Ẹ ṣeun fún ṣíbẹ̀wò sí Nature.com. Ẹ̀yà ẹ̀rọ ìṣàwárí tí ẹ ń lò ní àtìlẹ́yìn CSS díẹ̀. Fún ìrírí tí ó dára jùlọ, a gbà yín nímọ̀ràn pé kí ẹ lo ẹ̀rọ ìṣàwárí tí a ti mú gbóná (tàbí kí ẹ mú Ìbáramu Ipò nínú Internet Explorer kúrò). Ní ​​àkókò yìí, láti rí i dájú pé a ń tẹ̀síwájú láti ṣe àtìlẹ́yìn, a ó ṣe àtìlẹ́yìn sí ojú-òpó wẹ́ẹ̀bù náà láìsí àwọn àṣà àti JavaScript.
A nílò ètò in vitro tó ṣeé gbẹ́kẹ̀lé tó lè ṣe àtúnṣe àyíká ara ọkàn dáadáa fún ìdánwò oògùn. Wíwà tó wà nílẹ̀ fún àwọn ètò ìṣẹ̀dá ọkàn ènìyàn ti yọrí sí ìtumọ̀ tí kò péye nípa àwọn ipa oògùn ọkàn. Níbí, a ti ṣe àgbékalẹ̀ àpẹẹrẹ àṣà ìṣẹ̀dá ọkàn (CTCM) kan tí ó ń ru àwọn ẹ̀yà ọkàn sókè pẹ̀lú ẹ̀rọ amóhùnmáwòrán àti láti fara da ìfàsẹ́yìn ara nígbà tí a bá ń lo systolic àti diastolic nínú ìyípo ọkàn. Lẹ́yìn ọjọ́ méjìlá ti ìṣẹ̀dá, ọ̀nà yìí mú kí àwọn ẹ̀yà ọkàn dára síi díẹ̀, ṣùgbọ́n kò pa ìdúróṣinṣin ara wọn mọ́ pátápátá. Nítorí náà, lẹ́yìn ìwádìí molecule kékeré, a rí i pé fífi 100 nM triiodothyronine (T3) àti 1 μM dexamethasone (Dex) kún àárín wa mú kí àwọn ẹ̀yà náà wà fún ọjọ́ méjìlá. Ní ìdàpọ̀ pẹ̀lú ìtọ́jú T3/Dex, ètò CTCM ń ṣe ìtọ́jú àwọn ìpìlẹ̀ ìkọ̀wé, ìṣiṣẹ́ ara, ìṣiṣẹ́ ara, àti ìdúróṣinṣin ara ní ìpele kan náà pẹ̀lú àsopọ ọkàn tuntun fún ọjọ́ méjìlá. Ní àfikún, fífẹ̀ àsopọ ọkàn púpọ̀ jù nínú àṣà ìbílẹ̀ máa ń fa àmì ọkàn hypertrophic, èyí tí ó ń fi ẹ̀rí hàn pé CTCM lè fara wé àwọn ipò hypertrophic tí ìfà ọkàn ń fà. Ní ìparí, CTCM lè ṣe àwòkọ́ṣe ìṣiṣẹ́ ara àti ìṣiṣẹ́ ara ọkàn ní àṣà ìbílẹ̀ fún ìgbà pípẹ́, èyí tí ó ń jẹ́ kí a lè ṣe àyẹ̀wò oògùn tí ó ṣeé gbẹ́kẹ̀lé.
Kí a tó ṣe ìwádìí ìṣègùn, a nílò àwọn ètò in vitro tó ṣeé gbẹ́kẹ̀lé tí ó lè ṣe àtúnṣe àyíká ìṣiṣẹ́ ọkàn ènìyàn dáadáa. Irú àwọn ètò bẹ́ẹ̀ yẹ kí ó fara wé ìfàsẹ́yìn oníṣẹ́-ẹ̀rọ, ìlù ọkàn, àti àwọn ohun-ìní electrophysiological. Àwọn àpẹẹrẹ ẹranko ni a sábà máa ń lò gẹ́gẹ́ bí pẹpẹ ìṣàyẹ̀wò fún ìṣiṣẹ́ ọkàn pẹ̀lú ìgbẹ́kẹ̀lé díẹ̀ ní ṣíṣe àfihàn àwọn ipa ti àwọn oògùn nínú ọkàn ènìyàn1,2. Níkẹyìn, Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) jẹ́ àpẹẹrẹ kan tí ó ní ìfọkànsí gidigidi àti pàtó fún onírúurú ìtọ́jú ìlera àti ìṣègùn, tí ó ń ṣe àtúnṣe ìṣiṣẹ́ ara àti pathophysiology ti ọkàn ènìyàn lọ́nà tó péye3. Àìsí irú ètò bẹ́ẹ̀ ń dín àwárí àwọn ìtọ́jú tuntun fún àìlera ọkàn kù4,5 ó sì ti yọrí sí ìpalára ọkàn gẹ́gẹ́ bí ìdí pàtàkì fún fífi ọjà sílẹ̀6.
Láàárín ọdún mẹ́wàá tó kọjá, àwọn oògùn mẹ́jọ tí kì í ṣe ti ọkàn ni a ti yọ kúrò nínú lílo ilé ìwòsàn nítorí wọ́n ń fa ìfàsẹ́yìn àkókò QT tó ń yọrí sí arrhythmias ventricular àti ikú òjijì7. Nítorí náà, àìní ń pọ̀ sí i fún àwọn ọgbọ́n ìṣàyẹ̀wò ṣáájú ìṣègùn tó ṣeé gbẹ́kẹ̀lé láti ṣe àyẹ̀wò ipa àti ìpalára ọkàn. Lílo àwọn sẹ́ẹ̀lì ẹ̀jẹ̀ pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPS-CM) tí ènìyàn ń fà láìpẹ́ yìí nínú ìṣàyẹ̀wò oògùn àti ìdánwò ìpalára fún ìṣòro yìí pèsè ojútùú díẹ̀ sí ìṣòro yìí. Síbẹ̀síbẹ̀, ìwà àìtó àwọn hiPS-CM àti àìní ìṣòro multicellular ti àsopọ ọkàn jẹ́ àwọn ìdíwọ́ pàtàkì ti ọ̀nà yìí. Àwọn ìwádìí tuntun ti fihàn pé a lè borí ìdíwọ́ yìí nípa lílo hiPS-CM ní ìbẹ̀rẹ̀ láti ṣẹ̀dá àwọn hydrogels àsopọ ọkàn ní kété lẹ́yìn ìbẹ̀rẹ̀ ìfàsẹ́yìn láìròtẹ́lẹ̀ àti fífi agbára iná mànàmáná pọ̀ sí i ní kẹ̀rẹ̀kẹ̀rẹ̀. Síbẹ̀síbẹ̀, àwọn microtissues hiPS-CM wọ̀nyí kò ní àwọn ohun-ìní electrophysiological àti contracile ti myocardium àgbàlagbà. Ní àfikún, àsopọ ọkàn ènìyàn ní ìṣètò tó díjú jù, tí ó ní àdàpọ̀ onírúurú ti àwọn irú sẹ́ẹ̀lì, pẹ̀lú àwọn sẹ́ẹ̀lì endothelial, neurons, àti stromal fibroblasts, tí àwọn àkójọpọ̀ pàtó ti àwọn protein extracellular matrix so pọ̀ mọ́ra. Àìdọ́gba yìí nínú ọkàn àwọn ẹranko tí kìí ṣe ti ọkàn àyà11,12,13 jẹ́ ìdènà pàtàkì sí ṣíṣe àwòṣe àsopọ ọkàn nípa lílo àwọn irú sẹ́ẹ̀lì kọ̀ọ̀kan. Àwọn ìdíwọ́ pàtàkì wọ̀nyí tẹnu mọ́ pàtàkì ṣíṣe àwọn ọ̀nà láti gbin àsopọ ọkàn tí ó wà lábẹ́ àwọn ipò ìṣiṣẹ́ ara àti àìsàn.
Àwọn apá tín-tín tí a gbin (300 µm) ti ọkàn ènìyàn ti fihàn pé ó jẹ́ àpẹẹrẹ rere fún myocardium ènìyàn tí ó wà ní ipò pípé. Ọ̀nà yìí ń fúnni ní àǹfààní sí ètò 3D multicellular tí ó jọ ti àsopọ ọkàn ènìyàn. Síbẹ̀síbẹ̀, títí di ọdún 2019, lílo àwọn apá ọkàn tí a gbin ni a dínkù nítorí ìwaláàyè àṣà kúkúrú (wákàtí 24). Èyí jẹ́ nítorí ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn nǹkan bíi àìsí ìfàsẹ́yìn ti ara-ẹ̀rọ, ìsopọ̀ afẹ́fẹ́-omi, àti lílo àwọn ohun èlò tí ó rọrùn tí kò ṣe àtìlẹ́yìn fún àìní ti àsopọ ọkàn. Ní ọdún 2019, ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn ẹgbẹ́ ìwádìí fihàn pé fífi àwọn ohun èlò onímọ̀-ẹ̀rọ sínú àwọn ètò àṣà àsopọ ọkàn lè fa ìgbésí ayé àṣà gùn, mú kí ìfarahàn ọkàn sunwọ̀n síi, kí ó sì fara wé àrùn ọkàn. Àwọn ìwádìí méjì tí ó dára 17 àti 18 fihàn pé ìfàsẹ́yìn onímọ̀-ẹ̀rọ uniaxial ní ipa rere lórí ìrísí ọkàn nígbà àṣà. Síbẹ̀síbẹ̀, àwọn ìwádìí wọ̀nyí kò lo ìfàsẹ́yìn oníwọ̀n mẹ́ta ti ìṣiṣẹ́ ọkàn, nítorí pé àwọn apá ọkàn ní agbára ìfàsẹ́yìn isometric 17 tàbí linear auxotonic loading 18 kún. Àwọn ọ̀nà ìfàmọ́ra àsopọ wọ̀nyí yọrí sí pípa ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn jínì ọkàn run tàbí ìfarahàn púpọ̀ ti àwọn jínì tí ó ní í ṣe pẹ̀lú àwọn ìdáhùn ìfàmọ́ra àìdára. Lóòótọ́, Pitoulis et al. 19 ṣe àgbékalẹ̀ ìwẹ̀ àṣà ìbílẹ̀ ọkàn onígbà díẹ̀ fún àtúnṣe ìyípo ọkàn nípa lílo ìdáhùn transducer force àti tension drives. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé ètò yìí gba ààyè fún àwòṣe ìyípo ọkàn ní vitro tó péye jù, ìṣòro àti ìlọ́po díẹ̀ ti ọ̀nà náà dín lílo ètò yìí kù. Ilé ìwádìí wa ṣẹ̀ṣẹ̀ ṣe àgbékalẹ̀ ètò àṣà ìbílẹ̀ kan tí ó rọrùn nípa lílo ìfúnni iná mànàmáná àti ohun èlò tí a ṣe àtúnṣe láti mú kí àwọn apá ti ẹran ẹlẹ́dẹ̀ àti àsopọ ọkàn ènìyàn ṣeé ṣe fún ọjọ́ mẹ́fà.
Nínú ìwé àfọwọ́kọ lọ́wọ́lọ́wọ́, a ṣe àpèjúwe àwòṣe àṣà ìṣẹ̀dá ọkàn (CTCM) nípa lílo àwọn apá kan ti ọkàn ẹlẹ́dẹ̀ tí ó ní àwọn àmì ìhùmọ̀ láti ṣàtúnṣe ìṣiṣẹ́ ọkàn onípele mẹ́ta àti ìfàsẹ́yìn pathophysiological nígbà ìyípo ọkàn. CTCM yìí lè mú kí ìpéye àsọtẹ́lẹ̀ oògùn ṣáájú ìṣègùn pọ̀ sí i dé ìpele tí a kò tíì rí tẹ́lẹ̀ nípa fífúnni ní ètò ọkàn tí ó ní owó tí ó munadoko, tí ó ń fara wé ìṣiṣẹ́ ọkàn/pathophysiology ti ọkàn ẹranko fún ìdánwò oògùn ṣáájú ìṣègùn.
Àwọn àmì ẹ̀rọ hemodynamic kó ipa pàtàkì nínú mímú iṣẹ́ cardiomyocyte dúró ní vitro 22,23,24. Nínú ìwé àfọwọ́kọ lọ́wọ́lọ́wọ́, a ti ṣe àgbékalẹ̀ CTCM kan (Àwòrán 1a) tí ó lè fara wé àyíká ọkàn àgbàlagbà nípa fífún ìfúnni ní agbára iná mànàmáná àti ti ẹ̀rọ ní àwọn ìgbà tí ara ń gbà (1.2 Hz, ìlù 72 fún ìṣẹ́jú kan). Láti yẹra fún fífà àsopọ pọ̀ jù nígbà diastole, a lo ẹ̀rọ ìtẹ̀wé 3D láti mú kí ìwọ̀n àsopọ pọ̀ sí i nípa 25% (Àwòrán 1b). A ṣètò àkókò ìṣípo iná mànàmáná tí ètò C-PACE fà láti bẹ̀rẹ̀ ní 100 ms kí systole tó bẹ̀rẹ̀ nípa lílo ètò ìkórajọ dátà láti tún ìyípo ọkàn ṣe. Ètò àṣà àsopọ náà lo ohun èlò amúṣiṣẹ́ pneumatic tí a lè ṣètò (LB Engineering, Germany) láti fẹ̀ sí awọ ara silicone tí ó rọrùn láti fa ìfẹ̀ sí i ní yàrá òkè. A so ètò náà pọ̀ mọ́ ìlà afẹ́fẹ́ òde nípasẹ̀ ohun èlò amúṣiṣẹ́ tí ń fa ìfúnni, èyí tí ó mú kí ó ṣeé ṣe láti ṣàtúnṣe ìfúnni náà (± 1 mmHg) àti àkókò (± 1 ms) dáadáa (Àwòrán 1c).
a So apa àsopọ mọ́ òrùka ìtìlẹ́yìn 7 mm, tí a fihàn ní àwọ̀ búlúù, nínú yàrá àṣà ti ẹ̀rọ náà. A ya yàrá àṣà ti a fi awọ silikoni tín-tín tí ó rọrùn yà sọ́tọ̀ kúrò nínú yàrá afẹ́fẹ́. Fi gasket kan sí àárín yàrá kọ̀ọ̀kan láti dènà jíjò. Ìdè ẹ̀rọ náà ní àwọn elekitirodu graphite tí ó ń fúnni ní ìsúnniṣe iná mànàmáná. b Àfihàn àwòrán ti ẹ̀rọ àsopọ ńlá, òrùka ìtọ́sọ́nà àti òrùka ìtìlẹ́yìn. A gbé àwọn apá àsopọ (brown) sí orí ẹ̀rọ tí ó tóbi jùlọ pẹ̀lú òrùka ìtọ́sọ́nà tí a gbé sínú ihò ní etí òde ẹ̀rọ náà. Nípa lílo ìtọ́sọ́nà náà, fi ìṣọ́ra gbé òrùka ìtìlẹ́yìn tí a fi àwọ̀ acrylic tissue bo sórí apá àsopọ ọkàn. c Àwòrán tí ó ń fi àkókò ìsúnniṣe iná mànàmáná hàn gẹ́gẹ́ bí iṣẹ́ ìsúnniṣe yàrá afẹ́fẹ́ tí a ń ṣe ètò pneumatic actuator (PPD) ń ṣàkóso. A lo ẹ̀rọ gbígbà dátà láti mú ìsúnniṣe iná mànàmáná ṣiṣẹpọ nípa lílo àwọn sensọ̀ ìfúnpá. Nígbà tí ìfúnpá nínú yàrá àṣà ti dé ààlà tí a ṣètò, a fi àmì ìfúnpá ránṣẹ́ sí C-PACE-EM láti fa ìsúnniṣe iná mànàmáná. d Àwòrán àwọn CTCM mẹ́rin tí a gbé sórí ṣẹ́ẹ̀lì incubator kan. Àwọn ẹ̀rọ mẹ́rin ni a so pọ̀ mọ́ PPD kan nípasẹ̀ ìṣiṣẹ́ pneumatic, a sì fi àwọn sensọ titẹ sínú fáìlì hemostatic láti ṣe àyẹ̀wò ìfúnpá nínú ìṣiṣẹ́ pneumatic. Ẹ̀rọ kọ̀ọ̀kan ní àwọn apá ìṣiṣẹ́ mẹ́fà.
