გმადლობთ, რომ ეწვიეთ Nature.com-ს. თქვენს მიერ გამოყენებულ ბრაუზერის ვერსიას CSS-ის შეზღუდული მხარდაჭერა აქვს. საუკეთესო გამოცდილებისთვის გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში). ამასობაში, მხარდაჭერის უწყვეტი უზრუნველყოფის მიზნით, საიტს სტილებისა და JavaScript-ის გარეშე ვაჩვენებთ.
საჭიროა საიმედო in vitro სისტემა, რომელსაც შეუძლია ზუსტად რეპროდუცირება მოახდინოს გულის ფიზიოლოგიური გარემოს წამლის ტესტირებისთვის. ადამიანის გულის ქსოვილის კულტურის სისტემების შეზღუდულმა ხელმისაწვდომობამ გამოიწვია გულის წამლის ეფექტების არაზუსტი ინტერპრეტაცია. აქ ჩვენ შევიმუშავეთ გულის ქსოვილის კულტურის მოდელი (CTCM), რომელიც ელექტრომექანიკურად ასტიმულირებს გულის ნაჭრებს და განიცდის ფიზიოლოგიურ გაჭიმვას გულის ციკლის სისტოლური და დიასტოლური ფაზების დროს. 12-დღიანი კულტივირების შემდეგ, ამ მიდგომამ ნაწილობრივ გააუმჯობესა გულის ნაჭრების სიცოცხლისუნარიანობა, მაგრამ სრულად არ შეინარჩუნა მათი სტრუქტურული მთლიანობა. ამიტომ, მცირე მოლეკულების სკრინინგის შემდეგ, აღმოვაჩინეთ, რომ ჩვენს გარემოში 100 ნმ ტრიიოდთირონინის (T3) და 1 μM დექსამეტაზონის (Dex) დამატებამ შეინარჩუნა ნაჭრების მიკროსტრუქტურა 12 დღის განმავლობაში. T3/Dex დამუშავებასთან ერთად, CTCM სისტემამ შეინარჩუნა ტრანსკრიფციული პროფილები, სიცოცხლისუნარიანობა, მეტაბოლური აქტივობა და სტრუქტურული მთლიანობა იმავე დონეზე, როგორც ახალი გულის ქსოვილი 12 დღის განმავლობაში. გარდა ამისა, კულტურაში გულის ქსოვილის ზედმეტი გაჭიმვა იწვევს ჰიპერტროფიულ გულის სიგნალიზაციას, რაც წარმოადგენს CTCM-ის უნარის მტკიცებულებას, მიბაძოს გულის გაჭიმვით გამოწვეული ჰიპერტროფიული მდგომარეობების. დასკვნის სახით, CTCM-ს შეუძლია გულის ფიზიოლოგიისა და პათოფიზიოლოგიის მოდელირება კულტურაში ხანგრძლივი პერიოდის განმავლობაში, რაც საშუალებას იძლევა წამლების სანდო სკრინინგის ჩატარების.
კლინიკურ კვლევებამდე საჭიროა საიმედო in vitro სისტემები, რომლებსაც შეუძლიათ ადამიანის გულის ფიზიოლოგიური გარემოს ზუსტად რეპროდუცირება. ასეთმა სისტემებმა უნდა მიბაძონ შეცვლილ მექანიკურ დაჭიმულობას, გულისცემას და ელექტროფიზიოლოგიურ თვისებებს. ცხოველთა მოდელები ხშირად გამოიყენება გულის ფიზიოლოგიის სკრინინგის პლატფორმად, შეზღუდული სანდოობით ადამიანის გულზე წამლების ეფექტების ასახვისას1,2. საბოლოო ჯამში, გულის ქსოვილის კულტურის იდეალური ექსპერიმენტული მოდელი (CTCM) არის მოდელი, რომელიც მაღალმგრძნობიარე და სპეციფიკურია სხვადასხვა თერაპიული და ფარმაკოლოგიური ჩარევისთვის, რომელიც ზუსტად ასახავს ადამიანის გულის ფიზიოლოგიასა და პათოფიზიოლოგიას3. ასეთი სისტემის არარსებობა ზღუდავს გულის უკმარისობის ახალი მკურნალობის მეთოდების აღმოჩენას4,5 და განაპირობა წამლის კარდიოტოქსიკურობა, როგორც ბაზრიდან გასვლის მთავარი მიზეზი6.
ბოლო ათწლეულის განმავლობაში, კლინიკური გამოყენებიდან ამოღებულია რვა არაგულ-სისხლძარღვთა პრეპარატი, რადგან ისინი იწვევენ QT ინტერვალის გახანგრძლივებას, რაც იწვევს პარკუჭოვან არითმიებს და უეცარ სიკვდილს7. ამრიგად, იზრდება საიმედო პრეკლინიკური სკრინინგის სტრატეგიების საჭიროება გულ-სისხლძარღვთა ეფექტურობისა და ტოქსიკურობის შესაფასებლად. ადამიანის მიერ ინდუცირებული პლურიპოტენტური ღეროვანი უჯრედებიდან მიღებული კარდიომიოციტების (hiPS-CM) ბოლოდროინდელი გამოყენება წამლების სკრინინგსა და ტოქსიკურობის ტესტირებაში ამ პრობლემის ნაწილობრივ გადაწყვეტას იძლევა. თუმცა, hiPS-CM-ების მოუმწიფებელი ბუნება და გულის ქსოვილის მრავალუჯრედიანი სირთულის არარსებობა ამ მეთოდის ძირითადი შეზღუდვებია. ბოლოდროინდელმა კვლევებმა აჩვენა, რომ ეს შეზღუდვა ნაწილობრივ შეიძლება დაიძლიოს ადრეული hiPS-CM-ის გამოყენებით გულის ქსოვილის ჰიდროგელების ფორმირებისთვის სპონტანური შეკუმშვის დაწყებიდან მალევე და დროთა განმავლობაში ელექტრული სტიმულაციის თანდათანობით გაზრდით. თუმცა, ამ hiPS-CM მიკროტიშებს არ გააჩნიათ ზრდასრული მიოკარდიუმის მომწიფებული ელექტროფიზიოლოგიური და შეკუმშვის თვისებები. გარდა ამისა, ადამიანის გულის ქსოვილს აქვს უფრო რთული სტრუქტურა, რომელიც შედგება სხვადასხვა ტიპის უჯრედების ჰეტეროგენული ნარევისგან, მათ შორის ენდოთელური უჯრედების, ნეირონების და სტრომული ფიბრობლასტების, რომლებიც ერთმანეთთან დაკავშირებულია უჯრედგარე მატრიქსის ცილების სპეციფიკური ნაკრებებით. ზრდასრული ძუძუმწოვრების გულში არაკარდიომიოციტების პოპულაციების11,12,13 ეს ჰეტეროგენულობა გულის ქსოვილის ინდივიდუალური უჯრედების ტიპების გამოყენებით მოდელირების მთავარ ბარიერს წარმოადგენს. ეს ძირითადი შეზღუდვები ხაზს უსვამს ფიზიოლოგიურ და პათოლოგიურ პირობებში ინტაქტური მიოკარდიუმის ქსოვილის კულტივირების მეთოდების შემუშავების მნიშვნელობას.
ადამიანის გულის კულტივირებული თხელი (300 µm) მონაკვეთები ადამიანის ინტაქტური მიოკარდიუმის პერსპექტიულ მოდელად იქცა. ეს მეთოდი ადამიანის გულის ქსოვილის მსგავს სრულ სამგანზომილებიან მრავალუჯრედიან სისტემაზე წვდომას იძლევა. თუმცა, 2019 წლამდე კულტივირებული გულის მონაკვეთების გამოყენება შეზღუდული იყო კულტურის მოკლე (24 საათიანი) გადარჩენით. ეს გამოწვეულია რიგი ფაქტორებით, მათ შორის ფიზიკურ-მექანიკური გაჭიმვის არარსებობით, ჰაერ-სითხის ინტერფეისით და მარტივი გარემოს გამოყენებით, რომლებიც არ აკმაყოფილებენ გულის ქსოვილის საჭიროებებს. 2019 წელს რამდენიმე კვლევითმა ჯგუფმა აჩვენა, რომ გულის ქსოვილის კულტურის სისტემებში მექანიკური ფაქტორების ჩართვამ შეიძლება გაახანგრძლივოს კულტურის სიცოცხლე, გააუმჯობესოს გულის ექსპრესია და მიბაძოს გულის პათოლოგიას. ორი ელეგანტური კვლევა 17 და 18 აჩვენებს, რომ ცალღერძიან მექანიკურ დატვირთვას დადებითი გავლენა აქვს გულის ფენოტიპზე კულტურის დროს. თუმცა, ამ კვლევებში არ გამოიყენებოდა გულის ციკლის დინამიური სამგანზომილებიანი ფიზიკურ-მექანიკური დატვირთვა, რადგან გულის მონაკვეთები დატვირთული იყო ან იზომეტრიული დაჭიმვის ძალებით 17, ან წრფივი აუქსოტონური დატვირთვით 18. ქსოვილის გაჭიმვის ამ მეთოდებმა გამოიწვია გულის მრავალი გენის დათრგუნვა ან პათოლოგიური გაჭიმვის რეაქციებთან დაკავშირებული გენების ზედმეტად ექსპრესია. აღსანიშნავია, რომ პიტოულისმა და სხვებმა19 შეიმუშავეს დინამიური გულის ნაჭრის კულტურის აბაზანა გულის ციკლის რეკონსტრუქციისთვის ძალის გადამცემის უკუკავშირისა და დაძაბულობის დრაივერების გამოყენებით. მიუხედავად იმისა, რომ ეს სისტემა საშუალებას იძლევა უფრო ზუსტი ინ ვიტრო გულის ციკლის მოდელირებისა, მეთოდის სირთულე და დაბალი გამტარუნარიანობა ზღუდავს ამ სისტემის გამოყენებას. ჩვენმა ლაბორატორიამ ცოტა ხნის წინ შეიმუშავა გამარტივებული კულტურის სისტემა ელექტროსტიმულაციისა და ოპტიმიზირებული გარემოს გამოყენებით, რათა შენარჩუნდეს ღორისა და ადამიანის გულის ქსოვილის მონაკვეთების სიცოცხლისუნარიანობა 6 დღემდე20,21.
ამჟამინდელ ნაშრომში ჩვენ აღვწერთ გულის ქსოვილის კულტურის მოდელს (CTCM), რომელიც იყენებს ღორის გულის მონაკვეთებს და რომელიც მოიცავს ჰუმორულ სიგნალებს გულის ციკლის დროს სამგანზომილებიანი გულის ფიზიოლოგიისა და პათოფიზიოლოგიური შებერილობის შესაჯამებლად. ამ CTCM-ს შეუძლია გაზარდოს კლინიკური კვლევების წინარე კლინიკური კვლევების პროგნოზირების სიზუსტე ისეთ დონემდე, როგორიც აქამდე არასდროს ყოფილა, ეკონომიური, საშუალო გამტარუნარიანობის გულის სისტემის უზრუნველყოფით, რომელიც კლინიკური კვლევების წინარე კლინიკური კვლევებისთვის ძუძუმწოვრების გულის ფიზიოლოგიას/პათოფიზიოლოგიას ბაძავს.
ჰემოდინამიკური მექანიკური სიგნალები გადამწყვეტ როლს თამაშობენ კარდიომიოციტების ფუნქციის შენარჩუნებაში in vitro 22,23,24. ამჟამინდელ ნაშრომში ჩვენ შევიმუშავეთ CTCM (სურათი 1ა), რომელსაც შეუძლია ზრდასრული ადამიანის გულის გარემოს იმიტაცია ფიზიოლოგიური სიხშირეებით (1.2 ჰც, 72 დარტყმა წუთში) ელექტრული და მექანიკური სტიმულაციის ინდუცირებით. დიასტოლის დროს ქსოვილების ზედმეტი გაჭიმვის თავიდან ასაცილებლად, გამოყენებული იქნა 3D ბეჭდვის მოწყობილობა ქსოვილის ზომის 25%-ით გასაზრდელად (სურ. 1ბ). C-PACE სისტემით გამოწვეული ელექტრული სტიმულაცია დაყენებული იყო სისტოლამდე 100 ms-ით დაწყების დროზე, მონაცემთა შეგროვების სისტემის გამოყენებით, გულის ციკლის სრულად რეპროდუცირებისთვის. ქსოვილების კულტურის სისტემა იყენებს პროგრამირებად პნევმატურ აქტივატორს (LB Engineering, გერმანია) მოქნილი სილიკონის მემბრანის ციკლურად გასაშლელად, რათა გამოიწვიოს გულის ნაჭრების გაფართოება ზედა კამერაში. სისტემა დაკავშირებული იყო გარე ჰაერის ხაზთან წნევის გადამყვანის საშუალებით, რამაც შესაძლებელი გახადა წნევის (± 1 mmHg) და დროის (± 1 ms) ზუსტად რეგულირება (სურ. 1გ).
