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Há necessidade de um sistema in vitro confiável que possa reproduzir com precisão o ambiente fisiológico do coração para testes de fármacos. A disponibilidade limitada de sistemas de cultura de tecido cardíaco humano levou a interpretações imprecisas dos efeitos cardíacos de fármacos. Aqui, desenvolvemos um modelo de cultura de tecido cardíaco (CTCM) que estimula eletromecanicamente fatias de coração e sofre alongamento fisiológico durante as fases sistólica e diastólica do ciclo cardíaco. Após 12 dias de cultura, essa abordagem melhorou parcialmente a viabilidade das seções cardíacas, mas não preservou totalmente sua integridade estrutural. Portanto, após a triagem de pequenas moléculas, descobrimos que a adição de 100 nM de triiodotironina (T3) e 1 μM de dexametasona (Dex) ao nosso meio manteve a microestrutura das seções por 12 dias. Em combinação com o tratamento com T3/Dex, o sistema CTCM manteve os perfis transcricionais, a viabilidade, a atividade metabólica e a integridade estrutural no mesmo nível do tecido cardíaco fresco por 12 dias. Além disso, o estiramento excessivo do tecido cardíaco em cultura induz sinalização cardíaca hipertrófica, evidenciando a capacidade da CTCM de mimetizar condições hipertróficas induzidas pelo estiramento cardíaco. Em conclusão, a CTCM pode modelar a fisiologia e a fisiopatologia do coração em cultura por longos períodos, permitindo a triagem confiável de medicamentos.
Antes da pesquisa clínica, são necessários sistemas in vitro confiáveis ​​que possam reproduzir com precisão o ambiente fisiológico do coração humano. Tais sistemas devem imitar o alongamento mecânico, a frequência cardíaca e as propriedades eletrofisiológicas alteradas. Modelos animais são comumente usados ​​como plataforma de triagem para fisiologia cardíaca, com confiabilidade limitada em refletir os efeitos de fármacos no coração humano1,2. Em última análise, o Modelo Experimental Ideal de Cultura de Tecido Cardíaco (CTCM) é um modelo altamente sensível e específico para diversas intervenções terapêuticas e farmacológicas, reproduzindo com precisão a fisiologia e a fisiopatologia do coração humano3. A ausência de tal sistema limita a descoberta de novos tratamentos para insuficiência cardíaca4,5 e levou à cardiotoxicidade de fármacos como um dos principais motivos para a saída do mercado6.
Na última década, oito medicamentos não cardiovasculares foram retirados do uso clínico por causarem prolongamento do intervalo QT, levando a arritmias ventriculares e morte súbita7. Assim, há uma necessidade crescente de estratégias de triagem pré-clínica confiáveis ​​para avaliar a eficácia e a toxicidade cardiovascular. O uso recente de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPS-CM) na triagem de medicamentos e testes de toxicidade fornece uma solução parcial para esse problema. No entanto, a natureza imatura dos hiPS-CMs e a falta de complexidade multicelular do tecido cardíaco são as principais limitações desse método. Estudos recentes mostraram que essa limitação pode ser parcialmente superada usando hiPS-CM precocemente para formar hidrogéis de tecido cardíaco logo após o início das contrações espontâneas e aumentando gradualmente a estimulação elétrica ao longo do tempo. No entanto, esses microtecidos de hiPS-CM não possuem as propriedades eletrofisiológicas e contráteis maduras do miocárdio adulto. Além disso, o tecido cardíaco humano possui uma estrutura mais complexa, consistindo em uma mistura heterogênea de diferentes tipos celulares, incluindo células endoteliais, neurônios e fibroblastos estromais, interconectados por conjuntos específicos de proteínas da matriz extracelular. Essa heterogeneidade de populações não cardiomiócitos11,12,13 no coração de mamíferos adultos representa uma grande barreira à modelagem do tecido cardíaco utilizando tipos celulares individuais. Essas limitações significativas enfatizam a importância do desenvolvimento de métodos para o cultivo de tecido miocárdico intacto em condições fisiológicas e patológicas.
Secções finas cultivadas (300 µm) do coração humano provaram ser um modelo promissor de miocárdio humano intacto. Este método fornece acesso a um sistema multicelular 3D completo semelhante ao tecido cardíaco humano. No entanto, até 2019, o uso de secções cardíacas cultivadas era limitado pela curta sobrevivência da cultura (24 h). Isto deve-se a uma série de fatores, incluindo a falta de estiramento físico-mecânico, a interface ar-líquido e a utilização de meios simples que não suportam as necessidades do tecido cardíaco. Em 2019, vários grupos de investigação demonstraram que a incorporação de fatores mecânicos em sistemas de cultura de tecido cardíaco pode prolongar a vida da cultura, melhorar a expressão cardíaca e imitar a patologia cardíaca. Dois estudos elegantes 17 e 18 mostram que a carga mecânica uniaxial tem um efeito positivo no fenótipo cardíaco durante a cultura. No entanto, estes estudos não utilizaram a carga físico-mecânica tridimensional dinâmica do ciclo cardíaco, uma vez que as secções cardíacas foram carregadas com forças de tração isométricas 17 ou carga auxotónica linear 18 . Esses métodos de estiramento de tecidos resultaram na supressão de muitos genes cardíacos ou na superexpressão de genes associados a respostas anormais de estiramento. Notavelmente, Pitoulis et al. 19 desenvolveram um banho de cultura dinâmico de fatias cardíacas para reconstrução do ciclo cardíaco utilizando feedback de transdutor de força e acionamentos de tensão. Embora esse sistema permita uma modelagem in vitro mais precisa do ciclo cardíaco, a complexidade e o baixo rendimento do método limitam sua aplicação. Nosso laboratório desenvolveu recentemente um sistema de cultura simplificado utilizando estimulação elétrica e um meio otimizado para manter a viabilidade de cortes de tecido cardíaco suíno e humano por até 6 dias 20,21.
No presente manuscrito, descrevemos um modelo de cultura de tecido cardíaco (CTCM) utilizando secções do coração suíno que incorpora sinais humorais para recapitular a fisiologia cardíaca tridimensional e a distensão fisiopatológica durante o ciclo cardíaco. Este CTCM pode aumentar a precisão da predição pré-clínica de fármacos a um nível nunca antes alcançado, fornecendo um sistema cardíaco de rendimento médio e custo-efetivo que imita a fisiologia/fisiopatologia do coração de mamíferos para testes pré-clínicos de fármacos.
Sinais mecânicos hemodinâmicos desempenham um papel crítico na manutenção da função dos cardiomiócitos in vitro 22,23,24. No presente manuscrito, desenvolvemos uma CTCM (Figura 1a) que pode imitar o ambiente cardíaco adulto, induzindo estimulação elétrica e mecânica em frequências fisiológicas (1,2 Hz, 72 batimentos por minuto). Para evitar o estiramento excessivo do tecido durante a diástole, um dispositivo de impressão 3D foi utilizado para aumentar o tamanho do tecido em 25% (Fig. 1b). A estimulação elétrica induzida pelo sistema C-PACE foi programada para iniciar 100 ms antes da sístole, utilizando um sistema de aquisição de dados para reproduzir completamente o ciclo cardíaco. O sistema de cultura de tecidos utiliza um atuador pneumático programável (LB Engineering, Alemanha) para expandir ciclicamente uma membrana de silicone flexível, causando a expansão das fatias cardíacas na câmara superior. O sistema foi conectado a uma linha de ar externa através de um transdutor de pressão, o que permitiu ajustar com precisão a pressão (± 1 mmHg) e o tempo (± 1 ms) (Fig. 1c).
a Fixe a secção de tecido ao anel de suporte de 7 mm, mostrado em azul, dentro da câmara de cultura do dispositivo. A câmara de cultura é separada da câmara de ar por uma fina membrana de silicone flexível. Coloque uma junta entre cada câmara para evitar vazamentos. A tampa do dispositivo contém eletrodos de grafite que fornecem estimulação elétrica. b Representação esquemática do dispositivo de tecido grande, anel-guia e anel de suporte. As secções de tecido (marrom) são colocadas no dispositivo de grandes dimensões com o anel-guia colocado na ranhura na borda externa do dispositivo. Usando o guia, coloque cuidadosamente o anel de suporte revestido com adesivo acrílico tecidual sobre a secção de tecido cardíaco. c Gráfico mostrando o tempo de estimulação elétrica em função da pressão da câmara de ar controlada por um atuador pneumático programável (PPD). Um dispositivo de aquisição de dados foi usado para sincronizar a estimulação elétrica usando sensores de pressão. Quando a pressão na câmara de cultura atinge o limite definido, um sinal de pulso é enviado ao C-PACE-EM para disparar a estimulação elétrica. d Imagem de quatro CTCMs colocados em uma prateleira de incubadora. Quatro dispositivos são conectados a um PPD por meio de um circuito pneumático, e sensores de pressão são inseridos na válvula hemostática para monitorar a pressão no circuito pneumático. Cada dispositivo contém seis seções de tecido.
