Salamat sa pagbisita sa Nature.com.Ang bersyon ng browser na iyong ginagamit ay may limitadong suporta sa CSS.Para sa pinakamagandang karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng na-update na browser (o huwag paganahin ang Compatibility Mode sa Internet Explorer).Pansamantala, upang matiyak ang patuloy na suporta, ire-render namin ang site nang walang mga istilo at JavaScript.
May pangangailangan para sa isang maaasahang in vitro system na maaaring tumpak na magparami ng physiological na kapaligiran ng puso para sa pagsusuri sa droga.Ang limitadong kakayahang magamit ng mga sistema ng kultura ng tisyu ng puso ng tao ay humantong sa mga hindi tumpak na interpretasyon ng mga epekto ng gamot sa puso.Dito, nakabuo kami ng isang cardiac tissue culture model (CTCM) na electromechanically stimulates heart slices at sumasailalim sa physiological stretch sa panahon ng systolic at diastolic phase ng cardiac cycle.Pagkatapos ng 12 araw ng kultura, ang diskarte na ito ay bahagyang nagpabuti sa posibilidad na mabuhay ng mga seksyon ng puso, ngunit hindi ganap na napanatili ang kanilang integridad ng istruktura.Samakatuwid, pagkatapos ng maliit na screening ng molekula, nalaman namin na ang pagdaragdag ng 100 nM triiodothyronine (T3) at 1 μM dexamethasone (Dex) sa aming daluyan ay nagpapanatili ng microstructure ng mga seksyon sa loob ng 12 araw.Kasabay ng paggamot sa T3/Dex, pinananatili ng CTCM system ang mga transcriptional profile, viability, metabolic na aktibidad, at integridad ng istruktura sa parehong antas ng sariwang tissue ng puso sa loob ng 12 araw.Bilang karagdagan, ang labis na pag-stretch ng cardiac tissue sa kultura ay nag-uudyok ng hypertrophic cardiac signaling, na nagbibigay ng ebidensya para sa kakayahan ng CTCM na gayahin ang mga hypertrophic na kondisyon na dulot ng cardiac stretch.Sa konklusyon, maaaring imodelo ng CTCM ang pisyolohiya at pathophysiology ng puso sa kultura sa mahabang panahon, na nagbibigay-daan sa maaasahang pagsusuri ng gamot.
Bago ang klinikal na pananaliksik, kailangan ang maaasahang mga in vitro system na maaaring tumpak na magparami ng physiological na kapaligiran ng puso ng tao.Dapat gayahin ng mga naturang sistema ang binagong mekanikal na pag-abot, tibok ng puso, at mga katangian ng electrophysiological.Ang mga modelo ng hayop ay karaniwang ginagamit bilang isang screening platform para sa cardiac physiology na may limitadong pagiging maaasahan sa pagpapakita ng mga epekto ng mga gamot sa puso ng tao1,2.Sa huli, ang Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) ay isang modelong napakasensitibo at partikular para sa iba't ibang therapeutic at pharmacological intervention, na tumpak na nagre-reproduce ng physiology at pathophysiology ng puso ng tao3.Ang kawalan ng naturang sistema ay naglilimita sa pagtuklas ng mga bagong paggamot para sa pagpalya ng puso4,5 at humantong sa cardiotoxicity ng gamot bilang isang pangunahing dahilan sa pag-alis sa merkado6.
Sa nakalipas na dekada, walong non-cardiovascular na gamot ang inalis sa klinikal na paggamit dahil nagiging sanhi ito ng pagpapahaba ng QT interval na humahantong sa ventricular arrhythmias at biglaang pagkamatay7.Kaya, mayroong isang pagtaas ng pangangailangan para sa maaasahang preclinical na mga diskarte sa screening upang masuri ang cardiovascular efficacy at toxicity.Ang kamakailang paggamit ng human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPS-CM) sa drug screening at toxicity testing ay nagbibigay ng bahagyang solusyon sa problemang ito.Gayunpaman, ang immature na kalikasan ng mga hiPS-CM at ang kakulangan ng multicellular complexity ng cardiac tissue ay mga pangunahing limitasyon ng pamamaraang ito.Ipinakita ng mga kamakailang pag-aaral na ang limitasyong ito ay maaaring bahagyang malampasan sa pamamagitan ng paggamit ng maagang hiPS-CM upang makabuo ng mga hydrogel ng cardiac tissue sa ilang sandali pagkatapos ng pagsisimula ng mga kusang pag-urong at unti-unting pagtaas ng electrical stimulation sa paglipas ng panahon.Gayunpaman, ang mga hiPS-CM microtissue na ito ay kulang sa mga mature na electrophysiological at contractile na katangian ng adult myocardium.Bilang karagdagan, ang tissue ng puso ng tao ay may mas kumplikadong istraktura, na binubuo ng isang heterogenous na pinaghalong iba't ibang uri ng cell, kabilang ang mga endothelial cell, neuron, at stromal fibroblast, na magkakaugnay ng mga tiyak na hanay ng mga extracellular matrix na protina.Ang heterogeneity ng mga non-cardiomyocyte na populasyon11,12,13 sa adult mammalian heart ay isang pangunahing hadlang sa pagmomodelo ng cardiac tissue gamit ang mga indibidwal na uri ng cell.Ang mga pangunahing limitasyong ito ay nagbibigay-diin sa kahalagahan ng pagbuo ng mga pamamaraan para sa pag-kultura ng buo na myocardial tissue sa ilalim ng physiological at pathological na mga kondisyon.
Napatunayang isang magandang modelo ng buo na myocardium ng tao ang mga nakakulturang manipis (300 µm) na bahagi ng puso ng tao.Ang pamamaraang ito ay nagbibigay ng access sa isang kumpletong 3D multicellular system na katulad ng tissue ng puso ng tao.Gayunpaman, hanggang 2019, ang paggamit ng mga kultural na seksyon ng puso ay limitado ng maikling (24 h) na kaligtasan ng kultura.Ito ay dahil sa ilang salik kabilang ang kakulangan ng physical-mechanical stretch, ang air-liquid interface, at ang paggamit ng simpleng media na hindi sumusuporta sa mga pangangailangan ng cardiac tissue.Noong 2019, ipinakita ng ilang grupo ng pananaliksik na ang pagsasama ng mga mekanikal na salik sa mga sistema ng kultura ng tissue ng puso ay maaaring pahabain ang buhay ng kultura, mapabuti ang pagpapahayag ng puso, at gayahin ang patolohiya ng puso.Dalawang eleganteng pag-aaral 17 at 18 ang nagpapakita na ang uniaxial mechanical loading ay may positibong epekto sa cardiac phenotype sa panahon ng kultura.Gayunpaman, ang mga pag-aaral na ito ay hindi gumamit ng dynamic na three-dimensional na physico-mechanical loading ng cardiac cycle, dahil ang mga seksyon ng puso ay na-load ng alinman sa isometric tensile forces 17 o linear auxotonic loading 18 .Ang mga pamamaraang ito ng tissue stretching ay nagresulta sa pagsugpo ng maraming cardiac genes o ang sobrang pagpapahayag ng mga gene na nauugnay sa mga abnormal na tugon sa pag-inat.Kapansin-pansin, Pitoulis et al.19 ay bumuo ng isang dynamic na heart slice culture bath para sa cardiac cycle reconstruction gamit ang force transducer feedback at tension drives.Bagama't nagbibigay-daan ang system na ito para sa mas tumpak na in vitro cardiac cycle modeling, nililimitahan ng pagiging kumplikado at mababang throughput ng pamamaraan ang paggamit ng system na ito.Ang aming laboratoryo ay nakabuo kamakailan ng isang pinasimpleng sistema ng kultura gamit ang electrical stimulation at isang na-optimize na daluyan upang mapanatili ang posibilidad ng mga seksyon ng baboy at tisyu ng puso ng tao nang hanggang 6 na araw20,21.
Sa kasalukuyang manuskrito, inilalarawan namin ang isang cardiac tissue culture model (CTCM) gamit ang mga seksyon ng porcine heart na nagsasama ng mga humoral na cue upang muling i-recapitulate ang three-dimensional na cardiac physiology at pathophysiological distension sa panahon ng cardiac cycle.Maaaring pataasin ng CTCM na ito ang katumpakan ng pre-clinical na hula sa gamot sa isang antas na hindi pa nakamit sa pamamagitan ng pagbibigay ng cost-effective, mid-throughput na cardiac system na ginagaya ang physiology/pathophysiology ng mammalian heart para sa pre-clinical na pagsusuri sa gamot.
Ang mga hemodynamic mechanical signal ay gumaganap ng isang kritikal na papel sa pagpapanatili ng cardiomyocyte function sa vitro 22,23,24.Sa kasalukuyang manuskrito, nakabuo kami ng isang CTCM (Larawan 1a) na maaaring gayahin ang pang-adultong kapaligiran ng puso sa pamamagitan ng pag-uudyok sa parehong elektrikal at mekanikal na pagpapasigla sa mga frequency ng physiological (1.2 Hz, 72 na mga beats bawat minuto).Upang maiwasan ang labis na pag-inat ng tissue sa panahon ng diastole, ginamit ang isang 3D printing device upang madagdagan ang laki ng tissue ng 25% (Fig. 1b).Ang electrical pacing na dulot ng C-PACE system ay na-time na magsimula ng 100 ms bago ang systole gamit ang isang data acquisition system upang ganap na mai-reproduce ang cardiac cycle.Gumagamit ang tissue culture system ng programmable pneumatic actuator (LB Engineering, Germany) upang paikot-ikot na palawakin ang isang nababaluktot na silicone membrane upang maging sanhi ng paglawak ng mga hiwa ng puso sa itaas na silid.Ang sistema ay konektado sa isang panlabas na linya ng hangin sa pamamagitan ng isang pressure transducer, na naging posible upang tumpak na ayusin ang presyon (± 1 mmHg) at oras (± 1 ms) (Larawan 1c).
a Ilakip ang tissue section sa 7 mm support ring, na ipinapakita sa kulay asul, sa loob ng culture chamber ng device.Ang silid ng kultura ay pinaghihiwalay mula sa silid ng hangin sa pamamagitan ng isang manipis na nababaluktot na silicone membrane.Maglagay ng gasket sa pagitan ng bawat silid upang maiwasan ang pagtagas.Ang takip ng device ay naglalaman ng mga graphite electrodes na nagbibigay ng electrical stimulation.b Schematic na representasyon ng malaking tissue device, guide ring at support ring.Ang mga seksyon ng tissue (kayumanggi) ay inilalagay sa napakalaking aparato na may singsing na gabay na inilagay sa uka sa panlabas na gilid ng aparato.Gamit ang gabay, maingat na ilagay ang support ring na pinahiran ng tissue acrylic adhesive sa ibabaw ng seksyon ng cardiac tissue.c Graph na nagpapakita ng oras ng electrical stimulation bilang isang function ng air chamber pressure na kinokontrol ng isang programmable pneumatic actuator (PPD).Ginamit ang isang data acquisition device upang i-synchronize ang electrical stimulation gamit ang mga pressure sensor.Kapag ang pressure sa culture chamber ay umabot sa itinakdang threshold, isang pulse signal ang ipapadala sa C-PACE-EM upang mag-trigger ng electrical stimulation.d Larawan ng apat na CTCM na inilagay sa istante ng incubator.Apat na device ang nakakonekta sa isang PPD sa pamamagitan ng pneumatic circuit, at ang mga pressure sensor ay ipinapasok sa hemostatic valve upang subaybayan ang pressure sa pneumatic circuit.Ang bawat aparato ay naglalaman ng anim na seksyon ng tissue.
