Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com. Używana przez Ciebie wersja przeglądarki ma ograniczoną obsługę CSS. Aby zapewnić Ci najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie z nowszej wersji przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w Internet Explorerze). W międzyczasie, aby zapewnić ciągłą obsługę, będziemy renderować witrynę bez stylów i JavaScriptu.
Istnieje potrzeba niezawodnego systemu in vitro, który mógłby dokładnie odtworzyć fizjologiczne środowisko serca na potrzeby testów leków. Ograniczona dostępność systemów hodowli tkanek ludzkiego serca doprowadziła do niedokładnych interpretacji wpływu leków na serce. W niniejszym opracowaniu opracowaliśmy model hodowli tkanek serca (CTCM), który elektromechanicznie stymuluje skrawki serca i poddaje je fizjologicznemu rozciąganiu podczas fazy skurczowej i rozkurczowej cyklu pracy serca. Po 12 dniach hodowli takie podejście częściowo poprawiło żywotność skrawków serca, ale nie zachowało w pełni ich integralności strukturalnej. Dlatego też, po badaniu przesiewowym małych cząsteczek, stwierdziliśmy, że dodanie 100 nM trójjodotyroniny (T3) i 1 μM deksametazonu (Dex) do naszego podłoża utrzymywało mikrostrukturę skrawków przez 12 dni. W połączeniu z zastosowaniem T3/Dex, system CTCM utrzymywał profile transkrypcyjne, żywotność, aktywność metaboliczną i integralność strukturalną na tym samym poziomie co świeża tkanka serca przez 12 dni. Ponadto, nadmierne rozciąganie tkanki serca w hodowli indukuje przerostową sygnalizację serca, co dostarcza dowodów na zdolność CTCM do naśladowania stanów przerostowych wywołanych przez rozciąganie serca. Podsumowując, CTCM może modelować fizjologię i patofizjologię serca w hodowli przez długi czas, umożliwiając wiarygodne badania przesiewowe leków.
Przed rozpoczęciem badań klinicznych potrzebne są niezawodne systemy in vitro, które będą w stanie dokładnie odtworzyć fizjologiczne środowisko ludzkiego serca. Takie systemy powinny naśladować zmienione rozciąganie mechaniczne, tętno i właściwości elektrofizjologiczne. Modele zwierzęce są powszechnie wykorzystywane jako platforma przesiewowa do badań fizjologii serca, jednak ich wiarygodność w odzwierciedlaniu wpływu leków na ludzkie serce jest ograniczona1,2. Ostatecznie, Idealny Eksperymentalny Model Kultury Tkanki Serca (CTCM) to model o wysokiej czułości i swoistości dla różnych interwencji terapeutycznych i farmakologicznych, dokładnie odtwarzający fizjologię i patofizjologię ludzkiego serca3. Brak takiego systemu ogranicza odkrywanie nowych metod leczenia niewydolności serca4,5 i doprowadził do tego, że kardiotoksyczność leków stała się głównym powodem wycofania ich z rynku6.
W ciągu ostatniej dekady osiem leków niekardiologicznych zostało wycofanych z użytku klinicznego, ponieważ powodują wydłużenie odstępu QT, co prowadzi do arytmii komorowych i nagłej śmierci7. W związku z tym rośnie zapotrzebowanie na wiarygodne przedkliniczne strategie badań przesiewowych w celu oceny skuteczności i toksyczności w odniesieniu do układu sercowo-naczyniowego. Niedawne zastosowanie ludzkich kardiomiocytów pochodzących z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (hiPS-CM) w badaniach przesiewowych leków i badaniach toksyczności stanowi częściowe rozwiązanie tego problemu. Jednak niedojrzałość hiPS-CM i brak wielokomórkowej złożoności tkanki serca stanowią główne ograniczenia tej metody. Najnowsze badania wykazały, że to ograniczenie można częściowo przezwyciężyć, wykorzystując wczesne hiPS-CM do tworzenia hydrożeli tkanki serca wkrótce po rozpoczęciu skurczów spontanicznych i stopniowo zwiększając stymulację elektryczną z czasem. Jednak te mikrotkanki hiPS-CM nie mają dojrzałych właściwości elektrofizjologicznych i kurczliwych dorosłego mięśnia sercowego. Ponadto ludzka tkanka sercowa ma bardziej złożoną strukturę, składającą się z heterogenicznej mieszaniny różnych typów komórek, w tym komórek śródbłonka, neuronów i fibroblastów podścieliska, połączonych specyficznymi zestawami białek macierzy zewnątrzkomórkowej. Ta heterogeniczność populacji komórek innych niż kardiomiocyty11,12,13 w sercu dorosłego ssaka stanowi główną przeszkodę w modelowaniu tkanki sercowej z wykorzystaniem pojedynczych typów komórek. Te istotne ograniczenia podkreślają wagę opracowania metod hodowli nieuszkodzonej tkanki mięśnia sercowego w warunkach fizjologicznych i patologicznych.
Hodowlane cienkie (300 µm) skrawki ludzkiego serca okazały się obiecującym modelem nienaruszonego ludzkiego mięśnia sercowego. Metoda ta zapewnia dostęp do kompletnego, trójwymiarowego układu wielokomórkowego, podobnego do ludzkiej tkanki serca. Jednak do 2019 roku wykorzystanie hodowanych skrawków serca było ograniczone przez krótki (24 godziny) czas przeżycia hodowli. Wynika to z szeregu czynników, w tym braku rozciągliwości fizyczno-mechanicznej, granicy faz ciecz-powietrze oraz stosowania prostych mediów, które nie odpowiadają potrzebom tkanki serca. W 2019 roku kilka grup badawczych wykazało, że włączenie czynników mechanicznych do systemów hodowli tkanek serca może wydłużyć czas życia hodowli, poprawić ekspresję serca i naśladować patologię serca. Dwa eleganckie badania17 i 18 pokazują, że jednoosiowe obciążenie mechaniczne ma pozytywny wpływ na fenotyp serca podczas hodowli. Jednak w badaniach tych nie wykorzystano dynamicznego, trójwymiarowego obciążenia fizyczno-mechanicznego cyklu pracy serca, ponieważ skrawki serca obciążano albo izometrycznymi siłami rozciągającymi17, albo liniowym obciążeniem auksotonicznym18. Te metody rozciągania tkanek skutkowały supresją wielu genów sercowych lub nadekspresją genów związanych z nieprawidłowymi reakcjami na rozciąganie. Warto zauważyć, że Pitoulis i wsp. [19] opracowali dynamiczną kąpiel hodowlaną na plasterkach serca do rekonstrukcji cyklu pracy serca z wykorzystaniem sprzężenia zwrotnego przetwornika siły i napędów naprężeniowych. Chociaż system ten pozwala na dokładniejsze modelowanie cyklu pracy serca in vitro, złożoność i niska przepustowość metody ograniczają jego zastosowanie. Nasze laboratorium opracowało niedawno uproszczony system hodowli wykorzystujący stymulację elektryczną i zoptymalizowane medium, aby utrzymać żywotność skrawków tkanki serca świńskiego i ludzkiego przez okres do 6 dni [20,21].
W niniejszym artykule opisujemy model hodowli tkankowej serca (CTCM) wykorzystujący fragmenty serca świni, które zawierają sygnały humoralne, aby odtworzyć trójwymiarową fizjologię serca i patofizjologiczne rozdęcie podczas cyklu pracy serca. Model CTCM może zwiększyć dokładność przedklinicznego przewidywania leków do poziomu dotąd nieosiągalnego, zapewniając ekonomiczny, średnioprzepustowy system kardiologiczny, który naśladuje fizjologię/patofizjologię serca ssaków na potrzeby przedklinicznych testów leków.
Hemodynamiczne sygnały mechaniczne odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu funkcji kardiomiocytów in vitro22,23,24. W niniejszym artykule opracowaliśmy CTCM (ryc. 1a), który może naśladować środowisko serca dorosłego poprzez indukowanie stymulacji elektrycznej i mechanicznej o częstotliwości fizjologicznej (1,2 Hz, 72 uderzenia na minutę). Aby uniknąć nadmiernego rozciągania tkanek podczas rozkurczu, użyto drukarki 3D w celu zwiększenia rozmiaru tkanki o 25% (ryc. 1b). Stymulację elektryczną indukowaną przez system C-PACE zaprogramowano tak, aby rozpoczynała się 100 ms przed skurczem, za pomocą systemu akwizycji danych, aby w pełni odtworzyć cykl pracy serca. System hodowli tkanek wykorzystuje programowalny siłownik pneumatyczny (LB Engineering, Niemcy) do cyklicznego rozszerzania elastycznej membrany silikonowej, powodując rozszerzanie się warstw serca w górnej komorze. System został podłączony do zewnętrznego przewodu powietrza za pomocą przetwornika ciśnienia, co umożliwiło dokładną regulację ciśnienia (± 1 mmHg) i czasu (± 1 ms) (rys. 1c).
a Przymocuj skrawek tkanki do 7 mm pierścienia podporowego, pokazanego na niebiesko, wewnątrz komory hodowlanej urządzenia. Komora hodowlana jest oddzielona od komory powietrznej cienką, elastyczną membraną silikonową. Umieść uszczelkę między każdą komorą, aby zapobiec wyciekom. Pokrywa urządzenia zawiera elektrody grafitowe, które zapewniają stymulację elektryczną. b Schematyczne przedstawienie dużego urządzenia tkankowego, pierścienia prowadzącego i pierścienia podporowego. Skrawki tkanki (brązowe) umieszcza się na powiększonym urządzeniu z pierścieniem prowadzącym umieszczonym w rowku na zewnętrznej krawędzi urządzenia. Używając prowadnicy, ostrożnie umieść pierścień podporowy pokryty klejem akrylowym do tkanek na skrawku tkanki serca. c Wykres przedstawiający czas stymulacji elektrycznej w funkcji ciśnienia w komorze powietrznej sterowanego przez programowalny siłownik pneumatyczny (PPD). Urządzenie do akwizycji danych zostało użyte do synchronizacji stymulacji elektrycznej za pomocą czujników ciśnienia. Gdy ciśnienie w komorze hodowlanej osiągnie zadany próg, sygnał impulsowy jest wysyłany do C-PACE-EM w celu uruchomienia stymulacji elektrycznej. d Obraz czterech CTCM umieszczonych na półce inkubatora. Cztery urządzenia są podłączone do jednego PPD za pomocą obwodu pneumatycznego, a czujniki ciśnienia są wprowadzane do zaworu hemostatycznego w celu monitorowania ciśnienia w obwodzie pneumatycznym. Każde urządzenie zawiera sześć wycinków tkanki.
