Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazivat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Postoji potreba za pouzdanim in vitro sustavom koji može točno reproducirati fiziološko okruženje srca za testiranje lijekova. Ograničena dostupnost sustava za kulturu tkiva ljudskog srca dovela je do netočnih interpretacija učinaka lijekova na srce. Ovdje smo razvili model kulture tkiva srca (CTCM) koji elektromehanički stimulira srčane kriške i podvrgava se fiziološkom istezanju tijekom sistoličke i dijastoličke faze srčanog ciklusa. Nakon 12 dana kulture, ovaj pristup djelomično je poboljšao održivost srčanih presjeka, ali nije u potpunosti sačuvao njihov strukturni integritet. Stoga smo, nakon probira malih molekula, otkrili da je dodatak 100 nM trijodtironina (T3) i 1 μM deksametazona (Dex) našem mediju održao mikrostrukturu presjeka tijekom 12 dana. U kombinaciji s tretmanom T3/Dex, CTCM sustav održao je transkripcijske profile, održivost, metaboličku aktivnost i strukturni integritet na istoj razini kao i svježe srčano tkivo tijekom 12 dana. Osim toga, pretjerano istezanje srčanog tkiva u kulturi inducira hipertrofičnu srčanu signalizaciju, što dokazuje sposobnost CTCM-a da oponaša hipertrofična stanja izazvana istezanjem srca. Zaključno, CTCM može modelirati fiziologiju i patofiziologiju srca u kulturi tijekom duljih vremenskih razdoblja, omogućujući pouzdan probir lijekova.
Prije kliničkih istraživanja potrebni su pouzdani in vitro sustavi koji mogu točno reproducirati fiziološko okruženje ljudskog srca. Takvi sustavi trebali bi oponašati promijenjeno mehaničko istezanje, otkucaje srca i elektrofiziološka svojstva. Životinjski modeli se često koriste kao platforma za probir srčane fiziologije s ograničenom pouzdanošću u odražavanju učinaka lijekova u ljudskom srcu1,2. U konačnici, Idealni eksperimentalni model kulture srčanog tkiva (CTCM) je model koji je vrlo osjetljiv i specifičan za različite terapijske i farmakološke intervencije, točno reproducirajući fiziologiju i patofiziologiju ljudskog srca3. Nedostatak takvog sustava ograničava otkrivanje novih tretmana za zatajenje srca4,5 i doveo je do kardiotoksičnosti lijekova kao glavnog razloga za izlazak s tržišta6.
Tijekom proteklog desetljeća, osam lijekova koji nisu kardiovaskularni povučeno je iz kliničke upotrebe jer uzrokuju produljenje QT intervala što dovodi do ventrikularnih aritmija i iznenadne smrti7. Stoga postoji sve veća potreba za pouzdanim predkliničkim strategijama probira za procjenu kardiovaskularne učinkovitosti i toksičnosti. Nedavna upotreba kardiomiocita dobivenih iz pluripotentnih matičnih stanica (hiPS-CM) u probiru lijekova i testiranju toksičnosti pruža djelomično rješenje ovog problema. Međutim, nezrela priroda hiPS-CM-ova i nedostatak višestanične složenosti srčanog tkiva glavna su ograničenja ove metode. Nedavne studije pokazale su da se ovo ograničenje može djelomično prevladati korištenjem ranog hiPS-CM-a za stvaranje hidrogelova srčanog tkiva ubrzo nakon početka spontanih kontrakcija i postupnim povećanjem električne stimulacije tijekom vremena. Međutim, ova hiPS-CM mikrotkiva nemaju zrela elektrofiziološka i kontraktilna svojstva odraslog miokarda. Osim toga, ljudsko srčano tkivo ima složeniju strukturu, koja se sastoji od heterogene mješavine različitih tipova stanica, uključujući endotelne stanice, neurone i stromalne fibroblaste, međusobno povezane specifičnim skupovima proteina izvanstanične matrice. Ova heterogenost populacija koje nisu kardiomiociti11,12,13 u srcu odraslih sisavaca glavna je prepreka modeliranju srčanog tkiva korištenjem pojedinačnih tipova stanica. Ova glavna ograničenja naglašavaju važnost razvoja metoda za kultiviranje intaktnog miokardnog tkiva u fiziološkim i patološkim uvjetima.
Tanki (300 µm) presjeci ljudskog srca pokazali su se obećavajućim modelom intaktnog ljudskog miokarda. Ova metoda omogućuje pristup kompletnom 3D višestaničnom sustavu sličnom tkivu ljudskog srca. Međutim, do 2019. godine upotreba presjeka srca u kulturi bila je ograničena kratkim (24 h) preživljavanjem kulture. To je zbog niza čimbenika, uključujući nedostatak fizičko-mehaničkog istezanja, sučelje zrak-tekućina i upotrebu jednostavnih medija koji ne podržavaju potrebe srčanog tkiva. Godine 2019. nekoliko je istraživačkih skupina pokazalo da uključivanje mehaničkih čimbenika u sustave kulture srčanog tkiva može produžiti vijek trajanja kulture, poboljšati srčanu ekspresiju i oponašati srčanu patologiju. Dvije elegantne studije 17 i 18 pokazuju da jednoosno mehaničko opterećenje ima pozitivan učinak na srčani fenotip tijekom kulture. Međutim, ove studije nisu koristile dinamičko trodimenzionalno fizičko-mehaničko opterećenje srčanog ciklusa, budući da su presjeci srca bili opterećeni ili izometrijskim vlačnim silama 17 ili linearnim auksotoničnim opterećenjem 18. Ove metode istezanja tkiva rezultirale su supresijom mnogih srčanih gena ili prekomjernom ekspresijom gena povezanih s abnormalnim odgovorima istezanja. Posebno su Pitoulis i suradnici 19 razvili dinamičku kupelj za kulturu srčanih rezova za rekonstrukciju srčanog ciklusa korištenjem povratne informacije pretvarača sile i pogona napetosti. Iako ovaj sustav omogućuje preciznije in vitro modeliranje srčanog ciklusa, složenost i niska propusnost metode ograničavaju primjenu ovog sustava. Naš laboratorij nedavno je razvio pojednostavljeni sustav kulture korištenjem električne stimulacije i optimiziranog medija za održavanje održivosti presjeka svinjskog i ljudskog srčanog tkiva do 6 dana 20,21.
U ovom rukopisu opisujemo model kulture srčanog tkiva (CTCM) korištenjem dijelova svinjskog srca koji uključuje humoralne znakove za rekapitulaciju trodimenzionalne srčane fiziologije i patofiziološke distenzije tijekom srčanog ciklusa. Ovaj CTCM može povećati točnost predkliničkog predviđanja lijekova na razinu koja nikada prije nije postignuta pružanjem isplativog srčanog sustava srednjeg protoka koji oponaša fiziologiju/patofiziologiju srca sisavaca za predkliničko testiranje lijekova.
Hemodinamski mehanički signali igraju ključnu ulogu u održavanju funkcije kardiomiocita in vitro 22,23,24. U ovom rukopisu razvili smo CTCM (slika 1a) koji može oponašati srčano okruženje odraslih inducirajući i električnu i mehaničku stimulaciju na fiziološkim frekvencijama (1,2 Hz, 72 otkucaja u minuti). Kako bi se izbjeglo pretjerano istezanje tkiva tijekom dijastole, korišten je 3D uređaj za ispis kako bi se povećala veličina tkiva za 25% (slika 1b). Električna stimulacija inducirana C-PACE sustavom tempirana je da počne 100 ms prije sistole pomoću sustava za akviziciju podataka kako bi se u potpunosti reproducirao srčani ciklus. Sustav za kulturu tkiva koristi programabilni pneumatski aktuator (LB Engineering, Njemačka) za cikličko širenje fleksibilne silikonske membrane kako bi se izazvalo širenje srčanih kriški u gornjoj komori. Sustav je bio spojen na vanjski dovod zraka putem pretvornika tlaka, što je omogućilo precizno podešavanje tlaka (± 1 mmHg) i vremena (± 1 ms) (slika 1c).
a Pričvrstite presjek tkiva na 7 mm potporni prsten, prikazan plavom bojom, unutar komore za kulturu uređaja. Komora za kulturu odvojena je od zračne komore tankom fleksibilnom silikonskom membranom. Postavite brtvu između svake komore kako biste spriječili curenje. Poklopac uređaja sadrži grafitne elektrode koje pružaju električnu stimulaciju. b Shematski prikaz velikog uređaja za tkivo, vodećeg prstena i potpornog prstena. Presjeci tkiva (smeđi) postavljeni su na preveliki uređaj s vodećim prstenom postavljenim u utor na vanjskom rubu uređaja. Pomoću vodilice pažljivo postavite potporni prsten premazan ljepilom za tkivo preko presjeka srčanog tkiva. c Grafikon koji prikazuje vrijeme električne stimulacije kao funkciju tlaka u zračnoj komori kojim upravlja programabilni pneumatski aktuator (PPD). Uređaj za prikupljanje podataka korišten je za sinkronizaciju električne stimulacije pomoću senzora tlaka. Kada tlak u komori za kulturu dosegne postavljeni prag, impulsni signal šalje se C-PACE-EM-u za pokretanje električne stimulacije. d Slika četiri CTCM-a postavljena na policu inkubatora. Četiri uređaja spojena su na jedan PPD putem pneumatskog kruga, a senzori tlaka umetnuti su u hemostatski ventil za praćenje tlaka u pneumatskom krugu. Svaki uređaj sadrži šest presjeka tkiva.
