Ďakujeme, že ste navštívili Nature.com.Verzia prehliadača, ktorú používate, má obmedzenú podporu CSS.Pre najlepší zážitok vám odporúčame použiť aktualizovaný prehliadač (alebo vypnúť režim kompatibility v programe Internet Explorer).Medzitým, aby sme zabezpečili nepretržitú podporu, vykreslíme stránku bez štýlov a JavaScriptu.
Je potrebné spoľahlivý systém in vitro, ktorý môže presne reprodukovať fyziologické prostredie srdca na testovanie liekov.Obmedzená dostupnosť systémov kultúry tkanív ľudského srdca viedla k nepresným interpretáciou účinkov srdcových liekov.Tu sme vyvinuli model srdcového tkanivového kultúry (CTCM), ktorý elektromechanicky stimuluje plátky srdca a prechádza fyziologickým úsekom počas systolických a diastolických fáz srdcového cyklu.Po 12 dňoch kultúry tento prístup čiastočne zlepšil životaschopnosť srdcových sekcií, ale úplne nezachoval svoju štrukturálnu integritu.Preto sme po skríningu malých molekúl zistili, že pridanie 100 nM triodotyronínu (T3) a 1 μm dexametazón (DEX) do nášho média udržiavalo mikroštruktúru rezov počas 12 dní.V kombinácii s ošetrením T3/DEX si systém CTCM udržiaval transkripčné profily, životaschopnosť, metabolickú aktivitu a štrukturálnu integritu na rovnakej úrovni ako čerstvé srdcové tkanivo počas 12 dní.Okrem toho nadmerné rozťahovanie srdcového tkaniva v kultúre indukuje hypertrofickú srdcovú signalizáciu, čo poskytuje dôkaz o schopnosti CTCM napodobňovať hypertrofické stavy vyvolané srdcovým úsekom.Záverom možno povedať, že CTCM môže modelovať fyziológiu a patofyziológiu srdca v kultúre po dlhú dobu, čo umožňuje spoľahlivý skríning liekov.
Pred klinickým výskumom sú potrebné spoľahlivé systémy in vitro, ktoré môžu presne reprodukovať fyziologické prostredie ľudského srdca.Takéto systémy by mali napodobňovať zmenený mechanický úsek, srdcový rytmus a elektrofyziologické vlastnosti.Zvieracie modely sa bežne používajú ako skríningová platforma pre srdcovú fyziológiu s obmedzenou spoľahlivosťou pri odrážaní účinkov liekov v ľudskom srdci 1,2.V konečnom dôsledku je ideálny experimentálny model kultúry srdcového tkaniva (CTCM) model, ktorý je vysoko citlivý a špecifický pre rôzne terapeutické a farmakologické zásahy, ktorý presne reprodukuje fyziológiu a patofyziológiu ľudského srdca3.Neprítomnosť takého systému obmedzuje objavenie nových liečebných postupov srdcového zlyhania4,5 a viedla k kardiotoxicite liekov ako hlavným dôvodom výstupu na trhu6.
V poslednom desaťročí bolo osem nekardiovaskulárnych liekov stiahnutých z klinického použitia, pretože spôsobujú predĺženie intervalu QT, čo vedie k komorovým arytmiám a náhlej smrti7.Zvyšuje sa teda potreba spoľahlivých predklinických skríningových stratégií na vyhodnotenie kardiovaskulárnej účinnosti a toxicity.Nedávne použitie ľudských indukovaných pluripotentných kardiomyocytov odvodených od kmeňových buniek (HIPS-CM) pri skríningu liečiva a testovaní toxicity poskytuje čiastočné riešenie tohto problému.Nezrelá povaha HIP-CM a nedostatok mnohobunkovej zložitosti srdcového tkaniva sú však hlavnými obmedzeniami tejto metódy.Posledné štúdie ukázali, že toto obmedzenie možno čiastočne prekonať použitím skorých HIPS-CM na vytvorenie hydrogélov srdcového tkaniva krátko po nástupe spontánnych kontrakcií a postupne zvyšujúca sa elektrická stimulácia v priebehu času.Tieto mikrotívy HIPS-CM však chýbajú zrelé elektrofyziologické a kontraktilné vlastnosti dospelého myokardu.Okrem toho má ľudské srdcové tkanivo komplexnejšiu štruktúru, ktorá pozostáva z heterogénnej zmesi rôznych typov buniek, vrátane endotelových buniek, neurónov a stromálnych fibroblastov, prepojených špecifickými množinami proteínov extracelulárnej matrice.Táto heterogenita populácií nekardiomyocytov11,12,13 v srdci dospelých cicavcov je hlavnou prekážkou modelovania srdcového tkaniva pomocou jednotlivých typov buniek.Tieto hlavné obmedzenia zdôrazňujú dôležitosť vývoja metód na kultiváciu neporušeného tkaniva myokardu vo fyziologických a patologických podmienkach.
Kultivované tenké (300 um) rezy ľudského srdca sa ukázali ako sľubný model neporušeného ľudského myokardu.Táto metóda poskytuje prístup k kompletnému 3D mnohobunkovému systému podobného tkaniva ľudského srdca.Až do roku 2019 bolo však použitie kultivovaných sekcií srdca obmedzené krátkym (24 hodinovým prežitím kultúry.Je to kvôli mnohým faktorom vrátane nedostatku fyzikálneho mechanického úseku, rozhrania vzduchovej kvapaliny a používania jednoduchých médií, ktoré nepodporujú potreby srdcového tkaniva.V roku 2019 niekoľko výskumných skupín preukázalo, že začlenenie mechanických faktorov do systémov kultúry srdcových tkanív môže predĺžiť život v kultúre, zlepšiť srdcovú expresiu a mimickú srdcovú patológiu.Dve elegantné štúdie 17 a 18 ukazujú, že jednoosové mechanické zaťaženie má pozitívny vplyv na srdcový fenotyp počas kultúry.Tieto štúdie však nepoužívali dynamické trojrozmerné fyzikálno-mechanické zaťaženie srdcového cyklu, pretože srdcové rezy boli naložené buď izometrickými ťahovými silami 17 alebo lineárnym pomocným zaťažením 18.Tieto metódy natiahnutia tkaniva viedli k potlačeniu mnohých srdcových génov alebo k nadmernej expresii génov spojených s abnormálnymi reakciami na roztiahnutie.Najmä Pitoulis a kol.19 sa vyvinula dynamická kúpeľňa srdcových plátkov pre rekonštrukciu srdcového cyklu s použitím spätnej väzby pre prevodník a napätia.Aj keď tento systém umožňuje presnejšie modelovanie srdcového cyklu in vitro, zložitosť a nízka priepustnosť metódy obmedzuje použitie tohto systému.Naše laboratórium nedávno vyvinulo zjednodušený kultivačný systém využívajúci elektrickú stimuláciu a optimalizované médium na udržanie životaschopnosti úsekov tkaniva ošípaných a ľudského srdca až po 6 dní 20,21.
V súčasnom rukopise opíšeme model kultúry srdcového tkaniva (CTCM) s použitím rezov ošípaného srdca, ktoré zahŕňajú humorálne narážky na rekapituláciu trojrozmernej srdcovej fyziológie a patofyziologickej distenzie počas srdcového cyklu.Tento CTCM môže zvýšiť presnosť predklinickej predikcie liečiva na úroveň, ktorá sa nikdy predtým nedosiahla poskytnutím nákladovo efektívneho, strednodobého srdcového systému, ktorý napodobňuje fyziológiu/patofyziológiu srdca cicavcov na predklinické testovanie liekov.
Hemodynamické mechanické signály hrajú rozhodujúcu úlohu pri udržiavaní funkcie kardiomyocytov in vitro 22,23,24.V súčasnom rukopise sme vyvinuli CTCM (obrázok 1A), ktoré dokážu napodobňovať dospelé srdcové prostredie indukciou elektrickej aj mechanickej stimulácie pri fyziologických frekvenciách (1,2 Hz, 72 úderov za minútu).Aby sa predišlo nadmernému tkanivovému úseku počas diastoly, 3D tlačové zariadenie sa použilo na zvýšenie veľkosti tkaniva o 25% (obr. 1B).Elektrická stimulácia indukovaná systémom C-PACE bola načasovaná na začiatok 100 ms pred systolom pomocou systému na získanie údajov na úplnú reprodukciu srdcového cyklu.Systém tkanivovej kultúry využíva programovateľný pneumatický ovládač (LB Engineering, Nemecko) na cyklické rozšírenie flexibilnej silikónovej membrány, aby spôsobil rozšírenie srdcových plátkov v hornej komore.Systém bol pripojený k vonkajšiemu vzduchovému vedeniu cez tlakový prevodník, ktorý umožnil presne upraviť tlak (± 1 mmHg) a čas (± 1 ms) (obr. 1C).
Pripojte časť tkaniva k podpornému krúžku 7 mm, zobrazený modrou farbou vo vnútri kultivačnej komory zariadenia.Kultúrna komora je od vzduchovej komory oddelená tenkou flexibilnou silikónovou membránou.Umiestnite tesnenie medzi každú komoru, aby ste zabránili úniku.Veko zariadenia obsahuje grafitové elektródy, ktoré poskytujú elektrickú stimuláciu.B Schematické znázornenie veľkého tkanivového zariadenia, vodiaci krúžok a podporný krúžok.Tkanivové úseky (hnedé) sú umiestnené na nadmernom zariadení s vodiacim krúžkom umiestneným v drážke na vonkajšom okraji zariadenia.Pomocou sprievodcu opatrne umiestnite podporný krúžok potiahnutý tkanivovým akrylovým lepidlom na časť srdcového tkaniva.C graf ukazujúci čas elektrickej stimulácie ako funkcia tlaku vzduchovej komory riadeného programovateľným pneumatickým ovládačom (PPD).Na synchronizáciu elektrickej stimulácie pomocou tlakových senzorov sa použilo zariadenie na získavanie údajov.Keď tlak v kultivačnej komore dosiahne stanovenú prahovú hodnotu, pulzný signál sa odošle do C-Pace-EM na spustenie elektrickej stimulácie.D Obrázok štyroch CTCM umiestnených na inkubátorskej polici.Štyri zariadenia sú pripojené k jednému PPD prostredníctvom pneumatického obvodu a tlakové senzory sa vkladajú do hemostatického ventilu, aby sa monitoroval tlak v pneumatickom obvode.Každé zariadenie obsahuje šesť častí tkaniva.
