Nature.com تي اچڻ لاءِ مهرباني. توهان جي استعمال ڪيل برائوزر ورزن ۾ محدود CSS سپورٽ آهي. بهترين تجربي لاءِ، اسان سفارش ڪريون ٿا ته توهان هڪ اپڊيٽ ٿيل برائوزر استعمال ڪريو (يا انٽرنيٽ ايڪسپلورر ۾ مطابقت واري موڊ کي غير فعال ڪريو). انهي دوران، مسلسل سپورٽ کي يقيني بڻائڻ لاءِ، اسان سائيٽ کي اسٽائل ۽ جاوا اسڪرپٽ کان سواءِ رينڊر ڪنداسين.
هڪ قابل اعتماد ان ويٽرو سسٽم جي ضرورت آهي جيڪو دل جي جسماني ماحول کي صحيح طور تي دوا جي جاچ لاءِ ٻيهر پيدا ڪري سگهي. انساني دل جي ٽشو ڪلچر سسٽم جي محدود دستيابي دل جي دوا جي اثرات جي غلط تشريح جو سبب بڻيل آهي. هتي، اسان هڪ ڪارڊيڪ ٽشو ڪلچر ماڊل (CTCM) تيار ڪيو آهي جيڪو اليڪٽروميڪنيڪل طور تي دل جي سلائسن کي متحرڪ ڪري ٿو ۽ دل جي چڪر جي سسٽولڪ ۽ ڊائسٽولڪ مرحلن دوران جسماني ڇڪڻ مان گذري ٿو. ڪلچر جي 12 ڏينهن کان پوءِ، هن طريقي سان دل جي حصن جي عملداري کي جزوي طور تي بهتر بڻايو، پر انهن جي ساخت جي سالميت کي مڪمل طور تي محفوظ نه ڪيو. تنهن ڪري، ننڍي ماليڪيول اسڪريننگ کان پوءِ، اسان ڏٺو ته اسان جي ميڊيم ۾ 100 nM ٽرائيوڊوٿيرونين (T3) ۽ 1 μM ڊيڪساميٿاسون (ڊيڪس) جو اضافو 12 ڏينهن تائين حصن جي مائڪرو اسٽريچر کي برقرار رکيو. T3/Dex علاج سان گڏ، CTCM سسٽم ٽرانسڪرپشنل پروفائلز، عملداري، ميٽابولڪ سرگرمي، ۽ ساخت جي سالميت کي 12 ڏينهن تائين تازي دل جي ٽشو جي برابر سطح تي برقرار رکيو. ان کان علاوه، ڪلچر ۾ دل جي ٽشو جي گهڻي ڇڪڻ هائپرٽروفڪ ڪارڊيڪ سگنلنگ کي متاثر ڪري ٿي، جيڪو ڪارڊيڪ اسٽريچ جي ڪري پيدا ٿيندڙ هائپرٽروفڪ حالتن جي نقل ڪرڻ لاءِ CTCM جي صلاحيت جو ثبوت فراهم ڪري ٿو. نتيجي ۾، CTCM ڊگهي عرصي تائين ڪلچر ۾ دل جي فزيالوجي ۽ پيٿوفزيولوجي کي ماڊل ڪري سگهي ٿو، قابل اعتماد دوا جي اسڪريننگ کي فعال بڻائي ٿو.
ڪلينڪل ريسرچ کان اڳ، قابل اعتماد ان ويٽرو سسٽم جي ضرورت آهي جيڪي انساني دل جي جسماني ماحول کي صحيح طور تي ٻيهر پيدا ڪري سگهن. اهڙن سسٽمن کي تبديل ٿيل ميڪيڪل اسٽريچ، دل جي شرح، ۽ اليڪٽرو فزيولوجيڪل خاصيتن جي نقل ڪرڻ گهرجي. جانورن جا ماڊل عام طور تي دل جي فزيالوجي لاءِ اسڪريننگ پليٽ فارم طور استعمال ڪيا ويندا آهن انساني دل ۾ دوائن جي اثرن کي ظاهر ڪرڻ ۾ محدود اعتبار سان 1,2. آخرڪار، آئيڊيل ڪارڊيڪ ٽشو ڪلچر تجرباتي ماڊل (CTCM) هڪ ماڊل آهي جيڪو مختلف علاج ۽ فارماسولوجيڪل مداخلتن لاءِ انتهائي حساس ۽ مخصوص آهي، انساني دل جي فزيالوجي ۽ پيٿو فزيالوجي کي صحيح طور تي ٻيهر پيدا ڪري ٿو. اهڙي سسٽم جي غير موجودگي دل جي ناڪامي لاءِ نئين علاج جي دريافت کي محدود ڪري ٿي 4,5 ۽ مارڪيٽ مان نڪرڻ جو هڪ وڏو سبب دوا جي ڪارڊيوٽوڪسيسيٽي کي جنم ڏنو آهي 6.
گذريل ڏهاڪي دوران، اٺ غير دل جون دوائون ڪلينڪل استعمال کان واپس ورتيون ويون آهن ڇاڪاڻ ته اهي QT وقفي جي طوالت جو سبب بڻجن ٿيون جنهن جي ڪري وينٽريڪيولر اريٿميا ۽ اوچتو موت ٿئي ٿي. تنهن ڪري، دل جي اثرائتي ۽ زهر جو جائزو وٺڻ لاءِ قابل اعتماد پري ڪلينڪل اسڪريننگ حڪمت عملين جي وڌندڙ ضرورت آهي. دوا جي اسڪريننگ ۽ زهر جي جاچ ۾ انساني-حوصلہ افزائي پلوريپوٽنٽ اسٽيم سيل مان نڪتل ڪارڊيوميوسائٽس (hiPS-CM) جو تازو استعمال هن مسئلي جو جزوي حل فراهم ڪري ٿو. بهرحال، hiPS-CMs جي ناپختہ نوعيت ۽ دل جي ٽشو جي ملٽي سيلولر پيچيدگي جي کوٽ هن طريقي جون وڏيون حدون آهن. تازين مطالعي مان ظاهر ٿيو آهي ته هن حد کي جزوي طور تي ابتدائي hiPS-CM استعمال ڪندي دل جي ٽشو هائيڊروجيلز ٺاهڻ لاءِ فوري طور تي خود بخود سنڪچن جي شروعات کان پوءِ ۽ وقت سان گڏ بتدريج برقي محرک وڌائڻ سان ختم ڪري سگهجي ٿو. بهرحال، انهن hiPS-CM مائڪرو ٽشوز ۾ بالغ مايوڪارڊيم جي پختو اليڪٽرو فزيولوجيڪل ۽ سنڪچن خاصيتون نه هونديون آهن. ان کان علاوه، انساني دل جي ٽشو ۾ هڪ وڌيڪ پيچيده جوڙجڪ آهي، جنهن ۾ مختلف سيل قسمن جو هڪ متفاوت مرکب شامل آهي، جنهن ۾ اينڊوٿيليل سيلز، نيورون، ۽ اسٽرومل فائبرو بلاسٽس شامل آهن، جيڪي خارجي سيلولر ميٽرڪس پروٽين جي مخصوص سيٽن سان ڳنڍيل آهن. بالغ ممالين جي دل ۾ غير ڪارڊيوميوسائيٽ آبادي 11،12،13 جي هي متفاوت انفرادي سيل قسمن کي استعمال ڪندي دل جي ٽشو کي ماڊل ڪرڻ لاءِ هڪ وڏي رڪاوٽ آهي. اهي وڏيون حدون جسماني ۽ پيٿولوجيڪل حالتن هيٺ برقرار مايوڪارڊيل ٽشو کي ڪلچر ڪرڻ لاءِ طريقن جي ترقي جي اهميت تي زور ڏين ٿيون.
انساني دل جا ڪلچر ٿيل پتلا (300 µm) حصا برقرار انساني مايوڪارڊيم جو هڪ اميد افزا ماڊل ثابت ٿيا آهن. هي طريقو انساني دل جي ٽشو وانگر مڪمل 3D ملٽي سيلولر سسٽم تائين رسائي فراهم ڪري ٿو. جڏهن ته، 2019 تائين، ڪلچر ٿيل دل جي حصن جو استعمال مختصر (24 ڪلاڪ) ڪلچر بقا جي ڪري محدود هو. اهو ڪيترن ئي عنصرن جي ڪري آهي جنهن ۾ جسماني-مڪينيڪل اسٽريچ جي کوٽ، هوا-مائع انٽرفيس، ۽ سادي ميڊيا جو استعمال شامل آهي جيڪي دل جي ٽشو جي ضرورتن کي پورو نٿا ڪن. 2019 ۾، ڪيترن ئي تحقيقي گروپن اهو ظاهر ڪيو ته ڪارڊيڪ ٽشو ڪلچر سسٽم ۾ ميڪيڪل عنصرن کي شامل ڪرڻ ڪلچر جي زندگي کي وڌائي سگھي ٿو، دل جي اظهار کي بهتر بڻائي سگھي ٿو، ۽ دل جي بيماري جي نقل ڪري سگھي ٿو. ٻه خوبصورت مطالعي 17 ۽ 18 ڏيکارين ٿا ته غير محوري ميڪيڪل لوڊنگ ڪلچر دوران دل جي فينوٽائپ تي مثبت اثر وجهي ٿي. جڏهن ته، انهن مطالعي دل جي چڪر جي متحرڪ ٽي-dimensional فزيڪو-مڪينيڪل لوڊنگ استعمال نه ڪئي، ڇاڪاڻ ته دل جا حصا يا ته آئسوميٽرڪ ٽينسل فورسز 17 يا لڪير آڪسوٽوونڪ لوڊنگ 18 سان لوڊ ڪيا ويا هئا. ٽشو اسٽريچنگ جي انهن طريقن جي نتيجي ۾ ڪيترن ئي دل جي جين کي دٻايو ويو يا غير معمولي اسٽريچ ردعمل سان لاڳاپيل جين جي اوور ايڪسپريشن. خاص طور تي، Pitoulis et al. 19 فورس ٽرانسڊيوسر فيڊ بيڪ ۽ ٽينشن ڊرائيو استعمال ڪندي دل جي چڪر جي بحالي لاءِ هڪ متحرڪ دل جي سلائس ڪلچر غسل تيار ڪيو. جيتوڻيڪ هي نظام وڌيڪ صحيح ان ويٽرو ڪارڊيڪ سائيڪل ماڊلنگ جي اجازت ڏئي ٿو، طريقي جي پيچيدگي ۽ گهٽ ٿرو پُٽ هن نظام جي استعمال کي محدود ڪري ٿو. اسان جي ليبارٽري تازو ئي هڪ آسان ڪلچر سسٽم تيار ڪيو آهي جيڪو برقي محرڪ ۽ هڪ بهتر ميڊيم استعمال ڪندي سور ۽ انساني دل جي ٽشو جي حصن جي عملداري کي 6 ڏينهن تائين برقرار رکڻ لاءِ 20,21.
موجوده مسودي ۾، اسان هڪ ڪارڊيڪ ٽشو ڪلچر ماڊل (CTCM) بيان ڪريون ٿا جيڪو سور جي دل جي حصن کي استعمال ڪندي آهي جيڪو دل جي چڪر دوران ٽن طرفي ڪارڊيڪ فزيالوجي ۽ پيٿوفزيولوجيڪل ڊسٽينشن کي ٻيهر بيان ڪرڻ لاءِ مزاحيه اشارن کي شامل ڪري ٿو. هي CTCM پري ڪلينڪل دوا جي اڳڪٿي جي درستگي کي هڪ سطح تائين وڌائي سگهي ٿو جيڪو اڳ ڪڏهن به حاصل نه ڪيو ويو هو هڪ قيمتي اثرائتي، وچ-ٿرو پُٽ ڪارڊيڪ سسٽم فراهم ڪندي جيڪو پري ڪلينڪل دوا جي جاچ لاءِ مماليا جي دل جي فزيالوجي/پيٿوفزيالوجي جي نقل ڪري ٿو.
هيموڊينامڪ ميڪيڪل سگنل ڪارڊيوميوسائيٽ فنڪشن کي برقرار رکڻ ۾ اهم ڪردار ادا ڪن ٿا 22,23,24. موجوده مسودي ۾، اسان هڪ CTCM (شڪل 1a) تيار ڪيو آهي جيڪو جسماني فريڪوئنسي (1.2 Hz، 72 ڌڙڪن في منٽ) تي برقي ۽ ميڪيڪل محرک ٻنهي کي پيدا ڪندي بالغن جي دل جي ماحول جي نقل ڪري سگهي ٿو. ڊائسٽول دوران وڌيڪ ٽشو اسٽريچ کان بچڻ لاءِ، ٽشو جي سائيز کي 25٪ وڌائڻ لاءِ هڪ 3D پرنٽنگ ڊيوائس استعمال ڪئي وئي (شڪل 1b). C-PACE سسٽم پاران پيدا ٿيندڙ برقي رفتار کي ڊيٽا حاصل ڪرڻ واري نظام کي استعمال ڪندي سسٽول کان 100 ms شروع ڪرڻ جو وقت ڏنو ويو ته جيئن دل جي چڪر کي مڪمل طور تي ٻيهر پيدا ڪري سگهجي. ٽشو ڪلچر سسٽم هڪ پروگراميبل نيوميٽڪ ايڪٽيوٽر (LB انجنيئرنگ، جرمني) استعمال ڪري ٿو ته جيئن مٿيون چيمبر ۾ دل جي سلائسن جي توسيع جو سبب بڻجندڙ هڪ لچڪدار سلڪون جھلي کي چڪر طور تي وڌايو وڃي. سسٽم کي پريشر ٽرانسڊيوسر ذريعي هڪ ٻاهرين ايئر لائن سان ڳنڍيو ويو، جنهن دٻاءُ (± 1 mmHg) ۽ وقت (± 1 ms) (شڪل 1c) کي صحيح طور تي ترتيب ڏيڻ ممڪن بڻايو.
a ڊوائيس جي ڪلچر چيمبر اندر، نيري رنگ ۾ ڏيکاريل 7 ملي ميٽر سپورٽ رنگ سان ٽشو سيڪشن کي ڳنڍيو. ڪلچر چيمبر کي هڪ پتلي لچڪدار سلڪون جھلي ذريعي ايئر چيمبر کان الڳ ڪيو ويو آهي. ليڪ کي روڪڻ لاءِ هر چيمبر جي وچ ۾ هڪ گيسڪيٽ رکو. ڊوائيس جي ڍڪ ۾ گريفائيٽ اليڪٽروڊ شامل آهن جيڪي برقي محرڪ فراهم ڪن ٿا. b وڏي ٽشو ڊيوائس، گائيڊ رنگ ۽ سپورٽ رنگ جي اسڪيميٽڪ نمائندگي. ٽشو سيڪشن (ناسي) وڏي سائيز واري ڊوائيس تي رکيا ويا آهن گائيڊ رنگ ڊوائيس جي ٻاهرئين ڪنڊ تي نالي ۾ رکيل آهي. گائيڊ استعمال ڪندي، سپورٽ رنگ کي احتياط سان ڪارڊيڪ ٽشو جي حصي تي ٽشو ايڪريلڪ چپڪندڙ سان ڍڪيل رکو. c گراف برقي محرڪ جي وقت کي پروگراميبل نيوميٽڪ ايڪٽيوٽر (PPD) پاران ڪنٽرول ڪيل ايئر چيمبر پريشر جي ڪم جي طور تي ڏيکاري ٿو. پريشر سينسر استعمال ڪندي برقي محرڪ کي هم وقت سازي ڪرڻ لاءِ ڊيٽا حاصل ڪرڻ واري ڊوائيس استعمال ڪئي وئي. جڏهن ڪلچر چيمبر ۾ دٻاءُ مقرر حد تائين پهچي ٿو، هڪ نبض سگنل C-PACE-EM ڏانهن موڪليو ويندو آهي ته جيئن برقي محرڪ کي متحرڪ ڪري سگهجي. d انڪيوبيٽر شيلف تي رکيل چار CTCMs جي تصوير. چار ڊوائيس هڪ پي پي ڊي سان هڪ نيوميٽڪ سرڪٽ ذريعي ڳنڍيل آهن، ۽ پريشر سينسر هيموسٽيٽڪ والو ۾ داخل ڪيا ويا آهن ته جيئن نيوميٽڪ سرڪٽ ۾ دٻاءُ جي نگراني ڪري سگهجي. هر ڊوائيس ۾ ڇهه ٽشو سيڪشن هوندا آهن.