Pomoću jednog pneumatskog aktuatora mogli smo kontrolirati 4 CTCM uređaja, od kojih je svaki mogao držati 6 presjeka tkiva (slika 1d). U CTCM-u, tlak zraka u zračnoj komori pretvara se u sinkroni tlak u komori s tekućinom i inducira fiziološko širenje srčanog presjeka (slika 2a i dodatni film 1). Evaluacija istezanja tkiva pri 80 mm Hg. Art. pokazala je istezanje presjeka tkiva za 25% (slika 2b). Pokazalo se da ovaj postotak istezanja odgovara fiziološkoj duljini sarkomera od 2,2–2,3 µm za normalnu kontraktilnost srčanog presjeka17,19,25. Pomicanje tkiva procijenjeno je pomoću prilagođenih postavki kamere (dodatna slika 1). Amplituda i brzina kretanja tkiva (slika 2c, d) odgovarali su istezanju tijekom srčanog ciklusa i vremenu tijekom sistole i dijastole (slika 2b). Istezanje i brzina srčanog tkiva tijekom kontrakcije i opuštanja ostali su konstantni 12 dana u kulturi (slika 2f). Kako bismo procijenili učinak električne stimulacije na kontraktilnost tijekom kulture, razvili smo metodu za određivanje aktivne deformacije pomoću algoritma sjenčanja (Dopunska slika 2a,b) i uspjeli smo razlikovati deformacije s električnom stimulacijom i bez nje. Isti presjek srca (Slika 2f). U pokretnom području reza (R6-9), napon tijekom električne stimulacije bio je 20% veći nego u odsutnosti električne stimulacije, što ukazuje na doprinos električne stimulacije kontraktilnoj funkciji.
Reprezentativni tragovi mjerenja tlaka u zračnoj komori, tlaka u fluidnoj komori i kretanja tkiva potvrđuju da tlak u komori mijenja tlak u fluidnoj komori, uzrokujući odgovarajuće kretanje presjeka tkiva. b Reprezentativni tragovi postotka istezanja (plavo) presjeka tkiva koji odgovaraju postotku istezanja (narančasto). c Izmjereno kretanje srčanog presjeka u skladu je s izmjerenom brzinom gibanja. (d) Reprezentativne putanje cikličkog gibanja (plava linija) i brzine (narančasta isprekidana linija) u presjeku srca. e Kvantifikacija vremena ciklusa (n = 19 presjeka po skupini, od različitih svinja), vremena kontrakcije (n = 19 presjeka po skupini), vremena relaksacije (n = 19 presjeka po skupini, od različitih svinja), kretanja tkiva (n = 25 presjeka)/skupini od različitih svinja, vršne sistoličke brzine (n = 24(D0), 25(D12) presjeka/skupini od različitih svinja) i vršne brzine relaksacije (n = 24(D0), 25(D12) presjeka/skupini od različitih svinja). Dvostrani Studentov t-test nije pokazao značajnu razliku ni u jednom parametru. f Reprezentativni tragovi analize naprezanja presjeka tkiva s (crvena) i bez (plava) električne stimulacije, deset regionalnih područja presjeka tkiva iz istog presjeka. Donji paneli prikazuju kvantifikaciju postotne razlike u naprezanju u presjecima tkiva s i bez električne stimulacije u deset područja iz različitih presjeka. (n = 8 kriški/skupina od različitih svinja, proveden je dvostrani Studentov t-test; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 kriški/skupina od različitih svinja, proveden je dvostrani Studentov t-test; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 rezova/skupina od različitih svinja, provodi se dvostrani t-kriterij Stjudenta; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 dijelova/skupina od različitih svinja, dvostrani Studentov t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 (n = 8 rezova/skupina, od različitih svinja, dvostrani kriterij Stjudenta; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 dijelova/skupina, od različitih svinja, dvostrani Studentov t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Trake pogreške predstavljaju srednju vrijednost ± standardnu ​​devijaciju.
U našem prethodnom statičkom biomimetičkom sustavu kulture srčanih rezova [20, 21], održavali smo održivost, funkciju i strukturni integritet srčanih rezova tijekom 6 dana primjenom električne stimulacije i optimizacijom sastava medija. Međutim, nakon 10 dana te su se brojke naglo smanjile. Pozvat ćemo se na presjeke kultivirane u našem prethodnom statičkom biomimetičkom sustavu kulture 20, 21 kontrolnim uvjetima (Ctrl) i koristit ćemo naš prethodno optimizirani medij kao MC uvjete i kulturu pod istovremenom mehaničkom i električnom stimulacijom (CTCM). Prvo smo utvrdili da mehanička stimulacija bez električne stimulacije nije dovoljna za održavanje održivosti tkiva tijekom 6 dana (Dodatna slika 3a,b). Zanimljivo je da je, uvođenjem fizikalno-mehaničke i električne stimulacije pomoću STCM-a, održivost 12-dnevnih presjeka srca ostala ista kao u svježim presjecima srca pod MS uvjetima, ali ne i pod Ctrl uvjetima, kao što je prikazano MTT analizom (Slika 1). 3a). To sugerira da mehanička stimulacija i simulacija srčanog ciklusa mogu održati presjeke tkiva održivima dvostruko dulje nego što je zabilježeno u našem prethodnom statičkom sustavu kulture. Međutim, procjena strukturnog integriteta presjeka tkiva imunoobilježavanjem srčanog troponina T i koneksina 43 pokazala je da je ekspresija koneksina 43 bila značajno veća u tkivima MC 12. dana nego u kontrolama istog dana. Međutim, ujednačena ekspresija koneksina 43 i formiranje Z-diska nisu u potpunosti održani (slika 3b). Koristimo okvir umjetne inteligencije (AI) za kvantificiranje strukturnog integriteta tkiva26, cjevovod dubokog učenja temeljen na slici, bojenju troponina-T i koneksina43, za automatsku kvantifikaciju strukturnog integriteta i fluorescencije srčanih presjeka u smislu jačine lokalizacije. Ova metoda koristi konvolucijsku neuronsku mrežu (CNN) i okvir dubokog učenja za pouzdano kvantificiranje strukturnog integriteta srčanog tkiva na automatiziran i nepristran način, kao što je opisano u referenci.26. Tkivo MC pokazalo je poboljšanu strukturnu sličnost s danom 0 u usporedbi sa statičkim kontrolnim presjecima. Osim toga, Massonovo trikromno bojenje otkrilo je značajno niži postotak fibroze u uvjetima MS u usporedbi s kontrolnim uvjetima 12. dana kulture (slika 3c). Iako je CTCM povećao održivost presjeka srčanog tkiva 12. dana na razinu sličnu onoj svježeg srčanog tkiva, nije značajno poboljšao strukturni integritet presjeka srca.
Stupčasti grafikon prikazuje kvantifikaciju MTT održivosti svježih srčanih kriški (D0) ili kulture srčanih kriški tijekom 12 dana, bilo u statičkoj kulturi (D12 Ctrl) ili u CTCM-u (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) kriški/skupina od različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u usporedbi s D0 i **p < 0,01 u usporedbi s D12 Ctrl). Stupčasti grafikon prikazuje kvantifikaciju MTT održivosti svježih srčanih kriški (D0) ili kulture srčanih kriški tijekom 12 dana, bilo u statičkoj kulturi (D12 Ctrl) ili u CTCM-u (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) kriški/skupina od različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u usporedbi s D0 i **p < 0,01 u usporedbi s D12 Ctrl).Histogram prikazuje kvantifikaciju održivosti svježih MTT presjeka srca (D0) ili kulture presjeka srca tijekom 12 dana u statičkoj kulturi (D12 kontrola) ili CTCM-u (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrola).) ), 12 (D12 MC) presjeka/skupina od različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test;####p < 0,0001 u usporedbi s D0 i **p < 0,01 u usporedbi s D12 Ctrl). ####p < 0,0001 u usporedbi s D0 i **p < 0,01 u usporedbi s D12 (kontrola). a 条形图显示在静态培养 (D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养 (D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl相比，**p。)histogram koji prikazuje kvantifikaciju održivosti MTT-a u svježim presjecima srca (D0) ili presjecima srca uzgajanim 12 dana u statičkoj kulturi (D12 kontrola) ili CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrola)), 12 (D12 MC) presjeka/skupine od različitih svinja, jednosmjerni ANOVA test;####p < 0,0001 u usporedbi s D0, **p < 0,01 u usporedbi s D12 Ctrl). ####p < 0,0001 u usporedbi s D0, **p < 0,01 u usporedbi s D12 Ctrl).b Troponin-T (zeleno), koneksin 43 (crveno) i DAPI (plavo) u svježe izoliranim presjecima srca (D0) ili presjecima srca uzgajanim u statičkim uvjetima (Ctrl) ili CTCM uvjetima (MC) tijekom 12 dana) reprezentativnih imunofluorescentnih slika (prazna skala = 100 µm). Kvantifikacija strukturnog integriteta srčanog tkiva pomoću umjetne inteligencije (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) kriški/skupina, svaka od različite svinje, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u usporedbi s D0 i ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 Ctrl). Kvantifikacija strukturnog integriteta srčanog tkiva pomoću umjetne inteligencije (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) kriški/skupina od različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u usporedbi s D0 i ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 Ctrl). Količestvena procjena strukturne cjelosti srčanog tkiva vještačkog intelekta (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezova/grupa različitih svinja, provodi se jednofaktorski test ANOVA; ####p < 0,0001 u usporedbi s D0 i ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 Ctrl). Kvantifikacija strukturnog integriteta srčanog tkiva umjetnom inteligencijom (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) presjeka/skupina od različitih svinja, proveden jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u odnosu na D0 i ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) kriški/skupina svaka od različite svinje, jednosmjerni ANOVA test;####p < 0,0001 与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) kriški/skupina svake od različitih svinja, jednosmjerni ANOVA test;####p < 0,0001与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Iskusni intelekt za količinsku ocjenu strukturne cjelosti srčanog tkiva (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezova/skupina svake od različitih svinja, odnosni test ANOVA; ####p <0,0001 naspram D0 Za sravnjenja ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 Ctrl). Umjetna inteligencija za kvantificiranje strukturnog integriteta srčanog tkiva (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) presjeka/skupine svake od različitih svinja, jednosmjerni ANOVA test; ####p<0,0001 vs .D0 Za usporedbu ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 Ctrl). c Reprezentativne slike (lijevo) i kvantifikacija (desno) za kriške srca obojene Massonovom trikromskom bojom (Scale gole = 500 µm) (n = 10 kriški/skupini svaka od različite svinje, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u usporedbi s D0 i ***p < 0,001 u usporedbi s D12 Ctrl). c Reprezentativne slike (lijevo) i kvantifikacija (desno) za kriške srca obojene Massonovom trikromskom bojom (Scale gole = 500 µm) (n = 10 kriški/skupini od svake od različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; #### p < 0,0001 u usporedbi s D0 i ***p < 0,001 u usporedbi s D12 Ctrl). c Reprezentativne slike (udio) i kvantitativna ocjena (isprava) rez srca, ukrašen trokromnim ukrasom Massona (mašina bez pokrivanja = 500 mkm) (n = 10 rezova/skupina od različitih svinja, provodi se odnosni test ANOVA; #### p < 0,0001 u usporedbi s D0 i ***p < 0,001 u usporedbi s D12 Ctrl). c Reprezentativne slike (lijevo) i kvantifikacija (desno) dijelova srca obojenih Massonovom trikromnom bojom (nepremazana skala = 500 µm) (n = 10 dijelova/skupina od različitih svinja, proveden jednosmjerni ANOVA test; #### p < 0,0001 u usporedbi s D0 i ***p < 0,001 u usporedbi s D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 µm）（n = 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl相比）。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Reprezentativne slike (udio) i kvantitativna analiza (uzorak) razreza srca, ukrašenog trikromnim krasiteljem Massona (čista skala = 500 mkm) (n = 10 rezova/grupa, svaka od druge svinje, testirano pomoću jednofaktorne disperzijske analize ;### #p < 0,0001 u usporedbi s D0, ***p < 0,001 u usporedbi s D12 Ctrl). c Reprezentativne slike (lijevo) i kvantifikacija (desno) dijelova srca obojenih Massonovom trikromnom bojom (prazna proba = 500 µm) (n = 10 dijelova/skupini, svaki od različite svinje, testirano jednosmjernom analizom varijance;### # p < 0,0001 u usporedbi s D0, ***p < 0,001 u usporedbi s D12 Ctrl).Trake pogreške predstavljaju srednju vrijednost ± standardnu ​​devijaciju.