ა) ქსოვილის სექცია მიამაგრეთ 7 მმ-იან საყრდენ რგოლზე, რომელიც ლურჯად არის ნაჩვენები, მოწყობილობის კულტურის კამერის შიგნით. კულტურის კამერა ჰაერის კამერისგან გამოყოფილია თხელი მოქნილი სილიკონის მემბრანით. გაჟონვის თავიდან ასაცილებლად თითოეულ კამერას შორის მოათავსეთ შუასადები. მოწყობილობის თავსახური შეიცავს გრაფიტის ელექტროდებს, რომლებიც უზრუნველყოფენ ელექტროსტიმულაციას. ბ) დიდი ქსოვილის მოწყობილობის, გამტარი რგოლის და საყრდენი რგოლის სქემატური წარმოდგენა. ქსოვილის სექციები (ყავისფერი) მოთავსებულია დიდი ზომის მოწყობილობაზე, გამტარი რგოლი მოთავსებულია მოწყობილობის გარეთა კიდეზე არსებულ ღარში. გამტარის გამოყენებით, ფრთხილად მოათავსეთ ქსოვილის აკრილის წებოვანით დაფარული საყრდენი რგოლი გულის ქსოვილის სექციაზე. გ) გრაფიკი, რომელიც აჩვენებს ელექტროსტიმულაციის დროს, როგორც ჰაერის კამერის წნევის ფუნქცია, რომელიც კონტროლდება პროგრამირებადი პნევმატური აქტივატორით (PPD). მონაცემთა შეგროვების მოწყობილობა გამოყენებული იქნა ელექტრო სტიმულაციის სინქრონიზაციისთვის წნევის სენსორების გამოყენებით. როდესაც კულტურის კამერაში წნევა აღწევს დადგენილ ზღურბლს, პულსური სიგნალი იგზავნება C-PACE-EM-ში ელექტროსტიმულაციის გასააქტიურებლად. დ) ინკუბატორის თაროზე განთავსებული ოთხი CTCM-ის სურათი. ოთხი მოწყობილობა დაკავშირებულია ერთ PPD-თან პნევმატური წრედის საშუალებით და წნევის სენსორები შეყვანილია ჰემოსტაზურ სარქველში პნევმატურ წრედში წნევის მონიტორინგისთვის. თითოეული მოწყობილობა შეიცავს ექვს ქსოვილის სექციას.
ერთი პნევმატური აქტივატორის გამოყენებით, ჩვენ შევძელით 4 CTCM მოწყობილობის კონტროლი, რომელთაგან თითოეულს შეეძლო 6 ქსოვილის კვეთის დაკავება (სურ. 1დ). CTCM-ში, ჰაერის კამერაში ჰაერის წნევა გარდაიქმნება სინქრონულ წნევად სითხის კამერაში და იწვევს გულის ჭრილის ფიზიოლოგიურ გაფართოებას (სურათი 2ა და დამატებითი ვიდეო 1). ქსოვილის დაჭიმვის შეფასება 80 მმ ვწყ.სვ.-ზე. ნახაზმა აჩვენა ქსოვილის კვეთების 25%-ით დაჭიმვა (სურ. 2ბ). ნაჩვენებია, რომ ეს პროცენტული დაჭიმვა შეესაბამება სარკომერის ფიზიოლოგიურ სიგრძეს 2.2–2.3 მკმ გულის კვეთის ნორმალური შეკუმშვისთვის17,19,25. ქსოვილის მოძრაობა შეფასდა კამერის მორგებული პარამეტრების გამოყენებით (დამატებითი სურათი 1). ქსოვილის მოძრაობის ამპლიტუდა და სიჩქარე (სურ. 2გ, დ) შეესაბამებოდა გულის ციკლის დროს დაჭიმვას და სისტოლისა და დიასტოლის დროს დროს (სურ. 2ბ). გულის ქსოვილის დაჭიმვა და სიჩქარე შეკუმშვისა და რელაქსაციის დროს კულტურაში 12 დღის განმავლობაში მუდმივი დარჩა (სურ. 2ვ). კულტურის დროს ელექტრული სტიმულაციის შეკუმშვადობაზე ზემოქმედების შესაფასებლად, ჩვენ შევიმუშავეთ აქტიური დეფორმაციის განსაზღვრის მეთოდი დაჩრდილვის ალგორითმის გამოყენებით (დამატებითი სურ. 2ა,ბ) და შევძელით ელექტრული სტიმულაციით და მის გარეშე დეფორმაციების გარჩევა. გულის იგივე მონაკვეთი (სურ. 2ვ). ჭრილის მოძრავ რეგიონში (R6-9), ელექტრული სტიმულაციის დროს ძაბვა 20%-ით მაღალი იყო, ვიდრე ელექტრული სტიმულაციის არარსებობის შემთხვევაში, რაც მიუთითებს ელექტრული სტიმულაციის წვლილზე შეკუმშვის ფუნქციაში.
ჰაერის კამერის წნევის, სითხის კამერის წნევის და ქსოვილის მოძრაობის გაზომვების წარმომადგენლობითი კვალი ადასტურებს, რომ კამერის წნევა ცვლის სითხის კამერის წნევას, რაც იწვევს ქსოვილის ჭრილის შესაბამის მოძრაობას. ბ ქსოვილის მონაკვეთების პროცენტული დაჭიმვის (ლურჯი) წარმომადგენლობითი კვალი, რომელიც შეესაბამება დაჭიმვის პროცენტს (ნარინჯისფერი). გ გულის ჭრილის გაზომილი მოძრაობა შეესაბამება მოძრაობის გაზომილ სიჩქარეს. (დ) გულის ჭრილში ციკლური მოძრაობის (ლურჯი ხაზი) და სიჩქარის (ნარინჯისფერი წერტილოვანი ხაზი) წარმომადგენლობითი ტრაექტორიები. ე ციკლის დროის (n = 19 ნაჭერი ჯგუფში, სხვადასხვა ღორებიდან), შეკუმშვის დროის (n = 19 ნაჭერი ჯგუფში, სხვადასხვა ღორებიდან), რელაქსაციის დროის (n = 19 ნაჭერი ჯგუფში, სხვადასხვა ღორებიდან), ქსოვილის მოძრაობის (n = 25 ნაჭერი)/ჯგუფი სხვადასხვა ღორებიდან), პიკური სისტოლური სიჩქარის (n = 24(D0), 25(D12) ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორებიდან) და პიკური რელაქსაციის სიჩქარის (n=24(D0), 25(D12) ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორებიდან). ორმხრივმა სტუდენტის t-ტესტმა არ აჩვენა მნიშვნელოვანი განსხვავება არცერთ პარამეტრში. ვ ქსოვილის მონაკვეთების წარმომადგენლობითი დეფორმაციის ანალიზის კვალი (წითელი) და ელექტროსტიმულაციის გარეშე (ლურჯი), ერთი და იგივე მონაკვეთის ქსოვილის მონაკვეთების ათი რეგიონალური არე. ქვედა პანელები აჩვენებს დეფორმაციის პროცენტული სხვაობის რაოდენობრივ განსაზღვრას ქსოვილის მონაკვეთებში ელექტროსტიმულაციის გარეშე და ელექტროსტიმულაციის გარეშე, სხვადასხვა მონაკვეთის ათ უბანში. (n = 8 ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორებიდან, ჩატარდა ორმხრივი სტუდენტური t-ტესტი; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორებიდან, ჩატარდა ორმხრივი სტუდენტური t-ტესტი; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 სექცია/ჯგუფი სხვადასხვა ღორებიდან, ორმხრივი სტუდენტის t-ტესტი; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001，**p <0.01，5p <0.01，5p （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001，**p <0.01，5p <0.01，5p (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 სექცია/ჯგუფი, სხვადასხვა ღორებიდან, ორმხრივი სტუდენტის t-ტესტი; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).შეცდომის ზოლები წარმოადგენს საშუალო ± სტანდარტულ გადახრას.
ჩვენს წინა სტატიკური ბიომიმეტიკური გულის ნაჭრების კულტივირების სისტემაში [20, 21], ჩვენ შევინარჩუნეთ გულის ნაჭრების სიცოცხლისუნარიანობა, ფუნქცია და სტრუქტურული მთლიანობა 6 დღის განმავლობაში ელექტროსტიმულაციის გამოყენებით და გარემოს შემადგენლობის ოპტიმიზაციის გზით. თუმცა, 10 დღის შემდეგ ეს მაჩვენებლები მკვეთრად შემცირდა. ჩვენ განვიხილავთ ჩვენს წინა სტატიკური ბიომიმეტიკური კულტივირების სისტემის 20, 21 საკონტროლო პირობებში (Ctrl) კულტივირებულ ნაჭრებს და გამოვიყენებთ ჩვენს ადრე ოპტიმიზებულ გარემოს, როგორც MC პირობებს და კულტივირებას ერთდროული მექანიკური და ელექტრო სტიმულაციის (CTCM) პირობებში, რომელსაც ეწოდება . პირველ რიგში, ჩვენ დავადგინეთ, რომ მექანიკური სტიმულაცია ელექტროსტიმულაციის გარეშე არასაკმარისი იყო ქსოვილის სიცოცხლისუნარიანობის შესანარჩუნებლად 6 დღის განმავლობაში (დამატებითი სურ. 3ა,ბ). საინტერესოა, რომ ფიზიომექანიკური და ელექტროსტიმულაციის STCM-ის გამოყენებით დანერგვით, 12-დღიანი გულის ნაჭრების სიცოცხლისუნარიანობა იგივე დარჩა, რაც ახალი გულის ნაჭრების შემთხვევაში MS პირობებში, მაგრამ არა Ctrl პირობებში, როგორც ეს ნაჩვენებია MTT ანალიზით (სურ. 1). 3ა). ეს მიუთითებს, რომ გულის ციკლის მექანიკურ სტიმულაციას და სიმულაციას შეუძლია ქსოვილის ნაჭრების სიცოცხლისუნარიანობის შენარჩუნება ორჯერ მეტხანს, ვიდრე ეს ჩვენს წინა სტატიკური კულტივირების სისტემაში იყო აღწერილი. თუმცა, ქსოვილის მონაკვეთების სტრუქტურული მთლიანობის შეფასებამ გულის ტროპონინ T-სა და კონექსინ 43-ის იმუნომარკირებით აჩვენა, რომ კონექსინ 43-ის ექსპრესია მნიშვნელოვნად მაღალი იყო MC ქსოვილებში მე-12 დღეს, ვიდრე საკონტროლო ჯგუფში იმავე დღეს. თუმცა, კონექსინ 43-ის ერთგვაროვანი ექსპრესია და Z-დისკის ფორმირება სრულად არ იყო შენარჩუნებული (სურ. 3ბ). ქსოვილის სტრუქტურული მთლიანობის რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის ჩვენ ვიყენებთ ხელოვნური ინტელექტის (AI) ჩარჩოს26, ხოლო ტროპონინ-T-სა და კონექსინ შეღებვაზე დაფუძნებულ გამოსახულებაზე დაფუძნებულ ღრმა სწავლების სისტემას43, რათა ავტომატურად განისაზღვროს გულის ნაჭრების სტრუქტურული მთლიანობა და ფლუორესცენცია ლოკალიზაციის სიძლიერის მიხედვით. ეს მეთოდი იყენებს კონვოლუციურ ნერვულ ქსელს (CNN) და ღრმა სწავლების ჩარჩოს, რათა საიმედოდ განისაზღვროს გულის ქსოვილის სტრუქტურული მთლიანობა ავტომატიზირებული და მიუკერძოებელი გზით, როგორც ეს აღწერილია მითითებაში.26. MC ქსოვილმა აჩვენა გაუმჯობესებული სტრუქტურული მსგავსება 0 დღემდე სტატიკურ საკონტროლო მონაკვეთებთან შედარებით. გარდა ამისა, მასონის ტრიქრომულმა შეღებვამ გამოავლინა ფიბროზის მნიშვნელოვნად დაბალი პროცენტი MS პირობებში, საკონტროლო პირობებთან შედარებით, კულტურის მე-12 დღეს (სურ. 3გ). მიუხედავად იმისა, რომ CTCM-მა მე-12 დღეს გულის ქსოვილის სექციების სიცოცხლისუნარიანობა ახალი გულის ქსოვილის მსგავს დონემდე გაზარდა, მან მნიშვნელოვნად არ გააუმჯობესა გულის სექციების სტრუქტურული მთლიანობა.
