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약물 테스트를 위해 심장의 생리적 환경을 정확하게 재현할 수 있는 신뢰할 수 있는 체외 시스템이 필요합니다. 인간 심장 조직 배양 시스템의 제한적인 가용성으로 인해 심장 약물 효과에 대한 해석이 부정확해지는 경우가 있었습니다. 본 연구에서는 심장 절편에 전기기계적 자극을 가하고 심장 주기의 수축기 및 이완기 동안 생리적 신장을 적용하는 심장 조직 배양 모델(CTCM)을 개발했습니다. 12일간의 배양 후, 이 방법은 심장 절편의 생존율을 부분적으로 향상시켰지만 구조적 완전성을 완전히 보존하지는 못했습니다. 따라서 소분자 스크리닝을 통해 배양액에 100 nM 트리요오드티로닌(T3)과 1 μM 덱사메타손(Dex)을 첨가하면 12일 동안 절편의 미세구조가 유지됨을 확인했습니다. T3/Dex 처리와 병용했을 때, CTCM 시스템은 12일 동안 신선한 심장 조직과 동일한 수준으로 전사 프로파일, 생존율, 대사 활동 및 구조적 완전성을 유지했습니다. 또한, 배양된 심장 조직을 과도하게 늘리면 심장 비대 신호가 유도되는데, 이는 CTCM이 심장 조직 늘림으로 인한 비대 상태를 모방할 수 있음을 보여주는 증거입니다. 결론적으로, CTCM은 장기간에 걸쳐 배양 환경에서 심장의 생리 및 병리 생리를 모델링할 수 있어 신뢰할 수 있는 약물 스크리닝을 가능하게 합니다.
임상 연구에 앞서, 인체 심장의 생리적 환경을 정확하게 재현할 수 있는 신뢰할 수 있는 체외 시스템이 필요합니다. 이러한 시스템은 변화된 기계적 신장, 심박수 및 전기생리학적 특성을 모방해야 합니다. 동물 모델은 심장 생리학 스크리닝 플랫폼으로 흔히 사용되지만, 인체 심장에 대한 약물 효과를 반영하는 데에는 신뢰도가 제한적입니다.^1,2 궁극적으로 이상적인 심장 조직 배양 실험 모델(CTCM)은 다양한 치료 및 약리학적 개입에 대해 높은 민감도와 특이성을 가지며, 인체 심장의 생리 및 병태생리학을 정확하게 재현하는 모델입니다.³ 이러한 시스템의 부재는 심부전의 새로운 치료법 개발을 제한하고^4,5 약물 심장 독성이 시장 퇴출의 주요 원인이 되고 있습니다.⁶
지난 10년간 심혈관계 질환과 관련 없는 약물 8종이 QT 간격 연장을 유발하여 심실 부정맥 및 급성 심장사를 초래하는 부작용으로 임상에서 퇴출되었습니다.7 따라서 심혈관계 효능 및 독성을 평가하기 위한 신뢰할 수 있는 전임상 스크리닝 전략의 필요성이 점점 커지고 있습니다. 최근 인간 유도 만능 줄기세포 유래 심근세포(hiPS-CM)를 이용한 약물 스크리닝 및 독성 시험은 이러한 문제에 대한 부분적인 해결책을 제시합니다. 그러나 hiPS-CM의 미성숙한 특성과 심장 조직의 다세포 복잡성 부족은 이 방법의 주요 한계점입니다. 최근 연구에 따르면, 자발적 수축이 시작된 직후의 hiPS-CM을 이용하여 심장 조직 하이드로겔을 형성하고 시간에 따라 전기 자극을 점진적으로 증가시키는 방법을 통해 이러한 한계를 부분적으로 극복할 수 있음을 보여주었습니다. 그러나 이러한 hiPS-CM 미세조직은 성인 심근의 성숙한 전기생리학적 및 수축 특성을 결여하고 있습니다. 또한, 인간 심장 조직은 내피 세포, 신경 세포, 기질 섬유아세포를 비롯한 다양한 세포 유형이 특정한 세포외 기질 단백질에 의해 서로 연결된 이질적인 혼합물로 구성된 더욱 복잡한 구조를 가지고 있습니다. 성체 포유류 심장에서 심근세포 이외의 세포 집단이 이질적이라는 점11,12,13은 개별 세포 유형을 사용하여 심장 조직을 모델링하는 데 있어 주요한 장벽입니다. 이러한 주요 한계점들은 생리적 및 병리학적 조건 하에서 손상되지 않은 심근 조직을 배양하는 방법을 개발하는 것이 중요하다는 점을 강조합니다.
배양된 얇은(300µm) 인간 심장 절편은 손상되지 않은 인간 심근의 유망한 모델임이 입증되었습니다. 이 방법은 인간 심장 조직과 유사한 완전한 3차원 다세포 시스템을 제공합니다. 그러나 2019년까지 배양된 심장 절편의 사용은 짧은(24시간) 배양 생존 시간으로 인해 제한되었습니다. 이는 물리적-기계적 신장 부족, 공기-액체 계면, 심장 조직의 요구 사항을 충족하지 못하는 단순한 배지 사용 등 여러 요인 때문입니다. 2019년, 여러 연구 그룹은 심장 조직 배양 시스템에 기계적 요인을 통합하면 배양 수명을 연장하고 심장 발현을 개선하며 심장 병리를 모방할 수 있음을 입증했습니다. 두 가지 주목할 만한 연구17과 18는 단축 기계적 하중이 배양 중 심장 표현형에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 그러나 이 연구들은 심장 절편에 등척성 인장력17 또는 선형 등장성 하중18만을 적용했기 때문에 심장 주기의 동적인 3차원 물리적-기계적 하중을 사용하지 않았습니다. 이러한 조직 스트레칭 방법은 많은 심장 유전자의 발현 억제 또는 비정상적인 스트레칭 반응과 관련된 유전자의 과발현을 초래했습니다. 특히, Pitoulis 등19은 힘 변환기 피드백과 장력 구동을 이용하여 심장 주기 재구성을 위한 동적 심장 조직 절편 배양조를 개발했습니다. 이 시스템은 보다 정확한 체외 심장 주기 모델링을 가능하게 하지만, 방법의 복잡성과 낮은 처리량으로 인해 적용이 제한적입니다. 저희 연구실에서는 최근 전기 자극과 최적화된 배지를 사용하여 돼지 및 인간 심장 조직 절편의 생존력을 최대 6일20,21 동안 유지할 수 있는 간소화된 배양 시스템을 개발했습니다.
본 논문에서는 돼지 심장 조직 일부를 이용한 심장 조직 배양 모델(CTCM)을 개발하여, 심장 주기 동안의 3차원적인 심장 생리 및 병리생리적 팽창을 재현하기 위해 체액 신호를 도입했습니다. 이 CTCM은 비용 효율적이고 중간 처리량의 심장 시스템을 제공함으로써, 포유류 심장의 생리/병리생리적 특성을 모방하여 전임상 약물 예측의 정확도를 전례 없는 수준으로 향상시킬 수 있습니다.
혈역학적 기계적 신호는 시험관 내에서 심근세포 기능을 유지하는 데 중요한 역할을 합니다.22,23,24 본 논문에서는 생리적 주파수(1.2Hz, 분당 72회)에서 전기적 및 기계적 자극을 모두 유도하여 성인 심장 환경을 모방할 수 있는 CTCM(그림 1a)을 개발했습니다. 이완기 동안 조직의 과도한 늘어짐을 방지하기 위해 3D 프린팅 장치를 사용하여 조직 크기를 25% 증가시켰습니다(그림 1b). C-PACE 시스템에 의한 전기 자극은 데이터 수집 시스템을 사용하여 수축기 100ms 전에 시작되도록 설정하여 심장 주기를 완벽하게 재현했습니다. 조직 배양 시스템은 프로그래밍 가능한 공압 액추에이터(LB Engineering, 독일)를 사용하여 유연한 실리콘 막을 주기적으로 팽창시켜 상부 챔버의 심장 조직을 팽창시킵니다. 이 시스템은 압력 변환기를 통해 외부 공기 라인에 연결되어 압력(± 1mmHg)과 시간(± 1ms)을 정밀하게 조절할 수 있었습니다(그림 1c).
a. 조직 절편을 기기 배양 챔버 내부의 파란색으로 표시된 7mm 지지 링에 부착합니다. 배양 챔버는 얇고 유연한 실리콘 막으로 공기 챔버와 분리되어 있습니다. 누출을 방지하기 위해 각 챔버 사이에 개스킷을 넣습니다. 기기 뚜껑에는 전기 자극을 제공하는 흑연 전극이 있습니다. b. 대형 조직 장치, 가이드 링 및 지지 링의 개략도입니다. 조직 절편(갈색)은 가이드 링이 장치 바깥쪽 가장자리의 홈에 놓인 대형 장치 위에 놓습니다. 가이드 링을 사용하여 조직용 아크릴 접착제가 도포된 지지 링을 심장 조직 절편 위에 조심스럽게 놓습니다. c. 프로그래밍 가능한 공압 액추에이터(PPD)로 제어되는 공기 챔버 압력에 따른 전기 자극 시간을 나타내는 그래프입니다. 압력 센서를 사용하여 전기 자극을 동기화하기 위해 데이터 수집 장치를 사용했습니다. 배양 챔버의 압력이 설정된 임계값에 도달하면 펄스 신호가 C-PACE-EM으로 전송되어 전기 자극을 유발합니다. d. 배양기 선반에 놓인 4개의 CTCM 이미지입니다. 네 개의 장치가 공압 회로를 통해 하나의 PPD에 연결되며, 압력 센서가 지혈 밸브에 삽입되어 공압 회로의 압력을 모니터링합니다. 각 장치에는 6개의 조직 조각이 포함되어 있습니다.
단일 공압 액추에이터를 사용하여 각각 6개의 조직 절편을 고정할 수 있는 4개의 CTCM 장치를 제어할 수 있었습니다(그림 1d). CTCM에서 공기 챔버의 공기압은 유체 챔버의 동기 압력으로 변환되어 심장 절편의 생리적 팽창을 유도합니다(그림 2a 및 보충 동영상 1). 80 mmHg 압력에서 조직 신장률을 평가한 결과, 조직 절편이 25% 신장된 것으로 나타났습니다(그림 2b). 이 신장률은 정상적인 심장 절편 수축력에 대한 생리적 근절 길이인 2.2~2.3 µm에 해당하는 것으로 알려져 있습니다.17,19,25 조직 움직임은 맞춤형 카메라 설정을 사용하여 평가했습니다(보충 그림 1). 조직 움직임의 진폭과 속도(그림 2c, d)는 심장 주기 동안의 신장률 및 수축기와 이완기 동안의 시간에 따라 변화했습니다(그림 2b). 심장 조직의 수축 및 이완 동안의 신장률과 속도는 배양 12일 동안 일정하게 유지되었습니다(그림 2f). 배양 중 수축력에 대한 전기 자극의 효과를 평가하기 위해 음영 알고리즘을 이용한 능동적 변형 판별 방법을 개발하였고(보충 그림 2a,b), 전기 자극 유무에 따른 변형을 구별할 수 있었습니다. 동일한 심장 단면(그림 2f)에서, 절단면의 가동 영역(R6-9)에서 전기 자극 시 전압은 전기 자극이 없을 때보다 20% 더 높았으며, 이는 전기 자극이 수축 기능에 기여함을 나타냅니다.