Nípa lílo ohun èlò amúṣẹ́-afẹ́fẹ́ kan ṣoṣo, a lè ṣàkóso àwọn ẹ̀rọ CTCM mẹ́rin, èyí tí ọ̀kọ̀ọ̀kan wọn lè gba àwọn ẹ̀yà ara mẹ́fà (Àwòrán 1d). Nínú CTCM, afẹ́fẹ́ inú yàrá afẹ́fẹ́ ni a yípadà sí ìfúnpọ̀ nínú yàrá omi, ó sì ń fa ìfẹ̀ síi ti ẹ̀yà ara ọkàn (Àwòrán 2a àti Àfikún fíìmù 1). Ìṣàyẹ̀wò ìfúnpọ̀ ara ní 80 mm Hg. Àwòrán fihàn pé ìfúnpọ̀ ara ní 25% (Àwòrán 2b). Ìfúnpọ̀ ara yìí ni a ti fihàn pé ó bá gígùn sarcomere ti ara mu ti 2.2–2.3 µm fún ìfàsẹ́yìn apá ọkàn déédéé17,19,25. A ṣe àyẹ̀wò ìṣípo ara nípa lílo àwọn ètò kámẹ́rà àdáni (Àwòrán Àfikún 1). Ìtóbi àti iyàrá ìṣípo ara ti ara (Àwòrán 2c, d) bá ìfúnpọ̀ ara mu nígbà ìyípo ọkàn àti àkókò nígbà systole àti diastole (Àwòrán 2b). Ìfúnpọ̀ ara àti iyàrá ti àsopọ ọkàn nígbà ìfàsẹ́yìn àti ìsinmi dúró ṣinṣin fún ọjọ́ 12 nínú àṣà (Àwòrán 2f). Láti ṣe àyẹ̀wò ipa tí ìfúnni iná mànàmáná ní lórí ìfàsẹ́yìn nígbà ìbílẹ̀, a ṣe àgbékalẹ̀ ọ̀nà kan fún pípinnu ìfàsẹ́yìn tí ń ṣiṣẹ́ nípa lílo algoridimu ìbòjú (Àfikún Àwòrán 2a,b) a sì lè ṣe ìyàtọ̀ láàrín àwọn ìfàsẹ́yìn pẹ̀lú àti láìsí ìfúnni iná mànàmáná. Apá kan náà ti ọkàn (Àwòrán 2f). Ní ​​agbègbè tí a gbé gé (R6-9), fóltéèjì nígbà ìfúnni iná mànàmáná ga ní 20% ju tí kò bá sí ìfúnni iná mànàmáná, èyí tí ó fi àfikún ìfúnni iná mànàmáná sí iṣẹ́ ìfàsẹ́yìn.
Àwọn àmì ìtẹ̀síwájú ti titẹ yàrá afẹ́fẹ́, titẹ yàrá omi, àti ìwọ̀n ìṣípo àsopọ jẹ́rìí sí i pé titẹ yàrá yí titẹ yàrá omi padà, èyí sì ń fa ìṣípo tó báramu ti ege àsopọ mu. b Àwọn àmì ìtẹ̀síwájú ti ìpín ọgọ́rùn-ún (bulu) ti àwọn ẹ̀yà àsopọ tó bá ìpín ọgọ́rùn-ún (orange) mu. c Ìṣípo tí a wọ̀n ti ege ọkàn bá iyara ìṣípo tí a wọ̀n mu. (d) Àwọn àmì ìtẹ̀síwájú ti ìṣípo cyclic (ìlà búlúù) àti iyàrá (ìlà àmì osàn) nínú ègé ọkàn. e Ìwọ̀n àkókò ìyípo (n = 19 ègé fún ẹgbẹ́ kan, láti ọ̀dọ̀ àwọn ẹlẹ́dẹ̀ onírúurú), àkókò ìfàmọ́ra (n = 19 ègé fún ẹgbẹ́ kan, láti ọ̀dọ̀ àwọn ẹlẹ́dẹ̀ onírúurú), ìṣípo àsopọ (n = 25). Àwọn ègé)/ẹgbẹ́ láti ọ̀dọ̀ àwọn ẹlẹ́dẹ̀ onírúurú), ìyára systolic temp (n = 24(D0), 25(D12) ègé/ẹgbẹ́ láti ọ̀dọ̀ àwọn ẹlẹ́dẹ̀ onírúurú) àti ìwọ̀n ìsinmi temp (n=24(D0), 25(D12) ègé/ẹgbẹ́ láti ọ̀dọ̀ àwọn ẹlẹ́dẹ̀ onírúurú). Ìdánwò t-akẹ́kọ́ọ́ onírù méjì kò fi ìyàtọ̀ pàtàkì hàn nínú èyíkéyìí paramita. f Àwọn àmì ìṣàyẹ̀wò ìpele ìṣàfihàn àwọn ẹ̀yà ara pẹ̀lú (pupa) àti láìsí ìfúnni iná mànàmáná (blúù), àwọn agbègbè mẹ́wàá agbègbè ti àwọn ẹ̀yà ara láti apá kan náà. Àwọn páànù ìsàlẹ̀ fi ìwọ̀n ìyàtọ̀ ìpín ogorun nínú ìfúnni nínú àwọn ẹ̀yà ara pẹ̀lú àti láìsí ìfúnni iná mànàmáná hàn ní agbègbè mẹ́wàá láti oríṣiríṣi apá. (n = 8 ege/ẹgbẹ́ láti inú àwọn ẹlẹ́dẹ̀ ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, a ṣe ìdánwò t-akẹ́kọ́ọ́ onírù méjì; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 ege/ẹgbẹ́ láti inú àwọn ẹlẹ́dẹ̀ ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, a ṣe ìdánwò t-akẹ́kọ́ọ́ onírù méjì; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01). (n = 8 apa/ẹgbẹ́ láti inú àwọn ẹlẹ́dẹ̀ ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, ìdánwò t-akẹ́kọ́ọ́ onírù méjì; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 （n = 8 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; **** p <0,0001, ** p <0,01, *p <0,05). (n = 8 apa/ẹgbẹ́, láti inú onírúurú ẹlẹ́dẹ̀, ìdánwò t-akẹ́kọ́ọ́ onírù méjì; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Àwọn ọ̀pá àṣìṣe dúró fún ìyípadà ìwọ̀n ± ti àròpín.
Nínú ètò àṣà ìbílẹ̀ ọkàn wa tí a ti ṣe tẹ́lẹ̀ [20, 21], a ṣe ìtọ́jú ìlera, iṣẹ́, àti ìdúróṣinṣin ìṣètò ti àwọn ẹ̀ka ọkàn fún ọjọ́ mẹ́fà nípa lílo ìtara iná mànàmáná àti ṣíṣe àtúnṣe àkójọpọ̀ àárín. Síbẹ̀síbẹ̀, lẹ́yìn ọjọ́ mẹ́wàá, àwọn nọ́mbà wọ̀nyí dínkù gidigidi. A ó tọ́ka sí àwọn ẹ̀ka tí a gbin nínú ètò àṣà ìbílẹ̀ onígbà díẹ̀ wa ti tẹ́lẹ̀ 20, 21 (Ctrl) a ó sì lo ẹ̀ka tí a ti ṣe àtúnṣe tẹ́lẹ̀ gẹ́gẹ́ bí àwọn ipò MC àti àṣà ìbílẹ̀ lábẹ́ ìtara iná mànàmáná àti ìtara onígbà díẹ̀ (CTCM). tí a pè ní . Àkọ́kọ́, a pinnu pé ìtara iná mànàmáná láìsí ìtara iná mànàmáná kò tó láti ṣe ìtọ́jú ìlera àsopọ fún ọjọ́ mẹ́fà (Àfikún Àwòrán 3a,b). Lọ́nà tí ó yani lẹ́nu, pẹ̀lú ìfihàn ìtara ọkàn-ẹ̀rọ àti ìtara iná mànàmáná nípa lílo STCM, ìlera àwọn ẹ̀ka ọkàn ọjọ́ 12 dúró gẹ́gẹ́ bí ti àwọn ẹ̀ka ọkàn tuntun lábẹ́ àwọn ipò MS, ṣùgbọ́n kìí ṣe lábẹ́ àwọn ipò Ctrl, gẹ́gẹ́ bí a ṣe fihàn nípasẹ̀ ìwádìí MTT (Àwòrán 1). 3a). Èyí fihàn pé ìtara ọkàn àti ìfarahàn ti ìyípo ọkàn lè jẹ́ kí àwọn ẹ̀ka àsopọ wà láàyè fún ìgbà méjì bí a ṣe ròyìn nínú ètò àṣà ìbílẹ̀ onígbà díẹ̀ wa ti tẹ́lẹ̀. Sibẹsibẹ, ayẹwo ti iduroṣinṣin eto ti awọn apakan ti ara nipa gbigba ajẹsara ti troponin cardiac T ati connexin 43 fihan pe ifihan connexin 43 ga pupọ ninu awọn tissues MC ni ọjọ 12 ju ti awọn iṣakoso ni ọjọ kanna lọ. Sibẹsibẹ, ifihan iṣọkan connexin 43 ati idagbasoke Z-diski ko ni kikun (Fig. 3b). A lo ilana oye atọwọda (AI) lati ṣe iwọn iduroṣinṣin eto tissue26, opo gigun ẹkọ jinle ti o da lori aworan ti o da lori troponin-T ati connexin staining43 lati ṣe iwọn iduroṣinṣin eto ati fluorescence ti awọn ege ọkan ni awọn ofin ti agbara agbegbe. Ọna yii lo Nẹtiwọki Neural Convolutional (CNN) ati eto ẹkọ jinna lati ṣe iwọn iduroṣinṣin eto ti ara ọkan ni ọna adaṣiṣẹ ati lainidi, gẹgẹbi a ti ṣalaye ninu itọkasi. 26. Tissue MC fihan ibajọra eto ti o dara si ọjọ 0 ni akawe si awọn apakan iṣakoso aimi. Ni afikun, awọ trichrome ti Masson ṣafihan ipin ogorun fibrosis ti o kere pupọ labẹ awọn ipo MS ni akawe si awọn ipo iṣakoso ni ọjọ 12 ti asa (Fig. 3c). Bó tilẹ̀ jẹ́ pé CTCM mú kí àwọn ẹ̀yà ara ọkàn lágbára sí i ní ọjọ́ kejìlá sí ìwọ̀n tó jọ ti ẹ̀yà ara ọkàn tuntun, kò mú kí ìdúróṣinṣin ẹ̀yà ọkàn sunwọ̀n sí i ní pàtàkì.
