Salamat sa pagbisita sa Nature.com. Limitado ang suporta sa CSS sa bersyon ng browser na iyong ginagamit. Para sa pinakamahusay na karanasan, inirerekomenda namin na gumamit ka ng updated na browser (o i-disable ang Compatibility Mode sa Internet Explorer). Samantala, upang matiyak ang patuloy na suporta, ire-render namin ang site nang walang mga style at JavaScript.
Kailangan ang isang maaasahang in vitro system na maaaring tumpak na kopyahin ang pisyolohikal na kapaligiran ng puso para sa drug testing. Ang limitadong availability ng mga sistema ng human heart tissue culture ay humantong sa mga hindi tumpak na interpretasyon ng mga epekto ng cardiac drug. Dito, bumuo kami ng isang cardiac tissue culture model (CTCM) na electromechanically stimulates heart slices at sumasailalim sa physiological stretch sa panahon ng systolic at diastolic phases ng cardiac cycle. Pagkatapos ng 12 araw na culture, bahagyang napabuti ng pamamaraang ito ang viability ng mga seksyon ng puso, ngunit hindi lubos na napreserba ang kanilang structural integrity. Samakatuwid, pagkatapos ng small molecule screening, natuklasan namin na ang pagdaragdag ng 100 nM triiodothyronine (T3) at 1 μM dexamethasone (Dex) sa aming medium ay nagpapanatili ng microstructure ng mga seksyon sa loob ng 12 araw. Kasabay ng T3/Dex treatment, pinanatili ng CTCM system ang mga transcriptional profile, viability, metabolic activity, at structural integrity sa parehong antas ng sariwang tissue ng puso sa loob ng 12 araw. Bilang karagdagan, ang labis na pag-unat ng cardiac tissue sa culture ay nagdudulot ng hypertrophic cardiac signaling, na nagbibigay ng ebidensya para sa kakayahan ng CTCM na gayahin ang mga hypertrophic na kondisyon na dulot ng cardiac stretch. Bilang konklusyon, maaaring imodelo ng CTCM ang pisyolohiya at patopisyolohiya ng puso sa pamamagitan ng kultura sa mahabang panahon, na nagbibigay-daan sa maaasahang drug screening.
Bago ang klinikal na pananaliksik, kailangan ang maaasahang mga in vitro system na maaaring tumpak na kopyahin ang pisyolohikal na kapaligiran ng puso ng tao. Dapat gayahin ng mga ganitong sistema ang nabagong mekanikal na pag-unat, tibok ng puso, at mga electrophysiological na katangian. Karaniwang ginagamit ang mga modelo ng hayop bilang isang screening platform para sa cardiac physiology na may limitadong pagiging maaasahan sa pagpapakita ng mga epekto ng mga gamot sa puso ng tao1,2. Sa huli, ang Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) ay isang modelo na lubos na sensitibo at tiyak para sa iba't ibang therapeutic at pharmacological na interbensyon, na tumpak na kinokopya ang pisyolohiya at pathophysiology ng puso ng tao3. Ang kawalan ng ganitong sistema ay naglilimita sa pagtuklas ng mga bagong paggamot para sa pagpalya ng puso4,5 at humantong sa cardiotoxicity ng gamot bilang isang pangunahing dahilan para sa paglabas sa merkado6.
Sa nakalipas na dekada, walong gamot na hindi pangkardiovascular ang inalis sa klinikal na paggamit dahil nagdudulot ang mga ito ng pagpapahaba ng QT interval na humahantong sa ventricular arrhythmias at biglaang pagkamatay7. Kaya naman, mayroong lumalaking pangangailangan para sa maaasahang mga estratehiya sa preclinical screening upang masuri ang cardiovascular efficacy at toxicity. Ang kamakailang paggamit ng human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPS-CM) sa drug screening at toxicity testing ay nagbibigay ng bahagyang solusyon sa problemang ito. Gayunpaman, ang immature na katangian ng mga hiPS-CM at ang kakulangan ng multicellular complexity ng cardiac tissue ay mga pangunahing limitasyon ng pamamaraang ito. Ipinakita ng mga kamakailang pag-aaral na ang limitasyong ito ay maaaring bahagyang malampasan sa pamamagitan ng paggamit ng maagang hiPS-CM upang bumuo ng mga cardiac tissue hydrogel ilang sandali matapos ang pagsisimula ng kusang pagkontrata at unti-unting pagtaas ng electrical stimulation sa paglipas ng panahon. Gayunpaman, ang mga hiPS-CM microtissue na ito ay kulang sa mature na electrophysiological at contractile properties ng adult myocardium. Bilang karagdagan, ang human cardiac tissue ay may mas kumplikadong istraktura, na binubuo ng isang heterogeneous na halo ng iba't ibang uri ng cell, kabilang ang mga endothelial cell, neuron, at stromal fibroblast, na magkakaugnay ng mga partikular na set ng extracellular matrix protein. Ang heterogeneity na ito ng mga populasyon na hindi cardiomyocyte11,12,13 sa nasa hustong gulang na puso ng mammalian ay isang pangunahing hadlang sa pagmomodelo ng tisyu ng puso gamit ang mga indibidwal na uri ng selula. Ang mga pangunahing limitasyong ito ay nagbibigay-diin sa kahalagahan ng pagbuo ng mga pamamaraan para sa pag-cultivate ng buo na tisyu ng myocardial sa ilalim ng mga kondisyong pisyolohikal at pathological.
Ang mga cultured thin (300 µm) na seksyon ng puso ng tao ay napatunayang isang promising model ng buo na myocardium ng tao. Ang pamamaraang ito ay nagbibigay ng access sa isang kumpletong 3D multicellular system na katulad ng tissue ng puso ng tao. Gayunpaman, hanggang 2019, ang paggamit ng mga cultured heart section ay limitado ng maikli (24 na oras) na survival ng culture. Ito ay dahil sa ilang mga salik kabilang ang kakulangan ng physical-mechanical stretch, ang air-liquid interface, at ang paggamit ng mga simpleng media na hindi sumusuporta sa mga pangangailangan ng cardiac tissue. Noong 2019, ipinakita ng ilang grupo ng pananaliksik na ang pagsasama ng mga mechanical factor sa mga cardiac tissue culture system ay maaaring magpahaba ng buhay ng culture, mapabuti ang cardiac expression, at gayahin ang cardiac pathology. Dalawang eleganteng pag-aaral 17 at 18 ang nagpapakita na ang uniaxial mechanical loading ay may positibong epekto sa cardiac phenotype habang nasa culture. Gayunpaman, ang mga pag-aaral na ito ay hindi gumamit ng dynamic three-dimensional physico-mechanical loading ng cardiac cycle, dahil ang mga heart section ay nilagyan ng isometric tensile forces 17 o linear auxotonic loading 18. Ang mga pamamaraang ito ng tissue stretching ay nagresulta sa pagsugpo ng maraming cardiac genes o sa labis na ekspresyon ng mga genes na nauugnay sa abnormal na mga tugon sa pag-unat. Kapansin-pansin, si Pitoulis et al. 19 ay bumuo ng isang dynamic heart slice culture bath para sa cardiac cycle reconstruction gamit ang force transducer feedback at tension drives. Bagama't ang sistemang ito ay nagbibigay-daan para sa mas tumpak na in vitro cardiac cycle modeling, ang pagiging kumplikado at mababang throughput ng pamamaraan ay naglilimita sa aplikasyon ng sistemang ito. Kamakailan ay bumuo ang aming laboratoryo ng isang pinasimpleng culture system gamit ang electrical stimulation at isang na-optimize na medium upang mapanatili ang viability ng mga seksyon ng tissue ng puso ng baboy at tao nang hanggang 6 na araw20,21.
Sa kasalukuyang manuskrito, inilalarawan namin ang isang cardiac tissue culture model (CTCM) gamit ang mga seksyon ng puso ng baboy na nagsasama ng mga humoral cues upang muling buuin ang three-dimensional cardiac physiology at pathophysiological distension sa panahon ng cardiac cycle. Maaaring mapataas ng CTCM na ito ang katumpakan ng pre-clinical drug prediction sa isang antas na hindi pa nakakamit noon sa pamamagitan ng pagbibigay ng isang cost-effective, mid-throughput cardiac system na ginagaya ang physiology/pathophysiology ng mammalian heart para sa pre-clinical drug testing.
Ang mga hemodynamic mechanical signal ay may mahalagang papel sa pagpapanatili ng tungkulin ng cardiomyocyte in vitro 22,23,24. Sa kasalukuyang manuskrito, nakabuo kami ng isang CTCM (Larawan 1a) na maaaring gayahin ang kapaligiran ng puso ng nasa hustong gulang sa pamamagitan ng pag-induce ng parehong electrical at mechanical stimulation sa mga physiological frequency (1.2 Hz, 72 beats kada minuto). Upang maiwasan ang labis na pag-unat ng tissue habang diastole, isang 3D printing device ang ginamit upang mapataas ang laki ng tissue ng 25% (Larawan 1b). Ang electrical pacing na dulot ng C-PACE system ay in-time na magsimula ng 100 ms bago ang systole gamit ang isang data acquisition system upang ganap na kopyahin ang cardiac cycle. Ang tissue culture system ay gumagamit ng isang programmable pneumatic actuator (LB Engineering, Germany) upang paikot na palawakin ang isang flexible silicone membrane upang maging sanhi ng paglawak ng mga hiwa ng puso sa itaas na silid. Ang sistema ay konektado sa isang panlabas na linya ng hangin sa pamamagitan ng isang pressure transducer, na naging posible upang tumpak na ayusin ang presyon (± 1 mmHg) at oras (± 1 ms) (Larawan 1c).
a Ikabit ang seksyon ng tisyu sa 7 mm na singsing ng suporta, na ipinapakita sa asul, sa loob ng silid ng kultura ng aparato. Ang silid ng kultura ay nakahiwalay mula sa silid ng hangin sa pamamagitan ng isang manipis na flexible na silicone membrane. Maglagay ng gasket sa pagitan ng bawat silid upang maiwasan ang pagtagas. Ang takip ng aparato ay naglalaman ng mga graphite electrode na nagbibigay ng electrical stimulation. b Eskematikong representasyon ng malaking aparato ng tisyu, gabay na singsing at singsing ng suporta. Ang mga seksyon ng tisyu (kayumanggi) ay inilalagay sa napakalaking aparato kung saan ang gabay na singsing ay nakalagay sa uka sa panlabas na gilid ng aparato. Gamit ang gabay, maingat na ilagay ang singsing ng suporta na pinahiran ng tissue acrylic adhesive sa ibabaw ng seksyon ng tisyu ng puso. c Graph na nagpapakita ng oras ng electrical stimulation bilang isang function ng presyon ng silid ng hangin na kinokontrol ng isang programmable pneumatic actuator (PPD). Isang aparato ng pagkuha ng datos ang ginamit upang i-synchronize ang electrical stimulation gamit ang mga pressure sensor. Kapag ang presyon sa silid ng kultura ay umabot sa itinakdang threshold, isang pulse signal ang ipinapadala sa C-PACE-EM upang mag-trigger ng electrical stimulation. d Larawan ng apat na CTCM na nakalagay sa isang istante ng incubator. Apat na aparato ang nakakonekta sa isang PPD sa pamamagitan ng isang pneumatic circuit, at ang mga pressure sensor ay ipinapasok sa hemostatic valve upang masubaybayan ang presyon sa pneumatic circuit. Ang bawat aparato ay naglalaman ng anim na seksyon ng tissue.
