Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili da onemogućite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Postoji potreba za pouzdanim in vitro sistemom koji može precizno reproducirati fiziološko okruženje srca za testiranje lijekova. Ograničena dostupnost sistema kulture tkiva ljudskog srca dovela je do netačnih interpretacija efekata lijekova na srce. Ovdje smo razvili model kulture tkiva srca (CTCM) koji elektromehanički stimulira srčane kriške i podvrgava se fiziološkom istezanju tokom sistolne i dijastolne faze srčanog ciklusa. Nakon 12 dana kulture, ovaj pristup je djelimično poboljšao održivost srčanih presjeka, ali nije u potpunosti sačuvao njihov strukturni integritet. Stoga smo, nakon skrininga malih molekula, otkrili da je dodavanje 100 nM trijodtironina (T3) i 1 μM deksametazona (Dex) našem mediju održalo mikrostrukturu presjeka 12 dana. U kombinaciji s tretmanom T3/Dex, CTCM sistem je održavao transkripcijske profile, održivost, metaboličku aktivnost i strukturni integritet na istom nivou kao i svježe srčano tkivo 12 dana. Osim toga, prekomjerno istezanje srčanog tkiva u kulturi inducira hipertrofičnu srčanu signalizaciju, što pruža dokaz o sposobnosti CTCM-a da oponaša hipertrofična stanja izazvana istezanjem srca. Zaključno, CTCM može modelirati fiziologiju i patofiziologiju srca u kulturi tokom dužih vremenskih perioda, omogućavajući pouzdan skrining lijekova.
Prije kliničkih istraživanja, potrebni su pouzdani in vitro sistemi koji mogu precizno reproducirati fiziološko okruženje ljudskog srca. Takvi sistemi trebaju oponašati izmijenjeno mehaničko istezanje, otkucaje srca i elektrofiziološka svojstva. Životinjski modeli se često koriste kao platforma za skrining srčane fiziologije s ograničenom pouzdanošću u odražavanju učinaka lijekova na ljudsko srce1,2. U konačnici, Idealni eksperimentalni model kulture srčanog tkiva (CTCM) je model koji je vrlo osjetljiv i specifičan za različite terapijske i farmakološke intervencije, precizno reproducirajući fiziologiju i patofiziologiju ljudskog srca3. Odsustvo takvog sistema ograničava otkrivanje novih tretmana za srčanu insuficijenciju4,5 i dovelo je do kardiotoksičnosti lijekova kao glavnog razloga za izlazak s tržišta6.
Tokom protekle decenije, osam lijekova koji nisu kardiovaskularni povučeno je iz kliničke upotrebe jer uzrokuju produženje QT intervala što dovodi do ventrikularnih aritmija i iznenadne smrti7. Stoga postoji sve veća potreba za pouzdanim predkliničkim strategijama skrininga za procjenu kardiovaskularne efikasnosti i toksičnosti. Nedavna upotreba kardiomiocita izvedenih iz pluripotentnih matičnih ćelija (hiPS-CM) indukovanih ljudskim putem u skriningu lijekova i testiranju toksičnosti pruža djelimično rješenje ovog problema. Međutim, nezrela priroda hiPS-CM i nedostatak višećelijske složenosti srčanog tkiva glavna su ograničenja ove metode. Nedavne studije su pokazale da se ovo ograničenje može djelimično prevazići korištenjem ranog hiPS-CM za formiranje hidrogelova srčanog tkiva ubrzo nakon početka spontanih kontrakcija i postepenim povećanjem električne stimulacije tokom vremena. Međutim, ova hiPS-CM mikrotkiva nemaju zrela elektrofiziološka i kontraktilna svojstva odraslog miokarda. Osim toga, ljudsko srčano tkivo ima složeniju strukturu, koja se sastoji od heterogene mješavine različitih tipova ćelija, uključujući endotelne ćelije, neurone i stromalne fibroblaste, međusobno povezane specifičnim skupovima proteina ekstracelularnog matriksa. Ova heterogenost populacija koje nisu kardiomiociti11,12,13 u srcu odraslih sisara predstavlja glavnu prepreku modeliranju srčanog tkiva korištenjem pojedinačnih tipova ćelija. Ova glavna ograničenja naglašavaju važnost razvoja metoda za kultiviranje intaktnog miokardnog tkiva u fiziološkim i patološkim uslovima.
Tanki presjeci ljudskog srca (300 µm) pokazali su se obećavajućim modelom intaktnog ljudskog miokarda. Ova metoda pruža pristup kompletnom 3D višećelijskom sistemu sličnom tkivu ljudskog srca. Međutim, do 2019. godine, upotreba presjeka srca bila je ograničena kratkim (24 h) preživljavanjem kulture. To je zbog niza faktora, uključujući nedostatak fizičko-mehaničkog istezanja, granicu zrak-tekućina i upotrebu jednostavnih medija koji ne podržavaju potrebe srčanog tkiva. U 2019. godini, nekoliko istraživačkih grupa je pokazalo da uključivanje mehaničkih faktora u sisteme kulture srčanog tkiva može produžiti vijek trajanja kulture, poboljšati srčanu ekspresiju i oponašati srčanu patologiju. Dvije elegantne studije 17 i 18 pokazuju da jednoosno mehaničko opterećenje ima pozitivan učinak na srčani fenotip tokom kulture. Međutim, ove studije nisu koristile dinamičko trodimenzionalno fizičko-mehaničko opterećenje srčanog ciklusa, budući da su presjeci srca opterećeni ili izometrijskim zateznim silama 17 ili linearnim auksotoničnim opterećenjem 18. Ove metode istezanja tkiva rezultirale su supresijom mnogih srčanih gena ili prekomjernom ekspresijom gena povezanih s abnormalnim odgovorima istezanja. Posebno je važno napomenuti da su Pitoulis i saradnici 19 razvili dinamičko kupatilo za kulturu srčanih kriški za rekonstrukciju srčanog ciklusa korištenjem povratne sprege pretvarača sile i pogona za napon. Iako ovaj sistem omogućava preciznije in vitro modeliranje srčanog ciklusa, složenost i nizak protok metode ograničavaju primjenu ovog sistema. Naša laboratorija je nedavno razvila pojednostavljeni sistem kulture korištenjem električne stimulacije i optimiziranog medija za održavanje održivosti sekcija svinjskog i ljudskog srčanog tkiva do 6 dana 20,21.
U ovom rukopisu opisujemo model kulture srčanog tkiva (CTCM) koristeći dijelove svinjskog srca koji uključuje humoralne signale za rekapitulaciju trodimenzionalne srčane fiziologije i patofiziološke distenzije tokom srčanog ciklusa. Ovaj CTCM može povećati tačnost predkliničkog predviđanja lijekova na nivo koji nikada prije nije postignut pružanjem isplativog srčanog sistema srednjeg protoka koji oponaša fiziologiju/patofiziologiju srca sisara za predkliničko testiranje lijekova.
Hemodinamski mehanički signali igraju ključnu ulogu u održavanju funkcije kardiomiocita in vitro 22,23,24. U ovom rukopisu, razvili smo CTCM (Slika 1a) koji može oponašati srčano okruženje odraslih indukujući i električnu i mehaničku stimulaciju na fiziološkim frekvencijama (1,2 Hz, 72 otkucaja u minuti). Kako bi se izbjeglo prekomjerno istezanje tkiva tokom dijastole, korišten je 3D uređaj za štampanje kako bi se povećala veličina tkiva za 25% (Slika 1b). Električna stimulacija inducirana C-PACE sistemom tempirana je da počne 100 ms prije sistole koristeći sistem za akviziciju podataka kako bi se u potpunosti reproducirao srčani ciklus. Sistem za kulturu tkiva koristi programabilni pneumatski aktuator (LB Engineering, Njemačka) za ciklično širenje fleksibilne silikonske membrane kako bi se izazvalo širenje srčanih kriški u gornjoj komori. Sistem je bio povezan sa vanjskom zračnom linijom putem pretvarača pritiska, što je omogućilo precizno podešavanje pritiska (± 1 mmHg) i vremena (± 1 ms) (Slika 1c).
a Pričvrstite presjek tkiva na 7 mm potporni prsten, prikazan plavom bojom, unutar komore za kulturu uređaja. Komora za kulturu je odvojena od komore za zrak tankom fleksibilnom silikonskom membranom. Postavite brtvu između svake komore kako biste spriječili curenje. Poklopac uređaja sadrži grafitne elektrode koje pružaju električnu stimulaciju. b Shematski prikaz velikog uređaja za tkivo, vodećeg prstena i potpornog prstena. Presjeci tkiva (smeđi) postavljeni su na predimenzionirani uređaj s vodećim prstenom postavljenim u žlijeb na vanjskom rubu uređaja. Koristeći vodilicu, pažljivo postavite potporni prsten premazan akrilnim ljepilom za tkivo preko presjeka srčanog tkiva. c Grafikon koji prikazuje vrijeme električne stimulacije kao funkciju tlaka u komori za zrak kojim upravlja programabilni pneumatski aktuator (PPD). Uređaj za akviziciju podataka korišten je za sinhronizaciju električne stimulacije pomoću senzora tlaka. Kada tlak u komori za kulturu dostigne postavljeni prag, impulsni signal se šalje C-PACE-EM-u za pokretanje električne stimulacije. d Slika četiri CTCM-a postavljena na policu inkubatora. Četiri uređaja su povezana s jednim PPD-om putem pneumatskog kruga, a senzori tlaka su umetnuti u hemostatski ventil za praćenje tlaka u pneumatskom krugu. Svaki uređaj sadrži šest sekcija tkiva.