هڪ واحد نيوميٽڪ ايڪٽيوئيٽر استعمال ڪندي، اسان 4 CTCM ڊوائيسز کي ڪنٽرول ڪرڻ جي قابل هئاسين، جن مان هر هڪ 6 ٽشو سيڪشن رکي سگهي ٿو (شڪل 1d). CTCM ۾، هوا جي چيمبر ۾ هوا جو دٻاءُ فلوئڊ چيمبر ۾ هم وقت ساز دٻاءُ ۾ تبديل ٿئي ٿو ۽ دل جي سلائس جي جسماني توسيع کي متاثر ڪري ٿو (شڪل 2a ۽ ضمني فلم 1). 80 ملي ميٽر Hg تي ٽشو اسٽريچ جو جائزو. آرٽ. ٽشو سيڪشن جي اسٽريچنگ کي 25٪ (شڪل 2b) ڏيکاريو. هي سيڪڙو اسٽريچ عام ڪارڊيڪ سيڪشن ڪانٽريڪٽيليٽي 17,19,25 لاءِ 2.2-2.3 µm جي جسماني سارڪومير جي ڊيگهه سان مطابقت رکي ٿو. ڪسٽم ڪئميرا سيٽنگز استعمال ڪندي ٽشو جي حرڪت جو جائزو ورتو ويو (ضمني شڪل 1). ٽشو جي حرڪت جي طول و عرض ۽ رفتار (شڪل 2c، d) دل جي چڪر دوران اسٽريچ ۽ سسٽول ۽ ڊائسٽول دوران وقت سان مطابقت رکي ٿي (شڪل 2b). سنڪچ ۽ آرام دوران دل جي ٽشو جي اسٽريچ ۽ رفتار ڪلچر ۾ 12 ڏينهن تائين مسلسل رهي (شڪل 2f). ڪلچر دوران بجلي جي محرڪ جي ڪانٽريڪٽيلٽي تي اثر جو جائزو وٺڻ لاءِ، اسان شيڊنگ الگورتھم (ضمني شڪل 2a، b) استعمال ڪندي فعال خرابي کي طئي ڪرڻ لاءِ هڪ طريقو تيار ڪيو ۽ برقي محرڪ سان ۽ بغير خرابي جي وچ ۾ فرق ڪرڻ جي قابل ٿي ويا. دل جو ساڳيو حصو (شڪل 2f). ڪٽ جي متحرڪ علائقي ۾ (R6-9)، برقي محرڪ دوران وولٽيج برقي محرڪ جي غير موجودگي جي ڀيٽ ۾ 20٪ وڌيڪ هو، جيڪو برقي محرڪ جي ڪانٽريڪٽيل فنڪشن ۾ حصو کي ظاهر ڪري ٿو.
هوا جي چيمبر جي دٻاءُ، فلوئڊ چيمبر جي دٻاءُ، ۽ ٽشو جي حرڪت جي ماپن جا نمائندا نشان تصديق ڪن ٿا ته چيمبر جو دٻاءُ فلوئڊ چيمبر جي دٻاءُ کي تبديل ڪري ٿو، جنهن جي ڪري ٽشو سلائس جي هڪجهڙي حرڪت ٿئي ٿي. b سيڪڙو اسٽريچ (نارنگي) سان ملندڙ ٽشو حصن جي سيڪڙو اسٽريچ (نيرو) جا نمائندا نشان. c دل جي سلائس جي ماپيل حرڪت ماپيل رفتار سان مطابقت رکي ٿي. (d) دل جي هڪ سلائس ۾ چڪر واري حرڪت (نيري لڪير) ۽ رفتار (نارنگي ڊاٽ ٿيل لڪير) جا نمائندا پيچرا. e چڪر جي وقت جي مقدار (n = 19 سلائس في گروپ، مختلف سورن مان)، ڇڪڻ جو وقت (n = 19 سلائس في گروپ، مختلف سورن مان)، ٽشو جي حرڪت (n = 25). سلائسون)/مختلف سورن مان گروپ)، چوٽي سسٽولڪ رفتار (n = 24(D0)، 25(D12) سلائسون/مختلف سورن مان گروپ) ۽ چوٽي آرام جي شرح (n=24(D0)، 25(D12) سلائسون/مختلف سورن مان گروپ). ٻن-ٽيل شاگردن جي ٽي-ٽيسٽ ڪنهن به پيرا ميٽر ۾ ڪو خاص فرق نه ڏيکاريو. f نمائندگي ڪندڙ دٻاءُ جو تجزيو ٽشو حصن جا نشان (ڳاڙهو) ۽ بغير (نيرو) برقي محرڪ سان، ساڳئي حصي مان ٽشو حصن جا ڏهه علائقائي علائقا. هيٺيون پينل مختلف حصن مان ڏهه علائقن ۾ برقي محرڪ سان ۽ بغير ٽشو حصن ۾ دٻاءُ ۾ سيڪڙو فرق جي مقدار کي ڏيکارين ٿا. (n = مختلف سورن مان 8 سلائسون/گروپ، ٻہ-ٽيل شاگرد ٽي-ٽيسٽ ڪيو ويو آهي؛ ****p < 0.0001، **p < 0.01، *p < 0.05). (n = مختلف سورن مان 8 سلائسون/گروپ، ٻہ-ٽيل شاگرد ٽي-ٽيسٽ ڪيو ويو آهي؛ ****p < 0.0001، **p < 0.01، *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента؛ ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,00,*p<0,001). (n = مختلف سورن مان 8 حصا/گروپ، ٻن پڇ وارن شاگردن جو ٽي-ٽيسٽ؛ ****p<0.0001، **p<0.01، *p<0.05). n = 8 片/组، 来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；**p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05）. n = 8 片/组، 来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；**p <0.0001,**p <0.01,*p <0.05）. (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента؛ ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 حصا/گروپ، مختلف سورن مان، ٻن پڇ وارن شاگردن جو ٽي-ٽيسٽ؛ ****p<0.0001، **p<0.01، *p<0.05).غلطي بار اوسط ± معياري انحراف جي نمائندگي ڪن ٿا.
اسان جي پوئين جامد بايوميميٽڪ دل جي سلائس ڪلچر سسٽم [20، 21] ۾، اسان برقي محرڪ لاڳو ڪندي ۽ وچولي ساخت کي بهتر بڻائي 6 ڏينهن تائين دل جي سلائسن جي استحڪام، ڪم ۽ ساخت جي سالميت کي برقرار رکيو. جڏهن ته، 10 ڏينهن کان پوءِ، اهي انگ اکر تيزيءَ سان گهٽجي ويا. اسان پنهنجي پوئين جامد بايوميميٽڪ ڪلچر سسٽم 20، 21 ڪنٽرول حالتن (Ctrl) ۾ ڪلچر ٿيل حصن جو حوالو ڏينداسين ۽ اسان پنهنجي اڳوڻي بهتر ڪيل وچولي کي MC حالتن ۽ هڪ ئي وقت ميڪيڪل ۽ برقي محرڪ (CTCM) تحت ڪلچر طور استعمال ڪنداسين. سڏيو ويندو آهي. پهرين، اسان اهو طئي ڪيو ته برقي محرڪ کان سواءِ ميڪيڪل محرڪ 6 ڏينهن تائين ٽشو جي عملداري کي برقرار رکڻ لاءِ ڪافي نه هو (ضمني شڪل 3a، b). دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، STCM استعمال ڪندي فزيو-مڪينيڪل ۽ برقي محرڪ جي تعارف سان، 12 ڏينهن جي دل جي حصن جي عملداري MS حالتن هيٺ تازي دل جي حصن وانگر رهي، پر Ctrl حالتن هيٺ نه، جيئن MTT تجزيو (شڪل 1) پاران ڏيکاريل آهي. 3a). ان مان ظاهر ٿئي ٿو ته ڪارڊيڪ سائيڪل جي ميڪانياتي محرڪ ۽ سموليشن ٽشو سيڪشن کي اسان جي پوئين جامد ڪلچر سسٽم ۾ رپورٽ ڪيل کان ٻه ڀيرا وڌيڪ وقت تائين قابل عمل رکي سگهي ٿي. بهرحال، ڪارڊيڪ ٽروپونن ٽي ۽ ڪنڪسن 43 جي امونوليبلنگ ذريعي ٽشو سيڪشن جي ساخت جي سالميت جو جائزو ڏيکاريو ته ڪنڪسن 43 اظهار ڏينهن 12 تي MC ٽشوز ۾ ساڳئي ڏينهن ڪنٽرولن جي ڀيٽ ۾ تمام گهڻو وڌيڪ هو. تنهن هوندي به، يونيفارم ڪنڪسن 43 اظهار ۽ Z-ڊسڪ فارميشن مڪمل طور تي برقرار نه رکيا ويا (شڪل 3b). اسان ٽشو جي جوڙجڪ جي سالميت 26 کي مقدار ڏيڻ لاءِ هڪ مصنوعي ذهانت (AI) فريم ورڪ استعمال ڪندا آهيون، هڪ تصوير تي ٻڌل ڊيپ لرننگ پائپ لائن ٽروپونن-ٽي ۽ ڪنڪسن اسٽيننگ 43 تي ٻڌل آهي ته جيئن مقامي ڪرڻ جي طاقت جي لحاظ کان دل جي سلائسن جي ساخت جي سالميت ۽ فلوروسينس کي خودڪار طريقي سان مقدار ۾ رکي سگهجي. هي طريقو هڪ ڪنوولوشنل نيورل نيٽ ورڪ (CNN) ۽ هڪ ڊيپ لرننگ فريم ورڪ استعمال ڪري ٿو ته جيئن دل جي ٽشو جي ساخت جي سالميت کي قابل اعتماد طور تي خودڪار ۽ غير جانبدار انداز ۾ مقدار ۾ رکي سگهجي، جيئن حوالي ۾ بيان ڪيو ويو آهي. 26. ايم سي ٽشو جامد ڪنٽرول سيڪشن جي مقابلي ۾ ڏينهن 0 سان بهتر ساخت جي هڪجهڙائي ڏيکاري. ان کان علاوه، ميسن جي ٽرائي ڪروم اسٽيننگ ڪلچر جي 12 هين ڏينهن تي ڪنٽرول حالتن جي مقابلي ۾ ايم ايس حالتن ۾ فائبروسس جو هڪ خاص طور تي گهٽ سيڪڙو ظاهر ڪيو (شڪل 3c). جڏهن ته سي ٽي سي ايم 12 هين ڏينهن تي دل جي ٽشو حصن جي استحڪام کي تازي دل جي ٽشو جي برابر سطح تائين وڌايو، ان دل جي حصن جي ساخت جي سالميت کي خاص طور تي بهتر نه ڪيو.
هڪ بار گراف 12 ڏينهن لاءِ تازي دل جي سلائسن (D0) يا دل جي سلائسن ڪلچر جي MTT جي عملداري جي مقدار کي ڏيکاري ٿو يا ته جامد ڪلچر (D12 Ctrl) ۾ يا CTCM (D12 MC) ۾ (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl)، 12 (D12 MC) سلائسن/مختلف سورن مان گروپ، هڪ طرفي ANOVA ٽيسٽ ڪئي وئي آهي؛ ####p < 0.0001 D0 جي مقابلي ۾ ۽ **p < 0.01 D12 Ctrl جي مقابلي ۾). هڪ بار گراف 12 ڏينهن لاءِ تازي دل جي سلائسن (D0) يا دل جي سلائسن ڪلچر جي MTT جي قابل عمل هجڻ جي مقدار کي ڏيکاري ٿو يا ته جامد ڪلچر (D12 Ctrl) ۾ يا CTCM (D12 MC) ۾ (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl)، 12 (D12 MC) سلائسن/مختلف سورن مان گروپ، هڪ طرفي ANOVA ٽيسٽ ڪئي وئي آهي؛ ####p < 0.0001 D0 جي مقابلي ۾ ۽ **p < 0.01 D12 Ctrl جي مقابلي ۾).هسٽوگرام مختلف سورن مان 12 ڏينهن لاءِ ايم ٽي ٽي فريش هارٽ سيڪشنز (ڊي0) يا دل جي سيڪشنز جي ڪلچر جي مقدار کي ڏيکاري ٿو يا ته جامد ڪلچر (ڊي12 ڪنٽرول) يا سي ٽي سي ايم (ڊي12 ايم سي) (اين = 18 (ڊي0)، 15 (ڊي12 ڪنٽرول))، 12 (ڊي12 ايم سي) سيڪشنز/گروپ ۾، هڪ طرفي اينووا ٽيسٽ ڪئي ويندي آهي؛####p <0,0001 по сравнению с D0 ۽ **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 D0 جي مقابلي ۾ ۽ **p < 0.01 D12 Ctrl جي مقابلي ۾). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC)相比،####p < 0.0001، 与D12 Ctrl 相比، **p <0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组,进行单向ANOVA 测试；与D0 相比,###p <0.0001，Ctrl**D12,与p.هسٽوگرام جيڪو تازي دل جي حصن (D0) يا دل جي حصن ۾ MTT جي قابليت جي مقدار کي ڏيکاري ٿو جيڪو جامد ڪلچر (D12 ڪنٽرول) يا CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)، 15 (D12 ڪنٽرول))، 12 (D12 MC) حصن/مختلف سورن مان گروپ ۾ 12 ڏينهن لاءِ ڪلچر ڪيو ويو آهي، هڪ طرفي ANOVA ٽيسٽ؛####p <0,0001 по сравнению с D0، **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 D0 جي مقابلي ۾، **p < 0.01 D12 Ctrl جي مقابلي ۾).b ٽروپونن-ٽي (سائي)، ڪنيڪسين 43 (ڳاڙهو) ۽ DAPI (نيرو) تازو الڳ ٿيل دل جي حصن (D0) يا دل جي حصن ۾ جيڪي جامد حالتن (Ctrl) يا CTCM حالتن (MC) ۾ 12 ڏينهن لاءِ ڪلچر ڪيا ويا آهن) نمائندگي ڪندڙ اميونو فلوروسينس تصويرن (خالي پيماني = 100 µm). دل جي ٽشو جي ساخت جي سالميت جي مصنوعي ذهانت جي مقدار (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) سلائسس/گروپ هر هڪ مختلف سور مان، هڪ طرفي ANOVA ٽيسٽ ڪئي وئي آهي؛ ####p < 0.0001 D0 جي مقابلي ۾ ۽ ****p < 0.0001 D12 Ctrl جي مقابلي ۾). دل جي ٽشو جي ساخت جي سالميت جي مصنوعي ذهانت جي مقدار (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) سلائسس/گروپ هر هڪ مختلف سور مان، هڪ طرفي ANOVA ٽيسٽ ڪئي وئي آهي؛ ####p < 0.0001 D0 جي مقابلي ۾ ۽ ****p < 0.0001 D12 Ctrl جي مقابلي ۾). ڪوليچسٽ ويننايا اوزانڪا اسٽرڪچرنائي سيلوسٽن ٽيڪني искусственным интеллектом (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5/12 ايم سي پيز разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA؛ ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p <0,0001 по сравнению). مصنوعي ذهانت (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) مختلف سورن مان سيڪشن/گروپ، هڪ طرفي ANOVA ٽيسٽ ڪيو ويو؛ ####p < 0.0001 بمقابلہ D0 ۽ ****p < 0.0001 سان D12 Ctrl جي مقابلي ۾) ذريعي دل جي ٽشو جي ساخت جي سالميت جو مقدار.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) سلائس/گروپ هر هڪ مختلف سور، هڪ طرفو ANOVA test.相比،****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) سلائسس/گروپ هر هڪ مختلف سور، هڪ طرفو ANOVA test. ##0p0;与D0相比،****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl/D05)، каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA؛ ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p <0,0001 по сравнению сl12). دل جي ٽشو جي ساخت جي سالميت کي ماپڻ لاءِ مصنوعي ذهانت (n = 7 (D0)، 7 (D12 Ctrl)، 5 (D12 MC) سيڪشن/گروپ هر هڪ مختلف سور، هڪ طرفي ANOVA ٽيسٽ؛ ####p<0.0001 بمقابلہ .D0 مقابلي لاءِ ****p < 0.0001 D12 Ctrl جي مقابلي ۾). c ميسن جي ٽرائيڪروم اسٽين سان داغدار دل جي سلائسن لاءِ نمائندگي ڪندڙ تصويرون (کاٻي) ۽ مقدار (ساڄي) (اسڪيل بيئر = 500 µm) (n = 10 سلائسون/گروپ هر هڪ مختلف سور مان، هڪ طرفي ANOVA ٽيسٽ ڪئي وئي آهي؛ ####p < 0.0001 D0 جي مقابلي ۾ ۽ ***p < 0.001 D12 جي مقابلي ۾ Ctrl). c ميسن جي ٽرائيڪروم اسٽين سان داغدار دل جي سلائسن لاءِ نمائندگي ڪندڙ تصويرون (کاٻي) ۽ مقدار (ساڄي) (اسڪيل بيئر = 500 µm) (n = 10 سلائسون/گروپ هر هڪ مختلف سور مان، هڪ طرفي ANOVA ٽيسٽ ڪئي وئي آهي؛ #### p < 0.0001 D0 جي مقابلي ۾ ۽ ***p < 0.001 D12 جي مقابلي ۾ Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красибатеных покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест انووا؛ #### p <0,000p *** D <0,0001 0,001 پو ڊي 12 Ctrl سان سروي). c ميسن جي ٽرائيڪروم اسٽين سان داغدار دل جي حصن جون نمائندگي ڪندڙ تصويرون (کاٻي) ۽ مقدار (ساڄي) (غير ڪوٽيڊ اسڪيل = 500 µm) (n = مختلف سورن مان 10 حصا/گروپ، هڪ طرفي ANOVA ٽيسٽ ڪئي وئي؛ #### p < 0 .0001 D0 جي مقابلي ۾ ۽ ***p < 0.001 D12 Ctrl جي مقابلي ۾). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（0¼n0m0¼n = 裸尺度=个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向انووا 测试；#### p <0.0001 与D0 相比，***p <0.0.1 . C 用 masson 三色染料的心脏切片的代表性（左左）量化（右）裸尺度度度度裸小裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单勛 单向 单勐 انووا 0.0001 与 ڊي 0 相比، ***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）. ج ريپريزينٽيٽيوني ايزوبراجينيا (слева) и colichественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихнамным краситкатем 500 mkm) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного однофакторного дисперсионного ##### 0,0001 پو сравнению с D0، ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c دل جي حصن جون نمائندگي ڪندڙ تصويرون (کاٻي) ۽ مقدار (ساڄي) جيڪي ميسن جي ٽرائي ڪروم داغ سان داغدار آهن (خالي = 500 µm) (n = 10 حصا/گروپ، هر هڪ مختلف سور مان، ويرينس جي هڪ طرفي تجزيي ذريعي جانچيو ويو آهي؛### # p < 0.0001 D0 جي مقابلي ۾، ***p < 0.001 D12 جي مقابلي ۾ Ctrl).غلطي بار اوسط ± معياري انحراف جي نمائندگي ڪن ٿا.
