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Für Arzneimitteltests besteht Bedarf an einem zuverlässigen In-vitro-System, das die physiologische Umgebung des Herzens präzise nachbilden kann. Die begrenzte Verfügbarkeit von humanen Herzgewebekultursystemen hat zu fehlerhaften Interpretationen der kardialen Arzneimittelwirkungen geführt. Wir haben daher ein Herzgewebekulturmodell (CTCM) entwickelt, das Herzschnitte elektromechanisch stimuliert und während der systolischen und diastolischen Phase des Herzzyklus physiologischer Dehnung unterliegt. Nach 12 Tagen Kultivierung verbesserte dieser Ansatz die Lebensfähigkeit der Herzschnitte teilweise, konnte aber deren strukturelle Integrität nicht vollständig erhalten. Nach einem Screening mit niedermolekularen Substanzen stellten wir fest, dass die Zugabe von 100 nM Triiodthyronin (T3) und 1 μM Dexamethason (Dex) zum Medium die Mikrostruktur der Schnitte über 12 Tage bewahrte. In Kombination mit der T3/Dex-Behandlung hielt das CTCM-System Transkriptionsprofile, Lebensfähigkeit, metabolische Aktivität und strukturelle Integrität über 12 Tage auf dem Niveau von frischem Herzgewebe aufrecht. Darüber hinaus induziert eine übermäßige Dehnung von Herzgewebe in der Zellkultur hypertrophische Herzsignale, was die Fähigkeit von CTCM belegt, durch Herzdehnung hervorgerufene hypertrophische Zustände nachzuahmen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CTCM die Physiologie und Pathophysiologie des Herzens in Zellkultur über lange Zeiträume modellieren und somit ein zuverlässiges Wirkstoffscreening ermöglichen kann.
Vor Beginn klinischer Studien sind zuverlässige In-vitro-Systeme erforderlich, die die physiologische Umgebung des menschlichen Herzens präzise nachbilden können. Solche Systeme sollten veränderte mechanische Dehnung, Herzfrequenz und elektrophysiologische Eigenschaften simulieren. Tiermodelle werden häufig als Screening-Plattform für die Herzphysiologie eingesetzt, ihre Zuverlässigkeit bei der Abbildung der Wirkung von Medikamenten auf das menschliche Herz ist jedoch begrenzt^1,2. Das ideale experimentelle Herzgewebekulturmodell (CTCM) ist ein Modell, das hochsensitiv und -spezifisch für verschiedene therapeutische und pharmakologische Interventionen ist und die Physiologie und Pathophysiologie des menschlichen Herzens präzise reproduziert³. Das Fehlen eines solchen Systems schränkt die Entwicklung neuer Therapien für Herzinsuffizienz ein^4,5 und hat dazu geführt, dass die Kardiotoxizität von Medikamenten ein Hauptgrund für deren Marktrücknahme ist⁶.
Im letzten Jahrzehnt wurden acht nicht-kardiovaskuläre Medikamente aufgrund von QT-Intervallverlängerungen, die zu ventrikulären Arrhythmien und plötzlichem Herztod führen können, vom Markt genommen.⁷ Daher besteht ein zunehmender Bedarf an zuverlässigen präklinischen Screening-Strategien zur Beurteilung der kardiovaskulären Wirksamkeit und Toxizität. Der Einsatz von aus humanen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnenen Kardiomyozyten (hiPS-CM) im Wirkstoff-Screening und in Toxizitätstests bietet eine Teillösung für dieses Problem. Die Unreife der hiPS-CM und die fehlende multizelluläre Komplexität des Herzgewebes stellen jedoch wesentliche Einschränkungen dieser Methode dar. Neuere Studien haben gezeigt, dass diese Einschränkung teilweise überwunden werden kann, indem man frühe hiPS-CM zur Bildung von Herzgewebehydrogelen kurz nach Beginn spontaner Kontraktionen verwendet und die elektrische Stimulation über die Zeit schrittweise erhöht. Allerdings weisen diese hiPS-CM-Mikrogewebe nicht die ausgereiften elektrophysiologischen und kontraktilen Eigenschaften des adulten Myokards auf. Darüber hinaus weist menschliches Herzgewebe eine komplexere Struktur auf, die aus einer heterogenen Mischung verschiedener Zelltypen besteht, darunter Endothelzellen, Neuronen und Stromafibroblasten, die durch spezifische extrazelluläre Matrixproteine ​​miteinander verbunden sind. Diese Heterogenität der Nicht-Kardiomyozyten-Populationen^11,12,13 im adulten Säugetierherzen stellt ein großes Hindernis für die Modellierung von Herzgewebe mithilfe einzelner Zelltypen dar. Diese wesentlichen Einschränkungen unterstreichen die Bedeutung der Entwicklung von Methoden zur Kultivierung intakten Myokardgewebes unter physiologischen und pathologischen Bedingungen.
Kultivierte Dünnschnitte (300 µm) des menschlichen Herzens haben sich als vielversprechendes Modell für intaktes menschliches Myokard erwiesen. Diese Methode ermöglicht den Zugang zu einem vollständigen dreidimensionalen multizellulären System, das dem menschlichen Herzgewebe ähnelt. Bis 2019 war die Verwendung kultivierter Herzschnitte jedoch durch die kurze Überlebensdauer (24 h) begrenzt. Dies ist auf verschiedene Faktoren zurückzuführen, darunter das Fehlen physikalisch-mechanischer Dehnung, die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche und die Verwendung einfacher Medien, die den Bedürfnissen des Herzgewebes nicht gerecht werden. Im Jahr 2019 zeigten mehrere Forschungsgruppen, dass die Integration mechanischer Faktoren in Herzgewebekultursysteme die Kulturdauer verlängern, die kardiale Genexpression verbessern und die kardiale Pathologie nachahmen kann. Zwei wegweisende Studien^17,18 belegen, dass eine uniaxiale mechanische Belastung einen positiven Effekt auf den kardialen Phänotyp während der Kultivierung hat. Diese Studien nutzten jedoch nicht die dynamische dreidimensionale physikalisch-mechanische Belastung des Herzzyklus, da die Herzschnitte entweder mit isometrischen Zugkräften¹⁷ oder mit linearer auxotonischer Belastung¹⁸ belastet wurden. Diese Methoden der Gewebedehnung führten zur Unterdrückung zahlreicher Herzgene oder zur Überexpression von Genen, die mit abnormalen Dehnungsreaktionen assoziiert sind. Pitoulis et al.¹⁹ entwickelten ein dynamisches Kulturbad für Herzschnitte zur Rekonstruktion des Herzzyklus mittels Kraftaufnehmer-Feedback und Spannungsantrieb. Obwohl dieses System eine genauere In-vitro-Modellierung des Herzzyklus ermöglicht, schränken seine Komplexität und der geringe Durchsatz die Anwendung ein. Unser Labor hat kürzlich ein vereinfachtes Kultursystem entwickelt, das elektrische Stimulation und ein optimiertes Medium nutzt, um die Lebensfähigkeit von Schnitten aus Schweine- und menschlichem Herzgewebe bis zu 6 Tage lang zu erhalten.^20,21
In der vorliegenden Arbeit beschreiben wir ein Herzgewebekulturmodell (CTCM) mit Schnitten des Schweineherzens, das humorale Signale nutzt, um die dreidimensionale Herzphysiologie und pathophysiologische Dehnung während des Herzzyklus nachzubilden. Dieses CTCM kann die Genauigkeit präklinischer Arzneimittelprognosen auf ein bisher unerreichtes Niveau steigern, indem es ein kosteneffektives, für den mittleren Durchsatz geeignetes Herzsystem bereitstellt, das die Physiologie und Pathophysiologie des Säugetierherzens für präklinische Arzneimitteltests simuliert.
Hämodynamische mechanische Signale spielen eine entscheidende Rolle für die Aufrechterhaltung der Kardiomyozytenfunktion in vitro^22,23,24. In der vorliegenden Arbeit haben wir ein CTCM (Abb. 1a) entwickelt, das die Umgebung des erwachsenen Herzens durch elektrische und mechanische Stimulation mit physiologischen Frequenzen (1,2 Hz, 72 Schläge pro Minute) nachbilden kann. Um eine übermäßige Gewebedehnung während der Diastole zu vermeiden, wurde das Gewebe mithilfe eines 3D-Druckers um 25 % vergrößert (Abb. 1b). Die elektrische Stimulation durch das C-PACE-System wurde mithilfe eines Datenerfassungssystems 100 ms vor der Systole gestartet, um den Herzzyklus vollständig zu reproduzieren. Das Gewebekultursystem nutzt einen programmierbaren pneumatischen Aktor (LB Engineering, Deutschland), um eine flexible Silikonmembran zyklisch zu dehnen und so die Herzschnitte in der oberen Herzkammer zu expandieren. Das System war über einen Druckwandler mit einer externen Druckluftleitung verbunden, wodurch Druck (± 1 mmHg) und Zeit (± 1 ms) präzise eingestellt werden konnten (Abb. 1c).
a Befestigen Sie den Gewebeschnitt am 7 mm großen Stützring (blau) in der Kulturkammer des Geräts. Die Kulturkammer ist durch eine dünne, flexible Silikonmembran von der Luftkammer getrennt. Legen Sie eine Dichtung zwischen die Kammern, um Leckagen zu vermeiden. Der Deckel des Geräts enthält Graphitelektroden zur elektrischen Stimulation. b Schematische Darstellung des großen Gewebegeräts mit Führungsring und Stützring. Die Gewebeschnitte (braun) werden auf das übergroße Gerät gelegt, wobei der Führungsring in die Nut am Außenrand des Geräts eingesetzt wird. Platzieren Sie mithilfe des Führungsrings vorsichtig den mit Gewebekleber beschichteten Stützring über dem Herzgewebeschnitt. c Diagramm: Dauer der elektrischen Stimulation in Abhängigkeit vom Luftkammerdruck, gesteuert durch einen programmierbaren pneumatischen Aktor (PPD). Ein Datenerfassungsgerät synchronisierte die elektrische Stimulation mithilfe von Drucksensoren. Sobald der Druck in der Kulturkammer den eingestellten Schwellenwert erreicht, wird ein Impulssignal an das C-PACE-EM gesendet, um die elektrische Stimulation auszulösen. d Abbildung von vier CTCMs auf einem Inkubatorregal. Vier Geräte sind über einen pneumatischen Kreislauf mit einem PPD verbunden, und Drucksensoren sind in das Hämostaseventil eingeführt, um den Druck im pneumatischen Kreislauf zu überwachen. Jedes Gerät enthält sechs Gewebeschnitte.
