Zikomo pochezera Nature.com. Mtundu wa msakatuli womwe mukugwiritsa ntchito uli ndi chithandizo chochepa cha CSS. Kuti mugwiritse ntchito bwino, tikukulimbikitsani kuti mugwiritse ntchito msakatuli wosinthidwa (kapena kuletsa Compatibility Mode mu Internet Explorer). Pakadali pano, kuti tipitirize kukuthandizani, tidzapanga tsamba lino lopanda masitayelo ndi JavaScript.
Pakufunika njira yodalirika yopangira minofu ya mtima yomwe ingabwereze molondola malo ozungulira mtima kuti ayesere mankhwala. Kuchepa kwa machitidwe okulitsa minofu ya mtima wa munthu kwapangitsa kuti pakhale kutanthauzira kolakwika kwa zotsatira za mankhwala a mtima. Pano, tapanga chitsanzo cha kukula kwa minofu ya mtima (CTCM) chomwe chimalimbikitsa magawo a mtima ndikuchita kufalikira kwa thupi panthawi ya systolic ndi diastolic ya kuzungulira kwa mtima. Pambuyo pa masiku 12 akukula, njira iyi idasintha pang'ono mphamvu ya magawo a mtima, koma sinasunge bwino kapangidwe kake. Chifukwa chake, titayang'ana mamolekyu ang'onoang'ono, tinapeza kuti kuwonjezera kwa 100 nM triiodothyronine (T3) ndi 1 μM dexamethasone (Dex) ku sing'anga yathu kunasunga kapangidwe ka magawo kwa masiku 12. Kuphatikiza ndi chithandizo cha T3/Dex, njira ya CTCM idasunga ma profiles olembera, mphamvu, kagayidwe kachakudya, ndi mphamvu ya kapangidwe pamlingo womwewo monga minofu yatsopano ya mtima kwa masiku 12. Kuphatikiza apo, kutambasula kwambiri minofu ya mtima m'chitukuko kumayambitsa zizindikiro za mtima zomwe zimawonjezera kuchuluka kwa shuga m'magazi, zomwe zimapereka umboni wa kuthekera kwa CTCM kutsanzira matenda omwe amayamba chifukwa cha kutambasula mtima. Pomaliza, CTCM imatha kutsanzira momwe thupi ndi matenda a mtima zimagwirira ntchito kwa nthawi yayitali, zomwe zimathandiza kuti munthu azitha kuyeza mankhwala moyenera.
Kafukufuku wa zachipatala asanachitike, pamafunika njira zodalirika zogwiritsira ntchito mu vitro zomwe zingabereke bwino malo a mtima wa munthu. Njira zoterezi ziyenera kutsanzira kusintha kwa makina, kugunda kwa mtima, ndi mphamvu zamagetsi. Zitsanzo za nyama nthawi zambiri zimagwiritsidwa ntchito ngati njira yowunikira za thupi la mtima ndi kudalirika kochepa powonetsa zotsatira za mankhwala mumtima wa munthu1,2. Pomaliza, Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) ndi chitsanzo chomwe chimakhala chodziwika bwino komanso chapadera pa njira zosiyanasiyana zochiritsira komanso zamankhwala, zomwe zimapanganso molondola za thupi ndi matenda a mtima wa munthu3. Kusakhalapo kwa dongosolo lotere kumalepheretsa kupezeka kwa njira zatsopano zochiritsira kulephera kwa mtima4,5 ndipo kwapangitsa kuti matenda a mtima ndi mankhwala aziwopsa ngati chifukwa chachikulu chotuluka pamsika6.
M'zaka khumi zapitazi, mankhwala asanu ndi atatu osagwiritsa ntchito mtima achotsedwa kugwiritsidwa ntchito kuchipatala chifukwa amachititsa kuti QT ikule kwambiri zomwe zimapangitsa kuti ventricular arrhythmias ichitike komanso imfa yadzidzidzi7. Chifukwa chake, pakufunika njira zodalirika zowunikira matenda asanafike kuchipatala kuti aone momwe mtima umagwirira ntchito komanso poizoni wake. Kugwiritsa ntchito kwaposachedwa kwa ma cardiomyocytes opangidwa ndi anthu (hiPS-CM) pofufuza mankhwala ndi kuyesa poizoni kumapereka yankho pang'ono pa vutoli. Komabe, kusakhwima kwa ma hiPS-CM komanso kusowa kwa zovuta zambiri za minofu ya mtima ndi zolepheretsa zazikulu za njira iyi. Kafukufuku waposachedwa wasonyeza kuti kuchepa kumeneku kumatha kuthetsedwa pang'ono pogwiritsa ntchito ma hiPS-CM oyambirira kupanga ma hydrogel a minofu ya mtima atangoyamba kumene kukomoka mwadzidzidzi ndikuwonjezera pang'onopang'ono mphamvu zamagetsi pakapita nthawi. Komabe, ma microtissue a hiPS-CM awa alibe mphamvu zamagetsi komanso zogonana za myocardium ya akuluakulu. Kuphatikiza apo, minofu ya mtima wa munthu ili ndi kapangidwe kovuta kwambiri, kopangidwa ndi mitundu yosiyanasiyana ya maselo, kuphatikizapo maselo a endothelial, ma neuron, ndi ma stromal fibroblast, olumikizidwa ndi magulu enaake a mapuloteni a extracellular matrix. Kusiyana kumeneku kwa anthu omwe si a cardiomyocyte11,12,13 mumtima wa nyama zazikulu ndi cholepheretsa chachikulu pakujambula minofu ya mtima pogwiritsa ntchito mitundu ya maselo payokha. Zolepheretsa zazikuluzi zikugogomezera kufunika kopanga njira zokulira minofu ya mtima yosawonongeka pansi pa zochitika za thupi komanso matenda.
Magawo owonda (300 µm) a mtima wa munthu aonekera kukhala chitsanzo chabwino cha myocardium ya munthu yosatha. Njirayi imapereka mwayi wopeza dongosolo lonse la 3D multicellular lofanana ndi minofu ya mtima wa munthu. Komabe, mpaka 2019, kugwiritsa ntchito magawo a mtima wotukuka kunachepetsedwa ndi kupulumuka kwakanthawi kochepa (maola 24) kwa chikhalidwe. Izi zikuchitika chifukwa cha zinthu zingapo kuphatikizapo kusowa kwa kutambasula thupi, mawonekedwe a mpweya ndi madzi, komanso kugwiritsa ntchito zinthu zosavuta zomwe sizikugwirizana ndi zosowa za minofu ya mtima. Mu 2019, magulu angapo ofufuza adawonetsa kuti kuphatikiza zinthu zamakina mu machitidwe otukula minofu ya mtima kumatha kukulitsa moyo wa chikhalidwe, kusintha mawonekedwe a mtima, komanso kutsanzira matenda a mtima. Maphunziro awiri okongola 17 ndi 18 akuwonetsa kuti kukweza kwa uniaxial mechanical kumakhudza bwino mawonekedwe a mtima panthawi yotukula. Komabe, maphunzirowa sanagwiritse ntchito kukweza kwa physico-mechanical kwa kayendedwe ka mtima, popeza magawo a mtima anali ndi mphamvu zolimbitsa thupi 17 kapena kukweza kwa auxotonic 18. Njira zimenezi zotambasula minofu zinapangitsa kuti majini ambiri a mtima achepetsedwe kapena kuti majini ambiri azichulukirachulukira chifukwa cha kufalikira kwa matenda osazolowereka. Chochititsa chidwi n'chakuti, Pitoulis et al. 19 adapanga njira yosinthira kayendedwe ka mtima pogwiritsa ntchito njira yolumikizirana mphamvu ndi mphamvu ya transducer komanso njira zoyendetsera kupsinjika. Ngakhale kuti njira imeneyi imalola kuti pakhale njira yolondola kwambiri yopangira kayendedwe ka mtima, kusinthasintha kwake komanso kugwiritsa ntchito njira imeneyi kumachepetsa kugwiritsa ntchito njira imeneyi. Labotale yathu posachedwapa yapanga njira yosavuta yopangira pogwiritsa ntchito mphamvu zamagetsi komanso njira yabwino yosungira kuti magawo a minofu ya mtima wa nkhumba ndi anthu azikhala bwino kwa masiku 6.
Mu zolembedwa zomwe zilipo pano, tikufotokoza za chitsanzo cha chikhalidwe cha minofu ya mtima (CTCM) pogwiritsa ntchito magawo a mtima wa nkhumba omwe amaphatikiza zizindikiro za humoral kuti afotokozenso za thupi la mtima la magawo atatu ndi kufalikira kwa matenda panthawi ya kuzungulira kwa mtima. CTCM iyi ikhoza kuwonjezera kulondola kwa kulosera kwa mankhwala asanafike kuchipatala kufika pamlingo womwe sunachitikepo kale popereka dongosolo la mtima lotsika mtengo, lapakati lomwe limatsanzira thupi/matenda a mtima wa nyamakazi poyesa mankhwala asanafike kuchipatala.
Zizindikiro za hemodynamic mechanical zimagwira ntchito yofunika kwambiri pakusunga ntchito ya mtima mu vitro 22,23,24. Mu zolembedwa pano, tapanga CTCM (Chithunzi 1a) yomwe ingatsanzire malo a mtima wa munthu wamkulu poyambitsa kukondoweza kwamagetsi ndi kwamakina pamafupipafupi a thupi (1.2 Hz, 72 beats pa mphindi). Pofuna kupewa kutambasula minofu kwambiri panthawi ya diastole, chipangizo chosindikizira cha 3D chinagwiritsidwa ntchito kuti chiwonjezere kukula kwa minofu ndi 25% (Chithunzi 1b). Kuyenda kwamagetsi komwe kumayambitsidwa ndi dongosolo la C-PACE kunakonzedwa kuti kuyambe 100 ms systole isanayambe pogwiritsa ntchito njira yopezera deta kuti iberekenso bwino kayendedwe ka mtima. Dongosolo lokulitsa minofu limagwiritsa ntchito actuator yoyendetsedwa ndi pneumatic (LB Engineering, Germany) kuti ikule membrane yosinthasintha ya silicone kuti ipangitse kukula kwa magawo a mtima m'chipinda chapamwamba. Dongosololi linalumikizidwa ku chingwe chakunja cha mpweya kudzera mu transducer yokakamiza, zomwe zinapangitsa kuti zitheke kusintha molondola kuthamanga (± 1 mmHg) ndi nthawi (± 1 ms) (Chithunzi 1c).
a Lumikizani gawo la minofu ku mphete yothandizira ya 7 mm, yomwe yawonetsedwa mu buluu, mkati mwa chipinda chokulitsa cha chipangizocho. Chipinda chokulitsa chimalekanitsidwa ndi chipinda cha mpweya ndi nembanemba yopyapyala yosinthasintha ya silicone. Ikani gasket pakati pa chipinda chilichonse kuti mupewe kutuluka kwa madzi. Chivundikiro cha chipangizocho chili ndi ma electrode a graphite omwe amapereka kusonkhezera kwamagetsi. b Kuyimira kwachithunzi cha chipangizo chachikulu cha minofu, mphete yotsogolera ndi mphete yothandizira. Zigawo za minofu (zofiirira) zimayikidwa pa chipangizo chachikulu ndi mphete yotsogolera yomwe imayikidwa mu groove pamphepete mwa chipangizocho. Pogwiritsa ntchito chitsogozo, ikani mosamala mphete yothandizira yokutidwa ndi guluu wa acrylic pamwamba pa gawo la minofu ya mtima. c Chithunzi chosonyeza nthawi yosonkhezera yamagetsi ngati ntchito ya kukakamizidwa kwa chipinda cha mpweya komwe kumayendetsedwa ndi actuator ya pneumatic (PPD). Chipangizo chopezera deta chinagwiritsidwa ntchito kulumikiza kusonkhezera kwamagetsi pogwiritsa ntchito masensa okakamiza. Pamene kukakamizidwa mu chipinda chokulitsa kufika pamlingo wokhazikitsidwa, chizindikiro cha pulse chimatumizidwa ku C-PACE-EM kuti chiyambitse kusonkhezera kwamagetsi. d Chithunzi cha ma CTCM anayi omwe aikidwa pa shelufu yosungiramo zinthu. Zipangizo zinayi zimalumikizidwa ku PPD imodzi kudzera mu dera lozungulira mpweya, ndipo masensa otsekereza mpweya amaikidwa mu valavu yoyezera kuthamanga kwa mpweya kuti ayang'anire kuthamanga kwa mpweya mu dera lozungulira mpweya. Chipangizo chilichonse chili ndi magawo asanu ndi limodzi a minofu.
