Dziękujemy za odwiedzenie Nature.com.Wersja przeglądarki, której używasz, ma ograniczoną obsługę CSS.Aby uzyskać najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie ze zaktualizowanej przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w Internet Explorerze).W międzyczasie, aby zapewnić ciągłe wsparcie, będziemy renderować witrynę bez stylów i języka JavaScript.
Istnieje zapotrzebowanie na niezawodny system in vitro, który może dokładnie odtworzyć fizjologiczne środowisko serca do testowania leków.Ograniczona dostępność systemów hodowli ludzkich tkanek serca doprowadziła do niedokładnych interpretacji działania leków na serce.Tutaj opracowaliśmy model hodowli tkanek serca (CTCM), który elektromechanicznie stymuluje skrawki serca i ulega rozciąganiu fizjologicznemu podczas skurczowej i rozkurczowej fazy cyklu serca.Po 12 dniach hodowli podejście to częściowo poprawiło żywotność skrawków serca, ale nie w pełni zachowało ich strukturalną integralność.Dlatego po badaniu przesiewowym małych cząsteczek stwierdziliśmy, że dodanie 100 nM trijodotyroniny (T3) i 1 μM deksametazonu (Dex) do naszej pożywki utrzymywało mikrostrukturę skrawków przez 12 dni.W połączeniu z leczeniem T3/Dex system CTCM utrzymywał profile transkrypcyjne, żywotność, aktywność metaboliczną i integralność strukturalną na tym samym poziomie, co świeża tkanka serca przez 12 dni.Ponadto nadmierne rozciąganie tkanki serca w hodowli indukuje przerostową sygnalizację sercową, dostarczając dowodów na zdolność CTCM do naśladowania warunków przerostowych wywołanych rozciąganiem serca.Podsumowując, CTCM może modelować fizjologię i patofizjologię serca w hodowlach przez długi czas, umożliwiając wiarygodne badania przesiewowe leków.
Przed rozpoczęciem badań klinicznych potrzebne są niezawodne systemy in vitro, które będą w stanie dokładnie odtworzyć fizjologiczne środowisko ludzkiego serca.Takie systemy powinny naśladować zmienioną rozciągliwość mechaniczną, tętno i właściwości elektrofizjologiczne.Modele zwierzęce są powszechnie stosowane jako platforma przesiewowa fizjologii serca z ograniczoną wiarygodnością w odzwierciedlaniu wpływu leków na ludzkie serce1,2.Ostatecznie Model Eksperymentalny Kultury Tkankowej Idealnego Serca (CTCM) jest modelem, który jest bardzo czuły i specyficzny dla różnych interwencji terapeutycznych i farmakologicznych, dokładnie odtwarzając fizjologię i patofizjologię ludzkiego serca3.Brak takiego systemu ogranicza odkrywanie nowych metod leczenia niewydolności serca4,5 i doprowadził do kardiotoksyczności leków jako głównego powodu wycofania ich z rynku6.
W ciągu ostatniej dekady wycofano z użytku klinicznego osiem leków niesercowo-naczyniowych, ponieważ powodują wydłużenie odstępu QT, prowadząc do komorowych zaburzeń rytmu i nagłej śmierci7.W związku z tym istnieje coraz większe zapotrzebowanie na wiarygodne strategie badań przedklinicznych w celu oceny skuteczności i toksyczności sercowo-naczyniowej.Niedawne zastosowanie indukowanych przez człowieka kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPS-CM) w badaniach przesiewowych leków i testach toksyczności zapewnia częściowe rozwiązanie tego problemu.Jednak niedojrzały charakter hiPS-CM i brak wielokomórkowej złożoności tkanki serca są głównymi ograniczeniami tej metody.Ostatnie badania wykazały, że to ograniczenie można częściowo przezwyciężyć, stosując wczesny hiPS-CM do tworzenia hydrożeli tkanki serca wkrótce po wystąpieniu spontanicznych skurczów i stopniowo zwiększając stymulację elektryczną w czasie.Jednak te mikrotkanki hiPS-CM nie mają dojrzałych właściwości elektrofizjologicznych i kurczliwych dorosłego mięśnia sercowego.Ponadto tkanka ludzkiego serca ma bardziej złożoną strukturę, składającą się z heterogenicznej mieszaniny różnych typów komórek, w tym komórek śródbłonka, neuronów i fibroblastów zrębu, połączonych ze sobą specyficznymi zestawami białek macierzy zewnątrzkomórkowej.Ta heterogeniczność populacji innych niż kardiomiocyty11,12,13 w sercu dorosłego ssaka jest główną przeszkodą w modelowaniu tkanki serca przy użyciu poszczególnych typów komórek.Te główne ograniczenia podkreślają znaczenie opracowania metod hodowli nienaruszonej tkanki mięśnia sercowego w warunkach fizjologicznych i patologicznych.
Hodowane cienkie (300 µm) skrawki ludzkiego serca okazały się obiecującym modelem nienaruszonego ludzkiego mięśnia sercowego.Ta metoda zapewnia dostęp do kompletnego systemu wielokomórkowego 3D, podobnego do ludzkiej tkanki serca.Jednak do 2019 r. wykorzystanie hodowanych skrawków serca było ograniczone krótkim (24-godzinnym) przeżyciem hodowli.Wynika to z wielu czynników, w tym braku rozciągania fizyczno-mechanicznego, granicy faz powietrze-ciecz oraz stosowania prostych mediów, które nie obsługują potrzeb tkanki serca.W 2019 roku kilka grup badawczych wykazało, że włączenie czynników mechanicznych do systemów hodowli tkanek serca może przedłużyć żywotność hodowli, poprawić ekspresję serca i naśladować patologię serca.Dwa eleganckie badania 17 i 18 pokazują, że jednoosiowe obciążenie mechaniczne ma pozytywny wpływ na fenotyp serca podczas hodowli.Jednak badania te nie wykorzystywały dynamicznego trójwymiarowego fizyczno-mechanicznego obciążenia cyklu serca, ponieważ skrawki serca były obciążane izometrycznymi siłami rozciągającymi 17 lub liniowymi obciążeniami auksotonicznymi 18 .Te metody rozciągania tkanek spowodowały supresję wielu genów sercowych lub nadekspresję genów związanych z nieprawidłową odpowiedzią na rozciąganie.Warto zauważyć, że Pitoulis i in.19 opracowali dynamiczną kąpiel hodowlaną wycinka serca do rekonstrukcji cyklu serca z wykorzystaniem sprzężenia zwrotnego przetwornika siły i napędów napięciowych.Chociaż ten system pozwala na dokładniejsze modelowanie cyklu serca in vitro, złożoność i niska przepustowość metody ograniczają zastosowanie tego systemu.Nasze laboratorium opracowało niedawno uproszczony system hodowli wykorzystujący stymulację elektryczną i zoptymalizowaną pożywkę w celu utrzymania żywotności skrawków tkanki serca świni i człowieka przez okres do 6 dni20,21.
W obecnym manuskrypcie opisujemy model hodowli tkanek serca (CTCM) przy użyciu skrawków serca świni, który zawiera wskazówki humoralne w celu podsumowania trójwymiarowej fizjologii serca i patofizjologicznego rozdęcia podczas cyklu serca.Ten CTCM może zwiększyć dokładność przedklinicznego przewidywania leku do poziomu nigdy wcześniej nieosiągalnego, zapewniając niedrogi system kardiologiczny o średniej przepustowości, który naśladuje fizjologię/patofizjologię serca ssaków do przedklinicznych testów leków.
Mechaniczne sygnały hemodynamiczne odgrywają kluczową rolę w utrzymaniu funkcji kardiomiocytów in vitro 22,23,24.W obecnym manuskrypcie opracowaliśmy CTCM (ryc. 1a), który może naśladować środowisko serca dorosłego poprzez indukowanie zarówno elektrycznej, jak i mechanicznej stymulacji przy częstotliwościach fizjologicznych (1, 2 Hz, 72 uderzenia na minutę).Aby uniknąć nadmiernego rozciągania tkanki podczas rozkurczu, zastosowano urządzenie do drukowania 3D w celu zwiększenia rozmiaru tkanki o 25% (ryc. 1b).Rozpoczęcie stymulacji elektrycznej indukowanej przez system C-PACE zaplanowano na 100 ms przed skurczem przy użyciu systemu zbierania danych w celu pełnego odtworzenia cyklu pracy serca.System hodowli tkankowej wykorzystuje programowalny siłownik pneumatyczny (LB Engineering, Niemcy) do cyklicznego rozszerzania elastycznej silikonowej membrany, co powoduje rozszerzanie się plastrów serca w górnej komorze.System został podłączony do zewnętrznego przewodu powietrza poprzez przetwornik ciśnienia, co umożliwiło dokładną regulację ciśnienia (± 1 mmHg) i czasu (± 1 ms) (ryc. 1c).
a Przymocuj skrawek tkanki do pierścienia podtrzymującego 7 mm, zaznaczonego na niebiesko, wewnątrz komory hodowlanej urządzenia.Komora hodowlana jest oddzielona od komory powietrznej cienką, elastyczną silikonową membraną.Umieść uszczelkę między każdą komorą, aby zapobiec wyciekom.W pokrywie urządzenia znajdują się elektrody grafitowe, które zapewniają stymulację elektryczną.b Schematyczne przedstawienie dużego urządzenia tkankowego, pierścienia prowadzącego i pierścienia podtrzymującego.Skrawki tkankowe (brązowe) umieszcza się na powiększonym urządzeniu z pierścieniem prowadzącym umieszczonym w rowku na zewnętrznej krawędzi urządzenia.Korzystając z prowadnicy, ostrożnie umieść pierścień podtrzymujący pokryty bibułkowym klejem akrylowym na skrawku tkanki serca.c Wykres przedstawiający czas stymulacji elektrycznej w funkcji ciśnienia w komorze powietrznej kontrolowanej przez programowalny siłownik pneumatyczny (PPD).Do synchronizacji stymulacji elektrycznej za pomocą czujników ciśnienia wykorzystano urządzenie do gromadzenia danych.Kiedy ciśnienie w komorze hodowlanej osiągnie ustawioną wartość progową, do C-PACE-EM wysyłany jest sygnał impulsowy w celu wyzwolenia stymulacji elektrycznej.d Obraz czterech CTCM umieszczonych na półce inkubatora.Cztery urządzenia są podłączone do jednego PPD przez obwód pneumatyczny, a czujniki ciśnienia są wkładane do zaworu hemostatycznego w celu monitorowania ciśnienia w obwodzie pneumatycznym.Każde urządzenie zawiera sześć skrawków tkanki.