Mithilfe eines einzigen pneumatischen Aktuators konnten wir vier CTCM-Geräte steuern, die jeweils sechs Gewebeschnitte aufnehmen konnten (Abb. 1d). In der CTCM wird der Luftdruck in der Luftkammer in einen synchronen Druck in der Flüssigkeitskammer umgewandelt und induziert so die physiologische Expansion des Herzschnitts (Abb. 2a und ergänzendes Video 1). Die Auswertung der Gewebedehnung bei 80 mmHg ergab eine Dehnung der Gewebeschnitte um 25 % (Abb. 2b). Diese prozentuale Dehnung entspricht einer physiologischen Sarkomerlänge von 2,2–2,3 µm für die Kontraktilität normaler Herzschnitte^17,19,25. Die Gewebebewegung wurde mithilfe spezieller Kameraeinstellungen erfasst (ergänzende Abb. 1). Amplitude und Geschwindigkeit der Gewebebewegung (Abb. 2c, d) korrelierten mit der Dehnung während des Herzzyklus und der Zeit während Systole und Diastole (Abb. 2b). Dehnung und Geschwindigkeit des Herzgewebes während Kontraktion und Relaxation blieben über 12 Tage in Kultur konstant (Abb. 2f). Um den Einfluss elektrischer Stimulation auf die Kontraktilität während der Zellkultur zu untersuchen, entwickelten wir eine Methode zur Bestimmung aktiver Deformitäten mithilfe eines Schattierungsalgorithmus (Ergänzende Abb. 2a,b). Dadurch konnten wir Deformitäten mit und ohne elektrische Stimulation unterscheiden. Derselbe Herzabschnitt (Abb. 2f). Im beweglichen Bereich des Schnitts (R6-9) war die Spannung während der elektrischen Stimulation um 20 % höher als ohne elektrische Stimulation. Dies deutet auf den Beitrag der elektrischen Stimulation zur Kontraktionsfunktion hin.
Repräsentative Kurvenverläufe von Luftkammerdruck, Flüssigkeitskammerdruck und Gewebebewegungsmessungen bestätigen, dass der Kammerdruck den Flüssigkeitskammerdruck verändert und dadurch eine entsprechende Bewegung des Gewebeschnitts bewirkt. b Repräsentative Kurvenverläufe der prozentualen Dehnung (blau) von Gewebeschnitten entsprechend der prozentualen Dehnung (orange). c Die gemessene Bewegung des Herzschnitts stimmt mit der gemessenen Bewegungsgeschwindigkeit überein. d) Repräsentative Trajektorien der zyklischen Bewegung (blaue Linie) und Geschwindigkeit (orange gestrichelte Linie) in einem Herzschnitt. e Quantifizierung der Zykluszeit (n = 19 Schnitte pro Gruppe, von verschiedenen Schweinen), Kontraktionszeit (n = 19 Schnitte pro Gruppe, von verschiedenen Schweinen), Relaxationszeit (n = 19 Schnitte pro Gruppe, von verschiedenen Schweinen), Gewebebewegung (n = 25 Schnitte pro Gruppe, von verschiedenen Schweinen), systolischer Spitzengeschwindigkeit (n = 24 (D0), 25 (D12) Schnitte pro Gruppe, von verschiedenen Schweinen) und maximaler Relaxationsrate (n = 24 (D0), 25 (D12) Schnitte pro Gruppe, von verschiedenen Schweinen). Der zweiseitige t-Test nach Student ergab keinen signifikanten Unterschied in den untersuchten Parametern. Abbildung f zeigt repräsentative Dehnungsanalysen von Gewebeschnitten mit (rot) und ohne (blau) elektrische Stimulation, dargestellt in zehn Bereichen desselben Schnitts. Die unteren Abbildungen zeigen die Quantifizierung der prozentualen Dehnungsdifferenz in Gewebeschnitten mit und ohne elektrische Stimulation in zehn Bereichen aus verschiedenen Schnitten. (n = 8 Scheiben/Gruppe von verschiedenen Schweinen, zweiseitiger Student-t-Test durchgeführt; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 Scheiben/Gruppe von verschiedenen Schweinen, zweiseitiger Student-t-Test durchgeführt; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 Zeilen/Gruppe aus mehreren Zeilen, ergibt eine doppelte T-Kriterium-Liste; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 Abschnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, zweiseitiger Student-t-Test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 片/组, 来自不同的猪, 进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 片/组, 来自不同的猪, 进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 Stufen/Gruppe, aus verschiedenen Breiten, zweistufiges Kriterium; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 Abschnitte/Gruppe, von verschiedenen Schweinen, zweiseitiger Student-t-Test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Die Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar.
In unserem vorherigen statischen biomimetischen Herzschnittkultursystem [20, 21] konnten wir die Lebensfähigkeit, Funktion und strukturelle Integrität der Herzschnitte über 6 Tage durch elektrische Stimulation und Optimierung der Mediumzusammensetzung aufrechterhalten. Nach 10 Tagen sanken diese Werte jedoch rapide. Wir bezeichnen Schnitte, die in unserem vorherigen statischen biomimetischen Kultursystem [20, 21] kultiviert wurden, als Kontrollbedingungen (Ctrl) und verwenden unser zuvor optimiertes Medium als MC-Bedingungen. Anschließend kultivieren wir die Schnitte unter simultaner mechanischer und elektrischer Stimulation (CTCM). Zunächst stellten wir fest, dass mechanische Stimulation ohne elektrische Stimulation nicht ausreichte, um die Gewebelebensfähigkeit über 6 Tage zu erhalten (Ergänzende Abb. 3a,b). Interessanterweise blieb die Lebensfähigkeit der 12 Tage alten Herzschnitte nach Einführung der physiomechanischen und elektrischen Stimulation mittels CTCM unter MS-Bedingungen unverändert, nicht jedoch unter Ctrl-Bedingungen, wie die MTT-Analyse zeigte (Abb. 1). Dies deutet darauf hin, dass mechanische Stimulation und die Simulation des Herzzyklus die Lebensfähigkeit von Gewebeschnitten im Vergleich zu unserem vorherigen statischen Kultursystem doppelt so lange erhalten können. Die Beurteilung der strukturellen Integrität der Gewebeschnitte mittels Immunmarkierung von kardialem Troponin T und Connexin 43 zeigte jedoch, dass die Connexin-43-Expression in MC-Geweben an Tag 12 signifikant höher war als in den Kontrollen am selben Tag. Eine gleichmäßige Connexin-43-Expression und die Ausbildung der Z-Scheiben waren jedoch nicht vollständig erhalten (Abb. 3b). Wir verwenden ein KI-Framework zur Quantifizierung der Gewebestrukturintegrität²⁶, eine bildbasierte Deep-Learning-Pipeline basierend auf Troponin-T- und Connexin-Färbung⁴³, um die Strukturintegrität und Fluoreszenz von Herzschnitten hinsichtlich der Lokalisierungsstärke automatisch zu quantifizieren. Diese Methode nutzt ein Convolutional Neural Network (CNN) und ein Deep-Learning-Framework, um die Strukturintegrität von Herzgewebe zuverlässig, automatisiert und unvoreingenommen zu quantifizieren, wie in der Referenz beschrieben. 26. MC-Gewebe zeigte im Vergleich zu statischen Kontrollpräparaten eine verbesserte strukturelle Ähnlichkeit zu Tag 0. Darüber hinaus ergab die Masson-Trichrom-Färbung am 12. Kulturtag einen signifikant geringeren Fibroseanteil unter MS-Bedingungen im Vergleich zu den Kontrollbedingungen (Abb. 3c). Obwohl CTCM die Viabilität der Herzgewebeschnitte am 12. Tag auf ein ähnliches Niveau wie frisches Herzgewebe erhöhte, verbesserte es die strukturelle Integrität der Herzgewebeschnitte nicht signifikant.
Ein Balkendiagramm zeigt die Quantifizierung der MTT-Viabilität von frischen Herzschnitten (D0) oder von Herzschnitten, die 12 Tage lang entweder in statischer Kultur (D12 Ctrl) oder in CTCM (D12 MC) kultiviert wurden (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, es wurde ein einfaktorieller ANOVA-Test durchgeführt; ####p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und **p < 0,01 im Vergleich zu D12 Ctrl). Ein Balkendiagramm zeigt die Quantifizierung der MTT-Viabilität von frischen Herzschnitten (D0) oder von Herzschnitten, die 12 Tage lang entweder in statischer Kultur (D12 Ctrl) oder in CTCM (D12 MC) kultiviert wurden (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, es wurde ein einfaktorieller ANOVA-Test durchgeführt; ####p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und **p < 0,01 im Vergleich zu D12 Ctrl).Das Histogramm zeigt die Quantifizierung der Lebensfähigkeit von MTT-frischen Herzschnitten (D0) oder von Herzschnitten, die 12 Tage lang entweder in statischer Kultur (D12 Kontrolle) oder in CTCM (D12 MC) kultiviert wurden (n = 18 (D0), 15 (D12 Kontrolle). ), 12 (D12 MC) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, es wird ein einfaktorieller ANOVA-Test durchgeführt;####p < 0,0001 durch D0 und **p < 0,01 durch D12 Strg). ####p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und **p < 0,01 im Vergleich zu D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Strg) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Strg) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切培养12 天的MTT 活力的量化), 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组, 进行单向ANOVA 测试；与D0相比，####p < 0.0001, 与D12 Ctrl 相比**p < 0.01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Strg) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Strg) 中新鲜心脏切片(D0) (D12 MC) 切片/组Histogramm zur Quantifizierung der MTT-Viabilität in frischen Herzschnitten (D0) oder Herzschnitten, die 12 Tage lang in statischer Kultur (D12 Kontrolle) oder CTCM (D12 MC) kultiviert wurden (n = 18 (D0), 15 (D12 Kontrolle)), 12 (D12 MC) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, einfaktorieller ANOVA-Test;####p < 0,0001 durch D0, **p < 0,01 durch D12 Strg). ####p < 0,0001 im Vergleich zu D0, **p < 0,01 im Vergleich zu D12 Ctrl).b Troponin-T (grün), Connexin 43 (rot) und DAPI (blau) in frisch isolierten Herzschnitten (D0) oder Herzschnitten, die unter statischen Bedingungen (Ctrl) oder CTCM-Bedingungen (MC) für 12 Tage kultiviert wurden) repräsentativer Immunfluoreszenzbilder (Leermaßstab = 100 µm). Künstliche Intelligenz zur Quantifizierung der strukturellen Integrität des Herzgewebes (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) Schnitte/Gruppe jeweils von verschiedenen Schweinen, es wurde ein einfaktorieller ANOVA-Test durchgeführt; ####p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und ****p < 0,0001 im Vergleich zu D12 Ctrl). Künstliche Intelligenz zur Quantifizierung der strukturellen Integrität des Herzgewebes (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) Schnitte/Gruppe jeweils von verschiedenen Schweinen, es wurde ein einfaktorieller ANOVA-Test durchgeführt; ####p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und ****p < 0,0001 im Vergleich zu D12 Ctrl). Zusammenfassende Analyse der Struktur des Gehirns mit niedriger Intelligenz (n = 7 (D0), 7 (D12 Strg), 5 (D12 MC) Stufen/Gruppen aus mehreren Zeilen, проводится Odnofaktorischer Test ANOVA; ####p < 0,0001 durch D0 und ****p < 0,0001 durch D12 Strg). Quantifizierung der strukturellen Integrität des Herzgewebes mittels künstlicher Intelligenz (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) Schnitte/Gruppen von verschiedenen Schweinen, einfaktorieller ANOVA-Test durchgeführt; ####p < 0,0001 vs. mit D0 und ****p < 0,0001 im Vergleich zu D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Strg), 5 (D12 MC) Scheiben/Gruppe jeweils von verschiedenen Schweinen, einfaktorieller ANOVA-Test;####p < 0,0001 与D0相比,****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Strg), 5 (D12 MC) Scheiben/Gruppe jeweils von verschiedenen Schweinen, einfaktorieller ANOVA-Test;####p < 0,0001与D0相比,****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 Intelligentes Intellektsystem für die Gesamtstruktur des Gehirns mit niedriger Geschwindigkeit (n = 7 (D0), 7 (D12 Strg), 5 (D12 MC) Stufen/Gruppenstufen aus verschiedenen Bereichen süß, односторонний TEST ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Mehr anzeigen ****p < 0,0001 durch D12 Strg). Künstliche Intelligenz zur Quantifizierung der strukturellen Integrität von Herzgewebe (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) Schnitte/Gruppe jeweils von verschiedenen Schweinen, einfaktorieller ANOVA-Test; ####p<0,0001 vs. D0; zum Vergleich ****p < 0,0001 im Vergleich zu D12 Ctrl). c Repräsentative Bilder (links) und Quantifizierung (rechts) von Herzschnitten, die mit Masson-Trichrom-Färbung angefärbt wurden (Maßstab = 500 µm) (n = 10 Schnitte/Gruppe von jeweils einem anderen Schwein, es wurde ein einfaktorieller ANOVA-Test durchgeführt; ####p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und ***p < 0,001 im Vergleich zu D12 Ctrl). c Repräsentative Bilder (links) und Quantifizierung (rechts) von Herzschnitten, die mit Masson-Trichrom-Färbung angefärbt wurden (Maßstab = 500 µm) (n = 10 Schnitte/Gruppe von jeweils verschiedenen Schweinen, es wurde ein einfaktorieller ANOVA-Test durchgeführt; #### p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und ***p < 0,001 im Vergleich zu D12 Ctrl). c Repräsentative Bilddarstellung (später) und allgemeines öffentliches Interesse (geprägt) innerhalb der ersten drei Monate, geschlossene dreifache Auflösung von Massona (nicht mehr verfügbar). 500 мкм) (n = 10 Punkte/Gruppe aus verschiedenen Teilen der Welt, wird als Standard-ANOVA-Test ausgewählt; #### p < 0,0001 nach D0 und ***p < 0,001 nach D12 Strg). c Repräsentative Bilder (links) und Quantifizierung (rechts) von Herzschnitten, die mit Masson-Trichrom-Färbung angefärbt wurden (unbeschichteter Maßstab = 500 µm) (n = 10 Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, einfaktorieller ANOVA-Test durchgeführt; #### p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und ***p < 0,001 im Vergleich zu D12 Ctrl). c 用Masson个切片/组,每组来自不同的猪,进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比,***p < 0.001 与D12 Strg相比） C. masson裸尺度 = 500 µm） （n = 10与D0 ***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Repräsentatives Bild (Skala) und umfassende Analyse (Sprech) innerhalb von 10 Minuten, 100 % dreifaches Massaker (Mindestzahl = 500). мкм) (n = 10 Größe/Gruppe, die sich aus zwei Ländern zusammensetzt und durch eine unabhängige analytische Analyse ersetzt wird ;### #p < 0,0001 nach D0, ***p < 0,001 Nach D12 Strg). c Repräsentative Bilder (links) und Quantifizierung (rechts) von Herzschnitten, die mit Masson-Trichrom-Färbung angefärbt wurden (Leerwert = 500 µm) (n = 10 Schnitte/Gruppe, jeweils von einem anderen Schwein, getestet mittels einfaktorieller Varianzanalyse; ### # p < 0,0001 im Vergleich zu D0, ***p < 0,001 im Vergleich zu D12 Ctrl).Die Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar.