Pomocou jediného pneumatického ovládača sme boli schopní ovládať 4 CTCM zariadenia, z ktorých každé dokázali držať 6 tkanivových rezov (obr. 1D).V CTCM sa tlak vzduchu vo vzduchovej komore premieňa na synchrónny tlak v tekutej komore a indukuje fyziologickú expanziu srdcového plátku (obrázok 2A a doplnkový film 1).Hodnotenie tkanivového úseku pri 80 mm Hg.Umenie.vykazovalo rozťahovanie tkanivových rezov o 25% (obr. 2B).Ukázalo sa, že tento percentuálny úsek zodpovedá fyziologickej dĺžke sarkómu 2,2–2,3 µm pre normálnu kontraktilitu srdcovej sekcie17,19,25.Pohyb tkanív sa hodnotil pomocou vlastných nastavení fotoaparátu (doplnkový obrázok 1).Amplitúda a rýchlosť pohybu tkaniva (obr. 2C, D) zodpovedali napínaniu počas srdcového cyklu a času počas systoly a diastoly (obr. 2B).Stretch a rýchlosť srdcového tkaniva počas kontrakcie a relaxácie zostali konštantné 12 dní v kultúre (obr. 2F).Na vyhodnotenie účinku elektrickej stimulácie na kontraktilitu počas kultúry sme vyvinuli metódu určovania aktívnej deformácie pomocou tieňovacieho algoritmu (doplnkový obrázok 2A, B) a boli sme schopní rozlíšiť medzi deformáciami s elektrickou stimuláciou a bez nich.Rovnaká časť srdca (obr. 2F).V pohyblivej oblasti rezu (R6-9) bolo napätie počas elektrickej stimulácie o 20% vyššie ako v neprítomnosti elektrickej stimulácie, čo naznačuje príspevok elektrickej stimulácie k kontraktilnej funkcii.
Reprezentatívne stopy tlaku vzduchovej komory, tlaku kvapaliny a merania pohybu tkanív potvrdzujú, že tlak v komore mení tlak v komore, čo spôsobuje zodpovedajúci pohyb rezu tkaniva.c Nameraný pohyb srdcového plátku je v súlade s nameranou rýchlosťou pohybu.(D) Reprezentatívne trajektórie cyklického pohybu (modrá čiara) a rýchlosti (oranžová bodkovaná čiara) v kúsku srdca.E kvantifikácia času cyklu (n = 19 plátkov na skupinu, z rôznych ošípaných), čas kontrakcie (n = 19 plátkov na skupinu), relaxačný čas (n = 19 plátkov na skupinu, z rôznych ošípaných), pohyb tkaniva (n = 25).plátky)/skupina z rôznych ošípaných), špičková systolická rýchlosť (n = 24 (D0), 25 (D12) plátky/skupina z rôznych ošípaných) a rýchlosť maximálnej relaxácie (n = 24 (D0), 25 (D12) plátky/skupina z rôznych ošípaných).T-test Two-Tailed Studentov T-test nevykazoval žiadny významný rozdiel v žiadnom parametri.Spodné panely ukazujú kvantifikáciu percentuálneho rozdielu v napätí v tkanivových úsekoch s elektrickou stimuláciou a bez nich v desiatich oblastiach z rôznych sekcií. (n = 8 plátkov/skupina z rôznych ošípaných, vykonáva sa dvojstranná študentská t-test; **** p <0,0001, ** p <0,01,*p <0,05). (n = 8 plátkov/skupina z rôznych ošípaných, vykonáva sa dvojstranná študentská t-test; **** p <0,0001, ** p <0,01,*p <0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-китерит п двусторонний t -критерий*P <0,05). (n = 8 rezov/skupina z rôznych ošípaných, T-test s dvojitým chvostom; **** p <0,0001, ** p <0,01,*p <0,05). （N = 8 片/组 ， 来自 不同 的 ， 进行 双尾 学生 学生 T 检验 ； **** P <0,0001 ， ** p <0,01 ，*p <0,05）。 （N = 8 片/组 ， 来自 不同 的 ， 进行 双尾 学生 学生 T 检验 ； **** P <0,0001 ， ** p <0,01 ，*p <0,05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий стююента; **** p <0 0001, ** P <0,01,*p <0,05). (n = 8 sekcií/skupina, z rôznych ošípaných, T-test s dvojstranným študentom; **** p <0,0001, ** p <0,01,*p <0,05).Chybové stĺpce predstavujú priemernú ± štandardnú odchýlku.
V našom predchádzajúcom statickom biomimetickom kultúrnom systéme srdcových rezov [20, 21] sme si zachovali životaschopnosť, funkciu a štrukturálnu integritu plátkov srdca počas 6 dní použitím elektrickej stimulácie a optimalizáciou stredného zloženia.Po 10 dňoch však tieto čísla prudko klesli.Budeme odkazovať na sekcie kultivované v našom predchádzajúcom systéme statickej biomimetickej kultúry 20, 21 kontrolných podmienok (CTRL) a naše predtým optimalizované médium použijeme ako MC podmienky a kultúru pri súčasnej mechanickej a elektrickej stimulácii (CTCM).volá.Najprv sme zistili, že mechanická stimulácia bez elektrickej stimulácie nebola dostatočná na udržanie životaschopnosti tkaniva počas 6 dní (doplnkový obr. 3A, b).Je zaujímavé, že so zavedením fyzio-mechanickej a elektrickej stimulácie pomocou STCM zostala životaschopnosť 12-dňových srdcových rezov rovnaká ako v čerstvých srdcových rezoch za podmienok MS, ale nie za podmienok CTRL, ako je znázornené analýzou MTT (obr. 1).3a).To naznačuje, že mechanická stimulácia a simulácia srdcového cyklu môže udržiavať tkanivové rezy životaschopné dvakrát tak dlho, ako sa uvádza v našom predchádzajúcom systéme statickej kultúry.Hodnotenie štrukturálnej integrity tkanivových rezov imunozerovaním srdcového troponínu T a konexínu 43 však ukázalo, že expresia konexínu 43 bola významne vyššia v tkanivách MC v deň 12 ako v kontrolách v ten istý deň.Rovnomerná expresia konexínu 43 a tvorba Z-DISC sa však úplne nezachovali (obr. 3B).Na kvantifikáciu tkanivovej štrukturálnej integrity26, hlbokého učenia založeného na troponínovom a konexínskom farbení43, používame rámec umelej inteligencie (AI) na automatickú kvantifikáciu štrukturálnej integrity a fluorescencie srdcových plátkov z hľadiska sily lokalizácie.Táto metóda používa konvolučnú neurónovú sieť (CNN) a hlboký rámec na učenie na spoľahlivú kvantifikáciu štrukturálnej integrity srdcového tkaniva automatizovaným a nezaujatým spôsobom, ako je opísané v referencii.26. MC tkanivo vykazovalo zlepšenú štrukturálnu podobnosť s dňom 0 v porovnaní so statickými kontrolnými úsekmi.Okrem toho Massonovo farbenie trichrómu odhalilo významne nižšie percento fibrózy za podmienok MS v porovnaní s kontrolnými podmienkami v deň 12 kultúry (obr. 3C).Zatiaľ čo CTCM zvýšila životaschopnosť sekcií srdcového tkaniva v dni 12 na úroveň podobnú miere v tkanive čerstvého srdca, významne nezlepšila štrukturálnu integritu srdcových rezov.
Stĺpcový graf ukazuje kvantifikáciu MTT životaschopnosti rezov čerstvých srdcových plátkov (D0) alebo srdcových rezov počas 12 dní buď v statickej kultúre (D12 CTRL) alebo v CTCM (D12 MC) (N = 18 (D0), 15 (D12 CTRL), 12 (D12 MC) v porovnaní s rôznymi ošípanými ošípanými, jedným spôsobom AVA AVA Test; D12 Ctrl). Stĺpcový graf ukazuje kvantifikáciu MTT životaschopnosti rezov čerstvých srdcových plátkov (D0) alebo srdcových rezov počas 12 dní buď v statickej kultúre (D12 CTRL) alebo v CTCM (D12 MC) (N = 18 (D0), 15 (D12 CTRL), 12 (D12 MC) v porovnaní s rôznymi ošípanými ošípanými, jedným spôsobom AVA AVA Test; D12 Ctrl).Histogram ukazuje kvantifikáciu životaschopnosti čerstvých srdcových rezov MTT (D0) alebo kultúry srdcových rezov počas 12 dní v statickej kultúre (D12) alebo CTCM (D12 MC) (N = 18 (D0), 15 (D12 kontrola).).), 12 (D12 MC)), 12 (D12 MC)), 12 (D12 MC), rezy/skupina z rôznych ošípaných ošípaných, jednorazový test AVERA AVERA sa vykonáva;#### P <0 0001 по сравнению с D0 и ** P <0,01 по сравнению с D12 Ctrl). #### p <0,0001 v porovnaní s D0 a ** P <0,01 v porovnaní s D12 Ctrl). a 条形图 显示 在 静态 培养 (d12 ctrl) 或 ctcm (d12 mc) (n = 18 (d0), 15 (d12 ctrl) 中 心脏 切片 (d0) 或 心脏 切片 培养 切片 天 的 单向 测试 测试 单向 单向 测试 测试 测试相比 ， #### p <0,0001 ， 与 d12 ctrl 相比 ， ** p <0,01)。 A 条形图 显示 在 静态 培养 (D12 Ctrl) 或 CTCM (D12 mc) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中 心脏 切片 (D0)相比 ， ** p。)Histogram ukazujúci kvantifikáciu životaschopnosti MTT v čerstvých srdcových rezoch (D0) alebo srdcových rezoch kultivovaných počas 12 dní v statickej kultúre (kontrola D12) alebo CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrola D12)), 12 (D12 MC) rezy/skupina z rôznych ošípaných, jednosmerný test ANOVA;#### p <0 0001 по сравнению с d0, ** p <0,01 п сравнению с d12 ctrl). #### p <0,0001 v porovnaní s D0, ** p <0,01 v porovnaní s D12 Ctrl).B troponín-T (zelená), konexín 43 (červená) a DAPI (modrá) v čerstvo izolovaných srdcových rezoch (D0) alebo srdcové rezy kultivované za statických podmienok (CTRL) alebo CTCM podmienky (MC) počas 12 dní) reprezentatívnych imunofluorescenčných obrazov (prázdna stupnica = 100 µm). Kvantifikácia umelej inteligencie štrukturálnej integrity srdcového tkaniva (n = 7 (D0), 7 (D12 CTRL), 5 (D12 mc) plátky/skupina z rôznych ošípaných, sa vykonáva jednosmerný test ANOVA; #### p <0,0001 v porovnaní s D0 a **** P <0,0001 v porovnaní s D12 Ctrl). Kvantifikácia umelej inteligencie štrukturálnej integrity srdcového tkaniva (n = 7 (D0), 7 (D12 CTRL), 5 (D12 mc) plátky/skupiny z rôznych ošípaných, vykonáva sa jednosmerný test ANOVA; #### p <0,0001 v porovnaní s D0 a **** P <0,0001 v porovnaní s D12 Ctrl). Количественная ценка структурной целостности сердечной ткани искуской ткч (d12), 7 (d12) (d12) (d12) (d12) (d12) (d12) ( групп от разных свиней, проводится однорарный тест ANOVA; ### P <0 0001 по с с с12 Ctrl). Kvantifikácia štrukturálnej integrity srdcového tkaniva umelou inteligenciou (n = 7 (D0), 7 (D12 CTRL), 5 (D12 mc) rezy/skupiny z rôznych ošípaných, jednosmerná ANOVA test; ### P <0,0001 vs. s D0 a **** P <0,0001 v porovnaní s D12 Ctrl).