Używając pojedynczego siłownika pneumatycznego, byliśmy w stanie sterować 4 urządzeniami CTCM, z których każde mogło pomieścić 6 skrawków tkanki (rys. 1d). W CTCM ciśnienie powietrza w komorze powietrznej jest przekształcane w ciśnienie synchroniczne w komorze płynowej i indukuje fizjologiczne rozszerzenie wycinka serca (rysunek 2a i film uzupełniający 1). Ocena rozciągnięcia tkanki przy ciśnieniu 80 mm Hg. Art. pokazał rozciągnięcie skrawków tkanki o 25% (rys. 2b). Wykazano, że to procentowe rozciągnięcie odpowiada fizjologicznej długości sarkomeru wynoszącej 2,2–2,3 µm dla normalnej kurczliwości przekroju serca17,19,25. Ruch tkanki oceniano przy użyciu niestandardowych ustawień kamery (rysunek uzupełniający 1). Amplituda i prędkość ruchu tkanki (rys. 2c, d) odpowiadały rozciągnięciu podczas cyklu pracy serca oraz czasowi skurczu i rozkurczu (rys. 2b). Rozciągnięcie i prędkość tkanki serca podczas skurczu i rozkurczu pozostawały stałe przez 12 dni w hodowli (ryc. 2f). Aby ocenić wpływ stymulacji elektrycznej na kurczliwość podczas hodowli, opracowaliśmy metodę określania aktywnej deformacji z wykorzystaniem algorytmu cieniowania (rys. uzupełniające 2a, b) i byliśmy w stanie odróżnić deformacje ze stymulacją elektryczną od deformacji bez niej. Ten sam fragment serca (ryc. 2f). W ruchomym obszarze nacięcia (R6-9) napięcie podczas stymulacji elektrycznej było o 20% wyższe niż w przypadku braku stymulacji elektrycznej, co wskazuje na udział stymulacji elektrycznej w funkcji skurczowej.
Reprezentatywne ślady ciśnienia w komorze powietrznej, ciśnienia w komorze z płynem i pomiarów ruchu tkanek potwierdzają, że ciśnienie w komorze zmienia ciśnienie w komorze z płynem, powodując odpowiedni ruch wycinka tkanki. b Reprezentatywne ślady procentowego rozciągnięcia (niebieskie) przekrojów tkanki odpowiadające procentowemu rozciągnięciu (pomarańczowe). c Zmierzony ruch wycinka serca jest zgodny ze zmierzoną prędkością ruchu. (d) Reprezentatywne trajektorie ruchu cyklicznego (niebieska linia) i prędkości (pomarańczowa linia przerywana) w wycinku serca. e Kwantyfikacja czasu cyklu (n = 19 wycinków na grupę, od różnych świń), czasu skurczu (n = 19 wycinków na grupę), czasu relaksacji (n = 19 wycinków na grupę, od różnych świń), ruchu tkanek (n = 25). wycinków)/grupę od różnych świń), szczytowej prędkości skurczowej (n = 24 (D0), 25 (D12) wycinków/grupę od różnych świń) i szczytowej szybkości relaksacji (n = 24 (D0), 25 (D12) wycinków/grupę od różnych świń). Dwustronny test t-Studenta nie wykazał istotnej różnicy w żadnym parametrze. f Reprezentatywne ślady analizy odkształceń w skrawkach tkanek ze stymulacją elektryczną (czerwony) i bez niej (niebieski), dziesięć regionalnych obszarów skrawków tkanek z tego samego skrawku. Dolne panele przedstawiają kwantyfikację procentowej różnicy odkształceń w skrawkach tkanek ze stymulacją elektryczną i bez niej w dziesięciu obszarach z różnych skrawków. (n = 8 plasterków/grupa od różnych świń, wykonano dwustronny test t-Studenta; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 plasterków/grupa od różnych świń, wykonano dwustronny test t-Studenta; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 sekcji/grupa od różnych świń, dwustronny test t-Studenta; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 sekcji/grupa, od różnych świń, dwustronny test t-Studenta; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Słupki błędów przedstawiają średnią ± odchylenie standardowe.
W naszym poprzednim statycznym biomimetycznym systemie hodowli plastrów serca [20, 21] utrzymywaliśmy żywotność, funkcję i integralność strukturalną plastrów serca przez 6 dni, stosując stymulację elektryczną i optymalizując skład pożywki. Jednak po 10 dniach wartości te gwałtownie spadły. Będziemy odnosić się do skrawków hodowanych w naszym poprzednim statycznym biomimetycznym systemie hodowli 20, 21 w warunkach kontrolnych (Ctrl) i będziemy używać naszego wcześniej zoptymalizowanego pożywki jako warunków MC oraz hodowli w warunkach jednoczesnej stymulacji mechanicznej i elektrycznej (CTCM). zwanej . Najpierw ustaliliśmy, że stymulacja mechaniczna bez stymulacji elektrycznej była niewystarczająca do utrzymania żywotności tkanek przez 6 dni (rys. uzupełniający 3a, b). Co ciekawe, po wprowadzeniu stymulacji fizjomechanicznej i elektrycznej za pomocą STCM, żywotność 12-dniowych skrawków serca pozostała taka sama jak w świeżych skrawkach serca w warunkach MS, ale nie w warunkach Ctrl, jak wykazała analiza MTT (rys. 1). 3a). Sugeruje to, że mechaniczna stymulacja i symulacja cyklu pracy serca mogą utrzymać żywotność skrawków tkanek dwukrotnie dłużej niż w naszym poprzednim systemie hodowli statycznej. Jednakże ocena integralności strukturalnej skrawków tkanek poprzez immunoznakowanie troponiny T i koneksyny 43 serca wykazała, że ​​ekspresja koneksyny 43 była istotnie wyższa w tkankach MC w dniu 12 niż w tkankach kontrolnych w tym samym dniu. Jednakże, jednolita ekspresja koneksyny 43 i formowanie się dysku Z nie zostały w pełni utrzymane (ryc. 3b). Wykorzystujemy platformę sztucznej inteligencji (AI) do ilościowego określenia integralności strukturalnej tkanek26, opartą na obrazowaniu metodę głębokiego uczenia się opartą na barwieniu troponiną T i koneksynami43, aby automatycznie określić ilościowo integralność strukturalną i fluorescencję skrawków serca pod kątem siły lokalizacji. Ta metoda wykorzystuje konwolucyjną sieć neuronową (CNN) i platformę głębokiego uczenia się do wiarygodnego ilościowego określenia integralności strukturalnej tkanki serca w sposób zautomatyzowany i obiektywny, zgodnie z opisem w publikacji. 26. Tkanka mięśnia sercowego (MC) wykazywała lepsze podobieństwo strukturalne w dniu 0 w porównaniu ze statycznymi skrawkami kontrolnymi. Ponadto barwienie trichromem Massona wykazało istotnie niższy odsetek zwłóknienia w warunkach MS w porównaniu z warunkami kontrolnymi w 12. dniu hodowli (ryc. 3c). Chociaż CTCM zwiększyło żywotność skrawków tkanki serca w dniu 12. do poziomu zbliżonego do świeżej tkanki serca, nie poprawiło to istotnie integralności strukturalnej skrawków serca.