Utilizando um único atuador pneumático, conseguimos controlar 4 dispositivos de CTCM, cada um com capacidade para 6 secções de tecido (Fig. 1d). Na CTCM, a pressão do ar na câmara de ar é convertida em pressão síncrona na câmara de fluido e induz a expansão fisiológica da fatia cardíaca (Figura 2a e Filme Suplementar 1). A avaliação do estiramento do tecido a 80 mm Hg. A técnica demonstrou um estiramento das secções de tecido em 25% (Fig. 2b). Foi demonstrado que este estiramento percentual corresponde a um comprimento fisiológico do sarcómero de 2,2–2,3 µm para a contratilidade normal da secção cardíaca17,19,25. O movimento do tecido foi avaliado utilizando configurações personalizadas da câmara (Figura Suplementar 1). A amplitude e a velocidade do movimento do tecido (Fig. 2c, d) corresponderam ao estiramento durante o ciclo cardíaco e ao tempo durante a sístole e a diástole (Fig. 2b). O estiramento e a velocidade do tecido cardíaco durante a contração e o relaxamento permaneceram constantes durante 12 dias em cultura (Fig. 2f). Para avaliar o efeito da estimulação elétrica na contratilidade durante a cultura, desenvolvemos um método para determinar a deformidade ativa usando um algoritmo de sombreamento (Fig. 2a,b suplementar) e conseguimos distinguir entre deformidades com e sem estimulação elétrica. O mesmo corte do coração (Fig. 2f). Na região móvel do corte (R6-9), a voltagem durante a estimulação elétrica foi 20% maior do que na ausência de estimulação elétrica, o que indica a contribuição da estimulação elétrica para a função contrátil.
Traços representativos da pressão da câmara de ar, pressão da câmara de fluido e medições de movimento do tecido confirmam que a pressão da câmara altera a pressão da câmara de fluido, causando um movimento correspondente da fatia de tecido. b Traços representativos da porcentagem de estiramento (azul) de seções de tecido correspondentes à porcentagem de estiramento (laranja). c O movimento medido da fatia cardíaca é consistente com a velocidade de movimento medida. (d) Trajetórias representativas do movimento cíclico (linha azul) e velocidade (linha pontilhada laranja) em uma fatia do coração. e Quantificação do tempo de ciclo (n = 19 fatias por grupo, de porcos diferentes), tempo de contração (n = 19 fatias por grupo), tempo de relaxamento (n = 19 fatias por grupo, de porcos diferentes), movimento do tecido (n = 25 fatias)/grupo de porcos diferentes), velocidade sistólica de pico (n = 24(D0), 25(D12) fatias/grupo de porcos diferentes) e taxa de relaxamento de pico (n=24(D0), 25(D12) fatias/grupo de porcos diferentes). O teste t de Student bicaudal não mostrou diferença significativa em nenhum parâmetro. f Traços representativos da análise de deformação de cortes de tecido com (vermelho) e sem estimulação elétrica (azul), dez áreas regionais de cortes de tecido do mesmo corte. Os painéis inferiores mostram a quantificação da diferença percentual na deformação em cortes de tecido com e sem estimulação elétrica em dez áreas de cortes diferentes. (n = 8 fatias/grupo de diferentes porcos, teste t de Student bicaudal realizado; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 fatias/grupo de diferentes porcos, teste t de Student bicaudal realizado; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 seções/grupo de diferentes porcos, teste t de Student bicaudal; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 seções/grupo, de diferentes suínos, teste t de Student bicaudal; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).As barras de erro representam a média ± desvio padrão.
Em nosso sistema anterior de cultura de fatias de coração biomimético estático [20, 21], mantivemos a viabilidade, a função e a integridade estrutural das fatias de coração por 6 dias aplicando estimulação elétrica e otimizando a composição do meio. No entanto, após 10 dias, esses números caíram drasticamente. Iremos nos referir às seções cultivadas em nosso sistema anterior de cultura biomimético estático 20, 21 sob condições de controle (Ctrl) e usaremos nosso meio previamente otimizado como condições de MC e cultura sob estimulação mecânica e elétrica simultâneas (CTCM). chamado . Primeiro, determinamos que a estimulação mecânica sem estimulação elétrica foi insuficiente para manter a viabilidade do tecido por 6 dias (Fig. 3a,b Suplementar). Curiosamente, com a introdução da estimulação fisiomecânica e elétrica usando STCM, a viabilidade das seções de coração de 12 dias permaneceu a mesma que em seções de coração frescas sob condições de MS, mas não sob condições de Ctrl, como mostrado pela análise de MTT (Fig. 1). 3a). Isso sugere que a estimulação mecânica e a simulação do ciclo cardíaco podem manter as seções de tecido viáveis ​​por duas vezes mais tempo do que o relatado em nosso sistema de cultura estática anterior. No entanto, a avaliação da integridade estrutural das seções de tecido por imunomarcação da troponina T cardíaca e da conexina 43 mostrou que a expressão da conexina 43 foi significativamente maior nos tecidos de MC no dia 12 do que nos controles no mesmo dia. No entanto, a expressão uniforme da conexina 43 e a formação do disco Z não foram totalmente mantidas (Fig. 3b). Usamos uma estrutura de inteligência artificial (IA) para quantificar a integridade estrutural do tecido26, um pipeline de aprendizado profundo baseado em imagem baseado na coloração de troponina T e conexina43 para quantificar automaticamente a integridade estrutural e a fluorescência das fatias de coração em termos de força de localização. Este método usa uma Rede Neural Convolucional (CNN) e uma estrutura de aprendizado profundo para quantificar de forma confiável a integridade estrutural do tecido cardíaco de forma automatizada e imparcial, conforme descrito na referência.26 O tecido de MC apresentou maior similaridade estrutural no dia 0 em comparação com as seções de controle estáticas. Além disso, a coloração tricrômica de Masson revelou uma porcentagem significativamente menor de fibrose sob condições de EM em comparação com as condições de controle no 12º dia de cultura (Fig. 3c). Embora a CTCM tenha aumentado a viabilidade das secções de tecido cardíaco no 12º dia para um nível semelhante ao do tecido cardíaco fresco, não melhorou significativamente a integridade estrutural das secções cardíacas.
Um gráfico de barras mostra a quantificação da viabilidade do MTT de fatias de coração frescas (D0) ou cultura de fatias de coração por 12 dias em cultura estática (D12 Ctrl) ou em CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) fatias/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA unidirecional realizado; ####p < 0,0001 comparado a D0 e **p < 0,01 comparado a D12 Ctrl). Um gráfico de barras mostra a quantificação da viabilidade do MTT de fatias de coração frescas (D0) ou cultura de fatias de coração por 12 dias em cultura estática (D12 Ctrl) ou em CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) fatias/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA unidirecional realizado; ####p < 0,0001 comparado a D0 e **p < 0,01 comparado a D12 Ctrl).o histograma mostra a quantificação da viabilidade de secções cardíacas frescas de MTT (D0) ou cultura de secções cardíacas durante 12 dias em cultura estática (controlo D12) ou CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (controlo D12). ) ), 12 (D12 MC) secções/grupo de diferentes porcos, é realizado um teste ANOVA unidireccional;####p < 0,0001 para сравнению com D0 e **p < 0,01 para сравнению com D12 Ctrl). ####p < 0,0001 comparado a D0 e **p < 0,01 comparado a D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化),来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组,进行单向ANOVA 测试;与D0相比,####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC).histograma mostrando a quantificação da viabilidade do MTT em secções cardíacas frescas (D0) ou secções cardíacas cultivadas durante 12 dias em cultura estática (controlo D12) ou CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (controlo D12)), 12 (D12 MC) secções/grupo de diferentes suínos, teste ANOVA unidirecional;####p < 0,0001 para сравнению com D0, **p < 0,01 para сравнению com D12 Ctrl). ####p < 0,0001 comparado a D0, **p < 0,01 comparado a D12 Ctrl).b Troponina-T (verde), conexina 43 (vermelho) e DAPI (azul) em secções cardíacas recentemente isoladas (D0) ou secções cardíacas cultivadas em condições estáticas (Ctrl) ou condições CTCM (MC) durante 12 dias) de imagens de imunofluorescência representativas (escala em branco = 100 µm). Quantificação por inteligência artificial da integridade estrutural do tecido cardíaco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fatias/grupo de cada um de porco diferente, teste ANOVA unidirecional realizado; ####p < 0,0001 comparado a D0 e ****p < 0,0001 comparado a D12 Ctrl). Quantificação por inteligência artificial da integridade estrutural do tecido cardíaco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fatias/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA unidirecional realizado; ####p < 0,0001 comparado a D0 e ****p < 0,0001 comparado a D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственной интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 para configuração com D0 e ****p < 0,0001 para configuração com D12 Ctrl). Quantificação da integridade estrutural do tecido cardíaco por inteligência artificial (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seções/grupos de diferentes porcos, teste ANOVA unidirecional realizado; ####p < 0,0001 vs. com D0 e ****p < 0,0001 comparado a D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fatias/grupo de porcos diferentes, teste ANOVA unidirecional;####p < 0,0001 与D0相比,****p < 0.0001 em D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fatias/grupo de porcos diferentes, teste ANOVA unidirecional;####p < 0,0001与D0相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Inteligência artificial para quantificar a integridade estrutural do tecido cardíaco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seções/grupo de porcos diferentes, teste ANOVA unidirecional; ####p<0,0001 vs .D0 Para comparação ****p < 0,0001 comparado a D12 Ctrl). c Imagens representativas (esquerda) e quantificação (direita) para fatias de coração coradas com coloração tricrômica de Masson (escala nua = 500 µm) (n = 10 fatias/grupo de cada porco diferente, teste ANOVA unidirecional realizado; ####p < 0,0001 comparado a D0 e ***p < 0,001 comparado a D12 Ctrl). c Imagens representativas (esquerda) e quantificação (direita) para fatias de coração coradas com coloração tricrômica de Masson (escala nua = 500 µm) (n = 10 fatias/grupo de cada um de porcos diferentes, teste ANOVA unidirecional realizado; #### p < 0,0001 comparado a D0 e ***p < 0,001 comparado a D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) e количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 por сравнению com D0 e ***p < 0,001 por сравнению com D12 Ctrl). c Imagens representativas (esquerda) e quantificação (direita) de cortes cardíacos corados com coloração tricrômica de Masson (escala não revestida = 500 µm) (n = 10 cortes/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA unidirecional realizado; #### p < 0,0001 comparado a D0 e ***p < 0,001 comparado a D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 µm）（n = 10个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 , 进行 单向 单向 Anova 测试;#### p < 0,0001与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Análise de representação (слева) e количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного аnalиза ;### #p < 0,0001 para resolução com D0, ***p < 0,001 para resolução com D12 Ctrl). c Imagens representativas (esquerda) e quantificação (direita) de cortes cardíacos corados com coloração tricrômica de Masson (branco = 500 µm) (n = 10 cortes/grupo, cada um de um porco diferente, testado por análise de variância unidirecional; ### # p < 0,0001 comparado a D0, ***p < 0,001 comparado a D12 Ctrl).As barras de erro representam a média ± desvio padrão.
