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Há uma necessidade de um sistema in vitro confiável que possa reproduzir com precisão o ambiente fisiológico do coração para testes de medicamentos. A disponibilidade limitada de sistemas de cultura de tecido cardíaco humano tem levado a interpretações imprecisas dos efeitos de fármacos cardíacos. Aqui, desenvolvemos um modelo de cultura de tecido cardíaco (CTCM) que estimula eletromecanicamente fatias de tecido cardíaco e as submete a estiramento fisiológico durante as fases sistólica e diastólica do ciclo cardíaco. Após 12 dias de cultura, essa abordagem melhorou parcialmente a viabilidade das seções cardíacas, mas não preservou completamente sua integridade estrutural. Portanto, após triagem com pequenas moléculas, descobrimos que a adição de 100 nM de triiodotironina (T3) e 1 μM de dexametasona (Dex) ao nosso meio de cultura manteve a microestrutura das seções por 12 dias. Em combinação com o tratamento com T3/Dex, o sistema CTCM manteve os perfis transcricionais, a viabilidade, a atividade metabólica e a integridade estrutural no mesmo nível do tecido cardíaco fresco por 12 dias. Além disso, o estiramento excessivo do tecido cardíaco em cultura induz sinalização cardíaca hipertrófica, fornecendo evidências da capacidade do CTCM de mimetizar condições hipertróficas induzidas pelo estiramento cardíaco. Em conclusão, o CTCM pode modelar a fisiologia e a fisiopatologia do coração em cultura por longos períodos, permitindo uma triagem confiável de fármacos.
Antes da pesquisa clínica, são necessários sistemas in vitro confiáveis ​​que possam reproduzir com precisão o ambiente fisiológico do coração humano. Tais sistemas devem mimetizar alterações no estiramento mecânico, na frequência cardíaca e nas propriedades eletrofisiológicas. Modelos animais são comumente usados ​​como plataforma de triagem para fisiologia cardíaca, com confiabilidade limitada na reprodução dos efeitos de fármacos no coração humano^1,2. Em última análise, o Modelo Experimental Ideal de Cultura de Tecido Cardíaco (CTCM) é um modelo altamente sensível e específico para diversas intervenções terapêuticas e farmacológicas, reproduzindo com precisão a fisiologia e a fisiopatologia do coração humano³. A ausência de um sistema como esse limita a descoberta de novos tratamentos para insuficiência cardíaca^4,5 e tem levado à cardiotoxicidade medicamentosa como um dos principais motivos para a sua retirada do mercado⁶.
Na última década, oito medicamentos não cardiovasculares foram retirados do uso clínico por causarem prolongamento do intervalo QT, levando a arritmias ventriculares e morte súbita⁷. Assim, há uma crescente necessidade de estratégias confiáveis ​​de triagem pré-clínica para avaliar a eficácia e a toxicidade cardiovascular. O uso recente de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPS-CM) na triagem de medicamentos e em testes de toxicidade oferece uma solução parcial para esse problema. No entanto, a natureza imatura dos hiPS-CMs e a falta de complexidade multicelular do tecido cardíaco são limitações importantes desse método. Estudos recentes demonstraram que essa limitação pode ser parcialmente superada utilizando hiPS-CMs em estágio inicial para formar hidrogéis de tecido cardíaco logo após o início das contrações espontâneas e aumentando gradualmente a estimulação elétrica ao longo do tempo. Contudo, esses microtecidos de hiPS-CMs não possuem as propriedades eletrofisiológicas e contráteis maduras do miocárdio adulto. Além disso, o tecido cardíaco humano possui uma estrutura mais complexa, consistindo em uma mistura heterogênea de diferentes tipos celulares, incluindo células endoteliais, neurônios e fibroblastos estromais, interconectados por conjuntos específicos de proteínas da matriz extracelular. Essa heterogeneidade das populações de células não cardiomiócitas^11,12,13 no coração de mamíferos adultos representa uma grande barreira para a modelagem do tecido cardíaco utilizando tipos celulares individuais. Essas limitações importantes ressaltam a relevância do desenvolvimento de métodos para o cultivo de tecido miocárdico intacto em condições fisiológicas e patológicas.
Secções finas (300 µm) de coração humano cultivadas têm se mostrado um modelo promissor de miocárdio humano intacto. Esse método permite o acesso a um sistema multicelular 3D completo, semelhante ao tecido cardíaco humano. No entanto, até 2019, o uso de secções cardíacas cultivadas era limitado pela curta sobrevida da cultura (24 h). Isso se deve a diversos fatores, incluindo a falta de estiramento físico-mecânico, a interface ar-líquido e o uso de meios de cultura simples que não atendem às necessidades do tecido cardíaco. Em 2019, vários grupos de pesquisa demonstraram que a incorporação de fatores mecânicos em sistemas de cultura de tecido cardíaco pode prolongar a vida útil da cultura, melhorar a expressão cardíaca e mimetizar a patologia cardíaca. Dois estudos elegantes¹⁷ e¹⁸ mostram que o carregamento mecânico uniaxial tem um efeito positivo no fenótipo cardíaco durante a cultura. Contudo, esses estudos não utilizaram o carregamento físico-mecânico tridimensional dinâmico do ciclo cardíaco, uma vez que as secções cardíacas foram submetidas a forças de tração isométricas¹⁷ ou carregamento auxotônico linear¹⁸. Esses métodos de estiramento tecidual resultaram na supressão de muitos genes cardíacos ou na superexpressão de genes associados a respostas anormais ao estiramento. Notavelmente, Pitoulis et al.¹⁹ desenvolveram um banho de cultura dinâmico para fatias de tecido cardíaco para reconstrução do ciclo cardíaco usando feedback de transdutor de força e acionamentos de tensão. Embora esse sistema permita uma modelagem in vitro mais precisa do ciclo cardíaco, a complexidade e a baixa produtividade do método limitam sua aplicação. Nosso laboratório desenvolveu recentemente um sistema de cultura simplificado usando estimulação elétrica e um meio otimizado para manter a viabilidade de seções de tecido cardíaco suíno e humano por até 6 dias^20,21.
Neste manuscrito, descrevemos um modelo de cultura de tecido cardíaco (CTCM) utilizando secções do coração suíno que incorpora sinais humorais para recapitular a fisiologia cardíaca tridimensional e a distensão fisiopatológica durante o ciclo cardíaco. Este CTCM pode aumentar a precisão da previsão pré-clínica de fármacos a um nível nunca antes alcançado, ao fornecer um sistema cardíaco de baixo custo e de média escala que mimetiza a fisiologia/fisiopatologia do coração de mamíferos para testes pré-clínicos de fármacos.
Os sinais mecânicos hemodinâmicos desempenham um papel crucial na manutenção da função dos cardiomiócitos in vitro 22,23,24. Neste manuscrito, desenvolvemos um CTCM (Figura 1a) capaz de mimetizar o ambiente cardíaco adulto, induzindo estimulação elétrica e mecânica em frequências fisiológicas (1,2 Hz, 72 batimentos por minuto). Para evitar o estiramento excessivo do tecido durante a diástole, um dispositivo de impressão 3D foi utilizado para aumentar o tamanho do tecido em 25% (Figura 1b). O estímulo elétrico induzido pelo sistema C-PACE foi programado para iniciar 100 ms antes da sístole, utilizando um sistema de aquisição de dados para reproduzir completamente o ciclo cardíaco. O sistema de cultura de tecidos utiliza um atuador pneumático programável (LB Engineering, Alemanha) para expandir ciclicamente uma membrana flexível de silicone, causando a expansão das fatias de tecido cardíaco na câmara superior. O sistema foi conectado a uma linha de ar externa através de um transdutor de pressão, o que possibilitou o ajuste preciso da pressão (± 1 mmHg) e do tempo (± 1 ms) (Figura 1c).
a) Fixe a secção de tecido ao anel de suporte de 7 mm, mostrado em azul, dentro da câmara de cultura do dispositivo. A câmara de cultura é separada da câmara de ar por uma fina membrana flexível de silicone. Coloque uma junta entre cada câmara para evitar vazamentos. A tampa do dispositivo contém eletrodos de grafite que fornecem estimulação elétrica. b) Representação esquemática do dispositivo de tecido grande, anel guia e anel de suporte. As secções de tecido (marrom) são colocadas no dispositivo de tamanho maior com o anel guia posicionado na ranhura na borda externa do dispositivo. Usando o guia, coloque cuidadosamente o anel de suporte revestido com adesivo acrílico para tecido sobre a secção de tecido cardíaco. c) Gráfico mostrando o tempo de estimulação elétrica em função da pressão da câmara de ar controlada por um atuador pneumático programável (PPD). Um dispositivo de aquisição de dados foi usado para sincronizar a estimulação elétrica usando sensores de pressão. Quando a pressão na câmara de cultura atinge o limite definido, um sinal de pulso é enviado ao C-PACE-EM para acionar a estimulação elétrica. d) Imagem de quatro CTCMs colocados em uma prateleira de incubadora. Quatro dispositivos são conectados a um PPD por meio de um circuito pneumático, e sensores de pressão são inseridos na válvula hemostática para monitorar a pressão no circuito pneumático. Cada dispositivo contém seis seções de tecido.