Wykres słupkowy przedstawia ilościową ocenę żywotności MTT świeżych plastrów serca (D0) lub hodowli plastrów serca przez 12 dni w hodowli statycznej (D12 Ctrl) lub w CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) plastrów/grupę od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; ####p < 0,0001 w porównaniu do D0 i **p < 0,01 w porównaniu do D12 Ctrl). Wykres słupkowy przedstawia ilościowe określenie żywotności MTT świeżych plastrów serca (D0) lub hodowli plastrów serca przez 12 dni w hodowli statycznej (D12 Ctrl) lub w CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) plastrów/grupę od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; ####p < 0,0001 w porównaniu do D0 i **p < 0,01 w porównaniu do D12 Ctrl).histogram przedstawia ilościową ocenę żywotności świeżych skrawków serca MTT (D0) lub hodowli skrawków serca przez 12 dni w hodowli statycznej (kontrola D12) lub CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrola D12). )), 12 (D12 MC) skrawków/grupę od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA;####p < 0,0001 dla D0 i **p < 0,01 dla D12 Ctrl). ####p < 0,0001 w porównaniu do D0 i **p < 0,01 w porównaniu do D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl相比，**p。)histogram przedstawiający ilościową ocenę żywotności MTT w świeżych przekrojach serca (D0) lub przekrojach serca hodowanych przez 12 dni w hodowli statycznej (kontrola D12) lub CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrola D12)), 12 (D12 MC) przekrojów/grupę od różnych świń, jednokierunkowy test ANOVA;####p < 0,0001 w przypadku D0, **p < 0,01 w przypadku D12 Ctrl). ####p < 0,0001 w porównaniu do D0, **p < 0,01 w porównaniu do D12 Ctrl).b Troponina-T (zielona), koneksyna 43 (czerwona) i DAPI (niebieska) w świeżo wyizolowanych przekrojach serca (D0) lub przekrojach serca hodowanych w warunkach statycznych (Ctrl) lub warunkach CTCM (MC) przez 12 dni) na reprezentatywnych obrazach immunofluorescencji (skala próby pustej = 100 µm). Kwantyfikacja integralności strukturalnej tkanki serca z wykorzystaniem sztucznej inteligencji (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) plasterków/grupę, każdy z innej świni, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; ####p < 0,0001 w porównaniu do D0 i ****p < 0,0001 w porównaniu do D12 Ctrl). Kwantyfikacja integralności strukturalnej tkanki serca z wykorzystaniem sztucznej inteligencji (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) plasterków/grupę, każdy od innej świni, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; ####p < 0,0001 w porównaniu z D0 i ****p < 0,0001 w porównaniu z D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный test ANOVA; ####p < 0,0001 za zmianą w D0 i ****p < 0,0001 za zmianą za D12 Ctrl). Kwantyfikacja integralności strukturalnej tkanki serca przy użyciu sztucznej inteligencji (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skrawków/grup od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; ####p < 0,0001 w porównaniu z D0 i ****p < 0,0001 w porównaniu z D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性(n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) wycinków/grupę każdej innej świni, jednokierunkowy test ANOVA;####p < 0,0001 与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性(n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) wycinków/grupę każdej różnej świni, jednoczynnikowy test ANOVA;####p < 0,0001与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний test ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 za pomocą D12 Ctrl). Sztuczna inteligencja służąca do ilościowego określenia integralności strukturalnej tkanki serca (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skrawków/grupę, każda od różnych świń, jednokierunkowy test ANOVA; ####p<0,0001 w porównaniu z D0. Dla porównania ****p <0,0001 w porównaniu z D12 Ctrl). c Obrazy reprezentatywne (po lewej) i kwantyfikacja (po prawej) dla plastrów serca barwionych trichromem Massona (skala pusta = 500 µm) (n = 10 plastrów/grupę, każdy z innej świni, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; ####p < 0,0001 w porównaniu do D0 i ***p < 0,001 w porównaniu do D12 Ctrl). c Obrazy reprezentatywne (po lewej) i kwantyfikacja (po prawej) dla plastrów serca barwionych trichromem Massona (skala pusta = 500 µm) (n = 10 plastrów/grupę, każdy od innej świni, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; #### p < 0,0001 w porównaniu do D0 i ***p < 0,001 w porównaniu do D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 сравнению с D0 i ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Obrazy reprezentatywne (po lewej) i kwantyfikacja (po prawej) przekrojów serca barwionych trichromem Massona (skala niepowlekana = 500 µm) (n = 10 przekrojów/grupę od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; #### p < 0,0001 w porównaniu z D0 i ***p < 0,001 w porównaniu z D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像(左)和量化(右)（裸尺度= 500 µm）(n = 10个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比). C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 w stosunku do D0, ***p < 0,001 w stosunku do D12 Ctrl). c Obrazy reprezentatywne (po lewej) i ilościowe oznaczenie (po prawej) przekrojów serca barwionych trichromem Massona (ślepa próba = 500 µm) (n = 10 przekrojów/grupę, każdy od innej świni, testowane metodą jednokierunkowej analizy wariancji ;### # p < 0,0001 w porównaniu z D0, ***p < 0,001 w porównaniu z D12 Ctrl).Słupki błędów przedstawiają średnią ± odchylenie standardowe.
Postawiliśmy hipotezę, że dodanie małych cząsteczek do pożywki hodowlanej może poprawić integralność kardiomiocytów i ograniczyć rozwój włóknienia podczas hodowli CTCM. Dlatego też, ze względu na niewielką liczbę czynników zakłócających, przeprowadziliśmy badania przesiewowe w kierunku małych cząsteczek, wykorzystując nasze statyczne hodowle kontrolne20,21. Do badań wybrano deksametazon (Dex), trójjodotyroninę (T3) i SB431542 (SB). Te małe cząsteczki były wcześniej stosowane w hodowlach hiPSC-CM w celu indukcji dojrzewania kardiomiocytów poprzez zwiększenie długości sarkomerów, kanalików T i szybkości przewodzenia. Ponadto wiadomo, że zarówno Dex (glikokortykoid), jak i SB hamują stan zapalny29,30. Dlatego też sprawdziliśmy, czy dodanie jednej lub kombinacji tych małych cząsteczek poprawi integralność strukturalną skrawków serca. Do wstępnego badania przesiewowego dawkę każdego związku dobrano na podstawie stężeń powszechnie stosowanych w modelach hodowli komórkowych (1 μM Dex27, 100 nM T327 i 2,5 μM SB31). Po 12 dniach hodowli połączenie T3 i Dex zapewniło optymalną integralność strukturalną kardiomiocytów i minimalny przerost tkanki włóknistej (rysunki uzupełniające 4 i 5). Ponadto, zastosowanie podwojonych lub podwojonych stężeń T3 i Dex skutkowało szkodliwymi efektami w porównaniu ze stężeniami prawidłowymi (rysunki uzupełniające 6a, b).
Po wstępnym przesiewie przeprowadziliśmy bezpośrednie porównanie 4 warunków hodowli (Rysunek 4a): Ctrl: skrawki serca hodowane w opisanej wcześniej hodowli statycznej przy użyciu naszego zoptymalizowanego podłoża; 20.21 TD: T3 i Ctrl s Dodano Dex w środę; MC: skrawki serca hodowane w CTCM przy użyciu naszego wcześniej zoptymalizowanego podłoża; i MT: CTCM z T3 i Dex dodanymi do podłoża. Po 12 dniach hodowli żywotność tkanek MS i MT pozostała taka sama jak w świeżych tkankach ocenianych za pomocą testu MTT (Rysunek 4b). Co ciekawe, dodanie T3 i Dex do kultur transwell (TD) nie spowodowało znaczącej poprawy żywotności w porównaniu z warunkami Ctrl, co wskazuje na ważną rolę stymulacji mechanicznej w utrzymaniu żywotności skrawków serca.
Schemat eksperymentu przedstawiający cztery warunki hodowli stosowane do oceny efektów stymulacji mechanicznej i suplementacji T3/Dex na podłożu przez 12 dni. b Wykres słupkowy przedstawia ilościową ocenę żywotności 12 dni po hodowli we wszystkich 4 warunkach hodowli (Ctrl, TD, MC i MT) w porównaniu do świeżych plasterków serca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), 12 (D12 MC) plasterków/grupę od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 w porównaniu do D0 i **p < 0,01 w porównaniu do D12 Ctrl). b Wykres słupkowy przedstawia ilościową ocenę żywotności 12 dni po hodowli we wszystkich 4 warunkach hodowli (Ctrl, TD, MC i MT) w porównaniu do świeżych plasterków serca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), 12 (D12 MC) plasterków/grupę od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 w porównaniu do D0 i **p < 0,01 w porównaniu do D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 dni после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний test ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 w przypadku D0 i **p < 0,01 w przypadku D12 Ctrl). b Wykres słupkowy przedstawia ilościową ocenę żywotności po 12 dniach od hodowli we wszystkich 4 warunkach hodowli (kontrola, TD, MC i MT) w porównaniu do świeżych skrawków serca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), 12 (D12 MC) skrawków/grupę od różnych świń, jednokierunkowy test ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 w porównaniu do D0 i **p < 0,01 w porównaniu do D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0,0001,###p < 0,001 与D0相比，**p < 0,01 与D12 控制).b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC i MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 w stosunku do D0, **p <0,01 w stosunku do partnera D12). b Histogram przedstawiający wszystkie 4 warunki hodowli (kontrola, TD, MC i MT) w porównaniu do świeżych przekrojów serca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), z różnych świń, 12 (D12 MC) przekrojów/grupę, jednokierunkowy test ANOVA; ####p<0,0001, ###p<0,001 w porównaniu z D0, **p<0,01 w porównaniu z kontrolą D12). c Wykres słupkowy przedstawia ilościowe określenie przepływu glukozy 12 dni po hodowli we wszystkich 4 warunkach hodowli (Ctrl, TD, MC i MT) w porównaniu do świeżych plasterków serca (D0) (n = 6 plasterków/grupa od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; ###p < 0,001 w porównaniu do D0 i ***p < 0,001 w porównaniu do D12 Ctrl). c Wykres słupkowy przedstawia ilościowe określenie przepływu glukozy 12 dni po hodowli we wszystkich 4 warunkach hodowli (Ctrl, TD, MC i MT) w porównaniu do świeżych plasterków serca (D0) (n = 6 plasterków/grupa od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; ###p < 0,001 w porównaniu do D0 i ***p < 0,001 w porównaniu do D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 dni после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, односторонний Выполняется test ANOVA; ###p < 0,001 za zmianą w D0 i ***p < 0,001 za zmianą za D12 Ctrl). c Histogram przedstawia ilościowe określenie przepływu glukozy 12 dni po hodowli we wszystkich 4 warunkach hodowli (kontrola, TD, MC i MT) w porównaniu do świeżych przekrojów serca (D0) (n = 6 przekrojów/grupa od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; ###p < 0,001 w porównaniu do D0 i ***p < 0,001 w porównaniu do D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件(Ctrl, TD, MC 和MT) 与新鲜心脏切片(D0) 相比,培养后12天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （(ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 ，培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 猪Wyświetl ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 dni после культивирования для всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены testy ANOVA; ###p < 0,001 w stosunku do D0, ***p < 0,001 w stosunku do D12 (kontrоль). c Histogram przedstawiający ilościowe określenie przepływu glukozy 12 dni po hodowli dla wszystkich 4 warunków hodowli (kontrola, TD, MC i MT) w porównaniu do świeżych przekrojów serca (D0) (n = 6 przekrojów/grupa, od różnych świń, jednostronne). Przeprowadzono testy ANOVA, ###p < 0,001 w porównaniu do D0, ***p < 0,001 w porównaniu do D12 (kontrola).d Wykresy analizy szczepów dla świeżej (niebieskiej), 12. dnia MC (zielonej) i 12. dnia MT (czerwonej) tkanki w dziesięciu punktach regionalnych skrawków tkankowych (n = 4 plasterki/grupę, jednokierunkowy test ANOVA; nie stwierdzono istotnych różnic między grupami). e Wykres wulkanu przedstawiający różnicowo ekspresję genów w świeżych skrawkach serca (D0) w porównaniu z skrawkami serca hodowanymi w warunkach statycznych (Ctrl) lub w warunkach MT (MT) przez 10–12 dni. f Mapa cieplna genów sarkomerów dla skrawków serca hodowanych w każdych warunkach hodowli. Słupki błędów przedstawiają średnią ± odchylenie standardowe.
