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약물 검사를 위해 심장의 생리적 환경을 정확하게 재현할 수 있는 신뢰할 수 있는 체외 시스템이 필요합니다. 인간 심장 조직 배양 시스템의 가용성이 제한적이어서 심장 약물 효과에 대한 해석이 부정확했습니다. 본 연구에서는 심장 절편을 전기기계적으로 자극하고 심장 주기의 수축기 및 이완기 동안 생리적 신장을 겪는 심장 조직 배양 모델(CTCM)을 개발했습니다. 12일 배양 후, 이 접근법은 심장 절편의 생존율을 부분적으로 향상시켰지만, 구조적 완전성을 완전히 보존하지는 못했습니다. 따라서 소분자 스크리닝 후, 배지에 100 nM 트리요오드티로닌(T3)과 1 μM 덱사메타손(Dex)을 첨가했을 때 절편의 미세 구조가 12일 동안 유지됨을 확인했습니다. T3/Dex 처리와 병용했을 때, CTCM 시스템은 전사 프로파일, 생존율, 대사 활성 및 구조적 완전성을 12일 동안 신선한 심장 조직과 동일한 수준으로 유지했습니다. 또한, 배양 중 심장 조직의 과도한 신장은 비대성 심장 신호전달을 유도하여, CTCM이 심장 신장으로 유발되는 비대 상태를 모방할 수 있음을 시사합니다. 결론적으로, CTCM은 장기간 배양된 심장의 생리 및 병태생리를 모델링하여 신뢰할 수 있는 약물 스크리닝을 가능하게 합니다.
임상 연구에 앞서, 인간 심장의 생리적 환경을 정확하게 재현할 수 있는 신뢰할 수 있는 시험관 내 시스템이 필요합니다. 이러한 시스템은 변화된 기계적 신장, 심박수, 그리고 전기생리학적 특성을 모방해야 합니다. 동물 모델은 심장 생리학 스크리닝 플랫폼으로 일반적으로 사용되지만, 인간 심장에서 약물의 효과를 반영하는 데 있어 신뢰성이 제한적입니다.1,2 궁극적으로 이상적인 심장 조직 배양 실험 모델(CTCM)은 다양한 치료 및 약물학적 개입에 대해 매우 민감하고 특이적인 모델로, 인간 심장의 생리학적 및 병태생리학적 특성을 정확하게 재현합니다.3 이러한 시스템의 부재는 심부전의 새로운 치료법 개발에 제약을 주며,4,5 약물의 심장 독성은 시장 철수의 주요 원인으로 작용했습니다.6
지난 10년 동안 8개의 비심혈관 약물이 QT 간격 연장을 유발하여 심실 부정맥 및 급사를 유발한다는 이유로 임상 사용이 중단되었습니다.7 따라서 심혈관 효능과 독성을 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 전임상 스크리닝 전략에 대한 필요성이 증가하고 있습니다. 최근 약물 스크리닝 및 독성 시험에 인간 유도 만능 줄기세포 유래 심근세포(hiPS-CM)를 사용함으로써 이 문제에 대한 부분적인 해결책을 제시하고 있습니다. 그러나 hiPS-CM의 미성숙성과 심장 조직의 다세포적 복잡성 부족은 이 방법의 주요 한계입니다. 최근 연구에 따르면 자발적 수축이 시작된 직후 초기 hiPS-CM을 사용하여 심장 조직 하이드로젤을 형성하고 시간이 지남에 따라 전기 자극을 점진적으로 증가시킴으로써 이러한 한계를 부분적으로 극복할 수 있는 것으로 나타났습니다. 그러나 이러한 hiPS-CM 미세조직은 성인 심근의 성숙한 전기생리학적 및 수축적 특성을 갖지 못합니다. 또한, 인간의 심장 조직은 내피 세포, 뉴런, 기질 섬유아세포를 포함한 다양한 세포 유형이 이질적으로 혼합되어 특정 세포외 기질 단백질 세트에 의해 상호 연결된 더욱 복잡한 구조를 가지고 있습니다. 성인 포유류 심장에서 심근세포를 제외한 비심근세포 집단의 이러한 이질성11,12,13은 개별 세포 유형을 사용하여 심장 조직을 모델링하는 데 큰 장벽이 됩니다. 이러한 주요 한계는 생리적 및 병리적 조건에서 온전한 심근 조직을 배양하는 방법 개발의 중요성을 강조합니다.
인간 심장의 배양된 박편(300µm)은 온전한 인간 심근의 유망한 모델임이 입증되었습니다. 이 방법은 인간 심장 조직과 유사한 완전한 3차원 다세포 시스템에 대한 접근을 제공합니다. 그러나 2019년까지 배양된 심장 절편의 사용은 짧은(24시간) 배양 생존율로 인해 제한되었습니다. 이는 물리적-기계적 신축성 부족, 공기-액체 계면, 심장 조직의 필요를 충족시키지 못하는 단순 배지 사용 등 여러 요인 때문입니다. 2019년에 여러 연구 그룹에서 심장 조직 배양 시스템에 기계적 요소를 통합하면 배양 수명을 연장하고 심장 발현을 개선하며 심장 병리를 모방할 수 있음을 보여주었습니다. 두 가지 훌륭한 연구 17과 18은 단축 기계적 하중이 배양 중 심장 표현형에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 그러나 이러한 연구에서는 심장 절편에 등척성 인장력 17 또는 선형 요긴장 하중 18이 적용되었기 때문에 심장 주기의 동적 3차원 물리-기계적 하중을 사용하지 않았습니다. 이러한 조직 신장 방법은 여러 심장 유전자의 억제 또는 비정상적인 신장 반응 관련 유전자의 과발현을 초래했습니다. 특히, Pitoulis 외 연구진은 힘 변환기 피드백과 장력 구동 장치를 이용하여 심장 주기 재구성을 위한 동적 심장 슬라이스 배양조를 개발했습니다. 이 시스템은 더욱 정확한 체외 심장 주기 모델링을 가능하게 하지만, 방법의 복잡성과 낮은 처리량으로 인해 적용에 제약이 있습니다. 저희 연구실은 최근 전기 자극과 최적화된 배지를 사용하여 돼지와 사람 심장 조직 절편의 생존력을 최대 6일 동안 유지하는 단순화된 배양 시스템을 개발했습니다.
본 원고에서는 돼지 심장 절편을 이용한 심장 조직 배양 모델(CTCM)을 제시합니다. 이 모델은 체액 신호를 통합하여 심장 주기 동안 3차원 심장 생리 및 병태생리학적 팽창을 재현합니다. 이 CTCM은 포유류 심장의 생리/병태생리를 모방하는 비용 효율적인 중간 처리량 심장 시스템을 제공하여 전임상 약물 검사의 정확도를 이전에는 달성할 수 없었던 수준으로 높일 수 있습니다.
혈역학적 기계적 신호는 시험관 내 심근세포 기능 유지에 중요한 역할을 합니다(22,23,24). 본 연구에서는 생리적 주파수(1.2Hz, 분당 72회)에서 전기적 및 기계적 자극을 유도하여 성인 심장 환경을 모방할 수 있는 CTCM(그림 1a)을 개발했습니다. 이완기 동안 과도한 조직 신장을 방지하기 위해 3D 프린팅 장치를 사용하여 조직 크기를 25% 증가시켰습니다(그림 1b). C-PACE 시스템으로 유도된 전기적 페이싱은 심장 주기를 완전히 재현하기 위해 데이터 수집 시스템을 사용하여 수축기 100ms 전에 시작되도록 시간을 조정했습니다. 조직 배양 시스템은 프로그래밍 가능한 공압 액추에이터(LB Engineering, 독일)를 사용하여 유연한 실리콘 막을 주기적으로 팽창시켜 상부 심실의 심장 절편을 팽창시킵니다. 이 시스템은 압력 변환기를 통해 외부 공기 라인에 연결되어 압력(± 1mmHg)과 시간(± 1ms)을 정확하게 조절할 수 있었습니다(그림 1c).
a 조직 절편을 장치 배양실 내부의 파란색 7mm 지지 링에 부착합니다. 배양실은 얇고 유연한 실리콘 막으로 공기실과 분리되어 있습니다. 누출을 방지하기 위해 각 챔버 사이에 개스킷을 끼웁니다. 장치 뚜껑에는 전기 자극을 제공하는 흑연 전극이 있습니다. b 대형 조직 장치, 가이드 링, 지지 링의 개략도. 조직 절편(갈색)을 가이드 링이 장치 바깥쪽 가장자리의 홈에 위치하도록 대형 장치 위에 놓습니다. 가이드를 사용하여 조직 아크릴 접착제로 코팅된 지지 링을 심장 조직 절편 위에 조심스럽게 놓습니다. c 프로그래밍 가능한 공압 액추에이터(PPD)로 제어되는 공기실 압력에 따른 전기 자극 시간을 보여주는 그래프입니다. 데이터 수집 장치를 사용하여 압력 센서를 사용하여 전기 자극을 동기화했습니다. 배양실의 압력이 설정된 임계값에 도달하면 펄스 신호가 C-PACE-EM으로 전송되어 전기 자극을 유발합니다. d 인큐베이터 선반에 놓인 네 개의 CTCM 이미지. 네 개의 장치가 공압 회로를 통해 하나의 PPD에 연결되고, 압력 센서가 지혈 밸브에 삽입되어 공압 회로의 압력을 모니터링합니다. 각 장치에는 여섯 개의 조직 절편이 들어 있습니다.
단일 공압 액추에이터를 사용하여 각각 6개의 조직 절편을 보유할 수 있는 4개의 CTCM 장치를 제어할 수 있었습니다(그림 1d). CTCM에서 공기실의 공기압은 유체실의 동기 압력으로 변환되어 심장 슬라이스의 생리적 팽창을 유도합니다(그림 2a 및 보충 영상 1). 80mmHg에서 조직 신축을 평가한 결과 조직 절편이 25% 신축되었습니다(그림 2b). 이 신축률은 정상 심장 절편 수축성에 대한 생리적 근절 길이 2.2~2.3µm에 해당하는 것으로 나타났습니다17,19,25. 조직 움직임은 사용자 지정 카메라 설정을 사용하여 평가했습니다(보충 영상 1). 조직 움직임의 진폭과 속도(그림 2c, d)는 심장 주기 동안의 신축과 수축기 및 이완기 동안의 시간에 해당했습니다(그림 2b). 수축과 이완 동안 심장 조직의 신축과 속도는 배양에서 12일 동안 일정하게 유지되었습니다(그림 2f). 배양 중 전기 자극이 수축성에 미치는 영향을 평가하기 위해, 음영 알고리즘을 사용하여 활성 변형을 판별하는 방법을 개발했습니다(보충 그림 2a, b). 이를 통해 전기 자극이 있는 변형과 없는 변형을 구분할 수 있었습니다. 심장의 동일한 단면(그림 2f). 절단 부위의 가동 영역(R6-9)에서 전기 자극 시 전압은 전기 자극이 없는 경우보다 20% 더 높았는데, 이는 전기 자극이 수축 기능에 기여함을 시사합니다.