Pogwiritsa ntchito chipangizo chimodzi choyendetsera mpweya, tinatha kuwongolera zipangizo 4 za CTCM, chilichonse mwa izo chingathe kugwira magawo 6 a minofu (Chithunzi 1d). Mu CTCM, kuthamanga kwa mpweya m'chipinda cha mpweya kumasinthidwa kukhala kuthamanga kogwirizana m'chipinda chamadzimadzi ndipo kumayambitsa kukula kwa gawo la mtima (Chithunzi 2a ndi Filimu Yowonjezera 1). Kuwunika kutambasula kwa minofu pa 80 mm Hg. Art. kunawonetsa kutambasula kwa magawo a minofu ndi 25% (Chithunzi 2b). Kutambasula kumeneku kwawonetsedwa kuti kukugwirizana ndi kutalika kwa sarcomere ya thupi ya 2.2–2.3 µm kuti gawo la mtima likhale lolimba17,19,25. Kusuntha kwa minofu kunayesedwa pogwiritsa ntchito makina okonzedwa ndi kamera (Chithunzi Chowonjezera 1). Kukula ndi liwiro la kuyenda kwa minofu (Chithunzi 2c, d) kunagwirizana ndi kutambasula panthawi ya kuzungulira kwa mtima ndi nthawi panthawi ya systole ndi diastole (Chithunzi 2b). Kutambasula ndi liwiro la minofu ya mtima panthawi ya kupweteka ndi kupumula kunakhalabe kosalekeza kwa masiku 12 pakukulitsa (Chithunzi 2f). Kuti tiwone momwe kusonkhezera kwamagetsi kumakhudzira kugwira ntchito kwa thupi panthawi yolima, tinapanga njira yodziwira kusokonekera kwa thupi pogwiritsa ntchito njira yojambulira (Chithunzi Chowonjezera 2a,b) ndipo tinatha kusiyanitsa pakati pa kusokonekera kwa thupi ndi komwe sikulimbikitsa kwamagetsi. Gawo lomwelo la mtima (Chithunzi 2f). Mu gawo losunthika la chodulidwa (R6-9), mphamvu yamagetsi panthawi yolimbikitsa kwamagetsi inali yokwera ndi 20% kuposa popanda kusonkhezera kwamagetsi, zomwe zikusonyeza kuti kusonkhezera kwamagetsi kumathandizira kugwira ntchito kwa thupi.
Zizindikiro zosonyeza kuthamanga kwa mpweya m'chipinda, kuthamanga kwa madzi m'chipinda, ndi kuyeza kayendedwe ka minofu zimatsimikizira kuti kuthamanga kwa chipinda kumasintha kuthamanga kwa madzi m'chipinda, zomwe zimapangitsa kuti chidutswa cha minofu chiyende mofanana. b Zizindikiro zosonyeza kuchuluka kwa kutambasula (buluu) kwa magawo a minofu ofanana ndi kuchuluka kwa kutambasula (lalanje). c Kuyenda koyezedwa kwa chidutswa cha mtima kumagwirizana ndi liwiro loyezedwa la kuyenda. (d) Zizindikiro zosonyeza kuyenda kwa kayendedwe ka cyclic (mzere wabuluu) ndi liwiro (mzere wa lalanje wokhala ndi madontho) mu chidutswa cha mtima. e Kuyeza nthawi yozungulira (n = magawo 19 pagulu, kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana), nthawi yokhota (n = magawo 19 pagulu), nthawi yopumula (n = magawo 19 pagulu, kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana), kuyenda kwa minofu (n = 25). zidutswa)/gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana), liwiro la systolic (n = 24(D0), zidutswa 25(D12)/gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana) ndi kuchuluka kwa mpumulo (n = 24(D0), zidutswa 25(D12)/gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana). Mayeso a T-Test a Wophunzira wokhala ndi michira iwiri sanawonetse kusiyana kwakukulu pa gawo lililonse. f Kuwunikira kwa kupsinjika kwa magawo a minofu okhala ndi kukondoweza kwamagetsi (kofiira) komanso kopanda (buluu), madera khumi a zigawo za minofu kuchokera ku gawo lomwelo. Mapanelo apansi akuwonetsa kuchuluka kwa kusiyana kwa kuchuluka kwa kupsinjika m'magawo a minofu okhala ndi kukondoweza kwamagetsi komanso kopanda m'malo khumi ochokera ku magawo osiyanasiyana. (n = magawo 8/gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, mayeso a T-Student t-test amachitika; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = magawo 8/gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, mayeso a T-Student t-test amachitika; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = magawo 8/gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, mayeso a t a Ophunzira okhala ndi michira iwiri; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，來自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05）. （n = 8 片/组，來自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05）. (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = magawo 8/gulu, kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, mayeso a t a Ophunzira okhala ndi michira iwiri; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Mipiringidzo yolakwika ikuyimira pakati ± kupotoka kokhazikika.
Mu dongosolo lathu lakale la static biomimetic heart slices culture [20, 21], tinasunga moyo, ntchito, ndi kapangidwe kake ka magawo a mtima kwa masiku 6 pogwiritsa ntchito mphamvu zamagetsi ndikukonza kapangidwe ka sing'anga. Komabe, patatha masiku 10, ziwerengerozi zinatsika kwambiri. Tidzatchula magawo omwe adakulitsidwa mu dongosolo lathu lakale la static biomimetic culture 20, 21 control conditions (Ctrl) ndipo tidzagwiritsa ntchito njira yathu yokonzedweratu kale ngati MC conditions ndi culture pansi pa nthawi imodzi ya mechanical ndi electrical stimulation (CTCM). yotchedwa . Choyamba, tinapeza kuti kusonkhezera kwa makina popanda mphamvu zamagetsi sikunali kokwanira kuti minofu ikhale ndi moyo kwa masiku 6 (Chithunzi Chowonjezera 3a,b). Chosangalatsa n'chakuti, poyambitsa kusonkhezera kwa physio-mechanical ndi electrical pogwiritsa ntchito STCM, moyo wa magawo a mtima a masiku 12 unakhalabe wofanana ndi magawo atsopano a mtima pansi pa matenda a MS, koma osati pansi pa matenda a Ctrl, monga momwe zasonyezedwera ndi kusanthula kwa MTT (Chithunzi 1). 3a). Izi zikusonyeza kuti kusonkhezera kwa makina ndi kutsanzira kwa kayendedwe ka mtima kumatha kusunga magawo a minofu kukhala ndi moyo kwa nthawi yayitali kawiri kuposa momwe zanenedwera mu dongosolo lathu lakale la static culture. Komabe, kuwunika kwa kapangidwe ka minofu pogwiritsa ntchito immunolabeling ya cardiac troponin T ndi connexin 43 kunawonetsa kuti mawonekedwe a connexin 43 anali okwera kwambiri m'maselo a MC pa tsiku la 12 kuposa m'ma controls tsiku lomwelo. Komabe, mawonekedwe ofanana a connexin 43 ndi mapangidwe a Z-disc sizinasungidwe mokwanira (Chithunzi 3b). Timagwiritsa ntchito chimango cha luntha lochita kupanga (AI) kuti tiyese umphumphu wa kapangidwe ka minofu26, njira yophunzirira mozama yochokera pa chithunzi yochokera pa troponin-T ndi connexin staining43 kuti tiyese yokha umphumphu wa kapangidwe ka minofu ndi kuwala kwa magawo a mtima malinga ndi mphamvu ya malo. Njirayi imagwiritsa ntchito Convolutional Neural Network (CNN) ndi chimango cha kuphunzira mozama kuti tiyese molondola umphumphu wa kapangidwe ka minofu ya mtima mwanjira yodziyimira yokha komanso yopanda tsankho, monga tafotokozera mu bukhuli. 26. Minofu ya MC inawonetsa kufanana kwa kapangidwe kake ndi tsiku la 0 poyerekeza ndi magawo olamulira osasinthasintha. Kuphatikiza apo, utoto wa Masson wa trichrome unawonetsa kuchuluka kochepa kwambiri kwa fibrosis pansi pa matenda a MS poyerekeza ndi matenda owongolera pa tsiku la 12 la chitukuko (Chithunzi 3c). Ngakhale CTCM inawonjezera kuthekera kwa magawo a minofu ya mtima pa tsiku la 12 kufika pamlingo wofanana ndi wa minofu yatsopano ya mtima, sizinawongolere kwambiri kapangidwe ka magawo a mtima.