اسان اهو تصور ڪيو ته ڪلچر ميڊيم ۾ ننڍڙن ماليڪيولن کي شامل ڪرڻ سان، ڪارڊيو مايو سائٽ جي سالميت کي بهتر بڻائي سگهجي ٿو ۽ CTCM ڪلچر دوران فائبروسس جي ترقي کي گهٽائي سگهجي ٿو. تنهن ڪري اسان پنهنجي جامد ڪنٽرول ڪلچر 20,21 استعمال ڪندي ننڍڙن ماليڪيولن جي اسڪريننگ ڪئي ڇاڪاڻ ته گهٽ تعداد ۾ مونجهارو پيدا ڪندڙ عنصر هئا. هن اسڪرين لاءِ ڊيڪساميٿاسون (ڊيڪس)، ٽرائيوڊوٿائيرونين (T3)، ۽ SB431542 (SB) کي چونڊيو ويو. اهي ننڍڙا ماليڪيول اڳ ۾ hiPSC-CM ڪلچر ۾ استعمال ڪيا ويا آهن ته جيئن سارڪومير جي ڊيگهه، ٽي-ٽيوبلز، ۽ وهڪري جي رفتار کي وڌائي ڪارڊيو مايو سائٽس جي پختگي کي وڌايو وڃي. ان کان علاوه، ڊيڪس (هڪ گلوڪوڪارٽيڪائيڊ) ۽ SB ٻئي سوزش کي دٻائڻ لاءِ سڃاتل آهن 29,30. تنهن ڪري، اسان جانچ ڪئي ته ڇا انهن ننڍڙن ماليڪيولن جي هڪ يا ميلاپ کي شامل ڪرڻ سان دل جي حصن جي ساخت جي سالميت بهتر ٿيندي. شروعاتي اسڪريننگ لاءِ، هر مرڪب جي دوز کي سيل ڪلچر ماڊلز ۾ عام طور تي استعمال ٿيندڙ ڪنسنٽريشن جي بنياد تي چونڊيو ويو (1 μM Dex27، 100 nM T327، ۽ 2.5 μM SB31). 12 ڏينهن جي ڪلچر کان پوءِ، T3 ۽ Dex جي ميلاپ جي نتيجي ۾ بهترين ڪارڊيوميوسائيٽ جي جوڙجڪ جي سالميت ۽ گهٽ ۾ گهٽ فائبرس ريموڊلنگ (ضمني شڪل 4 ۽ 5) ٿي. ان کان علاوه، T3 ۽ Dex جي انهن ڪنسنٽريشن کي ٻيڻو يا ٻيڻو ڪرڻ جي استعمال عام ڪنسنٽريشن جي مقابلي ۾ نقصانڪار اثر پيدا ڪيا (اضافي شڪل 6a، b).
شروعاتي اسڪريننگ کان پوءِ، اسان 4 ڪلچر جي حالتن جو هڪ سر کان مٿي مقابلو ڪيو (شڪل 4a): Ctrl: دل جا حصا اسان جي اڳ ۾ بيان ڪيل جامد ڪلچر ۾ اسان جي اصلاح ٿيل وچولي استعمال ڪندي ڪلچر ڪيا ويا؛ 20.21 TD: T3 ۽ Ctrl اربع تي ڊيڪس شامل ڪيو ويو؛ MC: دل جا حصا اسان جي اڳ ۾ اصلاح ٿيل وچولي استعمال ڪندي CTCM ۾ ڪلچر ڪيا ويا؛ ۽ MT: T3 ۽ ڊيڪس سان CTCM وچولي ۾ شامل ڪيو ويو. 12 ڏينهن جي پوک کان پوءِ، MS ۽ MT ٽشوز جي عملداري MTT ٽيسٽ (شڪل 4b) پاران جائزو ورتل تازي ٽشوز جي برابر رهي. دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، ٽرانس ويل ڪلچرز (TD) ۾ T3 ۽ ڊيڪس جي اضافي سان Ctrl حالتن جي مقابلي ۾ عملداري ۾ اهم بهتري نه آئي، جيڪا دل جي حصن جي عملداري کي برقرار رکڻ ۾ ميڪيڪل محرڪ جي اهم ڪردار کي ظاهر ڪري ٿي.
هڪ تجرباتي ڊيزائن ڊاگرام جيڪو چار ڪلچر حالتن کي ڏيکاري ٿو جيڪي 12 ڏينهن تائين ميڊيم تي ميڪيڪل محرڪ ۽ T3/Dex سپليمينٽيشن جي اثرات جو جائزو وٺڻ لاءِ استعمال ڪيا ويا آهن. b بار گراف سڀني 4 ڪلچر حالتن (Ctrl، TD، MC، ۽ MT) ۾ ڪلچر کان پوءِ 12 ڏينهن جي عملداري جي مقدار کي ڏيکاري ٿو تازن دل جي سلائسن (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD ۽ D12 MT)، 12 (D12 MC) سلائسن/گروپ جي مقابلي ۾ مختلف سورن مان، هڪ طرفي ANOVA ٽيسٽ ڪئي وئي آهي؛ ####p < 0.0001، ###p < 0.001 D0 جي مقابلي ۾ ۽ **p < 0.01 D12 Ctrl جي مقابلي ۾). b بار گراف سڀني 4 ڪلچر حالتن (Ctrl، TD، MC، ۽ MT) ۾ ڪلچر کان پوءِ 12 ڏينهن جي عملداري جي مقدار کي ڏيکاري ٿو تازن دل جي سلائسن (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD ۽ D12 MT)، 12 (D12 MC) سلائسن/مختلف سورن جي گروپ جي مقابلي ۾، هڪ طرفي ANOVA ٽيسٽ ڪئي وئي آهي؛ ####p < 0.0001، ###p < 0.001 D0 جي مقابلي ۾ ۽ **p < 0.01 D12 ctrl جي مقابلي ۾). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 усеховирования (ڪنٽرول، TD، MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD ۽ D12 MT)، 12/DMC 12 نزاڪت وارو ، پيشو односторонний тест انووا؛ ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0 ۽ **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b بار گراف سڀني 4 ڪلچر حالتن (ڪنٽرول، ٽي ڊي، ايم سي، ۽ ايم ٽي) ۾ ڪلچر کان پوءِ 12 ڏينهن تي عمل جي مقدار کي ڏيکاري ٿو، تازو دل جي حصن (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD، ۽ D12 MT)، 12 (D12 MC) حصن/مختلف سورن مان گروپ، هڪ طرفي ANOVA ٽيسٽ؛ ####p < 0.0001، ###p < 0.001 بمقابله D0 ۽ **p < 0.01 D12 Ctrl جي مقابلي ۾). ب 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)18 (D0) TD 和D12 MT) 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p <0.0001，###p <0.0001，###p <0p <0.0** 0.01 与D12控制).ب 4 12 (ڊي 12 ايم سي) ب جِسٽوگرامما، پوکازِواوِيوِيَا 4 کان پوءِ условия культивирования (ڪونٽرول، TD، MC и MT) по сравнению со свежими срезами (со свежими срезами) 15 (D12 Ctrl, D12 TD ۽ D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001,0001, D0، **p <0,01 по сравнению (ڪنٽروليم D12 سان). b هسٽوگرام سڀني 4 ڪلچر حالتن (ڪنٽرول، ٽي ڊي، ايم سي ۽ ايم ٽي) کي تازي دل جي حصن (D0) (n = 18 (D0)، 15 (D12 Ctrl، D12 TD ۽ D12 MT) جي مقابلي ۾ ڏيکاري ٿو، مختلف سور 12 (D12 MC) حصن/گروپ مان، هڪ طرفي ANOVA ٽيسٽ؛ ####p<0.0001، ###p<0.001 بمقابله D0، **p<0.01 بمقابله ڪنٽرول D12). c بار گراف سڀني 4 ڪلچر حالتن (Ctrl، TD، MC، ۽ MT) ۾ گلوڪوز فلوڪس جي مقدار کي ڏيکاري ٿو تازو دل جي سلائسن (D0) جي مقابلي ۾ (n = 6 سلائسون/مختلف سورن مان گروپ، هڪ طرفي ANOVA ٽيسٽ ڪئي وئي آهي؛ ###p < 0.001، D0 جي مقابلي ۾ ۽ ***p < 0.001 D12 Ctrl جي مقابلي ۾). c بار گراف سڀني 4 ڪلچر حالتن (Ctrl، TD، MC، ۽ MT) ۾ گلوڪوز فلوڪس جي مقدار کي ڏيکاري ٿو تازو دل جي سلائسن (D0) جي مقابلي ۾ (n = 6 سلائسون/مختلف سورن مان گروپ، هڪ طرفي ANOVA ٽيسٽ ڪئي وئي آهي؛ ###p < 0.001، D0 جي مقابلي ۾ ۽ ***p < 0.001 D12 Ctrl جي مقابلي ۾). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 усеховирования (ڪنٽرول، TD، MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, онолноястей свиней, одноля свиней. انووا؛ ###p <0,001 по сравнению с D0 ۽ ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c هسٽوگرام سڀني 4 ڪلچر حالتن (ڪنٽرول، ٽي ڊي، ايم سي ۽ ايم ٽي) جي تحت گلوڪوز فلوڪس جي مقدار کي ڏيکاري ٿو تازو دل جي حصن (D0) جي مقابلي ۾ (n = 6 حصا/مختلف سورن مان گروپ، هڪ طرفي ANOVA ٽيسٽ ڪئي وئي؛ ###p < 0.001 D0 جي مقابلي ۾ ۽ ***p < 0.001 D12 Ctrl جي مقابلي ۾). سي 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比养切片天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行انووا 测试；###p <0.001,00p <0.0*0p <0.0**与D12 Ctrl 相比). سي 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片切片片培养 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， 猪 猪单 茡吡测试；###p <0.001،与D0 相比، ***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всеховирования для всехественную (ڪنٽرول، TD، MC ۽ MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, одроных свиней, одровных свиней ٽيسٽ انووا؛ ###p <0,001 по сравнению с D0, ***p <0,001 по сравнению с D12 (controll). c هسٽوگرام جيڪو سڀني 4 ڪلچر حالتن (ڪنٽرول، ٽي ڊي، ايم سي، ۽ ايم ٽي) لاءِ 12 ڏينهن جي پوسٽ ڪلچر تي گلوڪوز فلوڪس جي مقدار کي ڏيکاري ٿو تازو دل جي حصن (D0) جي مقابلي ۾ (n = 6 حصا/گروپ، مختلف سورن مان، هڪ طرفي ANOVA ٽيسٽ ڪيا ويا، ###p < 0.001 D0 جي مقابلي ۾، ***p < 0.001 D12 جي مقابلي ۾ (ڪنٽرول).d ڏهه علائقائي ٽشو سيڪشن پوائنٽس تي تازي (نيرو)، ڏينهن 12 ايم سي (سائي)، ۽ ڏينهن 12 ايم ٽي (ڳاڙهو) ٽشوز جي اسٽرين تجزيو پلاٽ (n = 4 سلائسون/گروپ، هڪ طرفي ANOVA ٽيسٽ؛ گروپن جي وچ ۾ ڪو به اهم فرق نه هو). اي آتش فشاني پلاٽ تازي دل جي حصن (D0) ۾ مختلف طور تي ظاهر ڪيل جين ڏيکاري ٿو دل جي حصن جي مقابلي ۾ جامد حالتن (Ctrl) يا MT حالتن (MT) جي تحت 10-12 ڏينهن لاءِ. f دل جي حصن لاءِ سارڪومير جين جو هيٽ ميپ هر ڪلچر جي حالتن هيٺ ڪلچر ڪيو ويو آهي. غلطي بار اوسط ± معياري انحراف جي نمائندگي ڪن ٿا.