공기실 압력, 유체실 압력 및 조직 운동 측정의 대표적인 흔적은 공기실 압력이 유체실 압력을 변화시켜 조직 슬라이스의 해당 운동을 유발함을 확인합니다.b 조직 절편의 백분율 신장(파란색)의 대표적인 흔적은 백분율 신장(주황색)에 해당합니다.c 심장 슬라이스의 측정된 운동은 운동의 측정된 속도와 일치합니다.(d) 심장 슬라이스의 순환 운동(파란색 선)과 속도(주황색 점선)의 대표적인 궤적.e 사이클 시간(그룹당 n = 19개 슬라이스, 다른 돼지에서), 수축 시간(그룹당 n = 19개 슬라이스), 이완 시간(그룹당 n = 19개 슬라이스, 다른 돼지에서), 조직 운동(n = 25개 슬라이스)/그룹, 최대 수축 속도(다른 돼지에서 n = 24(D0), 25(D12)개 슬라이스/그룹) 및 최대 이완율(다른 돼지에서 n = 24(D0), 25(D12)개 슬라이스/그룹)의 정량화. 양측 스튜던트 t-검정 결과, 어떤 매개변수에서도 유의미한 차이가 나타나지 않았습니다. f. 전기 자극을 가한 조직 절편(빨간색)과 전기 자극을 가하지 않은 조직 절편(파란색)의 대표 변형률 분석 결과, 동일 절편의 조직 절편 10개 부위. 아래 패널은 서로 다른 절편의 10개 부위에서 전기 자극을 가한 조직 절편과 전기 자극을 가하지 않은 조직 절편의 변형률 차이 백분율을 정량화한 결과를 보여줍니다. (n = 다른 돼지의 그룹당 8개 조각, 양측 학생 t-검정을 수행함; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 다른 돼지의 그룹당 8개 조각, 양측 학생 t-검정을 수행함; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьудента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 다른 돼지의 8개 섹션/그룹, 양측 학생 t-검정; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). (n = 8 조각/组, 来自不同猪, 进行双尾science生t 检验; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 조각/组, 来自不同猪, 进行双尾science生t 检验; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьудента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8개 섹션/그룹, 다른 돼지에서 추출, 양측 학생 t-검정; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).오차 막대는 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다.
우리의 이전 정적 생체모방 심장 슬라이스 배양 시스템[20, 21]에서 우리는 전기 자극을 가하고 배지 구성을 최적화함으로써 6일 동안 심장 슬라이스의 생존력, 기능 및 구조적 무결성을 유지했습니다.그러나 10일 후, 이 수치는 급격히 떨어졌습니다.우리는 이전 정적 생체모방 배양 시스템 20, 21에서 배양한 절편을 참조할 것이며, 이전에 최적화한 배지를 MC 조건으로 사용하고 동시 기계적 및 전기적 자극(CTCM) 하에서 배양할 것입니다.라고 합니다.먼저, 우리는 전기 자극이 없는 기계적 자극은 6일 동안 조직 생존력을 유지하기에 충분하지 않다는 것을 확인했습니다(보충 그림 3a, b).흥미롭게도 STCM을 사용한 물리 기계적 및 전기적 자극을 도입함으로써 12일 심장 절편의 생존력은 MS 조건에서 신선한 심장 절편과 동일하게 유지되었지만, MTT 분석에서 보여준 것처럼 Ctrl 조건에서는 그렇지 않았습니다(그림 1).3a). 이는 기계적 자극과 심장 주기 시뮬레이션이 기존 정적 배양 시스템에서 보고된 것보다 두 배 더 오랫동안 조직 절편의 생존력을 유지할 수 있음을 시사합니다. 그러나 심장 트로포닌 T와 코넥신 43의 면역 표지를 통해 조직 절편의 구조적 무결성을 평가한 결과, 코넥신 43 발현이 12일차에 대조군보다 MC 조직에서 유의하게 높았습니다. 그러나 균일한 코넥신 43 발현과 Z-디스크 형성은 완전히 유지되지 않았습니다(그림 3b). 본 연구에서는 인공 지능(AI) 프레임워크를 사용하여 조직의 구조적 무결성을 정량화하고, 트로포닌 T 및 코넥신 염색을 기반으로 하는 이미지 기반 딥러닝 파이프라인을 사용하여 심장 절편의 구조적 무결성과 형광을 국소화 강도 측면에서 자동으로 정량화합니다. 이 방법은 참고문헌에 설명된 바와 같이 합성곱 신경망(CNN)과 딥러닝 프레임워크를 사용하여 심장 조직의 구조적 무결성을 자동화되고 편향되지 않은 방식으로 안정적으로 정량화합니다. 26. MC 조직은 정적 대조군 절편에 비해 0일차에 구조적 유사성이 향상되었습니다. 또한, Masson 트리크롬 염색 결과 배양 12일차에 대조군에 비해 MS 조건에서 섬유화 비율이 유의미하게 낮았습니다(그림 3c). CTCM은 12일차에 심장 조직 절편의 생존율을 신선한 심장 조직과 유사한 수준으로 증가시켰지만, 심장 절편의 구조적 완전성을 유의미하게 향상시키지는 못했습니다.
막대 그래프는 정적 배양(D12 Ctrl) 또는 CTCM(D12 MC)에서 12일 동안 배양한 신선한 심장 슬라이스(D0) 또는 심장 슬라이스의 MTT 생존력을 정량화한 것입니다(다른 돼지에서 채취한 슬라이스/그룹당 n = 18(D0), 15(D12 Ctrl), 12(D12 MC), 일원 분산 분석 검정을 수행했습니다. ####p < 0.0001은 D0와 비교하고 **p < 0.01은 D12 Ctrl과 비교함). 막대 그래프는 정적 배양(D12 Ctrl) 또는 CTCM(D12 MC)에서 12일 동안 배양한 신선한 심장 슬라이스(D0) 또는 심장 슬라이스의 MTT 생존력을 정량화한 것입니다(다른 돼지에서 얻은 슬라이스/그룹당 n = 18(D0), 15(D12 Ctrl), 12(D12 MC), 일원 분산 분석 검정을 수행했습니다. ####p < 0.0001은 D0와 비교하고 **p < 0.01은 D12 Ctrl과 비교함).히스토그램은 MTT 신선 심장 절편(D0) 또는 정적 배양(D12 대조군) 또는 CTCM(D12 MC)에서 12일 동안 배양한 심장 절편의 생존력을 정량화한 것을 보여줍니다(n = 18(D0), 15(D12 대조군). ) ), 다른 돼지의 12(D12 MC) 절편/그룹에 대해 일원 분산 분석 테스트를 수행했습니다.####p < 0,0001 по сравненив с D0 и **p < 0,01 по сравненив с D12 Ctrl). ####p < 0.0001은 D0와 비교하고 **p < 0.01은 D12와 비교합니다(Ctrl). a 형태의 사진은 静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切 Pictures(D0) 或心脏切 Pictures 培养12 천적 MTT活력량화), 来自不同猪 12 (D12 MC) 切pictures/组, 进行单向ANOVA 测试; 与D0 엇比, ####p < 0.0001, 与D12 Ctrl 比, **p < 0.01). a 형태의 사진은 静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切 Pictures(D0) , 来自不同猪的12 (D12 MC)切picture/组，进行单向ANOVA 测试;与D0 엇比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 엇比，**p。)신선 심장 절편(D0) 또는 정적 배양(D12 대조군) 또는 CTCM(D12 MC)에서 12일간 배양한 심장 절편에서 MTT 생존력의 정량화를 보여주는 히스토그램(n = 18(D0), 15(D12 대조군)), 다른 돼지에서 얻은 12(D12 MC) 절편/그룹, 일원 분산 분석 검정;####p < 0,0001 по сравненив с D0, **p < 0,01 по сравненив с D12 Ctrl). ####D0와 비교했을 때 p < 0.0001, **D12와 비교했을 때 p < 0.01 (Ctrl).b 신선하게 분리한 심장 절편(D0) 또는 정적 조건(Ctrl) 또는 CTCM 조건(MC)에서 12일 동안 배양한 심장 절편의 트로포닌-T(녹색), 코넥신 43(빨간색) 및 DAPI(파란색)는 대표적인 면역 형광 이미지(빈칸 척도 = 100 µm)입니다. 심장 조직 구조적 무결성에 대한 인공지능 정량화(각각 다른 돼지에서 채취한 n = 7(D0), 7(D12 Ctrl), 5(D12 MC) 슬라이스/그룹, 일원 분산 분석 검정 수행; ####p < 0.0001(D0 대비), ****p < 0.0001(D12 Ctrl 대비)). 심장 조직 구조적 무결성에 대한 인공지능 정량화(각각 다른 돼지에서 채취한 n = 7(D0), 7(D12 Ctrl), 5(D12 MC) 슬라이스/그룹, 일원 분산 분석 검정 수행; ####p < 0.0001(D0 대비), ****p < 0.0001(D12 Ctrl 대비)). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7(D0), 7(D12 Ctrl), 5(D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравненив с D0 и ****p < 0,0001 по сравненив с D12 Ctrl). 인공 지능을 이용한 심장 조직의 구조적 무결성 정량화(다른 돼지의 n = 7(D0), 7(D12 Ctrl), 5(D12 MC) 섹션/그룹, 일원 분산 분석 검정 수행; ####p < 0.0001 vs. D0 및 ****p < 0.0001과 D12 Ctrl 비교).人工智能weight化心脏组织结构完整性(n = 7(D0), 7(D12 Ctrl), 5(D12 MC) 각기 다른 돼지의 슬라이스/그룹, 일원 분산 분석 테스트;####p < 0.0001 与D0 相比，****p < 0.0001与D12 Ctrl 엇比).人工智能weight化心脏组织结构完整性(n = 7(D0), 7(D12 Ctrl), 5(D12 MC) 서로 다른 돼지 각각의 슬라이스/그룹화, 일원 분산 분석 테스트;####p < 0.0001 与D0상比，****p < 0.0001与D12 Ctrl 엇比). Iскуственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7(D0), 7(D12 Ctrl), 5(D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравненив с D12 Ctrl). 심장 조직의 구조적 무결성을 정량화하기 위한 인공 지능(n = 7(D0), 7(D12 Ctrl), 5(D12 MC) 섹션/그룹 각각 다른 돼지, 일원 분산 분석 검정; ####p<0.0001 대 D0 비교를 위해 ****p < 0.0001 대 D12 Ctrl). c Masson 삼색 염색으로 염색한 심장 조각의 대표적 이미지(왼쪽)와 정량화(오른쪽)(척도 베어 = 500 µm)(각 돼지에서 그룹당 n = 10개 조각, 일원 분산 분석 검정 수행; ####p < 0.0001은 D0와 비교하고 ***p < 0.001은 D12 Ctrl과 비교). c Masson 삼색 염색으로 염색한 심장 조각의 대표적 이미지(왼쪽)와 정량화(오른쪽)(척도 베어 = 500 µm)(각 돼지에서 그룹당 n = 10개 조각, 일원 분산 분석 검정 수행; #### D0와 비교 시 p < 0.0001, D12 Ctrl과 비교 시 ***p < 0.001). c Репрезентативные изображения (слева) 및 количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем masсона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < D0에서 0,0001까지 и ***p < 0,001 по сравненив с D12 Ctrl). c Masson 삼색 염색(비코팅 척도 = 500µm)으로 염색한 심장 절편의 대표적 이미지(왼쪽)와 정량화(오른쪽)(다른 돼지의 n = 10개 절편/그룹, 일원 분산 분석 검정 수행됨; #### p < 0 .0001(D0 대비), ***p < 0.001(D12 Ctrl 대비)). c 는 Masson 3색깔의 染料染색상심장사진의 현대적인 이미지(左)와 질량화(右)(裸尺島= 500 µm)(n = 10 个切이미지/组, 每组来自不同的猪,进行单向ANOVA)를 사용했습니다.测试;#### p < 0.0001 与D0 比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 比)。 C 사용 Masson 3 color 染料 的 心脏 切 그 代表性 （左 左） 량화 （右） 裸尺degree 裸尺degree 裸尺degree = 500 µm） （n = 10 个 切分 组每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试; #### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 엇比). c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Mасона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помочьѕ однофакторного 분석하기 ;### #p < 0,0001 по сравненив с D0, ***p < 0,001 по сравненив с D12 Ctrl). c Masson 삼색 염색으로 염색한 심장 절편의 대표적 이미지(왼쪽)와 정량화(오른쪽)(공백 = 500µm)(n = 10개 절편/그룹, 각각 다른 돼지에서 채취, 일원 분산 분석으로 검정 ;### # D0와 비교한 p < 0.0001, D12 Ctrl과 비교한 ***p < 0.001).오차 막대는 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다.