Gamit ang isang pneumatic actuator, nagawa naming kontrolin ang 4 na CTCM device, na ang bawat isa ay maaaring maglaman ng 6 na tissue section (Fig. 1d). Sa CTCM, ang air pressure sa air chamber ay kino-convert sa synchronous pressure sa fluid chamber at nagdudulot ng physiological expansion ng heart slice (Figure 2a at Supplementary Movie 1). Ang pagsusuri ng tissue stretch sa 80 mm Hg. Ipinakita ng Art. ang stretching ng tissue sections ng 25% (Fig. 2b). Ang percentage stretch na ito ay naipakita na tumutugma sa physiological sarcomere length na 2.2–2.3 µm para sa normal na cardiac section contractility17,19,25. Ang paggalaw ng tissue ay tinasa gamit ang mga custom camera setting (Karagdagang Figure 1). Ang amplitude at velocity ng paggalaw ng tissue (Fig. 2c, d) ay tumutugma sa stretch sa panahon ng cardiac cycle at oras sa panahon ng systole at diastole (Fig. 2b). Ang stretch at velocity ng cardiac tissue sa panahon ng contraction at relaxation ay nanatiling constant sa loob ng 12 araw sa culture (Fig. 2f). Upang masuri ang epekto ng electrical stimulation sa contractility habang isinasagawa ang culture, bumuo kami ng isang paraan para matukoy ang aktibong deformity gamit ang isang shading algorithm (Karagdagang Fig. 2a,b) at nagawa naming makilala ang pagkakaiba sa pagitan ng mga deformity na mayroon at walang electrical stimulation. Ang parehong bahagi ng puso (Fig. 2f). Sa movable region ng cut (R6-9), ang boltahe habang isinasagawa ang electrical stimulation ay 20% na mas mataas kaysa sa kawalan ng electrical stimulation, na nagpapahiwatig ng kontribusyon ng electrical stimulation sa contractile function.
Ang mga representatibong bakas ng presyon ng silid ng hangin, presyon ng silid ng likido, at mga sukat ng paggalaw ng tisyu ay nagpapatunay na ang presyon ng silid ay nagbabago sa presyon ng silid ng likido, na nagiging sanhi ng katumbas na paggalaw ng hiwa ng tisyu. b Mga representatibong bakas ng porsyento ng pag-unat (asul) ng mga seksyon ng tisyu na tumutugma sa porsyento ng pag-unat (kahel). c Ang nasukat na paggalaw ng hiwa ng puso ay naaayon sa nasukat na bilis ng paggalaw. (d) Mga representatibong trajectory ng cyclic motion (asul na linya) at bilis (kahel na tuldok-tuldok na linya) sa isang hiwa ng puso. e Pagkuwantipika ng oras ng pag-ikot (n = 19 na hiwa bawat grupo, mula sa iba't ibang baboy), oras ng pag-urong (n = 19 na hiwa bawat grupo, mula sa iba't ibang baboy), oras ng pagrerelaks (n = 19 na hiwa bawat grupo, mula sa iba't ibang baboy), paggalaw ng tisyu (n = 25 (). hiwa)/grupo mula sa iba't ibang baboy), peak systolic velocity (n = 24(D0), 25(D12) na hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy) at peak relaxation rate (n=24(D0), 25(D12) na hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy). Ang Two-tailed Student's t-test ay hindi nagpakita ng makabuluhang pagkakaiba sa anumang parameter. f Kinatawan ng pagsusuri ng strain traces ng mga seksyon ng tissue na may (pula) at walang (asul) electrical stimulation, sampung rehiyonal na bahagi ng mga seksyon ng tissue mula sa parehong seksyon. Ipinapakita ng mga panel sa ibaba ang pagkuwantipika ng porsyento ng pagkakaiba sa strain sa mga seksyon ng tissue na mayroon at walang electrical stimulation sa sampung lugar mula sa iba't ibang seksyon. (n = 8 hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy, isinagawa ang Two-tailed Student t-test; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy, isinagawa ang Two-tailed Student t-test; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 seksyon/grupo mula sa iba't ibang baboy, two-tailed Student's t-test; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 seksyon/grupo, mula sa iba't ibang baboy, two-tailed Student's t-test; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Ang mga error bar ay kumakatawan sa mean ± standard deviation.
Sa aming nakaraang static biomimetic heart slice culture system [20, 21], pinanatili namin ang viability, function, at structural integrity ng mga heart slices sa loob ng 6 na araw sa pamamagitan ng paglalapat ng electrical stimulation at pag-optimize sa komposisyon ng medium. Gayunpaman, pagkatapos ng 10 araw, ang mga bilang na ito ay bumaba nang husto. Tatalakayin namin ang mga seksyon na kinultura sa aming nakaraang static biomimetic culture system 20, 21 control conditions (Ctrl) at gagamitin namin ang aming dating na-optimize na medium bilang mga kondisyon ng MC at kultura sa ilalim ng sabay-sabay na mechanical at electrical stimulation (CTCM). na tinatawag na . Una, natukoy namin na ang mechanical stimulation nang walang electrical stimulation ay hindi sapat upang mapanatili ang tissue viability sa loob ng 6 na araw (Supplementary Fig. 3a,b). Kapansin-pansin, sa pagpapakilala ng physio-mechanical at electrical stimulation gamit ang STCM, ang viability ng 12-day heart sections ay nanatiling pareho tulad ng sa mga sariwang heart sections sa ilalim ng mga kondisyon ng MS, ngunit hindi sa ilalim ng mga kondisyon ng Ctrl, tulad ng ipinakita ng MTT analysis (Fig. 1). 3a). Ipinahihiwatig nito na ang mechanical stimulation at simulation ng cardiac cycle ay maaaring mapanatili ang tissue sections na viable nang doble ang haba kaysa sa naiulat sa aming nakaraang static culture system. Gayunpaman, ang pagtatasa ng integridad ng istruktura ng mga seksyon ng tisyu sa pamamagitan ng immunolabeling ng cardiac troponin T at connexin 43 ay nagpakita na ang ekspresyon ng connexin 43 ay mas mataas nang malaki sa mga tisyu ng MC sa ika-12 araw kaysa sa mga kontrol sa parehong araw. Gayunpaman, ang pare-parehong ekspresyon ng connexin 43 at pagbuo ng Z-disc ay hindi ganap na napanatili (Fig. 3b). Gumagamit kami ng isang artificial intelligence (AI) framework upang masukat ang integridad ng istruktura ng tisyu26, isang image-based deep learning pipeline batay sa troponin-T at connexin staining43 upang awtomatikong masukat ang integridad ng istruktura at fluorescence ng mga hiwa ng puso sa mga tuntunin ng lakas ng lokalisasyon. Ang pamamaraang ito ay gumagamit ng isang Convolutional Neural Network (CNN) at isang deep learning framework upang mapagkakatiwalaang masukat ang integridad ng istruktura ng tisyu ng puso sa isang awtomatiko at walang kinikilingang paraan, tulad ng inilarawan sa sanggunian. 26. Ang tisyu ng MC ay nagpakita ng pinahusay na pagkakatulad ng istruktura sa araw 0 kumpara sa mga static control section. Bilang karagdagan, ang Masson's trichrome staining ay nagpakita ng isang mas mababang porsyento ng fibrosis sa ilalim ng mga kondisyon ng MS kumpara sa mga kondisyon ng kontrol sa ika-12 araw ng kultura (Fig. 3c). Bagama't pinataas ng CTCM ang posibilidad na mabuhay ang mga seksyon ng tisyu ng puso sa ika-12 araw sa antas na katulad ng sa sariwang tisyu ng puso, hindi nito lubos na napabuti ang integridad ng istruktura ng mga seksyon ng puso.