Pretpostavili smo da se dodavanjem malih molekula u medij za uzgoj može poboljšati integritet kardiomiocita i smanjiti razvoj fibroze tijekom CTCM uzgoja. Stoga smo provjerili male molekule koristeći naše statičke kontrolne kulture20,21 zbog malog broja zbunjujućih čimbenika. Za ovaj probir odabrani su deksametazon (Dex), trijodtironin (T3) i SB431542 (SB). Ove male molekule prethodno su korištene u hiPSC-CM kulturama za induciranje sazrijevanja kardiomiocita povećanjem duljine sarkomera, T-tubula i brzine provođenja. Osim toga, poznato je da i Dex (glukokortikoid) i SB potiskuju upalu29,30. Stoga smo testirali hoće li uključivanje jedne ili kombinacije ovih malih molekula poboljšati strukturni integritet dijelova srca. Za početni probir, doza svakog spoja odabrana je na temelju koncentracija koje se obično koriste u modelima stanične kulture (1 μM Dex27, 100 nM T327 i 2,5 μM SB31). Nakon 12 dana uzgoja, kombinacija T3 i Dexa rezultirala je optimalnim strukturnim integritetom kardiomiocita i minimalnim fibroznim preoblikovanjem (Dodatne slike 4 i 5). Osim toga, korištenje dvostrukih ili dvostruko većih koncentracija T3 i Dexa proizvelo je štetne učinke u usporedbi s normalnim koncentracijama (Dodatna slika 6a,b).
Nakon početnog probira, proveli smo izravnu usporedbu 4 uvjeta kulture (Slika 4a): Ctrl: presjeci srca kultivirani u našoj prethodno opisanoj statičkoj kulturi korištenjem našeg optimiziranog medija; 20.21 TD: T3 i Ctrl s dodanim Dexom u srijedu; MC: presjeci srca kultivirani u CTCM-u korištenjem našeg prethodno optimiziranog medija; i MT: CTCM s T3 i Dexom dodanim u medij. Nakon 12 dana kultivacije, održivost MS i MT tkiva ostala je ista kao i u svježim tkivima procijenjenim MTT testom (Slika 4b). Zanimljivo je da dodavanje T3 i Dexa u transwell kulture (TD) nije rezultiralo značajnim poboljšanjem održivosti u usporedbi s Ctrl uvjetima, što ukazuje na važnu ulogu mehaničke stimulacije u održavanju održivosti presjeka srca.
Dijagram eksperimentalnog dizajna koji prikazuje četiri uvjeta kulture korištena za procjenu učinaka mehaničke stimulacije i suplementacije T3/Dex na medij tijekom 12 dana. b Stupčasti grafikon prikazuje kvantifikaciju održivosti 12 dana nakon uzgoja u sva 4 uvjeta uzgoja (Ctrl, TD, MC i MT) u usporedbi sa svježim srčanim kriškama (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), 12 (D12 MC) kriški/skupina od različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 u usporedbi s D0 i **p < 0,01 u usporedbi s D12 Ctrl). b Stupčasti grafikon prikazuje kvantifikaciju održivosti 12 dana nakon uzgoja u sva 4 uvjeta uzgoja (Ctrl, TD, MC i MT) u usporedbi sa svježim srčanim kriškama (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), 12 (D12 MC) kriški/skupina od različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 u usporedbi s D0 i **p < 0,01 u usporedbi s D12 ctrl). b Gistogram pokazuje umjerenu ocjenu sposobnosti rada kroz 12 dana nakon kultiviranja u sva 4 uvjeta kultiviranja (kontrola, TD, MC i MT) u usporedbi sa svježim rezovima srca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), 12 (D12 MC) rezova/grupa od različitih svinja, proizvedeno odnostoronnij test ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 u usporedbi s D0 i **p < 0,01 u usporedbi s D12 Ctrl). b Stupčasti grafikon prikazuje kvantifikaciju održivosti 12 dana nakon uzgoja u sva 4 uvjeta uzgoja (kontrola, TD, MC i MT) u usporedbi sa svježim presjecima srca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), 12 (D12 MC) presjeka/skupina od različitih svinja, jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 u odnosu na D0 i **p < 0,01 u usporedbi s D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0,0001，###p < 0,001 与D0相比，**p < 0,01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Gistogram, koji pokazuje sva 4 uvjeta kultiviranja (kontrola, TD, MC i MT) u usporedbi sa svježim rezovima srca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), od različitih svinja 12 (D12 MC) srez/grupa, odnostoronjski test ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 u usporedbi s D0, **p <0,01 u usporedbi s kontrolom D12). b Histogram koji prikazuje sva 4 uvjeta kulture (kontrola, TD, MC i MT) u usporedbi sa svježim presjecima srca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), od različitih svinja 12 (D12 MC) presjeka/skupina, jednosmjerni ANOVA test; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. kontrola D12). c Stupčasti grafikon prikazuje kvantifikaciju protoka glukoze 12 dana nakon uzgoja u sva 4 uvjeta uzgoja (Ctrl, TD, MC i MT) u usporedbi sa svježim srčanim kriškama (D0) (n = 6 kriški/skupina od različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ###p < 0,001, u usporedbi s D0 i ***p < 0,001 u usporedbi s D12 Ctrl). c Stupčasti grafikon prikazuje kvantifikaciju protoka glukoze 12 dana nakon uzgoja u sva 4 uvjeta uzgoja (Ctrl, TD, MC i MT) u usporedbi sa svježim srčanim kriškama (D0) (n = 6 kriški/skupina od različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ###p < 0,001, u usporedbi s D0 i ***p < 0,001 u usporedbi s D12 Ctrl). c Gistogram pokazuje količinsku ocjenu protoka glukoze kroz 12 dana nakon kultiviranja u sva 4 uvjeta kultiviranja (kontrola, TD, MC i MT) u usporedbi sa svježim rezovima srca (D0) (n = 6 rezova/skupina od različitih svinja, jednostrani Izvodi se test ANOVA; ###p < 0,001 u usporedbi s D0 i ***p < 0,001 u usporedbi s D12 Ctrl). c Histogram prikazuje kvantifikaciju protoka glukoze 12 dana nakon kulture pod sva 4 uvjeta kulture (kontrola, TD, MC i MT) u usporedbi sa svježim presjecima srca (D0) (n = 6 presjeka/skupina od različitih svinja, proveden jednosmjerni ANOVA test; ###p < 0,001 u usporedbi s D0 i ***p < 0,001 u usporedbi s D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 ，培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 猪猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Gistogram, koji pokazuje kvantitetnu ocjenu protoka glukoze kroz 12 dana nakon kultiviranja za sva 4 uvjeta kultiviranja (kontrola, TD, MC i MT) u usporedbi sa svježim rezovima srca (D0) (n = 6 rezova/grupa, od različitih svinja, jednostranih Provedena je ANOVA analiza; ###p < 0,001 u usporedbi s D0, ***p < 0,001 u usporedbi s D12 (kontrola). c Histogram koji prikazuje kvantifikaciju protoka glukoze 12 dana nakon kulture za sva 4 uvjeta kulture (kontrola, TD, MC i MT) u usporedbi sa svježim presjecima srca (D0) (n = 6 presjeka/skupina, od različitih svinja, unilateralno). Gdje su provedeni ANOVA testovi, ###p < 0,001 u usporedbi s D0, ***p < 0,001 u usporedbi s D12 (kontrola).d Grafovi analize sojeva svježeg (plavo), MC tkiva 12. dana (zeleno) i MT tkiva 12. dana (crveno) na deset regionalnih točaka presjeka tkiva (n = 4 presjeka/skupina, jednosmjerni ANOVA test; nije bilo značajne razlike između skupina). e Vulkanski graf koji prikazuje različito eksprimirane gene u svježim presjecima srca (D0) u usporedbi sa presjecima srca uzgajanim u statičkim uvjetima (Ctrl) ili u MT uvjetima (MT) tijekom 10-12 dana. f Toplinska karta gena sarkomera za presjeke srca uzgajane u svakom od uvjeta kulture. Trake pogreške predstavljaju srednju vrijednost ± standardnu ​​devijaciju.