Gamit ang isang solong pneumatic actuator, nakontrol namin ang 4 na CTCM device, bawat isa ay maaaring humawak ng 6 na seksyon ng tissue (Fig. 1d).Sa CTCM, ang presyon ng hangin sa silid ng hangin ay na-convert sa kasabay na presyon sa silid ng likido at hinihimok ang pagpapalawak ng pisyolohikal ng hiwa ng puso (Larawan 2a at Karagdagang Pelikula 1).Pagsusuri ng tissue stretch sa 80 mm Hg.Art.nagpakita ng kahabaan ng mga seksyon ng tissue ng 25% (Larawan 2b).Ang porsyentong kahabaan na ito ay ipinakita na tumutugma sa isang haba ng pisyolohikal na sarcomere na 2.2–2.3 µm para sa normal na pagkontrata ng seksyon ng puso17,19,25.Nasuri ang paggalaw ng tissue gamit ang mga pasadyang setting ng camera (Karagdagang Larawan 1).Ang amplitude at bilis ng paggalaw ng tissue (Larawan 2c, d) ay tumutugma sa kahabaan sa panahon ng ikot ng puso at oras sa panahon ng systole at diastole (Larawan 2b).Ang stretch at velocity ng cardiac tissue sa panahon ng contraction at relaxation ay nanatiling pare-pareho sa loob ng 12 araw sa kultura (Fig. 2f).Upang suriin ang epekto ng electrical stimulation sa contractility sa panahon ng kultura, bumuo kami ng isang paraan para sa pagtukoy ng aktibong deformity gamit ang shading algorithm (Karagdagang Fig. 2a, b) at nagawang makilala sa pagitan ng mga deformidad na mayroon at walang electrical stimulation.Ang parehong seksyon ng puso (Larawan 2f).Sa movable region ng cut (R6-9), ang boltahe sa panahon ng electrical stimulation ay 20% na mas mataas kaysa sa kawalan ng electrical stimulation, na nagpapahiwatig ng kontribusyon ng electrical stimulation sa contractile function.
Ang mga kinatawan ng mga bakas ng presyon ng silid ng hangin, presyon ng silid ng likido, at mga sukat ng paggalaw ng tisyu ay nagpapatunay na ang presyon ng silid ay nagbabago ng presyon ng silid ng likido, na nagiging sanhi ng kaukulang paggalaw ng hiwa ng tissue.b Kinakatawan na mga bakas ng porsyento ng kahabaan (asul) ng mga seksyon ng tissue na tumutugma sa porsyento ng kahabaan (orange).c Ang sinusukat na paggalaw ng hiwa ng puso ay pare-pareho sa sinusukat na bilis ng paggalaw.(d) Kinakatawan na mga trajectory ng cyclic motion (asul na linya) at bilis (orange na tuldok na linya) sa isang slice ng puso.e Quantification ng cycle time (n = 19 slice bawat grupo, mula sa iba't ibang baboy), contraction time (n = 19 slices bawat grupo), relaxation time (n = 19 slice bawat grupo, mula sa iba't ibang baboy), tissue movement (n = 25 ).slice)/pangkat mula sa iba't ibang baboy), peak systolic velocity (n = 24(D0), 25(D12) slice/group mula sa iba't ibang baboy) at peak relaxation rate (n=24(D0), 25(D12) slice/group mula sa iba't ibang baboy).Ang two-tailed Student's t-test ay nagpakita ng walang makabuluhang pagkakaiba sa anumang parameter.f Representative strain analysis bakas ng tissue section na may (pula) at walang (asul) electrical stimulation, sampung rehiyonal na lugar ng tissue section mula sa parehong seksyon.Ang mga panel sa ibaba ay nagpapakita ng quantification ng porsyento ng pagkakaiba sa strain sa mga seksyon ng tissue na may at walang electrical stimulation sa sampung lugar mula sa iba't ibang mga seksyon. (n = 8 hiwa/pangkat mula sa iba't ibang baboy, Dalawang-tailed Student t-test ay ginanap; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = 8 hiwa/pangkat mula sa iba't ibang baboy, Dalawang-tailed Student t-test ay ginanap; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 seksyon/pangkat mula sa iba't ibang baboy, dalawang-tailed na t-test ng Mag-aaral; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 seksyon/pangkat, mula sa iba't ibang baboy, dalawang-tailed na t-test ng Mag-aaral; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Ang mga error bar ay kumakatawan sa mean ± standard deviation.
Sa aming nakaraang static biomimetic heart slice culture system [20, 21], pinanatili namin ang viability, function, at structural integrity ng heart slices sa loob ng 6 na araw sa pamamagitan ng paglalapat ng electrical stimulation at pag-optimize ng medium composition.Gayunpaman, pagkatapos ng 10 araw, ang mga bilang na ito ay bumaba nang husto.Magre-refer kami sa mga seksyong naka-culture sa aming nakaraang static biomimetic culture system 20, 21 control conditions (Ctrl) at gagamitin namin ang dati naming na-optimize na medium bilang mga kondisyon at kultura ng MC sa ilalim ng sabay-sabay na mechanical at electrical stimulation (CTCM).tinawag na .Una, natukoy namin na ang mekanikal na pagpapasigla na walang elektrikal na pagpapasigla ay hindi sapat upang mapanatili ang kakayahang kumita ng tisyu sa loob ng 6 na araw (Karagdagang Fig. 3a, b).Kapansin-pansin, sa pagpapakilala ng physio-mechanical at electrical stimulation gamit ang STCM, ang posibilidad na mabuhay ng 12-araw na mga seksyon ng puso ay nanatiling pareho sa mga sariwang seksyon ng puso sa ilalim ng mga kondisyon ng MS, ngunit hindi sa ilalim ng mga kondisyon ng Ctrl, tulad ng ipinapakita ng pagsusuri ng MTT (Fig. 1).3a).Iminumungkahi nito na ang mekanikal na pagpapasigla at simulation ng ikot ng puso ay maaaring panatilihing mabubuhay ang mga seksyon ng tissue nang dalawang beses hangga't iniulat sa aming nakaraang static na sistema ng kultura.Gayunpaman, ang pagtatasa ng integridad ng istruktura ng mga seksyon ng tisyu sa pamamagitan ng immunolabeling ng cardiac troponin T at connexin 43 ay nagpakita na ang expression ng connexin 43 ay makabuluhang mas mataas sa mga tisyu ng MC sa araw na 12 kaysa sa mga kontrol sa parehong araw.Gayunpaman, ang pare-parehong connexin 43 expression at Z-disc formation ay hindi ganap na napanatili (Larawan 3b).Gumagamit kami ng artificial intelligence (AI) na framework para ma-quantify ang tissue structural integrity26, isang image-based deep learning pipeline batay sa troponin-T at connexin staining43 para awtomatikong ma-quantify ang structural integrity at fluorescence ng heart slices sa mga tuntunin ng lakas ng localization.Gumagamit ang paraang ito ng Convolutional Neural Network (CNN) at isang malalim na balangkas ng pag-aaral upang mapagkakatiwalaang mabilang ang integridad ng istruktura ng cardiac tissue sa isang awtomatiko at walang pinapanigan na paraan, gaya ng inilarawan sa reference.26. Ang MC tissue ay nagpakita ng pinahusay na pagkakatulad ng istruktura sa araw na 0 kumpara sa mga static na seksyon ng kontrol.Bilang karagdagan, ang paglamlam ng trichrome ng Masson ay nagsiwalat ng isang makabuluhang mas mababang porsyento ng fibrosis sa ilalim ng mga kondisyon ng MS kumpara sa mga kondisyon ng kontrol sa araw na 12 ng kultura (Larawan 3c).Habang pinataas ng CTCM ang viability ng mga seksyon ng tissue ng puso sa araw na 12 sa isang antas na katulad ng sa sariwang tissue ng puso, hindi nito lubos na napabuti ang integridad ng istruktura ng mga seksyon ng puso.