Nossa hipótese é que, adicionando pequenas moléculas ao meio de cultura, a integridade dos cardiomiócitos poderia ser melhorada e o desenvolvimento de fibrose reduzido durante a cultura de CTCM. Portanto, rastreamos moléculas pequenas usando nossas culturas de controle estático20,21 devido ao pequeno número de fatores de confusão. Dexametasona (Dex), triiodotironina (T3) e SB431542 (SB) foram escolhidas para essa triagem. Essas pequenas moléculas já foram usadas em culturas de hiPSC-CM para induzir a maturação de cardiomiócitos, aumentando o comprimento do sarcômero, os túbulos T e a velocidade de condução. Além disso, tanto Dex (um glicocorticoide) quanto SB são conhecidos por suprimir a inflamação29,30. Portanto, testamos se a inclusão de uma ou uma combinação dessas pequenas moléculas melhoraria a integridade estrutural das seções cardíacas. Para a triagem inicial, a dose de cada composto foi selecionada com base nas concentrações comumente utilizadas em modelos de cultura celular (1 μM de Dex27, 100 nM de T327 e 2,5 μM de SB31). Após 12 dias de cultura, a combinação de T3 e Dex resultou em integridade estrutural ideal dos cardiomiócitos e remodelação fibrosa mínima (Figuras Suplementares 4 e 5). Além disso, o uso de concentrações duas ou duas vezes maiores de T3 e Dex produziu efeitos deletérios em comparação com as concentrações normais (Figuras Suplementares 6a, b).
Após a triagem inicial, realizamos uma comparação direta de 4 condições de cultura (Figura 4a): Ctrl: secções cardíacas cultivadas na nossa cultura estática previamente descrita, utilizando o nosso meio otimizado; 20,21 TD: T3 e Ctrl com adição de Dex na quarta-feira; MC: secções cardíacas cultivadas em CTCM, utilizando o nosso meio previamente otimizado; e MT: CTCM com T3 e Dex adicionados ao meio. Após 12 dias de cultivo, a viabilidade dos tecidos MS e MT permaneceu a mesma que nos tecidos frescos avaliados pelo ensaio MTT (Fig. 4b). Curiosamente, a adição de T3 e Dex às culturas transwell (TD) não resultou numa melhoria significativa na viabilidade em comparação com as condições Ctrl, indicando um papel importante da estimulação mecânica na manutenção da viabilidade das secções cardíacas.
um diagrama de projeto experimental representando as quatro condições de cultura usadas para avaliar os efeitos da estimulação mecânica e da suplementação de T3/Dex no meio por 12 dias. b O gráfico de barras mostra a quantificação da viabilidade 12 dias após a cultura em todas as 4 condições de cultura (Ctrl, TD, MC e MT) em comparação com fatias de coração fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC) fatias/grupo de diferentes porcos, o teste ANOVA unidirecional é realizado; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 em comparação com D0 e **p < 0,01 em comparação com D12 Ctrl). b O gráfico de barras mostra a quantificação da viabilidade 12 dias após a cultura em todas as 4 condições de cultura (Ctrl, TD, MC e MT) em comparação com fatias de coração fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC) fatias/grupo de diferentes porcos, o teste ANOVA unidirecional é realizado; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 em comparação com D0 e **p < 0,01 em comparação com D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во 4º ano cultura (контроль, TD, MC e MT) para a construção de uma série de serviços (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний teste ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 para сравнению с D0 e **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b O gráfico de barras mostra a quantificação da viabilidade em 12 dias após a cultura em todas as 4 condições de cultura (controle, TD, MC e MT) em comparação com seções de coração fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), 12 (D12 MC) seções/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA unidirecional; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 vs. D0 e **p < 0,01 em comparação com D12 Ctrl). b. MT); 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC e MT) para сравнению со свежими срезами série (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), na linha 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 para сравнению с D0, **p <0,01 para сравнению с контролем D12). b Histograma mostrando todas as 4 condições de cultura (controle, TD, MC e MT) comparadas às seções de coração fresco (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD e D12 MT), de diferentes suínos 12 (D12 MC) seções/grupo, teste ANOVA unidirecional; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. controle D12). c O gráfico de barras mostra a quantificação do fluxo de glicose 12 dias após a cultura em todas as 4 condições de cultura (Ctrl, TD, MC e MT) em comparação com fatias de coração fresco (D0) (n = 6 fatias/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA unidirecional realizado; ###p < 0,001, em comparação com D0 e ***p < 0,001 em comparação com D12 Ctrl). c O gráfico de barras mostra a quantificação do fluxo de glicose 12 dias após a cultura em todas as 4 condições de cultura (Ctrl, TD, MC e MT) em comparação com fatias de coração fresco (D0) (n = 6 fatias/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA unidirecional realizado; ###p < 0,001, em comparação com D0 e ***p < 0,001 em comparação com D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях cultura (контроль, TD, MC e MT) para a construção de uma série de séries (D0) (n = 6 semanas/grupo de distribuição) свиней, односторонний Teste ANOVA; ###p < 0,001 para сравнению com D0 e ***p < 0,001 para сравнению com D12 Ctrl). c O histograma mostra a quantificação do fluxo de glicose 12 dias após a cultura em todas as 4 condições de cultura (controle, TD, MC e MT) em comparação com seções de coração fresco (D0) (n = 6 seções/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA unidirecional realizado; ###p < 0,001 em comparação com D0 e ***p < 0,001 em comparação com D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件(Ctrl、TD、MC 和MT)与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001与D12 Ctrl 相比）。 C:后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для 4º mês cultura (контроль, TD, MC e MT) para construir uma série de séries (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были testes ANOVA; ###p < 0,001 para сравнению с D0, ***p < 0,001 para сравнению с D12 (контроль). c Histograma mostrando a quantificação do fluxo de glicose em 12 dias pós-cultura para todas as 4 condições de cultura (controle, TD, MC e MT) em comparação com seções de coração fresco (D0) (n = 6 seções/grupo, de diferentes porcos, unilateral). Onde os testes ANOVA foram realizados, ###p < 0,001 em comparação com D0, ***p < 0,001 em comparação com D12 (controle).d Gráficos de análise de deformação de tecidos frescos (azul), MC do dia 12 (verde) e MT do dia 12 (vermelho) em dez pontos de cortes de tecido regionais (n = 4 fatias/grupo, teste ANOVA unidirecional; não houve diferença significativa entre os grupos). e Gráfico de vulcão mostrando genes diferencialmente expressos em cortes de coração frescos (D0) em comparação com cortes de coração cultivados em condições estáticas (Ctrl) ou em condições de MT (MT) por 10 a 12 dias. f Mapa de calor dos genes do sarcômero para cortes de coração cultivados em cada uma das condições de cultura. As barras de erro representam a média ± desvio padrão.