Za pomocą jednego siłownika pneumatycznego byliśmy w stanie kontrolować 4 urządzenia CTCM, z których każde mogło pomieścić 6 skrawków tkanek (ryc. 1d).W CTCM ciśnienie powietrza w komorze powietrznej jest przekształcane w ciśnienie synchroniczne w komorze płynowej i indukuje fizjologiczną ekspansję wycinka serca (ryc. 2a i film uzupełniający 1).Ocena rozciągnięcia tkanki przy 80 mm Hg.Sztuka.wykazało rozciągnięcie skrawków tkanki o 25% (ryc. 2b).Wykazano, że to procentowe rozciągnięcie odpowiada fizjologicznej długości sarkomeru wynoszącej 2,2–2,3 µm dla normalnej kurczliwości przekroju serca17,19,25.Ruch tkanki oceniano przy użyciu niestandardowych ustawień aparatu (rysunek uzupełniający 1).Amplituda i prędkość ruchu tkanki (ryc. 2c, d) odpowiadały rozciągnięciu podczas cyklu serca i czasowi podczas skurczu i rozkurczu (ryc. 2b).Rozciągnięcie i prędkość tkanki serca podczas skurczu i relaksacji pozostawały stałe przez 12 dni w hodowli (ryc. 2f).Aby ocenić wpływ stymulacji elektrycznej na kurczliwość podczas hodowli, opracowaliśmy metodę określania aktywnej deformacji za pomocą algorytmu cieniowania (rysunek uzupełniający 2a, b) i byliśmy w stanie rozróżnić deformacje ze stymulacją elektryczną i bez niej.Ten sam fragment serca (ryc. 2f).W ruchomym obszarze nacięcia (R6-9) napięcie podczas stymulacji elektrycznej było o 20% wyższe niż przy braku stymulacji elektrycznej, co wskazuje na udział stymulacji elektrycznej w czynności skurczowej.
Reprezentatywne ślady ciśnienia w komorze powietrznej, ciśnienia w komorze płynu i pomiarów ruchu tkanki potwierdzają, że ciśnienie w komorze zmienia ciśnienie w komorze płynu, powodując odpowiedni ruch skrawka tkanki.b Reprezentatywne ślady procentowego rozciągnięcia (niebieski) skrawków tkanki odpowiadające procentowemu rozciągnięciu (pomarańczowy).c Zmierzony ruch wycinka serca jest zgodny ze zmierzoną prędkością ruchu.( d ) Reprezentatywne trajektorie ruchu cyklicznego (niebieska linia) i prędkości (pomarańczowa linia przerywana) w kawałku serca.e Kwantyfikacja czasu cyklu (n = 19 skrawków na grupę, od różnych świń), czasu skurczu (n = 19 skrawków na grupę), czasu relaksacji (n = 19 skrawków na grupę, od różnych świń), ruchu tkanki (n = 25).plastry)/grupę od różnych świń), szczytową prędkość skurczową (n = 24(D0), 25(D12) skrawków/grupę od różnych świń) i szczytową szybkość relaksacji (n=24(D0), 25(D12) skrawków/grupę od różnych świń).Dwustronny test t-Studenta nie wykazał istotnej różnicy w żadnym parametrze.f Reprezentatywne ślady analizy odkształceń skrawków tkanek z (czerwoną) i bez (niebieskiej) stymulacji elektrycznej, dziesięć regionalnych obszarów skrawków tkanek z tego samego skrawka.Dolne panele pokazują kwantyfikację procentowej różnicy naprężeń w skrawkach tkanek ze stymulacją elektryczną i bez niej w dziesięciu obszarach z różnych skrawków. (n = 8 skrawków/grupę od różnych świń, przeprowadza się dwustronny test t-Studenta; **** p < 0,0001, ** p < 0,01, * p < 0,05). (n = 8 skrawków/grupę od różnych świń, przeprowadza się dwustronny test t-Studenta; **** p < 0,0001, ** p < 0,01, * p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t- критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 sekcji/grupę od różnych świń, dwustronny test t-Studenta; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）. （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）. (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 sekcji/grupę, od różnych świń, dwustronny test t-Studenta; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Słupki błędów przedstawiają średnią ± odchylenie standardowe.
W naszym poprzednim statycznym biomimetycznym systemie hodowli plastrów serca [20, 21] utrzymywaliśmy żywotność, funkcję i strukturalną integralność plastrów serca przez 6 dni, stosując stymulację elektryczną i optymalizując skład pożywki.Jednak po 10 dniach liczby te gwałtownie spadły.Odniesiemy się do skrawków hodowanych w naszym poprzednim statycznym systemie kultury biomimetycznej 20, 21 w warunkach kontrolnych (Ctrl) i użyjemy naszej wcześniej zoptymalizowanej pożywki jako warunków MC i hodowli przy jednoczesnej stymulacji mechanicznej i elektrycznej (CTCM).zwany .Najpierw ustaliliśmy, że stymulacja mechaniczna bez stymulacji elektrycznej była niewystarczająca do utrzymania żywotności tkanki przez 6 dni (Uzupełniająca Ryc. 3a, b).Co ciekawe, wraz z wprowadzeniem stymulacji fizyczno-mechanicznej i elektrycznej za pomocą STCM, żywotność 12-dniowych skrawków serca pozostała taka sama jak w świeżych skrawkach serca w warunkach MS, ale nie w warunkach Ctrl, jak pokazuje analiza MTT (ryc. 1).3a).Sugeruje to, że mechaniczna stymulacja i symulacja cyklu pracy serca mogą utrzymać skrawki tkanek w stanie żywotności dwa razy dłużej niż podano w naszym poprzednim systemie hodowli statycznej.Jednak ocena integralności strukturalnej skrawków tkanek przez znakowanie immunologiczne sercowej troponiny T i koneksyny 43 wykazała, że ​​ekspresja koneksyny 43 była znacznie wyższa w tkankach MC w dniu 12 niż w kontrolach tego samego dnia.Jednak jednolita ekspresja koneksyny 43 i tworzenie dysku Z nie zostały w pełni utrzymane (ryc. 3b).Używamy ram sztucznej inteligencji (AI) do ilościowego określania integralności strukturalnej tkanki26, rurociągu głębokiego uczenia opartego na obrazie opartego na barwieniu troponiną-T i koneksyną43 do automatycznego określania ilościowego integralności strukturalnej i fluorescencji skrawków serca pod względem siły lokalizacji.Ta metoda wykorzystuje konwolucyjną sieć neuronową (CNN) i platformę głębokiego uczenia się, aby wiarygodnie określić ilościowo integralność strukturalną tkanki serca w sposób zautomatyzowany i bezstronny, jak opisano w odnośniku.26. Tkanka MC wykazywała lepsze podobieństwo strukturalne do dnia 0 w porównaniu ze statycznymi skrawkami kontrolnymi.Ponadto barwienie trichromem Massona ujawniło znacznie niższy procent zwłóknienia w warunkach MS w porównaniu z warunkami kontrolnymi w 12 dniu hodowli (ryc. 3c).Chociaż CTCM zwiększyło żywotność skrawków tkanki serca w dniu 12 do poziomu podobnego do świeżej tkanki serca, nie poprawiło znacząco integralności strukturalnej skrawków serca.