Metaboliczna zależność od przejścia z utleniania kwasów tłuszczowych do glikolizy jest cechą charakterystyczną dedyferencjacji kardiomiocytów. Niedojrzałe kardiomiocyty wykorzystują glukozę głównie do produkcji ATP i mają hipoplastyczne mitochondria z niewielką liczbą grzebieni5,32. Analizy wykorzystania glukozy wykazały, że w warunkach MC i MT, wykorzystanie glukozy było podobne do tego w tkankach dnia 0 (ryc. 4c). Jednakże próbki kontrolne (CT) wykazały istotny wzrost wykorzystania glukozy w porównaniu ze świeżą tkanką. Wskazuje to, że połączenie CTCM i T3/Dex poprawia żywotność tkanek i zachowuje fenotyp metaboliczny 12-dniowych skrawków serca w hodowli. Ponadto analiza odkształceń wykazała, że ​​poziomy odkształceń pozostały takie same jak w świeżej tkance serca przez 12 dni w warunkach MT i MS (ryc. 4d).
Aby przeanalizować ogólny wpływ CTCM i T3/Dex na globalny obraz transkrypcyjny tkanki plastra serca, przeprowadziliśmy sekwencjonowanie RNA na plastrach serca pochodzących ze wszystkich czterech różnych warunków hodowli (Dane uzupełniające 1). Co ciekawe, skrawki MT wykazały wysokie podobieństwo transkrypcyjne do świeżej tkanki serca, z różnicową ekspresją tylko 16 spośród 13 642 genów. Jednakże, jak wykazaliśmy wcześniej, w plastrach Ctrl po 10–12 dniach hodowli stwierdzono różnicową ekspresję 1229 genów (Rys. 4e). Dane te zostały potwierdzone przez qRT-PCR genów serca i fibroblastów (Rys. uzupełniające 7a-c). Co ciekawe, w skrawkach Ctrl zaobserwowano obniżenie ekspresji genów serca i cyklu komórkowego oraz aktywację programów genów zapalnych. Dane te sugerują, że dedyferencjacja, która normalnie zachodzi po długotrwałej hodowli, jest całkowicie osłabiona w warunkach MT (Rys. uzupełniające 8a,b). Dokładne badanie genów sarkomerów wykazało, że geny kodujące sarkomer (ryc. 4f) i kanał jonowy (ryc. 9 w materiale uzupełniającym) są zachowane tylko w warunkach MT, co chroni je przed supresją w warunkach Ctrl, TD i MC. Dane te dowodzą, że dzięki połączeniu stymulacji mechanicznej i humoralnej (T3/Dex) transkryptom wycinka serca może pozostać podobny do świeżych wycinków serca po 12 dniach hodowli.
Te wyniki transkrypcyjne potwierdza fakt, że integralność strukturalna kardiomiocytów w skrawkach serca jest najlepiej zachowana w warunkach MT przez 12 dni, co potwierdza nienaruszona i zlokalizowana koneksyna 43 (ryc. 5a). Ponadto, włóknienie w skrawkach serca w warunkach MT było istotnie zmniejszone w porównaniu z Ctrl i podobne do świeżych skrawków serca (ryc. 5b). Dane te dowodzą, że połączenie stymulacji mechanicznej i terapii T3/Dex skutecznie zachowuje strukturę serca w skrawkach serca w hodowli.
a Typowe obrazy immunofluorescencji troponiny T (zielona), koneksyny 43 (czerwona) i DAPI (niebieska) w świeżo wyizolowanych przekrojach serca (D0) lub hodowanych przez 12 dni we wszystkich czterech warunkach hodowli przekrojów serca (skala = 100 µm). ). Kwantyfikacja integralności strukturalnej tkanki serca z wykorzystaniem sztucznej inteligencji (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) plasterków/grupę od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; ####p < 0,0001 w porównaniu do D0 i *p < 0,05 lub ****p < 0,0001 w porównaniu do D12 Ctrl). Kwantyfikacja integralności strukturalnej tkanki serca z wykorzystaniem sztucznej inteligencji (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) plasterków/grupę od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; #### p < 0,0001 w porównaniu do D0 i *p < 0,05 lub ****p < 0,0001 w porównaniu do D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный test ANOVA; #### p < 0,0001 za zmianą w D0 i *p < 0,05 lub ****p < 0,0001 za zmianą za D12 Ctrl). Kwantyfikacja integralności strukturalnej tkanki serca z wykorzystaniem sztucznej inteligencji (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) skrawków/grupę od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; #### p < 0,0001 w porównaniu z D0 i *p < 0,05 lub ****p < 0,0001 w porównaniu z D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性(n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化,进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或**p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组)人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,0001 与D12 Sterowanie 相比).Kwantyfikacja integralności strukturalnej tkanki serca przy użyciu sztucznej inteligencji u różnych świń (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) przekrojów/grupę) przy użyciu jednokierunkowego testu ANOVA;#### p < 0,0001 za zmianą w D0 i *p < 0,05 lub ****p < 0,0001 za zmianą za D12 Ctrl). #### p < 0,0001 w porównaniu do D0 i *p < 0,05 lub ****p < 0,0001 w porównaniu do D12 Ctrl). b Obrazy reprezentatywne i kwantyfikacja plastrów serca barwionych trichromem Massona (skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) plastrów/grupę od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; ####p < 0,0001 w porównaniu z D0 i ***p < 0,001 lub ****p < 0,0001 w porównaniu z D12 Ctrl). b Obrazy reprezentatywne i kwantyfikacja plastrów serca barwionych trichromem Massona (skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) plastrów/grupę od różnych świń, wykonano jednokierunkowy test ANOVA; ####p < 0,0001 w porównaniu z D0 i ***p < 0,001 lub ****p < 0,0001 w porównaniu z D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний test ANOVA; ####p < 0,0001 dla D0 i ***p < 0,001 lub ****p < 0,0001 za pomocą D12 Ctrl). b Obrazy reprezentatywne i kwantyfikacja przekrojów serca barwionych trichromem Massona (skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) przekrojów/grupę od różnych świń, wykonano jednokierunkową analizę wariancji; ####p < 0,0001 w porównaniu z D0 i ***p < 0,001 lub ****p < 0,0001 w porównaniu z D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化 (比例尺= 500 µm) (n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0相比,***str < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 za zmianą w D0, ***p < 0,001 lub ****p < 0,0001 za zmianą za D12 Ctrl). b Obrazy reprezentatywne i kwantyfikacja przekrojów serca barwionych trichromem Massona (skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) przekrojów od różnych świń/grup, jedna metoda ANOVA; ####p < 0,0001 w porównaniu z D0, ***p < 0,001 lub ****p < 0,0001 w porównaniu z D12 Ctrl).Słupki błędów przedstawiają średnią ± odchylenie standardowe.
Na koniec, zdolność CTCM do naśladowania przerostu serca została oceniona poprzez zwiększenie rozciągnięcia tkanki serca. W CTCM szczytowe ciśnienie w komorze powietrznej wzrosło z 80 mmHg do 80 mmHg. Art. (normalne rozciągnięcie) do 140 mmHg Art. (Rys. 6a). Odpowiada to 32% wzrostowi rozciągnięcia (Rys. 6b), co zostało wcześniej pokazane jako odpowiedni procent rozciągnięcia wymagany, aby przekroje serca osiągnęły długość sarkomeru podobną do obserwowanej w przeroście. Rozciągnięcie i prędkość tkanki serca podczas skurczu i rozkurczu pozostawały stałe przez sześć dni hodowli (Rys. 6c). Tkanka serca z warunków MT była poddawana normalnemu rozciągnięciu (MT (Normalne)) lub warunkom nadmiernego rozciągnięcia (MT (OS)) przez sześć dni. Już po czterech dniach hodowli, biomarker przerostu NT-ProBNP był istotnie podwyższony w podłożu w warunkach MT (OS) w porównaniu do warunków MT (normalne) (Rys. 7a). Ponadto, po sześciu dniach hodowli, rozmiar komórek w MT (OS) (ryc. 7b) znacząco wzrósł w porównaniu z przekrojami serca MT (prawidłowego). Co więcej, translokacja jądrowa NFATC4 była znacząco zwiększona w tkankach nadmiernie rozciągniętych (ryc. 7c). Wyniki te wskazują na postępujący rozwój patologicznej przebudowy po nadmiernym rozciągnięciu i potwierdzają hipotezę, że urządzenie CTCM może być wykorzystane jako platforma do badania sygnalizacji przerostu serca indukowanego rozciągnięciem.