A dependência metabólica da mudança da oxidação de ácidos graxos para a glicólise é uma característica marcante da desdiferenciação dos cardiomiócitos. Cardiomiócitos imaturos utilizam principalmente glicose para a produção de ATP e apresentam mitocôndrias hipoplásicas com poucas cristas5,32. As análises de utilização de glicose mostraram que, sob condições de MC e MT, a utilização de glicose foi semelhante à dos tecidos no dia 0 (Figura 4c). No entanto, as amostras de Ctrl apresentaram um aumento significativo na utilização de glicose em comparação com o tecido fresco. Isso indica que a combinação de CTCM e T3/Dex aumenta a viabilidade do tecido e preserva o fenótipo metabólico de secções cardíacas cultivadas durante 12 dias. Além disso, a análise de deformação mostrou que os níveis de deformação permaneceram os mesmos do tecido cardíaco fresco durante 12 dias sob condições de MT e MS (Fig. 4d).
Para analisar o impacto geral da CTCM e da T3/Dex no panorama transcricional global do tecido cardíaco fatiado, realizamos RNAseq em fatias cardíacas de todas as quatro diferentes condições de cultura (Dados Suplementares 1). Curiosamente, as seções de MT apresentaram alta similaridade transcricional com o tecido cardíaco fresco, com apenas 16 genes diferencialmente expressos de um total de 13.642. No entanto, como demonstramos anteriormente, as fatias de Ctrl apresentaram 1.229 genes diferencialmente expressos após 10 a 12 dias em cultura (Fig. 4e). Esses dados foram confirmados por qRT-PCR de genes cardíacos e de fibroblastos (Fig. Suplementares 7a-c). Curiosamente, as seções de Ctrl apresentaram regulação negativa de genes cardíacos e do ciclo celular, além de ativação de programas gênicos inflamatórios. Esses dados sugerem que a desdiferenciação, que normalmente ocorre após o cultivo em longo prazo, é completamente atenuada em condições de MT (Fig. Suplementares 8a,b). Um estudo cuidadoso dos genes do sarcômero mostrou que apenas em condições de MT os genes que codificam o sarcômero (Fig. 4f) e o canal iônico (Fig. Suplementar 9) são preservados, protegendo-os da supressão em condições de Ctrl, TD e MC. Esses dados demonstram que, com uma combinação de estimulação mecânica e humoral (T3/Dex), o transcriptoma da fatia de coração pode permanecer semelhante a fatias de coração frescas após 12 dias em cultura.
Esses achados transcricionais são corroborados pelo fato de que a integridade estrutural dos cardiomiócitos em cortes cardíacos é melhor preservada em condições de TM por 12 dias, como demonstrado pela conexina 43 intacta e localizada (Fig. 5a). Além disso, a fibrose em cortes cardíacos em condições de TM foi significativamente reduzida em comparação com Ctrl e semelhante a cortes cardíacos frescos (Fig. 5b). Esses dados demonstram que a combinação de estimulação mecânica e tratamento com T3/Dex preserva efetivamente a estrutura cardíaca em cortes cardíacos em cultura.
a Imagens representativas de imunofluorescência de troponina-T (verde), conexina 43 (vermelho) e DAPI (azul) em secções cardíacas recentemente isoladas (D0) ou cultivadas durante 12 dias em todas as quatro condições de cultura de secções cardíacas (barra de escala = 100 µm). ). Quantificação por inteligência artificial da integridade estrutural do tecido cardíaco (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) fatias/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA unidirecional realizado; ####p < 0,0001 comparado a D0 e *p < 0,05, ou ****p < 0,0001 comparado a D12 Ctrl). Quantificação por inteligência artificial da integridade estrutural do tecido cardíaco (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) fatias/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA unidirecional realizado; #### p < 0,0001 comparado a D0 e *p < 0,05, ou ****p < 0,0001 comparado a D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) срезов/группу na verdade, teste ANOVA comprovado; #### p < 0,0001 para сравнению com D0 e *p < 0,05 ou ****p < 0,0001 para сравнению com D12 Ctrl). Quantificação da integridade estrutural do tecido cardíaco usando inteligência artificial (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) seções/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA unidirecional realizado; #### p < 0,0001 comparado a D0 e *p < 0,05 ou ****p < 0,0001 comparado a D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0,0001 para D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 e d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组） ########### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0,0001 por D12 Ctrl 相比）。Quantificação da integridade estrutural do tecido cardíaco usando inteligência artificial em diferentes suínos (n = 7 (D0 e D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC e D12 MT) seções/grupo) com um teste ANOVA unidirecional;#### p < 0,0001 para сравнению com D0 e *p < 0,05 ou ****p < 0,0001 para сравнению com D12 Ctrl). #### p < 0,0001 comparado a D0 e *p < 0,05 ou ****p < 0,0001 comparado a D12 Ctrl). b Imagens representativas e quantificação de fatias de coração coradas com coloração tricrômica de Masson (barra de escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) fatias/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA unidirecional realizado; ####p < 0,0001 comparado a D0 e ***p < 0,001, ou ****p < 0,0001 comparado a D12 Ctrl). b Imagens representativas e quantificação de fatias de coração coradas com coloração tricrômica de Masson (barra de escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) fatias/grupo de diferentes porcos, teste ANOVA unidirecional realizado; ####p < 0,0001 comparado a D0 e ***p < 0,001, ou ****p < 0,0001 comparado a D12 Ctrl). b Representar a distribuição e a coleta de dados de maneira correta, okraшенных трихромным красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 para сравнению с D0 e ***p < 0,001 ou ****p < 0,0001 por meio de D12 Ctrl). b Imagens representativas e quantificação de cortes cardíacos corados com coloração tricrômica de Masson (barra de escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) cortes/grupo de diferentes suínos, ANOVA unidirecional realizada; ####p < 0,0001 vs. D0 e ***p < 0,001 ou ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 para D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl, d12 td e d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная linha = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 para resolução com D0, ***p < 0,001 ou ****p < 0,0001 para resolução com D12 Ctrl). b Imagens representativas e quantificação de cortes cardíacos corados com tricrômico de Masson (barra de escala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) cortes de diferentes porcos/grupo, um método ANOVA; ####p < 0,0001 comparado a D0, ***p < 0,001 ou ****p < 0,0001 comparado a D12 Ctrl).As barras de erro representam a média ± desvio padrão.
Finalmente, a capacidade da CTCM de mimetizar a hipertrofia cardíaca foi avaliada pelo aumento do estiramento do tecido cardíaco. Na CTCM, a pressão máxima da câmara de ar aumentou de 80 mmHg para 80 mmHg (estiramento normal) até 140 mmHg (Fig. 6a). Isso corresponde a um aumento de 32% no estiramento (Fig. 6b), que foi previamente demonstrado como o percentual de estiramento correspondente necessário para que as seções cardíacas atinjam um comprimento de sarcômero semelhante ao observado na hipertrofia. O estiramento e a velocidade do tecido cardíaco durante a contração e o relaxamento permaneceram constantes durante seis dias de cultura (Fig. 6c). O tecido cardíaco das condições de MT foi submetido a estiramento normal (MT (Normal)) ou condições de sobreestiramento (MT (OS)) por seis dias. Já após quatro dias em cultura, o biomarcador hipertrófico NT-ProBNP estava significativamente elevado no meio sob condições de MT (OS) em comparação com as condições de MT (normais) (Fig. 7a). Além disso, após seis dias de cultivo, o tamanho celular em MT (OS) (Fig. 7b) aumentou significativamente em comparação com cortes de coração de MT (normal). Além disso, a translocação nuclear de NFATC4 aumentou significativamente em tecidos hiperdistendidos (Fig. 7c). Esses resultados demonstram o desenvolvimento progressivo da remodelação patológica após hiperdistensão e corroboram o conceito de que o dispositivo CTCM pode ser usado como plataforma para estudar a sinalização da hipertrofia cardíaca induzida por estiramento.