a Wykres słupkowy przedstawia kwantyfikację żywotności MTT świeżych skrawków serca (D0) lub hodowanych skrawków serca przez 12 dni w hodowli statycznej (D12 Ctrl) lub w CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) skrawków/grupę od różnych świń, wykonywany jest jednokierunkowy test ANOVA; ####p < 0,0001 w porównaniu z D0 i **p < 0,01 w porównaniu z D12 Ctrl). a Wykres słupkowy przedstawia kwantyfikację żywotności MTT świeżych skrawków serca (D0) lub hodowanych skrawków serca przez 12 dni w hodowli statycznej (D12 Ctrl) lub w CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) skrawków/grupę od różnych świń, wykonywany jest jednokierunkowy test ANOVA; ####p < 0,0001 w porównaniu z D0 i ** p < 0,01 w porównaniu z D12 Ctrl).histogram pokazuje ilościową ocenę żywotności świeżych skrawków serca MTT (D0) lub hodowli skrawków serca przez 12 dni w hodowli statycznej (kontrola D12) lub CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrola D12).)), 12 (D12 MC) skrawków/grupę od różnych świń, przeprowadza się jednokierunkowy test ANOVA;####p < 0,0001 по сравнению с D0 i **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 w porównaniu z D0 i **p < 0,01 w porównaniu z D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) 或心脏切片培养12天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001 ，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D 12 MC) 切片/组,进行单向ANOVA 测试；与D0 相比,####p < 0.0001,与D12 Ctrl 相比,**p。)histogram przedstawiający ilościową ocenę żywotności MTT w świeżych skrawkach serca (D0) lub skrawkach serca hodowanych przez 12 dni w hodowli statycznej (D12 kontrola) lub CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrola)), 12 (D12 MC) skrawków/grupy od różnych świń, jednoczynnikowy test ANOVA;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 w porównaniu z D0, **p < 0,01 w porównaniu z D12 Ctrl).b Troponina-T (zielona), koneksyna 43 (czerwona) i DAPI (niebieska) w świeżo wyizolowanych skrawkach serca (D0) lub skrawkach serca hodowanych w warunkach statycznych (Ctrl) lub warunkach CTCM (MC) przez 12 dni) reprezentatywnych obrazów immunofluorescencyjnych (pusta skala = 100 µm). Kwantyfikacja integralności strukturalnej tkanki serca przy użyciu sztucznej inteligencji (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skrawków/grupę, każdy od innej świni, przeprowadza się jednoczynnikowy test ANOVA; ####p <0,0001 w porównaniu z D0 i ****p <0,0001 w porównaniu z D12 Ctrl). Kwantyfikacja integralności strukturalnej tkanki serca za pomocą sztucznej inteligencji (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skrawków/grupę, każdy od różnych świń, przeprowadza się jednoczynnikowy test ANOVA; ####p <0,0001 w porównaniu z D0 i ****p <0,0001 w porównaniu z D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срез ов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнени ю с D12 Ctrl). Kwantyfikacja integralności strukturalnej tkanki serca za pomocą sztucznej inteligencji (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) skrawków/grup od różnych świń, przeprowadzono jednoczynnikowy test ANOVA; ####p <0,0001 vs. z D0 i ****p <0,0001 w porównaniu z D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) wycinki/grupy każdej z różnych świń, jednoczynnikowy test ANOVA;####p < 0,0001 与D0 相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) wycinki/grupy różnych świń, jednoczynnikowy test ANOVA;####p < 0,0001 与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) сре зов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D 12 Ctrl). Sztuczna inteligencja do ilościowego określenia integralności strukturalnej tkanki serca (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sekcje/grupy każdej z różnych świń, jednoczynnikowy test ANOVA; ####p<0,0001 vs.D0 Dla porównania ****p <0,0001 w porównaniu z D12 Ctrl). c Reprezentatywne obrazy (po lewej) i ocena ilościowa (po prawej) dla skrawków serca wybarwionych trichromem Massona (skala naga = 500 µm) (n = 10 skrawków/grupę, każdy od innej świni, przeprowadza się jednokierunkowy test ANOVA; ####p <0,0001 w porównaniu z D0 i ***p <0,001 w porównaniu z D12 Ctrl). c Reprezentatywne obrazy (po lewej) i ocena ilościowa (po prawej) dla skrawków serca wybarwionych trichromem Massona (skala naga = 500 µm) (n = 10 skrawków/grupę, każdy od różnych świń, przeprowadza się jednoczynnikowy test ANOVA; #### p <0,0001 w porównaniu z D0 i ***p <0,001 w porównaniu z D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется одностор онний тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 i *** p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Reprezentatywne obrazy (po lewej) i ocena ilościowa (po prawej) skrawków serca barwionych trichromem Massona (skala niepowleczona = 500 µm) (n = 10 skrawków/grupę od różnych świń, przeprowadzono jednokierunkowy test ANOVA; #### p < 0,0001 w porównaniu z D0 i *** p < 0,001 w porównaniu z D12 Ctrl). C 用 Masson 三 色 染料 染色 的 心脏 切片 的 代表性 图像 （左） 和 量化 （右） （裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片/组 ， 每 组 来自 不同 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 的 ， ， 进行 进行 进行 单向 单向 单向 ；## 相比 相比 ， ， 组 来自 不同 的 猪 ， 的 的 的 ， 进行 进行 进行 进行 单向 单向 ；### P <0,0001 与 d0 每 ， 组 来自 不同 的 猪 ， 进行 进行 进行 单向 单向 ； 相比 相比 相比 ， 组 来自 不同 的 的 ， 不同 的 的 的 的 的 的 的 ， ， 进行 进行 进行 单向 单向 ANOVA 测试 ~ l 相比。。 C 用 masson 三 色 染料 的 心 脏 切 片 的 代 表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度 = 500 µm) （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0,0001 与D0相比,***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощь ю однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Reprezentatywne obrazy (po lewej) i ocena ilościowa (po prawej) skrawków serca barwionych trichromem Massona (puste = 500 µm) (n = 10 skrawków/grupę, każdy od innej świni, testowane przez jednoczynnikową analizę wariancji;#### p <0,0001 w porównaniu z D0, ***p <0,001 w porównaniu z D12 Ctrl).Słupki błędów przedstawiają średnią ± odchylenie standardowe.
Postawiliśmy hipotezę, że dodanie małych cząsteczek do pożywki hodowlanej może poprawić integralność kardiomiocytów i zmniejszyć rozwój zwłóknienia podczas hodowli CTCM.Dlatego przeprowadziliśmy badania przesiewowe pod kątem małych cząsteczek przy użyciu naszych statycznych kultur kontrolnych20,21 ze względu na niewielką liczbę czynników zakłócających.Do tego przesiewu wybrano deksametazon (Dex), trijodotyroninę (T3) i SB431542 (SB).Te małe cząsteczki były wcześniej stosowane w hodowlach hiPSC-CM do indukowania dojrzewania kardiomiocytów poprzez zwiększanie długości sarkomerów, kanalików T i prędkości przewodzenia.Ponadto wiadomo, że zarówno Dex (glukokortykoid), jak i SB hamują stany zapalne29,30.Dlatego przetestowaliśmy, czy włączenie jednej lub kombinacji tych małych cząsteczek poprawi integralność strukturalną skrawków serca.Do wstępnego badania przesiewowego dawkę każdego związku wybrano na podstawie stężeń powszechnie stosowanych w modelach hodowli komórkowych (1 μM Dex27, 100 nM T327 i 2,5 μM SB31).Po 12 dniach hodowli połączenie T3 i Dex skutkowało optymalną integralnością strukturalną kardiomiocytów i minimalną przebudową włóknistą (dodatkowe ryciny 4 i 5).Ponadto zastosowanie podwójnych lub podwójnych stężeń T3 i Dex powodowało szkodliwe skutki w porównaniu z normalnymi stężeniami (Uzupełniająca Ryc. 6a, b).
Po wstępnym badaniu przesiewowym przeprowadziliśmy bezpośrednie porównanie 4 warunków hodowli (ryc. 4a): Ctrl: skrawki serca hodowane w naszej wcześniej opisanej hodowli statycznej przy użyciu naszej zoptymalizowanej pożywki;20.21 TD: T3 i Ctrl s Dodano Dex w środę;MC: skrawki serca hodowane w CTCM przy użyciu naszej wcześniej zoptymalizowanej pożywki;i MT: CTCM z T3 i Dex dodanymi do pożywki.Po 12 dniach hodowli żywotność tkanek MS i MT pozostała taka sama jak w świeżych tkankach ocenionych za pomocą testu MTT (ryc. 4b).Co ciekawe, dodanie T3 i Dex do hodowli transwell (TD) nie spowodowało znaczącej poprawy żywotności w porównaniu z warunkami Ctrl, co wskazuje na ważną rolę stymulacji mechanicznej w utrzymaniu żywotności skrawków serca.
schemat projektu eksperymentu przedstawiający cztery warunki hodowli stosowane do oceny wpływu stymulacji mechanicznej i suplementacji T3/Dex na pożywkę przez 12 dni. b Wykres słupkowy przedstawia ilościową ocenę żywotności 12 dni po hodowli we wszystkich 4 warunkach hodowli (Ctrl, TD, MC i MT) w porównaniu ze świeżymi skrawkami serca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), 12 (D12 MC) skrawków/grupę od różnych świń, wykonywany jest jednokierunkowy test ANOVA; ####p < 0,0001, # ##p < 0,001 w porównaniu z D0 i **p < 0,01 w porównaniu z D12 Ctrl). b Wykres słupkowy przedstawia ilościową ocenę żywotności 12 dni po hodowli we wszystkich 4 warunkach hodowli (Ctrl, TD, MC i MT) w porównaniu ze świeżymi skrawkami serca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), 12 (D12 MC) skrawków/grupę od różnych świń, wykonywany jest jednokierunkowy test ANOVA; ####p < 0,0001, # ##p < 0,001 w porównaniu z D0 i **p < 0,01 w porównaniu z D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнен ию с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Wykres słupkowy pokazuje ilościową ocenę żywotności 12 dni po hodowli we wszystkich 4 warunkach hodowli (kontrola, TD, MC i MT) w porównaniu ze świeżymi skrawkami serca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), 12 (D12 MC) skrawkami/grupą od różnych świń, jednokierunkowy test ANOVA; ####p < 0,0001, ### p < 0,001 vs. D0 i **p < 0,01 w porównaniu z D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD 和D1 2 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p <0.001 与D0 相比，**p <0.0 1 与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), z разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 , ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram przedstawiający wszystkie 4 warunki hodowli (kontrola, TD, MC i MT) w porównaniu ze świeżymi skrawkami serca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), od różnych świń 12 (D12 MC) skrawków/grupę, jednoczynnikowy test ANOVA; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,0 1 vs. kontrola D12). c Wykres słupkowy pokazuje ilościową ocenę przepływu glukozy 12 dni po hodowli we wszystkich 4 warunkach hodowli (Ctrl, TD, MC i MT) w porównaniu ze świeżymi skrawkami serca (D0) (n = 6 skrawków/grupę od różnych świń, przeprowadza się jednokierunkowy test ANOVA; ### p < 0,001 w porównaniu z D0 i *** p < 0,001 w porównaniu z D12 Ctrl). c Wykres słupkowy pokazuje ilościową ocenę przepływu glukozy 12 dni po hodowli we wszystkich 4 warunkach hodowli (Ctrl, TD, MC i MT) w porównaniu ze świeżymi skrawkami serca (D0) (n = 6 skrawków/grupę od różnych świń, przeprowadza się jednokierunkowy test ANOVA; ### p < 0,001 w porównaniu z D0 i *** p < 0,001 w porównaniu z D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от ра зных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 i ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogram pokazuje ilościową ocenę przepływu glukozy 12 dni po hodowli we wszystkich 4 warunkach hodowli (kontrola, TD, MC i MT) w porównaniu ze świeżymi skrawkami serca (D0) (n = 6 skrawków/grupę od różnych świń, przeprowadzono jednokierunkowy test ANOVA; ###p < 0,001 w porównaniu z D0 i ***p <0,001 w porównaniu z D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12 天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt) 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 ， 培ANOVA测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа , z разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 ( контроль). c Histogram przedstawiający kwantyfikację przepływu glukozy w 12 dni po hodowli dla wszystkich 4 warunków hodowli (kontrola, TD, MC i MT) w porównaniu ze świeżymi skrawkami serca (D0) (n = 6 skrawków/grupę, od różnych świń, jednostronnie przeprowadzono testy ANOVA, ### p < 0,001 w porównaniu z D0, *** p < 0,001 w porównaniu z D12 (kontrola).d Wykresy analizy odkształceń świeżych (niebieskich), 12-dniowych MC (zielonych) i 12-dniowych MT (czerwonych) tkanek w dziesięciu regionalnych punktach przekroju tkanek (n = 4 skrawki / grupę, jednokierunkowy test ANOVA; nie było znaczącej różnicy między grupami).e Wykres wulkanu przedstawiający geny o zróżnicowanej ekspresji w świeżych skrawkach serca (D0) w porównaniu z skrawkami serca hodowanymi w warunkach statycznych (Ctrl) lub w warunkach MT (MT) przez 10-12 dni.f Mapa termiczna genów sarkomeru dla skrawków serca hodowanych w każdych warunkach hodowli.Słupki błędów przedstawiają średnią ± odchylenie standardowe.