Chithunzi cha Bar chikuwonetsa kuchuluka kwa MTT ya slices zatsopano za mtima (D0) kapena slices za mtima zomwe zimamera kwa masiku 12 kaya mu static culture (D12 Ctrl) kapena mu CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) zidutswa/gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, njira imodzi yomwe mayeso a ANOVA amachitikira; ####p < 0.0001 poyerekeza ndi D0 ndi **p < 0.01 poyerekeza ndi D12 Ctrl). Chithunzi cha Bar chikuwonetsa kuchuluka kwa MTT ya slices zatsopano za mtima (D0) kapena slices za mtima zomwe zimamera kwa masiku 12 kaya mu static culture (D12 Ctrl) kapena mu CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) zidutswa/gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, njira imodzi yomwe mayeso a ANOVA amachitikira; ####p < 0.0001 poyerekeza ndi D0 ndi **p < 0.01 poyerekeza ndi D12 Ctrl).Histogram ikuwonetsa kuchuluka kwa kuthekera kwa MTT fresh heart sections (D0) kapena chikhalidwe cha magawo a mtima kwa masiku 12 mu static culture (D12 control) kapena CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 control). ) ), 12 (D12 MC) magawo/gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, mayeso a ANOVA amachitika njira imodzi;####p < 0,0001 по сравнению с D0 ndi **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 poyerekeza ndi D0 ndi **p < 0.01 poyerekeza ndi D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 新鲜心脏切片(D0) 12 或片(D0) 2天的MTT 活力的量化)，來自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p <2比比比，####p <2.00D 10.00D < 0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 新鲜心脏切片(D0) 中文 (D0) 中文切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p <0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p.)histogram yosonyeza kuchuluka kwa MTT viability mu magawo atsopano a mtima (D0) kapena magawo a mtima omwe adakulitsidwa kwa masiku 12 mu static culture (D12 control) kapena CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 control)), 12 (D12 MC) magawo/gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, mayeso a ANOVA opita mbali imodzi;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 poyerekeza ndi D0, **p < 0.01 poyerekeza ndi D12 Ctrl).b Troponin-T (wobiriwira), connexin 43 (wofiira) ndi DAPI (wabuluu) m'magawo a mtima omwe angopatulidwa kumene (D0) kapena magawo a mtima omwe amakula pansi pa mikhalidwe yosasinthasintha (Ctrl) kapena mikhalidwe ya CTCM (MC) kwa masiku 12) a zithunzi zosonyeza kuwala kwa chitetezo chamthupi (chiwerengero chopanda kanthu = 100 µm). Kuyeza luntha lochita kupanga la kulimba kwa kapangidwe ka minofu ya mtima (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) magawo/gulu lililonse kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, mayeso a ANOVA opita mbali imodzi amachitidwa; ####p < 0.0001 poyerekeza ndi D0 ndi ****p < 0.0001 poyerekeza ndi D12 Ctrl). Kuyeza luntha lochita kupanga la kulimba kwa kapangidwe ka minofu ya mtima (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) zidutswa/gulu lililonse kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, mayeso a ANOVA opita mbali imodzi amachitidwa; ####p < 0.0001 poyerekeza ndi D0 ndi ****p < 0.0001 poyerekeza ndi D12 Ctrl). Kuwongolera kwapakatikati (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) kukopera, 5 (D12 MC) проводится однофакторный тест ANOVA; ####p <0,0001 по сравнению с D0 ndi ****p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Kuyeza kuchuluka kwa kapangidwe ka minofu ya mtima pogwiritsa ntchito luntha lochita kupanga (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) magawo/magulu ochokera ku nkhumba zosiyanasiyana, mayeso a ANOVA opita mbali imodzi adachitidwa; ####p < 0.0001 vs. ndi D0 ndi ****p < 0.0001 poyerekeza ndi D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) magawo/gulu lililonse la nkhumba yosiyana, kuyesa njira imodzi ya ANOVA;##0#0D010. Sinthani, ****p <0.0001 pa D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) magawo/gulu lililonse la nkhumba zosiyanasiyana, kuyesa njira imodzi ya ANOVA;##0#0D0D **** 10. <0.0001 D12 Ctrl + fungulo. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC/pang'onopang'ono) p. разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Luntha lochita kupanga kuti liyese kulimba kwa minofu ya mtima (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), magawo 5 (D12 MC) a nkhumba zosiyanasiyana, mayeso a ANOVA opita mbali imodzi; ####p<0.0001 vs .D0 Poyerekeza ****p < 0.0001 poyerekeza ndi D12 Ctrl). c Zithunzi zoyimira (kumanzere) ndi kuchuluka (kumanja) kwa magawo a mtima omwe adapakidwa utoto wa Masson's trichrome (Scale bare = 500 µm) (n = magawo 10/gulu lililonse kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, mayeso a ANOVA opita mbali imodzi amachitidwa; ####p < 0.0001 poyerekeza ndi D0 ndi ***p < 0.001 poyerekeza ndi D12 Ctrl). c Zithunzi zoyimira (kumanzere) ndi kuchuluka (kumanja) kwa magawo a mtima omwe adapakidwa utoto wa Masson's trichrome (Scale bare = 500 µm) (n = magawo 10/gulu lililonse kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, mayeso a ANOVA opita mbali imodzi amachitidwa; #### p < 0.0001 poyerekeza ndi D0 ndi ***p < 0.001 poyerekeza ndi D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Масязкен Масязкон мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Zithunzi zoyimira (kumanzere) ndi kuchuluka (kumanja) kwa magawo a mtima omwe adapakidwa utoto wa Masson's trichrome (sikelo yosaphimbidwa = 500 µm) (n = magawo 10/gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, mayeso a ANOVA opita mbali imodzi adachitidwa; #### p < 0 .0001 poyerekeza ndi D0 ndi ***p < 0.001 poyerekeza ndi D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 µm） 500个切片/组，每组來自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p <0.0001 与D0 相比，***p <0.001 Ctrl ）D12. C 用 mason 三 色 染料的 心脏 切片的 代表性 （左 左） 量化= 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 来自 不同 猪 , 进行 单向 单向 Anova 测试；####D0p0<0.0. <0.001 Dinani pa D12 Ctrl Ctrl. c Репрезентативные изображения (слева) ndi количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массом Массом 5 (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;####p <0,000,000 tsegulani ndi D12 Ctrl). c Zithunzi zoyimira (kumanzere) ndi kuchuluka (kumanja) kwa magawo a mtima omwe adapakidwa utoto wa Masson's trichrome (wopanda kanthu = 500 µm) (n = magawo 10/gulu, lililonse kuchokera ku nkhumba yosiyana, yoyesedwa ndi kusanthula kwa njira imodzi ya kusiyana ;### # p < 0.0001 poyerekeza ndi D0, ***p < 0.001 poyerekeza ndi D12 Ctrl).Mipiringidzo yolakwika ikuyimira pakati ± kupotoka kokhazikika.
Tinaganiza kuti powonjezera mamolekyu ang'onoang'ono ku malo osungiramo zinthu, umphumphu wa mtima ukhoza kukwera ndipo kukula kwa fibrosis kungathe kuchepa panthawi yokolola ya CTCM. Chifukwa chake tinayesa mamolekyu ang'onoang'ono pogwiritsa ntchito ma static control cultures20,21 chifukwa cha zinthu zochepa zomwe zimasokoneza. Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), ndi SB431542 (SB) adasankhidwa pa mayeso awa. Mamolekyu ang'onoang'ono awa adagwiritsidwa ntchito kale mu ma cultures a hiPSC-CM kuti apangitse kukula kwa ma cardiomyocytes mwa kuwonjezera kutalika kwa sarcomere, T-tubules, ndi liwiro la conduction. Kuphatikiza apo, onse Dex (glucocorticoid) ndi SB amadziwika kuti amaletsa kutupa29,30. Chifukwa chake, tinayesa ngati kuphatikiza kwa molekyulu imodzi kapena kuphatikiza kwa mamolekyu ang'onoang'ono awa kungathandize kuti magawo a mtima akhale olimba. Poyesa koyamba, mlingo wa chinthu chilichonse unasankhidwa kutengera kuchuluka komwe kumagwiritsidwa ntchito kwambiri mu ma model a ma cell culture (1 μM Dex27, 100 nM T327, ndi 2.5 μM SB31). Pambuyo pa masiku 12 akukula, kuphatikiza kwa T3 ndi Dex kunapangitsa kuti thupi likhale lolimba komanso kuti lisamakhale ndi ulusi wambiri (Zithunzi Zowonjezera 4 ndi 5). Kuphatikiza apo, kugwiritsa ntchito kawiri kapena kawiri kuchuluka kwa T3 ndi Dex kumeneku kunabweretsa zotsatira zoyipa poyerekeza ndi kuchuluka kwabwinobwino (Chithunzi Chowonjezera 6a,b).
Pambuyo poyesa koyamba, tinayerekeza mikhalidwe 4 yokhazikika (Chithunzi 4a): Ctrl: magawo a mtima omwe adakulitsidwa mu chikhalidwe chathu chokhazikika chomwe chidafotokozedwa kale pogwiritsa ntchito njira yathu yokhazikika; 20.21 TD: T3 ndi Ctrl s Added Dex Lachitatu; MC: magawo a mtima omwe adakulitsidwa mu CTCM pogwiritsa ntchito njira yathu yokhazikika kale; ndi MT: CTCM yokhala ndi T3 ndi Dex yowonjezeredwa ku njira. Pambuyo pa masiku 12 olima, kuthekera kwa minofu ya MS ndi MT kunakhalabe kofanana ndi m'maselo atsopano omwe adawunikidwa ndi mayeso a MTT (Chithunzi 4b). Chosangalatsa n'chakuti, kuwonjezera kwa T3 ndi Dex ku transwell cultures (TD) sikunapangitse kusintha kwakukulu pakukhalitsa poyerekeza ndi mikhalidwe ya Ctrl, zomwe zikusonyeza gawo lofunika la kusonkhezera kwamakina pakusunga kuthekera kwa magawo a mtima.
Chithunzi chojambula choyesera chosonyeza mikhalidwe inayi ya chikhalidwe yomwe imagwiritsidwa ntchito poyesa zotsatira za kusonkhezera kwa makina ndi kuwonjezera kwa T3/Dex pa sing'anga kwa masiku 12. b Chithunzi cha mipiringidzo chikuwonetsa kuchuluka kwa moyo masiku 12 pambuyo pa ulimi m'mikhalidwe yonse 4 yolima (Ctrl, TD, MC, ndi MT) poyerekeza ndi magawo atsopano a mtima (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ndi D12 MT), magawo 12 (D12 MC)/gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, mayeso a ANOVA a njira imodzi amachitika; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 poyerekeza ndi D0 ndi **p < 0.01 poyerekeza ndi D12 Ctrl). b Chithunzi cha mipiringidzo chikuwonetsa kuchuluka kwa moyo masiku 12 pambuyo pa ulimi m'mikhalidwe yonse 4 yolima (Ctrl, TD, MC, ndi MT) poyerekeza ndi magawo atsopano a mtima (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ndi D12 MT), magawo 12 (D12 MC)/gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, mayeso a ANOVA a njira imodzi amachitika; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 poyerekeza ndi D0 ndi **p < 0.01 poyerekeza ndi D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования во всех 4 условиях культивирования сравнению свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ndi D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных пронстонстенный, ANOVA; ####p <0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 ndi **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Chithunzi cha bar chikuwonetsa kuchuluka kwa moyo pa masiku 12 pambuyo pa ulimi m'mikhalidwe yonse 4 yolima (kulamulira, TD, MC, ndi MT) poyerekeza ndi magawo atsopano a mtima (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, ndi D12 MT), magawo 12 (D12 MC)/gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, mayeso a ANOVA opita mbali imodzi; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 vs. D0 ndi **p < 0.01 poyerekeza ndi D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)),15 (D12 Ctrl,D12 TD和D12 MT)，來自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001,###p <0.001 与D0 相比，*0p Chithunzi cha D12控制.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC ndi MT) по сравнению свежими TD срезами сердца (D0) (n = 15,D122), D0) (n = 15,D12) MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; b Histogram yosonyeza mikhalidwe yonse 4 yolerera (kulamulira, TD, MC ndi MT) poyerekeza ndi magawo atsopano a mtima (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ndi D12 MT), kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana 12 (D12 MC) magawo/gulu, mayeso a ANOVA opita mbali imodzi; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. kulamulira D12). Chithunzi cha bar chikuwonetsa kuchuluka kwa glucose flux masiku 12 pambuyo pa culture m'mikhalidwe yonse 4 yoleredwa (Ctrl, TD, MC, ndi MT) poyerekeza ndi magawo a mtima watsopano (D0) (n = magawo 6/gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, mayeso a ANOVA a njira imodzi amachitika; ###p < 0.001, poyerekeza ndi D0 ndi ***p < 0.001 poyerekeza ndi D12 Ctrl). Chithunzi cha bar chikuwonetsa kuchuluka kwa glucose flux masiku 12 pambuyo pa culture m'mikhalidwe yonse 4 yoleredwa (Ctrl, TD, MC, ndi MT) poyerekeza ndi magawo a mtima watsopano (D0) (n = magawo 6/gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, mayeso a ANOVA a njira imodzi amachitika; ###p < 0.001, poyerekeza ndi D0 ndi ***p < 0.001 poyerekeza ndi D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования, MCTD, MCTD сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; ##не#p <0,00 0,00 kulumikiza ndi D12 Ctrl). c Histogram ikuwonetsa kuchuluka kwa glucose flux masiku 12 pambuyo pa kulima pansi pa mikhalidwe yonse 4 yolima (kulamulira, TD, MC ndi MT) poyerekeza ndi magawo atsopano a mtima (D0) (n = magawo 6/gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, mayeso a ANOVA opita mbali imodzi adachitidwa; ###p < 0.001 poyerekeza ndi D0 ndi ***p < 0.001 poyerekeza ndi D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，來自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p <0.001，与D0 相0p1 与0D0 Ctrl 1 t*.相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （(ctrl 、 td 、 mc 和 mt) 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 來自 猪 , , , , , , , , 猪 猪单向执行ANOVA 测试；#0#01 <0.相比,***p < 0.001 ndi D12 Ctrl fungulo. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех 4 условий кулькозы, TD сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###0p <0,0,0 0,001 pansi pa D12 (контроль). c Histogram yosonyeza kuchuluka kwa glucose flux patatha masiku 12 kuchokera pamene anakulira m'thupi la munthu pa matenda onse anayi omwe anakulira m'thupi (control, TD, MC, ndi MT) poyerekeza ndi magawo atsopano a mtima (D0) (n = magawo 6/gulu, kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, mbali imodzi. Kodi mayeso a ANOVA adachitidwa, ###p < 0.001 poyerekeza ndi D0, ***p < 0.001 poyerekeza ndi D12 (control).d Ma grafu osanthula kupsinjika kwa minofu yatsopano (yabuluu), tsiku la 12 MC (yobiriwira), ndi tsiku la 12 MT (yofiira) pa mfundo khumi za gawo la minofu ya m'deralo (n = magawo 4/gulu, mayeso a ANOVA a njira imodzi; panalibe kusiyana kwakukulu pakati pa magulu). e Chithunzi cha volcano chomwe chikuwonetsa majini owonetsedwa mosiyana m'magawo atsopano a mtima (D0) poyerekeza ndi magawo a mtima omwe adakulitsidwa pansi pa mikhalidwe yosasunthika (Ctrl) kapena pansi pa mikhalidwe ya MT (MT) kwa masiku 10-12. f Mapu otenthetsera a majini a sarcomere a magawo a mtima omwe adakulitsidwa pansi pa mikhalidwe iliyonse ya chikhalidwe. Mipiringidzo yolakwika ikuyimira pakati ± kupotoka kokhazikika.