Àwòrán Bar fi ìwọ̀n ìṣiṣẹ́ MTT ti àwọn ìgé ọkàn tuntun (D0) tàbí àṣà ìgé ọkàn fún ọjọ́ 12 hàn yálà nínú àṣà àìdúró (D12 Ctrl) tàbí nínú CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) àwọn ìgé/ẹgbẹ́ láti inú onírúurú ẹlẹ́dẹ̀, ọ̀nà kan tí a gbà ṣe ìdánwò ANOVA; ####p < 0.0001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D0 àti **p < 0.01 ní ìfiwéra pẹ̀lú D12 Ctrl). Àwòrán Bar fi ìwọ̀n ìṣiṣẹ́ MTT ti àwọn ìṣẹ́po ọkàn tuntun (D0) tàbí àṣà ìṣẹ́po ọkàn hàn fún ọjọ́ 12 yálà nínú àṣà àìdúró (D12 Ctrl) tàbí nínú CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), àwọn ìṣẹ́po 12 (D12 MC) láti inú àwọn ẹlẹ́dẹ̀ ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, ọ̀nà kan tí a gbà ṣe ìdánwò ANOVA; ####p < 0.0001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D0 àti **p < 0.01 ní ìfiwéra pẹ̀lú D12 Ctrl).histogram náà fi ìwọ̀n ìṣiṣẹ́ àwọn ẹ̀yà ọkàn tuntun MTT (D0) tàbí àṣà àwọn ẹ̀yà ọkàn fún ọjọ́ 12 nínú àṣà àìdúró (ìṣàkóso D12) tàbí CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (ìṣàkóso D12). ) ), àwọn ẹ̀yà/ẹgbẹ́ 12 (D12 MC) láti inú àwọn ẹlẹ́dẹ̀ ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀ hàn, a ṣe ìdánwò ANOVA ọ̀nà kan ṣoṣo;####p <0,0001 pо сравнению с D0 и **p <0,01 pо сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 ni akawe pẹlu D0 ati **p < 0.01 ni akawe pẹlu D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化),来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向A相比，####p <0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p <0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p <0.0001histogram tó ń fi ìwọ̀n ìṣiṣẹ́ MTT hàn nínú àwọn ẹ̀yà ọkàn tuntun (D0) tàbí àwọn ẹ̀yà ọkàn tí a gbìn fún ọjọ́ 12 nínú àṣà àìdúró (ìṣàkóso D12) tàbí CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (ìṣàkóso D12)), àwọn ẹ̀yà/ẹgbẹ́ 12 (D12 MC) láti inú onírúurú ẹlẹ́dẹ̀, ìdánwò ANOVA ọ̀nà kan;####p <0,0001 pо сравнению с D0, **p <0,01 pо сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D0, **p < 0.01 ní ìfiwéra pẹ̀lú D12 Ctrl).b Troponin-T (alawọ ewe), connexin 43 (pupa) ati DAPI (bulu) ninu awọn apa ọkan tuntun ti a ya sọtọ (D0) tabi awọn apa ọkan ti a gbin labẹ awọn ipo aiduro (Ctrl) tabi awọn ipo CTCM (MC) fun ọjọ 12) ti awọn aworan immunofluorescence aṣoju (iwọn òfo = 100 µm). Ìwọ̀n ọgbọ́n àtọwọ́dá ti ìdúróṣinṣin ìṣètò àsopọ ọkàn (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) gé/ẹgbẹ́ kọ̀ọ̀kan láti inú ẹlẹ́dẹ̀ ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, a ṣe ìdánwò ANOVA ọ̀nà kan; ####p < 0.0001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D0 àti ****p < 0.0001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D12 Ctrl). Ìwọ̀n ọgbọ́n àtọwọ́dá ti ìdúróṣinṣin ìṣètò àsopọ ọkàn (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) gé/ẹgbẹ́ kọ̀ọ̀kan láti inú onírúurú ẹlẹ́dẹ̀, a ṣe ìdánwò ANOVA ọ̀nà kan; ####p < 0.0001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D0 àti ****p < 0.0001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12) Ct (D12) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p <0,0001 pо сравнению с D0, Ctrl D12). Ìwọ̀n ìṣètò ìṣètò ti àsopọ ọkàn nípasẹ̀ ọgbọ́n àtọwọ́dá (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) àwọn ìpín/ẹgbẹ́ láti oríṣiríṣi ẹlẹ́dẹ̀, ìdánwò ANOVA ọ̀nà kan ṣoṣo tí a ṣe; ####p < 0.0001 vs. pẹ̀lú D0 àti ****p < 0.0001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ege/ẹgbẹ kọọkan ti o yatọ si ẹlẹdẹ, ọkan-ọna ANOVA igbeyewo;#0##0D相比，****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ege/ẹgbẹ kọọkan ti awọn elede oriṣiriṣi, ọkan-ọna ANOVA igbeyewo;#0##0p;与D0相比，****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D0), 7 (Drl) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p <0,0000 Konturolu). Ọgbọ́n àtọwọ́dá láti ṣe ìwọ̀n ìdúróṣinṣin ìṣètò ti àsopọ ọkàn (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) àwọn ìpín/kó àwọn ẹlẹ́dẹ̀ ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀ jọ, ìdánwò ANOVA ọ̀nà kan; ####p<0.0001 vs .D0 Fún ìfiwéra ****p < 0.0001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D12 Ctrl). c Àwọn àwòrán tí a fi àmì sí (òsì) àti ìwọ̀n (ọ̀tún) fún àwọn ègé ọkàn tí a fi àmì Masson's trichrome bò (Scale bare = 500 µm) (n = 10 ègé/ẹgbẹ́ kọ̀ọ̀kan láti inú ẹlẹ́dẹ̀ ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, a ṣe ìdánwò ANOVA ọ̀nà kan; ####p < 0.0001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D0 àti ***p < 0.001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D12 Ctrl). c Àwọn àwòrán tí a fi àmì Masson's trichrome bò jẹ́ àwọ̀ ọkàn (Scale bare = 500 µm) (n = 10 gé/ẹgbẹ́ kọ̀ọ̀kan láti inú àwọn ẹlẹ́dẹ̀ ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, a ṣe ìdánwò ANOVA ọ̀nà kan; #### p < 0.0001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D0 àti ***p < 0.001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) ati количественная Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется одностор 0,0001 по сравнению с D0 и ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Àwọn àwòrán tí a fi àwọ̀ ara ọkàn tí a fi àwọ̀ ara Masson's trichrome ti bò (ìwọ̀n tí a kò fi ìbòrí bò = 500 µm) hàn (n = ìpín mẹ́wàá/ẹgbẹ́ láti inú onírúurú ẹlẹ́dẹ̀, ìdánwò ANOVA ọ̀nà kan ṣoṣo ni a ṣe; #### p < 0 .0001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D0 àti ***p < 0.001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度（ 5m0 = 5个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p <0.0001 与D0 相比，***0 p <0.0001相比). C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova#p. 0.0001 与D0 相比，***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помї однофакторного дисперсионного анализа ;### #p <0,0001 fun сравнению с D0, ***p <0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Àwọn àwòrán tí a fi àmì Masson's trichrome bò hàn (òsì) àti ìwọ̀n (ọ̀tún) àwọn apá ọkàn tí a fi àmì Masson's trichrome bò (òfo = 500 µm) (n = 10 ìpín/ẹgbẹ́, ọ̀kọ̀ọ̀kan láti inú ẹlẹ́dẹ̀ ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, tí a dán wò nípasẹ̀ ìṣàyẹ̀wò ìyàtọ̀ ọ̀nà kan ;### # p < 0.0001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D0, ***p < 0.001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D12 Ctrl).Àwọn ọ̀pá àṣìṣe dúró fún ìyípadà ìwọ̀n ± ti àròpín.
A ṣe àbájáde pé nípa fífi àwọn molecule kéékèèké kún ibi ìṣẹ̀dá, a lè mú kí ìdúróṣinṣin cardiomyocyte sunwọ̀n síi àti pé ìdàgbàsókè fibrosis lè dínkù nígbà ìṣẹ̀dá CTCM. Nítorí náà, a ṣe àyẹ̀wò fún àwọn molecule kéékèèké nípa lílo àwọn àṣà ìṣàkóso static wa20,21 nítorí iye díẹ̀ tí ó ń dani rú. A yan Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), àti SB431542 (SB) fún ìṣàyẹ̀wò yìí. A ti lo àwọn molecule kéékèèké wọ̀nyí tẹ́lẹ̀ nínú àwọn àṣà hiPSC-CM láti fa ìdàgbàsókè àwọn cardiomyocytes nípa mímú kí gígùn sarcomere, T-tubules, àti iyàrá ìdarí pọ̀ sí i. Ní àfikún, a mọ̀ pé Dex (glucocorticoid) àti SB méjèèjì ń dín ìgbóná ara kù29,30. Nítorí náà, a dán wò bóyá fífi ọ̀kan tàbí àpapọ̀ àwọn molecule kéékèèké wọ̀nyí síi yóò mú ìdúróṣinṣin ìṣètò ti àwọn ẹ̀yà ọkàn sunwọ̀n síi. Fún ìṣàyẹ̀wò àkọ́kọ́, a yan ìwọ̀n èròjà kọ̀ọ̀kan ní ìbámu pẹ̀lú àwọn ìfọ́pọ̀ tí a sábà máa ń lò nínú àwọn àpẹẹrẹ àṣà sẹ́ẹ̀lì (1 μM Dex27, 100 nM T327, àti 2.5 μM SB31). Lẹ́yìn ọjọ́ méjìlá tí wọ́n ti ń tọ́jú àrùn náà, àpapọ̀ T3 àti Dex yọrí sí ìdúróṣinṣin ìṣètò ọkàn àti àtúnṣe okùn tó kéré sí (Àfikún Àwòrán 4 àti 5). Ní ​​àfikún, lílo ìlọ́po méjì tàbí ìlọ́po méjì àwọn ìṣọ̀kan T3 àti Dex wọ̀nyí mú àwọn ipa búburú jáde ní ìfiwéra pẹ̀lú ìṣọ̀kan déédé (Àfikún Àwòrán 6a,b).
Lẹ́yìn ìṣàyẹ̀wò àkọ́kọ́, a ṣe àfiwéra orí-sí-orí ti àwọn ipò àṣà mẹ́rin (Àwòrán 4a): Ctrl: àwọn ẹ̀yà ọkàn tí a gbìn sínú àṣà àìdúró tí a ti ṣàlàyé tẹ́lẹ̀ nípa lílo ìlà wa tí a ti ṣètò; 20.21 TD: T3 àti Ctrl s tí a fi kún Dex ní ọjọ́rú; MC: àwọn ẹ̀yà ọkàn tí a gbin nínú CTCM nípa lílo ìlà wa tí a ti ṣètò tẹ́lẹ̀; àti MT: CTCM pẹ̀lú T3 àti Dex tí a fi kún ìlà náà. Lẹ́yìn ọjọ́ 12 ti ìtọ́jú, agbára ìṣiṣẹ́ ti àwọn àsopọ MS àti MT dúró gẹ́gẹ́ bí ti àwọn àsopọ tuntun tí a ṣe àyẹ̀wò nípasẹ̀ àyẹ̀wò MTT (Àwòrán 4b). Lọ́nà tí ó yani lẹ́nu, fífi T3 àti Dex kún àwọn àṣà transwell (TD) kò yọrí sí ìdàgbàsókè pàtàkì nínú ìṣiṣẹ́ ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn ipò Ctrl, èyí tí ó fi ipa pàtàkì ti ìṣíṣẹ́ ẹ̀rọ hàn nínú mímú kí àwọn ẹ̀yà ọkàn ṣeé ṣe.
Àwòrán àpẹẹrẹ ìdánwò tó ń ṣàfihàn àwọn ipò àṣà mẹ́rin tí a lò láti ṣe àyẹ̀wò àwọn ipa ti ìfúnni ní ẹ̀rọ àti àfikún T3/Dex lórí àárín fún ọjọ́ 12. Àwòrán b fi ìwọ̀n ìwúlò hàn ní ọjọ́ 12 lẹ́yìn ìbílẹ̀ ní gbogbo ipò àṣà mẹ́rin (Ctrl, TD, MC, àti MT) ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn ègé ọkàn tuntun (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD àti D12 MT), àwọn ègé/ẹgbẹ́ 12 (D12 MC) láti ọ̀dọ̀ àwọn ẹlẹ́dẹ̀ ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, a ṣe ìdánwò ANOVA ọ̀nà kan; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D0 àti **p < 0.01 ní ìfiwéra pẹ̀lú D12 Ctrl). Àwòrán b fi ìwọ̀n ìwúlò hàn ní ọjọ́ 12 lẹ́yìn ìbílẹ̀ ní gbogbo ipò àṣà mẹ́rin (Ctrl, TD, MC, àti MT) ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn ègé ọkàn tuntun (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD àti D12 MT), àwọn ègé/ẹgbẹ́ 12 (D12 MC) láti ọ̀dọ̀ àwọn ẹlẹ́dẹ̀ ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, a ṣe ìdánwò ANOVA ọ̀nà kan; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D0 àti **p < 0.01 ní ìfiwéra pẹ̀lú D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12. культивирования (контроль, TD, MC и MT) fun сравнению MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0 и **p <0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Àwòrán ìtọ́ka náà fi ìwọ̀n ìṣiṣẹ́ tó ṣeé ṣe hàn ní ọjọ́ 12 lẹ́yìn ìṣẹ̀dá ní gbogbo ipò àṣà mẹ́rin (ìṣàkóso, TD, MC, àti MT) ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn ẹ̀yà ọkàn tuntun (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, àti D12 MT), àwọn ẹ̀yà/ẹgbẹ́ 12 (D12 MC) láti inú àwọn ẹlẹ́dẹ̀ ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, ìdánwò ANOVA ọ̀nà kan; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 vs. D0 àti **p < 0.01 ní ìfiwéra pẹ̀lú D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 0.01 与D12控制）b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ati D12 MT), разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односто <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram tí ó ń fi gbogbo àwọn ipò àṣà ìbílẹ̀ mẹ́rin hàn (ìṣàkóso, TD, MC àti MT) ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn ẹ̀yà ọkàn tuntun (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD àti D12 MT), láti oríṣiríṣi ẹlẹ́dẹ̀ 12 (D12 MC) àwọn ìpín/ẹgbẹ́, ìdánwò ANOVA ọ̀nà kan; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. ìṣàkóso D12). Àwòrán àtẹ c fi ìwọ̀n ìṣàn glucose hàn ní ọjọ́ 12 lẹ́yìn ìṣẹ̀dá ní gbogbo ipò àṣà mẹ́rin (Ctrl, TD, MC, àti MT) ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn ẹ̀gẹ́ ọkàn tuntun (D0) (n = 6 ẹ̀gẹ́/ẹgbẹ́ láti ọ̀dọ̀ àwọn ẹlẹ́dẹ̀ ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, a ṣe ìdánwò ANOVA ọ̀nà kan; ###p < 0.001, ní ìfiwéra pẹ̀lú D0 àti ***p < 0.001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D12 Ctrl). Àwòrán àtẹ c fi ìwọ̀n ìṣàn glucose hàn ní ọjọ́ 12 lẹ́yìn ìṣẹ̀dá ní gbogbo ipò àṣà mẹ́rin (Ctrl, TD, MC, àti MT) ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn ẹ̀gẹ́ ọkàn tuntun (D0) (n = 6 ẹ̀gẹ́/ẹgbẹ́ láti ọ̀dọ̀ àwọn ẹlẹ́dẹ̀ ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, a ṣe ìdánwò ANOVA ọ̀nà kan; ###p < 0.001, ní ìfiwéra pẹ̀lú D0 àti ***p < 0.001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12. культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со сравнению односторонний Выполняется тест ANOVA; c Histogram fi iye iye ti isun omi glukosi ninu ojo mejila leyin asa labẹ gbogbo awọn ipo asa mẹrin (iṣakoso, TD, MC ati MT) ni akawe pẹlu awọn apakan ọkan titun (D0) (n = awọn apakan/ẹgbẹ mẹfa lati awọn ẹlẹdẹ oriṣiriṣi, idanwo ANOVA ti a ṣe ni ọna kan; ###p < 0.001 ni akawe pẹlu D0 ati ***p < 0.001 ni akawe pẹlu D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 玻件（Ctrl、TD、MC天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；*##p < 0.000 丛0.001 与D12 Ctrl 相比） C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片培养 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ，测试；###p <0.001，与D0 相比，***p <0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока через 12 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; D12 (ìwé). c Histogram tí ó ń fi ìwọ̀n ìṣàn glucose hàn ní ọjọ́ 12 lẹ́yìn ìṣẹ̀dá fún gbogbo àwọn ipò ìṣẹ̀dá mẹ́rin (ìṣàkóso, TD, MC, àti MT) ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn ẹ̀yà ọkàn tuntun (D0) (n = ìpín 6/ẹgbẹ́, láti inú onírúurú ẹlẹ́dẹ̀, ní ẹ̀gbẹ́ kan. A ṣe àwọn ìdánwò ANOVA, ###p < 0.001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D0, ***p < 0.001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D12 (ìṣàkóso).d Àwọn àwòrán ìṣàyẹ̀wò oríṣiríṣi ti àwọn àsopọ̀ tuntun (aláwọ̀ búlúù), ọjọ́ kejìlá MC (aláwọ̀ ewé), àti ọjọ́ kejìlá MT (pupa) ní àwọn ibi ìpín àsopọ̀ agbègbè mẹ́wàá (n = 4 ege/ẹgbẹ́, ìdánwò ANOVA ọ̀nà kan; kò sí ìyàtọ̀ pàtàkì láàárín àwọn ẹgbẹ́). e àwòrán òkè ayọnáyèéfín tí ó ń fi àwọn jínì tí ó yàtọ̀ hàn ní àwọn ibi ìpín ọkàn tuntun (D0) ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn ibi ìpín ọkàn tí a gbìn lábẹ́ àwọn ipò àìdúró (Ctrl) tàbí lábẹ́ àwọn ipò MT (MT) fún ọjọ́ 10-12. f Àwòrán ooru ti àwọn jínì sarcomere fún àwọn ibi ìpín ọkàn tí a gbìn lábẹ́ àwọn ipò àṣà kọ̀ọ̀kan. Àwọn ọ̀pá àṣìṣe dúró fún ìyípadà ìwọ̀n ±.