Traços representativos da pressão da câmara de ar, pressão da câmara de fluido e medições de movimento do tecido confirmam que a pressão da câmara altera a pressão da câmara de fluido, causando um movimento correspondente da fatia de tecido. b Curvas representativas de porcentagem de alongamento e taxa de alongamento para seções de tecido normalmente esticadas (laranja) e superesticadas (azul). c Gráfico de barras mostrando tempo de ciclo (n = 19 fatias por grupo, de diferentes porcos), tempo de contração (n = 18-19 fatias por grupo, de diferentes porcos), tempo de relaxamento (n = 19 fatias por grupo, de diferentes porcos), amplitude do movimento do tecido (n = 14 fatias/grupo, de diferentes porcos), velocidade sistólica de pico (n = 14 fatias/grupo, de diferentes porcos) e taxa de relaxamento de pico (n = 14 (D0), 15 (D6)) seções/grupos) de diferentes porcos), o teste t de Student bicaudal não mostrou diferença significativa em nenhum parâmetro, indicando que esses parâmetros permaneceram constantes durante 6 dias de cultura com sobretensão. As barras de erro representam a média ± desvio padrão.
a Quantificação em gráfico de barras da concentração de NT-ProBNP em meios de cultura de fatias de coração cultivadas em condições de estiramento normal (Norm) ou de estiramento excessivo (OS) de MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm e D4 MTOS) fatias/grupo de diferentes porcos, ANOVA bidirecional é realizada; **p < 0,01 em comparação ao estiramento normal). a Quantificação em gráfico de barras da concentração de NT-ProBNP em meios de cultura de fatias de coração cultivadas em condições de estiramento normal (Norm) ou de estiramento excessivo (OS) de MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm e D4 MTOS) fatias/grupo de diferentes porcos, ANOVA bidirecional é realizada; **p < 0,01 em comparação ao estiramento normal).Histograma quantitativo da concentração de NT-ProBNP no meio de cultura de fatias de coração cultivadas em condições de estiramento normal de MT (norma) ou sobreestiramento (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm e D4).MTOS) fatias/grupo de diferentes suínos, análise de variância de dois fatores é realizada;**p < 0,01 em condições normais de uso). **p < 0,01 comparado ao alongamento normal). a 在MT 正常拉伸(Norma) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析;**与正常拉伸相比，p < 0,01）。 a Quantificação da concentração de NT-ProBNP em fatias de coração cultivadas sob condições de estiramento normal MT (Norm) ou estiramento excessivo (OS) (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) de diferentes猪的切片/组，可以双向方方发发动; **comparado com alongamento normal, p < 0,01).histograma Quantificação das concentrações de NT-ProBNP em fatias de coração cultivadas em condições de estiramento normal de MT (norma) ou sobreestiramento (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) e D4 MTOS) fatias/grupo de diferentes suínos, análise de variância bidirecional;**p < 0,01 em condições normais de uso). **p < 0,01 comparado ao alongamento normal). b Imagens representativas de fatias de coração coradas com troponina T e WGA (esquerda) e quantificação do tamanho das células (direita) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) células/grupo de 10 fatias diferentes de porcos diferentes, teste t de Student bicaudal realizado; ****p < 0,0001 comparado ao estiramento normal). b Imagens representativas de fatias de coração coradas com troponina T e WGA (esquerda) e quantificação do tamanho das células (direita) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) células/grupo de 10 fatias diferentes de porcos diferentes, teste t de Student bicaudal realizado; ****p < 0,0001 comparado ao estiramento normal). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т e АЗП (слева) и количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 por normalmente). b Imagens representativas de cortes cardíacos corados com troponina-T e AZP (esquerda) e quantificação do tamanho das células (direita) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) células/grupo de 10 cortes diferentes de diferentes porcos, teste t de Student bicaudal foi realizado; ****p < 0,0001 comparado à linhagem normal). b. MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验;与正常拉伸相比，****p < 0,0001）。 b Imagens representativas de fatias de coração coradas com calcareína-T e WGA (esquerda) e tamanho de célula (direita) (n = 330 (D6 MTOS), 369 de 10 fatias diferentes (D6 MTNorm)) Células/coração, teste t de células de tecido conjuntivo; comparado com alongamento normal, ****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т e АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) de 10 números de série de uma chave de fenda/chave, critérios de entrega Estágio; ****p < 0,0001 para uma vida normal rastenijem). b Imagens representativas de cortes cardíacos corados com troponina-T e AZP (esquerda) e quantificação do tamanho das células (direita) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) de 10 cortes diferentes de diferentes porcos) Células/grupo, critério bicaudal t de Student; ****p < 0,0001 comparado à cepa normal). c Imagens representativas de fatias de coração MTOS do dia 0 e dia 6 imunomarcadas para troponina-T e NFATC4 e quantificação da translocação de NFATC4 para os núcleos de CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fatias/grupo de diferentes porcos, teste t de Student bicaudal realizado; *p < 0,05). c Imagens representativas de fatias de coração MTOS do dia 0 e dia 6 imunomarcadas para troponina-T e NFATC4 e quantificação da translocação de NFATC4 para os núcleos de CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fatias/grupo de diferentes porcos, teste t de Student bicaudal realizado; *p < 0,05). c Репрезентативные изображения para срезов сердца 0 e 6 de janeiro MTOS, иммуномеченых para тропонина-Т e NFATC4, и количественная оценка транслокации NFATC4 em um conjunto de células (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Imagens representativas de cortes cardíacos em 0 e 6 dias MTOS, imunomarcadas para troponina-T e NFATC4, e quantificação da translocação de NFATC4 no núcleo de células cavernosas (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fatias/grupo de diferentes porcos) realizaram teste t de Student bicaudal; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像, 以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS)切片/组, 进行双尾学生t 检验;*p < 0,05)。 c Imagens representativas da imunomarcação de calcanina-T e NFATC4 第0天和第6天MTOS fatias de coração e NFATC4 de diferentes núcleos de células NFATC4 易位至CM的quantidade化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组,时间双尾学生et 电影;*p < 0,05). c Representação de uma série de MTOS em 0 e 6 dias para imunomarcas тропонином-Т e NFATC4 e количественная оценка транслокации NFATC4 em ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Imagens representativas de fatias de coração de MTOS nos dias 0 e 6 para imunomarcação de troponina T e NFATC4 e quantificação da translocação de NFATC4 no núcleo de CM de diferentes porcos (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fatias/grupo, critério t de Student bicaudal; *p < 0,05).Barras de erro representam média ± desvio padrão.
A pesquisa cardiovascular translacional requer modelos celulares que reproduzam com precisão o ambiente cardíaco. Neste estudo, foi desenvolvido e caracterizado um dispositivo de CTCM capaz de estimular secções ultrafinas do coração. O sistema de CTCM inclui estimulação eletromecânica fisiologicamente sincronizada e enriquecimento de fluidos com T3 e Dex. Quando secções cardíacas suínas foram expostas a estes fatores, a sua viabilidade, integridade estrutural, atividade metabólica e expressão transcricional permaneceram as mesmas que no tecido cardíaco fresco após 12 dias de cultura. Além disso, o estiramento excessivo do tecido cardíaco pode causar hipertrofia cardíaca causada pela hiperextensão. De um modo geral, estes resultados corroboram o papel crítico das condições fisiológicas de cultura na manutenção de um fenótipo cardíaco normal e fornecem uma plataforma para a triagem de fármacos.
Muitos fatores contribuem para a criação de um ambiente ideal para o funcionamento e a sobrevivência dos cardiomiócitos. Os mais óbvios desses fatores estão relacionados a (1) interações intercelulares, (2) estimulação eletromecânica, (3) fatores humorais e (4) substratos metabólicos. As interações fisiológicas célula a célula requerem redes tridimensionais complexas de múltiplos tipos celulares sustentadas por uma matriz extracelular. Essas interações celulares complexas são difíceis de reconstruir in vitro por cocultura de tipos celulares individuais, mas podem ser facilmente alcançadas utilizando a natureza organotípica das secções cardíacas.
O estiramento mecânico e a estimulação elétrica dos cardiomiócitos são essenciais para a manutenção do fenótipo cardíaco33,34,35. Embora a estimulação mecânica tenha sido amplamente utilizada para o condicionamento e a maturação de hiPSC-CM, vários estudos sofisticados tentaram recentemente a estimulação mecânica de fatias de coração em cultura usando carga uniaxial. Esses estudos mostram que a carga mecânica uniaxial 2D tem um efeito positivo no fenótipo do coração durante a cultura. Nesses estudos, seções do coração foram carregadas com forças de tração isométricas17, carga auxotônica linear18 ou o ciclo cardíaco foi recriado usando feedback do transdutor de força e acionamentos de tensão. No entanto, esses métodos usam estiramento uniaxial do tecido sem otimização ambiental, resultando na supressão de muitos genes cardíacos ou na superexpressão de genes associados a respostas anormais de estiramento. A CTCM descrita aqui fornece um estímulo eletromecânico 3D que imita o ciclo cardíaco natural em termos de tempo de ciclo e estiramento fisiológico (25% de estiramento, 40% de sístole, 60% de diástole e 72 batimentos por minuto). Embora essa estimulação mecânica tridimensional por si só não seja suficiente para manter a integridade do tecido, uma combinação de estimulação humoral e mecânica usando T3/Dex é necessária para manter adequadamente a viabilidade, a função e a integridade do tecido.
Fatores humorais desempenham um papel importante na modulação do fenótipo cardíaco adulto. Isso foi destacado em estudos de HiPS-CM nos quais T3 e Dex foram adicionados a meios de cultura para acelerar a maturação celular. T3 pode influenciar o transporte de aminoácidos, açúcares e cálcio através das membranas celulares36. Além disso, T3 promove a expressão de MHC-α e a regulação negativa de MHC-β, promovendo a formação de miofibrilas de contração rápida em cardiomiócitos maduros em comparação com miofibrilas de contração lenta em CM fetal. A deficiência de T3 em pacientes hipotireoidianos resulta na perda de bandas miofibrilares e em uma taxa reduzida de desenvolvimento de tônus37. Dex atua em receptores de glicocorticoides e demonstrou aumentar a contratilidade miocárdica em corações isolados perfundidos;38 acredita-se que essa melhora esteja relacionada ao efeito na entrada induzida por depósito de cálcio (SOCE)39,40. Além disso, Dex se liga a seus receptores, causando uma ampla resposta intracelular que suprime a função imunológica e a inflamação30.