Utilizando um único atuador pneumático, conseguimos controlar 4 dispositivos CTCM, cada um com capacidade para 6 cortes de tecido (Fig. 1d). No CTCM, a pressão do ar na câmara de ar é convertida em pressão síncrona na câmara de fluido, induzindo a expansão fisiológica da fatia cardíaca (Figura 2a e Vídeo Suplementar 1). A avaliação do estiramento do tecido a 80 mmHg mostrou um estiramento de 25% nos cortes de tecido (Fig. 2b). Essa porcentagem de estiramento corresponde a um comprimento fisiológico do sarcômero de 2,2–2,3 µm para a contratilidade normal de um corte cardíaco^17,19,25. O movimento do tecido foi avaliado utilizando configurações de câmera personalizadas (Figura Suplementar 1). A amplitude e a velocidade do movimento do tecido (Fig. 2c, d) corresponderam ao estiramento durante o ciclo cardíaco e ao tempo durante a sístole e a diástole (Fig. 2b). O estiramento e a velocidade do tecido cardíaco durante a contração e o relaxamento permaneceram constantes por 12 dias em cultura (Fig. 2f). Para avaliar o efeito da estimulação elétrica na contratilidade durante o cultivo, desenvolvemos um método para determinar a deformidade ativa usando um algoritmo de sombreamento (Figura Suplementar 2a,b) e conseguimos distinguir entre deformidades com e sem estimulação elétrica. A mesma secção do coração (Figura 2f). Na região móvel do corte (R6-9), a voltagem durante a estimulação elétrica foi 20% maior do que na ausência de estimulação elétrica, o que indica a contribuição da estimulação elétrica para a função contrátil.
a) Traçados representativos da pressão na câmara de ar, da pressão na câmara de fluido e das medições do movimento do tecido confirmam que a pressão na câmara altera a pressão na câmara de fluido, causando um movimento correspondente na fatia de tecido. b) Traçados representativos da porcentagem de alongamento (azul) das seções de tecido correspondentes à porcentagem de alongamento (laranja). c) O movimento medido da fatia cardíaca é consistente com a velocidade de movimento medida. (d) Trajetórias representativas do movimento cíclico (linha azul) e da velocidade (linha pontilhada laranja) em uma fatia do coração. e) Quantificação do tempo de ciclo (n = 19 fatias por grupo, de diferentes porcos), tempo de contração (n = 19 fatias por grupo), tempo de relaxamento (n = 19 fatias por grupo, de diferentes porcos), movimento do tecido (n = 25 fatias/grupo de diferentes porcos), velocidade sistólica máxima (n = 24 (D0), 25 (D12) fatias/grupo de diferentes porcos) e taxa de relaxamento máxima (n = 24 (D0), 25 (D12) fatias/grupo de diferentes porcos). O teste t de Student bicaudal não mostrou diferença significativa em nenhum parâmetro. f Traçados representativos da análise de deformação de seções de tecido com (vermelho) e sem (azul) estimulação elétrica, em dez áreas regionais de seções de tecido da mesma seção. Os painéis inferiores mostram a quantificação da diferença percentual na deformação em seções de tecido com e sem estimulação elétrica em dez áreas de seções diferentes. (n = 8 fatias/grupo de diferentes porcos, teste t de Student bicaudal realizado; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 fatias/grupo de diferentes porcos, teste t de Student bicaudal realizado; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 seções/grupo de diferentes porcos, teste t de Student bicaudal; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 seções/grupo, de porcos diferentes, teste t de Student bicaudal; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).As barras de erro representam a média ± desvio padrão.
Em nosso sistema anterior de cultura estática biomimética de fatias de coração [20, 21], mantivemos a viabilidade, a função e a integridade estrutural das fatias de coração por 6 dias aplicando estimulação elétrica e otimizando a composição do meio. No entanto, após 10 dias, esses valores caíram drasticamente. Referiremos às seções cultivadas em nosso sistema anterior de cultura estática biomimética [20, 21] como condições de controle (Ctrl) e utilizaremos nosso meio previamente otimizado como condições de cultura sob estimulação mecânica e elétrica simultânea (CTCM). Primeiramente, determinamos que a estimulação mecânica sem estimulação elétrica era insuficiente para manter a viabilidade do tecido por 6 dias (Figura Suplementar 3a,b). Curiosamente, com a introdução da estimulação físico-mecânica e elétrica utilizando STCM, a viabilidade das seções de coração de 12 dias permaneceu a mesma que a das seções de coração fresco sob condições de MS, mas não sob condições de Ctrl, conforme mostrado pela análise MTT (Figura 1a). Isso sugere que a estimulação mecânica e a simulação do ciclo cardíaco podem manter as seções de tecido viáveis ​​por duas vezes mais tempo do que o relatado em nosso sistema de cultura estática anterior. No entanto, a avaliação da integridade estrutural das seções de tecido por imunomarcação de troponina T cardíaca e conexina 43 mostrou que a expressão de conexina 43 foi significativamente maior nos tecidos MC no dia 12 do que nos controles no mesmo dia. Contudo, a expressão uniforme de conexina 43 e a formação do disco Z não foram totalmente mantidas (Fig. 3b). Utilizamos uma estrutura de inteligência artificial (IA) para quantificar a integridade estrutural do tecido26, um pipeline de aprendizado profundo baseado em imagens, utilizando a coloração de troponina-T e conexina43, para quantificar automaticamente a integridade estrutural e a fluorescência de fatias cardíacas em termos de intensidade de localização. Este método utiliza uma Rede Neural Convolucional (CNN) e uma estrutura de aprendizado profundo para quantificar de forma confiável a integridade estrutural do tecido cardíaco de maneira automatizada e imparcial, conforme descrito na referência 26. O tecido MC apresentou maior similaridade estrutural com o dia 0 em comparação com as seções de controle estáticas. Além disso, a coloração tricrômica de Masson revelou uma porcentagem significativamente menor de fibrose em condições de MS em comparação com as condições de controle no 12º dia de cultura (Fig. 3c). Embora o CTCM tenha aumentado a viabilidade das seções de tecido cardíaco no 12º dia para um nível semelhante ao do tecido cardíaco fresco, não melhorou significativamente a integridade estrutural das seções cardíacas.
Um gráfico de barras mostra a quantificação da viabilidade MTT de fatias de coração frescas (D0) ou de fatias de coração cultivadas por 12 dias, seja em cultura estática (D12 Ctrl) ou em CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) fatias/grupo de diferentes porcos; foi realizado um teste ANOVA de uma via; ####p < 0,0001 em comparação com D0 e **p < 0,01 em comparação com D12 Ctrl). Um gráfico de barras mostra a quantificação da viabilidade MTT de fatias de coração frescas (D0) ou de fatias de coração cultivadas por 12 dias, seja em cultura estática (D12 Ctrl) ou em CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) fatias/grupo de diferentes porcos; foi realizado um teste ANOVA de uma via; ####p < 0,0001 em comparação com D0 e **p < 0,01 em comparação com D12 Ctrl).O histograma mostra a quantificação da viabilidade de seções cardíacas frescas MTT (D0) ou cultura de seções cardíacas por 12 dias em cultura estática (controle D12) ou CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (controle D12). ) ), 12 (D12 MC) seções/grupo de diferentes porcos, um teste ANOVA de uma via é realizado;####p < 0,0001 para сравнению com D0 e **p < 0,01 para сравнению com D12 Ctrl). ####p < 0,0001 em comparação com D0 e **p < 0,01 em comparação com D12 (Controle). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化),来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组,进行单向ANOVA 测试;与D0相比,####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC).Histograma mostrando a quantificação da viabilidade do MTT em seções de coração fresco (D0) ou seções de coração cultivadas por 12 dias em cultura estática (controle D12) ou CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (controle D12)), 12 seções/grupo (D12 MC) de diferentes porcos, teste ANOVA de uma via;####p < 0,0001 para сравнению com D0, **p < 0,01 para сравнению com D12 Ctrl). ####p < 0,0001 em comparação com D0, **p < 0,01 em comparação com D12 (Controle).b Troponina-T (verde), conexina 43 (vermelho) e DAPI (azul) em secções cardíacas recém-isoladas (D0) ou secções cardíacas cultivadas em condições estáticas (Ctrl) ou em condições CTCM (MC) durante 12 dias) de imagens de imunofluorescência representativas (escala em branco = 100 µm). Quantificação por inteligência artificial da integridade estrutural do tecido cardíaco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fatias/grupo de cada porco diferente, teste ANOVA de uma via realizado; ####p < 0,0001 comparado a D0 e ****p < 0,0001 comparado a D12 Ctrl). Quantificação por inteligência artificial da integridade estrutural do tecido cardíaco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fatias/grupo de cada um dos diferentes porcos, teste ANOVA de uma via realizado; ####p < 0,0001 comparado a D0 e ****p < 0,0001 comparado a D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственной интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 para configuração com D0 e ****p < 0,0001 para configuração com D12 Ctrl). Quantificação da integridade estrutural do tecido cardíaco por inteligência artificial (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seções/grupos de diferentes porcos, teste ANOVA de uma via realizado; ####p < 0,0001 vs. com D0 e ****p < 0,0001 comparado a D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fatias/grupo de porcos diferentes, teste ANOVA unidirecional;####p < 0,0001 与D0相比,****p < 0.0001 em D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fatias/grupo de porcos diferentes, teste ANOVA unidirecional;####p < 0,0001与D0相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Inteligência artificial para quantificar a integridade estrutural do tecido cardíaco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seções/grupo de cada um dos diferentes porcos, teste ANOVA de uma via; ####p<0,0001 vs. D0. Para comparação, ****p < 0,0001 em comparação com D12 Ctrl). c Imagens representativas (esquerda) e quantificação (direita) de fatias de coração coradas com tricrômico de Masson (Escala sem coloração = 500 µm) (n = 10 fatias/grupo de cada porco diferente, teste ANOVA de uma via realizado; ####p < 0,0001 comparado a D0 e ***p < 0,001 comparado a D12 Ctrl). c Imagens representativas (esquerda) e quantificação (direita) de fatias de coração coradas com tricrômico de Masson (Escala sem coloração = 500 µm) (n = 10 fatias/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA de uma via realizado; #### p < 0,0001 comparado a D0 e ***p < 0,001 comparado a D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) e количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 por сравнению com D0 e ***p < 0,001 por сравнению com D12 Ctrl). c Imagens representativas (esquerda) e quantificação (direita) de cortes cardíacos corados com tricrômico de Masson (escala sem revestimento = 500 µm) (n = 10 cortes/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA de uma via realizado; #### p < 0,0001 comparado a D0 e ***p < 0,001 comparado a D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 µm）（n = 10个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl相比）。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 , 进行 单向 单向 Anova 测试;#### p < 0,0001与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Análise de representação (слева) e количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного análise de dispersão ;### #p < 0,0001 por сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Imagens representativas (esquerda) e quantificação (direita) de cortes cardíacos corados com tricrômico de Masson (branco = 500 µm) (n = 10 cortes/grupo, cada um de um porco diferente, testados por análise de variância unidirecional; ### # p < 0,0001 comparado a D0, ***p < 0,001 comparado a D12 Ctrl).As barras de erro representam a média ± desvio padrão.