Ìgbẹ́kẹ̀lé lórí ìyípadà láti ìfàsẹ́yìn ọ̀rá fatty acid sí glycolysis jẹ́ àmì ìyàtọ̀ cardiomyocyte. Àwọn sẹ́ẹ̀lì cardiomyocytes tí kò dàgbà máa ń lo glucose fún ìṣẹ̀dá ATP ní pàtàkì, wọ́n sì ní hypoplastic mitochondria pẹ̀lú díẹ̀ cristae5,32. Àwọn àyẹ̀wò lílo glucose fihàn pé lábẹ́ àwọn ipò MC àti MT, lílo glucose jọra sí èyí tí ó wà nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì ọjọ́ 0 (Àwòrán 4c). Síbẹ̀síbẹ̀, àwọn àpẹẹrẹ Ctrl fi ìbísí pàtàkì hàn nínú lílo glucose ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn sẹ́ẹ̀lì tuntun. Èyí fihàn pé àpapọ̀ CTCM àti T3/Dex mú kí agbára ìṣiṣẹ́ àsopọ pọ̀ sí i, ó sì ń pa ìrísí ìṣiṣẹ́ àsopọ mọ́ ti àwọn ẹ̀yà ọkàn tí a gbin fún ọjọ́ 12. Ní àfikún, ìwádìí strain fihàn pé ìwọ̀n strain náà dúró gẹ́gẹ́ bí ti àwọn sẹ́ẹ̀lì ọkàn tuntun fún ọjọ́ 12 lábẹ́ àwọn ipò MT àti MS (Àwòrán 4d).
Láti ṣàyẹ̀wò ipa gbogbogbò ti CTCM àti T3/Dex lórí àgbáyé transcriptional ti àsopọ cardiac slice, a ṣe RNAseq lórí àwọn dìẹ̀ ọkàn láti gbogbo àwọn ipò àṣà mẹ́rin tó yàtọ̀ síra (Àfikún Dátà 1). Lóòótọ́, àwọn apá MT fi ìfarajọra gíga hàn sí àsopọ ọkàn tuntun, pẹ̀lú 16 péré tí a fi ìyàtọ̀ hàn nínú àwọn dìẹ̀ 13,642. Síbẹ̀síbẹ̀, gẹ́gẹ́ bí a ti fihàn ní ìṣáájú, àwọn dìẹ̀ Ctrl fi àwọn dìẹ̀ 1229 hàn ní ìyàtọ̀ lẹ́yìn ọjọ́ 10–12 nínú àṣà (Àwòrán 4e). QRT-PCR ti àwọn dìẹ̀ ọkàn àti fibroblast jẹ́rìí sí àwọn ìwádìí wọ̀nyí (Àwòrán Àfikún 7a-c). Lóòótọ́, àwọn apá Ctrl fi ìdínkù nínú àwọn dìẹ̀ ọkàn àti sẹ́ẹ̀lì hàn àti ìmúṣiṣẹ́ àwọn ètò dìẹ̀ iredodo. Àwọn ìwádìí wọ̀nyí fihàn pé ìyàtọ̀, èyí tí ó sábà máa ń wáyé lẹ́yìn ìbímọ ìgbà pípẹ́, ni a dínkù pátápátá lábẹ́ àwọn ipò MT (Àwòrán Àfikún 8a,b). Ìwádìí pẹ̀lẹ́pẹ̀lẹ́ lórí àwọn jínì sarcomere fihàn pé lábẹ́ àwọn ipò MT nìkan ni àwọn jínì tí ó ń ṣàkójọ sarcomere (Àwòrán 4f) àti ikanni ion (Àfikún Àwòrán 9) ni a ti pa mọ́, tí ó ń dáàbò bò wọ́n kúrò lọ́wọ́ ìdènà lábẹ́ àwọn ipò Ctrl, TD, àti MC. Àwọn ìwádìí wọ̀nyí fihàn pé pẹ̀lú àpapọ̀ ìfúnni ní agbára ẹ̀rọ àti humoral (T3/Dex), ìkọ̀wé ọkàn lè dúró bí àwọn ìgé ọkàn tuntun lẹ́yìn ọjọ́ 12 nínú àṣà.
Àwọn àwárí ìkọ̀wé yìí ni a fi ẹ̀rí hàn nípa òtítọ́ pé ìdúróṣinṣin ìṣètò ti àwọn sẹ́ẹ̀lì ọkàn nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì ọkàn ni a lè pa mọ́ lábẹ́ àwọn ipò MT fún ọjọ́ 12, gẹ́gẹ́ bí a ṣe fihàn nípasẹ̀ connexin 43 tí ó wà ní ipò tí ó wà àti èyí tí a ti ṣe àgbékalẹ̀ rẹ̀ (Àwòrán 5a). Ní ​​àfikún, fibrosis nínú àwọn ẹ̀yà ọkàn lábẹ́ àwọn ipò MT dínkù gidigidi ní ìfiwéra pẹ̀lú Ctrl àti irú àwọn ẹ̀yà ọkàn tuntun (Àwòrán 5b). Àwọn ìwádìí wọ̀nyí fihàn pé àpapọ̀ ìfúnni ní ẹ̀rọ àti ìtọ́jú T3/Dex ń pa ìṣètò ọkàn mọ́ ní àwọn ẹ̀yà ọkàn ní àṣà.
Àwọn àwòrán immunofluorescence tó dúró fún troponin-T (alawọ ewe), connexin 43 (pupa), àti DAPI (bulu) nínú àwọn ẹ̀yà ọkàn tuntun tó ya sọ́tọ̀ (D0) tàbí tí wọ́n gbìn fún ọjọ́ méjìlá nínú gbogbo àwọn ipò ìṣẹ̀dá ẹ̀yà ọkàn mẹ́rin (ìwọ̀n ìwọ̀n = 100 µm). Ìwọ̀n ọgbọ́n àtọwọ́dá ti ìdúróṣinṣin ìṣètò àsopọ ọkàn (n = 7 (D0 àti D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC àti D12 MT) láti inú onírúurú ẹlẹ́dẹ̀, a ṣe ìdánwò ANOVA ọ̀nà kan; ####p < 0.0001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D0 àti *p < 0.05, tàbí ****p < 0.0001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D12 Ctrl). Ìwọ̀n ọgbọ́n àtọwọ́dá ti ìdúróṣinṣin ìṣètò àsopọ ọkàn (n = 7 (D0 àti D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC àti D12 MT) láti inú onírúurú ẹlẹ́dẹ̀, a ṣe ìdánwò ANOVA ọ̀nà kan; #### p < 0.0001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D0 àti *p < 0.05, tàbí ****p < 0.0001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердцас D12 MC ati D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; tabi ****p <0,0001 fun сравнению с D12 Ctrl). Ìṣirò ìdúróṣinṣin ìṣètò ti àsopọ ọkàn nípa lílo ọgbọ́n àtọwọ́dá (n = 7 (D0 àti D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC àti D12 MT) láti inú onírúurú ẹlẹ́dẹ̀, ìdánwò ANOVA ọ̀nà kan ṣoṣo tí a ṣe; #### p < 0.0001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D0 àti *p < 0.05 tàbí ****p < 0.0001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；### p <0.0001 世****D0 和*p <0.05与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5（d12 td 、 d12 mc 和 d12 mc智能量 化 行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p <0.0001 与D0 和*p <0.05 Konturolu 相比).Ìwọ̀n ìṣètò ìṣètò ti àsopọ ọkàn nípa lílo ọgbọ́n àtọwọ́dá nínú onírúurú ẹlẹ́dẹ̀ (n = 7 (D0 àti D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC àti D12 MT) àwọn ìpín/ẹgbẹ́) pẹ̀lú ìdánwò ANOVA ọ̀nà kan ṣoṣo;#### p <0,0001 pо сравнению с D0 и *p <0,05 tabi ****p <0,0001 pо сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 ni akawe pẹlu D0 ati *p < 0.05 tabi ****p < 0.0001 ni akawe pẹlu D12 Ctrl). b Àwọn àwòrán àti ìwọ̀n tó dúró fún àwọn ègé ọkàn tí wọ́n fi àwọ̀ Masson's trichrome stain (scale bar = 500 µm) ṣe (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, àti D12 MC), àwọn ègé 9 (D12 MT) láti inú àwọn ẹlẹ́dẹ̀ ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, a ṣe ìdánwò ANOVA ọ̀nà kan; ####p < 0.0001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D0 àti ***p < 0.001, tàbí ****p < 0.0001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D12 Ctrl). b Àwọn àwòrán àti ìwọ̀n tó dúró fún àwọn ègé ọkàn tí wọ́n fi àwọ̀ Masson's trichrome stain (scale bar = 500 µm) ṣe (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, àti D12 MC), àwọn ègé 9 (D12 MT) láti inú àwọn ẹlẹ́dẹ̀ ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, a ṣe ìdánwò ANOVA ọ̀nà kan; ####p < 0.0001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D0 àti ***p < 0.001, tàbí ****p < 0.0001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ati D12 MC), 9 (D12 MT) ANOVA ; D12 Ctrl). b Àwọn àwòrán àti ìṣàfihàn àwọn apá ọkàn tí a fi àbàwọ́n trichrome Masson ti ya (ìwọ̀n ìwọ̀n = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD àti D12 MC), àwọn apá/ẹgbẹ́ 9 (D12 MT) láti inú àwọn ẹlẹ́dẹ̀ ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, tí a ṣe ní ọ̀nà kan ṣoṣo ANOVA; ####p < 0.0001 vs. D0 àti ***p < 0.001 tàbí ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10！ TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p <10相比，***p <0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化ctrl d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；*####p < 0.0001 0.001,或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比） b Репрезентативные изображения и количественная оценка. 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ati D12 MC) сравнению с D0, *** p <0,001 tabi ****p <0,0001 pо сравнению с D12 Ctrl). b Àwọn àwòrán àti ìṣàfihàn àwọn apá ọkàn tí a fi àwọ̀ Masson's trichrome (ìwọ̀n ọ̀pá = 500 µm) ṣe (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD àti D12 MC), àwọn apá 9 (D12 MT) láti inú onírúurú ẹlẹ́dẹ̀/ẹgbẹ́, ọ̀nà ANOVA kan; ####p < 0.0001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D0, ***p < 0.001 tàbí ****p < 0.0001 ní ìfiwéra pẹ̀lú D12 Ctrl).Àwọn ọ̀pá àṣìṣe dúró fún ìyípadà ìwọ̀n ± ti àròpín.
Níkẹyìn, a ṣe àyẹ̀wò agbára CTCM láti fara wé hypertrophy ọkàn nípa mímú kí ìfàsẹ́yìn àsopọ ọkàn pọ̀ sí i. Nínú CTCM, ìfúnpá afẹ́fẹ́ tó ga jùlọ pọ̀ sí i láti 80 mmHg sí 80 mmHg. Art. (ìfàsẹ́yìn déédé) títí dé 140 mmHg Art. (Àwòrán 6a). Èyí bá ìbísí 32% nínú ìfàsẹ́yìn mu (Àwòrán 6b), èyí tí a ti fihàn tẹ́lẹ̀ gẹ́gẹ́ bí ìpín ọgọ́rùn-ún ìfàsẹ́yìn tó báramu tí a nílò fún àwọn apá ọkàn láti dé gígùn sarcomere kan tí ó jọ èyí tí a rí nínú hypertrophy. Ìfàsẹ́yìn àti iyàrá ti àsopọ ọkàn nígbà ìfàsẹ́yìn àti ìsinmi dúró ṣinṣin ní ọjọ́ mẹ́fà ti ìbísí (Àwòrán 6c). Àsopọ ọkàn láti inú MT ni a fi sí ipò ìfàsẹ́yìn déédé (MT (Normal)) tàbí ipò ìfàsẹ́yìn (MT (OS)) fún ọjọ́ mẹ́fà. Lẹ́yìn ọjọ́ mẹ́rin tí a ti ń ṣe ìbísí, àmì-ẹ̀rọ hypertrophic NT-ProBNP ti ga sí i ní àárín lábẹ́ ipò MT (OS) ní ìfiwéra pẹ̀lú ipò MT (deede) (Àwòrán 7a). Ní àfikún, lẹ́yìn ọjọ́ mẹ́fà tí a ti ń ṣe àgbékalẹ̀ rẹ̀, ìwọ̀n sẹ́ẹ̀lì nínú MT (OS) (Àwòrán 7b) pọ̀ sí i ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn apá ọkàn MT (déédéé). Ní ​​àfikún, ìyípadà nọ́mbà NFATC4 pọ̀ sí i ní pàtàkì nínú àwọn àsopọ̀ tí ó nà jù (Àwòrán 7c). Àwọn àbájáde wọ̀nyí fi ìdàgbàsókè ìṣàtúnṣe àrùn lẹ́yìn ìfàsẹ́yìn ẹ̀jẹ̀ hàn, wọ́n sì ṣe àtìlẹ́yìn fún èrò náà pé a lè lo ẹ̀rọ CTCM gẹ́gẹ́ bí pẹpẹ láti kẹ́kọ̀ọ́ nípa àmì hypertrophy ọkàn tí ó ń fa ìfàsẹ́yìn.
