Hvala, ker ste obiskali Nature.com. Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS. Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali onemogočite način združljivosti v Internet Explorerju). Medtem bomo za zagotovitev nadaljnje podpore spletno mesto prikazali brez slogov in JavaScripta.
Potreben je zanesljiv in vitro sistem, ki lahko natančno reproducira fiziološko okolje srca za testiranje zdravil. Omejena razpoložljivost sistemov za gojenje človeškega srčnega tkiva je privedla do netočnih interpretacij učinkov zdravil na srce. Tukaj smo razvili model gojenja srčnega tkiva (CTCM), ki elektromehansko stimulira srčne rezine in se fiziološko razteza med sistolično in diastolično fazo srčnega cikla. Po 12 dneh gojenja je ta pristop delno izboljšal sposobnost preživetja srčnih rezin, vendar ni v celoti ohranil njihove strukturne integritete. Zato smo po presejanju majhnih molekul ugotovili, da je dodatek 100 nM trijodotironina (T3) in 1 μM deksametazona (Dex) v naš medij ohranil mikrostrukturo rezin 12 dni. V kombinaciji z obdelavo s T3/Dex je sistem CTCM 12 dni ohranjal transkripcijske profile, sposobnost preživetja, presnovno aktivnost in strukturno integriteto na isti ravni kot sveže srčno tkivo. Poleg tega prekomerno raztezanje srčnega tkiva v kulturi povzroča hipertrofično srčno signalizacijo, kar dokazuje sposobnost CTCM, da posnema hipertrofična stanja, ki jih povzroča raztezanje srca. Skratka, CTCM lahko modelira fiziologijo in patofiziologijo srca v kulturi skozi dolga časovna obdobja, kar omogoča zanesljivo presejanje zdravil.
Pred kliničnimi raziskavami so potrebni zanesljivi in ​​vitro sistemi, ki lahko natančno reproducirajo fiziološko okolje človeškega srca. Takšni sistemi bi morali posnemati spremenjeno mehansko raztezanje, srčni utrip in elektrofiziološke lastnosti. Živalski modeli se pogosto uporabljajo kot presejalna platforma za srčno fiziologijo z omejeno zanesljivostjo pri odražanju učinkov zdravil v človeškem srcu1,2. Idealni eksperimentalni model srčne tkivne kulture (CTCM) je navsezadnje model, ki je zelo občutljiv in specifičen za različne terapevtske in farmakološke posege, ki natančno reproducira fiziologijo in patofiziologijo človeškega srca3. Odsotnost takega sistema omejuje odkrivanje novih zdravljenj srčnega popuščanja4,5 in je privedla do kardiotoksičnosti zdravil kot glavnega razloga za izstop s trga6.
V zadnjem desetletju je bilo osem zdravil, ki niso povezana s srčno-žilnim sistemom, umaknjenih iz klinične uporabe, ker povzročajo podaljšanje intervala QT, kar vodi v ventrikularne aritmije in nenadno smrt7. Zato je vse večja potreba po zanesljivih predkliničnih presejalnih strategijah za oceno kardiovaskularne učinkovitosti in toksičnosti. Nedavna uporaba kardiomiocitov, pridobljenih iz človeških pluripotentnih matičnih celic (hiPS-CM), pri presejanju zdravil in testiranju toksičnosti ponuja delno rešitev za ta problem. Vendar pa sta nezrela narava hiPS-CM in pomanjkanje večcelične kompleksnosti srčnega tkiva glavni omejitvi te metode. Nedavne študije so pokazale, da je to omejitev mogoče delno premagati z uporabo zgodnjih hiPS-CM za tvorbo hidrogelov srčnega tkiva kmalu po začetku spontanih kontrakcij in postopnim povečevanjem električne stimulacije skozi čas. Vendar pa ta mikrotkiva hiPS-CM nimajo zrelih elektrofizioloških in kontraktilnih lastnosti odraslega miokarda. Poleg tega ima človeško srčno tkivo bolj kompleksno strukturo, ki jo sestavlja heterogena mešanica različnih vrst celic, vključno z endotelijskimi celicami, nevroni in stromalnimi fibroblasti, ki so med seboj povezani s specifičnimi sklopi zunajceličnih matriksnih proteinov. Ta heterogenost populacij nekardiomiocitov11,12,13 v srcu odraslih sesalcev je glavna ovira za modeliranje srčnega tkiva z uporabo posameznih tipov celic. Te glavne omejitve poudarjajo pomen razvoja metod za gojenje intaktnega miokardnega tkiva v fizioloških in patoloških pogojih.