Nossa hipótese era de que, com a adição de pequenas moléculas ao meio de cultura, a integridade dos cardiomiócitos poderia ser melhorada e o desenvolvimento de fibrose reduzido durante o cultivo de CTCM. Portanto, devido ao pequeno número de fatores de confusão, realizamos uma triagem de pequenas moléculas utilizando nossas culturas de controle estáticas. Dexametasona (Dex), triiodotironina (T3) e SB431542 (SB) foram escolhidas para essa triagem. Essas pequenas moléculas já foram utilizadas em culturas de hiPSC-CM para induzir a maturação de cardiomiócitos, aumentando o comprimento do sarcômero, os túbulos T e a velocidade de condução. Além disso, tanto a Dex (um glicocorticoide) quanto o SB são conhecidos por suprimir a inflamação. Assim, testamos se a inclusão de uma ou de uma combinação dessas pequenas moléculas melhoraria a integridade estrutural de seções cardíacas. Para a triagem inicial, a dose de cada composto foi selecionada com base nas concentrações comumente utilizadas em modelos de cultura celular (1 μM de Dex27, 100 nM de T327 e 2,5 μM de SB31). Após 12 dias de cultura, a combinação de T3 e Dex resultou em integridade estrutural ideal dos cardiomiócitos e remodelamento fibroso mínimo (Figuras Suplementares 4 e 5). Além disso, o uso de concentrações duas vezes maiores ou o dobro dessas concentrações de T3 e Dex produziu efeitos deletérios em comparação com as concentrações normais (Figuras Suplementares 6a e 6b).
Após a triagem inicial, realizamos uma comparação direta de 4 condições de cultura (Figura 4a): Ctrl: seções cardíacas cultivadas em nossa cultura estática previamente descrita, utilizando nosso meio otimizado; TD: T3 e Ctrl com adição de Dex na quarta-feira; MC: seções cardíacas cultivadas em CTCM utilizando nosso meio previamente otimizado; e MT: CTCM com adição de T3 e Dex ao meio. Após 12 dias de cultivo, a viabilidade dos tecidos MS e MT permaneceu a mesma que a dos tecidos frescos, avaliada pelo ensaio MTT (Figura 4b). Curiosamente, a adição de T3 e Dex às culturas em transwell (TD) não resultou em uma melhora significativa na viabilidade em comparação com as condições Ctrl, indicando um papel importante da estimulação mecânica na manutenção da viabilidade das seções cardíacas.
Diagrama do projeto experimental representando as quatro condições de cultura utilizadas para avaliar os efeitos da estimulação mecânica e da suplementação com T3/Dex no meio de cultura durante 12 dias. O gráfico de barras b mostra a quantificação da viabilidade 12 dias após o cultivo em todas as 4 condições de cultivo (Ctrl, TD, MC e MT) em comparação com fatias de coração fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC) fatias/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA de uma via realizado; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 em comparação com D0 e **p < 0,01 em comparação com D12 Ctrl). b O gráfico de barras mostra a quantificação da viabilidade 12 dias após o cultivo em todas as 4 condições de cultivo (Ctrl, TD, MC e MT) em comparação com fatias de coração fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC) fatias/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA de uma via realizado; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 em comparação com D0 e **p < 0,01 em comparação com D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во 4 условиях cultura (контроль, TD, MC e MT) para a construção de uma série de serviços (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний teste ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 para сравнению с D0 e **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b O gráfico de barras mostra a quantificação da viabilidade 12 dias após o cultivo em todas as 4 condições de cultivo (controle, TD, MC e MT) em comparação com seções de coração fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC) seções/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA de uma via; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 vs. D0 e **p < 0,01 em comparação com D12 Ctrl). b. MT); 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC e MT) para сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 para сравнению с D0, **p <0,01 para сравнению с контролем D12). b Histograma mostrando todas as 4 condições de cultura (controle, TD, MC e MT) comparadas a seções de coração fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), de diferentes porcos, 12 (D12 MC) seções/grupo, teste ANOVA de uma via; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. controle D12). O gráfico de barras mostra a quantificação do fluxo de glicose 12 dias após o cultivo em todas as 4 condições de cultivo (Ctrl, TD, MC e MT) em comparação com fatias de coração fresco (D0) (n = 6 fatias/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA de uma via realizado; ###p < 0,001, em comparação com D0 e ***p < 0,001 em comparação com D12 Ctrl). O gráfico de barras mostra a quantificação do fluxo de glicose 12 dias após o cultivo em todas as 4 condições de cultivo (Ctrl, TD, MC e MT) em comparação com fatias de coração fresco (D0) (n = 6 fatias/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA de uma via realizado; ###p < 0,001, em comparação com D0 e ***p < 0,001 em comparação com D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 cultura (контроль, TD, MC e MT) por meio de uma série de séries (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 e ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). O histograma mostra a quantificação do fluxo de glicose 12 dias após o cultivo em todas as 4 condições de cultivo (controle, TD, MC e MT) em comparação com seções de coração fresco (D0) (n = 6 seções/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA de uma via realizado; ###p < 0,001 em comparação com D0 e ***p < 0,001 em comparação com D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件(Ctrl、TD、MC 和MT)与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001与D12 Ctrl 相比）。 C:后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для 4º mês cultura (контроль, TD, MC e MT) para construir uma série de séries (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были testes ANOVA; ###p < 0,001 para сравнению с D0, ***p < 0,001 para сравнению с D12 (контроль). c Histograma mostrando a quantificação do fluxo de glicose 12 dias após o cultivo para todas as 4 condições de cultivo (controle, TD, MC e MT) em comparação com seções de coração fresco (D0) (n = 6 seções/grupo, de diferentes porcos, unilateral). Foram realizados testes ANOVA, ###p < 0,001 em comparação com D0, ***p < 0,001 em comparação com D12 (controle).d Gráficos de análise de deformação de tecidos frescos (azul), MC no dia 12 (verde) e MT no dia 12 (vermelho) em dez pontos regionais de secção tecidual (n = 4 fatias/grupo, teste ANOVA de uma via; não houve diferença significativa entre os grupos). e Gráfico de vulcão mostrando genes diferencialmente expressos em secções cardíacas frescas (D0) em comparação com secções cardíacas cultivadas em condições estáticas (Ctrl) ou em condições de MT (MT) durante 10-12 dias. f Mapa de calor dos genes do sarcômero para secções cardíacas cultivadas em cada uma das condições de cultura. As barras de erro representam a média ± desvio padrão.