فيٽي ايسڊ آڪسائيڊيشن کان گلائڪوليسس ڏانهن سوئچ تي ميٽابولڪ انحصار ڪارڊيوميوسائيٽ ڊي ڊفرنٽيئيشن جي هڪ خاصيت آهي. نابالغ ڪارڊيوميوسائٽس بنيادي طور تي ATP پيداوار لاءِ گلوڪوز استعمال ڪندا آهن ۽ انهن ۾ ڪجهه ڪرسٽي 5,32 سان هائپوپلاسٽڪ مائيٽوڪونڊريا هوندا آهن. گلوڪوز جي استعمال جي تجزين مان ظاهر ٿيو ته MC ۽ MT حالتن ۾، گلوڪوز جو استعمال ڏينهن 0 ٽشوز ۾ ساڳيو هو (شڪل 4c). جڏهن ته، Ctrl نمونن تازي ٽشو جي مقابلي ۾ گلوڪوز جي استعمال ۾ هڪ اهم واڌارو ڏيکاريو. اهو ظاهر ڪري ٿو ته CTCM ۽ T3/Dex جو ميلاپ ٽشو جي استحڪام کي وڌائي ٿو ۽ 12 ڏينهن جي ڪلچر ٿيل دل جي حصن جي ميٽابولڪ فينوٽائپ کي محفوظ رکي ٿو. ان کان علاوه، اسٽرين تجزيي مان ظاهر ٿيو ته اسٽرين جي سطح MT ۽ MS حالتن ۾ 12 ڏينهن تائين تازي دل جي ٽشوز ۾ ساڳي رهي (شڪل 4d).
ڪارڊيڪ سلائس ٽشو جي عالمي ٽرانسڪرپشنل منظرنامي تي CTCM ۽ T3/Dex جي مجموعي اثر جو تجزيو ڪرڻ لاءِ، اسان سڀني چئن مختلف ڪلچر حالتن مان ڪارڊيڪ سلائسن تي RNAseq ڪيو (ضمني ڊيٽا 1). دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، MT حصن تازي دل جي ٽشو سان اعلي ٽرانسڪرپشنل مماثلت ڏيکاري، 13,642 جين مان صرف 16 مختلف طور تي ظاهر ڪيا ويا. جڏهن ته، جيئن اسان اڳ ۾ ڏيکاريو، Ctrl سلائسن ڪلچر ۾ 10-12 ڏينهن کان پوءِ 1229 مختلف طور تي ظاهر ڪيل جين ڏيکاريا (شڪل 4e). انهن ڊيٽا جي تصديق دل ۽ فائبروبلاسٽ جين جي qRT-PCR ذريعي ڪئي وئي (ضمني شڪل 7a-c). دلچسپ ڳالهه اها آهي ته Ctrl حصن دل ۽ سيل سائيڪل جين جي گهٽتائي ۽ سوزش واري جين پروگرامن جي چالو ٿيڻ کي ڏيکاريو. اهي ڊيٽا تجويز ڪن ٿا ته ڊي ڊفرنٽيئيشن، جيڪو عام طور تي ڊگهي مدت جي ڪلچرنگ کان پوءِ ٿئي ٿو، مڪمل طور تي MT حالتن هيٺ گهٽجي ويندو آهي (ضمني شڪل 8a، b). سارڪومير جينز جي احتياط سان مطالعي مان ظاهر ٿيو ته صرف ايم ٽي حالتن ۾ سارڪومير (شڪل 4f) ۽ آئن چينل (ضمني شڪل 9) کي انڪوڊ ڪندڙ جين محفوظ آهن، انهن کي Ctrl، TD، ۽ MC حالتن هيٺ دٻائڻ کان بچائيندا آهن. اهي ڊيٽا ظاهر ڪن ٿا ته ميڪيڪل ۽ هيومورل محرڪ (T3/Dex) جي ميلاپ سان، دل جي سلائس ٽرانسڪرپٽوم ڪلچر ۾ 12 ڏينهن کان پوءِ تازي دل جي سلائسن وانگر رهي سگهي ٿو.
انهن ٽرانسڪرپشنل نتيجن کي هن حقيقت جي حمايت حاصل آهي ته دل جي حصن ۾ ڪارڊيو مايو سائٽس جي ساختي سالميت 12 ڏينهن تائين MT حالتن ۾ بهترين طور تي محفوظ ڪئي ويندي آهي، جيئن برقرار ۽ مقامي ڪنڪسين 43 (شڪل 5a) پاران ڏيکاريل آهي. ان کان علاوه، MT حالتن ۾ دل جي حصن ۾ فائبروسس Ctrl جي مقابلي ۾ خاص طور تي گهٽجي ويو ۽ تازي دل جي حصن وانگر (شڪل 5b). اهي ڊيٽا ظاهر ڪن ٿا ته ميڪيڪل محرڪ ۽ T3/Dex علاج جو ميلاپ ڪلچر ۾ دل جي حصن ۾ دل جي جوڙجڪ کي مؤثر طريقي سان محفوظ رکي ٿو.
ٽروپونن-ٽي (سائي)، ڪنيڪسين 43 (ڳاڙهو)، ۽ ڊي اي پي آءِ (نيرو) جون نمائندگي ڪندڙ اميونو فلوروسينس تصويرون تازي طور تي الڳ ٿيل دل جي حصن (D0) ۾ يا سڀني چئن دل جي حصي جي ڪلچر حالتن ۾ 12 ڏينهن لاءِ ڪلچر ڪيون ويون آهن (اسڪيل بار = 100 µm). دل جي ٽشو جي ساخت جي سالميت (n = 7 (D0 ۽ D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC ۽ D12 MT) جي مصنوعي ذهانت جي مقدار کي مختلف سورن مان سلائسس/گروپ، هڪ طرفي ANOVA ٽيسٽ ڪئي وئي آهي؛ ####p < 0.0001 D0 جي مقابلي ۾ ۽ *p < 0.05، يا ****p < 0.0001 D12 Ctrl جي مقابلي ۾). دل جي ٽشو جي ساخت جي سالميت (n = 7 (D0 ۽ D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC ۽ D12 MT) جي مصنوعي ذهانت جي مقدار کي مختلف سورن مان سلائسس/گروپ، هڪ طرفي ANOVA ٽيسٽ ڪئي وئي آهي؛ #### p < 0.0001 D0 جي مقابلي ۾ ۽ *p < 0.05، يا ****p < 0.0001 D12 Ctrl جي مقابلي ۾). ڪوليچسٽ ويننايا اوزينڪا اسٽرڪچر ٽيڪني سيرڊزا کان پوءِ انٽليڪٽ (n = 7 (D0 ۽ D12 Ctrl12)، ڊي ايم سي ٽي ڊي 12، ڊي ايم سي ڊي 12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA؛ #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p <000*, ***00* ڊي 12 Ctrl سان سروي). مختلف سورن مان مصنوعي ذهانت (n = 7 (D0 ۽ D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC ۽ D12 MT) سيڪشن/گروپ استعمال ڪندي دل جي ٽشو جي ساخت جي سالميت جو مقدار، هڪ طرفي ANOVA ٽيسٽ ڪيو ويو؛ #### p < 0.0001 D0 جي مقابلي ۾ ۽ *p < 0.05 يا ****p < 0.0001 D12 Ctrl جي مقابلي ۾).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD, D12 MC 和D12 ميٽرڪ 0.0001 与D12 Ctrl 相比).对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 廉 12 mc人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p < 0.0001 与D0 和*p <0.0001 与D0 和*p <0.0001 0.0001 与D12 Ctrl 相比).هڪ طرفي ANOVA ٽيسٽ سان مختلف سورن (n = 7 (D0 ۽ D12 Ctrl)، 5 (D12 TD، D12 MC ۽ D12 MT) حصن/گروپ) ۾ مصنوعي ذهانت استعمال ڪندي دل جي ٽشو جي ساخت جي سالميت جو مقدار؛#### p <0,0001 по сравнению с D0 ۽ *p <0,05 يا ****p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 D0 جي مقابلي ۾ ۽ *p < 0.05 يا ****p < 0.0001 D12 جي مقابلي ۾ Ctrl). b ميسن جي ٽرائيڪروم اسٽين (اسڪيل بار = 500 µm) سان داغدار دل جي سلائسن لاءِ نمائندگي ڪندڙ تصويرون ۽ مقدار جي تصديق (n = 10 (D0، D12 Ctrl، D12 TD، ۽ D12 MC)، مختلف سورن مان 9 (D12 MT) سلائسون/گروپ، هڪ طرفي ANOVA ٽيسٽ ڪئي وئي آهي؛ ####p < 0.0001 D0 جي مقابلي ۾ ۽ ***p < 0.001، يا ****p < 0.0001 D12 Ctrl جي مقابلي ۾). b ميسن جي ٽرائيڪروم اسٽين (اسڪيل بار = 500 µm) سان داغدار دل جي سلائسن لاءِ نمائندگي ڪندڙ تصويرون ۽ مقدار جي تصديق (n = 10 (D0، D12 Ctrl، D12 TD، ۽ D12 MC)، مختلف سورن مان 9 (D12 MT) سلائسون/گروپ، هڪ طرفي ANOVA ٽيسٽ ڪئي وئي آهي؛ ####p < 0.0001 D0 جي مقابلي ۾ ۽ ***p < 0.001، يا ****p < 0.0001 D12 Ctrl جي مقابلي ۾). ب ريپريزينٽيٽيوني ايزوبراجينيا ۽ ڪوليچسٽ ويننايا اوزينڪا sрезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона ( мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ۽ D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторон, выполняется односторон; по сравнению с D0 ۽ ***p < 0,001 يا ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b نمائندگي ڪندڙ تصويرون ۽ دل جي حصن جي مقدار جيڪي ميسن جي ٽرائيڪروم داغ سان داغدار آهن (اسڪيل بار = 500 µm) (n = 10 (D0، D12 Ctrl، D12 TD ۽ D12 MC)، 9 (D12 MT) سيڪشن/مختلف سورن مان گروپ، هڪ طرفي ANOVA ڪئي وئي؛ ####p < 0.0001 بمقابله D0 ۽ ***p < 0.001 يا ****p < 0.0001 بمقابله D12 Ctrl). ب 用ميسن 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺=500 µm）（n = 10D Ctrl 、D12 TD 和D12 MC）,来自不同猪的9个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分因素方差分 00##0p相比،***p <0.001،或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比). ب 用 ماسن 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） 1 d = 500 µm） d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片切片切片切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p <0.0001D**p <0.0001D* 0.001، 或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）. ب ريپريزينٽيٽيوشن изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона = 50mk (50) (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p <0,000,0001 0,001 يا ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b ميسن جي ٽرائي ڪروم (اسڪيل بار = 500 µm) سان داغدار دل جي حصن جي نمائندگي ڪندڙ تصويرون ۽ مقدار جي تصديق (n = 10 (D0، D12 Ctrl، D12 TD ۽ D12 MC)، مختلف سور/گروپ مان 9 (D12 MT) حصا، هڪ ANOVA طريقو؛ ####p < 0.0001 D0 جي مقابلي ۾، ***p < 0.001 يا ****p < 0.0001 D12 Ctrl جي مقابلي ۾).غلطي بار اوسط ± معياري انحراف جي نمائندگي ڪن ٿا.
آخرڪار، ڪارڊيڪ هائپرٽروفي جي نقل ڪرڻ لاءِ CTCM جي صلاحيت جو جائزو ڪارڊيڪ ٽشو اسٽريچ وڌائڻ سان ورتو ويو. CTCM ۾، چوٽي ايئر چيمبر پريشر 80 mmHg کان 80 mmHg تائين وڌي ويو. آرٽ. (عام اسٽريچ) 140 mmHg تائين آرٽ. (شڪل 6a). هي اسٽريچ ۾ 32٪ واڌ سان مطابقت رکي ٿو (شڪل 6b)، جيڪو اڳ ۾ دل جي حصن لاءِ گهربل لاڳاپيل سيڪڙو اسٽريچ جي طور تي ڏيکاريو ويو هو جيڪو هائپرٽروفي ۾ ڏٺو ويو آهي. ڇهن ڏينهن جي ڪلچر دوران ڇڪتاڻ ۽ آرام دوران دل جي ٽشو جي اسٽريچ ۽ رفتار مسلسل رهي (شڪل 6c). MT حالتن مان ڪارڊيڪ ٽشو کي ڇهن ڏينهن لاءِ نارمل اسٽريچ (MT (عام)) يا اوور اسٽريچ حالتن (MT (OS)) جي تابع ڪيو ويو. ڪلچر ۾ چار ڏينهن کان پوءِ، هائپرٽروفڪ بايو مارڪر NT-ProBNP MT (عام) حالتن (شڪل 7a) جي مقابلي ۾ MT (OS) حالتن هيٺ وچولي ۾ خاص طور تي بلند ڪيو ويو هو. ان کان علاوه، ڇهن ڏينهن جي ڪلچرنگ کان پوءِ، MT (OS) (شڪل 7b) ۾ سيل سائيز MT دل جي حصن (عام) جي مقابلي ۾ خاص طور تي وڌي وئي. ان کان علاوه، NFATC4 نيوڪليئر ٽرانسلوڪشن اوور اسٽريچڊ ٽشوز (شڪل 7c) ۾ خاص طور تي وڌي وئي. اهي نتيجا هائپر ڊسٽينشن کان پوءِ پيٿولوجيڪل ريموڊلنگ جي ترقي پسند ترقي کي ظاهر ڪن ٿا ۽ ان تصور جي حمايت ڪن ٿا ته CTCM ڊوائيس کي اسٽريچ-انڊيوسڊ ڪارڊيڪ هائپر ٽرافي سگنلنگ جي مطالعي لاءِ پليٽ فارم طور استعمال ڪري سگهجي ٿو.
هوا جي چيمبر جي دٻاءُ، فلوئڊ چيمبر جي دٻاءُ، ۽ ٽشو جي حرڪت جي ماپن جا نمائندا نشان تصديق ڪن ٿا ته چيمبر جو دٻاءُ فلوئڊ چيمبر جي دٻاءُ کي تبديل ڪري ٿو، جنهن جي ڪري ٽشو سلائس جي هڪجهڙي حرڪت ٿئي ٿي. b عام طور تي اسٽريچ ٿيل (نارنگي) ۽ اوور اسٽريچ ٿيل (نيرو) ٽشو سيڪشن لاءِ نمائندا اسٽريچ فيصد ۽ اسٽريچ ريٽ وکر. c بار گراف ڏيکاري ٿو چڪر جو وقت (n = 19 سلائس في گروپ، مختلف سورن مان)، سڪون جو وقت (n = 18-19 سلائس في گروپ، مختلف سورن مان)، آرام جو وقت (n = 19 سلائس في گروپ، مختلف سورن مان)، ٽشو جي حرڪت جو طول و عرض (n = 14 سلائس/گروپ، مختلف سورن مان)، چوٽي سسٽولڪ رفتار (n = 14 سلائس/گروپ، مختلف سورن مان) ۽ چوٽي آرام جي شرح (n = 14 (D0)، 15 (D6)) سيڪشن/گروپ) مختلف سورن مان)، ٻن دم وارن شاگردن جي ٽي-ٽيسٽ ڪنهن به پيرا ميٽر ۾ ڪو خاص فرق نه ڏيکاريو، اهو ظاهر ڪري ٿو ته اهي پيرا ميٽر اوور وولٽيج سان ڪلچر جي 6 ڏينهن دوران مستقل رهيا. غلطي بار اوسط ± معياري انحراف جي نمائندگي ڪن ٿا.