Koristeći jedan pneumatski aktuator, uspjeli smo kontrolirati 4 CTCM uređaja, od kojih je svaki mogao držati 6 presjeka tkiva (Slika 1d). U CTCM-u, pritisak zraka u zračnoj komori pretvara se u sinhroni pritisak u komori za fluid i inducira fiziološko širenje srčanog presjeka (Slika 2a i Dodatni film 1). Evaluacija istezanja tkiva pri 80 mm Hg. Art. pokazala je istezanje presjeka tkiva za 25% (Slika 2b). Pokazalo se da ovaj postotak istezanja odgovara fiziološkoj dužini sarkomera od 2,2–2,3 µm za normalnu kontraktilnost srčanog presjeka17,19,25. Kretanje tkiva procijenjeno je korištenjem prilagođenih postavki kamere (Dodatna slika 1). Amplituda i brzina kretanja tkiva (Slika 2c, d) odgovarali su istezanju tokom srčanog ciklusa i vremenu tokom sistole i dijastole (Slika 2b). Istezanje i brzina srčanog tkiva tokom kontrakcije i relaksacije ostali su konstantni 12 dana u kulturi (Slika 2f). Da bismo procijenili učinak električne stimulacije na kontraktilnost tokom kultivacije, razvili smo metodu za određivanje aktivne deformacije korištenjem algoritma sjenčanja (Dopunska slika 2a,b) i bili smo u mogućnosti razlikovati deformitete sa i bez električne stimulacije. Isti presjek srca (Slika 2f). U pokretnom području reza (R6-9), napon tokom električne stimulacije bio je 20% veći nego u odsustvu električne stimulacije, što ukazuje na doprinos električne stimulacije kontraktilnoj funkciji.
Reprezentativni tragovi mjerenja pritiska u zračnoj komori, pritiska u fluidnoj komori i kretanja tkiva potvrđuju da pritisak u komori mijenja pritisak u fluidnoj komori, uzrokujući odgovarajuće kretanje presjeka tkiva. b Reprezentativni tragovi procentualnog istezanja (plavo) presjeka tkiva koji odgovaraju procentualnom istezanju (narandžasto). c Izmjereno kretanje srčanog presjeka je u skladu s izmjerenom brzinom kretanja. (d) Reprezentativne trajektorije cikličkog kretanja (plava linija) i brzine (narandžasta isprekidana linija) u presjeku srca. e Kvantifikacija vremena ciklusa (n = 19 presjeka po grupi, od različitih svinja), vremena kontrakcije (n = 19 presjeka po grupi), vremena relaksacije (n = 19 presjeka po grupi, od različitih svinja), kretanja tkiva (n = 25 presjeka)/grupi od različitih svinja, vršne sistolne brzine (n = 24(D0), 25(D12) presjeka/grupi od različitih svinja) i vršne brzine relaksacije (n = 24(D0), 25(D12) presjeka/grupi od različitih svinja). Dvostrani Studentov t-test nije pokazao značajnu razliku ni u jednom parametru. Reprezentativni tragovi analize naprezanja presjeka tkiva sa (crvena) i bez (plava) električne stimulacije, deset regionalnih područja presjeka tkiva iz istog presjeka. Donji paneli prikazuju kvantifikaciju procentualne razlike u naprezanju u presjecima tkiva sa i bez električne stimulacije u deset područja iz različitih presjeka. (n = 8 kriški/grupa od različitih svinja, proveden je dvostrani Studentov t-test; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 kriški/grupa od različitih svinja, proveden je dvostrani Studentov t-test; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 rezova/grupa od različitih svinja, provocira dvostrani t-kriterij Stjudenta; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 sekcija/grupa od različitih svinja, dvostrani Studentov t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组, 来自不同的猪, 进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001,**p < 0,01, 05 ） （n = 8 片/组, 来自不同的猪, 进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001,**p < 0,01, 05 ） (n = 8 rezova/grupa, od različitih svinja, dvostrani kriterijum Stjudenta; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 sekcija/grupa, od različitih svinja, dvostrani Studentov t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Trake greške predstavljaju srednju vrijednost ± standardnu ​​devijaciju.
U našem prethodnom statičkom biomimetičkom sistemu kulture srčanih kriški [20, 21], održavali smo održivost, funkciju i strukturni integritet srčanih kriški tokom 6 dana primjenom električne stimulacije i optimizacijom sastava medija. Međutim, nakon 10 dana, ove brojke su naglo opale. Pozvat ćemo se na presjeke kultivirane u našem prethodnom statičkom biomimetičkom sistemu kulture 20, 21 kontrolnim uslovima (Ctrl) i koristit ćemo naš prethodno optimizirani medij kao MC uslove i kulturu pod istovremenom mehaničkom i električnom stimulacijom (CTCM). Prvo smo utvrdili da mehanička stimulacija bez električne stimulacije nije bila dovoljna za održavanje održivosti tkiva tokom 6 dana (Dopunska slika 3a,b). Zanimljivo je da je, uvođenjem fizikalno-mehaničke i električne stimulacije korištenjem STCM-a, održivost 12-dnevnih presjeka srca ostala ista kao i kod svježih presjeka srca pod MS uslovima, ali ne i pod Ctrl uslovima, kao što je prikazano MTT analizom (Slika 1). 3a). Ovo sugerira da mehanička stimulacija i simulacija srčanog ciklusa mogu održati presjeke tkiva održivima dvostruko duže nego što je prijavljeno u našem prethodnom statičkom sistemu kulture. Međutim, procjena strukturnog integriteta presjeka tkiva imunoobilježavanjem srčanog troponina T i koneksina 43 pokazala je da je ekspresija koneksina 43 bila značajno veća u tkivima MC 12. dana nego u kontrolnim grupama istog dana. Međutim, ujednačena ekspresija koneksina 43 i formiranje Z-diska nisu u potpunosti održani (Slika 3b). Koristimo okvir vještačke inteligencije (AI) za kvantifikaciju strukturnog integriteta tkiva26, cjevovod dubokog učenja zasnovan na slici, bojenju troponina-T i koneksina43, za automatsku kvantifikaciju strukturnog integriteta i fluorescencije srčanih presjeka u smislu jačine lokalizacije. Ova metoda koristi konvolucijsku neuronsku mrežu (CNN) i okvir dubokog učenja za pouzdanu kvantifikaciju strukturnog integriteta srčanog tkiva na automatizovan i nepristrasan način, kao što je opisano u referenci.26. Tkivo MC pokazalo je poboljšanu strukturnu sličnost u odnosu na 0. dan u poređenju sa statičkim kontrolnim presjecima. Osim toga, Massonovo trihromno bojenje otkrilo je značajno niži postotak fibroze u uslovima MS u poređenju sa kontrolnim uslovima 12. dana kulture (Slika 3c). Iako je CTCM povećao održivost presjeka srčanog tkiva 12. dana na nivo sličan onome kod svježeg srčanog tkiva, nije značajno poboljšao strukturni integritet presjeka srca.
Stupčasti grafikon prikazuje kvantifikaciju MTT održivosti svježih srčanih kriški (D0) ili kulture srčanih kriški tokom 12 dana, bilo u statičkoj kulturi (D12 Ctrl) ili u CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) kriški/grupa od različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u poređenju sa D0 i **p < 0,01 u poređenju sa D12 Ctrl). Stupčasti grafikon prikazuje kvantifikaciju MTT održivosti svježih srčanih kriški (D0) ili kulture srčanih kriški tokom 12 dana, bilo u statičkoj kulturi (D12 Ctrl) ili u CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) kriški/grupa od različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u poređenju sa D0 i **p < 0,01 u poređenju sa D12 Ctrl).Histogram prikazuje kvantifikaciju održivosti MTT svježih srčanih presjeka (D0) ili kulture srčanih presjeka tokom 12 dana u statičkoj kulturi (D12 kontrola) ili CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrola).) ), 12 (D12 MC) presjeka/grupa od različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test;####p < 0,0001 u odnosu na D0 i **p < 0,01 u odnosu na D12 Ctrl). ####p < 0,0001 u poređenju sa D0 i **p < 0,01 u poređenju sa D12 (Ctrl). a 条形图显示在静态培养 (D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片 (D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，AN自的量化)测试；与D0 相比,####p < 0,0001, 与D12 Ctrl 相比,**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养 (D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片 (D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比,####p < 0,0001相比,**p。)histogram koji prikazuje kvantifikaciju održivosti MTT-a u svježim presjecima srca (D0) ili presjecima srca kultiviranim 12 dana u statičkoj kulturi (D12 kontrola) ili CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 kontrola)), 12 (D12 MC) presjeka/grupa od različitih svinja, jednosmjerni ANOVA test;####p < 0,0001 u odnosu na D0, **p < 0,01 u odnosu na D12 Ctrl). ####p < 0,0001 u poređenju sa D0, **p < 0,01 u poređenju sa D12 (kontrola).b Troponin-T (zeleno), koneksin 43 (crveno) i DAPI (plavo) u svježe izoliranim presjecima srca (D0) ili presjecima srca kultiviranim pod statičkim uvjetima (Ctrl) ili CTCM uvjetima (MC) tokom 12 dana) reprezentativnih imunofluorescentnih slika (prazna skala = 100 µm). Kvantifikacija strukturnog integriteta srčanog tkiva pomoću vještačke inteligencije (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) kriški/grupa, svaka od različite svinje, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u poređenju sa D0 i ****p < 0,0001 u poređenju sa D12 Ctrl). Kvantifikacija strukturnog integriteta srčanog tkiva pomoću vještačke inteligencije (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) kriški/grupa od različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u poređenju sa D0 i ****p < 0,0001 u poređenju sa D12 Ctrl). Količestvena procena strukturne celosti serdečne tkani iskusstvenim intelektom (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezova/grupa od različitih svinja, provodi jednofaktorni test ANOVA; ####p < 0,0001 u odnosu na D0 i ****p < 0,0,0. Kvantifikacija strukturnog integriteta srčanog tkiva pomoću vještačke inteligencije (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sekcija/grupa od različitih svinja, proveden jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u odnosu na D0 i ****p < 0,0001 u poređenju sa D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezova/grupa svaki od različitih svinja, jednosmjerni ANOVA test;0##00相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezova/grupa svaki od različitih svinja, jednosmjerni ANOVA test;0##00;与D0相比,****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Iskusni intelekt za kvantitetnu ocenu strukturne celosti serdžene tkani (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezova/grupa iz različitih svinja, odnosni test ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Za sravnjenost ****p < 0, 0,021. Umjetna inteligencija za kvantifikaciju strukturnog integriteta srčanog tkiva (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sekcija/grupa za svaku od različitih svinja, jednosmjerni ANOVA test; ####p<0,0001 vs .D0 Za poređenje ****p < 0,0001 u poređenju sa D12 Ctrl). c Reprezentativne slike (lijevo) i kvantifikacija (desno) za kriške srca obojene Massonovom trihromnom bojom (Scale gole = 500 µm) (n = 10 kriški/grupa, svaka od različite svinje, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u poređenju sa D0 i ***p < 0,001 u poređenju sa D12 Ctrl). c Reprezentativne slike (lijevo) i kvantifikacija (desno) za kriške srca obojene Massonovom trihromnom bojom (Scale gole = 500 µm) (n = 10 kriški/grupi od svake od različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; #### p < 0,0001 u poređenju sa D0 i ***p < 0,001 u poređenju sa D12 Ctrl). c Reprezentativne slike (sleva) i količinska ocjena (sprave) srezova srca, ukrašenih trihromnih krasitelja Massona (masštab bez pokrića = 500 mkm) (n = 10 rezova/grupa od različitih svinja, ispunjava se odnosni test ANOVA; #### p < 0,0001 i *** p1 u skladu sa D < 0,0001 i ***0 u odnosu na D Ctrl). c Reprezentativne slike (lijevo) i kvantifikacija (desno) dijelova srca obojenih Massonovom trihromnom bojom (neobložena skala = 500 µm) (n = 10 dijelova/grupa od različitih svinja, proveden jednosmjerni ANOVA test; #### p < 0,0001 u poređenju sa D0 i ***p < 0,001 u poređenju sa D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸=嵺 0 10 个切片/组,每组来自不同的猪,进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相0比 <0.0001 与D0 相0比相比）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸壸度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 µm) （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单单 （## 浐0,0001 与D0 相比,***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Reprezentativne slike (sleva) i količinski analiz (sprave) srezova srca, ukrašenih trihromnim krasitelem Massona (čista skala = 500 mkm) (n = 10 rezova/grupa, svaka od svinja, protestira uz pomoć odnofaktornog disperzionog analize ;###000, sravneno po sporednoj analizi ;###000, ***0 p < 0 po sravnjenju s D12 Ctrl). c Reprezentativne slike (lijevo) i kvantifikacija (desno) dijelova srca obojenih Massonovom trihromnom bojom (prazna proba = 500 µm) (n = 10 dijelova/grupi, svaki od različite svinje, testirano jednosmjernom analizom varijanse;### # p < 0,0001 u poređenju sa D0, ***p < 0,001 u poređenju sa D12 Ctrl).Trake greške predstavljaju srednju vrijednost ± standardnu ​​devijaciju.
