Hvala vam što ste posjetili Nature.com.Verzija pretraživača koju koristite ima ograničenu podršku za CSS.Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani pretraživač (ili onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru).U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Postoji potreba za pouzdanim in vitro sistemom koji može precizno reproducirati fiziološko okruženje srca za testiranje lijekova.Ograničena dostupnost sistema kulture ljudskog srčanog tkiva dovela je do netačnih tumačenja efekata srčanih lijekova.Ovdje smo razvili model kulture srčanog tkiva (CTCM) koji elektromehanički stimulira rezove srca i podliježe fiziološkom istezanju tokom sistoličke i dijastoličke faze srčanog ciklusa.Nakon 12 dana kulture, ovaj pristup je djelimično poboljšao vitalnost srčanih sekcija, ali nije u potpunosti sačuvao njihov strukturni integritet.Stoga smo, nakon skrininga malih molekula, otkrili da je dodavanje 100 nM trijodotironina (T3) i 1 μM deksametazona (Dex) našoj podlozi održava mikrostrukturu sekcija 12 dana.U kombinaciji sa T3/Dex tretmanom, CTCM sistem je održavao transkripcione profile, vitalnost, metaboličku aktivnost i strukturni integritet na istom nivou kao sveže srčano tkivo tokom 12 dana.Osim toga, prekomjerno istezanje srčanog tkiva u kulturi izaziva hipertrofičnu srčanu signalizaciju, pružajući dokaze o sposobnosti CTCM-a da oponaša hipertrofična stanja izazvana istezanjem srca.U zaključku, CTCM može modelirati fiziologiju i patofiziologiju srca u kulturi tokom dugih vremenskih perioda, omogućavajući pouzdan skrining lijekova.
Prije kliničkih istraživanja, potrebni su pouzdani in vitro sistemi koji mogu precizno reproducirati fiziološko okruženje ljudskog srca.Takvi sistemi bi trebali oponašati izmijenjeno mehaničko istezanje, rad srca i elektrofiziološka svojstva.Životinjski modeli se obično koriste kao platforma za skrining za srčanu fiziologiju sa ograničenom pouzdanošću u odražavanju efekata lijekova na ljudsko srce1,2.U konačnici, Idealni eksperimentalni model kulture srčanog tkiva (CTCM) je model koji je visoko osjetljiv i specifičan za različite terapijske i farmakološke intervencije, precizno reproducirajući fiziologiju i patofiziologiju ljudskog srca3.Odsustvo takvog sistema ograničava otkriće novih tretmana za srčanu insuficijenciju4,5 i dovelo je do kardiotoksičnosti lijekova kao glavnog razloga za izlazak s tržišta6.
Tokom protekle decenije, osam ne-kardiovaskularnih lekova je povučeno iz kliničke upotrebe jer izazivaju produženje QT intervala što dovodi do ventrikularnih aritmija i iznenadne smrti7.Stoga postoji sve veća potreba za pouzdanim pretkliničkim skrining strategijama za procjenu kardiovaskularne efikasnosti i toksičnosti.Nedavna upotreba kardiomiocita (hiPS-CM) izazvanih pluripotentnim matičnim ćelijama izazvanih ljudima u skriningu lekova i testiranju toksičnosti pruža delimično rešenje ovog problema.Međutim, nezrela priroda hiPS-CM i nedostatak višećelijske složenosti srčanog tkiva glavna su ograničenja ove metode.Nedavne studije su pokazale da se ovo ograničenje može djelomično prevazići korištenjem ranog hiPS-CM za formiranje hidrogelova srčanog tkiva ubrzo nakon početka spontanih kontrakcija i postupnog povećanja električne stimulacije tokom vremena.Međutim, ova hiPS-CM mikrotkiva nemaju zrela elektrofiziološka i kontraktilna svojstva odraslog miokarda.Osim toga, ljudsko srčano tkivo ima složeniju strukturu, koja se sastoji od heterogene mješavine različitih tipova ćelija, uključujući endotelne ćelije, neurone i stromalne fibroblaste, međusobno povezane specifičnim skupovima proteina ekstracelularnog matriksa.Ova heterogenost populacija ne-kardiomiocita11,12,13 u srcu odraslih sisara je glavna prepreka modeliranju srčanog tkiva korištenjem pojedinačnih tipova ćelija.Ova glavna ograničenja naglašavaju važnost razvoja metoda za kultivaciju intaktnog tkiva miokarda u fiziološkim i patološkim uslovima.
Kultivisani tanki (300 µm) preseci ljudskog srca pokazali su se kao obećavajući model intaktnog ljudskog miokarda.Ova metoda omogućava pristup kompletnom 3D višećelijskom sistemu sličnom ljudskom srčanom tkivu.Međutim, do 2019. godine korištenje kultiviranih srčanih rezova bilo je ograničeno kratkim (24 h) preživljavanjem kulture.To je zbog brojnih faktora uključujući nedostatak fizičko-mehaničkog rastezanja, sučelje zrak-tečnost i korištenje jednostavnih medija koji ne podržavaju potrebe srčanog tkiva.Godine 2019. nekoliko istraživačkih grupa pokazalo je da uključivanje mehaničkih faktora u sisteme kulture srčanog tkiva može produžiti život kulture, poboljšati srčanu ekspresiju i oponašati srčanu patologiju.Dvije elegantne studije 17 i 18 pokazuju da jednoosno mehaničko opterećenje ima pozitivan učinak na srčani fenotip tokom kulture.Međutim, ove studije nisu koristile dinamičko trodimenzionalno fizičko-mehaničko opterećenje srčanog ciklusa, budući da su sekcije srca bile opterećene ili izometrijskim vlačnim silama 17 ili linearnim auksotonskim opterećenjem 18 .Ove metode istezanja tkiva rezultirale su supresijom mnogih srčanih gena ili prekomjernom ekspresijom gena povezanih s abnormalnim odgovorima na istezanje.Posebno, Pitoulis et al.19 je razvio dinamičku kupku za kulturu srčanih rezova za rekonstrukciju srčanog ciklusa koristeći povratnu informaciju sonde sile i pogone napetosti.Iako ovaj sistem omogućava preciznije in vitro modeliranje srčanog ciklusa, složenost i niska propusnost metode ograničavaju primenu ovog sistema.Naša laboratorija je nedavno razvila pojednostavljeni sistem uzgoja koji koristi električnu stimulaciju i optimiziranu podlogu za održavanje vitalnosti dijelova svinjskog i ljudskog srčanog tkiva do 6 dana20,21.
U trenutnom rukopisu opisujemo model kulture srčanog tkiva (CTCM) koristeći dijelove svinjskog srca koji uključuje humoralne znakove za rekapitulaciju trodimenzionalne srčane fiziologije i patofiziološke distenzije tokom srčanog ciklusa.Ovaj CTCM može povećati tačnost pretkliničkog predviđanja lijeka na nivo koji nikada prije nije postignut, pružajući isplativ srčani sistem srednjeg protoka koji oponaša fiziologiju/patofiziologiju srca sisara za pretkliničko testiranje lijekova.
Hemodinamski mehanički signali igraju ključnu ulogu u održavanju funkcije kardiomiocita in vitro 22,23,24.U trenutnom rukopisu razvili smo CTCM (Slika 1a) koji može oponašati srčano okruženje odraslih izazivajući električnu i mehaničku stimulaciju na fiziološkim frekvencijama (1,2 Hz, 72 otkucaja u minuti).Kako bi se izbjeglo prekomjerno rastezanje tkiva tokom dijastole, korišćen je uređaj za 3D štampanje za povećanje veličine tkiva za 25% (slika 1b).Električni pejsing indukovan sistemom C-PACE je tempiran da počne 100 ms pre sistole korišćenjem sistema za prikupljanje podataka da bi se u potpunosti reprodukovao srčani ciklus.Sistem kulture tkiva koristi programabilni pneumatski aktuator (LB Engineering, Njemačka) za ciklično širenje fleksibilne silikonske membrane da izazove širenje srčanih kriški u gornjoj komori.Sistem je bio povezan sa eksternom vazdušnom linijom preko pretvarača pritiska, što je omogućilo precizno podešavanje pritiska (± 1 mmHg) i vremena (± 1 ms) (Sl. 1c).
a Pričvrstite dio tkiva na potporni prsten od 7 mm, prikazan plavom bojom, unutar komore za kulturu uređaja.Komora za kulturu je odvojena od vazdušne komore tankom fleksibilnom silikonskom membranom.Postavite brtvu između svake komore kako biste spriječili curenje.Poklopac uređaja sadrži grafitne elektrode koje pružaju električnu stimulaciju.b Šematski prikaz uređaja za veliko tkivo, prstena za vođenje i potpornog prstena.Presjeci tkiva (braon) postavljaju se na predimenzionirani uređaj sa vodećim prstenom postavljenim u žljeb na vanjskoj ivici uređaja.Koristeći vodilicu, pažljivo postavite potporni prsten obložen akrilnim ljepilom za tkivo preko dijela srčanog tkiva.c Grafikon koji prikazuje vrijeme električne stimulacije kao funkciju pritiska u vazdušnoj komori kontrolisanog pomoću programabilnog pneumatskog aktuatora (PPD).Za sinkronizaciju električne stimulacije pomoću senzora pritiska korišten je uređaj za prikupljanje podataka.Kada pritisak u komori za kulturu dostigne postavljeni prag, impulsni signal se šalje na C-PACE-EM kako bi se pokrenula električna stimulacija.d Slika četiri CTCM-a postavljena na policu inkubatora.Četiri uređaja su spojena na jedan PPD preko pneumatskog kruga, a senzori pritiska su umetnuti u hemostatski ventil za praćenje tlaka u pneumatskom krugu.Svaki uređaj sadrži šest dijelova tkiva.
