Nature.comን ስለጎበኙ እናመሰግናለን። የሚጠቀሙበት የአሳሽ ስሪት የተወሰነ የCSS ድጋፍ አለው። ለተሻለ ተሞክሮ፣ የዘመነ አሳሽ እንዲጠቀሙ እንመክራለን (ወይም በኢንተርኔት ኤክስፕሎረር ውስጥ የተኳኋኝነት ሁነታን እንዲያሰናክሉ)። ይህ በእንዲህ እንዳለ፣ ቀጣይነት ያለው ድጋፍ ለማረጋገጥ፣ ጣቢያውን ያለ ቅጦች እና ጃቫስክሪፕት እናቀርባለን።
የልብን የፊዚዮሎጂ አካባቢ በትክክል ለመድኃኒት ምርመራ ማባዛት የሚችል አስተማማኝ የብልቃጥ ስርዓት ያስፈልጋል። የሰው ልጅ የልብ ቲሹ ባህል ስርዓቶች ውስንነት የልብ መድሃኒት ተፅእኖዎችን በትክክል እንዲተረጉሙ አድርጓል። እዚህ፣ የልብ ቁርጥራጮችን በኤሌክትሮሜካኒካል መንገድ የሚያነቃቃ እና የልብ ዑደት ሲስቶሊክ እና ዲያስቶሊክ ደረጃዎች ወቅት ፊዚዮሎጂያዊ ዝርጋታ የሚያልፍ የልብ ቲሹ ባህል ሞዴል (CTCM) አዘጋጅተናል። ከ12 ቀናት ባህል በኋላ፣ ይህ አካሄድ የልብ ክፍሎችን ህያውነት በከፊል አሻሽሏል፣ ነገር ግን መዋቅራዊ አቋማቸውን ሙሉ በሙሉ አላስጠበቀም። ስለዚህ፣ አነስተኛ ሞለኪውል ምርመራ ከተደረገ በኋላ፣ 100 nM ትሪዮዶታይሮኒን (T3) እና 1 μM ዴክሳሜታሶን (Dex) ወደ መካከለኛችን መጨመር የክፍሎቹን ማይክሮ መዋቅር ለ12 ቀናት እንደጠበቀ ደርሰንበታል። ከT3/Dex ህክምና ጋር በማጣመር፣ የCTCM ስርዓት የትራንስክሪፕሽን መገለጫዎችን፣ ህያውነትን፣ የሜታቦሊክ እንቅስቃሴን እና መዋቅራዊ ታማኝነትን ለ12 ቀናት ከትኩስ የልብ ቲሹ ጋር በተመሳሳይ ደረጃ ጠብቆ ቆይቷል። በተጨማሪም፣ በባህል ውስጥ የልብ ሕብረ ሕዋስ ከመጠን በላይ መዘርጋት ከፍተኛ የደም ግፊት ምልክትን ያስከትላል፣ ይህም የሲቲኤም የልብ ዝርጋታ የሚፈጠረውን ከፍተኛ የደም ግፊት ሁኔታዎችን የመምሰል ችሎታን ያሳያል። በማጠቃለያ፣ ሲቲኤም በባህል ውስጥ የልብን ፊዚዮሎጂ እና የፓቶፊዚዮሎጂን በረጅም ጊዜ ውስጥ ሞዴል ማድረግ ይችላል፣ ይህም አስተማማኝ የመድኃኒት ምርመራ ያስችላል።
ክሊኒካዊ ምርምር ከመደረጉ በፊት፣ የሰውን ልብ የፊዚዮሎጂ አካባቢ በትክክል ሊባዙ የሚችሉ አስተማማኝ የኢንቪትሮ ሲስተምስ ያስፈልጋል። እንደዚህ ያሉ ስርዓቶች የተለወጠውን ሜካኒካል ዝርጋታ፣ የልብ ምት እና የኤሌክትሮፊዚዮሎጂ ባህሪያትን መምሰል አለባቸው። የእንስሳት ሞዴሎች በተለምዶ የልብ ፊዚዮሎጂን ለማጣሪያ መድረክ ሆነው ያገለግላሉ፤ ይህም በሰው ልብ ውስጥ ያሉትን መድኃኒቶች ተፅእኖ በማንፀባረቅ ውስን አስተማማኝነት ያለው ነው።1,2. በመጨረሻም፣ ተስማሚ የልብ ቲሹ ባህል የሙከራ ሞዴል (CTCM) በጣም ስሜታዊ እና ለተለያዩ የሕክምና እና የመድኃኒት ጣልቃገብነቶች የተወሰነ ሞዴል ሲሆን የሰውን ልብ ፊዚዮሎጂ እና ፓቶፊዚዮሎጂ በትክክል የሚያራምድ ነው።3. እንዲህ ዓይነቱ ሥርዓት አለመኖር ለልብ ድካም አዳዲስ ሕክምናዎችን ማግኘትን ይገድባል4,5 እና የመድኃኒት ካርዲዮቶክሲክነትን ከገበያ ለመውጣት እንደ ዋና ምክንያት አድርጎታል።6.
ባለፉት አስርት ዓመታት ውስጥ ስምንት የልብና የደም ሥር ያልሆኑ መድኃኒቶች ከክሊኒካዊ አጠቃቀም ተወግደዋል ምክንያቱም የQT የጊዜ ማራዘሚያ ወደ ventricular arrhythmias እና ድንገተኛ ሞት ያስከትላል። ስለዚህ የልብና የደም ሥር (cardiovascular) ውጤታማነትን እና መርዛማነትን ለመገምገም አስተማማኝ የቅድመ ክሊኒካዊ የማጣሪያ ስልቶች አስፈላጊነት እየጨመረ መጥቷል። በቅርቡ በሰው ሰራሽ ምክንያት የሚመጣ ፕሉሪፖተንት ስቴም ሴል-ዲሪቬትድ ካርዲዮሚዮሳይት (hiPS-CM) በመድኃኒት ምርመራ እና በመርዛማነት ምርመራ ውስጥ መጠቀሙ ለዚህ ችግር ከፊል መፍትሄ ይሰጣል። ሆኖም፣ የhiPS-CMs ያልበሰለ ባህሪ እና የልብ ሕብረ ሕዋስ ባለብዙ ሴል ውስብስብነት አለመኖር የዚህ ዘዴ ዋና ዋና ገደቦች ናቸው። የቅርብ ጊዜ ጥናቶች እንደሚያሳዩት ይህ ገደብ ድንገተኛ መኮማተር ከጀመረ በኋላ ብዙም ሳይቆይ የልብ ሕብረ ሕዋስ ሃይድሮጄሎችን ለመፍጠር እና ከጊዜ ወደ ጊዜ ቀስ በቀስ የኤሌክትሪክ ማነቃቂያን በመጨመር ቀደምት የhiPS-CM በመጠቀም በከፊል ሊወገድ ይችላል። ሆኖም፣ እነዚህ የhiPS-CM ማይክሮቲስቶች የአዋቂዎች ማዮካርዲየም የበሰለ ኤሌክትሮፊዚዮሎጂ እና የኮንትራክቲቭ ባህሪያት የላቸውም። በተጨማሪም፣ የሰው የልብ ሕብረ ሕዋስ የበለጠ ውስብስብ መዋቅር አለው፣ ይህም የኢንዶቴልያል ሴሎችን፣ የነርቭ ሴሎችን እና የስትሮማል ፋይብሮብላስትን ጨምሮ የተለያዩ የሴል ዓይነቶችን የተለያዩ ድብልቅ ያካትታል፣ እነዚህም በተወሰኑ የሴሎች ውጭ ያሉ ማትሪክስ ፕሮቲኖች ስብስቦች የተገናኙ ናቸው። ይህ በአዋቂ አጥቢ እንስሳት ልብ ውስጥ የልብ ያልሆኑ የደም ሴሎች ቁጥር 11,12,13 ልዩነት መኖሩ የልብ ሕብረ ሕዋሳትን በግለሰብ የሴል ዓይነቶች በመጠቀም ለመቅረጽ ትልቅ እንቅፋት ነው። እነዚህ ዋና ዋና ገደቦች በፊዚዮሎጂ እና በፓቶሎጂ ሁኔታዎች ውስጥ ያልተቋረጡ የልብ ጡንቻ ሕብረ ሕዋሳትን ለማዳበር ዘዴዎችን ማዘጋጀት አስፈላጊ መሆኑን ያጎላሉ።
የተለማመዱ ቀጭን (300 µm) የሰው ልብ ክፍሎች ያልተነካ የሰው ማዮካርዲየም ተስፋ ሰጪ ሞዴል መሆናቸውን አረጋግጠዋል። ይህ ዘዴ ከሰው ልብ ሕብረ ሕዋስ ጋር ተመሳሳይ የሆነ የተሟላ ባለ 3-ልኬት ባለብዙ ሕዋስ ስርዓት መዳረሻ ይሰጣል። ሆኖም ግን፣ እስከ 2019 ድረስ፣ የተለማመዱ የልብ ክፍሎች አጠቃቀም በአጭር (24 ሰዓታት) የባህል ህልውና የተገደበ ነበር። ይህ የሆነበት ምክንያት አካላዊ-ሜካኒካል ዝርጋታ አለመኖር፣ የአየር-ፈሳሽ በይነገጽ እና የልብ ሕብረ ሕዋስ ፍላጎቶችን የማይደግፉ ቀላል ሚዲያዎችን መጠቀምን ጨምሮ በርካታ ምክንያቶች በመኖራቸው ነው። በ2019፣ በርካታ የምርምር ቡድኖች ሜካኒካል ምክንያቶችን በልብ ሕብረ ሕዋስ ባህል ስርዓቶች ውስጥ ማካተት የባህል ህይወትን ማራዘም፣ የልብ አገላለጽን ማሻሻል እና የልብ ፓቶሎጂን መምሰል እንደሚችል አሳይተዋል። ሁለት የሚያምሩ ጥናቶች 17 እና 18 እንደሚያሳዩት የአንድዮሽ ሜካኒካዊ ጭነት በባህል ወቅት በልብ phenotype ላይ አዎንታዊ ተጽእኖ እንዳለው ያሳያሉ። ሆኖም፣ እነዚህ ጥናቶች የልብ ዑደት ተለዋዋጭ ባለ ሶስት አቅጣጫዊ ፊዚኮ-ሜካኒካል ጭነትን አልተጠቀሙም፣ ምክንያቱም የልብ ክፍሎች በኢሶሜትሪክ የመለጠጥ ኃይሎች 17 ወይም በመስመራዊ ኦክሶቶኒክ ጭነት 18 ተጭነዋል። እነዚህ የቲሹ ዝርጋታ ዘዴዎች ብዙ የልብ ጂኖችን መጨቆን ወይም ከተለመዱት የዝርጋታ ምላሾች ጋር የተያያዙ የጂኖችን ከመጠን በላይ መጋለጥ አስከትለዋል። በተለይም ፒቱሊስ እና ሌሎች 19 የልብ ዑደት መልሶ ግንባታን ለማድረግ የኃይል ማስተላለፊያ ግብረመልስ እና የውጥረት ድራይቮችን በመጠቀም ተለዋዋጭ የልብ ቁራጭ ባህል መታጠቢያ አዘጋጅተዋል። ምንም እንኳን ይህ ስርዓት የበለጠ ትክክለኛ የሆነ የልብ ዑደት ሞዴሊንግ ቢፈቅድም፣ የስልቱ ውስብስብነት እና ዝቅተኛ ውፅዓት የዚህን ስርዓት አተገባበር ይገድባል። ላቦራቶሪያችን በቅርቡ የኤሌክትሪክ ማነቃቂያ እና የአሳማ እና የሰው ልብ ቲሹ ክፍሎች እስከ 6 ቀናት ድረስ ህያውነትን ለመጠበቅ የሚያስችል የተመቻቸ መካከለኛ በመጠቀም ቀለል ያለ የባህል ስርዓት አዘጋጅቷል።20,21
በአሁኑ ጽሑፍ ውስጥ፣ የልብ ቲሹ ባህል ሞዴል (CTCM) በልብ ዑደት ውስጥ ባለ ሶስት አቅጣጫዊ የልብ ፊዚዮሎጂ እና የፓቶፊዚዮሎጂ መስፋፋትን ለማጠቃለል የሂሞራል ምልክቶችን የሚያካትት የአሳማ ልብ ክፍሎችን በመጠቀም እንገልፃለን። ይህ ሲቲሲኤም ወጪ ቆጣቢ፣ መካከለኛ የልብ ምት ስርዓት በማቅረብ የቅድመ-ክሊኒካዊ መድሃኒት ትንበያ ትክክለኛነትን ከዚህ በፊት ታይቶ በማይታወቅ ደረጃ ሊጨምር ይችላል፣ ይህም ለቅድመ-ክሊኒካዊ የመድኃኒት ምርመራ የአጥቢ እንስሳት ልብ ፊዚዮሎጂ/ፓቶፊዚዮሎጂን ያስመስላል።
የሂሞዳይናሚክ ሜካኒካል ሲግናሎች የልብ ጡንቻን ተግባር በብልቃጥ 22,23,24 ውስጥ በመጠበቅ ረገድ ወሳኝ ሚና ይጫወታሉ። በአሁኑ ጽሑፍ ውስጥ፣ በፊዚዮሎጂያዊ ድግግሞሽ (1.2 Hz፣ በደቂቃ 72 ምቶች) የኤሌክትሪክ እና የሜካኒካል ማነቃቂያዎችን በማስነሳት የአዋቂዎችን የልብ አካባቢ መምሰል የሚችል ሲቲሲኤም (ምስል 1a) አዘጋጅተናል። በዲያስቶል ወቅት ከመጠን በላይ የቲሹ መዘርጋትን ለማስወገድ፣ የቲሹ መጠንን በ25% ለመጨመር የ3-ልኬት ማተሚያ መሳሪያ ጥቅም ላይ ውሏል (ምስል 1ለ)። በሲ-ፒኤሲ ሲስተም የሚፈጠረው የኤሌክትሪክ ፍጥነት የልብ ዑደትን ሙሉ በሙሉ ለማባዛት የውሂብ ማግኛ ስርዓትን በመጠቀም ከሲስቶል በፊት 100 ms እንዲጀምር ጊዜ ተሰጥቶታል። የቲሹ ባህል ስርዓት በላይኛው ክፍል ውስጥ የልብ ቁርጥራጮች እንዲስፋፉ ለማድረግ በፕሮግራም ሊሰራ የሚችል የሳንባ ምች አክቲቬተር (LB Engineering, Germany) ይጠቀማል። ስርዓቱ በግፊት ትራንስዱሰር በኩል ከውጭ የአየር መስመር ጋር የተገናኘ ሲሆን ይህም ግፊቱን (± 1 mmHg) እና ጊዜ (± 1 ms) በትክክል ማስተካከል አስችሏል (ምስል 1c)።
a የቲሹን ክፍል በሰማያዊ ከሚታየው የ7 ሚሜ የድጋፍ ቀለበት ጋር በመሳሪያው የባህል ክፍል ውስጥ ያያይዙት። የባህል ክፍሉ ከአየር ክፍሉ በቀጭን ተለዋዋጭ የሲሊኮን ሽፋን ተለያይቷል። መፍሰስን ለመከላከል በእያንዳንዱ ክፍል መካከል ጋኬት ያስቀምጡ። የመሳሪያው ክዳን የኤሌክትሪክ ማነቃቂያ የሚሰጡ የግራፋይት ኤሌክትሮዶችን ይዟል። b የትልቁን የቲሹ መሳሪያ ንድፍ ውክልና፣ የመሪ ቀለበት እና የድጋፍ ቀለበት። የቲሹ ክፍሎች (ቡናማ) በትልቁ መሳሪያ ላይ የተቀመጡ ሲሆን የመሪ ቀለበት በመሳሪያው ውጫዊ ጠርዝ ላይ ባለው ጎድጎድ ውስጥ ይቀመጣል። መመሪያውን በመጠቀም፣ በቲሹ አክሬሊክስ ማጣበቂያ የተሸፈነውን የድጋፍ ቀለበት በልብ ቲሹ ክፍል ላይ በጥንቃቄ ያስቀምጡ። c የኤሌክትሪክ ማነቃቂያ ጊዜን የሚያሳይ ግራፍ በፕሮግራም በሚሰራ የሳንባ ምች አክቲቬተር (PPD) የሚቆጣጠረው የአየር ክፍል ግፊት ተግባር ነው። የውሂብ ማግኛ መሳሪያ የግፊት ዳሳሾችን በመጠቀም የኤሌክትሪክ ማነቃቂያን ለማመሳሰል ጥቅም ላይ ውሏል። በባህል ክፍሉ ውስጥ ያለው ግፊት ወደተቀመጠው ገደብ ሲደርስ፣ የኤሌክትሪክ ማነቃቂያን ለማስነሳት የ pulse ምልክት ወደ C-PACE-EM ይላካል። d በ incubator መደርደሪያ ላይ የተቀመጡ አራት ሲቲሲኤምዎች ምስል። አራት መሳሪያዎች በአየር ግፊት ዑደት በኩል ከአንድ PPD ጋር የተገናኙ ሲሆን የግፊት ዳሳሾች ደግሞ በአየር ግፊት ዑደት ውስጥ ያለውን ግፊት ለመከታተል ወደ ሄሞስታቲክ ቫልቭ ውስጥ ይገባሉ። እያንዳንዱ መሳሪያ ስድስት የቲሹ ክፍሎችን ይይዛል።
አንድ የአየር ግፊት አክቲቬተር በመጠቀም፣ እያንዳንዳቸው 6 የቲሹ ክፍሎችን መያዝ የሚችሉ አራት የሲቲሲኤም መሳሪያዎችን መቆጣጠር ችለናል (ምስል 1መ)። በሲቲሲኤም ውስጥ፣ በአየር ክፍሉ ውስጥ ያለው የአየር ግፊት በፈሳሽ ክፍሉ ውስጥ ወደ ተመሳሳይ ግፊት ይቀየራል እና የልብ ቁራጭ ፊዚዮሎጂያዊ መስፋፋትን ያስከትላል (ምስል 2a እና ተጨማሪ ፊልም 1)። በ80 ሚሜ ኤችጂ ላይ የቲሹ ዝርጋታ ግምገማ። ስነጥበብ የቲሹ ክፍሎችን መዘርጋት በ25% አሳይቷል (ምስል 2ለ)። ይህ የመቶኛ ዝርጋታ ለመደበኛ የልብ ክፍል መኮማተር 17,19,25 ከ2.2-2.3 µm የፊዚዮሎጂካል ሳርኮሜሬ ርዝመት ጋር እንደሚዛመድ ታይቷል። የቲሹ እንቅስቃሴ የተገመገመው ብጁ የካሜራ ቅንብሮችን በመጠቀም ነው (ተጨማሪ ምስል 1)። የቲሹ እንቅስቃሴ ስፋት እና ፍጥነት (ምስል 2ሐ፣ መ) በልብ ዑደት ወቅት ከመዘርጋት እና በሲስቶል እና ዲያስቶል ወቅት ካለው ጊዜ ጋር ይዛመዳል (ምስል 2ለ)። በመኮማተር እና በመዝናናት ወቅት የልብ ቲሹ መዘርጋት እና ፍጥነት በባህል ውስጥ ለ12 ቀናት ቋሚ ሆኖ ቆይቷል (ምስል 2f)። በባህል ወቅት የኤሌክትሪክ ማነቃቂያ በኮንትራክቲቭነት ላይ የሚያሳድረውን ተጽእኖ ለመገምገም፣ የጥላ ስልተ ቀመርን በመጠቀም ንቁ የሆነ የቅርጽ መዛባትን ለመወሰን የሚያስችል ዘዴ አዘጋጅተናል (ተጨማሪ ምስል 2a፣ ለ) እና በኤሌክትሪክ ማነቃቂያ እና ያለእነሱ የአካል ጉድለቶች መካከል ያለውን ልዩነት መለየት ችለናል። ተመሳሳይ የልብ ክፍል (ምስል 2f)። በተቆረጠው ተንቀሳቃሽ ክልል (R6-9)፣ በኤሌክትሪክ ማነቃቂያ ወቅት ያለው ቮልቴጅ የኤሌክትሪክ ማነቃቂያ ከሌለ በ20% ከፍ ያለ ነበር፣ ይህም የኤሌክትሪክ ማነቃቂያ ለኮንትራክቲቭ ተግባር ያለውን አስተዋጽኦ ያሳያል።