Pretpostavili smo da se dodavanjem malih molekula u medij za kulturu može poboljšati integritet kardiomiocita i smanjiti razvoj fibroze tokom CTCM kulture. Stoga smo, zbog malog broja faktora koji utiču na rezultate, izvršili skrining za male molekule koristeći naše statičke kontrolne kulture20,21. Deksametazon (Dex), trijodtironin (T3) i SB431542 (SB) su odabrani za ovaj skrining. Ovi mali molekuli su prethodno korišteni u hiPSC-CM kulturama za indukciju sazrijevanja kardiomiocita povećanjem dužine sarkomera, T-tubula i brzine provođenja. Osim toga, poznato je da i Dex (glukokortikoid) i SB potiskuju upalu29,30. Stoga smo testirali da li bi uključivanje jednog ili kombinacije ovih malih molekula poboljšalo strukturni integritet dijelova srca. Za početni skrining, doza svakog spoja je odabrana na osnovu koncentracija koje se obično koriste u modelima ćelijske kulture (1 μM Dex27, 100 nM T327 i 2,5 μM SB31). Nakon 12 dana kulture, kombinacija T3 i Dexa rezultirala je optimalnim strukturnim integritetom kardiomiocita i minimalnim fibroznim remodeliranjem (Dopunske slike 4 i 5). Osim toga, upotreba dvostrukih ili dvostruko većih koncentracija T3 i Dexa proizvela je štetne efekte u poređenju s normalnim koncentracijama (Dopunska slika 6a,b).
Nakon početnog skrininga, izvršili smo direktno poređenje 4 uslova kulture (Slika 4a): Ctrl: presjeci srca kultivisani u našoj prethodno opisanoj statičkoj kulturi koristeći naš optimizovani medij; 20.21 TD: T3 i Ctrl s dodanim Dexom u srijedu; MC: presjeci srca kultivisani u CTCM koristeći naš prethodno optimizovani medij; i MT: CTCM sa T3 i Dexom dodanim u medij. Nakon 12 dana kultivacije, održivost MS i MT tkiva ostala je ista kao i u svježim tkivima procijenjenim MTT testom (Slika 4b). Zanimljivo je da dodavanje T3 i Dexa u transwell kulture (TD) nije rezultiralo značajnim poboljšanjem održivosti u poređenju sa Ctrl uslovima, što ukazuje na važnu ulogu mehaničke stimulacije u održavanju održivosti presjeka srca.
Dijagram eksperimentalnog dizajna koji prikazuje četiri uvjeta kulture korištena za procjenu učinaka mehaničke stimulacije i suplementacije T3/Dex na podlozi tokom 12 dana. b Stupčasti grafikon prikazuje kvantifikaciju održivosti 12 dana nakon kultivacije u sva 4 uvjeta kultivacije (Ctrl, TD, MC i MT) u usporedbi sa svježim srčanim kriškama (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), 12 (D12 MC) kriški/grupa od različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 u usporedbi s D0 i **p < 0,01 u usporedbi s D12 Ctrl). b Trakasti grafikon prikazuje kvantifikaciju održivosti 12 dana nakon kultivacije u sva 4 uvjeta kultivacije (Ctrl, TD, MC i MT) u usporedbi sa svježim srčanim kriškama (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), 12 (D12 MC) kriški/grupa od različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 u usporedbi s D0 i **p < 0,01 u usporedbi s D12 ctrl). b Gistogramma pokazuje količinsku ocjenu nesposobnosti kroz 12 dana nakon kultiviranja u svih 4 uvjeta kultiviranja (kontrola, TD, MC i MT) u skladu sa svježim srezama srca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT12, 12 svinja se aktiviraju) odnostoronnij test ANOVA ####p < 0,0001, ###p < 0,001 po sravnjenju s D0 i **p < 0,01 po sravnjenju s D12 Ctrl). b Trakasti grafikon prikazuje kvantifikaciju održivosti 12 dana nakon kultivacije u sva 4 uslova kultivacije (kontrola, TD, MC i MT) u poređenju sa svježim presjecima srca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), 12 (D12 MC) presjeka/grupa od različitih svinja, jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 u odnosu na D0 i **p < 0,01 u poređenju sa D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件 (Ctrl、TD、MC 和MT)）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D15)、TD1、和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0,0001Ｘ0#0.相比,**p < 0,01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Gistogramma, pokazuje sva 4 uslova kultivisanja (kontrolʹ, TD, MC i MT) u skladu sa svežim srezama srca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), od različitih svinja 12 (D12 MC) odnosni/gruppa## ## test; <0,0001, ###p <0,001 u odnosu na D0, **p <0,01 u odnosu na kontrolu D12). b Histogram koji prikazuje sva 4 uvjeta kulture (kontrolni, TD, MC i MT) u usporedbi sa svježim presjecima srca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD i D12 MT), od različitih svinja 12 (D12 MC) presjeka/grupa, jednosmjerni ANOVA test; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. kontrolni D12). c Trakasti grafikon prikazuje kvantifikaciju fluksa glukoze 12 dana nakon kultivacije u sva 4 uslova kultivacije (Ctrl, TD, MC i MT) u poređenju sa svježim kriškama srca (D0) (n = 6 kriški/grupa od različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ###p < 0,001, u poređenju sa D0 i ***p < 0,001 u poređenju sa D12 Ctrl). c Trakasti grafikon prikazuje kvantifikaciju fluksa glukoze 12 dana nakon kultivacije u sva 4 uslova kultivacije (Ctrl, TD, MC i MT) u poređenju sa svježim kriškama srca (D0) (n = 6 kriški/grupa od različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ###p < 0,001, u poređenju sa D0 i ***p < 0,001 u poređenju sa D12 Ctrl). c Gistogramma pokazuje količinsku ocjenu toka glikoze kroz 12 dana nakon kultiviranja u svih 4 uvjeta kultiviranja (kontrola, TD, MC i MT) u skladu sa svježim srezama srca (D0) (n = 6 rezova/grupa od različitih svinja, odnosni Izvršava se < test ANOVA; ##00 i ***0 u skladu s ANOVA; ##00 <0 po sravnjenju s D12 Ctrl). c Histogram prikazuje kvantifikaciju fluksa glukoze 12 dana nakon kulture pod sva 4 uslova kulture (kontrola, TD, MC i MT) u poređenju sa svježim presjecima srca (D0) (n = 6 presjeka/grupa od različitih svinja, proveden jednosmjerni ANOVA test; ###p < 0,001 u poređenju sa D0 i ***p < 0,001 u poređenju sa D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件 (Ctrl、TD、MC MT)与新鲜心脏切片 (D0) 相比，12养原比天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组, 来自不同猪, 单向执行ANOVA 测试；##01Ｘ伸00.0.相比,***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 ((ctrl 、 td), mc 和 mt) 新鲜 心脏 切片 切片 切片 切片培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001,与D0 相比,***p <0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Gistogramma, koja pokazuje količinsku ocjenu toka glikoze kroz 12 dana nakon kultiviranja za sva 4 uslova kultiviranja (kontrola, TD, MC i MT) u skladu sa svježim srezovima srca (D0) (n = 6 rezova/grupa, od različitih svinja, odnosno Provedeni # testovi s <00 ANOVA, <# 0 ***p; 0,001 po sravnjenju s D12 (kontrolʹ). c Histogram koji prikazuje kvantifikaciju fluksa glukoze 12 dana nakon kulture za sva 4 uslova kulture (kontrola, TD, MC i MT) u poređenju sa svježim presjecima srca (D0) (n = 6 presjeka/grupa, od različitih svinja, unilateralno). Gdje su provedeni ANOVA testovi, ###p < 0,001 u poređenju sa D0, ***p < 0,001 u poređenju sa D12 (kontrola).d Grafikoni analize sojeva svježeg (plavo), MC (zeleno) tkiva 12. dana i MT (crveno) tkiva 12. dana na deset regionalnih presjeka tkiva (n = 4 presjeka/grupa, jednosmjerni ANOVA test; nije bilo značajne razlike između grupa). e Vulkanski grafik prikazuje različito eksprimirane gene u svježim presjecima srca (D0) u poređenju sa presjecima srca kultiviranim pod statičkim uslovima (Ctrl) ili pod MT uslovima (MT) tokom 10-12 dana. f Toplotna mapa gena sarkomera za presjeke srca kultivirane pod svakim od uslova kulture. Trake greške predstavljaju srednju vrijednost ± standardnu ​​devijaciju.