isang Bar graph ang nagpapakita ng quantification ng MTT viability ng sariwang heart slices (D0) o heart slices culture sa loob ng 12 araw alinman sa static culture (D12 Ctrl) o sa CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) na slice/grupo; isang paraan ng AN##0 na mga hiwa/grupo na ginawa mula sa AN##0 na mga baboy, at <1 na paraan ng pagsubok ng AN##0; **p <0.01 kumpara sa D12 Ctrl). Ipinapakita ng Bar graph ang quantification ng MTT viability ng sariwang heart slices (D0) o heart slices culture sa loob ng 12 araw alinman sa static culture (D12 Ctrl) o sa CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) na hiwa/grupo; isang paraan ang ANOVA sa mga hiwa/grupo na ginawa mula sa iba't ibang grupo ng D##0. at **p <0.01 kumpara sa D12 Ctrl).ipinapakita ng histogram ang quantification ng viability ng MTT fresh heart sections (D0) o kultura ng heart sections sa loob ng 12 araw sa alinman sa static culture (D12 control) o CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 control). ) ), 12 (D12 MC) sections/group;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 kumpara sa D0 at **p < 0.01 kumpara sa D12 Ctrl). isang 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切幇片(D12 MC)幇12.相比，**p < 0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切 片(D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切 片(D12)片12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p。)histogram na nagpapakita ng quantification ng MTT viability sa mga fresh heart section (D0) o heart section na na-culture sa loob ng 12 araw sa static culture (D12 control) o CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 control)), 12 (D12 MC) sections/group mula sa iba't ibang ANOVA test, one-way ANOVA test;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 kumpara sa D0, **p < 0.01 kumpara sa D12 Ctrl).b Troponin-T (berde), connexin 43 (pula) at DAPI (asul) sa mga bagong nakahiwalay na seksyon ng puso (D0) o mga seksyon ng puso na na-culture sa ilalim ng mga static na kondisyon (Ctrl) o mga kondisyon ng CTCM (MC) sa loob ng 12 araw) ng mga kinatawan ng immunofluorescence na imahe (blangko na sukat = 100 µm). Artificial intelligence quantification ng heart tissue structural integrity (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) na hiwa/grupo bawat isa mula sa iba't ibang baboy, ang one-way na ANOVA test ay ginaganap; ####p <0.0001 kumpara sa D0 at ****p <0.0001 kumpara sa D12 Ctrl). Artificial intelligence quantification ng heart tissue structural integrity (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) na hiwa/grupo bawat isa mula sa iba't ibang baboy, ang one-way na ANOVA test ay isinasagawa; ####p <0.0001 kumpara sa D0 at ****p <0.0001 kumpara sa D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной тпппни искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl от), MC5 (D1свектом) зных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению с D12). Quantification ng structural integrity ng cardiac tissue sa pamamagitan ng artificial intelligence (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) na seksyon/grupo mula sa iba't ibang baboy, one-way ANOVA test na isinagawa; ####p < 0.0001 kumpara sa D0 at ****p < 0.0001 kumpara sa D0.0001.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) slice/grupo bawat isa sa iba't ibang baboy, one-way ANOVA test;####p 0 盎000 < 0.****p 0. 001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) slice/grupo bawat isa sa iba't ibang baboy, one-way ANOVA test;##00 < 0.****p 0. 001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D0), 7 (D0), Ctrl2 (D12) у каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12). Artificial intelligence para ma-quantify ang structural integrity ng cardiac tissue (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sections/group each of different pigs, one-way ANOVA test; ####p<0.0001 vs .D0 Para sa paghahambing ****p <0.0001 kumpara sa D). c Representative na mga larawan (kaliwa) at quantification (kanan) para sa mga hiwa ng puso na nabahiran ng trichrome stain ni Masson (Scale bare = 500 µm) (n = 10 hiwa/grupo bawat isa mula sa iba't ibang baboy, ginagawa ang one-way na ANOVA test; ####p < 0.0001 kumpara sa D0 at ***p < 0.0001 kumpara sa D0 at ***p < 0.00 trl). c Representative na mga larawan (kaliwa) at quantification (kanan) para sa mga hiwa ng puso na nabahiran ng trichrome stain ni Masson (Scale bare = 500 µm) (n = 10 slice/grupo bawat isa mula sa iba't ibang baboy, ginagawa ang one-way ANOVA test; #### p < 0.0001 kumpara sa D0 at ***ptr < 0.0001 kumpara sa D0 at ***ptr <0.1). c Репрезентативные изображения (слева) at количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным кмрасимласем ытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 по свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; нию с D12 Ctrl). c Representative na mga larawan (kaliwa) at quantification (kanan) ng mga seksyon ng puso na nabahiran ng trichrome stain ni Masson (uncoated scale = 500 µm) (n = 10 section/group mula sa iba't ibang baboy, one-way ANOVA test na ginawa; #### p < 0 .0001 kumpara sa D0 at ***p < 0.001 kumpara sa D0 at ***p < 0.001). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度（裸尺度 （裸尺度= 5片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 Ctrl 。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸度10 p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) at количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красител5сите мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного диспего дисперсио ;## 0 нлио сионсио по иннлиов нению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Representative na mga larawan (kaliwa) at quantitation (kanan) ng mga seksyon ng puso na may mantsa ng trichrome stain ni Masson (blangko = 500 µm) (n = 10 seksyon/grupo, bawat isa mula sa ibang baboy, na sinuri ng one-way analysis ng variance ;### # p < 0.0001 kumpara sa D0, ***ptr <0.1).Ang mga error bar ay kumakatawan sa mean ± standard deviation.
Ipinagpalagay namin na sa pamamagitan ng pagdaragdag ng maliliit na molekula sa medium ng kultura, ang integridad ng cardiomyocyte ay maaaring mapabuti at ang pag-unlad ng fibrosis ay nabawasan sa panahon ng kultura ng CTCM.Kaya't nag-screen kami para sa maliliit na molekula gamit ang aming mga static control culture20,21 dahil sa maliit na bilang ng mga nakakalito na kadahilanan.Ang Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), at SB431542 (SB) ay pinili para sa screen na ito.Ang mga maliliit na molekula na ito ay dati nang ginamit sa mga kultura ng hiPSC-CM upang mahikayat ang pagkahinog ng mga cardiomyocytes sa pamamagitan ng pagtaas ng haba ng sarcomere, T-tubules, at bilis ng pagpapadaloy.Bilang karagdagan, ang parehong Dex (isang glucocorticoid) at SB ay kilala upang sugpuin ang pamamaga29,30.Samakatuwid, sinubukan namin kung ang pagsasama ng isa o isang kumbinasyon ng mga maliliit na molekula na ito ay mapapabuti ang integridad ng istruktura ng mga seksyon ng puso.Para sa paunang screening, ang dosis ng bawat tambalan ay pinili batay sa mga konsentrasyon na karaniwang ginagamit sa mga modelo ng kultura ng cell (1 μM Dex27, 100 nM T327, at 2.5 μM SB31).Pagkatapos ng 12 araw ng kultura, ang kumbinasyon ng T3 at Dex ay nagresulta sa pinakamainam na integridad ng istruktura ng cardiomyocyte at minimal na fibrous remodeling (Mga Pandagdag na Larawan 4 at 5).Bilang karagdagan, ang paggamit ng doble o dobleng mga konsentrasyon na ito ng T3 at Dex ay gumawa ng mga hindi kanais-nais na epekto kumpara sa mga normal na konsentrasyon (Karagdagang Fig. 6a, b).
Pagkatapos ng paunang screening, nagsagawa kami ng head-to-head na paghahambing ng 4 na kundisyon ng kultura (Figure 4a): Ctrl: mga seksyon ng puso na na-culture sa aming naunang inilarawan na static na kultura gamit ang aming na-optimize na medium;20.21 TD: T3 at Ctrl s Added Dex noong Miyerkules;MC: mga seksyon ng puso na na-culture sa CTCM gamit ang dati naming na-optimize na medium;at MT: CTCM na may T3 at Dex na idinagdag sa medium.Pagkatapos ng 12 araw ng paglilinang, ang posibilidad na mabuhay ng mga tisyu ng MS at MT ay nanatiling pareho sa mga sariwang tisyu na nasuri ng MTT assay (Fig. 4b).Kapansin-pansin, ang pagdaragdag ng T3 at Dex sa mga transwell culture (TD) ay hindi nagresulta sa isang makabuluhang pagpapabuti sa posibilidad na mabuhay kumpara sa mga kondisyon ng Ctrl, na nagpapahiwatig ng isang mahalagang papel ng mekanikal na pagpapasigla sa pagpapanatili ng posibilidad ng mga seksyon ng puso.
isang Eksperimental na diagram ng disenyo na naglalarawan sa apat na kundisyon ng kultura na ginamit upang suriin ang mga epekto ng mekanikal na pagpapasigla at T3/Dex supplementation sa medium sa loob ng 12 araw. b Ang bar graph ay nagpapakita ng quantification ng viability 12 araw pagkatapos ng kultura sa lahat ng 4 na kundisyon ng kultura (Ctrl, TD, MC, at MT) kumpara sa mga sariwang hiwa ng puso (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD at D12 MT), 12 (D12 MC, MC) na hiwa/grupo, oneway na hiwa/### ang isinagawa mula sa iba't ibang mga baboy, ###0. p <0.001 kumpara sa D0 at **p <0.01 kumpara sa D12 Ctrl). b Ang bar graph ay nagpapakita ng quantification ng viability 12 araw pagkatapos ng kultura sa lahat ng 4 na kundisyon ng kultura (Ctrl, TD, MC, at MT) kumpara sa mga sariwang hiwa ng puso (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD at D12 MT), 12 (D12 MC, MC) na hiwa/grupo, oneway na hiwa/### ang isinagawa mula sa iba't ibang mga baboy, ###0. p <0.001 kumpara sa D0 at **p <0.01 kumpara sa D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во вселокникрот 4 роль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) товин й, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Ang bar graph ay nagpapakita ng quantification ng viability sa 12 araw na post culture sa lahat ng 4 na kundisyon ng kultura (control, TD, MC, at MT) kumpara sa mga fresh heart section (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, at D12 MT), 12 (D12 MC) na seksyon/grupo, 12 (D12 MC) na pagsubok, ##0 # # # baboy/pangkat mula sa iba't ibang paraan p <0.001 kumpara sa D0 at **p <0.01 sa pamamagitan ng kumpara sa D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (Dl5)、 . ）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими свежими сердими (сердими серди и и MT) по сравнению со свежими (сердими (сердими серди) (сердими серди и серди) (0D15Dи серди) 12 Ctrl, D12 TD at D12 MT), mula sa разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ####p <0,001 спон внению с контролем D12). b Histogram na nagpapakita ng lahat ng 4 na kundisyon ng kultura (kontrol, TD, MC at MT) kumpara sa mga sariwang seksyon ng puso (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD at D12 MT), mula sa iba't ibang seksyon/grupo ng baboy 12 (D12 MC), one-way ANOVA test; #####p<0.0. 1 kumpara sa kontrol D12). c Bar graph ay nagpapakita ng quantification ng glucose flux 12 araw na post culture sa lahat ng 4 na kundisyon ng kultura (Ctrl, TD, MC, at MT) kumpara sa mga sariwang hiwa ng puso (D0) (n = 6 na hiwa/pangkat mula sa iba't ibang baboy, ang one-way na ANOVA test ay ginaganap; ###p <0.001, kumpara sa D0 at ***p <0.001 kumpara sa D1 Ctrl). c Bar graph ay nagpapakita ng quantification ng glucose flux 12 araw na post culture sa lahat ng 4 na kundisyon ng kultura (Ctrl, TD, MC, at MT) kumpara sa mga sariwang hiwa ng puso (D0) (n = 6 na hiwa/pangkat mula sa iba't ibang baboy, ang one-way na ANOVA test ay ginaganap; ###p <0.001, kumpara sa D0 at ***p <0.001 kumpara sa D1 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всенку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всеховольникроятирок ь, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, одностостолннин 0 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Histogram ay nagpapakita ng dami ng glucose flux 12 araw pagkatapos ng kultura sa ilalim ng lahat ng 4 na kundisyon ng kultura (kontrol, TD, MC at MT) kumpara sa mga sariwang seksyon ng puso (D0) (n = 6 na seksyon/pangkat mula sa iba't ibang mga baboy, one-way na ANOVA test na isinagawa ; ###p <0.001 kumpara sa D0 at ***p <0.001 kumpara sa D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比 的吹行埅通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，0）p1 。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 ， 切片后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单向执 猪单向执曌猪 ， ， ， ， ， 猪 猪单向执曌行0.相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования дло4 вселькования нтроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свинейБинский сторный; ##p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram na nagpapakita ng dami ng glucose flux sa 12 araw na post-culture para sa lahat ng 4 na kondisyon ng kultura (control, TD, MC, at MT) kumpara sa mga sariwang seksyon ng puso (D0) (n = 6 na seksyon/grupo, mula sa iba't ibang mga baboy, unilateral Ang mga pagsusuri sa ANOVA ay isinagawa, ###p <0.001 kumpara sa D0, ***p <0.001 kumpara sa D0, ***p <0.d Strain analysis plots ng sariwa (asul), araw 12 MC (berde), at araw 12 MT (pula) na mga tisyu sa sampung rehiyonal na mga punto ng seksyon ng tissue (n = 4 na hiwa/pangkat, one-way na pagsubok sa ANOVA; walang makabuluhang pagkakaiba sa pagitan ng mga grupo).e Volcano plot na nagpapakita ng differentially expressed genes sa mga fresh heart section (D0) kumpara sa mga heart section na na-culture sa ilalim ng static na kundisyon (Ctrl) o sa ilalim ng MT condition (MT) sa loob ng 10-12 araw.f Heatmap ng sarcomere genes para sa mga seksyon ng puso na na-culture sa ilalim ng bawat isa sa mga kundisyon ng kultura.Ang mga error bar ay kumakatawan sa mean ± standard deviation.