სვეტოვანი დიაგრამა გვიჩვენებს ახალი გულის ნაჭრების (D0) ან გულის ნაჭრების კულტურის MTT სიცოცხლისუნარიანობის რაოდენობრივ განსაზღვრას 12 დღის განმავლობაში, სტატიკურ კულტურაში (D12 Ctrl) ან CTCM-ში (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორიდან, ჩატარდა ცალმხრივი ANOVA ტესტი; ####p < 0.0001 D0-თან შედარებით და **p < 0.01 D12 Ctrl-თან შედარებით). სვეტოვანი დიაგრამა აჩვენებს ახალი გულის ნაჭრების (D0) ან გულის ნაჭრების კულტურის MTT სიცოცხლისუნარიანობის რაოდენობრივ განსაზღვრას 12 დღის განმავლობაში, სტატიკურ კულტურაში (D12 Ctrl) ან CTCM-ში (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორიდან, ტარდება ცალმხრივი ANOVA ტესტი; ####p < 0.0001 D0-თან შედარებით და **p < 0.01 D12 Ctrl-თან შედარებით).ჰისტოგრამა აჩვენებს MTT ახალი გულის კვეთების (D0) ან გულის კვეთების კულტურის 12 დღის განმავლობაში სიცოცხლისუნარიანობის რაოდენობრივ განსაზღვრას სტატიკურ კულტურაში (D12 კონტროლი) ან CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 კონტროლი). ) ), 12 (D12 MC) კვეთა/ჯგუფში სხვადასხვა ღორიდან, ტარდება ცალმხრივი ANOVA ტესტი;####p < 0,0001 по сравнению с D0 და **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 D0-თან შედარებით და **p < 0.01 D12 Ctrl-თან შედარებით). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，蕛测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比,**p <0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，#####p <1D，00l相比,**p.)ჰისტოგრამა, რომელიც აჩვენებს MTT-ის სიცოცხლისუნარიანობის რაოდენობრივ განსაზღვრას გულის ახალ კვეთებში (D0) ან გულის კვეთებში, რომლებიც კულტივირებულია 12 დღის განმავლობაში სტატიკურ კულტურაში (D12 კონტროლი) ან CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 კონტროლი)), სხვადასხვა ღორებიდან აღებული 12 (D12 MC) კვეთა/ჯგუფი, ცალმხრივი ANOVA ტესტი;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 D0-თან შედარებით, **p < 0.01 D12 Ctrl-თან შედარებით).b ტროპონინ-T (მწვანე), კონექსინი 43 (წითელი) და DAPI (ლურჯი) ახლად იზოლირებულ გულის კვეთებში (D0) ან გულის კვეთებში, რომლებიც კულტივირებულია სტატიკურ პირობებში (Ctrl) ან CTCM პირობებში (MC) 12 დღის განმავლობაში) წარმომადგენლობითი იმუნოფლუორესცენტული სურათების (ცარიელი მასშტაბი = 100 µm). გულის ქსოვილის სტრუქტურული მთლიანობის რაოდენობრივი განსაზღვრა ხელოვნური ინტელექტით (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ნაჭერი/ჯგუფი, თითოეული სხვადასხვა ღორიდან, ჩატარდა ცალმხრივი ANOVA ტესტი; ####p < 0.0001 D0-სთან შედარებით და ****p < 0.0001 D12 Ctrl-თან შედარებით). გულის ქსოვილის სტრუქტურული მთლიანობის რაოდენობრივი განსაზღვრა ხელოვნური ინტელექტით (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ნაჭერი/ჯგუფი, თითოეული სხვადასხვა ღორიდან, ჩატარდა ცალმხრივი ANOVA ტესტი; ####p < 0.0001 D0-სთან შედარებით და ****p < 0.0001 D12 Ctrl-თან შედარებით). Количественная оценка структурной целности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) резов/групп от разных свиней, проводится однофакторный, проводится однофакторный, проводится однофакторный, проводится однофакторный сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). გულის ქსოვილის სტრუქტურული მთლიანობის რაოდენობრივი განსაზღვრა ხელოვნური ინტელექტის გამოყენებით (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) სექცია/ჯგუფი სხვადასხვა ღორიდან, ჩატარებული ცალმხრივი ANOVA ტესტი; ####p < 0.0001 D0-სთან შედარებით და ****p < 0.0001 D12 Ctrl-თან შედარებით).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ნაჭერი/ჯგუფი თითოეული სხვადასხვა ღორიდან, ცალმხრივი ANOVA ტესტი.###00p
ჩვენ გამოვთქვით ჰიპოთეზა, რომ კულტურულ გარემოში მცირე მოლეკულების დამატებით, CTCM კულტურის დროს, შესაძლებელი იქნებოდა კარდიომიოციტების მთლიანობის გაუმჯობესება და ფიბროზის განვითარების შემცირება. ამიტომ, ჩვენი სტატიკური საკონტროლო კულტურების გამოყენებით, შემააშრიალებელი ფაქტორების მცირე რაოდენობის გამო, ჩვენ მცირე მოლეკულების სკრინინგი ჩავატარეთ ჩვენი სტატიკური საკონტროლო კულტურების გამოყენებით20,21. ამ სკრინინგისთვის შეირჩა დექსამეტაზონი (Dex), ტრიიოდთირონინი (T3) და SB431542 (SB). ეს მცირე მოლეკულები ადრე გამოიყენებოდა hiPSC-CM კულტურებში კარდიომიოციტების მომწიფების ინდუცირებისთვის სარკომერის სიგრძის, T-მილაკების და გამტარობის სიჩქარის გაზრდით. გარდა ამისა, ცნობილია, რომ როგორც Dex (გლუკოკორტიკოიდი), ასევე SB თრგუნავს ანთებას29,30. ამიტომ, ჩვენ გამოვცადეთ, გააუმჯობესებდა თუ არა ამ მცირე მოლეკულების ერთი ან მათი კომბინაციის ჩართვა გულის მონაკვეთების სტრუქტურულ მთლიანობას. საწყისი სკრინინგისთვის, თითოეული ნაერთის დოზა შეირჩა უჯრედული კულტურის მოდელებში ხშირად გამოყენებული კონცენტრაციების საფუძველზე (1 μM Dex27, 100 nM T327 და 2.5 μM SB31). 12-დღიანი კულტივირების შემდეგ, T3-ისა და Dex-ის კომბინაციამ გამოიწვია კარდიომიოციტების ოპტიმალური სტრუქტურული მთლიანობა და მინიმალური ბოჭკოვანი რემოდელირება (დამატებითი სურათები 4 და 5). გარდა ამისა, T3-ისა და Dex-ის ორმაგი ან ორმაგი კონცენტრაციის გამოყენებამ ნორმალურ კონცენტრაციებთან შედარებით უარყოფითი ეფექტები გამოიწვია (დამატებითი სურ. 6ა,ბ).
საწყისი სკრინინგის შემდეგ, ჩვენ ჩავატარეთ 4 კულტივირების პირობის პირდაპირი შედარება (სურათი 4ა): Ctrl: გულის კვეთები კულტივირებული იქნა ჩვენს მიერ ადრე აღწერილ სტატიკურ კულტურაში ჩვენი ოპტიმიზებული გარემოს გამოყენებით; 20.21 TD: T3 და Ctrl s დაემატა Dex ოთხშაბათს; MC: გულის კვეთები კულტივირებული იქნა CTCM-ში ჩვენი ადრე ოპტიმიზებული გარემოს გამოყენებით; და MT: CTCM გარემოში დამატებული T3 და Dex-ით. 12-დღიანი კულტივაციის შემდეგ, MS და MT ქსოვილების სიცოცხლისუნარიანობა იგივე დარჩა, რაც MTT ანალიზით შეფასებულ ახალ ქსოვილებში (სურ. 4ბ). საინტერესოა, რომ T3-ის და Dex-ის დამატებამ ტრანსველის კულტურებში (TD) არ გამოიწვია სიცოცხლისუნარიანობის მნიშვნელოვანი გაუმჯობესება Ctrl პირობებთან შედარებით, რაც მიუთითებს მექანიკური სტიმულაციის მნიშვნელოვან როლზე გულის კვეთების სიცოცხლისუნარიანობის შენარჩუნებაში.
ექსპერიმენტული დიზაინის დიაგრამა, რომელიც ასახავს ოთხ კულტურულ პირობას, რომლებიც გამოყენებულია მექანიკური სტიმულაციისა და T3/Dex დანამატის 12 დღის განმავლობაში გარემოზე ეფექტების შესაფასებლად. ბ სვეტოვანი დიაგრამა გვიჩვენებს სიცოცხლისუნარიანობის რაოდენობრივ განსაზღვრას კულტივაციიდან 12 დღის შემდეგ, კულტივირების ოთხივე პირობებში (Ctrl, TD, MC და MT) ახალ გულის ნაჭრებთან შედარებით (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD და D12 MT), 12 (D12 MC) ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორიდან, ჩატარდა ცალმხრივი ANOVA ტესტი; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 D0-თან შედარებით და **p < 0.01 D12 Ctrl-თან შედარებით). ბ სვეტოვანი დიაგრამა გვიჩვენებს სიცოცხლისუნარიანობის რაოდენობრივ განსაზღვრას კულტივაციიდან 12 დღის შემდეგ, კულტივირების ოთხივე პირობებში (Ctrl, TD, MC და MT) ახალ გულის ნაჭრებთან შედარებით (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD და D12 MT), 12 (D12 MC) ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორიდან, ჩატარდა ცალმხრივი ANOVA ტესტი; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 D0-სთან შედარებით და **p < 0.01 D12 ctrl-თან შედარებით). b Гистограмма показывает количественню оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях култивирования (კონტროლი, TD, MC და MT) ერთად ცრურწმენები 12 დღის განმავლობაში (D105) (D10 (D10) (D10) (D10) (D10D0) (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA ###p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с. 0,01 по сравнению со D12 Ctrl). ბ სვეტოვანი დიაგრამა გვიჩვენებს სიცოცხლისუნარიანობის რაოდენობრივ განსაზღვრას კულტივირების შემდეგ 12 დღის შემდეგ, კულტივირების ოთხივე პირობებში (კონტროლი, TD, MC და MT) ახალი გულის კვეთებთან შედარებით (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD და D12 MT), 12 (D12 MC) კვეთა/ჯგუფი სხვადასხვა ღორიდან, ცალმხრივი ANOVA ტესტი; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 D0-სთან შედარებით და **p < 0.01 D12 Ctrl-თან შედარებით). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18、21trC) TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.000##001；相比,**p <0.01 与D12控制）.ბ 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (კონტროლი, TD, MC და MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD2 და D12), (12 TD2 и D12). MC) срезы/группа, односоронний тест ANOVA ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению со контролем D12). b ჰისტოგრამა, რომელიც აჩვენებს კულტურის ოთხივე პირობას (კონტროლი, TD, MC და MT) შედარებით ახალ გულის კვეთებთან (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD და D12 MT), სხვადასხვა ღორებიდან 12 (D12 MC) კვეთა/ჯგუფი, ცალმხრივი ANOVA ტესტი; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. საკონტროლო D12). სვეტოვანი დიაგრამა გვიჩვენებს გლუკოზის ნაკადის რაოდენობრივ განსაზღვრას კულტივაციიდან 12 დღის შემდეგ, ოთხივე კულტივირების პირობებში (Ctrl, TD, MC და MT) ახალ გულის ნაჭრებთან შედარებით (D0) (n = 6 ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორიდან, ჩატარდა ცალმხრივი ANOVA ტესტი; ###p < 0.001, D0-სთან შედარებით და ***p < 0.001, D12 Ctrl-თან შედარებით). სვეტოვანი დიაგრამა გვიჩვენებს გლუკოზის ნაკადის რაოდენობრივ განსაზღვრას კულტივაციიდან 12 დღის შემდეგ, ოთხივე კულტივირების პირობებში (Ctrl, TD, MC და MT) ახალ გულის ნაჭრებთან შედარებით (D0) (n = 6 ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორიდან, ჩატარდა ცალმხრივი ANOVA ტესტი; ###p < 0.001, D0-სთან შედარებით და ***p < 0.001, D12 Ctrl-თან შედარებით). c Гистограмма показывает количественню оценку потока глюкозы через 12 днй после культивирования всех 4 условиях култивирования (კონტროლი, TD, MC და MT) სრავნენიიუ ერთად სჯულის შეჯვარებით (6 რეზიუმით) разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA ; ჰისტოგრამა აჩვენებს გლუკოზის ნაკადის რაოდენობრივ განსაზღვრას კულტივაციიდან 12 დღის შემდეგ, 4-ვე კულტივირების პირობებში (კონტროლი, TD, MC და MT) შედარებით გულის ახალ კვეთებთან (D0) (n = 6 კვეთა/ჯგუფი სხვადასხვა ღორებიდან, ჩატარდა ცალმხრივი ANOVA ტესტი; ###p < 0.001 D0-თან შედარებით და ***p < 0.001 D12 Ctrl-თან შედარებით). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相掹2，天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；#0#0p <0.相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比). C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 , 来自 猪 , , , , , , , ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 დღის შემდეგ კულტივირებაში ყოველი 4 პირობით კულტივიროვანია (კონტროლი, TD, MC და MT) ერთად სრავნეიმი (60 დღის განმავლობაში) срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению со D12 (контроль). გ ჰისტოგრამა, რომელიც აჩვენებს გლუკოზის ნაკადის რაოდენობრივ განსაზღვრას კულტივაციიდან 12 დღის შემდეგ 4-ვე კულტივირების პირობისთვის (კონტროლი, TD, MC და MT) შედარებით გულის ახალ კვეთებთან (D0) (n = 6 კვეთა/ჯგუფი, სხვადასხვა ღორიდან, ცალმხრივი). ჩატარდა ANOVA ტესტები, ###p < 0.001 D0-თან შედარებით, ***p < 0.001 D12-თან შედარებით (კონტროლი).დ. ახალი (ლურჯი), მე-12 დღის MC (მწვანე) და მე-12 დღის MT (წითელი) ქსოვილების შტამების ანალიზის დიაგრამები ქსოვილის ათ რეგიონულ მონაკვეთზე (n = 4 ნაჭერი/ჯგუფი, ცალმხრივი ANOVA ტესტი; ჯგუფებს შორის მნიშვნელოვანი განსხვავება არ იყო). ე. ვულკანის დიაგრამა, რომელიც აჩვენებს დიფერენცირებულ გენებს ახალ გულის მონაკვეთებში (D0), შედარებით სტატიკურ პირობებში (Ctrl) ან MT პირობებში (MT) 10-12 დღის განმავლობაში კულტივირებულ გულის მონაკვეთებთან. ვ. თითოეული კულტივირების პირობებში კულტივირებული გულის მონაკვეთების სარკომერის გენების სითბური რუკა. შეცდომის ზოლები წარმოადგენს საშუალო ± სტანდარტულ გადახრას.
ცხიმოვანი მჟავების დაჟანგვიდან გლიკოლიზზე გადასვლაზე მეტაბოლური დამოკიდებულება კარდიომიოციტების დედიფერენციაციის დამახასიათებელი ნიშანია. მოუმწიფებელი კარდიომიოციტები ძირითადად გლუკოზას იყენებენ ატფ-ის წარმოებისთვის და აქვთ ჰიპოპლაზიური მიტოქონდრიები მცირე რაოდენობით კრისტებით5,32. გლუკოზის გამოყენების ანალიზმა აჩვენა, რომ MC და MT პირობებში გლუკოზის გამოყენება მსგავსი იყო 0 დღის ქსოვილებში არსებულის (სურათი 4გ). თუმცა, Ctrl ნიმუშებმა აჩვენა გლუკოზის გამოყენების მნიშვნელოვანი ზრდა ახალ ქსოვილთან შედარებით. ეს მიუთითებს, რომ CTCM-ისა და T3/Dex-ის კომბინაცია ზრდის ქსოვილის სიცოცხლისუნარიანობას და ინარჩუნებს 12-დღიანი კულტივირებული გულის მონაკვეთების მეტაბოლურ ფენოტიპს. გარდა ამისა, შტამის ანალიზმა აჩვენა, რომ შტამის დონე იგივე დარჩა, რაც ახალ გულის ქსოვილში 12 დღის განმავლობაში MT და MS პირობებში (სურათი 4დ).