Metabolička ovisnost o prelasku s oksidacije masnih kiselina na glikolizu je obilježje dediferencijacije kardiomiocita. Nezreli kardiomiociti prvenstveno koriste glukozu za proizvodnju ATP-a i imaju hipoplastične mitohondrije s malo krista5,32. Analize iskorištavanja glukoze pokazale su da je pod MC i MT uvjetima iskorištavanje glukoze bilo slično onome u tkivima 0. dana (Slika 4c). Međutim, Ctrl uzorci pokazali su značajno povećanje iskorištavanja glukoze u usporedbi sa svježim tkivom. To ukazuje na to da kombinacija CTCM i T3/Dex poboljšava održivost tkiva i čuva metabolički fenotip 12-dnevnih kultiviranih presjeka srca. Osim toga, analiza soja pokazala je da su nivoi soja ostali isti kao u svježem tkivu srca tokom 12 dana pod MT i MS uvjetima (Slika 4d).
Kako bismo analizirali ukupni utjecaj CTCM-a i T3/Dex-a na globalni transkripcijski pejzaž tkiva srčanih presjeka, izvršili smo RNAseq na srčanim presjecima iz sva četiri različita uvjeta kulture (Dodatni podaci 1). Zanimljivo je da su MT presjeci pokazali visoku transkripcijsku sličnost sa svježim srčanim tkivom, sa samo 16 različito eksprimiranih od 13.642 gena. Međutim, kao što smo ranije pokazali, Ctrl presjeci su pokazali 1229 različito eksprimiranih gena nakon 10-12 dana u kulturi (Slika 4e). Ovi podaci su potvrđeni qRT-PCR-om gena srca i fibroblasta (Dodatna slika 7a-c). Zanimljivo je da su Ctrl presjeci pokazali smanjenje regulacije srčanih i gena ćelijskog ciklusa i aktivaciju programa upalnih gena. Ovi podaci sugeriraju da je dediferencijacija, koja se normalno javlja nakon dugotrajnog kultiviranja, potpuno oslabljena pod MT uvjetima (Dodatna slika 8a,b). Pažljivo proučavanje gena sarkomera pokazalo je da se samo pod MT uslovima očuvaju geni koji kodiraju sarkomeru (slika 4f) i jonski kanal (dopunska slika 9), štiteći ih od supresije pod Ctrl, TD i MC uslovima. Ovi podaci pokazuju da kombinacijom mehaničke i humoralne stimulacije (T3/Dex), transkriptom srčanog kriške može ostati sličan svježim srčanim kriškama nakon 12 dana u kulturi.
Ove transkripcijske nalaze podržava činjenica da se strukturni integritet kardiomiocita u presjecima srca najbolje očuva pod MT uslovima tokom 12 dana, što pokazuje intaktni i lokalizovani koneksin 43 (Slika 5a). Osim toga, fibroza u presjecima srca pod MT uslovima bila je značajno smanjena u poređenju sa Ctrl i slična svježim presjecima srca (Slika 5b). Ovi podaci pokazuju da kombinacija mehaničke stimulacije i tretmana T3/Dex efikasno čuva srčanu strukturu u presjecima srca u kulturi.
Reprezentativne imunofluorescentne slike troponina-T (zeleno), koneksina 43 (crveno) i DAPI (plavo) u svježe izoliranim presjecima srca (D0) ili kultiviranim 12 dana u sva četiri uvjeta kultiviranja presjeka srca (skala = 100 µm). Kvantifikacija strukturnog integriteta srčanog tkiva pomoću vještačke inteligencije (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) kriški/grupa od različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u poređenju sa D0 i *p < 0,05, ili ****p < 0,0001 u poređenju sa D12 Ctrl). Kvantifikacija strukturnog integriteta srčanog tkiva pomoću vještačke inteligencije (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) kriški/grupa od različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; #### p < 0,0001 u poređenju sa D0 i *p < 0,05, ili ****p < 0,0001 u poređenju sa D12 Ctrl). Količestvena procena strukturne celovitosti tkanja srca pomoću iskusnog intelekta (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) rezova/grupa različitih svinja, sprovedena odnofaktorski test ANOVA; ### p < 0,0001 po <0,0001 po <0,0001 po odnosu na D0,005 sravnjeno s D12 Ctrl). Kvantifikacija strukturnog integriteta srčanog tkiva korištenjem vještačke inteligencije (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) sekcija/grupa od različitih svinja, proveden jednosmjerni ANOVA test; #### p < 0,0001 u poređenju sa D0 i *p < 0,05 ili ****p < 0,0001 u poređenju sa D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7 (D0 和D12 Ctrl)、5 (D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组)）进行人工智能量化,进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） (5 （d12 td 、 d12 mc ） ） ） ） mc ）人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0.05 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.Kvantifikacija strukturnog integriteta srčanog tkiva korištenjem umjetne inteligencije kod različitih svinja (n = 7 (D0 i D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC i D12 MT) sekcija/grupa) jednosmjernim ANOVA testom;#### p < 0,0001 u odnosu na D0 i *p < 0,05 ili ****p < 0,0001 u odnosu na D12 Ctrl). #### p < 0,0001 u poređenju sa D0 i *p < 0,05 ili ****p < 0,0001 u poređenju sa D12 (Ctrl). b Reprezentativne slike i kvantifikacija za kriške srca obojene Massonovom trihromnom bojom (skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) kriški/grupa od različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u poređenju sa D0 i ***p < 0,001, ili ****p < 0,0001 u poređenju sa D12 Ctrl). b Reprezentativne slike i kvantifikacija za kriške srca obojene Massonovom trihromnom bojom (skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) kriški/grupa od različitih svinja, proveden je jednosmjerni ANOVA test; ####p < 0,0001 u poređenju sa D0 i ***p < 0,001, ili ****p < 0,0001 u poređenju sa D12 Ctrl). b Reprezentativne slike i količinska ocjena rezova srca, ukrašenih trihromnim krasiteljem Massona (masštabna linija = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) srezova/grupa od različitih svinja, ANp se izvršava <## grupa od različitih svinja, ANp. 0,0001 po sravnjenju s D0 i ***p < 0,001 ili ****p < 0,0001 po sravnjenju s D12 Ctrl). b Reprezentativne slike i kvantifikacija dijelova srca obojenih Massonovom trihromnom bojom (skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) dijelova/grupa od različitih svinja, provedena jednosmjerna ANOVA; ####p < 0,0001 vs. D0 i ***p < 0,001 ili ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化 (比例尺= 500 µm =）1（n) Ctrl、D12 TD 和D12 MC）,来自不同猪的9 个 (D12 MT)）切片/组,进行单因素方差，，进行单因素方差分##0.0.与D0 相比,***p < 0,001, 或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分##00.#0.与D0 相比，***p < 0,001,或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Reprezentativne slike i količinska ocjena sreza srca, ukrašenih trihroma Massona (masštabna linija = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) rezova od različitih svinja / grupe, po #01 ANp0; ***p < 0,001 ili ****p < 0,0001 u odnosu na D12 Ctrl). b Reprezentativne slike i kvantifikacija dijelova srca obojenih Massonovim trihromom (skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD i D12 MC), 9 (D12 MT) dijelova od različitih svinja/grupe, jedna ANOVA metoda; ####p < 0,0001 u poređenju sa D0, ***p < 0,001 ili ****p < 0,0001 u poređenju sa D12 Ctrl).Trake greške predstavljaju srednju vrijednost ± standardnu ​​devijaciju.
Konačno, sposobnost CTCM-a da imitira srčanu hipertrofiju procijenjena je povećanjem istezanja srčanog tkiva. Kod CTCM-a, vršni pritisak u zračnoj komori povećao se sa 80 mmHg na 80 mmHg. Art. (normalno istezanje) do 140 mmHg. Art. (Slika 6a). To odgovara povećanju istezanja od 32% (Slika 6b), što je prethodno prikazano kao odgovarajući postotak istezanja potreban da bi presjeci srca postigli dužinu sarkomera sličnu onoj koja se vidi kod hipertrofije. Istezanje i brzina srčanog tkiva tokom kontrakcije i relaksacije ostali su konstantni tokom šest dana kulture (Slika 6c). Srčano tkivo iz MT uslova bilo je podvrgnuto normalnom istezanju (MT (normalno)) ili uslovima pretjeranog istezanja (MT (OS)) tokom šest dana. Već nakon četiri dana u kulturi, hipertrofični biomarker NT-ProBNP bio je značajno povišen u mediju pod MT (OS) uslovima u poređenju sa MT (normalnim) uslovima (Slika 7a). Osim toga, nakon šest dana kultivacije, veličina ćelija u MT (OS) (Sl. 7b) se značajno povećala u poređenju sa presjecima MT srca (normalno). Pored toga, nuklearna translokacija NFATC4 je značajno povećana u prerastegnutim tkivima (Sl. 7c). Ovi rezultati pokazuju progresivni razvoj patološkog remodeliranja nakon hiperdistenzije i podržavaju koncept da se CTCM uređaj može koristiti kao platforma za proučavanje signalizacije srčane hipertrofije izazvane istezanjem.