人工 智能量化 心脏 组织 完整性 （（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 mc) plátky/skupina rôznych ošípaných, jednosmerný test ANOVA;人工 智能量化 心脏 组织 完整性 （（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 mc) plátky/skupina rôznych ošípaných, jednosmerný test ANOVA; Искуственный интелелект для количественной ценки структурной целостосттти сердеч т т т т// n = 7 (d0), 7 (d12) ( групví каждой из разных свиней, одностороний тест ANOVA; #### p <0 0001 vs. Umelá inteligencia na kvantifikáciu štrukturálnej integrity srdcového tkaniva (n = 7 (D0), 7 (D12 CTRL), 5 (d12 mc) rezy/skupina rôznych ošípaných, jednosmerný test ANOVA; ### P <0,0001 vs .D0 pre porovnanie **** P <0,0001 v porovnaní s D12 Ctrl). C Reprezentatívne snímky (vľavo) a kvantifikácia (vpravo) pre plátky srdca zafarbené Massonovým trichrómovým farbením (Scale holé = 500 um) (n = 10 plátkov/skupiny z rôznych ošípaných, vykonáva sa jednosmerný test ANOVA; #### p <0,0001 v porovnaní s D0 a *** P <0,001 v porovnaní s D12 Ctrl). C Reprezentatívne obrázky (vľavo) a kvantifikácia (vpravo) pre plátky srdca zafarbené Massonovým trichrómovým farbením (Scale holé = 500 um) (n = 10 plátkov/skupiny z rôznych ošípaných, vykonáva sa jednosmerný test ANOVA; #### p <0,0001 v porovnaní s D0 a *** P <0,001 v porovnaní s D12 Ctrl). C Reprezentatívne obrazy (vľavo) a kvantifikácia (vpravo) rezov srdca zafarbené Massonovým trichrómovým farbením (nepotiahnutá stupnica = 500 um) (n = 10 rezov/skupina z rôznych ošípaných, jednosmerný test ANOVA vykonaného; #### p <0 0001 v porovnaní s D0 a *** P <0,001 v porovnaní s D12 Ctrl). C 用 Masson 三 色 染料 染色 的 心脏 切片 代表性 图像 （左 左） 量化 （右 （裸尺度 裸尺度 ， 进行 进行 进行 ， ， ， ， 进行 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 （（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（（； ； ； ， ， ， ， ， 进行 进行 单向 单向 单向 （（（（（（； ； ； ； ； ， l 相比）。 C 用 Masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 （左 左 左 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度 单 向 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 单 向 向 向 向 向 （（测试 ； ；#； 每 与 ， ， ， trl 相比）。 C Reprezentatívne obrazy (vľavo) a kvantifikácia (vpravo) rezov srdca zafarbené Massonovou trichrómovou farbou (prázdne = 500 um) (n = 10 rezov/skupina, každá z iného ošípaného, ​​testovaná jednosmernou analýzou rozptylu; #### P <0,0001 v porovnaní s D0, *** P <0,001 v porovnaní s D12 Ctrl).Chybové stĺpce predstavujú priemernú ± štandardnú odchýlku.
Predpokladali sme, že pridaním malých molekúl do kultivačného média by sa mohla zlepšiť integrita kardiomyocytov a vývoj fibrózy sa počas CTCM kultúry znížil.Preto sme skrínovali malé molekuly pomocou našich statických kontrolných kultúr20,21 z dôvodu malého počtu mätúcich faktorov.Na túto obrazovku boli vybrané dexametazón (DEX), triodotyronín (T3) a SB431542 (SB).Tieto malé molekuly sa predtým používali v kultúrach HIPSC-CM na vyvolanie dozrievania kardiomyocytov zvýšením dĺžky sarkómu, T-tubulov a rýchlosti vodivosti.Okrem toho je známe, že Dex (glukokortikoid) aj SB potláčajú zápal29,30.Preto sme testovali, či by zahrnutie jednej alebo kombinácie týchto malých molekúl zlepšilo štrukturálnu integritu srdcových sekcií.Pri počiatočnom skríningu bola dávka každej zlúčeniny vybraná na základe koncentrácií bežne používaných v modeloch bunkovej kultúry (1 μM DEX27, 100 nM T327 a 2,5 uM SB31).Po 12 dňoch kultúry viedla kombinácia T3 a DEX k optimálnej štrukturálnej integrite kardiomyocytov a minimálnej vláknitej remodelácii (doplnkové obrázky 4 a 5).Okrem toho použitie dvojitých alebo dvojitých koncentrácií T3 a DEX vyvolalo škodlivé účinky v porovnaní s normálnymi koncentráciami (doplnkový obr. 6A, B).
Po počiatočnom skríningu sme vykonali porovnanie 4 kultivačných podmienok hlavy a hlavy (obrázok 4A): CTRL: srdcové rezy kultivované v našej predtým opísanej statickej kultúre pomocou nášho optimalizovaného média;20,21 TD: T3 a Ctrl S pridané v stredu DEX;MC: srdcové sekcie kultivované v CTCM pomocou nášho predtým optimalizovaného média;a MT: CTCM s T3 a DEX pridané do média.Po 12 dňoch kultivácie zostala životaschopnosť tkanív MS a MT rovnaká ako v čerstvých tkanivách hodnotených testom MTT (obr. 4B).Je zaujímavé, že pridanie T3 a DEX do transwell kultúr (TD) neviedlo k významnému zlepšeniu životaschopnosti v porovnaní s podmienkami CTRL, čo naznačuje dôležitú úlohu mechanickej stimulácie pri udržiavaní životaschopnosti srdcových rezov.
Experimentálny návrhový diagram znázorňujúci štyri kultivačné podmienky použité na vyhodnotenie účinkov mechanickej stimulácie a doplnku T3/DEX na médium počas 12 dní. B stĺpcový graf ukazuje kvantifikáciu životaschopnosti 12 dní po kultúre vo všetkých 4 kultivačných podmienkach (CTRL, TD, MC a MT) v porovnaní s čerstvými srdcovými plátkami (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 CTRL, D12 TD a D12 MT), 12 (D12 MC), v porovnaní s rôznymi ošípanými, jednosmerným testom Aova aova; *p <0,01 v porovnaní s D12 Ctrl). B stĺpcový graf ukazuje kvantifikáciu životaschopnosti 12 dní po kultúre vo všetkých 4 kultivačných podmienkach (CTRL, TD, MC a MT) v porovnaní s čerstvými srdcovými plátkami (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 CTRL, D12 TD a D12 MT), 12 (D12 MC), v porovnaní s rôznymi ošípanými, jednosmerným testom Aova aova; *p <0,01 v porovnaní s D12 Ctrl). B гистогрteri рования (контроль, TD, MC и Mt) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (D0) (D0) (D0) (D0) (d12), 15 (D12 Ctrl, D12 TD „оазных свиней, проводится оннороний тест ### P <0 0001, ### P <0,001 п 222 c. B Stĺpcový graf ukazuje kvantifikáciu životaschopnosti 12 dní po kultúre vo všetkých 4 kultivačných podmienkach (kontrola, TD, MC a MT) v porovnaní s čerstvými srdcovými rezmi (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 CTRL, D12 TD a D12 MT), 12 (D12 MC), 12 (D12 MC),######### *###############################################################################| p <0,01 v porovnaní s D12 Ctrl). B 条形图 显示 所有 4 种 培养 条件 （Ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 与 新鲜 心脏 (d0) (n = 18 (d0) 、 15 (d12 ctrl 、 d12 td 和 ； ；#### ### p <0,001 与 d0 相比 ， ** p <0,01 与 d12 控制）。B 4 12 (D12 MC) B гистограммnač, показывающая в се 4 условия клтивирования (контроль, TD, MC и (D0) ( 0 ( ** p <0,01 по сравнению с контролем d12). B histogram ukazujúci všetky 4 kultivačné podmienky (kontrola, TD, MC a MT) v porovnaní s čerstvými srdcovými rezmi (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 CTRL, D12 TD a D12 MT), z rôznych ošípaných 12 (D12 mc) rezy/D01 v. C stĺpový graf ukazuje kvantifikáciu glukózového toku 12 dní po kultúre vo všetkých 4 kultivačných podmienkach (CTRL, TD, MC a MT) v porovnaní s čerstvými srdcovými plátkami (D0) (n = 6 plátkov/skupiny z rôznych ošípaných, jednosmerný test ANOVA sa vykonáva; ### P <0,001 v porovnaní s D0 a *** p <0,001 v porovnaní s D12 CTRL). C stĺpový graf ukazuje kvantifikáciu glukózového toku 12 dní po kultúre vo všetkých 4 kultivačných podmienkach (CTRL, TD, MC a MT) v porovnaní s čerstvými srdcovými plátkami (D0) (n = 6 plátkov/skupiny z rôznych ošípaných, jednosmerný test ANOVA sa vykonáva; ### P <0,001 v porovnaní s D0 a *** p <0,001 v porovnaní s D12 CTRL). C гистогрteri ания (контроль, TD, MC и Mt) п сравнению со свежими срезами сердца (d0) няется тест ANOVA; ### p <0,001 по сравнению с D0 и *** P <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). C histogram ukazuje kvantifikáciu toku glukózy 12 dní po kultivácii za všetkých 4 kultivačných podmienok (kontrola, TD, MC a MT) v porovnaní s čerstvými srdcovými rezmi (D0) (n = 6 rezov/skupiny z rôznych ošípaných, jednosmerným testom ANOVA; ### P <0,001 v porovnaní s D0 a *** p <0,001 v porovnaní s D12 Ctrl). C 条形图 显示 所有 4 种 培养 条件 （Ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 与 新鲜 切片 (d0) 相比 ， 培养 后 后 12 天 的 葡萄糖 通量 通量 定量 （（n = 6 片 ， 相比 不同 ， ， ， 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与 与2 ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（Ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 相比 ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪 猪相比 ， *** p <0,001 与 d12 ctrl 相比）。 C гистограммnač, показывающая количественную ценку потока гюves через 12 днй па к Kedy кййт Kedy уй к Kedy уйй Kedy уйй к Kedy у Kedy кй к Kedy кй к Kedy кй Kedy кй к Kedy sa оания (контроль, TD, MC и Mt) по сравнению с свежими срезами сердца (d0) (n = 6 срезов/група, рз оирииррииииииииии Kedy т vyjadr. ли проведены тесты ANOVA; ### p <0,001 по сравнению с d0, *** p <0,001 по сравнению с d12 (контроль). C histogram ukazujúci kvantifikáciu toku glukózy v 12 dňoch po kultivácii pre všetky 4 kultivačné podmienky (kontrola, TD, MC a MT) v porovnaní s čerstvými srdcovými rezmi (D0) (n = 6 rezov/skupiny, z rôznych ošípaných, jednostranných sa uskutočnili ANOVA testy ANOVA (kontrola).D Kmeňová analýza grafov čerstvých (modrých), dňa 12 MC (zelená) a dni 12 mt (červená) tkanivá v desiatich regionálnych bodoch tkanivového sektora (n = 4 plátky/skupina, jednosmerný test ANOVA; medzi skupinami nebol významný rozdiel).Graf sopky E vykazujúce diferencovane exprimované gény v čerstvých srdcových rezoch (D0) v ​​porovnaní s srdcovými rezmi kultivovanými za statických podmienok (CTRL) alebo za podmienok MT (MT) počas 10-12 dní.F tepelné mapy génov sarkomérov pre srdcové rezy kultivované za každej z kultivačných podmienok.Chybové stĺpce predstavujú priemernú ± štandardnú odchýlku.