Wir vermuteten, dass die Zugabe von niedermolekularen Substanzen zum Kulturmedium die Integrität der Kardiomyozyten verbessern und die Fibroseentwicklung während der CTCM-Kultur reduzieren könnte. Daher suchten wir in unseren statischen Kontrollkulturen^20,21 aufgrund der geringen Anzahl an Störfaktoren nach geeigneten niedermolekularen Substanzen. Dexamethason (Dex), Triiodthyronin (T3) und SB431542 (SB) wurden für dieses Screening ausgewählt. Diese niedermolekularen Substanzen wurden bereits in hiPSC-CM-Kulturen eingesetzt, um die Reifung von Kardiomyozyten durch Verlängerung der Sarkomere, Erhöhung der T-Tubuli und Steigerung der Erregungsleitungsgeschwindigkeit zu induzieren. Darüber hinaus ist bekannt, dass sowohl Dex (ein Glukokortikoid) als auch SB Entzündungen hemmen^29,30. Wir untersuchten daher, ob die Zugabe einer oder mehrerer dieser niedermolekularen Substanzen die strukturelle Integrität von Herzschnitten verbessern würde. Für das initiale Screening wurde die Dosis jeder Substanz anhand der in Zellkulturmodellen üblicherweise verwendeten Konzentrationen gewählt (1 μM Dex27, 100 nM T327 und 2,5 μM SB31). Nach 12 Tagen Kultivierung führte die Kombination von T3 und Dex zu einer optimalen strukturellen Integrität der Kardiomyozyten und minimalem fibrotischem Remodeling (Ergänzende Abbildungen 4 und 5). Die Verwendung der doppelten Konzentration von T3 und Dex hatte im Vergleich zu den normalen Konzentrationen schädliche Auswirkungen (Ergänzende Abbildung 6a,b).
Nach einem ersten Screening führten wir einen direkten Vergleich von vier Kulturbedingungen durch (Abbildung 4a): Ctrl: Herzschnitte, kultiviert in unserer zuvor beschriebenen statischen Kultur mit unserem optimierten Medium; 20.21 TD: T3 und Ctrl mit Zugabe von Dexamethason (Dex) am Mittwoch; MC: Herzschnitte, kultiviert in CTCM mit unserem zuvor optimierten Medium; und MT: CTCM mit Zugabe von T3 und Dex. Nach 12 Tagen Kultivierung blieb die Viabilität der MS- und MT-Gewebe, bestimmt mittels MTT-Assay, unverändert (Abb. 4b). Interessanterweise führte die Zugabe von T3 und Dex zu Transwell-Kulturen (TD) im Vergleich zu den Ctrl-Bedingungen nicht zu einer signifikanten Verbesserung der Viabilität, was auf die wichtige Rolle der mechanischen Stimulation für den Erhalt der Viabilität der Herzschnitte hinweist.
Ein Diagramm des Versuchsaufbaus, das die vier Kulturbedingungen darstellt, die zur Bewertung der Auswirkungen mechanischer Stimulation und T3/Dex-Supplementierung auf das Medium über 12 Tage verwendet wurden. b Das Balkendiagramm zeigt die Quantifizierung der Viabilität 12 Tage nach der Kultivierung unter allen 4 Kulturbedingungen (Ctrl, TD, MC und MT) im Vergleich zu frischen Herzschnitten (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD und D12 MT), 12 (D12 MC) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, es wurde ein einfaktorieller ANOVA-Test durchgeführt; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 im Vergleich zu D0 und **p < 0,01 im Vergleich zu D12 Ctrl). b Das Balkendiagramm zeigt die Quantifizierung der Viabilität 12 Tage nach der Kultivierung unter allen 4 Kulturbedingungen (Ctrl, TD, MC und MT) im Vergleich zu frischen Herzschnitten (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD und D12 MT), 12 (D12 MC) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, es wurde ein einfaktorieller ANOVA-Test durchgeführt; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 im Vergleich zu D0 und **p < 0,01 im Vergleich zu D12 ctrl). b Гистограмма показывает оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования всех 4 условиях культивирования (control, TD, MC and MT) Zur Auswahl mit mehreren Zeilen (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD und D12 MT), 12 (D12 MC) werden mehrere Zeilen/Gruppen aus mehreren Zeilen angezeigt Test ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по Abweichung von D0 und **p < 0,01 bis Abweichung von D12 Strg). b Das Balkendiagramm zeigt die Quantifizierung der Lebensfähigkeit 12 Tage nach der Kultivierung unter allen 4 Kulturbedingungen (Kontrolle, TD, MC und MT) im Vergleich zu frischen Herzschnitten (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD und D12 MT), 12 (D12 MC) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, einfaktorieller ANOVA-Test; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 vs. D0 und **p < 0,01 im Vergleich zu D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Strg、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 与D0 相比**p < 0.01 与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Histogramm, ausgewählt aus 4 verschiedenen Sorten (Kontrolle, TD, MC und MT), basierend auf den einzelnen Zeilen (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Strg, D12 TD). und D12 MT), weitere Informationen свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний TEST ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 nach D0, **p <0,01 nach D12). b Histogramm, das alle 4 Kulturbedingungen (Kontrolle, TD, MC und MT) im Vergleich zu frischen Herzschnitten (D0) zeigt (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD und D12 MT), von verschiedenen Schweinen 12 (D12 MC) Schnitte/Gruppe, einfaktorieller ANOVA-Test; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. Kontrolle D12). c Das Balkendiagramm zeigt die Quantifizierung des Glukoseflusses 12 Tage nach der Kultivierung unter allen 4 Kulturbedingungen (Ctrl, TD, MC und MT) im Vergleich zu frischen Herzschnitten (D0) (n = 6 Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, es wurde ein einfaktorieller ANOVA-Test durchgeführt; ###p < 0,001 im Vergleich zu D0 und ***p < 0,001 im Vergleich zu D12 Ctrl). c Das Balkendiagramm zeigt die Quantifizierung des Glukoseflusses 12 Tage nach der Kultivierung unter allen 4 Kulturbedingungen (Ctrl, TD, MC und MT) im Vergleich zu frischen Herzschnitten (D0) (n = 6 Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, es wurde ein einfaktorieller ANOVA-Test durchgeführt; ###p < 0,001 im Vergleich zu D0 und ***p < 0,001 im Vergleich zu D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную ценку глюкозы через 12 дней после культивирования всех 4 условиях культивирования (Kontrolle, TD, MC und MT) по Skalierung mit kleinen Skalenwerten (D0) (n = 6 Skalierungen/Gruppen von sechs Skalen, neu) Выполняется TEST ANOVA; 0,001 pro Monat c D12 Strg). c Das Histogramm zeigt die Quantifizierung des Glukoseflusses 12 Tage nach der Kultivierung unter allen 4 Kulturbedingungen (Kontrolle, TD, MC und MT) im Vergleich zu frischen Herzschnitten (D0) (n = 6 Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, einfaktorieller ANOVA-Test durchgeführt; ###p < 0,001 im Vergleich zu D0 und ***p < 0,001 im Vergleich zu D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Strg、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组, 来自不同猪, 单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001, 与D0 相比, ***p < 0,001与D12 Strg 相比） C 条形图 显示 所有有4 种 件 （(ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 培养后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组, 来自 猪 ， ， 、 ， 、 ， 猪 猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Histogramm, 12 Tage nach der Kultivierung für alle 4 Kultivierungen (Kontrolle, TD, MC). и MT) auf Basis kleinerer Durchschnittswerte (D0) (n = 6 Stufen/Gruppe, aus verschiedenen Breitengraden, neu) Bewährte ANOVA-Tests; ###p < 0,001 auf Basis von D0, ***p < 0,001 по Reduziert mit D12 (Kontrolle). c Histogramm zur Quantifizierung des Glukoseflusses 12 Tage nach der Kultivierung für alle 4 Kulturbedingungen (Kontrolle, TD, MC und MT) im Vergleich zu frischen Herzschnitten (D0) (n = 6 Schnitte/Gruppe, von verschiedenen Schweinen, unilateral). Es wurden ANOVA-Tests durchgeführt, ###p < 0,001 im Vergleich zu D0, ***p < 0,001 im Vergleich zu D12 (Kontrolle).d. Darstellung der Dehnungsanalyse von frischem (blau), 12 Tage altem MC- (grün) und 12 Tage altem MT-Gewebe (rot) an zehn regionalen Schnittpunkten (n = 4 Schnitte/Gruppe, einfaktorielle ANOVA; kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen). e. Vulkanplot mit differentiell exprimierten Genen in frischen Herzschnitten (D0) im Vergleich zu Herzschnitten, die 10–12 Tage unter statischen Bedingungen (Ctrl) oder unter MT-Bedingungen (MT) kultiviert wurden. f. Heatmap der Sarkomergene für Herzschnitte, die unter den jeweiligen Kulturbedingungen kultiviert wurden. Die Fehlerbalken geben den Mittelwert ± Standardabweichung an.