Reprezentativni tragovi mjerenja pritiska u zračnoj komori, pritiska u fluidnoj komori i kretanja tkiva potvrđuju da pritisak u komori mijenja pritisak u fluidnoj komori, uzrokujući odgovarajuće kretanje presjeka tkiva. b Reprezentativne krivulje procenta istezanja i brzine istezanja za normalno istegnute (narandžaste) i preistegnute (plave) presjeke tkiva. c Stupčasti grafikon koji prikazuje vrijeme ciklusa (n = 19 presjeka po grupi, od različitih svinja), vrijeme kontrakcije (n = 18-19 presjeka po grupi, od različitih svinja), vrijeme relaksacije (n = 19 presjeka po grupi, od različitih svinja)), amplitudu kretanja tkiva (n = 14 presjeka/grupi, od različitih svinja), vršnu sistolnu brzinu (n = 14 presjeka/grupi, od različitih svinja) i vršnu brzinu relaksacije (n = 14 (D0), 15 (D6) presjeka/grupa) od različitih svinja), dvostrani Studentov t-test nije pokazao značajnu razliku ni u jednom parametru, što ukazuje da su ovi parametri ostali konstantni tokom 6 dana kulture s prenaponom. Trake greške predstavljaju srednju vrijednost ± standardnu ​​devijaciju.
Kvantifikacija koncentracije NT-ProBNP pomoću stupčastog grafikona u podlogama za kulturu iz srčanih kriški kultiviranih pod uvjetima normalnog istezanja MT (Norm) ili prekomjernog istezanja (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm i D4 MTOS) kriške/grupa od različitih svinja, provedena je dvosmjerna ANOVA; **p < 0,01 u usporedbi s normalnim istezanjem). Kvantifikacija koncentracije NT-ProBNP pomoću stupčastog grafikona u podlogama za kulturu iz srčanih kriški kultiviranih pod uvjetima normalnog istezanja MT (Norm) ili prekomjernog istezanja (OS) (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm i D4 MTOS) kriške/grupa od različitih svinja, provedena je dvosmjerna ANOVA; **p < 0,01 u usporedbi s normalnim istezanjem).Kvantitativni histogram koncentracije NT-ProBNP u medijumu za kulturu iz srčanih kriški kultiviranih pod uslovima normalnog MT istezanja (norma) ili prekomjernog istezanja (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm i D4 MTOS) kriške/grupa od različitih svinja, izvršena je dvofaktorska analiza varijanse;**p < 0,01 po sravnjenju s normalnim rastâženiem). **p < 0,01 u poređenju sa normalnim istezanjem). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化 (n = 4 (D2 MTNorm)、3 (D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4) MTOS）来自不同猪的切片/组,进行双向方差分析；**与正常拉伸相比, p < 0,01). a Kvantifikacija koncentracije NT-ProBNP u srčanim kriškama uzgojenim u MT normalnim uslovima rastezanja (Norm) ili prekomjernog rastezanja (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) iz različitih猪的切片/组，可以双向方方发发动 **u poređenju sa normalnim istezanjem, p < 0,01);histogram Kvantifikacija koncentracija NT-ProBNP u srčanim kriškama kultiviranim pod uslovima normalnog MT istezanja (norma) ili prekomjernog istezanja (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) i D4 MTOS) kriški/grupa od različitih svinja, dvosmjerna analiza varijanse;**p < 0,01 po sravnjenju s normalnim rastâženiem). **p < 0,01 u poređenju sa normalnim istezanjem). b Reprezentativne slike za srčane kriške obojene troponinom-T i WGA (lijevo) i kvantifikacija veličine ćelija (desno) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ćelija/grupa iz 10 različitih kriški od različitih svinja, proveden je dvostrani Studentov t-test; ****p < 0,0001 u poređenju sa normalnim istezanjem). b Reprezentativne slike za srčane kriške obojene troponinom-T i WGA (lijevo) i kvantifikacija veličine ćelija (desno) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ćelija/grupa iz 10 različitih kriški od različitih svinja, proveden je dvostrani Studentov t-test; ****p < 0,0001 u poređenju sa normalnim istezanjem). b Reprezentativne slike rezova srca, ukrašenih troponinom-T i AZP (sleva) i kvantitativnog određivanja veličine ćelija (sprave) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ćelija/grupa od 10 različitih rezova od različitih svinja, dva-provodi se hvostovoj t-deti, dva-provodi se hvostovoj t-deti, sravnjenju s ****0100; normalnim rastâženiem). b Reprezentativne slike dijelova srca obojenih troponinom-T i AZP-om (lijevo) i kvantifikacija veličine ćelija (desno) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ćelija/grupa iz 10 različitih dijelova od različitih svinja, proveden je dvostrani Studentov t-test; ****p < 0,0001 u poređenju sa normalnim sojem). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的切片的仼表 =D63表MTOS）, od 10. do 10. do 369 (D6 MTNorm) 检验；与正常拉伸相比,****p <0,0001)。 b Reprezentativne slike srčanih kriški obojenih kalkareinom-T i WGA (lijevo) i veličina ćelija (desno) (n = 330 (D6 MTOS), 369 iz 10 različitih kriški (D6 MTNorm)) Ćelije/组, t-test u poređenju sa normalnim istezanjem, ****p < 0,0001). b Reprezentativne slike sreza srca, ukrašenih troponinom-T i AZP (sleva) i količinska procjena veličine ćelija (sprave) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) od 10 različitih rezova od različitih svinja Kletka/grupe, dvostrani kriteriji **** 0 normalnih razlika 0 0 normalnih razlika; b Reprezentativne slike dijelova srca obojenih troponinom-T i AZP-om (lijevo) i kvantifikacija veličine ćelija (desno) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) iz 10 različitih dijelova od različitih svinja) Ćelije/grupa, dvostrani kriterij Studentovog t; ****p < 0,0001 u poređenju sa normalnim sojem). c Reprezentativne slike za MTOS srčanih kriški imunoobilježenih za troponin-T i NFATC4 na dan 0 i dan 6 i kvantifikacija translokacije NFATC4 u jezgre CM-a (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) kriške/grupa od različitih svinja, proveden je dvostrani Studentov t-test; *p < 0,05). c Reprezentativne slike za MTOS srčanih kriški imunoobilježenih za troponin-T i NFATC4 na dan 0 i dan 6 i kvantifikacija translokacije NFATC4 u jezgre CM-a (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) kriške/grupa od različitih svinja, proveden je dvostrani Studentov t-test; *p < 0,05). c Reprezentativne slike za rezove srca od 0 i 6 dana MTOS, imunomečenih za troponina-T i NFATC4, i količinsku procjenu translokacije NFATC4 u jadra kavernoznih ćelija (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) srezova/grupa uvrštava se od različitih svinja , dvustoronij, 0 st. c Reprezentativne slike za dijelove srca na 0 i 6 dana MTOS, imunoobilježene za troponin-T i NFATC4, i kvantifikacija NFATC4 translokacije u jezgru kavernoznih ćelija (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) dijela/grupa od različitih svinja) izvedena dvostrani Studentov t-test; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至 CM 细胞核的量化 (OSD 6) (OS) = ㌖4（Dn切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)。 c Reprezentativne slike kalkanin-T i NFATC4 imunoobilježavanja 第0天和第6天MTOS srčanih kriški i NFATC4 iz različitih količina NFATC4 易位至CM ćelijskog jezgra的(n = 4 (D0), 组弄/MTOS, 3时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Reprezentativne slike rezova srca MTOS na 0 i 6 dana za imunomarkiranje troponinom-T i NFATC4 i količinsku procjenu translokacije NFATC4 u jadra CM od različitih svinja (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) srez/grupa, dva hvostatyj t-kriterij, *0 t-kriterij. c Reprezentativne slike MTOS srčanih kriški na dan 0 i 6 za imunoobilježavanje troponinom-T i NFATC4 i kvantifikaciju NFATC4 translokacije u jezgru CM kod različitih svinja (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) kriške/grupa, dvostrani t-kriterij Studentovog; *p < 0,05).Trake greške predstavljaju srednju vrijednost ± standardnu ​​devijaciju.
Translacijska kardiovaskularna istraživanja zahtijevaju ćelijske modele koji precizno reproduciraju srčano okruženje. U ovoj studiji razvijen je i okarakteriziran CTCM uređaj koji može stimulirati ultratanke dijelove srca. CTCM sistem uključuje fiziološki sinhroniziranu elektromehaničku stimulaciju i obogaćivanje T3 i Dex tekućinom. Kada su dijelovi svinjskog srca bili izloženi ovim faktorima, njihova održivost, strukturni integritet, metabolička aktivnost i transkripcijska ekspresija ostali su isti kao u svježem srčanom tkivu nakon 12 dana kulture. Osim toga, prekomjerno istezanje srčanog tkiva može uzrokovati hipertrofiju srca uzrokovanu hiperekstenzijom. Sveukupno, ovi rezultati podržavaju ključnu ulogu fizioloških uvjeta kulture u održavanju normalnog srčanog fenotipa i pružaju platformu za skrining lijekova.
Mnogi faktori doprinose stvaranju optimalnog okruženja za funkcionisanje i preživljavanje kardiomiocita. Najočitiji od ovih faktora povezani su sa (1) međućelijskim interakcijama, (2) elektromehaničkom stimulacijom, (3) humoralnim faktorima i (4) metaboličkim supstratima. Fiziološke interakcije između ćelija zahtijevaju složene trodimenzionalne mreže više tipova ćelija koje podržava ekstracelularni matriks. Takve složene ćelijske interakcije je teško rekonstruisati in vitro kokulturom pojedinačnih tipova ćelija, ali se mogu lako postići korištenjem organotipske prirode presjeka srca.
Mehaničko istezanje i električna stimulacija kardiomiocita su ključni za održavanje srčanog fenotipa33,34,35. Dok se mehanička stimulacija široko koristi za kondicioniranje i sazrijevanje hiPSC-CM, nekoliko elegantnih studija je nedavno pokušalo mehaničku stimulaciju srčanih kriški u kulturi korištenjem jednoosnog opterećenja. Ove studije pokazuju da 2D jednoosno mehaničko opterećenje ima pozitivan učinak na fenotip srca tokom kulture. U ovim studijama, dijelovi srca su ili opterećeni izometrijskim zateznim silama17, linearnim auksotoničnim opterećenjem18 ili je srčani ciklus rekreiran korištenjem povratne informacije pretvarača sile i pogona zatezanja. Međutim, ove metode koriste jednoosno istezanje tkiva bez optimizacije okoline, što rezultira supresijom mnogih srčanih gena ili prekomjernom ekspresijom gena povezanih s abnormalnim odgovorima istezanja. CTCM opisan ovdje pruža 3D elektromehanički stimulus koji oponaša prirodni srčani ciklus u smislu vremena ciklusa i fiziološkog istezanja (25% istezanja, 40% sistole, 60% dijastole i 72 otkucaja u minuti). Iako ova trodimenzionalna mehanička stimulacija sama po sebi nije dovoljna za održavanje integriteta tkiva, potrebna je kombinacija humoralne i mehaničke stimulacije korištenjem T3/Dex-a kako bi se adekvatno održali održivost, funkcija i integritet tkiva.