Metabolička ovisnost o prelasku s oksidacije masnih kiselina na glikolizu obilježje je dediferencijacije kardiomiocita. Nezreli kardiomiociti prvenstveno koriste glukozu za proizvodnju ATP-a i imaju hipoplastične mitohondrije s malo krista5,32. Analize iskorištavanja glukoze pokazale su da je u uvjetima MC i MT iskorištavanje glukoze bilo slično onome u tkivima 0. dana (slika 4c). Međutim, Ctrl uzorci pokazali su značajno povećanje iskorištavanja glukoze u usporedbi sa svježim tkivom. To ukazuje na to da kombinacija CTCM i T3/Dex poboljšava održivost tkiva i čuva metabolički fenotip 12-dnevnih kultiviranih presjeka srca. Osim toga, analiza soja pokazala je da su razine soja ostale iste kao u svježem tkivu srca tijekom 12 dana u uvjetima MT i MS (slika 4d).
Kako bismo analizirali ukupni utjecaj CTCM-a i T3/Dex-a na globalni transkripcijski krajolik tkiva srčanih presjeka, proveli smo RNAseq na srčanim presjecima iz sva četiri različita uvjeta kulture (Dodatni podaci 1). Zanimljivo je da su MT presjeci pokazali visoku transkripcijsku sličnost sa svježim srčanim tkivom, sa samo 16 različito eksprimiranih od 13 642 gena. Međutim, kao što smo ranije pokazali, Ctrl presjeci pokazali su 1229 različito eksprimiranih gena nakon 10-12 dana u kulturi (slika 4e). Ovi podaci potvrđeni su qRT-PCR-om srčanih i fibroblastnih gena (Dodatna slika 7a-c). Zanimljivo je da su Ctrl presjeci pokazali smanjenu regulaciju srčanih i staničnih gena te aktivaciju upalnih genskih programa. Ovi podaci sugeriraju da je dediferencijacija, koja se normalno javlja nakon dugotrajnog uzgoja, potpuno oslabljena u MT uvjetima (Dodatna slika 8a,b). Pažljivo proučavanje gena sarkomera pokazalo je da se samo pod MT uvjetima očuvaju geni koji kodiraju sarkomeru (slika 4f) i ionski kanal (dodatna slika 9), štiteći ih od supresije pod Ctrl, TD i MC uvjetima. Ovi podaci pokazuju da kombinacijom mehaničke i humoralne stimulacije (T3/Dex), transkriptom srčanog kriške može ostati sličan svježim srčanim kriškama nakon 12 dana u kulturi.
Ove transkripcijske nalaze podupire činjenica da se strukturni integritet kardiomiocita u presjecima srca najbolje očuva u uvjetima MT tijekom 12 dana, što pokazuje intaktni i lokalizirani koneksin 43 (slika 5a). Osim toga, fibroza u presjecima srca u uvjetima MT bila je značajno smanjena u usporedbi s Ctrl i slična svježim presjecima srca (slika 5b). Ovi podaci pokazuju da kombinacija mehaničke stimulacije i tretmana T3/Dex učinkovito čuva srčanu strukturu u presjecima srca u kulturi.
Reprezentativne imunofluorescentne slike troponina-T (zeleno), koneksina 43 (crveno) i DAPI (plavo) u svježe izoliranim presjecima srca (D0) ili uzgajanim 12 dana u sva četiri uvjeta uzgoja presjeka srca (skala = 100 µm). Kvantifikacija strukturnog integriteta srčanog tkiva umjetnom inteligencijom (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) slojeva/skupina od različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u usporedbi s D0 i *p < 0,05, ili ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 Ctrl). Kvantifikacija strukturnog integriteta srčanog tkiva umjetnom inteligencijom (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) slojeva/skupina od različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; #### p < 0,0001 u usporedbi s D0 i *p < 0,05, ili ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 Ctrl). Količestvena procjena strukturne cjelovitosti tkiva srca pomoću umjetnog intelekta (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) rezova/grupa od različitih svinja, proveden jednofaktorski test ANOVA; #### p < 0,0001 u usporedbi s D0 i *p < 0,05 ili ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 Ctrl). Kvantifikacija strukturnog integriteta srčanog tkiva korištenjem umjetne inteligencije (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) presjeka/skupine od različitih svinja, proveden jednosmjerni ANOVA test; #### p < 0,0001 u usporedbi s D0 i *p < 0,05 ili ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组） < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。Kvantifikacija strukturnog integriteta srčanog tkiva korištenjem umjetne inteligencije kod različitih svinja (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) presjeci/skupina) jednosmjernim ANOVA testom;#### p < 0,0001 u usporedbi s D0 i *p < 0,05 ili ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 Ctrl). #### p < 0,0001 u usporedbi s D0 i *p < 0,05 ili ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 (kontrola). b Reprezentativne slike i kvantifikacija za kriške srca obojene Massonovom trikromskom bojom (mjerila = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) kriški/skupina od različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u usporedbi s D0 i ***p < 0,001 ili ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 Ctrl). b Reprezentativne slike i kvantifikacija za kriške srca obojene Massonovom trikromskom bojom (mjerila = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) kriški/skupina od različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u usporedbi s D0 i ***p < 0,001 ili ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 Ctrl). b Reprezentativne slike i kvantitativna procjena rezova srca, ukrašenih trikromnim krasiteljem Massona (masovna linija = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) rezova/skupina od različitih svinja, provodi se odnosnostrani test ANOVA; ####p < 0,0001 u usporedbi s D0 i ***p < 0,001 ili ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 Ctrl). b Reprezentativne slike i kvantifikacija dijelova srca obojenih Massonovom trikromskom bojom (mjerilo = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) dijelova/skupine od različitih svinja, provedena jednosmjerna ANOVA; ####p < 0,0001 vs. D0 i ***p < 0,001 ili ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MC，，来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 mason 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Reprezentativne slike i kvantitativna procjena rezova srca, ukrašenih trikromom Massona (mašinska linija = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) rezova od različitih svinja/grupa, jedan način ANOVA; ####p < 0,0001 u usporedbi s D0, ***p < 0,001 ili ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 Ctrl). b Reprezentativne slike i kvantifikacija dijelova srca obojenih Massonovim trikromom (mjerilo = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) dijelova od različitih svinja/skupina, jedna ANOVA metoda; ####p < 0,0001 u usporedbi s D0, ***p < 0,001 ili ****p < 0,0001 u usporedbi s D12 Ctrl).Trake pogreške predstavljaju srednju vrijednost ± standardnu ​​devijaciju.
Konačno, sposobnost CTCM-a da oponaša srčanu hipertrofiju procijenjena je povećanjem istezanja srčanog tkiva. U CTCM-u, vršni tlak u zračnoj komori povećao se s 80 mmHg na 80 mmHg. Art. (normalno istezanje) do 140 mmHg. Art. (slika 6a). To odgovara povećanju istezanja od 32% (slika 6b), što je prethodno prikazano kao odgovarajući postotak istezanja potreban da bi presjeci srca postigli duljinu sarkomera sličnu onoj uočenoj kod hipertrofije. Istezanje i brzina srčanog tkiva tijekom kontrakcije i opuštanja ostali su konstantni tijekom šest dana kulture (slika 6c). Srčano tkivo iz MT uvjeta podvrgnuto je normalnom istezanju (MT (normalno)) ili uvjetima pretjeranog istezanja (MT (OS)) tijekom šest dana. Već nakon četiri dana u kulturi, hipertrofični biomarker NT-ProBNP bio je značajno povišen u mediju pod MT (OS) uvjetima u usporedbi s MT (normalnim) uvjetima (slika 7a). Osim toga, nakon šest dana kultiviranja, veličina stanica u MT (OS) (slika 7b) značajno se povećala u usporedbi s presjecima MT srca (normalno). Osim toga, nuklearna translokacija NFATC4 bila je značajno povećana u prerastegnutim tkivima (slika 7c). Ovi rezultati pokazuju progresivni razvoj patološkog remodeliranja nakon hiperdistenzije i podupiru koncept da se CTCM uređaj može koristiti kao platforma za proučavanje signalizacije srčane hipertrofije inducirane istezanjem.
Reprezentativni tragovi mjerenja tlaka u zračnoj komori, tlaka u fluidnoj komori i kretanja tkiva potvrđuju da tlak u komori mijenja tlak u fluidnoj komori, uzrokujući odgovarajuće kretanje presjeka tkiva. b Reprezentativne krivulje postotka istezanja i brzine istezanja za normalno rastegnute (narančaste) i prerastegnute (plave) presjeke tkiva. c Stupčasti grafikon koji prikazuje vrijeme ciklusa (n = 19 presjeka po skupini, od različitih svinja), vrijeme kontrakcije (n = 18-19 presjeka po skupini, od različitih svinja), vrijeme relaksacije (n = 19 presjeka po skupini, od različitih svinja)), amplitudu kretanja tkiva (n = 14 presjeka/skupini, od različitih svinja), vršnu sistolnu brzinu (n = 14 presjeka/skupini, od različitih svinja) i vršnu brzinu relaksacije (n = 14 (D0), 15 (D6) presjeka/skupina) od različitih svinja), dvostrani Studentov t-test nije pokazao značajnu razliku ni u jednom parametru, što ukazuje da su ti parametri ostali konstantni tijekom 6 dana kulture s prenaponom. Trake pogreške predstavljaju srednju vrijednost ± standardnu ​​devijaciju.