Kudalira kagayidwe kachakudya pa kusintha kuchokera ku mafuta acid oxidation kupita ku glycolysis ndi chizindikiro cha cardiomyocyte dedifferentiation. Ma cardiomyocyte osakhwima amagwiritsa ntchito shuga popanga ATP ndipo ali ndi mitochondria yopanda pulasitiki yokhala ndi cristae yochepa5,32. Kusanthula kwa kagwiritsidwe ntchito ka shuga kunawonetsa kuti pansi pa mikhalidwe ya MC ndi MT, kagwiritsidwe ntchito ka shuga kanali kofanana ndi ka m'thupi la tsiku 0 (Chithunzi 4c). Komabe, zitsanzo za Ctrl zinawonetsa kuwonjezeka kwakukulu kwa kagwiritsidwe ntchito ka shuga poyerekeza ndi minofu yatsopano. Izi zikusonyeza kuti kuphatikiza kwa CTCM ndi T3/Dex kumawonjezera mphamvu ya minofu ndikusunga mawonekedwe a kagayidwe kachakudya a magawo a mtima olimidwa masiku 12. Kuphatikiza apo, kusanthula kwa kupsinjika kunawonetsa kuti kuchuluka kwa kupsinjika kunakhalabe kofanana ndi kwa minofu yatsopano ya mtima kwa masiku 12 pansi pa mikhalidwe ya MT ndi MS (Chithunzi 4d).
Kuti tiwunike momwe CTCM ndi T3/Dex zimakhudzira thupi lonse, tinachita RNAseq pa magawo a mtima ochokera ku matenda onse anayi osiyanasiyana (Supplementary Data 1). Chochititsa chidwi n'chakuti, magawo a MT adawonetsa kufanana kwakukulu kwa ma transcription ndi minofu yatsopano ya mtima, ndipo majini 16 okha ndi omwe adawonetsedwa mosiyana mwa majini 13,642. Komabe, monga momwe tawonetsera kale, magawo a Ctrl adawonetsa majini 1229 omwe adawonetsedwa mosiyana pambuyo pa masiku 10-12 mukukula (Chithunzi 4e). Deta iyi idatsimikiziridwa ndi qRT-PCR ya majini a mtima ndi fibroblast (Chithunzi Chowonjezera 7a-c). Chochititsa chidwi n'chakuti, magawo a Ctrl adawonetsa kuchepa kwa majini a mtima ndi maselo komanso kuyambitsa mapulogalamu a majini otupa. Deta iyi ikusonyeza kuti kusinthika, komwe kumachitika nthawi zambiri pambuyo pakukula kwa nthawi yayitali, kumachepa kwathunthu pansi pa mikhalidwe ya MT (Chithunzi Chowonjezera 8a,b). Kufufuza mosamala majini a sarcomere kunasonyeza kuti majini omwe amalemba sarcomere (Chithunzi 4f) ndi njira ya ion (Chithunzi Chowonjezera 9) amasungidwa pansi pa mikhalidwe ya MT yokha, kuwateteza ku kupsinjika pansi pa mikhalidwe ya Ctrl, TD, ndi MC. Deta iyi ikuwonetsa kuti ndi kuphatikiza kwa kukondoweza kwa makina ndi humoral (T3/Dex), transcriptome ya mtima ikhoza kukhalabe yofanana ndi magawo atsopano a mtima pambuyo pa masiku 12 akuleredwa.
Zomwe zapezekazi zikuthandizidwa ndi mfundo yakuti kulimba kwa kapangidwe ka mtima m'magawo a mtima kumasungidwa bwino pansi pa mikhalidwe ya MT kwa masiku 12, monga momwe zasonyezedwera ndi connexin 43 yosasinthika komanso yokhazikika (Chithunzi 5a). Kuphatikiza apo, fibrosis m'magawo a mtima pansi pa mikhalidwe ya MT idachepa kwambiri poyerekeza ndi Ctrl komanso yofanana ndi magawo atsopano a mtima (Chithunzi 5b). Deta iyi ikuwonetsa kuti kuphatikiza kwa kusonkhezera kwamakina ndi chithandizo cha T3/Dex kumasunga bwino kapangidwe ka mtima m'magawo a mtima m'chikhalidwe.
Zithunzi zosonyeza kuwala kwa immunofluorescence za troponin-T (wobiriwira), connexin 43 (wofiira), ndi DAPI (buluu) m'magawo a mtima omwe angopatulidwa kumene (D0) kapena kulimidwa kwa masiku 12 m'magawo onse anayi a mtima (scale bar = 100 µm). Kuyeza luntha lochita kupanga la kulimba kwa kapangidwe ka minofu ya mtima (n = 7 (D0 ndi D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ndi D12 MT) magawo/gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, mayeso a ANOVA opita mbali imodzi amachitidwa; ####p < 0.0001 poyerekeza ndi D0 ndi *p < 0.05, kapena ****p < 0.0001 poyerekeza ndi D12 Ctrl). Kuyeza luntha lochita kupanga la kulimba kwa kapangidwe ka minofu ya mtima (n = 7 (D0 ndi D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ndi D12 MT) magawo/gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, mayeso a ANOVA opita mbali imodzi amachitidwa; #### p < 0.0001 poyerekeza ndi D0 ndi *p < 0.05, kapena ****p < 0.0001 poyerekeza ndi D12 Ctrl). Njira zopangira zida zopangira zida zopangira zida zopangira zida zamagetsi (n = 7 (D0 ndi D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MT/D12 MT) ndi p. от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p <0,0001 по сравнению с D0 и *p <0,05 or ****p <0,0001 по сравнению с D12 ). Kuyeza kuchuluka kwa kapangidwe ka minofu ya mtima pogwiritsa ntchito luntha lochita kupanga (n = 7 (D0 ndi D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ndi D12 MT) magawo/gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, mayeso a ANOVA opita mbali imodzi adachitidwa; #### p < 0.0001 poyerekeza ndi D0 ndi *p < 0.05 kapena ****p < 0.0001 poyerekeza ndi D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试;相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 (n = 7 （d0 和 d12 ctrl)智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ; ########### p < 0.0001 与D0 和*p <0.05 相比 <0.05 相比 1 Ctrl 1 20D1 0.****0p相比）.Kuyeza kuchuluka kwa kapangidwe ka minofu ya mtima pogwiritsa ntchito luntha lochita kupanga m'magulu osiyanasiyana a nkhumba (n = 7 (D0 ndi D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ndi D12 MT) m'magulu/gulu) ndi mayeso a ANOVA opita mbali imodzi;#### p <0,0001 по сравнению с D0 и *p <0,05 kapena ****p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 poyerekeza ndi D0 ndi *p < 0.05 kapena ****p < 0.0001 poyerekeza ndi D12 Ctrl). b Zithunzi zoyimira ndi kuwerengera magawo a mtima omwe adapakidwa utoto wa Masson's trichrome (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, ndi D12 MC), magawo 9 (D12 MT)/gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, mayeso a ANOVA a njira imodzi amachitika; ####p < 0.0001 poyerekeza ndi D0 ndi ***p < 0.001, kapena ****p < 0.0001 poyerekeza ndi D12 Ctrl). b Zithunzi zoyimira ndi kuwerengera magawo a mtima omwe adapakidwa utoto wa Masson's trichrome (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, ndi D12 MC), magawo 9 (D12 MT)/gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, mayeso a ANOVA a njira imodzi amachitika; ####p < 0.0001 poyerekeza ndi D0 ndi ***p < 0.001, kapena ****p < 0.0001 poyerekeza ndi D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная 10) = 50 = 10 = (D0, D12 Ctrl, D12 TD ndi D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA <0 0,001 kapena ****p <0,0001 po tsegulani ndi D12 Ctrl). b Zithunzi zoyimira ndi kuwerengera magawo a mtima omwe adapakidwa utoto wa Masson's trichrome (scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ndi D12 MC), magawo 9 (D12 MT)/gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, adachitidwa ANOVA yolunjika; ####p < 0.0001 vs. D0 ndi ***p < 0.001 kapena ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10(D11D TD), D10（D2D0 MC. 0.0001 ndi D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 來自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p <0.0001 与D0 相0p1 0.0001 ndi D12 Ctrl fungulo. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500, D3, Ctrl = 500, D1 = 500, D. D12 TD ndi D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; D12 Ctrl). b Zithunzi zoyimira ndi kuwerengera magawo a mtima omwe adapakidwa ndi Masson's trichrome (scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ndi D12 MC), magawo 9 (D12 MT) ochokera ku nkhumba/gulu losiyana, njira imodzi ya ANOVA; ####p < 0.0001 poyerekeza ndi D0, ***p < 0.001 kapena ****p < 0.0001 poyerekeza ndi D12 Ctrl).Mipiringidzo yolakwika ikuyimira pakati ± kupotoka kokhazikika.
Pomaliza, kuthekera kwa CTCM kutsanzira kuthamanga kwa magazi m'thupi kunayesedwa powonjezera kutambasula kwa minofu ya mtima. Mu CTCM, kuthamanga kwa mpweya m'chipinda cha mpweya kunakwera kuchoka pa 80 mmHg kufika pa 80 mmHg. Art. (kutambasula kwabwinobwino) mpaka 140 mmHg Art. (Chithunzi 6a). Izi zikugwirizana ndi kuwonjezeka kwa 32% kwa kutambasula (Chithunzi 6b), komwe kunawonetsedwa kale ngati kuchuluka koyenera kwa kutambasula komwe kumafunikira kuti magawo a mtima akwaniritse kutalika kwa sarcomere kofanana ndi komwe kumawonedwa mu hypertrophy. Kutambasula ndi liwiro la minofu ya mtima panthawi yopumula ndi kupumula kunakhalabe kosalekeza mkati mwa masiku asanu ndi limodzi a kukula (Chithunzi 6c). Minofu ya mtima kuchokera ku matenda a MT idayikidwa mu kutambasula kwabwinobwino (MT (Normal)) kapena mopitirira muyeso (MT (OS)) kwa masiku asanu ndi limodzi. Patatha masiku anayi mukukula, hypertrophic biomarker NT-ProBNP idakwezedwa kwambiri mu sing'anga pansi pa matenda a MT (OS) poyerekeza ndi matenda a MT (normal) (Chithunzi 7a). Kuphatikiza apo, patatha masiku asanu ndi limodzi akukulitsa, kukula kwa maselo mu MT (OS) (Chithunzi 7b) kunawonjezeka kwambiri poyerekeza ndi magawo a mtima wa MT (wabwinobwino). Kuphatikiza apo, kusamutsidwa kwa nyukiliya kwa NFATC4 kunawonjezeka kwambiri m'maselo otambasuka kwambiri (Chithunzi 7c). Zotsatirazi zikuwonetsa kupita patsogolo kwa kusintha kwa matenda pambuyo pa hyperdistension ndipo zikuthandizira lingaliro lakuti chipangizo cha CTCM chingagwiritsidwe ntchito ngati nsanja yophunzirira zizindikiro za hypertrophy ya mtima zomwe zimatambasulidwa.