Nossos resultados indicam que a estimulação mecânica física (EM) melhorou o desempenho geral da cultura em comparação com Ctrl, mas não conseguiu manter a viabilidade, a integridade estrutural e a expressão cardíaca ao longo de 12 dias em cultura. Comparado ao Ctrl, a adição de T3 e Dex às culturas de CTCM (MT) melhorou a viabilidade e manteve perfis de transcrição, integridade estrutural e atividade metabólica semelhantes com tecido cardíaco fresco por 12 dias. Além disso, controlando o grau de estiramento do tecido, um modelo de hipertrofia cardíaca induzida por hiperextensão foi criado usando STCM, ilustrando a versatilidade do sistema STCM. Deve-se notar que, embora a remodelação cardíaca e a fibrose geralmente envolvam órgãos intactos cujas células circulantes podem fornecer as citocinas apropriadas, bem como fagocitose e outros fatores de remodelação, secções do coração ainda podem mimetizar o processo fibrótico em resposta ao estresse e trauma em miofibroblastos. Isso foi previamente avaliado neste modelo de fatia cardíaca. Deve-se observar que os parâmetros da CTCM podem ser modulados pela alteração da amplitude e frequência da pressão/eletricidade para simular diversas condições, como taquicardia, bradicardia e suporte circulatório mecânico (coração sem carga mecânica). Isso torna o sistema um meio de transporte para testes de drogas. A capacidade da CTCM de modelar a hipertrofia cardíaca induzida por esforço excessivo abre caminho para o teste deste sistema para terapia personalizada. Em conclusão, o presente estudo demonstra que o estiramento mecânico e a estimulação humoral são essenciais para a manutenção da cultura de cortes de tecido cardíaco.
Embora os dados apresentados aqui sugiram que a CTCM seja uma plataforma muito promissora para a modelagem de miocárdio íntegro, este método de cultura apresenta algumas limitações. A principal limitação da cultura por CTCM é que ela impõe tensões mecânicas dinâmicas contínuas às fatias, o que impede a capacidade de monitorar ativamente as contrações das fatias cardíacas durante cada ciclo. Além disso, devido ao pequeno tamanho das secções cardíacas (7 mm), a capacidade de avaliar a função sistólica fora dos sistemas de cultura usando sensores de força tradicionais é limitada. No presente manuscrito, superamos parcialmente essa limitação avaliando a voltagem óptica como um indicador da função contrátil. No entanto, essa limitação exigirá mais trabalho e poderá ser abordada no futuro com a introdução de métodos para o monitoramento óptico da função das fatias cardíacas em cultura, como o mapeamento óptico usando corantes sensíveis ao cálcio e à voltagem. Outra limitação da CTCM é que o modelo de trabalho não manipula o estresse fisiológico (pré-carga e pós-carga). Na CTCM, a pressão foi induzida em direções opostas para reproduzir 25% do alongamento fisiológico na diástole (alongamento total) e na sístole (duração da contração durante a estimulação elétrica) em tecidos muito grandes. Essa limitação deve ser removida em futuros projetos de CTCM por meio de pressão adequada no tecido cardíaco de ambos os lados e pela aplicação das relações exatas de pressão-volume que ocorrem nas câmaras do coração.
A remodelação induzida por estiramento excessivo relatada neste manuscrito limita-se a mimetizar sinais de hiperestiramento hipertrófico. Assim, este modelo pode auxiliar no estudo da sinalização hipertrófica induzida por estiramento sem a necessidade de fatores humorais ou neurais (que não existem neste sistema). Mais estudos são necessários para aumentar a multiplicidade da CTCM; por exemplo, a cocultura com células imunes, fatores humorais plasmáticos circulantes e a inervação durante a cocultura com células neuronais aumentarão as possibilidades de modelagem de doenças com CTCM.
Treze suínos foram utilizados neste estudo. Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes institucionais e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Louisville. O arco aórtico foi clampeado e o coração foi perfundido com 1 L de cardioplegia estéril (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL de heparina, pH até 7,4); os corações foram preservados em solução cardioplégica gelada até serem transportados para o laboratório em gelo, o que geralmente leva <10 minutos. os corações foram preservados em solução cardioplégica gelada até serem transportados para o laboratório em gelo, o que geralmente leva <10 minutos. serдца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 min. os corações foram armazenados em solução cardioplégica gelada até o transporte para o laboratório em gelo, o que geralmente leva <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Verifique a frequência do cardiopulmonar durante o transporte para o laboratório no local, normalmente <10 minutos. Manter os corações no gelo durante a cardioplegia até o transporte para o laboratório no gelo, geralmente <10 min.
O dispositivo CTCM foi desenvolvido no software de projeto auxiliado por computador (CAD) SolidWorks. As câmaras de cultura, divisores e câmaras de ar são feitas de plástico acrílico transparente CNC. O anel de apoio de 7 mm de diâmetro é feito de polietileno de alta densidade (PEAD) no centro e tem uma ranhura para o-ring para acomodar o o-ring de silicone usado para selar o meio por baixo. Uma fina membrana de sílica separa a câmara de cultura da placa de separação. A membrana de silicone é cortada a laser de uma folha de silicone de 0,02" de espessura e tem uma dureza de 35A. As juntas de silicone inferior e superior são cortadas a laser de uma folha de silicone de 1/16" de espessura e têm uma dureza de 50A. Parafusos e porcas borboleta de aço inoxidável 316L são usados ​​para fixar o bloco e criar uma vedação hermética.
Uma placa de circuito impresso (PCB) dedicada é projetada para ser integrada ao sistema C-PACE-EM. Os soquetes do conector da máquina suíça na PCB são conectados a eletrodos de grafite por fios de cobre prateados e parafusos de bronze 0-60 aparafusados ​​nos eletrodos. A placa de circuito impresso é colocada na tampa da impressora 3D.
O dispositivo CTCM é controlado por um atuador pneumático programável (PPD) que cria uma pressão circulatória controlada semelhante a um ciclo cardíaco. À medida que a pressão dentro da câmara de ar aumenta, a membrana flexível de silicone se expande para cima, forçando o meio sob o local do tecido. A área do tecido será então esticada por essa expulsão de fluido, imitando a expansão fisiológica do coração durante a diástole. No pico de relaxamento, a estimulação elétrica foi aplicada por meio de eletrodos de grafite, o que reduziu a pressão na câmara de ar e causou a contração de seções de tecido. Dentro do tubo há uma válvula hemostática com um sensor de pressão para detectar a pressão no sistema de ar. A pressão detectada pelo sensor de pressão é aplicada a um coletor de dados conectado ao laptop. Isso permite o monitoramento contínuo da pressão dentro da câmara de gás. Quando a pressão máxima da câmara foi atingida (padrão 80 mmHg, 140 mmHg OS), o dispositivo de aquisição de dados foi ordenado a enviar um sinal para o sistema C-PACE-EM para gerar um sinal de tensão bifásica por 2 ms, definido para 4 V.
