন্য ৫০০ μl dH2O যুক্ত একটি সিন্টিলেশন টিউবে রাখা হয়। তারপর মাইক্রোসেন্ট্রিফিউজ টিউবটি সিন্টিলেশন টিউব থেকে বের করে ১০ ml সিন্টিলেশন ফ্লুইড যোগ করা হয়। সিন্টিলেশন গণনাগুলো একটি ট্রাই-কার্ব ২৯০০টিআর লিকুইড সিন্টিলেশন অ্যানালাইজার (প্যাকার্ড বায়োসায়েন্স কোম্পানি, মেরিডেন, সিটি, ইউএসএ) ব্যবহার করে সম্পন্ন করা হয়েছিল। এরপর [5-3H]-গ্লুকোজের নির্দিষ্ট সক্রিয়তা, অসম্পূর্ণ সাম্যাবস্থা ও ব্যাকগ্রাউন্ড, লেবেলবিহীন গ্লুকোজে [5-3H]-এর লঘুকরণ এবং সিন্টিলেশন কাউন্টারের কার্যকারিতা বিবেচনা করে গ্লুকোজ ব্যবহারের পরিমাণ গণনা করা হয়েছিল। প্রাপ্ত ডেটা হৃৎপিণ্ডের বিভিন্ন অংশের ভরের সাপেক্ষে স্বাভাবিকীকরণ করা হয়েছে।
ট্রাইজলে টিস্যু হোমোজিনাইজেশনের পর, প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুযায়ী কায়াজেন মিআরনিজি মাইক্রো কিট #২১০৮৭৪ ব্যবহার করে হৃৎপিণ্ডের অংশ থেকে আরএনএ পৃথক করা হয়েছিল। আরএনএসেক লাইব্রেরি প্রস্তুতি, সিকোয়েন্সিং এবং ডেটা বিশ্লেষণ নিম্নরূপে সম্পন্ন করা হয়েছিল:
আরএনএ লাইব্রেরি তৈরির জন্য প্রাথমিক উপাদান হিসেবে প্রতিটি নমুনা থেকে ১ মাইক্রোগ্রাম আরএনএ ব্যবহার করা হয়েছিল। প্রস্তুতকারকের সুপারিশ অনুসরণ করে ইলুমিনার জন্য NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit (NEB, USA) ব্যবহার করে সিকোয়েন্সিং লাইব্রেরি তৈরি করা হয়েছিল এবং প্রতিটি নমুনার অ্যাট্রিবিউট সিকোয়েন্সে ইনডেক্স কোড যুক্ত করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, পলি-টি অলিগোনিউক্লিওটাইড সংযুক্ত ম্যাগনেটিক বিডস ব্যবহার করে মোট আরএনএ থেকে mRNA বিশুদ্ধ করা হয়েছিল। NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X)-এ উচ্চ তাপমাত্রায় দ্বিযোজী ক্যাটায়ন ব্যবহার করে ফ্র্যাগমেন্টেশন সম্পন্ন করা হয়। র‍্যান্ডম হেক্সামার প্রাইমার এবং M-MuLV রিভার্স ট্রান্সক্রিপ্টেজ (RNase H-) ব্যবহার করে ফার্স্ট স্ট্র্যান্ড সিডিএনএ সংশ্লেষণ করা হয়েছিল। এরপর ডিএনএ পলিমারেজ I এবং RNase H ব্যবহার করে সেকেন্ড স্ট্র্যান্ড সিডিএনএ সংশ্লেষণ করা হয়। অবশিষ্ট ওভারহ্যাংগুলোকে এক্সোনিউক্লিয়েজ/পলিমারেজ ক্রিয়ার মাধ্যমে ব্লান্ট এন্ডে রূপান্তরিত করা হয়। ডিএনএ খণ্ডের ৩' প্রান্তের অ্যাডেনাইলেশনের পর, হাইব্রিডাইজেশনের জন্য প্রস্তুত করতে এর সাথে একটি হেয়ারপিন লুপ কাঠামোযুক্ত NEBNext অ্যাডাপ্টার সংযুক্ত করা হয়। ১৫০-২০০ bp পছন্দের দৈর্ঘ্যের cDNA খণ্ড নির্বাচনের জন্য, AMPure XP সিস্টেম (বেকম্যান কুলটার, বেভারলি, ইউএসএ) ব্যবহার করে লাইব্রেরি