የአየር ክፍል ግፊት፣ የፈሳሽ ክፍል ግፊት እና የቲሹ እንቅስቃሴ መለኪያዎች የሚወክሉ ምልክቶች የክፍል ግፊት የፈሳሽ ክፍል ግፊትን እንደሚቀይር እና የቲሹ ቁራጭ ተጓዳኝ እንቅስቃሴን እንደሚያመጣ ያረጋግጣሉ። ለ የቲሹ ክፍሎች መቶኛ ዝርጋታ (ሰማያዊ) የሚወክሉ ምልክቶች ከመቶኛ ዝርጋታ (ብርቱካናማ) ጋር የሚዛመዱ። ሐ የልብ ክፍል የተለካው እንቅስቃሴ ከተለካው የእንቅስቃሴ ፍጥነት ጋር የሚጣጣም ነው። (መ) በልብ ቁራጭ ውስጥ የዑደት እንቅስቃሴ (ሰማያዊ መስመር) እና ፍጥነት (ብርቱካናማ ነጠብጣብ መስመር) የሚወክሉ አቅጣጫዎች። e የዑደት ጊዜ ብዛቱ (n = በቡድን 19 ቁርጥራጮች፣ ከተለያዩ አሳማዎች)፣ የመጨመቂያ ጊዜ (n = በቡድን 19 ቁርጥራጮች፣ ከተለያዩ አሳማዎች)፣ የቲሹ እንቅስቃሴ (n = 25)። ቁርጥራጮች)/ከተለያዩ አሳማዎች ቡድን)፣ ከፍተኛ የሲስቶሊክ ፍጥነት (n = 24(D0)፣ 25(D12) ቁርጥራጮች/ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች) እና ከፍተኛ የእረፍት መጠን (n=24(D0)፣ 25(D12) ቁርጥራጮች/ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች)። ባለ ሁለት ጭራ ተማሪ የቲ-ሙከራ በማንኛውም መለኪያ ላይ ምንም ጉልህ ልዩነት አላሳየም። ረ (ቀይ) እና (ሰማያዊ) የኤሌክትሪክ ማነቃቂያ የሌላቸው የቲሹ ክፍሎች ተወካይ የውጥረት ትንተና ዱካዎች፣ ከተመሳሳይ ክፍል አስር የቲሹ ክፍሎች የክልል ቦታዎች። የታችኛው ፓነሎች ከተለያዩ ክፍሎች በአስር አካባቢዎች የኤሌክትሪክ ማነቃቂያ ያላቸው እና የሌላቸው በቲሹ ክፍሎች ውስጥ ያለው የውጥረት መቶኛ ልዩነት መጠን ያሳያሉ። (n = ከተለያዩ አሳማዎች የተውጣጡ 8 ቁርጥራጮች/ቡድን፣ ባለ ሁለት ጭራ ተማሪ የቲ-ሙከራ ምርመራ ይካሄዳል፤ ****p < 0.0001፣ **p < 0.01፣ *p < 0.05)። (n = ከተለያዩ አሳማዎች የተውጣጡ 8 ቁርጥራጮች/ቡድን፣ ባለ ሁለት ጭራ ተማሪ የቲ-ሙከራ ምርመራ ይካሄዳል፤ ****p < 0.0001፣ **p < 0.01፣ *p < 0.05)። (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, **p<0,01. (n = ከተለያዩ አሳማዎች የተውጣጡ 8 ክፍሎች/ቡድን፣ ባለ ሁለት ጭራ ተማሪ የቲ-ሙከራ፤ ****p<0.0001፣ **p<0.01፣ *p<0.05)። （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, ** p <0,01, *p <0,05). (n = 8 ክፍሎች/ቡድን፣ ከተለያዩ አሳማዎች፣ ባለ ሁለት ጭራ ተማሪ የቲ-ሙከራ፤ ****p<0.0001፣ **p<0.01፣ *p<0.05)።የስህተት አሞሌዎች አማካይ ± መደበኛ መዛባትን ይወክላሉ።
በቀድሞው የማይንቀሳቀስ ባዮሚሜቲክ የልብ ቁራጭ ባህል ስርዓት [20፣ 21] ውስጥ፣ የኤሌክትሪክ ማነቃቂያን በመተግበር እና መካከለኛውን ስብጥር በማመቻቸት የልብ ቁርጥራጮችን ሕያውነት፣ ተግባር እና መዋቅራዊ ታማኝነት ለ6 ቀናት ጠብቀን ቆይተናል። ሆኖም፣ ከ10 ቀናት በኋላ፣ እነዚህ አሃዞች በከፍተኛ ሁኔታ ቀንሰዋል። በቀድሞው የማይንቀሳቀስ ባዮሚሜቲክ ባህል ስርዓታችን 20፣ 21 የቁጥጥር ሁኔታዎች (Ctrl) ውስጥ የተዳቀሉ ክፍሎችን እንጠቅሳለን እና ቀደም ሲል የተመቻቸ መካከለኛችንን እንደ MC ሁኔታዎች እና ባህል በተመሳሳይ ጊዜ ሜካኒካል እና ኤሌክትሪክ ማነቃቂያ (CTCM) ስር እንጠቀማለን። በመጀመሪያ፣ ያለኤሌክትሪክ ማነቃቂያ ሜካኒካል ማነቃቂያ የቲሹ ሕያውነትን ለ6 ቀናት ለመጠበቅ በቂ እንዳልሆነ ወስነናል (ተጨማሪ ምስል 3a፣ ለ)። የሚገርመው፣ የSTCMን በመጠቀም የፊዚዮ-ሜካኒካል እና የኤሌክትሪክ ማነቃቂያ በማስተዋወቅ፣ የ12-ቀን የልብ ክፍሎች ሕያውነት በMS ሁኔታዎች ስር እንደ ትኩስ የልብ ክፍሎች ተመሳሳይ ሆኖ ቆይቷል፣ ነገር ግን በMTT ትንተና እንደሚታየው በCtrl ሁኔታዎች ስር አይደለም (ምስል 1)። 3a)። ይህ የሚያመለክተው የልብ ዑደት ሜካኒካል ማነቃቂያ እና ማስመሰል የቲሹ ክፍሎች በቀድሞው የማይንቀሳቀስ ባህል ስርዓታችን ውስጥ ከተዘገበው በእጥፍ በላይ እንዲቆዩ ሊያደርግ እንደሚችል ነው። ይሁን እንጂ የልብ ትሮፖኒን ቲ እና ኮኔክሲን 43ን በክትባት መከላከያ ምልክት በማድረግ የቲሹ ክፍሎች መዋቅራዊ ታማኝነት ግምገማ እንደሚያሳየው የኮኔክሲን 43 አገላለጽ በቀን 12 በMC ቲሹዎች ውስጥ በተመሳሳይ ቀን ከነበሩት መቆጣጠሪያዎች በእጅጉ ከፍ ያለ ነበር። ሆኖም ግን፣ ወጥ የሆነ የኮኔክሲን 43 አገላለጽ እና የZ-ዲስክ ምስረታ ሙሉ በሙሉ አልተጠበቁም (ምስል 3ለ)። የቲሹ መዋቅራዊ ታማኝነት 26ን ለመለካት አርቲፊሻል ኢንተለጀንስ (AI) ማዕቀፍ እንጠቀማለን፣ ይህም በትሮፖኒን-ቲ እና ኮኔክሲን ስቴይንንግ43 ላይ የተመሠረተ ምስል ላይ የተመሠረተ ጥልቅ የመማሪያ ቧንቧ መስመር ሲሆን ይህም የልብ ቁርጥራጮችን መዋቅራዊ ታማኝነት እና ፍሎረሰንስን በራስ-ሰር በአካባቢያዊነት ጥንካሬ ለመለካት ነው። ይህ ዘዴ የልብ ቲሹ መዋቅራዊ ታማኝነት በራስ-ሰር እና ገለልተኛ በሆነ መንገድ በአስተማማኝ ሁኔታ ለመለካት ኮንቮሽናል ነርቭ ኔትወርክ (CNN) እና ጥልቅ የመማሪያ ማዕቀፍ ይጠቀማል። 26. የMC ቲሹ ከስታቲስቲክ ቁጥጥር ክፍሎች ጋር ሲነጻጸር ከቀን 0 ጋር የተሻሻለ መዋቅራዊ ተመሳሳይነት አሳይቷል። በተጨማሪም፣ የሜሰን ትሪክሮም ቀለም በ MS ሁኔታዎች ስር በባህል ቀን 12 ላይ ከቁጥጥር ሁኔታዎች ጋር ሲነፃፀር በእጅጉ ያነሰ የፋይብሮሲስ መቶኛ አሳይቷል (ምስል 3ሐ)። ሲቲሲኤም የልብ ቲሹ ክፍሎች ህያውነት ከትኩስ የልብ ቲሹ ጋር ተመሳሳይ ደረጃ ላይ ቢደርስም፣ የልብ ክፍሎችን መዋቅራዊ ትክክለኛነት በእጅጉ አላሻሻለም።
የባር ግራፍ ትኩስ የልብ ቁርጥራጮች (D0) ወይም የልብ ቁርጥራጮች ባህል ለ12 ቀናት በስታቲክ ባህል (D12 Ctrl) ወይም በCTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)፣ 15 (D12 Ctrl)፣ 12 (D12 MC) ቁርጥራጮች/ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች የተገኙ የኤምቲቲ ህያውነት መለኪያ ያሳያል፣ የANOVA ምርመራ በአንድ መንገድ ይከናወናል፤ ####p < 0.0001 ከD0 እና **p < 0.01 ከD12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)። የባር ግራፍ ትኩስ የልብ ቁርጥራጮች (D0) ወይም የልብ ቁርጥራጮች ባህል ለ12 ቀናት በስታቲክ ባህል (D12 Ctrl) ወይም በCTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)፣ 15 (D12 Ctrl)፣ 12 (D12 MC) ቁርጥራጮች/ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች የተገኙ የኤምቲቲ ህያውነትን መጠን ያሳያል፣ የANOVA ምርመራ በአንድ መንገድ ይከናወናል፤ ####p < 0.0001 ከD0 እና **p < 0.01 ከD12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)።ሂስቶግራም የኤምቲቲ ትኩስ የልብ ክፍሎች (D0) ወይም የልብ ክፍሎች ባህል በስታቲክ ባህል (D12 መቆጣጠሪያ) ወይም በሲቲኤም (D12 MC) (n = 18 (D0)፣ 15 (D12 መቆጣጠሪያ))፣ ከተለያዩ አሳማዎች የተገኙ 12 (D12 MC) ክፍሎች/ቡድኖች ውስጥ ለ12 ቀናት የመገኘት አቅምን ያሳያል፣ የአንድ አቅጣጫ የANOVA ምርመራ ይከናወናል፤####p <0,0001 по сравнению с D0 и **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl)። ####p < ከ D0 እና **p < 0.01 ከ D12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)። a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MT 活力的量化)፣来自不同猪的12 (D12 MC)相比፣####ገጽ <0.0001፣与D12 Ctrl 相比፣** p <0.01)። a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向አኖቫበስታቲክ ባህል (D12 መቆጣጠሪያ) ወይም በCTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)፣ 15 (D12 መቆጣጠሪያ))፣ ከተለያዩ አሳማዎች የተገኙ 12 (D12 MC) ክፍሎች/ቡድኖች፣ የአንድ አቅጣጫ ANOVA ምርመራ፣ የኤምቲቲ ህያውነት መለኪያን የሚያሳይ ሂስቶግራም፤####p <0,0001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < ከD0 ጋር ሲነጻጸር 0.0001፣ **p < 0.01 ከD12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)።ለ ትሮፖኒን-ቲ (አረንጓዴ)፣ ኮኔክሲን 43 (ቀይ) እና DAPI (ሰማያዊ) በአዲስ በተገለሉ የልብ ክፍሎች (D0) ወይም ለ12 ቀናት በማይለዋወጥ ሁኔታ (Ctrl) ወይም CTCM ሁኔታዎች (MC) ስር የተተከሉ የልብ ክፍሎች) ተወካይ የኢሚውኖፍሎረሰንስ ምስሎች (ባዶ ልኬት = 100 µm)። የልብ ሕብረ ሕዋስ መዋቅራዊ ታማኝነት (n = 7 (D0)፣ 7 (D12 Ctrl)፣ 5 (D12 MC) ቁርጥራጮች/ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች የተሰራ አርቲፊሻል ኢንተለጀንስ መለኪያ፣ የአንድ አቅጣጫ የANOVA ምርመራ ይካሄዳል፤ #####p < 0.0001 ከD0 እና ****p < 0.0001 ከD12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)። የልብ ሕብረ ሕዋስ መዋቅራዊ ታማኝነት (n = 7 (D0)፣ 7 (D12 Ctrl)፣ 5 (D12 MC) ቁርጥራጮች/ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች ጋር በመተባበር አርቲፊሻል ኢንተለጀንስ መለካት፣ የአንድ አቅጣጫ የANOVA ምርመራ ይካሄዳል፤ #####p < 0.0001 ከD0 እና ****p < 0.0001 ከD12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)። Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D15) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p <0,0001 сравнению с D0 D12 Ctrl)። የልብ ሕብረ ሕዋስ መዋቅራዊ ታማኝነት በአርቴፊሻል ኢንተለጀንስ (n = 7 (D0)፣ 7 (D12 Ctrl)፣ 5 (D12 MC) ክፍሎች/ቡድኖች ከተለያዩ አሳማዎች፣ የአንድ አቅጣጫ የANOVA ምርመራ ተካሂዷል፤ ####p < 0.0001 ከD0 እና ****p < 0.0001 ከD12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)።