Kvantifikacija koncentracije NT-ProBNP-a pomoću stupčastog grafikona u medijima za kulturu iz srčanih kriški uzgajanih pod uvjetima normalnog istezanja MT (Norm) ili prekomjernog istezanja (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm i D4 MTOS) kriške/skupina od različitih svinja, provedena je dvosmjerna ANOVA; **p < 0,01 u usporedbi s normalnim istezanjem). Kvantifikacija koncentracije NT-ProBNP-a pomoću stupčastog grafikona u medijima za kulturu iz srčanih kriški uzgajanih pod uvjetima normalnog istezanja MT (Norm) ili prekomjernog istezanja (OS) (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm i D4 MTOS) kriške/skupina od različitih svinja, provedena je dvosmjerna ANOVA; **p < 0,01 u usporedbi s normalnim istezanjem).Kvantitativni histogram koncentracije NT-ProBNP-a u mediju za kulturu iz srčanih kriški uzgajanih u uvjetima normalnog MT istezanja (norma) ili prekomjernog istezanja (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm i D4 MTOS) kriške/skupina od različitih svinja, provedena je dvofaktorska analiza varijance;**p < 0,01 u usporedbi s normalnim rastezanjem). **p < 0,01 u usporedbi s normalnim istezanjem). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01). a Kvantifikacija koncentracije NT-ProBNP u rezovima srca uzgojenim u uvjetima MT normalnog istezanja (Norm) ili prekomjernog rastezanja (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) iz različitih猪的切片/组，可以双向方方发发动 **u usporedbi s normalnim rastezanjem, p < 0,01).histogram Kvantifikacija koncentracija NT-ProBNP-a u srčanim presjecima kultiviranim u uvjetima normalnog MT istezanja (norma) ili prekomjernog istezanja (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) i D4 MTOS) presjeci/skupina od različitih svinja, dvosmjerna analiza varijance;**p < 0,01 u usporedbi s normalnim rastezanjem). **p < 0,01 u usporedbi s normalnim istezanjem). b Reprezentativne slike za srčane kriške obojene troponinom-T i WGA (lijevo) i kvantifikacija veličine stanica (desno) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) stanica/skupina iz 10 različitih kriški od različitih svinja, proveden je dvostrani Studentov t-test; ****p < 0,0001 u usporedbi s normalnim istezanjem). b Reprezentativne slike za srčane kriške obojene troponinom-T i WGA (lijevo) i kvantifikacija veličine stanica (desno) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) stanica/skupina iz 10 različitih kriški od različitih svinja, proveden je dvostrani Studentov t-test; ****p < 0,0001 u usporedbi s normalnim istezanjem). b Reprezentativne slike rezova srca, ukrašenih troponinom-T i AZP (slijed) i količinsko određivanje veličine stanica (sprava) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) stanica/skupina od 10 različitih rezova od različitih svinja, dva- provodi hvostov t-kriterij Stjudenta; ****p < 0,0001 u usporedbi s normalʹnim rastâženiem). b Reprezentativne slike dijelova srca obojenih troponinom-T i AZP-om (lijevo) i kvantifikacija veličine stanica (desno) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) stanica/skupina iz 10 različitih dijelova od različitih svinja, proveden je dvostrani Studentov t-test; ****p < 0,0001 u usporedbi s normalnim sojem). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS，来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）。 b Reprezentativne slike srčanih kriški obojenih kalkareinom-T i WGA (lijevo) i veličina stanica (desno) (n = 330 (D6 MTOS), 369 iz 10 različitih kriški (D6 MTNorm)) Stanice/组，两方法有尾学生 t-test；u usporedbi s normalnim istezanjem, ****p < 0,0001). b Reprezentativne slike rezova srca, ukrašenih troponinom-T i AZP (udio) i kvantitativna ocjena veličine ćelija (ispravka) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) od 10 različitih ureza različitih svinja Kletki/grupa, dvostrani kriterij Stjudenta; ****p < 0,0001 u usporedbi sa normalnim rastâženiem). b Reprezentativne slike dijelova srca obojenih troponinom-T i AZP-om (lijevo) i kvantifikacija veličine stanica (desno) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) iz 10 različitih dijelova od različitih svinja) Stanice/skupina, dvostrani kriterij Studentov t; ****p < 0,0001 u usporedbi s normalnim sojem). c Reprezentativne slike za MTOS srčanih rezova imunoobilježenih za troponin-T i NFATC4 0. i 6. dana te kvantifikacija translokacije NFATC4 u jezgre CM-ova (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) rezova/skupina od različitih svinja, proveden je dvostrani Studentov t-test; *p < 0,05). c Reprezentativne slike za MTOS srčanih rezova imunoobilježenih za troponin-T i NFATC4 0. i 6. dana te kvantifikacija translokacije NFATC4 u jezgre CM-ova (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) rezova/skupina od različitih svinja, proveden je dvostrani Studentov t-test; *p < 0,05). c Reprezentativne slike za rezove srca 0 i 6 dana MTOS, imunomeficijente za troponin-T i NFATC4, i količinsku ocjenu translokacije NFATC4 u jadra kavernoznih stanica (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) rezova/skupina od različitih svinja, ispunjava dvostrani t-kriterij Stjudenta; *p < 0,05). c Reprezentativne slike presjeka srca na 0 i 6 dana MTOS, imunoobilježene za troponin-T i NFATC4, te kvantifikacija translokacije NFATC4 u jezgri kavernoznih stanica (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) presjeci/skupina od različitih svinja) provedena dvostrani Studentov t-test; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)。 c Reprezentativne slike kalkanina-T i NFATC4 imunološkog označavanja 第0天和第6天MTOS rezova srca, i NFATC4 iz različitih NFATC4 易位至CM stanične jezgre的količine化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组,时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Reprezentativne slike rezova srca MTOS na 0 i 6 dana za imunomarkiranje troponinom-T i NFATC4 i količinsku ocjenu translokacije NFATC4 u jadra CM od različitih svinja (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) rez/grupa, dva hvostatna t-kriterija Stjudenta; *p < 0,05). c Reprezentativne slike MTOS srčanih rezova na dan 0 i 6 za imunoobilježavanje troponina-T i NFATC4 te kvantifikaciju NFATC4 translokacije u jezgri CM-a kod različitih svinja (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) rezova/skupina, dvostrani t-kriterij Studentovog; *p < 0,05).Trake pogreške predstavljaju srednju vrijednost ± standardnu ​​devijaciju.
Translacijska kardiovaskularna istraživanja zahtijevaju stanične modele koji točno reproduciraju srčano okruženje. U ovoj studiji razvijen je i karakteriziran CTCM uređaj koji može stimulirati ultratanke dijelove srca. CTCM sustav uključuje fiziološki sinkroniziranu elektromehaničku stimulaciju i obogaćivanje T3 i Dex tekućinom. Kada su dijelovi svinjskog srca bili izloženi tim čimbenicima, njihova održivost, strukturni integritet, metabolička aktivnost i transkripcijska ekspresija ostali su isti kao u svježem srčanom tkivu nakon 12 dana kulture. Osim toga, pretjerano istezanje srčanog tkiva može uzrokovati hipertrofiju srca uzrokovanu hiperekstenzijom. Sveukupno, ovi rezultati podržavaju ključnu ulogu fizioloških uvjeta kulture u održavanju normalnog srčanog fenotipa i pružaju platformu za probir lijekova.
Mnogi čimbenici doprinose stvaranju optimalnog okruženja za funkcioniranje i preživljavanje kardiomiocita. Najočitiji od tih čimbenika povezani su s (1) međustaničnim interakcijama, (2) elektromehaničkom stimulacijom, (3) humoralnim čimbenicima i (4) metaboličkim supstratima. Fiziološke interakcije stanica zahtijevaju složene trodimenzionalne mreže više tipova stanica koje podržava izvanstanični matriks. Takve složene stanične interakcije teško je rekonstruirati in vitro kokulturom pojedinačnih tipova stanica, ali se mogu lako postići korištenjem organotipske prirode presjeka srca.
Mehaničko istezanje i električna stimulacija kardiomiocita ključni su za održavanje srčanog fenotipa33,34,35. Iako se mehanička stimulacija široko koristi za kondicioniranje i sazrijevanje hiPSC-CM-a, nekoliko elegantnih studija nedavno je pokušalo mehaničku stimulaciju srčanih kriški u kulturi korištenjem jednoosnog opterećenja. Ove studije pokazuju da 2D jednoosno mehaničko opterećenje ima pozitivan učinak na fenotip srca tijekom kulture. U tim studijama, dijelovi srca bili su ili opterećeni izometrijskim vlačnim silama17, linearnim auksotoničnim opterećenjem18 ili je srčani ciklus rekreiran korištenjem povratne informacije pretvarača sile i pogona napetosti. Međutim, ove metode koriste jednoosno istezanje tkiva bez optimizacije okoliša, što rezultira supresijom mnogih srčanih gena ili prekomjernom ekspresijom gena povezanih s abnormalnim odgovorima istezanja. Ovdje opisani CTCM pruža 3D elektromehanički podražaj koji oponaša prirodni srčani ciklus u smislu vremena ciklusa i fiziološkog istezanja (25% istezanja, 40% sistole, 60% dijastole i 72 otkucaja u minuti). Iako ova trodimenzionalna mehanička stimulacija sama po sebi nije dovoljna za održavanje integriteta tkiva, potrebna je kombinacija humoralne i mehaničke stimulacije pomoću T3/Dex-a za adekvatno održavanje održivosti, funkcije i integriteta tkiva.