Metaboliczna zależność od przejścia od utleniania kwasów tłuszczowych do glikolizy jest cechą charakterystyczną odróżnicowania kardiomiocytów.Niedojrzałe kardiomiocyty wykorzystują głównie glukozę do produkcji ATP i mają hipoplastyczne mitochondria z kilkoma cristae5,32.Analizy wykorzystania glukozy wykazały, że w warunkach MC i MT wykorzystanie glukozy było podobne do tego w tkankach dnia 0 (ryc. 4c).Jednak próbki Ctrl wykazały znaczny wzrost wykorzystania glukozy w porównaniu ze świeżą tkanką.Wskazuje to, że połączenie CTCM i T3/Dex zwiększa żywotność tkanek i zachowuje fenotyp metaboliczny 12-dniowych hodowanych skrawków serca.Ponadto analiza odkształceń wykazała, że ​​poziomy odkształceń pozostały takie same jak w świeżej tkance serca przez 12 dni w warunkach MT i MS (ryc. 4d).
Aby przeanalizować ogólny wpływ CTCM i T3 / Dex na globalny krajobraz transkrypcyjny tkanki wycinka serca, wykonaliśmy RNAseq na skrawkach serca ze wszystkich czterech różnych warunków hodowli (dane uzupełniające 1).Co ciekawe, skrawki MT wykazywały wysokie podobieństwo transkrypcyjne do świeżej tkanki serca, przy czym tylko 16 różnicowało ekspresję z 13 642 genów.Jednak, jak pokazaliśmy wcześniej, plasterki Ctrl wykazywały 1229 różnie wyrażanych genów po 10–12 dniach hodowli (ryc. 4e).Dane te zostały potwierdzone przez qRT-PCR genów serca i fibroblastów (Uzupełniająca Fig. 7a-c).Co ciekawe, sekcje Ctrl wykazały obniżenie genów cyklu sercowego i komórkowego oraz aktywację programów genów zapalnych.Dane te sugerują, że odróżnicowanie, które zwykle występuje po długotrwałej hodowli, jest całkowicie osłabione w warunkach MT (Uzupełniająca Ryc. 8a, b).Dokładne badanie genów sarkomeru wykazało, że tylko w warunkach MT zachowane są geny kodujące sarkomer (ryc. 4f) i kanał jonowy (dodatkowa ryc. 9), chroniąc je przed supresją w warunkach Ctrl, TD i MC.Dane te pokazują, że przy połączeniu stymulacji mechanicznej i humoralnej (T3/Dex) transkryptom skrawka serca może pozostać podobny do świeżych skrawków serca po 12 dniach hodowli.
Te wyniki transkrypcji są poparte faktem, że integralność strukturalna kardiomiocytów w skrawkach serca jest najlepiej zachowana w warunkach MT przez 12 dni, jak pokazuje nienaruszona i zlokalizowana koneksyna 43 (ryc. 5a).Ponadto zwłóknienie w skrawkach serca w warunkach MT było znacznie zmniejszone w porównaniu z Ctrl i podobnie jak w przypadku świeżych skrawków serca (ryc. 5b).Dane te pokazują, że połączenie stymulacji mechanicznej i traktowania T3/Dex skutecznie zachowuje strukturę serca w skrawkach serca w hodowli.
a Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne troponiny-T (zielona), koneksyny 43 (czerwona) i DAPI (niebieska) w świeżo wyizolowanych skrawkach serca (D0) lub hodowanych przez 12 dni we wszystkich czterech warunkach hodowli skrawków serca (pasek skali = 100 µm).). Kwantyfikacja integralności strukturalnej tkanki serca za pomocą sztucznej inteligencji (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) skrawków / grupa od różnych świń, przeprowadzany jest jednoczynnikowy test ANOVA; #### p < 0,0001 w porównaniu z D0 i * p < 0,05 lub ****p < 0,0001 w porównaniu z D12 Ctrl). Kwantyfikacja integralności strukturalnej tkanki serca za pomocą sztucznej inteligencji (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) skrawków / grupa od różnych świń, wykonywany jest jednokierunkowy test ANOVA; #### p < 0,0001 w porównaniu z D0 i * p < 0,05 lub ****p < 0,0001 w porównaniu z D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 T D, D12 MC i D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 lub ****p < 0,0001 w przypadku D12 Ctrl). Kwantyfikacja integralności strukturalnej tkanki serca przy użyciu sztucznej inteligencji (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) skrawków/grup od różnych świń, przeprowadzono jednokierunkowy test ANOVA; #### p < 0,0001 w porównaniu z D0 i * p < 0,05 lub ****p < 0,0001 w porównaniu z D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt) 组） 人工智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.Kwantyfikacja integralności strukturalnej tkanki serca przy użyciu sztucznej inteligencji u różnych świń (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) sekcje/grupa) za pomocą jednokierunkowego testu ANOVA;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 lub ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 w porównaniu z D0 i *p < 0,05 lub ****p < 0,0001 w porównaniu z D12 Ctrl). b Reprezentatywne obrazy i kwantyfikacje dla skrawków serca wybarwionych trichromem Massona (pasek skali = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) skrawków/grupę od różnych świń, przeprowadza się jednokierunkowy test ANOVA; ####p <0,0001 w porównaniu z D0 i ***p <0,001, lub ****p < 0,0001 w porównaniu z D12 Ctrl). b Reprezentatywne obrazy i kwantyfikacje dla skrawków serca wybarwionych trichromem Massona (pasek skali = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) skrawków/grupę od różnych świń, przeprowadza się jednokierunkowy test ANOVA; ####p <0,0001 w porównaniu z D0 i ***p <0,001, lub ****p < 0,0001 w porównaniu z D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Масс она (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняетс я односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 i ***p < 0,001 lub ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Reprezentatywne obrazy i ocena ilościowa skrawków serca wybarwionych trichromem Massona (pasek skali = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) skrawków / grupa od różnych świń, przeprowadzona jednoczynnikowa ANOVA; #### p <0,0001 vs. D0 i ***p <0,001 lub ****p <0,0 001 kontra D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比，***p <0 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心 脏 切片 的 代 表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm) （n = 10 （d0 、 d12 ctr l 、 d12 td 和 d12 mc) 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масшта бная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 lub ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Reprezentatywne obrazy i ocena ilościowa skrawków serca barwionych trichromem Massona (pasek skali = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) skrawków od różnych świń/grup, jedna metoda ANOVA; ####p <0,0001 w porównaniu z D0, ***p <0,001 lub ****p <0,0001 w porównaniu do D12 Ctrl).Słupki błędów przedstawiają średnią ± odchylenie standardowe.
Na koniec oceniono zdolność CTCM do naśladowania przerostu mięśnia sercowego poprzez zwiększenie rozciągnięcia tkanki mięśnia sercowego.W CTCM szczytowe ciśnienie w komorze powietrznej wzrosło z 80 mmHg do 80 mmHg.Sztuka.(normalne rozciągnięcie) do 140 mmHg Nr art.(Rys. 6a).Odpowiada to 32% wzrostowi rozciągnięcia (ryc. 6b), co wcześniej pokazano jako odpowiednie procentowe rozciągnięcie wymagane dla przekrojów serca, aby osiągnąć długość sarkomeru podobną do tej obserwowanej w przeroście.Rozciągnięcie i prędkość tkanki serca podczas skurczu i rozkurczu pozostawały stałe przez sześć dni hodowli (ryc. 6c).Tkanka serca z warunków MT była poddawana normalnemu rozciąganiu (MT (Normalna)) lub nadmiernemu rozciąganiu (MT (OS)) przez sześć dni.Już po czterech dniach hodowli hipertroficzny biomarker NT-ProBNP był znacząco podwyższony w pożywce w warunkach MT (OS) w porównaniu z warunkami MT (normalnymi) (ryc. 7a).Ponadto po sześciu dniach hodowli wielkość komórek w MT (OS) (ryc. 7b) znacznie wzrosła w porównaniu ze skrawkami serca MT (normalne).Ponadto translokacja jądrowa NFATC4 była znacznie zwiększona w nadmiernie rozciągniętych tkankach (ryc. 7c).Wyniki te pokazują postępujący rozwój patologicznej przebudowy po nadmiernym rozdęciu i potwierdzają koncepcję, że urządzenie CTCM może być używane jako platforma do badania sygnalizacji przerostu mięśnia sercowego wywołanego rozciąganiem.