Secções cardíacas foram obtidas e as condições de cultura em 6 poços foram realizadas da seguinte forma: Transferir os corações colhidos do recipiente de transferência para uma bandeja contendo cardioplegia fria (4° C). O ventrículo esquerdo foi isolado com uma lâmina estéril e cortado em pedaços de 1-2 cm3. Estes blocos de tecido foram fixados a suportes de tecido com adesivo de tecido e colocados num banho de tecido de micrótomo vibratório contendo solução de Tyrode e continuamente oxigenado (3 g/L de 2,3-butanodiona monooxima (BDM), 140 mM de NaCl (8,18 g).), 6 mM de KCl (0,447 g), 10 mM de D-glicose (1,86 g), 10 mM de HEPES (2,38 g), 1 mM de MgCl2 (1 ml de solução 1 M), 1,8 mM de CaCl2 (1,8 ml de solução 1 M), até 1 L de ddH2O). O micrótomo vibratório foi ajustado para cortar fatias de 300 µm de espessura a uma frequência de 80 Hz, uma amplitude de vibração horizontal de 2 mm e uma taxa de avanço de 0,03 mm/s. O banho de tecido foi cercado por gelo para manter a solução fria e a temperatura foi mantida a 4 °C. Transfira as seções de tecido do banho do micrótomo para um banho de incubação contendo solução de Tyrode continuamente oxigenada em gelo até que seções suficientes sejam obtidas para uma placa de cultura. Para culturas transwell, as seções de tecido foram fixadas em suportes de poliuretano estéreis de 6 mm de largura e colocadas em 6 ml de meio otimizado (meio 199, 1x suplemento ITS, 10% SFB, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alcalino e 2X antibiótico-antifúngico). Estimulação elétrica (10 V, frequência 1,2 Hz) foi aplicada às seções de tecido através do C-Pace. Para as condições de TD, T3 e Dex frescos foram adicionados a 100 nM e 1 μM a cada troca de meio. O meio foi saturado com oxigênio antes da troca, 3 vezes ao dia. Cortes de tecido foram cultivados em uma incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
Para culturas de CTCM, secções de tecido foram colocadas numa impressora 3D personalizada, numa placa de Petri contendo solução de Tyrode modificada. O dispositivo foi concebido para aumentar o tamanho da fatia do coração em 25% da área do anel de suporte. Isto é feito para que as secções do coração não se estiquem após serem transferidas da solução de Tyrode para o meio e durante a diástole. Utilizando cola histoacrílica, secções de 300 µm de espessura foram fixadas num anel de suporte com 7 mm de diâmetro. Após a fixação das secções de tecido ao anel de suporte, cortou-se o excesso de secções de tecido e colocou-se as secções de tecido aderidas de volta no banho de solução de Tyrode em gelo (4 °C) até que secções suficientes tenham sido preparadas para um dispositivo. O tempo total de processamento para todos os dispositivos não deve exceder 2 horas. Após a fixação de 6 secções de tecido aos seus anéis de suporte, o dispositivo de CTCM foi montado. A câmara de cultura de CTCM foi pré-preenchida com 21 ml de meio pré-oxigenado. Transfira as secções de tecido para a câmara de cultura e remova cuidadosamente quaisquer bolhas de ar com uma pipeta. A secção de tecido é então guiada para o orifício e pressionada suavemente no lugar. Finalmente, coloque a tampa do elétrodo no dispositivo e transfira-o para a incubadora. Em seguida, conecte o CTCM ao tubo de ar e ao sistema C-PACE-EM. O atuador pneumático abre e a válvula de ar abre o CTCM. O sistema C-PACE-EM foi configurado para fornecer 4 V a 1,2 Hz durante estimulação bifásica durante 2 ms. O meio foi trocado duas vezes por dia e os elétrodos foram trocados uma vez por dia para evitar a acumulação de grafite nos elétrodos. Se necessário, as secções de tecido podem ser removidas dos seus poços de cultura para expelir quaisquer bolhas de ar que possam ter caído sob elas. Para as condições de tratamento MT, T3/Dex foi adicionado fresco a cada troca de meio com 100 nM de T3 e 1 μM de Dex. Os dispositivos CTCM foram cultivados numa incubadora a 37 °C e 5% de CO2.
Para obter trajetórias alongadas de fatias de coração, um sistema de câmera especial foi desenvolvido. Uma câmera SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tóquio, Japão) foi usada com uma lente macro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, São Francisco, CA). A visualização foi realizada em temperatura ambiente após a substituição do meio por meio novo. A câmera é posicionada em um ângulo de 51° e o vídeo é gravado a 30 quadros por segundo. Primeiro, um software de código aberto (MUSCLEMOTION43) foi usado com Image-J para quantificar o movimento das fatias de coração. A máscara foi criada usando MATLAB (MathWorks, Natick, MA, EUA) para definir regiões de interesse para fatias de coração batendo para evitar ruído. Máscaras segmentadas manualmente são aplicadas a todas as imagens em uma sequência de quadros e então passadas para o plug-in MUSCLEMOTION. O Muscle Motion usa a intensidade média dos pixels em cada quadro para quantificar seu movimento em relação ao quadro de referência. Os dados foram registrados, filtrados e utilizados para quantificar o tempo do ciclo e avaliar o estiramento do tecido durante o ciclo cardíaco. O vídeo gravado foi pós-processado utilizando um filtro digital de fase zero de primeira ordem. Para quantificar o estiramento do tecido (pico a pico), foi realizada uma análise pico a pico para distinguir entre picos e vales no sinal registrado. Além disso, a remoção de tendência é realizada utilizando um polinômio de 6ª ordem para eliminar o desvio do sinal. O código do programa foi desenvolvido em MATLAB para determinar o movimento global do tecido, o tempo do ciclo, o tempo de relaxamento e o tempo de contração (Código do Programa Suplementar 44).
Para a análise de deformação, utilizando os mesmos vídeos criados para a avaliação do alongamento mecânico, traçamos inicialmente duas imagens representando os picos de movimento (os pontos mais alto (superior) e mais baixo (inferior) do movimento) de acordo com o software MUSCLEMOTION. Em seguida, segmentamos as regiões do tecido e aplicamos um algoritmo de sombreamento ao tecido segmentado (Fig. 2a suplementar). O tecido segmentado foi então dividido em dez subsuperfícies, e a tensão em cada superfície foi calculada utilizando a seguinte equação: Deformação = (Sup-Sdown)/Sdown, onde Sup e Sdown são as distâncias da forma às sombras superior e inferior do tecido, respectivamente (Fig. 2b suplementar).
Cortes cardíacos foram fixados em paraformaldeído a 4% por 48 horas. Os tecidos fixados foram desidratados em sacarose a 10% e 20% por 1 h e, em seguida, em sacarose a 30% durante a noite. Os cortes foram então incluídos em composto para temperatura de corte ideal (composto OCT) e congelados gradualmente em um banho de isopentano/gelo seco. Os blocos de inclusão OCT foram armazenados a -80 °C até a separação. As lâminas foram preparadas como cortes com espessura de 8 μm.
Para remover a OCT de cortes cardíacos, aqueça as lâminas em um bloco de aquecimento a 95 °C por 5 minutos. Adicione 1 ml de PBS a cada lâmina e incube por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, permeie as lâminas colocando Triton-X a 0,1% em PBS por 15 minutos em temperatura ambiente. Para evitar que anticorpos não específicos se liguem à amostra, adicione 1 ml de solução de BSA a 3% às lâminas e incube por 1 hora em temperatura ambiente. O BSA foi então removido e as lâminas foram lavadas com PBS. Marque cada amostra com um lápis. Anticorpos primários (diluídos 1:200 em 1% BSA) (conexina 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) e troponina-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) foram adicionados ao longo de 90 minutos, então anticorpos secundários (diluídos 1:200 em 1% BSA) contra Alexa Fluor 488 de camundongo (Thermo Scientific; #A16079), contra Alexa Fluor 594 de coelho (Thermo Scientific; #T6391) por mais 90 minutos. Lavados 3 vezes com PBS Para distinguir a coloração alvo da de fundo, usamos apenas o anticorpo secundário como controle. Finalmente, a coloração nuclear DAPI foi adicionada e as lâminas foram colocadas em um vectashield (Vector Laboratories) e seladas com esmalte de unha. ampliação de -x) e microscópio Keyence com ampliação de 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) a 5 μg/ml em PBS foi utilizado para a coloração WGA e aplicado às secções fixadas durante 30 minutos à temperatura ambiente. As lâminas foram então lavadas com PBS e negro de Sudão foi adicionado a cada lâmina e incubadas durante 30 minutos. As lâminas foram então lavadas com PBS e o meio de inclusão Vectashield foi adicionado. As lâminas foram visualizadas num microscópio Keyence com ampliação de 40x.
O OCT foi removido das amostras conforme descrito acima. Após a remoção do OCT, mergulhe as lâminas na solução de Bouin durante a noite. As lâminas foram então enxaguadas com água destilada por 1 hora e então colocadas em uma solução de fucsina ácida de aloe Bibrich por 10 minutos. Então as lâminas foram lavadas com água destilada e colocadas em uma solução de 5% de fosfomolibdênio/5% de ácido fosfotúngstico por 10 minutos. Sem enxaguar, transfira as lâminas diretamente para a solução de azul de anilina por 15 minutos. Então as lâminas foram lavadas com água destilada e colocadas em uma solução de ácido acético a 1% por 2 minutos. As lâminas foram secas em etanol 200 N e transferidas para xileno. As lâminas coradas foram visualizadas usando um microscópio Keyence com uma objetiva de 10x. A porcentagem da área de fibrose foi quantificada usando o software Keyence Analyzer.
Ensaio de Viabilidade Celular CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), número de catálogo V13154, de acordo com o protocolo do fabricante, com algumas modificações. Em particular, um punch cirúrgico com diâmetro de 6 mm foi utilizado para garantir tamanho uniforme do tecido durante a análise de MTT. Os tecidos foram semeados individualmente nos poços de uma placa de 12 poços contendo substrato de MTT, de acordo com o protocolo do fabricante. As secções são incubadas a 37 °C durante 3 horas e o tecido vivo metaboliza o substrato de MTT para formar um composto de formazano roxo. Substituir a solução de MTT por 1 ml de DMSO e incubar a 37 °C durante 15 minutos para extrair a formazana roxa das secções cardíacas. As amostras foram diluídas 1:10 em DMSO em placas de fundo transparente de 96 poços e a intensidade da cor roxa foi medida a 570 nm utilizando um leitor de placas Cytation (BioTek). As leituras foram normalizadas para o peso de cada fatia do coração.