Ipinapakita ng isang Bar graph ang kwantipikasyon ng MTT viability ng mga sariwang hiwa ng puso (D0) o kultura ng mga hiwa ng puso sa loob ng 12 araw alinman sa static culture (D12 Ctrl) o sa CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) na hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy, isinagawa ang one way ANOVA test; ####p < 0.0001 kumpara sa D0 at **p < 0.01 kumpara sa D12 Ctrl). Ipinapakita ng isang Bar graph ang kwantipikasyon ng MTT viability ng mga sariwang hiwa ng puso (D0) o kultura ng mga hiwa ng puso sa loob ng 12 araw alinman sa static culture (D12 Ctrl) o sa CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) na hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy, isinagawa ang one way ANOVA test; ####p < 0.0001 kumpara sa D0 at **p < 0.01 kumpara sa D12 Ctrl).Ipinapakita ng histogram ang kwantipikasyon ng posibilidad ng pagiging posible ng mga bagong seksyon ng puso gamit ang MTT (D0) o kultura ng mga seksyon ng puso sa loob ng 12 araw sa alinman sa static culture (D12 control) o CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 control). ) ), 12 (D12 MC) na seksyon/grupo mula sa iba't ibang baboy, isang one-way ANOVA test ang isinagawa;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 kumpara sa D0 at **p < 0.01 kumpara sa D12 Ctrl). isang 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单后行单后行单后从相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01). isang 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与与用 Ctrl)histogram na nagpapakita ng kwantipikasyon ng kakayahang mabuhay ng MTT sa mga sariwang seksyon ng puso (D0) o mga seksyon ng puso na kinultura sa loob ng 12 araw sa static culture (kontrol ng D12) o CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrol ng D12)), 12 (D12 MC) na seksyon/grupo mula sa iba't ibang baboy, one-way ANOVA test;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 kumpara sa D0, **p < 0.01 kumpara sa D12 Ctrl).b Troponin-T (berde), connexin 43 (pula) at DAPI (asul) sa mga bagong hiwalay na seksyon ng puso (D0) o mga seksyon ng puso na kinultura sa ilalim ng mga static na kondisyon (Ctrl) o mga kondisyon ng CTCM (MC) sa loob ng 12 araw) ng mga representatibong imahe ng immunofluorescence (blank scale = 100 µm). Pagsukat ng integridad ng istruktura ng tisyu ng puso gamit ang artipisyal na katalinuhan (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) na hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy, isinagawa ang one-way ANOVA test; ####p < 0.0001 kumpara sa D0 at ****p < 0.0001 kumpara sa D12 Ctrl). Pagsukat ng integridad ng istruktura ng tisyu ng puso gamit ang artipisyal na katalinuhan (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) na hiwa/grupo bawat isa mula sa iba't ibang baboy, isinagawa ang one-way ANOVA test; ####p < 0.0001 kumpara sa D0 at ****p < 0.0001 kumpara sa D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной тппни искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl) mula sa разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; Pagkuwantipika ng integridad ng istruktura ng tisyu ng puso sa pamamagitan ng artificial intelligence (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) na mga seksyon/grupo mula sa iba't ibang baboy, isinagawa ang one-way ANOVA test; ####p < 0.0001 vs. na may D0 at ****p < 0.0001 kumpara sa D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) na hiwa/grupo bawat isa sa iba't ibang baboy, one-way ANOVA test;####p01 相0##p01 ， ####p01 相0##p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) slice/grupo bawat isa sa iba't ibang baboy, one-way ANOVA test;##00 < 0.****p0 ，p##p0 ， 0##p0 ， ##00 < 0.****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 12 (D0), 7 (D0), 12 (D12) Ctrl срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; Artipisyal na katalinuhan upang masukat ang integridad ng istruktura ng tisyu ng puso (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) na seksyon/grupo ang bawat isa sa iba't ibang baboy, one-way ANOVA test; ####p<0.0001 vs .D0 Para sa paghahambing ****p < 0.0001 kumpara sa D12 Ctrl). c Mga representatibong imahe (kaliwa) at kwantipikasyon (kanan) para sa mga hiwa ng puso na kinulayan ng Masson's trichrome stain (Scale bare = 500 µm) (n = 10 hiwa/grupo bawat isa mula sa iba't ibang baboy, isinagawa ang one-way ANOVA test; ####p < 0.0001 kumpara sa D0 at ***p < 0.001 kumpara sa D12 Ctrl). c Mga representatibong imahe (kaliwa) at kwantipikasyon (kanan) para sa mga hiwa ng puso na kinulayan ng Masson's trichrome stain (Scale bare = 500 µm) (n = 10 hiwa/grupo bawat isa mula sa iba't ibang baboy, isinagawa ang one-way ANOVA test; #### p < 0.0001 kumpara sa D0 at ***p < 0.001 kumpara sa D12 Ctrl). c. без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Mga representatibong larawan (kaliwa) at kwantipikasyon (kanan) ng mga seksyon ng puso na kinulayan gamit ang Masson's trichrome stain (uncoated scale = 500 µm) (n = 10 seksyon/grupo mula sa iba't ibang baboy, isinagawa ang one-way ANOVA test; #### p < 0 .0001 kumpara sa D0 at ***p < 0.001 kumpara sa D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度（裸尺度= 5（裸尺度= 5个切片/组，每组来自不同的猪，进桌单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.0012 C 。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单向 0##0.与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c. = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного донарного донаного дисперси <###; 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Mga representatibong larawan (kaliwa) at kwantipikasyon (kanan) ng mga seksyon ng puso na kinulayan ng Masson's trichrome stain (blangko = 500 µm) (n = 10 seksyon/grupo, bawat isa ay mula sa magkaibang baboy, sinubukan sa pamamagitan ng one-way analysis of variance ;### # p < 0.0001 kumpara sa D0, ***p < 0.001 kumpara sa D12 Ctrl).Ang mga error bar ay kumakatawan sa mean ± standard deviation.
Nagpalagay kami na sa pamamagitan ng pagdaragdag ng maliliit na molekula sa culture medium, maaaring mapabuti ang integridad ng cardiomyocyte at mabawasan ang pag-unlad ng fibrosis sa panahon ng CTCM culture. Samakatuwid, sinuri namin ang maliliit na molekula gamit ang aming static control cultures20,21 dahil sa maliit na bilang ng mga confounding factor. Ang Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), at SB431542 (SB) ang napili para sa screening na ito. Ang maliliit na molekulang ito ay dati nang ginamit sa mga hiPSC-CM culture upang ma-induce ang maturation ng mga cardiomyocyte sa pamamagitan ng pagpapataas ng haba ng sarcomere, T-tubules, at conduction velocity. Bukod pa rito, ang parehong Dex (isang glucocorticoid) at SB ay kilalang nakakapigil sa pamamaga29,30. Samakatuwid, sinubukan namin kung ang pagsasama ng isa o isang kombinasyon ng maliliit na molekulang ito ay magpapabuti sa integridad ng istruktura ng mga seksyon ng puso. Para sa unang screening, ang dosis ng bawat compound ay pinili batay sa mga konsentrasyon na karaniwang ginagamit sa mga modelo ng cell culture (1 μM Dex27, 100 nM T327, at 2.5 μM SB31). Pagkatapos ng 12 araw na kultura, ang kombinasyon ng T3 at Dex ay nagresulta sa pinakamainam na integridad ng istruktura ng cardiomyocyte at kaunting fibrous remodeling (Mga Karagdagang Larawan 4 at 5). Bukod pa rito, ang paggamit ng doble o dobleng konsentrasyon ng T3 at Dex na ito ay nagdulot ng masasamang epekto kumpara sa normal na konsentrasyon (Karagdagang Larawan 6a,b).
Pagkatapos ng unang screening, nagsagawa kami ng head-to-head na paghahambing ng 4 na kondisyon ng culture (Figure 4a): Ctrl: mga seksyon ng puso na kinultura sa aming naunang inilarawan na static culture gamit ang aming na-optimize na medium; 20.21 TD: Idinagdag nina T3 at Ctrl ang Dex noong Miyerkules; MC: mga seksyon ng puso na kinultura sa CTCM gamit ang aming naunang na-optimize na medium; at MT: CTCM na may T3 at Dex na idinagdag sa medium. Pagkatapos ng 12 araw ng cultivation, ang viability ng mga tisyu ng MS at MT ay nanatiling pareho tulad ng sa mga sariwang tisyu na tinasa ng MTT assay (Fig. 4b). Kapansin-pansin, ang pagdaragdag ng T3 at Dex sa mga transwell culture (TD) ay hindi nagresulta sa isang makabuluhang pagpapabuti sa viability kumpara sa mga kondisyon ng Ctrl, na nagpapahiwatig ng isang mahalagang papel ng mechanical stimulation sa pagpapanatili ng viability ng mga seksyon ng puso.
isang eksperimental na disenyo ng dayagram na naglalarawan ng apat na kondisyon ng kultura na ginamit upang suriin ang mga epekto ng mekanikal na pagpapasigla at suplemento ng T3/Dex sa medium sa loob ng 12 araw. Ipinapakita ng bar graph ang kwantipikasyon ng viability 12 araw pagkatapos ng culture sa lahat ng 4 na kondisyon ng culture (Ctrl, TD, MC, at MT) kumpara sa mga sariwang hiwa ng puso (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD at D12 MT), 12 (D12 MC) na hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy, isinagawa ang one-way ANOVA test; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 kumpara sa D0 at **p < 0.01 kumpara sa D12 Ctrl). Ipinapakita ng bar graph ang kwantipikasyon ng viability 12 araw pagkatapos ng culture sa lahat ng 4 na kondisyon ng culture (Ctrl, TD, MC, at MT) kumpara sa mga sariwang hiwa ng puso (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD at D12 MT), 12 (D12 MC) na hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy, isinagawa ang one-way ANOVA test; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 kumpara sa D0 at **p < 0.01 kumpara sa D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во вселякових 4 (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MT), 12)/гтузоп разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Ipinapakita ng bar graph ang kwantipikasyon ng viability sa 12 araw pagkatapos ng culture sa lahat ng 4 na kondisyon ng culture (control, TD, MC, at MT) kumpara sa mga sariwang seksyon ng puso (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, at D12 MT), 12 (D12 MC) na seksyon/grupo mula sa iba't ibang baboy, one-way ANOVA test; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 vs. D0 at **p < 0.01 kumpara sa D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (Dl5)、D0和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 ，p<0.001 ，p**0.001 与与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими серди серди (серди серди) (серди) 15. <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram na nagpapakita ng lahat ng 4 na kondisyon ng kultura (kontrol, TD, MC at MT) kumpara sa mga sariwang seksyon ng puso (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD at D12 MT), mula sa iba't ibang seksyon/grupo ng 12 baboy (D12 MC), one-way ANOVA test; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. control D12). Ipinapakita ng c Bar graph ang dami ng glucose flux 12 araw pagkatapos ng culture sa lahat ng 4 na kondisyon ng culture (Ctrl, TD, MC, at MT) kumpara sa mga sariwang hiwa ng puso (D0) (n = 6 na hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy, isinagawa ang one-way ANOVA test; ###p < 0.001, kumpara sa D0 at ***p < 0.001 kumpara sa D12 Ctrl). Ipinapakita ng c Bar graph ang dami ng glucose flux 12 araw pagkatapos ng culture sa lahat ng 4 na kondisyon ng culture (Ctrl, TD, MC, at MT) kumpara sa mga sariwang hiwa ng puso (D0) (n = 6 na hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy, isinagawa ang one-way ANOVA test; ###p < 0.001, kumpara sa D0 at ***p < 0.001 kumpara sa D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всенку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всехолотих 4 луся (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, роднин стоястя ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 at ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). Ipinapakita ng c Histogram ang kwantipikasyon ng glucose flux 12 araw pagkatapos ng culture sa ilalim ng lahat ng 4 na kondisyon ng culture (control, TD, MC at MT) kumpara sa mga sariwang seksyon ng puso (D0) (n = 6 na seksyon/grupo mula sa iba't ibang baboy, isinagawa ang one-way ANOVA test; ###p < 0.001 kumpara sa D0 at ***p < 0.001 kumpara sa D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，吹天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001 ，盎所0 < 0.001 ，与D1与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单同行< 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех для всех культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разинних Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram na nagpapakita ng dami ng glucose flux sa 12 araw pagkatapos ng culture para sa lahat ng 4 na kondisyon ng culture (kontrol, TD, MC, at MT) kumpara sa mga bagong seksyon ng puso (D0) (n = 6 na seksyon/grupo, mula sa iba't ibang baboy, unilateral. Kung saan isinagawa ang mga pagsusuri sa ANOVA, ###p < 0.001 kumpara sa D0, ***p < 0.001 kumpara sa D12 (kontrol).d Mga plot ng pagsusuri ng strain ng mga sariwa (asul), ika-12 araw na MC (berde), at ika-12 araw na MT (pula) na tisyu sa sampung rehiyonal na punto ng seksyon ng tisyu (n = 4 na hiwa/grupo, one-way ANOVA test; walang makabuluhang pagkakaiba sa pagitan ng mga grupo). e Plot ng bulkan na nagpapakita ng magkakaibang pagpapahayag ng mga gene sa mga sariwang seksyon ng puso (D0) kumpara sa mga seksyon ng puso na kinultura sa ilalim ng mga static na kondisyon (Ctrl) o sa ilalim ng mga kondisyon ng MT (MT) sa loob ng 10-12 araw. f Heatmap ng mga sarcomere gene para sa mga seksyon ng puso na kinultura sa ilalim ng bawat isa sa mga kondisyon ng kultura. Ang mga error bar ay kumakatawan sa mean ± standard deviation.