Die metabolische Abhängigkeit vom Wechsel von der Fettsäureoxidation zur Glykolyse ist ein Kennzeichen der Kardiomyozyten-Dedifferenzierung. Unreife Kardiomyozyten nutzen primär Glucose zur ATP-Produktion und weisen hypoplastische Mitochondrien mit wenigen Cristae auf^5,32. Analysen des Glucoseverbrauchs zeigten, dass dieser unter MC- und MT-Bedingungen dem von Gewebeproben an Tag 0 entsprach (Abb. 4c). Kontrollproben (Ctrl) zeigten jedoch einen signifikanten Anstieg des Glucoseverbrauchs im Vergleich zu frischem Gewebe. Dies deutet darauf hin, dass die Kombination von CTCM und T3/Dex die Gewebeviabilität erhöht und den metabolischen Phänotyp von 12 Tage lang kultivierten Herzabschnitten erhält. Darüber hinaus zeigte die Stammanalyse, dass die Stammwerte unter MT- und MS-Bedingungen über 12 Tage hinweg unverändert blieben (Abb. 4d).
Um den Gesamteinfluss von CTCM und T3/Dex auf das globale Transkriptionsprofil von Herzgewebeschnitten zu analysieren, führten wir RNA-Sequenzierung an Herzgewebeschnitten aus allen vier verschiedenen Kulturbedingungen durch (Ergänzende Daten 1). Interessanterweise zeigten MT-Schnitte eine hohe transkriptionelle Ähnlichkeit zu frischem Herzgewebe, wobei nur 16 von 13.642 Genen differentiell exprimiert waren. Wie bereits gezeigt, wiesen Ctrl-Schnitte jedoch nach 10–12 Tagen in Kultur 1229 differentiell exprimierte Gene auf (Abb. 4e). Diese Daten wurden durch qRT-PCR von Herz- und Fibroblastengenen bestätigt (Ergänzende Abb. 7a–c). Interessanterweise zeigten die Ctrl-Schnitte eine Herunterregulierung von Herz- und Zellzyklusgenen sowie eine Aktivierung von Entzündungsgenprogrammen. Diese Daten legen nahe, dass die Dedifferenzierung, die normalerweise nach Langzeitkultivierung auftritt, unter MT-Bedingungen vollständig unterdrückt wird (Ergänzende Abb. 8a,b). Eine detaillierte Untersuchung der Sarkomergene zeigte, dass die Gene für das Sarkomer (Abb. 4f) und den Ionenkanal (Ergänzende Abb. 9) nur unter MT-Bedingungen erhalten bleiben und somit vor der Suppression unter Ctrl-, TD- und MC-Bedingungen geschützt sind. Diese Daten belegen, dass das Transkriptom von Herzschnitten durch eine Kombination aus mechanischer und humoraler Stimulation (T3/Dex) nach 12 Tagen in Kultur dem von frischen Herzschnitten ähnelt.
Diese transkriptionellen Befunde werden durch die Tatsache gestützt, dass die strukturelle Integrität von Kardiomyozyten in Herzschnitten unter MT-Bedingungen über 12 Tage am besten erhalten bleibt, wie durch intaktes und lokalisiertes Connexin 43 gezeigt wird (Abb. 5a). Darüber hinaus war die Fibrose in Herzschnitten unter MT-Bedingungen im Vergleich zu Ctrl signifikant reduziert und ähnelte der in frischen Herzschnitten (Abb. 5b). Diese Daten belegen, dass die Kombination aus mechanischer Stimulation und T3/Dex-Behandlung die Herzstruktur in kultivierten Herzschnitten effektiv erhält.
a Repräsentative Immunfluoreszenzbilder von Troponin-T (grün), Connexin 43 (rot) und DAPI (blau) in frisch isolierten Herzschnitten (D0) oder nach 12-tägiger Kultivierung unter allen vier Kulturbedingungen für Herzschnitte (Maßstabsbalken = 100 µm). Künstliche Intelligenz zur Quantifizierung der strukturellen Integrität des Herzgewebes (n = 7 (D0 und D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC und D12 MT) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, es wird ein einfaktorieller ANOVA-Test durchgeführt; ####p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und *p < 0,05 oder ****p < 0,0001 im Vergleich zu D12 Ctrl). Künstliche Intelligenz zur Quantifizierung der strukturellen Integrität des Herzgewebes (n = 7 (D0 und D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC und D12 MT) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, es wird ein einfaktorieller ANOVA-Test durchgeführt; #### p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und *p < 0,05 oder ****p < 0,0001 im Vergleich zu D12 Ctrl). Kollektiv-basierte Struktur-Entwicklungsstrategie mit zunehmender Intelligenz (n = 7 (D0 und D12 Strg), 5 (D12 TD, D12 MC und D12 MT) срезов/группу от разных kleiner, bewährter wissenschaftlicher Test ANOVA; #### p < 0,0001 durch D0 und *p < 0,05 oder ****p < 0,0001 durch D12 Strg). Quantifizierung der strukturellen Integrität des Herzgewebes mittels künstlicher Intelligenz (n = 7 (D0 und D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC und D12 MT) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, einfaktorieller ANOVA-Test durchgeführt; #### p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und *p < 0,05 oder ****p < 0,0001 im Vergleich zu D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化,进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比,或****p < 0,0001 与D12 Strg-Taste）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组）人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比,或****p < 0,0001 与D12 Strg 相比）Quantifizierung der strukturellen Integrität des Herzgewebes mittels künstlicher Intelligenz bei verschiedenen Schweinen (n = 7 (D0 und D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC und D12 MT) Schnitte/Gruppe) mit einem einfaktoriellen ANOVA-Test;#### p < 0,0001 durch D0 und *p < 0,05 oder ****p < 0,0001 durch D12 Strg). #### p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und *p < 0,05 oder ****p < 0,0001 im Vergleich zu D12 Ctrl). b Repräsentative Bilder und Quantifizierung von Herzschnitten, die mit Masson-Trichrom-Färbung angefärbt wurden (Maßstabsbalken = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD und D12 MC), 9 (D12 MT) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, es wurde ein einfaktorieller ANOVA-Test durchgeführt; ####p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und ***p < 0,001 bzw. ****p < 0,0001 im Vergleich zu D12 Ctrl). b Repräsentative Bilder und Quantifizierung von Herzschnitten, die mit Masson-Trichrom-Färbung angefärbt wurden (Maßstabsbalken = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD und D12 MC), 9 (D12 MT) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, es wurde ein einfaktorieller ANOVA-Test durchgeführt; ####p < 0,0001 im Vergleich zu D0 und ***p < 0,001 bzw. ****p < 0,0001 im Vergleich zu D12 Ctrl). b Repräsentative Bilder und eine Reihe von Ergebnissen aus der ganzen Welt, dreiteilige dreiteilige Bilder von Masson (Maßstabslänge = 500 Mio. Kubikmeter) (n = 10 (D0, D12 Strg, D12 TD è D12 MC), 9 (D12 MT) Zeilen/Gruppen aus mehreren Zeilen, verfügbar für den ANOVA-Test; ####p < 0,0001 durch D0 und ***p < 0,001 oder ****p < 0,0001 durch D12 Strg). b Repräsentative Bilder und Quantifizierung von Herzschnitten, die mit Masson-Trichrom-Färbung angefärbt wurden (Maßstabsbalken = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD und D12 MC), 9 (D12 MT) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, durchgeführte einfaktorielle ANOVA; ####p < 0,0001 vs. D0 und ***p < 0,001 oder ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD和D12 MC）, 来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组, 进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0,001 oder ****p < 0,0001 与D12 Strg-Befehl） b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td und d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组,进行单因素方差分析；####p < 0,0001 与D0 ***p < 0,001, ****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比） b Repräsentative Bildauflösung und kollidierendes Ergebnis, begrenzte dreifache Auflösung von Masson (maximale Länge = 500 Mio. m) (n = 10 (D0, D12 Strg, D12 TD und D12 MC), 9 (D12 MT) Abschnitte über verschiedene Gruppen/Gruppen, oder auch ANOVA; ####p < 0,0001 durch D0, ***p < 0,001 oder ****p < 0,0001 durch D12 Strg). b Repräsentative Bilder und Quantifizierung von mit Masson-Trichrom gefärbten Herzschnitten (Maßstabsbalken = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD und D12 MC), 9 (D12 MT) Schnitte von verschiedenen Schweinen/Gruppe, eine ANOVA-Methode; ####p < 0,0001 im Vergleich zu D0, ***p < 0,001 oder ****p < 0,0001 im Vergleich zu D12 Ctrl).Die Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar.
Schließlich wurde die Fähigkeit von CTCM, eine Herzhypertrophie zu simulieren, durch Steigerung der Dehnung des Herzgewebes untersucht. In CTCM stieg der maximale Luftkammerdruck von 80 mmHg (normale Dehnung) auf bis zu 140 mmHg (Abb. 6a). Dies entspricht einer Dehnungszunahme von 32 % (Abb. 6b), was zuvor als die prozentuale Dehnung beschrieben wurde, die erforderlich ist, damit Herzabschnitte eine ähnliche Sarkomerlänge wie bei Hypertrophie erreichen. Dehnung und Geschwindigkeit des Herzgewebes während Kontraktion und Relaxation blieben über sechs Tage in Kultur konstant (Abb. 6c). Herzgewebe aus MT-Bedingungen wurde sechs Tage lang normaler Dehnung (MT (Normal)) oder Überdehnung (MT (OS)) ausgesetzt. Bereits nach vier Tagen in Kultur war der Hypertrophie-Biomarker NT-ProBNP im Medium unter MT (OS)-Bedingungen im Vergleich zu MT (normalen) Bedingungen signifikant erhöht (Abb. 7a). Darüber hinaus war die Zellgröße in MT (OS) nach sechstägiger Kultivierung (Abb. 7b) im Vergleich zu MT-Herzgewebe (normal) signifikant erhöht. Auch die nukleäre Translokation von NFATC4 war in überdehntem Gewebe signifikant gesteigert (Abb. 7c). Diese Ergebnisse belegen die fortschreitende Entwicklung pathologischer Umbauprozesse nach Hyperdistension und stützen die Annahme, dass das CTCM-Gerät als Plattform zur Untersuchung der Signalwege dehnungsinduzierter kardialer Hypertrophie genutzt werden kann.