مختلف سورن مان MT نارمل اسٽريچ (Norm) يا اوور اسٽريچنگ (OS) حالتن (n = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm، ۽ D4 MTOS) سلائسن/گروپ مان ڪلچر ميڊيا ۾ NT-ProBNP ڪنسنٽريشن جو بار گراف مقدار، ٻه طرفي ANOVA ڪيو ويندو آهي؛ **p < 0.01 عام اسٽريچ جي مقابلي ۾). MT نارمل اسٽريچ (Norm) يا اوور اسٽريچنگ (OS) حالتن (n = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm، ۽ D4 MTOS) سلائسن/گروپ مختلف سورن مان ڪلچر ڪيل دل جي سلائسن مان ڪلچر ميڊيا ۾ NT-ProBNP ڪنسنٽريشن جو بار گراف مقدار، ٻه طرفي ANOVA ڪيو ويندو آهي؛ **p < 0.01 عام اسٽريچ جي مقابلي ۾).عام MT اسٽريچ (عام) يا اوور اسٽريچ (OS) (n = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm، ۽ D4).MTOS) سلائسس / گروپ جي حالتن هيٺ ڪلچر ڪيل دل جي سلائسن مان ڪلچر ميڊيم ۾ NT-ProBNP ڪنسنٽريشن جو مقداري هسٽوگرام مختلف سورن مان، ويرينس جو ٻه عنصر تجزيو ڪيو ويندو آهي؛**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 عام اسٽريچ جي مقابلي ۾). هڪ 在MT 正常拉伸 (نارم) 或过度拉伸 (OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度曢坡4 (D2 MTNorm)، 3（D2 MTOS، D4 MTNorm ۽ D4 MTOS）来自不同猪的切片/组,进行双向方差分析；**与正常拉伸相比,p < 0.01). دل جي سلائسن ۾ NT-ProBNP ڪنسنٽريشن جو مقدار MT نارمل اسٽريچ (نارم) يا اوور اسٽريچ (OS) حالتن هيٺ ڪلچر ڪيو ويو (n = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm和D4 MTOS) مختلف مان.猪的切片/组，可以双向方方发发动؛ **عام اسٽريچنگ جي مقابلي ۾، p <0.01).مختلف سورن مان نارمل MT اسٽريچ (نارمل) يا اوور اسٽريچ (OS) (n = 4 (D2 MTNorm)، 3 (D2 MTOS، D4 MTNorm) ۽ D4 MTOS) سلائسس/گروپ جي حالتن هيٺ ڪلچر ڪيل دل جي سلائسن ۾ NT-ProBNP ڪنسنٽريشن جو هسٽوگرام مقدار، ويرينس جو ٻه طرفو تجزيو؛**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 عام اسٽريچ جي مقابلي ۾). b دل جي سلائسن لاءِ نمائندگي ڪندڙ تصويرون جيڪي ٽروپونن-ٽي ۽ WGA (کاٻي پاسي) سان داغدار آهن ۽ سيل سائيز جي مقدار (ساڄي پاسي) (n = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) سيلز/گروپ مختلف سورن مان 10 مختلف سلائسن مان، ٻه-ٽيل شاگرد ٽي-ٽيسٽ ڪيو ويو آهي؛ ****p < 0.0001 عام اسٽريچ جي مقابلي ۾). b دل جي سلائسن لاءِ نمائندگي ڪندڙ تصويرون جيڪي ٽراپونين-ٽي ۽ WGA (کاٻي) سان داغدار آهن ۽ سيل سائيز جي مقدار (ساڄي) (n = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) سيلز/گروپ مختلف سورن مان 10 مختلف سلائسن مان، ٻه-ٽيل شاگرد ٽي-ٽيسٽ ڪيو ويو آهي؛ ****p < 0.0001 عام اسٽريچ جي مقابلي ۾). ب ريپريزينٽيٽيوشن изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного определения (разовения) 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) ڪليٽوڪ/گروپپ из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-* 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b دل جي حصن جون نمائندگي ڪندڙ تصويرون جيڪي ٽروپونين-ٽي ۽ اي زي پي (کاٻي) سان رنگيل آهن ۽ سيل سائيز جي مقدار (ساڄي) (n = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) سيلز/گروپ مختلف سورن مان 10 مختلف حصن مان، ٻن دم وارن شاگردن جو ٽي-ٽيسٽ ڪيو ويو؛ ****p < 0.0001 عام اسٽرين جي مقابلي ۾). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的心脏切片的代表性图n3） MTOS، 来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组,两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比،****p <0.0001）. b دل جي سلائسن جون نمائندگي ڪندڙ تصويرون جيڪي ڪيلڪيرين-ٽي ۽ WGA (کاٻي) ۽ سيل سائيز (ساڄي) سان رنگيل آهن (n = 330 (D6 MTOS)، 10 مختلف سلائسن مان 369 (D6 MTNorm)) سيلز/سطح، عام اسٽريچنگ جي مقابلي ۾، ****p < 0.0001). b REPREZентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и colichественная оценка размена (30) MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента, ***0*p01; нормальным (رستو). b دل جي حصن جون نمائندگي ڪندڙ تصويرون جيڪي ٽروپونن-ٽي ۽ AZP سان رنگيل آهن (کاٻي پاسي) ۽ سيل سائيز جي مقدار (ساڄي پاسي) (n = 330 (D6 MTOS)، 369 (D6 MTNorm) مختلف سورن جي 10 مختلف حصن مان) سيل/گروپ، ٻه-ٽيل معيار شاگردن جو t؛ ****p < 0.0001 عام اسٽرين جي مقابلي ۾). c ڏينهن 0 ۽ ڏينهن 6 MTOS دل جي سلائسن لاءِ نمائندگي ڪندڙ تصويرون جيڪي ٽراپونين-T ۽ NFATC4 لاءِ امونوليبل ٿيل آهن ۽ مختلف سورن مان CMs (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) سلائسن/گروپ جي نيوڪلئي ڏانهن NFATC4 جي منتقلي جي مقدار، ٻه-ٽيل شاگرد ٽي-ٽيسٽ ڪيو ويو آهي؛ *p < 0.05). c ڏينهن 0 ۽ ڏينهن 6 MTOS دل جي سلائسن لاءِ نمائندگي ڪندڙ تصويرون جيڪي ٽراپونين-ٽي ۽ NFATC4 لاءِ امونوليبل ٿيل آهن ۽ مختلف سورن مان CMs (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) سلائسن/گروپ جي نيوڪلئي ڏانهن NFATC4 جي منتقلي جي مقدار، ٻه-ٽيل شاگرد ٽي-ٽيسٽ ڪيو ويو آهي؛ *p < 0.05). سي ريپريزنٽيٽيشن изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS , иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4 , и конячена сердца TRANSLOKACII NFATC4 ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0) ۾، 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняевитерий клеток سٽيوڊينٽا؛ *p <0,05). c 0 ۽ 6 ڏينهن جي MTOS تي دل جي حصن لاءِ نمائندگي ڪندڙ تصويرون، ٽروپونين-T ۽ NFATC4 لاءِ امونوليبل ٿيل، ۽ غار جي سيلز جي نيوڪليس ۾ NFATC4 ٽرانسلوڪشن جي مقدار (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) سلائسس/مختلف سورن مان گروپ) ٻن دم وارن شاگردن جي ٽي ٽيسٽ ڪئي؛ *p < 0.05). سي 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0) ㇀3/MT进行双尾学生t 检验；*p <0.05). c نمائندن جون تصويرون calcanin-T ۽ NFATC4 امونولبلنگ 第0天和第6天MTOS دل جي سلائسن، ۽ NFATC4 کان مختلف NFATC4 易位至CM سيل نيوڪليس 的 مقدار 化 (n = 4 (D0) 化 (n = 4 (D0)، 廄 燄 / MT)时间双尾学生et 电影；*p <0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и конличацевести TRANSLOKAции NFATC4 ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Сть;05). c مختلف سورن مان CM جي نيوڪلئس ۾ ٽروپونن-T ۽ NFATC4 امونوليبلنگ ۽ NFATC4 ٽرانسلوڪشن جي مقدار جي لاءِ ڏينهن 0 ۽ 6 تي MTOS دل جي سلائسن جون نمائندگي ڪندڙ تصويرون (n = 4 (D0)، 3 (D6 MTOS) سلائسون/گروپ، ٻه-ٽيل ٽي-معيار شاگردن؛ *p < 0.05).غلطي بار مطلب ± معياري انحراف جي نمائندگي ڪن ٿا.
ترجمو ڪندڙ دل جي تحقيق لاءِ سيلولر ماڊل جي ضرورت آهي جيڪي دل جي ماحول کي صحيح طور تي ٻيهر پيدا ڪن. هن مطالعي ۾، هڪ CTCM ڊوائيس تيار ڪئي وئي ۽ ان جي خاصيت ڪئي وئي جيڪا دل جي الٽراٿن حصن کي متحرڪ ڪري سگهي ٿي. CTCM سسٽم ۾ جسماني طور تي هم وقت سازي ڪندڙ اليڪٽروميڪينيڪل محرڪ ۽ T3 ۽ ڊيڪس فلوئڊ افزودگي شامل آهن. جڏهن سور جي دل جا حصا انهن عنصرن جي سامهون آيا، ته انهن جي عملداري، ساخت جي سالميت، ميٽابولڪ سرگرمي، ۽ ٽرانسڪرپشنل اظهار 12 ڏينهن جي ڪلچر کان پوءِ تازي دل جي ٽشو وانگر رهيو. ان کان علاوه، دل جي ٽشو جي گهڻي ڇڪڻ هائپر ايڪسٽينشن جي ڪري دل جي هائپر ٽرافي جو سبب بڻجي سگهي ٿي. مجموعي طور تي، اهي نتيجا هڪ عام دل جي فينوٽائپ کي برقرار رکڻ ۾ جسماني ڪلچر جي حالتن جي اهم ڪردار جي حمايت ڪن ٿا ۽ دوا جي اسڪريننگ لاءِ هڪ پليٽ فارم فراهم ڪن ٿا.
ڪيترائي عنصر ڪارڊيو مايو سائٽس جي ڪم ڪرڻ ۽ بقا لاءِ هڪ بهترين ماحول پيدا ڪرڻ ۾ حصو وٺندا آهن. انهن عنصرن مان سڀ کان وڌيڪ واضح عنصر (1) انٽر سيلولر رابطي، (2) اليڪٽروميڪينيڪل محرڪ، (3) هيومرل عنصر، ۽ (4) ميٽابولڪ سبسٽريٽس سان لاڳاپيل آهن. جسماني سيل کان سيل رابطي لاءِ هڪ خارجي سيلولر ميٽرڪس جي مدد سان ڪيترن ئي سيل قسمن جي پيچيده ٽي-dimensional نيٽ ورڪ جي ضرورت هوندي آهي. اهڙا پيچيده سيلولر رابطي انفرادي سيل قسمن جي گڏيل ثقافت ذريعي ويٽرو ۾ ٻيهر تعمير ڪرڻ ڏکيو آهي، پر دل جي حصن جي آرگنوٽائپڪ فطرت کي استعمال ڪندي آساني سان حاصل ڪري سگهجي ٿو.
ڪارڊيو مايو سائٽس جي ميڪينيڪل اسٽريچ ۽ برقي محرک دل جي فينوٽائپ کي برقرار رکڻ لاءِ اهم آهن 33,34,35. جڏهن ته ميڪينيڪل محرک کي hiPSC-CM ڪنڊيشننگ ۽ پختگي لاءِ وڏي پيماني تي استعمال ڪيو ويو آهي، ڪيترن ئي خوبصورت مطالعي تازو ئي ثقافت ۾ دل جي سلائسن جي ميڪينيڪل محرک جي ڪوشش ڪئي آهي غير محوري لوڊنگ استعمال ڪندي. اهي مطالعي ڏيکارين ٿا ته 2D غير محوري ميڪينيڪل لوڊنگ ڪلچر دوران دل جي فينوٽائپ تي مثبت اثر وجهي ٿي. انهن مطالعي ۾، دل جي حصن کي يا ته isometric tensile forces17، linear auxotonic لوڊنگ18 سان لوڊ ڪيو ويو، يا دل جي چڪر کي فورس ٽرانسڊيوسر فيڊ بيڪ ۽ ٽينشن ڊرائيو استعمال ڪندي ٻيهر ٺاهيو ويو. بهرحال، اهي طريقا ماحولياتي اصلاح کان سواءِ غير محوري ٽشو اسٽريچ استعمال ڪندا آهن، جنهن جي نتيجي ۾ ڪيترن ئي دل جي جين کي دٻائڻ يا غير معمولي اسٽريچ ردعمل سان لاڳاپيل جين جي اوور ايڪسپريشن. هتي بيان ڪيل CTCM هڪ 3D اليڪٽروميڪيڪل محرک فراهم ڪري ٿو جيڪو قدرتي دل جي چڪر کي چڪر جي وقت ۽ جسماني اسٽريچ (25٪ اسٽريچ، 40٪ سسٽول، 60٪ ڊائسٽول، ۽ 72 بيٽس في منٽ) جي لحاظ کان نقل ڪري ٿو. جيتوڻيڪ هي ٽي-dimensional ميڪانياتي محرڪ صرف ٽشو جي سالميت کي برقرار رکڻ لاءِ ڪافي ناهي، T3/Dex استعمال ڪندي انساني ۽ ميڪانياتي محرڪ جو ميلاپ ٽشو جي استحڪام، ڪم ۽ سالميت کي مناسب طور تي برقرار رکڻ لاءِ گهربل آهي.
بالغن جي دل جي فينوٽائپ کي ماڊل ڪرڻ ۾ مزاحيه عنصر اهم ڪردار ادا ڪن ٿا. هي HiPS-CM مطالعي ۾ نمايان ڪيو ويو جنهن ۾ T3 ۽ Dex کي ڪلچر ميڊيا ۾ شامل ڪيو ويو ته جيئن سيل جي پختگي کي تيز ڪري سگهجي. T3 سيل جھلي ۾ امينو ايسڊ، شگر ۽ ڪيلشيم جي ٽرانسپورٽ تي اثر انداز ٿي سگهي ٿو 36. ان کان علاوه، T3 MHC-α اظهار ۽ MHC-β ڊائون ريگوليشن کي فروغ ڏئي ٿو، جنين CM ۾ سست ٽوچ مائيوفائبرلز جي مقابلي ۾ بالغ ڪارڊيوميوسائٽس ۾ تيز ٽوچ مائيوفائبرلز جي ٺهڻ کي فروغ ڏئي ٿو. هائپوٿايرائڊ مريضن ۾ T3 جي گهٽتائي جي نتيجي ۾ مائيوفائبرلر بينڊز جو نقصان ۽ ٽون ڊولپمينٽ جي گهٽ شرح 37 ٿئي ٿي. ڊيڪس گلوڪوڪارٽيڪوڊ ريڪٽرز تي ڪم ڪري ٿو ۽ الڳ ٿيل پرفيوز ٿيل دلين ۾ مايوڪارڊيل ڪانٽريڪٽي کي وڌائڻ لاءِ ڏيکاريو ويو آهي؛ 38 هن بهتري کي ڪيلشيم ڊپازٽ-ڊرائيون انٽري (SOCE) 39,40 تي اثر سان لاڳاپيل سمجهيو ويندو آهي. ان کان علاوه، ڊيڪس پنهنجي ريڪٽرز سان ڳنڍيل آهي، هڪ وسيع اندروني ردعمل جو سبب بڻجندو آهي جيڪو مدافعتي ڪم ۽ سوزش کي دٻائي ٿو 30.