Zizindikiro zosonyeza kuthamanga kwa mpweya m'chipinda, kuthamanga kwa madzi m'chipinda, ndi kuyeza kayendedwe ka minofu zimatsimikizira kuti kuthamanga kwa chipinda kumasintha kuthamanga kwa madzi m'chipinda, zomwe zimapangitsa kuti chidutswa cha minofu chiziyenda mofanana. b Kuyimira kuchuluka kwa kutambasula ndi kuchuluka kwa kutambasula kwa magawo a minofu omwe nthawi zambiri amatambasulidwa (lalanje) ndi otambasulidwa kwambiri (buluu). c Grafu ya mipiringidzo yosonyeza nthawi yozungulira (n = magawo 19 pagulu, kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana), nthawi yochepetsera (n = magawo 18-19 pagulu, kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana), nthawi yopumula (n = magawo 19 pagulu, kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana) ), kuchuluka kwa kuyenda kwa minofu (n = magawo 14/gulu, kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana), liwiro la systolic (n = magawo 14/gulu, kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana) ndi kuchuluka kwa kupuma (n = 14 (D0), 15 (D6) ) magawo/magulu) kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana), mayeso a t-awiri a Ophunzira sanawonetse kusiyana kwakukulu pa parameter iliyonse, zomwe zikusonyeza kuti magawowa adakhalabe osasintha mkati mwa masiku 6 akukula ndi overvoltage. Mipiringidzo yolakwika ikuyimira pakati ± kupotoka kokhazikika.
Kuyeza kwa Bar graph ya kuchuluka kwa NT-ProBNP mu zofalitsa zachikhalidwe kuchokera ku magawo amtima omwe amalimidwa pansi pa mikhalidwe ya MT normal stretch (Norm) kapena overstretching (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ndi D4 MTOS) zidutswa/gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, Two-way ANOVA imachitidwa; **p < 0.01 poyerekeza ndi kutambasula kwachizolowezi). Kuyeza kwa Bar graph ya kuchuluka kwa NT-ProBNP mu zofalitsa zachikhalidwe kuchokera ku magawo amtima omwe amalimidwa pansi pa MT normal stretch (Norm) kapena overstretching (OS) mikhalidwe (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ndi D4 MTOS) magawo/gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, Two-way ANOVA imachitidwa; **p < 0.01 poyerekeza ndi normal stretch).Histogram yochuluka ya kuchuluka kwa NT-ProBNP mu culture medium kuchokera ku magawo a mtima omwe amalimidwa pansi pa mikhalidwe ya MT stretch yachibadwa (norm) kapena overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ndi D4).MTOS) magawo /gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, kusanthula kwa zinthu ziwiri kumachitika;**p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 poyerekeza ndi kutambasula kwabwinobwino). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓麦的条彈2 (D) = MTNorm)、 3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）來自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸1 . Kuwerengera kwa NT-ProBNP ndende mu magawo a mtima otukuka pansi pa MT yachibadwa kutambasula (Norm) kapena overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm neD4 MTOS) kuchokera ku 猪的切片/组，可以双向ndi kutambasula kwachibadwa, p <0.01).histogram Kuyeza kuchuluka kwa NT-ProBNP m'magawo a mtima omwe amalimidwa pansi pa mikhalidwe ya MT stretch yachibadwa (norm) kapena overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) ndi D4 MTOS) magawo/gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, kusanthula kwa njira ziwiri za kusiyana;**p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 poyerekeza ndi kutambasula kwabwinobwino). b Zithunzi zoyimira magawo a mtima opakidwa utoto wa troponin-T ndi WGA (kumanzere) ndi kuchuluka kwa maselo (kumanja) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) maselo/gulu kuchokera ku magawo 10 osiyanasiyana ochokera ku nkhumba zosiyanasiyana, T-test ya Student yokhala ndi michira iwiri imachitika; ****p < 0.0001 poyerekeza ndi kutambasula kwabwinobwino). b Zithunzi zoyimira magawo a mtima opakidwa utoto wa troponin-T ndi WGA (kumanzere) ndi kuchuluka kwa maselo (kumanja) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) maselo/gulu kuchokera ku magawo 10 osiyanasiyana ochokera ku nkhumba zosiyanasiyana, T-test ya Student yokhala ndi michira iwiri imachitika; ****p < 0.0001 poyerekeza ndi kutambasula kwabwinobwino). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т ndi АЗП (слева) ndi количественного определения размера клеток (с) (6 = 6) 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюден ****pыдента ****pыдента ****pыдента ****pыдента растяжением). b Zithunzi zoyimira magawo a mtima okhala ndi troponin-T ndi AZP (kumanzere) ndi kuchuluka kwa maselo (kumanja) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) maselo/gulu kuchokera ku magawo 10 osiyanasiyana kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, mayeso a t-okhala ndi michira iwiri a Ophunzira adachitidwa; ****p < 0.0001 poyerekeza ndi kupsinjika kwabwinobwino). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（D330) MTOS），來自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正弸0.0001). b Zithunzi zoyimira magawo a mtima omwe adapakidwa ndi calcarein-T ndi WGA (kumanzere) ndi kukula kwa maselo (kumanja) (n = 330 (D6 MTOS), 369 kuchokera ku magawo 10 osiyanasiyana (D6 MTNorm)) Maselo/组，两方法有尾学生t test；poyerekeza ndi kutambasula kwabwinobwino，****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (с69 MT) (S69 MT) (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента; b Zithunzi zoyimira magawo a mtima okhala ndi troponin-T ndi AZP (kumanzere) ndi kuchuluka kwa kukula kwa maselo (kumanja) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) kuchokera ku magawo 10 osiyanasiyana ochokera ku nkhumba zosiyanasiyana) Maselo/gulu, muyezo wa michira iwiri t ya wophunzira; ****p < 0.0001 poyerekeza ndi kupsinjika kwabwinobwino). c Zithunzi zoyimira magawo a mtima a MTOS a tsiku 0 ndi tsiku 6 omwe ali ndi immunolabeled ya troponin-T ndi NFATC4 ndi kuchuluka kwa kusamutsidwa kwa NFATC4 kupita ku nuclei ya CMs (n = 4 (D0), magawo 3 (D6 MTOS)/gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, T-test ya Student yokhala ndi michira iwiri imachitika; *p < 0.05). c Zithunzi zoyimira magawo a mtima a MTOS a tsiku 0 ndi tsiku 6 omwe ali ndi immunolabeled ya troponin-T ndi NFATC4 ndi kuchuluka kwa kusamutsidwa kwa NFATC4 kupita ku nuclei ya CMs (n = 4 (D0), magawo 3 (D6 MTOS)/gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana, T-test ya Student yokhala ndi michira iwiri imachitika; *p < 0.05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 ndi 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т ndi NFATC4, ndi количественная оцнсонка кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента, *5 ; c Zithunzi zoyimira magawo a mtima pa masiku 0 ndi 6 a MTOS, yolembedwa kuti troponin-T ndi NFATC4, komanso kuchuluka kwa kusamutsidwa kwa NFATC4 mu nucleus ya maselo a cavernous (n = 4 (D0), magawo 3 (D6 MTOS)/gulu kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana) adachita mayeso a t-test awiri a Student; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性图像，以及來自萌TC4猪的细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p <0.05). c Zithunzi zoyimira za calcanin-T ndi NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS magawo amtima, ndi NFATC4 kuchokera ku NFATC4 易位至CM cell nucleus的quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS)/时间双尾学生et 电影；*p <0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS pa 0 ndi 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т ndi NFATC4 ndi количественная оценская количественная оценсканка от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p <0,05). c Zithunzi zosonyeza magawo a mtima a MTOS pa tsiku la 0 ndi 6 za troponin-T ndi NFATC4 immunolabeling ndi kuchuluka kwa kusamutsidwa kwa NFATC4 mu nucleus ya CM kuchokera ku nkhumba zosiyanasiyana (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) magawo/gulu, t-criterion ya michira iwiri ya Ophunzira; *p < 0.05).Mipiringidzo yolakwika ikuyimira pakati ± kupotoka kokhazikika.
Kafukufuku womasulira wa mtima amafuna mitundu ya maselo yomwe imabwereza molondola malo a mtima. Mu kafukufukuyu, chipangizo cha CTCM chinapangidwa ndipo chinadziwika chomwe chingalimbikitse magawo oonda kwambiri a mtima. Dongosolo la CTCM limaphatikizapo kusonkhezera kwa electromechanical komwe kumagwirizanitsidwa ndi thupi komanso kuwonjezeka kwa madzi a T3 ndi Dex. Pamene magawo a mtima wa nkhumba adakumana ndi izi, kulimba kwawo, kukhazikika kwa kapangidwe kake, ntchito ya kagayidwe kachakudya, ndi mawonekedwe a transcriptional adakhalabe ofanana ndi omwe ali mu minofu yatsopano ya mtima patatha masiku 12 akuleredwa. Kuphatikiza apo, kutambasula kwambiri minofu ya mtima kungayambitse hypertrophy ya mtima yomwe imayambitsidwa ndi hyperextension. Ponseponse, zotsatirazi zimathandizira gawo lofunikira la chikhalidwe cha thupi pakusunga mawonekedwe abwinobwino a mtima ndikupereka malo owunikira mankhwala.
Zinthu zambiri zimathandiza kupanga malo abwino kwambiri kuti ma cardiomyocytes agwire ntchito komanso apulumuke. Zinthu zodziwika bwino kwambiri mwa izi zikugwirizana ndi (1) kuyanjana kwa maselo, (2) kusonkhezera kwamagetsi, (3) zinthu zodzitukumula, ndi (4) magawo a kagayidwe kachakudya. Kuyanjana kwa maselo kuchokera ku maselo kupita ku maselo kumafuna maukonde ovuta amitundu itatu a mitundu yambiri ya maselo omwe amathandizidwa ndi matrix yakunja. Kuyanjana kwa maselo ovuta kotereku n'kovuta kumanganso mu vitro mwa kuphatikiza mitundu ya maselo payokha, koma kumatha kuchitika mosavuta pogwiritsa ntchito mawonekedwe a ziwalo za mtima.
Kutambasula kwa makina ndi kusonkhezera kwa magetsi kwa ma cardiomyocytes ndikofunikira kwambiri kuti mtima ukhale ndi phenotype33,34,35. Ngakhale kusonkhezera kwa makina kwagwiritsidwa ntchito kwambiri pakusintha kwa hiPSC-CM, maphunziro angapo okongola posachedwapa ayesa kusonkhezera kwa makina kwa magawo a mtima pogwiritsa ntchito uniaxial loading. Maphunziro awa akuwonetsa kuti 2D uniaxial mechanical loading ili ndi zotsatira zabwino pa phenotype ya mtima panthawi ya chitukuko. Mu maphunziro awa, magawo a mtima anali ndi mphamvu zolimbitsa thupi17, linear auxotonic loading18, kapena kuzungulira kwa mtima kunapangidwanso pogwiritsa ntchito mphamvu ya transducer feedback ndi ma tension drives. Komabe, njira izi zimagwiritsa ntchito uniaxial tissue stretch popanda kukonza chilengedwe, zomwe zimapangitsa kuti majini ambiri a mtima achepetse kapena kuwonetsa kwambiri majini okhudzana ndi mayankho osazolowereka a stretch. CTCM yomwe yafotokozedwa pano imapereka chilimbikitso cha 3D electromechanical chomwe chimatsanzira kuzungulira kwachilengedwe kwa mtima malinga ndi nthawi ya cycle ndi physiological stretch (25% stretch, 40% systole, 60% diastole, ndi 72 beats pa mphindi). Ngakhale kuti kusonkhezera kwa makina kwa magawo atatu kokha sikukwanira kusunga umphumphu wa minofu, kuphatikiza kwa kusonkhezera kwa humoral ndi makina pogwiritsa ntchito T3/Dex ndikofunikira kuti minofu ikhale ndi moyo wabwino, ntchito, komanso umphumphu.