A dependência metabólica da transição da oxidação de ácidos graxos para a glicólise é uma característica marcante da desdiferenciação de cardiomiócitos. Cardiomiócitos imaturos utilizam principalmente glicose para a produção de ATP e possuem mitocôndrias hipoplásicas com poucas cristas5,32. Análises de utilização de glicose mostraram que, sob as condições MC e MT, a utilização de glicose foi semelhante à observada em tecidos do dia 0 (Figura 4c). No entanto, as amostras Ctrl apresentaram um aumento significativo na utilização de glicose em comparação com o tecido fresco. Isso indica que a combinação de CTCM e T3/Dex aumenta a viabilidade do tecido e preserva o fenótipo metabólico de seções cardíacas cultivadas por 12 dias. Além disso, a análise de deformação mostrou que os níveis de deformação permaneceram os mesmos que no tecido cardíaco fresco por 12 dias sob as condições MT e MS (Figura 4d).
Para analisar o impacto geral do CTCM e do T3/Dex no panorama transcricional global do tecido cardíaco fatiado, realizamos RNAseq em fatias cardíacas de todas as quatro condições de cultura diferentes (Dados Suplementares 1). Curiosamente, as seções MT mostraram alta similaridade transcricional com o tecido cardíaco fresco, com apenas 16 genes diferencialmente expressos entre 13.642 genes. No entanto, como mostramos anteriormente, as fatias Ctrl exibiram 1229 genes diferencialmente expressos após 10 a 12 dias em cultura (Fig. 4e). Esses dados foram confirmados por qRT-PCR de genes cardíacos e de fibroblastos (Fig. Suplementar 7a-c). Curiosamente, as seções Ctrl mostraram regulação negativa de genes cardíacos e do ciclo celular e ativação de programas gênicos inflamatórios. Esses dados sugerem que a desdiferenciação, que normalmente ocorre após cultivo prolongado, é completamente atenuada sob condições MT (Fig. Suplementar 8a,b). Um estudo cuidadoso dos genes do sarcômero mostrou que somente em condições de MT os genes que codificam o sarcômero (Fig. 4f) e o canal iônico (Fig. suplementar 9) são preservados, protegendo-os da supressão em condições de Ctrl, TD e MC. Esses dados demonstram que, com uma combinação de estimulação mecânica e humoral (T3/Dex), o transcriptoma de fatias de coração pode permanecer semelhante ao de fatias de coração frescas após 12 dias em cultura.
Esses achados transcricionais são corroborados pelo fato de que a integridade estrutural dos cardiomiócitos em cortes cardíacos é melhor preservada sob condições de estimulação mecânica por 12 dias, conforme demonstrado pela presença de conexina 43 intacta e localizada (Fig. 5a). Além disso, a fibrose em cortes cardíacos sob condições de estimulação mecânica foi significativamente reduzida em comparação com o grupo controle (Ctrl) e semelhante à observada em cortes cardíacos frescos (Fig. 5b). Esses dados demonstram que a combinação de estimulação mecânica e tratamento com T3/Dex preserva efetivamente a estrutura cardíaca em cortes de coração em cultura.
a) Imagens representativas de imunofluorescência de troponina-T (verde), conexina 43 (vermelho) e DAPI (azul) em cortes cardíacos recém-isolados (D0) ou cultivados por 12 dias em todas as quatro condições de cultura de cortes cardíacos (barra de escala = 100 µm). Quantificação por inteligência artificial da integridade estrutural do tecido cardíaco (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) fatias/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA de uma via realizado; ####p < 0,0001 comparado a D0 e *p < 0,05, ou ****p < 0,0001 comparado a D12 Ctrl). Quantificação por inteligência artificial da integridade estrutural do tecido cardíaco (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) fatias/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA de uma via realizado; #### p < 0,0001 comparado a D0 e *p < 0,05, ou ****p < 0,0001 comparado a D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) срезов/группу na verdade, teste ANOVA comprovado; #### p < 0,0001 para сравнению com D0 e *p < 0,05 ou ****p < 0,0001 para сравнению com D12 Ctrl). Quantificação da integridade estrutural do tecido cardíaco utilizando inteligência artificial (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) seções/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA de uma via realizado; #### p < 0,0001 comparado a D0 e *p < 0,05 ou ****p < 0,0001 comparado a D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0,0001 para D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 e d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组） ########### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0,0001 por D12 Ctrl 相比）。Quantificação da integridade estrutural do tecido cardíaco usando inteligência artificial em diferentes porcos (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) seções/grupo) com um teste ANOVA de uma via;#### p < 0,0001 para сравнению com D0 e *p < 0,05 ou ****p < 0,0001 para сравнению com D12 Ctrl). #### p < 0,0001 em comparação com D0 e *p < 0,05 ou ****p < 0,0001 em comparação com D12 Ctrl). b Imagens representativas e quantificação de fatias de coração coradas com tricrômico de Masson (Barra de escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) fatias/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA de uma via realizado; ####p < 0,0001 comparado a D0 e ***p < 0,001, ou ****p < 0,0001 comparado a D12 Ctrl). b Imagens representativas e quantificação de fatias de coração coradas com tricrômico de Masson (Barra de escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) fatias/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA de uma via realizado; ####p < 0,0001 comparado a D0 e ***p < 0,001, ou ****p < 0,0001 comparado a D12 Ctrl). b Representar a distribuição e a coleta de dados de maneira correta, okraшенных трихромным красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 por сравнению com D0 e ***p < 0,001 ou ****p < 0,0001 por сравнению com D12 Ctrl). b Imagens representativas e quantificação de cortes cardíacos corados com tricrômico de Masson (barra de escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) cortes/grupo de diferentes porcos, ANOVA de uma via realizada; ####p < 0,0001 vs. D0 e ***p < 0,001 ou ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 para D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl, d12 td e d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt foto 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная linha = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 para resolução com D0, ***p < 0,001 ou ****p < 0,0001 para resolução com D12 Ctrl). b Imagens representativas e quantificação de cortes cardíacos corados com tricrômico de Masson (barra de escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) cortes de diferentes porcos/grupo, um método ANOVA; ####p < 0,0001 comparado a D0, ***p < 0,001 ou ****p < 0,0001 comparado a D12 Ctrl).As barras de erro representam a média ± desvio padrão.
Por fim, a capacidade do CTCM de mimetizar a hipertrofia cardíaca foi avaliada pelo aumento do estiramento do tecido cardíaco. No CTCM, a pressão máxima na câmara de ar aumentou de 80 mmHg para 80 mmHg Art. (estiramento normal) até 140 mmHg Art. (Fig. 6a). Isso corresponde a um aumento de 32% no estiramento (Fig. 6b), que foi previamente demonstrado como a porcentagem de estiramento necessária para que as seções cardíacas atingissem um comprimento de sarcômero semelhante ao observado na hipertrofia. O estiramento e a velocidade do tecido cardíaco durante a contração e o relaxamento permaneceram constantes durante seis dias de cultura (Fig. 6c). O tecido cardíaco em condições MT foi submetido a estiramento normal (MT (Normal)) ou a condições de sobreestiramento (MT (OS)) por seis dias. Já após quatro dias em cultura, o biomarcador hipertrófico NT-ProBNP estava significativamente elevado no meio sob condições MT (OS) em comparação com as condições MT (normal) (Fig. 7a). Além disso, após seis dias de cultivo, o tamanho celular em MT (OS) (Fig. 7b) aumentou significativamente em comparação com seções de coração MT (normal). Adicionalmente, a translocação nuclear de NFATC4 aumentou significativamente em tecidos sobredistendidos (Fig. 7c). Esses resultados demonstram o desenvolvimento progressivo da remodelação patológica após hiperdistensão e corroboram a ideia de que o dispositivo CTCM pode ser utilizado como plataforma para o estudo da sinalização da hipertrofia cardíaca induzida por estiramento.
Traçados representativos da pressão na câmara de ar, da pressão na câmara de fluido e das medições do movimento do tecido confirmam que a pressão na câmara altera a pressão na câmara de fluido, causando um movimento correspondente na fatia de tecido. b Curvas representativas de porcentagem de alongamento e taxa de alongamento para seções de tecido normalmente alongadas (laranja) e sobrealongadas (azul). c Gráfico de barras mostrando o tempo de ciclo (n = 19 fatias por grupo, de diferentes porcos), o tempo de contração (n = 18-19 fatias por grupo, de diferentes porcos), o tempo de relaxamento (n = 19 fatias por grupo, de diferentes porcos), a amplitude do movimento do tecido (n = 14 fatias/grupo, de diferentes porcos), a velocidade sistólica máxima (n = 14 fatias/grupo, de diferentes porcos) e a taxa de relaxamento máxima (n = 14 (D0), 15 (D6) fatias/grupo) de diferentes porcos). O teste t de Student bicaudal não mostrou diferença significativa em nenhum parâmetro, indicando que esses parâmetros permaneceram constantes durante 6 dias de cultura com sobretensão. As barras de erro representam a média ± desvio padrão.