გულის ნაჭრის ქსოვილის გლობალურ ტრანსკრიფციულ ლანდშაფტზე CTCM-ისა და T3/Dex-ის საერთო გავლენის გასაანალიზებლად, ჩვენ ჩავატარეთ RNAseq გულის ნაჭრებზე ოთხივე განსხვავებული კულტივირების პირობებში (დამატებითი მონაცემები 1). საინტერესოა, რომ MT ნაჭრებმა აჩვენა მაღალი ტრანსკრიფციული მსგავსება გულის ახალ ქსოვილთან, 13,642 გენიდან მხოლოდ 16 იყო დიფერენცირებულად გამოხატული. თუმცა, როგორც ადრე ვაჩვენეთ, Ctrl ნაჭრებმა 10-12 დღის შემდეგ კულტურაში 1229 დიფერენცირებულად ექსპრესირებული გენი აჩვენეს (სურ. 4ე). ეს მონაცემები დადასტურდა გულისა და ფიბრობლასტების გენების qRT-PCR-ით (დამატებითი სურ. 7ა-გ). საინტერესოა, რომ Ctrl ნაჭრებმა აჩვენა გულისა და უჯრედული ციკლის გენების დაქვეითებული რეგულაცია და ანთებითი გენების პროგრამების აქტივაცია. ეს მონაცემები მიუთითებს, რომ დედიფერენციაცია, რომელიც ჩვეულებრივ ხდება ხანგრძლივი კულტივირების შემდეგ, მთლიანად შესუსტებულია MT პირობებში (დამატებითი სურ. 8ა,ბ). სარკომერების გენების საფუძვლიანმა შესწავლამ აჩვენა, რომ მხოლოდ MT პირობებშია შენარჩუნებული სარკომერის (სურ. 4f) და იონური არხის (დამატებითი სურ. 9) კოდირების გენები, რაც იცავს მათ დათრგუნვისგან Ctrl, TD და MC პირობებში. ეს მონაცემები აჩვენებს, რომ მექანიკური და ჰუმორული სტიმულაციის (T3/Dex) კომბინაციით, გულის ნაჭრის ტრანსკრიპტომი შეიძლება დარჩეს ახალი გულის ნაჭრების მსგავსი კულტურაში 12 დღის შემდეგაც.
ტრანსკრიფციული მონაცემების ამ მტკიცებას ადასტურებს ის ფაქტი, რომ გულის კვეთებში კარდიომიოციტების სტრუქტურული მთლიანობა საუკეთესოდ არის შენარჩუნებული MT პირობებში 12 დღის განმავლობაში, რასაც აჩვენებს ინტაქტური და ლოკალიზებული კონექსინ 43 (სურ. 5ა). გარდა ამისა, MT პირობებში გულის კვეთებში ფიბროზი მნიშვნელოვნად შემცირდა Ctrl-თან შედარებით და მსგავსად ახალი გულის კვეთებისა (სურ. 5ბ). ეს მონაცემები აჩვენებს, რომ მექანიკური სტიმულაციისა და T3/Dex დამუშავების კომბინაცია ეფექტურად ინარჩუნებს გულის სტრუქტურას კულტურაში გულის კვეთებში.
ტროპონინ-T-ს (მწვანე), კონექსინ 43-ის (წითელი) და DAPI-ს (ლურჯი) წარმომადგენლობითი იმუნოფლუორესცენტული გამოსახულებები ახლად იზოლირებულ გულის კვეთებში (D0) ან 12 დღის განმავლობაში კულტივირებულ ოთხივე გულის კვეთის კულტურის პირობებში (მასშტაბის ზოლი = 100 µm). გულის ქსოვილის სტრუქტურული მთლიანობის ხელოვნური ინტელექტით რაოდენობრივი განსაზღვრა (n = 7 (D0 და D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC და D12 MT) ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორიდან, ჩატარდა ცალმხრივი ANOVA ტესტი; ####p < 0.0001 D0-სთან შედარებით და *p < 0.05, ან ****p < 0.0001 D12 Ctrl-თან შედარებით). გულის ქსოვილის სტრუქტურული მთლიანობის ხელოვნური ინტელექტით რაოდენობრივი განსაზღვრა (n = 7 (D0 და D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC და D12 MT) ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორიდან, ჩატარდა ცალმხრივი ANOVA ტესტი; #### p < 0.0001 D0-სთან შედარებით და *p < 0.05, ან ****p < 0.0001 D12 Ctrl-თან შედარებით). Количественная оценка структурной целности ткани сердца со помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC და D12 MT) резов/группу од разных свиней, т. 0,0001 по сравнению с D0 და *p < 0,05 ან ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). გულის ქსოვილის სტრუქტურული მთლიანობის რაოდენობრივი განსაზღვრა ხელოვნური ინტელექტის გამოყენებით (n = 7 (D0 და D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC და D12 MT) სექცია/ჯგუფი სხვადასხვა ღორიდან, ჩატარებული ცალმხრივი ANOVA ტესტი; #### p < 0.0001 D0-სთან შედარებით და *p < 0.05 ან ****p < 0.0001 D12 Ctrl-თან შედარებით).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p <0.0001 与D0 和0*p <0.0001 挎D0 和0*p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 (n = 7 (d0 和 d12 ctrl) （5 (d12 td 、 d12 m） d1 mc人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.00. 0.0001 与D12 Ctrl 相比).გულის ქსოვილის სტრუქტურული მთლიანობის რაოდენობრივი განსაზღვრა ხელოვნური ინტელექტის გამოყენებით სხვადასხვა ღორებში (n = 7 (D0 და D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC და D12 MT) სექცია/ჯგუფი) ცალმხრივი ANOVA ტესტით;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 ან ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 D0-თან შედარებით და *p < 0.05 ან ****p < 0.0001 D12 Ctrl-თან შედარებით). ბ მასონის ტრიქრომული საღებავით შეღებილი გულის ნაჭრების წარმომადგენლობითი გამოსახულებები და რაოდენობრივი განსაზღვრა (მასშტაბის ზოლი = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD და D12 MC), 9 (D12 MT) ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორიდან, ჩატარდა ცალმხრივი ANOVA ტესტი; ####p < 0.0001 D0-სთან შედარებით და ***p < 0.001, ან ****p < 0.0001 D12 Ctrl-თან შედარებით). ბ მასონის ტრიქრომული საღებავით შეღებილი გულის ნაჭრების წარმომადგენლობითი გამოსახულებები და რაოდენობრივი განსაზღვრა (მასშტაბის ზოლი = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD და D12 MC), 9 (D12 MT) ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორიდან, ჩატარდა ცალმხრივი ANOVA ტესტი; ####p < 0.0001 D0-სთან შედარებით და ***p < 0.001, ან ****p < 0.0001 D12 Ctrl-თან შედარებით). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Massona (масштабная линейка = 500 მკმ) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12D2 MTD), და D12D2 MT9 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). ბ მასონის ტრიქრომული საღებავით შეღებილი გულის მონაკვეთების წარმომადგენლობითი გამოსახულებები და რაოდენობრივი განსაზღვრა (მასშტაბის ზოლი = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD და D12 MC), 9 (D12 MT) მონაკვეთი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორიდან, შესრულებული ცალმხრივი ANOVA; ####p < 0.0001 vs. D0 და ***p < 0.001 ან ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 μm）10（0D = Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单曠素方差弌#00与D0 相比，***p < 0.001，或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析； 00##0D；相比，***p <0,001,或****p <0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Massona (масштабная линейка = 500 მკმ) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 TD და D12 MC) / группы, один- способ ANOVA; ბ მასონის ტრიქრომით შეღებილი გულის კვეთების წარმომადგენლობითი გამოსახულებები და რაოდენობრივი განსაზღვრა (მასშტაბის ზოლი = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD და D12 MC), 9 (D12 MT) კვეთა სხვადასხვა ღორებიდან/ჯგუფიდან, ერთი ANOVA მეთოდით; ####p < 0.0001 D0-თან შედარებით, ***p < 0.001 ან ****p < 0.0001 D12 Ctrl-თან შედარებით).შეცდომის ზოლები წარმოადგენს საშუალო ± სტანდარტულ გადახრას.
და ბოლოს, CTCM-ის გულის ჰიპერტროფიის იმიტაციის უნარი შეფასდა გულის ქსოვილის დაჭიმვის გაზრდით. CTCM-ში ჰაერის კამერის პიკური წნევა გაიზარდა 80 mmHg-დან 80 mmHg-მდე (ნორმალური დაჭიმვა) 140 mmHg-მდე (სურ. 6ა). ეს შეესაბამება დაჭიმვის 32%-იან ზრდას (სურ. 6ბ), რაც ადრე ნაჩვენები იყო, როგორც შესაბამისი პროცენტული დაჭიმვა, რომელიც საჭიროა გულის მონაკვეთებისთვის, რათა მიღწეული იქნას სარკომერის სიგრძე, რომელიც ჰიპერტროფიის დროს შეინიშნება. გულის ქსოვილის დაჭიმვა და სიჩქარე შეკუმშვისა და რელაქსაციის დროს უცვლელი დარჩა კულტურის ექვსი დღის განმავლობაში (სურ. 6გ). MT პირობებში მიღებული გულის ქსოვილი დაექვემდებარა ნორმალურ დაჭიმვას (MT (ნორმალური)) ან ზედმეტად დაჭიმვის პირობებში (MT (OS)) ექვსი დღის განმავლობაში. კულტურაში ოთხი დღის შემდეგ, ჰიპერტროფიული ბიომარკერი NT-ProBNP მნიშვნელოვნად მომატებული იყო გარემოში MT (OS) პირობებში MT (ნორმალურ) პირობებთან შედარებით (სურ. 7ა). გარდა ამისა, ექვსდღიანი კულტივირების შემდეგ, MT-ში (OS) უჯრედების ზომა (სურ. 7ბ) მნიშვნელოვნად გაიზარდა MT გულის მონაკვეთებთან შედარებით (ნორმალური). გარდა ამისა, NFATC4 ბირთვის ტრანსლოკაცია მნიშვნელოვნად გაიზარდა ზედმეტად დაჭიმულ ქსოვილებში (სურ. 7გ). ეს შედეგები აჩვენებს ჰიპერდისტენზიის შემდეგ პათოლოგიური რემოდელირების პროგრესულ განვითარებას და ადასტურებს იმ კონცეფციას, რომ CTCM მოწყობილობა შეიძლება გამოყენებულ იქნას, როგორც პლატფორმა დაჭიმვით გამოწვეული გულის ჰიპერტროფიის სიგნალიზაციის შესასწავლად.
ჰაერის კამერის წნევის, სითხის კამერის წნევის და ქსოვილის მოძრაობის წარმომადგენლობითი გაზომვების კვალი ადასტურებს, რომ კამერის წნევა ცვლის სითხის კამერის წნევას, რაც იწვევს ქსოვილის ნაჭრის შესაბამის მოძრაობას. ბ ნორმალურად დაჭიმული (ნარინჯისფერი) და ზედმეტად დაჭიმული (ლურჯი) ქსოვილის მონაკვეთებისთვის დაჭიმვის პროცენტული და დაჭიმვის სიჩქარის წარმომადგენლობითი მრუდები. გ სვეტოვანი დიაგრამა, რომელიც აჩვენებს ციკლის დროს (n = 19 ნაჭერი ჯგუფში, სხვადასხვა ღორებიდან), შეკუმშვის დროს (n = 18-19 ნაჭერი ჯგუფში, სხვადასხვა ღორებიდან), რელაქსაციის დროს (n = 19 ნაჭერი ჯგუფში, სხვადასხვა ღორებიდან)), ქსოვილის მოძრაობის ამპლიტუდას (n = 14 ნაჭერი/ჯგუფი, სხვადასხვა ღორებიდან), პიკურ სისტოლურ სიჩქარეს (n = 14 ნაჭერი/ჯგუფი, სხვადასხვა ღორებიდან) და პიკურ რელაქსაციის სიჩქარეს (n = 14 (D0), 15 (D6) (სექცია/ჯგუფები) სხვადასხვა ღორებიდან), ორმხრივმა სტუდენტის t-ტესტმა არ აჩვენა მნიშვნელოვანი განსხვავება არცერთ პარამეტრში, რაც მიუთითებს, რომ ეს პარამეტრები მუდმივი დარჩა კულტივირების 6 დღის განმავლობაში ძაბვის გადაჭარბებით. შეცდომის სვეტები წარმოადგენს საშუალო ± სტანდარტულ გადახრას.