(a) 공기실 압력, 유체실 압력 및 조직 움직임 측정의 대표적인 그래프는 공기실 압력이 유체실 압력을 변화시켜 조직 절편의 움직임을 유발함을 확인시켜 줍니다. (b) 조직 절편의 신장률(파란색)과 이에 상응하는 신장률(주황색)의 대표적인 그래프. (c) 심장 절편의 측정된 움직임은 측정된 움직임 속도와 일치합니다. (d) 심장 절편에서 주기적 움직임(파란색 실선)과 속도(주황색 점선)의 대표적인 궤적. (e) 주기 시간(그룹당 19개 절편, 서로 다른 돼지에서 채취), 수축 시간(그룹당 19개 절편), 이완 시간(그룹당 19개 절편, 서로 다른 돼지에서 채취), 조직 움직임(그룹당 25개 절편, 서로 다른 돼지에서 채취), 최대 수축기 속도(그룹당 24개(D0), 25개(D12) 절편, 서로 다른 돼지에서 채취) 및 최대 이완 속도(그룹당 24개(D0), 25개(D12) 절편, 서로 다른 돼지에서 채취)의 정량화. 양측 검정 스튜던트 t-검정 결과, 모든 매개변수에서 유의미한 차이가 나타나지 않았습니다. f 전기 자극을 가한 조직 단면(빨간색)과 가하지 않은 조직 단면(파란색)의 대표적인 변형률 분석 결과이며, 동일한 조직 단면에서 10개의 영역을 추출했습니다. 아래 패널은 서로 다른 조직 단면에서 추출한 10개 영역에서 전기 자극을 가한 경우와 가하지 않은 경우의 변형률 차이를 백분율로 나타낸 것입니다. (각 그룹당 서로 다른 돼지에서 채취한 슬라이스 8개, 양측 검정 스튜던트 t-검정 수행; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (각 그룹당 서로 다른 돼지에서 채취한 슬라이스 8개, 양측 검정 스튜던트 t-검정 수행; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьудента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (각 그룹당 서로 다른 돼지에서 추출한 8개 부위, 양측 검정 스튜던트 t-검정; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). (n = 8 조각/组, 来自不同猪, 进行双尾science生t 检验; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 조각/组, 来自不同猪, 进行双尾science生t 检验; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьудента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (그룹당 8개 부위, 서로 다른 돼지에서 추출, 양측 검정 스튜던트 t-검정; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).오차 막대는 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다.
이전에 개발한 정적 생체모방 심장 절편 배양 시스템[20, 21]에서는 전기 자극을 가하고 배지 조성을 최적화하여 심장 절편의 생존력, 기능 및 구조적 완전성을 6일 동안 유지했습니다. 그러나 10일 후에는 이러한 수치가 급격히 감소했습니다. 본 연구에서는 이전의 정적 생체모방 배양 시스템[20, 21]에서 배양한 절편을 대조군(Ctrl)으로, 이전에 최적화한 배지를 MC 조건으로, 그리고 동시 기계적 및 전기적 자극(CTCM) 조건에서 배양한 절편을 CTCM으로 명명하겠습니다. 먼저, 전기 자극 없이 기계적 자극만으로는 조직 생존력을 6일 동안 유지하기에 불충분함을 확인했습니다(보충 그림 3a,b). 흥미롭게도, STCM을 이용하여 생리적-기계적 및 전기적 자극을 동시에 가했을 때, MTT 분석 결과에서 알 수 있듯이 12일 된 심장 절편의 생존력은 대조군 조건과는 달리 MS 조건에서 배양한 신선한 심장 절편과 동일하게 유지되었습니다(그림 1,3a). 이는 기계적 자극과 심장 주기 모방이 이전 정적 배양 시스템에서 보고된 것보다 두 배 더 오랫동안 조직 절편의 생존력을 유지할 수 있음을 시사합니다. 그러나 심장 트로포닌 T와 커넥신 43의 면역표지법을 통해 조직 절편의 구조적 완전성을 평가한 결과, 12일째 MC 조직에서 커넥신 43 발현이 동일 날짜의 대조군보다 유의하게 높았습니다. 하지만 균일한 커넥신 43 발현과 Z-disc 형성은 완전히 유지되지 않았습니다(그림 3b). 본 연구에서는 인공지능(AI) 프레임워크26을 사용하여 조직 구조적 완전성을 정량화했습니다. 이 프레임워크는 트로포닌 T와 커넥신 염색43을 기반으로 하는 이미지 기반 딥러닝 파이프라인으로, 심장 절편의 구조적 완전성과 형광 강도를 국소화 강도 측면에서 자동으로 정량화합니다. 이 방법은 참고 문헌에 설명된 바와 같이 합성곱 신경망(CNN)과 딥러닝 프레임워크를 사용하여 심장 조직의 구조적 완전성을 자동화되고 편향되지 않은 방식으로 안정적으로 정량화합니다. 26. MC 조직은 정적 대조군 절편에 비해 0일차와 구조적 유사성이 향상된 것으로 나타났습니다. 또한, 마손 트리크롬 염색 결과 배양 12일차에 MS 조건에서 배양한 경우 대조군 조건에 비해 섬유화 비율이 현저히 낮았습니다(그림 3c). CTCM은 배양 12일차에 심장 조직 절편의 생존율을 신선한 심장 조직과 유사한 수준으로 증가시켰지만, 심장 절편의 구조적 완전성은 유의미하게 개선시키지는 못했습니다.
a 막대 그래프는 신선한 심장 절편(D0) 또는 정지 배양(D12 Ctrl)이나 CTCM(D12 MC)에서 12일 동안 배양한 심장 절편의 MTT 생존율을 정량화한 결과를 보여줍니다(각 그룹당 서로 다른 돼지에서 얻은 절편 수 n = 18(D0), 15(D12 Ctrl), 12(D12 MC), 일원 분산 분석 수행; ####p < 0.0001은 D0 대비, **p < 0.01은 D12 Ctrl 대비). a 막대 그래프는 신선한 심장 절편(D0) 또는 정지 배양(D12 Ctrl)이나 CTCM(D12 MC)에서 12일 동안 배양한 심장 절편의 MTT 생존율을 정량화한 결과를 보여줍니다(각 그룹당 서로 다른 돼지에서 얻은 절편 수 n = 18(D0), 15(D12 Ctrl), 12(D12 MC), 일원 분산 분석 수행; ####p < 0.0001은 D0 대비, **p < 0.01은 D12 Ctrl 대비).히스토그램은 MTT 신선 심장 절편(D0) 또는 정지 배양(D12 대조군) 또는 CTCM(D12 MC)에서 12일 동안 배양한 심장 절편의 생존율 정량화를 보여줍니다(n = 18(D0), 15(D12 대조군)). 각 그룹은 서로 다른 돼지에서 얻은 12개(D12 MC)의 절편을 사용했으며, 일원 분산 분석(ANOVA)을 수행했습니다.####p < 0,0001 по сравненив с D0 и **p < 0,01 по сравненив с D12 Ctrl). (####p < 0.0001은 D0 대비, **p < 0.01은 D12 Ctrl 대비) a 형태의 사진은 静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切 Pictures(D0) 或心脏切 Pictures 培养12 천적 MTT活력량화), 来自不同猪 12 (D12 MC) 切pictures/组, 进行单向ANOVA 测试; 与D0 엇比, ####p < 0.0001, 与D12 Ctrl 比, **p < 0.01). a 형태의 사진은 静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切 Pictures(D0) , 来自不同猪的12 (D12 MC)切picture/组，进行单向ANOVA 测试;与D0 엇比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 엇比，**p。)신선한 심장 조직 절편(D0) 또는 정지 배양(D12 대조군) 또는 CTCM(D12 MC)에서 12일 동안 배양한 심장 조직 절편에서 MTT 생존율 정량화를 보여주는 히스토그램(n = 18(D0), 15(D12 대조군)), 각 그룹당 서로 다른 돼지에서 얻은 12개(D12 MC) 절편, 일원 분산 분석;####p < 0,0001 по сравненив с D0, **p < 0,01 по сравненив с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 (D0 대비), **p < 0.01 (D12 Ctrl 대비).b) 신선하게 분리한 심장 조직 절편(D0) 또는 정지 배양 조건(Ctrl)이나 CTCM 조건(MC)에서 12일 동안 배양한 심장 조직 절편의 트로포닌-T(녹색), 커넥신 43(빨간색) 및 DAPI(파란색)의 대표적인 면역형광 이미지(빈칸 크기 = 100 µm). 인공지능을 이용한 심장 조직 구조적 완전성 정량화 (각 그룹당 서로 다른 돼지에서 채취한 조직 조각 수 n = 7개(D0), 7개(D12 Ctrl), 5개(D12 MC), 일원 분산 분석 수행; ####p < 0.0001은 D0 대비, ****p < 0.0001은 D12 Ctrl 대비). 인공지능을 이용한 심장 조직 구조적 완전성 정량화 (각 그룹당 서로 다른 돼지에서 채취한 조직 조각 수 n = 7개(D0), 7개(D12 Ctrl), 5개(D12 MC), 일원 분산 분석 수행; ####p < 0.0001은 D0 대비, ****p < 0.0001은 D12 Ctrl 대비). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7(D0), 7(D12 Ctrl), 5(D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравненив с D0 и ****p < 0,0001 по сравненив с D12 Ctrl). 인공지능을 이용한 심장 조직의 구조적 완전성 정량화 (n = 7(D0), 7(D12 Ctrl), 5(D12 MC)개의 서로 다른 돼지에서 추출한 조직/그룹, 일원 분산 분석 수행; ####p < 0.0001 (D0 대비), ****p < 0.0001 (D12 Ctrl 대비)).人工智能weight化心脏组织结构完整性(n = 7(D0), 7(D12 Ctrl), 5(D12 MC) 각기 다른 돼지의 슬라이스/그룹, 일원 분산 분석 테스트;####p < 0.0001 与D0 相比，****p < 0.0001与D12 Ctrl 比).人工智能weight化心脏组织结构完整性(n = 7(D0), 7(D12 Ctrl), 5(D12 MC) 서로 다른 돼지 각각의 슬라이스/그룹화, 일원 분산 분석 테스트;####p < 0.0001 与D0상比，****p < 0.0001与D12 Ctrl 比). Iскуственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7(D0), 7(D12 Ctrl), 5(D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравненив с D12 Ctrl). 심장 조직의 구조적 완전성을 정량화하기 위한 인공지능 (각 그룹당 서로 다른 돼지에서 채취한 조직 절편 수 n = 7(D0), 7(D12 Ctrl), 5(D12 MC), 일원 분산 분석; ####p<0.0001 (D0 대비), ****p < 0.0001 (D12 Ctrl 대비)). c. Masson's trichrome 염색으로 염색한 심장 절편의 대표 이미지(왼쪽) 및 정량화 결과(오른쪽) (눈금 = 500 µm) (각 그룹당 서로 다른 돼지에서 채취한 절편 10개, 일원 분산 분석 수행; ####p < 0.0001은 D0 대비, ***p < 0.001은 D12 Ctrl 대비). c. 마손 삼색 염색으로 염색한 심장 조직 절편의 대표 이미지(왼쪽) 및 정량 분석 ​​결과(오른쪽) (눈금 = 500 µm) (각 그룹당 서로 다른 돼지에서 채취한 절편 10개, 일원 분산 분석 수행; #### p < 0.0001은 D0 대비, ***p < 0.001은 D12 대조군 대비). c Репрезентативные изображения (слева) 및 количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем masсона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравненив с D0 и ***p < 0,001 по сравненив с D12 Ctrl). c. Masson's trichrome 염색으로 염색한 심장 단면의 대표 이미지(왼쪽) 및 정량화 결과(오른쪽)(코팅되지 않은 단면의 스케일 = 500 µm)(각 그룹당 서로 다른 돼지에서 얻은 10개의 단면, 일원 분산 분석 수행; #### p < 0.0001은 D0 대비, ***p < 0.001은 D12 Ctrl 대비). c 는 Masson 3색깔의 染料染색상심장사진의 현대적인 이미지(左)와 질량화(右)(裸尺島= 500 µm)(n = 10 个切이미지/组, 每组来自不同的猪,进行单向ANOVA)를 사용했습니다.测试;#### p < 0.0001 与D0 比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 比)。 C 사용 Masson 3 color 染料 的 心脏 切 그 代表性 （左 左） 량화 （右） 裸尺degree 裸尺degree 裸尺degree = 500 µm） （n = 10 个 切分 组每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试; #### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 엇比). c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Mасона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помочьѕ однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравненив с D0, ***p < 0,001 по сравненив с D12 Ctrl). c. Masson's trichrome 염색으로 염색한 심장 단면의 대표 이미지(왼쪽) 및 정량 분석 ​​결과(오른쪽) (대조군 = 500 µm) (각 그룹당 10개의 단면, 각 단면은 서로 다른 돼지에서 채취, 일원 분산 분석으로 검정함; ### # p < 0.0001은 D0 대비, ***p < 0.001은 D12 Ctrl 대비).오차 막대는 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다.