Typowe ślady ciśnienia w komorze powietrznej, ciśnienia w komorze z płynem i pomiarów ruchu tkanek potwierdzają, że ciśnienie w komorze zmienia ciśnienie w komorze z płynem, powodując odpowiedni ruch wycinka tkanki. b Typowe krzywe rozciągnięcia procentowego i szybkości rozciągania dla normalnie rozciągniętych (pomarańczowe) i nadmiernie rozciągniętych (niebieskie) wycinków tkanki. c Wykres słupkowy przedstawiający czas cyklu (n = 19 wycinków na grupę, od różnych świń), czas skurczu (n = 18-19 wycinków na grupę, od różnych świń), czas relaksacji (n = 19 wycinków na grupę, od różnych świń)), amplitudę ruchu tkanki (n = 14 wycinków/grupę, od różnych świń), szczytową prędkość skurczową (n = 14 wycinków/grupę, od różnych świń) i szczytową szybkość relaksacji (n = 14 (D0), 15 (D6)) wycinków/grup od różnych świń), dwustronny test t-Studenta nie wykazał istotnej różnicy w żadnym parametrze, co wskazuje, że parametry te pozostały stałe przez 6 dni hodowli z przepięciem. Słupki błędów przedstawiają średnią ± odchylenie standardowe.
a Wykres słupkowy oznaczający stężenie NT-ProBNP w podłożu hodowlanym z plastrów serca hodowanych w warunkach normalnego rozciągnięcia MT (Norm) lub nadmiernego rozciągnięcia (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm i D4 MTOS) plastry/grupa od różnych świń; wykonano dwukierunkową analizę wariancji; **p < 0,01 w porównaniu do normalnego rozciągnięcia). a Wykres słupkowy oznaczający stężenie NT-ProBNP w podłożu hodowlanym z plastrów serca hodowanych w warunkach normalnego rozciągnięcia MT (Norm) lub nadmiernego rozciągnięcia (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm i D4 MTOS) plastry/grupa od różnych świń; wykonano dwukierunkową analizę wariancji; **p < 0,01 w porównaniu do normalnego rozciągnięcia).Histogram ilościowy stężenia NT-ProBNP w podłożu hodowlanym z plastrów serca hodowanych w warunkach normalnego rozciągnięcia MT (norm) lub nadmiernego rozciągnięcia (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm i D4).MTOS) plastrów/grupy pochodzących od różnych świń, przeprowadzono dwuczynnikową analizę wariancji;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 w porównaniu do normalnego rozciągania). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化 (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组,进行双向方差分析；**与正常拉伸相比,p < 0,01）。 a Kwantyfikacja stężenia NT-ProBNP w skrawkach serca hodowanych w warunkach normalnego rozciągnięcia MT (Norma) lub nadmiernego rozciągnięcia (OS) (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm–D4 MTOS) z różnych猪的切片/组，可以双向方方发发动 **w porównaniu z normalnym rozciąganiem, p < 0,01).histogram Kwantyfikacja stężeń NT-ProBNP w plasterkach serca hodowanych w warunkach normalnego rozciągnięcia MT (norm) lub nadmiernego rozciągnięcia (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) i D4 MTOS) plasterki/grupa od różnych świń, dwukierunkowa analiza wariancji;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 w porównaniu do normalnego rozciągania). b Obrazy reprezentatywne dla plastrów serca barwionych troponiną T i WGA (po lewej) oraz ilościowe określenie wielkości komórek (po prawej) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) komórek/grupę z 10 różnych plastrów od różnych świń; wykonano dwustronny test t-Studenta; ****p < 0,0001 w porównaniu do normalnego rozciągnięcia). b Obrazy reprezentatywne dla plastrów serca barwionych troponiną-T i WGA (po lewej) oraz ilościowe określenie wielkości komórek (po prawej) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) komórek/grupę z 10 różnych plastrów od różnych świń, wykonano dwustronny test t-Studenta; ****p < 0,0001 w porównaniu do normalnego rozciągnięcia). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Obrazy reprezentatywne przekrojów serca barwionych troponiną T i AZP (po lewej) oraz ilościowe określenie wielkości komórek (po prawej) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) komórek/grupę z 10 różnych przekrojów od różnych świń, wykonano dwustronny test t-Studenta; ****p < 0,0001 w porównaniu do szczepu normalnego). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像(n = 330（D6 MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）。 b Obrazy reprezentatywne wycinków serca barwionych kalkareiną-T i WGA (po lewej) oraz wielkość komórek (po prawej) (n = 330 (D6 MTOS), 369 z 10 różnych wycinków (D6 MTNorm)) Komórki/serce, test t; w porównaniu z normalnym rozciąganiem, ****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) i 10 stopni na poziomie разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Obrazy reprezentatywne przekrojów serca barwionych troponiną T i AZP (po lewej) oraz ilościowe określenie wielkości komórek (po prawej) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) z 10 różnych przekrojów od różnych świń) Komórki/grupa, kryterium dwustronne t-Studenta; ****p < 0,0001 w porównaniu do szczepu normalnego). c Obrazy reprezentatywne dla plasterków serca MTOS z dnia 0 i 6 znakowanych immunologicznie troponiną T i NFATC4 oraz ilościowe oznaczenie translokacji NFATC4 do jąder komórek mięśnia sercowego (n = 4 (D0), 3 (D6) plasterki MTOS/grupa od różnych świń, wykonano dwustronny test t-Studenta; *p < 0,05). c Obrazy reprezentatywne dla plasterków serca MTOS z dnia 0 i 6 znakowanych immunologicznie troponiną T i NFATC4 oraz ilościowe oznaczenie translokacji NFATC4 do jąder komórek CM (n = 4 (D0), 3 (D6) plasterki MTOS/grupa od różnych świń, wykonano dwustronny test t-Studenta; *p < 0,05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 i 6 dni MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т i NFATC4, i количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; 0,05). c Obrazy reprezentatywne dla przekrojów serca w 0 i 6 dniu MTOS, znakowane immunologicznie w celu wykrycia troponiny T i NFATC4 oraz ilościowe oznaczenie translokacji NFATC4 w jądrze komórek jamistych (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) przekroje/grupę od różnych świń) wykonane dwustronnym testem t-Studenta; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像,以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)。 c Reprezentatywne obrazy znakowania immunologicznego kalkaniną-T i NFATC4 第0天和第6天MTOS skrawki serca i NFATC4 z różnych jąder komórkowych NFATC4 易位至CM的ilość化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组,时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 i 6 dni dla иммуномаркировки тропонином-Т i NFATC4 и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Obrazy reprezentatywne wycinków serca MTOS w dniu 0 i 6 do immunoznakowania troponiny T i NFATC4 oraz ilościowego określenia translokacji NFATC4 w jądrze CM różnych świń (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) wycinki/grupa, dwustronne kryterium t-Studenta; *p < 0,05).Słupki błędów przedstawiają średnią ± odchylenie standardowe.
Translacyjne badania układu sercowo-naczyniowego wymagają modeli komórkowych, które dokładnie odtwarzają środowisko serca. W niniejszym badaniu opracowano i scharakteryzowano urządzenie CTCM, które może stymulować ultracienkie fragmenty serca. System CTCM obejmuje fizjologicznie zsynchronizowaną stymulację elektromechaniczną oraz wzbogacenie płynem T3 i Dex. Po wystawieniu skrawków serca świńskiego na działanie tych czynników, ich żywotność, integralność strukturalna, aktywność metaboliczna i ekspresja transkrypcyjna pozostały takie same jak w świeżej tkance serca po 12 dniach hodowli. Ponadto nadmierne rozciąganie tkanki serca może powodować przerost serca spowodowany nadmiernym wyprostem. Podsumowując, wyniki te potwierdzają kluczową rolę fizjologicznych warunków hodowli w utrzymaniu prawidłowego fenotypu serca i stanowią podstawę do badań przesiewowych leków.
Wiele czynników przyczynia się do stworzenia optymalnego środowiska dla funkcjonowania i przeżycia kardiomiocytów. Najbardziej oczywiste z nich to: (1) interakcje międzykomórkowe, (2) stymulacja elektromechaniczna, (3) czynniki humoralne oraz (4) substraty metaboliczne. Fizjologiczne interakcje międzykomórkowe wymagają złożonych trójwymiarowych sieci wielu typów komórek, wspieranych przez macierz zewnątrzkomórkową. Takie złożone interakcje komórkowe są trudne do odtworzenia in vitro poprzez współhodowlę pojedynczych typów komórek, ale można je łatwo uzyskać, wykorzystując organotypową naturę przekrojów serca.
Rozciąganie mechaniczne i stymulacja elektryczna kardiomiocytów mają kluczowe znaczenie dla utrzymania fenotypu serca33,34,35. Chociaż stymulacja mechaniczna jest szeroko stosowana do kondycjonowania i dojrzewania hiPSC-CM, w kilku prestiżowych badaniach podjęto ostatnio próbę mechanicznej stymulacji skrawków serca w hodowli z wykorzystaniem obciążenia jednoosiowego. Badania te pokazują, że dwuwymiarowe, jednokierunkowe obciążenie mechaniczne ma pozytywny wpływ na fenotyp serca w trakcie hodowli. W tych badaniach fragmenty serca obciążano izometrycznymi siłami rozciągającymi17, liniowym obciążeniem auksotonicznym18 lub odtwarzano cykl pracy serca za pomocą sprzężenia zwrotnego przetwornika siły i napędów naprężeniowych. Jednak metody te wykorzystują jednokierunkowe rozciąganie tkanek bez optymalizacji środowiska, co skutkuje supresją wielu genów sercowych lub nadekspresją genów związanych z nieprawidłowymi reakcjami na rozciąganie. Opisany tutaj CTCM zapewnia trójwymiarowy bodziec elektromechaniczny, który naśladuje naturalny cykl pracy serca pod względem czasu trwania cyklu i fizjologicznego rozciągnięcia (25% rozciągnięcia, 40% skurczu, 60% rozkurczu i 72 uderzeń na minutę). Mimo że sama trójwymiarowa stymulacja mechaniczna nie jest wystarczająca do utrzymania integralności tkanek, do odpowiedniego utrzymania żywotności, funkcji i integralności tkanek konieczna jest kombinacja stymulacji humoralnej i mechanicznej z wykorzystaniem T3/Dex.
Czynniki humoralne odgrywają istotną rolę w modulacji fenotypu serca u dorosłych. Zostało to podkreślone w badaniach HiPS-CM, w których T3 i dekstrometorfan (Dekstrometorfan) dodawano do pożywek hodowlanych w celu przyspieszenia dojrzewania komórek. T3 może wpływać na transport aminokwasów, cukrów i wapnia przez błony komórkowe36. Ponadto T3 promuje ekspresję MHC-α i obniża ekspresję MHC-β, promując powstawanie szybkokurczliwych miofibryli w dojrzałych kardiomiocytach w porównaniu z wolnokurczliwymi miofibrylami w płodowym kardiomiocytach. Niedobór T3 u pacjentów z niedoczynnością tarczycy prowadzi do utraty pasm miofibrylarnych i spowolnienia tempa rozwoju napięcia mięśnia sercowego37. Dekstrometorfan działa na receptory glikokortykosteroidowe i wykazano, że zwiększa kurczliwość mięśnia sercowego w izolowanych perfundowanych sercach38; uważa się, że ta poprawa jest związana z wpływem na napływ wapnia napędzanego depozytami (SOCE)39,40. Ponadto Dex wiąże się ze swoimi receptorami, wywołując szeroką odpowiedź wewnątrzkomórkową, która tłumi funkcje odpornościowe i stany zapalne30.