O meio de corte do coração foi substituído por meio contendo 1 μCi/ml de [5-3H]-glicose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, EUA) para o ensaio de utilização de glicose, conforme descrito anteriormente. Após 4 horas de incubação, adicionar 100 μL de meio a um tubo de microcentrífuga aberto contendo 100 μL de HCl 0,2 N. Em seguida, o tubo foi colocado em um tubo de cintilação contendo 500 μL de dH₂O para evaporar [3H]₂O por 72 horas a 37 °C. Em seguida, remover o tubo de microcentrífuga do tubo de cintilação e adicionar 10 ml de fluido de cintilação. As contagens de cintilação foram realizadas utilizando um analisador de cintilação líquida Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, EUA). A utilização de glicose foi então calculada levando em consideração a atividade específica da [5-3H]-glicose, o equilíbrio incompleto e o fundo, a diluição de [5-3H]-glicose não marcada e a eficiência do contador de cintilação. Os dados são normalizados para a massa das seções do coração.
Após a homogeneização do tecido em Trizol, o RNA foi isolado de cortes cardíacos utilizando o kit Qiagen miRNeasy Micro Kit nº 210874, de acordo com o protocolo do fabricante. A preparação da biblioteca de RNAsec, o sequenciamento e a análise dos dados foram realizados da seguinte forma:
1 μg de RNA por amostra foi usado como material de partida para a preparação da biblioteca de RNA. As bibliotecas de sequenciamento foram geradas usando o kit de preparação de bibliotecas de RNA NEBNext UltraTM para Illumina (NEB, EUA), seguindo as recomendações do fabricante, e códigos de índice foram adicionados às sequências de atributos para cada amostra. Resumidamente, o mRNA foi purificado a partir do RNA total usando esferas magnéticas fixadas com oligonucleotídeos poli-T. A fragmentação é realizada usando cátions divalentes em alta temperatura no tampão de reação de síntese de primeira fita NEBNext (5X). O cDNA da primeira fita foi sintetizado usando primers hexâmeros aleatórios e transcriptase reversa M-MuLV (RNase H-). O cDNA da segunda fita é então sintetizado usando DNA polimerase I e RNase H. As saliências restantes são convertidas em extremidades rombas pela atividade de exonuclease/polimerase. Após a adenilação da extremidade 3' do fragmento de DNA, um adaptador NEBNext com uma estrutura de alça em grampo de cabelo é anexado a ele para prepará-lo para hibridização. Para a seleção de fragmentos de cDNA com comprimento preferencial de 150-200 pb, os fragmentos da biblioteca foram purificados usando o sistema AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, EUA). Em seguida, 3 μl da enzima USER (NEB, EUA) com cDNA de tamanho selecionado ligado a um adaptador foram usados ​​por 15 minutos a 37 °C e, em seguida, por 5 minutos a 95 °C antes da PCR. A PCR foi então realizada usando a DNA polimerase Phusion High-Fidelity, primers universais para PCR e primers Index (X). Finalmente, os produtos da PCR foram purificados (sistema AMPure XP) e a qualidade da biblioteca foi avaliada em um sistema Agilent Bioanalyzer 2100. A biblioteca de cDNA foi então sequenciada usando um sequenciador Novaseq. Os arquivos de imagem bruta da Illumina foram convertidos em leituras brutas usando o CASAVA Base Calling. Os dados brutos são armazenados em arquivos no formato FASTQ(fq) que contêm sequências de leitura e qualidades de base correspondentes. Selecione HISAT2 para corresponder as leituras de sequenciamento filtradas ao genoma de referência Sscrofa11.1. Em geral, o HISAT2 suporta genomas de qualquer tamanho, incluindo genomas com mais de 4 bilhões de bases, e valores padrão são definidos para a maioria dos parâmetros. Leituras de splicing de dados de sequenciamento de RNA podem ser alinhadas com eficiência usando o HISAT2, o sistema mais rápido disponível atualmente, com a mesma ou melhor precisão do que qualquer outro método.
A abundância de transcritos reflete diretamente o nível de expressão gênica. Os níveis de expressão gênica são avaliados pela abundância de transcritos (contagem de sequenciamento) associados ao genoma ou aos éxons. O número de leituras é proporcional aos níveis de expressão gênica, comprimento do gene e profundidade do sequenciamento. FPKM (fragmentos por mil pares de bases de transcritos sequenciados por milhão de pares de bases) foram calculados e os valores de P da expressão diferencial foram determinados usando o pacote DESeq2. Em seguida, calculamos a taxa de falsa descoberta (FDR) para cada valor de P usando o método Benjamini-Hochberg9 com base na função R integrada "p.adjust".
O RNA isolado de secções cardíacas foi convertido em cDNA a uma concentração de 200 ng/μl utilizando a mistura SuperScript IV Vilo Master da Thermo (Thermo, cat. n.º 11756050). A RT-PCR quantitativa foi realizada utilizando uma placa de reação transparente Applied Biosystems Endura Plate Microamp de 384 poços (Thermo, cat. n.º 4483319) e adesivo óptico Microamp (Thermo, cat. n.º 4311971). A mistura de reação consistiu em 5 µl de mistura Taqman Fast Advanced Master (Thermo, cat. n.º 4444557), 0,5 µl de Taqman Primer e 3,5 µl de H2O misturados por poço. Ciclos de qPCR padrão foram realizados e os valores de CT foram medidos utilizando um instrumento de PCR em tempo real Applied Biosystems Quantstudio 5 (módulo de 384 poços; produto n.º A28135). Os primers Taqman foram adquiridos da Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) Os valores de CT de todas as amostras foram normalizados para o gene de manutenção GAPDH.
A liberação de NT-ProBNP no meio foi avaliada usando o kit NT-ProBNP (pig) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, 250 µl de cada amostra e padrão foram adicionados em duplicata a cada poço. Imediatamente após a adição da amostra, adicione 50 µl do Reagente de Ensaio A a cada poço. Agite suavemente a placa e sele com selante. Em seguida, os comprimidos foram incubados a 37 °C por 1 hora. Em seguida, aspire a solução e lave os poços 4 vezes com 350 µl de solução de lavagem 1X, incubando a solução de lavagem por 1 a 2 minutos de cada vez. Em seguida, adicione 100 µl do Reagente de Ensaio B por poço e sele com selante de placa. O comprimido foi agitado suavemente e incubado a 37 °C por 30 minutos. Aspirar a solução e lavar os poços 5 vezes com 350 µl de solução de lavagem 1X. Adicionar 90 µl de solução de substrato a cada poço e selar a placa. Incubar a placa a 37 °C por 10 a 20 minutos. Adicionar 50 µl de solução de parada a cada poço. A placa foi imediatamente medida usando um leitor de placas Cytation (BioTek) ajustado para 450 nm.
Foram realizadas análises de potência para escolher os tamanhos de grupo que fornecerão >80% de potência para detectar uma mudança absoluta de 10% no parâmetro com uma taxa de erro Tipo I de 5%. Foram realizadas análises de potência para escolher os tamanhos de grupo que fornecerão >80% de potência para detectar uma mudança absoluta de 10% no parâmetro com uma taxa de erro Tipo I de 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% isolamento absoluto parâmetro com 5% do valor do tipo I. A análise de potência foi realizada para selecionar tamanhos de grupo que forneceriam >80% de potência para detectar 10% de mudança absoluta de parâmetro com uma taxa de erro Tipo I de 5%.进行功效分析以选择将提供> 80%.进行功效分析以选择将提供> 80%. Você provavelmente terá uma análise de quantidade suficiente para seus grupos de trabalho, o que significa que você terá mais de 80% de energia para uso 10% de isenção gratuita parâmetros e 5% частоты ошибок типа I. Uma análise de potência foi realizada para selecionar um tamanho de grupo que forneceria >80% de potência para detectar 10% de mudança absoluta de parâmetro e 5% de taxa de erro tipo I.Cortes de tecido foram selecionados aleatoriamente antes do experimento. Todas as análises foram cegas em relação à condição e as amostras foram decodificadas somente após a análise de todos os dados. O software GraphPad Prism (San Diego, CA) foi utilizado para realizar todas as análises estatísticas. Para todas as estatísticas, os valores de p foram considerados significativos em valores <0,05. Para todas as estatísticas, os valores de p foram considerados significativos em valores < 0,05. Para suas estatísticas, p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Para todas as estatísticas, os valores de p foram considerados significativos em valores < 0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Para suas estatísticas, p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Para todas as estatísticas, os valores de p foram considerados significativos em valores < 0,05.O teste t de Student bicaudal foi realizado nos dados com apenas duas comparações. ANOVA unidirecional ou bidirecional foi utilizada para determinar a significância entre os múltiplos grupos. Ao realizar os testes post hoc, a correção de Tukey foi aplicada para levar em conta as comparações múltiplas. Os dados de RNAsec têm considerações estatísticas especiais ao calcular o FDR e o ajuste de p, conforme descrito na seção Métodos.
Para mais informações sobre o desenho do estudo, consulte o resumo do Nature Research Report vinculado a este artigo.