Metabolická závislosť od prechodu z oxidácie mastných kyselín na glykolýzu je charakteristickým znakom kardiomyocytov.Nezrelé kardiomyocyty primárne používajú glukózu na produkciu ATP a majú hypoplastické mitochondrie s niekoľkými cristae5,32.Analýzy využitia glukózy ukázali, že za podmienok MC a MT bolo využitie glukózy podobné ako v tkanivách dňa 0 (obrázok 4C).Vzorky CTRL však vykazovali významné zvýšenie využitia glukózy v porovnaní s čerstvým tkanivom.To naznačuje, že kombinácia CTCM a T3/DEX zvyšuje životaschopnosť tkaniva a zachováva metabolický fenotyp 12-dňových kultivovaných srdcových rezov.Okrem toho analýza kmeňa ukázala, že hladiny kmeňa zostali rovnaké ako v tkanive čerstvého srdca počas 12 dní za podmienok MT a MS (obr. 4D).
Na analýzu celkového vplyvu CTCM a T3/DEX na globálnu transkripčnú krajinu tkaniva srdcových plátkov sme vykonali RNASEQ na srdcové plátky zo všetkých štyroch rôznych kultivačných podmienok (doplnkové údaje 1).Je zaujímavé, že rezy MT vykazovali vysokú transkripčnú podobnosť s tkanivom čerstvého srdca, pričom iba 16 diferenciálne sa exprimovalo z 13 642 génov.Ako sme však ukázali skôr, plátky CTRL vykazovali 1229 diferencovane exprimovaných génov po 10 - 12 dňoch v kultúre (obr. 4E).Tieto údaje boli potvrdené qRT-PCR génov srdcových a fibroblastov (doplnkový obr. Obr. 7a-C).Je zaujímavé, že rezy CTRL vykazovali zníženie regulácie srdcových a bunkových cyklov a aktiváciu zápalových génových programov.Tieto údaje naznačujú, že dediferencia, ktorá sa bežne vyskytuje po dlhodobej kultivácii, je úplne oslabená za podmienok MT (doplnkový obr. 8a, b).Starostlivá štúdia génov sarkoméru ukázala, že iba za MT podmienok sú gény kódujúce sarkoméru (obr. 4F) a iónový kanál (doplnkový obr. 9) zachované a chránia ich pred potlačením za podmienok CTRL, TD a MC.Tieto údaje ukazujú, že pri kombinácii mechanickej a humorálnej stimulácie (T3/DEX) môže transkriptóm srdca zostať podobný čerstvým plátkom srdca po 12 dňoch v kultúre.
Tieto transkripčné zistenia sú podporené skutočnosťou, že štrukturálna integrita kardiomyocytov v srdcich sa najlepšie zachováva za podmienok MT počas 12 dní, ako ukazuje intaktný a lokalizovaný konexín 43 (obr. 5A).Okrem toho bola fibróza v srdcových rezoch za podmienok MT významne znížená v porovnaní s CTRL a podobným ako čerstvé srdcové rezy (obr. 5B).Tieto údaje demonštrujú, že kombinácia mechanickej stimulácie a liečby T3/DEX účinne zachováva srdcovú štruktúru v srdcových rezoch v kultúre.
Reprezentatívne imunofluorescenčné obrazy troponínu-T (zelené), konexín 43 (červená) a DAPI (modrá) v čerstvo izolovaných srdcových rezoch (D0) alebo kultivované počas 12 dní vo všetkých štyroch podmienkach kultúry srdcových sekcií (stupnica bar = 100 µm).). Kvantifikácia umelej inteligencie plátkov/skupiny N = 7 (D0 a D12 CTRL), 5 (D12 TD, D12 MC a D12 MT) z rôznych ošípaných, jednosmerný test ANOVA sa vykonáva; ### P <0,0001 v porovnaní s D0 a*P <0,05, OR ********** P <0.0001 v porovnaní s D12 CTR). Kvantifikácia umelej inteligencie plátkov/skupiny N = 7 (D0 a D12 CTRL), 5 (D12 TD, D12 MC a D12 MT) z rôznych ošípaných, jednosmerný test ANOVA sa vykonáva; ### P <0,0001 v porovnaní s D0 a*P <0,05, OR ********** P <0.0001 v porovnaní s D12 CTR). Количественная ценка структурной целостности таани сердца с помомомом и 212) MC и D12 MT) срезов/групví от разных свиней, проведен одно pokúsu сравнению с D12 Ctrl). Kvantifikácia štrukturálnej integrity srdcového tkaniva s použitím sekcií/skupiny N = 7 (D0 a D12 Ctrl), 5 (D12 Td, D12 MC a D12 MT) z rôznych ošípaných, jednosmerná ANOVA testovacia ANOVA; ### P <0,0001 v porovnaní s D0 a*P <对 不同 “与 D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 “ <0,0001 与 D12 Ctrl 相比）。Kvantifikácia štrukturálnej integrity srdcového tkaniva s použitím umelej inteligencie v rôznych ošípaných (n = 7 (D0 a D12 CTRL), 5 (D12 TD, D12 MC a D12 MT) s jednosmerným testom ANOVA;#### p <0 0001 по сравнению с D0 и*P <0,05 или **** p <0 0001 по сравнению с D12 Ctrl). ### P <0,0001 v porovnaní s D0 a*P <0,05 alebo **** p <0,0001 v porovnaní s D12 Ctrl). B Reprezentatívne obrazy a kvantifikácia pre plátky srdca zafarbené Massonovým trichrómovým farbením (stupnica μm = 500 um) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 Td a D12 Mc), 9 (D12 MT) plášťov/skupiny z rôznych ošípaných, ONE ošípaných ALEGI. trl). B Reprezentatívne obrazy a kvantifikácia pre plátky srdca zafarbené Massonovým trichrómovým farbením (stupnica μm = 500 um) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 Td a D12 Mc), 9 (D12 MT) plášťov/skupiny z rôznych ošípaných, ONE ošípaných ALEGI. trl). B репрезентативные изображения и количественная ценка срезов сердца, оем кем кшем к к кн к Ou кш к к к Ou кем кшем кем оен к к к кя к O ( инейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 Mt) срезов/групуquу отиииней, ыииней, ыииней, ыиau | 0 0001 по сравнению с D0 и *** p <0,001 ickи **** p <0 0001 по сравнению с D12 Ctrl). B 用 Masson 三 色 染料 染色 的 心脏 切片 代表性 图像 图像 和 量化 （尺 尺 = 500 µm） （（（（猪 猪 ； ； ； ； 猪 猪 猪 的 猪 的 的 的 的 的<0,0001 与 d0 相比 ， *** p <0,001 ， 或 **** p <0,0001 与 d12 ctrl 相比）。 B 用 Masson 三 色 染料 的 心脏 切片 代表性 和 量化 （（比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （（（（D0 、 D12 Ctrl 、 D12 TD 和 和 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片/组 ， 进行 单 因素 方 差 ； #### p <0,0001 与 d0 相比 ， *** p <0,001 ， 或 **** p <0,0001 与 d12 ctrl 相比）。 B репрезентативные изображения и количественная ценка срезов сердца, оенен т т б б б б б б б б б б б б б б б б б б б б к б б б к к к б к к к00 й к к б к к к м м б к м м м б б к к м м м м м м м00 к00 й к м м'оisku ček м. м) (N = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 mt) ickи **** p <0 0001 по сравнению с D12 Ctrl). B Reprezentatívne obrazy a kvantifikácia srdcových rezov zafarbených Massonovým trichrómom (mierka stupnice = 500 um) (n = 10 (D0, D12 CTRL, D12 TD a D12 MC), 9 rezy (D12 MT)) rezy z rôznych ošípaných/2,201 v porovnaní s D1 CTR).Chybové stĺpce predstavujú priemernú ± štandardnú odchýlku.
Nakoniec sa schopnosť CTCM napodobňovať srdcovú hypertrofiu sa hodnotila zvýšením natiahnutia srdcového tkaniva.V CTCM sa špičkový tlak vzduchovej komory zvýšil z 80 mmHg na 80 mmHg.Umenie.(Normálny úsek) do 140 mmHg čl.(Obr. 6a).To zodpovedá 32% zvýšeniu úseku (obr. 6B), ktorý bol predtým ukázaný ako zodpovedajúci percentuálny úsek potrebný na srdcové rezy na dosiahnutie dĺžky sarkómu podobnej dĺžke pozorovanej pri hypertrofii.Stretch a rýchlosť srdcového tkaniva počas kontrakcie a relaxácie zostali konštantné počas šiestich dní kultúry (obr. 6c).Srdcové tkanivo z MT podmienok bolo podrobené normálnemu úseku (MT (normálne)) alebo nadmerným podmienkam (MT (OS)) počas šiestich dní.Už po štyroch dňoch v kultúre bol hypertrofický biomarker NT-proBNP významne zvýšený v médiu za podmienok MT (OS) v porovnaní s MT (normálnymi) podmienkami (obr. 7A).Okrem toho sa po šiestich dňoch kultivácie významne zvýšila veľkosť buniek v MT (OS) (obr. 7B) v porovnaní s rezmi MT srdca (normálne).Okrem toho sa jadrová translokácia NFATC4 významne zvýšila v preťažených tkanivách (obr. 7C).Tieto výsledky ukazujú progresívny vývoj patologického prestavovania po hyperdistenzii a podporujú koncepciu, že zariadenie CTCM sa môže použiť ako platforma na štúdium roztiahnutej srdcovej hypertrofie.