اسان جا نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته جسماني ميڪيڪل محرڪ (MS) Ctrl جي مقابلي ۾ مجموعي ڪلچر ڪارڪردگي کي بهتر بڻايو، پر ڪلچر ۾ 12 ڏينهن تائين عملداري، ساخت جي سالميت، ۽ دل جي اظهار کي برقرار رکڻ ۾ ناڪام ٿيو. Ctrl جي مقابلي ۾، CTCM (MT) ڪلچر ۾ T3 ۽ Dex جي اضافي عملداري کي بهتر بڻايو ۽ 12 ڏينهن تائين تازي دل جي ٽشو سان ساڳي ٽرانسڪرپشن پروفائلز، ساخت جي سالميت، ۽ ميٽابولڪ سرگرمي کي برقرار رکيو. ان کان علاوه، ٽشو اسٽريچ جي درجي کي ڪنٽرول ڪندي، STCM استعمال ڪندي هڪ هائپر ايڪسٽينشن-انڊيوسڊ ڪارڊيڪ هائپر ٽرافي ماڊل ٺاهيو ويو، جيڪو STCM سسٽم جي ورسٽائلٽي کي بيان ڪري ٿو. اهو نوٽ ڪيو وڃي ته جيتوڻيڪ ڪارڊيڪ ريموڊلنگ ۽ فائبروسس عام طور تي برقرار عضون کي شامل ڪن ٿا جن جي گردش ڪندڙ سيلز مناسب سائيٽوڪائنز ۽ گڏوگڏ فيگوسائيٽوسس ۽ ٻيا ريموڊلنگ عنصر مهيا ڪري سگهن ٿا، دل جا حصا اڃا تائين دٻاءُ ۽ صدمي جي جواب ۾ فائبروٽڪ عمل جي نقل ڪري سگهن ٿا. مائيوفائبروبلاسٽس ۾. هن جو اڳ ۾ هن ڪارڊيڪ سلائس ماڊل ۾ جائزو ورتو ويو آهي. اهو نوٽ ڪيو وڃي ته CTCM پيرا ميٽرز کي دٻاءُ/اليڪٽريڪل ايمپليٽيوڊ ۽ فريڪوئنسي کي تبديل ڪندي ماڊل ڪري سگهجي ٿو ته جيئن ڪيترن ئي حالتن جهڙوڪ ٽيڪي ڪارڊيا، برڊي ڪارڊيا، ۽ ميڪيڪل گردش سپورٽ (ميڪنيڪل ان لوڊ ٿيل دل) کي نقل ڪري سگهجي. هي نظام کي دوا جي جاچ لاءِ هڪ وچولي ٿرو پُٽ بڻائي ٿو. اوور ايڪسرشن-انڊيوسڊ ڪارڊيڪ هائپر ٽرافي کي ماڊل ڪرڻ جي CTCM جي صلاحيت هن نظام کي ذاتي علاج لاءِ جانچڻ جو رستو هموار ڪري ٿي. نتيجي ۾، موجوده مطالعي مان ظاهر ٿئي ٿو ته ميڪيڪل اسٽريچ ۽ هيومرل محرڪ دل جي ٽشو حصن جي ڪلچر کي برقرار رکڻ لاءِ اهم آهن.
جيتوڻيڪ هتي پيش ڪيل ڊيٽا اهو ظاهر ڪري ٿو ته CTCM برقرار مايوڪارڊيم جي ماڊلنگ لاءِ هڪ تمام گهڻو اميد افزا پليٽ فارم آهي، هن ڪلچر جي طريقي ۾ ڪجهه حدون آهن. CTCM ڪلچر جي مکيه حد اها آهي ته اهو سلائسن تي مسلسل متحرڪ ميڪيڪل دٻاءُ لاڳو ڪري ٿو، جيڪو هر چڪر دوران دل جي سلائس جي ڇڪتاڻ کي فعال طور تي مانيٽر ڪرڻ جي صلاحيت کي روڪي ٿو. ان کان علاوه، دل جي حصن جي ننڍڙي سائيز (7 ملي ميٽر) جي ڪري، روايتي فورس سينسر استعمال ڪندي ڪلچر سسٽم کان ٻاهر سسٽولڪ فنڪشن جو جائزو وٺڻ جي صلاحيت محدود آهي. موجوده نسخي ۾، اسان آپٽيڪل وولٽيج کي ڪانٽريڪٽائل فنڪشن جي اشاري جي طور تي جائزو وٺڻ سان جزوي طور تي هن حد کي ختم ڪريون ٿا. بهرحال، هن حد کي وڌيڪ ڪم جي ضرورت پوندي ۽ مستقبل ۾ ڪلچر ۾ دل جي سلائسن جي ڪم جي آپٽيڪل مانيٽرنگ لاءِ طريقا متعارف ڪرائڻ سان حل ڪري سگهجي ٿو، جهڙوڪ ڪلسيم ۽ وولٽيج حساس رنگن کي استعمال ڪندي آپٽيڪل ميپنگ. CTCM جي هڪ ٻي حد اها آهي ته ڪم ڪندڙ ماڊل جسماني دٻاءُ (پري لوڊ ۽ آفٽر لوڊ) کي هٿي نه ٿو ڏئي. CTCM ۾، دٻاءُ مخالف طرفن ۾ پيدا ڪيو ويو ته جيئن تمام وڏي ٽشوز ۾ ڊائسٽول (مڪمل اسٽريچ) ۽ سسٽول (برقي محرڪ دوران ڇڪتاڻ جي ڊيگهه) ۾ 25٪ جسماني اسٽريچ کي ٻيهر پيدا ڪري سگهجي. مستقبل جي CTCM ڊيزائنن ۾ هن حد کي ٻنهي پاسن کان دل جي ٽشو تي مناسب دٻاءُ ۽ دل جي چيمبرن ۾ ٿيندڙ صحيح دٻاءُ-حجم رشتن کي لاڳو ڪندي ختم ڪيو وڃي.
هن مسودي ۾ رپورٽ ڪيل اوور اسٽريچ-انڊيوسڊ ريموڊلنگ هائپر ٽروفڪ هائپر اسٽريچ سگنلن جي نقل ڪرڻ تائين محدود آهي. تنهن ڪري، هي ماڊل هيومورل يا نيورل فيڪٽرز (جيڪي هن سسٽم ۾ موجود نه آهن) جي ضرورت کان سواءِ اسٽريچ-انڊيوسڊ هائپر ٽروفڪ سگنلنگ جي مطالعي ۾ مدد ڪري سگهي ٿو. CTCM جي ڪثرت کي وڌائڻ لاءِ وڌيڪ مطالعي جي ضرورت آهي، مثال طور، مدافعتي سيلز سان گڏ ڪلچرنگ، گردش ڪندڙ پلازما هيومورل فيڪٽرز، ۽ نيورونل سيلز سان گڏ ڪلچرنگ دوران انرويشن CTCM سان بيماري ماڊلنگ جي امڪانن کي بهتر بڻائيندو.
هن مطالعي ۾ تيرهن سور استعمال ڪيا ويا. سڀني جانورن جي طريقيڪار اداري جي هدايتن جي مطابق انجام ڏنو ويو ۽ يونيورسٽي آف لوئس ويل اداري جانورن جي سنڀال ۽ استعمال ڪميٽي پاران منظور ڪيو ويو. شہ رگ جي آرچ کي ڪلمپ ڪيو ويو ۽ دل کي 1 ليٽر جراثيم کان پاڪ ڪارڊيوپلجيا (110 ايم ايم NaCl، 1.2 ايم ايم CaCl2، 16 ايم ايم KCl، 16 ايم ايم MgCl2، 10 ايم ايم NaHCO3، 5 يو/ايم ايل هيپرين، پي ايڇ 7.4 تائين) سان پرفيوز ڪيو ويو. دليون برف جي ٿڌي ڪارڊيوپليجڪ محلول ۾ محفوظ ڪيون ويون جيستائين برف تي ليبارٽري ڏانهن منتقل نه ڪيون ويون، جيڪو عام طور تي <10 منٽ هوندو آهي. دليون برف جي ٿڌي ڪارڊيوپليجڪ محلول ۾ محفوظ ڪيون ويون جيستائين برف تي ليبارٽري ڏانهن منتقل نه ڪيون ويون، جيڪو عام طور تي <10 منٽ هوندو آهي. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. دليون برف تي ليبارٽري ڏانهن منتقل ٿيڻ تائين برف جي ٿڌي ڪارڊيوپليجڪ محلول ۾ محفوظ ڪيون ويون، جنهن ۾ عام طور تي <10 منٽ لڳن ٿا.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室،通常<10分钟.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室،通常<10分钟. Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min. دل کي برف تي ليبارٽري ڏانهن منتقل ڪرڻ تائين برف جي ڪارڊيوپلجيا تي رکو، عام طور تي <10 منٽ.
سي ٽي سي ايم ڊيوائس کي سولڊ ورڪس ڪمپيوٽر ايڊيڊ ڊيزائن (سي اي ڊي) سافٽ ويئر ۾ تيار ڪيو ويو آهي. ڪلچر چيمبر، ڊيوائيڊر ۽ ايئر چيمبر سي اين سي صاف ايڪريلڪ پلاسٽڪ مان ٺهيل آهن. 7 ملي ميٽر قطر جو بيڪ اپ رنگ مرڪز ۾ هاءِ ڊينسٽي پوليٿيلين (ايڇ ڊي پي اي) مان ٺهيل آهي ۽ ان ۾ هڪ او-رنگ گروو آهي جيڪو سلڪون او-رنگ کي ترتيب ڏئي ٿو جيڪو هيٺان ميڊيا کي سيل ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي. هڪ پتلي سليڪا جھلي ڪلچر چيمبر کي سيپريشن پليٽ کان الڳ ڪري ٿي. سلڪون جھلي 0.02 انچ ٿلهي سلڪون شيٽ مان ليزر ڪٽيل آهي ۽ ان جي سختي 35A آهي. هيٺيون ۽ مٿيون سلڪون گيسڪٽ 1/16 انچ ٿلهي سلڪون شيٽ مان ليزر ڪٽيل آهن ۽ ان جي سختي 50A آهي. بلاڪ کي مضبوط ڪرڻ ۽ ايئر ٽائيٽ سيل ٺاهڻ لاءِ 316L اسٽينلیس اسٽيل اسڪرو ۽ ونگ نٽ استعمال ڪيا ويندا آهن.
هڪ وقف ٿيل پرنٽ ٿيل سرڪٽ بورڊ (PCB) کي C-PACE-EM سسٽم سان ضم ڪرڻ لاءِ ٺاهيو ويو آهي. PCB تي سوئس مشين ڪنيڪٽر ساکٽ گريفائيٽ اليڪٽروڊس سان چانديءَ جي پليٽ ٿيل ٽامي جي تارن ۽ برونز 0-60 اسڪرو ذريعي ڳنڍيل آهن جيڪي اليڪٽرروڊس ۾ اسڪرو ٿيل آهن. پرنٽ ٿيل سرڪٽ بورڊ 3D پرنٽر جي ڍڪ ۾ رکيل آهي.
CTCM ڊوائيس هڪ پروگراميبل نيوميٽڪ ايڪٽيوئيٽر (PPD) ذريعي ڪنٽرول ڪيو ويندو آهي جيڪو دل جي چڪر وانگر ڪنٽرول ٿيل گردش دٻاءُ پيدا ڪري ٿو. جيئن جيئن هوائي چيمبر اندر دٻاءُ وڌندو آهي، لچڪدار سلڪون جھلي مٿي وڌندي آهي، وچولي کي ٽشو سائيٽ جي هيٺان مجبور ڪندي آهي. پوءِ ٽشو جو علائقو سيال جي هن خارج ٿيڻ سان وڌايو ويندو، جيڪو ڊائسٽول دوران دل جي جسماني توسيع جي نقل ڪندو آهي. آرام جي چوٽي تي، گريفائيٽ اليڪٽروڊ ذريعي برقي محرڪ لاڳو ڪيو ويو، جنهن هوا جي چيمبر ۾ دٻاءُ گهٽايو ۽ ٽشو حصن جي سڪڙڻ جو سبب بڻيو. پائپ جي اندر هڪ هيموسٽيٽڪ والو آهي جنهن ۾ پريشر سينسر آهي جيڪو هوا جي نظام ۾ دٻاءُ کي ڳولڻ لاءِ. پريشر سينسر پاران محسوس ڪيل دٻاءُ ليپ ٽاپ سان ڳنڍيل ڊيٽا ڪليڪٽر تي لاڳو ڪيو ويندو آهي. اهو گئس چيمبر اندر دٻاءُ جي مسلسل نگراني جي اجازت ڏئي ٿو. جڏهن وڌ ۾ وڌ چيمبر پريشر پهچي ويو (معياري 80 mmHg، 140 mmHg OS)، ڊيٽا حاصل ڪرڻ واري ڊوائيس کي حڪم ڏنو ويو ته C-PACE-EM سسٽم ڏانهن سگنل موڪلي ته جيئن 2 ms لاءِ بائيفاسک وولٽيج سگنل پيدا ڪري سگهجي، 4 V تي سيٽ ڪيو وڃي.
دل جا حصا حاصل ڪيا ويا ۽ 6 کوهن ۾ ڪلچر جون حالتون هن ريت ڪيون ويون: ڪٽيل دل کي منتقلي برتن مان هڪ ٽري ۾ منتقل ڪريو جنهن ۾ ٿڌي (4° C.) ڪارڊيوپليجيا هجي. کاٻي وينٽريڪل کي هڪ جراثيم کان پاڪ بليڊ سان الڳ ڪيو ويو ۽ 1-2 cm3 جي ٽڪرن ۾ ڪٽيو ويو. اهي ٽشو بلاڪ ٽشو سپورٽ سان ٽشو چپڪندڙ سان ڳنڍيل هئا ۽ ٽائروڊ جي محلول تي مشتمل هڪ وائبرٽنگ مائڪروٽوم ٽشو غسل ۾ رکيا ويا ۽ مسلسل آڪسيجن (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM)، 140 mM NaCl (8.18 g). )، 6 mM KCl (0.447 g)، 10 mM D-گلوڪوز (1.86 g)، 10 mM HEPES (2.38 g)، 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M محلول)، 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M محلول)، 1 L ddH2O تائين. وائبريٽنگ مائڪروٽوم کي 80 هرٽز جي فريڪوئنسي، 2 ملي ميٽر جي افقي وائبريشن ايمپليٽيوڊ، ۽ 0.03 ملي ميٽر/سيڪنڊ جي ايڊوانس ريٽ تي 300 µm ٿلها سلائس ڪٽڻ لاءِ مقرر ڪيو ويو هو. محلول کي ٿڌو رکڻ لاءِ ٽشو غسل کي برف سان گھيرو ڪيو ويو ۽ گرمي پد 4 °C تي برقرار رکيو ويو. مائڪروٽوم غسل مان ٽشو حصن کي برف تي مسلسل آڪسيجن ٿيل ٽائروڊ محلول تي مشتمل انڪيوبيشن غسل ۾ منتقل ڪريو جيستائين هڪ ڪلچر پليٽ لاءِ ڪافي حصا حاصل نه ٿين. ٽرانس ويل ڪلچر لاءِ، ٽشو حصن کي جراثيم کان پاڪ 6 ملي ميٽر ويڪر پولي يوريٿين سپورٽ سان ڳنڍيو ويو ۽ 6 ملي ليٽر آپٽمائزڊ ميڊيم (199 ميڊيم، 1x ITS سپليمينٽ، 10٪ FBS، 5 ng/ml VEGF، 10 ng/ml FGF-alkaline ۽ 2X اينٽي بايوٽڪ-اينٽي فنگل) ۾ رکيو ويو. برقي محرڪ (10 V، فريڪوئنسي 1.2 هرٽز) سي-پيس ذريعي ٽشو حصن تي لاڳو ڪيو ويو. ٽي ڊي جي حالتن لاءِ، هر وچولي تبديلي تي تازو ٽي 3 ۽ ڊيڪس 100 اين ايم ۽ 1 μM تي شامل ڪيا ويا. ڏينهن ۾ 3 ڀيرا متبادل کان اڳ ميڊيم آڪسيجن سان سير ٿيل هوندو آهي. ٽشو حصن کي انڪيوبيٽر ۾ 37 ° سي ۽ 5٪ CO2 تي ڪلچر ڪيو ويو.