NT-ProBNP კონცენტრაციის სვეტოვანი დიაგრამის რაოდენობრივი განსაზღვრა გულის ნაჭრების კულტურულ გარემოში, რომლებიც კულტივირებულია MT ნორმალური გაჭიმვის (ნორმა) ან ზედმეტი გაჭიმვის (OS) პირობებში (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm და D4 MTOS) ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორიდან. ჩატარდა ორმხრივი ANOVA; **p < 0.01 ნორმალურ გაჭიმვასთან შედარებით). NT-ProBNP კონცენტრაციის სვეტოვანი დიაგრამის რაოდენობრივი განსაზღვრა გულის ნაჭრების კულტურულ გარემოში, რომლებიც კულტივირებულია MT ნორმალური გაჭიმვის (ნორმა) ან ზედმეტი გაჭიმვის (OS) პირობებში (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm და D4 MTOS) ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორიდან. ჩატარდა ორმხრივი ANOVA; **p < 0.01 ნორმალურ გაჭიმვასთან შედარებით).სხვადასხვა ღორებიდან ნორმალური MT გაჭიმვის (ნორმა) ან ზედმეტი გაჭიმვის (OS) პირობებში კულტივირებული გულის ნაჭრების კულტივირებულ გარემოში NT-ProBNP კონცენტრაციის რაოდენობრივი ჰისტოგრამა, ჩატარებულია ვარიაციის ორფაქტორიანი ანალიზი;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 ნორმალურ გაჭიმვასთან შედარებით). a 在MT 正常拉伸(ნორმა) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0.01). NT-ProBNP კონცენტრაციის რაოდენობრივი განსაზღვრა გულის ნაჭრებში, რომლებიც კულტივირებულია MT ნორმალური გაჭიმვის (ნორმა) ან გადაჭიმვის (OS) პირობებში (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) სხვადასხვა猪的切片/组，可以双向方方发发动 **ნორმალური გაჭიმვასთან შედარებით, p <0.01).ჰისტოგრამა. გულის ნაჭრებში NT-ProBNP კონცენტრაციების რაოდენობრივი განსაზღვრა, რომლებიც კულტივირებულია ნორმალური MT გაჭიმვის (ნორმა) ან ზედმეტი გაჭიმვის (OS) პირობებში (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) და D4 MTOS) ნაჭრები/ჯგუფი სხვადასხვა ღორებიდან, ვარიაციის ორმხრივი ანალიზი;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 ნორმალურ გაჭიმვასთან შედარებით). b ტროპონინ-T-თი და WGA-თი შეღებილი გულის ნაჭრების წარმომადგენლობითი გამოსახულებები (მარცხნივ) და უჯრედების ზომის რაოდენობრივი განსაზღვრა (მარჯვნივ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) უჯრედი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორების 10 სხვადასხვა ნაჭრიდან, ჩატარდა ორმხრივი სტუდენტის t-ტესტი; ****p < 0.0001 ნორმალურ გაჭიმვასთან შედარებით). b ტროპონინ-T-თი და WGA-თი შეღებილი გულის ნაჭრების წარმომადგენლობითი გამოსახულებები (მარცხნივ) და უჯრედების ზომის რაოდენობრივი განსაზღვრა (მარჯვნივ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) უჯრედი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორების 10 სხვადასხვა ნაჭრიდან, ჩატარდა ორმხრივი სტუდენტის t-ტესტი; ****p < 0.0001 ნორმალურ გაჭიმვასთან შედარებით). b Representativnыe isobrazheniya sрезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного განსაზღვრა клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b ტროპონინ-T-თი და AZP-ით შეღებილი გულის მონაკვეთების წარმომადგენლობითი გამოსახულებები (მარცხნივ) და უჯრედების ზომის რაოდენობრივი განსაზღვრა (მარჯვნივ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) უჯრედი/ჯგუფი 10 სხვადასხვა მონაკვეთიდან სხვადასხვა ღორიდან, ჩატარდა ორმხრივი სტუდენტის t-ტესტი; ****p < 0.0001 ნორმალურ შტამთან შედარებით). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的心脏切片的代表會3 MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比，****p < 0.0001). b კალკარეინ-T-ით და WGA-თი შეღებილი გულის ნაჭრების წარმომადგენლობითი გამოსახულებები (მარცხნივ) და უჯრედის ზომა (მარჯვნივ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 10 სხვადასხვა ნაჭრიდან (D6 MTNorm)). უჯრედები/უჯრედები, უჯრედის ღეროვანი ქსოვილის t ტესტი; ნორმალურ გაჭიმვასთან შედარებით, ****p < 0.0001). b Репрезентативные свирения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm раззных) из 10 Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b ტროპონინ-T-თი და AZP-ით შეღებილი გულის მონაკვეთების წარმომადგენლობითი გამოსახულებები (მარცხნივ) და უჯრედების ზომის რაოდენობრივი განსაზღვრა (მარჯვნივ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) სხვადასხვა ღორის 10 სხვადასხვა მონაკვეთიდან) უჯრედები/ჯგუფი, ორმხრივი კრიტერიუმი სტუდენტის t; ****p < 0.0001 ნორმალურ შტამთან შედარებით). გ წარმომადგენლობითი გამოსახულებები 0 და 6 დღის MTOS გულის ნაჭრებისთვის, რომლებიც იმუნომარკირებულია ტროპონინ-T-სა და NFATC4-ზე და NFATC4-ის ტრანსლოკაციის რაოდენობრივი განსაზღვრა CM-ების ბირთვებში (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორიდან, ჩატარდა ორმხრივი სტუდენტის t-ტესტი; *p < 0.05). გ წარმომადგენლობითი გამოსახულებები 0 და 6 დღის MTOS გულის ნაჭრებისთვის, რომლებიც იმუნომარკირებულია ტროპონინ-T-სა და NFATC4-ზე და NFATC4-ის ტრანსლოკაციის რაოდენობრივი განსაზღვრა CM-ების ბირთვებში (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორიდან, ჩატარდა ორმხრივი სტუდენტის t-ტესტი; *p < 0.05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (D0n) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента *p < 0,05). გ გულის კვეთების წარმომადგენლობითი გამოსახულებები MTOS-ის 0 და 6 დღის შემდეგ, იმუნომარკირებული ტროპონინ-T-სა და NFATC4-ზე, და NFATC4 ტრანსლოკაციის რაოდენობრივი განსაზღვრა კავერნოზული უჯრედების ბირთვში (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ნაჭერი/ჯგუფი სხვადასხვა ღორებიდან) შესრულდა ორმხრივი სტუდენტის t-ტესტით; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化 (34（0n)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p <0.05). c კალკანინ-T და NFATC4 იმუნომარკეტირების წარმომადგენლობითი გამოსახულებები 第0天和第6天MTOS გულის ნაჭრების და NFATC4 სხვადასხვა NFATC4 易位至CM უჯრედის ბირთვიდან 的 რაოდენობა化 (n = 4 (D6 MTOS),时间双尾学生et 电影；*p <0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и количниквенная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свипай (n = 3 (Drez-D0), хвостатый t-критерий Стьюдента *p < 0,05). გ MTOS გულის ნაჭრების წარმომადგენლობითი გამოსახულებები 0 და 6 დღეს ტროპონინ-T და NFATC4 იმუნომარკირებისთვის და NFATC4 ტრანსლოკაციის რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის CM ბირთვში სხვადასხვა ღორებიდან (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ნაჭერი/ჯგუფი, ორმხრივი t-კრიტერიუმი სტუდენტის; *p < 0.05).შეცდომის ზოლები წარმოადგენს საშუალო ± სტანდარტულ გადახრას.
ტრანსლაციური გულ-სისხლძარღვთა კვლევა მოითხოვს უჯრედულ მოდელებს, რომლებიც ზუსტად აღადგენენ გულის გარემოს. ამ კვლევაში შემუშავდა და დახასიათდა CTCM მოწყობილობა, რომელსაც შეუძლია გულის ულტრათხელი მონაკვეთების სტიმულირება. CTCM სისტემა მოიცავს ფიზიოლოგიურად სინქრონიზებულ ელექტრომექანიკურ სტიმულაციას და T3 და Dex სითხით გამდიდრებას. როდესაც ღორის გულის მონაკვეთები ამ ფაქტორების ზემოქმედების ქვეშ მოექცა, მათი სიცოცხლისუნარიანობა, სტრუქტურული მთლიანობა, მეტაბოლური აქტივობა და ტრანსკრიფციული ექსპრესია 12-დღიანი კულტივირების შემდეგ იგივე დარჩა, რაც ახალ გულის ქსოვილში. გარდა ამისა, გულის ქსოვილის ჭარბმა გაჭიმვამ შეიძლება გამოიწვიოს გულის ჰიპერტროფია, რომელიც გამოწვეულია ჰიპერექსტენზიით. საერთო ჯამში, ეს შედეგები ადასტურებს ფიზიოლოგიური კულტურის პირობების კრიტიკულ როლს გულის ნორმალური ფენოტიპის შენარჩუნებაში და ქმნის პლატფორმას წამლის სკრინინგისთვის.
კარდიომიოციტების ფუნქციონირებისა და გადარჩენისთვის ოპტიმალური გარემოს შექმნას მრავალი ფაქტორი უწყობს ხელს. ამ ფაქტორებიდან ყველაზე აშკარა დაკავშირებულია (1) უჯრედშორის ურთიერთქმედებებთან, (2) ელექტრომექანიკურ სტიმულაციასთან, (3) ჰუმორულ ფაქტორებთან და (4) მეტაბოლურ სუბსტრატებთან. ფიზიოლოგიური უჯრედშორისი ურთიერთქმედება მოითხოვს უჯრედგარე მატრიქსით მხარდაჭერილი მრავალი ტიპის უჯრედის რთულ სამგანზომილებიან ქსელებს. ასეთი რთული უჯრედული ურთიერთქმედებების რეკონსტრუქცია in vitro რთულია ცალკეული უჯრედების ტიპების კოკულტურით, მაგრამ მათი მიღწევა ადვილად შესაძლებელია გულის კვეთების ორგანოტიპური ბუნების გამოყენებით.
კარდიომიოციტების მექანიკური დაჭიმვა და ელექტრული სტიმულაცია კრიტიკულად მნიშვნელოვანია გულის ფენოტიპის შესანარჩუნებლად33,34,35. მიუხედავად იმისა, რომ მექანიკური სტიმულაცია ფართოდ გამოიყენება hiPSC-CM-ის კონდიცირებისა და მომწიფებისთვის, რამდენიმე ელეგანტურმა კვლევამ ცოტა ხნის წინ სცადა გულის ნაჭრების მექანიკური სტიმულაცია კულტურაში ცალღერძიანი დატვირთვის გამოყენებით. ეს კვლევები აჩვენებს, რომ 2D ცალღერძიან მექანიკურ დატვირთვას დადებითი გავლენა აქვს გულის ფენოტიპზე კულტურის დროს. ამ კვლევებში, გულის მონაკვეთები დატვირთული იყო ან იზომეტრიული დაჭიმვის ძალებით17, წრფივი აუქსოტონური დატვირთვით18, ან გულის ციკლი ხელახლა შეიქმნა ძალის გადამცემის უკუკავშირის და დაჭიმვის დრაივების გამოყენებით. თუმცა, ეს მეთოდები იყენებენ ცალღერძიან ქსოვილის დაჭიმვას გარემოს ოპტიმიზაციის გარეშე, რაც იწვევს გულის მრავალი გენის დათრგუნვას ან პათოლოგიური დაჭიმვის რეაქციებთან დაკავშირებული გენების ზედმეტად ექსპრესიას. აქ აღწერილი CTCM უზრუნველყოფს 3D ელექტრომექანიკურ სტიმულს, რომელიც ბაძავს ბუნებრივ გულის ციკლს ციკლის დროისა და ფიზიოლოგიური დაჭიმვის თვალსაზრისით (25% დაჭიმვა, 40% სისტოლა, 60% დიასტოლა და 72 დარტყმა წუთში). მიუხედავად იმისა, რომ მხოლოდ ეს სამგანზომილებიანი მექანიკური სტიმულაცია არ არის საკმარისი ქსოვილების მთლიანობის შესანარჩუნებლად, ქსოვილების სიცოცხლისუნარიანობის, ფუნქციისა და მთლიანობის ადეკვატური შენარჩუნებისთვის საჭიროა ჰუმორული და მექანიკური სტიმულაციის კომბინაცია T3/Dex-ის გამოყენებით.
ჰუმორული ფაქტორები მნიშვნელოვან როლს ასრულებენ ზრდასრული გულის ფენოტიპის მოდულირებაში. ეს ხაზგასმული იყო HiPS-CM კვლევებში, რომლებშიც T3 და Dex დაემატა კულტურულ გარემოს უჯრედების მომწიფების დასაჩქარებლად. T3-მა შეიძლება გავლენა მოახდინოს ამინომჟავების, შაქრების და კალციუმის ტრანსპორტირებაზე უჯრედის მემბრანებში36. გარდა ამისა, T3 ხელს უწყობს MHC-α ექსპრესიას და MHC-β დაქვეითებულ რეგულაციას, რაც ხელს უწყობს სწრაფი შეკუმშვის მიოფიბრილების წარმოქმნას მომწიფებულ კარდიომიოციტებში, ნაყოფის CM-ში ნელი შეკუმშვის მიოფიბრილებთან შედარებით. ჰიპოთირეოზის მქონე პაციენტებში T3 დეფიციტი იწვევს მიოფიბრილარული ზოლების დაკარგვას და ტონუსის განვითარების სიჩქარის შემცირებას37. Dex მოქმედებს გლუკოკორტიკოიდულ რეცეპტორებზე და, როგორც ჩანს, ზრდის მიოკარდიუმის კუმშვადობას იზოლირებულ პერფუზირებულ გულებში;38 ეს გაუმჯობესება, სავარაუდოდ, დაკავშირებულია კალციუმის დეპოზიტებით გამოწვეულ შეღწევაზე (SOCE) ზემოქმედებასთან39,40. გარდა ამისა, Dex უკავშირდება თავის რეცეპტორებს, რაც იწვევს ფართო უჯრედშიდა პასუხს, რომელიც თრგუნავს იმუნურ ფუნქციას და ანთებას30.