Humoralni faktori igraju važnu ulogu u modulaciji fenotipa odraslog srca. Ovo je istaknuto u HiPS-CM studijama u kojima su T3 i Dex dodani u podlogu za kulturu kako bi se ubrzalo sazrijevanje ćelija. T3 može utjecati na transport aminokiselina, šećera i kalcija kroz ćelijske membrane36. Osim toga, T3 promovira ekspresiju MHC-α i smanjenje MHC-β, promovirajući stvaranje brzih miofibrila u zrelim kardiomiocitima u usporedbi sa sporim miofibrilama kod fetalnog CM. Nedostatak T3 kod hipotireoznih pacijenata rezultira gubitkom miofibrilnih traka i smanjenom stopom razvoja tonusa37. Dex djeluje na glukokortikoidne receptore i pokazalo se da povećava kontraktilnost miokarda u izoliranim perfuziranim srcima;38 smatra se da je ovo poboljšanje povezano s učinkom na ulazak uzrokovan depozitima kalcija (SOCE)39,40. Osim toga, Dex se veže za svoje receptore, uzrokujući široki unutarćelijski odgovor koji suzbija imunološku funkciju i upalu30.
Naši rezultati pokazuju da je fizička mehanička stimulacija (MS) poboljšala ukupne performanse kulture u poređenju sa Ctrl, ali nije uspjela održati održivost, strukturni integritet i srčanu ekspresiju tokom 12 dana u kulturi. U poređenju sa Ctrl, dodatak T3 i Dexa u CTCM (MT) kulture poboljšao je održivost i održao slične transkripcijske profile, strukturni integritet i metaboličku aktivnost sa svježim srčanim tkivom tokom 12 dana. Pored toga, kontrolisanjem stepena istezanja tkiva, kreiran je model srčane hipertrofije izazvane hiperekstenzijom korištenjem STCM sistema, ilustrujući svestranost STCM sistema. Treba napomenuti da iako remodeliranje srca i fibroza obično uključuju intaktne organe čije cirkulirajuće ćelije mogu obezbijediti odgovarajuće citokine, kao i fagocitozu i druge faktore remodeliranja, dijelovi srca i dalje mogu oponašati fibrotični proces kao odgovor na stres i traumu. Ovo je prethodno procijenjeno u ovom modelu srčanog presjeka. Treba napomenuti da se parametri CTCM-a mogu modulirati promjenom pritiska/električne amplitude i frekvencije kako bi se simulirala mnoga stanja kao što su tahikardija, bradikardija i mehanička cirkulatorna podrška (mehanički neopterećeno srce). Ovo čini sistem srednjim protokom za testiranje lijekova. Sposobnost CTCM-a da modelira srčanu hipertrofiju izazvanu prenaprezanjem otvara put testiranju ovog sistema za personaliziranu terapiju. Zaključno, ova studija pokazuje da su mehaničko istezanje i humoralna stimulacija ključni za održavanje kulture presjeka srčanog tkiva.
Iako podaci predstavljeni ovdje ukazuju na to da je CTCM vrlo obećavajuća platforma za modeliranje intaktnog miokarda, ova metoda kulture ima neka ograničenja. Glavno ograničenje CTCM kulture je to što nameće kontinuirana dinamička mehanička naprezanja na kriške, što onemogućava aktivno praćenje kontrakcija srčanih kriški tokom svakog ciklusa. Osim toga, zbog male veličine srčanih sekcija (7 mm), mogućnost procjene sistolne funkcije izvan sistema kulture korištenjem tradicionalnih senzora sile je ograničena. U ovom rukopisu djelimično prevazilazimo ovo ograničenje procjenom optičkog napona kao indikatora kontraktilne funkcije. Međutim, ovo ograničenje će zahtijevati daljnji rad i može se riješiti u budućnosti uvođenjem metoda za optičko praćenje funkcije srčanih kriški u kulturi, kao što je optičko mapiranje korištenjem kalcija i naponski osjetljivih boja. Još jedno ograničenje CTCM-a je to što radni model ne manipuliše fiziološkim stresom (predopterećenje i postopterećenje). U CTCM-u, pritisak je induciran u suprotnim smjerovima kako bi se reproduciralo 25% fiziološkog istezanja u dijastoli (puno istezanje) i sistoli (dužina kontrakcije tokom električne stimulacije) u vrlo velikim tkivima. Ovo ograničenje treba ukloniti u budućim dizajnima CTCM-a adekvatnim pritiskom na srčano tkivo sa obje strane i primjenom tačnih odnosa pritiska i volumena koji se javljaju u srčanim komorama.
Remodeliranje izazvano prekomjernim istezanjem o kojem se izvještava u ovom rukopisu ograničeno je na imitiranje hipertrofičnih signala hiperistezanja. Stoga, ovaj model može pomoći u proučavanju hipertrofične signalizacije izazvane istezanjem bez potrebe za humoralnim ili neuralnim faktorima (koji ne postoje u ovom sistemu). Potrebna su daljnja istraživanja kako bi se povećala multiplicitet CTCM-a, na primjer, ko-kultivacija s imunološkim ćelijama, cirkulirajućim humoralnim faktorima plazme i inervacija pri ko-kultivaciji s neuronskim ćelijama poboljšat će mogućnosti modeliranja bolesti s CTCM-om.
U ovoj studiji korišteno je trinaest svinja. Svi postupci na životinjama provedeni su u skladu sa institucionalnim smjernicama i odobreni su od strane Institucionalnog odbora za njegu i korištenje životinja Univerziteta u Louisvilleu. Aortni luk je stegnut, a srce je perfuzirano sa 1 L sterilne kardioplegije (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparina, pH do 7,4); Srca su čuvana u ledeno hladnom kardioplegičnom rastvoru do transporta u laboratorij na ledu, što obično traje <10 minuta. Srca su čuvana u ledeno hladnom kardioplegičnom rastvoru do transporta u laboratorij na ledu, što obično traje <10 minuta. serdca se čuvaju u ledjanom kardioplegnom rastvoru do transporta u laboratoriju na ldu, što obično radi <10 min. Srca su pohranjena u ledeno hladnoj kardioplegičnoj otopini do transporta u laboratorij na ledu, što obično traje <10 minuta.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室, 通常<10。钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室, 通常<10。钟 Držite srca u ledjanoj kardioplegiji do transporta u laboratoriju na ldu, obično <10 min. Držite srca na ledenoj kardioplegiji do transporta u laboratoriju na ledu, obično <10 minuta.
CTCM uređaj je razvijen u SolidWorks softveru za računarski potpomognuto projektovanje (CAD). Komore za kulturu, pregrade i zračne komore izrađene su od prozirne akrilne plastike obrađene CNC mašinom. Potporni prsten promjera 7 mm izrađen je od polietilena visoke gustoće (HDPE) u sredini i ima žlijeb za o-prsten za smještaj silikonskog o-prstena koji se koristi za brtvljenje medija ispod. Tanka silikatna membrana odvaja komoru za kulturu od ploče za odvajanje. Silikonska membrana je laserski izrezana od silikonskog lima debljine 0,02″ i ima tvrdoću od 35A. Donja i gornja silikonska brtva su laserski izrezane od silikonskog lima debljine 1/16″ i imaju tvrdoću od 50A. Vijci i krilate matice od nehrđajućeg čelika 316L koriste se za pričvršćivanje bloka i stvaranje hermetičkog brtvljenja.
Namjenska štampana ploča (PCB) dizajnirana je za integraciju sa C-PACE-EM sistemom. Utičnice konektora Swiss Machine na PCB-u povezane su sa grafitnim elektrodama pomoću posrebrenih bakrenih žica i bronzanih vijaka 0-60 uvrnutih u elektrode. Štampana ploča se nalazi u poklopcu 3D štampača.
CTCM uređajem upravlja programabilni pneumatski aktuator (PPD) koji stvara kontrolirani cirkulatorni pritisak sličan srčanom ciklusu. Kako se pritisak unutar zračne komore povećava, fleksibilna silikonska membrana se širi prema gore, prisiljavajući medij ispod mjesta tkiva. Područje tkiva će se zatim rastegnuti ovim izbacivanjem tekućine, oponašajući fiziološko širenje srca tokom dijastole. Na vrhuncu relaksacije, primijenjena je električna stimulacija putem grafitnih elektroda, što je smanjilo pritisak u zračnoj komori i izazvalo kontrakciju dijelova tkiva. Unutar cijevi nalazi se hemostatski ventil sa senzorom pritiska za detekciju pritiska u zračnom sistemu. Pritisak koji osjeti senzor pritiska primjenjuje se na kolektor podataka povezan s laptopom. To omogućava kontinuirano praćenje pritiska unutar plinske komore. Kada se dostigne maksimalni pritisak u komori (standardno 80 mmHg, 140 mmHg OS), uređaju za akviziciju podataka je naređeno da pošalje signal C-PACE-EM sistemu kako bi generirao dvofazni naponski signal tokom 2 ms, postavljen na 4 V.
