Asante kwa kutembelea Nature.com. Toleo la kivinjari unachotumia lina usaidizi mdogo wa CSS. Kwa matumizi bora zaidi, tunapendekeza utumie kivinjari kilichosasishwa (au uzime Hali ya Utangamano katika Internet Explorer). Wakati huo huo, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tutatoa tovuti bila mitindo na JavaScript.
Kuna haja ya mfumo wa kuaminika wa ndani ya vitro ambao unaweza kuzaliana kwa usahihi mazingira ya kisaikolojia ya moyo kwa ajili ya majaribio ya dawa. Upatikanaji mdogo wa mifumo ya utamaduni wa tishu za moyo wa binadamu umesababisha tafsiri zisizo sahihi za athari za dawa za moyo. Hapa, tumeunda mfumo wa utamaduni wa tishu za moyo (CTCM) ambao huchochea vipande vya moyo kwa njia ya kielektroniki na kupitia mkazo wa kisaikolojia wakati wa awamu za sistoli na diastoli za mzunguko wa moyo. Baada ya siku 12 za utamaduni, mbinu hii iliboresha kwa kiasi fulani uwezo wa sehemu za moyo, lakini haikuhifadhi kikamilifu uadilifu wao wa kimuundo. Kwa hivyo, baada ya uchunguzi mdogo wa molekuli, tuligundua kuwa kuongezwa kwa 100 nM triiodothyronine (T3) na 1 μM dexamethasone (Dex) kwenye chombo chetu cha kati kulidumisha muundo mdogo wa sehemu kwa siku 12. Pamoja na matibabu ya T3/Dex, mfumo wa CTCM ulidumisha wasifu wa unukuzi, uwezo wa kuishi, shughuli za kimetaboliki, na uadilifu wa kimuundo katika kiwango sawa na tishu mpya za moyo kwa siku 12. Zaidi ya hayo, kunyoosha kupita kiasi kwa tishu za moyo katika utamaduni husababisha ishara ya moyo yenye haipatrofiki, na kutoa ushahidi wa uwezo wa CTCM kuiga hali zenye haipatrofiki zinazosababishwa na kunyoosha moyo. Kwa kumalizia, CTCM inaweza kuiga fiziolojia na pathofiziolojia ya moyo katika utamaduni kwa muda mrefu, na kuwezesha uchunguzi wa kuaminika wa dawa.
Kabla ya utafiti wa kimatibabu, mifumo ya kuaminika ya ndani ya vitro inahitajika ambayo inaweza kuzaliana kwa usahihi mazingira ya kisaikolojia ya moyo wa binadamu. Mifumo kama hiyo inapaswa kuiga mabadiliko ya kunyoosha kwa mitambo, mapigo ya moyo, na sifa za kielektroniki za kielektroniki. Mifano ya wanyama hutumika kwa kawaida kama jukwaa la uchunguzi wa fiziolojia ya moyo huku uaminifu mdogo ukionyesha athari za dawa katika moyo wa binadamu1,2. Hatimaye, Mfano Bora wa Majaribio ya Utamaduni wa Tishu za Moyo (CTCM) ni mfano ambao ni nyeti sana na mahususi kwa uingiliaji kati mbalimbali wa matibabu na kifamasia, unaozalishwa kwa usahihi fiziolojia na pathofiziolojia ya moyo wa binadamu3. Kutokuwepo kwa mfumo kama huo kunapunguza ugunduzi wa matibabu mapya ya kushindwa kwa moyo4,5 na kumesababisha sumu ya moyo na dawa kama sababu kuu ya kutoka sokoni6.
Katika muongo mmoja uliopita, dawa nane zisizo za moyo na mishipa zimeondolewa kwenye matumizi ya kimatibabu kwa sababu husababisha muda mrefu wa QT na kusababisha arrhythmias ya ventrikali na kifo cha ghafla7. Kwa hivyo, kuna haja inayoongezeka ya mikakati ya uchunguzi wa awali wa kuaminika ili kutathmini ufanisi na sumu ya moyo na mishipa. Matumizi ya hivi karibuni ya moyo na mishipa inayotokana na seli shina zenye pluripotent (hiPS-CM) zinazosababishwa na binadamu katika uchunguzi wa dawa na upimaji wa sumu hutoa suluhisho la sehemu kwa tatizo hili. Hata hivyo, hali ya kutokomaa ya hiPS-CM na ukosefu wa ugumu wa seli nyingi za moyo ni mapungufu makubwa ya njia hii. Uchunguzi wa hivi karibuni umeonyesha kuwa kikomo hiki kinaweza kushindwa kwa kiasi fulani kwa kutumia hiPS-CM za mapema kuunda hidrojeli za tishu za moyo muda mfupi baada ya kuanza kwa mikazo ya ghafla na kuongeza polepole kichocheo cha umeme baada ya muda. Hata hivyo, tishu hizi ndogo za hiPS-CM hazina sifa za elektrofiziolojia na za kufyonza zilizokomaa za myocardiamu ya watu wazima. Zaidi ya hayo, tishu za moyo wa binadamu zina muundo tata zaidi, unaojumuisha mchanganyiko usio wa kawaida wa aina tofauti za seli, ikiwa ni pamoja na seli za endothelial, niuroni, na fibroblasti za stromal, zilizounganishwa na seti maalum za protini za matrix ya nje ya seli. Tofauti hii ya idadi isiyo ya moyo11,12,13 katika moyo wa mamalia wazima ni kizuizi kikubwa cha kutengeneza muundo wa tishu za moyo kwa kutumia aina za seli za kibinafsi. Vikwazo hivi vikuu vinasisitiza umuhimu wa kutengeneza mbinu za kukuza tishu za moyo zisizo na madhara chini ya hali za kisaikolojia na za kiafya.
Sehemu nyembamba (300 µm) za moyo wa binadamu zimethibitika kuwa kielelezo chenye matumaini cha myocardiamu ya binadamu isiyo na madhara. Njia hii hutoa ufikiaji wa mfumo kamili wa seli nyingi za 3D sawa na tishu za moyo wa binadamu. Hata hivyo, hadi 2019, matumizi ya sehemu za moyo zilizokuzwa yalipunguzwa na uhai mfupi wa utamaduni (saa 24). Hii ni kutokana na mambo kadhaa ikiwa ni pamoja na ukosefu wa kunyoosha kimwili-kimitambo, kiolesura cha hewa-kimiminika, na matumizi ya vyombo rahisi vya habari ambavyo haviungi mkono mahitaji ya tishu za moyo. Mnamo 2019, vikundi kadhaa vya utafiti vilionyesha kuwa kuingiza vipengele vya kiufundi katika mifumo ya utamaduni wa tishu za moyo kunaweza kupanua maisha ya utamaduni, kuboresha usemi wa moyo, na kuiga ugonjwa wa moyo. Tafiti mbili za kifahari 17 na 18 zinaonyesha kuwa mzigo wa mitambo wa uniaxial una athari chanya kwenye phenotype ya moyo wakati wa utamaduni. Hata hivyo, tafiti hizi hazikutumia mzigo wa kimwili-kimitambo wenye nguvu wa mzunguko wa moyo, kwa kuwa sehemu za moyo zilikuwa zimejaa nguvu za mvutano za isometric 17 au mzigo wa auxotonic wa mstari 18. Mbinu hizi za kunyoosha tishu zilisababisha kukandamizwa kwa jeni nyingi za moyo au usemi kupita kiasi wa jeni zinazohusiana na majibu yasiyo ya kawaida ya kunyoosha. Ikumbukwe kwamba, Pitoulis et al. 19 walitengeneza bafu ya kukuza moyo yenye nguvu kwa ajili ya ujenzi upya wa mzunguko wa moyo kwa kutumia mrejesho wa nguvu wa transducer na vichocheo vya mvutano. Ingawa mfumo huu unaruhusu uundaji sahihi zaidi wa mfumo wa mzunguko wa moyo katika vitro, ugumu na upitishaji mdogo wa njia hiyo hupunguza matumizi ya mfumo huu. Maabara yetu hivi karibuni imeunda mfumo rahisi wa kukuza moyo kwa kutumia kichocheo cha umeme na njia iliyoboreshwa ili kudumisha uhai wa sehemu za tishu za moyo wa nguruwe na binadamu kwa hadi siku 620,21.
Katika muswada wa sasa, tunaelezea modeli ya uundaji wa tishu za moyo (CTCM) kwa kutumia sehemu za moyo wa nguruwe zinazojumuisha ishara za humoral ili kufupisha fiziolojia ya moyo yenye pande tatu na mkunjo wa kiitolojia wakati wa mzunguko wa moyo. CTCM hii inaweza kuongeza usahihi wa utabiri wa dawa za kabla ya kliniki hadi kiwango ambacho hakijawahi kupatikana hapo awali kwa kutoa mfumo wa moyo wa wastani na wenye gharama nafuu unaoiga fiziolojia/pathofiziolojia ya moyo wa mamalia kwa ajili ya upimaji wa dawa za kabla ya kliniki.
Ishara za mitambo za hemodinamiki zina jukumu muhimu katika kudumisha utendaji kazi wa moyo na mishipa ya damu katika vitro 22,23,24. Katika hati ya sasa, tumeunda CTCM (Mchoro 1a) ambayo inaweza kuiga mazingira ya moyo wa mtu mzima kwa kuchochea kichocheo cha umeme na mitambo katika masafa ya kisaikolojia (1.2 Hz, mipigo 72 kwa dakika). Ili kuepuka kunyoosha tishu kupita kiasi wakati wa diastoli, kifaa cha uchapishaji cha 3D kilitumika kuongeza ukubwa wa tishu kwa 25% (Mchoro 1b). Kasi ya umeme inayosababishwa na mfumo wa C-PACE ilipangwa kuanza kwa ms 100 kabla ya sistoli kwa kutumia mfumo wa kupata data ili kuzaliana kikamilifu mzunguko wa moyo. Mfumo wa uundaji wa tishu hutumia kichocheo cha nyumatiki kinachoweza kupangwa (LB Engineering, Ujerumani) kupanua utando wa silikoni unaonyumbulika kwa mzunguko ili kusababisha upanuzi wa vipande vya moyo katika chumba cha juu. Mfumo uliunganishwa na waya wa nje wa hewa kupitia kipitisha shinikizo, ambacho kiliwezesha kurekebisha kwa usahihi shinikizo (± 1 mmHg) na muda (± 1 ms) (Mchoro 1c).
a Ambatisha sehemu ya tishu kwenye pete ya usaidizi ya milimita 7, inayoonyeshwa kwa rangi ya bluu, ndani ya chumba cha utamaduni cha kifaa. Chumba cha utamaduni kimetenganishwa na chumba cha hewa kwa utando mwembamba wa silikoni unaonyumbulika. Weka gasket kati ya kila chumba ili kuzuia uvujaji. Kifuniko cha kifaa kina elektrodi za grafiti zinazotoa kichocheo cha umeme. b Uwakilishi wa kimfumo wa kifaa kikubwa cha tishu, pete ya mwongozo na pete ya usaidizi. Sehemu za tishu (kahawia) huwekwa kwenye kifaa kikubwa zaidi huku pete ya mwongozo ikiwa imewekwa kwenye mfereji kwenye ukingo wa nje wa kifaa. Kwa kutumia mwongozo, weka kwa uangalifu pete ya usaidizi iliyofunikwa na gundi ya akriliki ya tishu juu ya sehemu ya tishu ya moyo. c Grafu inayoonyesha muda wa kichocheo cha umeme kama kazi ya shinikizo la chumba cha hewa linalodhibitiwa na kichocheo cha nyumatiki kinachoweza kupangwa (PPD). Kifaa cha kupata data kilitumika kusawazisha kichocheo cha umeme kwa kutumia vitambuzi vya shinikizo. Wakati shinikizo katika chumba cha utamaduni linapofikia kizingiti kilichowekwa, ishara ya mapigo hutumwa kwa C-PACE-EM ili kusababisha kichocheo cha umeme. d Picha ya CTCM nne zilizowekwa kwenye rafu ya incubator. Vifaa vinne vimeunganishwa na PPD moja kupitia saketi ya nyumatiki, na vitambuzi vya shinikizo huingizwa kwenye vali ya hemostatic ili kufuatilia shinikizo katika saketi ya nyumatiki. Kila kifaa kina sehemu sita za tishu.