Zinthu zoseketsa zimagwira ntchito yofunika kwambiri pakusintha momwe mtima wa munthu wamkulu umakhalira. Izi zidawonetsedwa mu maphunziro a HiPS-CM momwe T3 ndi Dex zidawonjezeredwa kuzinthu zokulira kuti zifulumizitse kukula kwa maselo. T3 ikhoza kukhudza kunyamula kwa amino acid, shuga ndi calcium kudutsa nembanemba ya maselo36. Kuphatikiza apo, T3 imalimbikitsa kufalikira kwa MHC-α ndi kuchepa kwa MHC-β, zomwe zimapangitsa kuti myofibrils zothamanga kwambiri zipangidwe m'magazi okhwima poyerekeza ndi myofibrils zothamanga pang'onopang'ono mu CM ya fetal. Kusowa kwa T3 mwa odwala omwe ali ndi hypothyroidism kumabweretsa kutayika kwa myofibrillar bands komanso kuchepa kwa kukula kwa toni37. Dex imagwira ntchito pa ma glucocorticoid receptors ndipo yawonetsedwa kuti ikuwonjezera kusinthasintha kwa mtima m'mitima yosungunuka; 38 kusinthaku kumaganiziridwa kuti kukugwirizana ndi zotsatira za kulowa kwa calcium deposit-driven (SOCE) 39,40. Kuphatikiza apo, Dex imamangirira ku ma receptor ake, zomwe zimayambitsa kuyankha kwakukulu kwamkati mwa maselo komwe kumaletsa ntchito ya chitetezo chamthupi komanso kutupa30.
Zotsatira zathu zikusonyeza kuti kusonkhezera thupi (physical mechanical stimulation (MS) kunathandiza kuti thupi lonse lizigwira ntchito bwino poyerekeza ndi Ctrl, koma sikunathe kusunga mphamvu, umphumphu wa kapangidwe kake, komanso mawonekedwe a mtima kwa masiku 12 mukukula. Poyerekeza ndi Ctrl, kuwonjezera kwa T3 ndi Dex ku CTCM (MT) cultures kunathandiza kuti thupi lizigwira ntchito bwino ndipo kunasunga ma profiles ofanana a transcription, umphumphu wa kapangidwe kake, ndi ntchito ya kagayidwe kachakudya ndi minofu yatsopano ya mtima kwa masiku 12. Kuphatikiza apo, powongolera kuchuluka kwa kutambasuka kwa minofu, chitsanzo cha hyperextension-induced cardiac hypertrophy chinapangidwa pogwiritsa ntchito STCM, kuwonetsa kusinthasintha kwa dongosolo la STCM. Tiyenera kudziwa kuti ngakhale kusintha kwa mtima ndi fibrosis nthawi zambiri zimakhudza ziwalo zomwe maselo ake ozungulira amatha kupereka ma cytokines oyenera komanso phagocytosis ndi zinthu zina zokonzanso, magawo a mtima amatha kutsanzira njira ya fibrotic poyankha kupsinjika ndi kuvulala. Izi zawunikidwa kale mu chitsanzo cha cardiac slice. Tiyenera kudziwa kuti magawo a CTCM amatha kusinthidwa mwa kusintha kuthamanga/magetsi ndi ma frequency kuti atsanzire matenda ambiri monga tachycardia, bradycardia, ndi chithandizo cha kayendedwe ka magazi (mechanical unloaded heart). Izi zimapangitsa kuti dongosololi likhale lothandiza poyesa mankhwala. Kuthekera kwa CTCM kutengera kuchuluka kwa mtima komwe kumayambitsa kupanikizika kwambiri kumatsegula njira yoyesera dongosololi kuti ligwiritsidwe ntchito payekha. Pomaliza, kafukufukuyu akuwonetsa kuti kutambasula kwa makina ndi kukondoweza kwa humoral ndikofunikira kwambiri pakusunga chikhalidwe cha minofu ya mtima.
Ngakhale deta yomwe yaperekedwa pano ikusonyeza kuti CTCM ndi nsanja yodalirika kwambiri yopangira chitsanzo cha myocardium yosasinthika, njira iyi yopangira ili ndi zoletsa zina. Cholepheretsa chachikulu cha CTCM culture ndikuti chimapangitsa kuti magawo azigwira ntchito mosalekeza, zomwe zimalepheretsa kutha kuyang'anira bwino kugwedezeka kwa magawo a mtima nthawi iliyonse. Kuphatikiza apo, chifukwa cha kukula kochepa kwa magawo a mtima (7 mm), kuthekera koyesa ntchito ya systolic kunja kwa machitidwe opangira pogwiritsa ntchito masensa achikhalidwe ndi ochepa. Mu zolembedwa zomwe zilipo pano, tagonjetsa pang'ono choletsa ichi poyesa mphamvu yamagetsi ngati chizindikiro cha ntchito yogwira ntchito. Komabe, choletsa ichi chidzafuna ntchito yowonjezera ndipo chingathetsedwe mtsogolo mwa kuyambitsa njira zowunikira ntchito ya magawo a mtima m'chilengedwe, monga mapu owonera pogwiritsa ntchito utoto wa calcium ndi voltage. Cholepheretsa china cha CTCM ndikuti chitsanzo chogwira ntchito sichisintha kupsinjika kwa thupi (kunyamula ndi kutsitsa pambuyo pake). Mu CTCM, kupanikizika kunayambitsidwa mbali zosiyana kuti kuberekenso 25% kutambasula kwa thupi mu diastole (kutambasula kwathunthu) ndi systole (kutalika kwa kugwedezeka panthawi yolimbikitsa magetsi) m'maselo akuluakulu kwambiri. Kuletsa kumeneku kuyenera kuchotsedwa m'mapangidwe a CTCM mtsogolo mwa kukakamiza kokwanira minofu ya mtima kuchokera mbali zonse ziwiri ndikugwiritsa ntchito ubale weniweni wa kupanikizika ndi kuchuluka kwa magazi komwe kumachitika m'zipinda za mtima.
Kusintha kochulukira komwe kwanenedwa m'bukuli kumangotengera zizindikiro za hypertrophic hyperstretch. Chifukwa chake, chitsanzochi chingathandize pophunzira za zizindikiro za hypertrophic zomwe zimayambitsidwa popanda kufunikira zinthu za humoral kapena neural (zomwe sizilipo mu dongosololi). Maphunziro ena akufunika kuti awonjezere kuchuluka kwa CTCM, mwachitsanzo, kukulitsa pamodzi ndi maselo oteteza thupi, zinthu za humoral zozungulira m'magazi, komanso kusunga malo osungiramo zinthu pamene kukulitsa pamodzi ndi maselo a neuronal kudzathandiza kuti pakhale njira zochizira matenda ndi CTCM.
Nkhumba khumi ndi zitatu zinagwiritsidwa ntchito mu kafukufukuyu. Njira zonse zochizira ziweto zinachitidwa motsatira malangizo a bungwe ndipo zinavomerezedwa ndi Komiti Yoona za Kusamalira ndi Kugwiritsa Ntchito kwa Zinyama ya University of Louisville. Chipilala cha aorta chinamangiriridwa ndipo mtima unadzazidwa ndi 1 L ya sterile cardioplegia (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH mpaka 7.4); Mitimayo inasungidwa mu yankho lozizira kwambiri la mtima mpaka itatumizidwa ku labu pa ayezi lomwe nthawi zambiri limakhala pansi pa mphindi 10. Mitimayo inasungidwa mu yankho lozizira kwambiri la mtima mpaka itatumizidwa ku labu pa ayezi lomwe nthawi zambiri limakhala pansi pa mphindi 10. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки pa лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. Mitima inasungidwa mu yankho lozizira kwambiri la mtima mpaka itanyamulidwa kupita ku labotale pa ayezi, zomwe nthawi zambiri zimatenga mphindi zosakwana 10.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟. Держите сердца pa ледяной кардиоплегии до транспортировки pa лабораторию pa льду, обычно <10 мин. Sungani mitima yanu pa ayezi mpaka mutapita nayo ku labotale pa ayezi, nthawi zambiri osapitirira mphindi 10.
Chipangizo cha CTCM chinapangidwa mu pulogalamu ya SolidWorks yothandizidwa ndi makompyuta (CAD). Zipinda zokulira, zogawa, ndi zipinda za mpweya zimapangidwa ndi pulasitiki ya acrylic yoyera ya CNC. Mzere wosungiramo wa 7mm m'mimba mwake umapangidwa ndi polyethylene yolimba kwambiri (HDPE) pakati ndipo uli ndi mzere wa o-ring kuti ugwirizane ndi mphete ya silicone yomwe imagwiritsidwa ntchito kutseka media yomwe ili pansi pake. Nembanemba yopyapyala ya silica imalekanitsa chipinda chokulirapo ndi mbale yolekanitsa. Nembanemba ya silicone imadulidwa ndi laser kuchokera pa pepala la silicone la 0.02″ wandiweyani ndipo ili ndi kuuma kwa 35A. Ma gasket a silicone pansi ndi pamwamba amadulidwa ndi laser kuchokera pa pepala la silicone la 1/16″ wandiweyani ndipo ali ndi kuuma kwa 50A. Zomangira zachitsulo chosapanga dzimbiri cha 316L ndi mtedza wa mapiko zimagwiritsidwa ntchito pomangirira chipikacho ndikupanga chisindikizo chopanda mpweya.
Bolodi yosindikizidwa yapadera (PCB) yapangidwa kuti iphatikizidwe ndi makina a C-PACE-EM. Ma soketi olumikizira makina a swiss pa PCB amalumikizidwa ku ma electrode a graphite pogwiritsa ntchito mawaya amkuwa opangidwa ndi siliva ndi zomangira zamkuwa za 0-60 zomwe zimakulungidwa mu ma electrode. Bolodi yosindikizidwa imayikidwa pachivundikiro cha chosindikizira cha 3D.
Chipangizo cha CTCM chimayendetsedwa ndi pulogalamu yoyendetsera mpweya (PPD) yomwe imapanga kuthamanga kwa magazi kolamulidwa kofanana ndi kuzungulira kwa mtima. Pamene kuthamanga mkati mwa chipinda cha mpweya kukukwera, nembanemba yosinthasintha ya silicone imakula mmwamba, kukakamiza cholumikizira pansi pa malo a minofu. Malo a minofu adzatambasulidwa ndi kutulutsa madzi, kutsanzira kukula kwa thupi kwa mtima panthawi ya diastole. Pachimake cha kupumula, kusonkhezera kwamagetsi kunagwiritsidwa ntchito kudzera mu ma electrode a graphite, zomwe zimachepetsa kuthamanga mu chipinda cha mpweya ndikupangitsa kuti magawo a minofu achepetse. Mkati mwa chitoliro muli valavu ya hemostatic yokhala ndi sensa yokakamiza kuti izindikire kuthamanga mu dongosolo la mpweya. Kupanikizika komwe kumamveka ndi sensa yokakamiza kumayikidwa pa chosonkhanitsa deta cholumikizidwa ku laputopu. Izi zimathandiza kuyang'anira kosalekeza kuthamanga mkati mwa chipinda cha mpweya. Kupanikizika kwakukulu kwa chipinda kukafika (muyezo wa 80 mmHg, 140 mmHg OS), chipangizo chopezera deta chinalamulidwa kutumiza chizindikiro ku dongosolo la C-PACE-EM kuti lipange chizindikiro cha biphasic voltage cha 2 ms, chokhazikitsidwa ku 4 V.