Humoralni čimbenici igraju važnu ulogu u modulaciji fenotipa odraslog srca. To je istaknuto u HiPS-CM studijama u kojima su T3 i Dex dodani u medij za uzgoj kako bi se ubrzalo sazrijevanje stanica. T3 može utjecati na transport aminokiselina, šećera i kalcija kroz stanične membrane36. Osim toga, T3 potiče ekspresiju MHC-α i smanjenje MHC-β, potičući stvaranje brzih miofibrila u zrelim kardiomiocitima u usporedbi sa sporim miofibrilama u fetalnom CM. Nedostatak T3 kod hipotireoznih pacijenata rezultira gubitkom miofibrilnih traka i smanjenom brzinom razvoja tonusa37. Dex djeluje na glukokortikoidne receptore i pokazalo se da povećava kontraktilnost miokarda u izoliranim perfuziranim srcima;38 smatra se da je ovo poboljšanje povezano s učinkom na ulazak uzrokovan depozitima kalcija (SOCE)39,40. Osim toga, Dex se veže na svoje receptore, uzrokujući široki unutarstanični odgovor koji potiskuje imunološku funkciju i upalu30.
Naši rezultati pokazuju da je fizikalno-mehanička stimulacija (MS) poboljšala ukupne performanse kulture u usporedbi s Ctrl, ali nije uspjela održati održivost, strukturni integritet i srčanu ekspresiju tijekom 12 dana u kulturi. U usporedbi s Ctrl, dodatak T3 i Dexa u CTCM (MT) kulture poboljšao je održivost i održao slične transkripcijske profile, strukturni integritet i metaboličku aktivnost sa svježim srčanim tkivom tijekom 12 dana. Osim toga, kontroliranjem stupnja istezanja tkiva, stvoren je model srčane hipertrofije inducirane hiperekstenzijom pomoću STCM-a, što ilustrira svestranost STCM sustava. Treba napomenuti da iako remodeliranje srca i fibroza obično uključuju netaknute organe čije cirkulirajuće stanice mogu osigurati odgovarajuće citokine, kao i fagocitozu i druge faktore remodeliranja, dijelovi srca i dalje mogu oponašati fibrotični proces kao odgovor na stres i traumu. To je prethodno procijenjeno u ovom modelu srčanog presjeka. Treba napomenuti da se parametri CTCM-a mogu modulirati promjenom tlaka/električne amplitude i frekvencije kako bi se simulirala mnoga stanja poput tahikardije, bradikardije i mehaničke cirkulacijske potpore (mehanički neopterećeno srce). To čini sustav srednjim protokom za testiranje lijekova. Sposobnost CTCM-a da modelira srčanu hipertrofiju izazvanu prenaprezanjem otvara put testiranju ovog sustava za personaliziranu terapiju. Zaključno, ova studija pokazuje da su mehaničko istezanje i humoralna stimulacija ključni za održavanje kulture presjeka srčanog tkiva.
Iako ovdje prikazani podaci sugeriraju da je CTCM vrlo obećavajuća platforma za modeliranje intaktnog miokarda, ova metoda kulture ima neka ograničenja. Glavno ograničenje CTCM kulture je to što nameće kontinuirana dinamička mehanička naprezanja na presjeke, što onemogućuje aktivno praćenje kontrakcija srčanih presjeka tijekom svakog ciklusa. Osim toga, zbog male veličine srčanih presjeka (7 mm), mogućnost procjene sistoličke funkcije izvan sustava kulture korištenjem tradicionalnih senzora sile je ograničena. U ovom rukopisu djelomično prevladavamo ovo ograničenje procjenom optičkog napona kao pokazatelja kontraktilne funkcije. Međutim, ovo ograničenje zahtijevat će daljnji rad i može se riješiti u budućnosti uvođenjem metoda za optičko praćenje funkcije srčanih presjeka u kulturi, kao što je optičko mapiranje korištenjem kalcija i naponski osjetljivih boja. Još jedno ograničenje CTCM-a je to što radni model ne manipulira fiziološkim stresom (predopterećenje i naknadno opterećenje). U CTCM-u je tlak induciran u suprotnim smjerovima kako bi se reproduciralo 25% fiziološkog istezanja u dijastoli (puno istezanje) i sistoli (duljina kontrakcije tijekom električne stimulacije) u vrlo velikim tkivima. Ovo ograničenje trebalo bi ukloniti u budućim dizajnima CTCM-a odgovarajućim pritiskom na srčano tkivo s obje strane i primjenom točnih odnosa tlaka i volumena koji se javljaju u srčanim komorama.
Preoblikovanje izazvano prekomjernim istezanjem opisano u ovom rukopisu ograničeno je na oponašanje hipertrofičnih signala hiperistezanja. Stoga ovaj model može pomoći u proučavanju hipertrofične signalizacije izazvane istezanjem bez potrebe za humoralnim ili neuronskim čimbenicima (koji ne postoje u ovom sustavu). Potrebna su daljnja istraživanja kako bi se povećala multiplicitet CTCM-a, na primjer, kokultiviranje s imunološkim stanicama, cirkulirajućim humoralnim faktorima plazme i inervacija pri kokultiviranju s neuronskim stanicama poboljšat će mogućnosti modeliranja bolesti s CTCM-om.
U ovoj studiji korišteno je trinaest svinja. Svi postupci na životinjama provedeni su u skladu s institucionalnim smjernicama i odobreni su od strane Odbora za institucionalnu njegu i korištenje životinja Sveučilišta u Louisvilleu. Aortni luk je stegnut, a srce je perfuzirano s 1 L sterilne kardioplegije (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparina, pH do 7,4); Srca su pohranjena u ledeno hladnoj kardioplegičnoj otopini do transporta u laboratorij na ledu, što obično traje <10 minuta. Srca su pohranjena u ledeno hladnoj kardioplegičnoj otopini do transporta u laboratorij na ledu, što obično traje <10 minuta. srca su pohranjena u ledjanom kardioplegijskom rastvoru za prijenos u laboratoriju na ledu, što obično traje <10 min. Srca su pohranjena u ledeno hladnoj kardioplegičnoj otopini do transporta u laboratorij na ledu, što obično traje <10 minuta.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Držite srce u ledjanoj kardioplegiji do transporta u laboratoriju na ledu, obično <10 min. Držite srca na ledenoj kardioplegiji do transporta u laboratorij na ledu, obično <10 minuta.
CTCM uređaj razvijen je u SolidWorks softveru za računalno potpomognuto projektiranje (CAD). Komore za kulturu, razdjelnici i zračne komore izrađene su od prozirne CNC akrilne plastike. Potporni prsten promjera 7 mm izrađen je od polietilena visoke gustoće (HDPE) u sredini i ima utor za o-prsten za smještaj silikonskog o-prstena koji se koristi za brtvljenje medija ispod. Tanka silikatna membrana odvaja komoru za kulturu od ploče za odvajanje. Silikonska membrana je laserski izrezana iz silikonskog lima debljine 0,02″ i ima tvrdoću od 35A. Donja i gornja silikonska brtva su laserski izrezane iz silikonskog lima debljine 1/16″ i imaju tvrdoću od 50A. Vijci i krilate matice od nehrđajućeg čelika 316L koriste se za pričvršćivanje bloka i stvaranje hermetičkog brtvljenja.
Namjenska tiskana ploča (PCB) dizajnirana je za integraciju sa sustavom C-PACE-EM. Utičnice švicarskog strojnog konektora na PCB-u spojene su na grafitne elektrode posrebrenim bakrenim žicama i brončanim vijcima 0-60 uvrnutim u elektrode. Tiskana ploča smještena je u poklopcu 3D printera.
CTCM uređajem upravlja programabilni pneumatski aktuator (PPD) koji stvara kontrolirani cirkulatorni tlak sličan srčanom ciklusu. Kako se tlak unutar zračne komore povećava, fleksibilna silikonska membrana se širi prema gore, prisiljavajući medij ispod mjesta tkiva. Područje tkiva će se zatim rastegnuti ovim izbacivanjem tekućine, oponašajući fiziološko širenje srca tijekom dijastole. Na vrhuncu opuštanja, primijenjena je električna stimulacija putem grafitnih elektroda, što je smanjilo tlak u zračnoj komori i uzrokovalo kontrakciju dijelova tkiva. Unutar cijevi nalazi se hemostatski ventil sa senzorom tlaka za detekciju tlaka u zračnom sustavu. Tlak koji osjeti senzor tlaka primjenjuje se na sakupljač podataka spojen na prijenosno računalo. To omogućuje kontinuirano praćenje tlaka unutar plinske komore. Kada se dosegne maksimalni tlak u komori (standardno 80 mmHg, 140 mmHg OS), uređaju za prikupljanje podataka naređeno je da pošalje signal C-PACE-EM sustavu za generiranje dvofaznog naponskog signala tijekom 2 ms, postavljenog na 4 V.
Dobiveni su presjeci srca i uvjeti uzgoja u 6 jažica provedeni su na sljedeći način: ubrano srce prebačeno je iz posude za prijenos u pladanj koji sadrži hladnu (4°C) kardioplegiju. Lijeva klijetka izolirana je sterilnom oštricom i izrezana na komade od 1-2 cm3. Ovi blokovi tkiva pričvršćeni su na nosače tkiva ljepilom za tkivo i smješteni u vibrirajuću mikrotomsku kupelj za tkivo koja sadrži Tyrodeovu otopinu i kontinuirano oksigenirana (3 g/L 2,3-butandion monooksima (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g)). ), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glukoze (1,86 g), 10 mM HEPES-a (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M otopine), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M otopine), do 1 L ddH2O). Vibrirajući mikrotom postavljen je za rezanje rezova debljine 300 µm pri frekvenciji od 80 Hz, horizontalnoj amplitudi vibracija od 2 mm i brzini pomicanja od 0,03 mm/s. Kupka za tkivo bila je okružena ledom kako bi se otopina održala hladnom, a temperatura se održavala na 4°C. Presjeci tkiva prenijeti su iz kupke za mikrotom u inkubacijsku kupku koja sadrži kontinuirano oksigeniranu Tyrode otopinu na ledu dok se ne dobije dovoljno presjeka za jednu ploču za kulturu. Za transwell kulture, presjeci tkiva pričvršćeni su na sterilne poliuretanske nosače širine 6 mm i smješteni u 6 ml optimiziranog medija (199 medij, 1x ITS dodatak, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalni i 2X antibiotik-antifungal). Električna stimulacija (10 V, frekvencija 1,2 Hz) primijenjena je na presjeke tkiva putem C-Pace-a. Za TD uvjete, svježi T3 i Dex dodani su u koncentracijama od 100 nM i 1 μM pri svakoj promjeni medija. Medij se zasiti kisikom prije zamjene 3 puta dnevno. Presjeci tkiva uzgajani su u inkubatoru na 37°C i 5% CO2.