Ang metabolic dependence sa paglipat mula sa fatty acid oxidation sa glycolysis ay isang tanda ng cardiomyocyte dedifferentiation.Ang mga immature cardiomyocytes ay pangunahing gumagamit ng glucose para sa produksyon ng ATP at mayroong hypoplastic mitochondria na may kaunting cristae5,32.Ang mga pagsusuri sa paggamit ng glucose ay nagpakita na sa ilalim ng mga kondisyon ng MC at MT, ang paggamit ng glucose ay katulad ng sa araw na 0 na mga tisyu (Larawan 4c).Gayunpaman, ang mga sample ng Ctrl ay nagpakita ng isang makabuluhang pagtaas sa paggamit ng glucose kumpara sa sariwang tissue.Ipinahihiwatig nito na ang kumbinasyon ng CTCM at T3/Dex ay nagpapahusay ng tissue viability at pinapanatili ang metabolic phenotype ng 12-araw na kulturang mga seksyon ng puso.Bilang karagdagan, ipinakita ng pagsusuri ng strain na ang mga antas ng strain ay nanatiling pareho sa sariwang tisyu ng puso sa loob ng 12 araw sa ilalim ng mga kondisyon ng MT at MS (Fig. 4d).
Upang pag-aralan ang pangkalahatang epekto ng CTCM at T3 / Dex sa pandaigdigang transcriptional landscape ng cardiac slice tissue, nagsagawa kami ng RNAseq sa mga hiwa ng puso mula sa lahat ng apat na magkakaibang kundisyon ng kultura (Karagdagang Data 1).Kapansin-pansin, ang mga seksyon ng MT ay nagpakita ng mataas na pagkakapareho ng transkripsyon sa sariwang tisyu ng puso, na may 16 na naiibang ipinahayag sa 13,642 na mga gene.Gayunpaman, tulad ng ipinakita namin kanina, ang mga hiwa ng Ctrl ay nagpakita ng 1229 na naiibang ipinahayag na mga gene pagkatapos ng 10-12 araw sa kultura (Larawan 4e).Ang mga datos na ito ay kinumpirma ng qRT-PCR ng mga gene ng puso at fibroblast (Karagdagang Fig. 7a-c).Kapansin-pansin, ang mga seksyon ng Ctrl ay nagpakita ng downregulation ng mga gene ng cardiac at cell cycle at pag-activate ng mga programa ng nagpapaalab na gene.Iminumungkahi ng mga datos na ito na ang dedifferentiation, na karaniwang nangyayari pagkatapos ng pangmatagalang pag-kultura, ay ganap na nababawasan sa ilalim ng mga kondisyon ng MT (Karagdagang Fig. 8a,b).Ang maingat na pag-aaral ng mga gen ng sarcomere ay nagpakita na sa ilalim lamang ng mga kundisyon ng MT ang mga gene na naka-encode sa sarcomere (Larawan 4f) at channel ng ion (Karagdagang Fig. 9) ay napanatili, na pinoprotektahan ang mga ito mula sa pagsugpo sa ilalim ng mga kondisyon ng Ctrl, TD, at MC.Ipinapakita ng data na ito na sa kumbinasyon ng mechanical at humoral stimulation (T3/Dex), ang heart slice transcriptome ay maaaring manatiling katulad ng mga sariwang hiwa ng puso pagkatapos ng 12 araw sa kultura.
Ang mga natuklasang transkripsyon na ito ay sinusuportahan ng katotohanan na ang integridad ng istruktura ng mga cardiomyocytes sa mga seksyon ng puso ay pinakamahusay na napanatili sa ilalim ng mga kondisyon ng MT sa loob ng 12 araw, tulad ng ipinakita ng buo at naisalokal na connexin 43 (Fig. 5a).Bilang karagdagan, ang fibrosis sa mga seksyon ng puso sa ilalim ng mga kondisyon ng MT ay makabuluhang nabawasan kumpara sa Ctrl at katulad ng mga sariwang seksyon ng puso (Larawan 5b).Ipinapakita ng mga datos na ito na ang kumbinasyon ng mekanikal na pagpapasigla at paggamot sa T3/Dex ay epektibong nagpapanatili ng istraktura ng puso sa mga seksyon ng puso sa kultura.
isang Representative immunofluorescence na mga larawan ng troponin-T (berde), connexin 43 (pula), at DAPI (asul) sa mga bagong nakahiwalay na seksyon ng puso (D0) o naka-culture sa loob ng 12 araw sa lahat ng apat na kondisyon ng kultura ng seksyon ng puso (scale bar = 100 µm).). Artificial intelligence quantification ng heart tissue structural integrity (n = 7 (D0 at D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC at D12 MT) na hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy, ang one-way na ANOVA test ay ginaganap; ####p < 0.0001 kumpara sa D0 at *p < 0.00tr <1. Artificial intelligence quantification ng heart tissue structural integrity (n = 7 (D0 at D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC at D12 MT) na mga hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy, ang one-way na ANOVA test ay ginaganap; #### p < 0.0001 kumpara sa D0 at *p < 0.00tr <1.00, o D0.000. Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 2 и TD12), D0 2 D15) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; 2 Ctrl). Quantification ng structural integrity ng heart tissue gamit ang artificial intelligence (n = 7 (D0 at D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC at D12 MT) na seksyon/grupo mula sa iba't ibang baboy, one-way ANOVA test na isinagawa; #### p < 0.0001 kumpara sa D0 at *p < ****0 tr < 1.00 o ****p < 0.05.对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和人/廇至）智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 与缛比。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 癄和 d1量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p 1；或****p < 2.Quantification ng structural integrity ng cardiac tissue gamit ang artificial intelligence sa iba't ibang baboy (n = 7 (D0 at D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC at D12 MT) na seksyon/grupo) na may one-way ANOVA test;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 o ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 kumpara sa D0 at *p < 0.05 o ****p < 0.0001 kumpara sa D12 Ctrl). b Representative na mga larawan at quantification para sa mga hiwa ng puso na nabahiran ng trichrome stain ng Masson (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, at D12 MC), 9 (D12 MT) na hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy, isasagawa ang one-way ANOVA na pagsubok at ##00 <0; ***0. 1, o ****p <0.0001 kumpara sa D12 Ctrl). b Representative na mga larawan at quantification para sa mga hiwa ng puso na nabahiran ng trichrome stain ng Masson (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, at D12 MC), 9 (D12 MT) na hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy, isasagawa ang one-way ANOVA na pagsubok at ##00 <0; ***0. 1, o ****p <0.0001 kumpara sa D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (массона) (массона) (массона) = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний те01 ,##0 тест ANOVA ,##0; ***p < 0,001 o ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Representative na mga larawan at quantification ng mga seksyon ng puso na nabahiran ng trichrome stain ng Masson (scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD at D12 MC), 9 (D12 MT) na seksyon/grupo mula sa iba't ibang baboy, gumanap ng one-way ANOVA; ##00 at ##00 <10p. p <0.0001 kumpara sa D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 2、D0）（n = 10）（n = 2、D10） D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；##****##p < 0.0001 ，*p 与 <0.0001 ，*p*** 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） = 500 µm） ） 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 ， 更 0.0001 ， 盠方差分析； ####p < 0.0001 ， 曾001， 曾01， 曾01， 曾01，曾001， 曾001， 更片****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная = 1,000) 2 Ctrl, D12 TD at D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; по сравнению с D12 Ctrl). b Mga representasyong larawan at quantification ng mga seksyon ng puso na nabahiran ng Masson's trichrome (scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD at D12 MC), 9 (D12 MT) na mga seksyon mula sa iba't ibang baboy/grupo, isang ANOVA na paraan; ##0p <0. .0001 kumpara sa D12 Ctrl).Ang mga error bar ay kumakatawan sa mean ± standard deviation.
Sa wakas, ang kakayahan ng CTCM na gayahin ang cardiac hypertrophy ay nasuri sa pamamagitan ng pagtaas ng cardiac tissue stretch.Sa CTCM, tumaas ang peak air chamber pressure mula 80 mmHg hanggang 80 mmHg.Art.(normal na kahabaan) hanggang 140 mmHg Art.(Larawan 6a).Ito ay tumutugma sa isang 32% na pagtaas sa kahabaan (Larawan 6b), na dati ay ipinakita bilang katumbas na porsyento na kahabaan na kinakailangan para sa mga seksyon ng puso upang makamit ang isang haba ng sarcomere na katulad ng nakikita sa hypertrophy.Ang stretch at velocity ng cardiac tissue sa panahon ng contraction at relaxation ay nanatiling pare-pareho sa anim na araw ng kultura (Fig. 6c).Ang tissue ng puso mula sa mga kondisyon ng MT ay sumailalim sa normal na kahabaan (MT (Normal)) o mga kondisyon ng overstretch (MT (OS)) sa loob ng anim na araw.Matapos ang apat na araw sa kultura, ang hypertrophic biomarker na NT-ProBNP ay makabuluhang nakataas sa medium sa ilalim ng mga kondisyon ng MT (OS) kumpara sa mga kondisyon ng MT (normal) (Fig. 7a).Bilang karagdagan, pagkatapos ng anim na araw ng pag-culture, ang laki ng cell sa MT (OS) (Fig. 7b) ay makabuluhang tumaas kumpara sa mga seksyon ng MT heart (normal).Bilang karagdagan, ang NFATC4 nuclear translocation ay makabuluhang nadagdagan sa overstretched tissues (Fig. 7c).Ang mga resultang ito ay nagpapakita ng progresibong pag-unlad ng pathological remodeling pagkatapos ng hyperdistension at sinusuportahan ang konsepto na ang CTCM device ay maaaring gamitin bilang isang plataporma para pag-aralan ang stretch-induced cardiac hypertrophy signaling.