Koristeći jedan pneumatski aktuator, bili smo u mogućnosti da kontrolišemo 4 CTCM uređaja, od kojih je svaki mogao da drži 6 delova tkiva (slika 1d).U CTCM, pritisak vazduha u vazdušnoj komori se pretvara u sinhroni pritisak u komori za tečnost i izaziva fiziološku ekspanziju srčanog preseka (slika 2a i dodatni film 1).Procjena rastezanja tkiva na 80 mm Hg.Art.pokazalo istezanje presjeka tkiva za 25% (slika 2b).Pokazalo se da ovaj postotak rastezanja odgovara fiziološkoj dužini sarkomera od 2,2-2,3 µm za normalnu kontraktilnost srčanog dijela17,19,25.Pokret tkiva je procijenjen korištenjem prilagođenih postavki kamere (dodatna slika 1).Amplituda i brzina kretanja tkiva (sl. 2c, d) odgovarale su istezanju tokom srčanog ciklusa i vremenu tokom sistole i dijastole (slika 2b).Rastezanje i brzina srčanog tkiva tokom kontrakcije i relaksacije ostali su konstantni tokom 12 dana u kulturi (slika 2f).Da bismo procijenili učinak električne stimulacije na kontraktilnost tijekom kulture, razvili smo metodu za određivanje aktivnog deformiteta korištenjem algoritma sjenčanja (dopunska slika 2a,b) i uspjeli smo razlikovati deformitete sa i bez električne stimulacije.Isti dio srca (slika 2f).U pokretnom području reza (R6-9) napon tokom električne stimulacije bio je 20% veći nego u odsustvu električne stimulacije, što ukazuje na doprinos električne stimulacije kontraktilnoj funkciji.
Reprezentativni tragovi pritiska u vazdušnoj komori, pritiska u komori za tečnost i merenja kretanja tkiva potvrđuju da pritisak u komori menja pritisak u komori tečnosti, izazivajući odgovarajuće pomeranje preseka tkiva.b Reprezentativni tragovi procentualnog rastezanja (plavo) odsječaka tkiva koji odgovaraju procentu rastezanja (narandžasto).c Izmereno kretanje srčanog preseka je u skladu sa izmerenom brzinom kretanja.(d) Reprezentativne putanje cikličkog kretanja (plava linija) i brzine (narandžasta tačkasta linija) u krišku srca.e Kvantifikacija vremena ciklusa (n = 19 kriški po grupi, od različitih svinja), vremena kontrakcije (n = 19 kriški po grupi), vremena opuštanja (n = 19 kriški po grupi, od različitih svinja), kretanja tkiva (n = 25).kriške)/grupi od različitih svinja), vršnu sistoličku brzinu (n = 24(D0), 25(D12) kriške/grupi od različitih svinja) i vršnu stopu opuštanja (n=24(D0), 25(D12) kriške/grupi od različitih svinja).Dvostrani Studentov t-test nije pokazao značajnu razliku ni u jednom parametru.f Reprezentativna analiza deformacija tragova tkiva sa (crvenim) i bez (plava) električna stimulacija, deset regionalnih područja preseka tkiva iz istog preseka.Donji paneli pokazuju kvantifikaciju procentualne razlike u naprezanju u presjecima tkiva sa i bez električne stimulacije u deset područja iz različitih sekcija. (n = 8 kriški/grupi od različitih svinja, izvršen je Two-tailed Student t-test; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 kriški/grupi od različitih svinja, izvršen je Two-tailed Student t-test; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 rezova/grupa od različitih svinja, provocira dvostrani t-kriterij Stjudenta; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 sekcija/grupa od različitih svinja, dvostrani Studentov t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组, 来自不同的猪, 进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001,**p < 0,01, 05 ） （n = 8 片/组, 来自不同的猪, 进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001,**p < 0,01, 05 ） (n = 8 rezova/grupa, od različitih svinja, dvostrani kriterijum Stjudenta; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 sekcija/grupi, od različitih svinja, dvostrani Studentov t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Trake greške predstavljaju srednju vrijednost ± standardnu ​​devijaciju.
U našem prethodnom statičkom biomimetičkom sistemu kulture srčanih kriški [20, 21], održavali smo vitalnost, funkciju i strukturni integritet srčanih kriški tokom 6 dana primjenom električne stimulacije i optimizacijom sastava medijuma.Međutim, nakon 10 dana ove brojke su naglo pale.Pozvaćemo se na sekcije uzgajane u našem prethodnom statičkom biomimetičkom sistemu kulture 20, 21 kontrolnim uslovima (Ctrl) i koristićemo našu prethodno optimizovanu podlogu kao MC uslove i kulturu pod istovremenom mehaničkom i električnom stimulacijom (CTCM).pozvao .Prvo smo utvrdili da mehanička stimulacija bez električne stimulacije nije dovoljna za održavanje vitalnosti tkiva tokom 6 dana (dodatna slika 3a,b).Zanimljivo je da je uvođenjem fizio-mehaničke i električne stimulacije primenom STCM-a, održivost 12-dnevnih preseka srca ostala je ista kao kod svežih preseka srca u uslovima MS, ali ne i u Ctrl uslovima, kao što pokazuje MTT analiza (Sl. 1).3a).Ovo sugerira da mehanička stimulacija i simulacija srčanog ciklusa mogu održati odsječke tkiva održivim dvostruko duže nego što je zabilježeno u našem prethodnom sistemu statične kulture.Međutim, procjena strukturnog integriteta presjeka tkiva imunoobilježavanjem srčanog troponina T i konneksina 43 pokazala je da je ekspresija koneksina 43 bila značajno veća u MC tkivima 12. dana nego u kontrolama istog dana.Međutim, uniformna ekspresija koneksina 43 i formiranje Z-diska nisu u potpunosti održane (slika 3b).Koristimo okvir umjetne inteligencije (AI) za kvantificiranje strukturnog integriteta tkiva26, cevovod dubokog učenja zasnovan na slikama baziran na bojenju troponinom-T i koneksinom43 da automatski kvantificiramo strukturni integritet i fluorescenciju srčanih kriški u smislu jačine lokalizacije.Ova metoda koristi konvolucionu neuronsku mrežu (CNN) i okvir dubokog učenja za pouzdano kvantificiranje strukturnog integriteta srčanog tkiva na automatiziran i nepristrasan način, kao što je opisano u referenci.26. MC tkivo je pokazalo poboljšanu strukturnu sličnost sa danom 0 u poređenju sa statičkim kontrolnim presecima.Pored toga, Massonovo trihromsko bojenje je otkrilo značajno manji procenat fibroze u uslovima MS u poređenju sa kontrolnim uslovima 12. dana kulture (slika 3c).Dok je CTCM povećao održivost sekcija srčanog tkiva 12. dana na nivo sličan onom svježeg srčanog tkiva, nije značajno poboljšao strukturni integritet srčanih dijelova.
Stupasti grafikon prikazuje kvantifikaciju održivosti MTT svježih kriški srca (D0) ili kulture kriški srca tokom 12 dana bilo u statičkoj kulturi (D12 Ctrl) ili u CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) kriški/grupa, u jednom smjeru izvode se testovi/grupe;0p <#0. D0 i **p < 0,01 u poređenju sa D12 Ctrl). Stupasti grafikon prikazuje kvantifikaciju vitalnosti MTT svježih kriški srca (D0) ili kulture kriški srca tokom 12 dana bilo u statičkoj kulturi (D12 Ctrl) ili u CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) kriški/grupa, u jednom smjeru se vrši upoređivanje #0##0OVA test iz različitih pika. na D0 i **p < 0,01 u poređenju sa D12 Ctrl).histogram prikazuje kvantifikaciju održivosti presjeka svježeg srca MTT (D0) ili kulture presjeka srca tokom 12 dana bilo u statičkoj kulturi (D12 kontrola) ili CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrola). ), 12 (D12 MC) načinjeni odsječci/grupa, jedan test je obavljen iz različitih sekcija svinja/grupe;####p < 0,0001 u odnosu na D0 i **p < 0,01 u odnosu na D12 Ctrl). ####p < 0,0001 u poređenju sa D0 i **p < 0,01 u poređenju sa D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养 (D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片 (D2心脏切)片 (D2心脏切)片天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测向ANOVA 测自不同猪的的12 (D12 MC) 切片/组,进行单向ANOVA 测向ANOVA 测自不同猪的的的，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养 (D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片 (D20) 中新鲜心脏切片 (D12 MC) (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比,####p < 0,0001,与D12 Ctrl 相比，)**phistogram koji pokazuje kvantifikaciju vitalnosti MTT u svježim dijelovima srca (D0) ili sekcijama srca uzgajanim 12 dana u statičkoj kulturi (D12 kontrola) ili CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrola)), 12 (D12 MC) sekcija/grupa iz različitih OVAN testova;####p < 0,0001 u odnosu na D0, **p < 0,01 u odnosu na D12 Ctrl). ####p < 0,0001 u poređenju sa D0, **p < 0,01 u poređenju sa D12 Ctrl).b Troponin-T (zeleno), koneksin 43 (crveno) i DAPI (plavo) u svježe izoliranim dijelovima srca (D0) ili odsjecima srca kultiviranim u statičkim uvjetima (Ctrl) ili CTCM uvjetima (MC) tokom 12 dana) reprezentativnih imunofluorescentnih slika (prazna skala = 100 µm). Kvantifikacija strukturnog integriteta srčanog tkiva veštačkom inteligencijom (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezova/grupa od svake od različitih svinja, izveden je jednosmerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u poređenju sa D0 i ****p < 01 u poređenju sa D0. Kvantifikacija strukturnog integriteta srčanog tkiva veštačkom inteligencijom (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezova/grupa od različitih svinja, izveden je jednosmerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u poređenju sa D0 i ****p < 01 u poređenju sa D0. Količestvena procena strukturne celosti serdečne tkani iskusstvenim intelektom (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezova/grupa od različitih svinja, provodi jednofaktorni test ANOVA; ####p < 0,0001 u odnosu na D0 i ****p < 0,0,0. Kvantifikacija strukturnog integriteta srčanog tkiva pomoću veštačke inteligencije (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sekcija/grupa od različitih svinja, izveden jednosmerni ANOVA test; ####p < 0,0001 naspram D0 i 0.02 p < 0.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezova/grupa svaki od različitih svinja, jednosmjerni ANOVA test;0##0渎0 ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezova/grupa svaki od različitih svinja, jednosmjerni ANOVA test; ****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Iskusni intelekt za kvantitetnu ocenu strukturne celosti serdžene tkani (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezova/grupa iz različitih svinja, odnosni test ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Za sravnjenost ****p < 0, 0,021. Umjetna inteligencija za kvantificiranje strukturnog integriteta srčanog tkiva (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sekcija/grupa za svaku od različitih svinja, jednosmjerni ANOVA test; ####p<0,0001 vs .D0 Za poređenje. ****02 < Ctrl. c Reprezentativne slike (lijevo) i kvantifikacija (desno) za kriške srca obojene Massonovom trihromnom bojom (Scale gola = 500 µm) (n = 10 kriški/grupi svaka od različitih svinja, izvršen je jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u poređenju sa 0,0001 u poređenju sa D0 i D0201). c Reprezentativne slike (lijevo) i kvantifikacija (desno) za kriške srca obojene Massonovom trihromskom bojom (Scale gola = 500 µm) (n = 10 kriški/grupi svaka od različitih svinja, izvršen je jednosmjerni ANOVA test; #### p < 0,0001 u poređenju sa 0,0001 u poređenju sa D0 i D01 ***p). c Reprezentativne slike (sleva) i količinska ocjena (sprave) rezova srca, ukrašenih trihromnih krasitelja Massona (masštab bez pokrića = 500 mkm) (n = 10 rezova/grupa od različitih svinja, ispunjava se različiti test ANOVA; #### p < 0,0001 i *** p < 0,0001 u odnosu na D Ctrl). c Reprezentativne slike (lijevo) i kvantifikacija (desno) odsječaka srca obojenih Massonovom trihromskom bojom (neobložena skala = 500 µm) (n = 10 sekcija/grupi od različitih svinja, obavljen jednosmjerni ANOVA test; #### p < 0 .0001 u poređenju sa D0 i 0 ***p < 0 . c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸=0 m个切片/组, 每组来自不同的猪,进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，D0 相比0. 。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸壸度 裸壸度 裸尺度度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 单向 组 每 组 每 组 来自 不同 猪相比,***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Reprezentativne slike (sleva) i količinski analiza (sprave) srezova srca, ukrašenih trihromnim krasitelem Massona (čista skala = 500 mkm) (n = 10 rezova/grupa, svaka od svinja, protestira uz pomoć odnofaktornog disperzionog analize ;###000, sravnotešeno s drugom analizom ;###000, sravnotešeno po sporednoj analizi ;###0001 < 0 ***0 2 Ctrl). c Reprezentativne slike (lijevo) i kvantitacija (desno) presjeka srca obojenih Massonovom trihromskom bojom (prazno = 500 µm) (n = 10 sekcija/grupi, svaki od različite svinje, testirano jednosmjernom analizom varijanse ;### # p < 0,0001 u poređenju sa D0, ***02 u poređenju sa D0.Trake greške predstavljaju srednju vrijednost ± standardnu ​​devijaciju.