Ang metabolic dependence sa paglipat mula sa fatty acid oxidation patungo sa glycolysis ay isang tanda ng cardiomyocyte dedifferentiation. Ang mga immature cardiomyocyte ay pangunahing gumagamit ng glucose para sa produksyon ng ATP at may hypoplastic mitochondria na may kaunting cristae5,32. Ipinakita ng mga pagsusuri sa paggamit ng glucose na sa ilalim ng mga kondisyon ng MC at MT, ang paggamit ng glucose ay katulad ng sa mga tissue sa day 0 (Figure 4c). Gayunpaman, ang mga sample ng Ctrl ay nagpakita ng isang makabuluhang pagtaas sa paggamit ng glucose kumpara sa sariwang tissue. Ipinapahiwatig nito na ang kumbinasyon ng CTCM at T3/Dex ay nagpapahusay sa tissue viability at pinapanatili ang metabolic phenotype ng 12-day cultured heart sections. Bilang karagdagan, ipinakita ng strain analysis na ang mga antas ng strain ay nanatiling pareho tulad ng sa sariwang tissue ng puso sa loob ng 12 araw sa ilalim ng mga kondisyon ng MT at MS (Fig. 4d).
Upang masuri ang pangkalahatang epekto ng CTCM at T3/Dex sa pandaigdigang transkripsyonal na tanawin ng tisyu ng cardiac slice, isinagawa namin ang RNAseq sa mga hiwa ng cardiac mula sa lahat ng apat na magkakaibang kondisyon ng kultura (Karagdagang Datos 1). Kapansin-pansin, ang mga seksyon ng MT ay nagpakita ng mataas na pagkakatulad sa transkripsyon sa sariwang tisyu ng puso, na may 16 lamang na magkakaibang ipinahayag mula sa 13,642 na gene. Gayunpaman, tulad ng ipinakita namin kanina, ang mga hiwa ng Ctrl ay nagpakita ng 1229 na magkakaibang ipinahayag na gene pagkatapos ng 10-12 araw sa kultura (Larawan 4e). Ang mga datos na ito ay kinumpirma ng qRT-PCR ng mga gene ng puso at fibroblast (Karagdagang Larawan 7a-c). Kapansin-pansin, ang mga seksyon ng Ctrl ay nagpakita ng downregulation ng mga gene ng cardiac at cell cycle at pag-activate ng mga programa ng nagpapaalab na gene. Ipinapahiwatig ng mga datos na ito na ang dedifferentiation, na karaniwang nangyayari pagkatapos ng pangmatagalang kultura, ay ganap na nababawasan sa ilalim ng mga kondisyon ng MT (Karagdagang Larawan 8a,b). Ipinakita ng maingat na pag-aaral ng mga sarcomere gene na sa ilalim lamang ng mga kondisyon ng MT napapanatili ang mga gene na nagko-code sa sarcomere (Fig. 4f) at ion channel (Supplementary Fig. 9), na pinoprotektahan ang mga ito mula sa pagsugpo sa ilalim ng mga kondisyon ng Ctrl, TD, at MC. Ipinapakita ng mga datos na ito na sa pamamagitan ng kombinasyon ng mechanical at humoral stimulation (T3/Dex), ang heart slice transcriptome ay maaaring manatiling katulad ng mga sariwang heart slice pagkatapos ng 12 araw sa kultura.
Ang mga natuklasang transkripsyon na ito ay sinusuportahan ng katotohanan na ang integridad ng istruktura ng mga cardiomyocyte sa mga seksyon ng puso ay pinakamahusay na napapanatili sa ilalim ng mga kondisyon ng MT sa loob ng 12 araw, tulad ng ipinapakita ng buo at naisalokal na connexin 43 (Larawan 5a). Bilang karagdagan, ang fibrosis sa mga seksyon ng puso sa ilalim ng mga kondisyon ng MT ay makabuluhang nabawasan kumpara sa Ctrl at katulad ng sa mga sariwang seksyon ng puso (Larawan 5b). Ipinapakita ng mga datos na ito na ang kumbinasyon ng mekanikal na pagpapasigla at paggamot ng T3/Dex ay epektibong nagpapanatili ng istruktura ng puso sa mga seksyon ng puso na nasa kultura.
Mga representatibong larawan ng immunofluorescence ng troponin-T (berde), connexin 43 (pula), at DAPI (asul) sa mga bagong hiwalay na seksyon ng puso (D0) o kinultura sa loob ng 12 araw sa lahat ng apat na kondisyon ng kultura ng seksyon ng puso (scale bar = 100 µm). Pagkuwantipika ng integridad ng istruktura ng tisyu ng puso gamit ang artipisyal na katalinuhan (n = 7 (D0 at D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC at D12 MT) na hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy, isinagawa ang one-way ANOVA test; ####p < 0.0001 kumpara sa D0 at *p < 0.05, o ****p < 0.0001 kumpara sa D12 Ctrl). Pagkuwantipika ng integridad ng istruktura ng tisyu ng puso gamit ang artipisyal na katalinuhan (n = 7 (D0 at D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC at D12 MT) na hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy, isinagawa ang one-way ANOVA test; #### p < 0.0001 kumpara sa D0 at *p < 0.05, o ****p < 0.0001 kumpara sa D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и TD12), D12 MC D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравнению с D0 ,**** и0 ли с D0 ,**** и0 и по < 0,**** *p < 0 сравнению с D12 Ctrl). Pagkuwantipika ng integridad ng istruktura ng tisyu ng puso gamit ang artificial intelligence (n = 7 (D0 at D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC at D12 MT) na seksyon/grupo mula sa iba't ibang baboy, isinagawa ang one-way ANOVA test; #### p < 0.0001 kumpara sa D0 at *p < 0.05 o ****p < 0.0001 kumpara sa D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 ，書我p < 0.05 ，测试与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 组） d1智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相月0 ， 戸 相 0.05 相比 ， 或l 0.相比）.Pagkuwantipika ng integridad ng istruktura ng tisyu ng puso gamit ang artificial intelligence sa iba't ibang baboy (n = 7 (D0 at D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC at D12 MT) seksyon/grupo) gamit ang one-way ANOVA test;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 o ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 kumpara sa D0 at *p < 0.05 o ****p < 0.0001 kumpara sa D12 Ctrl). b Mga representatibong imahe at kwantipikasyon para sa mga hiwa ng puso na kinulayan gamit ang Masson's trichrome stain (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, at D12 MC), 9 (D12 MT) na hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy, isinagawa ang one-way ANOVA test; ####p < 0.0001 kumpara sa D0 at ***p < 0.001, o ****p < 0.0001 kumpara sa D12 Ctrl). b Mga representatibong imahe at kwantipikasyon para sa mga hiwa ng puso na kinulayan gamit ang Masson's trichrome stain (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, at D12 MC), 9 (D12 MT) na hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy, isinagawa ang one-way ANOVA test; ####p < 0.0001 kumpara sa D0 at ***p < 0.001, o ****p < 0.0001 kumpara sa D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона ( мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний терносторонний ##0, ##0сторонний те сравнению с D0 at ***p < 0,001 o ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Mga representatibong imahe at kwantipikasyon ng mga seksyon ng puso na kinulayan gamit ang Masson's trichrome stain (scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD at D12 MC), 9 (D12 MT) na seksyon/grupo mula sa iba't ibang baboy, isinagawa ang one-way ANOVA; ####p < 0.0001 vs. D0 at ***p < 0.001 o ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）！1D = 2、2）！1D = 10） TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） = 500 µm） ） ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比，我0**p <0. 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная = лим50) (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA ####p < 0,0001 по , ***##p < 0,0001 по, ***##p < 0,0001 по, ***##p < 0,0001 по, ***##p < 0,0001 по, *** срав; ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Mga representatibong imahe at kwantipikasyon ng mga seksyon ng puso na kinulayan gamit ang Masson's trichrome (scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD at D12 MC), 9 (D12 MT) na mga seksyon mula sa iba't ibang baboy/grupo, isang pamamaraan ng ANOVA; ####p < 0.0001 kumpara sa D0, ***p < 0.001 o ****p < 0.0001 kumpara sa D12 Ctrl).Ang mga error bar ay kumakatawan sa mean ± standard deviation.
Panghuli, ang kakayahan ng CTCM na gayahin ang cardiac hypertrophy ay tinasa sa pamamagitan ng pagtaas ng cardiac tissue stretch. Sa CTCM, ang peak air chamber pressure ay tumaas mula 80 mmHg hanggang 80 mmHg. Art. (normal stretch) hanggang 140 mmHg Art. (Fig. 6a). Ito ay katumbas ng 32% na pagtaas sa stretch (Fig. 6b), na dating ipinakita bilang katumbas na porsyento ng stretch na kinakailangan para sa mga seksyon ng puso upang makamit ang haba ng sarcomere na katulad ng nakikita sa hypertrophy. Ang stretch at bilis ng cardiac tissue sa panahon ng contraction at relaxation ay nanatiling pare-pareho sa loob ng anim na araw ng culture (Fig. 6c). Ang cardiac tissue mula sa mga kondisyon ng MT ay isinailalim sa normal stretch (MT (Normal)) o overstretch na mga kondisyon (MT (OS)) sa loob ng anim na araw. Pagkatapos ng apat na araw sa culture, ang hypertrophic biomarker na NT-ProBNP ay tumaas nang malaki sa medium sa ilalim ng mga kondisyon ng MT (OS) kumpara sa mga kondisyon ng MT (normal) (Fig. 7a). Bilang karagdagan, pagkatapos ng anim na araw ng culture, ang laki ng cell sa MT (OS) (Fig. 7b) ay tumaas nang malaki kumpara sa mga seksyon ng MT heart (normal). Bukod pa rito, ang NFATC4 nuclear translocation ay tumaas nang malaki sa mga tisyung labis na naunat (Fig. 7c). Ipinapakita ng mga resultang ito ang progresibong pag-unlad ng pathological remodeling pagkatapos ng hyperdistension at sumusuporta sa konsepto na ang CTCM device ay maaaring gamitin bilang isang plataporma upang pag-aralan ang stretch-induced cardiac hypertrophy signaling.