우리는 배양 배지에 소분자를 첨가함으로써 심근세포의 구조적 완전성을 개선하고 CTCM 배양 중 섬유화 발생을 줄일 수 있을 것이라는 가설을 세웠습니다. 따라서 교란 요인의 수가 적은 정적 대조 배양20,21을 이용하여 소분자를 선별했습니다. 이 선별을 위해 덱사메타손(Dex), 트리요오드티로닌(T3), 그리고 SB431542(SB)를 선택했습니다. 이들 소분자는 이전에 hiPSC-CM 배양에서 근절 길이, T세관, 그리고 전도 속도를 증가시켜 심근세포의 성숙을 유도하는 데 사용된 바 있습니다. 또한, 글루코코르티코이드인 Dex와 SB는 모두 염증을 억제하는 것으로 알려져 있습니다29,30. 따라서 우리는 이들 소분자 중 하나 또는 여러 개를 조합하여 첨가했을 때 심장 조직의 구조적 완전성이 향상되는지 여부를 검증했습니다. 초기 스크리닝을 위해 각 화합물의 용량은 세포 배양 모델에서 일반적으로 사용되는 농도(1 μM Dex27, 100 nM T327, 2.5 μM SB31)를 기준으로 선택했습니다. 12일간의 배양 후, T3와 Dex의 병용 투여는 최적의 심근세포 구조적 완전성과 최소한의 섬유화 재형성을 유도했습니다(보충 그림 4 및 5). 또한, T3와 Dex의 농도를 정상 농도의 두 배 또는 그 이상으로 사용했을 때는 오히려 해로운 영향이 나타났습니다(보충 그림 6a,b).
초기 선별 후, 4가지 배양 조건(Ctrl: 최적화된 배지를 사용한 기존 정적 배양법으로 배양한 심장 조직; 20.21 TD: T3 및 Ctrl에 수요일에 덱사메타손을 첨가한 조건; MC: 최적화된 배지를 사용한 CTCM에서 배양한 심장 조직; MT: T3와 덱사메타손을 첨가한 CTCM)을 직접 비교했습니다. 12일간의 배양 후, MTT 분석으로 평가한 MS 및 MT 조직의 생존율은 신선한 조직과 동일한 수준을 유지했습니다(그림 4b). 흥미롭게도, 트랜스웰 배양(TD)에 T3와 덱사메타손을 첨가해도 Ctrl 조건에 비해 생존율이 크게 향상되지 않았는데, 이는 심장 조직의 생존율을 유지하는 데 기계적 자극이 중요한 역할을 한다는 것을 시사합니다.
기계적 자극과 T3/덱사메타손 보충이 12일 동안 배양액에 미치는 영향을 평가하기 위해 사용된 네 가지 배양 조건을 나타내는 실험 설계도. b 막대 그래프는 신선한 심장 절편(D0)과 비교하여 4가지 배양 조건(Ctrl, TD, MC 및 MT) 모두에서 배양 12일 후의 생존율을 정량화한 결과를 보여줍니다(각 그룹당 서로 다른 돼지에서 채취한 절편 수 n = 18(D0), 15(D12 Ctrl, D12 TD 및 D12 MT), 12(D12 MC)개, 일원 분산 분석 수행; ####p < 0.0001, ###p < 0.001은 D0 대비, **p < 0.01은 D12 Ctrl 대비). b 막대 그래프는 신선한 심장 절편(D0)과 비교하여 4가지 배양 조건(Ctrl, TD, MC 및 MT) 모두에서 배양 12일 후 생존율을 정량화한 결과를 보여줍니다(각 그룹당 서로 다른 돼지에서 채취한 절편 수 n = 18(D0), 15(D12 Ctrl, D12 TD 및 D12 MT), 12(D12 MC)개, 일원 분산 분석 수행; ####p < 0.0001, ###p < 0.001은 D0 대비, **p < 0.01은 D12 ctrl 대비). b Gистограма показывает количественнуу оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнениу со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12) MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний 테스트 ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнениу с D0 и **p < 0,01 по сравненив с D12 Ctrl). b 막대 그래프는 신선한 심장 조직 절편(D0)과 비교하여 4가지 배양 조건(대조군, TD, MC 및 MT) 모두에서 배양 후 12일째 생존율을 정량화한 결과를 보여줍니다(각 그룹당 서로 다른 돼지에서 채취한 조직 절편 수 n = 18(D0), 15(D12 Ctrl, D12 TD 및 D12 MT), 12(D12 MC), 일원 분산 분석; ####p < 0.0001, ###p < 0.001(D0 대비) 및 **p < 0.01(D12 Ctrl 대비)). b 형태의 형상에는 4개의 种培养条件（Ctrl、TD、MC 와MT)与new鲜心脏切 Pictures(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD 와 D12 MT)、来自不同猪的12 (D12 MC)切picture/组，进行单向ANOVA 测试; ####p < 0.0001，###p < 0.001 与D0 엇比，**p < 0.01 与D12控조제).b 4 12 (D12 MC) b Gистограма, показывававая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнениу со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравненив с D0, **p <0,01 по сравненив с контролем D12). b. 신선한 심장 조직 절편(D0)과 비교하여 4가지 배양 조건(대조군, TD, MC 및 MT) 모두를 보여주는 히스토그램(n = 18(D0), 15(D12 Ctrl, D12 TD 및 D12 MT), 각 그룹당 서로 다른 돼지에서 채취한 12(D12 MC)개의 절편, 일원 분산 분석; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. 대조군 D12). c 막대 그래프는 배양 12일 후의 포도당 플럭스 정량화를 4가지 배양 조건(Ctrl, TD, MC 및 MT) 모두에서 신선한 심장 절편(D0)과 비교하여 보여줍니다(각 그룹당 서로 다른 돼지에서 얻은 절편 6개, 일원 분산 분석 수행; ###p < 0.001, D0 대비, ***p < 0.001, D12 Ctrl 대비). c 막대 그래프는 배양 12일 후의 포도당 플럭스 정량화를 4가지 배양 조건(Ctrl, TD, MC 및 MT) 모두에서 신선한 심장 절편(D0)과 비교하여 보여줍니다(각 그룹당 서로 다른 돼지에서 얻은 절편 6개, 일원 분산 분석 수행; ###p < 0.001, D0 대비, ***p < 0.001, D12 Ctrl 대비). c Gистограма показывает количественнуу оценку потока глукозы через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнениу со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, односtorонний Выполняется 테스트 ANOVA; ###p < 0,001 по сравненив с D0 и ***p < 0,001 по сравненив с D12 Ctrl). c 히스토그램은 신선한 심장 조직 절편(D0)과 비교하여 4가지 배양 조건(대조군, TD, MC 및 MT) 모두에서 배양 후 12일째의 포도당 플럭스 정량화를 보여줍니다(각 그룹당 서로 다른 돼지에서 얻은 6개의 절편, 일원 분산 분석 수행; ###p < 0.001은 D0 대비, ***p < 0.001은 D12 Ctrl 대비). c 모양의 템플릿에는 4개의 种培养条件（Ctrl、TD、MC 와MT)与new鲜心脏切picture(D0) 培养后12 天的葡萄糖의 량량은 6입니다. 그림/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试;###p < 0.001，与D0 엇比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 엇比). C 형태의 유형은 4개입니다. 条件 （(ctrl , td , mc 및 mt) 新鲜 心脏 切 Pictures 切 Pictures 切 Pictures 比 , 培养 后 后 12 천 량 의 통 량 량 （n = 6개 조각/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单向执行ANOVA 测试;###p < 0.001 ，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 엇比）。 c Гистограма, показывававания количественнуу оценку потока глукозы через 12 дней после культивирования для всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнениу со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены ANOVA; ###p < 0,001 по сравненив с D0, ***p < 0,001 по сравненив с D12(контроль). c. 배양 후 12일째에 4가지 배양 조건(대조군, TD, MC, MT) 모두에서 포도당 플럭스를 정량화한 히스토그램을 신선한 심장 조직 절편(D0)과 비교한 결과 (n = 그룹당 6개 절편, 서로 다른 돼지에서 채취, 단측). ANOVA 검정을 수행하였으며, ###p < 0.001은 D0 대비, ***p < 0.001은 D12(대조군) 대비이다.d. 신선한 조직(파란색), 12일째 MC(녹색), 12일째 MT(빨간색) 조직의 10개 부위 조직 단면에서 얻은 변형률 분석 그래프(그룹당 4개 단면, 일원 분산 분석; 그룹 간 유의미한 차이 없음). e. 신선한 심장 단면(D0)과 정지 조건(Ctrl) 또는 MT 조건(MT)에서 10~12일 동안 배양한 심장 단면에서 차등 발현되는 유전자를 보여주는 화산 그래프. f. 각 배양 조건에서 배양한 심장 단면의 근절 유전자 발현 히트맵. 오차 막대는 평균 ± 표준 편차를 나타낸다.