Pretpostavili smo da bi se dodavanjem malih molekula u medijum kulture mogao poboljšati integritet kardiomiocita i smanjiti razvoj fibroze tokom CTCM kulture.Stoga smo testirali male molekule koristeći naše statičke kontrolne kulture20,21 zbog malog broja zbunjujućih faktora.Za ovaj ekran su odabrani deksametazon (Dex), trijodotironin (T3) i SB431542 (SB).Ovi mali molekuli su ranije korišteni u hiPSC-CM kulturama za induciranje sazrijevanja kardiomiocita povećanjem dužine sarkomera, T-tubula i brzine provođenja.Osim toga, poznato je da i Dex (glukokortikoid) i SB potiskuju upalu29,30.Stoga smo testirali da li bi uključivanje jednog ili kombinacije ovih malih molekula poboljšalo strukturni integritet srčanih dijelova.Za početni skrining, doza svakog spoja je odabrana na osnovu koncentracija koje se obično koriste u modelima ćelijske kulture (1 μM Dex27, 100 nM T327 i 2,5 μM SB31).Nakon 12 dana kulture, kombinacija T3 i Dex-a rezultirala je optimalnim strukturnim integritetom kardiomiocita i minimalnim fibroznim remodeliranjem (dodatne slike 4 i 5).Osim toga, upotreba dvostrukih ili dvostrukih ovih koncentracija T3 i Dex-a proizvela je štetne efekte u usporedbi s normalnim koncentracijama (dodatna slika 6a,b).
Nakon početnog skrininga, izvršili smo direktno poređenje 4 uslova kulture (Slika 4a): Ctrl: sekcije srca kultivirane u našoj prethodno opisanoj statičkoj kulturi koristeći naš optimizirani medij;20.21 TD: T3 i Ctrl s Dodani Dex u srijedu;MC: preseci srca kultivisani u CTCM koristeći naš prethodno optimizovan medijum;i MT: CTCM sa dodanim T3 i Dex u medijum.Nakon 12 dana kultivacije, održivost MS i MT tkiva ostala je ista kao u svježim tkivima procijenjenim MTT testom (slika 4b).Zanimljivo je da dodavanje T3 i Dex u transwell kulture (TD) nije rezultiralo značajnim poboljšanjem vitalnosti u poređenju sa Ctrl uslovima, što ukazuje na važnu ulogu mehaničke stimulacije u održavanju vitalnosti srčanih sekcija.
Dijagram eksperimentalnog dizajna koji prikazuje četiri uslova kulture korišćena za procenu efekata mehaničke stimulacije i T3/Dex suplementacije na medijumu tokom 12 dana. b Trakasti grafikon prikazuje kvantifikaciju vitalnosti 12 dana nakon kulture u sva 4 uslova kulture (Ctrl, TD, MC i MT) u poređenju sa svježim kriškama srca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), 12 (D12 MC) kriški/grupa, jednosmjerni test je izveden iz različitih svinja #0##0p; , ###p < 0,001 u poređenju sa D0 i **p < 0,01 u poređenju sa D12 Ctrl). b Trakasti grafikon prikazuje kvantifikaciju vitalnosti 12 dana nakon kulture u sva 4 uslova kulture (Ctrl, TD, MC i MT) u poređenju sa svježim kriškama srca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), 12 (D12 MC) kriški/grupa, jednosmjerni test je izveden iz različitih svinja #0##0p; , ###p < 0,001 u poređenju sa D0 i **p < 0,01 u poređenju sa D12 ctrl). b Gistogramma pokazuje količinsku ocjenu nesposobnosti kroz 12 dana nakon kultiviranja u svih 4 uvjeta kultiviranja (kontrola, TD, MC i MT) u skladu sa svježim izrezima srca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 TD i D12 MT1, 12 testova s ​​jedne strane), 12 testova od strane svinnjaka. ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 u odnosu na D0 i **p < 0,01 prema u odnosu na D12 Ctrl). b Stupasti grafikon prikazuje kvantifikaciju vitalnosti 12 dana nakon kulture u sva 4 uslova kulture (kontrola, TD, MC i MT) u poređenju sa presjecima svježeg srca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, i D12 MT), 12 (D12 MC, D12 MT), 12 (D12 MC, jedan način ispitivanja iz različitih sekcija; 0001, ###p < 0,001 u odnosu na D0 i **p < 0,01 u poređenju sa D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件 (Ctrl、TD、MC 和MT)）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D15) (D12D1) MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0,0001，###1，###p < 0.000与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Gistogramma, pokazuje sva 4 uslova kultiviranja (kontrolʹ, TD, MC i MT) u skladu sa svežim srezama srca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), od različitih svinja 12 (D12 MC) srezstory/gruppa ##1, ##0grupp0; <0,001 po sravnjenju s D0, **p <0,01 po sravnjenju s kontrolom D12). b Histogram koji prikazuje sva 4 uslova kulture (kontrola, TD, MC i MT) u poređenju sa svežim presecima srca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), od različitih svinja 12 (D12 MC) sekcija/grupa, jednosmerni ANOVA test, ###0p<0.##0p<0.##0p. 0, **p<0,01 u odnosu na kontrolu D12). c Trakasti grafikon prikazuje kvantifikaciju protoka glukoze 12 dana nakon kulture u sva 4 uslova kulture (Ctrl, TD, MC i MT) u poređenju sa svježim kriškama srca (D0) (n = 6 kriški/grupi od različitih svinja, izvršen je jednosmjerni ANOVA test; ###p < 0,001, u poređenju sa D0. c Trakasti grafikon prikazuje kvantifikaciju protoka glukoze 12 dana nakon kulture u sva 4 uslova kulture (Ctrl, TD, MC i MT) u poređenju sa svježim kriškama srca (D0) (n = 6 kriški/grupi od različitih svinja, izvršen je jednosmjerni ANOVA test; ###p < 0,001, u poređenju sa D0. c Gistogramma pokazuje količinsku ocjenu potoka glikoze kroz 12 dana nakon kultiviranja u svih 4 uvjeta kultiviranja (kontrola, TD, MC i MT) u skladu sa svježim srezama srca (D0) (n = 6 rezova/grupa od različitih svinja, odnosni Izvršeno < test ANOVA; ##00 i ***0 u skladu sa ANOVA; ##00 ***p1 po 0 2 Ctrl). c Histogram pokazuje kvantifikaciju fluksa glukoze 12 dana nakon kulture pod sva 4 uslova kulture (kontrola, TD, MC i MT) u poređenju sa svežim presecima srca (D0) (n = 6 sekcija/grupi od različitih svinja, izvršen jednosmerni ANOVA test; ###p < 0,001 u poređenju sa D0 i D01 ***p1). c 条形图显示所有4 种培养条件 (Ctrl、TD、MC 和MT)与新鲜心脏切片(D0) 种培养条件 (Ctrl、TD、MC 和MT) 与新鲜心脏切片 (D0) 相比 相比， 1糖通量定量（n = 6 片/组,来自不同猪,单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0.相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （ (ctrl 、 td 、 mc 和 mt)养 后 后 12 天 的 通 量 定量 （n = 6 片/组 , 来自 猪 , ， ， Ａ ， ， ， ， ， ， ， ，测试；###p < 0,001,与D0 相比,***p <0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Gistogramma, koja pokazuje količinsku ocjenu toka glikoze kroz 12 dana nakon kultiviranja za sva 4 uslova kultiviranja (kontrola, TD, MC i MT) u skladu sa svježim srezovima srca (D0) (n = 6 rezova/grupa, od različitih svinja, odnosno Provedeni # testovi < 0 00 ANOVA, < 0 *** ANOVA; 1 po sravnjenju s D12 (kontrolʹ). c Histogram koji pokazuje kvantifikaciju fluksa glukoze 12 dana nakon kulture za sva 4 uslova kulture (kontrola, TD, MC i MT) u poređenju sa presjecima svježeg srca (D0) (n = 6 sekcija/grupi, od različitih svinja, jednostrano Da li su obavljeni ANOVA testovi, ###p <0,010 u poređenju sa D0,001 ***p < 0,010 ***p < 0,010).d Grafičke analize soja svježeg (plavo), 12. MC (zeleno) i 12. MT (crveno) tkiva na deset regionalnih tačaka presjeka tkiva (n = 4 kriške/grupi, jednosmjerni ANOVA test; nije bilo značajne razlike između grupa).e Vulkanski grafikon koji prikazuje različito eksprimirane gene u svježim dijelovima srca (D0) u poređenju sa dijelovima srca kultiviranim u statičkim uvjetima (Ctrl) ili u MT uvjetima (MT) tokom 10-12 dana.f Heatmap gena sarkomera za srčane preseke kultivisane u svakom od uslova kulture.Trake greške predstavljaju srednju vrijednost ± standardnu ​​devijaciju.