Ang mga representatibong bakas ng presyon ng silid ng hangin, presyon ng silid ng likido, at mga sukat ng paggalaw ng tisyu ay nagpapatunay na ang presyon ng silid ay nagbabago sa presyon ng silid ng likido, na nagdudulot ng katumbas na paggalaw ng hiwa ng tisyu. b Mga representatibong kurba ng porsyento ng pag-unat at rate ng pag-unat para sa mga normal na nakaunat (kahel) at labis na nakaunat (asul) na mga seksyon ng tisyu. c Bar graph na nagpapakita ng oras ng pag-ikot (n = 19 na hiwa bawat grupo, mula sa iba't ibang baboy), oras ng pag-urong (n = 18-19 na hiwa bawat grupo, mula sa iba't ibang baboy), oras ng pagrerelaks (n = 19 na hiwa bawat grupo, mula sa iba't ibang baboy) ), amplitude ng paggalaw ng tisyu (n = 14 na hiwa/grupo, mula sa iba't ibang baboy), peak systolic velocity (n = 14 na hiwa/grupo, mula sa iba't ibang baboy) at peak relaxation rate (n = 14 (D0), 15 (D6) ) mga seksyon/grupo) mula sa iba't ibang baboy), ang two-tailed Student's t-test ay hindi nagpakita ng makabuluhang pagkakaiba sa anumang parameter, na nagpapahiwatig na ang mga parameter na ito ay nanatiling pare-pareho sa loob ng 6 na araw ng kultura na may overvoltage. Ang mga error bar ay kumakatawan sa mean ± standard deviation.
Isang bar graph na nagkukwenta ng konsentrasyon ng NT-ProBNP sa culture media mula sa mga hiwa ng puso na kinultura sa ilalim ng mga kondisyon ng MT normal stretch (Norm) o overstretching (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, at D4 MTOS) na hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy, isinagawa ang Two-way ANOVA; **p < 0.01 kumpara sa normal stretch). Isang bar graph na nagkukwenta ng konsentrasyon ng NT-ProBNP sa culture media mula sa mga hiwa ng puso na kinultura sa ilalim ng mga kondisyon ng MT normal stretch (Norm) o overstretching (OS) (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, at D4 MTOS) na hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy, Isinagawa ang Two-way ANOVA; **p < 0.01 kumpara sa normal stretch).Sa kwantitatibong histogram ng konsentrasyon ng NT-ProBNP sa culture medium mula sa mga hiwa ng puso na kinultura sa ilalim ng mga kondisyon ng normal na MT stretch (norm) o overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, at D4).MTOS) na mga hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy, isinasagawa ang two-factor analysis of variance;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 kumpara sa normal na pag-unat). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的曾度4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；p中方差分析；中不与与与0.01）. isang Quantification ng konsentrasyon ng NT-ProBNP sa mga hiwa ng puso na na-culture sa ilalim ng MT normal stretch (Norm) o overstretch (OS) na mga kondisyon (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) mula sa iba't ibang 猪的切片/绑，可以喌双可合**kumpara sa normal na pag-uunat, p <0.01).histogram Pagkuwantipika ng mga konsentrasyon ng NT-ProBNP sa mga hiwa ng puso na kinultura sa ilalim ng mga kondisyon ng normal na MT stretch (norm) o overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) at D4 MTOS) na mga hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy, two-way analysis of variance;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 kumpara sa normal na pag-unat). b Mga representatibong larawan para sa mga hiwa ng puso na kinulayan ng troponin-T at WGA (kaliwa) at pagkuwenta ng laki ng selula (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) na selula/grupo mula sa 10 magkakaibang hiwa mula sa magkakaibang baboy, Isinagawa ang Two-tailed Student t-test; ****p < 0.0001 kumpara sa normal na kahabaan). b Mga representatibong larawan para sa mga hiwa ng puso na kinulayan ng troponin-T at WGA (kaliwa) at pagkuwenta ng laki ng selula (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) na selula/grupo mula sa 10 magkakaibang hiwa mula sa magkakaibang baboy, Isinagawa ang Two-tailed Student t-test; ****p < 0.0001 kumpara sa normal na kahabaan). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного опеникрадрад (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится х tерюстой ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Mga representatibong larawan ng mga seksyon ng puso na kinulayan ng troponin-T at AZP (kaliwa) at pagkuwenta ng laki ng selula (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) na selula/grupo mula sa 10 magkakaibang seksyon mula sa magkakaibang baboy, isinagawa ang two-tailed Student's t-test; ****p < 0.0001 kumpara sa normal na strain). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性（3n6 MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比，****p < 0.0001）。 b Mga representatibong larawan ng mga hiwa ng puso na kinulayan ng calcarein-T at WGA (kaliwa) at laki ng selula (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 mula sa 10 iba't ibang hiwa (D6 MTNorm)) Mga Selyula/组，两方法有尾学生t test；kumpara sa normal na pag-unat，****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная озменка оцленка 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) at 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий С;юд0н сравнению с нормальным растяжением). b Mga representatibong larawan ng mga seksyon ng puso na kinulayan ng troponin-T at AZP (kaliwa) at pagbibilang ng laki ng selula (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) mula sa 10 magkakaibang seksyon mula sa magkakaibang baboy) Mga selula/grupo, two-tailed criterion Student's t; ****p < 0.0001 kumpara sa normal na pilay). c Mga representatibong larawan para sa araw 0 at araw 6 na hiwa ng puso ng MTOS na may immunolabel para sa troponin-T at NFATC4 at pagbibilang ng translocation ng NFATC4 sa nuclei ng mga CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) na hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy, isinagawa ang Two-tailed Student t-test; *p < 0.05). c Mga representatibong larawan para sa araw 0 at araw 6 na hiwa ng puso ng MTOS na nilagyan ng immunolabel para sa troponin-T at NFATC4 at pagkuwantipika ng translokasyon ng NFATC4 sa nuclei ng mga CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) na hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy, isinagawa ang Two-tailed Student t-test; *p < 0.05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, и колицеч транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , вылнядяетстрикрой Стьюдента; *p < 0,05). c Mga representatibong larawan para sa mga seksyon ng puso sa ika-0 at ika-6 na araw na MTOS, na may immunolabel para sa troponin-T at NFATC4, at pagbibilang ng translocation ng NFATC4 sa nucleus ng mga cavernous cell (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) na hiwa/grupo mula sa iba't ibang baboy) na isinagawa gamit ang two-tailed Student's t-test; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)片进行双尾学生t 检验；*p < 0.05). c Kinatawan ng mga larawan ng calcanin-T at NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS heart slices, at NFATC4 mula sa iba't ibang NFATC4 易位至CM cell nucleus的quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 刻礼)时间双尾学生et 电影；*p < 0.05). c. транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Синта, *0). c Mga representatibong larawan ng mga hiwa ng puso ng MTOS sa araw 0 at 6 para sa troponin-T at NFATC4 immunolabeling at pagbibilang ng translocation ng NFATC4 sa nucleus ng CM mula sa iba't ibang baboy (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) na hiwa/grupo, two-tailed t-criterion Student's; *p < 0.05).Ang mga error bar ay kumakatawan sa mean ± standard deviation.
Ang pananaliksik sa Translational Cardiovascular ay nangangailangan ng mga cellular model na tumpak na nagpaparami ng kapaligiran sa puso. Sa pag-aaral na ito, isang CTCM device ang binuo at nailalarawan na maaaring magpasigla ng mga ultrathin na bahagi ng puso. Kasama sa CTCM system ang physiologically synchronized electromechanical stimulation at T3 at Dex fluid enrichment. Kapag ang mga bahagi ng puso ng baboy ay nalantad sa mga salik na ito, ang kanilang viability, structural integrity, metabolic activity, at transcriptional expression ay nanatiling pareho tulad ng sa sariwang tisyu ng puso pagkatapos ng 12 araw ng culture. Bukod pa rito, ang labis na pag-unat ng tisyu ng puso ay maaaring magdulot ng hypertrophy ng puso na dulot ng hyperextension. Sa pangkalahatan, sinusuportahan ng mga resultang ito ang kritikal na papel ng mga kondisyon ng physiological culture sa pagpapanatili ng normal na cardiac phenotype at nagbibigay ng plataporma para sa drug screening.
Maraming salik ang nakakatulong sa paglikha ng pinakamainam na kapaligiran para sa paggana at kaligtasan ng mga cardiomyocyte. Ang pinakahalata sa mga salik na ito ay may kaugnayan sa (1) mga interaksyon sa pagitan ng mga selula, (2) electromechanical stimulation, (3) mga humoral factor, at (4) mga metabolic substrate. Ang mga interaksyon sa pagitan ng mga selula at selula ay nangangailangan ng mga kumplikadong three-dimensional na network ng maraming uri ng selula na sinusuportahan ng isang extracellular matrix. Ang ganitong mga kumplikadong interaksyon sa selula ay mahirap muling buuin in vitro sa pamamagitan ng co-culture ng mga indibidwal na uri ng selula, ngunit madaling makakamit gamit ang organotypic na katangian ng mga seksyon ng puso.
Ang mekanikal na pag-unat at elektrikal na pagpapasigla ng mga cardiomyocyte ay mahalaga para sa pagpapanatili ng cardiac phenotype33,34,35. Bagama't malawakang ginagamit ang mekanikal na pagpapasigla para sa pagkondisyon at pagkahinog ng hiPSC-CM, ilang magagandang pag-aaral kamakailan ang sumubok sa mekanikal na pagpapasigla ng mga hiwa ng puso sa kultura gamit ang uniaxial loading. Ipinapakita ng mga pag-aaral na ito na ang 2D uniaxial mechanical loading ay may positibong epekto sa phenotype ng puso habang isinasagawa ang kultura. Sa mga pag-aaral na ito, ang mga bahagi ng puso ay nilagyan ng isometric tensile forces17, linear auxotonic loading18, o ang cardiac cycle ay muling nilikha gamit ang force transducer feedback at tension drives. Gayunpaman, ang mga pamamaraang ito ay gumagamit ng uniaxial tissue stretch nang walang environmental optimization, na nagreresulta sa pagsugpo ng maraming cardiac genes o overexpression ng mga genes na nauugnay sa abnormal na mga tugon sa pag-unat. Ang CTCM na inilarawan dito ay nagbibigay ng 3D electromechanical stimulus na ginagaya ang natural na cardiac cycle sa mga tuntunin ng cycle time at physiological stretch (25% stretch, 40% systole, 60% diastole, at 72 beats kada minuto). Bagama't ang three-dimensional mechanical stimulation na ito lamang ay hindi sapat upang mapanatili ang integridad ng tisyu, kinakailangan ang kombinasyon ng humoral at mechanical stimulation gamit ang T3/Dex upang sapat na mapanatili ang viability, function, at integridad ng tisyu.