Repräsentative Messkurven für Luftkammerdruck, Flüssigkeitskammerdruck und Gewebebewegung bestätigen, dass der Kammerdruck den Flüssigkeitskammerdruck verändert und dadurch eine entsprechende Bewegung des Gewebeschnitts bewirkt. b Repräsentative Kurven für Dehnungsprozentsatz und Dehnungsrate für normal gedehnte (orange) und überdehnte (blau) Gewebeschnitte. c Balkendiagramm mit Zykluszeit (n = 19 Schnitte pro Gruppe, von verschiedenen Schweinen), Kontraktionszeit (n = 18–19 Schnitte pro Gruppe, von verschiedenen Schweinen), Relaxationszeit (n = 19 Schnitte pro Gruppe, von verschiedenen Schweinen), Amplitude der Gewebebewegung (n = 14 Schnitte/Gruppe, von verschiedenen Schweinen), systolischer Spitzengeschwindigkeit (n = 14 Schnitte/Gruppe, von verschiedenen Schweinen) und maximaler Relaxationsrate (n = 14 (D0), 15 (D6) Schnitte/Gruppen) von verschiedenen Schweinen). Der zweiseitige t-Test nach Student zeigte keinen signifikanten Unterschied in den Parametern, was darauf hindeutet, dass diese Parameter während der 6-tägigen Kultivierung mit Überspannung konstant blieben. Die Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar.
a Balkendiagramm zur Quantifizierung der NT-ProBNP-Konzentration in Kulturmedien von Herzschnitten, die unter normalen Dehnungsbedingungen (Norm) oder Überdehnungsbedingungen (OS) kultiviert wurden (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm und D4 MTOS) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen; es wurde eine Zwei-Wege-ANOVA durchgeführt; **p < 0,01 im Vergleich zur normalen Dehnung). a Balkendiagramm zur Quantifizierung der NT-ProBNP-Konzentration in Kulturmedien von Herzschnitten, die unter normalen Dehnungsbedingungen (Norm) oder Überdehnungsbedingungen (OS) kultiviert wurden (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm und D4 MTOS) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen; es wurde eine Zwei-Wege-ANOVA durchgeführt; **p < 0,01 im Vergleich zu normaler Dehnung).Quantitatives Histogramm der NT-ProBNP-Konzentration im Kulturmedium von Herzschnitten, die unter Bedingungen normaler MT-Dehnung (norm) oder Überdehnung (OS) kultiviert wurden (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm und D4 MTOS) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen; es wurde eine zweifaktorielle Varianzanalyse durchgeführt.**p < 0,01 im Vergleich zur normalen Norm. **p < 0,01 im Vergleich zur normalen Dehnung). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm), 3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01)。 a Quantifizierung der NT-ProBNP-Konzentration in Herzschnitten, die unter MT-Bedingungen mit normaler Dehnung (Norm) oder Überdehnung (OS) kultiviert wurden (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm und D4 MTOS) aus verschiedenen 猪的切片/组，可以双向方方发发动; **im Vergleich zu normal Dehnung, p < 0,01).Histogramm Quantifizierung der NT-ProBNP-Konzentrationen in Herzschnitten, die unter Bedingungen normaler MT-Dehnung (norm) oder Überdehnung (OS) kultiviert wurden (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) und D4 MTOS) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen, zweifaktorielle Varianzanalyse;**p < 0,01 im Vergleich zur normalen Norm. **p < 0,01 im Vergleich zur normalen Dehnung). b Repräsentative Bilder von Herzschnitten, die mit Troponin-T und WGA gefärbt wurden (links), sowie Zellgrößenquantifizierung (rechts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) Zellen/Gruppe aus 10 verschiedenen Schnitten von verschiedenen Schweinen; es wurde ein zweiseitiger Student-t-Test durchgeführt; ****p < 0,0001 im Vergleich zur normalen Dehnung). b Repräsentative Bilder von Herzschnitten, die mit Troponin-T und WGA gefärbt wurden (links), sowie Zellgrößenquantifizierung (rechts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) Zellen/Gruppe aus 10 verschiedenen Schnitten von verschiedenen Schweinen; es wurde ein zweiseitiger Student-t-Test durchgeführt; ****p < 0,0001 im Vergleich zur normalen Dehnung). b Repräsentative Bildsequenzen in einer Reihe von sechs, dreistelligen Trophäen-T- und Azoren-Zentren (klein) und einer großen Anzahl von Objekten (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 bei normaler Auflösung). b Repräsentative Bilder von Herzschnitten, die mit Troponin-T und AZP gefärbt wurden (links), und Zellgrößenquantifizierung (rechts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) Zellen/Gruppe aus 10 verschiedenen Schnitten von verschiedenen Schweinen, es wurde ein zweiseitiger Student's t-Test durchgeführt; ****p < 0,0001 im Vergleich zum normalen Stamm). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS）, Version 10, Version 369 (D6 MTNorm), 两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比,****p < 0.0001）。 b Repräsentative Bilder von Herzschnitten, die mit Calcarein-T und WGA gefärbt wurden (links), sowie die Zellgröße (rechts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 aus 10 verschiedenen Schnitten (D6 MTNorm)). Zellen/Gruppe, zwei Methoden, t-Test; im Vergleich zur normalen Dehnung, ****p < 0,0001). b Repräsentative Bildsequenzen im Halbfinale, begrenzte Trophäen-T- und Azoren-Inseln (später) und koloniale Meeresspiegel (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ab 10 различных срезов от разных свиней Клетки/group, двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 bei normaler Auflösung). b Repräsentative Bilder von Herzschnitten, die mit Troponin-T und AZP gefärbt wurden (links), und Quantifizierung der Zellgröße (rechts) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) aus 10 verschiedenen Schnitten von verschiedenen Schweinen) Zellen/Gruppe, zweiseitiger Student's t-Test; ****p < 0,0001 im Vergleich zum normalen Stamm). c Repräsentative Bilder von MTOS-Herzschnitten an Tag 0 und Tag 6, die immunmarkiert wurden für Troponin-T und NFATC4, sowie Quantifizierung der Translokation von NFATC4 in die Zellkerne der Kardiomyozyten (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen; es wurde ein zweiseitiger Student-t-Test durchgeführt; *p < 0,05). c Repräsentative Bilder von MTOS-Herzschnitten an Tag 0 und Tag 6, die immunmarkiert wurden für Troponin-T und NFATC4, sowie Quantifizierung der Translokation von NFATC4 in die Zellkerne der Kardiomyozyten (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen; es wurde ein zweiseitiger Student-t-Test durchgeführt; *p < 0,05). c Repräsentative Bilder für MTOS-Sätze 0 und 6 Tage, Immunimmunisierung für Tropon-T und NFATC4, und eine umfassende Analyse der NFATC4-Transformation im Jahr Kavernöse Blöcke (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) Stufen/Gruppen aus mehreren Spalten, ausgewählt aus einer doppelten T-Kriterien-Stufe; *p < 0,05). c Repräsentative Bilder von Herzschnitten an den Tagen 0 und 6 MTOS, immunmarkiert für Troponin-T und NFATC4, und Quantifizierung der NFATC4-Translokation im Zellkern von Schwellkörperzellen (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) Schnitte/Gruppe von verschiedenen Schweinen; zweiseitiger Student's t-Test; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS Weitere Informationen finden Sie unter NFATC4 und CM.切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)。 c Repräsentative Bilder der Calcanin-T- und NFATC4-Immunmarkierung mit 0,6 MTOS-Herzschnitten und NFATC4 aus verschiedenen NFATC4-CM-Zellkern-Mengen (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/µ,时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные зозображения срезов сердца MTOS on 0 and 6 day for immunмаркировки тропонином-Т und NFATC4 and количественная оценка транслокации NFATTC4 в ядра CM ot Anzahl der sechs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) Abschnitte/Gruppen, zwei verschiedene T-Kriterien-Stufen; *p < 0,05). c Repräsentative Bilder von MTOS-Herzschnitten an Tag 0 und 6 für die Immunmarkierung von Troponin-T und NFATC4 sowie die Quantifizierung der NFATC4-Translokation im Zellkern von Kardiomyozyten verschiedener Schweine (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) Schnitte/Gruppe, zweiseitiger t-Test nach Student; *p < 0,05).Die Fehlerbalken stellen den Mittelwert ± Standardabweichung dar.
Die translationale kardiovaskuläre Forschung benötigt Zellmodelle, die die kardiale Umgebung präzise nachbilden. In dieser Studie wurde ein CTCM-Gerät entwickelt und charakterisiert, das ultradünne Herzschnitte stimulieren kann. Das CTCM-System umfasst eine physiologisch synchronisierte elektromechanische Stimulation sowie die Anreicherung von T3- und Dexamethason-haltiger Flüssigkeit. Nach 12-tägiger Kultivierung von Schweineherzschnitten unter diesen Bedingungen blieben deren Viabilität, strukturelle Integrität, metabolische Aktivität und Transkription unverändert im Vergleich zu frischem Herzgewebe. Darüber hinaus kann eine übermäßige Dehnung des Herzgewebes zu einer Hypertrophie durch Überstreckung führen. Insgesamt unterstreichen diese Ergebnisse die entscheidende Rolle physiologischer Kulturbedingungen für die Aufrechterhaltung eines normalen kardialen Phänotyps und bieten eine Plattform für das Wirkstoff-Screening.
Zahlreiche Faktoren tragen zur Schaffung optimaler Bedingungen für die Funktion und das Überleben von Kardiomyozyten bei. Die wichtigsten dieser Faktoren sind (1) interzelluläre Interaktionen, (2) elektromechanische Stimulation, (3) humorale Faktoren und (4) metabolische Substrate. Physiologische Zell-Zell-Interaktionen erfordern komplexe dreidimensionale Netzwerke verschiedener Zelltypen, die von einer extrazellulären Matrix gestützt werden. Solche komplexen zellulären Interaktionen lassen sich in vitro durch Kokultur einzelner Zelltypen nur schwer nachbilden, können aber mithilfe der organotypischen Eigenschaften von Herzschnitten leicht erreicht werden.
Mechanische Dehnung und elektrische Stimulation von Kardiomyozyten sind entscheidend für den Erhalt des kardialen Phänotyps^33,34,35. Während mechanische Stimulation häufig zur Konditionierung und Reifung von hiPSC-CM eingesetzt wird, haben sich in jüngster Zeit mehrere elegante Studien mit der mechanischen Stimulation von Herzschnitten in Kultur mittels uniaxialer Belastung befasst. Diese Studien zeigen, dass eine zweidimensionale uniaxiale mechanische Belastung einen positiven Effekt auf den Phänotyp des Herzens während der Kultur hat. In diesen Studien wurden Herzschnitte entweder mit isometrischen Zugkräften¹⁷ oder linearer auxotonischer Belastung¹⁸ beaufschlagt, oder der Herzzyklus wurde mithilfe von Kraftaufnehmer-Feedback und Zugantrieben nachgebildet. Diese Methoden nutzen jedoch eine uniaxiale Gewebedehnung ohne Optimierung der Umgebungsbedingungen, was zur Unterdrückung vieler kardialer Gene oder zur Überexpression von Genen führt, die mit abnormalen Dehnungsreaktionen assoziiert sind. Das hier beschriebene CTCM bietet einen dreidimensionalen elektromechanischen Stimulus, der den natürlichen Herzzyklus hinsichtlich Zykluszeit und physiologischer Dehnung (25 % Dehnung, 40 % Systole, 60 % Diastole und 72 Schläge pro Minute) nachahmt. Obwohl diese dreidimensionale mechanische Stimulation allein nicht ausreicht, um die Gewebeintegrität aufrechtzuerhalten, ist eine Kombination aus humoraler und mechanischer Stimulation mit T3/Dex erforderlich, um die Lebensfähigkeit, Funktion und Integrität des Gewebes adäquat zu erhalten.