Metabolička ovisnost o prelasku s oksidacije masnih kiselina na glikolizu je znak dediferencijacije kardiomiocita.Nezreli kardiomiociti prvenstveno koriste glukozu za proizvodnju ATP-a i imaju hipoplastične mitohondrije sa nekoliko krista5,32.Analize iskorišćenja glukoze su pokazale da je u uslovima MC i MT iskorišćenje glukoze bilo slično onom u tkivima 0 dana (Slika 4c).Međutim, Ctrl uzorci su pokazali značajno povećanje iskorištenja glukoze u poređenju sa svježim tkivom.Ovo ukazuje da kombinacija CTCM-a i T3/Dex-a poboljšava vitalnost tkiva i čuva metabolički fenotip 12-dnevnih kultiviranih dijelova srca.Pored toga, analiza soja je pokazala da su nivoi soja ostali isti kao u svežem srčanom tkivu tokom 12 dana pod MT i MS uslovima (slika 4d).
Da bismo analizirali ukupni uticaj CTCM-a i T3/Dex-a na globalni transkripcijski pejzaž tkiva srčanog kriška, izveli smo RNAseq na srčanim kriškama iz sva četiri različita stanja kulture (dodatni podaci 1).Zanimljivo je da su MT sekcije pokazale visoku transkripcijsku sličnost sa svježim srčanim tkivom, sa samo 16 različito eksprimiranih od 13.642 gena.Međutim, kao što smo ranije pokazali, Ctrl rezovi su prikazali 1229 različito eksprimiranih gena nakon 10-12 dana u kulturi (slika 4e).Ovi podaci su potvrđeni qRT-PCR gena srca i fibroblasta (dopunska slika 7a-c).Zanimljivo je da su Ctrl sekcije pokazale regulaciju srčanih gena i gena ćelijskog ciklusa i aktivaciju programa inflamatornih gena.Ovi podaci sugeriraju da je dediferencijacija, koja se obično javlja nakon dugotrajnog uzgoja, potpuno oslabljena pod MT uvjetima (dodatna slika 8a,b).Pažljivo proučavanje gena sarkomera pokazalo je da su samo u MT uslovima sačuvani geni koji kodiraju sarkomer (slika 4f) i jonski kanal (dopunska slika 9), štiteći ih od supresije pod Ctrl, TD i MC uslovima.Ovi podaci pokazuju da uz kombinaciju mehaničke i humoralne stimulacije (T3/Dex), transkriptom srčanog kriška može ostati sličan svježim kriškama srca nakon 12 dana u kulturi.
Ovi transkripcijski nalazi su potkrijepljeni činjenicom da je strukturni integritet kardiomiocita u srčanim dijelovima najbolje očuvan u MT uslovima tokom 12 dana, što pokazuje intaktni i lokalizirani koneksin 43 (slika 5a).Dodatno, fibroza u srčanim presjecima pod MT uslovima je značajno smanjena u poređenju sa Ctrl i slično kao kod svježih srčanih presjeka (slika 5b).Ovi podaci pokazuju da kombinacija mehaničke stimulacije i T3/Dex tretmana efikasno čuva srčanu strukturu u srčanim dijelovima u kulturi.
a Reprezentativne imunofluorescentne slike troponina-T (zeleno), koneksina 43 (crveno) i DAPI (plavo) u svježe izolovanim dijelovima srca (D0) ili kultivirani 12 dana u sva četiri uslova kulture srčanog dijela (skala bar = 100 µm).). Kvantifikacija strukturnog integriteta srčanog tkiva pomoću umjetne inteligencije (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) rezova/grupa od različitih svinja, jednosmjerni ANOVA test je izveden; ####p < 0,0001, u poređenju sa D0****0 0 0 0 0 0 0 2 Ctrl). Kvantifikacija strukturnog integriteta srčanog tkiva pomoću umjetne inteligencije (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) rezova/grupa od različitih svinja, jednosmjerni ANOVA test je izveden; #### p < 0,0001, u poređenju sa D0****0 0 0 0 0 0 2 Ctrl). Količestvena procena strukturne celovitosti tkanja srca pomoću iskusnog intelekta (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) rezova/grupa od različitih svinja, sprovedena odnofaktorski test ANOVA; ### p < 0,0001 po < 0,0001 po < 0,0001 po <0,0001 po <0,0001 u odnosu na D0 i *p Ctrl). Kvantifikacija strukturnog integriteta srčanog tkiva korištenjem umjetne inteligencije (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) sekcija/grupa od različitih svinja, obavljen jednosmjerni ANOVA test; #### p < 0,0001 ili u poređenju sa D100 i * p < 0,001. Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性(n = 7(D0 和D12 Ctrl)、5(D12 TD、D12 MC)（D12躉绌D12 MT工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比,或相比,或点p < 0,0001 ，或****p < 0,0001对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） (5 （d12 td 、 d12 mc （d12 mc （智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相1或 Ctrl < 0,05 相1或相比）.Kvantifikacija strukturnog integriteta srčanog tkiva korišćenjem veštačke inteligencije kod različitih svinja (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) sekcija/grupa) sa jednosmernim ANOVA testom;#### p < 0,0001 u odnosu na D0 i *p < 0,05 ili ****p < 0,0001 u odnosu na D12 Ctrl). #### p < 0,0001 u poređenju sa D0 i *p < 0,05 ili ****p < 0,0001 u poređenju sa D12 Ctrl). b Reprezentativne slike i kvantifikacija za kriške srca obojene Massonovom trihromskom bojom (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) kriške/grupi od različitih svinja, izveden je jednosmjerni ANOVA test; 0,001, ili ****p < 0,0001 u poređenju sa D12 Ctrl). b Reprezentativne slike i kvantifikacija za kriške srca obojene Massonovom trihromskom bojom (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) kriške/grupi od različitih svinja, izveden je jednosmjerni ANOVA test; 0,001, ili ****p < 0,0001 u poređenju sa D12 Ctrl). b Reprezentativne slike i količinska ocjena rezova srca, ukrašenih trihromnim krasitelm Massona (masštabna linija = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) srezov/grupa od strane svih svinja, sravnjena ## grupa od različitih svinja, ispunjuje ##0 odno1 svinej0 popunjena; 0 i ***p < 0,001 ili ****p < 0,0001 u odnosu na D12 Ctrl). b Reprezentativne slike i kvantifikacija sekcija srca obojenih Massonovom trihromskom bojom (skala bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) sekcija/grupa od različitih svinja, izvedena jednosmjerna ANOVA. 1 ili ****p < 0,0001 u odnosu na D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化 (比例尺= 500 µm)）1（Tn）1（Dn和D12 MC），来自不同猪的9 个 (D12 MT)）切片/组，进行单因素方差分的減#0.#***0p < 0,001,或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µ10 d = 500 µ12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切凇片 切切片 切片片 切片 ​​切片 切片片 切片 ​​切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析（D#01 <D#01 ，***p < 0,001,或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Reprezentativne slike i količinska ocjena rezova srca, ukrašenih trihromom Massona (masštabna linija = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) rezova od različitih svinja / grupa, odin- sposoban ANp < ##0, jedan- sposoban ANp; ,001 ili ****p < 0,0001 u odnosu na D12 Ctrl). b Reprezentativne slike i kvantifikacija sekcija srca obojenih Massonovim trihromom (skala bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) sekcija različitih svinja/grupa, jedna ANOVA metoda; ##.****0p <0 ****0,0 p<0. < 0,0001 u poređenju sa D12 Ctrl).Trake greške predstavljaju srednju vrijednost ± standardnu ​​devijaciju.
Konačno, sposobnost CTCM-a da oponaša srčanu hipertrofiju procijenjena je povećanjem istezanja srčanog tkiva.U CTCM-u, vršni pritisak u vazdušnoj komori porastao je sa 80 mmHg na 80 mmHg.Art.(normalno rastezanje) do 140 mmHg Art.(Sl. 6a).Ovo odgovara povećanju rastezanja od 32% (slika 6b), što je prethodno prikazano kao odgovarajući postotak rastezanja koji je potreban da bi sekcije srca postigle dužinu sarkomera sličnu onoj koja se vidi kod hipertrofije.Rastezanje i brzina srčanog tkiva tokom kontrakcije i relaksacije ostali su konstantni tokom šest dana kulture (slika 6c).Srčano tkivo iz MT stanja je bilo podvrgnuto normalnom istezanju (MT (Normal)) ili uslovima preopterećenja (MT (OS)) tokom šest dana.Već nakon četiri dana u kulturi, hipertrofični biomarker NT-ProBNP je značajno povišen u medijumu pod MT (OS) uslovima u poređenju sa MT (normalnim) uslovima (slika 7a).Pored toga, nakon šest dana kultivisanja, veličina ćelije u MT (OS) (Slika 7b) značajno se povećala u poređenju sa delovima MT srca (normalno).Osim toga, translokacija NFATC4 jezgre je značajno povećana u prenapregnutim tkivima (slika 7c).Ovi rezultati pokazuju progresivni razvoj patološkog remodeliranja nakon hiperdistenzije i podržavaju koncept da se CTCM uređaj može koristiti kao platforma za proučavanje signalizacije srčane hipertrofije izazvane istezanjem.