Reprezentatywne ślady ciśnienia w komorze powietrznej, ciśnienia w komorze płynu i pomiarów ruchu tkanki potwierdzają, że ciśnienie w komorze zmienia ciśnienie w komorze płynu, powodując odpowiedni ruch skrawka tkanki.b Reprezentatywne krzywe procentu rozciągnięcia i szybkości rozciągania dla skrawków tkanki normalnie rozciągniętych (pomarańczowy) i nadmiernie rozciągniętych (niebieski).c Wykres słupkowy przedstawiający czas cyklu (n = 19 plastrów na grupę, od różnych świń), czas skurczu (n = 18-19 plastrów na grupę, od różnych świń), czas relaksacji (n = 19 plastrów na grupę, od różnych świń)), amplitudę ruchu tkanki (n = 14 plastrów/grupę, od różnych świń), szczytową prędkość skurczową (n = 14 plastrów/grupę, od różnych świń) i szczytową szybkość relaksacji (n = 14 (D0), 1 5 (D6) ) skrawków/grup) od różnych świń), dwustronny test t-Studenta nie wykazał istotnej różnicy w żadnym parametrze, co wskazuje, że parametry te pozostały stałe podczas 6 dni hodowli z przepięciem.Słupki błędów przedstawiają średnią ± odchylenie standardowe.
a Wykres słupkowy ilościowego oznaczania stężenia NT-ProBNP w pożywce hodowlanej z wycinków serca hodowanych w warunkach normalnego rozciągania MT (Norma) lub nadmiernego rozciągania (OS) (n = 4 (D2 MTNorma), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorma i D4 MTOS) skrawki/grupa od różnych świń, przeprowadzana jest dwukierunkowa ANOVA; **p < 0,01 w porównaniu do normalnego rozciągania). a Wykres słupkowy ilościowego oznaczania stężenia NT-ProBNP w pożywce hodowlanej z wycinków serca hodowanych w warunkach normalnego rozciągania MT (Norma) lub nadmiernego rozciągania (OS) (n = 4 (D2 MTNorma), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorma i D4 MTOS) skrawki/grupa od różnych świń, przeprowadzana jest dwukierunkowa ANOVA; ** p < 0,01 w porównaniu do normalnego rozciągania).Histogram ilościowy stężenia NT-ProBNP w pożywce hodowlanej z wycinków serca hodowanych w warunkach normalnego rozciągnięcia MT (norma) lub nadmiernego rozciągnięcia (OS) (n = 4 (D2 MTNorma), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorma i D4).MTOS) skrawków/grupę od różnych świń, przeprowadzana jest dwuczynnikowa analiza wariancji;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 w porównaniu do normalnego rozciągania). a 在MT 正常拉伸(Norma) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm lub D4 MTOS) ，p < 0,01）. a Kwantyfikacja stężenia NT-ProBNP w skrawkach serca hodowanych w warunkach MT normalnego rozciągania (Norm) lub nadmiernego rozciągania (OS) (n = 4 (D2 MTNorma), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorma? D4 MTOS) z różnych动; **w porównaniu z normalnym rozciąganiem, p < 0,01).histogram Kwantyfikacja stężeń NT-ProBNP w skrawkach serca hodowanych w warunkach normalnego rozciągnięcia MT (norma) lub nadmiernego rozciągnięcia (OS) (n = 4 (D2 MTNorma), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorma) i D4 MTOS) skrawków/grupę od różnych świń, dwukierunkowa analiza wariancji;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 w porównaniu do normalnego rozciągania). b Reprezentatywne obrazy dla skrawków serca barwionych troponiną-T i WGA (po lewej) oraz oznaczanie ilościowe wielkości komórek (po prawej) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) komórek/grupa z 10 różnych skrawków od różnych świń, przeprowadzany jest dwustronny test t-Studenta; **** p <0, 0001 w porównaniu do normalnego rozciągania). b Reprezentatywne obrazy dla skrawków serca barwionych troponiną-T i WGA (po lewej) oraz oznaczanie ilościowe wielkości komórek (po prawej) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) komórek/grupa z 10 różnych skrawków od różnych świń, przeprowadza się dwustronny test t-Studenta; ****p <0,0001 w porównaniu z normalnym rozciągnięciem). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного опре деления размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Reprezentatywne obrazy skrawków serca wybarwionych troponiną-T i AZP (po lewej) oraz oznaczenie ilościowe wielkości komórek (po prawej) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) komórek/grupa z 10 różnych skrawków od różnych świń, przeprowadzono dwustronny test t-Studenta; ****p <0,0001 w porównaniu do normalnego szczepu). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS ），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比,****p < 0,0001）. b Reprezentatywne obrazy skrawków serca wybarwionych kalkareiną-T i WGA (po lewej) i wielkością komórek (po prawej) (n = 330 (D6 MTOS), 369 z 10 różnych skrawków (D6 MTNorm)) Komórki / ? b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оцен ка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorma) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторо нние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Reprezentatywne obrazy skrawków serca wybarwionych troponiną-T i AZP (po lewej) i ilościowe oznaczenie wielkości komórek (po prawej) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorma) z 10 różnych skrawków od różnych świń) Komórki/grupy, kryterium dwustronne t Studenta;**** p < 0,0001 w porównaniu z odkształceniem normalnym). c Reprezentatywne obrazy dla dnia 0 i dnia 6 wycinki serca MTOS znakowane immunologicznie pod kątem troponiny-T i NFATC4 oraz ilościowa ocena translokacji NFATC4 do jąder CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) skrawki / grupa od różnych świń, przeprowadza się dwustronny test t-Studenta; * p <0, 05). c Reprezentatywne obrazy dla dnia 0 i dnia 6 wycinki serca MTOS znakowane immunologicznie pod kątem troponiny-T i NFATC4 oraz ilościowa ocena translokacji NFATC4 do jąder CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) skrawki / grupa od różnych świń, przeprowadza się dwustronny test t Studenta; * p <0, 05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 i 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т i NFATC4, и кол ичественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-kryterij Стьюдента; *p < 0,05). c Reprezentatywne obrazy skrawków serca w 0 i 6 dniu MTOS, znakowane immunologicznie dla troponiny-T i NFATC4 oraz ilościowa ocena translokacji NFATC4 w jądrze komórek jamistych (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) skrawki / grupa od różnych świń) przeprowadzono dwustronny test t-Studenta;*p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表性图像, 以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验;*p < 0,05). c Reprezentatywne obrazy znakowania immunologicznego kalkaniną-T i NFATC4 第0天和第6天MTOS i NFATC4 z różnych jąder komórkowych NFATC4 易位至CM ? ilość?生et 电影; * p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 i 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и коли чественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критери © Стьюдента; *p < 0,05). c Reprezentatywne obrazy skrawków serca MTOS w dniu 0 i 6 do znakowania immunologicznego troponiną-T i NFATC4 oraz ilościowego oznaczenia translokacji NFATC4 w jądrze CM od różnych świń (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) skrawki / grupa, dwustronne kryterium t Studenta; * p <0, 05).Słupki błędów przedstawiają średnią ± odchylenie standardowe.
Translacyjne badania sercowo-naczyniowe wymagają modeli komórkowych, które dokładnie odtwarzają środowisko serca.W tym badaniu opracowano i scharakteryzowano urządzenie CTCM, które może stymulować ultracienkie sekcje serca.System CTCM obejmuje fizjologicznie zsynchronizowaną stymulację elektromechaniczną oraz wzbogacanie płynami T3 i Dex.Kiedy skrawki serca świni były narażone na te czynniki, ich żywotność, integralność strukturalna, aktywność metaboliczna i ekspresja transkrypcyjna pozostały takie same jak w świeżej tkance serca po 12 dniach hodowli.Ponadto nadmierne rozciąganie tkanki serca może powodować przerost serca spowodowany przeprostem.Ogólnie rzecz biorąc, wyniki te potwierdzają kluczową rolę fizjologicznych warunków hodowli w utrzymaniu prawidłowego fenotypu serca i zapewniają platformę do badań przesiewowych leków.
Na stworzenie optymalnego środowiska dla funkcjonowania i przeżycia kardiomiocytów składa się wiele czynników.Najbardziej oczywiste z tych czynników są związane z (1) interakcjami międzykomórkowymi, (2) stymulacją elektromechaniczną, (3) czynnikami humoralnymi i (4) substratami metabolicznymi.Fizjologiczne interakcje między komórkami wymagają złożonych trójwymiarowych sieci wielu typów komórek wspieranych przez macierz zewnątrzkomórkową.Takie złożone interakcje komórkowe są trudne do zrekonstruowania in vitro przez wspólną hodowlę poszczególnych typów komórek, ale można je łatwo osiągnąć, wykorzystując organotypową naturę skrawków serca.
Mechaniczne rozciąganie i elektryczna stymulacja kardiomiocytów mają kluczowe znaczenie dla utrzymania fenotypu serca33,34,35.Podczas gdy stymulacja mechaniczna była szeroko stosowana do kondycjonowania i dojrzewania hiPSC-CM, w kilku eleganckich badaniach podjęto ostatnio próbę mechanicznej stymulacji skrawków serca w hodowli przy użyciu obciążenia jednoosiowego.Badania te pokazują, że jednoosiowe obciążenie mechaniczne 2D ma pozytywny wpływ na fenotyp serca podczas hodowli.W tych badaniach skrawki serca albo obciążano izometrycznymi siłami rozciągającymi17, liniowym obciążeniem auksotonicznym18, albo odtworzono cykl pracy serca za pomocą sprzężenia zwrotnego przetwornika siły i napędów napięciowych.Jednak metody te wykorzystują jednoosiowe rozciąganie tkanki bez optymalizacji środowiskowej, co skutkuje supresją wielu genów sercowych lub nadekspresją genów związanych z nieprawidłowymi odpowiedziami na rozciąganie.Opisany tutaj CTCM zapewnia elektromechaniczny bodziec 3D, który naśladuje naturalny cykl serca pod względem czasu cyklu i fizjologicznego rozciągnięcia (25% rozciągnięcia, 40% skurczu, 60% rozkurczu i 72 uderzeń na minutę).Chociaż sama trójwymiarowa stymulacja mechaniczna nie wystarcza do utrzymania integralności tkanki, do odpowiedniego utrzymania żywotności, funkcji i integralności tkanki wymagane jest połączenie stymulacji humoralnej i mechanicznej za pomocą T3/Dex.