人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0)፣ 7 (D12 Ctrl)፣ 5 (D12 MC) እያንዳንዳቸው የተለያዩ የአሳማ ሥጋዎች/ቡድኖች፣ ባለአንድ መንገድ ANOVA ሙከራ፣#0#0相比፣****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0)፣ 7 (D12 Ctrl)፣ 5 (D12 MC) እያንዳንዳቸው የተለያዩ አሳማዎች ቁርጥራጭ/ቡድን፣ አንድ-መንገድ ANOVA ሙከራ፣ <1#0#0与D0相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比） Искусственый интеллект для количественой оценки структурной целостности сердечный ткани (n = 7 (D0), 7 (D0), 7 (D0), 7 (D0) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p <0,000 Ctrl)። የልብ ሕብረ ሕዋሳትን መዋቅራዊ ትክክለኛነት ለመለካት አርቲፊሻል ኢንተለጀንስ (n = 7 (D0)፣ 7 (D12 Ctrl)፣ 5 (D12 MC) የተለያዩ አሳማዎችን ክፍሎች/ቡድን ማድረግ፣ የአንድ አቅጣጫ ANOVA ምርመራ፤ ####p<0.0001 vs .D0 ለማነፃፀር ****p < 0.0001 ከ D12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)። ሐ በማሰን ትሪክሮም እድፍ የተለበሱ የልብ ቁርጥራጮችን የሚወክሉ ምስሎች (በስተግራ) እና መጠን (በስተቀኝ) (ስኬል ባሮ = 500 µm) (n = እያንዳንዳቸው ከተለያዩ አሳማዎች 10 ቁርጥራጮች/ቡድን፣ የአንድ አቅጣጫ ANOVA ሙከራ ይከናወናል፤ ####p < 0.0001 ከ D0 እና ***p < 0.001 ከ D12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)። ሐ በማሰን ትሪክሮም እድፍ የተለበሱ የልብ ቁርጥራጮችን የሚወክሉ ምስሎች (በስተግራ) እና መጠን (በስተቀኝ) (ስኬል ባሮ = 500 µm) (n = እያንዳንዳቸው ከተለያዩ አሳማዎች 10 ቁርጥራጮች/ቡድን፣ የአንድ አቅጣጫ ANOVA ምርመራ ይካሄዳል፤ #### p < 0.0001 ከ D0 እና ***p < 0.001 ከ D12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)። c Репрезентативные изображения (ስሌቪ) Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свине, выполняется # pодностор; 0,0001 по сравнению с D0 እና ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl)። ሐ በማሰን ትራይክሮም እድፍ የተለበሱ የልብ ክፍሎችን የሚወክሉ ምስሎች (በስተግራ) እና መጠን (በስተቀኝ) (ያልተሸፈነ ልኬት = 500 µm) (n = ከተለያዩ አሳማዎች የተገኙ 10 ክፍሎች/ቡድን፣ የአንድ አቅጣጫ ANOVA ሙከራ ተከናውኗል፤ #### p < 0 .0001 ከ D0 እና ***p < ከ D12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)። ሐ 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度（右）（裸尺度） 5m = 5个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p <0.0001 与D0 相比，*** 1 与相比)። C 用 masson 的 心脏切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右）裸尺度 = 500 µm) （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova# p. 0.0001 与D0 相比፣***p <0.001 与D12 Ctrl 相比） c Репрезентативные изображения (слева) እና ኮሊኬስትቬንኒ አናሊዝ (ስፕራቫ) Массона (ቺስታያ ሺካላ = 500 ሚ.ሜትር) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано сьпом однофакторного дисперсионного анализа ;### #p <0,0001 по сравнению с D0, ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl)። ሐ በማሰን ትሪክሮም እድፍ የተነከሩ የልብ ክፍሎች ተወካይ ምስሎች (በስተግራ) እና መጠን (በስተቀኝ) (ባዶ = 500 µm) (n = 10 ክፍሎች/ቡድን፣ እያንዳንዳቸው ከተለየ አሳማ የተወሰዱ፣ በአንድ አቅጣጫ ልዩነት ትንተና የተፈተኑ፤### # p < 0.0001 ከ D0 ጋር ሲነጻጸር፣ ***p < 0.001 ከ D12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)።የስህተት አሞሌዎች አማካይ ± መደበኛ መዛባትን ይወክላሉ።
ትናንሽ ሞለኪውሎችን ወደ ባህል መካከለኛ በመጨመር የካርዲዮሚዮሳይት ታማኝነት ሊሻሻል እና የፋይብሮሲስ እድገት ሊቀንስ እንደሚችል ገምተናል። ስለዚህ አነስተኛ ቁጥር ያላቸው ግራ የሚያጋቡ ምክንያቶች በመኖራቸው የማይንቀሳቀሱ የቁጥጥር ባህሎቻችንን20,21 በመጠቀም ትናንሽ ሞለኪውሎችን መርምረናል። ዴክሳሜታሶን (ዴክስ)፣ ትሪዮዶታይሮኒን (ቲ3) እና SB431542 (ኤስቢ) ለዚህ ስክሪን ተመርጠዋል። እነዚህ ትናንሽ ሞለኪውሎች ቀደም ሲል በሂፒኤስሲ-ሲኤም ባህሎች ውስጥ የሳርኮሜሬ ርዝመት፣ የቲ-ቱቡሎች እና የኮንዳሽን ፍጥነት በመጨመር የካርዲዮሚዮሳይቶችን ብስለት ለማነሳሳት ጥቅም ላይ ውለዋል። በተጨማሪም፣ ዴክስ (ግሉኮርቲኮይድ) እና SB እብጠትን እንደሚገቱ ይታወቃሉ29,30። ስለዚህ፣ የእነዚህ ትናንሽ ሞለኪውሎች አንድ ወይም ጥምረት ማካተት የልብ ክፍሎችን መዋቅራዊ ታማኝነት ያሻሽላል ወይ የሚለውን ሞክረናል። ለመጀመሪያ ምርመራ፣ የእያንዳንዱ ውህድ መጠን የተመረጠው በሴል ባህል ሞዴሎች (1 μM Dex27፣ 100 nM T327 እና 2.5 μM SB31) ውስጥ በብዛት ጥቅም ላይ በሚውሉት ክምችቶች ላይ በመመስረት ነው። ከ12 ቀናት ባህል በኋላ፣ የT3 እና የDex ጥምረት ጥሩ የልብ ጡንቻ ህዋሳት መዋቅራዊ ታማኝነት እና አነስተኛ የፋይበር እድሳት አስገኝቷል (ተጨማሪ ምስሎች 4 እና 5)። በተጨማሪም፣ እነዚህን የT3 እና የDex ክምችቶች በእጥፍ ወይም በእጥፍ መጠቀም ከመደበኛ ክምችቶች ጋር ሲነጻጸር ጎጂ ውጤቶችን አስገኝቷል (ተጨማሪ ምስል 6a፣ለ)።
ከመጀመሪያው ምርመራ በኋላ፣ የ4 የባህል ሁኔታዎችን ራስ-ለፊት ንጽጽር አድርገናል (ምስል 4a): Ctrl: ቀደም ሲል በተገለጸው የማይንቀሳቀስ ባህላችን ውስጥ የተዳቀሉ የልብ ክፍሎች፤ 20.21 TD: T3 እና Ctrl s ረቡዕ ዕለት Dex ተጨምሯል፤ MC: ቀደም ሲል በተመቻቸ መካከለኛችን በመጠቀም በCTCM ውስጥ የተዳቀሉ የልብ ክፍሎች፤ እና MT: CTCM ከT3 እና Dex ጋር ወደ መካከለኛው ተጨምሯል። ከ12 ቀናት እርባታ በኋላ፣ የMS እና MT ሕብረ ሕዋሳት ህያውነት በMTT ምርመራ ከተገመገሙ ትኩስ ሕብረ ሕዋሳት ጋር ተመሳሳይ ሆኖ ቀጥሏል (ምስል 4ለ)። የሚገርመው ነገር፣ T3 እና Dex ወደ ትራንስዌል ባህሎች (TD) መጨመር ከCtrl ሁኔታዎች ጋር ሲነጻጸር በህያውነት ላይ ጉልህ መሻሻል አላመጣም፣ ይህም የልብ ክፍሎችን ህያውነት በመጠበቅ ረገድ የሜካኒካል ማነቃቂያ አስፈላጊ ሚና እንዳለው ያሳያል።
ለ12 ቀናት በሜዳ ላይ የሜካኒካል ማነቃቂያ እና የT3/Dex ተጨማሪ ምግብን ተፅእኖ ለመገምገም የሚያገለግሉትን አራት የባህል ሁኔታዎችን የሚያሳይ የሙከራ ንድፍ ዲያግራም። የባር ግራፍ ከአዲስ የልብ ቁርጥራጮች (D0) (n = 18 (D0)፣ 15 (D12 Ctrl፣ D12 TD እና D12 MT)፣ 12 (D12 MC) ቁርጥራጮች/ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች ጋር ሲነጻጸር ከባህሉ በኋላ ባሉት 12 ቀናት ውስጥ የህያውነት መለኪያን ያሳያል፣ የአንድ አቅጣጫ የANOVA ሙከራ ይከናወናል፤ ####p < 0.0001፣ ###p < 0.001 ከD0 እና **p < 0.01 ከD12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)። የባር ግራፍ ከአዲስ የልብ ቁርጥራጮች (D0) (n = 18 (D0)፣ 15 (D12 Ctrl፣ D12 TD እና D12 MT)፣ 12 (D12 MC) ቁርጥራጮች/ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች ጋር ሲነጻጸር ከባህሉ በኋላ ባሉት 12 ቀናት ውስጥ የህያውነት መለኪያን ያሳያል፣ የአንድ አቅጣጫ የANOVA ምርመራ ይካሄዳል፤ ####p < 0.0001፣ ###p < 0.001 ከD0 እና **p < 0.01 ከD12 ctrl ጋር ሲነጻጸር)። b Гистограмма показывает количественную оценку культивирования (контроль, TD, MC እና MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0)፣ 15 (D12 Ctrl 12 Ctrl)፣ D12 Ctrl MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0 እና **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl)። ለ የአሞሌ ግራፉ ከባህል በኋላ ባሉት 12 ቀናት ውስጥ በሁሉም የአራቱም የባህል ሁኔታዎች (ቁጥጥር፣ TD፣ MC እና MT) ውስጥ ከትኩስ የልብ ክፍሎች (D0) (n = 18 (D0)፣ 15 (D12 Ctrl፣ D12 TD እና D12 MT)፣ 12 (D12 MC) ክፍሎች/ቡድኖች ከተለያዩ አሳማዎች፣ የአንድ አቅጣጫ ANOVA ሙከራ፤ ####p < 0.0001፣ ###p < 0.001 vs. D0 እና **p < 0.01 ከ D12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር) ያሳያል። b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (15) ሲቲ (D0)和D12 MT)፣来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 0.01 与D12控制)።ቢ 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC እና MT) (D0) (n = 18 (D0)፣ 15 (D12 Ctrl፣ D12 TD እና D12 MT)፣ отразных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа፣ односторороронтый 0, ####pппа, односторорон#pппа, 0, ####pест ANOVA; <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b ሂስቶግራም ከትኩስ የልብ ክፍሎች (D0) ጋር ሲነጻጸር ሁሉንም 4 የባህል ሁኔታዎች (ቁጥጥር፣ TD፣ MC እና MT) ያሳያል (n = 18 (D0)፣ 15 (D12 Ctrl፣ D12 TD እና D12 MT)፣ ከተለያዩ አሳማዎች 12 (D12 MC) ክፍሎች/ቡድን፣ የአንድ አቅጣጫ ANOVA ሙከራ፤ ####p<0.0001፣ ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. ቁጥጥር D12)። ሐ የባር ግራፍ ከባህሉ በኋላ ባሉት 12 ቀናት ውስጥ በሁሉም የአራቱም የባህል ሁኔታዎች (Ctrl፣ TD፣ MC እና MT) ውስጥ የግሉኮስ ፍሰት መጠንን ከትኩስ የልብ ቁርጥራጮች (D0) ጋር ሲነጻጸር ያሳያል (n = ከተለያዩ አሳማዎች 6 ቁርጥራጮች/ቡድን፣ የአንድ አቅጣጫ ANOVA ምርመራ ይካሄዳል፤ ###p < 0.001፣ ከD0 እና ***p < 0.001 ጋር ሲነጻጸር ከD12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)። ሐ የባር ግራፍ ከባህሉ በኋላ ባሉት 12 ቀናት ውስጥ በሁሉም የአራቱም የባህል ሁኔታዎች (Ctrl፣ TD፣ MC እና MT) ውስጥ የግሉኮስ ፍሰት መጠንን ከትኩስ የልብ ቁርጥራጮች (D0) ጋር ሲነጻጸር ያሳያል (n = ከተለያዩ አሳማዎች 6 ቁርጥራጮች/ቡድን፣ የአንድ አቅጣጫ ANOVA ምርመራ ይካሄዳል፤ ###p < 0.001፣ ከD0 እና ***p < 0.001 ጋር ሲነጻጸር ከD12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)። c Гистограмма показывает количественую оценку потока глюкозы через 12 культивирования (контроль, TD, MC እና MT) посравнению односторонний Выполняется тест ANOVA; ሐ ሂስቶግራም ከትኩስ የልብ ክፍሎች (D0) ጋር ሲነጻጸር በ4ቱም የባህል ሁኔታዎች (ቁጥጥር፣ TD፣ MC እና MT) ስር የግሉኮስ ፍሰት መጠንን ያሳያል (n = ከተለያዩ አሳማዎች የተውጣጡ 6 ክፍሎች/ቡድን፣ የአንድ አቅጣጫ የANOVA ምርመራ ተካሂዷል፤ ###p < 0.001 ከD0 እና ***p < 0.001 ከD12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)። ሐ 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 王寔，吹1天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；**##p < 0.000 0.001 与D12 Ctrl 相比） ሲ 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt）培养 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组፣ 来自猪፣测试；###ገጽ <0.001፣与D0 相比፣***p <0.001 与D12 Ctrl 相比） c Гистограмма, показывающая количественную условий культивирования (контроль, TD, MC እና MT) по сравнению свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; D12 (контроль). ሐ ሂስቶግራም ከትኩስ የልብ ክፍሎች (D0) ጋር ሲነጻጸር ለሁሉም 4 የባህል ሁኔታዎች (ቁጥጥር፣ ቲዲ፣ ኤምሲ እና ኤምቲ) የግሉኮስ ፍሰት መጠንን የሚያሳይ ሲሆን ይህም ከትኩስ የልብ ክፍሎች (D0) ጋር ሲነጻጸር (n = 6 ክፍሎች/ቡድን፣ ከተለያዩ አሳማዎች፣ ጎን ለጎን) ነው። የANOVA ምርመራዎች ተከናውነዋል፣ ###p < 0.001 ከD0 ጋር ሲነጻጸር፣ ***p < 0.001 ከD12 (ቁጥጥር) ጋር ሲነጻጸር።