지방산 산화에서 해당 과정으로의 전환에 대한 대사 의존성은 심근세포 탈분화의 특징입니다. 미성숙 심근세포는 주로 포도당을 ATP 생산에 사용하며, 미토콘드리아는 저형성되어 있고 미토콘드리아 내막 능선(cristae)이 거의 없습니다.5,32 포도당 이용 분석 결과, MC 및 MT 조건에서 포도당 이용률은 0일차 조직과 유사한 것으로 나타났습니다(그림 4c). 그러나 대조군 샘플은 신선한 조직에 비해 포도당 이용률이 유의하게 증가했습니다. 이는 CTCM과 T3/Dex의 조합이 조직 생존력을 향상시키고 12일 동안 배양한 심장 조직의 대사 표현형을 유지함을 시사합니다. 또한, 균주 분석 결과, MT 및 MS 조건에서 12일 동안 균주 수준이 신선한 심장 조직과 동일하게 유지되었습니다(그림 4d).
CTCM과 T3/Dex가 심장 조직 절편의 전반적인 전사 환경에 미치는 영향을 분석하기 위해, 네 가지 배양 조건 모두에서 얻은 심장 절편에 대해 RNAseq 분석을 수행했습니다(보충 자료 1). 흥미롭게도, MT 조건의 절편은 신선한 심장 조직과 높은 전사 유사성을 보였으며, 13,642개의 유전자 중 단 16개만 차등 발현되었습니다. 그러나 앞서 언급했듯이, 대조군(Ctrl) 절편은 배양 10~12일 후 1,229개의 차등 발현 유전자를 나타냈습니다(그림 4e). 이러한 데이터는 심장 및 섬유아세포 유전자에 대한 qRT-PCR 분석을 통해 확인되었습니다(보충 그림 7a-c). 특히, 대조군 절편에서는 심장 및 세포 주기 관련 유전자의 발현이 감소하고 염증 관련 유전자 프로그램이 활성화되었습니다. 이러한 결과는 장기간 배양 후 일반적으로 발생하는 탈분화 현상이 MT 조건에서는 완전히 억제됨을 시사합니다(보충 그림 8a,b). 근절 유전자에 대한 면밀한 연구 결과, MT 조건에서만 근절(그림 4f) 및 이온 채널(보충 그림 9)을 코딩하는 유전자가 보존되어 Ctrl, TD 및 MC 조건에서의 억제로부터 보호되는 것으로 나타났습니다. 이러한 데이터는 기계적 자극과 체액성 자극(T3/Dex)을 병용하면 심장 절편의 전사체가 배양 12일 후에도 신선한 심장 절편과 유사하게 유지될 수 있음을 보여줍니다.
이러한 전사체 분석 결과는 심장 조직 절편에서 심근세포의 구조적 완전성이 MT 조건 하에서 12일 동안 가장 잘 보존된다는 사실(그림 5a에서 볼 수 있듯이, 손상되지 않고 국소화된 커넥신 43)에 의해 뒷받침됩니다. 또한, MT 조건 하에서 심장 조직 절편의 섬유화는 대조군에 비해 현저히 감소했으며, 신선한 심장 조직 절편과 유사한 수준이었습니다(그림 5b). 이러한 데이터는 기계적 자극과 T3/덱사메타손 처리의 병용이 배양된 심장 조직 절편에서 심장 구조를 효과적으로 보존한다는 것을 보여줍니다.
a. 신선하게 분리한 심장 조직 절편(D0) 또는 네 가지 심장 조직 절편 배양 조건 모두에서 12일 동안 배양한 조직 절편에서 트로포닌-T(녹색), 커넥신 43(빨간색) 및 DAPI(파란색)의 대표적인 면역형광 이미지(척도 막대 = 100 µm). 인공지능을 이용한 심장 조직 구조적 완전성 정량화 (n = 7 (D0 및 D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC 및 D12 MT)개의 조직 절편/그룹, 서로 다른 돼지에서 채취, 일원 분산 분석 수행; ####p < 0.0001은 D0 대비, *p < 0.05는 D12 Ctrl 대비, ****p < 0.0001은 D12 Ctrl 대비). 인공지능을 이용한 심장 조직 구조적 완전성 정량화 (n = 7 (D0 및 D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC 및 D12 MT)개의 조직 절편/그룹, 서로 다른 돼지에서 채취, 일원 분산 분석 수행; #### p < 0.0001은 D0 대비, *p < 0.05는 D12 Ctrl 대비, ****p < 0.0001은 D12 Ctrl 대비). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помочьу искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12) TD, D12 MC 및 D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравнения с D0 и *p < 0,05 또는 ****p < 0,0001 по сравненив с D12 Ctrl). 인공지능을 이용한 심장 조직의 구조적 완전성 정량화 (각 그룹당 서로 다른 돼지에서 채취한 조직 절편 7개(D0 및 D12 Ctrl), 5개(D12 TD, D12 MC 및 D12 MT), 일원 분산 분석 수행; #### p < 0.0001은 D0 대비, *p < 0.05 또는 ****p < 0.0001은 D12 Ctrl 대비).서로 다른 心脏组织结构完整性(n = 7(D0 과 D12 Ctrl), 5(D12 TD, D12 MC 와 D12 MT) 사진/组)进行人工智能weightization,进行单向ANOVA测试;#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 엇比，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 比)。对 不同 猪 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 과 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc and d12 mt） 组） 人工 智能 량 化 进行 单向 单向单向 测试 ; ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 엇比，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 엇比)。인공지능을 이용하여 다양한 돼지의 심장 조직 구조적 완전성을 정량화함(그룹당 n = 7개(D0 및 D12 Ctrl), 5개(D12 TD, D12 MC 및 D12 MT) 단면) 및 일원 분산 분석;#### p < 0,0001 по сравненив с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравненив с D12 Ctrl). #### p < 0.0001은 D0 대비, *p < 0.05 또는 ****p < 0.0001은 D12 Ctrl 대비 유의미한 차이를 나타냅니다. b. Masson's trichrome 염색으로 염색한 심장 조직 절편의 대표 이미지 및 정량 분석 ​​결과 (척도 막대 = 500 µm) (각 그룹당 서로 다른 돼지에서 채취한 조직 절편 10개(D0, D12 Ctrl, D12 TD 및 D12 MC), 9개(D12 MT), 일원 분산 분석(ANOVA) 수행; ####p < 0.0001은 D0 대비, ***p < 0.001은 D12 Ctrl 대비 유의미한 차이, ****p < 0.0001은 D12 Ctrl 대비 유의미한 차이). b. Masson's trichrome 염색으로 염색한 심장 조직 절편의 대표 이미지 및 정량 분석 ​​결과 (척도 막대 = 500 µm) (각 그룹당 서로 다른 돼지에서 채취한 조직 절편 10개(D0, D12 Ctrl, D12 TD 및 D12 MC), 9개(D12 MT), 일원 분산 분석(ANOVA) 수행; ####p < 0.0001은 D0 대비, ***p < 0.001은 D12 Ctrl 대비 유의미한 차이, ****p < 0.0001은 D12 Ctrl 대비 유의미한 차이). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001 по сравненив с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравненив с D12 Ctrl). b. Masson's trichrome 염색으로 염색한 심장 단면의 대표 이미지 및 정량화(척도 막대 = 500 µm) (각 그룹당 서로 다른 돼지에서 얻은 단면 10개(D0, D12 Ctrl, D12 TD 및 D12 MC), 9개(D12 MT), 일원 분산 분석 수행; ####p < 0.0001(D0 대비) 및 ***p < 0.001 또는 ****p < 0.0001(D12 Ctrl 대비)). b 용 Masson 3color染料染color 心脏切文 代表性图image andweightization (比例尺= 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD 와 D12 MC), 来自不同猪的9 个 (D12) MT) 사진/组，进行单因素方差分析; ####p < 0.0001 与D0 比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 比). b 사용 Masson 3 color 染料 的 心脏 切 Pictures 적 代表性 과 량화 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 , d12 ctrl , d12 td 및 d12 mc） 来自 同 的 9个 d12 mt 切조각 切조각 切조각 切조각 切조각 切조각 切조각 切조각 切조각 切조각 切조각 切조각 切조각 切조각 切picture/组，进行单因素方差分析; ####p < 0.0001 与D0 比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 比). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравненив с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравненив с D12 Ctrl). b. 마손 삼색 염색으로 염색한 심장 단면의 대표 이미지 및 정량화(척도 막대 = 500 µm) (n = 10(D0, D12 Ctrl, D12 TD 및 D12 MC), 9(D12 MT), 각 그룹당 서로 다른 돼지에서 얻은 단면, 단일 ANOVA 방법; ####p < 0.0001은 D0과 비교, ***p < 0.001 또는 ****p < 0.0001은 D12 Ctrl과 비교).오차 막대는 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다.
마지막으로, 심장 조직의 신장률을 증가시켜 CTCM이 심장 비대를 모방하는 능력을 평가했습니다. CTCM에서 최대 공기실 압력은 80 mmHg에서 80 mmHg Art.(정상 신장)에서 140 mmHg Art.까지 증가했습니다(그림 6a). 이는 신장률이 32% 증가한 것에 해당하며(그림 6b), 이는 이전에 심장 조직 절편이 비대에서 관찰되는 것과 유사한 근절 길이를 달성하는 데 필요한 신장률과 동일한 것으로 나타났습니다. 수축 및 이완 동안 심장 조직의 신장률과 속도는 6일간의 배양 기간 동안 일정하게 유지되었습니다(그림 6c). MT 조건의 심장 조직을 6일 동안 정상 신장(MT(Normal)) 또는 과신장 조건(MT(OS))에 노출시켰습니다. 배양 4일 후, 비대 바이오마커인 NT-ProBNP는 MT(normal) 조건에 비해 MT(OS) 조건의 배지에서 유의하게 증가했습니다(그림 7a). 또한, 6일간 배양 후 MT(OS)의 세포 크기(그림 7b)는 MT 심장(정상) 단면과 비교하여 유의하게 증가했습니다. 더불어, 과도하게 늘어난 조직에서 NFATC4의 핵 전이가 유의하게 증가했습니다(그림 7c). 이러한 결과는 과도한 신장 후 병리학적 리모델링이 점진적으로 진행됨을 보여주며, CTCM 장치가 신장 유발 심장 비대 신호 전달을 연구하는 플랫폼으로 사용될 수 있다는 개념을 뒷받침합니다.