Nasze wyniki wskazują, że fizyczna stymulacja mechaniczna (MS) poprawiła ogólną wydajność hodowli w porównaniu z Ctrl, ale nie utrzymała żywotności, integralności strukturalnej i ekspresji sercowej przez 12 dni w hodowli. W porównaniu z Ctrl, dodanie T3 i Dex do hodowli CTCM (MT) poprawiło żywotność i utrzymało podobne profile transkrypcyjne, integralność strukturalną i aktywność metaboliczną ze świeżą tkanką serca przez 12 dni. Ponadto, kontrolując stopień rozciągnięcia tkanki, stworzono model przerostu serca wywołanego nadmiernym wyprostem przy użyciu STCM, co ilustruje wszechstronność systemu STCM. Należy zauważyć, że chociaż przebudowa serca i włóknienie zwykle obejmują nienaruszone narządy, których krążące komórki mogą dostarczać odpowiednich cytokin, a także fagocytozę i inne czynniki przebudowy, fragmenty serca mogą nadal naśladować proces włóknienia w odpowiedzi na stres i uraz. do miofibroblastów. Zostało to wcześniej ocenione w tym modelu plastra serca. Należy zauważyć, że parametry CTCM można modulować poprzez zmianę amplitudy i częstotliwości ciśnienia/prądu elektrycznego, symulując wiele stanów, takich jak tachykardia, bradykardia i mechaniczne wspomaganie krążenia (mechaniczne odciążenie serca). Dzięki temu system charakteryzuje się średnią przepustowością w testach leków. Zdolność CTCM do modelowania przerostu serca wywołanego nadmiernym wysiłkiem otwiera drogę do testowania tego systemu w ramach terapii spersonalizowanej. Podsumowując, niniejsze badanie dowodzi, że rozciąganie mechaniczne i stymulacja humoralna mają kluczowe znaczenie dla utrzymania hodowli skrawków tkanki serca.
Chociaż przedstawione tutaj dane sugerują, że CTCM jest bardzo obiecującą platformą do modelowania nieuszkodzonego mięśnia sercowego, ta metoda hodowli ma pewne ograniczenia. Głównym ograniczeniem hodowli CTCM jest to, że nakłada ona ciągłe dynamiczne naprężenia mechaniczne na plastry serca, co uniemożliwia aktywne monitorowanie skurczów plastrów serca w każdym cyklu. Ponadto, ze względu na mały rozmiar skrawków serca (7 mm), możliwość oceny funkcji skurczowej poza systemami hodowli z wykorzystaniem tradycyjnych czujników siły jest ograniczona. W niniejszym manuskrypcie częściowo przezwyciężamy to ograniczenie, oceniając napięcie optyczne jako wskaźnik funkcji skurczowej. Jednak to ograniczenie będzie wymagało dalszych prac i może zostać rozwiązane w przyszłości poprzez wprowadzenie metod optycznego monitorowania funkcji plastrów serca w hodowli, takich jak mapowanie optyczne z wykorzystaniem barwników wrażliwych na wapń i napięcie. Kolejnym ograniczeniem CTCM jest to, że model roboczy nie manipuluje stresem fizjologicznym (obciążeniem wstępnym i następczym). W CTCM ciśnienie indukowano w przeciwnych kierunkach, aby odtworzyć fizjologiczne rozciągnięcie o 25% w fazie rozkurczu (pełne rozciągnięcie) i skurczu (długość skurczu podczas stymulacji elektrycznej) w bardzo dużych tkankach. To ograniczenie powinno zostać usunięte w przyszłych projektach CTCM poprzez odpowiednie ciśnienie na tkankę serca z obu stron oraz poprzez zastosowanie dokładnych zależności między ciśnieniem a objętością, jakie występują w komorach serca.
Remodeling wywołany nadmiernym rozciągnięciem, opisany w niniejszym manuskrypcie, ogranicza się do naśladowania hipertroficznych sygnałów hiperrozciągnięcia. Zatem model ten może pomóc w badaniu hipertroficznej sygnalizacji wywołanej rozciągnięciem, bez konieczności udziału czynników humoralnych lub neuronalnych (które nie występują w tym systemie). Konieczne są dalsze badania w celu zwiększenia liczby przypadków CTCM, na przykład, współhodowla z komórkami układu odpornościowego, czynnikami humoralnymi krążącymi w osoczu oraz unerwieniem, podczas gdy współhodowla z komórkami neuronalnymi poprawi możliwości modelowania chorób z CTCM.
W badaniu wykorzystano trzynaście świń. Wszystkie procedury na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi instytucji i zostały one zatwierdzone przez Komisję ds. Opieki nad Zwierzętami i ich Użytkowania Uniwersytetu Louisville. Łuk aorty zacisnięto, a serce perfundowano 1 litrem sterylnej kardioplegii (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/ml heparyny, pH do 7,4); serca przechowywano w lodowatym roztworze kardioplegicznym do momentu przetransportowania ich do laboratorium w lodzie, co zwykle trwa krócej niż 10 min. serca przechowywano w lodowatym roztworze kardioplegicznym do momentu przetransportowania ich do laboratorium w lodzie, co zwykle trwa krócej niż 10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно czas <10 min. serca przechowywano w lodowatym roztworze kardioplegicznym do momentu transportu do laboratorium w lodzie, co zwykle trwa mniej niż 10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10分钟. Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min. Przechowywać serca w lodzie do momentu transportu do laboratorium w lodzie, zwykle <10 min.
Urządzenie CTCM zostało opracowane w oprogramowaniu do komputerowego wspomagania projektowania (CAD) SolidWorks. Komory hodowlane, przegrody i komory powietrzne wykonane są z przezroczystego akrylu obrabianego CNC. Pierścień podporowy o średnicy 7 mm wykonany jest z polietylenu o wysokiej gęstości (HDPE) w środkowej części i posiada rowek na pierścień uszczelniający typu o-ring, w którym mieści się silikonowy pierścień uszczelniający, służący do uszczelnienia podłoża. Cienka membrana krzemionkowa oddziela komorę hodowlaną od płyty separującej. Membrana silikonowa jest wycinana laserowo z arkusza silikonowego o grubości 0,02 cala i ma twardość 35A. Dolne i górne uszczelki silikonowe są wycinane laserowo z arkusza silikonowego o grubości 1/16 cala i mają twardość 50A. Do mocowania bloku i tworzenia hermetycznego uszczelnienia służą śruby i nakrętki motylkowe ze stali nierdzewnej 316L.
Dedykowana płytka drukowana (PCB) została zaprojektowana do integracji z systemem C-PACE-EM. Gniazda złącza maszyny szwajcarskiej na płytce PCB są połączone z elektrodami grafitowymi za pomocą srebrzonych przewodów miedzianych i brązowych śrub 0-60 wkręconych w elektrody. Płytka drukowana jest umieszczona w obudowie drukarki 3D.
Urządzenie CTCM jest sterowane programowalnym siłownikiem pneumatycznym (PPD), który wytwarza kontrolowane ciśnienie krwi podobne do cyklu pracy serca. Wraz ze wzrostem ciśnienia w komorze powietrznej, elastyczna silikonowa membrana rozszerza się ku górze, wtłaczając medium pod tkankę. Obszar tkanki jest następnie rozciągany przez to wydalanie płynu, naśladując fizjologiczne rozszerzanie się serca podczas rozkurczu. W szczytowym momencie relaksacji, stymulacja elektryczna była stosowana za pomocą elektrod grafitowych, co zmniejszało ciśnienie w komorze powietrznej i powodowało skurcz fragmentów tkanki. Wewnątrz rurki znajduje się zawór hemostatyczny z czujnikiem ciśnienia, który mierzy ciśnienie w układzie powietrznym. Ciśnienie mierzone przez czujnik ciśnienia jest przekazywane do kolektora danych podłączonego do laptopa. Umożliwia to ciągłe monitorowanie ciśnienia w komorze gazowej. Po osiągnięciu maksymalnego ciśnienia w komorze (standardowo 80 mmHg, 140 mmHg OS), urządzenie do akwizycji danych otrzymywało polecenie wysłania sygnału do systemu C-PACE-EM w celu wygenerowania dwufazowego sygnału napięciowego trwającego 2 ms, ustawionego na 4 V.
Pobrano skrawki serca i przeprowadzono następujące warunki hodowli w 6 dołkach: Przeniesiono pobrane serca z naczynia transferowego do tacy zawierającej zimną (4°C) kardioplegię. Lewą komorę wyizolowano sterylnym ostrzem i pocięto na kawałki o powierzchni 1-2 cm3. Te bloki tkankowe przymocowano do podpór tkankowych za pomocą kleju tkankowego i umieszczono w wibrującej łaźni tkankowej mikrotomu zawierającej roztwór Tyrode'a i ciągle natleniano (3 g/l monooksymu 2,3-butanodionu (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g) . ), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glukozy (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M roztworu), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M roztworu), do 1 L ddH2O). Mikrotom wibracyjny ustawiono tak, aby ciąć plastry o grubości 300 µm z częstotliwością 80 Hz, amplitudą drgań poziomych 2 mm i szybkością posuwu 0,03 mm/s. Łaźnię tkankową otoczono lodem, aby utrzymać roztwór w chłodzie, a temperaturę utrzymywano na poziomie 4°C. Przenieś skrawki tkanek z łaźni mikrotomowej do łaźni inkubacyjnej zawierającej stale natleniony roztwór Tyrode'a na lodzie, aż do uzyskania wystarczającej liczby skrawków na jedną płytkę hodowlaną. W przypadku kultur transwell skrawki tkanek przymocowano do sterylnych poliuretanowych podpór o szerokości 6 mm i umieszczono w 6 ml zoptymalizowanego podłoża (podłoże 199, 1x suplement ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkaliczny i 2X antybiotyk-przeciwgrzybiczy). Do skrawków tkanek przyłożono stymulację elektryczną (10 V, częstotliwość 1,2 Hz) poprzez C-Pace. W warunkach TD, świeży T3 i Dex dodawano w stężeniu 100 nM i 1 μM przy każdej zmianie podłoża. Podłoże nasycano tlenem przed wymianą 3 razy dziennie. Skrawki tkanek hodowano w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO2.