Humorale Faktoren spielen eine wichtige Rolle bei der Modulation des Phänotyps des adulten Herzens. Dies wurde in HiPS-CM-Studien hervorgehoben, in denen T3 und Dexamethason dem Kulturmedium zugesetzt wurden, um die Zellreifung zu beschleunigen. T3 kann den Transport von Aminosäuren, Zuckern und Kalzium durch die Zellmembranen beeinflussen³⁶. Darüber hinaus fördert T3 die MHC-α-Expression und die Herunterregulierung von MHC-β, wodurch die Bildung von schnell zuckenden Myofibrillen in reifen Kardiomyozyten im Vergleich zu langsam zuckenden Myofibrillen in fetalen Kardiomyozyten begünstigt wird. Ein T3-Mangel bei Patienten mit Hypothyreose führt zum Verlust von Myofibrillenbändern und einer verringerten Tonusentwicklung³⁷. Dexamethason wirkt auf Glukokortikoidrezeptoren und erhöht nachweislich die myokardiale Kontraktilität in isolierten, perfundierten Herzen;³⁸ diese Verbesserung wird mit dem Effekt auf den Kalzium-Einstrom durch Ablagerungen (SOCE) in Verbindung gebracht^39,40. Darüber hinaus bindet Dex an seine Rezeptoren und löst eine breite intrazelluläre Reaktion aus, die die Immunfunktion und Entzündungen unterdrückt30.
Unsere Ergebnisse zeigen, dass die physikalische mechanische Stimulation (MS) die Gesamtleistung der Zellkultur im Vergleich zur Kontrollgruppe (Ctrl) verbesserte, jedoch die Lebensfähigkeit, die strukturelle Integrität und die Expression kardialer Gene über 12 Tage in Kultur nicht aufrechterhalten konnte. Im Vergleich zur Kontrollgruppe verbesserte die Zugabe von T3 und Dexamethason (Dex) zu CTCM-Kulturen (MT) die Lebensfähigkeit und erhielt über 12 Tage ähnliche Transkriptionsprofile, strukturelle Integrität und metabolische Aktivität wie frisches Herzgewebe. Darüber hinaus wurde durch die Kontrolle des Dehnungsgrades des Gewebes mithilfe von STCM ein Modell der durch Überdehnung induzierten Herzhypertrophie erstellt, was die Vielseitigkeit des STCM-Systems verdeutlicht. Es ist anzumerken, dass kardiales Remodeling und Fibrose zwar üblicherweise intakte Organe betreffen, deren zirkulierende Zellen die entsprechenden Zytokine sowie Phagozytose und andere Remodeling-Faktoren bereitstellen können, Herzschnitte jedoch dennoch den fibrotischen Prozess als Reaktion auf Stress und Trauma nachahmen können. Dies wurde bereits zuvor in diesem Herzschnittmodell untersucht. Es ist anzumerken, dass die CTCM-Parameter durch Änderung von Druck/elektrischer Amplitude und Frequenz moduliert werden können, um verschiedene Zustände wie Tachykardie, Bradykardie und mechanische Kreislaufunterstützung (mechanisch entlastetes Herz) zu simulieren. Dies macht das System für Arzneimitteltests mit mittlerem Durchsatz geeignet. Die Fähigkeit von CTCM, überanstrengungsbedingte Herzhypertrophie zu modellieren, ebnet den Weg für die Erprobung dieses Systems im Hinblick auf personalisierte Therapien. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Studie, dass mechanische Dehnung und humorale Stimulation entscheidend für die Aufrechterhaltung der Kultur von Herzgewebeschnitten sind.
Obwohl die hier präsentierten Daten nahelegen, dass CTCM eine vielversprechende Plattform zur Modellierung des intakten Myokards darstellt, weist diese Kulturmethode einige Einschränkungen auf. Die Hauptbeschränkung der CTCM-Kultur besteht darin, dass sie kontinuierliche dynamische mechanische Belastungen auf die Gewebeschnitte ausübt, wodurch die aktive Überwachung der Kontraktionen der Herzschnitte während jedes Zyklus unmöglich wird. Aufgrund der geringen Größe der Herzschnitte (7 mm) ist zudem die Beurteilung der systolischen Funktion außerhalb von Kultursystemen mit herkömmlichen Kraftsensoren eingeschränkt. In der vorliegenden Arbeit wird diese Einschränkung teilweise durch die Auswertung der optischen Spannung als Indikator für die Kontraktionsfunktion überwunden. Diese Einschränkung erfordert jedoch weitere Forschung und kann zukünftig durch die Einführung von Methoden zur optischen Überwachung der Funktion von Herzschnitten in Kultur, wie beispielsweise optisches Mapping mit Kalzium- und spannungssensitiven Farbstoffen, behoben werden. Eine weitere Einschränkung von CTCM besteht darin, dass das Arbeitsmodell physiologische Belastungen (Vor- und Nachlast) nicht manipuliert. Bei CTCM wurde Druck in entgegengesetzte Richtungen induziert, um eine physiologische Dehnung von 25 % in Diastole (volle Dehnung) und Systole (Kontraktionslänge während der elektrischen Stimulation) in sehr großen Geweben zu reproduzieren. Diese Einschränkung sollte bei zukünftigen CTCM-Designs durch ausreichenden Druck auf das Herzgewebe von beiden Seiten und durch Anwendung der exakten Druck-Volumen-Beziehungen, die in den Herzkammern auftreten, beseitigt werden.
Die in diesem Manuskript beschriebene, durch Überdehnung induzierte Remodellierung beschränkt sich auf die Nachahmung hypertrophischer Überdehnungssignale. Daher kann dieses Modell zur Untersuchung der dehnungsinduzierten hypertrophischen Signalgebung beitragen, ohne dass humorale oder neuronale Faktoren (die in diesem System nicht vorhanden sind) benötigt werden. Weitere Studien sind erforderlich, um die Vielfalt der CTCM zu erhöhen, beispielsweise durch Kokultur mit Immunzellen, zirkulierenden humoralen Plasmafaktoren und Innervation. Die Kokultur mit neuronalen Zellen wird die Möglichkeiten der Krankheitsmodellierung mit CTCM verbessern.
In dieser Studie wurden dreizehn Schweine verwendet. Alle Tierversuche wurden gemäß den institutionellen Richtlinien durchgeführt und vom Institutional Animal Care and Use Committee der Universität Louisville genehmigt. Der Aortenbogen wurde abgeklemmt und das Herz mit 1 l steriler Kardioplegielösung (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/ml Heparin, pH bis 7,4) perfundiert; Die Herzen wurden in eiskalter Kardioplegielösung konserviert, bis sie auf Eis ins Labor transportiert wurden, was in der Regel weniger als 10 Minuten dauerte. Die Herzen wurden in eiskalter Kardioplegielösung konserviert, bis sie auf Eis ins Labor transportiert wurden, was in der Regel weniger als 10 Minuten dauerte. Die Dauer der Herz-Kreislauf-Erkrankung beträgt weniger als 10 Minuten. Die Herzen wurden bis zum Transport ins Labor auf Eis in eiskalter Kardioplegielösung aufbewahrt, was in der Regel weniger als 10 Minuten dauert.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中, 直到冰上运送到实验室, 通常<10分钟.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中, 直到冰上运送到实验室, 通常<10分钟. Bringen Sie die Blutgefäße in die Herz-Kreislauf-Erkrankung zum Transport in Laboratorien auf die Straße, mindestens 10 Minuten. Die Herzen werden bis zum Transport ins Labor auf Eis gelagert, die Kardioplegie dauert in der Regel weniger als 10 Minuten.
Das CTCM-Gerät wurde mit der CAD-Software SolidWorks entwickelt. Die Kulturkammern, Trennwände und Luftkammern bestehen aus CNC-gefrästem, transparentem Acrylglas. Der 7 mm durchmessende Stützring ist in der Mitte aus hochdichtem Polyethylen (HDPE) gefertigt und verfügt über eine O-Ring-Nut zur Aufnahme des Silikon-O-Rings, der das darunterliegende Medium abdichtet. Eine dünne Silikamembran trennt die Kulturkammer von der Trennplatte. Die Silikonmembran wird lasergeschnitten aus 0,5 mm dickem Silikonmaterial und hat eine Härte von 35A. Die unteren und oberen Silikondichtungen werden lasergeschnitten aus 1,6 mm dickem Silikonmaterial und haben eine Härte von 50A. Schrauben und Flügelmuttern aus Edelstahl 316L dienen zur Befestigung des Blocks und gewährleisten eine luftdichte Abdichtung.
Eine spezielle Leiterplatte (PCB) wurde für die Integration in das C-PACE-EM-System entwickelt. Die Steckverbinder der Leiterplatte sind über versilberte Kupferdrähte und in die Elektroden eingeschraubte Bronzeschrauben (0-60) mit Graphitelektroden verbunden. Die Leiterplatte wird in das Gehäuse des 3D-Druckers eingesetzt.
Das CTCM-Gerät wird von einem programmierbaren pneumatischen Aktor (PPD) gesteuert, der einen kontrollierten Kreislaufdruck erzeugt, der dem Herzzyklus ähnelt. Mit steigendem Druck in der Luftkammer dehnt sich die flexible Silikonmembran nach oben aus und presst das Medium unter das Gewebe. Durch diesen Flüssigkeitsausstoß wird das Gewebe gedehnt, was die physiologische Ausdehnung des Herzens während der Diastole nachahmt. Im Entspannungsmaximum wurde über Graphitelektroden eine elektrische Stimulation durchgeführt, die den Druck in der Luftkammer reduzierte und eine Kontraktion der Gewebeabschnitte bewirkte. Im Inneren des Rohrs befindet sich ein Hämostaseventil mit einem Drucksensor zur Messung des Drucks im Luftsystem. Der vom Drucksensor erfasste Druck wird an einen mit dem Laptop verbundenen Datensammler weitergeleitet. Dies ermöglicht die kontinuierliche Überwachung des Drucks in der Gaskammer. Sobald der maximale Kammerdruck erreicht war (Standard 80 mmHg, 140 mmHg OS), wurde der Datenerfassungsgerät angewiesen, ein Signal an das C-PACE-EM-System zu senden, um ein biphasisches Spannungssignal von 4 V für 2 ms zu generieren.