Kwa kutumia kichocheo kimoja cha nyumatiki, tuliweza kudhibiti vifaa 4 vya CTCM, ambavyo kila kimoja kingeweza kushikilia sehemu 6 za tishu (Mchoro 1d). Katika CTCM, shinikizo la hewa katika chumba cha hewa hubadilishwa kuwa shinikizo la sanjari katika chumba cha umajimaji na husababisha upanuzi wa kisaikolojia wa kipande cha moyo (Mchoro 2a na Filamu ya Nyongeza 1). Tathmini ya kunyoosha tishu katika 80 mm Hg. Sanaa. ilionyesha kunyoosha sehemu za tishu kwa 25% (Mchoro 2b). Kunyoosha kwa asilimia hii kumeonyeshwa kuambatana na urefu wa sarcomere ya kisaikolojia wa 2.2–2.3 µm kwa unyumbufu wa kawaida wa sehemu ya moyo17,19,25. Mwendo wa tishu ulipimwa kwa kutumia mipangilio maalum ya kamera (Mchoro wa Nyongeza 1). Amplitude na kasi ya mwendo wa tishu (Mchoro 2c, d) ililingana na kunyoosha wakati wa mzunguko wa moyo na muda wakati wa sistoli na diastoli (Mchoro 2b). Kunyoosha na kasi ya tishu za moyo wakati wa kusinyaa na kulegea ilibaki bila kubadilika kwa siku 12 katika ukuaji (Mchoro 2f). Ili kutathmini athari za kichocheo cha umeme kwenye mkazo wakati wa ukuaji, tulibuni mbinu ya kubaini ulemavu unaofanya kazi kwa kutumia algoriti ya kivuli (Mchoro wa Nyongeza 2a,b) na tuliweza kutofautisha kati ya ulemavu ulio na kichocheo cha umeme na usio na kichocheo cha umeme. Sehemu hiyo hiyo ya moyo (Mchoro 2f). Katika eneo linaloweza kusongeshwa la sehemu iliyokatwa (R6-9), volteji wakati wa kichocheo cha umeme ilikuwa juu kwa 20% kuliko bila kichocheo cha umeme, ambayo inaonyesha mchango wa kichocheo cha umeme kwa utendaji kazi wa mkazo.
Vipimo vya uwakilishi wa shinikizo la chumba cha hewa, shinikizo la chumba cha umajimaji, na vipimo vya mwendo wa tishu vinathibitisha kwamba shinikizo la chumba hubadilisha shinikizo la chumba cha umajimaji, na kusababisha mwendo unaolingana wa kipande cha tishu. b Vipimo vya uwakilishi wa asilimia ya kunyoosha (bluu) ya sehemu za tishu zinazolingana na asilimia ya kunyoosha (chungwa). c Mwendo uliopimwa wa kipande cha moyo unaendana na kasi iliyopimwa ya mwendo. (d) Vipimo vya uwakilishi wa mwendo wa mzunguko (mstari wa bluu) na kasi (mstari wa chungwa wenye nukta) katika kipande cha moyo. e Upimaji wa muda wa mzunguko (n = vipande 19 kwa kila kundi, kutoka kwa nguruwe tofauti), muda wa kubana (n = vipande 19 kwa kila kundi), muda wa kupumzika (n = vipande 19 kwa kila kundi, kutoka kwa nguruwe tofauti), mwendo wa tishu (n = 25). vipande)/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti), kasi ya kilele cha sistoli (n = 24(D0), vipande 25(D12)/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti) na kiwango cha kilele cha kupumzika (n=24(D0), vipande 25(D12)/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti). Jaribio la t la Mwanafunzi lenye mikia miwili halikuonyesha tofauti kubwa katika kigezo chochote. f Uchambuzi wakilishi wa athari za sehemu za tishu zenye kichocheo cha umeme (nyekundu) na bila (bluu), maeneo kumi ya kikanda ya sehemu za tishu kutoka sehemu moja. Paneli za chini zinaonyesha upimaji wa tofauti ya asilimia katika mkazo katika sehemu za tishu zenye kichocheo cha umeme na bila katika maeneo kumi kutoka sehemu tofauti. (n = vipande 8/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, Jaribio la t la Mwanafunzi lenye mikia miwili linafanywa; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = vipande 8/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, Jaribio la t la Mwanafunzi lenye mikia miwili linafanywa; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = sehemu 8/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, mtihani wa t wa Mwanafunzi wenye mikia miwili; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). (n = 8 片/组，來自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05）. (n = 8 片/组，來自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05）. (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = sehemu 8/kikundi, kutoka kwa nguruwe tofauti, mtihani wa t wa Mwanafunzi wenye mikia miwili; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Pau za hitilafu zinawakilisha wastani wa kupotoka kwa kawaida ±.
Katika mfumo wetu wa awali wa uundaji wa vipande vya moyo tuli [20, 21], tulidumisha uhai, utendakazi, na uadilifu wa kimuundo wa vipande vya moyo kwa siku 6 kwa kutumia kichocheo cha umeme na kuboresha muundo wa kati. Hata hivyo, baada ya siku 10, takwimu hizi zilishuka sana. Tutarejelea sehemu zilizokuzwa katika mfumo wetu wa awali wa uundaji wa biomimetiki tuli 20, 21 hali za udhibiti (Ctrl) na tutatumia njia yetu iliyoboreshwa hapo awali kama hali ya MC na uundaji chini ya kichocheo cha mitambo na umeme kwa wakati mmoja (CTCM). kinachoitwa . Kwanza, tuliamua kwamba kichocheo cha mitambo bila kichocheo cha umeme hakikutosha kudumisha uhai wa tishu kwa siku 6 (Mchoro wa Nyongeza 3a,b). Cha kufurahisha ni kwamba, kwa kuanzishwa kwa kichocheo cha fizio-mitambo na umeme kwa kutumia STCM, uhai wa sehemu za moyo za siku 12 ulibaki sawa na katika sehemu mpya za moyo chini ya hali ya MS, lakini si chini ya hali ya Ctrl, kama inavyoonyeshwa na uchambuzi wa MTT (Mchoro 1). 3a). Hii inaonyesha kwamba kichocheo cha mitambo na uigaji wa mzunguko wa moyo vinaweza kuweka sehemu za tishu zikiwa hai kwa muda mrefu mara mbili kuliko ilivyoripotiwa katika mfumo wetu wa awali wa uundaji tuli. Hata hivyo, tathmini ya uadilifu wa kimuundo wa sehemu za tishu kwa kutumia kinga ya troponini T ya moyo na connexin 43 ilionyesha kuwa usemi wa connexin 43 ulikuwa juu zaidi katika tishu za MC siku ya 12 kuliko katika vidhibiti siku hiyo hiyo. Hata hivyo, usemi sare wa connexin 43 na uundaji wa diski ya Z haukuhifadhiwa kikamilifu (Mchoro 3b). Tunatumia mfumo wa akili bandia (AI) kupima uadilifu wa kimuundo wa tishu26, bomba la kujifunza kwa kina linalotegemea picha linalotegemea troponini-T na madoa ya connexin43 ili kupima kiotomatiki uadilifu wa kimuundo na mwangaza wa vipande vya moyo kulingana na nguvu ya ujanibishaji. Njia hii inatumia Mtandao wa Neva wa Convolutional (CNN) na mfumo wa kujifunza kwa kina ili kupima kwa uhakika uadilifu wa kimuundo wa tishu za moyo kwa njia otomatiki na isiyo na upendeleo, kama ilivyoelezwa katika marejeleo. 26. Tishu za MC zilionyesha ufanano bora wa kimuundo na siku ya 0 ikilinganishwa na sehemu za udhibiti tuli. Zaidi ya hayo, rangi ya trichrome ya Masson ilionyesha asilimia ndogo sana ya fibrosis chini ya hali ya MS ikilinganishwa na hali za udhibiti siku ya 12 ya utamaduni (Mchoro 3c). Ingawa CTCM iliongeza uwezo wa kuishi wa sehemu za tishu za moyo siku ya 12 hadi kiwango sawa na kile cha tishu mpya za moyo, haikuboresha kwa kiasi kikubwa uadilifu wa kimuundo wa sehemu za moyo.