Ang mga humoral factor ay may mahalagang papel sa pag-modulate ng phenotype ng puso ng nasa hustong gulang. Ito ay itinampok sa mga pag-aaral ng HiPS-CM kung saan ang T3 at Dex ay idinagdag sa culture media upang mapabilis ang pagkahinog ng cell. Maaaring maimpluwensyahan ng T3 ang transportasyon ng mga amino acid, asukal, at calcium sa mga lamad ng cell36. Bukod pa rito, itinataguyod ng T3 ang ekspresyon ng MHC-α at downregulation ng MHC-β, na nagtataguyod ng pagbuo ng mabilis na pagkibot ng myofibrils sa mga mature cardiomyocytes kumpara sa mabagal na pagkibot ng myofibrils sa fetal CM. Ang kakulangan ng T3 sa mga pasyenteng may hypothyroidism ay nagreresulta sa pagkawala ng mga myofibrillar band at isang pinababang rate ng pag-unlad ng tono37. Ang Dex ay kumikilos sa mga glucocorticoid receptor at ipinakita na nagpapataas ng myocardial contractility sa mga nakahiwalay na perfused heart; 38 ang pagpapabuting ito ay pinaniniwalaang nauugnay sa epekto sa calcium deposit-driven entry (SOCE) 39,40. Bilang karagdagan, ang Dex ay nagbubuklod sa mga receptor nito, na nagdudulot ng malawak na intracellular response na pumipigil sa immune function at pamamaga30.
Ipinapahiwatig ng aming mga resulta na ang pisikal na mekanikal na pagpapasigla (MS) ay nagpabuti sa pangkalahatang pagganap ng kultura kumpara sa Ctrl, ngunit nabigong mapanatili ang kakayahang mabuhay, integridad ng istruktura, at ekspresyon ng puso sa loob ng 12 araw sa kultura. Kung ikukumpara sa Ctrl, ang pagdaragdag ng T3 at Dex sa mga kultura ng CTCM (MT) ay nagpabuti sa kakayahang mabuhay at nagpapanatili ng magkatulad na mga profile ng transkripsyon, integridad ng istruktura, at aktibidad ng metabolismo na may sariwang tisyu ng puso sa loob ng 12 araw. Bilang karagdagan, sa pamamagitan ng pagkontrol sa antas ng pag-unat ng tisyu, isang modelo ng hyperextension-induced cardiac hypertrophy ang nilikha gamit ang STCM, na naglalarawan ng kagalingan sa paggamit ng sistema ng STCM. Dapat tandaan na bagama't ang cardiac remodeling at fibrosis ay karaniwang kinabibilangan ng mga buo na organo na ang mga circulating cell ay maaaring magbigay ng naaangkop na mga cytokine pati na rin ang phagocytosis at iba pang mga remodeling factor, ang mga seksyon ng puso ay maaari pa ring gayahin ang proseso ng fibrotic bilang tugon sa stress at trauma sa mga myofibroblast. Nasuri na ito dati sa cardiac slice model na ito. Dapat tandaan na ang mga parameter ng CTCM ay maaaring i-modulate sa pamamagitan ng pagbabago ng pressure/electrical amplitude at frequency upang gayahin ang maraming kondisyon tulad ng tachycardia, bradycardia, at mechanical circulatory support (mechanical unloaded heart). Dahil dito, ang sistema ay may katamtamang throughput para sa drug testing. Ang kakayahan ng CTCM na imodelo ang cardiac hypertrophy na dulot ng labis na ehersisyo ay nagbubukas ng daan para sa pagsubok sa sistemang ito para sa personalized na therapy. Bilang konklusyon, ipinapakita ng kasalukuyang pag-aaral na ang mechanical stretch at humoral stimulation ay mahalaga para sa pagpapanatili ng kultura ng mga seksyon ng cardiac tissue.
Bagama't ang datos na ipinakita rito ay nagmumungkahi na ang CTCM ay isang napaka-promising na plataporma para sa pagmomodelo ng buo na myocardium, ang pamamaraang ito ng kultura ay may ilang mga limitasyon. Ang pangunahing limitasyon ng kultura ng CTCM ay ang pagpapataw nito ng patuloy na dynamic mechanical stresses sa mga hiwa, na humahadlang sa kakayahang aktibong subaybayan ang mga pag-urong ng cardiac slice sa bawat cycle. Bilang karagdagan, dahil sa maliit na sukat ng mga seksyon ng cardiac (7 mm), ang kakayahang suriin ang systolic function sa labas ng mga sistema ng kultura gamit ang mga tradisyonal na sensor ng puwersa ay limitado. Sa kasalukuyang manuskrito, bahagyang nalampasan namin ang limitasyong ito sa pamamagitan ng pagsusuri sa optical voltage bilang isang tagapagpahiwatig ng contractile function. Gayunpaman, ang limitasyong ito ay mangangailangan ng karagdagang pag-aaral at maaaring matugunan sa hinaharap sa pamamagitan ng pagpapakilala ng mga pamamaraan para sa optical monitoring ng function ng mga hiwa ng puso sa kultura, tulad ng optical mapping gamit ang calcium at voltage-sensitive dyes. Ang isa pang limitasyon ng CTCM ay ang gumaganang modelo ay hindi minamanipula ang physiological stress (preload at afterload). Sa CTCM, ang presyon ay sapilitan sa magkasalungat na direksyon upang muling gawin ang 25% physiological stretch sa diastole (full stretch) at systole (haba ng pag-urong habang electrical stimulation) sa napakalaking mga tisyu. Dapat alisin ang limitasyong ito sa mga disenyo ng CTCM sa hinaharap sa pamamagitan ng sapat na presyon sa tisyu ng puso mula sa magkabilang panig at sa pamamagitan ng paglalapat ng eksaktong ugnayan ng presyon-dami na nangyayari sa mga silid ng puso.
Ang overstretch-induced remodeling na iniulat sa manuskritong ito ay limitado sa paggaya sa mga hypertrophic hyperstretch signal. Kaya naman, makakatulong ang modelong ito sa pag-aaral ng stretch-induced hypertrophic signaling nang hindi nangangailangan ng humoral o neural factors (na wala sa sistemang ito). Kinakailangan ang mga karagdagang pag-aaral upang mapataas ang multiplicity ng CTCM, halimbawa, ang co-culture sa mga immune cells, circulating plasma humoral factors, at innervation kapag ang co-culture sa mga neuronal cells ay magpapabuti sa mga posibilidad ng disease modeling gamit ang CTCM.
Labintatlong baboy ang ginamit sa pag-aaral na ito. Lahat ng mga pamamaraan sa hayop ay isinagawa alinsunod sa mga alituntunin ng institusyon at inaprubahan ng Institutional Animal Care and Use Committee ng University of Louisville. Ang arko ng aorta ay ikinabit at ang puso ay nilagyan ng perfuse ng 1 L ng sterile cardioplegia (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH hanggang 7.4); Ang mga puso ay pinreserba sa napakalamig na cardioplegic solution hanggang sa dalhin sa laboratoryo sakay ng yelo na kadalasang <10 minuto. Ang mga puso ay pinreserba sa napakalamig na cardioplegic solution hanggang sa dalhin sa laboratoryo sakay ng yelo na kadalasang <10 minuto. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимамит <10нимат Ang mga puso ay nakaimbak sa napakalamig na solusyon para sa cardioplegic hanggang sa dalhin sa laboratoryo sakay ng yelo, na karaniwang tumatagal ng <10 minuto.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Panatilihing naka-yelo ang mga puso, cardioplegia hanggang sa dalhin sa laboratoryo sakay ng yelo, karaniwang <10 minuto.
Ang CTCM device ay binuo gamit ang computer-aided design (CAD) software ng SolidWorks. Ang mga culture chamber, divider, at air chamber ay gawa sa CNC clear acrylic plastic. Ang 7mm diameter na back-up ring ay gawa sa high density polyethylene (HDPE) sa gitna at may o-ring groove para magkasya ang silicone o-ring na ginagamit sa pagtatakip ng media sa ilalim. Isang manipis na silica membrane ang naghihiwalay sa culture chamber mula sa separation plate. Ang silicone membrane ay pinutol gamit ang laser mula sa 0.02″ na kapal ng silicone sheet at may tigas na 35A. Ang mga silicone gasket sa ibaba at itaas ay pinutol gamit ang laser mula sa 1/16″ na kapal ng silicone sheet at may tigas na 50A. Ang 316L stainless steel screws at wing nuts ay ginagamit para sa pag-fasten ng block at paglikha ng airtight seal.
Isang nakalaang printed circuit board (PCB) ang idinisenyo upang maisama sa C-PACE-EM system. Ang mga swiss machine connector socket sa PCB ay konektado sa mga graphite electrode sa pamamagitan ng mga silver-plated copper wire at bronze 0-60 screw na naka-screw sa mga electrode. Ang printed circuit board ay inilalagay sa takip ng 3D printer.
Ang CTCM device ay kinokontrol ng isang programmable pneumatic actuator (PPD) na lumilikha ng kontroladong circulatory pressure na katulad ng cardiac cycle. Habang tumataas ang presyon sa loob ng air chamber, ang flexible silicone membrane ay lumalawak pataas, na pinipilit ang medium na ilubog ang tissue site. Ang bahagi ng tissue ay iuunat ng paglabas ng fluid, na ginagaya ang physiological expansion ng puso habang diastole. Sa tugatog ng relaxation, inilapat ang electrical stimulation sa pamamagitan ng graphite electrodes, na nagbawas sa presyon sa air chamber at nagdulot ng contraction ng mga tissue section. Sa loob ng tubo ay isang hemostatic valve na may pressure sensor upang matukoy ang presyon sa air system. Ang pressure na nararamdam ng pressure sensor ay inilalapat sa isang data collector na konektado sa laptop. Nagbibigay-daan ito sa patuloy na pagsubaybay sa presyon sa loob ng gas chamber. Nang naabot na ang maximum chamber pressure (standard 80 mmHg, 140 mmHg OS), inutusan ang data acquisition device na magpadala ng signal sa C-PACE-EM system upang makabuo ng biphasic voltage signal sa loob ng 2 ms, na nakatakda sa 4 V.