খণ্ডগুলোকে বিশুদ্ধ করা হয়েছিল। তারপর, PCR-এর আগে, অ্যাডাপ্টারের সাথে সংযুক্ত আকার-নির্বাচিত cDNA সহ ৩ μl USER এনজাইম (NEB, ইউএসএ) প্রথমে ৩৭°C তাপমাত্রায় ১৫ মিনিট এবং তারপর ৯৫°C তাপমাত্রায় ৫ মিনিটের জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল। এরপর Phusion High-Fidelity DNA পলিমারেজ, ইউনিভার্সাল PCR প্রাইমার এবং ইনডেক্স (X) প্রাইমার ব্যবহার করে PCR সম্পন্ন করা হয়েছিল। অবশেষে, PCR প্রোডাক্টগুলোকে (AMPure XP সিস্টেম) বিশুদ্ধ করা হয়েছিল এবং একটি Agilent Bioanalyzer 2100 সিস্টেমে লাইব্রেরির গুণমান মূল্যায়ন করা হয়েছিল। এরপর একটি Novaseq সিকোয়েন্সার ব্যবহার করে cDNA লাইব্রেরির সিকোয়েন্সিং করা হয়েছিল। Illumina থেকে প্রাপ্ত Raw ইমেজ ফাইলগুলোকে CASAVA Base Calling ব্যবহার করে Raw রিডে রূপান্তরিত করা হয়েছিল। Raw ডেটা FASTQ(fq) ফরম্যাটের ফাইলে সংরক্ষণ করা হয়, যেগুলোতে রিড সিকোয়েন্স এবং সংশ্লিষ্ট বেস কোয়ালিটি থাকে। ফিল্টার করা সিকোয়েন্সিং রিডগুলোকে Sscrofa11.1 রেফারেন্স জিনোমের সাথে মেলানোর জন্য HISAT2 নির্বাচন করুন। সাধারণত, HISAT2 যেকোনো আকারের জিনোম সমর্থন করে, যার মধ্যে ৪ বিলিয়ন বেসের চেয়ে বড় জিনোমও অন্তর্ভুক্ত, এবং বেশিরভাগ প্যারামিটারের জন্য ডিফল্ট মান সেট করা থাকে। বর্তমানে উপলব্ধ দ্রুততম সিস্টেম HISAT2 ব্যবহার করে RNA Seq ডেটা থেকে প্রাপ্ত স্প্লাইসিং রিডগুলোকে অন্য যেকোনো পদ্ধতির সমান বা তার চেয়ে ভালো নির্ভুলতার সাথে দক্ষতার সাথে অ্যালাইন করা যায়।
ট্রান্সক্রিপ্টের প্রাচুর্য সরাসরি জিন এক্সপ্রেশনের স্তরকে প্রতিফলিত করে। জিনোম বা এক্সনের সাথে সম্পর্কিত ট্রান্সক্রিপ্টের (সিকোয়েন্সিং কাউন্ট) প্রাচুর্যের মাধ্যমে জিন এক্সপ্রেশনের স্তর মূল্যায়ন করা হয়। রিডের সংখ্যা জিন এক্সপ্রেশনের স্তর, জিনের দৈর্ঘ্য এবং সিকোয়েন্সিং ডেপথের সমানুপাতিক। FPKM (ফ্র্যাগমেন্টস পার থাউজেন্ড বেস পেয়ারস অফ ট্রান্সক্রিপ্ট সিকোয়েন্সড পার মিলিয়ন বেস পেয়ারস) গণনা করা হয়েছিল এবং DESeq2 প্যাকেজ ব্যবহার করে ডিফারেনশিয়াল এক্সপ্রেশনের P-মান নির্ধারণ করা হয়েছিল। এরপর আমরা বিল্ট-ইন R-ফাংশন “p.adjust”-এর উপর ভিত্তি করে বেনজামিনি-হকবার্গ পদ্ধতি৯ ব্যবহার করে প্রতিটি P-মানের জন্য ফলস ডিসকভারি রেট (FDR) গণনা করেছি।