저분자 물질을 배양액에 첨가하면 CTCM 배양 중 심근세포의 온전성이 향상되고 섬유화 발생이 감소할 수 있다는 가설을 세웠습니다. 따라서 교란 요인의 수가 적기 때문에 정적 대조군 배양액20,21을 사용하여 저분자 물질을 스크리닝했습니다. 이 스크리닝을 위해 덱사메타손(Dex), 트리요오드티로닌(T3), 그리고 SB431542(SB)가 선택되었습니다. 이러한 저분자 물질들은 이전에 hiPSC-CM 배양에서 근절 길이, T-세관, 그리고 전도 속도를 증가시켜 심근세포의 성숙을 유도하는 데 사용되었습니다. 또한, 덱사메타손(글루코코르티코이드)과 SB는 모두 염증을 억제하는 것으로 알려져 있습니다29,30. 따라서, 이러한 저분자 물질 중 하나 또는 여러 개를 첨가하는 것이 심장 절편의 구조적 온전성을 향상시키는지 여부를 시험했습니다. 초기 스크리닝을 위해 각 화합물의 용량은 세포 배양 모델에서 일반적으로 사용되는 농도(1 μM Dex27, 100 nM T327, 2.5 μM SB31)를 기준으로 선정했습니다. 12일 배양 후, T3와 Dex를 병용 투여한 결과, 심근세포의 구조적 안정성이 최적화되었고 섬유질 재형성도 최소화되었습니다(보충 그림 4 및 5). 또한, T3와 Dex의 농도를 두 배 또는 두 배로 증가시켰을 때 정상 농도에 비해 유해한 효과가 나타났습니다(보충 그림 6a, b).
초기 스크리닝 후, 4가지 배양 조건에 대한 직접 비교를 수행했습니다(그림 4a): Ctrl: 이전에 설명한 정적 배양에서 최적화된 배지를 사용하여 배양한 심장 절편; 20.21 TD: 수요일에 T3 및 Ctrl s Dex 추가; MC: 이전에 최적화된 배지를 사용하여 CTCM에서 배양한 심장 절편; MT: 배지에 T3 및 Dex를 첨가한 CTCM. 12일 배양 후, MS 및 MT 조직의 생존율은 MTT 분석으로 평가한 신선한 조직과 동일하게 유지되었습니다(그림 4b). 흥미롭게도, 트랜스웰 배양(TD)에 T3 및 Dex를 첨가해도 Ctrl 조건에 비해 생존율이 크게 향상되지 않았으며, 이는 심장 절편의 생존율 유지에 기계적 자극이 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다.
12일 동안 배지에 대한 기계적 자극과 T3/Dex 보충의 효과를 평가하는 데 사용된 4가지 배양 조건을 나타낸 실험 설계 다이어그램입니다. b 막대 그래프는 모든 4가지 배양 조건(Ctrl, TD, MC 및 MT)에서 배양 후 12일째의 생존력을 신선한 심장 조각(D0)과 비교하여 정량화한 것입니다(n = 18(D0), 15(D12 Ctrl, D12 TD 및 D12 MT), 12(D12 MC) 조각/그룹, 다른 돼지에서, 일원 분산 분석 검정을 수행했습니다; ####p < 0.0001, ###p < 0.001은 D0와 비교하고, **p < 0.01은 D12 Ctrl과 비교했습니다). b 막대 그래프는 모든 4가지 배양 조건(Ctrl, TD, MC 및 MT)에서 배양 12일 후 생존력을 정량화한 것을 신선한 심장 조각(D0)과 비교한 것입니다(n = 18(D0), 15(D12 Ctrl, D12 TD 및 D12 MT), 12(D12 MC) 조각/그룹, 다른 돼지에서, 일원 분산 분석 검정을 수행했습니다; ####p < 0.0001, ###p < 0.001은 D0와 비교하고, **p < 0.01은 D12 ctrl과 비교했습니다). b Gистограма показывает количественнуу оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнениу со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12) MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний 테스트 ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнениу с D0 и **p < 0,01 по сравненив с D12 Ctrl). b 막대 그래프는 4가지 배양 조건(대조군, TD, MC 및 MT)에서 배양 후 12일째의 생존력 정량화를 신선 심장 절편(D0)과 비교한 것입니다(n = 18(D0), 15(D12 Ctrl, D12 TD 및 D12 MT), 12(D12 MC) 절편/그룹, 다른 돼지에서, 일원 분산 분석 검정; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 vs. D0 및 **p < 0.01 by by than D12 Ctrl). b 형태의 형상에는 4개의 种培养条件（Ctrl、TD、MC 와MT)与new鲜心脏切 Pictures(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD 와 D12 MT)、来自不同猪的12 (D12 MC)切picture/组，进行单向ANOVA 测试; ####p < 0.0001，###p < 0.001 与D0 엇比，**p < 0.01 与D12控조제).b 4 12 (D12 MC) b Gистограма, показывававая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнениу со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p D0에서 <0,001, **p <0,01 по сравнений с контролем D12). b 모든 4가지 배양 조건(대조군, TD, MC 및 MT)을 신선 심장 절편(D0)과 비교한 히스토그램(n = 18(D0), 15(D12 Ctrl, D12 TD 및 D12 MT), 다른 돼지 12마리(D12 MC) 절편/그룹, 일원 분산 분석 검정; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. 대조군 D12). c 막대 그래프는 모든 4가지 배양 조건(Ctrl, TD, MC 및 MT)에서 배양 12일 후 포도당 플럭스의 정량화를 신선한 심장 슬라이스(D0)와 비교한 것입니다(다른 돼지에서 얻은 n = 6개 슬라이스/그룹, 일원 분산 분석 검정 수행; ###p < 0.001, D0와 비교, ***p < 0.001, D12 Ctrl과 비교). c 막대 그래프는 모든 4가지 배양 조건(Ctrl, TD, MC 및 MT)에서 배양 12일 후 포도당 플럭스의 정량화를 신선한 심장 슬라이스(D0)와 비교한 것입니다(다른 돼지에서 얻은 n = 6개 슬라이스/그룹, 일원 분산 분석 검정 수행; ###p < 0.001, D0와 비교, ***p < 0.001, D12 Ctrl과 비교). c Gистограма показывает количественнуу оценку потока глукозы через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнениу со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, односtorонний Выполняется 테스트 분산분석; ###p < 0,001 по сравненив с D0 и ***p < 0,001 по сравненив с D12 Ctrl). c 히스토그램은 모든 4가지 배양 조건(대조군, TD, MC 및 MT)에서 배양 후 12일째의 포도당 플럭스를 신선 심장 절편(D0)과 비교하여 보여줍니다(다른 돼지에서 얻은 n = 6개 절편/그룹, 일원 분산 분석 검정 수행; ###p < 0.001은 D0와 비교하고 ***p < 0.001은 D12 Ctrl과 비교함). c 모양의 템플릿에는 4개의 种培养条件（Ctrl、TD、MC 와MT)与new鲜心脏切picture(D0) 培养后12 天的葡萄糖의 량량은 6입니다. 그림/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试;###p < 0.001，与D0 엇比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 엇比). C 형태의 유형은 4개입니다. 条件 （(ctrl , td , mc 및 mt) 新鲜 心脏 切 Pictures 切 Pictures 切 Pictures 比 , 培养 后 后 12 천 량 의 통 량 량 （n = 6개 조각/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单向执行ANOVA 测试;###p < 0.001 ，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 엇比）。 c Гистограма, показывававания количественнуу оценку потока глукозы через 12 дней после культивирования для всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнениу со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены ANOVA; ###p < 0,001 по сравненив с D0, ***p < 0,001 по сравненив с D12(контроль). c 모든 4가지 배양 조건(대조군, TD, MC 및 MT)에 대한 배양 후 12일째의 포도당 플럭스 정량화를 보여주는 히스토그램은 신선 심장 절편(D0)과 비교합니다(n = 6 절편/그룹, 다른 돼지에서 채취, 단측 ANOVA 검정이 수행되었으며, ###p < 0.001은 D0와 비교, ***p < 0.001은 D12(대조군)와 비교).d 신선 조직(파란색), 12일차 MC(녹색), 12일차 MT(빨간색) 조직의 10개 국소 조직 절편 지점에서의 균주 분석 플롯(n = 4 슬라이스/그룹, 일원 분산 분석; 그룹 간 유의미한 차이 없음). e 신선 심장 절편(D0)에서 10~12일 동안 정적 조건(Ctrl) 또는 MT 조건(MT)에서 배양한 심장 절편과 비교하여 차등 발현된 유전자를 보여주는 볼케이노 플롯. f 각 배양 조건에서 배양한 심장 절편의 근절 유전자 히트맵. 오차 막대는 평균 ± 표준 편차를 나타냄.