d የአስር ክልላዊ የቲሹ ክፍል ነጥቦች ላይ ትኩስ (ሰማያዊ)፣ የቀን 12 ኤምሲ (አረንጓዴ) እና የቀን 12 ኤምቲ (ቀይ) ሕብረ ሕዋሳት የውጥረት ትንተና ዕቅዶች (n = 4 ቁርጥራጮች/ቡድን፣ የአንድ አቅጣጫ ANOVA ምርመራ፤ በቡድኖች መካከል ምንም ጉልህ ልዩነት አልነበረም።)። የእሳተ ገሞራ ሴራ በአዲስ የልብ ክፍሎች (D0) ውስጥ በተለያዩ የተገለጹ ጂኖችን ያሳያል (በማይንቀሳቀስ ሁኔታ (Ctrl) ወይም በኤምቲ ሁኔታዎች (MT) ስር ለ10-12 ቀናት ከተለማመዱ የልብ ክፍሎች ጋር ሲነጻጸር። f በእያንዳንዱ የባህል ሁኔታዎች ስር ለተለማመዱ የልብ ክፍሎች የሳርኮሜሬ ጂኖች የሙቀት ካርታ። የስህተት አሞሌዎች አማካይ ± መደበኛ መዛባትን ይወክላሉ።
ከቅባት አሲድ ኦክሳይድ ወደ ግላይኮሊሲስ በሚቀየርበት ጊዜ የሜታቦሊክ ጥገኛነት የልብ ጡንቻ መለያየት መለያ ምልክት ነው። ያልበሰሉ የልብ ጡንቻ ሴሎች በዋናነት ለኤቲፒ ምርት ግሉኮስን የሚጠቀሙ ሲሆን ጥቂት ክሪስታኢ5,32 ያላቸው ሃይፖፕላስቲክ ሚቶኮንድሪያ አላቸው። የግሉኮስ አጠቃቀም ትንተናዎች እንደሚያሳዩት በኤምሲ እና ኤምቲ ሁኔታዎች ስር የግሉኮስ አጠቃቀም በቀን 0 ሕብረ ሕዋሳት ውስጥ ካለው ጋር ተመሳሳይ ነው (ምስል 4ሐ)። ሆኖም፣ የCtrl ናሙናዎች ከትኩስ ሕብረ ሕዋሳት ጋር ሲነፃፀሩ በግሉኮስ አጠቃቀም ላይ ከፍተኛ ጭማሪ አሳይተዋል። ይህ የሚያመለክተው የCTCM እና T3/Dex ጥምረት የቲሹ ህያውነትን እንደሚያሻሽል እና የ12-ቀን የተለማመዱ የልብ ክፍሎች ሜታቦሊክ ፊኖታይፕን እንደሚጠብቅ ነው። በተጨማሪም፣ የዝርያ ትንተና እንደሚያሳየው የዝርያ መጠን በኤምቲ እና ኤምኤስ ሁኔታዎች ስር ለ12 ቀናት እንደ ትኩስ የልብ ሕብረ ሕዋስ ውስጥ እንደነበረው ሆኖ ቀጥሏል (ምስል 4መ)።
የCTCM እና T3/Dex አጠቃላይ የልብ ቁርጥራጭ ቲሹ አለም አቀፍ የትራንስክሪፕሽን ገጽታ ላይ ያላቸውን ተጽእኖ ለመተንተን፣ ከአራቱም የተለያዩ የባህል ሁኔታዎች በተገኙ የልብ ቁርጥራጮች ላይ RNAseq አድርገናል (ተጨማሪ መረጃ 1)። የሚገርመው፣ የMT ክፍሎች ከትኩስ የልብ ቲሹ ጋር ከፍተኛ የትራንስክሪፕሽን ተመሳሳይነት አሳይተዋል፣ ከ13,642 ጂኖች ውስጥ 16ቱ ብቻ በልዩ ሁኔታ ተገልጸዋል። ሆኖም፣ ቀደም ብለን እንዳሳየነው፣ የCtrl ቁርጥራጮች በባህል ውስጥ ከ10-12 ቀናት በኋላ 1229 የተለያዩ የተገለጹ ጂኖችን አሳይተዋል (ምስል 4e)። እነዚህ መረጃዎች በልብ እና ፋይብሮብላስት ጂኖች qRT-PCR ተረጋግጠዋል (ተጨማሪ ምስል 7a-c)። የሚገርመው፣ የCtrl ክፍሎች የልብ እና የሴል ዑደት ጂኖች መቀነስ እና የእብጠት ጂን ፕሮግራሞችን ማግበር አሳይተዋል። እነዚህ መረጃዎች ብዙውን ጊዜ ከረጅም ጊዜ በኋላ የሚከሰተው ልዩነት አለመኖር በኤምቲ ሁኔታዎች ስር ሙሉ በሙሉ እንደሚቀንስ ይጠቁማሉ (ተጨማሪ ምስል 8a,b)። የሳርኮሜሬ ጂኖችን በጥንቃቄ ማጥናት እንዳሳየው የሳርኮሜሬውን (ምስል 4f) እና የአዮን ቻናል (ተጨማሪ ምስል 9) የሚቀዱ ጂኖች በኤምቲ ሁኔታዎች ስር ብቻ ተጠብቀው በCtrl፣ TD እና MC ሁኔታዎች ስር ከመጨቆን ይጠብቃቸዋል። እነዚህ መረጃዎች እንደሚያሳዩት በሜካኒካል እና በሂሞራል ማነቃቂያ (T3/Dex) ጥምረት የልብ ቁራጭ ትራንስክሪፕቶሜ በባህል ውስጥ ከ12 ቀናት በኋላ ከትኩስ የልብ ቁርጥራጮች ጋር ተመሳሳይ ሆኖ ሊቆይ ይችላል።
እነዚህ የትራንስክሪፕሽን ግኝቶች የተደገፉት በልብ ክፍሎች ውስጥ ያሉት የልብና የደም ሥር ሴሎች መዋቅራዊ ታማኝነት ለ12 ቀናት በኤምቲ ሁኔታዎች ውስጥ በተሻለ ሁኔታ መጠበቁ በመቻሉ ነው፣ ይህም ባልተበላሸ እና በአካባቢው ባለው ኮንኔክሲን 43 (ምስል 5a) እንደሚታየው። በተጨማሪም፣ በኤምቲ ሁኔታዎች ስር በልብ ክፍሎች ውስጥ ያለው ፋይብሮሲስ ከ Ctrl እና ከትኩስ የልብ ክፍሎች ጋር ሲነጻጸር በከፍተኛ ሁኔታ ቀንሷል (ምስል 5ለ)። እነዚህ መረጃዎች የሜካኒካል ማነቃቂያ እና የT3/Dex ሕክምና ጥምረት በልብ ክፍሎች ውስጥ ያለውን የልብ መዋቅር በብቃት እንደሚጠብቅ ያሳያሉ።
አዲስ በተገለሉ የልብ ክፍሎች (D0) ውስጥ የትሮፖኒን-ቲ (አረንጓዴ)፣ የኮኔክሲን 43 (ቀይ) እና DAPI (ሰማያዊ) ተወካይ የኢሚውኖፍሎረሰንስ ምስሎች ወይም በአራቱም የልብ ክፍል ባህል ሁኔታዎች ውስጥ ለ12 ቀናት የተተከሉ (የልኬት አሞሌ = 100 µm)።) የልብ ሕብረ ሕዋስ መዋቅራዊ ታማኝነት (n = 7 (D0 እና D12 Ctrl)፣ 5 (D12 TD፣ D12 MC እና D12 MT) ቁርጥራጮች/ቡድኖች ከተለያዩ አሳማዎች የተወሰዱ አርቲፊሻል ኢንተለጀንስ መለካት፣ የአንድ አቅጣጫ ANOVA ምርመራ ይካሄዳል፤ #####p < 0.0001 ከ D0 እና *p < 0.05 ጋር ሲነጻጸር፣ ወይም ****p < 0.0001 ከ D12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)። የልብ ሕብረ ሕዋስ መዋቅራዊ ታማኝነት (n = 7 (D0 እና D12 Ctrl)፣ 5 (D12 TD፣ D12 MC እና D12 MT) ቁርጥራጮች/ቡድኖች ከተለያዩ አሳማዎች የተወሰዱ አርቲፊሻል ኢንተለጀንስ መለካት፣ የአንድ አቅጣጫ ANOVA ምርመራ ይካሄዳል፤ ##### p < 0.0001 ከ D0 እና *p < 0.05 ጋር ሲነጻጸር፣ ወይም ****p < 0.0001 ከ D12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)። Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интелллекта (n = 2), ዳይ = 2, 2 (D = 2) D12 MC እና D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p <0,0001 по срас, ወይም ****p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)። የልብ ሕብረ ሕዋስ መዋቅራዊ ታማኝነት ከተለያዩ አሳማዎች የተወሰዱ አርቲፊሻል ኢንተለጀንስ (n = 7 (D0 እና D12 Ctrl)፣ 5 (D12 TD፣ D12 MC እና D12 MT) ክፍሎችን/ቡድን በመጠቀም መቁጠር፣ የአንድ አቅጣጫ ANOVA ምርመራ ተካሂዷል፤ #### p < 0.0001 ከ D0 እና *p < 0.05 ወይም ****p < 0.0001 ከ D12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)።对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 ኤምቲ.与D12 Ctrl 相比）对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5（d12 td、t12 mc智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######## p <0.0001 与D0 和*p < 0.05 Ctrl 相比)።የልብ ሕብረ ሕዋስ መዋቅራዊ ታማኝነት በተለያዩ አሳማዎች (n = 7 (D0 እና D12 Ctrl)፣ 5 (D12 TD፣ D12 MC እና D12 MT) ክፍሎች/ቡድን) በአንድ አቅጣጫ ANOVA ምርመራ በመጠቀም መቁጠር፤#### p <0,0001 по сравнению с D0 እና *p <0,05 ወይም ****p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)። #### p < ከ D0 እና *p < 0.05 ወይም ****p < 0.0001 ከ D12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)። ለ በማሰን ትሪክሮም እድፍ የተለበሱ የልብ ቁርጥራጮችን የሚወክሉ ምስሎች እና መጠኖች (የልኬት አሞሌ = 500 µm) (n = 10 (D0፣ D12 Ctrl፣ D12 TD፣ እና D12 MC)፣ ከተለያዩ አሳማዎች የተገኙ 9 (D12 MT) ቁርጥራጮች/ቡድን፣ የአንድ አቅጣጫ ANOVA ሙከራ ይከናወናል፤ ####p < 0.0001 ከ D0 እና ***p < 0.001 ጋር ሲነጻጸር፣ ወይም ****p < 0.0001 ከ D12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)። ለ በማሰን ትሪክሮም እድፍ የተለበሱ የልብ ቁርጥራጮችን የሚወክሉ ምስሎች እና መጠኖች (የልኬት አሞሌ = 500 µm) (n = 10 (D0፣ D12 Ctrl፣ D12 TD፣ እና D12 MC)፣ ከተለያዩ አሳማዎች የተገኙ 9 (D12 MT) ቁርጥራጮች/ቡድን፣ የአንድ አቅጣጫ ANOVA ሙከራ ይከናወናል፤ ####p < 0.0001 ከ D0 እና ***p < 0.001 ጋር ሲነጻጸር፣ ወይም ****p < 0.0001 ከ D12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)። b Репрезентативные линейка = 500 ሚሜ) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD እና D12 MC), 9 (D12 MT) ANOVA; ####p <0,0001 по сравнению с D0 እና ***p <0,001 ወይም ****p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)። ለ የተለያዩ አሳማዎች የተወሰዱ 9 (D12 MT) ክፍሎች/ቡድኖች በማሰን ትሪክሮም እድፍ የተነከሩ የልብ ክፍሎችን የሚወክሉ ምስሎች እና መጠን፤ በአንድ አቅጣጫ ANOVA የተከናወኑ፤ ####p < 0.0001 ከ D0 እና ***p < 0.001 ወይም ****p < 0.0001 ከ D12 Ctrl ጋር)። b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10！ TD 和D12 MC）፣来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p <10 与相比፣*** p <0.001፣或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比） b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；*####p < 0.0001 0.001፣或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比） b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашеных трихромом ኤም ኤም. 500 ሚሜ) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD እና D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свине / группы, один- # способ ANOVA; сравнению с D0, *** p <0,001 ወይም ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). ለ በማሰን ትሪክሮም (የልኬት አሞሌ = 500 µm) የተነከሩ የልብ ክፍሎችን የሚወክሉ ምስሎች እና መጠን (n = 10 (D0፣ D12 Ctrl፣ D12 TD እና D12 MC)፣ ከተለያዩ አሳማዎች/ቡድን የተገኙ 9 (D12 MT) ክፍሎች፣ አንድ የANOVA ዘዴ፤ ####p < 0.0001 ከD0 ጋር ሲነጻጸር፣ ***p < 0.001 ወይም ****p < 0.0001 ከD12 Ctrl ጋር ሲነጻጸር)።የስህተት አሞሌዎች አማካይ ± መደበኛ መዛባትን ይወክላሉ።