Ang mga kinatawan ng mga bakas ng presyon ng silid ng hangin, presyon ng silid ng likido, at mga sukat ng paggalaw ng tisyu ay nagpapatunay na ang presyon ng silid ay nagbabago ng presyon ng silid ng likido, na nagiging sanhi ng kaukulang paggalaw ng hiwa ng tissue.b Kinakatawan na porsyento ng kahabaan at mga kurba ng rate ng kahabaan para sa mga karaniwang nakaunat (kahel) at labis na nakaunat (asul) na mga seksyon ng tissue.c Bar graph na nagpapakita ng cycle time (n = 19 slice bawat grupo, mula sa iba't ibang baboy), contraction time (n = 18-19 slices bawat grupo, mula sa iba't ibang baboy), relaxation time (n = 19 slice bawat grupo, mula sa iba't ibang baboy) ), amplitude ng paggalaw ng tissue (n = 14 slice/group, mula sa iba't ibang baboy), peak systolic rate at 4 na grupo ng mga baboy n = 14 (D0), 15 (D6) ) na mga seksyon/grupo) mula sa iba't ibang mga baboy), ang t-test ng dalawang-tailed na Student ay nagpakita ng walang makabuluhang pagkakaiba sa anumang parameter, na nagpapahiwatig na ang mga parameter na ito ay nanatiling pare-pareho sa loob ng 6 na araw ng kultura na may overvoltage.Ang mga error bar ay kumakatawan sa mean ± standard deviation.
isang Bar graph na quantification ng konsentrasyon ng NT-ProBNP sa culture media mula sa mga hiwa ng puso na na-culture sa ilalim ng MT normal na stretch (Norm) o overstretching (OS) na mga kondisyon (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, at D4 MTOS) na hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy, Ginagawa ang Two-way ANOVA; **p <0.01 isang Bar graph na quantification ng konsentrasyon ng NT-ProBNP sa culture media mula sa mga hiwa ng puso na na-culture sa ilalim ng MT normal stretch (Norm) o overstretching (OS) na kondisyon (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, at D4 MTOS) na hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy, Two-way na ANOVA ang ginagawa; **p <0.01 kumpara sa normal na stretch).Ang quantitative histogram ng NT-ProBNP na konsentrasyon sa medium ng kultura mula sa mga hiwa ng puso na na-culture sa ilalim ng mga kondisyon ng normal na MT stretch (norm) o overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, at D4).MTOS) na hiwa /grupo mula sa iba't ibang baboy, isinasagawa ang two-factor analysis ng pagkakaiba-iba;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 kumpara sa normal na kahabaan). isang 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的培养基中NT-ProBNP 浓度的2 Norm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正弛**与正弛**与正伯一与与正伯。 isang Quantification ng konsentrasyon ng NT-ProBNP sa mga hiwa ng puso na na-culture sa ilalim ng MT normal na stretch (Norm) o overstretch (OS) na mga kondisyon (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) mula sa iba't ibang 猪的切片/组，可以喌可吹 na may normal na stretching; , p < 0.01).histogram Quantification ng mga konsentrasyon ng NT-ProBNP sa mga hiwa ng puso na na-culture sa ilalim ng mga kondisyon ng normal na MT stretch (norm) o overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) at D4 MTOS) na hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy, two-way analysis ng pagkakaiba-iba;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 kumpara sa normal na kahabaan). b Mga larawan ng kinatawan para sa mga hiwa ng puso na nabahiran ng troponin-T at WGA (kaliwa) at quantification ng laki ng cell (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) na mga cell/grupo mula sa 10 iba't ibang mga hiwa mula sa iba't ibang mga baboy, Ginagawa ang Two-tailed Student t-test; ****p <0.0001 kumpara sa normal na kahabaan). b Mga larawan ng kinatawan para sa mga hiwa ng puso na nabahiran ng troponin-T at WGA (kaliwa) at quantification ng laki ng cell (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) na mga cell/grupo mula sa 10 iba't ibang hiwa mula sa iba't ibang baboy, Ang two-tailed Student t-test ay isinasagawa; ****p <0.0001 kumpara sa normal na kahabaan). b. 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-крию**** ; сравнению с нормальным растяжением). b Mga larawan ng kinatawan ng mga seksyon ng puso na nabahiran ng troponin-T at AZP (kaliwa) at quantification ng laki ng cell (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) na mga cell/grupo mula sa 10 iba't ibang seksyon mula sa iba't ibang mga baboy, isinagawa ang t-test ng dalawang-tailed na Estudyante; ****p <0.0001 kumpara sa normal na strain. b.自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与曉正1. ）. b Mga larawan ng kinatawan ng mga hiwa ng puso na nabahiran ng calcarein-T at WGA (kaliwa) at laki ng cell (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 mula sa 10 iba't ibang hiwa (D6 MTNorm)) Cells/组，两方法有尾学生t test；0；0 na normal na pag-stretch. b. 6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента ****0; льным растяжением). b Mga larawan ng kinatawan ng mga seksyon ng puso na nabahiran ng troponin-T at AZP (kaliwa) at quantification ng laki ng cell (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) mula sa 10 iba't ibang seksyon mula sa iba't ibang baboy) Mga cell/grupo, two-tailed criterion Student's t;****p <0.0001 kumpara sa normal na strain). c Mga larawan ng kinatawan para sa araw 0 at araw 6 na mga hiwa ng puso ng MTOS na may immunolabeled para sa troponin-T at NFATC4 at dami ng pagsasalin ng NFATC4 sa nuclei ng CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) na mga hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy, Isinasagawa ang Two-tailed Student t-test; *p <0.05). c Representative na mga imahe para sa araw 0 at araw 6 MTOS heart slices immunolabeled para sa troponin-T at NFATC4 at quantification ng translocation ng NFATC4 sa nuclei ng CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) na hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy , Two-tailed Student t-test ay ginanap; *p <0.00. c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, at NFATC4, столикацнач FATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двустонюся двустонюди двустонюд, выполняется двустонюд 5 * t-клеток. c Kinatawan ng mga imahe para sa mga seksyon ng puso sa 0 at 6 na araw MTOS, immunolabeled para sa troponin-T at NFATC4, at quantification ng NFATC4 translocation sa nucleus ng cavernous cell (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) hiwa/grupo mula sa iba't ibang mga baboy) nagsagawa ng two-tailed Student's t-test;*p <0.05). c.易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p) < 。 c Representative na larawan ng calcanin-T at NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS heart slices, at NFATC4 mula sa iba't ibang NFATC4 易位至CM cell nucleus的quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 制生et 电影；*p < 0.05). c. FATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Kinatawan ng mga larawan ng MTOS heart slices sa araw 0 at 6 para sa troponin-T at NFATC4 immunolabeling at quantification ng NFATC4 translocation sa nucleus ng CM mula sa iba't ibang baboy (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) na hiwa/grupo, two-tailed t -criterion Student's; *p <0.05).Ang mga error bar ay kumakatawan sa mean ± standard deviation.
Ang pagsasalin ng cardiovascular na pananaliksik ay nangangailangan ng mga cellular na modelo na tumpak na nagpaparami sa kapaligiran ng puso.Sa pag-aaral na ito, isang CTCM device ang binuo at nailalarawan na maaaring pasiglahin ang mga ultrathin na seksyon ng puso.Kasama sa sistema ng CTCM ang physiologically synchronize na electromechanical stimulation at T3 at Dex fluid enrichment.Kapag ang mga seksyon ng puso ng baboy ay nalantad sa mga salik na ito, ang kanilang posibilidad, integridad ng istruktura, aktibidad ng metabolic, at pagpapahayag ng transkripsyon ay nanatiling pareho sa sariwang tisyu ng puso pagkatapos ng 12 araw na kultura.Bilang karagdagan, ang sobrang pag-stretch ng cardiac tissue ay maaaring maging sanhi ng hypertrophy ng puso na dulot ng hyperextension.Sa pangkalahatan, sinusuportahan ng mga resultang ito ang kritikal na papel ng mga kondisyon ng kulturang pisyolohikal sa pagpapanatili ng isang normal na phenotype ng puso at nagbibigay ng isang plataporma para sa screening ng gamot.
Maraming mga kadahilanan ang nag-aambag sa paglikha ng isang pinakamainam na kapaligiran para sa paggana at kaligtasan ng mga cardiomyocytes.Ang pinaka-halata sa mga salik na ito ay nauugnay sa (1) intercellular interaction, (2) electromechanical stimulation, (3) humoral factor, at (4) metabolic substrates.Ang mga pakikipag-ugnayan ng physiological cell-to-cell ay nangangailangan ng mga kumplikadong three-dimensional na network ng maraming uri ng cell na sinusuportahan ng isang extracellular matrix.Ang ganitong mga kumplikadong pakikipag-ugnayan ng cellular ay mahirap na muling buuin sa vitro sa pamamagitan ng co-culture ng mga indibidwal na uri ng cell, ngunit madaling makamit gamit ang organotypic na kalikasan ng mga seksyon ng puso.
Ang mekanikal na kahabaan at elektrikal na pagpapasigla ng mga cardiomyocytes ay kritikal para sa pagpapanatili ng cardiac phenotype33,34,35.Habang ang mechanical stimulation ay malawakang ginagamit para sa hiPSC-CM conditioning at maturation, ilang mga eleganteng pag-aaral ang kamakailan ay sinubukan ang mekanikal na pagpapasigla ng mga hiwa ng puso sa kultura gamit ang uniaxial loading.Ang mga pag-aaral na ito ay nagpapakita na ang 2D uniaxial mechanical loading ay may positibong epekto sa phenotype ng puso sa panahon ng kultura.Sa mga pag-aaral na ito, maaaring ni-load ang mga seksyon ng puso ng isometric tensile forces17, linear auxotonic loading18, o muling ginawa ang cycle ng puso gamit ang force transducer feedback at tension drives.Gayunpaman, ang mga pamamaraang ito ay gumagamit ng uniaxial tissue stretch nang walang environmental optimization, na nagreresulta sa pagsugpo sa maraming cardiac genes o overexpression ng mga gene na nauugnay sa abnormal na mga tugon sa stretch.Ang CTCM na inilarawan dito ay nagbibigay ng 3D electromechanical stimulus na ginagaya ang natural na cycle ng puso sa mga tuntunin ng cycle time at physiological stretch (25% stretch, 40% systole, 60% diastole, at 72 beats kada minuto).Bagaman ang tatlong-dimensional na mekanikal na pagpapasigla lamang ay hindi sapat upang mapanatili ang integridad ng tissue, ang isang kumbinasyon ng humoral at mekanikal na pagpapasigla gamit ang T3/Dex ay kinakailangan upang sapat na mapanatili ang tissue viability, function, at integridad.