공기실 압력, 유체실 압력 및 조직 움직임 측정의 대표적인 그래프는 공기실 압력이 유체실 압력을 변화시켜 조직 절편의 움직임을 유발함을 확인시켜 줍니다. b 정상적으로 늘어난(주황색) 조직 절편과 과도하게 늘어난(파란색) 조직 절편의 대표적인 신장률 및 신장률 곡선입니다. c 주기 시간(그룹당 19개 절편, 서로 다른 돼지에서 채취), 수축 시간(그룹당 18-19개 절편, 서로 다른 돼지에서 채취), 이완 시간(그룹당 19개 절편, 서로 다른 돼지에서 채취), 조직 움직임 진폭(그룹당 14개 절편, 서로 다른 돼지에서 채취), 최대 수축기 속도(그룹당 14개 절편, 서로 다른 돼지에서 채취) 및 최대 이완률(그룹당 14개(D0), 15개(D6) 절편, 서로 다른 돼지에서 채취)을 나타내는 막대 그래프입니다. 양측 스튜던트 t-검정 결과 모든 매개변수에서 유의미한 차이가 없었으며, 이는 이러한 매개변수들이 과전압 배양 6일 동안 일정하게 유지되었음을 나타냅니다. 오차 막대는 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다.
a. 정상 신장(Norm) 또는 과신장(OS) 조건에서 배양한 심장 절편의 배양액 내 NT-ProBNP 농도를 정량화한 막대 그래프(각 그룹당 서로 다른 돼지에서 얻은 절편 수 n = 4(D2 MTNorm), 3(D2 MTOS, D4 MTNorm 및 D4 MTOS), 이원 분산 분석 수행; **p < 0.01 정상 신장과 비교). a. 정상 신장(Norm) 또는 과신장(OS) 조건에서 배양한 심장 절편의 배양액 내 NT-ProBNP 농도를 정량화한 막대 그래프(각 그룹당 서로 다른 돼지에서 얻은 절편 수 n = 4(D2 MTNorm), 3(D2 MTOS, D4 MTNorm 및 D4 MTOS), 이원 분산 분석 수행; **p < 0.01 정상 신장과 비교).정상 MT 신장(norm) 또는 과신장(OS) 조건에서 배양한 심장 절편의 배양액 내 NT-ProBNP 농도의 정량적 히스토그램(n = 4(D2 MTNorm), 3(D2 MTOS, D4 MTNorm 및 D4).MTOS) 각 그룹당 서로 다른 돼지에서 얻은 절편, 이원 분산 분석 수행;**p < 0,01의 경우 снормальным растяжением). (p < 0.01, 정상적인 스트레칭과 비교). a 에서 MT 正常拉伸(Norm) 或过島拉伸(OS) 条件下培养 的心脏切 Pictures 培养基中NT-ProBNP 浓tivity적 형태의 크기 (n = 4 (D2 MTNorm)、3 (D2 MTOS、D4 MTNorm) 와 D4 MTOS)는 서로 다른 사진/사진, 이동 방법을 사용하는 방법입니다.**与정常拉伸상호,p < 0.01). a MT 정상 신장(Norm) 또는 과다 신장(OS) 조건(n = 4(D2 MTNorm), 3(D2 MTOS, D4 MTNorm 및 D4 MTOS)) 하에서 배양된 심장 절편의 NT-ProBNP 농도 정량화, 다른 猪의 조각/组, 可以双向方方发发动; **정상 신장과 비교, p < 0.01).정상 MT 신장(norm) 또는 과신장(OS) 조건에서 배양된 심장 절편의 NT-ProBNP 농도 정량화 히스토그램(n = 4(D2 MTNorm), 3(D2 MTOS, D4 MTNorm) 및 D4 MTOS) 각 그룹, 서로 다른 돼지에서 얻은 절편, 이원 분산 분석;**p < 0,01의 경우 снормальным растяжением). (p < 0.01, 정상적인 스트레칭과 비교). b 트로포닌-T 및 WGA로 염색한 심장 조직 절편의 대표 이미지(왼쪽) 및 세포 크기 정량화(오른쪽) (각 그룹당 330개(D6 MTOS), 369개(D6 MTNorm) 세포, 서로 다른 돼지에서 얻은 10개의 절편에서 추출, 양측 스튜던트 t-검정 수행; ****p < 0.0001, 정상 신장과 비교). b 트로포닌-T 및 WGA로 염색한 심장 조직 절편의 대표 이미지(왼쪽) 및 세포 크기 정량화(오른쪽) (각 그룹당 330개(D6 MTOS), 369개(D6 MTNorm) 세포, 서로 다른 돼지에서 얻은 10개의 절편에서 추출, 양측 스튜던트 t-검정 수행; ****p < 0.0001, 정상 신장과 비교). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т 및 АЗП (слева) и количественного определения размера клеток(справа) (n = 330(D6 MTOS), 369(D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьудента; ****p < 0,0001의 경우 с нормальным растяжением). b 트로포닌-T 및 AZP로 염색한 심장 단면의 대표 이미지(왼쪽) 및 세포 크기 정량화(오른쪽) (각 그룹당 330개(D6 MTOS), 369개(D6 MTNorm) 세포, 서로 다른 돼지의 10개 단면에서 추출, 양측 스튜던트 t-검정 수행; ****p < 0.0001 정상 계통과 비교). b 用肌钙蛋白-T 와 WGA(左) 및 细胞大切分化(右) 染color的心脏切 Images 代表性图image (n = 330 (D6 MTOS), 来自不同猪 10 个不同切材表 369 (D6) MTNorm)细胞/组，两进行有尾school生t 检验;与正常拉伸比，****p < 0.0001). b 칼카레인-T 및 WGA로 염색한 심장 절편의 대표 이미지(왼쪽) 및 세포 크기(오른쪽) (n = 330(D6 MTOS), 10개의 다른 절편에서 추출한 369개(D6 MTNorm)) 세포/조직, 두 가지 방법 모두 세포 크기 t 검정; 정상적인 스트레칭과 비교, ****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т 및 АЗП(слева) 및 количественная оценка размера клеток(справа) (n = 330(D6 MTOS), 369(D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий ****p < 0,0001 сравненив с нормальным растяжением). b 트로포닌-T 및 AZP로 염색한 심장 단면의 대표 이미지(왼쪽)와 세포 크기 정량화(오른쪽) (n = 330(D6 MTOS), 369(D6 MTNorm), 서로 다른 돼지에서 채취한 10개의 단면) 세포 수/그룹, 양측 검정 Student's t 검정; ****p < 0.0001 (정상 계통 대비). c. 0일차와 6일차 MTOS 심장 절편에 대한 대표 이미지로, 트로포닌-T와 NFATC4에 대한 면역표지법을 사용하여 NFATC4가 심근세포 핵으로 이동하는 정도를 정량화했습니다(각 그룹당 서로 다른 돼지에서 얻은 절편 4개(D0), 3개(D6 MTOS) 사용, 양측 스튜던트 t-검정 수행; *p < 0.05). c. 0일차와 6일차 MTOS 심장 절편에 대한 대표 이미지로, 트로포닌-T와 NFATC4에 대한 면역표지법을 사용하여 NFATC4가 심근세포 핵으로 이동하는 정도를 정량화했습니다(각 그룹당 서로 다른 돼지에서 얻은 절편 4개(D0), 3개(D6 MTOS) 사용, 양측 스튜던트 t-검정 수행; *p < 0.05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 및 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т 및 NFATC4, и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток(n = 4(D0), 3(D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней, выполняется двусtorонний t-critерий Стьудента; *p < 0.05). c. 0일 및 6일 MTOS 시점의 심장 단면 대표 이미지. 트로포닌-T 및 NFATC4에 대한 면역염색을 실시하고, 해면체 세포 핵 내 NFATC4 전위량을 정량화하였다(각 그룹당 서로 다른 돼지에서 얻은 4개(D0), 3개(D6 MTOS)의 절편을 사용하여 양측 스튜던트 t-검정을 수행함; *p < 0.05). c 사용于肌钙蛋白-T 와NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切文 代表性图image,以及来自猪的NFATC4 易位至CM细胞核의 양화(n = 4(D0), 3(D6 MTOS) 切分/组, 进行双尾school生t 检验; *p < 0.05). c 칼카닌-T 및 NFATC4 면역표지의 대표 이미지 第0天와 第6天MTOS 심장 조각, 그리고 다른 NFATC4 易位至CM 세포 핵의 양화(n = 4(D0), 3(D6 MTOS))의 NFATC4 切礼/组, 时间双尾학电影; *p < 0.05). c Репрезентативные izображения срезов сердца MTOS на 0 및 6 день для IMмуномаркировки тропонином-Т 및 NFATC4 и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней(n = 4(D0), 3(D6 MTOS) срез/групpa, два- хвостатый t-критерий Стьудента; *p < 0,05). c. 트로포닌-T 및 NFATC4 면역표지 및 서로 다른 돼지의 심근세포 핵에서 NFATC4 전위 정량화를 위한 MTOS 심장 절편의 대표 이미지(그룹당 절편 수 n = 4(D0), 3(D6 MTOS)개, 양측 t 검정 기준 스튜던트 검정; *p < 0.05).오차 막대는 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다.
심혈관 질환 연구에는 심장 환경을 정확하게 재현하는 세포 모델이 필수적입니다. 본 연구에서는 심장의 초박형 절편을 자극할 수 있는 CTCM(세포 배양 시스템)을 개발하고 특성을 분석했습니다. CTCM 시스템은 생리적으로 동기화된 전기기계적 자극과 T3 및 덱사메타손(Dex)이 풍부한 배양액을 포함합니다. 돼지 심장 절편을 이러한 조건에 노출시킨 후 12일 동안 배양했을 때, 세포 생존력, 구조적 완전성, 대사 활동 및 유전자 발현은 신선한 심장 조직과 동일한 수준을 유지했습니다. 또한, 심장 조직을 과도하게 늘리면 과신전으로 인한 심장 비대가 발생할 수 있습니다. 이러한 결과는 정상적인 심장 표현형을 유지하는 데 생리적 배양 조건이 중요하다는 것을 뒷받침하며, 약물 스크리닝을 위한 플랫폼을 제공합니다.
심근세포의 기능과 생존에 최적의 환경을 조성하는 데에는 여러 요인이 작용합니다. 이러한 요인 중 가장 명확한 것은 (1) 세포 간 상호작용, (2) 전기기계적 자극, (3) 체액 인자, (4) 대사 기질과 관련이 있습니다. 생리적인 세포 간 상호작용은 세포외 기질에 의해 지지되는 다양한 세포 유형으로 이루어진 복잡한 3차원 네트워크를 필요로 합니다. 이러한 복잡한 세포 상호작용은 개별 세포 유형을 공동 배양하는 방식으로는 시험관 내에서 재현하기 어렵지만, 심장 조직 절편의 기관 유사성을 이용하면 쉽게 재현할 수 있습니다.