Grafu ya Mistari inaonyesha kipimo cha uwezo wa MTT wa vipande vya moyo vipya (D0) au uundaji wa vipande vya moyo kwa siku 12 ama katika uundaji tuli (D12 Ctrl) au katika CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), vipande 12 (D12 MC)/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, njia moja ambayo jaribio la ANOVA linafanywa; ####p < 0.0001 ikilinganishwa na D0 na **p < 0.01 ikilinganishwa na D12 Ctrl). Grafu ya miraba inaonyesha kipimo cha uwezo wa MTT wa vipande vya moyo vipya (D0) au uundaji wa vipande vya moyo kwa siku 12 ama katika uundaji tuli (D12 Ctrl) au katika CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), vipande/kikundi 12 (D12 MC) kutoka kwa nguruwe tofauti, njia moja ambayo jaribio la ANOVA linafanywa; ####p < 0.0001 ikilinganishwa na D0 na **p < 0.01 ikilinganishwa na D12 Ctrl).Histogramu inaonyesha kipimo cha uwezekano wa kuishi kwa sehemu za moyo mpya za MTT (D0) au utamaduni wa sehemu za moyo kwa siku 12 katika utamaduni tuli (udhibiti wa D12) au CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (udhibiti wa D12). ) ), sehemu/kikundi 12 (D12 MC) kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja hufanywa;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 ikilinganishwa na D0 na **p < 0.01 ikilinganishwa na D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 新鲜心脏切片(D0) 則片(D0) 1天的MTT 活力的量化)，來自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p <2比比，####p <0.00D 10.00D < 0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 新鲜心脏切片(D0) 中文 (D0) 中文 (D0) ，切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p <0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p.)histogramu inayoonyesha kipimo cha uwezo wa kuishi wa MTT katika sehemu za moyo mpya (D0) au sehemu za moyo zilizokuzwa kwa siku 12 katika utamaduni tuli (udhibiti wa D12) au CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (udhibiti wa D12)), 12 (D12 MC) sehemu/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 ikilinganishwa na D0, **p < 0.01 ikilinganishwa na D12 Ctrl).b Troponin-T (kijani), connexin 43 (nyekundu) na DAPI (bluu) katika sehemu za moyo zilizotengwa hivi karibuni (D0) au sehemu za moyo zilizokuzwa chini ya hali tuli (Ctrl) au hali ya CTCM (MC) kwa siku 12) za picha wakilishi za fluorescence (kipimo tupu = 100 µm). Upimaji wa akili bandia wa uadilifu wa kimuundo wa tishu za moyo (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), vipande/kikundi 5 (D12 MC) kila kimoja kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja hufanywa; ####p < 0.0001 ikilinganishwa na D0 na ****p < 0.0001 ikilinganishwa na D12 Ctrl). Upimaji wa akili bandia wa uadilifu wa kimuundo wa tishu za moyo (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), vipande/kikundi 5 (D12 MC) kila kimoja kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja hufanywa; ####p < 0.0001 ikilinganishwa na D0 na ****p < 0.0001 ikilinganishwa na D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) сруправи/ проводится однофакторный тест ANOVA ####p <0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Upimaji wa uadilifu wa kimuundo wa tishu za moyo kwa kutumia akili bandia (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sehemu/vikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja lilifanyika; ####p < 0.0001 dhidi ya D0 na ****p < 0.0001 ikilinganishwa na D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) vipande/panga kila nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja;###00D0 <10.相比，****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) vipande/kundi kila nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja;###0#0D010. <0.0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC/гранг) скачать разных свиней, односторонний тест ANOVA <0,0001 dhidi ya D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Akili bandia ili kupima uadilifu wa kimuundo wa tishu za moyo (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sehemu/kikundi kila moja ya nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja; ####p<0.0001 dhidi ya .D0 Kwa kulinganisha ****p < 0.0001 ikilinganishwa na D12 Ctrl). c Picha wakilishi (kushoto) na upimaji (kulia) kwa vipande vya moyo vilivyopakwa rangi ya Masson's trichrome stain (Kiwango wazi = 500 µm) (n = vipande 10/kikundi kila kimoja kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja linafanywa; ####p < 0.0001 ikilinganishwa na D0 na ***p < 0.001 ikilinganishwa na D12 Ctrl). c Picha wakilishi (kushoto) na upimaji (kulia) kwa vipande vya moyo vilivyopakwa rangi ya Masson's trichrome stain (Kiwango wazi = 500 µm) (n = vipande 10/kikundi kila kimoja kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja linafanywa; #### p < 0.0001 ikilinganishwa na D0 na ***p < 0.001 ikilinganishwa na D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) na количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Масязкен Масяз50 = мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0не ***p. c Picha wakilishi (kushoto) na upimaji (kulia) wa sehemu za moyo zilizopakwa rangi ya Masson's trichrome doa (kipimo kisichofunikwa = 500 µm) (n = sehemu 10/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja lilifanyika; #### p < 0 .0001 ikilinganishwa na D0 na ***p < 0.001 ikilinganishwa na D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化(右)（裸尺度= 500 µm） 500个切片/组，每组來自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p <0.0001 与D0 相比，***p <0.001 Ctrl 缉D12. C 用 mason 三 色 染料的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺庰裸尺庰裸尺庰裸尺庰裸尺庰裦尺= 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 來自 不同 猪 , 进行 单向 单向 Anova 测试；####D0 p0 , #### D0 <0 0.0. < 0.001 kwa D12 Ctrl funguo. c Репрезентативные изображения (слева) na количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массом Массоя = (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,000,000 ***p сравнению с D12 Ctrl). c Picha wakilishi (kushoto) na upimaji (kulia) wa sehemu za moyo zilizopakwa rangi ya Masson's trichrome doa (tupu = 500 µm) (n = sehemu 10/kikundi, kila moja kutoka kwa nguruwe tofauti, iliyojaribiwa kwa uchambuzi wa tofauti wa njia moja ;### # p < 0.0001 ikilinganishwa na D0, ***p < 0.001 ikilinganishwa na D12 Ctrl).Pau za hitilafu zinawakilisha wastani wa kupotoka kwa kawaida ±.
Tulidhani kwamba kwa kuongeza molekuli ndogo kwenye njia ya tamaduni, uadilifu wa moyo na mishipa unaweza kuboreshwa na ukuaji wa fibrosis ukapungua wakati wa tamaduni ya CTCM. Kwa hivyo, tulichunguza molekuli ndogo kwa kutumia tamaduni zetu za udhibiti tuli20,21 kutokana na idadi ndogo ya mambo yanayochanganya. Deksamethasoni (Dex), triiodothyronine (T3), na SB431542 (SB) zilichaguliwa kwa ajili ya uchunguzi huu. Molekuli hizi ndogo zimetumika hapo awali katika tamaduni za hiPSC-CM ili kuchochea kukomaa kwa moyo na mishipa kwa kuongeza urefu wa sarcomere, mirija ya T, na kasi ya upitishaji. Kwa kuongezea, Deksamethasoni (glukokotikoidi) na SB zote zinajulikana kukandamiza uvimbe29,30. Kwa hivyo, tulijaribu ikiwa kuingizwa kwa molekuli moja au mchanganyiko wa hizi ndogo kungeboresha uadilifu wa kimuundo wa sehemu za moyo. Kwa uchunguzi wa awali, kipimo cha kila kiwanja kilichaguliwa kulingana na viwango vinavyotumika sana katika mifano ya tamaduni ya seli (1 μM Dex27, 100 nM T327, na 2.5 μM SB31). Baada ya siku 12 za kutengenezwa, mchanganyiko wa T3 na Dex ulisababisha uadilifu bora wa kimuundo wa moyo na mishipa na urekebishaji mdogo wa nyuzinyuzi (Michoro ya Nyongeza 4 na 5). Zaidi ya hayo, matumizi ya mara mbili au mara mbili ya viwango hivi vya T3 na Dex yalisababisha athari mbaya ikilinganishwa na viwango vya kawaida (Mchoro wa Nyongeza 6a,b).
Baada ya uchunguzi wa awali, tulifanya ulinganisho wa ana kwa ana wa hali 4 za uundaji (Mchoro 4a): Ctrl: sehemu za moyo zilizokuzwa katika uundaji wetu tuli ulioelezewa hapo awali kwa kutumia njia yetu iliyoboreshwa; 20.21 TD: T3 na Ctrl s Imeongezwa Dex Jumatano; MC: sehemu za moyo zilizokuzwa katika CTCM kwa kutumia njia yetu iliyoboreshwa hapo awali; na MT: CTCM yenye T3 na Dex iliyoongezwa kwenye njia. Baada ya siku 12 za uundaji, uwezo wa uundaji wa tishu za MS na MT ulibaki sawa na katika tishu mpya zilizopimwa na jaribio la MTT (Mchoro 4b). Cha kufurahisha ni kwamba, kuongezwa kwa T3 na Dex kwenye tamaduni za transwell (TD) hakukusababisha uboreshaji mkubwa wa uwezo wa uundaji ikilinganishwa na hali za Ctrl, ikionyesha jukumu muhimu la kichocheo cha kiufundi katika kudumisha uwezo wa uundaji wa sehemu za moyo.
Mchoro wa muundo wa majaribio unaoonyesha hali nne za utamaduni zinazotumika kutathmini athari za kichocheo cha mitambo na nyongeza ya T3/Dex kwenye wastani kwa siku 12. b Grafu ya mihimili inaonyesha kipimo cha uwezo wa kuishi siku 12 baada ya kupandwa katika hali zote 4 za kupandwa (Ctrl, TD, MC, na MT) ikilinganishwa na vipande vya moyo vipya (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD na D12 MT), vipande 12 (D12 MC)/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja hufanywa; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 ikilinganishwa na D0 na **p < 0.01 ikilinganishwa na D12 Ctrl). b Grafu ya mihimili inaonyesha kipimo cha uwezo wa kuishi siku 12 baada ya kupandwa katika hali zote 4 za kupandwa (Ctrl, TD, MC, na MT) ikilinganishwa na vipande vya moyo vipya (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD na D12 MT), vipande 12 (D12 MC)/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja hufanywa; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 ikilinganishwa na D0 na **p < 0.01 ikilinganishwa na D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования во всех 4 условиях культивирования всех 4 условиях культивирования сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD na D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разныст пронстонстений, ANOVA; ####p <0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Grafu ya upau inaonyesha kipimo cha uwezo wa kuishi katika siku 12 baada ya kukuzwa katika hali zote 4 za kukuzwa (udhibiti, TD, MC, na MT) ikilinganishwa na sehemu za moyo mpya (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, na D12 MT), sehemu/kikundi 12 (D12 MC) kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 dhidi ya D0 na **p < 0.01 kwa ikilinganishwa na D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)),15 (D12 Ctrl,D12 TD) MT)，來自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001,###p < 0.001 与D0 相比，*0p与D12控制.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC na MT) по сравнению со свежими TD срезами сердца (D0) (n = 15,D12), D0) (n = 15,D12) MT), kutoka kwa разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; b Histogramu inayoonyesha hali zote 4 za ukuaji (udhibiti, TD, MC na MT) ikilinganishwa na sehemu za moyo safi (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD na D12 MT), kutoka kwa nguruwe tofauti sehemu/kikundi 12 (D12 MC), jaribio la ANOVA la njia moja; ####p<0.0001, ###p<0.001 dhidi ya D0, **p<0.01 dhidi ya udhibiti D12). c Grafu ya upau inaonyesha kipimo cha mtiririko wa glukosi siku 12 baada ya kukuzwa katika hali zote 4 za kukuzwa (Ctrl, TD, MC, na MT) ikilinganishwa na vipande vya moyo safi (D0) (n = vipande 6/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja linafanywa; ###p < 0.001, ikilinganishwa na D0 na ***p < 0.001 ikilinganishwa na D12 Ctrl). c Grafu ya upau inaonyesha kipimo cha mtiririko wa glukosi siku 12 baada ya kukuzwa katika hali zote 4 za kukuzwa (Ctrl, TD, MC, na MT) ikilinganishwa na vipande vya moyo safi (D0) (n = vipande 6/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja linafanywa; ###p < 0.001, ikilinganishwa na D0 na ***p < 0.001 ikilinganishwa na D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования, MCTD, MCTD сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; ##не#p <0,00 unganisha na D12 Ctrl). c Histogramu inaonyesha kipimo cha mtiririko wa glukosi siku 12 baada ya kukuzwa chini ya hali zote 4 za kukuzwa (udhibiti, TD, MC na MT) ikilinganishwa na sehemu za moyo safi (D0) (n = sehemu 6/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja limefanywa; ###p < 0.001 ikilinganishwa na D0 na ***p < 0.001 ikilinganishwa na D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，來自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比 1*D0 Ctrl 20 单向执行ANOVA 测试;相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （(ctrl 、 td 、 mc 和 mt) 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， 猪单向执行ANOVA 测试；##00 <0.相比，***p < 0.001 kwa D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, казывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех 4 условий кулькозы, TD сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###0p < 0,0, *** 0,001 по сравнению с D12 (kontrol). c Histogramu inayoonyesha kipimo cha mtiririko wa glukosi siku 12 baada ya kukuzwa kwa hali zote 4 za kukuzwa (udhibiti, TD, MC, na MT) ikilinganishwa na sehemu za moyo safi (D0) (n = sehemu 6/kikundi, kutoka kwa nguruwe tofauti, upande mmoja. Vipimo vya ANOVA vilifanywa, ###p < 0.001 ikilinganishwa na D0, ***p < 0.001 ikilinganishwa na D12 (udhibiti).d Vielelezo vya uchambuzi wa msongo wa damu vya tishu mbichi (bluu), siku ya 12 MC (kijani), na siku ya 12 MT (nyekundu) katika sehemu kumi za sehemu ya tishu za kikanda (n = vipande 4/kikundi, jaribio la ANOVA la njia moja; hakukuwa na tofauti kubwa kati ya vikundi). e Vielelezo vya volkano vinavyoonyesha jeni zilizoonyeshwa tofauti katika sehemu za moyo mbichi (D0) ikilinganishwa na sehemu za moyo zilizokuzwa chini ya hali tuli (Ctrl) au chini ya hali ya MT (MT) kwa siku 10-12. f Ramani ya joto ya jeni za sarcomere kwa sehemu za moyo zilizokuzwa chini ya kila hali ya ukuaji. Pau za hitilafu zinawakilisha wastani ± kupotoka kwa kawaida.