በመጨረሻም፣ የCTCM የልብ ሃይፐርትሮፊ የመምሰል ችሎታ የልብ ቲሹ ዝርጋታ በመጨመር ተገምግሟል። በCTCM ውስጥ፣ ከፍተኛው የአየር ክፍል ግፊት ከ80 mmHg ወደ 80 mmHg ጨምሯል። አርት. (መደበኛ ዝርጋታ) እስከ 140 mmHg አርት. (ምስል 6a)። ይህ ቀደም ሲል የልብ ክፍሎች በከፍተኛ ትሮፊ ውስጥ ከሚታየው ጋር ተመሳሳይ የሆነ የሳርኮሜሬ ርዝመት ለማግኘት የሚያስፈልገውን ተጓዳኝ መቶኛ ዝርጋታ እንደ 32% ጭማሪ ያሳያል (ምስል 6b)። በመኮማተር እና በመዝናናት ወቅት የልብ ቲሹ ዝርጋታ እና ፍጥነት በስድስት ቀናት ባህል ውስጥ ቋሚ ሆኖ ቆይቷል (ምስል 6c)። ከኤምቲ ሁኔታዎች የሚመጣው የልብ ቲሹ ለስድስት ቀናት ለመደበኛ ዝርጋታ (ኤምቲ (መደበኛ)) ወይም ከመጠን በላይ ዝርጋታ ሁኔታዎች (ኤምቲ (ኦኤስ)) ተገዝቷል። ቀድሞውኑ በባህል ውስጥ ከአራት ቀናት በኋላ፣ በኤምቲ (ኦኤስ) ሁኔታዎች ስር ባለው መካከለኛ ውስጥ ሃይፐርትሮፊክ ባዮማርከር NT-ProBNP ከኤምቲ (መደበኛ) ሁኔታዎች ጋር ሲነጻጸር በከፍተኛ ሁኔታ ጨምሯል (ምስል 7a)። በተጨማሪም፣ ለስድስት ቀናት ከተለማመዱ በኋላ፣ በኤምቲ (OS) ውስጥ ያለው የሴል መጠን (ምስል 7ለ) ከኤምቲ የልብ ክፍሎች (መደበኛ) ጋር ሲነጻጸር በከፍተኛ ሁኔታ ጨምሯል። በተጨማሪም፣ ከመጠን በላይ በተዘረጉ ሕብረ ሕዋሳት ውስጥ የNFATC4 የኑክሌር ትራንስሎኬሽን በከፍተኛ ሁኔታ ጨምሯል (ምስል 7ሐ)። እነዚህ ውጤቶች ከከፍተኛ የደም ግፊት በኋላ የፓቶሎጂ እድሳት እድገትን ያሳያሉ እና የCTCM መሳሪያው የተዘረጋ የልብ ሃይፐርትሮፊ ምልክትን ለማጥናት እንደ መድረክ ሊያገለግል ይችላል የሚለውን ጽንሰ-ሀሳብ ይደግፋሉ።
የአየር ክፍል ግፊት፣ የፈሳሽ ክፍል ግፊት እና የቲሹ እንቅስቃሴ መለኪያዎች የሚወክሉ ምልክቶች የክፍል ግፊት የፈሳሽ ክፍል ግፊትን እንደሚቀይር እና የቲሹ ቁራጭ ተጓዳኝ እንቅስቃሴን እንደሚያስከትል ያረጋግጣሉ። ለ በተለምዶ ለተዘረጉ (ብርቱካናማ) እና ከመጠን በላይ ለተዘረጉ (ሰማያዊ) የቲሹ ክፍሎች የሚወክሉ የመለጠጥ መቶኛ እና የመለጠጥ ፍጥነት ኩርባዎች። c የዑደት ጊዜን የሚያሳይ የባር ግራፍ (n = በቡድን 19 ቁርጥራጮች፣ ከተለያዩ አሳማዎች)፣ የመጨመቂያ ጊዜ (n = በቡድን 18-19 ቁርጥራጮች፣ ከተለያዩ አሳማዎች)፣ የመዝናናት ጊዜ (n = በቡድን 19 ቁርጥራጮች፣ ከተለያዩ አሳማዎች)፣ የቲሹ እንቅስቃሴ ስፋት (n = ከተለያዩ አሳማዎች 14 ቁርጥራጮች/ቡድን፣)፣ ከፍተኛ የሲስቶሊክ ፍጥነት (n = ከተለያዩ አሳማዎች 14 ቁርጥራጮች/ቡድን፣) እና ከፍተኛ የመዝናናት ፍጥነት (n = 14 (D0)፣ 15 (D6)) ክፍሎች/ቡድኖች) ከተለያዩ አሳማዎች)፣ ባለ ሁለት ጭራ የተማሪ ቲ-ሙከራ በማንኛውም መለኪያ ላይ ምንም ጉልህ ልዩነት አላሳየም፣ እነዚህ መለኪያዎች ከመጠን በላይ ቮልቴጅ ባለበት ባህል በ6 ቀናት ውስጥ ቋሚ ሆነው እንደቆዩ ያሳያል። የስህተት አሞሌዎች አማካይ ± መደበኛ መዛባትን ይወክላሉ።
በባህላዊ ሚዲያ ውስጥ የ NT-ProBNP ክምችት መጠንን በኤምቲ መደበኛ ዝርጋታ (ኖርም) ወይም ከመጠን በላይ ዝርጋታ (OS) ሁኔታዎች (n = 4 (D2 MTNorm)፣ 3 (D2 MTOS፣ D4 MTNorm፣ እና D4 MTOS) ከተለያዩ አሳማዎች የተወሰዱ ቁርጥራጮች/ቡድን በባር ግራፍ መለካት። ባለ ሁለት መንገድ ANOVA ይከናወናል፤ **p < 0.01 ከመደበኛ ዝርጋታ ጋር ሲነጻጸር)። በባህላዊ ሚዲያ ውስጥ የ NT-ProBNP ክምችት መጠን በኤምቲ መደበኛ ዝርጋታ (ኖርም) ወይም ከመጠን በላይ ዝርጋታ (OS) ሁኔታዎች ስር ከተመረቱ የልብ ቁርጥራጮች (n = 4 (D2 MTNorm)፣ 3 (D2 MTOS፣ D4 MTNorm፣ እና D4 MTOS) ከተለያዩ አሳማዎች የተወሰዱ ቁርጥራጮች/ቡድን፣ የሁለት መንገድ ANOVA ይከናወናል፤ **p < 0.01 ከመደበኛ ዝርጋታ ጋር ሲነጻጸር)።ከተለመደው የኤምቲ ዝርጋታ (መደበኛ) ወይም ከመጠን በላይ መወጠር (OS) (n = 4 (D2 MTNorm)፣ 3 (D2 MTOS፣ D4 MTNorm፣ እና D4).MTOS) የተለያዩ አሳማዎች የተውጣጡ ቁርጥራጮች/ቡድን በባህል መካከለኛ ውስጥ የኤንቲ-ፕሮቢኤንፒ ክምችት መጠናዊ ሂስቶግራም፣ የልዩነት ሁለት-ደረጃ ትንተና ይከናወናል፤** p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением)። **p < 0.01 ከመደበኛው የመለጠጥ መጠን ጋር ሲነጻጸር)። a 在MT 正常拉伸(ኖርም) 或过度拉伸(OS) (D2 MTNorm)፣ 3 (D2 MTOS፣D4 MTNorm 和D4) MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p <0.01） በኤምቲ መደበኛ ዝርጋታ (ኖርም) ወይም ከመጠን በላይ መወጠር (OS) ሁኔታዎች (n= 4 (D2 MTNorm)፣ 3 (D2 MTOS፣ D4 MTNorm和D4 MTOS) በልዩ የልብ ቁርጥራጭ ውስጥ የ NT-ProBNP ትኩረት መጠን猪的切片/组，可以双向方方发发动;ሂስቶግራም በተለመደው የኤምቲ ዝርጋታ (መደበኛ) ወይም ከመጠን በላይ መወጠር (OS) (n = 4 (D2 MTNorm)፣ 3 (D2 MTOS፣ D4 MTNorm) እና D4 MTOS) ከተለያዩ አሳማዎች የተውጣጡ ቁርጥራጮች/ቡድኖች ውስጥ በተመረቱ የልብ ቁርጥራጮች ውስጥ የ NT-ProBNP ክምችት መጠን፣ የሁለትዮሽ ልዩነት ትንተና፤** p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением)። **p < 0.01 ከመደበኛው የመለጠጥ መጠን ጋር ሲነጻጸር)። ለ በትሮፖኒን-ቲ እና ደብሊውጂኤ (ግራ) እና የሴል መጠን መለኪያ (ቀኝ) የተለበሱ የልብ ቁርጥራጮችን የሚወክሉ ምስሎች (n = 330 (D6 MTOS)፣ 369 (D6 MTNorm) ሴሎች/ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች የተውጣጡ፣ ባለ ሁለት ጭራ ተማሪ ቲ-ሙከራ ይከናወናል፤ ****p < 0.0001 ከተለመደው ዝርጋታ ጋር ሲነጻጸር)። ለ በትሮፖኒን-ቲ እና ደብሊውጂኤ (ግራ) እና የሴል መጠን መለኪያ (ቀኝ) የተለበሱ የልብ ቁርጥራጮችን የሚወክሉ ምስሎች (n = 330 (D6 MTOS)፣ 369 (D6 MTNorm) ሴሎች/ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች የተውጣጡ፣ ባለ ሁለት ጭራ ተማሪ የቲ-ሙከራ ምርመራ ይካሄዳል፤ ****p < 0.0001 ከተለመደው ዝርጋታ ጋር ሲነጻጸር)። b Репрезентативные изображения срезов сеrdца клеток (ስፕራቫ) (n = 330 (D6 MTOS)፣ 369 (D6 MTNorm) клеток/групу из 10 разных срезов от разных свине, два- t-критерий Стьюдента; ****p <0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). ለ ከተለያዩ አሳማዎች፣ ባለ ሁለት ጭራ የተማሪ ቲ-ሙከራ ከተውጣጡ 10 የተለያዩ ክፍሎች የተውጣጡ በትሮፖኒን-ቲ እና AZP (ግራ) እና በሴል መጠን መለኪያ (ቀኝ) የተነከሩ የልብ ክፍሎችን የሚወክሉ ምስሎች (n = 330 (D6 MTOS)፣ 369 (D6 MTNorm) ሴሎች/ቡድን የተገኙ ምስሎች፣ ባለ ሁለት ጭራ የተማሪ ቲ-ሙከራ ተካሂዷል፤ ****p < 0.0001 ከመደበኛው ውጥረት ጋር ሲነጻጸር)። b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表切片的代表性3） MTOS）来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 ኤምቲኖርም检验；与正常拉伸相比，****p < 0.0001)። ለ በካልኬርኢን-ቲ እና ደብሊውጂኤ (ግራ) እና በሴል መጠን (ቀኝ) የተነከሩ የልብ ቁርጥራጮችን የሚወክሉ ምስሎች (n = 330 (D6 MTOS)፣ ከ10 የተለያዩ ቁርጥራጮች (D6 MTNorm)) ሴሎች/የሴል ምርመራ (የሴል ምርመራ)፤ ከመደበኛ የመለጠጥ ችሎታ ጋር ሲነጻጸር፣****p < 0.0001)። b Репрезентативные изображения срезов сеrdца (ስፕራቫ) (n = 330 (D6 MTOS)፣ 369 (D6 MTNorm) ወይም Стьюдента; ****p <0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). ለ በትሮፖኒን-ቲ እና AZP (ግራ) የተነከሩ የልብ ክፍሎችን የሚወክሉ ምስሎች እና የሴል መጠን (ቀኝ) መጠን (n = 330 (D6 MTOS)፣ 369 (D6 MTNorm) ከተለያዩ አሳማዎች የተገኙ 10 የተለያዩ ክፍሎች) ሴሎች/ቡድን፣ ባለ ሁለት ጭራ መስፈርት የተማሪው t; ****p < 0.0001 ከመደበኛው ውጥረት ጋር ሲነጻጸር)። ሐ ለትሮፖኒን-ቲ እና ለNFATC4 የበሽታ መከላከያ ምልክት የተደረገባቸው የMTOS የልብ ቁርጥራጮች ቀን 0 እና ቀን 6 የሚወክሉ ምስሎች እና የNFATC4ን ወደ CMs ኒውክሊየስ (n = 4 (D0)፣ 3 (D6 MTOS) ቁርጥራጮች/ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች መተላለፍን መለካት፣ ባለ ሁለት ጭራ ተማሪ የቲ-ሙከራ ምርመራ ይከናወናል፤ *p < 0.05)። ሐ ለትሮፖኒን-ቲ እና ለNFATC4 የበሽታ መከላከያ ምልክት የተደረገባቸው የMTOS የልብ ቁርጥራጮች ቀን 0 እና ቀን 6 የሚወክሉ ምስሎች እና የNFATC4ን ወደ CMs ኒውክሊየስ (n = 4 (D0)፣ 3 (D6 MTOS) ቁርጥራጮች/ቡድን ከተለያዩ አሳማዎች መተላለፍን መለካት። ባለ ሁለት ጭራ ተማሪ የቲ-ሙከራ ምርመራ ይካሄዳል፤ *p < 0.05)። c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS оценка транслокации NFATC4 በ ያዳራ ካቬርኖዝኒክስ ክሊቶክ (n = 4 (D0)፣ 3 (D6 MTOS) двусторонний t-критерий Стьюдента; * p <0,05). ሐ በ0 እና 6 ቀናት ውስጥ MTOS ላይ የልብ ክፍሎችን የሚወክሉ ምስሎች፣ ለትሮፖኒን-ቲ እና ለNFATC4 የበሽታ መከላከያ ምልክት የተደረገባቸው፣ እና በዋቨርን ህዋሶች ኒውክሊየስ ውስጥ የNFATC4 ትራንስሎኬሽን መጠን (n = 4 (D0)፣ ከተለያዩ አሳማዎች የተገኙ 3 (D6 MTOS) ቁርጥራጮች/ቡድኖች) ባለ ሁለት ጭራ የተማሪ ቲ-ሙከራ አከናውነዋል፤ *p < 0.05)። c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4进行双尾学生t 检验；*p <0.05)። ሐ የካልካኒን-ቲ እና የ NFATC4 የበሽታ መከላከያ ምስሎች 第0天和第6天MTOS የልብ ቁርጥራጭ እና NFATC4 ከተለያዩ NFATC4时间双尾学生et 电影；*p <0.05)። c Репрезентативные оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свине (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-крытытыть; 0፣05)። ሐ. በሲኤም ኒውክሊየስ ውስጥ ከተለያዩ አሳማዎች (n = 4 (D0)፣ 3 (D6 MTOS) ቁርጥራጮች/ቡድን፣ ባለ ሁለት ጭራ ቲ-ክሪተሪዮን የተማሪዎች፤ *p < 0.05) የ MTOS የልብ ቁርጥራጮች በቀን 0 እና 6 ላይ የሚታዩት ተወካዮች ምስሎች።የስህተት አሞሌዎች አማካይ ± መደበኛ መዛባትን ይወክላሉ።
የትርጉም የልብና የደም ሥር (cardiovascular) ጥናት የልብ አካባቢን በትክክል የሚራቡ የሴሉላር ሞዴሎችን ይፈልጋል። በዚህ ጥናት ውስጥ፣ እጅግ በጣም ቀጭን የልብ ክፍሎችን ሊያነቃቃ የሚችል የሲቲሲኤም መሣሪያ ተዘጋጅቶ ተለይቶ ታውቋል። የሲቲሲኤም ሲስተም ፊዚዮሎጂያዊ በሆነ መልኩ የተመሳሰሉ ኤሌክትሮሜካኒካል ማነቃቂያዎችን እና የቲ3 እና የዴክስ ፈሳሽ ማበልጸጊያዎችን ያካትታል። የአሳማ ልብ ክፍሎች ለእነዚህ ምክንያቶች ሲጋለጡ፣ የእነሱ ህያውነት፣ መዋቅራዊ ታማኝነት፣ የሜታቦሊክ እንቅስቃሴ እና የትራንስክሪፕሽን አገላለጽ ከ12 ቀናት ባህል በኋላ እንደ ትኩስ የልብ ሕብረ ሕዋስ ውስጥ እንዳለ ሆኖ ቀጥሏል። በተጨማሪም፣ የልብ ሕብረ ሕዋስ ከመጠን በላይ መዘርጋት በከፍተኛ ኤክስቴንሽን ምክንያት የሚመጣ የልብን የደም ግፊት መጨመር ሊያስከትል ይችላል። በአጠቃላይ፣ እነዚህ ውጤቶች የፊዚዮሎጂ ባህል ሁኔታዎች መደበኛ የልብ ገጽታን በመጠበቅ ረገድ ወሳኝ ሚና ይደግፋሉ እና ለመድኃኒት ምርመራ መድረክ ይሰጣሉ።