Reprezentatívne stopy tlaku vzduchovej komory, tlaku kvapaliny a merania pohybu tkanív potvrdzujú, že tlak v komore mení tlak v komore, čo spôsobuje zodpovedajúci pohyb rezu tkaniva.B Reprezentatívne krivky s priemerom a krivky rýchlosti roztiahnutia pre normálne roztiahnuté (oranžové) a preťažené (modré) tkanivové sekcie.C stĺpový graf ukazujúci čas cyklu (n = 19 plátkov na skupinu, z rôznych ošípaných), čas kontrakcie (n = 18-19 plátkov na skupinu, z rôznych ošípaných), relaxačný čas (n = n = n = n = n = n = pätice na skupinu, z rôznych ošípaných)), amplitúd 6)) Sekcie/skupiny) Z rôznych ošípaných) T-test Studentov Two-chvostom nevykazoval žiadny významný rozdiel v žiadnom parametri, čo naznačuje, že tieto parametre zostali konštantné počas 6 dní kultúry s prepätím.Chybové stĺpce predstavujú priemernú ± štandardnú odchýlku.
Kvantifikácia stĺpcového grafu koncentrácie NT-proBNP v kultivačnom médiu zo srdcových rezov kultivovaných pri MT Normal Stretch (Norm) alebo nadmerných (OS) (OS) (n = 4 (d2 mtnor), 3 (d2 mTOS, d4 mtnorm a d4 mTOS) a skupiny z rôznych ošípaných; Kvantifikácia stĺpcového grafu koncentrácie NT-proBNP v kultivačnom médiu zo srdcových rezov kultivovaných pri MT Normal Stretch (Norm) alebo nadmerných (OS) (OS) (n = 4 (d2 mtnor), 3 (d2 mTOS, d4 mtnorm a d4 mTOS) a skupiny z rôznych ošípaných;Kvantitatívny histogram koncentrácie NT-proBNP v kultivačnom médiu zo srdcových rezov kultivovaných v podmienkach normálneho rozťahovania MT (Norm) alebo OverSretch (OS) (n = 4 (D2 Mtnorm), 3 (D2 MTO, D4 Mtnorm a D4) .MTOS).** p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). ** p <0,01 v porovnaní s normálnym úsekom). a 在 mt 正常 拉伸 (norma) 或 过度 拉伸 (os) 条件 下 培养 的 心脏 切片 培养 中 NT-PRONP 浓度 的 图量化 （（n = 4 (d2 mtnor) 、 3 （（分析 分析 ， ， 分析 分析 分析 分析 ， 分析 分析 分析 分析 分析 分析 分析 分析 分析正常 拉伸相比 ， p <0,01）。 Kvantifikácia koncentrácie NT-proBNP v srdcových rezoch kultivovaných v podmienkach MT normálneho úseku (norma) alebo nadmerné (OS) (n = 4 (d2 mtnorm), 3 (d2 mTO, d4 mtnorm 和 d4 mTOS) z rôznych 猪 切片 组 ， ， 双向 方方发 发动; ** v porovnaní s normálnym úsekom, p <0,01).Kvantifikácia histogramu koncentrácií NT-proBNP v srdcových rezoch kultivovaných v podmienkach normálneho roztiahnutia MT (Norm) alebo nadmerné (OS) (n = 4 (d2 mtnorm), 3 (d2 mTO, d4 mtnorm) a d4 mTOS) a skupina z rôznych ošípaných, dvojsmerná analýza rozptylu;** p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). ** p <0,01 v porovnaní s normálnym úsekom). B Reprezentatívne obrázky pre plátky srdca zafarbené troponínom-T a WGA (vľavo) a kvantifikáciou veľkosti buniek (vpravo) (n = 330 (D6 mTO), 369 (D6 mtnorm) bunkami/skupinou z 10 rôznych plátkov z rôznych ošípaných, vykonáva sa dvojstranná študentská T-test; **** P <0,0001 v porovnaní s normálnym úsekom). B Reprezentatívne obrázky pre plátky srdca zafarbené troponínom-T a WGA (vľavo) a kvantifikáciou veľkosti buniek (vpravo) (n = 330 (D6 mTO), 369 (D6 mtnorm) bunkami/skupinou z 10 rôznych plátkov z rôznych ošípaných, vykonáva sa dvojaký študentský T-test; **** P <0,0001 v porovnaní s normálnym úsekom). B репрезентативные изображения срезов срдца, окрашенных тропониноark-пззз па ка ке ке пе ке ке ке ке пе ке пе ка ке пе ке ка ке па ке пе пе пе пе пе пе пе па п istý пл п istý еток (справа) (n = 330 (d6 mTO), 369 (d6 mtnorm) клеток/групví з 10 разных срезов от от к о т х т х х х к т т т т к с к к т т т т т т т т т т т т х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х х хných „ B Reprezentatívne obrazy srdcových rezov zafarbených troponín-T a AZP (vľavo) a kvantifikácia veľkosti buniek (vpravo) (n = 330 (D6 mTO), 369 (D6 mtnorm)/skupina z 10 rôznych rezov z rôznych ošípaných, vykonal T-chvostový študentský T-test; **** P <0,0001 v porovnaní s normálnym kmeňom). B 用 肌钙 蛋白 -t 和 WGA （左） 和 大小量化 （右） 染色 的 心脏 切片 代表性 图像 （（（（， ， 检验 个 个 检验 检验 检验 检验 正常 正常 检验 检验 检验 检验 检验 检验 检验 检验 检验 检验 检验 正常 检验 正常 ， 检验 ， ， ， ， ， ， ， 正常 ， ， <0,0001）。 B репрезентативные изображения срезов срдца, окрашенных тропониноark-т азза а ле кел а ле кел а ле кел кел а кел кел а че кел а чел кел кел азла а ла а ла а лллла а лллллел а лллла а ла к а ллел к а лла к а лел к Ouлла а ллел к Ouл Kedy к ел а лаллел а лллел а лаллел а лаллелves справа) (n = 330 (d6 mtos), 369 (d6 mtnorm) из 10 различных срезов от разных свиней клиииииии**,000,000**ййййййAт к,000,000***к*кй к *,000,000***,000***,000 *,000,000,000,000,000,000Aк*к,000,000,000,000 *,000,000,000,000,000A*к *,000,000,000,000,000,000Kт к,000,000,000,000 *,000,000,000Kт кй,000,000***,000Kт кй,000,000 *,000,000 *,000Kт кй,000,000*****Kт*. по сравнению с нормальным растяжением). **** p <0,0001 v porovnaní s normálnym kmeňom). C Reprezentatívne obrazy pre 0 a deň 6 MTO SRDCES IMUNULED pre troponín-T a NFATC4 a kvantifikácia translokácie NFATC4 do jadier CMS (N = 4 (D0), 3 (D6 MTOS)/skupiny z rôznych ošípaných, vykonáva sa dvojkrípka T-TEST Student; *P <0,05). C Reprezentatívne obrazy pre 0 a deň 6 MTO SRDCES IMUNULED pre troponín-T a NFATC4 a kvantifikácia translokácie NFATC4 do jadier CMS (N = 4 (D0), 3 (D6 MTOS)/skupiny z rôznych ošípaných, vykonáva sa dvojkrípka T-TEST Student; *P <0,05). C репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней Mtos, иммм sчеч де допопоcien де д Ouр д т т т т т т т т трр тррр трррррр rim трр трр р р трр трр трр тр трр тр тррр тр т т тр тр тр тр т трр т т т трр т т т т тря т т т т т т т т т я т т я. транслокации nfatc4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (d0), 3 (d6 mtos) срезов/гру от рз -у -й -й podpr. рий стююента; *p <0,05). C Reprezentatívne obrazy pre rezy srdca pri 0 a 6 dní MTO, imunoznateľné pre troponín-T a NFATC4 a kvantifikácia translokácie NFATC4 v jadre kavernóznych buniek (N = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) plátky/skupiny z rôznych ošípaných) vykonali dva-chvosty T-test Student;*p <0,05). C 用 于 肌钙 蛋白 -t 和 NFATC4 免疫 标记 第 第 第 0 天 和 第 第 天 天 切片 的 代表性 图像 ， 来自 不同 不同 猪 的 的 NFATC4 易位 切片 至 细胞 ； 核 （（N = 4 (D0) 。 C репрезентативные изображения срезов са MtOS на 0 и 6 день для дл д имлл4 ил Kedy ел Kedy елл Kedy елл Kedy а транслокации nfatc4 в ядра cm от разных свиней (n = 4 (d0), 3 (d6 mtos) срез/гуп два- C Reprezentatívne obrazy MTOS srdcových plátkov v deň 0 a 6 pre imunoakelovanie troponínu-T a NFATC4 a kvantifikácia translokácie NFATC4 v jadre CM z rôznych ošípaných (n = 4 (D0), 3 (D6 MTO), dvojakrivo T-taily T-kritériónov;Chybové stĺpce predstavujú priemernú ± štandardnú odchýlku.
Translačný kardiovaskulárny výskum vyžaduje bunkové modely, ktoré presne reprodukujú srdcové prostredie.V tejto štúdii bolo vyvinuté a charakterizované zariadenie CTCM, ktoré môže stimulovať ultratenké časti srdca.Systém CTCM obsahuje fyziologicky synchronizovanú elektromechanickú stimuláciu a obohatenie tekutiny T3 a DEX.Keď boli rezy srdca ošípaných vystavené týmto faktorom, ich životaschopnosť, štrukturálna integrita, metabolická aktivita a transkripčná expresia zostali rovnaké ako v čerstvom srdcovom tkanive po 12 dňoch kultúry.Okrem toho nadmerné rozťahovanie srdcového tkaniva môže spôsobiť hypertrofiu srdca spôsobenú hyperextenziou.Celkovo tieto výsledky podporujú kritickú úlohu podmienok fyziologickej kultúry pri udržiavaní normálneho srdcového fenotypu a poskytujú platformu pre skríning liekov.
Mnoho faktorov prispieva k vytvoreniu optimálneho prostredia pre fungovanie a prežitie kardiomyocytov.Najzreteľnejšie z týchto faktorov súvisia s (1) medzibunkovými interakciami, (2) elektromechanická stimulácia, (3) humorálne faktory a (4) metabolické substráty.Fyziologické interakcie medzi bunkami vyžadujú komplexné trojrozmerné siete viacerých typov buniek podporovaných extracelulárnou matricou.Takéto komplexné bunkové interakcie je ťažké rekonštruovať in vitro ko-kultiváciou jednotlivých typov buniek, ale dá sa ľahko dosiahnuť pomocou organotypovej povahy srdcových rezov.