Czynniki humoralne odgrywają ważną rolę w modulowaniu fenotypu dorosłego serca.Zostało to podkreślone w badaniach HiPS-CM, w których T3 i Dex dodano do pożywki hodowlanej w celu przyspieszenia dojrzewania komórek.T3 może wpływać na transport aminokwasów, cukrów i wapnia przez błony komórkowe36.Ponadto T3 promuje ekspresję MHC-α i regulację w dół MHC-β, promując tworzenie szybkokurczliwych miofibryli w dojrzałych kardiomiocytach w porównaniu z wolnokurczliwymi miofibrylami w miopatii płodowej.Niedobór T3 u pacjentów z niedoczynnością tarczycy powoduje utratę prążków miofibrylarnych i zmniejszone tempo rozwoju napięcia37.Dex działa na receptory glukokortykoidowe i wykazano, że zwiększa kurczliwość mięśnia sercowego w izolowanych perfundowanych sercach;38 Uważa się, że ta poprawa jest związana z wpływem na wejście spowodowane osadami wapnia (SOCE) 39,40.Ponadto Dex wiąże się ze swoimi receptorami, powodując szeroką odpowiedź wewnątrzkomórkową, która tłumi funkcje odpornościowe i stany zapalne30.
Nasze wyniki wskazują, że fizyczna stymulacja mechaniczna (MS) poprawiła ogólną wydajność hodowli w porównaniu z Ctrl, ale nie utrzymała żywotności, integralności strukturalnej i ekspresji serca w ciągu 12 dni hodowli.W porównaniu z Ctrl, dodanie T3 i Dex do hodowli CTCM (MT) poprawiło żywotność i utrzymało podobne profile transkrypcji, integralność strukturalną i aktywność metaboliczną ze świeżą tkanką serca przez 12 dni.Ponadto, kontrolując stopień rozciągnięcia tkanki, stworzono model przerostu mięśnia sercowego wywołanego przeprostem przy użyciu STCM, ilustrujący wszechstronność systemu STCM.Należy zauważyć, że chociaż przebudowa serca i zwłóknienie zwykle obejmują nienaruszone narządy, których krążące komórki mogą dostarczać odpowiednich cytokin, jak również fagocytozę i inne czynniki przebudowy, sekcje serca mogą nadal naśladować proces włóknienia w odpowiedzi na stres i uraz.do miofibroblastów.Zostało to wcześniej ocenione w tym modelu wycinka serca.Należy zauważyć, że parametry CTCM można modulować poprzez zmianę amplitudy i częstotliwości ciśnienia/elektrycznej w celu symulacji wielu stanów, takich jak tachykardia, bradykardia i mechaniczne wspomaganie krążenia (mechaniczne odciążenie serca).To sprawia, że ​​system ma średnią przepustowość do testowania leków.Zdolność CTCM do modelowania przerostu serca wywołanego nadmiernym wysiłkiem toruje drogę do testowania tego systemu pod kątem spersonalizowanej terapii.Podsumowując, niniejsze badanie pokazuje, że mechaniczne rozciąganie i stymulacja humoralna mają kluczowe znaczenie dla utrzymania hodowli skrawków tkanki serca.
Chociaż przedstawione tutaj dane sugerują, że CTCM jest bardzo obiecującą platformą do modelowania nienaruszonego mięśnia sercowego, ta metoda hodowli ma pewne ograniczenia.Głównym ograniczeniem hodowli CTCM jest to, że nakłada ona ciągłe dynamiczne naprężenia mechaniczne na plastry, co wyklucza możliwość aktywnego monitorowania skurczów skrawków serca podczas każdego cyklu.Ponadto, ze względu na mały rozmiar skrawków serca (7 mm), możliwość oceny funkcji skurczowej poza systemami hodowlanymi przy użyciu tradycyjnych czujników siły jest ograniczona.W obecnym manuskrypcie częściowo przezwyciężyliśmy to ograniczenie, oceniając napięcie optyczne jako wskaźnik funkcji skurczowej.Jednak to ograniczenie będzie wymagało dalszych prac i może zostać rozwiązane w przyszłości poprzez wprowadzenie metod optycznego monitorowania funkcji skrawków serca w hodowli, takich jak mapowanie optyczne przy użyciu barwników wapniowych i wrażliwych na napięcie.Kolejnym ograniczeniem CTCM jest to, że działający model nie manipuluje stresem fizjologicznym (obciążeniem wstępnym i następczym).W CTCM indukowano ciśnienie w przeciwnych kierunkach, aby odtworzyć 25% fizjologiczne rozciągnięcie w rozkurczu (pełne rozciągnięcie) i skurczu (długość skurczu podczas stymulacji elektrycznej) w bardzo dużych tkankach.Ograniczenie to powinno zostać usunięte w przyszłych projektach CTCM poprzez odpowiedni nacisk na tkankę serca z obu stron i zastosowanie dokładnych zależności ciśnienie-objętość, które występują w komorach serca.
Przebudowa wywołana nadmiernym rozciąganiem opisana w tym manuskrypcie ogranicza się do naśladowania przerostowych sygnałów hipertroficznych.Zatem model ten może pomóc w badaniu sygnalizacji hipertroficznej wywołanej rozciąganiem bez potrzeby stosowania czynników humoralnych lub neuronalnych (które nie występują w tym systemie).Potrzebne są dalsze badania w celu zwiększenia liczebności CTCM, na przykład współhodowli z komórkami odpornościowymi, czynnikami humoralnymi krążącymi w osoczu i unerwieniem, gdy współhodowla z komórkami neuronalnymi poprawi możliwości modelowania chorób za pomocą CTCM.
W tym badaniu wykorzystano trzynaście świń.Wszystkie procedury na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zostały zatwierdzone przez Komitet Instytucjonalnej Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania Uniwersytetu w Louisville.Łuk aorty zaciśnięto i serce poddano perfuzji 1 l jałowej kardioplegii (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/ml heparyny, pH do 7,4); serca przechowywano w lodowatym roztworze kardioplegicznym do czasu transportu do laboratorium na lodzie, co zwykle trwa <10 min. serca przechowywano w lodowatym roztworze kardioplegicznym do czasu transportu do laboratorium na lodzie, co zwykle trwa <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимае т <10 min. serca przechowywano w lodowatym roztworze kardioplegicznym do czasu transportu do laboratorium na lodzie, co zwykle trwa <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min. Trzymaj serca na lodzie kardioplegia do czasu transportu do laboratorium na lodzie, zwykle <10 min.
Urządzenie CTCM zostało opracowane w oprogramowaniu do projektowania wspomaganego komputerowo (CAD) SolidWorks.Komory hodowlane, przegrody i komory powietrzne wykonane są z przezroczystego tworzywa akrylowego CNC.Pierścień oporowy o średnicy 7 mm jest wykonany z polietylenu o wysokiej gęstości (HDPE) w środku i ma rowek na o-ring, w którym mieści się silikonowy o-ring używany do uszczelnienia nośnika pod spodem.Cienka membrana krzemionkowa oddziela komorę hodowlaną od płytki rozdzielającej.Membrana silikonowa jest wycinana laserowo z arkusza silikonowego o grubości 0,02 cala i ma twardość 35A.Dolna i górna uszczelka silikonowa są wycinane laserowo z arkusza silikonowego o grubości 1/16″ i mają twardość 50A.Śruby i nakrętki motylkowe ze stali nierdzewnej 316L służą do mocowania bloku i tworzenia hermetycznego uszczelnienia.
Dedykowana płytka drukowana (PCB) jest przeznaczona do integracji z systemem C-PACE-EM.Gniazda złącza maszyny szwajcarskiej na płytce drukowanej są połączone z elektrodami grafitowymi za pomocą posrebrzanych drutów miedzianych i śrub z brązu 0-60 wkręconych w elektrody.Płytka drukowana umieszczona jest w obudowie drukarki 3D.
Urządzenie CTCM jest sterowane przez programowalny siłownik pneumatyczny (PPD), który wytwarza kontrolowane ciśnienie krążenia, podobne do cyklu pracy serca.Wraz ze wzrostem ciśnienia wewnątrz komory powietrznej, elastyczna membrana silikonowa rozszerza się w górę, wpychając medium pod tkankę.Obszar tkanki zostanie następnie rozciągnięty przez to wydalenie płynu, naśladując fizjologiczną ekspansję serca podczas rozkurczu.W szczytowym momencie relaksacji zastosowano stymulację elektryczną za pomocą elektrod grafitowych, co obniżyło ciśnienie w komorze powietrznej i spowodowało skurcz skrawków tkanek.Wewnątrz rurki znajduje się zawór hemostatyczny z czujnikiem ciśnienia do wykrywania ciśnienia w układzie powietrznym.Ciśnienie wykrywane przez czujnik ciśnienia jest przykładane do kolektora danych podłączonego do laptopa.Pozwala to na ciągłe monitorowanie ciśnienia wewnątrz komory gazowej.Po osiągnięciu maksymalnego ciśnienia w komorze (standardowe 80 mmHg, 140 mmHg OS) zlecono urządzeniu do akwizycji danych wysłanie sygnału do systemu C-PACE-EM w celu wygenerowania dwufazowego sygnału napięciowego przez 2 ms, ustawionego na 4 V.