Ang mga seksyon ng puso ay kinuha at ang mga kondisyon ng kultura sa 6 na balon ay isinagawa gaya ng sumusunod: Ilipat ang mga inaning puso mula sa transfer vessel patungo sa isang tray na naglalaman ng malamig (4° C.) cardioplegia. Ang kaliwang ventricle ay inihiwalay gamit ang isang sterile blade at hiniwa sa mga piraso na may sukat na 1-2 cm3. Ang mga bloke ng tisyu na ito ay ikinabit sa mga suporta ng tisyu gamit ang tissue adhesive at inilagay sa isang vibrating microtome tissue bath na naglalaman ng Tyrode's solution at patuloy na nilagyan ng oxygen (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g) . ), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-glucose (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M na solusyon), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M na solusyon), hanggang 1 L ddH2O). Ang vibrating microtome ay itinakda upang pumutol ng 300 µm na kapal na mga hiwa sa frequency na 80 Hz, isang horizontal vibration amplitude na 2 mm, at isang advance rate na 0.03 mm/s. Ang tissue bath ay napapalibutan ng yelo upang mapanatiling malamig ang solusyon at ang temperatura ay pinanatili sa 4°C. Ilipat ang mga seksyon ng tissue mula sa microtome bath patungo sa isang incubation bath na naglalaman ng patuloy na oxygenated na Tyrode solution sa yelo hanggang sa makakuha ng sapat na mga seksyon para sa isang culture plate. Para sa mga transwell culture, ang mga seksyon ng tissue ay ikinabit sa sterile na 6 mm na lapad na polyurethane support at inilagay sa 6 ml ng optimized medium (199 medium, 1x ITS supplement, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkaline at 2X antibiotic-antifungal). Ang electrical stimulation (10 V, frequency 1.2 Hz) ay inilapat sa mga seksyon ng tissue sa pamamagitan ng C-Pace. Para sa mga kondisyon ng TD, ang sariwang T3 at Dex ay idinagdag sa 100 nM at 1 μM sa bawat pagpapalit ng medium. Ang medium ay binabad sa oxygen bago palitan nang 3 beses sa isang araw. Ang mga seksyon ng tissue ay kinultura sa isang incubator sa 37°C at 5% CO2.
Para sa mga CTCM culture, ang mga tissue section ay inilagay sa isang custom-made na 3D printer sa isang Petri dish na naglalaman ng binagong Tyrode's solution. Ang device ay dinisenyo upang palakihin ang laki ng hiwa ng puso ng 25% ng lawak ng support ring. Ginagawa ito upang ang mga seksyon ng puso ay hindi lumawak pagkatapos mailipat mula sa Tyrode's solution patungo sa medium at sa panahon ng diastole. Gamit ang histoacrylic glue, ang mga seksyon na may kapal na 300 µm ay ikinabit sa isang support ring na 7 mm ang diyametro. Pagkatapos ikabit ang mga tissue section sa support ring, putulin ang sobrang tissue section at ilagay muli ang nakakabit na tissue section sa bath ng Tyrode solution na nasa yelo (4°C) hanggang sa maihanda ang sapat na mga seksyon para sa isang device. Ang kabuuang oras ng pagproseso para sa lahat ng device ay hindi dapat lumagpas sa 2 oras. Pagkatapos ikabit ang 6 na tissue section sa kanilang mga support ring, binuo ang CTCM device. Ang CTCM culture chamber ay paunang napuno ng 21 ml pre-oxygenated medium. Ilipat ang mga tissue section sa culture chamber at maingat na alisin ang anumang mga bula ng hangin gamit ang isang pipette. Ang bahagi ng tisyu ay iginuguhit papasok sa butas at dahan-dahang idinidiin sa tamang lugar. Panghuli, ilagay ang takip ng elektrod sa aparato at ilipat ang aparato sa incubator. Pagkatapos ay ikonekta ang CTCM sa tubo ng hangin at sa C-PACE-EM system. Bubukas ang pneumatic actuator at bubuksan ng balbula ng hangin ang CTCM. Ang C-PACE-EM system ay na-configure upang maghatid ng 4 V sa 1.2 Hz sa panahon ng biphasic pacing sa loob ng 2 ms. Ang medium ay pinapalitan nang dalawang beses sa isang araw at ang mga electrode ay pinapalitan isang beses sa isang araw upang maiwasan ang akumulasyon ng graphite sa mga electrode. Kung kinakailangan, maaaring alisin ang mga bahagi ng tisyu mula sa kanilang mga culture well upang ilabas ang anumang mga bula ng hangin na maaaring nahulog sa ilalim ng mga ito. Para sa mga kondisyon ng paggamot sa MT, ang T3/Dex ay idinagdag nang sariwa sa bawat pagpapalit ng medium na may 100 nM T3 at 1 μM Dex. Ang mga CTCM device ay kinultura sa isang incubator sa 37°C at 5% CO2.
Upang makakuha ng mga nakaunat na trajectory ng mga hiwa ng puso, isang espesyal na sistema ng kamera ang binuo. Isang SLR camera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) ang ginamit gamit ang isang Navitar Zoom 7000 18-108mm macro lens (Navitar, San Francisco, CA). Isinagawa ang visualization sa temperatura ng silid pagkatapos palitan ang medium ng bagong medium. Ang camera ay nakaposisyon sa anggulong 51° at ang video ay nire-record sa 30 frames per second. Una, ginamit ang open source software (MUSCLEMOTION43) kasama ang Image-J upang masukat ang galaw ng mga hiwa ng puso. Ang mask ay nilikha gamit ang MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) upang tukuyin ang mga rehiyon na interesado para sa pagtibok ng mga hiwa ng puso upang maiwasan ang ingay. Ang mga manu-manong naka-segment na mask ay inilalapat sa lahat ng mga imahe sa isang frame sequence at pagkatapos ay ipinapasa sa MUSCLEMOTION plug-in. Ginagamit ng Muscle Motion ang average intensity ng mga pixel sa bawat frame upang masukat ang galaw nito kaugnay ng reference frame. Ang mga datos ay nire-record, sinala, at ginamit upang masukat ang oras ng cycle at masuri ang tissue stretch sa panahon ng cardiac cycle. Ang naitalang video ay pinoproseso gamit ang isang first-order zero-phase digital filter. Upang masukat ang tissue stretch (peak-to-peak), isinagawa ang peak-to-peak analysis upang makilala ang pagkakaiba sa pagitan ng mga peak at trough sa naitalang signal. Bukod pa rito, isinasagawa ang detrending gamit ang isang 6th order polynomial upang maalis ang signal drift. Ang program code ay binuo sa MATLAB upang matukoy ang global tissue motion, cycle time, relaxation time, at contraction time (Supplementary Program Code 44).
Para sa pagsusuri ng strain, gamit ang parehong mga video na ginawa para sa mechanical stretch assessment, una naming sinubaybayan ang dalawang larawan na kumakatawan sa mga peak ng paggalaw (ang pinakamataas (itaas) at pinakamababa (ibabang) punto ng paggalaw) ayon sa MUSCLEMOTION software. Pagkatapos ay hinati namin ang mga rehiyon ng tisyu at naglapat ng isang anyo ng shading algorithm sa segmented tissue (Karagdagang Larawan 2a). Ang segmented tissue ay hinati sa sampung subsurface, at ang stress sa bawat ibabaw ay kinalkula gamit ang sumusunod na equation: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, kung saan ang Sup at Sdown ay ang mga distansya ng hugis mula sa itaas at ibabang mga anino ng tela, ayon sa pagkakabanggit (Karagdagang Larawan .2b).
Ang mga bahagi ng puso ay inayos sa 4% paraformaldehyde sa loob ng 48 oras. Ang mga tisyung inayos ay inalis sa tubig sa 10% at 20% sucrose sa loob ng 1 oras, pagkatapos ay sa 30% sucrose magdamag. Ang mga bahagi ay inilagay sa optimum cutting temperature compound (OCT compound) at unti-unting ini-freeze sa isang isopentane/dry ice bath. Itabi ang mga OCT embedding block sa -80 °C hanggang sa mahiwalay. Ang mga slide ay inihanda bilang mga bahagi na may kapal na 8 μm.
Para tanggalin ang OCT mula sa mga bahaging heart section, painitin ang mga slide sa isang heating block sa 95 °C sa loob ng 5 minuto. Magdagdag ng 1 ml PBS sa bawat slide at i-incubate sa loob ng 30 minuto sa temperatura ng kuwarto, pagkatapos ay i-permeate ang mga bahagi sa pamamagitan ng paglalagay ng 0.1% Triton-X sa PBS sa loob ng 15 minuto sa temperatura ng kuwarto. Para maiwasan ang pagdikit ng mga non-specific antibodies sa sample, magdagdag ng 1 ml ng 3% BSA solution sa mga slide at i-incubate sa loob ng 1 oras sa temperatura ng kuwarto. Pagkatapos ay tinanggal ang BSA at hinugasan ang mga slide gamit ang PBS. Markahan ang bawat sample gamit ang lapis. Ang mga pangunahing antibody (pinalabnaw 1:200 sa 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) at troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) ay idinagdag sa loob ng 90 minuto, pagkatapos ay ang mga pangalawang antibody (pinalabnaw 1:200 sa 1% BSA) laban sa daga na Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), laban sa kuneho na Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) sa loob ng karagdagang 90 minuto. Hinugasan ng 3 beses gamit ang PBS. Upang maiba ang target staining mula sa background, ginamit lamang namin ang pangalawang antibody bilang kontrol. Panghuli, idinagdag ang DAPI nuclear stain at ang mga slide ay inilagay sa isang vectashield (Vector Laboratories) at tinatakan ng nail polish (-x magnification) at Keyence microscope na may 40x magnification.
Ang WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) sa 5 μg/ml sa PBS ay ginamit para sa paglamlam ng WGA at inilapat sa mga nakapirming seksyon sa loob ng 30 minuto sa temperatura ng silid. Ang mga slide ay hinugasan gamit ang PBS at idinagdag ang Sudan black sa bawat slide at in-incubate sa loob ng 30 minuto. Ang mga slide ay hinugasan gamit ang PBS at idinagdag ang vectashield embedding medium. Ang mga slide ay nakita sa isang Keyence microscope sa 40x magnification.
Ang OCT ay tinanggal mula sa mga sample gaya ng inilarawan sa itaas. Pagkatapos tanggalin ang OCT, ilubog ang mga slide sa solusyon ni Bouin magdamag. Ang mga slide ay hinugasan ng distilled water sa loob ng 1 oras at pagkatapos ay inilagay sa isang solusyon ng Bibrich aloe acid fuchsin sa loob ng 10 minuto. Pagkatapos, ang mga slide ay hinugasan ng distilled water at inilagay sa isang solusyon ng 5% phosphomolybdenum/5% phosphotungstic acid sa loob ng 10 minuto. Nang hindi binabanlawan, ilipat ang mga slide nang direkta sa aniline blue solution sa loob ng 15 minuto. Pagkatapos, ang mga slide ay hinugasan ng distilled water at inilagay sa isang 1% acetic acid solution sa loob ng 2 minuto. Ang mga slide ay pinatuyo sa 200 N ethanol at inilipat sa xylene. Ang mga may kulay na slide ay tiningnan gamit ang isang Keyence microscope na may 10x objective. Ang porsyento ng fibrosis area ay tinantiya gamit ang Keyence Analyzer software.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), numero ng katalogo na V13154, ayon sa protocol ng tagagawa na may ilang mga pagbabago. Sa partikular, isang surgical punch na may diyametrong 6 mm ang ginamit upang matiyak ang pare-parehong laki ng tisyu sa panahon ng pagsusuri ng MTT. Ang mga tisyu ay isa-isang inilagay sa mga balon ng isang 12-well plate na naglalaman ng MTT substrate ayon sa protocol ng tagagawa. Ang mga seksyon ay ini-incubate sa 37° C sa loob ng 3 oras at ang buhay na tisyu ay nagme-metabolize ng MTT substrate upang bumuo ng isang lilang formazan compound. Palitan ang solusyon ng MTT ng 1 ml DMSO at i-incubate sa 37 °C sa loob ng 15 minuto upang makuha ang lilang formazan mula sa mga seksyon ng puso. Ang mga sample ay diluted 1:10 sa DMSO sa 96-well clear bottom plates at sinukat ang intensity ng kulay ng lila sa 570 nm gamit ang isang Cytation plate reader (BioTek). Ang mga pagbasa ay na-normalize sa bigat ng bawat hiwa ng puso.