Gráfico de barras quantificando a concentração de NT-ProBNP em meio de cultura de fatias cardíacas cultivadas sob condições de estiramento normal (Norm) ou sobreestiramento (OS) do músculo tibial medial (MT) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm e D4 MTOS) fatias/grupo de diferentes porcos; ANOVA de duas vias foi realizada; **p < 0,01 em comparação com o estiramento normal). Gráfico de barras quantificando a concentração de NT-ProBNP em meio de cultura de fatias cardíacas cultivadas sob condições de estiramento normal (Norm) ou sobreestiramento (OS) do músculo tibial medial (MT) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm e D4 MTOS) fatias/grupo de diferentes porcos, ANOVA de duas vias realizada; **p < 0,01 em comparação com o estiramento normal).Histograma quantitativo da concentração de NT-ProBNP no meio de cultura de fatias de coração cultivadas sob condições de estiramento normal do MT (norm) ou sobreestiramento (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm e D4 MTOS) fatias/grupo de diferentes porcos, análise de variância de dois fatores é realizada;**p < 0,01 em condições normais de uso). **p < 0,01 em comparação com o alongamento normal). a 在MT 正常拉伸(Norma) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析;**与正常拉伸相比，p < 0,01). a Quantificação da concentração de NT-ProBNP em fatias de coração cultivadas sob condições de estiramento normal MT (Norm) ou estiramento excessivo (OS) (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) de diferentes猪的切片/组，可以双向方方发发动; **comparado com alongamento normal, p < 0,01).Quantificação do histograma das concentrações de NT-ProBNP em fatias de coração cultivadas sob condições de estiramento normal do MT (norm) ou sobreestiramento (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) e D4 MTOS) fatias/grupo de diferentes porcos, análise de variância de duas vias;**p < 0,01 em condições normais de uso). **p < 0,01 em comparação com o alongamento normal). b Imagens representativas de cortes cardíacos corados com troponina-T e WGA (esquerda) e quantificação do tamanho celular (direita) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) células/grupo de 10 cortes diferentes de porcos diferentes, teste t de Student bicaudal realizado; ****p < 0,0001 em comparação com o estiramento normal). b Imagens representativas de cortes cardíacos corados com troponina-T e WGA (esquerda) e quantificação do tamanho celular (direita) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) células/grupo de 10 cortes diferentes de porcos diferentes, teste t de Student bicaudal realizado; ****p < 0,0001 em comparação com o estiramento normal). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т e АЗП (слева) и количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 por normalmente). b Imagens representativas de cortes cardíacos corados com troponina-T e AZP (esquerda) e quantificação do tamanho celular (direita) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) células/grupo de 10 cortes diferentes de porcos diferentes, foi realizado o teste t de Student bicaudal; ****p < 0,0001 em comparação com a linhagem normal). b. MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验;与正常拉伸相比，****p < 0,0001）。 b Imagens representativas de fatias de coração coradas com calcareína-T e WGA (esquerda) e tamanho celular (direita) (n = 330 (D6 MTOS), 369 de 10 fatias diferentes (D6 MTNorm)). Células/grupo, teste t de Student para ambos os métodos; comparado com alongamento normal, ****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т e АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) de 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 para uma vida normal растяжением). b Imagens representativas de cortes cardíacos corados com troponina-T e AZP (esquerda) e quantificação do tamanho celular (direita) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) de 10 cortes diferentes de porcos diferentes). Células/grupo, teste t de Student bicaudal; ****p < 0,0001 em comparação com a linhagem normal). c Imagens representativas de fatias de coração MTOS nos dias 0 e 6, imunomarcadas para troponina-T e NFATC4, e quantificação da translocação de NFATC4 para os núcleos dos cardiomiócitos (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fatias/grupo de diferentes porcos; teste t de Student bicaudal realizado; *p < 0,05). c Imagens representativas de fatias de coração MTOS do dia 0 e do dia 6 imunomarcadas para troponina-T e NFATC4 e quantificação da translocação de NFATC4 para os núcleos dos CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fatias/grupo de diferentes porcos, teste t de Student bicaudal realizado; *p < 0,05). c Репрезентативные изображения para срезов сердца 0 e 6 de janeiro MTOS, иммуномеченых para тропонина-Т e NFATC4, и количественная оценка транслокации NFATC4 em um conjunto de células (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Imagens representativas de cortes cardíacos em 0 e 6 dias MTOS, imunomarcados para troponina-T e NFATC4, e quantificação da translocação de NFATC4 no núcleo das células cavernosas (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fatias/grupo de diferentes porcos) realizada com teste t de Student bicaudal; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像, 以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS)切片/组, 进行双尾学生t 检验;*p < 0,05)。 c Imagens representativas da imunomarcação de calcanina-T e NFATC4 第0天和第6天MTOS fatias de coração e NFATC4 de diferentes núcleos de células NFATC4 易位至CM的quantidade化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组,时间双尾学生et 电影;*p < 0,05). c Representação de uma série de MTOS em 0 e 6 dias para imunomarcas тропонином-Т e NFATC4 e количественная оценка транслокации NFATC4 em ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Imagens representativas de cortes cardíacos de MTOS nos dias 0 e 6 para imunomarcação de troponina-T e NFATC4 e quantificação da translocação de NFATC4 no núcleo de cardiomiócitos de diferentes porcos (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) cortes/grupo, teste t de Student bicaudal; *p < 0,05).As barras de erro representam a média ± desvio padrão.
A pesquisa translacional cardiovascular requer modelos celulares que reproduzam com precisão o ambiente cardíaco. Neste estudo, um dispositivo CTCM foi desenvolvido e caracterizado, capaz de estimular cortes ultrafinos do coração. O sistema CTCM inclui estimulação eletromecânica fisiologicamente sincronizada e enriquecimento com T3 e Dex. Quando seções de coração suíno foram expostas a esses fatores, sua viabilidade, integridade estrutural, atividade metabólica e expressão transcricional permaneceram semelhantes às do tecido cardíaco fresco após 12 dias de cultura. Além disso, o estiramento excessivo do tecido cardíaco pode causar hipertrofia cardíaca devido à hiperextensão. Em suma, esses resultados corroboram o papel crucial das condições fisiológicas de cultura na manutenção de um fenótipo cardíaco normal e fornecem uma plataforma para triagem de fármacos.
Diversos fatores contribuem para a criação de um ambiente ideal para o funcionamento e a sobrevivência dos cardiomiócitos. Os mais óbvios desses fatores estão relacionados a (1) interações intercelulares, (2) estimulação eletromecânica, (3) fatores humorais e (4) substratos metabólicos. As interações fisiológicas entre células requerem redes tridimensionais complexas de múltiplos tipos celulares, sustentadas por uma matriz extracelular. Tais interações celulares complexas são difíceis de reconstruir in vitro por meio do cultivo conjunto de tipos celulares individuais, mas podem ser facilmente obtidas utilizando a natureza organotípica de cortes cardíacos.
O estiramento mecânico e a estimulação elétrica dos cardiomiócitos são cruciais para a manutenção do fenótipo cardíaco33,34,35. Embora a estimulação mecânica tenha sido amplamente utilizada para o condicionamento e maturação de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (hiPSC-CMs), diversos estudos elegantes têm tentado recentemente estimular mecanicamente fatias de coração em cultura utilizando carga uniaxial. Esses estudos mostram que a carga mecânica uniaxial bidimensional tem um efeito positivo no fenótipo do coração durante o cultivo. Nesses estudos, seções do coração foram submetidas a forças de tração isométrica17, carga auxotônica linear18 ou o ciclo cardíaco foi recriado utilizando feedback de transdutor de força e estímulos de tensão. No entanto, esses métodos utilizam estiramento uniaxial do tecido sem otimização ambiental, resultando na supressão de muitos genes cardíacos ou na superexpressão de genes associados a respostas anormais ao estiramento. O CTCM descrito aqui fornece um estímulo eletromecânico tridimensional que mimetiza o ciclo cardíaco natural em termos de duração do ciclo e estiramento fisiológico (25% de estiramento, 40% de sístole, 60% de diástole e 72 batimentos por minuto). Embora essa estimulação mecânica tridimensional por si só não seja suficiente para manter a integridade do tecido, uma combinação de estimulação humoral e mecânica usando T3/Dex é necessária para manter adequadamente a viabilidade, a função e a integridade do tecido.
Fatores humorais desempenham um papel importante na modulação do fenótipo cardíaco adulto. Isso foi evidenciado em estudos com cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (HiPS-CM), nos quais T3 e dexametasona (Dex) foram adicionados ao meio de cultura para acelerar a maturação celular. O T3 pode influenciar o transporte de aminoácidos, açúcares e cálcio através das membranas celulares36. Além disso, o T3 promove a expressão de MHC-α e a regulação negativa de MHC-β, promovendo a formação de miofibrilas de contração rápida em cardiomiócitos maduros, em comparação com miofibrilas de contração lenta em cardiomiócitos fetais. A deficiência de T3 em pacientes hipotireoidianos resulta na perda de bandas miofibrilares e em uma taxa reduzida de desenvolvimento do tônus37. A Dex atua nos receptores de glicocorticoides e demonstrou aumentar a contratilidade miocárdica em corações perfundidos isolados;38 acredita-se que essa melhora esteja relacionada ao efeito na entrada de cálcio mediada por deposição de cálcio (SOCE)39,40. Além disso, a Dex se liga aos seus receptores, causando uma ampla resposta intracelular que suprime a função imunológica e a inflamação30.