Reprezentativni tragovi pritiska u vazdušnoj komori, pritiska u komori za tečnost i merenja kretanja tkiva potvrđuju da pritisak u komori menja pritisak u komori tečnosti, izazivajući odgovarajuće pomeranje preseka tkiva.b Reprezentativni procenat rastezanja i krivulje brzine istezanja za normalno rastegnute (narandžaste) i preopterećene (plave) dijelove tkiva.c Trakasti grafikon koji prikazuje vrijeme ciklusa (n = 19 kriški po grupi, od različitih svinja), vrijeme kontrakcije (n = 18-19 kriški po grupi, od različitih svinja), vrijeme relaksacije (n = 19 kriški po grupi, od različitih svinja) ), amplitudu kretanja tkiva (n = 14 kriški/grupi, od različitih svinja), i vršni broj rezova po grupi, od različitih svinja, i vršni period opuštanja u grupi od različitih svinja. stopa (n = 14 (D0), 15 (D6) ) sekcija/grupa) od različitih svinja), dvostrani Studentov t-test nije pokazao značajnu razliku ni u jednom parametru, što ukazuje da su ovi parametri ostali konstantni tokom 6 dana kulture sa prenaponom.Trake greške predstavljaju srednju vrijednost ± standardnu ​​devijaciju.
a Kvantifikacija stupčastog grafikona koncentracije NT-ProBNP u medijumu za kulturu iz kriški srca uzgojenih u uslovima normalnog rastezanja MT (Norm) ili prekomernog rastezanja (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm i D4 MTOS) kriške/grupe od različitih svinja, upoređeno je dvosmerno sa 0 p 0; a Kvantifikacija stupčastog grafikona koncentracije NT-ProBNP u mediju kulture iz kriški srca uzgojenih u uslovima MT normalnog rastezanja (Norm) ili prekomernog rastezanja (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm i D4 MTOS) kriške/grupa od različitih svinja, upoređeno je 2-stretch 2-0;Kvantitativni histogram koncentracije NT-ProBNP u mediju kulture iz srčanih kriški uzgojenih u uslovima normalnog MT rastezanja (norma) ili preopterećenja (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm i D4).MTOS) kriške/grupe iz različitih svinja, vršena je dvofaktorna analiza;**p < 0,01 po sravnjenju s normalnim rastâženiem). **p < 0,01 u poređenju sa normalnim istezanjem). a MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中 NT-ProBNP 浓度拉伸4 (D2 MTNorm)、3 (D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS)比, p < 0,01). a Kvantifikacija koncentracije NT-ProBNP u srčanim kriškama uzgojenim u uslovima normalnog rastezanja MT (Norm) ili prekomjernog rastezanja (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) iz različitih 猪的切片，叐发动; **u poređenju sa normalnim istezanjem, p < 0,01).histogram Kvantifikacija koncentracija NT-ProBNP u srčanim kriškama uzgojenim u uvjetima normalnog MT rastezanja (norm) ili prekomjernog rastezanja (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) i D4 MTOS) kriške/grupe od različitih svinja, dvosmjerna analiza varijanse;**p < 0,01 po sravnjenju s normalnim rastâženiem). **p < 0,01 u poređenju sa normalnim istezanjem). b Reprezentativne slike za srčane kriške obojene troponinom-T i WGA (lijevo) i kvantifikaciju veličine ćelije (desno) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ćelija/grupi od 10 različitih rezova različitih svinja, izveden je Dvostrani Studentov t-test 0. ****0p01 < . b Reprezentativne slike za srčane kriške obojene troponinom-T i WGA (lijevo) i kvantifikaciju veličine ćelija (desno) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ćelija/grupi od 10 različitih rezova različitih svinja, upoređen je dvorepi Studentov t-test; 0. ****p0 <normalno. b Reprezentativne slike rezova srca, ukrašenih troponinom-T i AZP (sleva) i kvalitativnog određivanja veličine ćelija (sprave) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ćelija/grupe od 10 različitih rezova od različitih svinja, dva- provodi hvostovoj t-krinciji, dva- provocira hvostovoj t-deneniem; ). b Reprezentativne slike presjeka srca obojenih troponinom-T i AZP (lijevo) i kvantifikacijom veličine ćelije (desno) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ćelija/grupi od 10 različitih sekcija različitih svinja, dvorepi Studentov t-test upoređen je sa 0 ****p1 u poređenju sa normalnim 0 ****p1; b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化 (右）染色的心脏切片的切片的仼大小量化（右）染色的心脏切片的切片的仼3表和 =D63表惀 =D63表倃）, 来自不同猪的10 个不同切片的369 (D6 MTNorm) 细胞/组, 两进行有尾学生縉尾学生比，****p < 0,0001). b Reprezentativne slike rezova srca obojenih kalkareinom-T i WGA (lijevo) i veličine ćelije (desno) (n = 330 (D6 MTOS), 369 iz 10 različitih rezova (D6 MTNorm)) Ćelije/组，两方法漌尟s testom ，两方法漌尟t 妭.0001). b Reprezentativne slike sreza srca, ukrašenih troponinom-T i AZP (sleva) i količinska procjena veličine ćelija (sprave) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) od 10 različitih rezova od različitih svinja Kletka/grupe, dvostrani kriteriji **** 0 normalnih razlika 0 0 normalnih razlika; b Reprezentativne slike preseka srca obojenih troponinom-T i AZP (levo) i kvantifikacija veličine ćelije (desno) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) iz 10 različitih preseka različitih svinja) Ćelije/grupa, dvostrani kriterijum Studentov st;****p < 0,0001 u poređenju sa normalnim naprezanjem). c Reprezentativne slike za dan 0 i dan 6 MTOS kriške srca imunoobilježene za troponin-T i NFATC4 i kvantifikaciju translokacije NFATC4 u jezgra CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) kriške/grupe iz različitih svinja, Izveden je dvostrani student; 0 p < 0). c Reprezentativne slike za dan 0 i dan 6 MTOS kriške srca imunoobilježene za troponin-T i NFATC4 i kvantifikaciju translokacije NFATC4 u jezgra CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) kriške/grupe od različitih svinja, Izveden je dvostrani student 0 * t-test). c Reprezentativne slike za rezove srca od 0 i 6 dana MTOS, imunomečenih za troponina-T i NFATC4, i količinsku procjenu translokacije NFATC4 u jadra kavernoznih ćelija (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) srezova/grupa uvrštava se od različitih svinja , dvustoronij, 0 st. c Reprezentativne slike za sekcije srca na MTOS 0 i 6 dana, imunoobilježene na troponin-T i NFATC4, i kvantifikacija translokacije NFATC4 u jezgru kavernoznih ćelija (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) kriške/grupa od različitih svinja) obavljeni su testovi sa dva repa kod učenika;*p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 engl.的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化 (n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生 化)（0.0p 检. c Reprezentativne slike kalkanin-T i NFATC4 imunoobilježavanja 第0天和第6天MTOS kriške srca i NFATC4 iz različitih količina NFATC4 易位至CM ćelijskog jezgra的 (n = 4 (D0), 旄 弶 (D0) ) (n = 4 (D0) )双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Reprezentativne slike rezova srca MTOS na 0 i 6 dana za imunomarkiranje troponinom-T i NFATC4 i količinsku procjenu translokacije NFATC4 u jadra CM od različitih svinja (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) srez/grupa, dva hvostatyj t-kriterij, *0 t-kriterij. c Reprezentativne slike MTOS srčanih kriški na dan 0 i 6 za imunoobilježavanje troponin-T i NFATC4 i kvantifikaciju translokacije NFATC4 u jezgru CM od različitih svinja (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) kriške/grupa, dvostrani Studentov t'-kriterijum. *p.5).Trake greške predstavljaju srednju vrijednost ± standardnu ​​devijaciju.
Translacijska kardiovaskularna istraživanja zahtijevaju ćelijske modele koji precizno reproduciraju srčano okruženje.U ovoj studiji razvijen je i karakteriziran CTCM uređaj koji može stimulirati ultratanke dijelove srca.CTCM sistem uključuje fiziološki sinhronizovanu elektromehaničku stimulaciju i obogaćivanje T3 i Dex tečnosti.Kada su sekcije svinjskog srca bile izložene ovim faktorima, njihova održivost, strukturni integritet, metabolička aktivnost i ekspresija transkripcije ostali su isti kao u svježem srčanom tkivu nakon 12 dana kulture.Osim toga, pretjerano istezanje srčanog tkiva može uzrokovati hipertrofiju srca uzrokovanu hiperekstenzijom.Sve u svemu, ovi rezultati podržavaju kritičnu ulogu uslova fiziološke kulture u održavanju normalnog srčanog fenotipa i pružaju platformu za skrining lijekova.
Mnogi faktori doprinose stvaranju optimalnog okruženja za funkcionisanje i opstanak kardiomiocita.Najočigledniji od ovih faktora se odnose na (1) međućelijske interakcije, (2) elektromehaničku stimulaciju, (3) humoralne faktore i (4) metaboličke supstrate.Fiziološke interakcije između stanica zahtijevaju složene trodimenzionalne mreže više tipova ćelija koje podržava ekstracelularni matriks.Takve složene ćelijske interakcije je teško rekonstruisati in vitro ko-kulturom pojedinačnih tipova ćelija, ali se lako mogu postići korišćenjem organotipske prirode srčanih delova.