হৃৎপিণ্ডের অংশ থেকে পৃথক করা RNA-কে থার্মো-র সুপারস্ক্রিপ্ট IV ভিলো মাস্টার মিক্স (থার্মো, ক্যাট. নং ১১৭৫৬০৫০) ব্যবহার করে ২০০ ng/μl ঘনত্বে cDNA-তে রূপান্তরিত করা হয়েছিল। একটি অ্যাপ্লায়েড বায়োসিস্টেমস এন্ডুরা প্লেট মাইক্রোঅ্যাম্প ৩৮৪-ওয়েল স্বচ্ছ রিঅ্যাকশন প্লেট (থার্মো, ক্যাট. নং ৪৪৮৩৩১৯) এবং মাইক্রোঅ্যাম্প অপটিক্যাল অ্যাডহেসিভ (থার্মো, ক্যাট. নং ৪৩১১৯৭১) ব্যবহার করে কোয়ান্টিটেটিভ RT-PCR সম্পন্ন করা হয়েছিল। রিঅ্যাকশন মিশ্রণটিতে প্রতি ওয়েলে ৫ µl ট্যাকম্যান ফাস্ট অ্যাডভান্সড মাস্টার মিক্স (থার্মো, ক্যাট # ৪৪৪৪৫৫৭), ০.৫ µl ট্যাকম্যান প্রাইমার এবং ৩.৫ µl H2O মেশানো ছিল। একটি অ্যাপ্লায়েড বায়োসিস্টেমস কোয়ান্টস্টুডিও ৫ রিয়েল-টাইম PCR যন্ত্র (৩৮৪-ওয়েল মডিউল; প্রোডাক্ট # A28135) ব্যবহার করে স্ট্যান্ডার্ড qPCR সাইকেলগুলো চালানো হয়েছিল এবং CT মান পরিমাপ করা হয়েছিল। থার্মো থেকে ট্যাকম্যান প্রাইমারগুলো কেনা হয়েছিল (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1)। সমস্ত নমুনার CT মান হাউসকিপিং জিন GAPDH-এর সাপেক্ষে স্বাভাবিক করা হয়েছিল।
প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুযায়ী NT-ProBNP কিট (শূকর) (ক্যাট. নং MBS2086979, MyBioSource) ব্যবহার করে NT-ProBNP-এর মিডিয়া রিলিজ মূল্যায়ন করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, প্রতিটি ওয়েলে প্রতিটি নমুনা এবং স্ট্যান্ডার্ডের ২৫০ µl করে দ্বৈতভাবে যোগ করা হয়েছিল। নমুনা যোগ করার সাথে সাথেই, প্রতিটি ওয়েলে ৫০ µl অ্যাসে রিএজেন্ট A যোগ করুন। প্লেটটি আলতোভাবে ঝাঁকিয়ে সিল্যান্ট দিয়ে সিল করুন। তারপর ট্যাবলেটগুলো ৩৭°C তাপমাত্রায় ১ ঘন্টার জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল। এরপর দ্রবণটি অ্যাস্পিরেট করে ৩৫০ µl ১X ওয়াশ সলিউশন দিয়ে ওয়েলগুলো ৪ বার ধুয়ে ফেলুন, প্রতিবার ওয়াশ সলিউশনটি ১-২ মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করুন। তারপর প্রতিটি ওয়েলে ১০০ µl অ্যাসে রিএজেন্ট B যোগ করে প্লেট সিল্যান্ট দিয়ে সিল করুন। ট্যাবলেটটি আলতোভাবে ঝাঁকিয়ে ৩৭°C তাপমাত্রায় ৩০ মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করা হয়েছিল। দ্রবণটি অ্যাসপিরেট করুন এবং ৩৫০ µl ১X ওয়াশ সলিউশন দিয়ে ওয়েলগুলো ৫ বার ধুয়ে নিন। প্রতিটি ওয়েলে ৯০ µl সাবস্ট্রেট সলিউশন যোগ করুন এবং প্লেটটি সিল করে দিন। প্লেটটি ৩৭°C তাপমাত্রায় ১০-২০ মিনিটের জন্য ইনকিউবেট করুন। প্রতিটি ওয়েলে ৫০ µl স্টপ সলিউশন যোগ করুন। প্লেটটি অবিলম্বে ৪৫০ nm-এ সেট করা একটি সাইটেশন (বায়োটেক) প্লেট রিডার ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল।