Ang mga humoral na kadahilanan ay may mahalagang papel sa pag-modulate ng pang-adultong phenotype ng puso.Na-highlight ito sa mga pag-aaral ng HiPS-CM kung saan idinagdag ang T3 at Dex sa media ng kultura upang mapabilis ang pagkahinog ng cell.Maaaring maimpluwensyahan ng T3 ang transportasyon ng mga amino acid, asukal at calcium sa mga lamad ng cell36.Bilang karagdagan, ang T3 ay nagtataguyod ng MHC-α expression at MHC-β downregulation, na nagsusulong ng pagbuo ng mabilis na twitch myofibrils sa mature cardiomyocytes kumpara sa mabagal na twitch myofibrils sa fetal CM.Ang kakulangan ng T3 sa mga pasyente ng hypothyroid ay nagreresulta sa pagkawala ng mga myofibrillar band at isang pinababang rate ng pag-unlad ng tono37.Ang Dex ay kumikilos sa mga glucocorticoid receptor at naipakita na nagpapataas ng myocardial contractility sa mga nakahiwalay na perfused na puso;38 ang pagpapahusay na ito ay naisip na nauugnay sa epekto sa pagpasok ng calcium deposit-driven (SOCE) 39,40.Bilang karagdagan, ang Dex ay nagbubuklod sa mga receptor nito, na nagdudulot ng malawak na intracellular na tugon na pinipigilan ang immune function at pamamaga30.
Ang aming mga resulta ay nagpapahiwatig na ang pisikal na mekanikal na pagpapasigla (MS) ay nagpabuti ng pangkalahatang pagganap ng kultura kumpara sa Ctrl, ngunit nabigo na mapanatili ang kakayahang umangkop, integridad ng istruktura, at pagpapahayag ng puso sa loob ng 12 araw sa kultura.Kung ikukumpara sa Ctrl, ang pagdaragdag ng T3 at Dex sa mga kultura ng CTCM (MT) ay nagpabuti ng kakayahang umangkop at nagpapanatili ng mga katulad na profile ng transkripsyon, integridad ng istruktura, at aktibidad ng metabolic na may sariwang tissue ng puso sa loob ng 12 araw.Bilang karagdagan, sa pamamagitan ng pagkontrol sa antas ng tissue stretch, isang hyperextension-induced cardiac hypertrophy model ang nilikha gamit ang STCM, na naglalarawan ng versatility ng STCM system.Dapat tandaan na kahit na ang cardiac remodeling at fibrosis ay karaniwang may kinalaman sa mga buo na organo na ang mga circulating cell ay maaaring magbigay ng naaangkop na mga cytokine pati na rin ang phagocytosis at iba pang remodeling factor, ang mga seksyon ng puso ay maaari pa ring gayahin ang fibrotic na proseso bilang tugon sa stress at trauma.sa myofibroblast.Dati na itong nasuri sa modelong ito ng cardiac slice.Dapat pansinin na ang mga parameter ng CTCM ay maaaring ma-modulate sa pamamagitan ng pagpapalit ng pressure/electrical amplitude at frequency para gayahin ang maraming kondisyon tulad ng tachycardia, bradycardia, at mechanical circulatory support (mechanical unloaded heart).Ginagawa nitong medium throughput ang system para sa drug testing.Ang kakayahan ng CTCM na magmodelo ng overexertion-induced cardiac hypertrophy ay nagbibigay daan para sa pagsubok sa system na ito para sa personalized na therapy.Sa konklusyon, ipinapakita ng kasalukuyang pag-aaral na ang mekanikal na kahabaan at pagpapasigla ng humoral ay kritikal para sa pagpapanatili ng kultura ng mga seksyon ng cardiac tissue.
Bagaman iminumungkahi ng data na ipinakita dito na ang CTCM ay isang napaka-promising na platform para sa pagmomodelo ng buo na myocardium, ang pamamaraang ito ng kultura ay may ilang mga limitasyon.Ang pangunahing limitasyon ng kultura ng CTCM ay ang pagpapataw nito ng tuluy-tuloy na mga dynamic na mekanikal na stress sa mga hiwa, na humahadlang sa kakayahang aktibong subaybayan ang mga contraction ng cardiac slice sa bawat cycle.Bilang karagdagan, dahil sa maliit na sukat ng mga seksyon ng puso (7 mm), ang kakayahang suriin ang systolic function sa labas ng mga sistema ng kultura gamit ang mga tradisyonal na sensor ng puwersa ay limitado.Sa kasalukuyang manuskrito, bahagyang nalampasan namin ang limitasyong ito sa pamamagitan ng pagsusuri ng optical voltage bilang indicator ng contractile function.Gayunpaman, ang limitasyong ito ay mangangailangan ng karagdagang trabaho at maaaring matugunan sa hinaharap sa pamamagitan ng pagpapakilala ng mga pamamaraan para sa optical monitoring ng function ng mga hiwa ng puso sa kultura, tulad ng optical mapping gamit ang calcium at mga boltahe na sensitibong tina.Ang isa pang limitasyon ng CTCM ay ang gumaganang modelo ay hindi manipulahin ang physiological stress (preload at afterload).Sa CTCM, ang presyon ay na-induce sa magkasalungat na direksyon upang magparami ng 25% physiological stretch sa diastole (full stretch) at systole (haba ng contraction sa panahon ng electrical stimulation) sa napakalaking tissue.Ang limitasyong ito ay dapat alisin sa hinaharap na mga disenyo ng CTCM sa pamamagitan ng sapat na presyon sa cardiac tissue mula sa magkabilang panig at sa pamamagitan ng paglalapat ng eksaktong mga ugnayan ng pressure-volume na nangyayari sa mga silid ng puso.
Ang overstretch-induced remodeling na iniulat sa manuskrito na ito ay limitado sa paggaya sa hypertrophic hyperstretch signal.Kaya, ang modelong ito ay makakatulong sa pag-aaral ng stretch-induced hypertrophic signaling nang hindi nangangailangan ng humoral o neural na mga kadahilanan (na wala sa sistemang ito).Ang mga karagdagang pag-aaral ay kinakailangan upang madagdagan ang multiplicity ng CTCM, halimbawa, co-culturing na may immune cells, nagpapalipat-lipat ng plasma humoral factor, at innervation kapag ang co-culturing sa neuronal cells ay mapapabuti ang mga posibilidad ng pagmomodelo ng sakit sa CTCM.
Labintatlong baboy ang ginamit sa pag-aaral na ito.Ang lahat ng mga pamamaraan ng hayop ay isinagawa alinsunod sa mga alituntunin ng institusyonal at naaprubahan ng University of Louisville Institutional Animal Care and Use Committee.Ang aortic arch ay na-clamp at ang puso ay pinabanguhan ng 1 L ng sterile cardioplegia (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH hanggang 7.4); ang mga puso ay napanatili sa malamig na solusyon ng cardioplegic hanggang sa dalhin sa lab sa yelo na karaniwang <10 min. ang mga puso ay napanatili sa malamig na solusyon ng cardioplegic hanggang sa dalhin sa lab sa yelo na karaniwang <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимамит <10нимат ang mga puso ay nakaimbak sa malamig na solusyon ng cardioplegic hanggang sa dalhin sa laboratoryo sa yelo, na karaniwang tumatagal ng <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Panatilihin ang mga puso sa ice cardioplegia hanggang sa dalhin sa laboratoryo sa yelo, karaniwan ay <10 min.
Ang CTCM device ay binuo sa SolidWorks computer-aided design (CAD) software.Ang mga culture chamber, divider at air chamber ay gawa sa CNC clear acrylic plastic.Ang 7mm diameter na back-up ring ay gawa sa high density polyethylene (HDPE) sa gitna at may o-ring groove para i-accommodate ang silicone o-ring na ginamit para i-seal ang media sa ilalim.Ang isang manipis na silica membrane ay naghihiwalay sa silid ng kultura mula sa plato ng paghihiwalay.Ang silicone membrane ay laser cut mula sa 0.02″ makapal na silicone sheet at may tigas na 35A.Ang ilalim at itaas na mga silicone gasket ay laser cut mula sa 1/16″ makapal na silicone sheet at may tigas na 50A.316L stainless steel screws at wing nuts ay ginagamit para sa fastening ang block at paggawa ng airtight seal.
Ang isang nakatuong naka-print na circuit board (PCB) ay idinisenyo upang maisama sa C-PACE-EM system.Ang swiss machine connector sockets sa PCB ay konektado sa graphite electrodes sa pamamagitan ng silver-plated copper wires at bronze 0-60 screws na naka-screw sa mga electrodes.Ang naka-print na circuit board ay inilalagay sa takip ng 3D printer.
Ang CTCM device ay kinokontrol ng isang programmable pneumatic actuator (PPD) na lumilikha ng kontroladong circulatory pressure na katulad ng isang cycle ng puso.Habang tumataas ang presyon sa loob ng silid ng hangin, ang nababaluktot na silicone membrane ay lumalawak paitaas, na pinipilit ang daluyan sa ilalim ng tissue site.Ang bahagi ng tissue ay iuunat sa pamamagitan ng pagpapatalsik na ito ng likido, na ginagaya ang physiological expansion ng puso sa panahon ng diastole.Sa tuktok ng pagpapahinga, ang elektrikal na pagpapasigla ay inilapat sa pamamagitan ng mga graphite electrodes, na nagpababa ng presyon sa silid ng hangin at nagdulot ng pag-urong ng mga seksyon ng tissue.Sa loob ng pipe ay isang hemostatic valve na may pressure sensor para makita ang pressure sa air system.Ang pressure na nararamdaman ng pressure sensor ay inilalapat sa isang data collector na nakakonekta sa laptop.Pinapayagan nito ang patuloy na pagsubaybay sa presyon sa loob ng silid ng gas.Kapag naabot na ang maximum na presyon ng chamber (karaniwang 80 mmHg, 140 mmHg OS), inutusan ang data acquisition device na magpadala ng signal sa C-PACE-EM system para makabuo ng biphasic voltage signal para sa 2 ms, na nakatakda sa 4 V.
Ang mga seksyon ng puso ay nakuha at ang mga kondisyon ng kultura sa 6 na balon ay isinagawa tulad ng sumusunod: Ilipat ang mga inani na puso mula sa sisidlan ng paglilipat sa isang tray na naglalaman ng malamig (4° C.) cardioplegia.Ang kaliwang ventricle ay nakahiwalay sa isang sterile blade at pinutol sa mga piraso ng 1-2 cm3.Ang mga tissue block na ito ay nakakabit sa tissue support na may tissue adhesive at inilagay sa isang vibrating microtome tissue bath na naglalaman ng Tyrode's solution at patuloy na oxygenated (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g) . ), 6 mM KCl (0.407 m), 6 mM KCl (0.407 m) PES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M solution), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M solution), hanggang 1 L ddH2O).Ang vibrating microtome ay nakatakdang maghiwa ng 300 µm makapal na hiwa sa dalas na 80 Hz, isang pahalang na vibration amplitude na 2 mm, at isang advance rate na 0.03 mm/s.Ang tissue bath ay napapalibutan ng yelo upang panatilihing malamig ang solusyon at ang temperatura ay napanatili sa 4°C.Ilipat ang mga seksyon ng tissue mula sa microtome bath patungo sa incubation bath na naglalaman ng tuluy-tuloy na oxygenated na Tyrode solution sa yelo hanggang sa makakuha ng sapat na seksyon para sa isang culture plate.Para sa mga transwell culture, ang mga seksyon ng tissue ay nakakabit sa sterile 6 mm wide polyurethane support at inilagay sa 6 ml ng optimized medium (199 medium, 1x ITS supplement, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkaline at 2X antibiotic-antifungal ).Ang elektrikal na pagpapasigla (10 V, dalas na 1.2 Hz) ay inilapat sa mga seksyon ng tissue sa pamamagitan ng C-Pace.Para sa mga kondisyon ng TD, ang sariwang T3 at Dex ay idinagdag sa 100 nM at 1 μM sa bawat pagbabago ng daluyan.Ang daluyan ay puspos ng oxygen bago palitan ng 3 beses sa isang araw.Ang mga seksyon ng tissue ay nilinang sa isang incubator sa 37°C at 5% CO2.