지방산 산화에서 해당분해로의 전환에 대한 대사 의존성은 심근세포 역분화의 특징입니다. 미성숙 심근세포는 ATP 생성을 위해 주로 포도당을 사용하며, 크리스타가 거의 없는 저형성 미토콘드리아를 가지고 있습니다5,32. 포도당 이용 분석 결과, MC 및 MT 조건에서 포도당 이용률은 0일차 조직과 유사했습니다(그림 4c). 그러나 Ctrl 샘플은 신선한 조직에 비해 포도당 이용률이 유의미하게 증가했습니다. 이는 CTCM과 T3/Dex의 병용이 조직 생존력을 향상시키고 12일 배양 심장 절편의 대사적 표현형을 보존함을 시사합니다. 또한, 균주 분석 결과, MT 및 MS 조건에서 12일 동안 균주 수준이 신선한 심장 조직과 동일하게 유지되었습니다(그림 4d).
CTCM과 T3/Dex가 심장 절편 조직의 전반적인 전사 환경에 미치는 전반적인 영향을 분석하기 위해, 네 가지 배양 조건 모두에서 심장 절편에 RNAseq를 수행했습니다(보충 자료 1). 흥미롭게도, MT 절편은 신선한 심장 조직과 높은 전사 유사성을 보였으며, 13,642개의 유전자 중 16개만 차등 발현되었습니다. 그러나 앞서 언급했듯이, Ctrl 절편은 배양 10~12일 후 1,229개의 유전자가 차등 발현되었습니다(그림 4e). 이러한 데이터는 심장 및 섬유아세포 유전자의 qRT-PCR을 통해 확인되었습니다(보충 자료 그림 7a-c). 흥미롭게도, Ctrl 절편은 심장 및 세포 주기 유전자의 하향 조절과 염증 유전자 프로그램의 활성화를 보였습니다. 이러한 데이터는 일반적으로 장기 배양 후 발생하는 역분화가 MT 조건에서 완전히 약화됨을 시사합니다(보충 자료 그림 8a, b). 근절 유전자에 대한 면밀한 연구는 MT 조건에서만 근절(그림 4f)과 이온 채널(보충 그림 9)을 암호화하는 유전자가 보존되어 Ctrl, TD, MC 조건에서의 억제로부터 보호됨을 보여주었습니다. 이러한 데이터는 기계적 자극과 체액 자극(T3/Dex)을 병행할 경우, 심장 슬라이스 전사체가 배양 12일 후에도 신선한 심장 슬라이스와 유사한 상태를 유지할 수 있음을 보여줍니다.
이러한 전사 결과는 심장 절편에서 심근세포의 구조적 온전성이 MT 조건에서 12일 동안 가장 잘 보존된다는 사실, 즉 온전하고 국소화된 코넥신 43(그림 5a)을 통해 뒷받침됩니다. 또한, MT 조건에서 심장 절편의 섬유화는 Ctrl에 비해 유의미하게 감소했으며, 신선 심장 절편과 유사했습니다(그림 5b). 이러한 결과는 기계적 자극과 T3/Dex 처리의 조합이 배양 중인 심장 절편의 심장 구조를 효과적으로 보존함을 보여줍니다.
신선하게 분리한 심장 절편(D0) 또는 4가지 심장 절편 배양 조건에서 12일 동안 배양한 트로포닌-T(녹색), 코넥신 43(빨간색) 및 DAPI(파란색)의 대표적인 면역 형광 이미지(척도 막대 = 100 µm). 심장 조직 구조적 무결성에 대한 인공지능 정량화(n = 7(D0 및 D12 Ctrl), 5(D12 TD, D12 MC 및 D12 MT) 조각/그룹, 다른 돼지에서, 일원 분산 분석 검정이 수행됨; ####p < 0.0001은 D0와 비교하고 *p < 0.05, 또는 ****p < 0.0001은 D12 Ctrl과 비교함). 심장 조직 구조적 무결성에 대한 인공지능 정량화(n = 7(D0 및 D12 Ctrl), 5(D12 TD, D12 MC 및 D12 MT) 조각/그룹, 다른 돼지에서, 일원 분산 분석 검정이 수행됨; #### p < 0.0001은 D0와 비교하고 *p < 0.05, 또는 ****p < 0.0001은 D12 Ctrl과 비교함). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помочьу искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12) TD, D12 MC 및 D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравнения с D0 и *p < 0,05 또는 ****p < 0,0001 по сравненив с D12 Ctrl). 인공 지능을 사용하여 심장 조직의 구조적 무결성을 정량화함(n = 7(D0 및 D12 Ctrl), 다른 돼지의 5(D12 TD, D12 MC 및 D12 MT) 절편/그룹, 일원 분산 분석 검정 수행됨; #### D0와 비교 시 p < 0.0001, D12 Ctrl과 비교 시 *p < 0.05 또는 ****p < 0.0001).서로 다른 心脏组织结构完整性(n = 7(D0 과 D12 Ctrl), 5(D12 TD, D12 MC 와 D12 MT) 사진/组)进行人工智能weightization,进行单向ANOVA测试;#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 엇比，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 比)。对 不同 猪 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 과 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc and d12 mt） 组） 人工 智能 량 化 进行 单向 单向单向 测试 ; ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 엇比，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 엇比)。인공 지능을 사용하여 다양한 돼지(n = 7(D0 및 D12 Ctrl), 5(D12 TD, D12 MC 및 D12 MT) 섹션/그룹)에서 심장 조직의 구조적 무결성을 일원 분산 분석(ANOVA)으로 정량화함#### p < 0,0001 по сравненив с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравненив с D12 Ctrl). #### D0와 비교했을 때 p < 0.0001이고 D12와 비교했을 때 *p < 0.05 또는 ****p < 0.0001입니다(Ctrl). b Masson 삼색 염색으로 염색한 심장 조각의 대표적 이미지와 정량화(척도 막대 = 500µm)(n = 10(D0, D12 Ctrl, D12 TD 및 D12 MC), 다른 돼지에서 얻은 조각/그룹 9(D12 MT), 일원 분산 분석 검정 수행; ####p < 0.0001은 D0와 비교하고 ***p < 0.001, 또는 ****p < 0.0001은 D12 Ctrl과 비교). b Masson 삼색 염색으로 염색한 심장 조각의 대표적 이미지와 정량화(척도 막대 = 500µm)(n = 10(D0, D12 Ctrl, D12 TD 및 D12 MC), 다른 돼지에서 얻은 조각/그룹 9(D12 MT), 일원 분산 분석 검정 수행; ####p < 0.0001은 D0와 비교하고 ***p < 0.001, 또는 ****p < 0.0001은 D12 Ctrl과 비교). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001 по сравненив с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравненив с D12 Ctrl). b Masson 삼색 염색으로 염색한 심장 절편의 대표적 이미지와 정량화(척도 막대 = 500µm)(n = 10(D0, D12 Ctrl, D12 TD 및 D12 MC), 다른 돼지의 9(D12 MT) 절편/그룹, 일원 분산 분석 수행; ####p < 0.0001 대 D0 및 ***p < 0.001 또는 ****p < 0.0001 대 D12 Ctrl). b 용 Masson 3color染料染color 心脏切文 代表性图image andweightization (比例尺= 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD 와 D12 MC), 来自不同猪的9 个 (D12) MT) 사진/组，进行单因素方差分析; ####p < 0.0001 与D0 比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 比). b 사용 Masson 3 color 染料 的 心脏 切 Pictures 적 代表性 과 량화 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 , d12 ctrl , d12 td 및 d12 mc） 来自 同 的 9个 d12 mt 切조각 切조각 切조각 切조각 切조각 切조각 切조각 切조각 切조각 切조각 切조각 切조각 切조각 切조각 切picture/组，进行单因素方差分析; ####p < 0.0001 与D0 比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 比). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравненив с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравненив с D12 Ctrl). b Masson 삼색염색체로 염색한 심장 절편의 대표적 이미지와 정량화(척도 막대 = 500µm)(n = 10(D0, D12 Ctrl, D12 TD 및 D12 MC), 다른 돼지/그룹의 절편 9(D12 MT), 1가지 ANOVA 방법; ####p < 0.0001(D0와 비교), ***p < 0.001 또는 ****p < 0.0001(D12 Ctrl과 비교).오차 막대는 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다.
마지막으로, 심장 비대를 모방하는 CTCM의 능력은 심장 조직 신장을 증가시켜 평가했습니다.CTCM에서 최대 기실 압력은 80mmHg에서 80mmHg로 증가했습니다.Art.(정상 신장) 최대 140mmHg Art.(그림 6a).이는 신장이 32% 증가한 것과 일치하며(그림 6b), 이는 이전에 심장 절편이 비대에서 볼 수 있는 것과 유사한 근절 길이를 얻는 데 필요한 해당 백분율 신장으로 나타났습니다.수축 및 이완 중 심장 조직의 신장과 속도는 배양 6일 동안 일정하게 유지되었습니다(그림 6c).MT 조건의 심장 조직은 6일 동안 정상 신장(MT(정상)) 또는 과신장 조건(MT(OS))에 노출되었습니다.배양 4일 후, 비대 바이오마커 NT-ProBNP는 MT(정상) 조건에 비해 MT(OS) 조건의 배지에서 유의하게 증가했습니다(그림 7a). 또한, 배양 6일 후, MT(OS)의 세포 크기(그림 7b)는 MT 심장(정상) 절편에 비해 유의하게 증가했습니다. 또한, 과신장된 조직에서 NFATC4 핵 전좌가 유의하게 증가했습니다(그림 7c). 이러한 결과는 과신장 후 병적인 리모델링이 점진적으로 진행됨을 보여주며, CTCM 장치가 신장 유도 심장 비대 신호전달을 연구하는 플랫폼으로 활용될 수 있다는 가능성을 뒷받침합니다.
공기실 압력, 유체실 압력 및 조직 이동 측정의 대표적인 흔적은 공기실 압력이 유체실 압력을 변화시켜 조직 슬라이스의 해당 이동을 유발한다는 것을 확인합니다.b 정상적으로 늘어난(주황색) 조직 절편과 과도하게 늘어난(파란색) 조직 절편의 대표적인 늘어남 백분율 및 늘어남 속도 곡선.c 사이클 시간(그룹당 n = 19개 슬라이스, 다른 돼지에서), 수축 시간(그룹당 n = 18-19개 슬라이스, 다른 돼지에서), 이완 시간(그룹당 n = 19개 슬라이스, 다른 돼지에서)을 보여주는 막대 그래프, 조직 이동의 진폭(그룹당 n = 14개 슬라이스, 다른 돼지에서), 최대 수축 속도(그룹당 n = 14개 슬라이스, 다른 돼지에서) 및 최대 이완 속도(다른 돼지의 n = 14(D0), 15(D6) ) 절편/그룹)를 나타냄), 양측 학생 t-검정은 어떤 매개변수에서도 유의미한 차이를 보이지 않았으며, 이러한 매개변수가 과전압으로 배양한 6일 동안 일정하게 유지되었음을 나타냄. 오차 막대는 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다.