Utegemezi wa kimetaboliki kwenye mabadiliko kutoka kwa oxidation ya asidi ya mafuta hadi glycolysis ni alama ya utofautishaji wa moyo na mishipa. Moyo na mishipa ya damu ambao hawajakomaa hutumia glukosi kwa ajili ya uzalishaji wa ATP na wana mitochondria isiyo na plastiki yenye cristae chache. Uchambuzi wa matumizi ya glukosi ulionyesha kuwa chini ya hali ya MC na MT, matumizi ya glukosi yalikuwa sawa na yale yaliyo katika tishu za siku 0 (Mchoro 4c). Hata hivyo, sampuli za Ctrl zilionyesha ongezeko kubwa la matumizi ya glukosi ikilinganishwa na tishu mpya. Hii inaonyesha kwamba mchanganyiko wa CTCM na T3/Dex huongeza uhai wa tishu na huhifadhi aina ya kimetaboliki ya sehemu za moyo zilizokuzwa kwa siku 12. Kwa kuongezea, uchanganuzi wa mkazo ulionyesha kuwa viwango vya mkazo vilibaki sawa na katika tishu mpya za moyo kwa siku 12 chini ya hali ya MT na MS (Mchoro 4d).
Ili kuchambua athari ya jumla ya CTCM na T3/Dex kwenye mandhari ya kimataifa ya unukuzi wa tishu za vipande vya moyo, tulifanya RNAseq kwenye vipande vya moyo kutoka kwa hali zote nne tofauti za utamaduni (Data ya Nyongeza 1). Cha kufurahisha ni kwamba, sehemu za MT zilionyesha kufanana kwa kiwango cha juu kwa unukuzi na tishu mpya za moyo, huku jeni 16 pekee zikionyeshwa tofauti kati ya jeni 13,642. Hata hivyo, kama tulivyoonyesha hapo awali, vipande vya Ctrl vilionyesha jeni 1229 zilizoonyeshwa tofauti baada ya siku 10-12 katika utamaduni (Mchoro 4e). Data hizi zilithibitishwa na qRT-PCR ya jeni za moyo na fibroblast (Mchoro wa Nyongeza 7a-c). Cha kufurahisha ni kwamba sehemu za Ctrl zilionyesha kupungua kwa jeni za mzunguko wa moyo na seli na uanzishaji wa programu za jeni za uchochezi. Data hizi zinaonyesha kwamba utofautishaji, ambao kwa kawaida hutokea baada ya uundaji wa muda mrefu, hupungua kabisa chini ya hali za MT (Mchoro wa Nyongeza 8a,b). Utafiti wa makini wa jeni za sarcomere ulionyesha kuwa ni chini ya hali ya MT pekee ndipo jeni zinazosimba sarcomere (Mchoro 4f) na njia ya ioni (Mchoro wa Nyongeza 9) huhifadhiwa, na kuzilinda kutokana na kukandamizwa chini ya hali ya Ctrl, TD, na MC. Data hizi zinaonyesha kwamba kwa mchanganyiko wa kusisimua kwa mitambo na humoral (T3/Dex), transcriptome ya kipande cha moyo inaweza kubaki sawa na vipande vipya vya moyo baada ya siku 12 katika tamaduni.
Matokeo haya ya unukuzi yanaungwa mkono na ukweli kwamba uadilifu wa kimuundo wa moyo na mishipa katika sehemu za moyo huhifadhiwa vyema chini ya hali ya MT kwa siku 12, kama inavyoonyeshwa na connexin isiyo na madhara na iliyopo 43 (Mchoro 5a). Zaidi ya hayo, fibrosis katika sehemu za moyo chini ya hali ya MT ilipunguzwa kwa kiasi kikubwa ikilinganishwa na Ctrl na sawa na sehemu za moyo mpya (Mchoro 5b). Data hizi zinaonyesha kwamba mchanganyiko wa kusisimua kwa mitambo na matibabu ya T3/Dex huhifadhi kwa ufanisi muundo wa moyo katika sehemu za moyo katika utamaduni.
Picha wakilishi za immunofluorescence za troponin-T (kijani), connexin 43 (nyekundu), na DAPI (bluu) katika sehemu za moyo zilizotengwa hivi karibuni (D0) au zilizopandwa kwa siku 12 katika hali zote nne za ukuaji wa sehemu za moyo (kipimo cha upau = 100 µm). Upimaji wa akili bandia wa uadilifu wa kimuundo wa tishu za moyo (n = 7 (D0 na D12 Ctrl), vipande/kikundi 5 (D12 TD, D12 MC na D12 MT) kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja hufanywa; ####p < 0.0001 ikilinganishwa na D0 na *p < 0.05, au ****p < 0.0001 ikilinganishwa na D12 Ctrl). Upimaji wa akili bandia wa uadilifu wa kimuundo wa tishu za moyo (n = 7 (D0 na D12 Ctrl), vipande/kikundi 5 (D12 TD, D12 MC na D12 MT) kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja hufanywa; #### p < 0.0001 ikilinganishwa na D0 na *p < 0.05, au ****p < 0.0001 ikilinganishwa na D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 na D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MT/ D12 MT) na от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p <0,0001 по сравнению с D0 и *p <0,05 или ****p <0,0001 по сравнению с D12 ). Upimaji wa uadilifu wa kimuundo wa tishu za moyo kwa kutumia akili bandia (n = 7 (D0 na D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC na D12 MT) sehemu/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la ANOVA la njia moja lilifanyika; #### p < 0.0001 ikilinganishwa na D0 na *p < 0.05 au ****p < 0.0001 ikilinganishwa na D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组)相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 (n = 7 (d0 和 d12 ctrl) (5 (d12 td , d12 mc 和 d12 mt ）智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ; ########## p < 0.0001 与D0 和*p <0.05 相比 <2 Ctrl 1 1 ****0D 1 2 ****0 p <0.0001相比）.Upimaji wa uadilifu wa kimuundo wa tishu za moyo kwa kutumia akili bandia katika nguruwe tofauti (n = 7 (D0 na D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC na D12 MT) sehemu/kikundi) kwa kutumia jaribio la ANOVA la njia moja;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 ikilinganishwa na D0 na *p < 0.05 au ****p < 0.0001 ikilinganishwa na D12 Ctrl). b Picha wakilishi na upimaji wa vipande vya moyo vilivyopakwa rangi ya Masson's trichrome doa (Kipimo cha upau = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, na D12 MC), vipande 9 (D12 MT)/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la njia moja la ANOVA hufanywa; ####p < 0.0001 ikilinganishwa na D0 na ***p < 0.001, au ****p < 0.0001 ikilinganishwa na D12 Ctrl). b Picha wakilishi na upimaji wa vipande vya moyo vilivyopakwa rangi ya Masson's trichrome doa (Kipimo cha upau = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, na D12 MC), vipande 9 (D12 MT)/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la njia moja la ANOVA hufanywa; ####p < 0.0001 ikilinganishwa na D0 na ***p < 0.001, au ****p < 0.0001 ikilinganishwa na D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения na количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная 10) = 50 = (D0, D12 Ctrl, D12 TD and D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA <####pнию <0,0 исполние 0,001 au ****p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Picha wakilishi na upimaji wa sehemu za moyo zilizopakwa rangi ya Masson's trichrome doa (kipimo cha upau = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD na D12 MC), sehemu/kikundi 9 (D12 MT) kutoka kwa nguruwe tofauti, zilizofanywa kwa njia moja ANOVA; ####p < 0.0001 dhidi ya D0 na ***p < 0.001 au ****p < 0.0001 dhidi ya D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 11（D2D0（D（D（D（D（D（10（D（D（D（D) MC. 0.0001 Ctrl D12 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 來自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；#****##p < 0.0001 与D0 相00p1 < 0.0001 与D0 ，*00p1 0.0001 kwa D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500n, DKT = 500n, D. D12 TD na D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; D12 Ctrl). b Picha wakilishi na upimaji wa sehemu za moyo zilizopakwa rangi ya trichrome ya Masson (upau wa kipimo = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD na D12 MC), sehemu 9 (D12 MT) kutoka kwa nguruwe/kikundi tofauti, njia moja ya ANOVA; ####p < 0.0001 ikilinganishwa na D0, ***p < 0.001 au ****p < 0.0001 ikilinganishwa na D12 Ctrl).Pau za hitilafu zinawakilisha wastani wa kupotoka kwa kawaida ±.
Hatimaye, uwezo wa CTCM kuiga hypertrophy ya moyo ulipimwa kwa kuongeza kunyoosha kwa tishu za moyo. Katika CTCM, shinikizo la kilele cha chumba cha hewa liliongezeka kutoka 80 mmHg hadi 80 mmHg. Sanaa. (kunyoosha kawaida) hadi 140 mmHg Sanaa. (Mchoro 6a). Hii inalingana na ongezeko la 32% la kunyoosha (Mchoro 6b), ambalo hapo awali lilionyeshwa kama asilimia inayolingana ya kunyoosha inayohitajika kwa sehemu za moyo kufikia urefu wa sarcomere sawa na ule unaoonekana katika hypertrophy. Kunyoosha na kasi ya tishu za moyo wakati wa kusinyaa na kulegea ilibaki sawa wakati wa siku sita za kukuza (Mchoro 6c). Tishu za moyo kutoka kwa hali ya MT zilifanyiwa kunyoosha kawaida (MT (Kawaida)) au hali ya kunyoosha kupita kiasi (MT (OS)) kwa siku sita. Tayari baada ya siku nne za kukuza, alama ya hypertrophic NT-ProBNP iliongezeka kwa kiasi kikubwa katika hali ya kati chini ya hali ya MT (OS) ikilinganishwa na hali ya MT (kawaida) (Mchoro 7a). Kwa kuongezea, baada ya siku sita za kukuza, ukubwa wa seli katika MT (OS) (Mchoro 7b) uliongezeka kwa kiasi kikubwa ikilinganishwa na sehemu za moyo wa MT (kawaida). Kwa kuongezea, uhamishaji wa nyuklia wa NFATC4 uliongezeka kwa kiasi kikubwa katika tishu zilizonyooshwa kupita kiasi (Mchoro 7c). Matokeo haya yanaonyesha maendeleo endelevu ya urekebishaji wa kiafya baada ya kupanuka kwa shinikizo la damu na yanaunga mkono dhana kwamba kifaa cha CTCM kinaweza kutumika kama jukwaa la kusoma ishara ya kupanuka kwa shinikizo la damu ya moyo inayosababishwa na kunyoosha.
Vipimo wakilishi vya shinikizo la chumba cha hewa, shinikizo la chumba cha umajimaji, na vipimo vya mwendo wa tishu vinathibitisha kwamba shinikizo la chumba hubadilisha shinikizo la chumba cha umajimaji, na kusababisha mwendo unaolingana wa kipande cha tishu. b Asilimia wakilishi ya kunyoosha na mikunjo ya kiwango cha kunyoosha kwa sehemu za tishu zilizonyooshwa (chungwa) na zilizonyooshwa kupita kiasi (bluu). c Grafu ya upau inayoonyesha muda wa mzunguko (n = vipande 19 kwa kila kundi, kutoka kwa nguruwe tofauti), muda wa kubana (n = vipande 18-19 kwa kila kundi, kutoka kwa nguruwe tofauti), muda wa kupumzika (n = vipande 19 kwa kila kundi, kutoka kwa nguruwe tofauti) ), amplitude ya mwendo wa tishu (n = vipande 14/kikundi, kutoka kwa nguruwe tofauti), kasi ya kilele cha sistoli (n = vipande 14/kikundi, kutoka kwa nguruwe tofauti) na kiwango cha kilele cha kupumzika (n = 14 (D0), 15 (D6) ) kutoka kwa nguruwe tofauti), jaribio la t la Mwanafunzi lenye mikia miwili halikuonyesha tofauti kubwa katika kigezo chochote, ikionyesha kwamba vigezo hivi vilibaki sawa wakati wa siku 6 za ukuzaji na overvoltage. Pau za hitilafu zinawakilisha wastani ± kupotoka kwa kawaida.