Para sa mga kultura ng CTCM, ang mga seksyon ng tissue ay inilagay sa isang custom-made na 3D printer sa isang Petri dish na naglalaman ng binagong solusyon ng Tyrode.Ang aparato ay idinisenyo upang palakihin ang laki ng hiwa ng puso ng 25% ng lugar ng ring ng suporta.Ginagawa ito upang ang mga seksyon ng puso ay hindi mag-inat pagkatapos mailipat mula sa solusyon ni Tyrode sa daluyan at sa panahon ng diastole.Gamit ang histoacrylic glue, ang mga seksyon na 300 µm ang kapal ay naayos sa isang support ring na 7 mm ang lapad.Pagkatapos ikabit ang mga seksyon ng tissue sa support ring, putulin ang labis na mga seksyon ng tissue at ilagay ang mga nakadikit na seksyon ng tissue pabalik sa paliguan ng Tyrode solution sa yelo (4°C) hanggang sa maihanda ang sapat na mga seksyon para sa isang device.Ang kabuuang oras ng pagproseso para sa lahat ng device ay hindi dapat lumampas sa 2 oras.Matapos ikabit ang 6 na seksyon ng tissue sa kanilang mga support ring, na-assemble ang CTCM device.Ang silid ng kultura ng CTCM ay paunang napuno ng 21 ml na pre-oxygenated na daluyan.Ilipat ang mga seksyon ng tissue sa silid ng kultura at maingat na alisin ang anumang mga bula ng hangin gamit ang isang pipette.Ang seksyon ng tissue ay pagkatapos ay ginagabayan sa butas at dahan-dahang pinindot sa lugar.Panghuli, ilagay ang takip ng elektrod sa aparato at ilipat ang aparato sa incubator.Pagkatapos ay ikonekta ang CTCM sa air tube at sa C-PACE-EM system.Ang pneumatic actuator ay bubukas at ang air valve ay bubukas ang CTCM.Ang C-PACE-EM system ay na-configure upang maghatid ng 4 V sa 1.2 Hz sa panahon ng biphasic pacing para sa 2 ms.Ang daluyan ay binago dalawang beses sa isang araw at ang mga electrodes ay pinalitan isang beses sa isang araw upang maiwasan ang akumulasyon ng grapayt sa mga electrodes.Kung kinakailangan, maaaring tanggalin ang mga seksyon ng tissue mula sa kanilang mga balon ng kultura upang paalisin ang anumang mga bula ng hangin na maaaring nahulog sa ilalim ng mga ito.Para sa mga kondisyon ng paggamot sa MT, ang T3/Dex ay idinagdag na sariwa sa bawat pagbabago sa daluyan na may 100 nM T3 at 1 μM Dex.Ang mga aparatong CTCM ay nilinang sa isang incubator sa 37°C at 5% CO2.
Upang makakuha ng mga stretched trajectory ng mga hiwa ng puso, isang espesyal na sistema ng camera ang binuo.Isang SLR camera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) ang ginamit sa isang Navitar Zoom 7000 18-108mm macro lens (Navitar, San Francisco, CA).Ang visualization ay isinagawa sa temperatura ng silid pagkatapos palitan ang daluyan ng sariwang daluyan.Ang camera ay nakaposisyon sa isang 51° anggulo at ang video ay naitala sa 30 mga frame bawat segundo.Una, ginamit ang open source software (MUSCLEMOTION43) kasama ang Image-J upang mabilang ang galaw ng mga hiwa ng puso.Ginawa ang mask gamit ang MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) upang tukuyin ang mga rehiyon ng interes para sa pagtibok ng mga hiwa ng puso upang maiwasan ang ingay.Ang mga manu-manong naka-segment na mask ay inilalapat sa lahat ng mga larawan sa isang frame sequence at pagkatapos ay ipinapasa sa MUSCLEMOTION plug-in.Ginagamit ng Muscle Motion ang average na intensity ng mga pixel sa bawat frame upang mabilang ang paggalaw nito kaugnay ng reference frame.Ang data ay naitala, na-filter at ginamit upang mabilang ang cycle ng oras at masuri ang tissue stretch sa panahon ng cardiac cycle.Ang na-record na video ay post-processed gamit ang isang first-order na zero-phase digital filter.Para ma-quantify ang tissue stretch (peak-to-peak), ang peak-to-peak analysis ay isinagawa upang makilala ang pagitan ng mga peak at troughs sa naitala na signal.Bilang karagdagan, ang detrending ay ginagawa gamit ang ika-6 na order polynomial upang maalis ang pag-anod ng signal.Ang program code ay binuo sa MATLAB upang matukoy ang pandaigdigang paggalaw ng tissue, cycle time, relaxation time, at contraction time (Supplementary Program Code 44).
Para sa pagsusuri ng strain, gamit ang parehong mga video na ginawa para sa mechanical stretch assessment, na-trace muna namin ang dalawang larawan na kumakatawan sa mga peak ng paggalaw (ang pinakamataas (itaas) at pinakamababang (mas mababang) mga punto ng paggalaw) ayon sa software ng MUSCLEMOTION.Pagkatapos ay pinag-segment namin ang mga rehiyon ng tissue at inilapat ang isang anyo ng shading algorithm sa naka-segment na tissue (Karagdagang Fig. 2a).Ang naka-segment na tissue ay pagkatapos ay hinati sa sampung subsurfaces, at ang stress sa bawat ibabaw ay kinakalkula gamit ang sumusunod na equation: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, kung saan ang Sup at Sdown ay ang mga distansya ng hugis mula sa itaas at ilalim na mga anino ng tela, ayon sa pagkakabanggit (Karagdagang Fig. 2b).
Ang mga seksyon ng puso ay naayos sa 4% paraformaldehyde sa loob ng 48 oras.Ang mga nakapirming tisyu ay na-dehydrate sa 10% at 20% na sucrose sa loob ng 1 oras, pagkatapos ay sa 30% na sucrose sa magdamag.Ang mga seksyon ay pagkatapos ay naka-embed sa pinakamainam na cutting temperature compound (OCT compound) at unti-unting nagyelo sa isang isopentane/dry ice bath.Itabi ang mga bloke ng pag-embed ng OCT sa -80 °C hanggang sa paghihiwalay.Ang mga slide ay inihanda bilang mga seksyon na may kapal na 8 μm.
Upang alisin ang OCT mula sa mga seksyon ng puso, painitin ang mga slide sa isang heating block sa 95 °C sa loob ng 5 min.Magdagdag ng 1 ml PBS sa bawat slide at i-incubate sa loob ng 30 minuto sa temperatura ng silid, pagkatapos ay tumagos sa mga seksyon sa pamamagitan ng pagtatakda ng 0.1% Triton-X sa PBS sa loob ng 15 minuto sa temperatura ng silid.Upang maiwasan ang mga di-tiyak na antibodies mula sa pagbubuklod sa sample, magdagdag ng 1 ml ng 3% BSA solution sa mga slide at i-incubate ng 1 oras sa temperatura ng silid.Pagkatapos ay inalis ang BSA at ang mga slide ay hinugasan ng PBS.Markahan ang bawat sample ng lapis.Pangunahing antibodies (diluted 1:200 sa 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) at troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) ay idinagdag sa loob ng 90 minuto, pagkatapos ay idinagdag ang pangalawang antibodies (%Alexa) (208) laban sa 1%Alexa8 (208) Thermo Scientific; #A16079), laban sa kuneho Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) para sa karagdagang 90 minuto Hinugasan ng 3 beses gamit ang PBS Upang makilala ang target na paglamlam mula sa background, ginamit lang namin ang pangalawang antibody bilang kontrol. Panghuli, ang DAPI nuclear stain ay idinagdag at ang mga slider ay inilagay sa isang vectoral staining at ang mga slider ay inilagay sa isang vector shield. magnification) at Keyence microscope na may 40x magnification.
Ang WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) sa 5 μg/ml sa PBS ay ginamit para sa paglamlam ng WGA at inilapat sa mga nakapirming seksyon sa loob ng 30 minuto sa temperatura ng silid.Ang mga slide ay pagkatapos ay hugasan ng PBS at Sudan itim ay idinagdag sa bawat slide at incubated para sa 30 minuto.Pagkatapos ay hugasan ang mga slide gamit ang PBS at idinagdag ang vectashield embedding medium.Na-visualize ang mga slide sa isang Keyence microscope sa 40x magnification.
Ang OCT ay tinanggal mula sa mga sample tulad ng inilarawan sa itaas.Pagkatapos alisin ang OCT, isawsaw ang mga slide sa solusyon ni Bouin sa magdamag.Ang mga slide ay pagkatapos ay banlawan ng distilled water sa loob ng 1 oras at pagkatapos ay inilagay sa isang Bibrich aloe acid fuchsin solution sa loob ng 10 minuto.Pagkatapos ang mga slide ay hugasan ng distilled water at inilagay sa isang solusyon ng 5% phosphomolybdenum/5% phosphotungstic acid sa loob ng 10 minuto.Nang walang pagbabanlaw, ilipat ang mga slide nang direkta sa aniline blue solution sa loob ng 15 minuto.Pagkatapos ang mga slide ay hugasan ng distilled water at inilagay sa isang 1% acetic acid solution sa loob ng 2 minuto.Ang mga slide ay pinatuyo sa 200 N ethanol at inilipat sa xylene.Ang mga stained slide ay na-visualize gamit ang isang Keyence microscope na may 10x na layunin.Ang porsyento ng fibrosis area ay na-quantified gamit ang Keyence Analyzer software.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), catalog number V13154, ayon sa protocol ng manufacturer na may ilang pagbabago.Sa partikular, ang isang surgical punch na may diameter na 6 mm ay ginamit upang matiyak ang pare-parehong laki ng tissue sa panahon ng pagsusuri sa MTT.Ang mga tissue ay isa-isang nilagyan ng mga balon ng 12-well plate na naglalaman ng MTT substrate ayon sa protocol ng manufacturer.Ang mga seksyon ay incubated sa 37° C. para sa 3 oras at ang buhay na tissue metabolizes ang MTT substrate upang bumuo ng isang purple formazan compound.Palitan ang solusyon ng MTT ng 1 ml DMSO at i-incubate sa 37 °C sa loob ng 15 minuto upang kunin ang purple formazan mula sa mga seksyon ng puso.Ang mga sample ay natunaw ng 1:10 sa DMSO sa 96-well clear bottom plate at purple color intensity na sinusukat sa 570 nm gamit ang Cytation plate reader (BioTek).Ang mga pagbabasa ay na-normalize sa bigat ng bawat hiwa ng puso.