MT 정상 신장(Norm) 또는 과신장(OS) 조건에서 배양한 심장 슬라이스의 배양 배지에서 NT-ProBNP 농도를 막대 그래프로 정량화한 것입니다(다른 돼지에서 채취한 슬라이스/그룹당 n = 4(D2 MTNorm), 3(D2 MTOS, D4 MTNorm 및 D4 MTOS), 이원 분산 분석 수행, **정상 신장과 비교한 p < 0.01). MT 정상 신장(Norm) 또는 과신장(OS) 조건에서 배양한 심장 슬라이스의 배양 배지에서 NT-ProBNP 농도를 막대 그래프로 정량화했습니다(다른 돼지의 슬라이스/그룹당 n = 4(D2 MTNorm), 3(D2 MTOS, D4 MTNorm 및 D4 MTOS), 이원 분산 분석 수행, **정상 신장과 비교한 **p < 0.01).정상 MT 신장(norm) 또는 과신장(OS) 조건에서 배양한 심장 슬라이스의 배양 배지에서 NT-ProBNP 농도의 정량적 히스토그램(n = 4(D2 MTNorm), 3(D2 MTOS, D4 MTNorm 및 D4).MTOS) 슬라이스/그룹은 서로 다른 돼지에서 채취, 분산의 2요인 분석을 수행함;**p < 0,01의 경우 снормальным растяжением). **p < 0.01 (정상적인 스트레칭과 비교). a 에서 MT 正常拉伸(Norm) 或过島拉伸(OS) 条件下培养 的心脏切 Pictures 培养基中NT-ProBNP 浓tivity적 형태의 크기 (n = 4 (D2 MTNorm)、3 (D2 MTOS、D4 MTNorm) 와 D4 MTOS)는 서로 다른 사진/사진, 이동 방법을 사용하는 방법입니다.**与정常拉伸상호,p < 0.01). a MT 정상 신장(Norm) 또는 과다 신장(OS) 조건(n = 4(D2 MTNorm), 3(D2 MTOS, D4 MTNorm 및 D4 MTOS)) 하에서 배양된 심장 절편의 NT-ProBNP 농도 정량화, 다른 猪의 조각/组, 可以双向方方发发动; **정상 신장과 비교, p < 0.01).정상 MT 신장(정상) 또는 과신장(OS) 조건에서 배양된 심장 슬라이스에서 NT-ProBNP 농도를 정량화한 히스토그램(n = 4(D2 MTNorm), 3(D2 MTOS, D4 MTNorm) 및 D4 MTOS) 슬라이스/그룹, 다른 돼지, 이원 분산 분석;**p < 0,01의 경우 снормальным растяжением). **p < 0.01 (정상적인 스트레칭과 비교). b 트로포닌 T와 WGA로 염색한 심장 슬라이스의 대표적 이미지(왼쪽)와 세포 크기 정량화(오른쪽)(다른 돼지의 10가지 슬라이스에서 얻은 n = 330(D6 MTOS), 369(D6 MTNorm) 세포/그룹, 양측 학생 t-검정을 수행함; ****p < 0.0001 정상 스트레치와 비교). b 트로포닌-T 및 WGA로 염색한 심장 슬라이스의 대표적 이미지(왼쪽) 및 세포 크기 정량화(오른쪽)(다른 돼지의 10개 슬라이스에서 얻은 n = 330(D6 MTOS), 369(D6 MTNorm) 세포/그룹, 양측 학생 t-검정을 수행함; ****p < 0.0001 정상 스트레치와 비교). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т 및 АЗП (слева) и количественного определения размера клеток(справа) (n = 330(D6 MTOS), 369(D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-크리테리이 감사합니다; ****p < 0,0001의 경우 с нормальным растяжением). b 트로포닌-T와 AZP로 염색한 심장 절편의 대표적 이미지(왼쪽)와 세포 크기 정량화(오른쪽)(다른 돼지의 10가지 다른 절편에서 얻은 n = 330(D6 MTOS), 369(D6 MTNorm) 세포/그룹, 양측 학생 t-검정 수행됨; 정상 균주와 비교한 ****p < 0.0001). b 用肌钙蛋白-T 와 WGA(左) 및 细胞大切分化(右) 染color的心脏切 Images 代表性图image (n = 330 (D6 MTOS), 来自不同猪 10 个不同切材表 369 (D6) MTNorm)细胞/组，两进行有尾school生t 检验;与正常拉伸比，****p < 0.0001). b 칼카레인-T 및 WGA로 염색한 심장 슬라이스의 대표적 이미지(왼쪽) 및 세포 크기(오른쪽)(n = 330(D6 MTOS), 10개의 다른 슬라이스에서 369개(D6 MTNorm)) 세포/섬유, 두 방법은 모두 t 검정을 사용함; 정상적인 스트레칭과 비교함, ****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т 및 АЗП(слева) 및 количественная оценка размера клеток(справа) (n = 330(D6 MTOS), 369(D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий ****p < 0,0001 сравненив с нормальным растяжением). b 트로포닌 T와 AZP로 염색한 심장 절편의 대표적 이미지(왼쪽)와 세포 크기 정량화(오른쪽)(다른 돼지의 10가지 다른 절편에서 얻은 n = 330(D6 MTOS), 369(D6 MTNorm)) 세포/그룹, 양측 기준 학생 t; ****p < 0.0001(정상 균주와 비교). c 트로포닌 T 및 NFATC4에 대해 면역 표지된 0일 및 6일 MTOS 심장 슬라이스의 대표적 이미지와 CM 핵으로의 NFATC4 전위 정량화(다른 돼지의 슬라이스/그룹당 n = 4(D0), 3(D6 MTOS), 양측 학생 t-검정 수행됨; *p < 0.05). c 트로포닌-T 및 NFATC4에 대해 면역 표지된 0일 및 6일 MTOS 심장 슬라이스의 대표적 이미지와 CM 핵으로의 NFATC4 전위 정량화(다른 돼지의 그룹당 슬라이스 n = 4(D0), 3(D6 MTOS), 양측 학생 t-검정 수행됨; *p < 0.05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 및 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т 및 NFATC4, и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток(n = 4(D0), 3(D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней, выполняется двусторонний t-크리테리이 감사합니다; *p < 0,05). c 0일 및 6일 MTOS에서 심장 절편에 대한 대표적 이미지, 트로포닌 T 및 NFATC4에 대한 면역 표지, 해면 세포 핵에서 NFATC4 전위의 정량화(다른 돼지의 그룹당 n = 4(D0), 3(D6 MTOS) 절편)는 양측 학생 t-검정을 수행했습니다. *p < 0.05). c 사용于肌钙蛋白-T 와NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切文 代表性图image,以及来自猪的NFATC4 易位至CM细胞核의 양화(n = 4(D0), 3(D6 MTOS) 切分/组, 进行双尾school生t 检验; *p < 0.05). c 칼카닌-T 및 NFATC4 면역표지의 대표 이미지 第0天와 第6天MTOS 심장 조각, 그리고 다른 NFATC4 易位至CM 세포 핵의 양화(n = 4(D0), 3(D6 MTOS))의 NFATC4 切礼/组, 时间双尾학电影; *p < 0.05). c Репрезентативные izображения срезов сердца MTOS на 0 및 6 день для IMмуномаркировки тропонином-Т 및 NFATC4 и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней(n = 4(D0), 3(D6 MTOS) срез/групpa, два- хвостатый t-критерий Стьудента; *p < 0,05). c 0일과 6일차에 트로포닌 T 및 NFATC4 면역 표지와 다양한 돼지의 CM 핵에서 NFATC4 전위 정량화를 위한 MTOS 심장 슬라이스의 대표적 이미지(n = 4(D0), 3(D6 MTOS) 슬라이스/그룹, 양측 t-기준 학생; *p < 0.05).오차 막대는 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다.
중개 심혈관 연구는 심장 환경을 정확하게 재현하는 세포 모델을 필요로 합니다. 본 연구에서는 심장의 초박막 절편을 자극할 수 있는 CTCM 장치를 개발하고 그 특성을 분석했습니다. CTCM 시스템은 생리학적으로 동기화된 전기기계적 자극과 T3 및 Dex 액 농축을 포함합니다. 돼지 심장 절편을 이러한 요인에 노출시켰을 때, 생존력, 구조적 무결성, 대사 활성 및 전사 발현은 12일 배양 후에도 신선한 심장 조직과 동일하게 유지되었습니다. 또한, 심장 조직의 과도한 신장은 과신전으로 인한 심장 비대를 유발할 수 있습니다. 전반적으로, 이러한 결과는 정상적인 심장 표현형을 유지하는 데 있어 생리학적 배양 조건이 중요한 역할을 한다는 것을 뒷받침하며, 약물 스크리닝을 위한 기반을 제공합니다.
심근세포의 기능과 생존을 위한 최적의 환경을 조성하는 데에는 여러 요인이 기여합니다. 이러한 요인 중 가장 명확한 요인은 (1) 세포 간 상호작용, (2) 전기기계적 자극, (3) 체액성 요인, 그리고 (4) 대사 기질과 관련이 있습니다. 생리학적 세포 간 상호작용은 세포외 기질에 의해 지지되는 여러 세포 유형의 복잡한 3차원 네트워크를 필요로 합니다. 이러한 복잡한 세포 상호작용은 개별 세포 유형의 공동 배양을 통해 시험관 내에서 재구성하기 어렵지만, 심장 절편의 기관형적 특성을 이용하면 쉽게 달성할 수 있습니다.
심근세포의 기계적 신장과 전기 자극은 심장 표현형 유지에 매우 중요합니다33,34,35. 기계적 자극은 hiPSC-CM의 전처리 및 성숙에 널리 사용되어 왔지만, 최근 몇몇 연구에서는 단축 부하를 이용하여 배양 중인 심장 절편에 기계적 자극을 시도했습니다. 이러한 연구들은 2차원 단축 기계적 부하가 배양 중 심장의 표현형에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 이 연구에서 심장 절편은 등척성 인장력17, 선형 요긴장 부하18를 부하하거나, 힘 변환기 피드백 및 장력 구동 장치를 사용하여 심장 주기를 재현했습니다. 그러나 이러한 방법들은 환경 최적화 없이 단축 조직 신장을 사용하기 때문에, 많은 심장 유전자의 발현이 억제되거나 비정상적인 신장 반응과 관련된 유전자의 과발현이 발생합니다. 본 명세서에 설명된 CTCM은 주기 시간과 생리적 신장(신장 25%, 수축기 40%, 이완기 60%, 분당 72회) 측면에서 자연스러운 심장 주기를 모방하는 3차원 전기기계적 자극을 제공합니다. 이러한 3차원 기계적 자극만으로는 조직의 온전성을 유지하기에 충분하지 않지만, T3/Dex를 이용한 체액성 자극과 기계적 자극을 병행해야 조직의 생존력, 기능 및 온전성을 적절히 유지할 수 있습니다.