Nossos resultados indicam que a estimulação mecânica física (EM) melhorou o desempenho geral da cultura em comparação com o controle (Ctrl), mas não conseguiu manter a viabilidade, a integridade estrutural e a expressão cardíaca ao longo de 12 dias de cultura. Em comparação com o Ctrl, a adição de T3 e Dex às culturas CTCM (MT) melhorou a viabilidade e manteve perfis de transcrição, integridade estrutural e atividade metabólica semelhantes aos do tecido cardíaco fresco por 12 dias. Além disso, controlando o grau de estiramento do tecido, um modelo de hipertrofia cardíaca induzida por hiperextensão foi criado usando STCM, ilustrando a versatilidade do sistema STCM. Deve-se notar que, embora a remodelação cardíaca e a fibrose geralmente envolvam órgãos intactos cujas células circulantes podem fornecer as citocinas apropriadas, bem como fagocitose e outros fatores de remodelação, seções do coração ainda podem mimetizar o processo fibrótico em resposta ao estresse e trauma. Isso já foi avaliado anteriormente neste modelo de fatia cardíaca. Deve-se notar que os parâmetros do CTCM podem ser modulados pela alteração da amplitude e frequência da pressão/elétrica para simular diversas condições, como taquicardia, bradicardia e suporte circulatório mecânico (coração sem carga mecânica). Isso torna o sistema adequado para testes de medicamentos em escala média. A capacidade do CTCM de modelar a hipertrofia cardíaca induzida por esforço excessivo abre caminho para o teste desse sistema em terapias personalizadas. Em conclusão, o presente estudo demonstra que o estiramento mecânico e a estimulação humoral são cruciais para a manutenção da cultura de cortes de tecido cardíaco.
Embora os dados aqui apresentados sugiram que a CTCM seja uma plataforma muito promissora para modelar o miocárdio intacto, esse método de cultura apresenta algumas limitações. A principal limitação da cultura CTCM é a imposição de tensões mecânicas dinâmicas contínuas nas fatias, o que impede o monitoramento ativo das contrações das fatias cardíacas durante cada ciclo. Além disso, devido ao pequeno tamanho das seções cardíacas (7 mm), a capacidade de avaliar a função sistólica fora dos sistemas de cultura usando sensores de força tradicionais é limitada. No presente manuscrito, superamos parcialmente essa limitação avaliando a voltagem óptica como um indicador da função contrátil. No entanto, essa limitação exigirá mais estudos e poderá ser abordada no futuro com a introdução de métodos para monitoramento óptico da função das fatias cardíacas em cultura, como o mapeamento óptico usando corantes sensíveis a cálcio e voltagem. Outra limitação da CTCM é que o modelo de trabalho não manipula o estresse fisiológico (pré-carga e pós-carga). Na CTCM, a pressão foi induzida em direções opostas para reproduzir 25% do estiramento fisiológico na diástole (estiramento total) e na sístole (duração da contração durante a estimulação elétrica) em tecidos muito grandes. Essa limitação deve ser eliminada em futuros projetos de CTCM por meio de pressão adequada no tecido cardíaco em ambos os lados e pela aplicação das relações exatas de pressão-volume que ocorrem nas câmaras do coração.
A remodelação induzida por estiramento excessivo relatada neste manuscrito limita-se a mimetizar sinais hipertróficos de hiperestiramento. Assim, este modelo pode auxiliar no estudo da sinalização hipertrófica induzida por estiramento sem a necessidade de fatores humorais ou neurais (que não existem neste sistema). Estudos adicionais são necessários para aumentar a multiplicidade do CTCM, por exemplo, o cocultivo com células imunes, fatores humorais circulantes no plasma e inervação durante o cocultivo com células neuronais ampliarão as possibilidades de modelagem de doenças com CTCM.
Treze porcos foram utilizados neste estudo. Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Louisville. O arco aórtico foi pinçado e o coração foi perfundido com 1 L de cardioplegia estéril (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL de heparina, pH até 7,4); Os corações foram preservados em solução cardioplégica gelada até serem transportados para o laboratório em gelo, o que geralmente leva menos de 10 minutos. Os corações foram preservados em solução cardioplégica gelada até serem transportados para o laboratório em gelo, o que geralmente leva menos de 10 minutos. serдца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 min. Os corações foram armazenados em solução cardioplégica gelada até o transporte para o laboratório em gelo, o que geralmente leva menos de 10 minutos.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Verifique a frequência do cardiopulmonar durante o transporte para o laboratório no local, normalmente <10 minutos. Mantenha os corações em cardioplegia com gelo até o transporte para o laboratório, também em gelo, geralmente em menos de 10 minutos.
O dispositivo CTCM foi desenvolvido no software de desenho assistido por computador (CAD) SolidWorks. As câmaras de cultura, divisórias e câmaras de ar são feitas de plástico acrílico transparente usinado em CNC. O anel de suporte de 7 mm de diâmetro é feito de polietileno de alta densidade (PEAD) no centro e possui um sulco para o anel de vedação de silicone usado para selar o meio de cultura abaixo. Uma fina membrana de sílica separa a câmara de cultura da placa de separação. A membrana de silicone é cortada a laser a partir de uma folha de silicone de 0,02″ de espessura e possui dureza 35A. As juntas de silicone superior e inferior são cortadas a laser a partir de uma folha de silicone de 1/16″ de espessura e possuem dureza 50A. Parafusos e porcas borboleta de aço inoxidável 316L são usados ​​para fixar o bloco e criar uma vedação hermética.
Uma placa de circuito impresso (PCI) dedicada foi projetada para ser integrada ao sistema C-PACE-EM. Os conectores tipo "máquina suíça" na PCI são conectados a eletrodos de grafite por fios de cobre banhados a prata e parafusos de bronze 0-60 fixados aos eletrodos. A placa de circuito impresso é colocada na tampa da impressora 3D.
O dispositivo CTCM é controlado por um atuador pneumático programável (PPD) que cria uma pressão circulatória controlada, semelhante a um ciclo cardíaco. À medida que a pressão dentro da câmara de ar aumenta, a membrana flexível de silicone se expande para cima, forçando o meio sob o tecido. A área do tecido é então esticada por essa expulsão de fluido, mimetizando a expansão fisiológica do coração durante a diástole. No pico do relaxamento, a estimulação elétrica é aplicada através de eletrodos de grafite, o que reduz a pressão na câmara de ar e causa a contração das seções de tecido. Dentro do tubo há uma válvula hemostática com um sensor de pressão para detectar a pressão no sistema de ar. A pressão detectada pelo sensor é aplicada a um coletor de dados conectado a um laptop. Isso permite o monitoramento contínuo da pressão dentro da câmara de gás. Quando a pressão máxima na câmara é atingida (padrão de 80 mmHg, 140 mmHg OS), o dispositivo de aquisição de dados envia um sinal para o sistema C-PACE-EM para gerar um sinal de tensão bifásico de 4 V por 2 ms.