ჩვენი შედეგები მიუთითებს, რომ ფიზიკურ-მექანიკურმა სტიმულაციამ (MS) გააუმჯობესა კულტურის საერთო მაჩვენებლები Ctrl-თან შედარებით, მაგრამ ვერ შეძლო სიცოცხლისუნარიანობის, სტრუქტურული მთლიანობის და გულის ექსპრესიის შენარჩუნება კულტურაში 12 დღის განმავლობაში. Ctrl-თან შედარებით, T3-ის და Dex-ის დამატებამ CTCM (MT) კულტურებში გააუმჯობესა სიცოცხლისუნარიანობა და შეინარჩუნა მსგავსი ტრანსკრიფციის პროფილები, სტრუქტურული მთლიანობა და მეტაბოლური აქტივობა ახალ გულის ქსოვილთან 12 დღის განმავლობაში. გარდა ამისა, ქსოვილის დაჭიმვის ხარისხის კონტროლით, STCM-ის გამოყენებით შეიქმნა ჰიპერექსტენზიით გამოწვეული გულის ჰიპერტროფიის მოდელი, რაც ასახავს STCM სისტემის მრავალფეროვნებას. უნდა აღინიშნოს, რომ მიუხედავად იმისა, რომ გულის რემოდელირება და ფიბროზი ჩვეულებრივ მოიცავს ინტაქტურ ორგანოებს, რომელთა მოცირკულირე უჯრედებს შეუძლიათ უზრუნველყონ შესაბამისი ციტოკინები, ასევე ფაგოციტოზი და სხვა რემოდელირების ფაქტორები, გულის მონაკვეთებს მაინც შეუძლიათ მიოფიბრობლასტებში ფიბროზული პროცესის იმიტაცია სტრესისა და ტრავმის საპასუხოდ. ეს ადრე შეფასდა ამ გულის ჭრილის მოდელში. უნდა აღინიშნოს, რომ CTCM პარამეტრების მოდულირება შესაძლებელია წნევის/ელექტრული ამპლიტუდის და სიხშირის შეცვლით, რათა სიმულირდეს მრავალი მდგომარეობა, როგორიცაა ტაქიკარდია, ბრადიკარდია და მექანიკური სისხლის მიმოქცევის მხარდაჭერა (მექანიკური განტვირთული გული). ეს სისტემას წამლის ტესტირებისთვის საშუალო გამტარუნარიანობას ანიჭებს. CTCM-ის უნარი, მოდელირება გაუკეთოს გადაჭარბებული დატვირთვით გამოწვეული გულის ჰიპერტროფიის, გზას უხსნის ამ სისტემის პერსონალიზებული თერაპიის ტესტირებას. დასკვნის სახით, ეს კვლევა აჩვენებს, რომ მექანიკური გაჭიმვა და ჰუმორული სტიმულაცია კრიტიკულად მნიშვნელოვანია გულის ქსოვილის მონაკვეთების კულტურის შესანარჩუნებლად.
მიუხედავად იმისა, რომ აქ წარმოდგენილი მონაცემები მიუთითებს, რომ CTCM არის ძალიან პერსპექტიული პლატფორმა ინტაქტური მიოკარდიუმის მოდელირებისთვის, ამ კულტურულ მეთოდს აქვს გარკვეული შეზღუდვები. CTCM კულტურის მთავარი შეზღუდვა ის არის, რომ ის ნაჭრებზე ახდენს უწყვეტ დინამიურ მექანიკურ სტრესებს, რაც ხელს უშლის გულის ნაჭრების შეკუმშვების აქტიური მონიტორინგის შესაძლებლობას თითოეული ციკლის დროს. გარდა ამისა, გულის მონაკვეთების მცირე ზომის (7 მმ) გამო, სისტოლური ფუნქციის შეფასების შესაძლებლობა კულტურული სისტემების გარეთ ტრადიციული ძალის სენსორების გამოყენებით შეზღუდულია. ამჟამინდელ ნაშრომში ჩვენ ნაწილობრივ ვძლევთ ამ შეზღუდვას ოპტიკური ძაბვის შეფასებით, როგორც შეკუმშვის ფუნქციის ინდიკატორის. თუმცა, ეს შეზღუდვა მოითხოვს შემდგომ მუშაობას და შესაძლოა მომავალში მისი მოგვარება კულტურაში გულის ნაჭრების ფუნქციის ოპტიკური მონიტორინგის მეთოდების დანერგვით, როგორიცაა ოპტიკური რუკების შედგენა კალციუმის და ძაბვისადმი მგრძნობიარე საღებავების გამოყენებით. CTCM-ის კიდევ ერთი შეზღუდვა ის არის, რომ სამუშაო მოდელი არ მანიპულირებს ფიზიოლოგიურ სტრესზე (წინასწარი და შემდგომი დატვირთვა). CTCM-ში წნევა ინდუცირებული იყო საპირისპირო მიმართულებით, რათა ძალიან დიდ ქსოვილებში დიასტოლაში (სრული დაჭიმვა) და სისტოლაში (შეკუმშვის ხანგრძლივობა ელექტროსტიმულაციის დროს) 25%-იანი ფიზიოლოგიური დაჭიმვის რეპროდუცირება მომხდარიყო. ეს შეზღუდვა CTCM-ის მომავალ დიზაინში უნდა მოიხსნას გულის ქსოვილზე ორივე მხრიდან ადეკვატური წნევით და გულის საკნებში არსებული წნევა-მოცულობის ზუსტი თანაფარდობის გამოყენებით.
ამ ხელნაწერში აღწერილი ზედმეტი დაჭიმვით გამოწვეული რემოდელირება შემოიფარგლება ჰიპერტროფიული ჰიპერდაჭიმვის სიგნალების იმიტაციით. ამრიგად, ამ მოდელს შეუძლია დაეხმაროს დაჭიმვით გამოწვეული ჰიპერტროფიული სიგნალიზაციის შესწავლას ჰუმორული ან ნერვული ფაქტორების საჭიროების გარეშე (რომლებიც ამ სისტემაში არ არსებობს). საჭიროა შემდგომი კვლევები CTCM-ის მრავალფეროვნების გასაზრდელად, მაგალითად, იმუნურ უჯრედებთან, მოცირკულირე პლაზმის ჰუმორულ ფაქტორებთან და ნეირონულ უჯრედებთან თანაკულტივირებისას ინერვაცია გააუმჯობესებს დაავადების მოდელირების შესაძლებლობებს CTCM-ით.
კვლევაში გამოყენებული იქნა ცამეტი ღორი. ცხოველებზე ჩატარებული ყველა პროცედურა ჩატარდა ინსტიტუციური გაიდლაინების შესაბამისად და დამტკიცებული იყო ლუისვილის უნივერსიტეტის ინსტიტუციური ცხოველთა მოვლისა და გამოყენების კომიტეტის მიერ. აორტის რკალი დაიჭირეს და გული პერფუზირებული იქნა 1 ლიტრი სტერილური კარდიოპლეგიით (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/მლ ჰეპარინი, pH 7.4-მდე); გულები ინახებოდა ყინულივით ცივ კარდიოპლეგიურ ხსნარში ლაბორატორიაში ყინულზე გადატანამდე, რაც, როგორც წესი, 10 წუთზე ნაკლებია. გულები ინახებოდა ყინულივით ცივ კარდიოპლეგიურ ხსნარში ლაბორატორიაში ყინულზე გადატანამდე, რაც, როგორც წესი, 10 წუთზე ნაკლებია. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 წთ. გულები ინახებოდა ყინულივით ცივ კარდიოპლეგიურ ხსნარში ლაბორატორიაში ყინულზე ტრანსპორტირებამდე, რაც, როგორც წესი, 10 წუთზე ნაკლებ დროს მოითხოვს.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钞将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钞 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 წთ. გული ყინულზე კარდიოპლეგიის დროს ლაბორატორიაში ყინულზე ტრანსპორტირებამდე უნდა შეინახოთ, როგორც წესი, 10 წუთზე ნაკლები.
CTCM მოწყობილობა შემუშავდა SolidWorks-ის კომპიუტერული დიზაინის (CAD) პროგრამულ უზრუნველყოფაში. კულტურის კამერები, გამყოფები და ჰაერის კამერები დამზადებულია CNC გამჭვირვალე აკრილის პლასტმასისგან. 7 მმ დიამეტრის სათადარიგო რგოლი ცენტრში დამზადებულია მაღალი სიმკვრივის პოლიეთილენისგან (HDPE) და აქვს ო-რგოლის ღარი, რომელიც იტევს სილიკონის ო-რგოლს, რომელიც გამოიყენება ქვედა მედიის დალუქვისთვის. თხელი სილიციუმის მემბრანა ჰყოფს კულტურის კამერას გამყოფი ფირფიტისგან. სილიკონის მემბრანა ლაზერით არის ამოჭრილი 0.02 ინჩი სისქის სილიკონის ფურცლიდან და მისი სიმტკიცეა 35A. ქვედა და ზედა სილიკონის შუასადებები ლაზერით არის ამოჭრილი 1/16 ინჩი სისქის სილიკონის ფურცლიდან და მისი სიმტკიცეა 50A. ბლოკის დასამაგრებლად და ჰერმეტული დალუქვის შესაქმნელად გამოიყენება 316L უჟანგავი ფოლადის ხრახნები და ფრთისებრი კაკლები.
სპეციალური დაბეჭდილი მიკროსქემის დაფა (PCB) შექმნილია C-PACE-EM სისტემასთან ინტეგრირებისთვის. PCB-ზე შვეიცარიული მანქანის შემაერთებელი ბუდეები გრაფიტის ელექტროდებს უკავშირდება ვერცხლისფერი სპილენძის მავთულებით და ელექტროდებში ჩამაგრებული ბრინჯაოს 0-60 ხრახნებით. დაბეჭდილი მიკროსქემის დაფა მოთავსებულია 3D პრინტერის საფარში.
CTCM მოწყობილობა კონტროლდება პროგრამირებადი პნევმატური აქტივატორით (PPD), რომელიც ქმნის კონტროლირებად ცირკულაციურ წნევას, გულის ციკლის მსგავსს. ჰაერის კამერაში წნევის მატებასთან ერთად, მოქნილი სილიკონის მემბრანა ფართოვდება ზემოთ, რაც ქსოვილის ქვეშ არსებულ გარემოს აიძულებს. ქსოვილის არე შემდეგ იჭიმება სითხის ამ გამოდევნით, რაც მიბაძავს გულის ფიზიოლოგიურ გაფართოებას დიასტოლის დროს. რელაქსაციის პიკზე, გრაფიტის ელექტროდების საშუალებით ელექტროსტიმულაცია განხორციელდა, რამაც შეამცირა წნევა ჰაერის კამერაში და გამოიწვია ქსოვილის მონაკვეთების შეკუმშვა. მილის შიგნით არის ჰემოსტატიკური სარქველი წნევის სენსორით, რომელიც აფიქსირებს ჰაერის სისტემაში წნევას. წნევის სენსორის მიერ აღქმული წნევა მიეწოდება ლეპტოპთან დაკავშირებულ მონაცემთა შემგროვებელს. ეს საშუალებას იძლევა გაზის კამერაში წნევის უწყვეტი მონიტორინგის. როდესაც კამერის მაქსიმალური წნევა მიღწეული იქნა (სტანდარტული 80 mmHg, 140 mmHg OS), მონაცემთა შემგროვებელ მოწყობილობას დაევალა სიგნალის გაგზავნა C-PACE-EM სისტემაში, რათა გენერირებულიყო ორფაზიანი ძაბვის სიგნალი 2 ms-ის განმავლობაში, დაყენებული 4 ვოლტზე.
გულის კვეთები იქნა აღებული და 6 ჭაში კულტივირების პირობები შემდეგნაირად იქნა შემუშავებული: აღებული გულები გადასატანი ჭურჭლიდან გადაიტანეს ცივი (4°C) კარდიოპლეგიის შემცველ უჯრაში. მარცხენა პარკუჭი იზოლირებული იქნა სტერილური დანით და დაჭრილ იქნა 1-2 სმ3 ნაჭრებად. ეს ქსოვილის ბლოკები მიმაგრებული იქნა ქსოვილის საყრდენებზე ქსოვილის წებოვანი საშუალებით და მოთავსებული იქნა ვიბრირებულ მიკროტომის ქსოვილის აბაზანაში, რომელიც შეიცავდა ტიროდის ხსნარს და მუდმივად იყო გაჯერებული ჟანგბადით (3 გ/ლ 2,3-ბუტანდიონ მონოოქსიმი (BDM), 140 mM NaCl (8.18 გ). ), 6 mM KCl (0.447 გ), 10 mM D-გლუკოზა (1.86 გ), 10 mM HEPES (2.38 გ), 1 mM MgCl2 (1 მლ 1 M ხსნარი), 1.8 mM CaCl2 (1.8 მლ 1 M ხსნარი), 1 ლიტრამდე ddH2O). ვიბრირებადი მიკროტომი დაყენებული იყო 300 µm სისქის ნაჭრების დასაჭრელად 80 ჰც სიხშირით, 2 მმ ჰორიზონტალური ვიბრაციის ამპლიტუდით და 0.03 მმ/წმ წინსვლის სიჩქარით. ქსოვილის აბაზანა გარშემორტყმული იყო ყინულით ხსნარის გასაგრილად და ტემპერატურა შენარჩუნებული იყო 4°C-ზე. ქსოვილის ნაჭრები მიკროტომის აბაზანიდან გადაიტანეთ ინკუბაციის აბაზანაში, რომელიც შეიცავდა ყინულზე მუდმივად ჟანგბადით გაჯერებულ Tyrode-ის ხსნარს, სანამ საკმარისი ნაჭრები არ მიიღებოდა ერთი კულტურული ფირფიტისთვის. ტრანსვეილური კულტურებისთვის, ქსოვილის ნაჭრები მიმაგრებული იყო სტერილურ 6 მმ სიგანის პოლიურეთანის საყრდენებზე და მოთავსებული იყო 6 მლ ოპტიმიზებულ გარემოში (199 გარემო, 1x ITS დანამატი, 10% FBS, 5 ნგ/მლ VEGF, 10 ნგ/მლ FGF-ტუტე და 2X ანტიბიოტიკ-სოკოს საწინააღმდეგო საშუალება). ქსოვილის ნაჭრებს C-Pace-ის საშუალებით მიეწოდებოდა ელექტრული სტიმულაცია (10 ვ, სიხშირე 1.2 ჰც). TD პირობებისთვის, ახალი T3 და Dex დაემატა 100 ნმ და 1 μM გარემოს ყოველი ცვლილებისას. ჩანაცვლებამდე, გარემო დღეში 3-ჯერ ჟანგბადით იჟღინთება. ქსოვილის კვეთები კულტივირებული იქნა ინკუბატორში 37°C ტემპერატურაზე და 5% CO2-ზე.