Upimaji wa grafu ya miraba ya mkusanyiko wa NT-ProBNP katika vyombo vya habari vya ufugaji kutoka kwa vipande vya moyo vilivyokuzwa chini ya hali ya kunyoosha kwa kawaida kwa MT (Norm) au kunyoosha kupita kiasi (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, na D4 MTOS) vipande/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, ANOVA ya njia mbili inafanywa; **p < 0.01 ikilinganishwa na kunyoosha kwa kawaida). Upimaji wa grafu ya miraba ya mkusanyiko wa NT-ProBNP katika vyombo vya habari vya ufugaji kutoka kwa vipande vya moyo vilivyokuzwa chini ya hali ya kunyoosha kwa kawaida kwa MT (Norm) au kunyoosha kupita kiasi (OS) (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, na D4 MTOS) vipande/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, ANOVA ya njia mbili inafanywa; **p < 0.01 ikilinganishwa na kunyoosha kwa kawaida).Histogramu ya kiasi cha mkusanyiko wa NT-ProBNP katika njia ya kilimo kutoka kwa vipande vya moyo vilivyokuzwa chini ya hali ya kawaida ya kunyoosha MT (kawaida) au kunyoosha kupita kiasi (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, na D4).MTOS) vipande /kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, uchambuzi wa tofauti wa sababu mbili unafanywa;**p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 ikilinganishwa na kunyoosha kawaida). a 在MT 正常拉伸(Kawaida) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓麦的条彈2 = D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）來自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸1 （0. Ukadiriaji wa mkusanyiko wa NT-ProBNP katika vipande vya moyo vilivyokuzwa chini ya hali ya kunyoosha ya kawaida ya MT (Kawaida) au ya kunyoosha (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm neD4 MTOS) kutoka kwa 猪的切片/组，可斑双双双，com na kunyoosha kawaida, p <0.01).histogramu Upimaji wa viwango vya NT-ProBNP katika vipande vya moyo vilivyokuzwa chini ya hali ya kawaida ya kunyoosha MT (kawaida) au kunyoosha kupita kiasi (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) na D4 MTOS) vipande/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, uchambuzi wa njia mbili wa tofauti;**p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 ikilinganishwa na kunyoosha kawaida). b Picha wakilishi za vipande vya moyo vilivyotiwa rangi ya troponin-T na WGA (kushoto) na kipimo cha ukubwa wa seli (kulia) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) seli/kikundi kutoka vipande 10 tofauti kutoka kwa nguruwe tofauti, Jaribio la t la Mwanafunzi lenye mikia miwili linafanywa; ****p < 0.0001 ikilinganishwa na kunyoosha kawaida). b Picha wakilishi za vipande vya moyo vilivyopakwa rangi ya troponin-T na WGA (kushoto) na kipimo cha ukubwa wa seli (kulia) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) seli/kikundi kutoka vipande 10 tofauti kutoka kwa nguruwe tofauti, Jaribio la t la Mwanafunzi lenye mikia miwili linafanywa; ****p < 0.0001 ikilinganishwa na kunyoosha kawaida). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) na количественного определения размера клетокток) (6) = 6 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюномном ****pымномнта ****pымномнта ****pымнинта ****pыmномнта ****pыmy ****p растяжением). b Picha wakilishi za sehemu za moyo zilizopakwa rangi ya troponin-T na AZP (kushoto) na kipimo cha ukubwa wa seli (kulia) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) seli/kikundi kutoka sehemu 10 tofauti kutoka kwa nguruwe tofauti, jaribio la t la Mwanafunzi lenye mikia miwili lilifanywa; ****p < 0.0001 ikilinganishwa na mkazo wa kawaida). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（右）染色的心脏切片的代表性图像（n=D60) MTOS），來自不同猪的10 个不同切片的369(D6 MTNorm) 0.0001). b Picha wakilishi za vipande vya moyo vilivyotiwa rangi ya calcarein-T na WGA (kushoto) na ukubwa wa seli (kulia) (n = 330 (D6 MTOS), 369 kutoka vipande 10 tofauti (D6 MTNorm)) Seli/组，两方法有尾学生t test；ikilinganishwa na kunyoosha kawaida，****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) na количественная оценка размера клеток (с69 MT) (с69 MT) (D6 MTNorm) na kwa 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнильмья сравные; b Picha wakilishi za sehemu za moyo zilizopakwa rangi ya troponin-T na AZP (kushoto) na kipimo cha ukubwa wa seli (kulia) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) kutoka sehemu 10 tofauti kutoka kwa nguruwe tofauti) Seli/kikundi, kigezo cha mikia miwili T ya mwanafunzi; ****p < 0.0001 ikilinganishwa na mkazo wa kawaida). c Picha wakilishi za vipande vya moyo vya MTOS vya siku 0 na siku 6 vilivyo na lebo ya kinga kwa troponin-T na NFATC4 na kipimo cha uhamishaji wa NFATC4 hadi kwenye viini vya CM (n = 4 (D0), vipande/kikundi 3 (D6 MTOS) kutoka kwa nguruwe tofauti, Jaribio la t la mwanafunzi lenye mikia miwili linafanywa; *p < 0.05). c Picha wakilishi za vipande vya moyo vya MTOS vya siku 0 na siku 6 vilivyo na lebo ya kinga kwa troponin-T na NFATC4 na kipimo cha uhamishaji wa NFATC4 hadi kwenye viini vya CM (n = 4 (D0), vipande 3 (D6 MTOS)/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti, Jaribio la t la mwanafunzi lenye mikia miwili linafanywa; *p < 0.05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 na 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т na NFATC4, na количественная оцнсанка кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента, *0; c Picha wakilishi za sehemu za moyo katika siku 0 na 6 za MTOS, zilizowekwa lebo ya troponin-T na NFATC4, na kipimo cha uhamishaji wa NFATC4 katika kiini cha seli za mapango (n = 4 (D0), vipande 3 (D6 MTOS)/kikundi kutoka kwa nguruwe tofauti) zilifanya jaribio la t la Mwanafunzi lenye mikia miwili; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性图像，以及來自蘎TCCM4细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p <0.05). c Picha wakilishi za calcanin-T na NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS vipande vya moyo, na NFATC4 kutoka NFATC4 易位至 kiini kiini cha CM的quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS)/切礼时间双尾学生et 电影；*p <0.05). c Utoaji wa taarifa kwa wateja wa MTOS katika 0 na 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т na NFATC4 na количественная оценская количественная оценская количественная оценская оценка от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p <0,05). c Picha wakilishi za vipande vya moyo vya MTOS siku ya 0 na 6 kwa ajili ya uwekaji wa lebo za kinga za troponin-T na NFATC4 na upimaji wa uhamishaji wa NFATC4 katika kiini cha CM kutoka kwa nguruwe tofauti (n = 4 (D0), vipande 3 (D6 MTOS)/kikundi, vigezo vya t vyenye mikia miwili. Mwanafunzi; *p < 0.05).Pau za hitilafu zinawakilisha wastani ± mkengeuko wa kawaida.
Utafiti wa moyo na mishipa unaotafsiriwa unahitaji mifumo ya seli inayozalisha kwa usahihi mazingira ya moyo. Katika utafiti huu, kifaa cha CTCM kilitengenezwa na kubainishwa ambacho kinaweza kuchochea sehemu nyembamba sana za moyo. Mfumo wa CTCM unajumuisha kichocheo cha kielektroniki kilichosawazishwa kisaikolojia na uboreshaji wa maji ya T3 na Dex. Wakati sehemu za moyo wa nguruwe zilipowekwa wazi kwa mambo haya, uhai wao, uadilifu wa kimuundo, shughuli za kimetaboliki, na usemi wa unukuzi ulibaki sawa na katika tishu mpya za moyo baada ya siku 12 za utamaduni. Kwa kuongezea, kunyoosha kupita kiasi kwa tishu za moyo kunaweza kusababisha hypertrophy ya moyo inayosababishwa na hyperextension. Kwa ujumla, matokeo haya yanaunga mkono jukumu muhimu la hali ya utamaduni wa kisaikolojia katika kudumisha phenotype ya kawaida ya moyo na kutoa jukwaa la uchunguzi wa dawa.
Mambo mengi huchangia kuunda mazingira bora kwa ajili ya utendaji kazi na uhai wa moyo na mishipa ya damu. Mambo yaliyo dhahiri zaidi kati ya haya yanahusiana na (1) mwingiliano kati ya seli, (2) kichocheo cha kielektroniki, (3) vipengele vya humoral, na (4) substrates za kimetaboliki. Mwingiliano wa kifiziolojia kati ya seli na seli unahitaji mitandao tata ya pande tatu ya aina nyingi za seli inayoungwa mkono na matrix ya nje ya seli. Mwingiliano huo tata wa seli ni vigumu kuujenga upya ndani ya vitro kwa kukuza pamoja aina za seli za kila mmoja, lakini unaweza kupatikana kwa urahisi kwa kutumia asili ya oganotipi ya sehemu za moyo.
Kunyoosha kwa mitambo na kusisimua kwa umeme kwa moyo na mishipa ya damu ni muhimu kwa kudumisha phenotype ya moyo33,34,35. Ingawa kusisimua kwa mitambo kumetumika sana kwa ajili ya urekebishaji na ukomavu wa hiPSC-CM, tafiti kadhaa za kifahari hivi karibuni zimejaribu kusisimua kwa mitambo kwa vipande vya moyo katika uundaji kwa kutumia upakiaji wa uniaxial. Tafiti hizi zinaonyesha kuwa upakiaji wa mitambo wa uniaxial wa 2D una athari chanya kwenye phenotype ya moyo wakati wa uundaji. Katika tafiti hizi, sehemu za moyo zilijazwa nguvu za mvutano za isometric17, upakiaji wa auxotonic wa mstari18, au mzunguko wa moyo uliundwa upya kwa kutumia maoni ya transducer ya nguvu na vichocheo vya mvutano. Hata hivyo, mbinu hizi hutumia unyooshaji wa tishu uniaxial bila uboreshaji wa mazingira, na kusababisha kukandamizwa kwa jeni nyingi za moyo au usemi kupita kiasi wa jeni zinazohusiana na majibu yasiyo ya kawaida ya mnyumbuliko. CTCM iliyoelezwa hapa inatoa kichocheo cha umeme cha 3D kinachoiga mzunguko wa asili wa moyo kwa upande wa muda wa mzunguko na mnyumbuliko wa kisaikolojia (kunyoosha 25%, sistoli 40%, diastoli 60%, na mipigo 72 kwa dakika). Ingawa kusisimua huku kwa mitambo kwa pande tatu pekee hakutoshi kudumisha uadilifu wa tishu, mchanganyiko wa kusisimua kwa humoral na kiufundi kwa kutumia T3/Dex unahitajika ili kudumisha uimara, utendaji, na uadilifu wa tishu ipasavyo.