Secções cardíacas foram obtidas e as condições de cultura em 6 poços foram realizadas da seguinte forma: Os corações colhidos foram transferidos do recipiente de transferência para uma bandeja contendo cardioplegia fria (4°C). O ventrículo esquerdo foi isolado com uma lâmina estéril e cortado em pedaços de 1-2 cm³. Esses blocos de tecido foram fixados a suportes de tecido com adesivo para tecido e colocados em um banho de tecido de micrótomo vibratório contendo solução de Tyrode e oxigenação contínua (3 g/L de 2,3-butanodiona monooxima (BDM), 140 mM de NaCl (8,18 g), 6 mM de KCl (0,447 g), 10 mM de D-glicose (1,86 g), 10 mM de HEPES (2,38 g), 1 mM de MgCl₂ (1 ml de solução 1 M), 1,8 mM de CaCl₂ (1,8 ml de solução 1 M), até 1 L de ddH₂O). O micrótomo vibratório foi configurado para cortar fatias de 300 µm de espessura a uma frequência de 80 Hz, amplitude de vibração horizontal de 2 mm e velocidade de avanço de 0,03 mm/s. O banho de tecido foi mantido em gelo para resfriar a solução, e a temperatura foi mantida a 4 °C. As seções de tecido foram transferidas do banho do micrótomo para um banho de incubação contendo solução de Tyrode continuamente oxigenada, em gelo, até que se obtivessem seções suficientes para uma placa de cultura. Para as culturas em transwell, as seções de tecido foram fixadas em suportes de poliuretano estéreis de 6 mm de largura e colocadas em 6 ml de meio otimizado (meio 199, suplemento ITS 1x, 10% de FBS, 5 ng/ml de VEGF, 10 ng/ml de FGF-alcalino e 2x antibiótico-antifúngico). A estimulação elétrica (10 V, frequência de 1,2 Hz) foi aplicada às seções de tecido através do C-Pace. Para as condições TD, T3 e Dex frescos foram adicionados a 100 nM e 1 μM, respectivamente, a cada troca de meio. O meio foi saturado com oxigênio antes da troca, realizada 3 vezes ao dia. Os cortes de tecido foram cultivados em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
Para as culturas CTCM, as secções de tecido foram colocadas em uma impressora 3D personalizada, em uma placa de Petri contendo solução de Tyrode modificada. O dispositivo foi projetado para aumentar o tamanho da fatia do coração em 25% da área do anel de suporte. Isso evita que as secções do coração se estiquem após a transferência da solução de Tyrode para o meio de cultura e durante a diástole. Utilizando cola histoacrílica, secções de 300 µm de espessura foram fixadas em um anel de suporte com 7 mm de diâmetro. Após a fixação das secções de tecido ao anel de suporte, o excesso de tecido foi removido e as secções fixadas foram colocadas de volta no banho de solução de Tyrode em gelo (4 °C) até que se obtivesse a quantidade suficiente de secções para um dispositivo. O tempo total de processamento para todos os dispositivos não deve exceder 2 horas. Após a fixação de 6 secções de tecido aos seus respectivos anéis de suporte, o dispositivo CTCM foi montado. A câmara de cultura CTCM é preenchida previamente com 21 ml de meio de cultura pré-oxigenado. As secções de tecido foram transferidas para a câmara de cultura e quaisquer bolhas de ar foram cuidadosamente removidas com uma pipeta. A secção de tecido é então guiada para dentro do orifício e pressionada suavemente até ficar no lugar. Finalmente, a tampa do eletrodo é colocada no dispositivo e o dispositivo é transferido para a incubadora. Em seguida, o CTCM é conectado ao tubo de ar e ao sistema C-PACE-EM. O atuador pneumático abre e a válvula de ar abre o CTCM. O sistema C-PACE-EM foi configurado para fornecer 4 V a 1,2 Hz durante a estimulação bifásica por 2 ms. O meio de cultura foi trocado duas vezes ao dia e os eletrodos, uma vez ao dia, para evitar o acúmulo de grafite nos eletrodos. Se necessário, as secções de tecido podem ser removidas dos poços de cultura para expelir quaisquer bolhas de ar que possam ter se depositado sob elas. Para as condições de tratamento MT, T3/Dex foi adicionado fresco a cada troca de meio, com 100 nM de T3 e 1 μM de Dex. Os dispositivos CTCM foram cultivados em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
Para obter trajetórias alongadas de fatias de tecido cardíaco, um sistema de câmera especial foi desenvolvido. Uma câmera SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tóquio, Japão) foi utilizada com uma lente macro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, São Francisco, CA). A visualização foi realizada à temperatura ambiente após a substituição do meio de cultura por meio fresco. A câmera foi posicionada em um ângulo de 51° e o vídeo foi gravado a 30 quadros por segundo. Inicialmente, o software de código aberto MUSCLEMOTION43 foi utilizado com o ImageJ para quantificar o movimento das fatias de tecido cardíaco. A máscara foi criada utilizando o MATLAB (MathWorks, Natick, MA, EUA) para definir regiões de interesse nas fatias de tecido cardíaco em batimento, a fim de evitar ruídos. As máscaras segmentadas manualmente foram aplicadas a todas as imagens em uma sequência de quadros e, em seguida, passadas para o plug-in MUSCLEMOTION. O Muscle Motion utiliza a intensidade média dos pixels em cada quadro para quantificar seu movimento em relação ao quadro de referência. Os dados foram registrados, filtrados e utilizados para quantificar o tempo do ciclo e avaliar o estiramento do tecido durante o ciclo cardíaco. O vídeo gravado foi pós-processado utilizando um filtro digital de primeira ordem com fase zero. Para quantificar o estiramento do tecido (pico a pico), foi realizada uma análise pico a pico para distinguir entre picos e vales no sinal gravado. Além disso, foi realizada uma remoção de tendência utilizando um polinômio de 6ª ordem para eliminar a deriva do sinal. O código do programa foi desenvolvido em MATLAB para determinar o movimento global do tecido, o tempo do ciclo, o tempo de relaxamento e o tempo de contração (Código do Programa Suplementar 44).
Para a análise de deformação, utilizando os mesmos vídeos criados para a avaliação do alongamento mecânico, primeiro traçamos duas imagens representando os picos de movimento (os pontos mais altos (superior) e mais baixos (inferior) do movimento) de acordo com o software MUSCLEMOTION. Em seguida, segmentamos as regiões do tecido e aplicamos um algoritmo de sombreamento ao tecido segmentado (Figura Suplementar 2a). O tecido segmentado foi então dividido em dez subsuperfícies, e a tensão em cada superfície foi calculada utilizando a seguinte equação: Deformação = (Sup-Sdown)/Sdown, onde Sup e Sdown são as distâncias da forma às sombras superior e inferior do tecido, respectivamente (Figura Suplementar 2b).
Secções do coração foram fixadas em paraformaldeído a 4% durante 48 horas. Os tecidos fixados foram desidratados em sacarose a 10% e 20% durante 1 hora e, em seguida, em sacarose a 30% durante a noite. As secções foram então incluídas em composto de temperatura de corte ideal (composto OCT) e congeladas gradualmente em banho de isopentano/gelo seco. Os blocos de inclusão em OCT foram armazenados a -80 °C até à separação. As lâminas foram preparadas com secções de 8 μm de espessura.
Para remover o OCT das secções cardíacas, aqueça as lâminas num bloco de aquecimento a 95 °C durante 5 minutos. Adicione 1 ml de PBS a cada lâmina e incube durante 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, permeabilize as secções com Triton-X a 0,1% em PBS durante 15 minutos à temperatura ambiente. Para evitar a ligação de anticorpos não específicos à amostra, adicione 1 ml de solução de BSA a 3% às lâminas e incube durante 1 hora à temperatura ambiente. A BSA foi então removida e as lâminas foram lavadas com PBS. Identifique cada amostra com um lápis. Os anticorpos primários (diluídos 1:200 em BSA a 1%) (conexina 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) e troponina-T (Thermo Scientific; #MA5-12960)) foram adicionados ao longo de 90 minutos, seguidos pelos anticorpos secundários (diluídos 1:200 em BSA a 1%) contra Alexa Fluor 488 de rato (Thermo Scientific; #A16079) e contra Alexa Fluor 594 de coelho (Thermo Scientific; #T6391), por mais 90 minutos. As lâminas foram lavadas 3 vezes com PBS. Para distinguir a marcação do alvo do fundo, utilizamos apenas o anticorpo secundário como controle. Finalmente, adicionamos o corante nuclear DAPI e as lâminas foram colocadas em um Vectashield (Vector Laboratories) e seladas com esmalte de unha. A microscopia foi realizada com um microscópio Keyence com ampliação de 40x.
A coloração com WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; nº W32464) a 5 μg/ml em PBS foi aplicada às secções fixadas durante 30 minutos à temperatura ambiente. As lâminas foram então lavadas com PBS e adicionou-se Sudan Black a cada lâmina, incubando-se por 30 minutos. Em seguida, as lâminas foram lavadas novamente com PBS e adicionou-se meio de inclusão Vectashield. As lâminas foram visualizadas num microscópio Keyence com ampliação de 40x.
O OCT foi removido das amostras conforme descrito anteriormente. Após a remoção do OCT, as lâminas foram imersas em solução de Bouin durante a noite. Em seguida, as lâminas foram enxaguadas com água destilada por 1 hora e colocadas em uma solução de fucsina ácida de Bibrich por 10 minutos. Posteriormente, as lâminas foram lavadas com água destilada e colocadas em uma solução de fosfomolibdênio a 5%/ácido fosfotúngstico a 5% por 10 minutos. Sem enxaguar, as lâminas foram transferidas diretamente para a solução de azul de anilina por 15 minutos. Em seguida, as lâminas foram lavadas com água destilada e colocadas em uma solução de ácido acético a 1% por 2 minutos. As lâminas foram secas em etanol 200 N e transferidas para xileno. As lâminas coradas foram visualizadas utilizando um microscópio Keyence com objetiva de 10x. A porcentagem da área de fibrose foi quantificada utilizando o software Keyence Analyzer.
O ensaio de viabilidade celular CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), número de catálogo V13154, foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações. Em particular, utilizou-se um punch cirúrgico com 6 mm de diâmetro para garantir a uniformidade do tamanho do tecido durante a análise de MTT. Os tecidos foram semeados individualmente em placas de 12 poços contendo o substrato MTT, seguindo o protocolo do fabricante. As seções foram incubadas a 37 °C por 3 horas, permitindo que o tecido vivo metabolizasse o substrato MTT e formasse um composto de formazan púrpura. A solução de MTT foi substituída por 1 ml de DMSO e incubada a 37 °C por 15 minutos para extrair o formazan púrpura das seções cardíacas. As amostras foram diluídas 1:10 em DMSO em placas de 96 poços com fundo transparente e a intensidade da cor púrpura foi medida a 570 nm utilizando um leitor de placas Cytation (BioTek). As leituras foram normalizadas pelo peso de cada fatia do coração.