CTCM კულტურებისთვის, ქსოვილის სექციები განთავსდა სპეციალურად დამზადებულ 3D პრინტერზე, პეტრის ჭურჭელში, რომელიც შეიცავდა მოდიფიცირებულ ტიროდის ხსნარს. მოწყობილობა შექმნილია გულის ჭრილის ზომის საყრდენი რგოლის ფართობის 25%-ით გაზრდისთვის. ეს კეთდება ისე, რომ გულის სექციები არ გაიჭიმოს ტიროდის ხსნარიდან გარემოში გადატანის შემდეგ და დიასტოლის დროს. ჰისტოაკრილის წებოს გამოყენებით, 300 µm სისქის სექციები დამაგრდა 7 მმ დიამეტრის საყრდენ რგოლზე. ქსოვილის სექციების საყრდენ რგოლზე მიმაგრების შემდეგ, ზედმეტი ქსოვილის სექციები მოიჭრა და მიმაგრებული ქსოვილის სექციები ისევ მოათავსეს ტიროდის ხსნარის აბაზანაში ყინულზე (4°C), სანამ ერთი მოწყობილობისთვის საკმარისი სექციები არ მომზადდება. ყველა მოწყობილობის დამუშავების საერთო დრო არ უნდა აღემატებოდეს 2 საათს. მას შემდეგ, რაც 6 ქსოვილის სექციის მიმაგრება მოხდა მათ საყრდენ რგოლებზე, აწყობილი იქნა CTCM მოწყობილობა. CTCM კულტურის კამერა წინასწარ ივსება 21 მლ წინასწარ ჟანგბადით გაჯერებული გარემოთი. ქსოვილის სექციები გადაიტანეთ კულტურის კამერაში და ფრთხილად ამოიღეთ ჰაერის ბუშტები პიპეტით. შემდეგ ქსოვილის სექცია შეჰყავთ ხვრელში და ფრთხილად აწვება. და ბოლოს, მოწყობილობას ელექტროდის თავსახური ათავსებენ და ინკუბატორში გადააქვთ. შემდეგ CTCM-ს ჰაერის მილსა და C-PACE-EM სისტემას აერთებენ. პნევმატური აქტივატორი იხსნება და ჰაერის სარქველი ხსნის CTCM-ს. C-PACE-EM სისტემა კონფიგურირებული იყო ისე, რომ მიეწოდებინა 4 ვოლტი 1.2 ჰც სიხშირით ორფაზიანი სტიმულაციის დროს 2 მილიწამის განმავლობაში. ელექტროდებზე გრაფიტის დაგროვების თავიდან ასაცილებლად, გარემო იცვლებოდა დღეში ორჯერ, ხოლო ელექტროდები - დღეში ერთხელ. საჭიროების შემთხვევაში, ქსოვილის სექცია შეიძლება ამოღებულ იქნას მათი კულტივირების ჭებიდან, რათა გამოიდევნოს ჰაერის ბუშტები, რომლებიც შეიძლება მათ ქვეშ მოხვედრილიყო. MT დამუშავების პირობებისთვის, T3/Dex დაემატა ახალი გარემოს ყოველი ცვლილებისას 100 ნმ T3-ით და 1 μM Dex-ით. CTCM მოწყობილობები კულტივირებული იყო ინკუბატორში 37°C ტემპერატურაზე და 5% CO2-ზე.
გულის ნაჭრების გაწელილი ტრაექტორიების მისაღებად შემუშავდა სპეციალური კამერის სისტემა. გამოყენებული იქნა SLR კამერა (Canon Rebel T7i, Canon, ტოკიო, იაპონია) Navitar Zoom 7000 18-108 მმ მაკრო ლინზით (Navitar, სან-ფრანცისკო, კალიფორნია). ვიზუალიზაცია ჩატარდა ოთახის ტემპერატურაზე, საშუალების ახალი საშუალებით ჩანაცვლების შემდეგ. კამერა განთავსებულია 51°-იანი კუთხით და ვიდეო იწერება წამში 30 კადრით. პირველ რიგში, გულის ნაჭრების მოძრაობის რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის გამოყენებული იქნა ღია კოდის პროგრამული უზრუნველყოფა (MUSCLEMOTION43) Image-J-თან ერთად. ნიღაბი შეიქმნა MATLAB-ის (MathWorks, Natick, MA, აშშ) გამოყენებით, რათა განისაზღვროს გულის ნაჭრების ინტერესის რეგიონები ხმაურის თავიდან ასაცილებლად. ხელით სეგმენტირებული ნიღბები გამოიყენება კადრების თანმიმდევრობის ყველა სურათზე და შემდეგ გადაეცემა MUSCLEMOTION დანამატს. Muscle Motion იყენებს თითოეულ კადრში პიქსელების საშუალო ინტენსივობას მისი მოძრაობის რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის საცნობარო კადრთან მიმართებაში. მონაცემები ჩაიწერა, გაფილტრეს და გამოიყენეს ციკლის დროის რაოდენობრივი განსაზღვრისა და ქსოვილების გაჭიმვის შესაფასებლად გულის ციკლის დროს. ჩაწერილი ვიდეო დამუშავებული იქნა პირველი რიგის ნულოვანი ფაზის ციფრული ფილტრის გამოყენებით. ქსოვილის დაჭიმვის რაოდენობრივი განსაზღვრისთვის (პიკიდან პიკამდე), ჩატარდა პიკიდან პიკამდე ანალიზი, რათა განესხვავებინათ ჩაწერილ სიგნალში პიკები და ვარდნები. გარდა ამისა, სიგნალის დრიფტის აღმოსაფხვრელად, ტენდენციის შემცირება ხორციელდება მე-6 რიგის პოლინომის გამოყენებით. პროგრამის კოდი შემუშავდა MATLAB-ში ქსოვილის გლობალური მოძრაობის, ციკლის დროის, რელაქსაციის დროისა და შეკუმშვის დროის დასადგენად (დამატებითი პროგრამის კოდი 44).
დეფორმაციის ანალიზისთვის, მექანიკური დაჭიმვის შესაფასებლად შექმნილი იგივე ვიდეოების გამოყენებით, თავდაპირველად MUSCLEMOTION პროგრამული უზრუნველყოფის მიხედვით, მოძრაობის პიკების (მოძრაობის უმაღლესი (ზედა) და ყველაზე დაბალი (ქვედა) წერტილები) წარმომადგენლობითი ორი სურათი გადავიღეთ. შემდეგ ქსოვილის რეგიონები სეგმენტირებული გვქონდა და სეგმენტირებულ ქსოვილზე დაჩრდილვის ალგორითმის ფორმა გამოვიყენეთ (დამატებითი სურ. 2ა). სეგმენტირებული ქსოვილი შემდეგ ათ ქვეზედაპირად დაიყო და თითოეულ ზედაპირზე დატვირთვა გამოითვალა შემდეგი განტოლების გამოყენებით: დეფორმაცია = (Sup-Sdown)/Sdown, სადაც Sup და Sdown ფორმის მანძილებია ქსოვილის ზედა და ქვედა ჩრდილებიდან, შესაბამისად (დამატებითი სურ. 2ბ).
გულის კვეთები 48 საათის განმავლობაში ფიქსირდებოდა 4%-იან პარაფორმალდეჰიდში. ფიქსირებული ქსოვილები 1 საათის განმავლობაში დეჰიდრატირებული იყო 10%-იან და 20%-იან საქაროზაში, შემდეგ კი მთელი ღამით 30%-იან საქაროზაში. შემდეგ კვეთები ჩადგმული იყო ოპტიმალური ჭრის ტემპერატურის ნაერთში (OCT ნაერთი) და თანდათანობით გაყინული იყო იზოპენტანის/მშრალი ყინულის აბაზანაში. OCT ჩადგმის ბლოკები შეინახეთ -80°C ტემპერატურაზე გამოყოფამდე. სლაიდები მომზადდა 8 მკმ სისქის კვეთების სახით.
გულის სექციებიდან OCT-ის მოსაშორებლად, სლაიდები გააცხელეთ გამათბობელ ბლოკზე 95°C ტემპერატურაზე 5 წუთის განმავლობაში. თითოეულ სლაიდს დაამატეთ 1 მლ PBS და ინკუბაცია მოახდინეთ 30 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე, შემდეგ სექცია გაჟღენთეთ 0.1%-იანი Triton-X-ის PBS-ში მოთავსებით 15 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე. არასპეციფიკური ანტისხეულების ნიმუშთან შეკავშირების თავიდან ასაცილებლად, სლაიდებს დაამატეთ 1 მლ 3%-იანი BSA ხსნარი და ინკუბაცია მოახდინეთ 1 საათის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე. შემდეგ BSA ამოიღეს და სლაიდები გარეცხეს PBS-ით. თითოეული ნიმუში ფანქრით მონიშნეთ. პირველადი ანტისხეულები (განზავებული 1:200 1%-იან BSA-ში) (კონექსინი 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) და ტროპონინ-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) დაემატა 90 წუთის განმავლობაში, შემდეგ მეორადი ანტისხეულები (განზავებული 1:200 1%-იან BSA-ში) თაგვის Alexa Fluor 488-ის (Thermo Scientific; #A16079) და კურდღლის Alexa Fluor 594-ის (Thermo Scientific; #T6391) წინააღმდეგ დამატებით 90 წუთის განმავლობაში. 3-ჯერ გავრეცხეთ PBS-ით. სამიზნის შეღებვის ფონისგან გასარჩევად, კონტროლის სახით მხოლოდ მეორადი ანტისხეული გამოვიყენეთ. დაბოლოს, დაემატა DAPI ბირთვული საღებავი და სლაიდები მოათავსეს ვექტაშიელდში (Vector Laboratories) და დალუქეს ფრჩხილის ლაქით (-x გადიდება) და Keyence-ის მიკროსკოპში 40-ჯერ გადიდებით.
WGA-შეღებვისთვის გამოყენებული იქნა WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) 5 μg/მლ PBS-ში და დატანილი იქნა ფიქსირებულ კვეთებზე 30 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე. შემდეგ სლაიდები გაირეცხა PBS-ით და თითოეულ სლაიდს დაემატა სუდანის შავი ფერი და ინკუბირებული იყო 30 წუთის განმავლობაში. შემდეგ სლაიდები გაირეცხა PBS-ით და დაემატა vectashield-ის ჩასაშენებელი საშუალება. სლაიდები ვიზუალიზებული იქნა Keyence მიკროსკოპზე 40-ჯერადი გადიდებით.
OCT ამოღებულ იქნა ნიმუშებიდან ზემოთ აღწერილი მეთოდით. OCT-ის ამოღების შემდეგ, სლაიდები მთელი ღამით ჩაუშვით ბუენის ხსნარში. შემდეგ სლაიდები 1 საათის განმავლობაში გამოირეცხა გამოხდილი წყლით და შემდეგ 10 წუთის განმავლობაში მოათავსეს ბიბრიჩის ალოეს მჟავა ფუქსინის ხსნარში. შემდეგ სლაიდები გაირეცხა გამოხდილი წყლით და მოათავსეს 5%-იანი ფოსფომოლიბდენის/5%-იანი ფოსფოვოლფრამმჟავას ხსნარში 10 წუთის განმავლობაში. გავლების გარეშე, სლაიდები პირდაპირ გადაიტანეს ანილინის ლურჯ ხსნარში 15 წუთის განმავლობაში. შემდეგ სლაიდები გაირეცხა გამოხდილი წყლით და მოათავსეს 1%-იან ძმარმჟავას ხსნარში 2 წუთის განმავლობაში. სლაიდები გააშრეს 200 N ეთანოლში და გადაიტანეს ქსილენში. შეღებილი სლაიდები ვიზუალიზებული იქნა Keyence მიკროსკოპის გამოყენებით 10x ობიექტივით. ფიბროზის ფართობის პროცენტული მაჩვენებელი განისაზღვრა Keyence Analyzer პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით.
CyQUANT™ MTT უჯრედების სიცოცხლისუნარიანობის ანალიზი (Invitrogen, კარლსბადი, კალიფორნია), კატალოგის ნომერი V13154, მწარმოებლის პროტოკოლის მიხედვით, გარკვეული ცვლილებებით. კერძოდ, MTT ანალიზის დროს ქსოვილის ერთგვაროვანი ზომის უზრუნველსაყოფად გამოყენებული იქნა 6 მმ დიამეტრის ქირურგიული ნახვრეტი. ქსოვილები ინდივიდუალურად მოთავსდა 12-ჭედიანი ფირფიტის ჭურჭელში, რომელიც შეიცავდა MTT სუბსტრატს მწარმოებლის პროტოკოლის მიხედვით. სექციები ინკუბირებულია 37°C ტემპერატურაზე 3 საათის განმავლობაში და ცოცხალი ქსოვილი მეტაბოლიზებს MTT სუბსტრატს იისფერი ფორმაზანის ნაერთის წარმოქმნით. MTT ხსნარი შეცვალეთ 1 მლ DMSO-თი და ინკუბირებულია 37°C ტემპერატურაზე 15 წუთის განმავლობაში, რათა გულის სექციებიდან იისფერი ფორმაზანი გამოიყოს. ნიმუშები განზავდა DMSO-ში 1:10 თანაფარდობით 96-ჭედიან გამჭვირვალე ფსკერიან ფირფიტებში და იისფერი ფერის ინტენსივობა გაიზომა 570 ნმ-ზე ციტაციის ფირფიტის წამკითხველის (BioTek) გამოყენებით. ჩვენებები ნორმალიზებული იყო გულის თითოეული ნაჭრის წონის მიხედვით.