Vipengele vya ucheshi vina jukumu muhimu katika kurekebisha umbo la moyo wa mtu mzima. Hili lilionyeshwa katika tafiti za HiPS-CM ambapo T3 na Dex ziliongezwa kwenye vyombo vya habari vya utamaduni ili kuharakisha kukomaa kwa seli. T3 inaweza kuathiri usafirishaji wa amino asidi, sukari na kalsiamu kwenye utando wa seli36. Kwa kuongezea, T3 inakuza usemi wa MHC-α na kupungua kwa MHC-β, na kukuza uundaji wa myofibrili zenye msisimko wa haraka katika moyo wa moyo uliokomaa ikilinganishwa na myofibrili zenye msisimko wa polepole katika CM ya fetasi. Upungufu wa T3 kwa wagonjwa walio na hypothyroidism husababisha kupotea kwa bendi za myofibrili na kiwango cha kupungua cha ukuaji wa toni37. Dex hufanya kazi kwenye vipokezi vya glukokotikoidi na imeonyeshwa kuongeza usikivu wa moyo katika mioyo iliyotengwa iliyojaa damu;38 uboreshaji huu unadhaniwa kuwa unahusiana na athari kwenye kuingia kwa amana ya kalsiamu (SOCE) 39,40. Kwa kuongezea, Dex hufungamana na vipokezi vyake, na kusababisha mwitikio mpana wa ndani ya seli ambao hukandamiza utendaji kazi wa kinga na uvimbe30.
Matokeo yetu yanaonyesha kuwa kichocheo cha kimwili cha mitambo (MS) kiliboresha utendaji wa jumla wa utamaduni ikilinganishwa na Ctrl, lakini kilishindwa kudumisha uhai, uadilifu wa kimuundo, na usemi wa moyo kwa siku 12 katika utamaduni. Ikilinganishwa na Ctrl, kuongezwa kwa tamaduni za T3 na Dex kwenye tamaduni za CTCM (MT) kuliboresha uhai na kudumisha wasifu sawa wa unukuzi, uadilifu wa kimuundo, na shughuli za kimetaboliki na tishu mpya za moyo kwa siku 12. Zaidi ya hayo, kwa kudhibiti kiwango cha kunyoosha tishu, modeli ya hypertrophy ya moyo inayosababishwa na hyperextension iliundwa kwa kutumia STCM, ikionyesha utofauti wa mfumo wa STCM. Ikumbukwe kwamba ingawa urekebishaji wa moyo na fibrosis kwa kawaida huhusisha viungo vilivyosalia ambavyo seli zinazozunguka zinaweza kutoa saitokini zinazofaa pamoja na fagosaitosisi na mambo mengine ya urekebishaji, sehemu za moyo bado zinaweza kuiga mchakato wa fibrotiki katika kukabiliana na mfadhaiko na kiwewe. Hii imetathminiwa hapo awali katika modeli hii ya vipande vya moyo. Ikumbukwe kwamba vigezo vya CTCM vinaweza kubadilishwa kwa kubadilisha amplitude ya shinikizo/umeme na masafa ili kuiga hali nyingi kama vile tachycardia, bradycardia, na usaidizi wa mzunguko wa damu wa mitambo (moyo usio na mzigo wa mitambo). Hii inafanya mfumo kuwa wa kati kwa ajili ya upimaji wa dawa. Uwezo wa CTCM wa kuiga hypertrophy ya moyo inayosababishwa na bidii kupita kiasi hufungua njia ya kupima mfumo huu kwa ajili ya tiba ya kibinafsi. Kwa kumalizia, utafiti huu unaonyesha kwamba kunyoosha kwa mitambo na kusisimua kwa ucheshi ni muhimu kwa kudumisha utamaduni wa sehemu za tishu za moyo.
Ingawa data iliyotolewa hapa inaonyesha kwamba CTCM ni jukwaa lenye matumaini makubwa la kuiga myocardiamu isiyo na madhara, mbinu hii ya uundaji ina mapungufu kadhaa. Kikwazo kikuu cha uundaji wa CTCM ni kwamba huweka mkazo endelevu wa mitambo kwenye vipande, ambayo huzuia uwezo wa kufuatilia kikamilifu mikazo ya vipande vya moyo wakati wa kila mzunguko. Kwa kuongezea, kutokana na ukubwa mdogo wa sehemu za moyo (7 mm), uwezo wa kutathmini utendakazi wa sistoli nje ya mifumo ya uundaji kwa kutumia vitambuzi vya nguvu vya jadi ni mdogo. Katika hati ya sasa, tunashinda kwa kiasi fulani kikwazo hiki kwa kutathmini volteji ya macho kama kiashiria cha utendakazi wa uundaji. Hata hivyo, kikwazo hiki kitahitaji kazi zaidi na kinaweza kushughulikiwa katika siku zijazo kwa kuanzisha mbinu za ufuatiliaji wa macho wa utendakazi wa vipande vya moyo katika uundaji, kama vile uchoraji ramani wa macho kwa kutumia rangi nyeti kwa kalsiamu na voltage. Kikwazo kingine cha CTCM ni kwamba mfumo wa kufanya kazi haudhibiti msongo wa kisaikolojia (upakiaji wa awali na upakiaji wa baada). Katika CTCM, shinikizo lilisababishwa katika pande tofauti ili kuzalisha 25% ya mkazo wa kisaikolojia katika diastoli (mnyoosho kamili) na sistoli (urefu wa mkazo wakati wa kusisimua kwa umeme) katika tishu kubwa sana. Kikwazo hiki kinapaswa kuondolewa katika miundo ya CTCM ya siku zijazo kwa shinikizo la kutosha kwenye tishu za moyo kutoka pande zote mbili na kwa kutumia uhusiano halisi wa shinikizo na ujazo unaotokea katika vyumba vya moyo.
Urekebishaji unaosababishwa na kunyoosha kupita kiasi ulioripotiwa katika hati hii una kikomo cha kuiga ishara za hypertrophic hyperstretch. Kwa hivyo, modeli hii inaweza kusaidia katika utafiti wa ishara za hypertrophic zinazosababishwa na kunyoosha bila hitaji la vipengele vya humoral au neva (ambavyo havipo katika mfumo huu). Uchunguzi zaidi unahitajika ili kuongeza wingi wa CTCM, kwa mfano, kukuza pamoja na seli za kinga, vipengele vya humoral vinavyozunguka plasma, na uhifadhi wakati wa kukuza pamoja na seli za neva kutaboresha uwezekano wa kuunda modeli za magonjwa na CTCM.
Nguruwe kumi na tatu walitumika katika utafiti huu. Taratibu zote za wanyama zilifanywa kwa mujibu wa miongozo ya kitaasisi na ziliidhinishwa na Kamati ya Huduma na Matumizi ya Wanyama ya Chuo Kikuu cha Louisville. Upinde wa aorta ulifungwa na moyo ulijazwa lita 1 ya ugonjwa wa moyo usio na vijidudu (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparini, pH hadi 7.4); Mioyo ilihifadhiwa katika suluhisho la moyo na mishipa ya damu baridi hadi isafirishwe hadi maabara kwenye barafu ambayo kwa kawaida huwa chini ya dakika 10. Mioyo ilihifadhiwa katika suluhisho la moyo na mishipa ya damu baridi hadi isafirishwe hadi maabara kwenye barafu ambayo kwa kawaida huwa chini ya dakika 10. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. Mioyo ilihifadhiwa kwenye mchanganyiko wa moyo na mishipa ya damu baridi hadi isafirishwe hadi maabara kwenye barafu, ambayo kwa kawaida huchukua chini ya dakika 10.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟. Держите сердца katika ледяной кардиоплегии до транспортировки katika laбораторию kwenye льду, обычно <10 мин. Weka mioyo kwenye barafu ya moyo hadi isafirishwe hadi maabara kwenye barafu, kwa kawaida chini ya dakika 10.
Kifaa cha CTCM kilitengenezwa katika programu ya usanifu wa kompyuta (CAD) inayosaidiwa na SolidWorks. Vyumba vya uundaji, vigawanyio na vyumba vya hewa vimetengenezwa kwa plastiki safi ya akriliki ya CNC. Pete ya nyuma yenye kipenyo cha 7mm imetengenezwa kwa polyethilini yenye msongamano mkubwa (HDPE) katikati na ina mfereji wa pete ya o-kupitisha pete ya o-kupitisha ya silicone inayotumika kuziba vyombo vya habari vilivyo chini. Utando mwembamba wa silika hutenganisha chumba cha uundaji na bamba la utenganisho. Utando wa silicone umekatwa kwa leza kutoka kwa karatasi ya silicone yenye unene wa inchi 0.02 na una ugumu wa 35A. Gesi za silicone za chini na juu zimekatwa kwa leza kutoka kwa karatasi ya silicone yenye unene wa inchi 1/16 na zina ugumu wa 50A. Skurubu za chuma cha pua za lita 316 na karanga za mabawa hutumiwa kwa kufunga kizuizi na kuunda muhuri usiopitisha hewa.
Bodi maalum ya saketi iliyochapishwa (PCB) imeundwa ili kuunganishwa na mfumo wa C-PACE-EM. Soketi za kiunganishi cha mashine ya Uswisi kwenye PCB zimeunganishwa na elektrodi za grafiti kwa waya za shaba zilizofunikwa kwa fedha na skrubu za shaba 0-60 zilizowekwa kwenye elektrodi. Bodi ya saketi iliyochapishwa imewekwa kwenye kifuniko cha printa ya 3D.
Kifaa cha CTCM kinadhibitiwa na kichocheo cha nyumatiki kinachoweza kupangwa (PPD) ambacho huunda shinikizo la mzunguko wa damu linalodhibitiwa sawa na mzunguko wa moyo. Kadri shinikizo ndani ya chumba cha hewa linavyoongezeka, utando wa silikoni unaonyumbulika hupanuka juu, na kulazimisha vyombo vya habari chini ya eneo la tishu. Eneo la tishu litanyooshwa na kutolewa huku kwa umajimaji, kuiga upanuzi wa kisaikolojia wa moyo wakati wa diastoli. Katika kilele cha kulegea, kichocheo cha umeme kilitumika kupitia elektrodi za grafiti, ambazo zilipunguza shinikizo katika chumba cha hewa na kusababisha mgandamizo wa sehemu za tishu. Ndani ya bomba kuna vali ya hemostatic yenye kihisi shinikizo ili kugundua shinikizo katika mfumo wa hewa. Shinikizo linalohisiwa na kihisi shinikizo hutumika kwa mkusanyaji data aliyeunganishwa na kompyuta ya mkononi. Hii inaruhusu ufuatiliaji endelevu wa shinikizo ndani ya chumba cha gesi. Shinikizo la juu zaidi la chumba lilipofikiwa (kiwango cha kawaida cha 80 mmHg, 140 mmHg OS), kifaa cha kupata data kiliamriwa kutuma ishara kwa mfumo wa C-PACE-EM ili kutoa ishara ya volteji mbili kwa ms 2, iliyowekwa kwa 4 V.
Sehemu za moyo zilipatikana na hali ya ukuaji katika visima 6 ilifanywa kama ifuatavyo: Hamisha mioyo iliyovunwa kutoka kwenye chombo cha kuhamisha hadi kwenye trei yenye ugonjwa wa moyo na mishipa ya damu baridi (4° C.). Ventilaki ya kushoto ilitengwa kwa blade tasa na kukatwa vipande vya 1-2 cm3. Vitalu hivi vya tishu viliunganishwa kwenye viunganishi vya tishu kwa gundi ya tishu na kuwekwa kwenye bafu ya tishu yenye mikrotome inayotetemeka yenye myeyusho wa Tyrode na kuwekwa oksijeni mfululizo (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g). ), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-glucose (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml myeyusho 1 M), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml myeyusho 1 M), hadi 1 L ddH2O). Microtomu inayotetemeka iliwekwa kukata vipande vya unene wa µm 300 kwa masafa ya 80 Hz, amplitude ya mtetemo mlalo ya 2 mm, na kasi ya awali ya 0.03 mm/s. Bafu ya tishu ilizungukwa na barafu ili kuweka mchanganyiko ukiwa baridi na halijoto ilidumishwa kwa 4°C. Hamisha sehemu za tishu kutoka kwenye bafu ya microtomu hadi kwenye bafu ya kuangulia yenye mchanganyiko wa Tyrode uliojaa oksijeni kwenye barafu hadi sehemu za kutosha zipatikane kwa sahani moja ya kuangulia. Kwa ajili ya kuangulia kwa njia ya kuangulia, sehemu za tishu ziliunganishwa na vifaa tasa vya polyurethane vyenye upana wa 6 mm na kuwekwa katika 6 ml ya mchanganyiko ulioboreshwa (199 kati, 1x nyongeza ya ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkali na 2X antibiotiki-antifungal). Kichocheo cha umeme (10 V, masafa ya 1.2 Hz) kilitumika kwenye sehemu za tishu kupitia C-Pace. Kwa hali ya TD, T3 na Dex mbichi ziliongezwa kwa 100 nM na 1 μM kila mabadiliko ya wastani. Medium hujaa oksijeni kabla ya kubadilishwa mara 3 kwa siku. Sehemu za tishu zilikuzwa kwenye incubator kwa 37°C na 5% CO2.