Zigawo za mtima zinapezeka ndipo chikhalidwe cha m'zitsime 6 chinachitidwa motere: Kusamutsa mitima yodulidwa kuchokera ku chotengera chosamutsira kupita ku thireyi yokhala ndi cardioplegia yozizira (4° C.). Mtsempha wakumanzere unapatulidwa ndi tsamba lopanda banga ndikudulidwa mzidutswa za 1-2 cm3. Mitsempha iyi inalumikizidwa ku zothandizira minofu ndi guluu wa minofu ndikuyikidwa mu bafa yogwedezeka ya microtome yokhala ndi yankho la Tyrode ndikuwotchedwa mpweya nthawi zonse (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g). ), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-glucose (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M yankho), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M yankho), mpaka 1 L ddH2O). Microtome yogwedezeka idakonzedwa kuti idule zidutswa zokhuthala za 300 µm pafupipafupi ya 80 Hz, kutalika kwa kugwedezeka kopingasa kwa 2 mm, ndi liwiro la 0.03 mm/s. Bafa ya minofu idazunguliridwa ndi ayezi kuti yankho likhale lozizira ndipo kutentha kunasungidwa pa 4°C. Tumizani zigawo za minofu kuchokera ku bafa ya microtome kupita ku bafa yosungiramo zinthu zomwe zili ndi yankho la Tyrode lokhala ndi mpweya nthawi zonse pa ayezi mpaka zigawo zokwanira za mbale imodzi yosungiramo zinthu zitapezeka. Pa kubzala kwa transwell, zigawo za minofu zidalumikizidwa ku zothandizira za polyurethane zosabala za 6 mm m'lifupi ndipo zidayikidwa mu 6 ml ya medium yabwino (199 medium, 1x ITS supplement, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkaline ndi 2X antibiotic-antifungal). Kulimbikitsa magetsi (10 V, pafupipafupi 1.2 Hz) kudagwiritsidwa ntchito ku zigawo za minofu kudzera mu C-Pace. Pa matenda a TD, T3 ndi Dex zatsopano zinawonjezedwa pa 100 nM ndi 1 μM pa kusintha kulikonse kwapakati. Chomeracho chimadzazidwa ndi mpweya musanachisinthe katatu patsiku. Zigawo za minofu zinakulitsidwa mu chosungiramo zinthu pa kutentha kwa 37°C ndi 5% CO2.
Pa CTCM cultures, zigawo za minofu zinayikidwa pa chosindikizira cha 3D chopangidwa mwapadera mu mbale ya Petri yokhala ndi yankho la Tyrode losinthidwa. Chipangizochi chapangidwa kuti chiwonjezere kukula kwa chidutswa cha mtima ndi 25% ya dera la mphete yothandizira. Izi zimachitika kuti zigawo za mtima zisatambasulidwe zitasamutsidwa kuchokera ku yankho la Tyrode kupita ku sing'anga komanso panthawi ya diastole. Pogwiritsa ntchito guluu wa histoacrylic, zigawo za makulidwe a 300 µm zinakhazikika pa mphete yothandizira ya mainchesi 7 mm. Mukalumikiza zigawo za minofu ku mphete yothandizira, dulani zigawo za minofu yochulukirapo ndikuyika zigawo za minofu yolumikizidwa m'bafa la yankho la Tyrode pa ayezi (4°C) mpaka zigawo zokwanira zitakonzedwa pa chipangizo chimodzi. Nthawi yonse yogwiritsira ntchito zida zonse siyenera kupitirira maola awiri. Zigawo 6 za minofu zitalumikizidwa ku mphete zawo zothandizira, chipangizo cha CTCM chinasonkhanitsidwa. Chipinda chophunzitsira cha CTCM chimadzazidwa kale ndi 21 ml pre-oxygenated medium. Samutsani zigawo za minofu ku chipinda chophunzitsira ndikuchotsa mosamala thovu lililonse la mpweya ndi pipette. Gawo la minofu limalowetsedwa mu dzenje ndikukanikizidwa pang'onopang'ono pamalo pake. Pomaliza, ikani chivundikiro cha electrode pa chipangizocho ndikusamutsa chipangizocho ku chosungiramo mpweya. Kenako lumikizani CTCM ku chubu cha mpweya ndi makina a C-PACE-EM. Choyatsira mpweya chimatseguka ndipo valavu ya mpweya imatsegula CTCM. Dongosolo la C-PACE-EM linapangidwa kuti lipereke 4 V pa 1.2 Hz panthawi ya biphasic pacing kwa 2 ms. Chosungiramo mpweya chinasinthidwa kawiri patsiku ndipo ma electrode anasinthidwa kamodzi patsiku kuti apewe kusonkhanitsa graphite pa ma electrode. Ngati pakufunika, magawo a minofu amatha kuchotsedwa m'zitsime zawo zosungiramo mpweya kuti atulutse thovu lililonse la mpweya lomwe lingakhale litagwera pansi pake. Pazifukwa za chithandizo cha MT, T3/Dex inawonjezedwa yatsopano ndi kusintha kulikonse kwapakati ndi 100 nM T3 ndi 1 μM Dex. Zipangizo za CTCM zinakulitsidwa mu chosungiramo mpweya pa 37°C ndi 5% CO2.
Kuti mupeze njira zotambasula za magawo a mtima, makina apadera a kamera adapangidwa. Kamera ya SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) idagwiritsidwa ntchito ndi Navitar Zoom 7000 18-108mm macro lens (Navitar, San Francisco, CA). Kuwonetsa zithunzi kunachitika kutentha kwa chipinda mutasintha chojambuliracho ndi chojambulira chatsopano. Kamerayo imayikidwa pa ngodya ya 51° ndipo kanemayo amajambulidwa pa mafelemu 30 pa sekondi. Choyamba, pulogalamu yotseguka (MUSCLEMOTION43) idagwiritsidwa ntchito ndi Image-J kuti iwerengere mayendedwe a magawo a mtima. Chigobacho chidapangidwa pogwiritsa ntchito MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) kuti ifotokoze madera ofunikira pakumenya magawo a mtima kuti apewe phokoso. Zigoba zogawika pamanja zimagwiritsidwa ntchito pazithunzi zonse mu dongosolo la chimango kenako zimaperekedwa ku pulogalamu ya MUSCLEMOTION. Muscle Motion imagwiritsa ntchito mphamvu yapakati ya ma pixels mu chimango chilichonse kuti iwerengere mayendedwe ake poyerekeza ndi chimango chofotokozera. Deta inalembedwa, kusefedwa ndikugwiritsidwa ntchito poyeza nthawi ya kuzungulira ndikuwunika kutambasula kwa minofu panthawi ya kuzungulira kwa mtima. Kanema wojambulidwayo adakonzedwa pambuyo pogwiritsa ntchito fyuluta ya digito ya zero-phase yoyamba. Kuti muyese kutambasula kwa minofu (kuyambira pachimake mpaka pachimake), kusanthula kwa pachimake mpaka pachimake kunachitika kuti kusiyanitsa pakati pa mapiri ndi mitsinje mu chizindikiro chojambulidwa. Kuphatikiza apo, kusokoneza kumachitika pogwiritsa ntchito polynomial ya 6th order kuti athetse kusuntha kwa chizindikiro. Khodi ya pulogalamu idapangidwa mu MATLAB kuti idziwe mayendedwe apadziko lonse a minofu, nthawi ya kuzungulira, nthawi yopumula, ndi nthawi yochepetsa (Supplementary Program Code 44).
Pa kusanthula kupsinjika, pogwiritsa ntchito makanema omwewo omwe adapangidwa kuti ayese kutambasula kwa makina, choyamba tidatsata zithunzi ziwiri zomwe zikuyimira mayendedwe (malo apamwamba kwambiri (apamwamba) ndi otsika kwambiri (otsika) a mayendedwe) malinga ndi pulogalamu ya MUSCLEMOTION. Kenako tidagawa madera a minofu ndikugwiritsa ntchito njira yojambulira mthunzi ku minofu yogawidwa (Chithunzi Chowonjezera 2a). Kenako minofu yogawidwa idagawidwa m'magawo khumi, ndipo kupsinjika pa malo aliwonse kudawerengedwa pogwiritsa ntchito equation iyi: Kupsinjika = (Sup-Sdown)/Sdown, pomwe Sup ndi Sdown ndi mtunda wa mawonekedwe kuchokera ku mithunzi yapamwamba ndi pansi pa nsalu, motsatana (Chithunzi Chowonjezera .2b).
Zigawo za mtima zinakhazikika mu 4% ya paraformaldehyde kwa maola 48. Ziwalo zokhazikika zinauma mu 10% ndi 20% ya sucrose kwa ola limodzi, kenako mu 30% ya sucrose usiku wonse. Zigawozo zinayikidwa mu optimum cutting temperature compound (OCT compound) ndipo pang'onopang'ono zinazizira mu isopentane/dry ice bath. Sungani ma OCT embedding blocks pa -80 °C mpaka zitapatukana. Ma slide anakonzedwa ngati zigawo zokhala ndi makulidwe a 8 μm.
Kuti muchotse OCT m'zigawo za mtima, tenthetsani ma slide pa chotenthetsera pa 95 °C kwa mphindi 5. Onjezani 1 ml ya PBS ku slide iliyonse ndikuyikamo kwa mphindi 30 kutentha kwa chipinda, kenako lowetsani m'zigawozo poika 0.1% Triton-X mu PBS kwa mphindi 15 kutentha kwa chipinda. Kuti mupewe ma antibodies osakhala enieni kuti asagwirizane ndi chitsanzo, onjezani 1 ml ya yankho la 3% la BSA ku ma slide ndikuyikamo kwa ola limodzi kutentha kwa chipinda. Kenako BSA inachotsedwa ndipo ma slidewo anatsukidwa ndi PBS. Ikani chizindikiro pa chitsanzo chilichonse ndi pensulo. Ma antibodies oyambira (ochepetsedwa 1:200 mu 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) ndi troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) adawonjezedwa kwa mphindi 90, kenako ma antibodies ena (ochepetsedwa 1:200 mu 1% BSA) motsutsana ndi mbewa Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), motsutsana ndi kalulu Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) kwa mphindi zina 90. Tinatsukidwa katatu ndi PBS. Pofuna kusiyanitsa utoto womwe uli pachithunzichi ndi maziko ake, tinagwiritsa ntchito antibody yachiwiri yokha ngati chowongolera. Pomaliza, utoto wa DAPI nuclear unawonjezedwa ndipo ma slide anaikidwa mu vectashield (Vector Laboratories) ndikusindikizidwa ndi misomali. -x magnification) ndi Keyence microscope yokhala ndi kukula kwa 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) pa 5 μg/ml mu PBS idagwiritsidwa ntchito popaka utoto wa WGA ndipo idayikidwa pazigawo zokhazikika kwa mphindi 30 kutentha kwa chipinda. Kenako masilayidi adatsukidwa ndi PBS ndipo Sudan wakuda adawonjezedwa pa slide iliyonse ndikuyikidwa mu incubation kwa mphindi 30. Kenako masilayidi adatsukidwa ndi PBS ndipo vectashield embedding medium idawonjezedwa. Masilayidi adawonetsedwa pa maikulosikopu ya Keyence pa kukula kwa 40x.
OCT inachotsedwa m'zitsanzo monga tafotokozera pamwambapa. Mukachotsa OCT, ikani ma slide mu yankho la Bouin usiku wonse. Kenako ma slide anatsukidwa ndi madzi osungunuka kwa ola limodzi kenako anaikidwa mu yankho la Bibrich aloe acid fuchsin kwa mphindi 10. Kenako ma slide anatsukidwa ndi madzi osungunuka ndipo anaikidwa mu yankho la 5% phosphomolybdenum/5% phosphotungstic acid kwa mphindi 10. Popanda kutsuka, sungani ma slidewo mwachindunji mu yankho la buluu la aniline kwa mphindi 15. Kenako ma slidewo anatsukidwa ndi madzi osungunuka ndipo anaikidwa mu yankho la 1% acetic acid kwa mphindi ziwiri. Ma slidewo anaumitsidwa mu 200 N ethanol ndikusamutsidwa ku xylene. Ma slide opakidwa utoto anawonetsedwa pogwiritsa ntchito maikulosikopu ya Keyence yokhala ndi cholinga cha 10x. Chiŵerengero cha dera la Fibrosis chinayesedwa pogwiritsa ntchito pulogalamu ya Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), nambala ya katalogi V13154, malinga ndi njira ya wopanga ndi zosintha zina. Makamaka, kumenyedwa kwa opaleshoni yokhala ndi mainchesi 6 mm kunagwiritsidwa ntchito kuti zitsimikizire kukula kwa minofu yofanana panthawi yofufuza MTT. Minofu inayikidwa payokha m'zitsime za mbale ya zitsime 12 yokhala ndi substrate ya MTT malinga ndi njira ya wopanga. Zigawozo zimayikidwa pa 37° C. kwa maola atatu ndipo minofu yamoyo imasinthira substrate ya MTT kuti ipange mankhwala ofiirira a formazan. Sinthani yankho la MTT ndi 1 ml DMSO ndikuyiyika pa 37°C kwa mphindi 15 kuti mutulutse formazan wofiirira kuchokera ku zigawo za mtima. Zitsanzo zinachepetsedwa 1:10 mu DMSO m'mapepala omveka bwino a pansi a 96-well ndi mtundu wofiirira womwe unayesedwa pa 570 nm pogwiritsa ntchito Cytation plate reader (BioTek). Kuwerenga kunasinthidwa kukhala koyenera kulemera kwa chidutswa chilichonse cha mtima.