W przypadku hodowli CTCM skrawki tkanek umieszczono na specjalnie zaprojektowanej drukarce 3D w szalce Petriego zawierającej zmodyfikowany roztwór Tyrode'a. Urządzenie zostało zaprojektowane w celu zwiększenia rozmiaru plastra serca o 25% powierzchni pierścienia podtrzymującego. Ma to na celu zapobieganie rozciąganiu się skrawków serca po przeniesieniu z roztworu Tyrode'a do pożywki oraz podczas rozkurczu. Za pomocą kleju histoakrylowego skrawki o grubości 300 µm zamocowano na pierścieniu podtrzymującym o średnicy 7 mm. Po przymocowaniu skrawków tkanek do pierścienia podtrzymującego odcięto nadmiar skrawków i umieszczono przymocowane skrawki tkanek z powrotem w kąpieli z roztworem Tyrode'a w lodzie (4°C), aż do uzyskania wystarczającej liczby skrawków dla jednego urządzenia. Całkowity czas przetwarzania dla wszystkich urządzeń nie powinien przekroczyć 2 godzin. Po przymocowaniu 6 skrawków tkanek do ich pierścieni podtrzymujących złożono urządzenie CTCM. Komora hodowlana CTCM jest wstępnie wypełniona 21 ml wstępnie natlenionego medium. Przenieś skrawki tkanki do komory hodowlanej i ostrożnie usuń wszelkie pęcherzyki powietrza za pomocą pipety. Następnie skrawek tkanki jest wprowadzany do otworu i delikatnie dociskany. Na koniec umieść nasadkę elektrody na urządzeniu i przenieś urządzenie do inkubatora. Następnie podłącz CTCM do przewodu powietrza i systemu C-PACE-EM. Siłownik pneumatyczny otwiera się, a zawór powietrza otwiera CTCM. System C-PACE-EM został skonfigurowany do dostarczania napięcia 4 V o częstotliwości 1,2 Hz podczas stymulacji dwufazowej przez 2 ms. Medium zmieniano dwa razy dziennie, a elektrody wymieniano raz dziennie, aby uniknąć gromadzenia się grafitu na elektrodach. W razie potrzeby skrawki tkanki można wyjąć z ich dołków hodowlanych, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogły pod nie wpaść. W przypadku warunków leczenia MT, T3/Dex dodawano świeżo przy każdej zmianie medium w stężeniu 100 nM T3 i 1 μM Dex. Urządzenia CTCM hodowano w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO2.
Aby uzyskać rozciągnięte trajektorie wycinków serca, opracowano specjalny system kamer. Użyto lustrzanki (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japonia) z obiektywem makro Navitar Zoom 7000 18-108 mm (Navitar, San Francisco, Kalifornia). Wizualizacja została przeprowadzona w temperaturze pokojowej po wymianie medium na świeże. Kamerę ustawiono pod kątem 51°, a wideo nagrywano z prędkością 30 klatek na sekundę. Najpierw użyto oprogramowania open source (MUSCLEMOTION43) z programem Image-J do ilościowego określenia ruchu wycinków serca. Maskę utworzono za pomocą programu MATLAB (MathWorks, Natick, Massachusetts, USA) w celu zdefiniowania obszarów zainteresowania dla bijących wycinków serca, aby uniknąć szumu. Ręcznie segmentowane maski są stosowane do wszystkich obrazów w sekwencji klatek, a następnie przekazywane do wtyczki MUSCLEMOTION. Muscle Motion wykorzystuje średnią intensywność pikseli w każdej klatce do ilościowego określenia jej ruchu względem klatki odniesienia. Dane zostały zarejestrowane, przefiltrowane i wykorzystane do ilościowego określenia czasu cyklu oraz oceny rozciągnięcia tkanek podczas cyklu pracy serca. Nagranie wideo zostało poddane obróbce końcowej za pomocą cyfrowego filtru zerowej fazy pierwszego rzędu. Aby ilościowo określić rozciągnięcie tkanek (od szczytu do szczytu), przeprowadzono analizę szczytu do szczytu, aby odróżnić szczyty od dołków w zarejestrowanym sygnale. Dodatkowo, w celu wyeliminowania dryftu sygnału, przeprowadzono detrendowanie za pomocą wielomianu 6. stopnia. Kod programu został opracowany w środowisku MATLAB w celu określenia globalnego ruchu tkanek, czasu cyklu, czasu relaksacji i czasu skurczu (Kod programu uzupełniającego 44).
Do analizy odkształceń, wykorzystując te same filmy, które zostały stworzone do oceny rozciągania mechanicznego, najpierw nakreśliliśmy dwa obrazy reprezentujące szczyty ruchu (najwyższy (górny) i najniższy (dolny) punkt ruchu) zgodnie z oprogramowaniem MUSCLEMOTION. Następnie segmentowaliśmy obszary tkanki i zastosowaliśmy do nich algorytm cieniowania (Rysunek uzupełniający 2a). Segmentowaną tkankę podzieliliśmy na dziesięć podpowierzchni, a naprężenie na każdej powierzchni obliczyliśmy za pomocą następującego równania: Odkształcenie = (Sup-Sdown)/Sdown, gdzie Sup i Sdown to odpowiednio odległości kształtu od górnego i dolnego cienia tkaniny (Rysunek uzupełniający 2b).
Skrawki serca utrwalano w 4% paraformaldehydu przez 48 godzin. Utrwalone tkanki odwadniano w 10% i 20% sacharozie przez 1 godzinę, a następnie w 30% sacharozie przez noc. Następnie skrawki zatapiano w roztworze o optymalnej temperaturze cięcia (związek OCT) i stopniowo zamrażano w łaźni izopentanowej z suchym lodem. Przechowywać bloki do zatapiania OCT w temperaturze -80°C do momentu rozdzielenia. Preparaty przygotowano w postaci skrawków o grubości 8 μm.
Aby usunąć OCT z preparatów serca, należy wygrzać preparaty na bloku grzejnym w temperaturze 95°C przez 5 minut. Dodać 1 ml PBS do każdego preparatu i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przesączyć preparaty, umieszczając 0,1% Triton-X w PBS na 15 minut w temperaturze pokojowej. Aby zapobiec wiązaniu się nieswoistych przeciwciał z próbką, dodać 1 ml 3% roztworu BSA do preparatów i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie usunąć BSA, a preparaty przemyć PBS. Oznaczyć każdą próbkę ołówkiem. Pierwszorzędowe przeciwciała (rozcieńczone 1:200 w 1% BSA) (koneksyna 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) i troponina-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) dodano na okres 90 minut, następnie drugorzędowe przeciwciała (rozcieńczone 1:200 w 1% BSA) przeciwko mysiej Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), przeciwko króliczej Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) przez kolejne 90 minut. Przemyto 3 razy PBS. Aby odróżnić barwienie docelowe od tła, użyliśmy tylko drugorzędowego przeciwciała jako kontroli. Na koniec dodano barwnik jądrowy DAPI, a szkiełka umieszczono w Vectashield (Vector Laboratories) i uszczelniono lakierem do paznokci. -x powiększenie) i mikroskop Keyence z 40x powiększenie.
Do barwienia WGA użyto barwnika WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; nr W32464) w stężeniu 5 μg/ml w PBS. Preparat naniesiono na utrwalone skrawki na 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie preparaty przemyto w PBS, a do każdego preparatu dodano czerń sudańską i inkubowano przez 30 minut. Następnie preparaty przemyto w PBS i dodano medium Vectashield do zatapiania. Preparaty wizualizowano pod mikroskopem Keyence przy powiększeniu 40x.
OCT usunięto z próbek zgodnie z powyższym opisem. Po usunięciu OCT, zanurzono preparaty w roztworze Bouina na noc. Preparaty następnie przepłukano wodą destylowaną przez 1 godzinę, a następnie umieszczono w roztworze fuksyny kwasu aloesowego Bibricha na 10 minut. Następnie preparaty przemyto wodą destylowaną i umieszczono w roztworze 5% fosfomolibdenu/5% kwasu fosfowolframowego na 10 minut. Bez płukania, przeniesiono preparaty bezpośrednio do roztworu błękitu anilinowego na 15 minut. Następnie preparaty przemyto wodą destylowaną i umieszczono w 1% roztworze kwasu octowego na 2 minuty. Preparaty wysuszono w 200 N etanolu i przeniesiono do ksylenu. Barwione preparaty wizualizowano za pomocą mikroskopu Keyence z obiektywem 10x. Procent powierzchni zwłóknienia określono ilościowo za pomocą oprogramowania Keyence Analyzer.
Test żywotności komórek CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia), numer katalogowy V13154, zgodnie z protokołem producenta z pewnymi modyfikacjami. W szczególności, do zapewnienia jednolitej wielkości tkanki podczas analizy MTT użyto dziurkacza chirurgicznego o średnicy 6 mm. Tkanki pojedynczo wysiano do dołków 12-dołkowej płytki zawierającej substrat MTT zgodnie z protokołem producenta. Skrawki inkubowano w temperaturze 37°C przez 3 godziny, a żywa tkanka metabolizowała substrat MTT, tworząc purpurowy formazan. Zastąpić roztwór MTT 1 ml DMSO i inkubować w temperaturze 37°C przez 15 minut, aby wyekstrahować purpurowy formazan z skrawków serca. Próbki rozcieńczono w stosunku 1:10 w DMSO w 96-dołkowych płytkach z przezroczystym dnem, a intensywność fioletowego zabarwienia mierzono przy długości fali 570 nm za pomocą czytnika płytek Cytation (BioTek). Odczyty znormalizowano do masy każdego wycinka serca.