Uzyskano skrawki serca i warunki hodowli w 6 studzienkach przeprowadzono w następujący sposób: Przeniesiono zebrane serca z naczynia do przenoszenia na tacę zawierającą zimną (4°C) kardioplegię.Lewą komorę izolowano sterylnym ostrzem i krojono na kawałki o objętości 1-2 cm3.Te bloki tkanek przymocowano do wsporników tkanek za pomocą kleju do tkanek i umieszczono w wibrującej kąpieli mikrotomowej zawierającej roztwór Tyrode'a i w sposób ciągły natleniano (3 g/l monooksymu 2,3-butandionu (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g).), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glukozy (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M roztworu), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M roztworu), do 1 l ddH2O).Wibrujący mikrotom ustawiono na cięcie skrawków o grubości 300 urn z częstotliwością 80 Hz, poziomą amplitudą drgań 2 mm i szybkością posuwu 0,03 mm/s.Łaźnię tkankową otaczano lodem, aby utrzymać chłód roztworu, a temperaturę utrzymywano na poziomie 4°C.Przenieść skrawki tkanki z łaźni mikrotomowej do łaźni inkubacyjnej zawierającej stale natleniany roztwór Tyrode'a na lodzie, aż do uzyskania wystarczającej liczby skrawków na jedną płytkę hodowlaną.W przypadku hodowli transwell skrawki tkanek przymocowano do sterylnych podkładek poliuretanowych o szerokości 6 mm i umieszczono w 6 ml zoptymalizowanej pożywki (pożywka 199, 1x suplement ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-zasadowy i 2X antybiotyk-przeciwgrzybiczy).Stymulację elektryczną (10 V, częstotliwość 1,2 Hz) zastosowano do skrawków tkanki przez C-Pace.W warunkach TD świeże T3 i Dex dodawano przy 100 nM i 1 μM przy każdej zmianie pożywki.Pożywkę nasyca się tlenem przed wymianą 3 razy dziennie.Skrawki tkanek hodowano w inkubatorze w 37°C i 5% CO2.
W przypadku kultur CTCM skrawki tkanek umieszczono na specjalnie wykonanej drukarce 3D na szalce Petriego zawierającej zmodyfikowany roztwór Tyrode'a.Urządzenie ma za zadanie zwiększyć rozmiar wycinka serca o 25% powierzchni pierścienia podtrzymującego.Odbywa się to tak, aby skrawki serca nie rozciągały się po przeniesieniu z roztworu Tyrode'a do ośrodka i podczas rozkurczu.Za pomocą kleju histoakrylowego skrawki o grubości 300 µm mocowano na pierścieniu nośnym o średnicy 7 mm.Po przymocowaniu skrawków tkanki do pierścienia podtrzymującego odciąć nadmiar skrawków tkanki i umieścić dołączone skrawki tkanki z powrotem w łaźni z roztworem Tyrode'a na lodzie (4°C), aż zostanie przygotowana wystarczająca liczba skrawków dla jednego urządzenia.Łączny czas przetwarzania dla wszystkich urządzeń nie powinien przekroczyć 2 godzin.Po przymocowaniu 6 skrawków tkanki do ich pierścieni podtrzymujących zmontowano urządzenie CTCM.Komora hodowlana CTCM jest wstępnie napełniona 21 ml wstępnie natlenionej pożywki.Przenieś skrawki tkanek do komory hodowlanej i ostrożnie usuń za pomocą pipety wszelkie pęcherzyki powietrza.Następnie skrawek tkanki wprowadza się do otworu i delikatnie wciska na miejsce.Na koniec umieść nasadkę elektrody na urządzeniu i przenieś urządzenie do inkubatora.Następnie podłącz CTCM do przewodu powietrza i systemu C-PACE-EM.Siłownik pneumatyczny otwiera się, a zawór powietrza otwiera CTCM.System C-PACE-EM skonfigurowano tak, aby dostarczał napięcie 4 V przy 1,2 Hz podczas stymulacji dwufazowej przez 2 ms.Pożywkę zmieniano dwa razy dziennie, a elektrody zmieniano raz dziennie, aby uniknąć gromadzenia się grafitu na elektrodach.W razie potrzeby skrawki tkanek można wyjąć ze studzienek hodowlanych, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, które mogły się pod nimi dostać.W warunkach traktowania MT T3/Dex dodawano świeżo przy każdej zmianie pożywki z 100 nM T3 i 1 μM Dex.Urządzenia CTCM hodowano w inkubatorze w 37°C i 5% CO2.
Aby uzyskać rozciągnięte trajektorie plastrów serca, opracowano specjalny system kamer.Użyto lustrzanki (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japonia) z obiektywem makro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA).Wizualizacja została przeprowadzona w temperaturze pokojowej po wymianie pożywki na świeżą.Kamera jest ustawiona pod kątem 51°, a wideo jest nagrywane z prędkością 30 klatek na sekundę.Najpierw oprogramowanie typu open source (MUSCLEMOTION43) zostało użyte z Image-J do ilościowego określenia ruchu wycinków serca.Maska została utworzona przy użyciu MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) w celu zdefiniowania obszarów zainteresowania dla bicia kawałków serca w celu uniknięcia hałasu.Ręcznie podzielone maski są nakładane na wszystkie obrazy w sekwencji klatek, a następnie przekazywane do wtyczki MUSCLEMOTION.Ruch mięśni wykorzystuje średnią intensywność pikseli w każdej klatce do ilościowego określenia jej ruchu względem klatki odniesienia.Dane rejestrowano, filtrowano i wykorzystywano do ilościowego określenia czasu cyklu i oceny rozciągnięcia tkanki podczas cyklu pracy serca.Nagrane wideo zostało poddane obróbce końcowej przy użyciu cyfrowego filtra fazy zerowej pierwszego rzędu.Aby określić ilościowo rozciągnięcie tkanki (między szczytami), przeprowadzono analizę pików w celu rozróżnienia pików i dolin w zarejestrowanym sygnale.Ponadto, usuwanie trendu jest przeprowadzane przy użyciu wielomianu szóstego rzędu w celu wyeliminowania dryftu sygnału.Kod programu został opracowany w MATLAB w celu określenia globalnego ruchu tkanki, czasu cyklu, czasu relaksacji i czasu skurczu (kod programu uzupełniającego 44).
Do analizy odkształceń, korzystając z tych samych filmów stworzonych do oceny mechanicznego rozciągania, najpierw prześledziliśmy dwa obrazy przedstawiające szczyty ruchu (najwyższy (górny) i najniższy (dolny) punkt ruchu) zgodnie z oprogramowaniem MUSCLEMOTION.Następnie podzieliliśmy obszary tkanki i zastosowaliśmy formę algorytmu cieniowania do segmentowanej tkanki (Uzupełniająca Ryc. 2a).Segmentowaną tkankę podzielono następnie na dziesięć podpowierzchni, a naprężenie na każdej powierzchni obliczono za pomocą następującego równania: Odkształcenie = (Sup-Sdown) / Sdown, gdzie Sup i Sdown to odległości kształtu od odpowiednio górnego i dolnego cienia tkaniny (rysunek uzupełniający .2b).
Skrawki serca utrwalano w 4% paraformaldehydzie przez 48 godzin.Utrwalone tkanki odwadniano w 10% i 20% sacharozie przez 1 godzinę, a następnie w 30% sacharozie przez noc.Następnie skrawki zatapiano w mieszance o optymalnej temperaturze cięcia (związek OCT) i stopniowo zamrażano w kąpieli izopentan/suchy lód.Bloczki do zatapiania OCT należy przechowywać w temperaturze -80°C do czasu rozdzielenia.Szkiełka przygotowano jako skrawki o grubości 8 μm.
Aby usunąć OCT ze skrawków serca, podgrzej szkiełka na bloku grzejnym w temperaturze 95°C przez 5 min.Dodać 1 ml PBS do każdego szkiełka i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przeniknąć skrawki przez ustawienie 0,1% Triton-X w PBS na 15 minut w temperaturze pokojowej.Aby zapobiec wiązaniu niespecyficznych przeciwciał do próbki, dodać 1 ml 3% roztworu BSA do szkiełek i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.BSA następnie usunięto i szkiełka przemyto PBS.Zaznacz każdą próbkę ołówkiem.Pierwotne przeciwciała (rozcieńczone 1:200 w 1% BSA) (koneksyna 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) i troponina-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) zostały dodane w ciągu 90 minut, następnie drugorzędowe przeciwciała (rozcieńczone 1:200 w 1% BSA) przeciwko mysiej Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific ;#A16079), przeciwko króliczej Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) przez dodatkowe 90 minut Przemyto 3 razy PBS Aby odróżnić docelowe barwienie od tła, użyliśmy tylko drugorzędowego przeciwciała jako kontroli.Na koniec dodano barwnik jądrowy DAPI i szkiełka umieszczono w vectashield (Vector Laboratories) i uszczelniono lakierem do paznokci.-x powiększenie) i mikroskopem Keyence o 40-krotnym powiększeniu.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) w stężeniu 5 μg/ml w PBS użyto do barwienia WGA i nałożono na utrwalone skrawki na 30 minut w temperaturze pokojowej.Szkiełka następnie przemyto PBS i do każdego szkiełka dodano czerń Sudanu i inkubowano przez 30 minut.Szkiełka następnie przemyto PBS i dodano środek do zatapiania Vectashield.Szkiełka wizualizowano na mikroskopie Keyence przy 40-krotnym powiększeniu.
OCT usunięto z próbek, jak opisano powyżej.Po wyjęciu OCT zanurz szkiełka w roztworze Bouina na noc.Szkiełka następnie płukano wodą destylowaną przez 1 godzinę, a następnie umieszczano w roztworze Bibrich z kwasem aloesowym i fuksyną na 10 minut.Następnie szkiełka przemyto wodą destylowaną i umieszczono w roztworze 5% fosfomolibdenu/5% kwasu fosfowolframowego na 10 minut.Bez płukania przenieść szkiełka bezpośrednio do roztworu błękitu anilinowego na 15 minut.Następnie szkiełka przemyto wodą destylowaną i umieszczono w 1% roztworze kwasu octowego na 2 minuty.Szkiełka wysuszono w 200 N etanolu i przeniesiono do ksylenu.Wybarwione szkiełka wizualizowano przy użyciu mikroskopu Keyence z obiektywem 10x.Procent obszaru zwłóknienia określono ilościowo przy użyciu oprogramowania Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), numer katalogowy V13154, zgodnie z protokołem producenta z pewnymi modyfikacjami.W szczególności zastosowano stempel chirurgiczny o średnicy 6 mm, aby zapewnić jednorodną wielkość tkanki podczas analizy MTT.Tkanki wysiano pojedynczo do studzienek 12-studzienkowej płytki zawierającej substrat MTT zgodnie z protokołem producenta.Skrawki inkubuje się w temperaturze 37°C przez 3 godziny, po czym żywa tkanka metabolizuje substrat MTT z wytworzeniem purpurowego związku formazanu.Zastąpić roztwór MTT 1 ml DMSO i inkubować w temperaturze 37°C przez 15 minut w celu wyekstrahowania purpurowego formazanu z skrawków serca.Próbki rozcieńczono 1:10 w DMSO w 96-dołkowych płytkach z przezroczystym dnem i zmierzono intensywność purpurowego zabarwienia przy 570 nm stosując czytnik płytek Cytation (BioTek).Odczyty znormalizowano do masy każdego kawałka serca.