Mechanický úsek a elektrická stimulácia kardiomyocytov sú rozhodujúce pre udržiavanie srdcovej fenotypu33,34,35.Zatiaľ čo mechanická stimulácia sa široko používa na kondicionovanie a dozrievanie HIPSC-CM, niekoľko elegantných štúdií sa nedávno pokúsilo o mechanickú stimuláciu srdcových plátkov v kultúre pomocou jednoosového zaťaženia.Tieto štúdie ukazujú, že 2D jednoosové mechanické zaťaženie má pozitívny vplyv na fenotyp srdca počas kultúry.V týchto štúdiách boli rezy srdca buď naplnené izometrickými ťahovými silami17, lineárnym auxotonickým zaťažením18 alebo srdcovým cyklom sa znovu vytvorili pomocou spätnej väzby a napätia v ťahu.Tieto metódy však používajú roztiahnutie jednoosového tkaniva bez optimalizácie životného prostredia, čo vedie k potlačeniu mnohých srdcových génov alebo nadmernej expresii génov spojených s abnormálnymi reakciami na roztiahnutie.Tu opísaný CTCM poskytuje 3D elektromechanický stimul, ktorý napodobňuje prírodný srdcový cyklus z hľadiska času cyklu a fyziologického úseku (25% úsek, 40% systol, 60% diastola a 72 úderov za minútu).Aj keď táto trojrozmerná mechanická stimulácia nie je dostatočná na udržanie integrity tkaniva, na primeranú udržanie životaschopnosti, funkcie a integrity je potrebná kombinácia humorálnej a mechanickej stimulácie pomocou T3/DEX.
Humorálne faktory zohrávajú dôležitú úlohu pri modulácii fenotypu srdca dospelých.Toto bolo zvýraznené v štúdiách HIPS-CM, v ktorých boli do kultivačného média pridané T3 a DEX, aby sa urýchlila dozrievanie buniek.T3 môže ovplyvniť transport aminokyselín, cukrov a vápnika cez bunkové membrány36.Okrem toho T3 podporuje expresiu MHC-a a downreguláciu MHC-P, čo podporuje tvorbu rýchlych štiepnych myofibríl v zrelých kardiomyocytoch v porovnaní s pomalými šklbajúcimi myofibrílmi v plodu CM.Nedostatok T3 u pacientov s hypotyreózou vedie k strate myofibrilárnych pásiem a zníženej miere vývoja tónov37.Dex pôsobí na glukokortikoidové receptory a ukázalo sa, že zvyšuje kontraktilitu myokardu v izolovaných perfúznych srdciach;38 Predpokladá sa, že toto zlepšenie súvisí s vplyvom na vstup na základe vkladu vápnika (SOCE) 39,40.Okrem toho sa Dex viaže na svoje receptory, čo spôsobuje širokú intracelulárnu reakciu, ktorá potláča imunitnú funkciu a zápal30.
Naše výsledky naznačujú, že fyzikálna mechanická stimulácia (MS) zlepšila celkovú výkonnosť kultúry v porovnaní s CTRL, ale nedokázala si zachovať životaschopnosť, štrukturálnu integritu a srdcovú expresiu počas 12 dní v kultúre.V porovnaní s CTRL, pridanie T3 a DEX do CTCM (MT) kultúr zlepšilo životaschopnosť a udržiavalo podobné transkripčné profily, štrukturálnu integritu a metabolickú aktivitu s čerstvým srdcovým tkanivom počas 12 dní.Okrem toho sa pomocou STCM vytvoril model STCM, ktorý ilustroval všestrannú stranu systému STCM, vytvorený model srdcovej hypertrofie vyvolanej srdcovej hypertrofie.Je potrebné poznamenať, že hoci remodelovanie srdca a fibróza zvyčajne zahŕňajú neporušené orgány, ktorých cirkulujúce bunky môžu poskytovať vhodné cytokíny, ako aj fagocytózu a iné remodelovacie faktory, rezy srdca môžu stále napodobňovať fibrotický proces v reakcii na stres a traumu.do myofibroblastov.Toto sa predtým hodnotilo v tomto modeli srdcových plátkov.Malo by sa poznamenať, že parametre CTCM sa dajú modulovať zmenou amplitúdy a frekvencie elektrickej elektrickej energie, aby sa simulovali mnoho podmienok, ako je tachykardia, bradykardia a mechanická podpora obehov (mechanické vyložené srdce).Vďaka tomu je systém strednou priepustnosťou na testovanie liekov.Schopnosť CTCM modelovať nadmerne indukovanú srdcovú hypertrofiu pripravuje cestu na testovanie tohto systému na personalizovanú terapiu.Záverom je, že táto štúdia ukazuje, že mechanický úsek a humorálna stimulácia sú rozhodujúce pre udržiavanie kultúry rezov srdcových tkanív.
Aj keď tu uvedené údaje naznačujú, že CTCM je veľmi sľubnou platformou na modelovanie neporušeného myokardu, táto metóda kultúry má určité obmedzenia.Hlavným obmedzením kultúry CTCM je to, že na plátky ukladá kontinuálne dynamické mechanické napätia, ktoré vylučuje schopnosť aktívne monitorovať kontrakcie srdcových plátkov počas každého cyklu.Okrem toho je v dôsledku malej veľkosti srdcových rezov (7 mm) schopnosť vyhodnotiť systolické funkcie mimo kultivačných systémov pomocou tradičných senzorov sily.V súčasnom rukopise čiastočne prekonáme toto obmedzenie vyhodnotovaním optického napätia ako indikátora kontraktilnej funkcie.Toto obmedzenie si však bude vyžadovať ďalšiu prácu a môže sa v budúcnosti riešiť zavedením metód optického monitorovania funkcie srdcových plátkov v kultúre, ako je optické mapovanie pomocou farbív citlivých na vápniky a napätie.Ďalším obmedzením CTCM je to, že pracovný model manipuluje s fyziologickým stresom (predpätie a dodatočné zaťaženie).V CTCM bol tlak indukovaný v opačných smeroch, aby sa reprodukoval 25% fyziologický úsek v diastole (celý úsek) a sýr (dĺžka kontrakcie počas elektrickej stimulácie) vo veľmi veľkých tkanivách.Toto obmedzenie by sa malo odstrániť v budúcich návrhoch CTCM adekvátnym tlakom na srdcové tkanivo z oboch strán a použitím presných vzťahov tlaku a objemu, ktoré sa vyskytujú v komorách srdca.
Prestavba vyvolaná nadmerným vyvolaným v tomto rukopise je obmedzená na napodobňovanie hypertrofických signálov hyperstretch.Tento model teda môže pomôcť pri štúdiu roztiahnutej hypertrofickej signalizácie bez potreby humorálnych alebo nervových faktorov (ktoré v tomto systéme neexistujú).Potrebné sú ďalšie štúdie na zvýšenie multiplicity CTCM, napríklad ko-kultivovanie s imunitnými bunkami, cirkulujúce plazmatické humorálne faktory a inervácia, keď kokultizácia s neuronálnymi bunkami zlepší možnosti modelovania chorôb pomocou CTCM.
V tejto štúdii bolo použitých trinásť ošípaných.Všetky postupy na zvieratách sa uskutočňovali v súlade s inštitucionálnymi usmerneniami a boli schválené Výborom pre inštitucionálnu starostlivosť a používanie zvierat University of Louisville.Aortálny oblúk bol zovrel a srdce bolo perfundované 1 L sterilnou kardioplegiou (110 mM NaCl, 1,2 mm CACL2, 16 mM KCl, 16 mM MGCL2, 10 mM NAHCO3, 5 U/ml heparínu, pH až 7,4); Srdce sa zachovali v ľadovo chladnom kardioplegickom roztoku, až kým sa neprepravili do laboratória na ľade, ktoré je zvyčajne <10 minút. Srdce sa zachovali v ľadovo chladnom kardioplegickom roztoku, až kým sa neprepravili do laboratória na ľade, ktoré je zvyčajne <10 minút. сердца хранили в ледяном кардиопrimлегическом растворе до до транспортироророр op, л л л л л лнычычычычычычычычычычычычычычычычычычычычычычычычычычычычычычычычычычычычычычычычычычычычычычычычnor лчычычéra. Srdce boli uložené v ľadovo chladnom kardioplegickom roztoku až do prepravy do laboratória na ľade, ktoré zvyčajne trvá <10 minút.将 心脏 保存 在 的 心脏 停搏液 中 ， 直到 冰上 运送 到 ， 通常 <10 分钟。将 心脏 保存 在 的 心脏 停搏液 中 ， 直到 冰上 运送 到 ， 通常 <10 分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки к лараторию луу оуычыч <10 минн. Udržujte srdcia na ľadovej kardioplegii až do prepravy do laboratória na ľade, zvyčajne <10 minút.
Zariadenie CTCM bolo vyvinuté v softvéri SolidWorks Computer Aided Design (CAD).Kultúrne komory, rozdeľovače a vzduchové komory sú vyrobené z CNC čírych akrylových plastov.Zálohovací krúžok s priemerom 7 mm je vyrobený z polyetylénu s vysokou hustotou (HDPE) v strede a má drážku O-krúžku, ktorá by vyhovovala silikónovému O-krúžku, ktorý sa používa na utesnenie média pod ňou.Tenká membrána oxidu kremičitého oddeľuje kultivačnú komoru od separačnej platne.Silikónová membrána je laserom rezaná z 0,02 ″ hrubého silikónového plechu a má tvrdosť 35a.Spodné a horné silikónové tesnenia sú laserom rezané z 1/16 ″ hrubého silikónového plechu a majú tvrdosť 50A.Na upevnenie bloku a vytvorenie vzduchotesného tesnenia sa používajú skrutky z nehrdzavejúcej ocele a matice z nehrdzavejúcej ocele.
Vyhradená doska s tlačenými obvodmi (PCB) je navrhnutá tak, aby bola integrovaná so systémom C-PACE-EM.Zásuvky na konektory švajčiarskeho stroja na DPS sú pripojené k grafitovým elektródam striebornými medenými drôtmi a bronzovými skrutkami 0-60 skrutkovanými do elektród.Doska tlačeného obvodu je umiestnená na obálke 3D tlačiarne.
Zariadenie CTCM je riadené programovateľným pneumatickým ovládačom (PPD), ktorý vytvára regulovaný obehový tlak podobný srdcovému cyklu.Keď sa tlak vo vzduchovej komore zvyšuje, flexibilná silikónová membrána sa rozširuje smerom nahor, čo núti médium pod tkanivovým miestom.Oblasť tkaniva sa potom natiahne týmto vyhostením tekutiny, ktorá napodobňuje fyziologickú expanziu srdca počas diastoly.Na vrchole relaxácie sa elektrická stimulácia aplikovala pomocou grafitových elektród, čo znížilo tlak vo vzduchovej komore a spôsobil kontrakciu tkanivových rezov.Vo vnútri potrubia je hemostatický ventil s tlakovým senzorom na detekciu tlaku vo vzduchovom systéme.Tlak snímaný tlakovým snímačom sa aplikuje na zberateľ údajov pripojeného k notebooku.To umožňuje nepretržité monitorovanie tlaku vo vnútri plynovej komory.Keď sa dosiahol maximálny tlak komory (štandardný 80 mmHg, 140 mmHg OS), bolo nariadené zariadenie na získanie údajov na odoslanie signálu do systému C-PACE-EM na generovanie dvojfázového napäťového signálu na 2 ms, nastavené na 4 V.