Mehaničko istezanje i električna stimulacija kardiomiocita su kritični za održavanje srčanog fenotipa33,34,35.Dok se mehanička stimulacija naširoko koristi za hiPSC-CM kondicioniranje i sazrijevanje, nekoliko elegantnih studija nedavno je pokušalo mehaničku stimulaciju srčanih kriški u kulturi korištenjem jednoosnog opterećenja.Ove studije pokazuju da 2D jednoosno mehaničko opterećenje ima pozitivan učinak na fenotip srca tokom kulture.U ovim studijama, dijelovi srca su bili ili opterećeni izometrijskim zateznim silama17, linearnim auksotonskim opterećenjem18, ili je srčani ciklus ponovo kreiran korištenjem povratne sprege sonde sile i pogona napetosti.Međutim, ove metode koriste jednoosno istezanje tkiva bez optimizacije okoline, što rezultira supresijom mnogih srčanih gena ili prekomjernom ekspresijom gena povezanih s abnormalnim odgovorima na istezanje.Ovdje opisani CTCM pruža 3D elektromehanički stimulus koji oponaša prirodni srčani ciklus u smislu vremena ciklusa i fiziološkog rastezanja (25% istezanja, 40% sistole, 60% dijastole i 72 otkucaja u minuti).Iako ova trodimenzionalna mehanička stimulacija sama po sebi nije dovoljna za održavanje integriteta tkiva, potrebna je kombinacija humoralne i mehaničke stimulacije koristeći T3/Dex da bi se adekvatno održala vitalnost, funkcija i integritet tkiva.
Humoralni faktori igraju važnu ulogu u modulaciji fenotipa srca kod odraslih.Ovo je istaknuto u HiPS-CM studijama u kojima su T3 i Dex dodani u medijum za kulturu da bi se ubrzalo sazrevanje ćelija.T3 može uticati na transport aminokiselina, šećera i kalcijuma kroz ćelijske membrane36.Osim toga, T3 promoviše ekspresiju MHC-α i smanjenje MHC-β, promovišući stvaranje miofibrila koji se brzo trzaju u zrelim kardiomiocitima u poređenju sa miofibrilima koji se sporo trzaju u fetalnom CM.Nedostatak T3 kod hipotireoidnih pacijenata dovodi do gubitka miofibrilarnih traka i smanjene stope razvoja tonusa37.Dex djeluje na glukokortikoidne receptore i pokazalo se da povećava kontraktilnost miokarda u izoliranim perfuziranim srcima;38 se smatra da je ovo poboljšanje povezano sa efektom na ulazak vođen depozitom kalcijuma (SOCE) 39,40.Osim toga, Dex se veže za svoje receptore, uzrokujući široki intracelularni odgovor koji potiskuje imunološku funkciju i upalu30.
Naši rezultati pokazuju da je fizička mehanička stimulacija (MS) poboljšala ukupne performanse kulture u odnosu na Ctrl, ali nije uspjela održati održivost, strukturni integritet i srčanu ekspresiju tokom 12 dana u kulturi.U poređenju sa Ctrl, dodavanje T3 i Dex kulturama CTCM (MT) poboljšalo je održivost i zadržalo slične profile transkripcije, strukturni integritet i metaboličku aktivnost sa svežim srčanim tkivom tokom 12 dana.Pored toga, kontrolom stepena istezanja tkiva, kreiran je model hipertrofije srca izazvane hiperekstenzijom koristeći STCM, ilustrujući svestranost STCM sistema.Treba napomenuti da iako remodeliranje srca i fibroza obično uključuju intaktne organe čije cirkulirajuće stanice mogu osigurati odgovarajuće citokine, kao i fagocitozu i druge faktore remodeliranja, dijelovi srca još uvijek mogu oponašati fibrozni proces kao odgovor na stres i traumu.u miofibroblaste.Ovo je prethodno procijenjeno u ovom modelu srčanog kriška.Treba napomenuti da se CTCM parametri mogu modulirati promjenom pritiska/električne amplitude i frekvencije kako bi se simulirali mnoga stanja kao što su tahikardija, bradikardija i mehanička cirkulacijska potpora (mehaničko neopterećeno srce).Ovo čini sistem srednjim protokom za testiranje na droge.Sposobnost CTCM-a da modelira hipertrofiju srca izazvanu prenaprezanjem otvara put za testiranje ovog sistema za personaliziranu terapiju.U zaključku, ova studija pokazuje da su mehaničko istezanje i humoralna stimulacija kritični za održavanje kulture sekcija srčanog tkiva.
Iako ovdje predstavljeni podaci sugeriraju da je CTCM vrlo obećavajuća platforma za modeliranje intaktnog miokarda, ova metoda kulture ima neka ograničenja.Glavno ograničenje CTCM kulture je to što ona nameće kontinuirane dinamičke mehaničke naprezanja na rezove, što onemogućava aktivno praćenje kontrakcija srčanih rezova tokom svakog ciklusa.Osim toga, zbog male veličine srčanih sekcija (7 mm), mogućnost procjene sistoličke funkcije izvan sistema kulture pomoću tradicionalnih senzora sile je ograničena.U trenutnom rukopisu, djelimično smo prevazišli ovo ograničenje procjenom optičkog napona kao indikatora kontraktilne funkcije.Međutim, ovo ograničenje će zahtijevati daljnji rad i može se riješiti u budućnosti uvođenjem metoda za optičko praćenje funkcije srčanih kriški u kulturi, kao što je optičko mapiranje korištenjem boja osjetljivih na kalcij i napon.Još jedno ograničenje CTCM-a je da radni model ne manipuliše fiziološkim stresom (predopterećenje i naknadno opterećenje).U CTCM-u, pritisak je induciran u suprotnim smjerovima kako bi se reproduciralo 25% fiziološkog rastezanja u dijastoli (puno istezanje) i sistoli (dužina kontrakcije tijekom električne stimulacije) u vrlo velikim tkivima.Ovo ograničenje bi trebalo biti uklonjeno u budućim CTCM dizajnima adekvatnim pritiskom na srčano tkivo sa obe strane i primenom tačnih odnosa pritisak-volumen koji se javljaju u komorama srca.
Remodeliranje izazvano prekomjernim rastezanjem o kojem se govori u ovom rukopisu ograničeno je na oponašanje signala hipertrofičnog hiperistezanja.Dakle, ovaj model može pomoći u proučavanju hipertrofične signalizacije izazvane istezanjem bez potrebe za humoralnim ili neuralnim faktorima (koji ne postoje u ovom sistemu).Potrebne su daljnje studije kako bi se povećala brojnost CTCM-a, na primjer, ko-kultura sa imunim ćelijama, cirkulirajući humoralni faktori plazme i inervacija pri zajedničkom uzgoju sa neuronskim ćelijama će poboljšati mogućnosti modeliranja bolesti sa CTCM-om.
U ovom istraživanju korišćeno je trinaest svinja.Svi postupci na životinjama izvedeni su u skladu sa institucionalnim smjernicama i odobreni su od strane Institucionalne komisije za njegu i korištenje životinja Univerziteta Louisville.Luk aorte je stegnut i srce je perfuzirano sa 1 L sterilne kardioplegije (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL do 7 heparina. pH); srca su čuvana u ledeno hladnom kardioplegičnom rastvoru do transporta u laboratoriju na ledu što je obično <10 min. srca su čuvana u ledeno hladnom kardioplegičnom rastvoru do transporta u laboratoriju na ledu što je obično <10 min. serdca se čuvaju u ledjanom kardioplegnom rastvoru do transporta u laboratoriju na ldu, što obično radi <10 min. srca su čuvana u ledeno hladnom kardioplegičnom rastvoru do transporta u laboratoriju na ledu, što obično traje <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室, 通常<10。钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室, 通常<10。钟 Držite srca u ledjanoj kardioplegiji do transporta u laboratoriju na ldu, obično <10 min. Držite srca na ledu kardioplegija do transporta u laboratoriju na ledu, obično <10 min.
CTCM uređaj je razvijen u SolidWorks softveru za kompjutersko projektovanje (CAD).Komore za kulturu, razdjelnici i zračne komore izrađene su od CNC prozirne akrilne plastike.Potporni prsten promjera 7 mm napravljen je od polietilena visoke gustine (HDPE) u sredini i ima žljeb za o-prsten za smještaj silikonskog o-prstena koji se koristi za brtvljenje medija ispod.Tanka silika membrana odvaja komoru za kulturu od ploče za odvajanje.Silikonska membrana je laserski izrezana od silikonskog lima debljine 0,02″ i ima tvrdoću od 35A.Donja i gornja silikonska brtva su laserski izrezane od 1/16″ debele silikonske ploče i imaju tvrdoću od 50A.Za pričvršćivanje bloka i stvaranje hermetičke brtve koriste se vijci i krilne matice od nehrđajućeg čelika 316L.
Namenska štampana ploča (PCB) je dizajnirana da se integriše sa C-PACE-EM sistemom.Utičnice za konektore za švajcarske mašine na PCB-u su povezane sa grafitnim elektrodama posrebrenim bakarnim žicama i bronzanim 0-60 zavrtnjima uvrnutim u elektrode.Štampana ploča se nalazi u poklopcu 3D štampača.
CTCM uređajem upravlja programabilni pneumatski aktuator (PPD) koji stvara kontrolirani cirkulatorni tlak sličan srčanom ciklusu.Kako se pritisak unutar vazdušne komore povećava, fleksibilna silikonska membrana se širi prema gore, gurajući medijum ispod mesta tkiva.Područje tkiva će se tada istegnuti ovim izbacivanjem tekućine, oponašajući fiziološku ekspanziju srca tokom dijastole.Na vrhuncu relaksacije primenjivana je električna stimulacija preko grafitnih elektroda, što je smanjilo pritisak u vazdušnoj komori i izazvalo kontrakciju preseka tkiva.Unutar cijevi je hemostatski ventil sa senzorom pritiska za detekciju tlaka u zračnom sistemu.Pritisak koji detektuje senzor pritiska primenjuje se na kolektor podataka povezan sa laptopom.Ovo omogućava kontinuirano praćenje pritiska unutar gasne komore.Kada je dostignut maksimalni pritisak u komori (standardni 80 mmHg, 140 mmHg OS), uređaju za prikupljanje podataka je naređeno da pošalje signal sistemu C-PACE-EM da generiše dvofazni naponski signal u trajanju od 2 ms, postavljen na 4 V.