Pożywkę wycinka serca zastąpiono pożywką zawierającą 1 μCi / ml [5-3H]-glukozy (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) do testu wykorzystania glukozy, jak opisano wcześniej.Po 4 godzinach inkubacji dodać 100 µl pożywki do otwartej probówki do mikrowirówki zawierającej 100 µl 0,2 N HCl.Następnie probówkę umieszczono w probówce scyntylacyjnej zawierającej 500 μl dH2O w celu odparowania [3H]2O na 72 godziny w temperaturze 37°C.Następnie wyjąć probówkę mikrowirówki z probówki scyntylacyjnej i dodać 10 ml płynu scyntylacyjnego.Zliczenia scyntylacyjne wykonano przy użyciu ciekłego analizatora scyntylacyjnego Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA).Następnie obliczono wykorzystanie glukozy, biorąc pod uwagę aktywność właściwą [5-3H]-glukozy, niepełną równowagę i tło, rozcieńczenie [5-3H]- do nieznakowanej glukozy i skuteczność licznika scyntylacyjnego.Dane normalizuje się do masy skrawków serca.
Po homogenizacji tkanki w Trizolu wyizolowano RNA z skrawków serca przy użyciu zestawu Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 zgodnie z protokołem producenta.Przygotowanie biblioteki RNAsec, sekwencjonowanie i analizę danych przeprowadzono w następujący sposób:
Jako materiał wyjściowy do przygotowania biblioteki RNA użyto 1 μg RNA na próbkę.Biblioteki sekwencjonowania wygenerowano przy użyciu zestawu NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit for Illumina (NEB, USA) zgodnie z zaleceniami producenta, a do sekwencji atrybutów dla każdej próbki dodano kody indeksowe.Pokrótce, mRNA oczyszczono z całkowitego RNA przy użyciu kulek magnetycznych połączonych z oligonukleotydami poli-T.Fragmentację przeprowadza się przy użyciu dwuwartościowych kationów w wysokiej temperaturze w buforze do reakcji NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).Pierwszą nić cDNA zsyntetyzowano przy użyciu losowych starterów heksamerowych i odwrotnej transkryptazy M-MuLV (RNaza H-).Druga nić cDNA jest następnie syntetyzowana przy użyciu polimerazy DNA I i RNazy H. Pozostałe nawisy są przekształcane w tępe końce przez aktywność egzonukleazy/polimerazy.Po adenylacji końca 3' fragmentu DNA dołącza się do niego adapter NEBNext o strukturze pętli spinki do włosów, aby przygotować go do hybrydyzacji.Do selekcji fragmentów cDNA o preferowanej długości 150-200 bp.fragmenty biblioteki oczyszczono przy użyciu systemu AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA).Następnie 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) z dobranym pod względem wielkości cDNA zligowanym adapterem stosowano przez 15 minut w 37°C, a następnie przez 5 minut w 95°C przed PCR.Następnie przeprowadzono PCR przy użyciu polimerazy DNA Phusion High-Fidelity, uniwersalnych starterów PCR i starterów Index (X).Ostatecznie produkty PCR oczyszczono (system AMPure XP) i oceniono jakość biblioteki w systemie Agilent Bioanalyzer 2100.Następnie bibliotekę cDNA zsekwencjonowano stosując sekwenator Novaseq.Surowe pliki obrazów z Illuminy zostały przekonwertowane na surowe odczyty za pomocą CASAVA Base Calling.Surowe dane są przechowywane w plikach w formacie FASTQ(fq), które zawierają odczytywane sekwencje i odpowiadające im jakości bazowe.Wybierz HISAT2, aby dopasować przefiltrowane odczyty sekwencjonowania do genomu referencyjnego Sscrofa11.1.Ogólnie rzecz biorąc, HISAT2 obsługuje genomy dowolnej wielkości, w tym genomy większe niż 4 miliardy zasad, a dla większości parametrów ustawione są wartości domyślne.Odczyty splicingu z danych Seq RNA można skutecznie wyrównać za pomocą HISAT2, najszybszego obecnie dostępnego systemu, z taką samą lub lepszą dokładnością niż jakakolwiek inna metoda.
Obfitość transkryptów bezpośrednio odzwierciedla poziom ekspresji genów.Poziomy ekspresji genów ocenia się na podstawie obfitości transkryptów (liczba sekwencjonowań) związanych z genomem lub eksonami.Liczba odczytów jest proporcjonalna do poziomów ekspresji genów, długości genów i głębokości sekwencjonowania.Obliczono FPKM (fragmenty na tysiąc par zasad sekwencjonowanego transkryptu na milion par zasad) i określono wartości P różnicowej ekspresji za pomocą pakietu DESeq2.Następnie obliczyliśmy współczynnik fałszywych odkryć (FDR) dla każdej wartości P, stosując metodę Benjaminiego-Hochberga9 opartą na wbudowanej funkcji R „p.adjust”.
RNA wyizolowany z skrawków serca przekształcono w cDNA w stężeniu 200 ng/μl stosując SuperScript IV Vilo Master mix firmy Thermo (Thermo, nr kat. 11756050).Ilościową reakcję RT-PCR przeprowadzono przy użyciu 384-dołkowej przezroczystej płytki reakcyjnej Applied Biosystems Endura Plate Microamp (Thermo, nr kat. 4483319) i kleju optycznego Microamp (Thermo, nr kat. 4311971).Mieszanina reakcyjna składała się z 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, nr kat. 4444557), 0,5 µl Taqman Primer i 3,5 µl H2O zmieszanych na studzienkę.Przeprowadzono standardowe cykle qPCR i zmierzono wartości CT za pomocą urządzenia Applied Biosystems Quantstudio 5 do PCR w czasie rzeczywistym (moduł 384-dołkowy; nr produktu A28135).Startery Taqman zakupiono od Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA 4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) Wartości CT wszystkich próbek znormalizowano do genu metabolizmu podstawowego GAPDH.
Uwalnianie NT-ProBNP do mediów oceniano stosując zestaw NT-ProBNP (świnia) (nr kat. MBS2086979, MyBioSource) zgodnie z protokołem producenta.Pokrótce, do każdej studzienki dodano w dwóch powtórzeniach 250 ul każdej próbki i wzorca.Natychmiast po dodaniu próbki dodać 50 µl odczynnika testowego A do każdego dołka.Delikatnie potrząśnij płytką i uszczelnij szczeliwem.Następnie tabletki inkubowano w temperaturze 37°C przez 1 godzinę.Następnie zaaspirować roztwór i przemyć dołki 4 razy 350 µl 1X roztworu do płukania, za każdym razem inkubując roztwór do płukania przez 1-2 minuty.Następnie dodać 100 µl odczynnika testowego B na studzienkę i uszczelnić szczeliwem do płytek.Tabletkę delikatnie wytrząsano i inkubowano w temperaturze 37°C przez 30 minut.Odessać roztwór i przemyć dołki 5 razy 350 µl 1X roztworu do płukania.Dodaj 90 µl roztworu substratu do każdego dołka i zamknij płytkę.Inkubować płytkę w temperaturze 37°C przez 10-20 minut.Dodać 50 µl roztworu zatrzymującego reakcję do każdego dołka.Płytkę natychmiast zmierzono stosując czytnik płytek Cytation (BioTek) ustawiony na 450 nm.
Przeprowadzono analizy mocy w celu wybrania wielkości grup, które zapewnią >80% mocy do wykrycia 10% bezwzględnej zmiany parametru z 5% poziomem błędu typu I. Przeprowadzono analizy mocy w celu wybrania wielkości grup, które zapewnią >80% mocy do wykrycia 10% bezwzględnej zmiany parametru z 5% poziomem błędu typu I. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Przeprowadzono analizę mocy, aby wybrać rozmiary grup, które zapewniłyby > 80% mocy do wykrycia 10% bezwzględnej zmiany parametrów z 5% poziomem błędu typu I.进行功效分析以选择将提供> 80% 功效以检测参数中10%绝对变化和5%I型错误率的组大小.进行功效分析以选择将提供> 80% 功效以检测参数中10%绝对变化和5%I型错误率的组大小. Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаружен ия 10% абсолютного изменения параметров i 5% частоты ошибок типа I. Przeprowadzono analizę mocy, aby wybrać wielkość grupy, która zapewniłaby > 80% mocy do wykrycia 10% bezwzględnej zmiany parametrów i 5% wskaźnika błędu typu I.Skrawki tkanek wybrano losowo przed eksperymentem.Wszystkie analizy były ślepe na warunki, a próbki dekodowano dopiero po przeanalizowaniu wszystkich danych.Do wykonania wszystkich analiz statystycznych użyto oprogramowania GraphPad Prism (San Diego, CA). Dla wszystkich statystyk wartości p uznano za istotne przy wartościach <0,05. Dla wszystkich statystyk wartości p uznano za istotne przy wartościach <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Dla wszystkich statystyk wartości p uznano za istotne przy wartościach <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Dla wszystkich statystyk wartości p uznano za istotne przy wartościach <0,05.Dwustronny test t-Studenta przeprowadzono na danych z tylko 2 porównaniami.Jednokierunkową lub dwukierunkową ANOVA zastosowano do określenia istotności między wieloma grupami.Podczas przeprowadzania testów post hoc zastosowano poprawkę Tukeya, aby uwzględnić wielokrotne porównania.Dane RNAsec mają specjalne względy statystyczne podczas obliczania FDR i p.adjust, jak opisano w sekcji Metody.
Więcej informacji na temat projektowania badań można znaleźć w streszczeniu Raportu z badania przyrody, do którego link znajduje się w tym artykule.