Získali sa srdcové rezy a kultivačné podmienky v 6 jamkách sa uskutočňovali nasledovne: Preneste zozbierané srdcia z prenosovej nádoby do podnosu obsahujúcej studenú (4 ° C) kardioplegia.Ľavá komora bola izolovaná sterilnou čepeľou a nakrájaná na kúsky 1-2 cm3.Tieto tkanivové bloky boli pripevnené k tkanivové podpery tkanivovým lepidlom a umiestnené vo vibračnom mikrotómovom tkanivovom kúpeli obsahujúcom roztok Tyrode a kontinuálne okysličené (3 g/l 2,3-butánedione monooxime (BDM), 140 MM), 10 mm), 10 mm), 10 mm), 10 mm), 10 mm), 10 mm), 10 mm), 10 mm), 10 mm), 10 mm), 10 mm). ES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M roztok), 1,8 mM CACL2 (1,8 ml 1 M roztok), až do 1 L DDH2O).Vibračný mikrotóm bol nastavený na rezanie plátkov hrubých 300 um pri frekvencii 80 Hz, horizontálnej vibračnej amplitúde 2 mm a rýchlosť zálohy 0,03 mm/s.Tkanivový kúpeľ bol obklopený ľadom, aby sa roztok chladil a teplota sa udržiavala pri 4 ° C.Preneste rezy tkaniva z mikrotómového kúpeľa do inkubačného kúpeľa obsahujúceho neustále okysličené roztok tyrode na ľade, až kým sa nezíska dostatok rezov pre jednu kultivačnú dosku.V prípade transwell kultúr boli tkanivové rezy pripojené na sterilné 6 mm široké polyuretánové podpery a umiestnené v 6 ml optimalizovaného média (199 médií, 1X jeho doplnku, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalínu a 2x antibiotiká-antifungal).Elektrická stimulácia (10 V, frekvencia 1,2 Hz) sa aplikovala na úseky tkaniva cez C-Pace.Pre podmienok TD sa pri každej médiovej zmene pridali čerstvé T3 a DEX pri 100 nm a 1 μm.Médium je nasýtené kyslíkom pred výmenou trikrát denne.Tkanivové rezy sa kultivovali v inkubátore pri 37 ° C a 5% CO2.
V prípade kultúr CTCM boli tkanivové rezy umiestnené na 3D tlačiareň na mieru v Petriho miske obsahujúcom modifikované roztok Tyrode.Zariadenie je navrhnuté tak, aby zvýšilo veľkosť plátku srdca o 25% plochy podporného kruhu.To sa deje tak, aby sa sekcie srdca po prenose z roztoku Tyrode na médium a počas diastoly neroztiahli.Pomocou histoakrylového lepidla boli rezy 300 um hrubé pripevnené na podporný krúžok s priemerom 7 mm.Po pripojení tkanivových sekcií k opornému krúžku odrežte prebytočné tkanivové časti a vložte pripojené tkanivové časti späť do kúpeľa roztoku tyrode na ľade (4 ° C), až kým nebude pripravené dostatok častí pre jedno zariadenie.Celkový čas spracovania pre všetky zariadenia by nemal prekročiť 2 hodiny.Po pripevnení 6 tkanivových úsekov k ich podporným krúžkom bolo zostavené zariadenie CTCM.Krácha kultúry CTCM je vopred vyplnená 21 ml vopred vopred oxygenovaným médiom.Preneste úseky tkanív do kultivačnej komory a opatrne odstráňte všetky vzduchové bubliny pomocou pipety.Tkanivová sekcia sa potom vedie do otvoru a jemne sa tlačí na miesto.Nakoniec položte uzáver elektród na zariadenie a preneste zariadenie do inkubátora.Potom pripojte CTCM k vzduchovej trubici a systému C-PACE-EM.Otvorí sa pneumatický ovládač a vzduchový ventil otvára CTCM.Systém C-PACE-EM bol nakonfigurovaný tak, aby dodával 4 V pri 1,2 Hz počas dvojfázovej stimulácie počas 2 ms.Médium sa zmenilo dvakrát denne a elektródy sa zmenili raz denne, aby sa zabránilo hromadeniu grafitu na elektródach.Ak je to potrebné, tkanivové sekcie môžu byť z ich kultúrnych jamiek odstránené, aby sa vylúčili všetky vzduchové bubliny, ktoré mohli spadnúť pod nimi.Pri podmienkach ošetrenia MT sa pridal T3/DEX čerstvý s každou zmenou média so 100 nm T3 a 1 μm DEX.Zariadenia CTCM sa kultivovali v inkubátore pri 37 ° C a 5% CO2.
Na získanie roztiahnutých trajektórií plátkov srdca sa vyvinula špeciálny kamerový systém.Kamera SLR (Canon Rebel T7I, Canon, Tokio, Japonsko) sa používala s makro objektívmi Navitar Zoom 7000 18-108 mm (Navitar, San Francisco, CA).Vizualizácia sa uskutočňovala pri teplote miestnosti po výmene média čerstvým médiom.Fotoaparát je umiestnený pod uhlom 51 ° a video sa zaznamenáva pri 30 snímkach za sekundu.Po prvé, softvér Open Source (Musclemotion43) sa použil s Image-J na kvantifikáciu pohybu plátkov srdca.Maska bola vytvorená pomocou MATLAB (Mathworks, Natick, MA, USA) na definovanie oblastí záujmu pre bitie srdcových plátkov, aby sa predišlo hluku.Ručne segmentované masky sa aplikujú na všetky obrázky v rámcovej sekvencii a potom sa odovzdávajú do doplnku svalovej moci.Svalový pohyb používa priemernú intenzitu pixelov v každom rámci na kvantifikáciu jeho pohybu v porovnaní s referenčným rámcom.Dáta boli zaznamenané, filtrované a použité na kvantifikáciu času cyklu a na vyhodnotenie tkanivového úseku počas srdcového cyklu.Zaznamenané video bolo následne spracované pomocou digitálneho filtra v nulovej fáze prvého poriadku.Na kvantifikáciu tkanivového úseku (vrchol-pak) sa uskutočnila analýza vrcholu na vrchol, aby sa rozlíšila medzi vrcholmi a žľabmi v zaznamenanom signáli.Okrem toho sa detrekovanie vykonáva pomocou polynómu 6. poradia, aby sa eliminoval posun signálu.Programový kód bol vyvinutý v MATLAB na určenie globálneho pohybu tkaniva, času cyklu, relaxačného času a času kontrakcie (doplnkový programový kód 44).
Na analýzu kmeňa, s použitím rovnakých videí vytvorených na mechanické hodnotenie natiahnutia, sme najprv vysledovali dva obrázky predstavujúce vrcholy pohybu (najvyššie (horné) a najnižšie (nižšie) pohybové body) podľa softvéru na svaly.Potom sme segmentovali tkanivové oblasti a na segmentované tkanivo sme aplikovali formu tieňovacieho algoritmu (doplnkový obr. 2A).Segmentované tkanivo sa potom rozdelilo do desiatich čiastkových obvodov a napätie na každom povrchu sa vypočítalo pomocou nasledujúcej rovnice: kmeň = (sup-sdown)/sdown, kde SUP a SDown sú vzdialenosti tvaru z horných a spodných tieňov tkaniny (doplnkový obr. 2B).
Rezy srdca boli fixované v 4% paraformaldehyde počas 48 hodín.Fixované tkanivá sa dehydratovali v 10% a 20% sacharóza počas 1 hodiny, potom v 30% sacharóza cez noc.Rezy boli potom zabudované do optimálnej teplotnej zlúčeniny rezania (zlúčenina OCT) a postupne zmrazené v izopentánovom/suchom ľadovom kúpeli.Uložte bloky vkladania OCT pri -80 ° C až do oddelenia.Sklíčka sa pripravili ako rezy s hrúbkou 8 μm.
Na odstránenie OCT z sekcií srdca zahrievajte posuny na vyhrievacom bloku pri 95 ° C počas 5 minút.Pridajte 1 ml PBS do každého posúvača a inkubujte 30 minút pri teplote miestnosti, potom prejdite sekcie nastavením 0,1% Triton-X v PBS počas 15 minút pri teplote miestnosti.Aby ste zabránili viazaniu nešpecifických protilátok do vzorky, pridajte 1 ml 3% roztoku BSA do sklíčok a inkubujte 1 hodinu pri teplote miestnosti.BSA sa potom odstránil a sklíčka boli premyté PBS.Každú vzorku označte ceruzkou.Primárne protilátky (zriedené 1: 200 v 1% BSA) (konexín 43 (ABCAM; #AB11370), NFATC4 (ABCAM; #AB99431) a troponín-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) boli pridané viac ako 90 minút, potom sekundárne protilátky (DILOUED ific; #A16079), proti králikovi Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) pre ďalších 90 minút premytých trikrát s PBS na rozlíšenie zafarbenia cieľa z pozadia, použili sme iba sekundárnu protilátku ako kontrola. X zväčšenie.
WGA-ALEXA Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) pri 5 μg/ml v PBS sa použil na zafarbenie WGA a aplikoval sa na pevné úseky počas 30 minút pri teplote miestnosti.Sklíčka sa potom premyli PBS a do každého posúvača sa pridala sudánska čierna a inkubovala sa 30 minút.Sklíčka sa potom premyli PBS a pridalo sa médium Vectashield.Sklíčka sa vizualizovali na mikroskopu kľúčenku pri 40 -násobnom zväčšení.
OCT bol odstránený zo vzoriek, ako je opísané vyššie.Po odstránení OCT cez noc ponorte sklíčka do Bouinovho roztoku.Sklíčka sa potom opláchli destilovanou vodou 1 hodinu a potom sa umiestnili do roztoku fuchsínu kyseliny Bibrich aloe počas 10 minút.Potom sa sklíčka premyli destilovanou vodou a umiestnili sa do roztoku 5% fosfomolybdénu/5% kyseliny fosfoungstovej počas 10 minút.Bez opláchnutia preneste posuny priamo do roztoku Anilínu modrého po dobu 15 minút.Potom sa sklíčka premyli destilovanou vodou a umiestnili sa do roztoku 1% kyseliny octovej počas 2 minút.Sklíčka sa sušili v 200 N etanolu a preniesli sa na xylén.Farbené sklíčka sa vizualizovali pomocou kľúčového mikroskopu s 10x objektívom.Percento oblasti fibrózy bolo kvantifikované pomocou softvéru Keyence Analyzer.