CTCM ڪلچر لاءِ، ٽشو سيڪشن کي پيٽري ڊش ۾ ڪسٽم ٺهيل 3D پرنٽر تي رکيو ويو جنهن ۾ تبديل ٿيل ٽائروڊ جو محلول شامل هو. ڊوائيس دل جي سلائس جي سائيز کي سپورٽ رنگ جي علائقي جي 25٪ تائين وڌائڻ لاءِ ٺاهيو ويو آهي. اهو ڪيو ويو آهي ته جيئن دل جا حصا ٽائروڊ جي محلول کان وچولي ۾ منتقل ٿيڻ کان پوءِ ۽ ڊائسٽول دوران نه ڇڪين. هسٽو ايڪريلڪ گلو استعمال ڪندي، 300 µm ٿلهي حصن کي سپورٽ رنگ تي 7 ملي ميٽر قطر ۾ مقرر ڪيو ويو. ٽشو سيڪشن کي سپورٽ رنگ سان ڳنڍڻ کان پوءِ، اضافي ٽشو سيڪشن کي ڪٽيو ۽ ڳنڍيل ٽشو سيڪشن کي واپس برف تي ٽائروڊ محلول جي غسل ۾ (4°C) رکو جيستائين هڪ ڊوائيس لاءِ ڪافي حصا تيار نه ٿي وڃن. سڀني ڊوائيسز لاءِ ڪل پروسيسنگ وقت 2 ڪلاڪن کان وڌيڪ نه هجڻ گهرجي. 6 ٽشو سيڪشن کي انهن جي سپورٽ رنگن سان ڳنڍڻ کان پوءِ، CTCM ڊيوائس کي گڏ ڪيو ويو. CTCM ڪلچر چيمبر 21 ملي ليٽر پري آڪسيجن ٿيل ميڊيم سان اڳ ۾ ڀريو ويو آهي. ٽشو سيڪشن کي ڪلچر چيمبر ۾ منتقل ڪريو ۽ احتياط سان ڪنهن به هوائي بلبل کي پائپٽ سان هٽايو. پوءِ ٽشو سيڪشن کي سوراخ ۾ هدايت ڪئي ويندي آهي ۽ نرميءَ سان جاءِ تي دٻايو ويندو آهي. آخرڪار، ڊوائيس تي اليڪٽروڊ ڪيپ رکو ۽ ڊوائيس کي انڪيوبيٽر ڏانهن منتقل ڪريو. پوءِ CTCM کي ايئر ٽيوب ۽ C-PACE-EM سسٽم سان ڳنڍيو. نيوميٽڪ ايڪٽيوٽر کلي ٿو ۽ ايئر والو CTCM کولي ٿو. C-PACE-EM سسٽم کي 2 ms لاءِ بائي فاسڪ پيسنگ دوران 1.2 Hz تي 4 V پهچائڻ لاءِ ترتيب ڏنو ويو هو. ميڊيم کي ڏينهن ۾ ٻه ڀيرا تبديل ڪيو ويو ۽ اليڪٽروڊ تي گريفائٽ جي جمع ٿيڻ کان بچڻ لاءِ ڏينهن ۾ هڪ ڀيرو اليڪٽروڊ تبديل ڪيا ويا. جيڪڏهن ضروري هجي ته، ٽشو سيڪشن کي انهن جي ڪلچر ويلز مان ڪڍي سگهجي ٿو ته جيئن ڪنهن به هوائي بلبل کي ٻاهر ڪڍي سگهجي جيڪي شايد انهن جي هيٺان گريا هجن. MT علاج جي حالتن لاءِ، T3/Dex کي هر ميڊيم تبديلي سان 100 nM T3 ۽ 1 μM Dex سان تازو شامل ڪيو ويو. CTCM ڊوائيسز کي 37°C ۽ 5% CO2 تي انڪيوبيٽر ۾ ڪلچر ڪيو ويو.
دل جي ٽڪرن جي ڇڪيل پيچرن کي حاصل ڪرڻ لاءِ، هڪ خاص ڪئميرا سسٽم تيار ڪيو ويو. هڪ SLR ڪئميرا (ڪينن ريبل T7i، ڪينن، ٽوڪيو، جاپان) کي نيويٽر زوم 7000 18-108 ايم ايم ميڪرو لينس (نيويٽر، سان فرانسسڪو، سي اي) سان استعمال ڪيو ويو. وچولي کي تازي وچولي سان تبديل ڪرڻ کان پوءِ ڪمري جي حرارت تي ويزوئلائيزيشن ڪئي وئي. ڪئميرا 51° زاويه تي رکيل آهي ۽ وڊيو 30 فريم في سيڪنڊ تي رڪارڊ ڪئي وئي آهي. پهرين، اوپن سورس سافٽ ويئر (MUSCLEMOTION43) کي دل جي ٽڪرن جي حرڪت جي مقدار کي ماپڻ لاءِ Image-J سان استعمال ڪيو ويو. ماسڪ MATLAB (MathWorks، Natick، MA، USA) استعمال ڪندي ٺاهيو ويو ته جيئن شور کان بچڻ لاءِ دل جي ٽڪرن کي ڌڙڪائڻ لاءِ دلچسپي جي علائقن کي بيان ڪري سگهجي. دستي طور تي ورهايل ماسڪ سڀني تصويرن تي فريم تسلسل ۾ لاڳو ڪيا ويندا آهن ۽ پوءِ MUSCLEMOTION پلگ ان ڏانهن منتقل ڪيا ويندا آهن. عضلاتي حرڪت هر فريم ۾ پکسلز جي سراسري شدت کي استعمال ڪندي ريفرنس فريم جي نسبت ان جي حرڪت کي مقدار ڏيڻ لاءِ. ڊيٽا کي رڪارڊ ڪيو ويو، فلٽر ڪيو ويو ۽ چڪر جي وقت کي مقدار ڏيڻ ۽ دل جي چڪر دوران ٽشو اسٽريچ جو جائزو وٺڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو. رڪارڊ ٿيل وڊيو کي پهرين آرڊر زيرو فيز ڊجيٽل فلٽر استعمال ڪندي پوسٽ پروسيس ڪيو ويو. ٽشو اسٽريچ (چوٽي کان چوٽي) جي مقدار کي طئي ڪرڻ لاءِ، رڪارڊ ٿيل سگنل ۾ چوٽي ۽ گرت جي وچ ۾ فرق ڪرڻ لاءِ چوٽي کان چوٽي تجزيو ڪيو ويو. ان کان علاوه، سگنل ڊرفٽ کي ختم ڪرڻ لاءِ ڇهين آرڊر پولينوميل استعمال ڪندي ڊيٽرينڊنگ ڪئي ويندي آهي. پروگرام ڪوڊ MATLAB ۾ عالمي ٽشو موشن، سائيڪل جو وقت، آرام جو وقت، ۽ ڇڪڻ جو وقت طئي ڪرڻ لاءِ تيار ڪيو ويو (سپليمينٽري پروگرام ڪوڊ 44).
اسٽرين تجزيي لاءِ، ميڪينڪل اسٽريچ اسيسمينٽ لاءِ ٺاهيل ساڳين وڊيوز کي استعمال ڪندي، اسان پهريان MUSCLEMOTION سافٽ ويئر جي مطابق حرڪت جي چوٽين (سڀ کان وڌيڪ (مٿيون) ۽ گهٽ ۾ گهٽ (هيٺيون) نقطي) جي نمائندگي ڪندڙ ٻن تصويرن کي ڳولهيو. پوءِ اسان ٽشو علائقن کي ورهائي ڇڏيو ۽ سيگمينٽ ٿيل ٽشو تي شيڊنگ الگورٿم جو هڪ روپ لاڳو ڪيو (ضمني شڪل 2a). پوءِ سيگمينٽ ٿيل ٽشو کي ڏهه سبسرفيس ۾ ورهايو ويو، ۽ هر مٿاڇري تي دٻاءُ هيٺ ڏنل مساوات استعمال ڪندي ڳڻيو ويو: اسٽرين = (Sup-Sdown)/Sdown، جتي Sup ۽ Sdown ترتيب وار ڪپڙي جي مٿين ۽ هيٺئين پاڇين کان شڪل جا فاصلا آهن (ضمني شڪل 2b).
دل جي حصن کي 48 ڪلاڪن لاءِ 4٪ پيرافارملڊيهائيڊ ۾ مقرر ڪيو ويو. مقرر ٿيل ٽشوز کي 1 ڪلاڪ لاءِ 10٪ ۽ 20٪ سکروز ۾ ڊيهائيڊريٽ ڪيو ويو، پوءِ رات جو 30٪ سکروز ۾. پوءِ حصن کي بهترين ڪٽنگ گرمي پد مرڪب (OCT مرڪب) ۾ شامل ڪيو ويو ۽ بتدريج هڪ آئسوپينٽين / خشڪ برف غسل ۾ منجمد ڪيو ويو. OCT ايمبيڊنگ بلاڪ کي -80 °C تي الڳ ٿيڻ تائين ذخيرو ڪريو. سلائيڊون 8 μm جي ٿولهه سان حصن جي طور تي تيار ڪيون ويون.
دل جي حصن مان OCT ڪڍڻ لاءِ، سلائيڊن کي 95 °C تي 5 منٽن لاءِ گرم ڪريو. هر سلائيڊ ۾ 1 ml PBS شامل ڪريو ۽ ڪمري جي حرارت تي 30 منٽن لاءِ انڪيوبيٽ ڪريو، پوءِ ڪمري جي حرارت تي 15 منٽن لاءِ PBS ۾ 0.1% Triton-X سيٽ ڪري حصن ۾ داخل ٿيو. غير مخصوص اينٽي باڊيز کي نموني سان ڳنڍڻ کان روڪڻ لاءِ، سلائيڊن ۾ 3% BSA محلول جو 1 ml شامل ڪريو ۽ ڪمري جي حرارت تي 1 ڪلاڪ لاءِ انڪيوبيٽ ڪريو. پوءِ BSA کي هٽايو ويو ۽ سلائيڊن کي PBS سان ڌوئي ڇڏيو ويو. هر نموني کي پينسل سان نشان لڳايو. پرائمري اينٽي باڊيز (1% BSA ۾ 1:200 کي گھٽايو ويو) (ڪنڪسن 43 (Abcam; #AB11370)، NFATC4 (Abcam; #AB99431) ۽ ٽروپونين-ٽي (Thermo Scientific; #MA5-12960) 90 منٽن کان وڌيڪ شامل ڪيا ويا، پوءِ ثانوي اينٽي باڊيز (1% BSA ۾ 1:200 کي گھٽايو ويو) چوٿون Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079)، خرگوش Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) جي خلاف اضافي 90 منٽن لاءِ PBS سان 3 ڀيرا ڌوئيو ويو ٽارگيٽ اسٽيننگ کي پس منظر کان ڌار ڪرڻ لاءِ، اسان صرف سيڪنڊري اينٽي باڊي کي ڪنٽرول طور استعمال ڪيو. آخرڪار، DAPI نيوڪليئر اسٽين شامل ڪيو ويو ۽ سلائيڊز کي ويڪٽاشيلڊ (ویکٹر ليبارٽريز) ۾ رکيو ويو ۽ نيل پالش سان سيل ڪيو ويو. -x ميگنيفڪيشن) ۽ ڪيئنس مائڪروسڪوپ 40x ميگنيفڪيشن سان.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) PBS ۾ 5 μg/ml تي WGA اسٽيننگ لاءِ استعمال ڪيو ويو ۽ ڪمري جي حرارت تي 30 منٽن لاءِ مقرر حصن تي لاڳو ڪيو ويو. پوءِ سلائيڊن کي PBS سان ڌويو ويو ۽ هر سلائيڊ ۾ سوڊان بليڪ شامل ڪيو ويو ۽ 30 منٽن لاءِ انڪيوبيٽ ڪيو ويو. پوءِ سلائيڊن کي PBS سان ڌويو ويو ۽ ويڪٽاشيلڊ ايمبيڊنگ ميڊيم شامل ڪيو ويو. سلائيڊن کي ڪيئنس مائڪروسڪوپ تي 40x ميگنيفڪيشن تي ڏٺو ويو.
مٿي بيان ڪيل نموني مان OCT ڪڍيو ويو. OCT ڪڍڻ کان پوءِ، سلائيڊن کي رات جو بوئن جي محلول ۾ ٻوڙيو. پوءِ سلائيڊن کي 1 ڪلاڪ لاءِ ڊسٽلڊ پاڻي سان ڌوئي ڇڏيو ويو ۽ پوءِ 10 منٽن لاءِ بِبرِچ ايلو ايسڊ فوچسن محلول ۾ رکيو ويو. پوءِ سلائيڊن کي ڊسٽلڊ پاڻي سان ڌوئي 5٪ فاسفومولائبڊينم / 5٪ فاسفوٽنگسٽڪ ايسڊ جي محلول ۾ 10 منٽن لاءِ رکيو ويو. ڌوئڻ کان سواءِ، سلائيڊن کي سڌو سنئون اينيلين نيرو محلول ۾ 15 منٽن لاءِ منتقل ڪريو. پوءِ سلائيڊن کي ڊسٽلڊ پاڻي سان ڌوئي 2 منٽن لاءِ 1٪ ايسٽڪ ايسڊ محلول ۾ رکيو ويو. سلائيڊن کي 200 N ايٿانول ۾ سڪايو ويو ۽ زائلين ۾ منتقل ڪيو ويو. داغدار سلائيڊن کي 10x مقصد سان ڪيئنس مائڪروسڪوپ استعمال ڪندي تصور ڪيو ويو. ڪيئنس اينالائيزر سافٽ ويئر استعمال ڪندي فائبروسس ايريا جي فيصد کي مقدار ڏني وئي.
CyQUANT™ MTT سيل وائبيلٽي ايسي (انويٽروجن، ڪارلس بيڊ، CA)، ڪيٽلاگ نمبر V13154، ٺاهيندڙ جي پروٽوڪول مطابق ڪجهه تبديلين سان. خاص طور تي، MTT تجزيي دوران هڪجهڙائي ٽشو سائيز کي يقيني بڻائڻ لاءِ 6 ملي ميٽر قطر سان هڪ سرجيڪل پنچ استعمال ڪيو ويو. ٺاهيندڙ جي پروٽوڪول مطابق ٽشوز کي انفرادي طور تي 12 ويل پليٽ جي کوهن ۾ پليٽ ڪيو ويو جنهن ۾ MTT سبسٽريٽ شامل آهي. حصن کي 3 ڪلاڪن لاءِ 37 ° C تي انڪيوبيٽ ڪيو ويندو آهي ۽ زنده ٽشو MTT سبسٽريٽ کي ميٽابولائيز ڪري جامني فارمازان مرڪب ٺاهيندو آهي. دل جي حصن مان جامني فارمازان ڪڍڻ لاءِ MTT محلول کي 1 ml DMSO سان تبديل ڪريو ۽ 15 منٽن لاءِ 37 ° C تي انڪيوبيٽ ڪريو. نمونن کي 96 ويل صاف هيٺئين پليٽن ۾ DMSO ۾ 1:10 تي پتلو ڪيو ويو ۽ سائٽيشن پليٽ ريڊر (بايو ٽيڪ) استعمال ڪندي جامني رنگ جي شدت 570 nm تي ماپي وئي. دل جي هر سلائس جي وزن مطابق ريڊنگ کي نارمل ڪيو ويو.