체액성 인자는 성인 심장 표현형 조절에 중요한 역할을 합니다. 이는 세포 성숙을 촉진하기 위해 T3와 Dex를 배양 배지에 첨가한 HiPS-CM 연구에서 강조되었습니다. T3는 세포막을 통한 아미노산, 당, 칼슘의 수송에 영향을 미칠 수 있습니다36. 또한, T3는 MHC-α 발현 및 MHC-β 하향조절을 촉진하여 태아 CM의 느린 수축 근원섬유와 비교하여 성숙 심근세포에서 빠른 수축 근원섬유 형성을 촉진합니다. 갑상선 기능 저하증 환자의 T3 결핍은 근원섬유띠 소실 및 근긴장도 발달 속도 감소를 초래합니다37. Dex는 글루코코르티코이드 수용체에 작용하여 고립 관류 심장에서 심근 수축력을 증가시키는 것으로 나타났습니다.38 이러한 개선은 칼슘 침착 유도 유입(SOCE)에 대한 효과와 관련이 있는 것으로 생각됩니다39,40. 또한, 덱스는 수용체에 결합하여 면역 기능과 염증을 억제하는 광범위한 세포 내 반응을 일으킵니다.
본 연구 결과는 물리적 기계적 자극(MS)이 Ctrl에 비해 전반적인 배양 성능을 향상시켰지만, 배양 12일 동안 생존율, 구조적 완전성, 그리고 심장 발현을 유지하지 못했다는 것을 시사합니다. CTCM(MT) 배양에 T3와 Dex를 첨가한 경우, Ctrl에 비해 생존율이 향상되었고, 신선한 심장 조직과 12일 동안 유사한 전사 프로파일, 구조적 완전성, 그리고 대사 활성을 유지했습니다. 또한, 조직 신장 정도를 조절함으로써 STCM을 이용하여 과신전 유도 심장 비대 모델을 구축하여 STCM 시스템의 다재다능함을 보여주었습니다. 심장 리모델링 및 섬유화는 일반적으로 순환 세포가 적절한 사이토카인과 식세포작용 및 기타 리모델링 인자를 제공할 수 있는 온전한 장기를 포함하지만, 심장의 일부 조직은 스트레스와 외상에 반응하여 섬유화 과정을 모방할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 근섬유아세포로의 전환은 이전에 이 심장 절편 모델에서 평가되었습니다. CTCM 매개변수는 압력/전기적 진폭 및 주파수를 변경하여 빈맥, 서맥, 기계적 순환 지원(기계적 무부하 심장)과 같은 다양한 상태를 시뮬레이션할 수 있다는 점에 유의해야 합니다. 이러한 특징으로 인해 이 시스템은 약물 검사에 중간 처리량을 제공합니다. 과로로 유발된 심장 비대를 모델링할 수 있는 CTCM의 능력은 이 시스템을 개인 맞춤형 치료에 시험할 수 있는 길을 열어줍니다. 결론적으로, 본 연구는 기계적 신장과 체액 자극이 심장 조직 절편의 배양 유지에 필수적임을 보여줍니다.
본 논문에서 제시된 데이터는 CTCM이 온전한 심근을 모델링하는 데 매우 유망한 플랫폼임을 시사하지만, 이 배양 방법에는 몇 가지 한계가 있습니다. CTCM 배양의 주요 한계는 슬라이스에 지속적인 동적 기계적 응력을 가한다는 점인데, 이는 각 주기 동안 심장 슬라이스 수축을 능동적으로 모니터링하는 것을 불가능하게 합니다. 또한, 심장 절편의 크기가 7mm로 작기 때문에 배양 시스템 외부에서 기존의 힘 센서를 사용하여 수축 기능을 평가하는 데 한계가 있습니다. 본 논문에서는 수축 기능의 지표로 광 전압을 평가하여 이러한 한계를 부분적으로 극복했습니다. 그러나 이러한 한계는 추가 연구가 필요하며, 향후 칼슘 및 전압 민감성 염료를 사용한 광학 매핑과 같은 배양 중 심장 슬라이스 기능의 광학적 모니터링 방법을 도입하여 해결할 수 있을 것입니다. CTCM의 또 다른 한계는 작동 모델이 생리적 응력(전부하 및 후부하)을 조작하지 않는다는 것입니다. CTCM에서는 매우 큰 조직에서 이완기(완전한 신장)와 수축기(전기 자극 시 수축 시간)에 25%의 생리적 신장을 재현하기 위해 반대 방향으로 압력을 유도했습니다. 향후 CTCM 설계에서는 심장 조직에 양쪽에서 충분한 압력을 가하고 심방에서 발생하는 정확한 압력-용적 관계를 적용함으로써 이러한 한계를 극복할 수 있을 것입니다.
본 논문에서 보고된 과신장 유도 리모델링은 비대성 과신장 신호를 모방하는 데 국한되어 있습니다. 따라서 이 모델은 체액성 또는 신경성 요인(이 시스템에는 존재하지 않음) 없이 신장 유도 비대 신호전달 연구에 도움이 될 수 있습니다. CTCM의 다중성을 높이기 위한 추가 연구가 필요합니다. 예를 들어, 면역 세포, 순환 혈장 체액성 요인, 그리고 신경 세포와 공동 배양 시 신경 지배를 고려하면 CTCM을 이용한 질병 모델링의 가능성이 높아질 것입니다.
본 연구에는 돼지 13마리가 사용되었습니다. 모든 동물 실험은 기관 지침에 따라 수행되었으며 루이빌 대학교 동물실험윤리위원회(University of Louisville Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다. 대동맥궁을 고정하고, 무균 심정지액 1L(110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL 헤파린, pH 7.4 이하)을 심장에 관류했습니다. 심장은 보통 10분 이내에 얼음 위에 있는 실험실로 운반되기 전까지 얼음처럼 차가운 심정지 용액에 보관됩니다. 심장은 보통 10분 이내에 얼음 위에 있는 실험실로 운반되기 전까지 얼음처럼 차가운 심정지 용액에 보관됩니다. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторик на льду, что обычно занимает <10 분. 심장은 실험실로 운반하기 전까지 얼음처럼 차가운 심정지 용액에 보관했는데, 보통 얼음 위에 올려 운반하는 데 10분 미만이 걸립니다.将心脏保存은 冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，常<10分钟。将心脏保存은 冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораториу на льду, обычно 10분 미만. 심장을 얼음 위에 두고, 실험실로 이송하기 전까지 심장을 얼음 위에 두며, 보통 10분 미만입니다.
CTCM 장치는 SolidWorks CAD(컴퓨터 지원 설계) 소프트웨어를 사용하여 개발되었습니다. 배양 챔버, 분배기, 공기 챔버는 CNC 투명 아크릴 플라스틱으로 제작되었습니다. 직경 7mm의 백업 링은 중앙에 고밀도 폴리에틸렌(HDPE)으로 제작되었으며, 아래에 있는 배지를 밀봉하는 데 사용되는 실리콘 O-링을 수용할 수 있는 O-링 홈이 있습니다. 얇은 실리카 멤브레인이 배양 챔버와 분리판을 분리합니다. 실리콘 멤브레인은 0.02인치 두께의 실리콘 시트를 레이저 절단하여 제작되었으며 경도는 35A입니다. 하단 및 상단 실리콘 개스킷은 1/16인치 두께의 실리콘 시트를 레이저 절단하여 제작되었으며 경도는 50A입니다. 316L 스테인리스 스틸 나사와 윙 너트를 사용하여 블록을 고정하고 기밀 밀봉을 형성합니다.
전용 인쇄 회로 기판(PCB)은 C-PACE-EM 시스템과 통합되도록 설계되었습니다. PCB의 스위스 머신 커넥터 소켓은 은도금 구리선과 전극에 고정된 청동 0-60 나사를 통해 흑연 전극에 연결됩니다. 인쇄 회로 기판은 3D 프린터 덮개에 배치됩니다.
CTCM 장치는 심장 주기와 유사한 제어된 순환압을 생성하는 프로그래밍 가능 공압 액추에이터(PPD)로 제어됩니다. 공기실 내부 압력이 증가함에 따라 유연한 실리콘 막이 위쪽으로 팽창하여 조직 부위 아래에 있는 매질을 밀어냅니다. 이 액체 배출로 인해 조직 부위가 늘어나는데, 이는 심장 이완기 동안 심장의 생리적 팽창을 모방합니다. 이완 최고점에서 흑연 전극을 통해 전기 자극이 가해져 공기실의 압력이 감소하고 조직 단면이 수축되었습니다. 파이프 내부에는 공기 시스템의 압력을 감지하는 압력 센서가 있는 지혈 밸브가 있습니다. 압력 센서에서 감지된 압력은 노트북에 연결된 데이터 수집기에 인가됩니다. 이를 통해 가스실 내부 압력을 지속적으로 모니터링할 수 있습니다. 최대 공기실 압력(표준 80mmHg, OS 140mmHg)에 도달하면, 데이터 수집 장치는 C-PACE-EM 시스템으로 신호를 보내 2ms 동안 4V로 설정된 이상 전압 신호를 생성하도록 명령받았습니다.
심장 절편을 얻었고 6개 웰에서 다음과 같이 배양 조건을 수행했습니다. 수확한 심장을 이송 용기에서 차가운(4° C) 심정지액이 담긴 트레이로 옮깁니다. 멸균 칼날로 좌심실을 분리하고 1-2 cm3의 조각으로 자릅니다. 이 조직 블록을 조직 접착제로 조직 지지대에 부착하고 Tyrode 용액이 담긴 진동 마이크로톰 조직 욕조에 넣고 지속적으로 산소를 공급했습니다(3 g/L 2,3-부탄디온 모노옥심(BDM), 140 mM NaCl(8.18 g) . ), 6 mM KCl(0.447 g), 10 mM D-포도당(1.86 g), 10 mM HEPES(2.38 g), 1 mM MgCl2(1 M 용액 1 ml), 1.8 mM CaCl2(1 M 용액 1.8 ml), 최대 1 L ddH2O). 진동 마이크로톰은 80Hz의 주파수, 2mm의 수평 진동 진폭, 0.03mm/s의 진행 속도로 300µm 두께의 슬라이스를 절단하도록 설정되었습니다. 조직 욕조는 용액을 시원하게 유지하기 위해 얼음으로 둘러싸여 있었고 온도는 4°C로 유지되었습니다. 마이크로톰 욕조에서 조직 절편을 얼음 위에서 연속 산소화된 Tyrode 용액이 들어 있는 배양 욕조로 옮겨 한 배양 플레이트에 충분한 절편을 얻을 때까지 옮깁니다. 트랜스웰 배양의 경우, 조직 절편을 멸균된 6mm 너비의 폴리우레탄 지지대에 부착하고 최적화된 배지(199배지, 1x ITS 보충제, 10% FBS, 5ng/ml VEGF, 10ng/ml FGF-알칼리 및 2x 항생제-항진균) 6ml에 넣었습니다. 전기 자극(10V, 주파수 1.2Hz)을 C-Pace를 통해 조직 절편에 적용했습니다. TD 조건의 경우, 배지를 교체할 때마다 신선한 T3와 Dex를 100 nM과 1 μM으로 첨가했습니다. 배지는 하루 세 번 교체하기 전에 산소로 포화시켰습니다. 조직 절편은 37°C, 5% CO2의 인큐베이터에서 배양했습니다.