Dobijeni su presjeci srca i uslovi kultivacije u 6 jažica su provedeni na sljedeći način: Sakupljena srca su prebačena iz posude za transfer u posudu koja sadrži hladnu (4°C) kardioplegiju. Lijeva komora je izolovana sterilnom oštricom i izrezana na komade od 1-2 cm3. Ovi blokovi tkiva su pričvršćeni za nosače tkiva pomoću ljepila za tkivo i postavljeni u vibrirajuću mikrotomsku kupku za tkivo koja sadrži Tyrodeov rastvor i kontinuirano oksigenovana (3 g/L 2,3-butandion monooksima (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glukoze (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M rastvora), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M rastvora), do 1 L ddH2O). Vibrirajući mikrotom je postavljen za rezanje kriški debljine 300 µm na frekvenciji od 80 Hz, horizontalnoj amplitudi vibracije od 2 mm i brzini napredovanja od 0,03 mm/s. Kupka za tkivo je bila okružena ledom kako bi se rastvor održao hladnim, a temperatura je održavana na 4°C. Presjeci tkiva su preneseni iz kupke za mikrotom u inkubacijsku kupku koja sadrži kontinuirano oksigenirani Tyrode rastvor na ledu dok se ne dobije dovoljno presjeka za jednu ploču za kulturu. Za transwell kulture, presjeci tkiva su pričvršćeni na sterilne poliuretanske nosače širine 6 mm i smješteni u 6 ml optimiziranog medija (199 medij, 1x ITS dodatak, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalni i 2X antibiotik-antifungal). Električna stimulacija (10 V, frekvencija 1,2 Hz) je primijenjena na presjeke tkiva putem C-Pace. Za TD uslove, svježi T3 i Dex su dodavani u koncentracijama od 100 nM i 1 μM pri svakoj promjeni medija. Medij se zasićuje kisikom prije zamjene 3 puta dnevno. Presjeci tkiva su kultivirani u inkubatoru na 37°C i 5% CO2.
Za CTCM kulture, presjeci tkiva su postavljeni na prilagođeni 3D printer u Petrijevoj zdjelici koja sadrži modificirani Tyrodeov rastvor. Uređaj je dizajniran da poveća veličinu kriške srca za 25% površine potpornog prstena. To se radi kako se presjeci srca ne bi rastezali nakon prenošenja iz Tyrodeovog rastvora u medij i tokom dijastole. Korištenjem histoakrilnog ljepila, presjeci debljine 300 µm su fiksirani na potporni prsten promjera 7 mm. Nakon pričvršćivanja presjeka tkiva na potporni prsten, odrežite višak presjeka tkiva i pričvršćene presjeke tkiva vratite u kupku Tyrodeovog rastvora na ledu (4°C) dok se ne pripremi dovoljno presjeka za jedan uređaj. Ukupno vrijeme obrade za sve uređaje ne smije biti duže od 2 sata. Nakon što je 6 presjeka tkiva pričvršćeno na njihove potporne prstenove, CTCM uređaj je sastavljen. Komora za CTCM kulturu je prethodno napunjena sa 21 ml prethodno oksigeniranog medija. Prenesite presjeke tkiva u komoru za kulturu i pažljivo uklonite sve mjehuriće zraka pipetom. Presjek tkiva se zatim uvodi u otvor i nježno pritiska na mjesto. Na kraju, stavite poklopac elektrode na uređaj i prebacite uređaj u inkubator. Zatim spojite CTCM na cijev za zrak i C-PACE-EM sistem. Pneumatski aktuator se otvara, a zračni ventil otvara CTCM. C-PACE-EM sistem je konfigurisan da isporučuje 4 V na 1,2 Hz tokom bifaznog stimulisanja u trajanju od 2 ms. Medij je mijenjan dva puta dnevno, a elektrode su mijenjane jednom dnevno kako bi se izbjeglo nakupljanje grafita na elektrodama. Ako je potrebno, presjeci tkiva mogu se ukloniti iz njihovih jažica za kulturu kako bi se istisnuli svi mjehurići zraka koji su možda pali ispod njih. Za uslove MT tretmana, T3/Dex je dodavan svjež sa svakom promjenom medija sa 100 nM T3 i 1 μM Dex. CTCM uređaji su kultivirani u inkubatoru na 37°C i 5% CO2.
Za dobijanje rastegnutih trajektorija srčanih kriški razvijen je poseban sistem kamera. Korištena je SLR kamera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japan) sa makro objektivom Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, Kalifornija). Vizualizacija je izvršena na sobnoj temperaturi nakon zamjene medija svježim medijem. Kamera je postavljena pod uglom od 51°, a video se snima brzinom od 30 kadrova u sekundi. Prvo je korišten softver otvorenog koda (MUSCLEMOTION43) sa Image-J za kvantifikaciju kretanja srčanih kriški. Maska je kreirana pomoću MATLAB-a (MathWorks, Natick, MA, SAD) kako bi se definirala područja od interesa za kriške kucajućeg srca kako bi se izbjegao šum. Ručno segmentirane maske primjenjuju se na sve slike u nizu kadrova, a zatim se prosljeđuju MUSCLEMOTION dodatku. Muscle Motion koristi prosječni intenzitet piksela u svakom kadru za kvantifikaciju njegovog kretanja u odnosu na referentni kadar. Podaci su snimljeni, filtrirani i korišteni za kvantifikaciju vremena ciklusa i procjenu istezanja tkiva tokom srčanog ciklusa. Snimljeni video je naknadno obrađen korištenjem digitalnog filtera nulte faze prvog reda. Da bi se kvantificiralo istezanje tkiva (od vrha do vrha), izvršena je analiza od vrha do vrha kako bi se razlikovali vrhovi i doline u snimljenom signalu. Pored toga, detrendiranje je provedeno korištenjem polinoma 6. reda kako bi se eliminirao pomak signala. Programski kod je razvijen u MATLAB-u za određivanje globalnog kretanja tkiva, vremena ciklusa, vremena relaksacije i vremena kontrakcije (Dopunski programski kod 44).
Za analizu naprezanja, koristeći iste videozapise kreirane za procjenu mehaničkog istezanja, prvo smo pratili dvije slike koje predstavljaju vrhove kretanja (najvišu (gornju) i najnižu (donju) tačku kretanja) prema softveru MUSCLEMOTION. Zatim smo segmentirali područja tkiva i primijenili oblik algoritma sjenčanja na segmentirano tkivo (Dopunska slika 2a). Segmentirano tkivo je zatim podijeljeno na deset podpovršina, a napon na svakoj površini izračunat je pomoću sljedeće jednačine: Naprezanje = (Sup-Sdown)/Sdown, gdje su Sup i Sdown udaljenosti oblika od gornje i donje sjene tkanine, respektivno (Dopunska slika 2b).
Presjeci srca su fiksirani u 4% paraformaldehidu tokom 48 sati. Fiksirana tkiva su dehidrirana u 10% i 20% saharozi tokom 1 sata, a zatim u 30% saharozi preko noći. Presjeci su zatim ugrađeni u spoj optimalne temperature rezanja (OCT spoj) i postepeno zamrznuti u kupki izopentana/suhog leda. OCT blokove za ugradnju čuvati na -80 °C do odvajanja. Slajdovi su pripremljeni kao presjeci debljine 8 μm.
Da biste uklonili OCT iz presjeka srca, zagrijavajte preparate na grijaćem bloku na 95 °C tokom 5 minuta. Dodajte 1 ml PBS-a na svaki preparat i inkubirajte 30 minuta na sobnoj temperaturi, a zatim permeirajte presjeke postavljanjem 0,1% Triton-X u PBS tokom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Da biste spriječili vezivanje nespecifičnih antitijela za uzorak, dodajte 1 ml 3% rastvora BSA na preparate i inkubirajte 1 sat na sobnoj temperaturi. BSA je zatim uklonjen, a preparati su isprani PBS-om. Označite svaki uzorak olovkom. Primarna antitijela (razrijeđena 1:200 u 1% BSA) (koneksin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) i troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) dodavani su tokom 90 minuta, zatim sekundarna antitijela (razrijeđena 1:200 u 1% BSA) protiv mišjeg Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), protiv zečjeg Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) tokom dodatnih 90 minuta. Isprano 3 puta sa PBS-om. Da bismo razlikovali ciljno bojenje od pozadine, koristili smo samo sekundarno antitijelo kao kontrolu. Na kraju, dodana je DAPI nuklearna boja, a preparati su stavljeni u vectashield (Vector Laboratories) i zapečaćeni lakom za nokte. -x uvećanje) i Keyence mikroskop sa 40x uvećanjem.
Za WGA bojenje korišten je WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) u koncentraciji od 5 μg/ml u PBS-u i nanesen na fiksirane dijelove tokom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Zatim su preparati isprani PBS-om, a na svaki preparat je dodana Sudan crna boja i inkubirani 30 minuta. Zatim su preparati isprani PBS-om i dodan je vectashield medij za ugradnju. Preparati su vizualizirani na Keyence mikroskopu pri uvećanju od 40x.
OCT je uklonjen iz uzoraka kao što je gore opisano. Nakon uklanjanja OCT-a, pločice su uronjene u Bouinov rastvor preko noći. Pločice su zatim isprane destilovanom vodom 1 sat, a zatim stavljene u Bibrichov rastvor aloe kiseline i fuksina na 10 minuta. Nakon toga, pločice su isprane destilovanom vodom i stavljene u rastvor 5% fosfomolibdena/5% fosfovolframove kiseline na 10 minuta. Bez ispiranja, pločice su direktno prenesene u rastvor anilinskog plavog na 15 minuta. Zatim su pločice isprane destilovanom vodom i stavljene u 1% rastvor sirćetne kiseline na 2 minute. Pločice su osušene u 200 N etanolu i prenesene u ksilen. Obojene pločice su vizualizirane pomoću Keyence mikroskopa sa objektivom od 10x. Procenat površine fibroze je kvantifikovan pomoću Keyence Analyzer softvera.
CyQUANT™ MTT test vijabilnosti ćelija (Invitrogen, Carlsbad, CA), kataloški broj V13154, u skladu s protokolom proizvođača s nekim modifikacijama. Konkretno, korišten je hirurški bušilica promjera 6 mm kako bi se osigurala ujednačena veličina tkiva tokom MTT analize. Tkiva su pojedinačno nasađena u jažice ploče s 12 jažica koje sadrže MTT supstrat u skladu s protokolom proizvođača. Sekcije se inkubiraju na 37°C tokom 3 sata, a živo tkivo metabolizira MTT supstrat formirajući ljubičasti formazan. Zamijenite MTT otopinu sa 1 ml DMSO i inkubirajte na 37°C tokom 15 minuta kako biste ekstrahirali ljubičasti formazan iz dijelova srca. Uzorci su razrijeđeni 1:10 u DMSO u pločama s prozirnim dnom s 96 jažica, a intenzitet ljubičaste boje mjeren je na 570 nm pomoću čitača ploča Cytation (BioTek). Očitavanja su normalizirana na težinu svakog kriške srca.