Za CTCM kulture, presjeci tkiva postavljeni su na prilagođeni 3D printer u Petrijevoj zdjelici koja sadrži modificiranu Tyrodeovu otopinu. Uređaj je dizajniran za povećanje veličine kriške srca za 25% površine potpornog prstena. To se radi kako se presjeci srca ne bi rastezali nakon prijenosa iz Tyrodeove otopine u medij i tijekom dijastole. Pomoću histoakrilnog ljepila, presjeci debljine 300 µm pričvršćeni su na potporni prsten promjera 7 mm. Nakon pričvršćivanja presjeka tkiva na potporni prsten, odrežite višak presjeka tkiva i pričvršćene presjeke tkiva vratite u kupelj Tyrodeove otopine na ledu (4°C) dok se ne pripremi dovoljno presjeka za jedan uređaj. Ukupno vrijeme obrade za sve uređaje ne smije biti dulje od 2 sata. Nakon što je 6 presjeka tkiva pričvršćeno na njihove potporne prstenove, CTCM uređaj je sastavljen. CTCM komora za kulturu prethodno je napunjena s 21 ml prethodno oksigeniranog medija. Prenesite presjeke tkiva u komoru za kulturu i pažljivo uklonite sve mjehuriće zraka pipetom. Presjek tkiva se zatim uvodi u rupu i nježno pritiska na mjesto. Na kraju, stavite poklopac elektrode na uređaj i prenesite uređaj u inkubator. Zatim spojite CTCM na cijev za zrak i C-PACE-EM sustav. Pneumatski aktuator se otvara, a zračni ventil otvara CTCM. C-PACE-EM sustav je konfiguriran da isporučuje 4 V pri 1,2 Hz tijekom bifazne stimulacije tijekom 2 ms. Medij se mijenjao dva puta dnevno, a elektrode su se mijenjale jednom dnevno kako bi se izbjeglo nakupljanje grafita na elektrodama. Ako je potrebno, presjeci tkiva mogu se ukloniti iz njihovih jažica za kulturu kako bi se izbacili svi mjehurići zraka koji su možda pali ispod njih. Za uvjete MT tretmana, T3/Dex je dodan svježi sa svakom promjenom medija sa 100 nM T3 i 1 μM Dex. CTCM uređaji su uzgajani u inkubatoru na 37°C i 5% CO2.
Za dobivanje rastegnutih putanja srčanih kriški razvijen je poseban sustav kamera. Korištena je SLR kamera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japan) s makro objektivom Navitar Zoom 7000 18-108 mm (Navitar, San Francisco, Kalifornija). Vizualizacija je provedena na sobnoj temperaturi nakon zamjene medija svježim medijem. Kamera je postavljena pod kutom od 51°, a video se snima pri 30 sličica u sekundi. Prvo je korišten softver otvorenog koda (MUSCLEMOTION43) s Image-J za kvantificiranje gibanja srčanih kriški. Maska je stvorena pomoću MATLAB-a (MathWorks, Natick, MA, SAD) kako bi se definirala područja interesa za kucajuće srčane kriške kako bi se izbjegao šum. Ručno segmentirane maske primjenjuju se na sve slike u nizu kadrova, a zatim se prosljeđuju MUSCLEMOTION dodatku. Muscle Motion koristi prosječni intenzitet piksela u svakom kadru za kvantificiranje njegovog gibanja u odnosu na referentni okvir. Podaci su snimljeni, filtrirani i korišteni za kvantificiranje vremena ciklusa i procjenu istezanja tkiva tijekom srčanog ciklusa. Snimljeni video je naknadno obrađen pomoću digitalnog filtera nulte faze prvog reda. Za kvantificiranje istezanja tkiva (od vrha do vrha), provedena je analiza od vrha do vrha kako bi se razlikovali vrhovi i doline u snimljenom signalu. Osim toga, provedeno je uklanjanje trenda pomoću polinoma 6. reda kako bi se uklonio pomak signala. Programski kod razvijen je u MATLAB-u za određivanje globalnog gibanja tkiva, vremena ciklusa, vremena relaksacije i vremena kontrakcije (Dodatni programski kod 44).
Za analizu naprezanja, koristeći iste videozapise stvorene za procjenu mehaničkog istezanja, prvo smo pratili dvije slike koje predstavljaju vrhove gibanja (najviša (gornja) i najniža (donja) točka gibanja) prema softveru MUSCLEMOTION. Zatim smo segmentirali područja tkiva i primijenili oblik algoritma sjenčanja na segmentirano tkivo (Dodatna slika 2a). Segmentirano tkivo je zatim podijeljeno na deset podpovršina, a naprezanje na svakoj površini izračunato je pomoću sljedeće jednadžbe: Naprezanje = (Sup-Sdown)/Sdown, gdje su Sup i Sdown udaljenosti oblika od gornje i donje sjene tkanine (Dodatna slika 2b).
Rezovi srca fiksirani su u 4%-tnom paraformaldehidu tijekom 48 sati. Fiksirana tkiva dehidrirana su u 10% i 20%-tnoj saharozi tijekom 1 sata, a zatim u 30%-tnoj saharozi preko noći. Rezovi su zatim ugrađeni u spoj optimalne temperature rezanja (OCT spoj) i postupno zamrznuti u kupelji izopentana/suhog leda. OCT blokove za ugradnju čuvajte na -80 °C do odvajanja. Predmeti su pripremljeni kao rezovi debljine 8 μm.
Za uklanjanje OCT-a iz presjeka srca, zagrijavajte preparate na grijaćem bloku na 95 °C tijekom 5 minuta. Dodajte 1 ml PBS-a na svaki preparat i inkubirajte 30 minuta na sobnoj temperaturi, zatim prožmite presjeke postavljanjem 0,1% Triton-X u PBS tijekom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Kako biste spriječili vezanje nespecifičnih antitijela za uzorak, dodajte 1 ml 3% otopine BSA na preparate i inkubirajte 1 sat na sobnoj temperaturi. BSA je zatim uklonjen, a preparati su isprani PBS-om. Označite svaki uzorak olovkom. Primarna antitijela (razrijeđena 1:200 u 1% BSA) (koneksin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) i troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) dodana su tijekom 90 minuta, zatim sekundarna antitijela (razrijeđena 1:200 u 1% BSA) protiv mišjeg Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), protiv zečjeg Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) tijekom dodatnih 90 minuta. Isprano 3 puta s PBS-om. Kako bismo razlikovali ciljno bojenje od pozadine, koristili smo samo sekundarno antitijelo kao kontrolu. Na kraju je dodana DAPI nuklearna boja, a preparati su stavljeni u vectashield (Vector Laboratories) i zapečaćeni lakom za nokte. -x povećanje) i Keyence mikroskop s 40x povećanjem.
Za WGA bojenje korišten je WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) u koncentraciji od 5 μg/ml u PBS-u i nanesen na fiksirane dijelove tijekom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim su preparati isprani s PBS-om, a na svaki preparat je dodana Sudan crna boja i inkubirani 30 minuta. Zatim su preparati isprani s PBS-om i dodan je vectashield medij za ugradnju. Preparati su vizualizirani na Keyence mikroskopu pri povećanju od 40x.
OCT je uklonjen iz uzoraka kako je gore opisano. Nakon uklanjanja OCT-a, pločice su uronjene u Bouinovu otopinu preko noći. pločice su zatim isprane destiliranom vodom 1 sat, a zatim stavljene u Bibrichovu otopinu aloe kiseline fuksina na 10 minuta. Nakon toga, pločice su isprane destiliranom vodom i stavljene u otopinu 5% fosfomolibdena/5% fosfovolframove kiseline na 10 minuta. Bez ispiranja, pločice su prenesene izravno u otopinu anilinskog plavog na 15 minuta. Zatim su pločice isprane destiliranom vodom i stavljene u 1% otopinu octene kiseline na 2 minute. Pločice su osušene u 200 N etanolu i prenesene u ksilen. Obojene pločice su vizualizirane pomoću Keyence mikroskopa s objektivom od 10x. Postotak površine fibroze kvantificiran je pomoću Keyence Analyzer softvera.
CyQUANT™ MTT test stanične vijabilnosti (Invitrogen, Carlsbad, CA), kataloški broj V13154, prema protokolu proizvođača s nekim izmjenama. Konkretno, korišten je kirurški bušilica promjera 6 mm kako bi se osigurala ujednačena veličina tkiva tijekom MTT analize. Tkiva su pojedinačno nasađena u jažice ploče s 12 jažica koja sadrži MTT supstrat prema protokolu proizvođača. Rezovi se inkubiraju na 37 °C tijekom 3 sata, a živo tkivo metabolizira MTT supstrat stvarajući ljubičasti formazan. MTT otopinu zamijenite s 1 ml DMSO-a i inkubirajte na 37 °C tijekom 15 minuta kako biste ekstrahirali ljubičasti formazan iz dijelova srca. Uzorci su razrijeđeni 1:10 u DMSO-u u pločama s 96 jažica s prozirnim dnom, a intenzitet ljubičaste boje mjeren je na 570 nm pomoću čitača ploča Cytation (BioTek). Očitavanja su normalizirana na težinu svakog kriške srca.