Kwa ajili ya uundaji wa CTCM, sehemu za tishu ziliwekwa kwenye printa ya 3D iliyotengenezwa maalum katika sahani ya Petri iliyo na myeyusho wa Tyrode uliorekebishwa. Kifaa hiki kimeundwa ili kuongeza ukubwa wa kipande cha moyo kwa 25% ya eneo la pete ya usaidizi. Hii inafanywa ili sehemu za moyo zisinyooke baada ya kuhamishwa kutoka kwa myeyusho wa Tyrode hadi kwenye kati na wakati wa diastoli. Kwa kutumia gundi ya histoacrilic, sehemu zenye unene wa µm 300 ziliwekwa kwenye pete ya usaidizi yenye kipenyo cha milimita 7. Baada ya kuunganisha sehemu za tishu kwenye pete ya usaidizi, kata sehemu za tishu zilizozidi na uweke sehemu za tishu zilizounganishwa tena kwenye bafu ya myeyusho wa Tyrode kwenye barafu (4°C) hadi sehemu za kutosha ziwe zimeandaliwa kwa kifaa kimoja. Muda wote wa usindikaji wa vifaa vyote haupaswi kuzidi saa 2. Baada ya sehemu 6 za tishu kuunganishwa kwenye pete zao za usaidizi, kifaa cha CTCM kilikusanywa. Chumba cha uundaji wa CTCM kimejazwa awali na 21 ml ya kati iliyo na oksijeni. Hamisha sehemu za tishu kwenye chumba cha uundaji na uondoe kwa uangalifu viputo vyovyote vya hewa kwa kutumia bomba. Sehemu ya tishu kisha huongozwa ndani ya shimo na kushinikizwa kwa upole mahali pake. Hatimaye, weka kifuniko cha elektrodi kwenye kifaa na uhamishe kifaa kwenye incubator. Kisha unganisha CTCM kwenye bomba la hewa na mfumo wa C-PACE-EM. Kiendeshaji cha nyumatiki hufunguka na vali ya hewa hufungua CTCM. Mfumo wa C-PACE-EM uliundwa ili kutoa 4 V kwa 1.2 Hz wakati wa mwendo wa biphasic kwa ms 2. Medium ilibadilishwa mara mbili kwa siku na elektrodi zilibadilishwa mara moja kwa siku ili kuepuka mkusanyiko wa grafiti kwenye elektrodi. Ikiwa ni lazima, sehemu za tishu zinaweza kuondolewa kutoka kwenye visima vyao vya uundaji ili kutoa viputo vyovyote vya hewa ambavyo vinaweza kuwa vimeanguka chini yake. Kwa hali ya matibabu ya MT, T3/Dex iliongezwa mpya kwa kila mabadiliko ya kati na 100 nM T3 na 1 μM Dex. Vifaa vya CTCM vilikuzwa kwenye incubator kwa 37°C na 5% CO2.
Ili kupata njia zilizonyooshwa za vipande vya moyo, mfumo maalum wa kamera ulitengenezwa. Kamera ya SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japani) ilitumika kwa kutumia lenzi ya Navitar Zoom 7000 18-108mm macro (Navitar, San Francisco, CA). Taswira ilifanywa kwenye joto la kawaida baada ya kubadilisha vyombo vya habari na vyombo vipya vya habari. Kamera imewekwa kwenye pembe ya 51° na video hurekodiwa kwa fremu 30 kwa sekunde. Kwanza, programu huria (MUSCLEMOTION43) ilitumika kwa kutumia Image-J kupima mwendo wa vipande vya moyo. Barakoa iliundwa kwa kutumia MATLAB (MathWorks, Natick, MA, Marekani) ili kufafanua maeneo ya kuvutia kwa kupiga vipande vya moyo ili kuepuka kelele. Barakoa zilizogawanywa kwa mikono hutumika kwa picha zote katika mfuatano wa fremu na kisha hupitishwa kwenye programu-jalizi ya MUSCLEMOTION. Muscle Motion hutumia kiwango cha wastani cha pikseli katika kila fremu kupima mwendo wake ikilinganishwa na fremu ya marejeleo. Data zilirekodiwa, kuchujwa na kutumika kupima muda wa mzunguko na kutathmini kunyoosha kwa tishu wakati wa mzunguko wa moyo. Video iliyorekodiwa ilichakatwa baada ya kutumia kichujio cha kidijitali cha awamu ya sifuri cha mpangilio wa kwanza. Ili kupima kunyoosha kwa tishu (kilele hadi kilele), uchanganuzi wa kilele hadi kilele ulifanywa ili kutofautisha kati ya vilele na mifereji katika ishara iliyorekodiwa. Zaidi ya hayo, uondoaji wa mwelekeo hufanywa kwa kutumia polinomiali ya mpangilio wa 6 ili kuondoa kuteleza kwa ishara. Msimbo wa programu ulitengenezwa katika MATLAB ili kubaini mwendo wa tishu duniani, muda wa mzunguko, muda wa kupumzika, na muda wa kubana (Msimbo wa Programu ya Nyongeza 44).
Kwa uchanganuzi wa mkazo, kwa kutumia video zile zile zilizoundwa kwa ajili ya tathmini ya kunyoosha kwa mitambo, kwanza tulifuatilia picha mbili zinazowakilisha vilele vya mwendo (sehemu za juu zaidi (za juu) na za chini zaidi (za chini) za mwendo) kulingana na programu ya MUSCLEMOTION. Kisha tukagawanya maeneo ya tishu na kutumia aina ya algoriti ya kivuli kwenye tishu zilizogawanywa (Mchoro wa Nyongeza 2a). Tishu zilizogawanywa kisha ziligawanywa katika sehemu kumi za chini, na mkazo kwenye kila uso ulihesabiwa kwa kutumia mlinganyo ufuatao: Mkazo = (Sup-Sdown)/Sdown, ambapo Sup na Sdown ni umbali wa umbo kutoka vivuli vya juu na vya chini vya kitambaa, mtawalia (Mchoro wa Nyongeza .2b).
Sehemu za moyo ziliwekwa kwenye 4% ya paraformaldehyde kwa saa 48. Tishu zilizowekwa zilikaushwa katika 10% na 20% ya sucrose kwa saa 1, kisha katika 30% ya sucrose usiku kucha. Sehemu hizo ziliwekwa kwenye kiwanja cha halijoto bora zaidi (kiwanja cha OCT) na kugandishwa polepole kwenye bafu ya barafu ya isopentane/kavu. Hifadhi vitalu vya kupachika vya OCT kwa -80 °C hadi kutenganishwa. Slaidi zilitayarishwa kama sehemu zenye unene wa 8 μm.
Ili kuondoa OCT kutoka sehemu za moyo, pasha slaidi kwenye kizuizi cha kupasha joto kwa 95 °C kwa dakika 5. Ongeza mililita 1 ya PBS kwenye kila slaidi na uanguke kwa dakika 30 kwenye halijoto ya kawaida, kisha penya sehemu hizo kwa kuweka 0.1% Triton-X katika PBS kwa dakika 15 kwenye halijoto ya kawaida. Ili kuzuia kingamwili zisizo maalum kuungana na sampuli, ongeza mililita 1 ya myeyusho wa 3% wa BSA kwenye slaidi na uanguke kwa saa 1 kwenye halijoto ya kawaida. Kisha BSA iliondolewa na slaidi zikaoshwa na PBS. Weka alama kwa kila sampuli kwa penseli. Kingamwili za msingi (zilizopunguzwa 1:200 katika 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) na troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) ziliongezwa kwa dakika 90, kisha kingamwili za pili (zilizopunguzwa 1:200 katika 1% BSA) dhidi ya panya Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), dhidi ya sungura Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) kwa dakika 90 za ziada. Zilioshwa mara 3 na PBS. Ili kutofautisha madoa yaliyolengwa kutoka kwa mandharinyuma, tulitumia kingamwili ya pili pekee kama kidhibiti. Hatimaye, madoa ya nyuklia ya DAPI yaliongezwa na slaidi ziliwekwa kwenye vectashield (Vector Laboratories) na kufungwa kwa rangi ya kucha. -x ukuzaji) na darubini ya Keyence yenye ukuzaji wa 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) katika 5 μg/ml katika PBS ilitumika kwa ajili ya kuchafua WGA na kupakwa kwenye sehemu zisizobadilika kwa dakika 30 kwenye joto la kawaida. Kisha slaidi zilioshwa na PBS na Sudan nyeusi iliongezwa kwenye kila slaidi na kuwekwa kwenye incubator kwa dakika 30. Kisha slaidi zilioshwa na PBS na vectashield embedding medium iliongezwa. Slaidi zilionyeshwa kwenye darubini ya Keyence kwa ukuzaji wa mara 40.
OCT iliondolewa kwenye sampuli kama ilivyoelezwa hapo juu. Baada ya kuondoa OCT, immerse slaidi kwenye myeyusho wa Bouin usiku kucha. Kisha slaidi zilioshwa kwa maji yaliyochemshwa kwa saa 1 na kisha kuwekwa kwenye myeyusho wa Bibrich aloe acid fuchsin kwa dakika 10. Kisha slaidi zilioshwa kwa maji yaliyochemshwa na kuwekwa kwenye myeyusho wa 5% phosphomolybdenum/5% phosphotungstic acid kwa dakika 10. Bila kusuuza, hamisha slaidi moja kwa moja kwenye myeyusho wa bluu wa anilini kwa dakika 15. Kisha slaidi zilioshwa kwa maji yaliyochemshwa na kuwekwa kwenye myeyusho wa 1% asidi asetiki kwa dakika 2. Slaidi zilikaushwa kwenye ethanoli 200 N na kuhamishiwa kwenye xylene. Slaidi zilizopakwa rangi zilionyeshwa kwa kutumia darubini ya Keyence yenye lengo la mara 10. Asilimia ya eneo la Fibrosis ilipimwa kwa kutumia programu ya Keyence Analyzer.
Kipimo cha Uwezekano wa Seli cha CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), nambari ya katalogi V13154, kulingana na itifaki ya mtengenezaji pamoja na marekebisho kadhaa. Hasa, ngumi ya upasuaji yenye kipenyo cha milimita 6 ilitumika kuhakikisha ukubwa sawa wa tishu wakati wa uchambuzi wa MTT. Tishu zilibandikwa moja moja kwenye visima vya sahani ya visima 12 iliyo na substrate ya MTT kulingana na itifaki ya mtengenezaji. Sehemu hizo huwekwa kwenye incubation kwa 37° C. kwa saa 3 na tishu hai humeng'enya substrate ya MTT ili kuunda kiwanja cha zambarau formazan. Badilisha mchanganyiko wa MTT na 1 ml DMSO na uweke kwenye incubation kwa 37°C kwa dakika 15 ili kutoa formazan ya zambarau kutoka sehemu za moyo. Sampuli zilipunguzwa 1:10 katika DMSO katika sahani za chini zenye uwazi wa visima 96 na kiwango cha rangi ya zambarau kilichopimwa kwa 570 nm kwa kutumia kisomaji cha sahani ya Cytation (BioTek). Usomaji ulirekebishwa kwa uzito wa kila kipande cha moyo.