Test životaschopnosti buniek Cyquant ™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), katalógové číslo V13154, podľa protokolu výrobcu s niektorými úpravami.Na zabezpečenie rovnomernej veľkosti tkaniva počas analýzy MTT sa použil najmä chirurgický úder s priemerom 6 mm.Tkanivá boli individuálne poklepané do jamiek 12-jamkovej doštičky obsahujúcej MTT substrát podľa protokolu výrobcu.Rezy sú inkubované pri 37 ° C počas 3 hodín a živé tkanivo metabolizuje substrát MTT za vzniku fialovej formazanskej zlúčeniny.Nahraďte roztok MTT za 1 ml DMSO a inkubujte pri 37 ° C počas 15 minút, aby ste extrahovali fialovú formazán zo srdcových rezov.Vzorky sa zriedili 1:10 v DMSO v 96-jamkových čistých spodných doštičkách a intenzita fialovej farby meraná pri 570 nm pomocou čítačky cytačných dosiek (Biotek).Hodnoty sa normalizovali na hmotnosť každého plátku srdca.
Médium srdcového plátku bolo nahradené médiom obsahujúcim 1 μCI/ml [5-3H] -glukózu (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) na test využitia glukózy, ako už bolo opísané.Po 4 hodinách inkubácie pridajte 100 ul stredného do otvorenej mikrocentrifugačnej trubice obsahujúcej 100 ul 0,2 N HCI.Potom sa trubica umiestnila do scintilačnej trubice obsahujúcej 500 ul DH2O, aby sa odparil [3H] 2O počas 72 hodín pri 37 ° C.Potom vyberte mikrocentrifugeovú trubicu zo scintilačnej trubice a pridajte 10 ml scintilačnej tekutiny.Počet scintilácií sa uskutočňoval s použitím analyzátora tekutej scintilačnej scintilácie Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA).Potom sa vypočítalo využitie glukózy, berúc do úvahy [5-3H] -glukózovo špecifickú aktivitu, neúplnú rovnováhu a pozadie, riedenie [5-3H]-na neoznačenú glukózu a účinnosť scintilácie.Údaje sú normalizované na hmotnosť sekcií srdca.
Po homogenizácii tkaniva v TRIZOL bola RNA izolovaná zo srdcových rezov pomocou Micro Kit Qiagen MiRNeasy Micro Kit #210874 podľa protokolu výrobcu.Príprava knižnice RNASEC, sekvenovanie a analýza údajov sa uskutočňovali takto:
Ako východiskový materiál sa použil 1 μg RNA na vzorku na prípravu knižnice RNA.Sekvenčné knižnice sa generovali pomocou súpravy NEBNext UltraTM RNA Knižnica pre Illumina (NEB, USA) po odporúčaniach výrobcu a indexové kódy boli pridané do sekvencií atribútov pre každú vzorku.Stručne, mRNA sa čistila z celkovej RNA pomocou magnetických guľôčok pripojených s poly-T oligonukleotidmi.Fragmentácia sa vykonáva s použitím dvojmocných katiónov pri vysokej teplote v Nebnextovej reakcii Synthesis Reaktion Synthesis (5x).Prvá reťazová cDNA sa syntetizovala pomocou náhodných hexamérnych primérov a reverznej transkriptázy M-MULV (RNáza H-).Druhá reťazová cDNA sa potom syntetizuje pomocou DNA polymerázy I a RNázy H. Zostávajúce previsy sa premieňajú na tupé konce pomocou exonukleázovej/polymerázy.Po adenylácii 3 'konca fragmentu DNA sa k nemu pripojí nebnextový adaptér so štruktúrou voči vlásenke, aby sa pripravil na hybridizáciu.Na výber cDNA fragmentov preferovanej dĺžky 150-200 bp.Fragmenty knižnice boli purifikované pomocou systému Ampure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA).Potom sa 3 μl užívateľský enzým (NEB, USA) s pomocou veľkosti ligovanej s adaptérom použil 15 minút pri 37 ° C a potom počas 5 minút pri 95 ° C pred PCR.PCR sa potom uskutočňovala s použitím fúznej vysokej vernosti DNA polymerázy, univerzálnych primérov PCR a indexových (x) primérov.Nakoniec boli produkty PCR purifikované (systém Ampure XP) a kvalita knižnice hodnotená v systéme Agilent Bioanalyzer 2100.Knižnica cDNA sa potom sekvenovala pomocou sekvencera Novaseq.Surové obrazové súbory z Illuminy boli prevedené na RAW čítanie pomocou volania základne Casava.NAJATÉ DATY sú uložené vo formátových súboroch FASTQ (FQ), ktoré obsahujú sekvencie čítania a zodpovedajúce základné vlastnosti.Vyberte HISAT2, aby sa zhodovalo s filtrovaným sekvencovaním, ktoré čítajú referenčný genóm SSCROFA11.1.Všeobecne platí, že HIDAT2 podporuje genómy akejkoľvek veľkosti, vrátane genómov väčších ako 4 miliardy báz, a predvolené hodnoty sú nastavené pre väčšinu parametrov.Zostrihovacie čítania z údajov RNA SEQ sa dajú efektívne zarovnať pomocou HISAT2, najrýchlejšieho systému, ktorý je v súčasnosti dostupný, s rovnakou alebo lepšou presnosťou ako ktorákoľvek iná metóda.
Výskyt transkriptov priamo odráža úroveň génovej expresie.Hladiny génovej expresie sa hodnotia množstvom transkriptov (počet sekvencií) spojených s genómom alebo exónmi.Počet čítaní je úmerný hladinám génovej expresie, dĺžke génov a hĺbky sekvenovania.Vypočítali sa FPKM (fragmenty na tisíc párov báz transkriptov sekvenovaných na milión párov báz) a p-hodnoty diferenciálnej expresie sa stanovili pomocou balíka DESEQ2.Potom sme vypočítali mieru falošného objavu (FDR) pre každú hodnotu P pomocou metódy Benjamini-Hochberg na základe zabudovaného R-funkcie „P.adjust“.
RNA izolovaná zo srdcových rezov bola prevedená na cDNA pri koncentrácii 200 ng/μl pomocou hlavnej mixu SuperScript IV Vilo Master z Thermo (Thermo, kat. Č. 11756050).Kvantitatívna RT-PCR sa uskutočňovala s použitím aplikovanej biosystémov endura doštičiek s priehľadnou reakčnou doštičkou (Thermo, kat. 4483319) a optickým lepidlom MicroAMP (Thermo, kat. Č. 4311971).Reakčná zmes pozostávala z 5 ul rýchlej pokročilej hlavnej zmesi Taqman (Thermo, Cat # 4444557), 0,5 ul priméru Taqman a 3,5 ul H2O zmiešané na jamku.Spustili sa štandardné qPCR cykly a hodnoty CT sa merali pomocou aplikovaného biosystémov Quantstudio 5 PCR prístroja v reálnom čase (384-jamkový modul; produkt # A28135).
Uvoľňovanie média NT-PROBNP sa hodnotilo pomocou súpravy NT-PROBNP (PIG) ​​(kat. Č. MBS2086979, MYBIOSource) podľa protokolu výrobcu.Stručne, 250 ul každej vzorky a štandard sa pridal dvojmo do každej jamky.Ihneď po pridaní vzorky pridajte do každej jamky 50 ul testovacieho činidla A.Jemne pretrepte dosku a utesnite tmelom.Potom boli tablety inkubované pri 37 ° C počas 1 hodiny.Potom roztok aspirujte a studne umyte 4-krát 350 ul 1x premývacieho roztoku, čím sa zakaždým inkubuje premytý roztok počas 1-2 minút.Potom pridajte 100 ul testovacieho činidla B na jamku a utesnite tmelom doštičky.Tablet bol jemne otrasený a inkubovaný pri 37 ° C počas 30 minút.Aspirujte roztok a studne premyjte 5 -krát 350 ul 1x premytia roztoku.Do každej jamky pridajte 90 ul roztoku substrátu a doštičku utesnite.Inkubujte dosku pri 37 ° C počas 10-20 minút.Do každej jamky pridajte 50 ul zastavovacie roztok.Doska bola okamžite meraná pomocou čítačky platničiek cytácie (biotek) nastavená na 450 nm.
Vykonali sa analýzy výkonu na výber veľkostí skupiny, ktoré poskytnú> 80% výkon na detekciu 10% absolútnej zmeny parametra s mierou chybovosti 5% typu I. Vykonali sa analýzy výkonu na výber veľkostí skupiny, ktoré poskytnú> 80% výkon na detekciu 10% absolútnej zmeny parametra s mierou chybovosti 5% typu I. Анализ мощности ыыл ыыыолнен для ыыбора размеров группrim, которые обесеч ат аюю аж о ое 10 о ое 10 а о а оюююююююю а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а а о ю о о о а а. ния параметра с 5% частотой шибок типа I. I. Analýza výkonu sa uskutočnila na výber veľkostí skupín, ktorá by poskytla> 80% výkon na detekciu 10% absolútnej zmeny parametrov s mierou chybovosti 5% typu I.进行 功效 分析 以 将 提供 提供 提供 提供 ％ 功效 以 检测 参数 中 ％ ％ 绝对 和 5 ％ i 型 的 的 组。。进行 功效 分析 以 将 提供 提供 提供 提供 ％ 功效 以 检测 参数 中 ％ ％ 绝对 和 5 ％ i 型 的 的 组。。 Ыы ok ' Uskutočnila sa analýza výkonu na výber veľkosti skupiny, ktorá by poskytla> 80% výkon na detekciu 10% absolútnej zmeny parametrov a 5% chybovosť typu I.Pred experimentom boli náhodne vybrané tkanivové rezy.Všetky analýzy boli slepé a vzorky boli dekódované až po analýze všetkých údajov.Softvér GraphPad Prism (San Diego, CA) sa použil na vykonanie všetkých štatistických analýz. Pre všetky štatistiky sa hodnoty p považovali za významné pri hodnotách <0,05. Pre všetky štatistiky sa hodnoty p považovali za významné pri hodnotách <0,05. Для всей статистики p-значения считались значими при пениvie <0,05. Pre všetky štatistiky sa hodnoty p považovali za významné pri hodnotách <0,05.对于 所有 统计 ， p 值 在值 <0,05 时 被 认为 是 显着。对于 所有 统计 ， p 值 在值 <0,05 时 被 认为 是 显着。 Для всей статистики p-значения считались значими при пениvie <0,05. Pre všetky štatistiky sa hodnoty p považovali za významné pri hodnotách <0,05.T-test Two-Tailed Student sa uskutočnil na údajoch iba s 2 porovnaniami.Na stanovenie významnosti medzi viacerými skupinami sa použila jednosmerná alebo obojsmerná ANOVA.Pri vykonávaní post hoc testov sa Tukeyova korekcia použila na zohľadnenie viacerých porovnaní.Údaje RNASEC majú osobitné štatistické úvahy pri výpočte FDR a P.Adjust, ako je opísané v časti Metódy.
Viac informácií o návrhu štúdie nájdete v správe o výskume prírody Abstrakt s týmto článkom.