심근세포의 기계적 신장과 전기적 자극은 심장 표현형 유지에 매우 중요합니다.33,34,35 기계적 자극은 hiPSC-CM의 배양 및 성숙에 널리 사용되어 왔지만, 최근 몇몇 연구에서는 단축 하중을 이용하여 배양된 심장 조직 절편에 기계적 자극을 가하는 방법을 시도했습니다. 이러한 연구들은 2차원 단축 기계적 하중이 배양 중 심장 표현형에 긍정적인 영향을 미친다는 것을 보여줍니다. 이 연구들에서 심장 조직 절편은 등척성 인장력17, 선형 등척성 하중18으로 하중을 받거나, 힘 변환기 피드백과 장력 구동을 이용하여 심장 주기를 재현했습니다. 그러나 이러한 방법들은 환경 최적화 없이 단축 조직 신장을 사용하기 때문에 많은 심장 관련 유전자의 발현이 억제되거나 비정상적인 신장 반응과 관련된 유전자가 과발현되는 결과를 초래합니다. 본 논문에서 설명하는 CTCM은 주기 시간 및 생리적 신장률(25% 신장, 40% 수축기, 60% 이완기, 분당 72회 박동) 측면에서 자연적인 심장 주기를 모방하는 3차원 전기기계적 자극을 제공합니다. 이러한 3차원 기계적 자극만으로는 조직의 완전성을 유지하기에 충분하지 않으며, 조직의 생존력, 기능 및 완전성을 적절히 유지하기 위해서는 T3/Dex를 이용한 체액성 자극과 기계적 자극의 병용이 필요합니다.
체액 인자는 성인 심장 표현형을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다. 이는 T3와 덱사메타손(Dex)을 배양 배지에 첨가하여 세포 성숙을 촉진한 HiPS-CM 연구에서 강조되었습니다. T3는 세포막을 통한 아미노산, 당, 칼슘의 수송에 영향을 미칠 수 있습니다.36 또한, T3는 MHC-α 발현을 촉진하고 MHC-β 발현을 억제하여 태아 심근세포의 지근섬유에 비해 성숙한 심근세포에서 속근섬유 형성을 촉진합니다. 갑상선 기능 저하증 환자의 T3 결핍은 근섬유 띠의 소실과 근긴장도 발달 속도 감소를 초래합니다.37 덱사메타손은 글루코코르티코이드 수용체에 작용하며 분리 관류 심장에서 심근 수축력을 증가시키는 것으로 나타났습니다.38 이러한 개선은 칼슘 침착 유도 세포외 수송(SOCE)에 대한 효과와 관련이 있는 것으로 생각됩니다.39,40 또한, 덱사메타손은 수용체에 결합하여 면역 기능과 염증을 억제하는 광범위한 세포 내 반응을 유발합니다.30
본 연구 결과는 물리적 기계적 자극(MS)이 대조군(Ctrl)에 비해 전반적인 배양 성능을 향상시켰지만, 12일 배양 동안 세포 생존력, 구조적 완전성 및 심장 발현을 유지하는 데는 실패했음을 보여줍니다. 대조군과 비교했을 때, CTCM(MT) 배양에 T3와 Dex를 첨가하면 세포 생존력이 향상되고 12일 동안 신선한 심장 조직과 유사한 전사 프로파일, 구조적 완전성 및 대사 활성을 유지했습니다. 또한, 조직 신장 정도를 조절함으로써 STCM을 이용하여 과신전 유도 심장 비대 모델을 구축하여 STCM 시스템의 다용성을 입증했습니다. 심장 리모델링 및 섬유화는 일반적으로 순환 세포가 적절한 사이토카인, 식세포 작용 및 기타 리모델링 인자를 제공할 수 있는 온전한 장기에서 발생하지만, 심장 절편 또한 스트레스와 외상에 대한 반응으로 섬유화 과정을 모방할 수 있다는 점에 주목해야 합니다. 이는 이전에 본 심장 절편 모델에서 평가된 바 있습니다. CTCM 매개변수는 압력/전기 진폭 및 주파수 변경을 통해 조절하여 빈맥, 서맥, 기계적 순환 보조(기계적 무부하 심장)와 같은 다양한 조건을 모사할 수 있다는 점에 주목해야 합니다. 이러한 특성 덕분에 이 시스템은 약물 테스트에 있어 중간 처리량을 제공합니다. 과도한 운동으로 인한 심장 비대를 모델링할 수 있는 CTCM의 능력은 개인 맞춤형 치료를 위한 시스템 테스트의 가능성을 열어줍니다. 결론적으로, 본 연구는 기계적 신장과 체액 자극이 심장 조직 절편 배양을 유지하는 데 매우 중요하다는 것을 보여줍니다.
본 연구에서 제시된 데이터는 CTCM이 손상되지 않은 심근을 모델링하는 데 매우 유망한 플랫폼임을 시사하지만, 이 배양 방법에는 몇 가지 한계가 있습니다. CTCM 배양의 가장 큰 한계는 조직 절편에 지속적인 동적 기계적 스트레스를 가한다는 점이며, 이로 인해 각 주기 동안 심장 절편의 수축을 능동적으로 모니터링할 수 없습니다. 또한, 심장 절편의 크기가 작기 때문에(7mm) 기존의 힘 센서를 사용하여 배양 시스템 외부에서 수축 기능을 평가하는 데에도 한계가 있습니다. 본 논문에서는 수축 기능의 지표로 광학 전압을 평가함으로써 이러한 한계를 부분적으로 극복했습니다. 그러나 이 한계는 추가적인 연구가 필요하며, 칼슘 및 전압 감응 염료를 이용한 광학 매핑과 같은 배양된 심장 절편 기능의 광학적 모니터링 방법을 도입함으로써 향후 해결될 수 있을 것입니다. CTCM의 또 다른 한계는 생리적 스트레스(전부하 및 후부하)를 조작할 수 없다는 점입니다. CTCM에서는 매우 큰 조직에서 이완기(최대 신장)와 수축기(전기 자극 중 수축 길이)에 25%의 생리적 신장을 재현하기 위해 반대 방향으로 압력을 가했습니다. 향후 CTCM 설계에서는 심장 조직에 양쪽에서 적절한 압력을 가하고 심장 내강에서 발생하는 정확한 압력-부피 관계를 적용함으로써 이러한 한계를 제거해야 합니다.
본 논문에서 보고된 과도한 신장으로 인한 재형성은 비대성 과신장 신호를 모방하는 데에만 국한됩니다. 따라서 이 모델은 체액성 또는 신경성 인자(본 시스템에는 존재하지 않음) 없이 신장으로 인한 비대 신호 전달 연구에 도움이 될 수 있습니다. CTCM의 활용도를 높이기 위해서는 추가 연구가 필요합니다. 예를 들어, 면역 세포와의 공동 배양, 순환 혈장 체액성 인자 도입, 신경 세포와의 공동 배양 시 신경 분포 유도 등을 통해 CTCM을 이용한 질병 모델링 가능성을 향상시킬 수 있을 것입니다.
본 연구에는 돼지 13마리가 사용되었습니다. 모든 동물 실험 절차는 기관 지침에 따라 수행되었으며 루이빌 대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받았습니다. 대동맥궁을 클램핑하고 심장에 멸균 심정지액(110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL 헤파린, pH 7.4까지) 1 L를 주입했습니다. 심장은 얼음처럼 차가운 심정지 용액에 보관한 후 얼음 위에 올려 실험실로 운반했는데, 이 과정은 보통 10분 미만이 소요됩니다. 심장은 얼음처럼 차가운 심정지 용액에 보관한 후 얼음 위에 올려 실험실로 운반했는데, 이 과정은 보통 10분 미만이 소요됩니다. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторик на льду, что обычно занимает <10 분. 심장은 얼음처럼 차가운 심정지 용액에 보관한 후 얼음 위에 올려 실험실로 운반했는데, 이 과정은 보통 10분 미만이 소요됩니다.将心脏保存은 冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，常<10分钟。将心脏保存은 冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораториу на льду, обычно 10분 미만. 심장은 실험실로 운반할 때까지 (일반적으로 10분 이내) 얼음 위에 놓고 심정지 상태로 유지하십시오.
CTCM 장치는 SolidWorks 컴퓨터 지원 설계(CAD) 소프트웨어로 개발되었습니다. 배양 챔버, 칸막이 및 공기 챔버는 CNC 가공된 투명 아크릴 플라스틱으로 제작되었습니다. 직경 7mm의 백업 링 중앙부는 고밀도 폴리에틸렌(HDPE)으로 만들어졌으며, 아래쪽 배지 밀봉에 사용되는 실리콘 O링을 수용할 수 있는 O링 홈이 있습니다. 얇은 실리카 멤브레인이 배양 챔버와 분리판을 분리합니다. 실리콘 멤브레인은 두께 0.02인치의 실리콘 시트를 레이저로 절단하여 제작되었으며 경도는 35A입니다. 하단 및 상단 실리콘 개스킷은 두께 1/16인치의 실리콘 시트를 레이저로 절단하여 제작되었으며 경도는 50A입니다. 316L 스테인리스강 나사와 나비 너트를 사용하여 블록을 고정하고 기밀 밀봉을 구현합니다.
C-PACE-EM 시스템과 통합되도록 설계된 전용 인쇄 회로 기판(PCB)이 있습니다. PCB의 스위스 머신 커넥터 소켓은 은도금 구리선과 전극에 조여진 청동 0-60 나사를 통해 흑연 전극에 연결됩니다. 이 인쇄 회로 기판은 3D 프린터의 덮개 내부에 장착됩니다.
CTCM 장치는 심장 박동 주기와 유사한 제어된 순환 압력을 생성하는 프로그래밍 가능한 공압 액추에이터(PPD)에 의해 제어됩니다. 공기 챔버 내부 압력이 증가함에 따라 유연한 실리콘 막이 위쪽으로 팽창하여 조직 부위 아래의 매질을 밀어냅니다. 그러면 이 유체 배출로 인해 조직 부위가 늘어나 심장 이완기 동안의 생리적 팽창을 모방합니다. 이완이 최고조에 달했을 때 흑연 전극을 통해 전기 자극이 가해져 공기 챔버 내부 압력이 감소하고 조직 부위가 수축됩니다. 파이프 내부에는 공기 시스템 내 압력을 감지하는 압력 센서가 있는 지혈 밸브가 있습니다. 압력 센서가 감지한 압력은 노트북에 연결된 데이터 수집기로 전달됩니다. 이를 통해 가스 챔버 내부 압력을 지속적으로 모니터링할 수 있습니다. 챔버 압력이 최대치(표준 80mmHg, OS 140mmHg)에 도달하면 데이터 수집 장치는 C-PACE-EM 시스템으로 신호를 보내 2ms 동안 4V의 위상 전압 신호를 생성하도록 합니다.