ብዙ ምክንያቶች ለካርዲዮሚዮሳይቶች አሠራር እና ህልውና ተስማሚ አካባቢ ለመፍጠር አስተዋጽኦ ያደርጋሉ። ከእነዚህ ምክንያቶች ውስጥ በጣም ግልፅ የሆኑት (1) ከሴሉላር መስተጋብሮች፣ (2) ኤሌክትሮሜካኒካል ማነቃቂያ፣ (3) ሁሞራል ምክንያቶች እና (4) ከሜታቦሊክ ንጥረ ነገሮች ጋር የተያያዙ ናቸው። ፊዚዮሎጂካል ከሴል ወደ ሕዋስ መስተጋብሮች ከሴሉላር ማትሪክስ የተደገፉ ውስብስብ ባለ ሶስት አቅጣጫዊ የሴል ዓይነቶችን ይፈልጋሉ። እንደዚህ ያሉ ውስብስብ የሴሉላር መስተጋብሮች በተናጥል የሴል ዓይነቶች በጋራ ባህል በብልቃጥ ውስጥ እንደገና ለመገንባት አስቸጋሪ ናቸው፣ ነገር ግን የልብ ክፍሎችን ኦርጋኖታይፕ ተፈጥሮ በመጠቀም በቀላሉ ሊሳኩ ይችላሉ።
የልብ ጡንቻ ሴሎች ሜካኒካል ዝርጋታ እና የኤሌክትሪክ ማነቃቂያ የልብ ጡንቻ phenotypeን ለመጠበቅ ወሳኝ ናቸው33,34,35። ሜካኒካል ማነቃቂያ ለ hiPSC-CM ኮንዲሽነር እና ብስለት በስፋት ጥቅም ላይ የዋለ ቢሆንም፣ በርካታ የሚያምሩ ጥናቶች በቅርቡ በባህል ውስጥ የልብ ቁርጥራጮችን በዩኒአክሲያል ጭነት በመጠቀም ሜካኒካል ማነቃቂያ ሞክረዋል። እነዚህ ጥናቶች እንደሚያሳዩት 2D ዩኒአክሲያል ሜካኒካል ጭነት በባህል ወቅት በልብ phenotype ላይ አዎንታዊ ተጽእኖ አለው። በእነዚህ ጥናቶች ውስጥ የልብ ክፍሎች በኢሶሜትሪክ የመለጠጥ ኃይሎች17፣ መስመራዊ ኦክሶቶኒክ ጭነት18፣ ወይም የልብ ዑደት በሃይል ትራንስዱሰር ግብረመልስ እና የውጥረት ድራይቮች በመጠቀም ተፈጥሯል። ሆኖም፣ እነዚህ ዘዴዎች ያለአካባቢ ማመቻቸት የአንድ አክሲያል ቲሹ ዝርጋታ ይጠቀማሉ፣ ይህም ብዙ የልብ ጂኖችን መጨቆን ወይም ከተለመዱት የዝርጋታ ምላሾች ጋር የተያያዙ ጂኖችን ከመጠን በላይ መግለጽን ያስከትላል። እዚህ የተገለጸው CTCM የተፈጥሮ የልብ ዑደትን በዑደት ጊዜ እና በፊዚዮሎጂካል ዝርጋታ (25% ዝርጋታ፣ 40% ሲስቶል፣ 60% ዲያስቶል እና 72 ምቶች በደቂቃ) የሚመስል 3D ኤሌክትሮሜካኒካል ማነቃቂያ ይሰጣል። ምንም እንኳን ይህ ባለ ሶስት አቅጣጫዊ ሜካኒካል ማነቃቂያ ብቻውን የቲሹን ታማኝነት ለመጠበቅ በቂ ባይሆንም፣ የቲሹን ህያውነት፣ ተግባር እና ታማኝነት በበቂ ሁኔታ ለመጠበቅ T3/Dexን በመጠቀም የሂሞራል እና የሜካኒካል ማነቃቂያ ጥምረት ያስፈልጋል።
የሂሞራል ምክንያቶች የአዋቂዎችን የልብ phenotype በመቀየር ረገድ ወሳኝ ሚና ይጫወታሉ። ይህ በHiPS-CM ጥናቶች ውስጥ ተብራርቷል፣ በዚህ ጥናት ውስጥ T3 እና Dex የሕዋስ ብስለትን ለማፋጠን ወደ ባህል ሚዲያ የተጨመሩበት ነው። T3 በሴል ሽፋኖች ውስጥ የአሚኖ አሲዶችን፣ የስኳር እና የካልሲየምን ትራንስፖርት ላይ ተጽዕኖ ሊያሳድር ይችላል። በተጨማሪም፣ T3 የMHC-α አገላለጽን እና የMHC-β ቅነሳን ያበረታታል፣ ይህም በፅንስ CM ውስጥ ካለው ቀርፋፋ ትዊች myofibrils ጋር ሲነጻጸር በበሰሉ የልብና የደም ሥር ሴሎች ውስጥ ፈጣን ትዊች myofibrils እንዲፈጠሩ ያበረታታል። በሃይፖታይሮይዲድ ታካሚዎች ላይ የT3 እጥረት myofibrillar ባንዶችን ማጣት እና የቃና እድገት መጠን መቀነስ ያስከትላል37። Dex በግሉኮቶርኮይድ ተቀባዮች ላይ ይሠራል እና በተለዩ የተሟሉ ልቦች ውስጥ የልብ ጡንቻ መኮማተርን እንደሚጨምር ታይቷል፤ 38 ይህ መሻሻል በካልሲየም ተቀማጭ-ተኮር መግቢያ (SOCE) 39,40 ላይ ካለው ተጽእኖ ጋር የተያያዘ እንደሆነ ይታሰባል። በተጨማሪም፣ Dex ከተቀባዮቹ ጋር ይያያዛል፣ ይህም የበሽታ መከላከያ ተግባርን እና እብጠትን የሚገታ ሰፊ የውስጥ አካላት ምላሽ ያስከትላል30።
ውጤቶቻችን እንደሚያሳዩት አካላዊ ሜካኒካል ማነቃቂያ (MS) ከCtrl ጋር ሲነጻጸር አጠቃላይ የባህል አፈፃፀምን አሻሽሏል፣ ነገር ግን በባህል ውስጥ ለ12 ቀናት የህያውነት፣ የመዋቅር ታማኝነት እና የልብ አገላለጽን መጠበቅ አልቻለም። ከCtrl ጋር ሲነጻጸር፣ T3 እና Dex ወደ CTCM (MT) ባህሎች መጨመር ህያውነትን አሻሽሏል እና ተመሳሳይ የትራንስክሪፕሽን መገለጫዎችን፣ የመዋቅር ታማኝነት እና የሜታቦሊክ እንቅስቃሴን ለ12 ቀናት በአዲስ የልብ ቲሹ ይዞ ቆይቷል። በተጨማሪም፣ የቲሹ ዝርጋታ ደረጃን በመቆጣጠር፣ STCMን በመጠቀም ሃይፐርኤክስቴንሽን የሚያስከትለው የልብ ሃይፐርትሮፊ ሞዴል ተፈጠረ፣ ይህም የSTCM ስርዓትን ሁለገብነት ያሳያል። የልብ ማሻሻያ እና ፋይብሮሲስ ብዙውን ጊዜ የደም ዝውውር ህዋሶቻቸው ተገቢውን ሳይቶኪን እንዲሁም ፋጎሳይቶሲስን እና ሌሎች የመልሶ ማልማት ምክንያቶችን ሊያቀርቡ የሚችሉ ያልተሟሉ የአካል ክፍሎችን ቢያካትቱም፣ የልብ ክፍሎች ለጭንቀት እና ለአሰቃቂ ሁኔታ ምላሽ ለመስጠት ፋይብሮቲክ ሂደቱን ወደ myofibroblasts መምሰል እንደሚችሉ ልብ ሊባል ይገባል። ይህ ቀደም ሲል በዚህ የልብ ቁራጭ ሞዴል ውስጥ ተገምግሟል። የCTCM መለኪያዎች እንደ tachycardia፣ bradycardia እና ሜካኒካል የደም ዝውውር ድጋፍ (ሜካኒካል ያልተጫነ ልብ) ያሉ ብዙ ሁኔታዎችን ለማስመሰል ግፊት/ኤሌክትሪክ ስፋት እና ድግግሞሽ በመቀየር ሊሻሻሉ እንደሚችሉ ልብ ሊባል ይገባል። ይህ ስርዓቱን ለመድኃኒት ምርመራ መካከለኛ ውፅዓት ያደርገዋል። የሲቲሲኤም ከመጠን በላይ በጉልበት ምክንያት የሚመጣውን የልብ ሃይፐርትሮፊ የመምሰል ችሎታ ይህንን ስርዓት ለግል ቴራፒ ለመሞከር መንገድ ይከፍታል። በማጠቃለያው፣ የአሁኑ ጥናት የልብ ቲሹ ክፍሎችን ባህል ለመጠበቅ ሜካኒካል ዝርጋታ እና ሂሞራል ማነቃቂያ ወሳኝ እንደሆኑ ያሳያል።
ምንም እንኳን እዚህ የቀረበው መረጃ ሲቲኤም (CTCM) ያልተቋረጠ ማዮካርዲየምን ለመቅረጽ በጣም ተስፋ ሰጪ መድረክ መሆኑን ቢያመለክትም፣ ይህ የባህል ዘዴ አንዳንድ ገደቦች አሉት። የሲቲኤም (CTCM) ባህል ዋና ገደብ በቁርጭምጭሚቶቹ ላይ ቀጣይነት ያለው ተለዋዋጭ ሜካኒካል ጭንቀቶችን ማስከተሉ ሲሆን ይህም በእያንዳንዱ ዑደት ወቅት የልብ መቆረጥን በንቃት የመከታተል ችሎታን ይከለክላል። በተጨማሪም፣ የልብ ክፍሎች አነስተኛ መጠን (7 ሚሜ) ምክንያት፣ ባህላዊ የኃይል ዳሳሾችን በመጠቀም ከባህል ስርዓቶች ውጭ የሲስቶሊክ ተግባርን የመገምገም ችሎታው የተገደበ ነው። በአሁኑ ጽሑፍ ውስጥ፣ ይህንን ገደብ በከፊል የምናሸንፈው የኮንትራክቲቭ ተግባር አመላካች የሆነውን የኦፕቲካል ቮልቴጅ በመገምገም ነው። ሆኖም፣ ይህ ገደብ ተጨማሪ ሥራ የሚፈልግ ሲሆን ለወደፊቱ እንደ ካልሲየም እና ቮልቴጅ-ስሱ ቀለሞችን በመጠቀም የልብ መቆራረጥ ተግባርን የኦፕቲካል ክትትል ዘዴዎችን በማስተዋወቅ ሊፈታ ይችላል። የሲቲኤም ሌላው ገደብ የሥራ ሞዴሉ የፊዚዮሎጂ ጭንቀትን (ቅድመ ጭነት እና በኋላ ጭነት) አያስተናግድም የሚለው ነው። በሲቲኤም (CTCM) ውስጥ፣ በጣም ትላልቅ ቲሹዎች ውስጥ በዲያስቶል (ሙሉ ማራዘሚያ) እና በሲስቶል (በኤሌክትሪክ ማነቃቂያ ወቅት የመኮማተር ርዝመት) ውስጥ 25% የፊዚዮሎጂያዊ ማራዘሚያ እንዲባዛ በተቃራኒ አቅጣጫዎች ግፊት ተፈጥሯል። ይህ ገደብ በወደፊት የሲቲሲኤም ዲዛይኖች ውስጥ በሁለቱም በኩል በልብ ሕብረ ሕዋስ ላይ በቂ ጫና በማድረግ እና በልብ ክፍሎች ውስጥ የሚከሰቱ ትክክለኛ የግፊት-መጠን ግንኙነቶችን በመተግበር መወገድ አለበት።
በዚህ ጽሑፍ ውስጥ የተዘገበው ከመጠን በላይ የመለጠጥ ምክንያት የሆነው ዳግም ግንባታ ሃይፐርትሮፊክ ሃይፐርስትሮፊክ ምልክቶችን በመኮረጅ ብቻ የተወሰነ ነው። ስለዚህ፣ ይህ ሞዴል የሁሞራል ወይም የነርቭ ምክንያቶች (በዚህ ስርዓት ውስጥ የሌሉ) ሳያስፈልግ የመለጠጥ ምክንያት የሆነውን ሃይፐርትሮፊክ ምልክት በማጥናት ረገድ ሊረዳ ይችላል። የ CTCM ብዜትን ለመጨመር ተጨማሪ ጥናቶች ያስፈልጋሉ፣ ለምሳሌ፣ ከበሽታ ህዋሳት ጋር አብሮ ማልማት፣ የፕላዝማ ሂሞራል ፋክተሮችን ማዘዋወር እና ከነርቭ ሴሎች ጋር አብሮ ማልማት በ CTCM የበሽታ ሞዴሊንግ እድሎችን ያሻሽላል።
በዚህ ጥናት አስራ ሶስት አሳማዎች ጥቅም ላይ ውለዋል። ሁሉም የእንስሳት ሂደቶች በተቋማዊ መመሪያዎች መሰረት የተከናወኑ ሲሆን በሉዊስቪል ዩኒቨርሲቲ የተቋማዊ የእንስሳት እንክብካቤ እና አጠቃቀም ኮሚቴ ጸድቀዋል። የአኦርቲክ ቅስት ተጣብቆ ልብ በ1 ሊትር ንፁህ የልብና የደም ቧንቧ (110 mM NaCl፣ 1.2 mM CaCl2፣ 16 mM KCl፣ 16 mM MgCl2፣ 10 mM NaHCO3፣ 5 U/mL ሄፓሪን፣ እስከ 7.4) ተሞልቷል፤ ልቦቹ በበረዶ ቀዝቃዛ የልብና የደም ሥር (cardioplagic) መፍትሄ ውስጥ እስኪቀመጡ ድረስ በበረዶ ላይ ወደ ላቦራቶሪ እስኪወሰዱ ድረስ ተጠብቀው ይቆዩ ነበር፤ ይህም አብዛኛውን ጊዜ ከ10 ደቂቃ በታች ነው። ልቦቹ በበረዶ ቀዝቃዛ የልብና የደም ሥር (cardioplagic) መፍትሄ ውስጥ እስኪቀመጡ ድረስ በበረዶ ላይ ወደ ላቦራቶሪ እስኪወሰዱ ድረስ ተጠብቀው ይቆዩ ነበር፤ ይህም አብዛኛውን ጊዜ ከ10 ደቂቃ በታች ነው። сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обымы. ልቦች በበረዶ ላይ ወደ ላቦራቶሪ እስኪወሰዱ ድረስ በበረዶ ቀዝቃዛ የልብና የደም ሥር (cardioplagic) መፍትሄ ውስጥ ተከማችተዋል፤ ይህም አብዛኛውን ጊዜ ከ10 ደቂቃ በታች ይወስዳል።将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировky в лабораторию на льду, обыchно <10 мин. ልቦች በበረዶ ላይ እስኪቀመጡ ድረስ በበረዶ ላይ ወደ ላቦራቶሪ እስኪወሰዱ ድረስ የልብ ጡንቻዎን በበረዶ ላይ ያቆዩ፣ አብዛኛውን ጊዜ ከ10 ደቂቃ በታች።
የሲቲኤምሲ መሳሪያው የተገነባው በሶልዲውወርክስ ኮምፒውተር-አግዞት ዲዛይን (CAD) ሶፍትዌር ነው። የባህል ክፍሎቹ፣ መከፋፈያዎቹ እና የአየር ክፍሎቹ የተሠሩት ከሲኤንሲ ክሊር አክሬሊክስ ፕላስቲክ ነው። የ7ሚሜ ዲያሜትር ያለው የመጠባበቂያ ቀለበት በመሃል ላይ ከፍተኛ ጥግግት ካለው ፖሊ polyethylene (HDPE) የተሰራ ሲሆን ከታች ያለውን ሚዲያ ለመዝጋት የሚያገለግል የሲሊኮን ኦ-ቀለበት ለማስተናገድ የኦ-ቀለበት ጎድጎድ አለው። ቀጭን የሲሊኮን ሽፋን የባህል ክፍሉን ከመለያያ ሰሌዳ ይለያል። የሲሊኮን ሽፋን ከ0.02″ ውፍረት ካለው የሲሊኮን ወረቀት በሌዘር የተቆረጠ ሲሆን የ35A ጥንካሬ አለው። የታችኛው እና የላይኛው የሲሊኮን ጋኬቶች ከ1/16″ ውፍረት ካለው የሲሊኮን ወረቀት በሌዘር የተቆረጡ ሲሆኑ የ50A ጥንካሬ አላቸው። 316L አይዝጌ ብረት ዊንጮች እና የክንፍ ፍሬዎች ብሎኩን ለማሰር እና አየር የማያስገባ ማህተም ለመፍጠር ያገለግላሉ።
የተወሰነ የታተመ የወረዳ ሰሌዳ (PCB) ከሲ-ፒኤሲ-ኢኤም ሲስተም ጋር እንዲዋሃድ የተነደፈ ነው። በፒሲቢው ላይ ያሉት የስዊስ ማሽን ማያያዣ ሶኬቶች በብር የተለበጡ የመዳብ ሽቦዎች እና በኤሌክትሮዶች ውስጥ በተሰቀሉ የነሐስ 0-60 ዊንጮች ከግራፋይት ኤሌክትሮዶች ጋር የተገናኙ ናቸው። የታተመው የወረዳ ሰሌዳ በ3-ልኬት አታሚው ሽፋን ውስጥ ይቀመጣል።
የሲቲሲኤም መሳሪያው የልብ ዑደትን የሚመስል ቁጥጥር የሚደረግበት የደም ዝውውር ግፊት የሚፈጥር ፕሮግራም በሚደረግበት የአየር ማነቃቂያ (PPD) ቁጥጥር ይደረግበታል። በአየር ክፍሉ ውስጥ ያለው ግፊት እየጨመረ ሲሄድ፣ ተለዋዋጭው የሲሊኮን ሽፋን ወደ ላይ ይስፋፋል፣ ይህም መካከለኛውን በቲሹ ቦታ ስር ያስገድደዋል። ከዚያም የቲሹው ቦታ በዚህ ፈሳሽ መባረር ይዘረጋል፣ ይህም በዲያስቶል ወቅት የልብን ፊዚዮሎጂያዊ መስፋፋት በመምሰል። በመዝናናት ጫፍ ላይ፣ የኤሌክትሪክ ማነቃቂያ በግራፋይት ኤሌክትሮዶች በኩል ተተግብሯል፣ ይህም በአየር ክፍሉ ውስጥ ያለውን ግፊት ቀንሷል እና የቲሹ ክፍሎች መኮማተር አስከትሏል። በቧንቧው ውስጥ በአየር ስርዓቱ ውስጥ ያለውን ግፊት ለመለየት የግፊት ዳሳሽ ያለው ሄሞስታቲክ ቫልቭ አለ። የግፊት ዳሳሹ የሚሰማው ግፊት ከላፕቶፕ ጋር በተገናኘ የውሂብ ሰብሳቢ ላይ ይተገበራል። ይህም በጋዝ ክፍሉ ውስጥ ያለውን ግፊት ቀጣይነት ባለው ክትትል ያስችላል። ከፍተኛው የክፍል ግፊት ሲደረስ (መደበኛ 80 mmHg፣ 140 mmHg OS)፣ የውሂብ ማግኛ መሳሪያው ለ2 ms ሁለት ጊዜ የቮልቴጅ ምልክት ለማመንጨት ወደ C-PACE-EM ስርዓት ምልክት እንዲልክ ታዘዘ፣ ወደ 4 V ተቀናብሯል።