Àwọn àmì ìtọ́kasí ìfúnpá yàrá afẹ́fẹ́, ìfúnpá yàrá omi, àti ìwọ̀n ìṣípo àsopọ jẹ́rìí sí i pé ìfúnpá yàrá yí ìfúnpá yàrá omi padà, èyí sì ń fa ìṣípo tó báramu ti ìfúnpá náà. b Ìpíndọ́gba ìfúnpá àti ìtẹ̀sí ìfúnpá fún àwọn apá àsọ tí a nà (osàn) àti àwọn apá àsọ tí a nà jù (blúù). c Àwòrán ọ̀pá tí ó ń fi àkókò ìyípo hàn (n = 19 ìṣẹ́pọ̀ fún ẹgbẹ́ kan, láti ọ̀dọ̀ àwọn ẹlẹ́dẹ̀ onírúurú), àkókò ìfàmọ́ra (n = 18-19 ìṣẹ́pọ̀ fún ẹgbẹ́ kan, láti ọ̀dọ̀ àwọn ẹlẹ́dẹ̀ onírúurú), àkókò ìsinmi (n = 19 ìṣẹ́pọ̀ fún ẹgbẹ́ kan, láti ọ̀dọ̀ àwọn ẹlẹ́dẹ̀ onírúurú) ), ìwọ̀n ìṣípo àsọ (n = 14 ìṣẹ́pọ̀/ẹgbẹ́, láti ọ̀dọ̀ àwọn ẹlẹ́dẹ̀ onírúurú), ìwọ̀n ìfàmọ́ra systolic (n = 14 ìṣẹ́pọ̀/ẹgbẹ́, láti ọ̀dọ̀ àwọn ẹlẹ́dẹ̀ onírúurú) àti ìwọ̀n ìsinmi gígún (n = 14 (D0), 15 (D6) ) àwọn apá/ẹgbẹ́) láti ọ̀dọ̀ àwọn ẹlẹ́dẹ̀ onírúurú), ìdánwò t-akẹ́kọ́ọ́ onírù méjì kò fi ìyàtọ̀ pàtàkì hàn nínú èyíkéyìí pàrámítà, èyí tí ó fihàn pé àwọn pàrámítà wọ̀nyí dúró ṣinṣin ní ọjọ́ mẹ́fà ti àṣà pẹ̀lú ìfúnpá gígún. Àwọn ọ̀pá àṣìṣe dúró fún ìyàtọ̀ ± ìwọ̀n ààtò.
Àwòrán Bar graph ìṣàyẹ̀wò ìpele NT-ProBNP nínú àwọn èròjà àṣà láti inú àwọn ègé ọkàn tí a gbìn lábẹ́ MT normal stretch (Norm) tàbí overstretching (OS) conditions (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, àti D4 MTOS) láti inú àwọn ẹlẹ́dẹ̀ ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, a ṣe ANOVA ọ̀nà méjì; **p < 0.01 ní ìfiwéra pẹ̀lú stretching déédé). Àwòrán Bar graph ìṣàyẹ̀wò ìpele NT-ProBNP nínú àwọn èròjà àṣà láti inú àwọn ègé ọkàn tí a gbìn lábẹ́ MT normal stretch (Norm) tàbí overstretching (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, àti D4 MTOS) láti inú àwọn ẹlẹ́dẹ̀ ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, a ṣe ANOVA ọ̀nà méjì; **p < 0.01 ní ìfiwéra pẹ̀lú stretching déédé).Àwòrán oníṣirò ti ìfọkànsí NT-ProBNP nínú àṣà ìbílẹ̀ láti inú àwọn ègé ọkàn tí a gbìn lábẹ́ àwọn ipò ti ìfà MT déédé (ìlànà) tàbí ìfàsẹ́yìn (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, àti D4).MTOS) àwọn ègé/ẹgbẹ́ láti inú àwọn ẹlẹ́dẹ̀ ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, a ṣe ìwádìí onípele méjì ti ìyàtọ̀;**p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 ni akawe pẹlu isan deede). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm 和D4) MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p <0.01）. Quantification ti ifọkansi NT-ProBNP ni awọn ege ọkan ti o gbin labẹ isan deede MT (Norm) tabi awọn ipo apọju (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) lati oriṣiriṣi猪的切片/组，可以双向方方发发动 ** akawe pẹlu isunmọ deede, p <0.01).histogram Ìwọ̀n ìpele NT-ProBNP nínú àwọn ègé ọkàn tí a gbìn lábẹ́ àwọn ipò ti MT nà déédé (ìlànà) tàbí overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) àti D4 MTOS) àwọn ègé/ẹgbẹ́ láti inú àwọn ẹlẹ́dẹ̀ ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, ìṣàyẹ̀wò ìyàtọ̀ ọ̀nà méjì;**p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 ni akawe pẹlu isan deede). b Àwọn àwòrán aṣojú fún àwọn ègé ọkàn tí a fi troponin-T àti WGA (òsì) àti ìwọ̀n sẹ́ẹ̀lì (ọ̀tún) (n = 330 (D6 MTOS), àwọn sẹ́ẹ̀lì 369 (D6 MTNorm)/ẹgbẹ́ láti inú àwọn ègé 10 ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀ láti inú àwọn ẹlẹ́dẹ̀ ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, a ṣe ìdánwò t-akẹ́kọ́ọ́ onírù méjì; ****p < 0.0001 ní ìfiwéra pẹ̀lú ìnà déédé). b Àwọn àwòrán tí a fi troponin-T àti WGA ṣe àwọ̀ ọkàn (òsì) àti ìwọ̀n sẹ́ẹ̀lì (ọ̀tún) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sẹ́ẹ̀lì/ẹgbẹ́ láti oríṣiríṣi 10 láti oríṣiríṣi ẹlẹ́dẹ̀, a ṣe ìdánwò t-akẹ́kọ́ọ́ onírù méjì; ****p < 0.0001 ní ìfiwéra pẹ̀lú ìnà déédé). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) t-критерий Стьюдента; ****p <0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Àwọn àwòrán aṣojú ti àwọn ẹ̀yà ọkàn tí a fi troponin-T àti AZP (òsì) ṣe àwọ̀ àti ìwọ̀n sẹ́ẹ̀lì (ọ̀tún) (n = 330 (D6 MTOS), àwọn sẹ́ẹ̀lì 369 (D6 MTNorm)/ẹgbẹ́ láti àwọn ẹ̀yà mẹ́wàá ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀ láti inú àwọn ẹlẹ́dẹ̀ ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀, ìdánwò t-akẹ́kọ́ọ́ onírù méjì ni a ṣe; ****p < 0.0001 ní ìfiwéra pẹ̀lú irú àrùn déédéé). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表）3＃n = 6 MTOS）来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比，****p < 0.0001) b Àwọn àwòrán aṣojú ti àwọn ègé ọkàn tí a fi àwọ̀ calcarein-T àti WGA (òsì) àti ìwọ̀n sẹ́ẹ̀lì (ọ̀tún) ṣe (n = 330 (D6 MTOS), 369 láti inú àwọn ègé 10 ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀ (D6 MTNorm)) Àwọn sẹ́ẹ̀lì/Ìdánwò ìṣàpẹẹrẹ； ní ìfiwéra pẹ̀lú nínà déédéé，****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца ( справа ) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) Стьюдента; **** p <0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Àwọn àwòrán aṣojú ti àwọn apá ọkàn tí a fi troponin-T àti AZP (òsì) ṣe àwọ̀ àti ìwọ̀n ìwọ̀n sẹ́ẹ̀lì (ọ̀tún) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) láti àwọn apá mẹ́wàá tó yàtọ̀ síra láti inú àwọn ẹlẹ́dẹ̀ tó yàtọ̀ síra) Àwọn sẹ́ẹ̀lì/ẹgbẹ́, ìlànà onírù méjì. Àwọn akẹ́kọ̀ọ́ t; ****p < 0.0001 ní ìfiwéra pẹ̀lú irú àrùn tó wà déédéé). c Àwọn àwòrán aṣojú fún ọjọ́ 0 àti ọjọ́ 6. Àwọn MTOS ọkàn tí a fi àmì ìdámọ̀ràn fún troponin-T àti NFATC4 àti ìwọ̀n ìyípadà NFATC4 sí àárín àwọn CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) àwọn gé/ẹgbẹ́ láti inú onírúurú ẹlẹ́dẹ̀, a ṣe ìdánwò t-akẹ́kọ́ọ́ onírù méjì; *p < 0.05). c Àwọn àwòrán aṣojú fún ọjọ́ 0 àti ọjọ́ 6. Àwọn MTOS ọkàn tí a fi àmì ìdámọ̀ràn fún troponin-T àti NFATC4 àti ìwọ̀n ìyípadà NFATC4 sí àárín àwọn CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) àwọn gé/ẹgbẹ́ láti inú onírúurú ẹlẹ́dẹ̀, a ṣe ìdánwò t-akẹ́kọ́ọ́ onírù méjì; *p < 0.05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) двусторонний t-критерий Стьюдента; c Àwọn àwòrán aṣojú fún àwọn ẹ̀yà ọkàn ní ọjọ́ 0 àti 6 MTOS, tí a fi àmì ìdámọ̀ràn fún troponin-T àti NFATC4, àti ìwọ̀n ìyípadà NFATC4 nínú nucleus ti àwọn sẹ́ẹ̀lì ihò inú (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) gé/ẹgbẹ́ láti inú onírúurú ẹlẹ́dẹ̀) ṣe ìdánwò t-Akẹ́kọ̀ọ́ oní ìrù méjì; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)进行双尾学生t 检验；*p <0.05). c Awọn aworan aṣoju ti calcanin-T ati NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS awọn ege ọkan ọkan, ati NFATC4 lati oriṣiriṣi NFATC4时间双尾学生et 电影；*p <0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для. оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-крить; 0,05). c Àwọn àwòrán aṣojú ti àwọn ègé ọkàn MTOS ní ọjọ́ 0 àti 6 fún troponin-T àti NFATC4 immunolabeling àti ìwọ̀n ìyípadà NFATC4 nínú nucleus ti CM láti inú onírúurú ẹlẹ́dẹ̀ (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) gégé/ẹgbẹ́, àwọn akẹ́kọ̀ọ́ oní-ìrù méjì; *p < 0.05).Àwọn ọ̀pá àṣìṣe dúró fún ìyípadà ìwọ̀n ± ìwọ̀n.
Ìwádìí nípa ọkàn àti ẹ̀jẹ̀ ní ìtumọ̀ nílò àwọn àwòṣe sẹ́ẹ̀lì tí ó ń ṣe àtúnṣe àyíká ọkàn ní ọ̀nà tí ó tọ́. Nínú ìwádìí yìí, a ṣe àgbékalẹ̀ ẹ̀rọ CTCM kan tí a sì ṣe àfihàn rẹ̀ tí ó lè ru àwọn apá ọkàn tín-tín sókè. Ètò CTCM náà ní ìfúnni electromechanical tí a ṣe àgbékalẹ̀ rẹ̀ pẹ̀lú ìṣiṣẹ́ ara àti ìdàgbàsókè omi T3 àti Dex. Nígbà tí a bá fi àwọn apá ọkàn ẹlẹ́dẹ̀ hàn sí àwọn nǹkan wọ̀nyí, agbára wọn, ìdúróṣinṣin ìṣètò, ìṣiṣẹ́ ìṣiṣẹ́ ara, àti ìfarahàn ìkọ̀wé dúró gẹ́gẹ́ bí ó ti wà nínú àsopọ ọkàn tuntun lẹ́yìn ọjọ́ 12 ti ìbílẹ̀. Ní àfikún, nínà púpọ̀ jù ti àsopọ ọkàn lè fa hypertrophy ti ọkàn tí hyperextension fà. Ní gbogbogbòò, àwọn àbájáde wọ̀nyí ń ṣètìlẹ́yìn ipa pàtàkì ti àwọn ipò àṣà ìṣẹ̀dá ara nínú mímú ìrísí ọkàn déédéé dàgbà àti pèsè ìpìlẹ̀ fún ìwádìí oògùn.
Ọ̀pọ̀lọpọ̀ nǹkan ló ń fa kí a lè ṣẹ̀dá àyíká tó dára jùlọ fún iṣẹ́ àti ìwàláàyè àwọn sẹ́ẹ̀lì ọkàn. Èyí tó hàn gbangba jùlọ nínú àwọn ohun wọ̀nyí ni (1) ìbáṣepọ̀ láàárín sẹ́ẹ̀lì, (2) ìfúnni electromechanical, (3) àwọn ohun tó ń fa humoral, àti (4) àwọn ohun èlò ìṣẹ̀dá ara. Ìbáṣepọ̀ sẹ́ẹ̀lì sí sẹ́ẹ̀lì nípa ti ara nílò àwọn nẹ́ẹ̀tìwọ́ọ̀kì onípele mẹ́ta ti onírúurú sẹ́ẹ̀lì tí a fi matrix extracellular ṣe àtìlẹ́yìn fún. Irú ìbáṣepọ̀ sẹ́ẹ̀lì tó díjú bẹ́ẹ̀ ṣòro láti tún ṣe ní in vitro nípa ṣíṣe àjọpọ̀ àwọn irú sẹ́ẹ̀lì kọ̀ọ̀kan, ṣùgbọ́n a lè ṣe é ní lílo ìwà organotypic ti àwọn ẹ̀yà ọkàn.
Ìnà ẹ̀rọ àti ìfúnnimọ́ ... Bó tilẹ̀ jẹ́ pé ìfúnni onípele mẹ́ta yìí nìkan kò tó láti mú kí àsopọ ara dúró ṣinṣin, àpapọ̀ ìfúnni oníhòòhò àti oníhòòhò nípa lílo T3/Dex ni a nílò láti mú kí àsopọ ara ṣiṣẹ́ dáadáa, iṣẹ́ rẹ̀, àti ìwà rere rẹ̀.
Àwọn ohun tó ń fa ìrísí ọkàn jẹ́ ipa pàtàkì nínú ṣíṣe àtúnṣe ìrísí ọkàn àgbàlagbà. Èyí ni a tẹnu mọ́ nínú àwọn ìwádìí HiPS-CM níbi tí a ti fi T3 àti Dex kún àwọn ohun èlò àṣà láti mú kí ìdàgbàsókè sẹ́ẹ̀lì yára. T3 lè ní ipa lórí ìrìnnà àwọn amino acids, suga àti calcium kọjá àwọn awọ ara sẹ́ẹ̀lì36. Ní àfikún, T3 ń gbé ìgbékalẹ̀ MHC-α àti ìfàsẹ́yìn MHC-β lárugẹ, ó ń gbé ìṣẹ̀dá àwọn myofibrils tí ó yára tàn kálẹ̀ nínú àwọn sẹ́ẹ̀lì ọkàn tí ó dàgbà ní ìfiwéra pẹ̀lú àwọn myofibrils tí ó lọ́ra nínú CM ọmọ inú oyún. Àìtó T3 nínú àwọn aláìsàn hypothyroid ń yọrí sí pípadánù àwọn ìpele myofibrillar àti ìdínkù ìwọ̀n ìdàgbàsókè ohùn37. Dex ń ṣiṣẹ́ lórí àwọn olugba glucocorticoid ó sì ti fihàn pé ó ń mú kí ìfàsẹ́yìn ọkàn pọ̀ sí i nínú ọkàn tí a ti ya sọ́tọ̀; 38 a rò pé ìdàgbàsókè yìí ní í ṣe pẹ̀lú ipa lórí ìtẹ̀síwájú calcium deposit-driven (SOCE) 39,40. Ní àfikún, Dex ń so mọ́ àwọn olugba rẹ̀, ó sì ń fa ìdáhùn gbígbòòrò nínú ẹ̀jẹ̀ tí ó ń dín iṣẹ́ àjẹ́sí àti ìgbóná ara kù30.