გულის ნაჭრის მედიუმი შეიცვალა 1 μCi/მლ [5-3H]-გლუკოზის შემცველი მედიით (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA), როგორც ეს ადრე იყო აღწერილი გლუკოზის უტილიზაციის ანალიზისთვის. 4 საათიანი ინკუბაციის შემდეგ, ღია მიკროცენტრიფუგის მილში, რომელიც შეიცავდა 100 მკლ 0.2 N HCl-ს, დაამატეთ 100 მკლ საშუალება. შემდეგ მილი მოათავსეს სცინტილაციის მილში, რომელიც შეიცავდა 500 მკლ dH2O-ს, რათა აორთქლებულიყო [3H]2O 72 საათის განმავლობაში 37°C ტემპერატურაზე. შემდეგ ამოიღეთ მიკროცენტრიფუგის მილი სცინტილაციის მილიდან და დაამატეთ 10 მლ სცინტილაციის სითხე. სცინტილაციის დათვლა ჩატარდა Tri-Carb 2900TR თხევადი სცინტილაციის ანალიზატორის გამოყენებით (Packard Bioscience Company, მერიდენი, კონექტიკუტი, აშშ). შემდეგ გლუკოზის უტილიზაცია გამოითვალა [5-3H]-გლუკოზის სპეციფიკური აქტივობის, არასრული წონასწორობისა და ფონის, [5-3H]-ის არამარკირებულ გლუკოზამდე განზავებისა და სცინტილაციის მრიცხველის ეფექტურობის გათვალისწინებით. მონაცემები ნორმალიზებულია გულის მონაკვეთების მასის მიხედვით.
ტრიზოლში ქსოვილის ჰომოგენიზაციის შემდეგ, გულის კვეთებიდან რნმ იზოლირებული იქნა Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874-ის გამოყენებით, მწარმოებლის პროტოკოლის შესაბამისად. RNAsec ბიბლიოთეკის მომზადება, სეკვენირება და მონაცემთა ანალიზი ჩატარდა შემდეგნაირად:
რნმ ბიბლიოთეკის მოსამზადებლად საწყისი მასალის სახით გამოყენებული იქნა 1 მკგ რნმ თითო ნიმუშზე. მწარმოებლის რეკომენდაციების შესაბამისად, სეკვენირების ბიბლიოთეკები გენერირებული იქნა NEBNext UltraTM რნმ ბიბლიოთეკის მომზადების ნაკრების გამოყენებით Illumina-სთვის (NEB, აშშ) და თითოეული ნიმუშის ატრიბუტის თანმიმდევრობებს დაემატა ინდექსის კოდები. მოკლედ, mRNA გაიწმინდა მთლიანი რნმ-დან პოლი-T ოლიგონუკლეოტიდებით მიმაგრებული მაგნიტური მძივების გამოყენებით. ფრაგმენტაცია ხორციელდება ორვალენტიანი კათიონების გამოყენებით მაღალ ტემპერატურაზე NEBNext პირველი ჯაჭვის სინთეზის რეაქციის ბუფერში (5X). პირველი ჯაჭვის cDNA სინთეზირებული იქნა შემთხვევითი ჰექსამერის პრაიმერების და M-MuLV უკუ ტრანსკრიპტაზას (RNase H-) გამოყენებით. შემდეგ მეორე ჯაჭვის cDNA სინთეზირდება დნმ პოლიმერაზა I-ის და RNase H-ის გამოყენებით. დარჩენილი გამონაზარდები გარდაიქმნება ბლაგვი ბოლოებად ეგზონუკლეაზას/პოლიმერაზას აქტივობით. დნმ ფრაგმენტის 3' ბოლოს ადენილაციის შემდეგ, მასზე მიმაგრებულია NEBNext ადაპტერი თმის სამაგრების მარყუჟის სტრუქტურით, რათა მოემზადოს ჰიბრიდიზაციისთვის. სასურველი სიგრძის 150-200 bp cDNA ფრაგმენტების შესარჩევად, ბიბლიოთეკის ფრაგმენტები გაიწმინდა AMPure XP სისტემის (Beckman Coulter, Beverly, USA) გამოყენებით. შემდეგ, PCR-მდე გამოყენებული იქნა 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) ზომის მიხედვით შერჩეული cDNA-თი, რომელიც ადაპტერით იყო ლიგირებული, 15 წუთის განმავლობაში 37°C ტემპერატურაზე და შემდეგ 5 წუთის განმავლობაში 95°C ტემპერატურაზე. PCR ჩატარდა Phusion High-Fidelity დნმ პოლიმერაზას, უნივერსალური PCR პრაიმერების და Index (X) პრაიმერების გამოყენებით. და ბოლოს, PCR პროდუქტები გაიწმინდა (AMPure XP სისტემა) და ბიბლიოთეკის ხარისხი შეფასდა Agilent Bioanalyzer 2100 სისტემაზე. cDNA ბიბლიოთეკა შემდეგ სეკვენირებული იქნა Novaseq სეკვენსერის გამოყენებით. Illumina-დან მიღებული ნედლი გამოსახულების ფაილები გადაკეთდა ნედლ წაკითხულ ფაილებად CASAVA Base Calling-ის გამოყენებით. ნედლი მონაცემები ინახება FASTQ(fq) ფორმატის ფაილებში, რომლებიც შეიცავს წაკითხულ თანმიმდევრობებს და შესაბამის ბაზისურ თვისებებს. აირჩიეთ HISAT2, რათა გაფილტრული სეკვენირების წაკითხვები შეუსაბამოთ Sscrofa11.1 საცნობარო გენომს. ზოგადად, HISAT2 მხარს უჭერს ნებისმიერი ზომის გენომებს, მათ შორის 4 მილიარდ ფუძეზე დიდ გენომებს და პარამეტრების უმეტესობისთვის დაყენებულია ნაგულისხმევი მნიშვნელობები. RNA Seq მონაცემებიდან სპლაისინგის წაკითხვების ეფექტურად გასწორება შესაძლებელია HISAT2-ის გამოყენებით, რომელიც ამჟამად ხელმისაწვდომია ყველაზე სწრაფი სისტემაა, იგივე ან უკეთესი სიზუსტით, ვიდრე ნებისმიერი სხვა მეთოდი.
ტრანსკრიპტების სიმრავლე პირდაპირ ასახავს გენის ექსპრესიის დონეს. გენის ექსპრესიის დონეები ფასდება გენომთან ან ეგზონებთან დაკავშირებული ტრანსკრიპტების სიმრავლით (სეკვენირების რაოდენობა). წაკითხვის რაოდენობა პროპორციულია გენის ექსპრესიის დონის, გენის სიგრძისა და სეკვენირების სიღრმისა. გამოითვალა FPKM (ტრანსკრიპტის სეკვენირებული ფრაგმენტების რაოდენობა ათას ფუძე წყვილზე მილიონ ფუძე წყვილზე) და დიფერენციალური ექსპრესიის P-მნიშვნელობები განისაზღვრა DESeq2 პაკეტის გამოყენებით. შემდეგ ჩვენ გამოვთვალეთ ცრუ აღმოჩენის მაჩვენებელი (FDR) თითოეული P მნიშვნელობისთვის ბენჯამინი-ჰოხბერგის მეთოდის9 გამოყენებით, ჩაშენებული R-ფუნქციის „p.adjust“-ის საფუძველზე.
გულის კვეთებიდან იზოლირებული რნმ გარდაიქმნა ცდნმ-ად 200 ნგ/მკლ კონცენტრაციით Thermo-ს SuperScript IV Vilo Master mix-ის გამოყენებით (Thermo, კატ. № 11756050). რაოდენობრივი RT-PCR ჩატარდა Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-ჭაბურღილის გამჭვირვალე რეაქციის ფირფიტის (Thermo, კატ. № 4483319) და მიკროამპერული ოპტიკური წებოვანი მასალის (Thermo, კატ. № 4311971) გამოყენებით. რეაქციის ნარევი შედგებოდა 5 µლ Taqman Fast Advanced Master mix-ისგან (Thermo, კატ. № 4444557), 0.5 µლ Taqman Primer-ისგან და 3.5 µლ H2O-სგან, რომლებიც შერეული იყო თითო ჭაში. ჩატარდა სტანდარტული qPCR ციკლები და CT მნიშვნელობები გაიზომა Applied Biosystems Quantstudio 5 რეალურ დროში PCR ინსტრუმენტის გამოყენებით (384-ჭაბურღილის მოდული; პროდუქტის № A28135). ტაქმანის პრაიმერები შეძენილი იქნა Thermo-სგან (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). ყველა ნიმუშის CT მნიშვნელობები ნორმალიზებული იყო GAPDH გენის მიმართ.
NT-ProBNP-ის გამოთავისუფლება შეფასდა მწარმოებლის პროტოკოლის შესაბამისად, NT-ProBNP ნაკრების (ღორის) გამოყენებით (კატალოგის ნომერი: MBS2086979, MyBioSource). მოკლედ, თითოეულ ჭაში დუბლიკატად დაემატა თითოეული ნიმუშისა და სტანდარტის 250 მკლ. ნიმუშის დამატებისთანავე, თითოეულ ჭაში დაამატეთ 50 მკლ ანალიზის რეაგენტი A. ფრთხილად შეანჯღრიეთ ფირფიტა და დალუქეთ დალუქვით. შემდეგ ტაბლეტები ინკუბირებული იქნა 37°C-ზე 1 საათის განმავლობაში. შემდეგ ხსნარის ასპირაცია და ჭები 4-ჯერ გარეცხეთ 350 მკლ 1X გამრეცხი ხსნარით, ყოველ ჯერზე 1-2 წუთის განმავლობაში ინკუბაციით. შემდეგ თითოეულ ჭაში დაამატეთ 100 მკლ ანალიზის რეაგენტი B და დალუქეთ ფირფიტის დალუქვით. ტაბლეტი ფრთხილად შეანჯღრიეთ და ინკუბირებული იქნა 37°C-ზე 30 წუთის განმავლობაში. ხსნარის ასპირაცია და ჭები 5-ჯერ გარეცხეთ 350 მკლ 1X გამრეცხი ხსნარით. თითოეულ ჭაში დაამატეთ 90 µლ სუბსტრატის ხსნარი და დალუქეთ ფირფიტა. ფირფიტა ინკუბირებული უნდა იყოს 37°C ტემპერატურაზე 10-20 წუთის განმავლობაში. თითოეულ ჭაში დაამატეთ 50 µლ შემაჩერებელი ხსნარი. ფირფიტა დაუყოვნებლივ გაიზომა 450 ნმ-ზე დაყენებული Cytation (BioTek) ფირფიტის წამკითხველის გამოყენებით.
სიმძლავრის ანალიზები ჩატარდა იმ ჯგუფების ზომების შესარჩევად, რომლებიც უზრუნველყოფდნენ >80%-იან სიმძლავრეს პარამეტრის 10%-იანი აბსოლუტური ცვლილების აღმოსაჩენად 5%-იანი I ტიპის შეცდომის მაჩვენებლით. სიმძლავრის ანალიზები ჩატარდა იმ ჯგუფების ზომების შესარჩევად, რომლებიც უზრუნველყოფდნენ >80%-იან სიმძლავრეს პარამეტრის 10%-იანი აბსოლუტური ცვლილების აღმოსაჩენად 5%-იანი I ტიპის შეცდომის მაჩვენებლით. Analiz moщnosti был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечатување >80% moщnosti для обнаружения 10% აბსოლუტური გაცვლითი პარამეტრა 5% საათი ошибок ტიპის I. სიმძლავრის ანალიზი ჩატარდა იმ ჯგუფების ზომების შესარჩევად, რომლებიც უზრუნველყოფდნენ >80%-იან სიმძლავრეს 10%-იანი აბსოლუტური პარამეტრის ცვლილების აღმოსაჩენად 5%-იანი I ტიპის შეცდომის მაჩვენებლით.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Bыl proveden analiz moщnosti для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% სასარგებლო თვისებები 10% აბსოლუტურად გაცვლითი პარამეტრი და 5% საათი ошибок ტიპის I. ჩატარდა სიმძლავრის ანალიზი ჯგუფის ისეთი ზომის შესარჩევად, რომელიც უზრუნველყოფდა >80%-იან სიმძლავრეს 10%-იანი აბსოლუტური პარამეტრის ცვლილების და 5%-იანი I ტიპის შეცდომის მაჩვენებლის აღმოსაჩენად.ექსპერიმენტამდე ქსოვილის სექციები შემთხვევით შეირჩა. ყველა ანალიზი პირობითად ბრმა იყო და ნიმუშები გაშიფრული იქნა მხოლოდ ყველა მონაცემის ანალიზის შემდეგ. ყველა სტატისტიკური ანალიზის შესასრულებლად გამოყენებული იქნა GraphPad Prism პროგრამული უზრუნველყოფა (სან დიეგო, კალიფორნია). ყველა სტატისტიკისთვის, p-მნიშვნელობები მნიშვნელოვნად ჩაითვალა <0.05 მნიშვნელობებზე. ყველა სტატისტიკისთვის, p-მნიშვნელობები მნიშვნელოვნად ითვლებოდა <0.05 მნიშვნელობებზე. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. ყველა სტატისტიკისთვის, p-მნიშვნელობები მნიშვნელოვნად ითვლებოდა <0.05 მნიშვნელობებზე.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. ყველა სტატისტიკისთვის, p-მნიშვნელობები მნიშვნელოვნად ითვლებოდა <0.05 მნიშვნელობებზე.ორმხრივი სტუდენტის t-ტესტი ჩატარდა მონაცემებზე მხოლოდ 2 შედარებით. ცალმხრივი ან ორმხრივი ANOVA გამოყენებული იქნა მრავალ ჯგუფს შორის მნიშვნელობის დასადგენად. პოსტ-ჰოკ ტესტების ჩატარებისას, ტუკის კორექცია გამოყენებული იქნა მრავალჯერადი შედარებების გათვალისწინებით. RNAsec მონაცემებს განსაკუთრებული სტატისტიკური მოსაზრებები აქვს FDR-ისა და p.adjust-ის გაანგარიშებისას, როგორც ეს აღწერილია მეთოდების განყოფილებაში.
კვლევის დიზაინის შესახებ დამატებითი ინფორმაციისთვის იხილეთ Nature Research Report-ის რეზიუმე, რომელიც ამ სტატიასთან არის დაკავშირებული.
გამოქვეყნების დრო: 2022 წლის 28 სექტემბერი