የልብ ክፍሎች ተገኝተዋል እና በ6 ጉድጓዶች ውስጥ የባህላዊ ሁኔታዎች እንደሚከተለው ተከናውነዋል፡- የተቆረጡትን ልቦች ከማስተላለፊያው ዕቃ ወደ ቀዝቃዛ (4°ሴ) የልብ ጡንቻ ወደያዘ ትሪ ያስተላልፉ። የግራ ventricle በጸዳ ምላጭ ተለይቶ ከ1-2 ሴ.ሜ 3 ቁርጥራጮች ተቆርጧል። እነዚህ የቲሹ ብሎኮች ከቲሹ ድጋፎች ጋር በቲሹ ማጣበቂያ ተያይዘው የታይሮድ መፍትሄን በያዘ በሚንቀጠቀጥ ማይክሮቶም ቲሹ መታጠቢያ ውስጥ ተቀምጠዋል እና ያለማቋረጥ ኦክስጅን (3 ግ/ሊትር 2,3-ቡታኒዲዮን ሞኖኦክሲም (ቢዲኤም)፣ 140 mM NaCl (8.18 ግ)፣ 6 mM KCl (0.447 ግ)፣ 10 mM D-ግሉኮስ (1.86 ግ)፣ 10 mM HEPES (2.38 ግ)፣ 1 mM MgCl2 (1 ሚሊ ሊትር 1 M መፍትሄ)፣ 1.8 mM CaCl2 (1.8 ሚሊ ሊትር 1 M መፍትሄ)፣ እስከ 1 L ddH2O)። የሚንቀጠቀጠው ማይክሮቶም በ80 Hz ድግግሞሽ 300 µm ውፍረት ያላቸውን ቁርጥራጮች፣ 2 ሚሜ የሆነ አግድም የንዝረት ስፋት እና 0.03 ሚሜ/ሰከንድ ቅድመ ፍጥነት እንዲቆርጥ ተወስኗል። የቲሹ መታጠቢያው መፍትሄው እንዲቀዘቅዝ በበረዶ የተከበበ ሲሆን የሙቀት መጠኑም በ4°ሴ ተጠብቆ ቆይቷል። የቲሹ ክፍሎችን ከማይክሮቶም መታጠቢያ ገንዳ ወደ አንድ የባህል ሳህን በቂ ክፍሎች እስኪገኙ ድረስ በበረዶ ላይ ያለማቋረጥ ኦክስጅን ያለው የታይሮድ መፍትሄ ወዳለው የመታቀፊያ መታጠቢያ ያስተላልፉ። ለትራንስዌል ባህሎች፣ የቲሹ ክፍሎች ከ 6 ሚሜ ስፋት ካለው ፖሊዩረቴን ድጋፎች ጋር ተያይዘው በ 6 ሚሊ ሊትር በተመቻቸ መካከለኛ (199 መካከለኛ፣ 1x ITS ተጨማሪ፣ 10% FBS፣ 5 ng/ml VEGF፣ 10 ng/ml FGF-አልካላይን እና 2X አንቲባዮቲክ-ፀረ-ፈንገስ) ውስጥ ተጭነዋል። የኤሌክትሪክ ማነቃቂያ (10 V፣ ድግግሞሽ 1.2 Hz) በቲሹ ክፍሎች ላይ በC-Pace በኩል ተተግብሯል። ለቲዲ ሁኔታዎች፣ ትኩስ T3 እና Dex በ100 nM እና በእያንዳንዱ መካከለኛ ለውጥ 1 μM ተጨምረዋል። ​​መካከለኛው ክፍል በቀን 3 ጊዜ ከመተካቱ በፊት በኦክስጅን ይሞላል። የቲሹ ክፍሎች በ37°ሴ እና 5% CO2 ኢንኩቤተር ውስጥ ተክለዋል።
ለሲቲሲኤም ባህሎች፣ የቲሹ ክፍሎች የተሻሻለው የታይሮድ መፍትሄ በያዘው የፔትሪ ዲሽ ውስጥ በተሰራ 3D አታሚ ላይ ተቀምጠዋል። መሳሪያው የልብን ቁራጭ መጠን ከድጋፍ ቀለበቱ ስፋት በ25% ለማሳደግ የተነደፈ ነው። ይህ የሚደረገው የልብ ክፍሎች ከታይሮድ መፍትሄ ወደ መካከለኛ እና በዲያስቶል ወቅት ከተዘዋወሩ በኋላ እንዳይዘረጉ ነው። ሂስቶአክሪሊክ ሙጫ በመጠቀም፣ 300 µm ውፍረት ያላቸው ክፍሎች በ7 ሚሜ ዲያሜትር ባለው የድጋፍ ቀለበት ላይ ተስተካክለዋል። የቲሹ ክፍሎችን ከድጋፍ ቀለበቱ ጋር ካያያዙ በኋላ፣ ከመጠን በላይ የሆኑ የቲሹ ክፍሎችን ይቁረጡ እና የተያያዙትን የቲሹ ክፍሎች ለአንድ መሳሪያ በቂ ክፍሎች እስኪዘጋጁ ድረስ በበረዶ (4°ሴ) ላይ ባለው የታይሮድ መፍትሄ መታጠቢያ ውስጥ ያስቀምጡ። ለሁሉም መሳሪያዎች አጠቃላይ የማቀነባበሪያ ጊዜ ከ2 ሰዓታት መብለጥ የለበትም። 6 የቲሹ ክፍሎች ከድጋፍ ቀለበቶቻቸው ጋር ከተያያዙ በኋላ፣ የሲቲሲኤም መሳሪያው ተሰብስቧል። የሲቲሲኤም ባህል ክፍል በ21 ሚሊ ሊትር ቀድሞ ኦክስጅን በተደረገለት መካከለኛ ቀድሞ ተሞልቷል። የቲሹ ክፍሎችን ወደ ባህል ክፍል ያስተላልፉ እና ማንኛውንም የአየር አረፋ በፓይፕት በጥንቃቄ ያስወግዱ። ከዚያም የቲሹ ክፍል ወደ ቀዳዳው ይመራና በቀስታ ወደ ቦታው ይገባል። በመጨረሻም የኤሌክትሮድ ክዳኑን በመሳሪያው ላይ ያስቀምጡና መሳሪያውን ወደ ኢንኩቤተር ያስተላልፉ። ከዚያም ሲቲኤምን ከአየር ቱቦው እና ከሲ-ፒኤሲ-ኢኤም ሲስተም ጋር ያገናኙት። የአየር ማንቀሳቀሻው ይከፈታል እና የአየር ቫልቭ ሲቲኤምን ይከፍታል። የC-PACE-EM ሲስተም በ1.2 Hz ለሁለት ms በሁለት ፋሲክ ፍጥነት ወቅት 4 V እንዲያደርስ ተዋቅሯል። መካከለኛው በቀን ሁለት ጊዜ ተቀይሯል እና ኤሌክትሮዶቹ በኤሌክትሮዶች ላይ ግራፋይት እንዳይከማች በቀን አንድ ጊዜ ተቀይረዋል። አስፈላጊ ከሆነ፣ የቲሹ ክፍሎች ከባህል ጉድጓዶቻቸው ውስጥ ሊወገዱ ይችላሉ፣ ይህም በእነሱ ስር የወደቁ የአየር አረፋዎችን ያስወግዳል። ለኤምቲ የሕክምና ሁኔታዎች፣ T3/Dex በእያንዳንዱ መካከለኛ ለውጥ 100 nM T3 እና 1 μM Dex ትኩስ ተጨምሯል። የሲቲኤም መሳሪያዎች በ37°ሴ እና 5% CO2 ኢንኩቤተር ውስጥ ተክለዋል።
የልብ ቁርጥራጮችን የተዘረጉ አቅጣጫዎችን ለማግኘት ልዩ የካሜራ ስርዓት ተዘጋጅቷል። የSLR ካሜራ (Canon Rebel T7i፣ Canon፣ Tokyo፣ Japan) ከNavitar Zoom 7000 18-108ሚሜ ማክሮ ሌንስ (Navitar፣ San Francisco፣ CA) ጋር ጥቅም ላይ ውሏል። መካከለኛውን በአዲስ መካከለኛ ከተተካ በኋላ በክፍል ሙቀት ውስጥ ምስላዊነት ተካሂዷል። ካሜራው በ51° አንግል ላይ ተቀምጦ ቪዲዮ በሰከንድ በ30 ፍሬሞች ይመዘገባል። በመጀመሪያ፣ የልብ ቁርጥራጮችን እንቅስቃሴ ለመለካት ክፍት ምንጭ ሶፍትዌር (MUSCLEMOTION43) ከImage-J ጋር ጥቅም ላይ ውሏል። ጭምብሉ የተፈጠረው ጫጫታ ለማስወገድ የልብ ቁርጥራጮችን ለመምታት የፍላጎት ክልሎችን ለመወሰን MATLAB (MathWorks፣ Natick፣ MA፣ USA) በመጠቀም ነው። በእጅ የተከፋፈሉ ጭምብሎች በፍሬም ቅደም ተከተል ውስጥ በሁሉም ምስሎች ላይ ይተገበራሉ ከዚያም ወደ MUSCLEMOTION ተሰኪ ይተላለፋሉ። የጡንቻ እንቅስቃሴ በእያንዳንዱ ፍሬም ውስጥ ያለውን የፒክሰሎች አማካይ ጥንካሬ ከማጣቀሻ ፍሬሙ አንፃር ለመለካት ይጠቀማል። መረጃው የተቀዳ፣ የተጣራ እና የዑደት ጊዜን ለመለካት እና በልብ ዑደት ወቅት የቲሹ ዝርጋታ ለመገምገም ጥቅም ላይ ውሏል። የተቀረጸው ቪዲዮ ከተጠናቀቀ በኋላ የተከናወነው በአንደኛ ደረጃ ዜሮ-ደረጃ ዲጂታል ማጣሪያ በመጠቀም ነው። የቲሹ ዝርጋታ (ከጫፍ እስከ ጫፍ) ለመለካት፣ በተመዘገበው ምልክት ውስጥ ባሉ ጫፎች እና ጉድጓዶች መካከል ያለውን ልዩነት ለመለየት ከጫፍ እስከ ጫፍ ትንተና ተካሂዷል። በተጨማሪም፣ ዲትሪንዲንግ የሚከናወነው የምልክት መንሸራተትን ለማስወገድ በ6ኛ ደረጃ ፖሊኖሚያል በመጠቀም ነው። የፕሮግራም ኮድ በMATLAB ውስጥ የተዘጋጀው ዓለም አቀፍ የቲሹ እንቅስቃሴ፣ የዑደት ጊዜ፣ የመዝናኛ ጊዜ እና የመጨመቂያ ጊዜን ለመወሰን ነው (ተጨማሪ የፕሮግራም ኮድ 44)።
ለጭንቀት ትንተና፣ ለሜካኒካል የመለጠጥ ግምገማ የተፈጠሩትን ተመሳሳይ ቪዲዮዎች በመጠቀም፣ በመጀመሪያ በMUSCLEMOTION ሶፍትዌር መሠረት የእንቅስቃሴ ጫፎችን (ከፍተኛውን (የላይኛው) እና ዝቅተኛውን (ዝቅተኛ) የእንቅስቃሴ ነጥቦችን) የሚወክሉ ሁለት ምስሎችን ተከታትለናል። ከዚያም የቲሹ ክፍሎችን በመክፈል በተከፋፈለው ቲሹ ላይ የጥላ ስልተ ቀመር ተግባራዊ አድርገናል (ተጨማሪ ምስል 2a)። ከዚያም የተከፋፈለው ቲሹ በአስር ንዑስ ገጽታዎች የተከፈለ ሲሆን በእያንዳንዱ ገጽ ላይ ያለው ጫና በሚከተለው እኩልታ ይሰላል፡ ውጥረት = (ሱፕ-ዳውን)/ዳውን፣ ሱፕ እና ዳውን በቅደም ተከተል ከጨርቁ የላይኛው እና የታችኛው ጥላዎች የቅርጹ ርቀቶች ናቸው (ተጨማሪ ምስል .2b)።
የልብ ክፍሎች በ4% ፓራፎርማሌዴይድ ውስጥ ለ48 ሰዓታት ተስተካክለዋል። የተስተካከሉ ሕብረ ሕዋሳት በ10% እና 20% ሱክሮስ ውስጥ ለ1 ሰዓት፣ ከዚያም በ30% ሱክሮስ ውስጥ በአንድ ሌሊት ደርቀዋል። ከዚያም ክፍሎቹ በተመቻቸ የመቁረጥ የሙቀት መጠን ውህድ (ኦሲቲ ውህድ) ውስጥ ተክለዋል እና ቀስ በቀስ በኢሶፔንቴን/ደረቅ የበረዶ መታጠቢያ ውስጥ ቀዝቅዘዋል። የOCT መክተቻ ብሎኮችን እስከ መለያየት ድረስ በ -80 °C ያስቀምጡ። ስላይዶች እንደ 8 μm ውፍረት ክፍሎች ተዘጋጅተዋል።
ኦቲሲቲ ከልብ ክፍሎች ለማስወገድ፣ ስላይዶቹን በማሞቂያ ብሎክ ላይ በ95°ሴ ለ5 ደቂቃ ያሞቁ። በእያንዳንዱ ስላይድ ላይ 1 ሚሊ ሊትር PBS ይጨምሩ እና በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ30 ደቂቃዎች ያፍሱ፣ ከዚያም በክፍል ሙቀት ውስጥ 0.1% ትሪቶን-ኤክስን በፒቢኤስ ውስጥ ለ15 ደቂቃዎች በማዘጋጀት ክፍሎቹን ዘልለው ይግቡ። ልዩ ያልሆኑ ፀረ እንግዳ አካላት ከናሙናው ጋር እንዳይጣበቁ ለመከላከል፣ 1 ሚሊ ሊትር 3% BSA መፍትሄ በስላይዶቹ ላይ ይጨምሩ እና በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ1 ሰዓት ያፍሱ። ከዚያም BSA ተወግዶ ስላይዶቹ በፒቢኤስ ታጥበዋል። እያንዳንዱን ናሙና በእርሳስ ምልክት ያድርጉበት። ዋና ፀረ እንግዳ አካላት (በ1% BSA ውስጥ 1:200 የተበረዘ) (connexin 43 (Abcam፤ #AB11370)፣ NFATC4 (Abcam፤ #AB99431) እና ትሮፖኒን-ቲ (Thermo Scientific፤ #MA5-12960) በ90 ደቂቃዎች ውስጥ ተጨምረዋል፣ ከዚያም ሁለተኛ ፀረ እንግዳ አካላት (በ1% BSA ውስጥ 1:200 የተበረዘ) በአይጥ አሌክሳ ፍሎር 488 (Thermo Scientific፤ #A16079) ላይ፣ ጥንቸል አሌክሳ ፍሎር 594 (Thermo Scientific፤ #T6391) ላይ ለተጨማሪ 90 ደቂቃዎች ተጨምረዋል። ​​በPBS 3 ጊዜ ታጥቧል። የታለመውን ቀለም ከበስተጀርባ ለመለየት፣ እንደ መቆጣጠሪያ ሁለተኛ ፀረ እንግዳ አካላትን ብቻ ተጠቅመናል። በመጨረሻም፣ DAPI የኑክሌር እድፍ ተጨምሮ ስላይዶቹ በቬክታሺልድ (ቬክተር ላቦራቶሪዎች) ውስጥ ተቀምጠው በምስማር ቀለም ተሸፍነዋል። -x ማጉላት) እና በ40x ማጉላት በኪየንስ ማይክሮስኮፕ ተጨምረዋል።
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific፤ #W32464) በ5 μg/ml በPBS ውስጥ ለWGA ስቴይኒንግ ጥቅም ላይ ውሏል እና በክፍል ሙቀት ውስጥ ለ30 ደቂቃዎች በተስተካከሉ ክፍሎች ላይ ተተግብሯል። ከዚያም ተንሸራታቾቹ በPBS ታጥበው ሱዳን ብላክ በእያንዳንዱ ስላይድ ላይ ተጨምሮ ለ30 ደቂቃዎች እንዲታቀፉ ተደርጓል። ከዚያም ተንሸራታቾቹ በPBS ታጥበው ቬክታሼልድ ኢምቤዲንግ ሜዲ ተጨምሯል። ተንሸራታቾቹ በ40x ማጉላት በኪየንስ ማይክሮስኮፕ ላይ ታይተዋል።
ኦቲሲቲ ከላይ እንደተገለጸው ከናሙናዎቹ ተወግዷል። ኦቲሲቲውን ካስወገዱ በኋላ፣ ስላይዶቹን በቡይን መፍትሄ ውስጥ በአንድ ሌሊት አጥለቅልቀውታል። ከዚያም ስላይዶቹ ለ1 ሰዓት በተጣራ ውሃ ታጥበው ከዚያም በቢብሪች አሎይ አሲድ ፉችሲን መፍትሄ ውስጥ ለ10 ደቂቃዎች ተቀምጠዋል። ከዚያም ስላይዶቹ በተጣራ ውሃ ታጥበው ለ10 ደቂቃዎች በ5% ፎስፎሞሊብዴነም/5% ፎስፎቱንግስቲክ አሲድ መፍትሄ ውስጥ ተቀምጠዋል። ሳያጠቡ፣ ስላይዶቹን በቀጥታ ወደ አኒሊን ሰማያዊ መፍትሄ ለ15 ደቂቃዎች ያስተላልፉ። ከዚያም ስላይዶቹ በተጣራ ውሃ ታጥበው ለ2 ደቂቃዎች በ1% አሲቲክ አሲድ መፍትሄ ውስጥ ተቀምጠዋል። ስላይዶቹ በ200 N ኤታኖል ደርቀው ወደ ክሲሊን ተላልፈዋል። የተበከሉ ስላይዶች በ10x ዓላማ ባለው የኪየንስ ማይክሮስኮፕ በመጠቀም በምስል ታይተዋል። የፋይብሮሲስ አካባቢ መቶኛ በኪየንስ አናሌተር ሶፍትዌር በመጠቀም ተለካ።