CTCM 배양을 위해 조직 절편을 변형된 타이로드 용액이 담긴 페트리 접시의 맞춤형 3D 프린터에 배치했습니다. 이 장치는 심장 절편의 크기를 지지 링 면적의 25%만큼 늘리도록 설계되었습니다. 이는 타이로드 용액에서 배지로 옮긴 후와 이완기 동안 심장 절편이 늘어나지 않도록 하기 위한 것입니다. 히스토아크릴 접착제를 사용하여 두께 300µm의 절편을 직경 7mm의 지지 링에 고정했습니다. 조직 절편을 지지 링에 부착한 후 여분의 조직 절편을 잘라내고 부착된 조직 절편을 얼음(4°C)에서 타이로드 용액이 담긴 욕조에 다시 넣어 한 장치에 필요한 절편이 충분히 준비될 때까지 기다립니다. 모든 장치의 총 처리 시간은 2시간을 초과해서는 안 됩니다. 6개의 조직 절편을 지지 링에 부착한 후 CTCM 장치를 조립했습니다. CTCM 배양 챔버에는 21ml의 산소화된 배지가 미리 채워져 있습니다. 조직 절편을 배양 챔버로 옮기고 피펫으로 기포를 조심스럽게 제거합니다. 조직 절편을 구멍으로 유도하고 부드럽게 눌러 제자리에 고정합니다. 마지막으로 전극 캡을 장치에 씌우고 장치를 인큐베이터로 옮깁니다. 그런 다음 CTCM을 공기 튜브와 C-PACE-EM 시스템에 연결합니다. 공압 액추에이터가 열리고 공기 밸브가 CTCM을 엽니다. C-PACE-EM 시스템은 2ms 동안 이상성 페이싱 동안 1.2Hz에서 4V를 전달하도록 구성되었습니다. 전극에 흑연이 쌓이는 것을 방지하기 위해 배지는 하루에 두 번, 전극은 하루에 한 번 교체했습니다. 필요한 경우 조직 절편을 배양 웰에서 꺼내 아래에 떨어진 기포를 제거할 수 있습니다. MT 처리 조건의 경우, T3/Dex를 100 nM T3 및 1 μM Dex와 함께 배지를 교체할 때마다 새로 첨가했습니다. CTCM 장치는 37°C, 5% CO2의 인큐베이터에서 배양했습니다.
심장 슬라이스의 늘어난 궤적을 얻기 위해 특수 카메라 시스템이 개발되었습니다.SLR 카메라(Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan)에 Navitar Zoom 7000 18-108mm 매크로 렌즈(Navitar, San Francisco, CA)를 사용했습니다.매체를 새 매질로 교체한 후 실온에서 시각화를 수행했습니다.카메라는 51° 각도로 배치하고 비디오는 초당 30프레임으로 녹화합니다.먼저 오픈 소스 소프트웨어(MUSCLEMOTION43)를 Image-J와 함께 사용하여 심장 슬라이스의 움직임을 정량화했습니다.마스크는 MATLAB(MathWorks, Natick, MA, USA)을 사용하여 생성하여 노이즈를 방지하기 위해 박동하는 심장 슬라이스의 관심 영역을 정의했습니다.수동으로 분할된 마스크는 프레임 시퀀스의 모든 이미지에 적용된 다음 MUSCLEMOTION 플러그인으로 전달됩니다.Muscle Motion은 각 프레임의 픽셀 평균 강도를 사용하여 참조 프레임에 대한 움직임을 정량화합니다. 데이터를 기록, 필터링하여 심장 주기 동안 주기 시간을 정량화하고 조직 신장을 평가하는 데 사용했습니다. 녹화된 영상은 1차 영위상 디지털 필터를 사용하여 후처리했습니다. 조직 신장(피크-피크)을 정량화하기 위해, 기록된 신호의 피크와 골을 구분하기 위해 피크-피크 분석을 수행했습니다. 또한, 신호 드리프트를 제거하기 위해 6차 다항식을 사용하여 디트렌딩을 수행했습니다. 프로그램 코드는 MATLAB에서 개발되었으며, 전체 조직 운동, 주기 시간, 이완 시간, 수축 시간을 측정했습니다(보충 프로그램 코드 44).
변형률 분석을 위해 기계적 신장 평가에 사용된 것과 동일한 영상을 사용하여, 먼저 MUSCLEMOTION 소프트웨어를 이용하여 동작 피크(가장 높은(상단) 및 가장 낮은(하단) 동작 지점)를 나타내는 두 개의 이미지를 추적했습니다. 그런 다음 조직 영역을 분할하고 분할된 조직에 일종의 음영 처리 알고리즘을 적용했습니다(보충 그림 2a). 분할된 조직을 10개의 하부 표면으로 나누고, 다음 방정식을 사용하여 각 표면의 응력을 계산했습니다. 변형률 = (Sup-Sdown)/Sdown, 여기서 Sup과 Sdown은 각각 직물의 상단 및 하단 그림자에서 형상까지의 거리입니다(보충 그림 2b).
심장 절편을 4% 파라포름알데히드에 48시간 동안 고정했습니다. 고정된 조직은 10%와 20% 수크로스에서 1시간 동안 탈수시킨 후, 30% 수크로스에서 하룻밤 동안 탈수시켰습니다. 절편을 최적 절단 온도 화합물(OCT 화합물)에 포매하고 이소펜탄/드라이아이스 수조에서 서서히 동결시켰습니다. OCT 포매 블록은 분리될 때까지 -80°C에 보관했습니다. 슬라이드는 두께 8μm의 절편으로 준비했습니다.
심장 절편에서 OCT를 제거하려면 슬라이드를 가열 블록에서 95°C로 5분간 가열합니다. 각 슬라이드에 PBS 1ml를 넣고 실온에서 30분간 배양한 후, PBS에 0.1% Triton-X를 넣고 실온에서 15분간 배양하여 절편을 투과시킵니다. 비특이 항체가 샘플에 결합하는 것을 방지하기 위해 3% BSA 용액 1ml를 슬라이드에 넣고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 BSA를 제거하고 슬라이드를 PBS로 세척합니다. 각 샘플에 연필로 표시합니다. 1차 항체(1% BSA에 1:200으로 희석)(코넥신 43(Abcam; #AB11370), NFATC4(Abcam; #AB99431) 및 트로포닌-T(Thermo Scientific; #MA5-12960)를 90분 동안 첨가한 다음, 마우스 Alexa Fluor 488(Thermo Scientific; #A16079) 및 토끼 Alexa Fluor 594(Thermo Scientific; #T6391)에 대한 2차 항체(1% BSA에 1:200으로 희석)를 90분 더 첨가했습니다. PBS로 3번 세척했습니다. 타겟 염색과 배경을 구별하기 위해 2차 항체만을 대조군으로 사용했습니다. 마지막으로 DAPI 핵 염색을 첨가하고 슬라이드를 vectashield(Vector Laboratories)에 넣고 매니큐어로 밀봉했습니다. -x 배율) 및 40x 배율의 Keyence 현미경으로 관찰했습니다.
WGA 염색에는 WGA-Alexa Fluor 555(Thermo Scientific; #W32464)를 5 μg/ml의 PBS에 녹여 고정된 절편에 도포하고 실온에서 30분 동안 배양했습니다. 그런 다음 슬라이드를 PBS로 세척하고 수단 블랙을 각 슬라이드에 첨가하여 30분 동안 배양했습니다. 그런 다음 슬라이드를 PBS로 세척하고 벡타쉴드 포매 배지를 첨가했습니다. 슬라이드는 키엔스 현미경(Keyence Microscope)을 사용하여 40배 배율로 관찰했습니다.
위에서 설명한 대로 샘플에서 OCT를 제거했습니다. OCT를 제거한 후, 슬라이드를 Bouin 용액에 하룻밤 담갔습니다. 그런 다음 슬라이드를 증류수로 1시간 동안 헹군 후 Bibrich 알로에 산 푸크신 용액에 10분 동안 담갔습니다. 그런 다음 슬라이드를 증류수로 세척하고 5% 인몰리브덴/5% 인텅스텐산 용액에 10분 동안 담갔습니다. 헹구지 않고 슬라이드를 아닐린 블루 용액에 직접 15분 동안 담갔습니다. 그런 다음 슬라이드를 증류수로 세척하고 1% 아세트산 용액에 2분 동안 담갔습니다. 슬라이드를 200 N 에탄올에서 건조하고 자일렌으로 옮겼습니다. 염색된 슬라이드는 10배 대물렌즈가 있는 Keyence 현미경을 사용하여 시각화했습니다. 섬유화 면적 백분율은 Keyence Analyzer 소프트웨어를 사용하여 정량화했습니다.
CyQUANT™ MTT 세포 생존율 분석(Invitrogen, Carlsbad, CA), 카탈로그 번호 V13154, 제조사 프로토콜에 따라 일부 수정하여 시행했습니다. 특히, MTT 분석 중 조직 크기를 균일하게 유지하기 위해 직경 6mm의 수술용 펀치를 사용했습니다. 제조사 프로토콜에 따라 조직을 MTT 기질이 담긴 12웰 플레이트의 각 웰에 개별적으로 도말했습니다. 절편을 37°C에서 3시간 동안 배양하면 살아있는 조직이 MTT 기질을 대사하여 보라색 포르마잔 화합물을 형성합니다. MTT 용액을 DMSO 1ml로 교체하고 37°C에서 15분 동안 배양하여 심장 절편에서 보라색 포르마잔을 추출했습니다. 시료를 96웰 투명 바닥 플레이트에 DMSO에 1:10으로 희석하고 Cytation 플레이트 리더(BioTek)를 사용하여 570nm에서 보라색 강도를 측정했습니다. 측정값은 각 심장 절편의 무게를 기준으로 정규화했습니다.