Herzabschnitte wurden entnommen und die Kulturbedingungen in 6 Vertiefungen wie folgt durchgeführt: Die entnommenen Herzen wurden aus dem Transfergefäß in eine Schale mit kalter (4 °C) Kardioplegielösung überführt. Der linke Ventrikel wurde mit einer sterilen Klinge isoliert und in 1–2 cm³ große Stücke geschnitten. Diese Gewebeblöcke wurden mit Gewebekleber auf Gewebeträger geklebt und in ein vibrierendes Mikrotom-Gewebebad mit Tyrode-Lösung und kontinuierlicher Sauerstoffzufuhr (3 g/L 2,3-Butandionmonooxim (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-Glucose (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl₂ (1 ml 1 M Lösung), 1,8 mM CaCl₂ (1,8 ml 1 M Lösung), aufgefüllt auf 1 L ddH₂O) gegeben. Das Vibrationsmikrotom wurde so eingestellt, dass es 300 µm dicke Schnitte mit einer Frequenz von 80 Hz, einer horizontalen Vibrationsamplitude von 2 mm und einer Vorschubgeschwindigkeit von 0,03 mm/s schnitt. Das Gewebebad war mit Eis umgeben, um die Lösung kühl zu halten, und die Temperatur wurde bei 4 °C gehalten. Die Gewebeschnitte wurden aus dem Mikrotombad in ein Inkubationsbad mit kontinuierlich mit Sauerstoff angereicherter Tyrode-Lösung auf Eis überführt, bis genügend Schnitte für eine Kulturplatte gewonnen waren. Für Transwell-Kulturen wurden die Gewebeschnitte auf sterile, 6 mm breite Polyurethan-Träger aufgebracht und in 6 ml optimiertes Medium (Medium 199, 1x ITS-Supplement, 10 % FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalisch und 2x Antibiotikum-Antimykotikum) gegeben. Die Gewebeschnitte wurden mittels C-Pace elektrisch stimuliert (10 V, Frequenz 1,2 Hz). Für die TD-Bedingungen wurden frisches T3 und Dex bei jedem Mediumwechsel in Konzentrationen von 100 nM bzw. 1 μM zugegeben. Das Medium wurde dreimal täglich vor dem Austausch mit Sauerstoff gesättigt. Gewebeschnitte wurden in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ kultiviert.
Für die CTCM-Kulturen wurden Gewebeschnitte in einer Petrischale mit modifizierter Tyrode-Lösung auf einem speziell angefertigten 3D-Drucker platziert. Die Vorrichtung vergrößert die Herzschnitte um 25 % der Fläche des Stützrings. Dadurch wird verhindert, dass sich die Herzschnitte nach dem Überführen aus der Tyrode-Lösung in das Medium und während der Diastole dehnen. Mithilfe von Histoacrylatkleber wurden 300 µm dicke Schnitte auf einem Stützring mit 7 mm Durchmesser fixiert. Nach dem Aufkleben der Gewebeschnitte auf den Stützring wurden die überstehenden Gewebestücke abgeschnitten und die fixierten Gewebeschnitte zurück in das Tyrode-Lösungsbad auf Eis (4 °C) gelegt, bis genügend Schnitte für eine Vorrichtung vorbereitet waren. Die Gesamtbearbeitungszeit für alle Vorrichtungen sollte 2 Stunden nicht überschreiten. Nachdem 6 Gewebeschnitte auf ihren Stützringen befestigt waren, wurde die CTCM-Vorrichtung zusammengebaut. Die CTCM-Kulturkammer wurde mit 21 ml voroxygeniertem Medium vorgefüllt. Die Gewebeschnitte wurden in die Kulturkammer überführt und eventuell vorhandene Luftblasen vorsichtig mit einer Pipette entfernt. Das Gewebestück wird in die Öffnung eingeführt und vorsichtig angedrückt. Anschließend wird die Elektrodenkappe auf das Gerät gesetzt und dieses in den Inkubator überführt. Danach wird das CTCM an den Luftschlauch und das C-PACE-EM-System angeschlossen. Der pneumatische Aktor öffnet sich und das Luftventil öffnet das CTCM. Das C-PACE-EM-System wurde so konfiguriert, dass es während der biphasischen Stimulation für 2 ms 4 V bei 1,2 Hz abgibt. Das Medium wurde zweimal täglich und die Elektroden einmal täglich gewechselt, um Graphitablagerungen an den Elektroden zu vermeiden. Bei Bedarf können die Gewebestücke aus ihren Kulturgefäßen entnommen werden, um eventuell darunter befindliche Luftblasen zu entfernen. Für die MT-Behandlung wurde T3/Dex bei jedem Mediumwechsel frisch zugegeben (100 nM T3 und 1 μM Dex). Die CTCM-Geräte wurden in einem Inkubator bei 37 °C und 5 % CO₂ kultiviert.
Zur Erfassung gestreckter Bewegungsbahnen von Herzschnitten wurde ein spezielles Kamerasystem entwickelt. Eine Spiegelreflexkamera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japan) wurde mit einem Navitar Zoom 7000 18-108mm Makroobjektiv (Navitar, San Francisco, CA, USA) verwendet. Die Visualisierung erfolgte bei Raumtemperatur nach dem Austausch des Mediums. Die Kamera war in einem Winkel von 51° positioniert, und die Videoaufzeichnung erfolgte mit 30 Bildern pro Sekunde. Zunächst wurde die Bewegung der Herzschnitte mithilfe der Open-Source-Software MUSCLEMOTION43 in Verbindung mit ImageJ quantifiziert. Die Maske zur Definition von Bereichen von Interesse für schlagende Herzschnitte, um Rauschen zu vermeiden, wurde mit MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) erstellt. Manuell segmentierte Masken wurden auf alle Bilder einer Bildsequenz angewendet und anschließend an das MUSCLEMOTION-Plug-in übergeben. Muscle Motion verwendet die durchschnittliche Pixelintensität jedes Bildes, um dessen Bewegung relativ zum Referenzbild zu quantifizieren. Die Daten wurden aufgezeichnet, gefiltert und zur Quantifizierung der Zykluszeit sowie zur Beurteilung der Gewebedehnung während des Herzzyklus verwendet. Das aufgezeichnete Video wurde anschließend mit einem digitalen Nullphasenfilter erster Ordnung nachbearbeitet. Zur Quantifizierung der Gewebedehnung (Spitze-zu-Spitze) wurde eine Spitze-zu-Spitze-Analyse durchgeführt, um zwischen Spitzen und Tälern im aufgezeichneten Signal zu unterscheiden. Zusätzlich wurde eine Trendbereinigung mittels eines Polynoms 6. Ordnung durchgeführt, um Signalabweichungen zu eliminieren. Zur Bestimmung der globalen Gewebebewegung, der Zykluszeit, der Relaxationszeit und der Kontraktionszeit wurde ein Programmcode in MATLAB entwickelt (siehe ergänzender Programmcode 44).
Für die Dehnungsanalyse verwendeten wir dieselben Videos wie für die mechanische Dehnungsmessung. Zunächst zeichneten wir mithilfe der MUSCLEMOTION-Software zwei Bilder nach, die die Bewegungsmaxima (den höchsten (oberen) und den niedrigsten (unteren) Punkt der Bewegung) darstellten. Anschließend segmentierten wir die Gewebebereiche und wendeten einen Schattierungsalgorithmus auf das segmentierte Gewebe an (Ergänzende Abb. 2a). Das segmentierte Gewebe wurde dann in zehn Teilflächen unterteilt, und die Spannung auf jeder Fläche wurde mithilfe der folgenden Gleichung berechnet: Dehnung = (Sup-Sdown)/Sdown, wobei Sup und Sdown die Abstände der Form von den oberen bzw. unteren Schatten des Gewebes darstellen (Ergänzende Abb. 2b).
Herzabschnitte wurden 48 Stunden lang in 4%igem Paraformaldehyd fixiert. Anschließend wurden die fixierten Gewebe jeweils eine Stunde lang in 10%iger und 20%iger Saccharoselösung und danach über Nacht in 30%iger Saccharoselösung entwässert. Die Schnitte wurden dann in OCT-Einbettmedium eingebettet und in einem Isopentan-Trockeneis-Bad schrittweise eingefroren. Die OCT-Einbettungsblöcke wurden bis zur Weiterverarbeitung bei -80 °C gelagert. Die Präparate wurden als 8 μm dicke Schnitte angefertigt.
Um OCT von Herzschnitten zu entfernen, werden die Objektträger 5 Minuten lang auf einem Heizblock bei 95 °C erhitzt. Anschließend werden 1 ml PBS auf jeden Objektträger gegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Danach werden die Schnitte durch Zugabe von 0,1 % Triton X-100 in PBS für 15 Minuten bei Raumtemperatur permeabilisiert. Um die Bindung unspezifischer Antikörper an die Probe zu verhindern, werden 1 ml einer 3%igen BSA-Lösung auf die Objektträger gegeben und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wird die BSA-Lösung entfernt und die Objektträger mit PBS gewaschen. Jede Probe wird mit einem Bleistift markiert. Primäre Antikörper (1:200 in 1 % BSA verdünnt) (Connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) und Troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960)) wurden über 90 Minuten zugegeben, anschließend sekundäre Antikörper (1:200 in 1 % BSA verdünnt) gegen Maus-Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079) und gegen Kaninchen-Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) für weitere 90 Minuten. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurde zur Unterscheidung der Zielfärbung vom Hintergrund nur der sekundäre Antikörper als Kontrolle verwendet. Abschließend wurde DAPI-Kernfärbung hinzugefügt, die Objektträger in Vectashield (Vector Laboratories) eingebettet und mit Nagellack versiegelt. Die Präparate wurden mit einem Keyence-Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung (-x Vergrößerung) untersucht.
Für die WGA-Färbung wurde WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) in einer Konzentration von 5 μg/ml in PBS verwendet und 30 Minuten bei Raumtemperatur auf fixierte Gewebeschnitte aufgetragen. Anschließend wurden die Objektträger mit PBS gewaschen, Sudan Black auf jeden Objektträger gegeben und weitere 30 Minuten inkubiert. Nach erneutem Waschen mit PBS wurde Vectashield-Einbettungsmedium aufgetragen. Die Präparate wurden mit einem Keyence-Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung visualisiert.
OCT wurde wie oben beschrieben von den Proben entfernt. Nach der OCT-Entfernung wurden die Objektträger über Nacht in Bouinscher Lösung inkubiert. Anschließend wurden sie 1 Stunde lang mit destilliertem Wasser gespült und danach 10 Minuten lang in eine Bibrich-Aloe-Säurefuchsin-Lösung eingelegt. Danach wurden die Objektträger erneut mit destilliertem Wasser gewaschen und 10 Minuten lang in eine Lösung aus 5 % Phosphormolybdän und 5 % Phosphorwolframsäure inkubiert. Ohne vorheriges Spülen wurden die Objektträger direkt für 15 Minuten in Anilinblaulösung überführt. Anschließend wurden sie mit destilliertem Wasser gewaschen und 2 Minuten lang in eine 1%ige Essigsäurelösung eingelegt. Die Objektträger wurden in 200 N Ethanol getrocknet und in Xylol überführt. Die gefärbten Objektträger wurden mit einem Keyence-Mikroskop mit 10-facher Vergrößerung visualisiert. Der prozentuale Anteil der Fibrosefläche wurde mit der Keyence Analyzer Software quantifiziert.
Der CyQUANT™ MTT-Zellviabilitätstest (Invitrogen, Carlsbad, CA), Katalognummer V13154, wurde gemäß Herstellerprotokoll mit einigen Modifikationen durchgeführt. Insbesondere wurde eine chirurgische Stanzzange mit einem Durchmesser von 6 mm verwendet, um eine einheitliche Gewebegröße während der MTT-Analyse zu gewährleisten. Die Gewebeproben wurden einzeln in die Vertiefungen einer 12-Well-Platte mit MTT-Substrat gemäß Herstellerprotokoll pipettiert. Die Schnitte wurden 3 Stunden bei 37 °C inkubiert, wobei das lebende Gewebe das MTT-Substrat zu einer violetten Formazanverbindung metabolisierte. Die MTT-Lösung wurde durch 1 ml DMSO ersetzt und die Proben weitere 15 Minuten bei 37 °C inkubiert, um das violette Formazan aus den Herzschnitten zu extrahieren. Die Proben wurden 1:10 in DMSO verdünnt und in 96-Well-Platten mit klarem Boden überführt. Die Intensität der violetten Färbung wurde bei 570 nm mit einem Cytation-Plattenlesegerät (BioTek) gemessen. Die Messwerte wurden auf das Gewicht jedes Herzschnitts normiert.