Medij za srčane kriške zamijenjen je medijem koji sadrži 1 μCi/ml [5-3H]-glukoze (Moravek Biochemicals, Brea, CA, SAD) za test iskorištavanja glukoze kao što je prethodno opisano. Nakon 4 sata inkubacije, dodajte 100 µl medija u otvorenu mikrocentrifužnu epruvetu koja sadrži 100 µl 0,2 N HCl. Zatim je epruveta stavljena u scintilacionu epruvetu koja sadrži 500 μl dH2O da bi se ispario [3H]2O tokom 72 sata na 37°C. Zatim uklonite mikrocentrifužnu epruvetu iz scintilacijske epruvete i dodajte 10 ml scintilacijske tekućine. Scintilacijsko brojanje je provedeno pomoću analizatora tekućinske scintilacije Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, SAD). Iskorištenost glukoze je zatim izračunata uzimajući u obzir specifičnu aktivnost [5-3H]-glukoze, nepotpunu ravnotežu i pozadinu, razrjeđenje [5-3H]-neobilježenom glukozom i efikasnost scintilacijskog brojača. Podaci su normalizovani na masu dijelova srca.
Nakon homogenizacije tkiva u Trizolu, RNK je izolovana iz dijelova srca korištenjem Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 prema protokolu proizvođača. Priprema RNAsec biblioteke, sekvenciranje i analiza podataka izvršeni su na sljedeći način:
1 μg RNK po uzorku korišteno je kao početni materijal za pripremu RNK biblioteke. Sekvencirajuće biblioteke generirane su korištenjem NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit za Illuminu (NEB, SAD) prema preporukama proizvođača, a indeksni kodovi su dodani atributnim sekvencama za svaki uzorak. Ukratko, mRNA je pročišćena iz ukupne RNK korištenjem magnetskih kuglica pričvršćenih poli-T oligonukleotidima. Fragmentacija se provodi korištenjem dvovalentnih kationa na visokoj temperaturi u NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). Prvi lanac cDNK sintetiziran je korištenjem slučajnih heksamernih prajmera i M-MuLV reverzne transkriptaze (RNase H-). Drugi lanac cDNK se zatim sintetizira korištenjem DNK polimeraze I i RNase H. Preostali prevjesi se pretvaraju u tupe krajeve aktivnošću egzonukleaze/polimeraze. Nakon adenilacije 3' kraja DNK fragmenta, na njega se pričvršćuje NEBNext adapter sa strukturom u obliku ukosnice kako bi se pripremio za hibridizaciju. Za selekciju cDNK fragmenata poželjne dužine 150-200 bp. Fragmenti biblioteke su pročišćeni korištenjem AMPure XP sistema (Beckman Coulter, Beverly, SAD). Zatim je korišteno 3 μl USER enzima (NEB, SAD) sa cDNA odabrane veličine, ligiranom adapterom, tokom 15 minuta na 37°C, a zatim 5 minuta na 95°C prije PCR-a. PCR je zatim proveden korištenjem Phusion High-Fidelity DNA polimeraze, univerzalnih PCR primera i Index (X) primera. Konačno, PCR produkti su pročišćeni (AMPure XP sistem), a kvalitet biblioteke procijenjen na Agilent Bioanalyzer 2100 sistemu. Biblioteka cDNA je zatim sekvencirana korištenjem Novaseq sekvencera. Sirove slikovne datoteke iz Illumine su pretvorene u sirove očitavanja korištenjem CASAVA Base Calling-a. Sirovi podaci su pohranjeni u datotekama formata FASTQ(fq) koje sadrže sekvence očitavanja i odgovarajuće bazne kvalitete. Odaberite HISAT2 da biste uskladili filtrirana očitavanja sekvenciranja sa referentnim genomom Sscrofa11.1. Općenito, HISAT2 podržava genome bilo koje veličine, uključujući genome veće od 4 milijarde baza, a za većinu parametara su postavljene zadane vrijednosti. Očitavanja spajanja iz RNA Seq podataka mogu se efikasno poravnati korištenjem HISAT2, najbržeg trenutno dostupnog sistema, s istom ili boljom tačnošću od bilo koje druge metode.
Obilje transkripata direktno odražava nivo ekspresije gena. Nivoi ekspresije gena procjenjuju se obiljem transkripata (brojem sekvenciranja) povezanih s genomom ili eksonima. Broj očitavanja proporcionalan je nivoima ekspresije gena, dužini gena i dubini sekvenciranja. FPKM (fragmenti na hiljadu baznih parova transkripta sekvenciranih na milion baznih parova) izračunati su i P-vrijednosti diferencijalne ekspresije određene su korištenjem DESeq2 paketa. Zatim smo izračunali stopu lažnih otkrića (FDR) za svaku P vrijednost koristeći Benjamini-Hochbergovu metodu9 zasnovanu na ugrađenoj R-funkciji "p.adjust".
RNK izolovana iz srčanih presjeka pretvorena je u cDNA u koncentraciji od 200 ng/μl korištenjem SuperScript IV Vilo Master miksa od Thermo-a (Thermo, kat. br. 11756050). Kvantitativna RT-PCR provedena je korištenjem Applied Biosystems Endura Plate Microamp prozirne reakcijske ploče sa 384 jažice (Thermo, kat. br. 4483319) i microamp optičkog adheziva (Thermo, kat. br. 4311971). Reakcijska smjesa se sastojala od 5 µl Taqman Fast Advanced Master miksa (Thermo, kat. br. 4444557), 0,5 µl Taqman Primer-a i 3,5 µl H2O pomiješanih po jažici. Standardni qPCR ciklusi su pokrenuti, a CT vrijednosti su izmjerene korištenjem Applied Biosystems Quantstudio 5 instrumenta za real-time PCR (modul sa 384 jažice; broj proizvoda A28135). Taqman prajmeri su kupljeni od Thermo-a (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). CT vrijednosti svih uzoraka su normalizovane u odnosu na gen zadužen za domaćinstvo GAPDH.
Oslobađanje NT-ProBNP iz medija procijenjeno je korištenjem NT-ProBNP kita (pig) (kat. br. MBS2086979, MyBioSource) prema protokolu proizvođača. Ukratko, u svaku jažicu dodano je po 250 µl svakog uzorka i standarda u duplikatu. Odmah nakon dodavanja uzorka, dodajte 50 µl reagensa za ispitivanje A u svaku jažicu. Lagano protresite ploču i zatvorite je zaštitnom folijom. Zatim su tablete inkubirane na 37°C tokom 1 sata. Zatim aspirirajte otopinu i isperite jažice 4 puta sa 350 µl 1X otopine za pranje, inkubirajući otopinu za pranje 1-2 minute svaki put. Zatim dodajte 100 µl reagensa za ispitivanje B po jažici i zatvorite je zaštitnom folijom za ploču. Tableta je lagano protresena i inkubirana na 37°C tokom 30 minuta. Aspirirajte otopinu i isperite jažice 5 puta sa 350 µl 1X otopine za pranje. U svaki otvor dodajte 90 µl rastvora supstrata i zatvorite ploču. Inkubirajte ploču na 37°C tokom 10-20 minuta. Dodajte 50 µl rastvora za zaustavljanje reakcije u svaki otvor. Ploča je odmah izmjerena pomoću čitača ploča Cytation (BioTek) postavljenog na 450 nm.
Analize snage su provedene kako bi se odabrale veličine grupa koje će osigurati snagu >80% za detekciju apsolutne promjene parametra od 10% sa stopom greške tipa I od 5%. Analize snage su provedene kako bi se odabrale veličine grupa koje će osigurati snagu >80% za detekciju apsolutne promjene parametra od 10% sa stopom greške tipa I od 5%. Analizne snage su ispunjene za odabir grupa veličina, koje osiguravaju >80% snage za otkrivanje 10% apsolutno promjena parametara sa 5% frekvencije greške tipa I. Analiza snage je provedena kako bi se odabrale veličine grupa koje bi obezbijedile >80% snage za detekciju 10% apsolutne promjene parametra sa stopom greške tipa I od 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10%绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10%绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Provedena je analiza snage za odabir veličine grupe, koja je omogućila > 80% snage za otkriće 10% apsolutnih promjena parametara i 5% grešaka frekvencije tipa I. Analiza snage je provedena kako bi se odabrala veličina grupe koja bi obezbijedila >80% snage za detekciju 10% apsolutne promjene parametra i 5% stope greške tipa I.Presjeci tkiva su nasumično odabrani prije eksperimenta. Sve analize su bile uslovno slijepe, a uzorci su dekodirani tek nakon što su svi podaci analizirani. Za sve statističke analize korišten je GraphPad Prism softver (San Diego, Kalifornija). Za sve statistike, p-vrijednosti su smatrane značajnim pri vrijednostima <0,05. Za sve statistike, p-vrijednosti su smatrane značajnim pri vrijednostima <0,05. Za cijelu statistiku p-značenja smatraju značajnim pri značenjima <0,05. Za sve statistike, p-vrijednosti su smatrane značajnim pri vrijednostima <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Za cijelu statistiku p-značenja smatraju značajnim pri značenjima <0,05. Za sve statistike, p-vrijednosti su smatrane značajnim pri vrijednostima <0,05.Dvostrani Studentov t-test je proveden na podacima sa samo 2 poređenja. Jednosmjerna ili dvosmjerna ANOVA je korištena za određivanje značajnosti između više grupa. Prilikom izvođenja post hoc testova, primijenjena je Tukeyjeva korekcija kako bi se uzelo u obzir više poređenja. RNAsec podaci imaju posebna statistička razmatranja pri izračunavanju FDR-a i p.adjust-a kao što je opisano u odjeljku Metode.
Za više informacija o dizajnu studije, pogledajte sažetak Izvještaja o istraživanju prirode (Nature Research Report) povezan s ovim člankom.