جيئن اڳ بيان ڪيو ويو آهي، گلوڪوز جي استعمال جي جاچ لاءِ دل جي سلائس ميڊيا کي 1 μCi/ml [5-3H]-گلوڪوز (موراويڪ بايو ڪيميڪلز، بريا، CA، USA) تي مشتمل ميڊيا سان تبديل ڪيو ويو. 4 ڪلاڪن جي انڪيوبيشن کان پوءِ، 100 μl ميڊيم هڪ کليل مائڪرو سينٽريفيوج ٽيوب ۾ شامل ڪريو جنهن ۾ 100 μl 0.2 N HCl هجي. پوءِ ٽيوب کي هڪ سنٽيليشن ٽيوب ۾ رکيو ويو جنهن ۾ 500 μl dH2O هجي ته جيئن 37°C تي 72 ڪلاڪن لاءِ [3H]2O بخارات بڻجي وڃي. پوءِ مائڪرو سينٽريفيوج ٽيوب کي سنٽيليشن ٽيوب مان هٽايو ۽ 10 ml سنٽيليشن فلوئڊ شامل ڪيو. سنٽيليشن ڳڻپ ٽرائي ڪارب 2900TR مائع سنٽيليشن اينالائيزر (پيڪارڊ بايو سائنس ڪمپني، ميريڊن، CT، USA) استعمال ڪندي ڪئي وئي. پوءِ گلوڪوز جي استعمال جو حساب [5-3H] - گلوڪوز جي مخصوص سرگرمي، نامڪمل توازن ۽ پس منظر، [5-3H] - کي غير ليبل ٿيل گلوڪوز ۾ گھٽائڻ، ۽ سنٽيليشن ڪائونٽر ڪارڪردگي کي نظر ۾ رکندي ڪيو ويو. ڊيٽا کي دل جي حصن جي ماس تائين نارمل ڪيو ويو آهي.
ٽرائزول ۾ ٽشو هوموجنائيزيشن کان پوءِ، ٺاهيندڙ جي پروٽوڪول مطابق Qiagen miRNeasy مائڪرو ڪٽ #210874 استعمال ڪندي آر اين اي کي دل جي حصن کان الڳ ڪيو ويو. آر اين اي سيڪ لائبريري جي تياري، ترتيب ۽ ڊيٽا تجزيو هن ريت ڪيو ويو:
آر اين اي لائبريري جي تياري لاءِ شروعاتي مواد طور 1 μg آر اين اي في نموني استعمال ڪيو ويو. ٺاهيندڙ جي سفارشن تي عمل ڪندي NEBNext UltraTM RNA لائبريري تيار ڪرڻ واري ڪٽ فار ايلومينا (NEB، USA) استعمال ڪندي ترتيب ڏيڻ واريون لائبريريون تيار ڪيون ويون، ۽ هر نموني لاءِ خاصيت جي ترتيب ۾ انڊيڪس ڪوڊ شامل ڪيا ويا. مختصر طور تي، mRNA کي پولي-T اوليگونوڪليوليٽائڊس سان ڳنڍيل مقناطيسي موتي استعمال ڪندي ڪل RNA مان صاف ڪيو ويو. NEBNext فرسٽ اسٽرينڊ سنٿيسس ري ايڪشن بفر (5X) ۾ اعليٰ درجه حرارت تي ڊويلنٽ ڪيشن استعمال ڪندي فريگمينٽيشن ڪئي ويندي آهي. پهرين اسٽرينڊ سي ڊي اين اي کي بي ترتيب هيڪسامر پرائمر ۽ M-MuLV ريورس ٽرانسڪرپٽيس (RNase H-) استعمال ڪندي سنٿيسائز ڪيو ويو. پوءِ ٻئي اسٽرينڊ سي ڊي اين اي کي ڊي اين اي پوليمريز I ۽ RNase H استعمال ڪندي سنٿيسائز ڪيو ويو. باقي اوور هينگز کي ايڪسونڪليزيز/پوليمريز سرگرمي ذريعي بلنٽ اينڊز ۾ تبديل ڪيو ويندو آهي. ڊي اين اي فريگمينٽ جي 3′ آخر جي ايڊينيليشن کان پوءِ، هڪ NEBNext اڊاپٽر هڪ هيئر پن لوپ جي جوڙجڪ سان ان سان ڳنڍيل آهي ته جيئن ان کي هائبرڊائيزيشن لاءِ تيار ڪيو وڃي. 150-200 bp جي ترجيحي ڊيگهه جي cDNA ٽڪرن جي چونڊ لاءِ. لائبريري ٽڪرن کي AMPure XP سسٽم (Beckman Coulter، Beverly، USA) استعمال ڪندي صاف ڪيو ويو. پوءِ، 3 μl USER Enzyme (NEB، USA) سائيز جي چونڊيل cDNA سان گڏ هڪ اڊاپٽر سان ڳنڍيل 15 منٽن لاءِ 37°C تي ۽ پوءِ PCR کان اڳ 95°C تي 5 منٽن لاءِ استعمال ڪيو ويو. پوءِ PCR کي Phusion High-Fidelity DNA polymerase، universal PCR primers، ۽ Index (X) primers استعمال ڪندي ڪيو ويو. آخرڪار، PCR پراڊڪٽس کي صاف ڪيو ويو (AMPure XP سسٽم) ۽ لائبريري جي معيار جو جائزو Agilent Bioanalyzer 2100 سسٽم تي ڪيو ويو. پوءِ cDNA لائبريري کي Novaseq sequencer استعمال ڪندي ترتيب ڏنو ويو. Illumina مان خام تصويري فائلن کي CASAVA Base Calling استعمال ڪندي خام پڙهڻ ۾ تبديل ڪيو ويو. خام ڊيٽا FASTQ(fq) فارميٽ فائلن ۾ محفوظ ڪيو ويو آهي جنهن ۾ پڙهڻ جي ترتيب ۽ لاڳاپيل بنيادي خوبيون شامل آهن. فلٽر ٿيل ترتيب پڙهڻ کي Sscrofa11.1 ريفرنس جينوم سان ملائڻ لاءِ HISAT2 چونڊيو. عام طور تي، HISAT2 ڪنهن به سائيز جي جينومز کي سپورٽ ڪري ٿو، جنهن ۾ 4 ارب بيسز کان وڏا جينومز شامل آهن، ۽ گهڻن پيرا ميٽرز لاءِ ڊفالٽ قدر مقرر ڪيا ويا آهن. RNA Seq ڊيٽا مان اسپلائسنگ ريڊز کي HISAT2 استعمال ڪندي موثر طريقي سان ترتيب ڏئي سگهجي ٿو، جيڪو هن وقت موجود تيز ترين سسٽم آهي، ڪنهن به ٻئي طريقي جي ڀيٽ ۾ ساڳي يا بهتر درستگي سان.
ٽرانسڪرپٽس جي ڪثرت سڌو سنئون جين جي اظهار جي سطح کي ظاهر ڪري ٿي. جين جي اظهار جي سطحن جو اندازو جينوم يا ايڪسونز سان لاڳاپيل ٽرانسڪرپٽس (ترتيب جي ڳڻپ) جي ڪثرت سان ڪيو ويندو آهي. پڙهڻ جو تعداد جين جي اظهار جي سطح، جين جي ڊيگهه، ۽ ترتيب جي کوٽائي جي متناسب آهي. FPKM (في ملين بيس جوڙن جي ترتيب ڏنل ٽرانسڪرپٽ جي هزار بيس جوڙن جا ٽڪرا) ڳڻيا ويا ۽ DESeq2 پيڪيج استعمال ڪندي فرق جي اظهار جي P- قدرن جو تعين ڪيو ويو. پوءِ اسان بلٽ ان R-فنڪشن "p.adjust" جي بنياد تي بينجمني-هچبرگ طريقو 9 استعمال ڪندي هر P قدر لاءِ غلط دريافت جي شرح (FDR) جو حساب ڪيو.
دل جي حصن مان الڳ ٿيل آر اين اي کي ٿرمو (ٿرمو، ڪيٽ. نمبر 11756050) مان سپر اسڪرپٽ IV وِلو ماسٽر مڪس استعمال ڪندي 200 اين جي/μl جي ڪنسنٽريشن تي سي ڊي اين اي ۾ تبديل ڪيو ويو. مقداري آر ٽي-پي سي آر هڪ اپلائيڊ بايو سسٽم اينڊورا پليٽ مائڪرو ايمپ 384-ويل شفاف رد عمل پليٽ (ٿرمو، ڪيٽ. نمبر 4483319) ۽ مائڪرو ايمپ آپٽيڪل ايڊهيسيو (ٿرمو، ڪيٽ. نمبر 4311971) استعمال ڪندي ڪيو ويو. رد عمل جي مرکب ۾ 5 µl ٽقمان فاسٽ ايڊوانسڊ ماسٽر مڪس (ٿرمو، ڪيٽ # 4444557)، 0.5 µl ٽقمان پرائمر ۽ 3.5 µl H2O ملايو ويو في ويل. معياري qPCR سائيڪلون هلايون ويون ۽ اپلائيڊ بايو سسٽم ڪوانٽسٽوڊيو 5 ريئل ٽائيم پي سي آر انسٽرومينٽ (384-ويل ماڊل؛ پراڊڪٽ # A28135) استعمال ڪندي سي ٽي ويليوز ماپيون ويون. تاقمان پرائمر ٿرمو (GAPDH (Ss03375629_u1)، PARP12 (Ss06908795_m1)، PKDCC (Ss06903874_m1)، CYGB (Ss06900188_m1)، RGL1 (Ss06868890_m1)، ACTN1 (Ss01009508_mH)، GATA4 (Ss03383805_u1)، GJA1 (Ss03374839_u1)، COL1A2 (Ss03375009_u1)، COL3A1 (Ss04323794_m1)، ACTA2 (Ss04245588_m1) مان خريد ڪيا ويا. سڀني نمونن جي CT قدرن کي گھر جي سنڀال جين GAPDH سان نارمل ڪيو ويو.
ٺاهيندڙ جي پروٽوڪول مطابق NT-ProBNP جي ميڊيا رليز جو جائزو NT-ProBNP ڪٽ (سور) (ٻلي نمبر MBS2086979، MyBioSource) استعمال ڪندي ڪيو ويو. مختصر ۾، هر نموني ۽ معيار جو 250 µl هر کوهه ۾ نقل ۾ شامل ڪيو ويو. نموني شامل ڪرڻ کان فوري بعد، هر کوهه ۾ 50 µl Assay Reagent A شامل ڪريو. پليٽ کي نرميءَ سان هلايو ۽ سيلنٽ سان سيل ڪريو. پوءِ ٽيبليٽ کي 1 ڪلاڪ لاءِ 37°C تي انڪيوبيٽ ڪيو ويو. پوءِ محلول کي ايسپيريٽ ڪريو ۽ کوهن کي 4 ڀيرا 350 µl 1X واش محلول سان ڌوئو، هر دفعي 1-2 منٽن لاءِ واش محلول کي انڪيوبيٽ ڪريو. پوءِ هر کوهه ۾ 100 µl Assay Reagent B شامل ڪريو ۽ پليٽ سيلنٽ سان سيل ڪريو. ٽيبليٽ کي نرميءَ سان هلايو ويو ۽ 37°C تي 30 منٽن لاءِ انڪيوبيٽ ڪيو ويو. محلول کي ايسپيريٽ ڪريو ۽ کوهن کي 350 µl 1X واش محلول سان 5 ڀيرا ڌوئو. هر کوهه ۾ 90 µl سبسٽريٽ محلول شامل ڪريو ۽ پليٽ کي سيل ڪريو. پليٽ کي 10-20 منٽن لاءِ 37°C تي انڪيوبيٽ ڪريو. هر کوهه ۾ 50 µl اسٽاپ محلول شامل ڪريو. پليٽ کي فوري طور تي 450 nm تي سيٽ ڪيل سائيٽيشن (بائيوٽيڪ) پليٽ ريڊر استعمال ڪندي ماپيو ويو.
گروپ جي سائزن کي چونڊڻ لاءِ پاور تجزيا ڪيا ويا جيڪي 5٪ ٽائپ I غلطي جي شرح سان پيرا ميٽر ۾ 10٪ مطلق تبديلي کي ڳولڻ لاءِ 80٪ کان وڌيڪ طاقت فراهم ڪندا. گروپ جي سائزن کي چونڊڻ لاءِ پاور تجزيا ڪيا ويا جيڪي 5٪ ٽائپ I غلطي جي شرح سان پيرا ميٽر ۾ 10٪ مطلق تبديلي کي ڳولڻ لاءِ 80٪ کان وڌيڪ طاقت فراهم ڪندا. انااليز مائنس برگيڊ 10٪ PARAMETRA с 5% частотой ошибок типа I. پاور تجزيو گروپ جي سائزن کي چونڊڻ لاءِ ڪيو ويو جيڪي 5٪ ٽائپ I غلطي جي شرح سان 10٪ مطلق پيرا ميٽر تبديلي کي ڳولڻ لاءِ 80٪ کان وڌيڪ طاقت فراهم ڪندا.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％对变化和5％将提供>进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％对变化和5％将提供> Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаружения 10% PARAMETROV ۽ 5٪ частоты ошибок типа I. هڪ گروپ سائيز کي چونڊڻ لاءِ هڪ پاور تجزيو ڪيو ويو جيڪو 10٪ مطلق پيرا ميٽر تبديلي ۽ 5٪ قسم I غلطي جي شرح کي ڳولڻ لاءِ 80٪ کان وڌيڪ طاقت فراهم ڪندو.تجربي کان اڳ ٽشو سيڪشن بي ترتيب طور تي چونڊيا ويا. سڀئي تجزيا حالت ۾ بلائنڊ هئا ۽ نمونن کي صرف سڀني ڊيٽا جي تجزيي کان پوءِ ڊيڪوڊ ڪيو ويو. گراف پيڊ پرزم سافٽ ويئر (سان ڊياگو، ڪيليفورنيا) سڀني شمارياتي تجزيي کي انجام ڏيڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو. سڀني انگن اکرن لاءِ، <0.05 قدرن تي p-قدرن کي اهم سمجهيو ويو. سڀني انگن اکرن لاءِ، p-قدرن کي <0.05 قدرن تي اهم سمجهيو ويندو هو. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. سڀني انگن اکرن لاءِ، p-قدرن کي <0.05 قدرن تي اهم سمجهيو ويندو هو.对于所有统计数据،p 值在值<0.05 时被认为是显着的.对于所有统计数据،p 值在值<0.05 时被认为是显着的. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. سڀني انگن اکرن لاءِ، p-قدرن کي <0.05 قدرن تي اهم سمجهيو ويندو هو.ٻن-ٽيل شاگردن جو ٽي-ٽيسٽ صرف 2 مقابلي سان ڊيٽا تي ڪيو ويو. هڪ طرفي يا ٻه طرفي ANOVA ڪيترن ئي گروپن جي وچ ۾ اهميت کي طئي ڪرڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو. پوسٽ هاڪ ٽيسٽ ڪرڻ وقت، ٽوڪي جي اصلاح کي ڪيترن ئي مقابلي جي حساب سان لاڳو ڪيو ويو. RNAsec ڊيٽا ۾ خاص شمارياتي غور آهن جڏهن FDR ۽ p.adjust جو حساب ڪيو ويندو آهي جيئن طريقن جي سيڪشن ۾ بيان ڪيو ويو آهي.
مطالعي جي ڊيزائن بابت وڌيڪ معلومات لاءِ، هن مضمون سان ڳنڍيل نيچر ريسرچ رپورٽ جو خلاصو ڏسو.