Chophimba cha mtima chinasinthidwa ndi chophimba chokhala ndi 1 μCi/ml [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) kuti chiyesedwe monga momwe tafotokozera kale. Pambuyo pa maola 4 oikamo, onjezani 100 µl ya sing'anga ku chubu chotseguka cha microcentrifuge chokhala ndi 100 µl ya 0.2 N HCl. Kenako chubucho chinayikidwa mu chubu chowunikira chokhala ndi 500 μl ya dH2O kuti chisanduke [3H]2O kwa maola 72 pa 37°C. Kenako chotsani chubu cha microcentrifuge kuchokera mu chubu chowunikira ndikuwonjezera 10 ml ya madzi owunikira. Kuwerengera kwa scintillation kunachitika pogwiritsa ntchito Tri-Carb 2900TR liquid scintillation analyzer (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). Kenako kugwiritsidwa ntchito kwa shuga kunawerengedwa poganizira ntchito yeniyeni ya shuga ya [5-3H], kusakwanira kwa mgwirizano ndi maziko, kuchepetsedwa kwa shuga ya [5-3H] kupita ku shuga wosalembedwa, komanso mphamvu yotsutsana ndi scintillation. Deta imasinthidwa kukhala yofanana ndi kuchuluka kwa magawo a mtima.
Pambuyo pa kuyanjana kwa minofu mu Trizol, RNA idachotsedwa m'magawo a mtima pogwiritsa ntchito Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 malinga ndi njira ya wopanga. Kukonzekera kwa laibulale ya RNAsec, kutsatana ndi kusanthula deta kunachitika motere:
1 μg ya RNA pa chitsanzo chilichonse idagwiritsidwa ntchito ngati zinthu zoyambira pokonzekera laibulale ya RNA. Malaibulale otsatizana adapangidwa pogwiritsa ntchito NEBHext UltraTM RNA Library Preparation Kit for Illumina (NEB, USA) potsatira malangizo a wopanga, ndipo ma index code adawonjezedwa ku attribute sequences a chitsanzo chilichonse. Mwachidule, mRNA idayeretsedwa kuchokera ku total RNA pogwiritsa ntchito ma magnetic beads olumikizidwa ndi poly-T oligonucleotides. Kugawikana kumachitika pogwiritsa ntchito divalent cations pa kutentha kwakukulu mu NEBHext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). CDNA yoyamba ya strand idapangidwa pogwiritsa ntchito random hexamer primers ndi M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-). CDNA yachiwiri ya strand imapangidwanso pogwiritsa ntchito DNA polymerase I ndi RNase H. Ma overhang otsalawo amasinthidwa kukhala ma blunt edges ndi exonuclease/polymerase activity. Pambuyo pa adenylation ya malekezero a 3′ a DNA fragment, NEBHext Adapter yokhala ndi hairpin loop structure imalumikizidwa nayo kuti ikonzekere ku hybridization. Posankha zidutswa za cDNA zazitali zomwe zimakondedwa, zidutswa za laibulale ya 150-200 bp zinayeretsedwa pogwiritsa ntchito njira ya AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA). Kenako, 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) yokhala ndi cDNA yosankhidwa kukula yokhala ndi adaputala inagwiritsidwa ntchito kwa mphindi 15 pa 37°C kenako kwa mphindi 5 pa 95°C PCR isanathe. Kenako PCR inachitidwa pogwiritsa ntchito Phusion High-Fidelity DNA polymerase, ma PCR primers a universal, ndi ma Index (X) primers. Pomaliza, zinthu za PCR zinayeretsedwa (AMPure XP system) ndipo khalidwe la laibulale linayesedwa pa njira ya Agilent Bioanalyzer 2100. Kenako laibulale ya cDNA inasanjidwa pogwiritsa ntchito Novaseq sequencer. Mafayilo azithunzi zosaphika ochokera ku Illumina adasinthidwa kukhala ma raw reads pogwiritsa ntchito CASAVA Base Calling. Deta yosaphika imasungidwa mu mafayilo amtundu wa FASTQ(fq) omwe ali ndi ma read sequences ndi ma base qualities ofanana. Sankhani HISAT2 kuti mugwirizane ndi ma sequencing reads osefedwa ndi genome ya Sscrofa11.1. Kawirikawiri, HISAT2 imathandizira ma genome a kukula kulikonse, kuphatikizapo ma genome akuluakulu kuposa ma base 4 biliyoni, ndipo ma values ​​okhazikika amakhazikitsidwa pa magawo ambiri. Kuphatikiza ma reads kuchokera ku data ya RNA Seq kumatha kulumikizidwa bwino pogwiritsa ntchito HISAT2, njira yofulumira kwambiri yomwe ilipo pakadali pano, ndi kulondola komweko kapena kwabwino kuposa njira ina iliyonse.
Kuchuluka kwa zolemba kumawonetsa mwachindunji kuchuluka kwa jini. Milingo ya jini imayesedwa ndi kuchuluka kwa zolemba (kuwerengera kwa kutsatana) kogwirizana ndi genome kapena exons. Chiwerengero cha kuwerenga chikugwirizana ndi milingo ya jini, kutalika kwa jini, ndi kuzama kwa kutsatana. FPKM (zidutswa pa zikwi ziwiri za maziko a zolembedwa zotsatizana pa miliyoni imodzi ya maziko) zinawerengedwa ndipo ma P-values ​​​​a kutanthauzira kosiyana adadziwika pogwiritsa ntchito phukusi la DESeq2. Kenako tinawerengera false discovery rate (FDR) ya P iliyonse pogwiritsa ntchito njira ya Benjamini-Hochberg9 kutengera ntchito ya R-function "p.adjust".
RNA yochotsedwa m'magawo a mtima idasinthidwa kukhala cDNA pamlingo wa 200 ng/μl pogwiritsa ntchito SuperScript IV Vilo Master mix kuchokera ku Thermo (Thermo, cat. no. 11756050). Quantitative RT-PCR idachitika pogwiritsa ntchito Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well transparent reaction plate (Thermo, cat. no. 4483319) ndi microamp optical adhesive (Thermo, cat. no. 4311971). Kusakaniza kwa reaction kunali ndi 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer ndi 3.5 µl H2O yosakanikirana pa chitsime chilichonse. Ma cycle a qPCR okhazikika adayendetsedwa ndipo ma CT values ​​​​adayesedwa pogwiritsa ntchito Applied Biosystems Quantstudio 5 real-time PCR instrument (384-well module; product # A28135). Ma primer a Taqman adagulidwa kuchokera ku Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) Ma CT a zitsanzo zonse adasinthidwa kukhala jini la GAPDH.
Kutulutsidwa kwa NT-ProBNP kwa media kunayesedwa pogwiritsa ntchito NT-ProBNP kit (nkhumba) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) malinga ndi njira ya wopanga. Mwachidule, 250 µl ya chitsanzo chilichonse ndi muyezo zinawonjezedwa kawiri pachitsime chilichonse. Mukangowonjezera chitsanzocho, onjezerani 50 µl ya Assay Reagent A pachitsime chilichonse. Gwedezani mbaleyo pang'onopang'ono ndikutseka ndi sealant. Kenako mapiritsiwo anaikidwa pa 37°C kwa ola limodzi. Kenako tsanulirani yankholo ndikutsuka zitsimezo kanayi ndi 350 µl ya yankho la 1X, ndikuyika yankho la kutsuka kwa mphindi 1-2 nthawi iliyonse. Kenako onjezani 100 µl ya Assay Reagent B pachitsime chilichonse ndikutseka ndi sealant ya mbale. Piritsilo linagwedezeka pang'onopang'ono ndikuyikidwa pa 37°C kwa mphindi 30. Thirani madzi mu yankholo ndipo tsukani zitsimezo kasanu ndi kamodzi ndi 350 µl ya yankho losambitsa la 1X. Onjezani 90 µl ya yankho losambitsa pansi pa chitsime chilichonse ndikutseka mbaleyo. Ikani mbaleyo pa kutentha kwa 37°C kwa mphindi 10-20. Onjezani 50 µl Stop Solution pa chitsime chilichonse. Mbaleyo inayesedwa nthawi yomweyo pogwiritsa ntchito seti ya Cytation (BioTek) plate reader pa 450 nm.
Kusanthula kwa mphamvu kunachitika kuti asankhe kukula kwa gulu komwe kudzapereka mphamvu yoposa 80% kuti azindikire kusintha kwathunthu kwa 10% mu gawo ndi chiwopsezo cha 5% Type I. Kusanthula kwa mphamvu kunachitika kuti asankhe kukula kwa gulu komwe kudzapereka mphamvu yoposa 80% kuti azindikire kusintha kwathunthu kwa 10% mu gawo ndi chiwopsezo cha 5% Type I. Zomwe zalembedwa pansipa > 80% zapadziko lonse lapansi 10% zapadziko lonse lapansi 10% частотой ошибок типа I. Kusanthula mphamvu kunachitika kuti asankhe magulu omwe angapereke mphamvu yoposa 80% kuti azindikire kusintha kwa magawo 10% ndi chiwopsezo cha 5% Type I.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% kuthandizira kuthandizira 10% yapadziko lonse lapansi 5%. Kusanthula mphamvu kunachitika kuti asankhe kukula kwa gulu komwe kungapereke mphamvu yoposa 80% kuti azindikire kusintha kwa magawo 10% ndi kuchuluka kwa zolakwika za mtundu wa I wa 5%.Zigawo za minofu zinasankhidwa mwachisawawa asanayambe kuyesa. Kusanthula konse kunali kosazindikira momwe zinthu zilili ndipo zitsanzo zinasinthidwa pokhapokha deta yonse itafufuzidwa. Pulogalamu ya GraphPad Prism (San Diego, CA) idagwiritsidwa ntchito pochita kusanthula konse kwa ziwerengero. Pa ziwerengero zonse, ma p-values ​​amaonedwa kuti ndi ofunika kwambiri pa ma <0.05. Pa ziwerengero zonse, ma p-values ​​​​anaonedwa kuti ndi ofunika kwambiri pa ma values ​​​​<0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Pa ziwerengero zonse, ma p-values ​​​​anaonedwa kuti ndi ofunika kwambiri pa ma values ​​​​<0.05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认為是显着的.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认為是显着的. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Pa ziwerengero zonse, ma p-values ​​​​anaonedwa kuti ndi ofunika kwambiri pa ma values ​​​​<0.05.Mayeso a T-Test a Two-tailed Student adachitika pa deta ndi kufananiza kawiri kokha. ANOVA ya njira imodzi kapena ziwiri idagwiritsidwa ntchito kudziwa kufunika pakati pa magulu angapo. Pochita mayeso a post hoc, kukonza kwa Tukey kudagwiritsidwa ntchito poganizira kufananiza kambiri. Deta ya RNAsec ili ndi ziwerengero zapadera pakuwerengera FDR ndi p.adjust monga momwe tafotokozera mu gawo la Njira.
Kuti mudziwe zambiri za kapangidwe ka kafukufuku, onani chidule cha Nature Research Report cholumikizidwa ndi nkhaniyi.