심장 조직 절편을 채취하여 6웰 플레이트에서 다음과 같은 배양 조건을 수행하였다. 채취한 심장을 이송 용기에서 차가운(4°C) 심정지액이 담긴 트레이로 옮겼다. 멸균 칼날을 이용하여 좌심실을 분리하고 1-2cm³ 크기로 잘랐다. 이 조직 블록들을 조직 접착제를 사용하여 조직 지지대에 부착하고, Tyrode 용액이 담긴 진동 마이크로톰 조직 배양조에 넣고 지속적으로 산소를 공급하였다(3g/L 2,3-부탄디온 모노옥심(BDM), 140mM NaCl(8.18g), 6mM KCl(0.447g), 10mM D-포도당(1.86g), 10mM HEPES(2.38g), 1mM MgCl₂(1ml 1M 용액), 1.8mM CaCl₂(1.8ml 1M 용액), 최대 1L 증류수). 진동 마이크로톰은 80Hz의 진동수, 2mm의 수평 진동 진폭, 0.03mm/s의 이송 속도로 300µm 두께의 절편을 만들도록 설정되었습니다. 조직 배양조는 용액을 차갑게 유지하기 위해 얼음으로 둘러싸여 있었고, 온도는 4°C로 유지되었습니다. 마이크로톰 배양조에서 조직 절편을 꺼내어 얼음 위에 놓인 산소가 지속적으로 공급되는 Tyrode 용액이 담긴 배양조로 옮겨 배양 접시 하나에 필요한 만큼의 절편이 얻어질 때까지 배양했습니다. 트랜스웰 배양의 경우, 조직 절편을 멸균된 6mm 너비의 폴리우레탄 지지대에 부착하고 최적화된 배지(199 배지, 1x ITS 보충제, 10% FBS, 5ng/ml VEGF, 10ng/ml FGF-알칼리성 및 2x 항생제-항진균제) 6ml에 넣었습니다. C-Pace를 통해 조직 절편에 전기 자극(10V, 주파수 1.2Hz)을 가했습니다. TD 조건의 경우, 배지를 교체할 때마다 신선한 T3와 Dex를 각각 100 nM과 1 μM 농도로 첨가했습니다. 배지는 하루 3회 교체하기 전에 산소로 포화시켰습니다. 조직 절편은 37°C, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양했습니다.
CTCM 배양을 위해, 조직 절편을 변형된 Tyrode 용액이 담긴 페트리 접시에 담아 맞춤 제작된 3D 프린터에 올려놓았습니다. 이 장치는 심장 절편의 크기를 지지 링 면적의 25%만큼 확대하도록 설계되었습니다. 이는 심장 절편이 Tyrode 용액에서 배양액으로 옮겨진 후 및 이완기 동안 늘어나지 않도록 하기 위함입니다. 조직용 아크릴 접착제를 사용하여 두께 300µm의 절편을 직경 7mm의 지지 링에 고정했습니다. 조직 절편을 지지 링에 부착한 후, 여분의 조직 절편을 잘라내고 부착된 조직 절편을 Tyrode 용액이 담긴 얼음(4°C)에 다시 넣어 한 장치에 필요한 만큼의 절편이 준비될 때까지 보관합니다. 모든 장치의 총 처리 시간은 2시간을 넘지 않아야 합니다. 6개의 조직 절편을 지지 링에 부착한 후 CTCM 장치를 조립했습니다. CTCM 배양 챔버에는 산소가 공급된 배양액 21ml가 미리 채워져 있습니다. 조직 절편을 배양 챔버로 옮기고 피펫을 사용하여 기포를 조심스럽게 제거합니다. 조직 절편을 구멍에 넣고 부드럽게 눌러 고정합니다. 마지막으로 전극 캡을 장치에 씌우고 장치를 배양기로 옮깁니다. 그런 다음 CTCM을 공기 튜브와 C-PACE-EM 시스템에 연결합니다. 공압 액추에이터가 열리고 공기 밸브가 CTCM을 엽니다. C-PACE-EM 시스템은 2ms 동안 양방향 페이싱을 통해 1.2Hz에서 4V를 출력하도록 설정되었습니다. 배양액은 하루에 두 번 교체하고 전극은 하루에 한 번 교체하여 전극에 흑연이 축적되는 것을 방지했습니다. 필요한 경우, 조직 절편 아래에 있을 수 있는 기포를 제거하기 위해 배양 용기에서 조직 절편을 꺼낼 수 있습니다. MT 처리 조건의 경우, T3/Dex 용액은 배양액을 교체할 때마다 100nM T3와 1μM Dex를 새로 첨가했습니다. CTCM 장치는 37°C, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양했습니다.
심장 절편의 늘어난 궤적을 얻기 위해 특수 카메라 시스템을 개발했습니다. SLR 카메라(Canon Rebel T7i, Canon, 도쿄, 일본)와 Navitar Zoom 7000 18-108mm 매크로 렌즈(Navitar, 샌프란시스코, 캘리포니아)를 사용했습니다. 배양액을 새 배양액으로 교체한 후 실온에서 관찰을 진행했습니다. 카메라는 51° 각도로 위치시켰고, 초당 30프레임으로 영상을 녹화했습니다. 먼저, 오픈 소스 소프트웨어(MUSCLEMOTION43)와 Image-J를 사용하여 심장 절편의 움직임을 정량화했습니다. MATLAB(MathWorks, 나틱, 매사추세츠, 미국)을 사용하여 노이즈를 최소화하기 위해 박동하는 심장 절편의 관심 영역을 정의하는 마스크를 생성했습니다. 수동으로 분할된 마스크를 프레임 시퀀스의 모든 이미지에 적용한 후 MUSCLEMOTION 플러그인에 전달했습니다. Muscle Motion은 각 프레임의 픽셀 평균 강도를 사용하여 기준 프레임에 대한 상대적인 움직임을 정량화합니다. 데이터를 기록, 필터링하여 심장 주기 동안의 주기 시간과 조직 신장을 정량화하는 데 사용했습니다. 기록된 비디오는 1차 영위상 디지털 필터를 사용하여 후처리했습니다. 조직 신장(피크 대 피크)을 정량화하기 위해 기록된 신호의 피크와 골을 구분하는 피크 대 피크 분석을 수행했습니다. 또한 신호 드리프트를 제거하기 위해 6차 다항식을 사용하여 추세 제거를 수행했습니다. 전체 조직 운동, 주기 시간, 이완 시간 및 수축 시간을 계산하기 위해 MATLAB으로 프로그램 코드를 개발했습니다(보충 프로그램 코드 44).
기계적 신장 평가를 위해 제작된 동일한 비디오를 사용하여 변형률 분석을 수행했습니다. 먼저 MUSCLEMOTION 소프트웨어에 따라 동작의 최고점(상단)과 최저점(하단)을 나타내는 두 이미지를 추적했습니다. 그런 다음 조직 영역을 분할하고 분할된 조직에 음영 알고리즘을 적용했습니다(보충 그림 2a). 분할된 조직은 다시 10개의 하위 표면으로 나뉘었고, 각 표면의 응력은 다음 공식을 사용하여 계산했습니다. 변형률 = (Sup-Sdown)/Sdown, 여기서 Sup와 Sdown은 각각 직물의 상단 및 하단 그림자에서 형상까지의 거리입니다(보충 그림 2b).
심장 조직 절편을 4% 파라포름알데히드 용액에 48시간 동안 고정했습니다. 고정된 조직은 10% 및 20% 수크로오스 용액에 각각 1시간씩 탈수시킨 후, 30% 수크로오스 용액에 하룻밤 동안 담갔습니다. 그런 다음 절편을 최적 절단 온도 화합물(OCT 화합물)에 포매하고 이소펜탄/드라이아이스 욕조에서 서서히 동결시켰습니다. OCT 포매 블록은 분리 전까지 -80°C에서 보관했습니다. 슬라이드는 8μm 두께의 절편으로 제작했습니다.
심장 조직 절편에서 OCT를 제거하려면 슬라이드를 가열 블록에서 95°C로 5분간 가열합니다. 각 슬라이드에 PBS 1ml를 첨가하고 실온에서 30분간 배양한 후, 0.1% Triton-X를 함유한 PBS 용액을 실온에서 15분간 처리하여 조직에 침투시킵니다. 비특이적 항체가 시료에 결합하는 것을 방지하기 위해 슬라이드에 3% BSA 용액 1ml를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 그런 다음 BSA를 제거하고 슬라이드를 PBS로 세척합니다. 각 시료에 연필로 표시합니다. 1% BSA에 1:200으로 희석한 1차 항체(connexin 43(Abcam; #AB11370), NFATC4(Abcam; #AB99431), troponin-T(Thermo Scientific; #MA5-12960))를 90분 동안 반응시킨 후, 마우스 Alexa Fluor 488(Thermo Scientific; #A16079) 및 토끼 Alexa Fluor 594(Thermo Scientific; #T6391)에 대한 2차 항체(1% BSA에 1:200으로 희석)를 추가로 90분 동안 반응시켰습니다. PBS로 3회 세척했습니다. 표적 염색과 배경 염색을 구분하기 위해 2차 항체만 사용한 대조군을 사용했습니다. 마지막으로 DAPI 핵 염색을 첨가하고 슬라이드를 Vectashield(Vector Laboratories)에 넣은 후 매니큐어로 밀봉했습니다. (40배율) 및 Keyence 현미경(40배율)으로 관찰했습니다.
WGA 염색을 위해 PBS에 5 μg/ml 농도로 용해된 WGA-Alexa Fluor 555(Thermo Scientific; #W32464)를 사용하여 고정된 절편에 실온에서 30분 동안 처리했습니다. 슬라이드를 PBS로 세척한 후, 각 슬라이드에 수단 블랙을 첨가하고 30분 동안 배양했습니다. 다시 PBS로 세척한 후, Vectashield 포매제를 첨가했습니다. 슬라이드는 Keyence 현미경으로 40배율에서 관찰했습니다.
위에서 설명한 대로 샘플에서 OCT를 제거했습니다. OCT를 제거한 후, 슬라이드를 부앵 용액에 하룻밤 동안 담갔습니다. 그런 다음 슬라이드를 증류수로 1시간 동안 헹구고 비브리치 알로에산 푸크신 용액에 10분 동안 담갔습니다. 슬라이드를 증류수로 세척한 후 5% 포스포몰리브덴/5% 포스포텅스텐산 용액에 10분 동안 담갔습니다. 헹굼 과정 없이 슬라이드를 바로 아닐린 블루 용액에 15분 동안 담갔습니다. 그런 다음 슬라이드를 증류수로 세척하고 1% 아세트산 용액에 2분 동안 담갔습니다. 슬라이드를 200N 에탄올에서 건조시킨 후 자일렌으로 옮겼습니다. 염색된 슬라이드는 10배율 대물렌즈가 장착된 키엔스 현미경으로 관찰했습니다. 섬유증 면적 백분율은 키엔스 애널라이저 소프트웨어를 사용하여 정량화했습니다.
CyQUANT™ MTT 세포 생존력 분석 키트(Invitrogen, Carlsbad, CA, 카탈로그 번호 V13154)를 제조사 프로토콜에 따라 일부 수정하여 사용했습니다. 특히, MTT 분석 시 균일한 조직 크기를 확보하기 위해 직경 6mm의 수술용 펀치를 사용했습니다. 조직은 제조사 프로토콜에 따라 MTT 기질이 담긴 12웰 플레이트의 각 웰에 개별적으로 접종했습니다. 절편을 37°C에서 3시간 동안 배양하면 살아있는 조직이 MTT 기질을 대사하여 보라색 포르마잔 화합물을 생성합니다. MTT 용액을 1ml의 DMSO로 교체하고 37°C에서 15분 동안 배양하여 심장 절편에서 보라색 포르마잔을 추출했습니다. 샘플을 96웰 투명 바닥 플레이트에 DMSO로 1:10 희석하고 Cytation 플레이트 리더(BioTek)를 사용하여 570nm에서 보라색 강도를 측정했습니다. 측정값은 각 심장 절편의 무게로 정규화했습니다.