የCyQUANT™ MTT የሕዋስ ቫይቢሊቲ ምርመራ (Invitrogen፣ Carlsbad፣ CA)፣ የካታሎግ ቁጥር V13154፣ በአምራቹ ፕሮቶኮል መሠረት፣ አንዳንድ ማሻሻያዎችን በማድረግ። በተለይም፣ በMTT ትንተና ወቅት ተመሳሳይ የሆነ የቲሹ መጠን ለማረጋገጥ 6 ሚሜ የሆነ ዲያሜትር ያለው የቀዶ ጥገና ፓንች ጥቅም ላይ ውሏል። ሕብረ ሕዋሳት በአምራቹ ፕሮቶኮል መሠረት MTT ንጣፍ በያዘ ባለ 12 ጉድጓድ ሳህን ጉድጓዶች ውስጥ ለብቻቸው ተለጥፈዋል። ክፍሎቹ በ37°ሴ ለ3 ሰዓታት እንዲቀዘቅዙ ተደርገዋል እና ሕያው ሕብረ ሕዋሱ የMTT ንጣፍን በመቀየር ሐምራዊ ፎርማዛን ውህድ ይፈጥራል። የMTT መፍትሄን በ1 ሚሊ ሊትር DMSO ይተኩት እና ከልብ ክፍሎች ውስጥ ሐምራዊ ፎርማዛን ለማውጣት ለ15 ደቂቃዎች በ37°ሴ ያቀዘቅዙ። ናሙናዎቹ በ96 በሚገባ ግልጽ በሆኑ የታችኛው ሳህኖች እና በ570 nm በሲቴሽን ፕሌት አንባቢ (ባዮቴክ) በመጠቀም በDMSO ውስጥ በ1፡10 ተቀልጠዋል። ንባቦች እንደ እያንዳንዱ የልብ ቁራጭ ክብደት መደበኛ ተደርገዋል።
የልብ ቁርጥራጭ ሚዲያ ቀደም ሲል እንደተገለጸው የግሉኮስ አጠቃቀም ምርመራ ለማድረግ 1 μCi/ml [5-3H]-ግሉኮስ (ሞራቬክ ባዮኬሚካልስ፣ ብሬአ፣ ካሊፎርኒያ፣ አሜሪካ) በያዘ ሚዲያ ተተክቷል። ከ4 ሰዓታት በኋላ ከተቀቀለ በኋላ፣ 100 µl መካከለኛ ወደ ክፍት ማይክሮ ሴንትሪፉጅ ቱቦ 100 µl የ0.2 N HCl የያዘ 100 µl መካከለኛ ይጨምሩ። ከዚያም ቱቦው በ37°ሴ ለ72 ሰዓታት እንዲተን [3H]2O] 500 μl dH2O በያዘ የሲንቲሌሽን ቱቦ ውስጥ ተቀምጧል። ከዚያም የማይክሮ ሴንትሪፉጅ ቱቦውን ከሲንቲሌሽን ቱቦ ውስጥ ያስወግዱ እና 10 ሚሊ ሊትር የሲንቲሌሽን ፈሳሽ ይጨምሩ። የሲንቲሌሽን ቆጠራዎች የተከናወኑት ትሪ-ካርብ 2900TR ፈሳሽ ሲንቲሌሽን አናሊዘር (ፓካርድ ባዮሳይንስ ኩባንያ፣ ሜሪደን፣ ሲቲ፣ አሜሪካ) በመጠቀም ነው። ከዚያም የግሉኮስ አጠቃቀም የተሰላው [5-3H]-የግሉኮስ የተወሰነ እንቅስቃሴን፣ ያልተሟላ ሚዛንን እና ዳራን፣ የ[5-3H]-ወደ ያልተሰየመ የግሉኮስ መጠን መቀነስን እና የስካንቲሌሽን ቆጣቢ ቅልጥፍናን ግምት ውስጥ በማስገባት ነው። መረጃው የልብ ክፍሎችን ክብደት ወደ መደበኛ ሁኔታ ይለውጣል።
በትሪዞል ውስጥ የቲሹ ተመሳሳይነት ከተፈጠረ በኋላ፣ አር ኤን ኤ በአምራቹ ፕሮቶኮል መሠረት የ Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 በመጠቀም ከልብ ክፍሎች ተለይቷል። የRNAsec ቤተ-መጽሐፍት ዝግጅት፣ ቅደም ተከተል እና የውሂብ ትንተና እንደሚከተለው ተካሂዷል፡
በአንድ ናሙና 1 μg RNA ለRNA ቤተ-መጽሐፍት ዝግጅት እንደ መነሻ ቁሳቁስ ጥቅም ላይ ውሏል። የቅደም ተከተል ቤተ-መጻሕፍት የተፈጠሩት የአምራቹን ምክሮች በመከተል ለኢሉሚና (NEB፣ ዩኤስኤ) የNEBNext UltraTM RNA ቤተ-መጻሕፍት ዝግጅት ኪት በመጠቀም ሲሆን ለእያንዳንዱ ናሙና የኢንዴክስ ኮዶች ወደ የባህሪ ቅደም ተከተሎች ተጨምረዋል። ​​በአጭሩ፣ mRNA ከፖሊ-ቲ ኦሊጎኑክሊዮታይዶች ጋር የተያያዙ ማግኔቲክ ዶቃዎችን በመጠቀም ከጠቅላላ RNA ተጠርጓል። ፍራግሜሽን የሚከናወነው በNEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) ውስጥ በከፍተኛ ሙቀት ውስጥ ባለ divalent cations በመጠቀም ነው። የመጀመሪያው ክር cDNA በዘፈቀደ ሄክሳመር ፕሪመሮች እና M-MuLV ተገላቢጦሽ ትራንስክሪፕሴዝ (RNase H-) በመጠቀም ነው የተዋሃደው። ሁለተኛው ክር cDNA ከዚያም በዲኤንኤ ፖሊሜሬዝ I እና RNase H በመጠቀም ይዋሃዳል። የተቀሩት ተንጠልጣዮች በ exonuclease/ፖሊሜሬዝ እንቅስቃሴ ወደ ብልጭልጭ ጫፎች ይቀየራሉ። የዲኤንኤ ቁራጭ 3′ ጫፍ አድኒላይዜሽን ከተደረገ በኋላ፣ የፀጉር ማያያዣ ሉፕ መዋቅር ያለው የNEBNext አዳፕተር ከእሱ ጋር ተያይዟል። የተመረጡ ርዝመቶች ከ150-200 bp የሆኑ የcDNA ቁርጥራጮችን ለመምረጥ የቤተ መፃህፍት ቁርጥራጮች በAMPure XP ሲስተም (ቤክማን ኮልተር፣ ቤቨርሊ፣ አሜሪካ) ተጠርገዋል። ከዚያም፣ በመጠን የተመረጠ cDNA ከአዳፕተር ጋር የተሳሰረ 3 μl USER Enzyme (NEB፣ USA) ለ15 ደቂቃዎች በ37°ሴ እና ከዚያም ከPCR በፊት ለ5 ደቂቃዎች በ95°ሴ ጥቅም ላይ ውሏል። ከዚያም PCR በPhusion High-Fidelity DNA polymerase፣ ዩኒቨርሳል PCR ፕሪመሮች እና Index (X) ፕሪመሮች በመጠቀም ተካሂዷል። በመጨረሻም፣ የPCR ምርቶች (AMPure XP ስርዓት) ተጠርገው የቤተ መፃህፍት ጥራት በAgilent Bioanalyzer 2100 ስርዓት ተገምግሟል። ከዚያም የcDNA ቤተ መፃህፍት በኖቫሴክ ሴኩዌንሰር ተከተሏል። ከኢሉሚና የተገኙ ጥሬ የምስል ፋይሎች በCASAVA ቤዝ ክሊንግ በመጠቀም ወደ ጥሬ ንባቦች ተቀይረዋል። ጥሬ ውሂብ የንባብ ቅደም ተከተሎችን እና ተዛማጅ የመሠረት ባህሪያትን በያዙ FASTQ(fq) ቅርጸት ፋይሎች ውስጥ ይቀመጣል። የተጣሩ የቅደም ተከተል ንባቦችን ከ Sscrofa11.1 የማጣቀሻ ጂኖም ጋር ለማዛመድ HISAT2ን ይምረጡ። በአጠቃላይ፣ HISAT2 ከ4 ቢሊዮን መሠረቶች በላይ የሆኑ ጂኖሞችን ጨምሮ ማንኛውንም መጠን ያላቸውን ጂኖሞች ይደግፋል፣ እና ነባሪ እሴቶች ለአብዛኛዎቹ መለኪያዎች ተቀናብረዋል። ከ RNA Seq ውሂብ የሚነሱ ንባቦች በአሁኑ ጊዜ ካለው ፈጣኑ ስርዓት HISAT2 ጋር በብቃት ሊስተካከሉ ይችላሉ፣ ይህም ከማንኛውም ዘዴ ጋር ተመሳሳይ ወይም የተሻለ ትክክለኛነት አለው።
የትራንስክሪፕቶች ብዛት በቀጥታ የጂን አገላለጽ ደረጃን ያንፀባርቃል። የጂን አገላለጽ ደረጃዎች የሚገመገሙት ከጂኖም ወይም ኤክሶኖች ጋር በተያያዙት የትራንስክሪፕቶች ብዛት (የቅደም ተከተል ቆጠራ) ነው። የንባቦች ብዛት ከጂን አገላለጽ ደረጃዎች፣ ከጂን ርዝመት እና ከቅደም ተከተል ጥልቀት ጋር ተመጣጣኝ ነው። FPKM (በሚሊዮን የመሠረት ጥንዶች የተቀናጁ የትራንስክሪፕቶች በሺዎች የሚቆጠሩ የመሠረት ጥንዶች ቁርጥራጮች) ተሰልተው የልዩነት አገላለጽ P-እሴቶች በDESeq2 ጥቅል በመጠቀም ተወስነዋል። ከዚያም አብሮ በተሰራው የR-ተግባር "p.adjust" ላይ በመመስረት ለእያንዳንዱ P እሴት የሐሰት ግኝት መጠን (FDR) አስልተናል።
ከልብ ክፍሎች የተነጠለው አር ኤን ኤ ከቴርሞ የተገኘውን የሱፐርስክሪፕት IV ቪሎ ማስተር ድብልቅ በመጠቀም በ200 ng/μl ክምችት ወደ cDNA ተቀይሯል (ቴርሞ፣ ድመት ቁጥር 11756050)። ቁጥራዊ RT-PCR የተከናወነው በApplied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well transparent reaction plate (ቴርሞ፣ ድመት ቁጥር 4483319) እና ማይክሮአምፕ ኦፕቲካል ማጣበቂያ (ቴርሞ፣ ድመት ቁጥር 4311971) በመጠቀም ነው። የምላሽ ቅይጡ 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (ቴርሞ፣ ድመት ቁጥር 4444557)፣ 0.5 µl Taqman Primer እና 3.5 µl H2O በአንድ ጉድጓድ የተቀላቀለ ነበር። መደበኛ የqPCR ዑደቶች ተካሂደዋል እና የሲቲ እሴቶች የተለኩት በApplied Biosystems Quantstudio 5 real-time PCR መሳሪያ (384-well module፤ produkt # A28135) በመጠቀም ነው። የታክማን ፕሪመሮች የተገዙት ከቴርሞ (GAPDH (Ss03375629_u1)፣ PARP12 (Ss06908795_m1)፣ PKDCC (Ss06903874_m1)፣ CYGB (Ss06900188_m1)፣ RGL1 (Ss06868890_m1)፣ ACTN1 (Ss01009508_mH)፣ GATA4 (Ss03383805_u1)፣ GJA1 (Ss03374839_u1)፣ COL1A2 (Ss03375009_u1)፣ COL3A1 (Ss04323794_m1)፣ ACTA2 (Ss04245588_m1) ነው። የሁሉም ናሙናዎች የሲቲ እሴቶች ወደ የቤት አያያዝ ጂን GAPDH መደበኛ ተደርገዋል።
የNT-ProBNP የሚዲያ ልቀት በአምራቹ ፕሮቶኮል መሠረት በNT-ProBNP ኪት (አሳማ) (ድመት ቁጥር MBS2086979፣ MyBioSource) በመጠቀም ተገምግሟል። በአጭሩ፣ ከእያንዳንዱ ናሙና እና ደረጃ 250 µl በእያንዳንዱ ጉድጓድ ላይ በሁለት እጥፍ ተጨምሯል። ናሙናውን ከጨመሩ በኋላ ወዲያውኑ በእያንዳንዱ ጉድጓድ ላይ 50 µl የአሳሽ ሪጀንት A ይጨምሩ። ሳህኑን በቀስታ ያናውጡት እና በማሸጊያው ይሸፍኑት። ከዚያም ታብሌቶቹ በ37°ሴ ለ1 ሰዓት እንዲታቀፉ ተደርገዋል። ከዚያም መፍትሄውን ወደ ውስጥ አፍስሱ እና ጉድጓዶቹን በ350 µl የ1x ማጠቢያ መፍትሄ 4 ጊዜ ያጠቡ፣ በእያንዳንዱ ጊዜ ለ1-2 ደቂቃዎች የማጠቢያ መፍትሄውን ያቀዘቅዙ። ከዚያም በእያንዳንዱ ጉድጓድ 100 µl የአሳሽ ሪጀንት B ይጨምሩ እና በፕላት ማሸጊያው ያሽጉ። ታብሌቱ በቀስታ ተናወጠ እና በ37°ሴ ለ30 ደቂቃዎች እንዲታጠብ ተደርጓል። መፍትሄውን አፍነው ጉድጓዶቹን በ350 µl 1x የማጠቢያ መፍትሄ 5 ጊዜ ያጠቡ። በእያንዳንዱ ጉድጓድ ላይ 90 µl የንጥረ ነገር መፍትሄ ይጨምሩ እና ሳህኑን ይዝጉት። ሳህኑን በ37°ሴ ለ10-20 ደቂቃዎች ያቀዘቅዙ። በእያንዳንዱ ጉድጓድ ላይ 50 µl የማቆሚያ መፍትሄ ይጨምሩ። ሳህኑ ወዲያውኑ በ450 nm ላይ በሳይቴሽን (ባዮቴክ) የታርጋ አንባቢ በመጠቀም ተለከ።
የኃይል ትንተናዎች የተከናወኑት ከ80% በላይ ኃይል የሚሰጡ የቡድን መጠኖችን ለመምረጥ ሲሆን ይህም በፓራሜትር ውስጥ 10% ፍጹም ለውጥን በ5% ዓይነት I የስህተት መጠን ለመለየት ያስችላል። የኃይል ትንተናዎች የተከናወኑት ከ80% በላይ ኃይል የሚሰጡ የቡድን መጠኖችን ለመምረጥ ሲሆን ይህም በፓራሜትር ውስጥ 10% ፍጹም ለውጥን በ5% ዓይነት I የስህተት መጠን ለመለየት ያስችላል። Анализ мощnost изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. የኃይል ትንተና የተካሄደው ከ80% በላይ ኃይል የሚሰጡ የቡድን መጠኖችን ለመምረጥ ሲሆን ይህም በ5% ዓይነት I የስህተት መጠን 10% ፍጹም የሆነ የፓራሜትር ለውጥን ለመለየት ያስችላል።进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I廋發得中变化和5％I廋给。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I廋發得中变化和5％I廋给。 Быl проведен анализ мощности для выBORA размера групpy, который обеспечил бы > 80% ኤም.ኦ.ሲ. абсолютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. የ10% ፍጹም የፓራሜትር ለውጥ እና የ5% አይነት I የስህተት መጠንን ለመለየት ከ80% በላይ ኃይል የሚሰጥ የቡድን መጠን ለመምረጥ የኃይል ትንተና ተካሂዷል።ከሙከራው በፊት የቲሹ ክፍሎች በዘፈቀደ ተመርጠዋል። ሁሉም ትንታኔዎች ሁኔታዊ ያልሆኑ ነበሩ እና ናሙናዎች የተፈቱት ሁሉም መረጃዎች ከተተነተኑ በኋላ ብቻ ነው። GraphPad Prism ሶፍትዌር (ሳንዲያጎ፣ ካሊፎርኒያ) ሁሉንም የስታቲስቲክስ ትንታኔዎች ለማከናወን ጥቅም ላይ ውሏል። ለሁሉም ስታቲስቲክስ፣ የp-እሴቶች በ<0.05 እሴቶች ላይ ጉልህ እንደሆኑ ተደርገው ይቆጠሩ ነበር። ለሁሉም ስታቲስቲክስ፣ p-values ​​​​በእሴቶች <0.05 ላይ ጉልህ እንደሆኑ ተደርገው ይቆጠሩ ነበር። Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. ለሁሉም ስታቲስቲክስ፣ p-values ​​​​በእሴቶች <0.05 ላይ ጉልህ እንደሆኑ ተደርገው ይቆጠሩ ነበር።对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. ለሁሉም ስታቲስቲክስ፣ p-values ​​​​በእሴቶች <0.05 ላይ ጉልህ እንደሆኑ ተደርገው ይቆጠሩ ነበር።ባለ ሁለት ጭራ ተማሪ የቲ-ሙከራ ሙከራ የተከናወነው በመረጃው ላይ ሲሆን ሁለት ንጽጽሮችን ብቻ በመጠቀም ነው። በብዙ ቡድኖች መካከል ያለውን ጠቀሜታ ለመወሰን የአንድ ወይም የሁለት መንገድ ANOVA ጥቅም ላይ ውሏል። የድህረ-ሆክ ፈተናዎችን ሲያከናውን፣ የቱኪ እርማት ለብዙ ንጽጽሮች ግምት ውስጥ በማስገባት ተተግብሯል። የRNAsec መረጃ FDRን ሲያሰላ እና በዘዴዎች ክፍል ውስጥ እንደተገለጸው p.adjust ሲሰላ ልዩ የስታቲስቲክስ ጉዳዮች አሉት።
ስለ ጥናት ዲዛይን ተጨማሪ መረጃ ለማግኘት፣ ከዚህ ጽሑፍ ጋር የተገናኘውን የተፈጥሮ ምርምር ሪፖርት ማጠቃለያ ይመልከቱ።