Pożywkę HeartSlice zastąpiono pożywką zawierającą 1 μCi/ml [5-3H]-glukozy (Moravek Biochemicals, Brea, Kalifornia, USA) do oznaczenia wykorzystania glukozy, jak opisano wcześniej. Po 4 godzinach inkubacji, dodać 100 µl pożywki do otwartej probówki mikrocentrifugi zawierającej 100 µl 0,2 N HCl. Następnie probówkę umieszczono w probówce scyntylacyjnej zawierającej 500 µl dH2O w celu odparowania [3H]2O przez 72 godziny w temperaturze 37°C. Następnie wyjąć probówkę mikrocentrifugi z probówki scyntylacyjnej i dodać 10 ml płynu scyntylacyjnego. Zliczenia scyntylacyjne wykonano za pomocą analizatora scyntylacyjnego Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). Następnie obliczono wykorzystanie glukozy, uwzględniając aktywność właściwą [5-3H]-glukozy, niepełną równowagę i tło, rozcieńczenie [5-3H]-glukozy do nieoznakowanej glukozy oraz wydajność licznika scyntylacyjnego. Dane znormalizowano do masy przekrojów serca.
Po homogenizacji tkanki w Trizolu, RNA wyizolowano z wycinków serca za pomocą zestawu Qiagen miRNeasy Micro Kit nr 210874 zgodnie z protokołem producenta. Przygotowanie biblioteki RNAsec, sekwencjonowanie i analizę danych przeprowadzono w następujący sposób:
1 μg RNA na próbkę użyto jako materiału wyjściowego do przygotowania biblioteki RNA. Biblioteki sekwencjonowania wygenerowano przy użyciu zestawu NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit dla Illumina (NEB, USA) zgodnie z zaleceniami producenta, a kody indeksowe dodano do sekwencji atrybutów dla każdej próbki. W skrócie, mRNA oczyszczono z całkowitego RNA za pomocą kulek magnetycznych przytwierdzonych oligonukleotydami poli-T. Fragmentację przeprowadzono z użyciem kationów dwuwartościowych w wysokiej temperaturze w buforze NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). Pierwszą nić cDNA zsyntetyzowano przy użyciu losowych starterów heksamerowych i odwrotnej transkryptazy M-MuLV (RNazy H-). Drugą nić cDNA zsyntetyzowano następnie przy użyciu polimerazy DNA I i RNazy H. Pozostałe wystające fragmenty są przekształcane w tępe końce pod wpływem aktywności egzonukleazy/polimerazy. Po adenylacji końca 3' fragmentu DNA, dołączono do niego adapter NEBNext ze strukturą pętli spinki do włosów, aby przygotować go do hybrydyzacji. W celu selekcji fragmentów cDNA o preferowanej długości 150-200 pb, fragmenty biblioteki oczyszczono za pomocą systemu AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA). Następnie, 3 μl enzymu USER (NEB, USA) z cDNA o selekcji wielkości, zligowanym z adapterem, użyto przez 15 minut w temperaturze 37°C, a następnie przez 5 minut w temperaturze 95°C przed PCR. Następnie PCR przeprowadzono z użyciem polimerazy DNA Phusion High-Fidelity, uniwersalnych starterów PCR i starterów Index (X). Na koniec produkty PCR oczyszczono (system AMPure XP), a jakość biblioteki oceniono na systemie Agilent Bioanalyzer 2100. Bibliotekę cDNA sekwencjonowano za pomocą sekwenatora Novaseq. Surowe pliki obrazów z Illumina zostały przekonwertowane na surowe odczyty za pomocą CASAVA Base Calling. Surowe dane są przechowywane w plikach w formacie FASTQ(fq), które zawierają sekwencje odczytów i odpowiadające im jakości zasad. Wybierz HISAT2, aby dopasować przefiltrowane odczyty sekwencjonowania do genomu referencyjnego Sscrofa11.1. Zasadniczo HISAT2 obsługuje genomy o dowolnej wielkości, w tym genomy o długości powyżej 4 miliardów zasad, a dla większości parametrów ustawione są wartości domyślne. Odczyty splicingowe z danych sekwencjonowania RNA można efektywnie wyrównać za pomocą HISAT2, najszybszego obecnie dostępnego systemu, z taką samą lub lepszą dokładnością niż jakakolwiek inna metoda.
Liczebność transkryptów bezpośrednio odzwierciedla poziom ekspresji genów. Poziomy ekspresji genów ocenia się na podstawie liczebności transkryptów (liczba sekwencjonowanych) powiązanych z genomem lub eksonami. Liczba odczytów jest proporcjonalna do poziomu ekspresji genów, długości genu i głębokości sekwencjonowania. Obliczono FPKM (liczba fragmentów na tysiąc par zasad zsekwencjonowanego transkryptu na milion par zasad) i określono wartości p dla różnicowej ekspresji za pomocą pakietu DESeq2. Następnie obliczono współczynnik fałszywych odkryć (FDR) dla każdej wartości p, stosując metodę Benjaminiego-Hochberga9 w oparciu o wbudowaną funkcję R „p.adjust”.
RNA wyizolowane z fragmentów serca przekształcono w cDNA w stężeniu 200 ng/μl przy użyciu mieszaniny Master Mix SuperScript IV Vilo firmy Thermo (Thermo, nr kat. 11756050). Ilościową reakcję PCR w czasie rzeczywistym (RT-PCR) przeprowadzono z użyciem 384-dołkowej przezroczystej płytki reakcyjnej Endura Plate Microamp firmy Applied Biosystems (Thermo, nr kat. 4483319) i kleju optycznego Microamp (Thermo, nr kat. 4311971). Mieszanina reakcyjna składała się z 5 µl mieszaniny Master Mix Taqman Fast Advanced (Thermo, nr kat. 4444557), 0,5 µl primera Taqman i 3,5 µl wody dodanej do każdego dołka. Wykonano standardowe cykle qPCR i zmierzono wartości CT przy użyciu urządzenia do PCR w czasie rzeczywistym Quantstudio 5 firmy Applied Biosystems (moduł 384-dołkowy; nr produktu A28135). Startery Taqman zakupiono od Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Wartości CT wszystkich próbek znormalizowano do genu gospodarczego GAPDH.
Uwalnianie NT-ProBNP z pożywki oceniano przy użyciu zestawu NT-ProBNP (świnia) (nr kat. MBS2086979, MyBioSource) zgodnie z protokołem producenta. Krótko mówiąc, do każdego dołka dodano 250 µl każdej próbki i standardu w dwóch powtórzeniach. Natychmiast po dodaniu próbki, do każdego dołka dodano 50 µl odczynnika testowego A. Delikatnie wstrząsnąć płytką i uszczelnić ją uszczelniaczem. Następnie tabletki inkubowano w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Następnie odessać roztwór i przemyć dołki 4 razy 350 µl 1X roztworu płuczącego, inkubując roztwór płuczący przez 1-2 minuty za każdym razem. Następnie dodać 100 µl odczynnika testowego B na dołek i uszczelnić płytkę uszczelniaczem. Tabletkę delikatnie wstrząsnąć i inkubować w temperaturze 37°C przez 30 minut. Odessać roztwór i przemyć studzienki 5 razy 350 µl roztworu płuczącego 1X. Dodać 90 µl roztworu substratu do każdego studzienki i zamknąć płytkę. Inkubować płytkę w temperaturze 37°C przez 10–20 minut. Dodać 50 µl roztworu zatrzymującego do każdego studzienki. Płytkę natychmiast zmierzono za pomocą czytnika płytek Cytation (BioTek) ustawionego na 450 nm.
Przeprowadzono analizę mocy w celu wybrania rozmiarów grup zapewniających >80% mocy wykrycia 10% bezwzględnej zmiany parametru przy 5% współczynniku błędu rodzaju I. Przeprowadzono analizę mocy w celu wybrania rozmiarów grup zapewniających >80% mocy wykrycia 10% bezwzględnej zmiany parametru przy 5% współczynniku błędu rodzaju I. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Przeprowadzono analizę mocy w celu wybrania grup o takiej wielkości, aby zapewnić >80% mocy wykrycia 10% bezwzględnej zmiany parametrów przy 5% współczynniku błędu rodzaju I.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметров i 5% частоты ошибок типа I. Przeprowadzono analizę mocy w celu wybrania grupy o takiej wielkości, która zapewniłaby >80% mocy wykrycia 10% bezwzględnej zmiany parametrów i 5% współczynnika błędów typu I.Przed eksperymentem wycinki tkanek wybrano losowo. Wszystkie analizy przeprowadzono metodą ślepej próby, a próbki dekodowano dopiero po przeanalizowaniu wszystkich danych. Do przeprowadzenia wszystkich analiz statystycznych wykorzystano oprogramowanie GraphPad Prism (San Diego, Kalifornia). W przypadku wszystkich statystyk za istotne statystycznie uznawano wartości p <0,05. W przypadku wszystkich statystyk za istotne uznawano wartości p <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. W przypadku wszystkich statystyk za istotne uznawano wartości p <0,05.对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. W przypadku wszystkich statystyk za istotne uznawano wartości p <0,05.Dwustronny test t-Studenta przeprowadzono dla danych z zaledwie dwoma porównaniami. Do określenia istotności statystycznej między grupami zastosowano jednokierunkową lub dwukierunkową analizę wariancji (ANOVA). Podczas wykonywania testów post hoc, w celu uwzględnienia wielokrotnych porównań, zastosowano poprawkę Tukeya. Dane RNAsec wymagają uwzględnienia szczególnych zagadnień statystycznych przy obliczaniu FDR i korekty p, jak opisano w sekcji „Metody”.
Więcej informacji na temat projektu badania można znaleźć w streszczeniu raportu badawczego Nature Research Report, do którego link znajduje się w tym artykule.