심장 조직 절편 배양액은 이전에 설명한 바와 같이 포도당 이용률 분석을 위해 1 μCi/ml [5-3H]-포도당(Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA)을 함유한 배양액으로 교체했습니다. 4시간 배양 후, 0.2 N HCl 100 μl가 들어 있는 열린 마이크로원심분리 튜브에 배양액 100 μl를 넣었습니다. 그런 다음 튜브를 증류수 500 μl가 들어 있는 섬광 튜브에 넣어 37°C에서 72시간 동안 [3H]2O를 증발시켰습니다. 이후 마이크로원심분리 튜브를 섬광 튜브에서 꺼내고 섬광액 10 ml를 넣었습니다. 섬광 계수는 Tri-Carb 2900TR 액체 섬광 분석기(Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA)를 사용하여 측정했습니다. [5-3H]-포도당 비활성도, 불완전한 평형 및 배경, [5-3H]-포도당과 비표지 포도당의 희석, 그리고 섬광 계수기 효율을 고려하여 포도당 이용률을 계산했습니다. 데이터는 심장 절편의 질량으로 정규화되었습니다.
트리졸(Trizol)을 이용한 조직 균질화 후, Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874를 사용하여 제조사 프로토콜에 따라 심장 조직 절편에서 RNA를 분리했습니다. RNAsec 라이브러리 준비, 시퀀싱 및 데이터 분석은 다음과 같이 수행했습니다.
RNA 라이브러리 제작을 위한 시작 물질로 샘플당 1 μg의 RNA를 사용했습니다. 시퀀싱 라이브러리는 제조사의 권장 사항에 따라 NEBNext Ultra™ RNA Library Preparation Kit for Illumina(NEB, USA)를 사용하여 생성했으며, 각 샘플의 속성 서열에 인덱스 코드를 추가했습니다. 간단히 설명하면, 폴리-T 올리고뉴클레오티드가 부착된 자성 비드를 사용하여 총 RNA에서 mRNA를 정제했습니다. 단편화는 NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer(5X)에서 고온의 이가 양이온을 사용하여 수행했습니다. 1차 가닥 cDNA는 무작위 헥사머 프라이머와 M-MuLV 역전사효소(RNase H-)를 사용하여 합성했습니다. 2차 가닥 cDNA는 DNA 중합효소 I과 RNase H를 사용하여 합성했습니다. 남은 오버행은 엑소뉴클레아제/중합효소 활성에 의해 무딘 말단으로 변환했습니다. DNA 단편의 3' 말단을 아데닐화한 후, 헤어핀 루프 구조를 가진 NEBNext 어댑터를 부착하여 하이브리드화를 준비했습니다. 선호하는 길이인 150-200 bp의 cDNA 단편을 선별하기 위해, 라이브러리 단편을 AMPure XP 시스템(Beckman Coulter, Beverly, USA)을 사용하여 정제했습니다. 그런 다음, 크기별로 선별된 cDNA에 어댑터를 연결한 USER 효소(NEB, USA) 3 μl를 첨가하여 37°C에서 15분, 그리고 95°C에서 5분 동안 반응시킨 후 PCR을 수행했습니다. PCR은 Phusion High-Fidelity DNA polymerase, universal PCR primer, 그리고 Index (X) primer를 사용하여 진행했습니다. 마지막으로, PCR 산물을 AMPure XP 시스템으로 정제하고 Agilent Bioanalyzer 2100 시스템에서 라이브러리 품질을 평가했습니다. 이후, Novaseq 시퀀서를 사용하여 cDNA 라이브러리의 염기서열을 분석했습니다. Illumina에서 얻은 원시 이미지 파일은 CASAVA Base Calling을 사용하여 원시 리드로 변환했습니다. 원시 데이터는 리드 시퀀스와 해당 염기 품질 정보를 포함하는 FASTQ(fq) 형식 파일로 저장했습니다. 필터링된 시퀀싱 리드를 Sscrofa11.1 참조 게놈에 맞추려면 HISAT2를 선택하십시오. 일반적으로 HISAT2는 40억 염기 이상의 게놈을 포함하여 모든 크기의 게놈을 지원하며 대부분의 매개변수에 기본값이 설정되어 있습니다. 현재 사용 가능한 시스템 중 가장 빠른 HISAT2를 사용하면 RNA Seq 데이터의 스플라이싱 리드를 효율적으로 정렬할 수 있으며, 다른 어떤 방법보다 정확도가 같거나 더 높습니다.
전사체의 풍부도는 유전자 발현 수준을 직접적으로 반영합니다. 유전자 발현 수준은 게놈 또는 엑손과 관련된 전사체의 풍부도(시퀀싱 횟수)로 평가됩니다. 리드 수는 유전자 발현 수준, 유전자 길이 및 시퀀싱 깊이에 비례합니다. FPKM(백만 염기쌍당 시퀀싱된 전사체의 1,000개 염기쌍당 단편 수)을 계산하고 DESeq2 패키지를 사용하여 차등 발현의 P값을 결정했습니다. 그런 다음 내장된 R 함수 "p.adjust"를 기반으로 Benjamini-Hochberg 방법9을 사용하여 각 P값에 대한 거짓 발견율(FDR)을 계산했습니다.
심장 조직 절편에서 분리한 RNA를 Thermo사의 SuperScript IV Vilo Master mix(Thermo, 카탈로그 번호 11756050)를 사용하여 200 ng/μl 농도로 cDNA로 전환했습니다. 정량적 RT-PCR은 Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384웰 투명 반응 플레이트(Thermo, 카탈로그 번호 4483319)와 microamp 광학 접착제(Thermo, 카탈로그 번호 4311971)를 사용하여 수행했습니다. 반응 혼합물은 웰당 Taqman Fast Advanced Master mix(Thermo, 카탈로그 번호 4444557) 5 µl, Taqman Primer 0.5 µl, H2O 3.5 µl를 혼합하여 구성했습니다. 표준 qPCR 사이클을 실행하고 Applied Biosystems Quantstudio 5 실시간 PCR 기기(384웰 모듈; 제품 번호 A28135)를 사용하여 CT 값을 측정했습니다. Taqman 프라이머는 Thermo사에서 구입했습니다(GAPDH(Ss03375629_u1), PARP12(Ss06908795_m1), PKDCC(Ss06903874_m1), CYGB(Ss06900188_m1), RGL1(Ss06868890_m1), ACTN1(Ss01009508_mH), GATA4(Ss03383805_u1), GJA1(Ss03374839_u1), COL1A2(Ss03375009_u1), COL3A1(Ss04323794_m1), ACTA2(Ss04245588_m1). 모든 샘플의 CT 값은 하우스키핑 유전자 GAPDH를 기준으로 정규화했습니다.
NT-ProBNP의 미디어 방출은 제조사 프로토콜에 따라 NT-ProBNP 키트(돼지용)(제품 번호: MBS2086979, MyBioSource)를 사용하여 평가했습니다. 간단히 설명하면, 각 샘플과 표준 용액 250 µl를 각 웰에 두 번씩 첨가했습니다. 샘플을 첨가한 직후, 각 웰에 분석 시약 A 50 µl를 첨가했습니다. 플레이트를 가볍게 흔든 후 밀봉제로 밀봉했습니다. 그런 다음 37°C에서 1시간 동안 배양했습니다. 용액을 제거하고 1X 세척액 350 µl로 웰을 4회 세척했으며, 각 세척액은 1-2분 동안 배양했습니다. 이어서 각 웰에 분석 시약 B 100 µl를 첨가하고 플레이트 밀봉제로 밀봉했습니다. 플레이트를 가볍게 흔든 후 37°C에서 30분 동안 배양했습니다. 용액을 제거하고 1X 세척액 350 µl로 웰을 5회 세척했습니다. 각 웰에 기질 용액 90 µl를 넣고 플레이트를 밀봉합니다. 플레이트를 37°C에서 10-20분 동안 배양합니다. 각 웰에 정지 용액 50 µl를 첨가합니다. Cytation(BioTek) 플레이트 리더기를 450 nm로 설정하여 즉시 측정합니다.
검정력 분석을 통해 5%의 제1종 오류율에서 해당 매개변수의 10% 절대 변화를 감지하는 데 80% 이상의 검정력을 제공하는 그룹 크기를 선택했습니다. 검정력 분석을 통해 5%의 제1종 오류율에서 해당 매개변수의 10% 절대 변화를 감지하는 데 80% 이상의 검정력을 제공하는 그룹 크기를 선택했습니다. ANALYZ MONSTERNOSTY был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мочности для обнаружения 10% абсолутного изменения 매개변수 с 5% частотой ошибок типа I. 검정력 분석을 통해 5%의 제1종 오류율에서 10%의 절대적인 매개변수 변화를 감지하는 데 80% 이상의 검정력을 제공하는 그룹 크기를 선택했습니다.进行功效分析以选择将提供> 80%功效以检测参数中10%绝对变化와 5%I型错误率的组大大.进行功效分析以选择将提供> 80%功效以检测参数中10%绝对变化와 5%I型错误率的组大大. Был проведен анализ мочности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мочности для обнаружения 10% абсолутного изменения 매개변수 및 5% частоты ошибок типа I. 검정력 분석을 통해 절대적인 매개변수 변화율 10%와 제1종 오류율 5%를 감지하는 데 필요한 검정력 80% 이상을 확보할 수 있는 표본 크기를 선정했습니다.실험 전에 조직 절편을 무작위로 선택했습니다. 모든 분석은 조건 맹검 방식으로 진행되었으며, 모든 데이터 분석이 완료된 후에야 샘플 정보를 공개했습니다. 모든 통계 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어(샌디에이고, 캘리포니아)를 사용하여 수행했습니다. 모든 통계 분석에서 p값은 0.05 미만일 경우 통계적으로 유의미한 것으로 간주했습니다. 모든 통계에서 p값은 0.05 미만일 때 유의미한 것으로 간주했습니다. Для всей statистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. 모든 통계에서 p값은 0.05 미만일 때 유의미한 것으로 간주했습니다.对于所有统计数据，p 值재值<0.05 时被认为是显着的.对于所有统计数据，p 值재值<0.05 时被认为是显着的. Для всей statистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. 모든 통계에서 p값은 0.05 미만일 때 유의미한 것으로 간주했습니다.두 그룹 간 비교만 있는 데이터에 대해서는 양측 검정 스튜던트 t-검정을 수행했습니다. 여러 그룹 간의 유의성을 확인하기 위해 일원 또는 이원 분산 분석(ANOVA)을 사용했습니다. 사후 검정을 수행할 때는 다중 비교를 보정하기 위해 Tukey 보정을 적용했습니다. RNAsec 데이터는 방법 섹션에 설명된 대로 FDR 및 p값 조정을 계산할 때 특별한 통계적 고려 사항이 있습니다.
연구 설계에 대한 자세한 내용은 이 기사에 링크된 Nature Research Report 초록을 참조하십시오.