Àwọn àbájáde wa fihàn pé ìfúnni ní agbára ìṣiṣẹ́ ara (MS) mú kí iṣẹ́ ìṣẹ̀dá gbogbogbò sunwọ̀n síi ní ìfiwéra pẹ̀lú Ctrl, ṣùgbọ́n kò lè pa agbára ìṣiṣẹ́ mọ́, ìdúróṣinṣin ìṣètò, àti ìfarahàn ọkàn mọ́ra fún ọjọ́ 12 nínú àṣà. Ní ìfiwéra pẹ̀lú Ctrl, fífi T3 àti Dex kún àṣà CTCM (MT) mú kí agbára ìṣiṣẹ́ sunwọ̀n síi, ó sì pa àwọn ìrísí ìkọ̀wé kan náà mọ́, ìdúróṣinṣin ìṣètò, àti ìṣiṣẹ́ ìṣiṣẹ́ pẹ̀lú àsopọ ọkàn tuntun fún ọjọ́ 12. Ní àfikún, nípa ṣíṣàkóso ìwọ̀n ìfà àsopọ, a ṣẹ̀dá àwòṣe hypertrophy ọkàn tí ó fa hyperextension nípa lílo STCM, èyí tí ó ṣàfihàn ìyípadà ti ètò STCM. Ó yẹ kí a kíyèsí pé bó tilẹ̀ jẹ́ pé àtúnṣe ọkàn àti fibrosis sábà máa ń ní àwọn ẹ̀yà ara tí ó wà láìsí ìṣòro tí àwọn sẹ́ẹ̀lì tí ń yí kiri lè pèsè àwọn cytokines tí ó yẹ àti phagocytosis àti àwọn ohun mìíràn tí ń ṣe àtúnṣe, àwọn apá ọkàn ṣì lè fara wé ìlànà fibrotic ní ìdáhùn sí wahala àti ìpalára. sínú myofibroblasts. Èyí ni a ti ṣe àyẹ̀wò tẹ́lẹ̀ nínú àwòṣe àyà yìí. Ó yẹ kí a kíyèsí pé a lè ṣe àtúnṣe àwọn pàrámítà CTCM nípa yíyípadà ìfúnni/ìwọ̀n iná mànàmáná àti ìgbàkúgbà láti ṣe àfarawé ọ̀pọ̀lọpọ̀ ipò bíi tachycardia, bradycardia, àti ìtìlẹ́yìn ìṣàn ẹ̀jẹ̀ (ọkàn tí a kò gba sílẹ̀). Èyí mú kí ètò náà jẹ́ ọ̀nà àbájáde fún ìdánwò oògùn. Agbára CTCM láti ṣe àwòkọ hypertrophy ọkàn tí ó fa ìṣiṣẹ́ púpọ̀ ló ṣí ọ̀nà sílẹ̀ fún ìdánwò ètò yìí fún ìtọ́jú ara ẹni. Ní ìparí, ìwádìí yìí fihàn pé ìfàsẹ́yìn ẹ̀rọ àti ìfúnni ní ìfọwọ́sowọ́pọ̀ ṣe pàtàkì fún mímú àṣà àwọn ẹ̀yà ara ọkàn dúró.
Bó tilẹ̀ jẹ́ pé àwọn ìwádìí tí a gbé kalẹ̀ níbí fihàn pé CTCM jẹ́ pẹpẹ tí ó ní ìrètí púpọ̀ fún ṣíṣe àwòṣe myocardium tí ó wà ní ipò pípé, ọ̀nà àṣà yìí ní àwọn ààlà díẹ̀. Ààlà pàtàkì ti àṣà CTCM ni pé ó ń fi àwọn ìfúnpá oníṣiṣẹ́ tí ń lọ lọ́wọ́lọ́wọ́ sí àwọn ìfúnpá oníṣiṣẹ́ lórí àwọn ìfúnpá, èyí tí ó ń dí agbára láti ṣe àkíyèsí ìfàsẹ́yìn ìfúnpá ọkàn lọ́wọ́ nígbà gbogbo ìyípo. Ní àfikún, nítorí ìwọ̀n kékeré ti àwọn apá ọkàn (7 mm), agbára láti ṣe àyẹ̀wò iṣẹ́ systolic níta àwọn ètò àṣà nípa lílo àwọn sensọ agbára ìbílẹ̀ ní ààlà. Nínú ìwé àfọwọ́kọ lọ́wọ́lọ́wọ́, a borí ìdíwọ́ yìí díẹ̀ nípa ṣíṣe àyẹ̀wò fólítì ojú gẹ́gẹ́ bí àmì iṣẹ́ ìfàsẹ́yìn. Síbẹ̀síbẹ̀, ìdíwọ́ yìí yóò nílò iṣẹ́ síwájú sí i, a sì lè yanjú rẹ̀ ní ọjọ́ iwájú nípa ṣíṣe àgbékalẹ̀ àwọn ọ̀nà fún àbójútó ojú ti iṣẹ́ àwọn ìfúnpá ọkàn nínú àṣà, gẹ́gẹ́ bí àwòrán ojú nípa lílo àwọn àwọ̀ calcium àti folíìgì tí ó ní ìmọ̀lára. Ààlà mìíràn ti CTCM ni pé àpẹẹrẹ iṣẹ́ náà kò darí wahala ara (preload àti afterload). Nínú CTCM, a fa ìfúnpá ní àwọn ọ̀nà òdìkejì láti ṣe àtúnṣe 25% ìfàsẹ́yìn ti ara nínú diastole (full stretch) àti systole (gígùn ìfàsẹ́yìn nígbà ìfúnpá iná mànàmáná) nínú àwọn àsopọ ńlá. A gbọ́dọ̀ mú ìdíwọ́ yìí kúrò nínú àwọn àwòrán CTCM ọjọ́ iwájú nípa fífún ara tó péye lórí àsopọ ọkàn láti ẹ̀gbẹ́ méjèèjì àti nípa lílo àwọn ìbáṣepọ̀ ìwọ̀n ìfúnpọ̀ gangan tí ó ń wáyé nínú àwọn yàrá ọkàn.
Àtúnṣe tí ó fa ìfàsẹ́yìn tí ó pọ̀ jù tí a ròyìn nínú ìwé àfọwọ́kọ yìí ní ààlà sí ṣíṣe àfarawé àwọn àmì hyperstretch hypertrophic. Nítorí náà, àwòṣe yìí lè ran lọ́wọ́ nínú ìkẹ́kọ̀ọ́ ti àmì hypertrophic tí ó fa ìfàsẹ́yìn láìsí àìní fún àwọn ohun tí ó fa humoral tàbí neural (tí kò sí nínú ètò yìí). Àwọn ìwádìí síwájú sí i ni a nílò láti mú kí iye CTCM pọ̀ sí i, fún àpẹẹrẹ, ṣíṣe àfarawé pẹ̀lú àwọn sẹ́ẹ̀lì aláàbò, ṣíṣe àfarawé humoral plasma, àti ṣíṣe àfarawé innervation nígbà tí a bá ń ṣe àfarawé pẹ̀lú àwọn sẹ́ẹ̀lì neuronal yóò mú kí ó ṣeéṣe láti ṣe àfarawé àrùn pẹ̀lú CTCM.
A lo ẹlẹ́dẹ̀ mẹ́tàlá nínú ìwádìí yìí. Gbogbo ìtọ́jú ẹranko ni a ṣe ní ìbámu pẹ̀lú ìlànà ilé-iṣẹ́ àti Ìgbìmọ̀ Ìtọ́jú àti Lílo Ẹranko ti Yunifásítì Louisville fọwọ́ sí. A di apá aortic náà mú, a sì fi 1 L ti ọkàn aláìlera kún ọkàn (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH tó 7.4); A fi omi ìpara ọkàn tí ó tutù yìnyín pamọ́ sínú omi ìpara ọkàn títí a ó fi gbé e lọ sí yàrá ìwádìí lórí yìnyín, èyí tí ó sábà máa ń jẹ́ <10 min. A fi omi ìpara ọkàn tí ó tutù yìnyín pamọ́ sínú omi ìpara ọkàn títí a ó fi gbé e lọ sí yàrá ìwádìí lórí yìnyín, èyí tí ó sábà máa ń jẹ́ <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортиртировки в лабораторию на льду, что обыch A kó ọkàn pamọ́ sínú omi ìtútù ọkàn títí a ó fi gbé e lọ sí yàrá ìwádìí lórí yìnyín, èyí tí ó sábà máa ń gba ju ìṣẹ́jú mẹ́wàá lọ.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Jẹ́ kí ọkàn rẹ wà lórí yìnyín cardioplegia títí tí o fi gbé e lọ sí yàrá ìwádìí lórí yìnyín, nígbàkúgbà tí o bá ń lo yìnyín ní ìwọ̀n ìṣẹ́jú mẹ́wàá.
A ṣe ẹ̀rọ CTCM náà nípasẹ̀ sọ́fítíwọ́ọ̀tì SolidWorks kọ̀mpútà tí ó ṣe ìrànlọ́wọ́ fún ìṣètò (CAD). A fi ike acrylic CNC tí ó mọ́ kedere ṣe àwọn yàrá àṣà, àwọn ìpínyà àti àwọn yàrá afẹ́fẹ́. Orùka àtìlẹ́yìn oníwọ̀n 7mm ni a fi polyethylene oníwọ̀n gíga (HDPE) ṣe ní àárín, ó sì ní ihò o-ring láti gba o-ring silicone tí a lò láti fi dí àwọn ohun èlò tí ó wà ní ìsàlẹ̀. Okùn silica tín-ín-rín kan ya yàrá àṣà kúrò nínú àwo ìyàsọ́tọ̀. A fi lesa ge awo silikoni náà láti inú ìwé silikoni tí ó nípọn 0.02″, ó sì ní líle ti 35A. A fi lesa gé àwọn gaskets silikoni ìsàlẹ̀ àti òkè láti inú ìwé silikoni tí ó nípọn 1/16″, wọ́n sì ní líle ti 50A. A lo àwọn skru irin alagbara 316L àti àwọn èèpo ìyẹ́ fún dídì block náà àti ṣíṣẹ̀dá èèpo tí afẹ́fẹ́ kò lè wọ̀.
A ṣe àgbékalẹ̀ pátákó ìtẹ̀wé tí a yà sọ́tọ̀ (PCB) láti so pọ̀ mọ́ ètò C-PACE-EM. Àwọn ihò ìsopọ̀ ẹ̀rọ Swiss lórí PCB ni a so mọ́ àwọn elekitiródì graphite nípasẹ̀ àwọn wáyà bàbà tí a fi fàdákà ṣe àti àwọn skru idẹ 0-60 tí a fi sínú àwọn elekitiródì náà. A gbé pátákó ìtẹ̀wé tí a tẹ̀ sínú ìbòrí ẹ̀rọ ìtẹ̀wé 3D.
Ẹ̀rọ CTCM ni a ń ṣàkóso nípasẹ̀ ẹ̀rọ amúṣẹ́-afẹ́fẹ́ tí a lè ṣètò (PPD) tí ó ń ṣẹ̀dá ìfúnpọ̀ iṣan tí a ń ṣàkóso tí ó jọ ti ìyípo ọkàn. Bí ìfúnpọ̀ inú yàrá afẹ́fẹ́ ṣe ń pọ̀ sí i, awọ ara silikoni tí ó rọrùn yóò fẹ̀ sí i, tí yóò sì fipá mú ohun èlò náà wà lábẹ́ ibi tí àsopọ wà. Lẹ́yìn náà, a óò na agbègbè àsopọ náà nípa lílo omi jáde, èyí tí yóò fara wé ìfẹ̀sí ara ọkàn nígbà diastole. Ní àkókò ìsinmi, a lo ìfúnpọ̀ iná mànàmáná nípasẹ̀ àwọn elektirọd graphite, èyí tí yóò dín ìfúnpọ̀ nínú yàrá afẹ́fẹ́ kù tí yóò sì fa ìfàsẹ́yìn àwọn apá àsopọ. Nínú páìpù náà ni fáfà hemostatic kan wà pẹ̀lú sensọ titẹ láti ṣàwárí ìfúnpọ̀ nínú ètò afẹ́fẹ́. A fi ìfúnpọ̀ tí sensọ titẹ ń nímọ̀lára hàn sí olùkójọ data tí a so mọ́ kọ̀ǹpútà alágbèéká. Èyí ń jẹ́ kí a máa ṣe àkíyèsí ìfúnpọ̀ nínú yàrá gaasi nígbà gbogbo. Nígbà tí a bá dé ìfúnpọ̀ yàrá tí ó pọ̀ jùlọ (boṣewa 80 mmHg, 140 mmHg OS), a pàṣẹ fún ẹ̀rọ gbígbà data láti fi àmì ránṣẹ́ sí ẹ̀rọ C-PACE-EM láti ṣe àmì folti biphasic fún 2 ms, tí a ṣètò sí 4 V.