Kifaa cha kufyonza chembe za moyo kilibadilishwa na kifaa cha kufyonza chembe chenye 1 μCi/ml [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, Marekani) kwa ajili ya jaribio la matumizi ya glukosi kama ilivyoelezwa hapo awali. Baada ya saa 4 za kufyonza, ongeza 100 µl ya kati kwenye mrija wa microcentrifuge ulio wazi wenye 100 µl ya 0.2 N HCl. Kisha mrija uliwekwa kwenye mrija wa kufyonza chembe wenye 500 μl ya dH2O ili kuyeyuka [3H]2O kwa saa 72 kwa joto la 37°C. Kisha ondoa mrija wa microcentrifuge kutoka kwenye mrija wa kufyonza chembe na ongeza 10 ml ya maji ya kufyonza chembe. Hesabu za kufyonza chembe zilifanywa kwa kutumia kichambuzi cha kufyonza chembe za kioevu cha Tri-Carb 2900TR (Kampuni ya Packard Bioscience, Meriden, CT, Marekani). Matumizi ya glukosi kisha yalihesabiwa kwa kuzingatia shughuli maalum ya glukosi ya [5-3H], usawa na usuli usiokamilika, upunguzaji wa [5-3H] hadi glukosi isiyo na lebo, na ufanisi wa kupinga uchochezi. Data hurekebishwa kwa uzito wa sehemu za moyo.
Baada ya upatanisho wa tishu katika Trizol, RNA ilitengwa kutoka sehemu za moyo kwa kutumia Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 kulingana na itifaki ya mtengenezaji. Maandalizi, mpangilio na uchambuzi wa data wa maktaba ya RNAsec yalifanywa kama ifuatavyo:
1 μg ya RNA kwa kila sampuli ilitumika kama nyenzo ya kuanzia kwa ajili ya maandalizi ya maktaba ya RNA. Maktaba za mpangilio zilitengenezwa kwa kutumia Kifaa cha Maandalizi ya Maktaba ya RNA ya NEBHext UltraTM kwa Illumina (NEB, Marekani) kufuatia mapendekezo ya mtengenezaji, na misimbo ya faharasa iliongezwa kwenye mfuatano wa sifa kwa kila sampuli. Kwa kifupi, mRNA ilisafishwa kutoka kwa RNA jumla kwa kutumia shanga za sumaku zilizounganishwa na oligonukleotidi za poly-T. Kugawanyika hufanywa kwa kutumia cations divalent kwenye joto la juu katika NEBHext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). CDNA ya kamba ya kwanza ilitengenezwa kwa kutumia primers za hexamer nasibu na transcriptase ya M-MuLV reverse (RNase H-). CDNA ya kamba ya pili kisha hutengenezwa kwa kutumia polymerase ya DNA I na RNase H. Vifuniko vilivyobaki hubadilishwa kuwa ncha butu na shughuli ya exonuklease/polymerase. Baada ya adenylation ya mwisho wa 3′ wa kipande cha DNA, Adapta ya NEBHext yenye muundo wa kitanzi cha hairpin imeunganishwa nayo ili kuiandaa kwa mseto. Kwa uteuzi wa vipande vya cDNA vyenye urefu unaopendekezwa, vipande vya maktaba vya bp 150-200 vilisafishwa kwa kutumia mfumo wa AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, Marekani). Kisha, 3 μl USER Enzyme (NEB, Marekani) yenye cDNA iliyochaguliwa kwa ukubwa iliyounganishwa na adapta ilitumika kwa dakika 15 kwa 37°C na kisha kwa dakika 5 kwa 95°C kabla ya PCR. PCR kisha ilifanywa kwa kutumia polymerase ya Phusion High-Fidelity DNA, primers za PCR za ulimwengu wote, na primers za Index (X). Hatimaye, bidhaa za PCR zilisafishwa (mfumo wa AMPure XP) na ubora wa maktaba ukapimwa kwenye mfumo wa Agilent Bioanalyzer 2100. Maktaba ya cDNA kisha ilipangwa kwa kutumia sequencer ya Novaseq. Faili za picha mbichi kutoka Illumina zilibadilishwa kuwa usomaji mbichi kwa kutumia CASAVA Base Calling. Data mbichi huhifadhiwa katika faili za umbizo la FASTQ(fq) ambazo zina mfuatano wa usomaji na sifa za msingi zinazolingana. Chagua HISAT2 ili kulinganisha usomaji wa mpangilio uliochujwa na jenomu ya marejeleo ya Sscrofa11.1. Kwa ujumla, HISAT2 inasaidia jenomu za ukubwa wowote, ikiwa ni pamoja na jenomu kubwa kuliko besi bilioni 4, na thamani chaguo-msingi zimewekwa kwa vigezo vingi. Usomaji wa uunganishaji kutoka kwa data ya RNA Seq unaweza kupangwa kwa ufanisi kwa kutumia HISAT2, mfumo wa haraka zaidi unaopatikana kwa sasa, kwa usahihi sawa au bora zaidi kuliko njia nyingine yoyote.
Wingi wa nakala huonyesha moja kwa moja kiwango cha usemi wa jeni. Viwango vya usemi wa jeni hupimwa kwa wingi wa nakala (hesabu ya mfuatano) zinazohusiana na jenomu au eksoni. Idadi ya usomaji ni sawia na viwango vya usemi wa jeni, urefu wa jeni, na kina cha mfuatano. FPKM (vipande kwa kila jozi elfu ya msingi ya nakala zilizopangwa kwa kila jozi milioni ya msingi) zilihesabiwa na thamani za P za usemi tofauti ziliamuliwa kwa kutumia kifurushi cha DESeq2. Kisha tukahesabu kiwango cha ugunduzi bandia (FDR) kwa kila thamani ya P kwa kutumia mbinu ya Benjamini-Hochberg9 kulingana na kitendakazi cha R kilichojengewa ndani "p.adjust".
RNA iliyotengwa kutoka sehemu za moyo ilibadilishwa kuwa cDNA kwa mkusanyiko wa 200 ng/μl kwa kutumia mchanganyiko wa SuperScript IV Vilo Master kutoka Thermo (Thermo, cat. no. 11756050). RT-PCR ya Kiasi ilifanywa kwa kutumia bamba la mmenyuko lenye uwazi la Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well (Thermo, cat. no. 4483319) na gundi ya macho ya microamp (Thermo, cat. no. 4311971). Mchanganyiko wa mmenyuko ulikuwa na mchanganyiko wa 5 µl Taqman Fast Advanced Master (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer na 3.5 µl H2O iliyochanganywa kwa kila kisima. Mizunguko ya kawaida ya qPCR iliendeshwa na thamani za CT zilipimwa kwa kutumia kifaa cha Applied Biosystems Quantstudio 5 cha muda halisi cha PCR (moduli ya 384-well; bidhaa # A28135). Vipuli vya kwanza vya Taqman vilinunuliwa kutoka Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) Thamani za CT za sampuli zote zilirekebishwa kwa jeni la utunzaji wa nyumba GAPDH.
Utoaji wa NT-ProBNP kwa vyombo vya habari ulipimwa kwa kutumia kifaa cha NT-ProBNP (nguruwe) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) kulingana na itifaki ya mtengenezaji. Kwa kifupi, 250 µl ya kila sampuli na kiwango kiliongezwa maradufu kwenye kila kisima. Mara tu baada ya kuongeza sampuli, ongeza 50 µl ya Kitendanishi cha Jaribio A kwenye kila kisima. Tikisa sahani kwa upole na funga kwa kutumia kifuniko. Kisha vidonge viliwekwa kwenye incubation kwa 37°C kwa saa 1. Kisha vuta mchanganyiko na osha visima mara 4 kwa kutumia 350 µl ya suluhisho la 1X la kuosha, ukiweka mchanganyiko wa kuosha kwa dakika 1-2 kila wakati. Kisha ongeza 100 µl ya Kitendanishi cha Jaribio B kwa kila kisima na funga kwa kutumia kifuniko cha sahani. Tembe ilitikiswa kwa upole na kuwekwa kwenye incubation kwa 37°C kwa dakika 30. Pumua mchanganyiko na osha visima mara 5 kwa kutumia µl 350 za mchanganyiko wa 1X wa kuosha. Ongeza µl 90 za mchanganyiko wa substrate kwenye kila kisima na uzibe bamba. Weka bamba kwenye joto la 37°C kwa dakika 10-20. Ongeza µl 50 za Mchanganyiko wa Kusimamisha kwenye kila kisima. Bamba lilipimwa mara moja kwa kutumia seti ya kisomaji bamba cha Cytation (BioTek) kwenye 450 nm.
Uchambuzi wa nguvu ulifanywa ili kuchagua ukubwa wa kikundi ambao utatoa nguvu zaidi ya 80% kugundua mabadiliko kamili ya 10% katika kigezo chenye kiwango cha hitilafu ya Aina ya I ya 5%. Uchambuzi wa nguvu ulifanywa ili kuchagua ukubwa wa kikundi ambao utatoa nguvu zaidi ya 80% kugundua mabadiliko kamili ya 10% katika kigezo chenye kiwango cha hitilafu ya Aina ya I ya 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% абраспечат частотой ошибок типа I. Uchambuzi wa nguvu ulifanywa ili kuchagua ukubwa wa vikundi ambavyo vingetoa nguvu zaidi ya 80% kugundua mabadiliko kamili ya vigezo 10% na kiwango cha hitilafu ya Aina ya I cha 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаружения 10% абеспечил 5% частоты ошибок типа I. Uchambuzi wa nguvu ulifanywa ili kuchagua ukubwa wa kikundi ambao ungetoa nguvu ya >80% kugundua mabadiliko kamili ya vigezo 10% na kiwango cha hitilafu ya aina ya I cha 5%.Sehemu za tishu zilichaguliwa bila mpangilio kabla ya jaribio. Uchambuzi wote ulikuwa bila kuzingatia hali na sampuli zilisimbuliwa tu baada ya data yote kuchambuliwa. Programu ya GraphPad Prism (San Diego, CA) ilitumika kufanya uchambuzi wote wa takwimu. Kwa takwimu zote, thamani za p zilizingatiwa kuwa muhimu kwa thamani <0.05. Kwa takwimu zote, thamani za p zilizingatiwa kuwa muhimu kwa thamani <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Kwa takwimu zote, thamani za p zilizingatiwa kuwa muhimu kwa thamani <0.05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认為是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认為是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Kwa takwimu zote, thamani za p zilizingatiwa kuwa muhimu kwa thamani <0.05.Jaribio la t la Mwanafunzi lenye mikia miwili lilifanywa kwenye data kwa kulinganisha mara 2 pekee. ANOVA ya njia moja au njia mbili ilitumika kubaini umuhimu kati ya makundi mengi. Wakati wa kufanya majaribio ya baada ya hoc, marekebisho ya Tukey yalitumika kuzingatia ulinganisho mwingi. Data ya RNAsec ina mambo maalum ya kuzingatia takwimu wakati wa kuhesabu FDR na p.adjust kama ilivyoelezwa katika sehemu ya Mbinu.
Kwa maelezo zaidi kuhusu muundo wa utafiti, tazama muhtasari wa Ripoti ya Utafiti wa Mazingira uliounganishwa na makala haya.