Ang heart slice media ay pinalitan ng media na naglalaman ng 1 μCi/ml [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) para sa glucose utilization assay gaya ng naunang inilarawan.Pagkatapos ng 4 na oras ng pagpapapisa ng itlog, magdagdag ng 100 µl ng medium sa isang bukas na microcentrifuge tube na naglalaman ng 100 µl ng 0.2 N HCl.Pagkatapos ang tubo ay inilagay sa isang scintillation tube na naglalaman ng 500 μl ng dH2O upang mag-evaporate [3H]2O sa loob ng 72 oras sa 37°C.Pagkatapos ay alisin ang microcentrifuge tube mula sa scintillation tube at magdagdag ng 10 ml ng scintillation fluid.Ang mga bilang ng scintillation ay isinagawa gamit ang isang Tri-Carb 2900TR liquid scintillation analyzer (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA).Ang paggamit ng glucose ay pagkatapos ay kinakalkula na isinasaalang-alang ang [5-3H]-glucose na partikular na aktibidad, hindi kumpletong equilibrium at background, pagbabanto ng [5-3H]-sa walang label na glucose, at scintillation counter efficiency.Ang data ay na-normalize sa masa ng mga seksyon ng puso.
Pagkatapos ng homogenization ng tissue sa Trizol, ang RNA ay nahiwalay sa mga seksyon ng puso gamit ang Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 ayon sa protocol ng gumawa.Ang paghahanda ng library ng RNAsec, pagkakasunud-sunod at pagsusuri ng data ay isinagawa tulad ng sumusunod:
Ang 1 μg ng RNA bawat sample ay ginamit bilang panimulang materyal para sa paghahanda ng library ng RNA.Nabuo ang mga sequencing na library gamit ang NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit para sa Illumina (NEB, USA) kasunod ng mga rekomendasyon ng manufacturer, at idinagdag ang mga index code sa mga attribute sequence para sa bawat sample.Sa madaling sabi, ang mRNA ay nalinis mula sa kabuuang RNA gamit ang mga magnetic bead na nakakabit sa poly-T oligonucleotides.Isinasagawa ang fragmentation gamit ang divalent cations sa mataas na temperatura sa NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).Ang unang strand cDNA ay na-synthesize gamit ang random na hexamer primers at M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-).Ang pangalawang strand na cDNA ay na-synthesize gamit ang DNA polymerase I at RNase H. Ang natitirang mga overhang ay na-convert sa mga blunt na dulo sa pamamagitan ng aktibidad ng exonuclease/polymerase.Pagkatapos ng adenylation ng 3′ dulo ng DNA fragment, isang NEBNext Adapter na may hairpin loop na istraktura ay nakakabit dito upang ihanda ito para sa hybridization.Para sa pagpili ng mga fragment ng cDNA ng ginustong haba na 150-200 bp.Ang mga fragment ng library ay nalinis gamit ang AMPure XP system (Beckman Coulter, Beverly, USA).Pagkatapos, ang 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) na may napiling laki na cDNA na ligated na may adaptor ay ginamit sa loob ng 15 minuto sa 37 ° C at pagkatapos ay para sa 5 minuto sa 95 ° C bago ang PCR.Pagkatapos ay isinagawa ang PCR gamit ang Phusion High-Fidelity DNA polymerase, universal PCR primers, at Index (X) primers.Sa wakas, ang mga produkto ng PCR ay nalinis (AMPure XP system) at nasuri ang kalidad ng library sa isang Agilent Bioanalyzer 2100 system.Ang cDNA library ay pagkatapos ay sequenced gamit ang isang Novaseq sequencer.Ang mga hilaw na file ng imahe mula sa Illumina ay na-convert sa mga hilaw na pagbasa gamit ang CASAVA Base Calling.Ang raw data ay iniimbak sa FASTQ(fq) na mga file na format na naglalaman ng mga read sequence at kaukulang mga batayang katangian.Piliin ang HISAT2 upang itugma ang mga na-filter na sequencing na nabasa sa Sscrofa11.1 reference genome.Sa pangkalahatan, sinusuportahan ng HISAT2 ang mga genome ng anumang laki, kabilang ang mga genome na mas malaki sa 4 bilyong base, at ang mga default na halaga ay itinakda para sa karamihan ng mga parameter.Ang pag-splice ng mga nabasa mula sa data ng RNA Seq ay maaaring mahusay na ihanay gamit ang HISAT2, ang pinakamabilis na sistema na kasalukuyang magagamit, na may pareho o mas mahusay na katumpakan kaysa sa anumang iba pang paraan.
Ang kasaganaan ng mga transcript ay direktang sumasalamin sa antas ng pagpapahayag ng gene.Ang mga antas ng expression ng gene ay sinusuri sa pamamagitan ng kasaganaan ng mga transcript (sequencing count) na nauugnay sa genome o mga exon.Ang bilang ng mga nabasa ay proporsyonal sa mga antas ng expression ng gene, haba ng gene, at lalim ng pagkakasunud-sunod.Ang FPKM (mga fragment bawat libong batayang pares ng transcript na pinagsunod-sunod sa bawat milyong pares ng base) ay kinakalkula at ang mga P-value ng differential expression ay natukoy gamit ang DESeq2 package.Pagkatapos ay kinakalkula namin ang false discovery rate (FDR) para sa bawat P value gamit ang Benjamini-Hochberg method9 batay sa built-in na R-function na "p.adjust".
Ang RNA na nakahiwalay mula sa mga seksyon ng puso ay na-convert sa cDNA sa konsentrasyon na 200 ng/μl gamit ang SuperScript IV Vilo Master mix mula sa Thermo (Thermo, cat. no. 11756050).Ginawa ang quantitative RT-PCR gamit ang isang Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well transparent reaction plate (Thermo, cat. no. 4483319) at microamp optical adhesive (Thermo, cat. no. 4311971).Ang reaction mixture ay binubuo ng 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer at 3.5 µl H2O na pinaghalo bawat balon.Ang mga karaniwang qPCR cycle ay pinapatakbo at ang mga halaga ng CT ay sinusukat gamit ang isang Applied Biosystems Quantstudio 5 real-time na PCR instrument (384-well module; product # A28135).Ang mga primer ng Taqman ay binili mula sa Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss068795_m1) ), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) Na-normalize ang mga sample ng G sa lahat ng mga halaga ng CT ng lahat ng CT.
Ang paglabas ng media ng NT-ProBNP ay tinasa gamit ang NT-ProBNP kit (baboy) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) ayon sa protocol ng manufacturer.Sa madaling sabi, 250 µl ng bawat sample at pamantayan ay idinagdag nang doble sa bawat balon.Kaagad pagkatapos idagdag ang sample, magdagdag ng 50 µl ng Assay Reagent A sa bawat balon.Dahan-dahang iling ang plato at selyuhan ng sealant.Pagkatapos ang mga tablet ay incubated sa 37 ° C sa loob ng 1 oras.Pagkatapos ay i-aspirate ang solusyon at hugasan ang mga balon ng 4 na beses gamit ang 350 µl ng 1X wash solution, na inilublob ang wash solution sa loob ng 1-2 minuto bawat oras.Pagkatapos ay magdagdag ng 100 µl ng Assay Reagent B bawat balon at selyuhan ng plate sealant.Ang tableta ay malumanay na inalog at inilublob sa 37°C sa loob ng 30 minuto.Aspirate ang solusyon at hugasan ang mga balon ng 5 beses gamit ang 350 µl ng 1X wash solution.Magdagdag ng 90 µl ng substrate solution sa bawat balon at i-seal ang plato.I-incubate ang plato sa 37°C sa loob ng 10-20 minuto.Magdagdag ng 50 µl Stop Solution sa bawat balon.Ang plato ay agad na sinukat gamit ang isang Cytation (BioTek) plate reader na itinakda sa 450 nm.
Ang mga pagsusuri sa kapangyarihan ay isinagawa upang piliin ang mga laki ng pangkat na magbibigay ng >80% na kapangyarihan upang matukoy ang isang 10% ganap na pagbabago sa parameter na may 5% na Type I na rate ng error. Ang mga pagsusuri sa kapangyarihan ay isinagawa upang piliin ang mga laki ng pangkat na magbibigay ng >80% na kapangyarihan upang matukoy ang isang 10% ganap na pagbabago sa parameter na may 5% na Type I na rate ng error. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% раметра с 5% частотой ошибок типа I. Ginawa ang pagsusuri ng kapangyarihan upang pumili ng mga laki ng pangkat na magbibigay ng >80% na kapangyarihan upang makita ang 10% ganap na pagbabago ng parameter na may 5% na rate ng error sa Type I.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I功效以检测参数中10％绝对变化和5％I寎甎里。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I功效以检测参数中10％绝对变化和5％I寎甎里。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаругожленибно я параметров и 5% частоты ошибок типа I. Nagsagawa ng pagsusuri ng kapangyarihan upang pumili ng laki ng pangkat na magbibigay ng >80% na kapangyarihan upang matukoy ang 10% ganap na pagbabago ng parameter at 5% na rate ng error sa uri I.Ang mga seksyon ng tissue ay random na pinili bago ang eksperimento.Ang lahat ng mga pagsusuri ay bulag sa kondisyon at ang mga sample ay na-decode lamang pagkatapos na masuri ang lahat ng data.Ang GraphPad Prism software (San Diego, CA) ay ginamit upang maisagawa ang lahat ng pagsusuri sa istatistika. Para sa lahat ng istatistika, ang mga p-value ay itinuturing na makabuluhan sa mga halaga <0.05. Para sa lahat ng mga istatistika, ang mga p-value ay itinuturing na makabuluhan sa mga halaga <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Para sa lahat ng mga istatistika, ang mga p-value ay itinuturing na makabuluhan sa mga halaga <0.05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Para sa lahat ng mga istatistika, ang mga p-value ay itinuturing na makabuluhan sa mga halaga <0.05.Ang two-tailed Student's t-test ay isinagawa sa datos na may 2 paghahambing lamang.Ang one-way o two-way na ANOVA ay ginamit upang matukoy ang kahalagahan sa pagitan ng maraming grupo.Kapag nagsasagawa ng mga post hoc na pagsusulit, ang pagwawasto ni Tukey ay inilapat sa account para sa maraming paghahambing.Ang data ng RNAsec ay may mga espesyal na pagsasaalang-alang sa istatistika kapag kinakalkula ang FDR at p.adjust gaya ng inilarawan sa seksyong Mga Paraan.
Para sa karagdagang impormasyon sa disenyo ng pag-aaral, tingnan ang abstract ng Ulat sa Pananaliksik sa Kalikasan na naka-link sa artikulong ito.