প্যারামিটারটির ১০% পরম পরিবর্তন শনাক্ত করার জন্য এবং ৫% টাইপ I ত্রুটির হারে ৮০%-এর বেশি পাওয়ার নিশ্চিত করতে পারে এমন গ্রুপের আকার বেছে নেওয়ার জন্য পাওয়ার বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। প্যারামিটারটির ১০% পরম পরিবর্তন শনাক্ত করতে এবং ৫% টাইপ-I ত্রুটির হারে ৮০%-এর বেশি পাওয়ার প্রদান করবে এমন গ্রুপ সাইজগুলো বেছে নেওয়ার জন্য পাওয়ার বিশ্লেষণ করা হয়েছিল। অ্যানালিজ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% абнаружения প্যারামেট্র এর 5% частотой ошибок TIPA I. ৫% টাইপ I ত্রুটির হারে ১০% পরম প্যারামিটার পরিবর্তন শনাক্ত করার জন্য ৮০%-এর বেশি পাওয়ার প্রদানকারী গ্রুপ সাইজ নির্বাচন করতে পাওয়ার বিশ্লেষণ করা হয়েছিল।进行功效分析以选择将提供 > 80％功效以检测参数中10进行功效分析以选择将提供 > 80％功效以检测参数中10 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > ৮০% мощности для обнаружения 10% প্যারামেট্রভ এবং 5% частоты ошибок TIPA I. এমন একটি দলের আকার নির্বাচন করার জন্য একটি পাওয়ার বিশ্লেষণ করা হয়েছিল যা ১০% পরম প্যারামিটার পরিবর্তন এবং ৫% টাইপ I ত্রুটির হার শনাক্ত করতে ৮০%-এর বেশি পাওয়ার প্রদান করবে।পরীক্ষার আগে দৈবচয়নের ভিত্তিতে টিস্যুর অংশ নির্বাচন করা হয়েছিল। সমস্ত বিশ্লেষণ শর্ত-নিরপেক্ষ ছিল এবং সমস্ত ডেটা বিশ্লেষণ করার পরেই নমুনাগুলি ডিকোড করা হয়েছিল। সমস্ত পরিসংখ্যানগত বিশ্লেষণ সম্পাদনের জন্য গ্রাফপ্যাড প্রিজম সফটওয়্যার (সান ডিয়েগো, সিএ) ব্যবহার করা হয়েছিল। সকল পরিসংখ্যানের ক্ষেত্রে, p-মান <0.05 হলে তা তাৎপর্যপূর্ণ বলে বিবেচিত হয়েছিল। সকল পরিসংখ্যানের ক্ষেত্রে, p-মান <0.05 হলে তা তাৎপর্যপূর্ণ বলে বিবেচিত হয়েছিল। Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. সকল পরিসংখ্যানের ক্ষেত্রে, p-মান <0.05 হলে তা তাৎপর্যপূর্ণ বলে বিবেচিত হয়েছিল।对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的.对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. সকল পরিসংখ্যানের ক্ষেত্রে, p-মান <0.05 হলে তা তাৎপর্যপূর্ণ বলে বিবেচিত হয়েছিল।শুধুমাত্র ২টি তুলনা সহ ডেটার উপর দ্বি-পুচ্ছ স্টুডেন্ট'স টি-টেস্ট করা হয়েছিল। একাধিক গ্রুপের মধ্যে তাৎপর্য নির্ধারণের জন্য একমুখী বা দ্বিমুখী অ্যানোভা ব্যবহার করা হয়েছিল। পোস্ট হক টেস্ট করার সময়, একাধিক তুলনার বিষয়টি বিবেচনা করার জন্য ট্যুকি'স কারেকশন প্রয়োগ করা হয়েছিল। মেথডস বিভাগে বর্ণিত FDR এবং p.adjust গণনা করার সময় RNAsec ডেটার জন্য বিশেষ পরিসংখ্যানগত বিবেচনার প্রয়োজন হয়।
গবেষণা নকশা সম্পর্কে আরও তথ্যের জন্য, এই নিবন্ধের সাথে সংযুক্ত নেচার রিসার্চ রিপোর্টের সারসংক্ষেপটি দেখুন।