Ang heart slice media ay pinalitan ng media na naglalaman ng 1 μCi/ml [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) para sa glucose utilization assay gaya ng nailarawan noon. Pagkatapos ng 4 na oras ng incubation, magdagdag ng 100 µl ng medium sa isang bukas na microcentrifuge tube na naglalaman ng 100 µl ng 0.2 N HCl. Pagkatapos, ang tubo ay inilagay sa isang scintillation tube na naglalaman ng 500 μl ng dH2O upang ma-evaporate ang [3H]2O sa loob ng 72 oras sa 37°C. Pagkatapos, alisin ang microcentrifuge tube mula sa scintillation tube at magdagdag ng 10 ml ng scintillation fluid. Ang mga bilang ng scintillation ay isinagawa gamit ang isang Tri-Carb 2900TR liquid scintillation analyzer (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). Ang paggamit ng glucose ay kinalkula na isinasaalang-alang ang [5-3H]-glucose specific activity, incomplete equilibrium at background, dilution ng [5-3H]-to unlabeled glucose, at scintillation counter efficiency. Ang datos ay ni-normalize sa masa ng mga seksyon ng puso.
Pagkatapos ng homogenization ng tisyu sa Trizol, ang RNA ay inihiwalay mula sa mga seksyon ng puso gamit ang Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 ayon sa protocol ng gumawa. Ang paghahanda, sequencing, at pagsusuri ng datos ng RNAsec library ay isinagawa gaya ng sumusunod:
1 μg ng RNA bawat sample ang ginamit bilang panimulang materyal para sa paghahanda ng RNA library. Ang mga sequencing library ay binuo gamit ang NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit para sa Illumina (NEB, USA) kasunod ng mga rekomendasyon ng tagagawa, at ang mga index code ay idinagdag sa mga attribute sequence para sa bawat sample. Sa madaling salita, ang mRNA ay pinadalisay mula sa kabuuang RNA gamit ang magnetic beads na nakakabit sa poly-T oligonucleotides. Ang fragmentation ay isinasagawa gamit ang divalent cations sa mataas na temperatura sa NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). Ang unang strand cDNA ay na-synthesize gamit ang mga random hexamer primer at M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-). Ang pangalawang strand cDNA ay pagkatapos ay na-synthesize gamit ang DNA polymerase I at RNase H. Ang natitirang mga overhang ay kino-convert sa mga blunt ends sa pamamagitan ng exonuclease/polymerase activity. Pagkatapos ng adenylation ng 3′ end ng DNA fragment, isang NEBNext Adapter na may hairpin loop structure ang nakakabit dito upang ihanda ito para sa hybridization. Para sa pagpili ng mga cDNA fragment na may ginustong haba na 150-200 bp. Ang mga fragment ng library ay pinadalisay gamit ang AMPure XP system (Beckman Coulter, Beverly, USA). Pagkatapos, 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) na may size-selected cDNA na niligate gamit ang isang adapter ay ginamit sa loob ng 15 minuto sa 37°C at pagkatapos ay sa loob ng 5 minuto sa 95°C bago ang PCR. Pagkatapos ay isinagawa ang PCR gamit ang Phusion High-Fidelity DNA polymerase, universal PCR primers, at Index (X) primers. Panghuli, ang mga produkto ng PCR ay pinadalisay (AMPure XP system) at tinasa ang kalidad ng library sa isang Agilent Bioanalyzer 2100 system. Ang cDNA library ay pagkatapos ay sequenced gamit ang isang Novaseq sequencer. Ang mga raw image file mula sa Illumina ay na-convert sa mga raw read gamit ang CASAVA Base Calling. Ang raw data ay nakaimbak sa mga FASTQ(fq) format file na naglalaman ng mga read sequence at kaukulang base qualities. Piliin ang HISAT2 upang itugma ang mga filtered sequencing read sa Sscrofa11.1 reference genome. Sa pangkalahatan, sinusuportahan ng HISAT2 ang mga genome ng anumang laki, kabilang ang mga genome na mas malaki sa 4 na bilyong base, at ang mga default na halaga ay nakatakda para sa karamihan ng mga parameter. Ang mga splicing read mula sa data ng RNA Seq ay maaaring mahusay na ihanay gamit ang HISAT2, ang pinakamabilis na sistemang magagamit sa kasalukuyan, na may pareho o mas mahusay na katumpakan kaysa sa anumang iba pang pamamaraan.
Ang kasaganaan ng mga transcript ay direktang sumasalamin sa antas ng ekspresyon ng gene. Ang mga antas ng ekspresyon ng gene ay tinatasa sa pamamagitan ng kasaganaan ng mga transcript (bilang ng sequencing) na nauugnay sa genome o mga exon. Ang bilang ng mga nabasa ay proporsyonal sa mga antas ng ekspresyon ng gene, haba ng gene, at lalim ng sequencing. Ang FPKM (mga fragment bawat libong base pair ng transcript na sequenced bawat milyong base pair) ay kinalkula at ang mga P-value ng differential expression ay natukoy gamit ang DESeq2 package. Pagkatapos ay kinalkula namin ang false discovery rate (FDR) para sa bawat P value gamit ang Benjamini-Hochberg method9 batay sa built-in na R-function na "p.adjust".
Ang RNA na nakahiwalay mula sa mga seksyon ng puso ay ginawang cDNA sa konsentrasyon na 200 ng/μl gamit ang SuperScript IV Vilo Master mix mula sa Thermo (Thermo, cat. no. 11756050). Ang quantitative RT-PCR ay isinagawa gamit ang isang Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well transparent reaction plate (Thermo, cat. no. 4483319) at microamp optical adhesive (Thermo, cat. no. 4311971). Ang reaction mixture ay binubuo ng 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer at 3.5 µl H2O na hinalo bawat well. Ang mga karaniwang qPCR cycle ay isinagawa at ang mga CT value ay sinukat gamit ang isang Applied Biosystems Quantstudio 5 real-time PCR instrument (384-well module; product # A28135). Ang mga Taqman primer ay binili mula sa Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Ang mga CT value ng lahat ng sample ay na-normalize sa housekeeping gene na GAPDH.
Ang paglabas ng NT-ProBNP sa media ay tinasa gamit ang NT-ProBNP kit (pig) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) ayon sa protocol ng gumawa. Sa madaling salita, 250 µl ng bawat sample at standard ang idinagdag nang doble sa bawat well. Kaagad pagkatapos idagdag ang sample, magdagdag ng 50 µl ng Assay Reagent A sa bawat well. Dahan-dahang alugin ang plato at selyuhan ng sealant. Pagkatapos, ang mga tableta ay in-incubate sa 37°C sa loob ng 1 oras. Pagkatapos, sipsipin ang solusyon at hugasan ang mga well nang 4 na beses gamit ang 350 µl ng 1X wash solution, at i-incubate ang wash solution nang 1-2 minuto sa bawat pagkakataon. Pagkatapos, magdagdag ng 100 µl ng Assay Reagent B sa bawat well at selyuhan ng plate sealant. Ang tableta ay dahan-dahang inalog at in-incubate sa 37°C sa loob ng 30 minuto. Sipsipin ang solusyon at hugasan ang mga well nang 5 beses gamit ang 350 µl ng 1X wash solution. Magdagdag ng 90 µl ng substrate solution sa bawat well at isara ang plate. I-incubate ang plate sa 37°C sa loob ng 10-20 minuto. Magdagdag ng 50 µl Stop Solution sa bawat well. Agad na sinukat ang plate gamit ang Cytation (BioTek) plate reader na naka-set sa 450 nm.
Isinagawa ang mga power analysis upang piliin ang mga laki ng grupo na magbibigay ng >80% na power upang matukoy ang 10% na ganap na pagbabago sa parameter na may 5% Type I error rate. Isinagawa ang mga power analysis upang piliin ang mga laki ng grupo na magbibigay ng >80% na power upang matukoy ang 10% na ganap na pagbabago sa parameter na may 5% Type I error rate. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Isinagawa ang pagsusuri ng lakas upang pumili ng mga laki ng grupo na magbibigay ng >80% lakas upang matukoy ang 10% na ganap na pagbabago ng parameter na may 5% na rate ng error na Type I.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I功效以检测参数中10％绝对变化和5％I寎甎里。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I功效以检测参数中10％绝对变化和5％I寎甎里。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаругожлотябня изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Isinagawa ang isang pagsusuri ng kapangyarihan upang pumili ng laki ng grupo na magbibigay ng >80% kapangyarihan upang matukoy ang 10% na ganap na pagbabago ng parameter at 5% na rate ng error sa uri I.Ang mga seksyon ng tisyu ay sapalarang pinili bago ang eksperimento. Ang lahat ng pagsusuri ay condition blind at ang mga sample ay na-decode lamang pagkatapos masuri ang lahat ng datos. Ang GraphPad Prism software (San Diego, CA) ay ginamit upang maisagawa ang lahat ng pagsusuring pang-estadistika. Para sa lahat ng estadistika, ang mga p-value ay itinuring na makabuluhan sa mga halagang <0.05. Para sa lahat ng estadistika, ang mga p-value ay itinuturing na makabuluhan sa mga halagang <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Para sa lahat ng estadistika, ang mga p-value ay itinuturing na makabuluhan sa mga halagang <0.05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Para sa lahat ng estadistika, ang mga p-value ay itinuturing na makabuluhan sa mga halagang <0.05.Isinagawa ang two-tailed Student's t-test sa datos na may 2 paghahambing lamang. Ginamit ang one-way o two-way ANOVA upang matukoy ang kahalagahan sa pagitan ng maraming grupo. Kapag nagsasagawa ng mga post hoc test, inilapat ang Tukey's correction upang isaalang-alang ang maraming paghahambing. Ang datos ng RNAsec ay may mga espesyal na konsiderasyong pang-estadistika kapag kinakalkula ang FDR at p.adjust gaya ng inilarawan sa seksyon ng Mga Paraan.
Para sa karagdagang impormasyon tungkol sa disenyo ng pag-aaral, tingnan ang abstrak ng Ulat sa Pananaliksik sa Kalikasan na naka-link sa artikulong ito.