Medij za srčane rezove zamijenjen je medijem koji sadrži 1 μCi/ml [5-3H]-glukoze (Moravek Biochemicals, Brea, CA, SAD) za test iskorištenja glukoze kako je prethodno opisano. Nakon 4 sata inkubacije, dodajte 100 µl medija u otvorenu mikrocentrifugalnu epruvetu koja sadrži 100 µl 0,2 N HCl. Zatim je epruveta stavljena u scintilacijsku epruvetu koja sadrži 500 μl dH2O kako bi se ispario [3H]2O tijekom 72 sata na 37°C. Zatim uklonite mikrocentrifugalnu epruvetu iz scintilacijske epruvete i dodajte 10 ml scintilacijske tekućine. Scintilacijsko brojanje provedeno je pomoću analizatora tekućinske scintilacije Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, SAD). Iskorištenost glukoze zatim je izračunata uzimajući u obzir specifičnu aktivnost [5-3H]-glukoze, nepotpunu ravnotežu i pozadinu, razrjeđenje [5-3H]-neoznačenom glukozom i učinkovitost scintilacijskog brojača. Podaci su normalizirani na masu presjeka srca.
Nakon homogenizacije tkiva u Trizolu, RNA je izolirana iz dijelova srca pomoću Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 prema protokolu proizvođača. Priprema RNAsec biblioteke, sekvenciranje i analiza podataka provedeni su na sljedeći način:
1 μg RNA po uzorku korišten je kao početni materijal za pripremu RNA biblioteke. Sekvencirajuće biblioteke generirane su pomoću NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit za Illuminu (NEB, SAD) prema preporukama proizvođača, a indeksni kodovi dodani su atributnim sekvencama za svaki uzorak. Ukratko, mRNA je pročišćena iz ukupne RNA pomoću magnetskih kuglica pričvršćenih poli-T oligonukleotidima. Fragmentacija se provodi pomoću dvovalentnih kationa na visokoj temperaturi u NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). Prvi lanac cDNA sintetiziran je pomoću slučajnih heksamernih primera i M-MuLV reverzne transkriptaze (RNase H-). Drugi lanac cDNA zatim se sintetizira pomoću DNA polimeraze I i RNase H. Preostali prevjesi pretvaraju se u tupe krajeve aktivnošću egzonukleaze/polimeraze. Nakon adenilacije 3' kraja DNA fragmenta, na njega se pričvršćuje NEBNext adapter sa strukturom u obliku ukosnice kako bi se pripremio za hibridizaciju. Za odabir cDNA fragmenata preferirane duljine 150-200 bp. Fragmenti biblioteke pročišćeni su pomoću AMPure XP sustava (Beckman Coulter, Beverly, SAD). Zatim je korišteno 3 μl USER enzima (NEB, SAD) s cDNA odabranom veličinom, ligirano s adapterom, tijekom 15 minuta na 37°C, a zatim 5 minuta na 95°C prije PCR-a. PCR je zatim proveden korištenjem Phusion High-Fidelity DNA polimeraze, univerzalnih PCR primera i Index (X) primera. Konačno, PCR produkti su pročišćeni (AMPure XP sustav), a kvaliteta biblioteke procijenjena na Agilent Bioanalyzer 2100 sustavu. Biblioteka cDNA zatim je sekvencirana pomoću Novaseq sekvencera. Sirove slikovne datoteke iz Illumine pretvorene su u sirove očitanja pomoću CASAVA Base Callinga. Sirovi podaci pohranjeni su u datotekama formata FASTQ(fq) koje sadrže očitane sekvence i odgovarajuće bazne kvalitete. Odaberite HISAT2 za usklađivanje filtriranih očitanja sekvenciranja s referentnim genomom Sscrofa11.1. Općenito, HISAT2 podržava genome bilo koje veličine, uključujući genome veće od 4 milijarde baza, a za većinu parametara postavljene su zadane vrijednosti. Očitavanja spajanja iz RNA Seq podataka mogu se učinkovito poravnati pomoću HISAT2, najbržeg trenutno dostupnog sustava, s istom ili boljom točnošću od bilo koje druge metode.
Obilje transkripata izravno odražava razinu ekspresije gena. Razine ekspresije gena procjenjuju se obiljem transkripata (brojem sekvenciranja) povezanih s genomom ili eksonima. Broj očitavanja proporcionalan je razinama ekspresije gena, duljini gena i dubini sekvenciranja. FPKM (fragmenti na tisuću baznih parova transkripta sekvenciranih na milijun baznih parova) izračunati su i P-vrijednosti diferencijalne ekspresije određene su pomoću DESeq2 paketa. Zatim smo izračunali stopu lažnih otkrića (FDR) za svaku P vrijednost koristeći Benjamini-Hochbergovu metodu9 na temelju ugrađene R-funkcije „p.adjust“.
RNA izolirana iz srčanih presjeka pretvorena je u cDNA u koncentraciji od 200 ng/μl korištenjem SuperScript IV Vilo Master mixa tvrtke Thermo (Thermo, kat. br. 11756050). Kvantitativna RT-PCR provedena je korištenjem Applied Biosystems Endura Plate Microamp prozirne reakcijske ploče s 384 jažice (Thermo, kat. br. 4483319) i microamp optičkog adheziva (Thermo, kat. br. 4311971). Reakcijska smjesa sastojala se od 5 µl Taqman Fast Advanced Master mixa (Thermo, kat. br. 4444557), 0,5 µl Taqman Primera i 3,5 µl H2O pomiješanih po jažici. Standardni qPCR ciklusi su provedeni, a CT vrijednosti su izmjerene korištenjem Applied Biosystems Quantstudio 5 instrumenta za PCR u stvarnom vremenu (modul s 384 jažice; broj proizvoda A28135). Taqman primeri su kupljeni od tvrtke Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). CT vrijednosti svih uzoraka su normalizirane na gen za održavanje GAPDH.
Oslobađanje NT-ProBNP-a iz medija procijenjeno je pomoću NT-ProBNP kita (pig) (kat. br. MBS2086979, MyBioSource) prema protokolu proizvođača. Ukratko, u svaku jažicu dodano je po 250 µl svakog uzorka i standarda u duplikatu. Odmah nakon dodavanja uzorka, u svaku jažicu dodajte 50 µl reagensa za ispitivanje A. Lagano protresite ploču i zatvorite brtvilom. Zatim su tablete inkubirane na 37°C tijekom 1 sata. Zatim aspirirajte otopinu i isperite jažice 4 puta s 350 µl 1X otopine za ispiranje, inkubirajući otopinu za ispiranje 1-2 minute svaki put. Zatim dodajte 100 µl reagensa za ispitivanje B po jažici i zatvorite brtvilom za ploču. Tableta je lagano protresena i inkubirana na 37°C tijekom 30 minuta. Aspirirajte otopinu i isperite jažice 5 puta s 350 µl 1X otopine za ispiranje. U svaku jažicu dodajte 90 µl otopine supstrata i zatvorite ploču. Inkubirajte ploču na 37°C tijekom 10-20 minuta. U svaku jažicu dodajte 50 µl otopine za zaustavljanje reakcije. Ploča je odmah izmjerena pomoću čitača ploča Cytation (BioTek) postavljenog na 450 nm.
Analize snage provedene su kako bi se odabrale veličine grupa koje će osigurati snagu >80% za detekciju apsolutne promjene parametra od 10% s 5% stopom pogreške tipa I. Analize snage provedene su kako bi se odabrale veličine grupa koje će osigurati snagu >80% za detekciju apsolutne promjene parametra od 10% s stopom pogreške tipa I od 5%. Analiza snage je provedena za odabir veličine skupine, koja osigurava >80% snage za otkrivanje promjena 10% apsolutnog parametra s 5% frekvencije pogreške tipa I. Analiza snage provedena je kako bi se odabrale veličine grupa koje bi osigurale snagu >80% za otkrivanje 10% apsolutne promjene parametra s 5% stopom pogreške tipa I.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Provedena je analiza snage za odabir veličine skupine, koja je osigurala > 80% snage za otkrivanje 10% apsolutnih promjena parametara i 5% frekvencije pogreške tipa I. Provedena je analiza snage kako bi se odabrala veličina grupe koja bi osigurala >80% snage za detekciju 10% apsolutne promjene parametra i 5% stope pogreške tipa I.Presjeci tkiva su nasumično odabrani prije eksperimenta. Sve analize su bile uvjetno slijepe, a uzorci su dekodirani tek nakon što su svi podaci analizirani. Za sve statističke analize korišten je GraphPad Prism softver (San Diego, CA). Za sve statistike, p-vrijednosti su smatrane značajnima pri vrijednostima <0,05. Za sve statistike, p-vrijednosti su smatrane značajnima pri vrijednostima <0,05. Za cijelu statistiku p-značenje smatralo se značajnim pri značenjima <0,05. Za sve statistike, p-vrijednosti su smatrane značajnima pri vrijednostima <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Za cijelu statistiku p-značenje smatralo se značajnim pri značenjima <0,05. Za sve statistike, p-vrijednosti su smatrane značajnima pri vrijednostima <0,05.Dvostrani Studentov t-test proveden je na podacima s samo 2 usporedbe. Za određivanje značajnosti između više skupina korištena je jednosmjerna ili dvosmjerna ANOVA. Prilikom provođenja post hoc testova primijenjena je Tukeyjeva korekcija kako bi se uzele u obzir višestruke usporedbe. RNAsec podaci imaju posebna statistička razmatranja pri izračunu FDR-a i p.adjust-a kako je opisano u odjeljku Metode.
Za više informacija o dizajnu studije pogledajte sažetak izvješća o istraživanju prirode koji je povezan s ovim člankom.