O meio de cultura das fatias de coração foi substituído por meio contendo 1 μCi/ml de [5-3H]-glicose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, EUA) para o ensaio de utilização de glicose, conforme descrito anteriormente. Após 4 horas de incubação, adicione 100 µl do meio a um tubo de microcentrífuga aberto contendo 100 µl de HCl 0,2 N. Em seguida, o tubo foi colocado em um tubo de cintilação contendo 500 µl de água destilada para evaporação do [3H]2O por 72 horas a 37 °C. Posteriormente, o tubo de microcentrífuga foi removido do tubo de cintilação e 10 ml de fluido de cintilação foram adicionados. As contagens de cintilação foram realizadas utilizando um analisador de cintilação líquida Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, EUA). A utilização de glicose foi então calculada levando em consideração a atividade específica da [5-3H]-glicose, o equilíbrio incompleto e o ruído de fundo, a diluição da [5-3H]-glicose em glicose não marcada e a eficiência do contador de cintilação. Os dados foram normalizados pela massa das seções do coração.
Após a homogeneização do tecido em Trizol, o RNA foi isolado de seções cardíacas utilizando o kit Qiagen miRNeasy Micro #210874, de acordo com o protocolo do fabricante. A preparação da biblioteca de RNAsec, o sequenciamento e a análise dos dados foram realizados da seguinte forma:
Para a preparação da biblioteca de RNA, foi utilizado 1 μg de RNA por amostra como material inicial. As bibliotecas de sequenciamento foram geradas utilizando o kit NEBNext Ultra™ RNA Library Preparation para Illumina (NEB, EUA), seguindo as recomendações do fabricante, e códigos de indexação foram adicionados às sequências de atributos de cada amostra. Resumidamente, o mRNA foi purificado do RNA total utilizando esferas magnéticas ligadas a oligonucleotídeos poli-T. A fragmentação foi realizada utilizando cátions divalentes em alta temperatura no tampão de reação NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). A primeira fita de cDNA foi sintetizada utilizando primers hexâmeros aleatórios e transcriptase reversa M-MuLV (RNase H-). A segunda fita de cDNA foi então sintetizada utilizando DNA polimerase I e RNase H. As extremidades salientes restantes foram convertidas em extremidades rombas pela atividade de exonuclease/polimerase. Após a adenilação da extremidade 3′ do fragmento de DNA, um adaptador NEBNext com estrutura de alça em grampo foi ligado a ele para prepará-lo para hibridização. Para a seleção de fragmentos de cDNA com o comprimento desejado de 150-200 pb, os fragmentos da biblioteca foram purificados utilizando o sistema AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, EUA). Em seguida, 3 μl da enzima USER (NEB, EUA) contendo o cDNA selecionado por tamanho e ligado a um adaptador foram incubados por 15 minutos a 37 °C e, posteriormente, por 5 minutos a 95 °C antes da PCR. A PCR foi então realizada utilizando a DNA polimerase Phusion High-Fidelity, primers universais para PCR e primers Index (X). Finalmente, os produtos de PCR foram purificados (sistema AMPure XP) e a qualidade da biblioteca foi avaliada em um sistema Agilent Bioanalyzer 2100. A biblioteca de cDNA foi então sequenciada utilizando um sequenciador Novaseq. Os arquivos de imagem brutos da Illumina foram convertidos em leituras brutas utilizando o CASAVA Base Calling. Os dados brutos são armazenados em arquivos no formato FASTQ (fq) que contêm as sequências de leitura e as respectivas qualidades das bases. Selecione HISAT2 para alinhar as sequências de leitura filtradas ao genoma de referência Sscrofa11.1. Em geral, o HISAT2 suporta genomas de qualquer tamanho, incluindo genomas maiores que 4 bilhões de bases, e os valores padrão já estão definidos para a maioria dos parâmetros. As sequências de leitura de RNA-Seq podem ser alinhadas de forma eficiente usando o HISAT2, o sistema mais rápido disponível atualmente, com a mesma ou melhor precisão que qualquer outro método.
A abundância de transcritos reflete diretamente o nível de expressão gênica. Os níveis de expressão gênica são avaliados pela abundância de transcritos (contagem de sequenciamento) associados ao genoma ou aos éxons. O número de leituras é proporcional aos níveis de expressão gênica, ao comprimento do gene e à profundidade de sequenciamento. Os valores de FPKM (fragmentos por mil pares de bases de transcrito sequenciados por milhão de pares de bases) foram calculados e os valores de p da expressão diferencial foram determinados usando o pacote DESeq2. Em seguida, calculamos a taxa de falsos positivos (FDR) para cada valor de p usando o método de Benjamini-Hochberg⁹ com base na função integrada do R “p.adjust”.
O RNA isolado de secções cardíacas foi convertido em cDNA a uma concentração de 200 ng/μl utilizando o kit SuperScript IV Vilo Master Mix da Thermo (Thermo, nº de catálogo 11756050). A RT-PCR quantitativa foi realizada utilizando uma placa de reação transparente Applied Biosystems Endura Plate Microamp de 384 poços (Thermo, nº de catálogo 4483319) e adesivo óptico Microamp (Thermo, nº de catálogo 4311971). A mistura de reação consistiu em 5 µl de Taqman Fast Advanced Master Mix (Thermo, nº de catálogo 4444557), 0,5 µl de primer Taqman e 3,5 µl de água, misturados por poço. Os ciclos de qPCR padrão foram executados e os valores de CT foram medidos utilizando um instrumento de PCR em tempo real Applied Biosystems Quantstudio 5 (módulo de 384 poços; nº de produto A28135). Os primers Taqman foram adquiridos da Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Os valores de CT de todas as amostras foram normalizados para o gene de referência GAPDH.
A liberação do NT-ProBNP no meio de cultura foi avaliada utilizando o kit NT-ProBNP (suíno) (Cat. nº MBS2086979, MyBioSource) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, 250 µl de cada amostra e padrão foram adicionados em duplicata a cada poço. Imediatamente após a adição da amostra, foram adicionados 50 µl do Reagente de Ensaio A a cada poço. A placa foi agitada suavemente e selada com selante. Em seguida, as placas foram incubadas a 37 °C por 1 hora. Posteriormente, a solução foi aspirada e os poços foram lavados 4 vezes com 350 µl de solução de lavagem 1X, incubando a solução de lavagem por 1 a 2 minutos a cada lavagem. Em seguida, foram adicionados 100 µl do Reagente de Ensaio B a cada poço e a placa foi selada com selante. A placa foi agitada suavemente e incubada a 37 °C por 30 minutos. Aspire a solução e lave os poços 5 vezes com 350 µl de solução de lavagem 1X. Adicione 90 µl de solução de substrato a cada poço e sele a placa. Incube a placa a 37 °C por 10 a 20 minutos. Adicione 50 µl de solução de parada a cada poço. A placa foi imediatamente medida usando um leitor de placas Cytation (BioTek) configurado para 450 nm.
Foram realizadas análises de poder estatístico para escolher os tamanhos de grupo que proporcionarão um poder estatístico superior a 80% para detectar uma mudança absoluta de 10% no parâmetro, com uma taxa de erro do Tipo I de 5%. Foram realizadas análises de poder estatístico para escolher os tamanhos de grupo que proporcionarão um poder estatístico superior a 80% para detectar uma mudança absoluta de 10% no parâmetro, com uma taxa de erro do Tipo I de 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% isolamento absoluto parâmetro com 5% do valor do tipo I. Foi realizada uma análise de poder estatístico para selecionar tamanhos de grupo que proporcionassem um poder estatístico superior a 80% para detectar uma mudança absoluta de 10% no parâmetro, com uma taxa de erro tipo I de 5%.进行功效分析以选择将提供> 80%.进行功效分析以选择将提供> 80%. Você provavelmente terá uma análise de quantidade suficiente para seus grupos de trabalho, o que significa que você terá mais de 80% de energia para uso 10% de isenção gratuita parâmetros e 5% частоты ошибок типа I. Foi realizada uma análise de poder estatístico para selecionar um tamanho de grupo que proporcionasse um poder estatístico superior a 80% para detectar uma mudança absoluta de 10% no parâmetro e uma taxa de erro tipo I de 5%.Secções de tecido foram selecionadas aleatoriamente antes do experimento. Todas as análises foram realizadas sem conhecimento prévio das condições experimentais, e as amostras foram decodificadas somente após a análise completa dos dados. O software GraphPad Prism (San Diego, CA) foi utilizado para realizar todas as análises estatísticas. Para todas as análises estatísticas, os valores de p foram considerados significativos quando inferiores a 0,05. Para todas as análises estatísticas, os valores de p foram considerados significativos quando <0,05. Para suas estatísticas, p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Para todas as análises estatísticas, os valores de p foram considerados significativos quando <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Para suas estatísticas, p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Para todas as análises estatísticas, os valores de p foram considerados significativos quando <0,05.O teste t de Student bicaudal foi realizado nos dados com apenas duas comparações. A ANOVA de uma ou duas vias foi utilizada para determinar a significância entre múltiplos grupos. Ao realizar testes post hoc, a correção de Tukey foi aplicada para levar em consideração as múltiplas comparações. Os dados de RNAsec apresentam considerações estatísticas especiais no cálculo da FDR e do p ajustado, conforme descrito na seção Métodos.
Para obter mais informações sobre o desenho do estudo, consulte o resumo do relatório de pesquisa da Nature vinculado a este artigo.