A gba awọn apa ọkan ati awọn ipo idagbasoke ninu awọn ihò mẹfa ni a ṣe ni atẹle yii: Gbe awọn ọkàn ti a ti ya kuro lati inu ohun elo gbigbe si atẹ ti o ni tutu (4° C.) cardioplegia. A ya ventricle apa osi kuro pẹlu abẹfẹlẹ ti ko ni ailesa, a si ge wọn si awọn ege ti 1-2 cm3. Awọn bulọọki àsopọ wọnyi ni a so mọ awọn atilẹyin àsopọ pẹlu alemora àsopọ, a si fi wọn sinu iwẹ àsopọ microtome ti o n gbọn ti o ni ojutu Tyrode, a si fi atẹgun sinu rẹ nigbagbogbo (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g). , 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-glucose (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M ojutu), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M ojutu), titi de 1 L ddH2O). A ṣètò microtome tí ń gbọ̀n láti gé àwọn ege tí ó nípọn 300 µm ní ìgbóná 80 Hz, ìwọ̀n ìgbóná tí ó wà ní ìlàjìn 2 mm, àti ìwọ̀n ìtẹ̀síwájú 0.03 mm/s. A fi yìnyín yí ìwẹ̀ àsọ náà ká láti jẹ́ kí omi náà tutù, a sì ń pa ìwọ̀n otútù náà mọ́ ní 4°C. Gbé àwọn apá àsọ láti inú ìwẹ̀ microtome lọ sí ìwẹ̀ incubation tí ó ní omi Tyrode tí ó ní oxygen lórí yìnyín títí tí a ó fi rí àwọn apá tí ó tó fún àwo ìbílẹ̀ kan. Fún àwọn àṣà transwell, a so àwọn apá àsọ mọ́ àwọn ìtìlẹ́yìn polyurethane tí ó ní 6 mm tí ó ṣófo, a sì fi sínú 6 ml ti alabọde tí a ti ṣe àtúnṣe (199 medium, 1x ITS supplement, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkaline àti 2X antibiotic-antifungal). A lo ìfúnni iná mànàmáná (10 V, ìgbóná 1.2 Hz) sí àwọn apá àsọ nípasẹ̀ C-Pace. Fún àwọn ipò TD, a fi T3 àti Dex tuntun kún un ní 100 nM àti 1 μM ní gbogbo ìyípadà àárín. A fi atẹ́gùn kún inú rẹ̀ kí a tó yí i padà ní ìgbà mẹ́ta lójúmọ́. A gbin àwọn ẹ̀yà ara sínú incubator ní 37°C àti 5% CO2.
Fún àwọn àgbékalẹ̀ CTCM, a gbé àwọn àgbékalẹ̀ àsopọ sí orí ẹ̀rọ ìtẹ̀wé 3D tí a ṣe ní àwo Petri kan tí ó ní omi Tyrode tí a ti yípadà. A ṣe ẹ̀rọ náà láti mú kí ìwọ̀n apá ọkàn náà pọ̀ sí i ní 25% ti agbègbè òrùka ìtìlẹ́yìn. Èyí ni a ṣe kí àwọn apá ọkàn má baà nà lẹ́yìn tí a bá ti gbé e láti omi Tyrode sí àárín àti nígbà diastole. Nípa lílo gọ́ọ̀mù histoacrylic, a so àwọn apá tí ó nípọn 300 µm mọ́ òrùka ìtìlẹ́yìn tí ó ní ìwọ̀n 7 mm ní ìwọ̀n. Lẹ́yìn tí a bá ti so àwọn apá àsopọ mọ́ òrùka ìtìlẹ́yìn, gé àwọn apá àsopọ tí ó pọ̀ jù kúrò kí a sì gbé àwọn apá àsopọ tí a so mọ́ ara wọn padà sínú ìwẹ̀ omi Tyrode lórí yìnyín (4°C) títí tí a ó fi pèsè àwọn apá tí ó tó fún ẹ̀rọ kan. Àkókò ìṣiṣẹ́ gbogbo fún gbogbo ẹ̀rọ kò gbọdọ̀ ju wákàtí 2 lọ. Lẹ́yìn tí a bá ti so àwọn apá àsopọ mẹ́fà mọ́ àwọn òrùka ìtìlẹ́yìn wọn, a kó ẹ̀rọ CTCM jọ. A ti fi 21 ml tí a ti fi oksiji ṣe yàrá ìṣẹ̀dá CTCM kún un tẹ́lẹ̀. Gbé àwọn apá àsopọ náà sí yàrá ìṣẹ̀dá kí o sì fi ìṣọ́ra yọ àwọn èéfín afẹ́fẹ́ kúrò pẹ̀lú pipette. Lẹ́yìn náà, a óò darí apá àsopọ náà sínú ihò náà, a óò sì tẹ̀ ẹ́ mọ́lẹ̀ díẹ̀díẹ̀. Níkẹyìn, gbé ìbòrí elekitirodu náà sí orí ẹ̀rọ náà kí o sì gbé ẹ̀rọ náà lọ sí incubator. Lẹ́yìn náà, so CTCM pọ̀ mọ́ tube afẹ́fẹ́ àti ẹ̀rọ C-PACE-EM. Amúṣiṣẹ́ pneumatic náà yóò ṣí, fáìlì afẹ́fẹ́ yóò sì ṣí CTCM. A ṣètò ẹ̀rọ C-PACE-EM láti fi 4 V hàn ní 1.2 Hz nígbà tí a bá ń lo bíphasic fún 2 ms. A yí àárín náà padà lẹ́ẹ̀mejì lójúmọ́, a sì yí àwọn elekitirodu náà padà lẹ́ẹ̀kan lójúmọ́ láti yẹra fún ìkójọpọ̀ graphite lórí àwọn elekitirodu náà. Tí ó bá pọndandan, a lè yọ àwọn apá àsopọ kúrò nínú àwọn kànga ìbílẹ̀ wọn láti lé àwọn èéfín afẹ́fẹ́ tí ó lè ti ṣubú lábẹ́ wọn jáde. Fún àwọn ipò ìtọ́jú MT, a óò fi T3/Dex kún un ní tuntun pẹ̀lú ìyípadà àárín kọ̀ọ̀kan pẹ̀lú 100 nM T3 àti 1 μM Dex. A gbin àwọn ẹ̀rọ CTCM náà sínú incubator ní 37°C àti 5% CO2.
Láti gba àwọn ipa ọ̀nà tí ó nà sí àwọn ẹ̀yà ọkàn, a ṣe ètò kámẹ́rà pàtàkì kan. A lo kámẹ́rà SLR kan (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) pẹ̀lú lẹ́nsì macro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA). A ṣe ìwòran ní iwọ̀n otutu yàrá lẹ́yìn tí a fi àwọn ẹ̀yà ara tuntun rọ́pò wọn. A gbé kámẹ́rà náà sí igun 51°, a sì gba fídíò náà sílẹ̀ ní 30 fídíò fún ìṣẹ́jú-àáyá kan. Àkọ́kọ́, a lo sọ́fítíwètì orísun ṣíṣí (MUSCLEMOTION43) pẹ̀lú Image-J láti ṣe ìwọ̀n ìṣípo àwọn ẹ̀yà ọkàn. A ṣẹ̀dá ìbòjú náà nípa lílo MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) láti ṣàlàyé àwọn agbègbè tí ó wù wá fún lílu àwọn ẹ̀yà ọkàn láti yẹra fún ariwo. A fi àwọn ìbòjú tí a fi ọwọ́ pín sí gbogbo àwọn àwòrán nínú ìtẹ̀léra fídíò lẹ́yìn náà a gbé e sí MUSCLEMOTION plug-in. Ìṣípo Muscle lo agbára àpapọ̀ àwọn píksẹ́lì nínú fídíò kọ̀ọ̀kan láti ṣe ìwọ̀n ìṣípo rẹ̀ ní ìbámu pẹ̀lú fídíò ìtọ́kasí. A gba àwọn dátà sílẹ̀, a yọ wọ́n kúrò, a sì lò wọ́n láti ṣe ìwọ̀n àkókò ìyípo àti láti ṣe àyẹ̀wò ìfà àsopọ nígbà ìyípo ọkàn. A fi àlẹ̀mọ́ oní-ẹ̀rọ-ìpele-odò-ìpele àkọ́kọ́ ṣe àtúnṣe fídíò tí a gbà sílẹ̀ lẹ́yìn iṣẹ́ náà. Láti ṣe ìwọ̀n ìfà àsopọ (òkè-sí-òkè), a ṣe àyẹ̀wò òkè-sí-òkè láti fi ìyàtọ̀ láàrín àwọn òkè àti àwọn ibi tí ó wà nínú àmì tí a gbà sílẹ̀. Ní àfikún, a ṣe ìyípadà nípa lílo polynomial ìpele 6 láti mú ìyípadà àmì kúrò. A ṣe àgbékalẹ̀ kódì ètò ní MATLAB láti pinnu ìṣípo àsopọ àgbáyé, àkókò ìyípo, àkókò ìsinmi, àti àkókò ìfàmọ́ra (Àfikún Kódì Ètò 44).
Fún ìṣàyẹ̀wò ìpele, nípa lílo àwọn fídíò kan náà tí a ṣẹ̀dá fún ìṣàyẹ̀wò ìfàsẹ́yìn ẹ̀rọ, a kọ́kọ́ tọpasẹ̀ àwọn àwòrán méjì tí ó dúró fún àwọn òkè ìṣípo (àwọn ojú ìṣípo gíga jùlọ (òkè) àti àwọn ojú ìsàlẹ̀ (ìsàlẹ̀) ti ìṣípo) gẹ́gẹ́ bí sọ́fítíwè MUSCLEMOTION. Lẹ́yìn náà, a pín àwọn agbègbè àsopọ sí méjì, a sì lo irú àlùgọ́ọ̀mù ìbòjú sí àsopọ tí a pín sí méjì (Àfikún Àwòrán 2a). Lẹ́yìn náà, a pín àsopọ tí a pín sí mẹ́wàá ní ìsàlẹ̀, a sì ṣírò ìdààmú lórí ojú kọ̀ọ̀kan nípa lílo ìgbékalẹ̀ wọ̀nyí: Ìyàra = (Sup-Sdown)/Sdown, níbi tí Sup àti Sdown jẹ́ àwọn ìjìnnà ti ìrísí láti òjìji òkè àti ìsàlẹ̀ ti aṣọ, ní ìtẹ̀léra (Àfikún Àwòrán .2b).
A fi 4% paraformaldehyde ṣe àtúnṣe àwọn ẹ̀yà ọkàn fún wákàtí 48. A fi omi gbẹ àwọn àsopọ̀ ara tí a ti dì mọ́ ara wọn nínú 10% àti 20% sucrose fún wákàtí kan, lẹ́yìn náà a fi 30% sucrose sínú alẹ́. Lẹ́yìn náà, a fi àwọn ẹ̀yà ara náà sínú àsopọ̀ ìgbóná tí ó dára jùlọ (OCT compound) a sì fi díẹ̀díẹ̀ dì wọ́n nínú ìwẹ̀ yìnyín gbígbẹ tí a fi isopentane/gbígbẹ ṣe. Tọ́jú àwọn búlọ́ọ̀kù tí a fi OCT ṣe ní -80 °C títí tí a ó fi yà wọ́n sọ́tọ̀. A pèsè àwọn slides gẹ́gẹ́ bí àwọn ẹ̀yà tí ó nípọn tó 8 μm.
Láti yọ OCT kúrò nínú àwọn ẹ̀yà ọkàn, gbóná àwọn slips náà lórí ìgbóná ní 95 °C fún ìṣẹ́jú 5. Fi 1 ml PBS kún slip kọ̀ọ̀kan kí o sì fi sínú fún ìṣẹ́jú 30 ní ìwọ̀n otútù yàrá, lẹ́yìn náà wọ inú àwọn ẹ̀yà náà nípa ṣíṣe 0.1% Triton-X nínú PBS fún ìṣẹ́jú 15 ní ìwọ̀n otútù yàrá. Láti dènà àwọn èròjà tí kò ṣe pàtó láti so mọ́ àyẹ̀wò náà, fi 1 ml ti omi BSA 3% kún àwọn slips kí o sì fi sínú fún wákàtí kan ní ìwọ̀n otútù yàrá. Lẹ́yìn náà, a yọ BSA kúrò, a sì fi PBS fọ àwọn slips náà. Fi pẹ́ńsù sàmì sí àyẹ̀wò kọ̀ọ̀kan pẹ̀lú pẹ́ńsù. A fi àwọn èròjà ara tí a kọ́kọ́ kọ̀ (tí a ti pò mọ́ 1:200 nínú 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) àti troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) kún un fún ìṣẹ́jú 90, lẹ́yìn náà ni a fi àwọn èròjà ara tí a pò mọ́ 1:200 nínú 1% BSA) sí àwo Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), sí ehoro Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) fún ìṣẹ́jú 90 afikún. A fi PBS fọ̀ ọ́ ní ìgbà mẹ́ta láti fi ìyàtọ̀ sí àwọ̀ tí a fẹ́ fi pamọ́ láti ẹ̀yìn, a lo èròjà ara tí a kọ̀ láti inú àwọ̀ ...
A lo WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) ní 5 μg/ml nínú PBS fún àwọ̀ WGA, a sì fi sí àwọn ibi tí a ti tọ́jú fún ìṣẹ́jú 30 ní iwọ̀n otútù yàrá. Lẹ́yìn náà, a fi PBS fọ àwọn àwọ̀ náà, a sì fi Sudan black kún àwọ̀ kọ̀ọ̀kan, a sì fi sínú rẹ̀ fún ìṣẹ́jú 30. Lẹ́yìn náà, a fi PBS fọ àwọn àwọ̀ náà, a sì fi vectasheld inputding medium kún un. A fi àwọn àwọ̀ náà hàn lórí maikirosikopu Keyence ní ìwọ̀n ìbúgbà 40x.
A yọ OCT kúrò nínú àwọn àyẹ̀wò náà gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé rẹ̀ lókè. Lẹ́yìn tí a bá ti yọ OCT kúrò, tẹ àwọn slips náà sínú omi Bouin ní alẹ́. Lẹ́yìn náà, a fi omi ìfọ́ wẹ̀ àwọn slips náà fún wákàtí kan, lẹ́yìn náà a fi sínú omi ìfọ́ wẹ̀ Bibrich aloe acid fuchsin fún ìṣẹ́jú mẹ́wàá. Lẹ́yìn náà, a fi omi ìfọ́ wẹ̀ àwọn slips náà, a sì fi sínú omi ìfọ́ 5% phosphomolybdenum/5% phosphotungstic acid fún ìṣẹ́jú mẹ́wàá. Láìfọ wẹ̀, a gbé àwọn slips náà taara sínú omi ìfọ́ aniline blue fún ìṣẹ́jú 15. Lẹ́yìn náà, a fi omi ìfọ́ wẹ̀ àwọn slips náà, a sì fi sínú omi ìfọ́ 1% acetic acid fún ìṣẹ́jú méjì. A gbẹ àwọn slips náà nínú 200 N ethanol, a sì gbé wọn lọ sí xylene. A fi ohun èlò ìfọ́ wẹ̀ àwọn slips tí ó ní àbàwọ́n hàn nípa lílo ohun èlò ìfọ́ wẹ̀ Keyence pẹ̀lú ohun èlò ìfọ́ 10x. A ṣe ìwọ̀n ìpíndọ́gba agbègbè Fibrosis nípa lílo software Keyence Analyzer.