Dobijeni su preseci srca i uslovi kulture u 6 jažica su izvedeni na sledeći način: Prenesite sakupljena srca iz posude za transfer u posudu koja sadrži hladnu (4°C) kardioplegiju.Lijeva komora je izolirana sterilnom oštricom i isječena na komade od 1-2 cm3.Ovi blokovi tkiva su pričvršćeni za podloge za tkivo lepkom za tkivo i stavljeni u vibrirajuću kupku za tkivo mikrotoma koja je sadržavala Tirodov rastvor i kontinuirano oksigenisana (3 g/L 2,3-butandion monooksima (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g) . ), 6 mM KCl (0,1,4 m) , 1,47 g (0,106 g) . 0 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M rastvora), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M rastvora), do 1 L ddH2O).Vibrirajući mikrotom je postavljen da reže kriške debljine 300 µm na frekvenciji od 80 Hz, horizontalnoj amplitudi vibracije od 2 mm i brzini napredovanja od 0,03 mm/s.Kupatilo za tkivo je okruženo ledom da bi se rastvor održao hladnim, a temperatura je održavana na 4°C.Prebacite dijelove tkiva iz kupke za mikrotome u inkubacijsku kupku koja sadrži kontinuirano oksigenirani Tyrode otopinu na ledu dok se ne dobije dovoljno dijelova za jednu ploču za kulturu.Za transwell kulture, sekcije tkiva su pričvršćene na sterilne poliuretanske nosače širine 6 mm i stavljene u 6 ml optimiziranog medija (199 podloga, 1x ITS dodatak, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalni i 2X antibiotik-antifungalni).Električna stimulacija (10 V, frekvencija 1,2 Hz) je primijenjena na dijelove tkiva kroz C-Pace.Za TD uslove, svježi T3 i Dex su dodavani pri 100 nM i 1 μM pri svakoj promjeni medija.Podloga se zasićena kisikom prije zamjene 3 puta dnevno.Sekcije tkiva uzgajane su u inkubatoru na 37°C i 5% CO2.
Za CTCM kulture, isječci tkiva su stavljeni na prilagođeni 3D štampač u Petrijevu posudu koja je sadržavala modificirani Tyrodeov rastvor.Uređaj je dizajniran da poveća veličinu kriške srca za 25% površine potpornog prstena.Ovo se radi tako da se dijelovi srca ne rastežu nakon prenošenja iz Tyrode-ovog rastvora u medijum i tokom dijastole.Pomoću histoakrilnog ljepila sekcije debljine 300 µm su pričvršćene na noseći prsten promjera 7 mm.Nakon što pričvrstite dijelove tkiva na potporni prsten, odrežite višak dijelova tkiva i vratite pričvršćene dijelove tkiva u kupku s Tyrode otopinom na ledu (4°C) dok se ne pripremi dovoljno dijelova za jedan uređaj.Ukupno vreme obrade za sve uređaje ne bi trebalo da prelazi 2 sata.Nakon što je 6 dijelova tkiva pričvršćeno na njihove potporne prstenove, CTCM uređaj je sastavljen.CTCM komora za kulturu je prethodno napunjena sa 21 ml prethodno oksigenirane sredine.Prenesite dijelove tkiva u komoru za kulturu i pažljivo uklonite mjehuriće zraka pomoću pipete.Odsječak tkiva se zatim vodi u rupu i lagano se pritisne na mjesto.Na kraju, postavite poklopac elektrode na uređaj i prenesite uređaj u inkubator.Zatim spojite CTCM na zračnu cijev i C-PACE-EM sistem.Pneumatski aktuator se otvara, a zračni ventil otvara CTCM.C-PACE-EM sistem je konfigurisan da isporučuje 4 V na 1,2 Hz tokom dvofaznog pejsinga u trajanju od 2 ms.Podloga se mijenjala dva puta dnevno, a elektrode su se mijenjale jednom dnevno kako bi se izbjeglo nakupljanje grafita na elektrodama.Ako je potrebno, dijelovi tkiva se mogu ukloniti iz njihovih jažica za kulturu kako bi se izbacili svi mjehurići zraka koji su možda pali ispod njih.Za uslove MT tretmana, T3/Dex je dodan svež sa svakom promenom medijuma sa 100 nM T3 i 1 μM Dex.CTCM uređaji su uzgajani u inkubatoru na 37°C i 5% CO2.
Da bi se dobile istegnute putanje srčanih kriški, razvijen je poseban sistem kamera.Korišten je SLR fotoaparat (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japan) sa Navitar Zoom 7000 18-108 mm makro objektivom (Navitar, San Francisco, CA).Vizualizacija je izvedena na sobnoj temperaturi nakon zamjene medijuma svježim.Kamera je postavljena pod uglom od 51° i video se snima brzinom od 30 sličica u sekundi.Prvo, softver otvorenog koda (MUSCLEMOTION43) je korišten sa Image-J za kvantifikaciju kretanja srčanih kriški.Maska je kreirana korišćenjem MATLAB-a (MathWorks, Natick, MA, SAD) za definisanje regiona od interesa za otkucaje srčanih kriški kako bi se izbegla buka.Ručno segmentirane maske se primjenjuju na sve slike u nizu kadrova, a zatim se prosljeđuju dodatku MUSCLEMOTION.Muscle Motion koristi prosječan intenzitet piksela u svakom kadru da kvantifikuje njegovo kretanje u odnosu na referentni okvir.Podaci su snimljeni, filtrirani i korišteni za kvantifikaciju vremena ciklusa i procjenu istezanja tkiva tokom srčanog ciklusa.Snimljeni video je naknadno obrađen pomoću digitalnog filtera nulte faze prvog reda.Za kvantificiranje rastezanja tkiva (peak-to-peak), peak-to-peak analiza je izvršena da se napravi razlika između vrhova i padova u snimljenom signalu.Osim toga, detrendiranje se izvodi korištenjem polinoma 6. reda kako bi se eliminirao drift signala.Programski kod je razvijen u MATLAB-u za određivanje globalnog kretanja tkiva, vremena ciklusa, vremena relaksacije i vremena kontrakcije (Dopunski programski kod 44).
Za analizu naprezanja, koristeći iste video zapise napravljene za procjenu mehaničkog rastezanja, prvo smo pratili dvije slike koje predstavljaju vrhove kretanja (najvišu (gornju) i najnižu (donju) tačku kretanja) prema softveru MUSCLEMOTION.Zatim smo segmentirali regije tkiva i primijenili oblik algoritma sjenčanja na segmentirano tkivo (dopunska slika 2a).Segmentirano tkivo je zatim podijeljeno na deset podpovršina, a naprezanje na svakoj površini izračunato je pomoću sljedeće jednadžbe: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, gdje su Sup i Sdown udaljenosti oblika od gornje i donje sjene tkanine, respektivno (dopunska slika .2b).
Presjeci srca su fiksirani u 4% paraformaldehidu 48 sati.Fiksna tkiva su dehidrirana u 10% i 20% saharozi tokom 1 h, zatim u 30% saharozi preko noći.Sekcije su zatim ugrađene u smjesu optimalne temperature rezanja (OCT spoj) i postepeno zamrznute u kupelji izopentan/suhi led.Čuvajte OCT blokove za ugradnju na -80 °C do odvajanja.Stakalca su pripremljena kao preseci debljine 8 μm.
Da biste uklonili OCT iz odjeljaka srca, zagrijte stakalce na bloku za grijanje na 95 °C 5 minuta.Dodajte 1 ml PBS u svako stakalce i inkubirajte 30 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim prožmite sekcije postavljanjem 0,1% Triton-X u PBS 15 minuta na sobnoj temperaturi.Da biste spriječili da se nespecifična antitijela vežu za uzorak, dodajte 1 ml 3% otopine BSA u stakalce i inkubirajte 1 sat na sobnoj temperaturi.BSA je zatim uklonjen i stakalca su isprana sa PBS.Svaki uzorak označite olovkom.Primarna antitijela (razrijeđena 1:200 u 1% BSA) (koneksin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) i troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) dodana su tokom 90 minuta, a zatim 10% antitijela protiv Alexsa, zatim 10% BSA10 a Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), protiv zeca Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) dodatnih 90 minuta Opran 3 puta sa PBS Da bismo razlikovali ciljno bojenje od pozadine, koristili smo samo sekundarno antitijelo kao kontrolu. zapečaćena lakom za nokte. -x uvećanje) i Keyence mikroskop sa 40x uvećanjem.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) u 5 μg/ml u PBS-u korišten je za WGA bojenje i primijenjen na fiksne dijelove 30 minuta na sobnoj temperaturi.Stakalca su zatim isprana PBS-om i sudanska crna je dodana u svako stakalce i inkubirana 30 minuta.Stakalca su zatim isprana sa PBS i dodan je vektashield medij za ugradnju.Slajdovi su vizualizirani na Keyence mikroskopu pri 40x uvećanju.
OCT je uklonjen iz uzoraka kako je gore opisano.Nakon uklanjanja OCT-a, uronite stakalce u Bouin-ov rastvor preko noći.Stakalca su zatim ispirana destilovanom vodom 1 sat i zatim stavljena u rastvor fuksina Bibrich aloe kiseline na 10 minuta.Zatim su stakalca isprana destilovanom vodom i stavljena u rastvor 5% fosfomolibdena/5% fosfovolframske kiseline na 10 minuta.Bez ispiranja, prenesite stakalce direktno u rastvor anilin plave boje na 15 minuta.Zatim su predmeti isprani destilovanom vodom i stavljeni u 1% rastvor sirćetne kiseline na 2 minuta.Stakalca su osušena u 200 N etanolu i prebačena u ksilen.Obojena stakalca su vizualizirana pomoću Keyence mikroskopa sa 10x objektivom.Procenat površine fibroze je kvantifikovan korišćenjem softvera Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT test vitalnosti ćelija (Invitrogen, Carlsbad, CA), kataloški broj V13154, prema protokolu proizvođača sa nekim modifikacijama.Konkretno, korišćen je hirurški proboj prečnika 6 mm da bi se obezbedila ujednačena veličina tkiva tokom MTT analize.Tkiva su pojedinačno postavljena u jažice ploče sa 12 jažica koja sadrži MTT supstrat prema protokolu proizvođača.Sekcije se inkubiraju na 37°C tokom 3 sata i živo tkivo metabolizira MTT supstrat da formira ljubičasto jedinjenje formazana.Zamijenite MTT rastvor sa 1 ml DMSO i inkubirajte na 37 °C 15 minuta da biste ekstrahovali ljubičasti formazan iz srčanih delova.Uzorci su razrijeđeni 1:10 u DMSO u pločama sa prozirnim dnom sa 96 jažica, a intenzitet ljubičaste boje je izmjeren na 570 nm pomoću čitača ploča Cytation (BioTek).Očitavanja su normalizovana na težinu svake kriške srca.