심장 슬라이스 배지를 1 μCi/ml [5-3H]-포도당(Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA)이 포함된 배지로 교체하여 이전에 기술된 바와 같이 포도당 이용 분석을 수행했습니다. 4시간 배양 후, 0.2 N HCl 100 μL가 담긴 개방형 마이크로원심분리관에 배지 100 μL를 첨가했습니다. 그런 다음, 튜브를 500 μL의 dH2O가 담긴 섬광관에 넣고 37°C에서 72시간 동안 [3H]2O를 증발시켰습니다. 그런 다음, 섬광관에서 마이크로원심분리관을 제거하고 섬광액 10 ml를 첨가했습니다. 섬광 계수는 Tri-Carb 2900TR 액체 섬광 분석기(Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA)를 사용하여 수행했습니다. 포도당 이용률은 [5-3H]-포도당 비활성도, 불완전 평형 및 배경, [5-3H]-포도당의 비표지 포도당으로의 희석, 그리고 섬광 계수기 효율을 고려하여 계산되었습니다. 데이터는 심장 단면의 질량을 기준으로 정규화되었습니다.
트리졸(Trizol)로 조직을 균질화한 후, 제조사의 프로토콜에 따라 Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874를 사용하여 심장 절편에서 RNA를 분리했습니다. RNAsec 라이브러리 제작, 시퀀싱 및 데이터 분석은 다음과 같이 수행되었습니다.
RNA 라이브러리 제조를 위한 출발 물질로 샘플당 1 μg의 RNA를 사용했습니다. 시퀀싱 라이브러리는 제조업체의 권장 사항에 따라 Illumina(NEB, USA)용 NEBNext UltraTM RNA 라이브러리 제조 키트를 사용하여 생성했으며, 각 샘플의 속성 시퀀스에 인덱스 코드를 추가했습니다. 간략하게 설명하면, 폴리-T 올리고뉴클레오티드가 부착된 자성 비드를 사용하여 총 RNA에서 mRNA를 정제했습니다. NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer(5X)에서 고온에서 2가 양이온을 사용하여 단편화를 수행했습니다. 첫 번째 가닥 cDNA는 랜덤 헥사머 프라이머와 M-MuLV 역전사효소(RNase H-)를 사용하여 합성했습니다. 두 번째 가닥 cDNA는 DNA 중합효소 I과 RNase H를 사용하여 합성했습니다. 남은 돌출부는 엑소뉴클레아제/중합효소 활성에 의해 평활 말단으로 전환되었습니다. DNA 단편의 3' 말단을 아데닐화한 후, 헤어핀 루프 구조를 가진 NEBNext Adapter를 부착하여 혼성화를 준비했습니다. 150-200 bp의 원하는 길이를 갖는 cDNA 단편을 선별하기 위해, 라이브러리 단편을 AMPure XP 시스템(Beckman Coulter, Beverly, USA)을 사용하여 정제했습니다. 크기 선별된 cDNA를 어댑터로 연결한 USER Enzyme(NEB, USA) 3 μl를 37°C에서 15분, 그리고 PCR 전에 95°C에서 5분 동안 처리했습니다. PCR은 Phusion High-Fidelity DNA polymerase, universal PCR 프라이머, 그리고 Index(X) 프라이머를 사용하여 수행했습니다. 마지막으로, PCR 산물을 정제하고(AMPure XP 시스템), Agilent Bioanalyzer 2100 시스템에서 라이브러리 품질을 평가했습니다. cDNA 라이브러리는 Novaseq 시퀀서를 사용하여 시퀀싱했습니다. Illumina의 원시 이미지 파일은 CASAVA Base Calling을 사용하여 원시 리드로 변환했습니다. 원시 데이터는 리드 시퀀스와 해당 염기 품질을 포함하는 FASTQ(fq) 형식 파일로 저장됩니다. 필터링된 시퀀싱 리드를 Sscrofa11.1 참조 유전체와 일치시키려면 HISAT2를 선택하세요. 일반적으로 HISAT2는 40억 염기 이상의 유전체를 포함하여 모든 크기의 유전체를 지원하며, 대부분의 매개변수에는 기본값이 설정되어 있습니다. RNA Seq 데이터의 스플라이싱 리드는 현재 사용 가능한 가장 빠른 시스템인 HISAT2를 사용하여 다른 어떤 방법보다 동일하거나 더 나은 정확도로 효율적으로 정렬할 수 있습니다.
전사체의 풍부함은 유전자 발현 수준을 직접적으로 반영합니다. 유전자 발현 수준은 게놈 또는 엑손과 관련된 전사체의 풍부함(시퀀싱 수)으로 평가됩니다. 리드 수는 유전자 발현 수준, 유전자 길이, 그리고 시퀀싱 깊이에 비례합니다. FPKM(100만 염기쌍당 시퀀싱된 전사체의 1,000 염기쌍당 단편 수)을 계산하고, DESeq2 패키지를 사용하여 차등 발현의 P값을 구했습니다. 그런 다음 내장 R 함수 "p.adjust"를 기반으로 Benjamini-Hochberg 방법9을 사용하여 각 P값에 대한 위발견률(FDR)을 계산했습니다.
심장 절편에서 분리한 RNA를 Thermo(Thermo, 카탈로그 번호 11756050)의 SuperScript IV Vilo Master mix를 사용하여 200 ng/μl 농도의 cDNA로 전환했습니다. Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well 투명 반응 플레이트(Thermo, 카탈로그 번호 4483319)와 microamp 광학 접착제(Thermo, 카탈로그 번호 4311971)를 사용하여 정량 RT-PCR을 수행했습니다. 반응 혼합물은 Taqman Fast Advanced Master mix(Thermo, 카탈로그 번호 4444557) 5 µl, Taqman Primer 0.5 µl, H2O 3.5 µl를 웰당 혼합하여 사용했습니다. 표준 qPCR 사이클을 실행하고 Applied Biosystems Quantstudio 5 실시간 PCR 기기(384-well 모듈, 제품 번호 A28135)를 사용하여 CT 값을 측정했습니다. Taqman 프라이머는 Thermo(GAPDH(Ss03375629_u1), PARP12(Ss06908795_m1), PKDCC(Ss06903874_m1), CYGB(Ss06900188_m1), RGL1(Ss06868890_m1), ACTN1(Ss01009508_mH), GATA4(Ss03383805_u1), GJA1(Ss03374839_u1), COL1A2(Ss03375009_u1), COL3A1(Ss04323794_m1), ACTA2(Ss04245588_m1))에서 구입했습니다. 모든 샘플의 CT 값은 하우스키핑 유전자 GAPDH에 대해 정규화되었습니다.
NT-ProBNP의 배지 방출은 제조사의 프로토콜에 따라 NT-ProBNP 키트(돼지용)(카탈로그 번호 MBS2086979, MyBioSource)를 사용하여 평가했습니다. 간단히 말해서, 각 샘플과 표준물질을 250 µl씩 각 웰에 두 번씩 첨가했습니다. 샘플을 첨가한 직후, 각 웰에 Assay Reagent A 50 µl를 첨가했습니다. 플레이트를 가볍게 흔들고 밀봉제로 밀봉했습니다. 그런 다음 정제를 37°C에서 1시간 동안 배양했습니다. 그런 다음 용액을 흡인하고 1X 세척액 350 µl로 웰을 4번 세척하고 매번 세척액을 1~2분 동안 배양했습니다. 그런 다음 웰당 Assay Reagent B 100 µl를 첨가하고 플레이트 밀봉제로 밀봉했습니다. 정제를 가볍게 흔들고 37°C에서 30분 동안 배양했습니다. 용액을 흡인하고 1X 세척액 350 µl로 웰을 5번 세척했습니다. 각 웰에 기질 용액 90 µl를 넣고 플레이트를 밀봉합니다. 플레이트를 37°C에서 10-20분간 배양합니다. 각 웰에 정지 용액 50 µl를 넣습니다. 플레이트는 Cytation(BioTek) 플레이트 리더를 450 nm로 설정하여 즉시 측정했습니다.
매개변수의 10% 절대 변화를 5%의 제1종 오류율로 감지할 수 있는 80% 이상의 검정력을 제공하는 그룹 크기를 선택하기 위해 검정력 분석을 수행했습니다. 매개변수의 10% 절대 변화를 5%의 제1종 오류율로 감지할 수 있는 >80%의 검정력을 제공하는 그룹 크기를 선택하기 위해 검정력 분석을 수행했습니다. ANALYZ MONSTERNOSTY был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мочности для обнаружения 10% абсолутного изменения 매개변수 с 5% частотой ошибок типа I. 5%의 제1종 오류율로 10%의 절대 매개변수 변화를 감지하는 데 80% 이상의 검정력을 제공하는 그룹 크기를 선택하기 위해 검정력 분석을 수행했습니다.进行功效分析以选择将提供> 80%功效以检测参数中10%绝对变化와 5%I型错误率的组大大.进行功效分析以选择将提供> 80%功效以检测参数中10%绝对变化와 5%I型错误率的组大大. Был проведен анализ мочности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мочности для обнаружения 10% абсолутного изменения 매개변수 및 5% частоты ошибок типа I. 10%의 절대 매개변수 변화와 5%의 제1종 오류율을 감지하는 데 80% 이상의 검정력을 제공하는 그룹 크기를 선택하기 위해 검정력 분석을 수행했습니다.실험 전에 조직 절편을 무작위로 추출했습니다. 모든 분석은 조건 맹검으로 진행되었으며, 모든 데이터가 분석된 후에만 샘플을 판독했습니다. 모든 통계 분석에는 GraphPad Prism 소프트웨어(캘리포니아주 샌디에이고)를 사용했습니다. 모든 통계에서 p값은 0.05 미만일 때 유의한 것으로 간주되었습니다. 모든 통계에 대해 p값은 0.05 미만일 때 유의한 것으로 간주되었습니다. Для всей statистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. 모든 통계에 대해 p값은 0.05 미만일 때 유의한 것으로 간주되었습니다.对于所有统计数据，p 值재值<0.05 时被认为是显着的.对于所有统计数据，p 值재值<0.05 时被认为是显着的. Для всей statистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. 모든 통계에 대해 p값은 0.05 미만일 때 유의한 것으로 간주되었습니다.비교 횟수가 두 번뿐인 데이터에 대해 양측 스튜던트 t-검정을 수행했습니다. 여러 군 간의 유의성을 확인하기 위해 일원 분산 분석 또는 이원 분산 분석(ANOVA)을 사용했습니다. 사후 검정을 수행할 때는 다중 비교를 고려하여 투키 보정을 적용했습니다. RNAsec 데이터는 방법 섹션에서 설명한 바와 같이 FDR 및 p.adjust를 계산할 때 특별한 통계적 고려 사항이 있습니다.
연구 설계에 대한 자세한 내용은 이 기사에 링크된 Nature Research Report 초록을 참조하세요.