Das Medium der Herzschnitte wurde durch Medium mit 1 μCi/ml [5-3H]-Glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) für den Glucoseverbrauchstest, wie zuvor beschrieben, ersetzt. Nach 4 Stunden Inkubation wurden 100 μl Medium in ein offenes Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 μl 0,2 N HCl gegeben. Anschließend wurde das Röhrchen in ein Szintillationsröhrchen mit 500 μl dH₂O gestellt, um das [3H]₂O 72 Stunden lang bei 37 °C zu verdampfen. Danach wurde das Mikrozentrifugenröhrchen aus dem Szintillationsröhrchen entnommen und 10 ml Szintillationsflüssigkeit hinzugegeben. Die Szintillationszählung erfolgte mit einem Tri-Carb 2900TR Flüssigszintillationszähler (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). Die Glukoseverwertung wurde unter Berücksichtigung der spezifischen Aktivität von [5-3H]-Glukose, des unvollständigen Gleichgewichts und des Hintergrundsignals, der Verdünnung von [5-3H]-Glukose zu unmarkierter Glukose sowie der Effizienz des Szintillationszählers berechnet. Die Daten sind auf die Masse der Herzabschnitte normiert.
Nach der Gewebehomogenisierung in Trizol wurde RNA aus Herzschnitten mit dem Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 gemäß Herstellerprotokoll isoliert. Die RNAsec-Bibliothekspräparation, Sequenzierung und Datenanalyse wurden wie folgt durchgeführt:
Für die RNA-Bibliothekspräparation wurde 1 μg RNA pro Probe als Ausgangsmaterial verwendet. Die Sequenzierungsbibliotheken wurden mit dem NEBNext Ultra™ RNA Library Preparation Kit für Illumina (NEB, USA) gemäß den Herstellerangaben erstellt. Den Attributsequenzen jeder Probe wurden Indexcodes hinzugefügt. Kurz gesagt, wurde mRNA aus Gesamt-RNA mittels magnetischer Beads, die mit Poly-T-Oligonukleotiden gekoppelt waren, aufgereinigt. Die Fragmentierung erfolgte mit zweiwertigen Kationen bei hoher Temperatur im NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5x). Die cDNA des ersten Strangs wurde mit zufälligen Hexamerprimern und M-MuLV-Reverser Transkriptase (RNase H-) synthetisiert. Anschließend wurde die cDNA des zweiten Strangs mit DNA-Polymerase I und RNase H synthetisiert. Die verbleibenden Überhänge wurden durch Exonuklease-/Polymeraseaktivität in glatte Enden umgewandelt. Nach der Adenylierung des 3′-Endes des DNA-Fragments wurde ein NEBNext-Adapter mit Haarnadelstruktur angehängt, um es für die Hybridisierung vorzubereiten. Zur Selektion von cDNA-Fragmenten mit einer bevorzugten Länge von 150–200 bp wurden Bibliotheksfragmente mit dem AMPure XP-System (Beckman Coulter, Beverly, USA) aufgereinigt. Anschließend wurden 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) mit größenfraktionierter, mit einem Adapter ligierter cDNA 15 Minuten bei 37 °C und danach 5 Minuten bei 95 °C inkubiert, bevor die PCR durchgeführt wurde. Die PCR erfolgte mit Phusion High-Fidelity DNA-Polymerase, universellen PCR-Primern und Index-(X)-Primern. Die PCR-Produkte wurden abschließend erneut aufgereinigt (AMPure XP-System) und die Bibliotheksqualität mit einem Agilent Bioanalyzer 2100-System überprüft. Die cDNA-Bibliothek wurde anschließend mit einem NovaSeq-Sequenzer sequenziert. Die Rohbilddateien von Illumina wurden mit CASAVA Base Calling in Rohdaten umgewandelt. Die Rohdaten wurden in FASTQ(fq)-Dateien gespeichert, die die Sequenzen und die zugehörigen Basenqualitäten enthalten. Wählen Sie HISAT2, um gefilterte Sequenzierungs-Reads mit dem Referenzgenom Sscrofa11.1 abzugleichen. HISAT2 unterstützt generell Genome jeder Größe, einschließlich solcher mit mehr als 4 Milliarden Basenpaaren, und die meisten Parameter sind mit Standardwerten voreingestellt. Splicing-Reads aus RNA-Seq-Daten lassen sich mit HISAT2, dem derzeit schnellsten verfügbaren System, effizient und mit gleicher oder sogar höherer Genauigkeit als mit anderen Methoden ausrichten.
Die Transkriptmenge spiegelt direkt die Genexpression wider. Die Genexpression wird anhand der Transkriptmenge (Sequenzierungsanzahl) im Genom oder in Exons bestimmt. Die Anzahl der Reads ist proportional zur Genexpression, zur Genlänge und zur Sequenziertiefe. FPKM-Werte (Fragmente pro tausend Basenpaare sequenzierter Transkripte pro Million Basenpaare) wurden berechnet und die p-Werte der differentiellen Expression mithilfe des DESeq2-Pakets ermittelt. Anschließend wurde die Falsch-Entdeckungsrate (FDR) für jeden p-Wert nach der Benjamini-Hochberg-Methode⁹ anhand der integrierten R-Funktion „p.adjust“ berechnet.
Aus Herzschnitten isolierte RNA wurde mit dem SuperScript IV Vilo Mastermix von Thermo (Kat.-Nr. 11756050) in cDNA mit einer Konzentration von 200 ng/µl umgeschrieben. Die quantitative RT-PCR wurde mit einer transparenten 384-Well-Reaktionsplatte (Applied Biosystems Endura Plate Microamp, Thermo, Kat.-Nr. 4483319) und Microamp-Optikkleber (Thermo, Kat.-Nr. 4311971) durchgeführt. Die Reaktionsmischung enthielt pro Well 5 µl TaqMan Fast Advanced Mastermix (Thermo, Kat.-Nr. 4444557), 0,5 µl TaqMan-Primer und 3,5 µl H₂O. Standardmäßige qPCR-Zyklen wurden durchgeführt und die CT-Werte mit einem Applied Biosystems QuantStudio 5 Real-Time-PCR-Gerät (384-Well-Modul; Produktnr. A28135) gemessen. TaqMan-Primer wurden von Thermo bezogen (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1)). Die CT-Werte aller Proben wurden auf das Haushaltsgen GAPDH normalisiert.
Die Freisetzung von NT-ProBNP aus dem Medium wurde mit dem NT-ProBNP-Kit (Schwein) (Kat.-Nr. MBS2086979, MyBioSource) gemäß Herstellerprotokoll bestimmt. Kurz gesagt, wurden 250 µl jeder Probe und jedes Standards in doppelter Ausführung in jede Vertiefung pipettiert. Unmittelbar nach Zugabe der Probe wurden 50 µl Assay-Reagenz A in jede Vertiefung gegeben. Die Platte wurde vorsichtig geschüttelt und mit Dichtmittel verschlossen. Anschließend wurden die Platten 1 Stunde bei 37 °C inkubiert. Danach wurde die Lösung abgesaugt und die Vertiefungen viermal mit je 350 µl 1x Waschlösung gewaschen, wobei die Waschlösung jeweils 1–2 Minuten inkubiert wurde. Anschließend wurden 100 µl Assay-Reagenz B pro Vertiefung zugegeben und die Platte mit Dichtmittel verschlossen. Die Platte wurde vorsichtig geschüttelt und 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Die Lösung absaugen und die Vertiefungen 5-mal mit je 350 µl 1x Waschlösung waschen. 90 µl Substratlösung in jede Vertiefung geben und die Platte verschließen. Die Platte 10–20 Minuten bei 37 °C inkubieren. 50 µl Stopplösung in jede Vertiefung geben. Die Platte wurde sofort mit einem Cytation-Plattenlesegerät (BioTek) bei 450 nm gemessen.
Es wurden Poweranalysen durchgeführt, um die Gruppengrößen zu bestimmen, die eine statistische Power von >80 % bieten, um eine absolute Änderung des Parameters von 10 % bei einer Fehlerwahrscheinlichkeit 1. Art von 5 % nachzuweisen. Es wurden Poweranalysen durchgeführt, um die Gruppengrößen zu bestimmen, die eine statistische Power von >80 % bieten, um eine absolute Änderung des Parameters von 10 % bei einer Fehlerwahrscheinlichkeit 1. Art von 5 % nachzuweisen. Die Analyse der meisten Analysen wurde für die Auswahl einer Gruppe von Gruppen ausgewählt und liegt bei über 80 %. Die maximale Analysequote liegt bei 10 %, die absolute Parameterauswahl beträgt jedoch 5 %. частотой ошибок типа I. Es wurde eine Poweranalyse durchgeführt, um Gruppengrößen auszuwählen, die eine statistische Power von >80 % bieten, um eine absolute Parameteränderung von 10 % bei einer Fehlerwahrscheinlichkeit vom Typ I von 5 % nachzuweisen.进行功效分析以选择将提供> 80 % oder mehr, 10 % und 5 % Ich habe eine Gebühr von 10 % erhalten.进行功效分析以选择将提供> 80 % oder mehr, 10 % und 5 % Ich habe eine Gebühr von 10 % erhalten. Es wurde eine Analyse der meisten Parameter für die Auswahl von Gruppen durchgeführt, wobei eine Mindestanzahl von > 80 % für die Auswahl von 10 % der absoluten Parameter usw. festgestellt wurde 5 % частоты ошибок typ I. Es wurde eine Poweranalyse durchgeführt, um eine Gruppengröße auszuwählen, die eine Power von >80% bietet, um eine absolute Parameteränderung von 10% und eine Fehlerrate vom Typ I von 5% zu erkennen.Vor dem Experiment wurden Gewebeschnitte zufällig ausgewählt. Alle Analysen erfolgten verblindet, und die Proben wurden erst nach Abschluss der Datenanalyse dekodiert. Für alle statistischen Analysen wurde die Software GraphPad Prism (San Diego, CA) verwendet. Bei allen statistischen Analysen wurden p-Werte < 0,05 als signifikant betrachtet. Bei allen statistischen Analysen wurden p-Werte bei Werten <0,05 als signifikant betrachtet. Alle p-Zählerstatistiken wurden mit Zzätzwerten <0,05 erstellt. Bei allen statistischen Analysen wurden p-Werte bei Werten <0,05 als signifikant betrachtet.对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的.对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的. Alle p-Zählerstatistiken wurden mit Zzätzwerten <0,05 erstellt. Bei allen statistischen Analysen wurden p-Werte bei Werten <0,05 als signifikant betrachtet.Für die Daten mit nur zwei Vergleichen wurde ein zweiseitiger t-Test nach Student durchgeführt. Zur Bestimmung der Signifikanz zwischen mehreren Gruppen wurde eine ein- oder zweifaktorielle ANOVA verwendet. Bei den Post-hoc-Tests wurde die Tukey-Korrektur angewendet, um Mehrfachvergleiche zu berücksichtigen. RNAsec-Daten erfordern besondere statistische Überlegungen bei der Berechnung von FDR und p-Wert (adjustiert), wie im Methodenteil beschrieben.
Weitere Informationen zum Studiendesign finden Sie in der Zusammenfassung des Nature Research Reports, die mit diesem Artikel verlinkt ist.