Medij za rezove srca zamijenjen je podlogom koji sadrži 1 μCi/ml [5-3H]-glukoze (Moravek Biochemicals, Brea, CA, SAD) za analizu iskorištenja glukoze kao što je prethodno opisano.Nakon 4 sata inkubacije, dodajte 100 µl medijuma u otvorenu epruvetu za mikrocentrifugu koja sadrži 100 µl 0,2 N HCl.Zatim je epruveta stavljena u scintilacionu epruvetu koja sadrži 500 μl dH2O da bi se [3H]2O ispario 72 sata na 37°C.Zatim izvadite epruvetu za mikrocentrifugu iz scintilacione cevi i dodajte 10 ml scintilacione tečnosti.Brojanje scintilacije obavljeno je pomoću Tri-Carb 2900TR tečnog scintilacionog analizatora (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, SAD).Korištenje glukoze je zatim izračunato uzimajući u obzir specifičnu aktivnost [5-3H]-glukoze, nepotpunu ravnotežu i pozadinu, razrjeđivanje [5-3H]-u neobilježenu glukozu i efikasnost scintilacionog brojača.Podaci se normaliziraju na masu dijelova srca.
Nakon homogenizacije tkiva u Trizolu, RNK je izolirana iz srčanih sekcija korištenjem Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 prema protokolu proizvođača.Priprema RNAsec biblioteke, sekvenciranje i analiza podataka obavljeni su na sljedeći način:
1 μg RNK po uzorku je korišten kao polazni materijal za pripremu RNA biblioteke.Biblioteke sekvenciranja su generisane korišćenjem NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit za Illumina (NEB, SAD) prema preporukama proizvođača, a indeksni kodovi su dodati sekvencama atributa za svaki uzorak.Ukratko, mRNA je pročišćena od ukupne RNK pomoću magnetnih kuglica vezanih poli-T oligonukleotidima.Fragmentacija se izvodi upotrebom dvovalentnih katjona na visokoj temperaturi u NEBNext First Strand Synthesis Reaction puferu (5X).Prvi lanac cDNK sintetiziran je korištenjem nasumičnih heksamernih prajmera i M-MuLV reverzne transkriptaze (RNase H-).Drugi lanac cDNK se zatim sintetiše korišćenjem DNK polimeraze I i RNaze H. Preostale pregrade se pretvaraju u tupe krajeve uz pomoć aktivnosti egzonukleaze/polimeraze.Nakon adenilacije 3′ kraja DNK fragmenta, na njega je pričvršćen NEBNext adapter sa strukturom ukosne petlje kako bi se pripremio za hibridizaciju.Za odabir cDNK fragmenata poželjne dužine 150-200 bp.fragmenti biblioteke su pročišćeni pomoću AMPure XP sistema (Beckman Coulter, Beverly, SAD).Zatim je 3 μl USER Enzyme (NEB, SAD) sa cDNK odabranom po veličini ligiranom pomoću adaptera korišteno 15 minuta na 37°C, a zatim 5 minuta na 95°C prije PCR-a.PCR je zatim izveden upotrebom Phusion High-Fidelity DNK polimeraze, univerzalnih PCR prajmera i Index (X) prajmera.Konačno, PCR proizvodi su pročišćeni (AMPure XP sistem) i kvalitet biblioteke je procijenjen na Agilent Bioanalyzer 2100 sistemu.Biblioteka cDNK je zatim sekvencionirana korištenjem Novaseq sekvencera.Datoteke neobrađenih slika iz Illumina su konvertovane u neobrađene čitane pomoću CASAVA Base Calling.Sirovi podaci se pohranjuju u fajlovima formata FASTQ(fq) koji sadrže sekvence čitanja i odgovarajuće osnovne kvalitete.Odaberite HISAT2 da biste uparili čitanja filtriranog sekvenciranja sa referentnim genomom Sscrofa11.1.Općenito, HISAT2 podržava genome bilo koje veličine, uključujući genome veće od 4 milijarde baza, a za većinu parametara su postavljene zadane vrijednosti.Čitanje spajanja iz RNA Seq podataka može se efikasno uskladiti pomoću HISAT2, najbržeg trenutno dostupnog sistema, sa istom ili boljom preciznošću od bilo koje druge metode.
Obilje transkripata direktno odražava nivo ekspresije gena.Nivoi ekspresije gena se procjenjuju obiljem transkripata (broj sekvenci) povezanih sa genomom ili egzonima.Broj čitanja je proporcionalan nivoima genske ekspresije, dužini gena i dubini sekvenciranja.FPKM (fragmenti na hiljadu parova baza transkripta sekvenciranih na milion parova baza) su izračunati i P-vrijednosti diferencijalne ekspresije su određene pomoću DESeq2 paketa.Zatim smo izračunali stopu lažnog otkrivanja (FDR) za svaku P vrijednost koristeći Benjamini-Hochbergov metod9 na osnovu ugrađene R-funkcije “p.adjust”.
RNK izolovana iz srčanih sekcija konvertovana je u cDNK u koncentraciji od 200 ng/μl korišćenjem SuperScript IV Vilo Master mešavine kompanije Thermo (Thermo, kat. br. 11756050).Kvantitativna RT-PCR je izvedena korišćenjem Applied Biosystems Endura Plate Microamp prozirne reakcione ploče sa 384 bunara (Thermo, kat. br. 4483319) i mikroamp optičkog lepka (Thermo, kat. br. 4311971).Reakciona smjesa se sastojala od 5 µl Taqman Fast Advanced Master mješavine (Thermo, kat. br. 4444557), 0,5 µl Taqman Primera i 3,5 µl H2O pomiješanih po jažici.Standardni qPCR ciklusi su vođeni i CT vrijednosti su izmjerene pomoću Applied Biosystems Quantstudio 5 PCR instrumenta u realnom vremenu (modul sa 384 jažice; proizvod # A28135).Taqman prajmeri su kupljeni od Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06908795_m1) H), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1), ACTA2 (Ss04245588 gena su normalizirane na GAP-u) Uzorak je normaliziran.
Oslobađanje NT-ProBNP u medijima je procenjeno korišćenjem NT-ProBNP kompleta (svinja) (kat. br. MBS2086979, MyBioSource) prema protokolu proizvođača.Ukratko, 250 µl svakog uzorka i standarda dodano je u duplikatu u svaku jažicu.Odmah nakon dodavanja uzorka, dodajte 50 µl reagensa za analizu A u svaku jažicu.Lagano protresite ploču i zatvorite zaptivačem.Zatim su tablete inkubirane na 37°C 1 sat.Zatim aspirirajte rastvor i isperite jažice 4 puta sa 350 µl 1X rastvora za ispiranje, svaki put inkubirajući rastvor za ispiranje 1-2 minuta.Zatim dodajte 100 µl reagensa za analizu B po jažici i zatvorite zaptivačem za ploče.Tableta je lagano protresena i inkubirana na 37°C 30 minuta.Aspirirajte rastvor i isperite jažice 5 puta sa 350 µl 1X rastvora za ispiranje.Dodajte 90 µl rastvora supstrata u svaku jažicu i zatvorite ploču.Inkubirajte ploču na 37°C 10-20 minuta.Dodajte 50 µl Stop rastvora u svaku jažicu.Ploča je odmah izmjerena pomoću Cytation (BioTek) čitača ploča postavljenog na 450 nm.
Izvršene su analize snage kako bi se odabrale veličine grupe koje će osigurati >80% snage za detekciju apsolutne promjene parametra od 10% sa stopom greške tipa I od 5%. Izvršene su analize snage kako bi se odabrale veličine grupe koje će osigurati >80% snage za detekciju apsolutne promjene parametra od 10% sa stopom greške tipa I od 5%. Analizne snage su ispunjene za odabir grupa veličina, koje osiguravaju >80% snage za otkrivanje 10% apsolutno promjena parametara sa 5% frekvencije greške tipa I. Izvršena je analiza snage kako bi se odabrale veličine grupe koje bi pružile >80% snage za otkrivanje apsolutne promjene parametara od 10% sa stopom greške tipa I od 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和织゙I寋进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和织゙I寋 Provedena je analiza snage za odabir veličine grupe, koja je omogućila > 80% snage za otkriće 10% apsolutnih promjena parametara i 5% grešaka frekvencije tipa I. Izvršena je analiza snage kako bi se odabrala veličina grupe koja bi pružila >80% snage za otkrivanje 10% apsolutne promjene parametara i 5% stope greške tipa I.Sekcije tkiva su nasumično odabrane prije eksperimenta.Sve analize su bile uslovno slijepe i uzorci su dekodirani tek nakon što su svi podaci analizirani.Za sve statističke analize korišten je softver GraphPad Prism (San Diego, CA). Za sve statistike, p-vrijednosti su smatrane značajnim pri vrijednostima <0,05. Za sve statistike, p-vrijednosti su smatrane značajnim pri vrijednostima <0,05. Za cijelu statistiku p-značenja smatraju značajnim pri značenjima <0,05. Za sve statistike, p-vrijednosti su smatrane značajnim pri vrijednostima <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Za cijelu statistiku p-značenja smatraju značajnim pri značenjima <0,05. Za sve statistike, p-vrijednosti su smatrane značajnim pri vrijednostima <0,05.Dvostrani Studentov t-test je izveden na podacima sa samo 2 poređenja.Jednosmjerna ili dvosmjerna ANOVA korištena je za određivanje značaja između više grupa.Prilikom izvođenja post hoc testova, Tukeyjeva korekcija je primijenjena da bi se uračunala višestruka poređenja.RNAsec podaci imaju posebna statistička razmatranja prilikom izračunavanja FDR-a i p.prilagodbe kao što je opisano u odjeljku Metode.
Za više informacija o dizajnu studije, pogledajte sažetak Izvještaja o istraživanju prirode povezan s ovim člankom.