Àyẹ̀wò Ìgbésẹ̀ Ẹlẹ́ẹ̀jì CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), nọ́mbà katalogi V13154, gẹ́gẹ́ bí ìlànà olùpèsè pẹ̀lú àwọn àtúnṣe díẹ̀. Ní pàtàkì, a lo ẹ̀rọ ìṣẹ́ abẹ pẹ̀lú ìwọ̀n 6 mm láti rí i dájú pé ìwọ̀n àsọ ara kan náà wà ní àkókò ìṣàyẹ̀wò MTT. A fi àwọn àsọ ara sí ara wọn lẹ́nìkọ̀ọ̀kan sínú àwọn ihò àwo kan tí ó ní àsọ MTT gẹ́gẹ́ bí ìlànà olùpèsè. A fi àwọn apá náà sí i ní 37° C. fún wákàtí mẹ́ta, àsọ ara alààyè sì ń mú àsọ MTT náà ṣiṣẹ́ láti ṣẹ̀dá àsọ formazan aláwọ̀ elése àlùkò. Rọ́pò omi MTT pẹ̀lú 1 ml DMSO kí o sì fi sínú igbóná ní 37°C fún ìṣẹ́jú 15 láti yọ formazan aláwọ̀ elése àlùkò kúrò nínú àwọn apá ọkàn. A fi àwọn àpẹẹrẹ pò 1:10 nínú DMSO nínú àwọn àwo ìsàlẹ̀ tí ó mọ́ tónítóní 96 àti agbára àwọ̀ elése àlùkò tí a wọn ní 570 nm nípa lílo ohun tí a ń ka Cytation plate reader (BioTek). A ṣe àtúnṣe àwọn kíkà sí ìwọ̀n gbogbo apá ọkàn.
A fi ohun èlò tí ó ní 1 μCi/ml [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) rọ́pò ohun èlò tí ó ní 1 μCi/ml [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) fún àyẹ̀wò lílo glucose gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé rẹ̀ tẹ́lẹ̀. Lẹ́yìn wákàtí mẹ́rin tí a ti fi sínú rẹ̀, fi 100 µl ti alabọde kún inú ohun èlò microcentrifuge tí ó ṣí sílẹ̀ tí ó ní 100 µl ti 0.2 N HCl. Lẹ́yìn náà, a gbé ohun èlò náà sínú ohun èlò scintillation tí ó ní 500 μl ti dH2O láti gbẹ [3H]2O fún wákàtí 72 ní 37°C. Lẹ́yìn náà, yọ ohun èlò microcentrifuge kúrò nínú ohun èlò scintillation kí o sì fi 10 milimita ti omi scintillation kún un. A ṣe iye scintillation nípa lílo ohun èlò Tri-Carb 2900TR liquid scintillation analyzer (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). Lẹ́yìn náà, a ṣírò lílo glucose nípa lílo [5-3H]-ìṣiṣẹ́ pàtó glucose, ìwọ́ntúnwọ̀nsì àti ìpìlẹ̀ tí kò pé, ìyọkúrò [5-3H]-sí glucose tí a kò fi àmì sí, àti ìlò scintillation. A ṣe àtúnṣe àwọn dátà náà sí ìwọ̀n àwọn apá ọkàn.
Lẹ́yìn tí a ti ṣe àdàpọ̀ àsopọ ara ní Trizol, a ya RNA kúrò nínú àwọn apá ọkàn nípa lílo Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 gẹ́gẹ́ bí ìlànà olùpèsè. A ṣe ìpèsè ìkàwé RNAsec, ìtẹ̀léra àti ìṣàyẹ̀wò dátà gẹ́gẹ́ bí a ṣe tẹ̀lé:
A lo 1 μg ti RNA fun ayẹwo kọọkan gẹgẹbi ohun elo ibẹrẹ fun igbaradi ile-ikawe RNA. A ṣe agbekalẹ awọn ile-ikawe sequencing nipa lilo NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit fun Illumina (NEB, USA) ni ibamu si awọn iṣeduro olupese, ati pe a ṣafikun awọn koodu atọka si awọn ilana abuda fun ayẹwo kọọkan. Ni kukuru, a wẹ mRNA kuro ninu RNA lapapọ nipa lilo awọn ilẹkẹ oofa ti a so mọ pẹlu awọn oligonucleotides poly-T. A ṣe pipinka nipa lilo awọn cations divalent ni iwọn otutu giga ni NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). A ṣe iṣelọpọ cDNA okun akọkọ nipa lilo awọn primers hexamer laileto ati M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-). Lẹhinna a ṣe iṣelọpọ cDNA okun keji nipa lilo DNA polymerase I ati RNase H. Awọn overhangs ti o ku ni a yipada si awọn opin blunt nipasẹ iṣẹ exonuclease/polymerase. Lẹhin adenylation ti opin 3′ ti apakan DNA, Adapter NEBNext pẹlu eto iyipo hairpin ni a so mọ ọ lati mura silẹ fun idapọmọra. Fún yíyan àwọn ègé cDNA tí ó ní gígùn tí a fẹ́, 150-200 bp. A fọ àwọn ègé ìkàwé nípa lílo ètò AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA). Lẹ́yìn náà, a lo 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) pẹ̀lú cDNA tí a yàn tí a so pọ̀ mọ́ adapter fún ìṣẹ́jú 15 ní 37°C àti lẹ́yìn náà fún ìṣẹ́jú 5 ní 95°C kí PCR tó dé. Lẹ́yìn náà, a lo Phusion High-Fidelity DNA polymerase, àwọn àkọ́lé PCR gbogbogbò, àti àwọn àkọ́lé Index (X). Níkẹyìn, a sọ àwọn ọjà PCR di mímọ́ (ẹ̀rọ AMPure XP) a sì ṣe àyẹ̀wò dídára ìkàwé lórí ètò Agilent Bioanalyzer 2100. Lẹ́yìn náà, a ṣe àkójọ ìkàwé cDNA nípa lílo sequencer Novaseq. A yí àwọn fáìlì àwòrán tí kò dára láti Illumina padà sí àwọn fáìlì tí kò dára nípa lílo CASAVA Base Call. A tọ́jú àwọn dátà tí kò dára sínú àwọn fáìlì ìrísí FASTQ(fq) tí ó ní àwọn sequences read àti àwọn ànímọ́ ìpìlẹ̀ tí ó báramu. Yan HISAT2 láti bá àwọn ìtẹ̀léra tí a ti yọ́ mọ́ ìtọ́kasí Sscrofa11.1 mu. Ní gbogbogbòò, HISAT2 ń ṣe àtìlẹ́yìn fún àwọn ìrísí ara tí ó bá ìtóbi mu, títí kan àwọn ìpìlẹ̀ ara tí ó tóbi ju bílíọ̀nù mẹ́rin lọ, àti pé a ti ṣètò àwọn iye àìyípadà fún ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn pàrámítà. A lè ṣe àtúnṣe àwọn ìtẹ̀léra láti inú dátà RNA Seq dáadáa nípa lílo HISAT2, ètò tí ó yára jùlọ tí ó wà lọ́wọ́lọ́wọ́, pẹ̀lú ìṣedéédé kan náà tàbí tí ó dára jù bẹ́ẹ̀ lọ ju ọ̀nà mìíràn lọ.
Ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn àkọsílẹ̀ àfọwọ́kọ fi ìpele ìfarahàn jínì hàn ní tààrà. A ń ṣe àyẹ̀wò ìpele ìfarahàn jínì nípa ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn àkọsílẹ̀ (ìṣirò ìtẹ̀léra) tí ó níí ṣe pẹ̀lú jínì tàbí àwọn exon. Iye àwọn ìwé kíkà náà ní ìbámu pẹ̀lú àwọn ìpele ìfarahàn jínì, gígùn jínì, àti jíjìn ìtẹ̀léra. A ṣírò FPKM (àwọn ìpín fún ẹgbẹ̀rún àwọn ìpele ìpìlẹ̀ ti ìwé kíkà tí a tẹ̀léra fún mílíọ̀nù àwọn ìpìlẹ̀ méjì) a sì pinnu àwọn ìwọ̀n P ti ìfọ̀rọ̀wérọ̀ ìyàtọ̀ nípa lílo àpò DESeq2. Lẹ́yìn náà, a ṣírò ìwọ̀n ìwádìí èké (FDR) fún iye P kọ̀ọ̀kan nípa lílo ọ̀nà Benjamini-Hochberg9 tí ó dá lórí iṣẹ́-ṣíṣe R tí a kọ́ sínú rẹ̀ “p.adjust”.
A yí RNA tí a yà sọ́tọ̀ kúrò nínú àwọn ẹ̀yà ọkàn padà sí cDNA ní ìṣọ̀kan 200 ng/μl nípa lílo àdàpọ̀ SuperScript IV Vilo Master láti Thermo (Thermo, cat. no. 11756050). A ṣe RT-PCR oníṣirò nípa lílo àwo ìyípadà àgbékalẹ̀ Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well transparent (Thermo, cat. no. 4483319) àti microamp optical adhesive (Thermo, cat. no. 4311971). Àdàpọ̀ ìyípadà náà ní àdàpọ̀ Taqman Fast Advanced Master 5 µl (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer àti 3.5 µl H2O tí a dapọ̀ fún kànga kọ̀ọ̀kan. A ṣiṣẹ́ àwọn ìyípo qPCR déédéé a sì wọn àwọn ìwọ̀n CT nípa lílo ohun èlò PCR Applied Biosystems Quantstudio 5 real-time (384-well module; product # A28135). A ra àwọn àkọ́lé Taqman láti ọ̀dọ̀ Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Àwọn ìwọ̀n CT ti gbogbo àwọn àpẹẹrẹ ni a ṣe déédé sí ìran ìtọ́jú ilé GAPDH.
A ṣe àyẹ̀wò ìtújáde NT-ProBNP nípa lílo ohun èlò NT-ProBNP (ẹlẹ́dẹ̀) (Nọ́mbà Cat. MBS2086979, MyBioSource) gẹ́gẹ́ bí ìlànà olùpèsè. Ní kúkúrú, a fi 250 µl ti àpẹẹrẹ kọ̀ọ̀kan àti ìwọ̀n kọ̀ọ̀kan kún inú kànga kọ̀ọ̀kan. Lẹ́sẹ̀kẹsẹ̀ lẹ́yìn tí a bá fi àpẹẹrẹ náà kún un, a fi 50 µl ti Assay Reagent A kún kànga kọ̀ọ̀kan. A fi pẹ̀lẹ́pẹ̀lẹ́ gbọn àwo náà kí a sì fi sealant dí i. Lẹ́yìn náà, a fi àwọn tábìlẹ́ẹ̀tì náà sínú iná ní 37°C fún wákàtí kan. Lẹ́yìn náà, a fi omi náà sínú omi náà kí a sì fi omi ìfọṣọ 350 µl wẹ̀ àwọn kànga náà ní ìgbà mẹ́rin, a sì fi omi ìfọṣọ 1X dì í fún ìṣẹ́jú 1-2 ní ìgbà kọ̀ọ̀kan. Lẹ́yìn náà, a fi 100 µl ti Assay Reagent B kún inú kànga kọ̀ọ̀kan kí a sì fi sealant dí i. A fi pẹ̀lẹ́pẹ̀lẹ́ mì tábìlẹ́ẹ̀tì náà, a sì fi sínú iná ní 37°C fún ìṣẹ́jú 30. Fi omi ìfọṣọ omi náà sínú omi kí o sì fọ àwọn kànga náà ní ìgbà márùn-ún pẹ̀lú omi ìfọṣọ omi 350 µl kan. Fi omi ìfọṣọ omi 90 µl kún inú kànga kọ̀ọ̀kan kí o sì di àwo náà mọ́. Fi àwo náà sínú iná ní 37°C fún ìṣẹ́jú 10-20. Fi omi ìfọṣọ omi 50 µl kún inú kànga kọ̀ọ̀kan. A wọ́n àwo náà lẹ́sẹ̀kẹsẹ̀ nípa lílo ohun tí a fi ń ka àwo Cytation (BioTek) ní 450 nm.
A ṣe àgbéyẹ̀wò agbára láti yan àwọn ìwọ̀n ẹgbẹ́ tí yóò fúnni ní agbára tí ó ju 80% lọ láti ṣàwárí ìyípadà pípé 10% nínú paramita pẹ̀lú ìwọ̀n àṣìṣe 5% Iru I. A ṣe àyẹ̀wò agbára láti yan àwọn ìwọ̀n ẹgbẹ́ tí yóò fúnni ní agbára tí ó ju 80% lọ láti ṣàwárí ìyípadà pípé 10% nínú pàrámítà pẹ̀lú ìwọ̀n àṣìṣe 5% Irú I. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат > 80% мощности изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. A ṣe àgbéyẹ̀wò agbára láti yan àwọn ìwọ̀n ẹgbẹ́ tí yóò fúnni ní agbára tí ó ju 80% lọ láti ṣàwárí ìyípadà paramita pípé 10% pẹ̀lú ìwọ̀n àṣìṣe Iru I 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I变化和5％I型给。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I变化和5％I型给。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнару абсолютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. A ṣe àgbéyẹ̀wò agbára láti yan ìwọ̀n ẹgbẹ́ kan tí yóò fúnni ní agbára tí ó ju 80% lọ láti ṣàwárí ìyípadà paramita pípé 10% àti ìwọ̀n àṣìṣe irú I 5%.A yan awọn apakan ti ara laileto ṣaaju idanwo naa. Gbogbo awọn itupalẹ jẹ afọju ipo ati pe awọn ayẹwo ni a yipada nikan lẹhin ti a ti ṣe itupalẹ gbogbo data. A lo sọfitiwia GraphPad Prism (San Diego, CA) lati ṣe gbogbo awọn itupalẹ iṣiro. Fún gbogbo statistiki, a kà àwọn iye p sí pàtàkì ní àwọn iye <0.05. Fún gbogbo statistiki, a kà àwọn iye-p sí pàtàkì ní àwọn iye <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Fún gbogbo statistiki, a kà àwọn iye-p sí pàtàkì ní àwọn iye <0.05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Fún gbogbo statistiki, a kà àwọn iye-p sí pàtàkì ní àwọn iye <0.05.A ṣe ìdánwò t-Akẹ́kọ̀ọ́ oní ìrù méjì lórí dátà náà pẹ̀lú ìfiwéra méjì péré. ANOVA ọ̀nà kan tàbí ọ̀nà méjì ni a lò láti pinnu pàtàkì láàrín ọ̀pọ̀ ẹgbẹ́. Nígbà tí a bá ń ṣe àwọn ìdánwò lẹ́yìn hoc, a lo àtúnṣe Tukey láti ṣe àkíyèsí fún ọ̀pọ̀ ìfiwéra. Dátà RNAsec ní àwọn àkíyèsí pàtàkì nípa ìṣirò nígbà tí a bá ń ṣírò FDR àti p.adjust gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé rẹ̀ nínú apá Àwọn Ọ̀nà.
Fún ìwífún síi lórí ìṣètò ìkẹ́kọ̀ọ́, wo àkótán Ìròyìn Ìwádìí Ìṣẹ̀dá tí a so mọ́ àpilẹ̀kọ yìí.