Gojeni tanki (300 µm) rezini človeškega srca so se izkazali za obetaven model intaktnega človeškega miokarda. Ta metoda omogoča dostop do celotnega 3D večceličnega sistema, podobnega tkivu človeškega srca. Vendar pa je bila uporaba gojenih rezin srca do leta 2019 omejena zaradi kratkega (24 ur) preživetja kulture. To je posledica številnih dejavnikov, vključno s pomanjkanjem fizikalno-mehanskega raztezanja, vmesnikom zrak-tekočina in uporabo preprostih medijev, ki ne podpirajo potreb srčnega tkiva. Leta 2019 je več raziskovalnih skupin pokazalo, da lahko vključitev mehanskih dejavnikov v sisteme za gojenje srčnega tkiva podaljša življenjsko dobo kulture, izboljša srčno izražanje in posnema srčno patologijo. Dve elegantni študiji 17 in 18 kažeta, da ima enoosna mehanska obremenitev pozitiven učinek na srčni fenotip med kulturo. Vendar te študije niso uporabile dinamične tridimenzionalne fizikalno-mehanske obremenitve srčnega cikla, saj so bili rezini srca obremenjeni bodisi z izometričnimi nateznimi silami 17 bodisi z linearno avksotonično obremenitvijo 18. Te metode raztezanja tkiva so povzročile zaviranje številnih srčnih genov ali prekomerno izražanje genov, povezanih z nenormalnimi odzivi raztezanja. Omeniti velja, da so Pitoulis in sodelavci19 razvili dinamično kopel za gojenje srčnih rezin za rekonstrukcijo srčnega cikla z uporabo povratne zanke pretvornika sile in nateznih pogonov. Čeprav ta sistem omogoča natančnejše modeliranje srčnega cikla in vitro, kompleksnost in nizka prepustnost metode omejujeta uporabo tega sistema. Naš laboratorij je pred kratkim razvil poenostavljen sistem gojenja z uporabo električne stimulacije in optimiziranega medija za ohranjanje viabilnosti rezin prašičjega in človeškega srčnega tkiva do 6 dni20,21.
V tem rokopisu opisujemo model kulture srčnega tkiva (CTCM) z uporabo odsekov prašičjega srca, ki vključuje humoralne signale za rekapitulacijo tridimenzionalne srčne fiziologije in patofiziološke distenzije med srčnim ciklom. Ta CTCM lahko poveča natančnost predkliničnega napovedovanja zdravil na raven, ki še ni bila dosežena, saj zagotavlja stroškovno učinkovit srčni sistem srednje zmogljivosti, ki posnema fiziologijo/patofiziologijo srca sesalcev za predklinično testiranje zdravil.
Hemodinamični mehanski signali igrajo ključno vlogo pri ohranjanju delovanja kardiomiocitov in vitro 22,23,24. V tem rokopisu smo razvili CTCM (slika 1a), ki lahko posnema srčno okolje odraslega z indukcijo tako električne kot mehanske stimulacije pri fizioloških frekvencah (1,2 Hz, 72 utripov na minuto). Da bi se izognili prekomernemu raztezanju tkiva med diastolo, smo uporabili 3D-tiskalniško napravo za povečanje velikosti tkiva za 25 % (slika 1b). Električna stimulacija, ki jo je induciral sistem C-PACE, je bila časovno nastavljena tako, da se je začela 100 ms pred sistolo z uporabo sistema za zajem podatkov, da se je v celoti reproduciral srčni cikel. Sistem za tkivne kulture uporablja programabilni pnevmatski aktuator (LB Engineering, Nemčija) za ciklično širjenje fleksibilne silikonske membrane, kar povzroči širjenje srčnih rezin v zgornji komori. Sistem je bil prek tlačnega pretvornika priključen na zunanji zračni vod, kar je omogočilo natančno nastavitev tlaka (± 1 mmHg) in časa (± 1 ms) (slika 1c).
a Rezino tkiva pritrdite na 7 mm podporni obroč, prikazan z modro barvo, znotraj gojitvene komore naprave. Gojitvena komora je od zračne komore ločena s tanko prožno silikonsko membrano. Med vsako komoro namestite tesnilo, da preprečite puščanje. Pokrov naprave vsebuje grafitne elektrode, ki zagotavljajo električno stimulacijo. b Shematski prikaz velike tkivne naprave, vodilnega obroča in podpornega obroča. Rezine tkiva (rjave) so nameščene na preveliki napravi, vodilni obroč pa je nameščen v utoru na zunanjem robu naprave. S pomočjo vodila previdno namestite podporni obroč, prevlečen s tkivnim akrilnim lepilom, čez rez srčnega tkiva. c Graf, ki prikazuje čas električne stimulacije kot funkcijo tlaka v zračni komori, ki ga nadzoruje programabilni pnevmatski aktuator (PPD). Za sinhronizacijo električne stimulacije s pomočjo tlačnih senzorjev je bila uporabljena naprava za zajem podatkov. Ko tlak v gojitveni komori doseže nastavljeni prag, se impulzni signal pošlje v C-PACE-EM, da sproži električno stimulacijo. d Slika štirih CTCM-jev, nameščenih na polici inkubatorja. Štiri naprave so prek pnevmatskega vezja povezane z enim PPD, tlačni senzorji pa so vstavljeni v hemostatski ventil za spremljanje tlaka v pnevmatskem vezju. Vsaka naprava vsebuje šest tkivnih rezin.
Z enim samim pnevmatskim aktuatorjem smo lahko upravljali 4 naprave CTCM, od katerih je vsaka lahko shranila 6 tkivnih rezin (slika 1d). Pri CTCM se zračni tlak v zračni komori pretvori v sinhroni tlak v tekočinski komori in povzroči fiziološko raztezanje srčnega rezina (slika 2a in dodatni film 1). Ocena raztezanja tkiva pri 80 mm Hg. Art. je pokazala raztezanje tkivnih rezin za 25 % (slika 2b). Dokazano je, da ta odstotek raztezanja ustreza fiziološki dolžini sarkomer 2,2–2,3 µm za normalno kontraktilnost srčnega rezina17,19,25. Gibanje tkiva je bilo ocenjeno z uporabo prilagojenih nastavitev kamere (dodatna slika 1). Amplituda in hitrost gibanja tkiva (slika 2c, d) sta ustrezali raztezanju med srčnim ciklom in času med sistolo in diastolo (slika 2b). Raztezanje in hitrost srčnega tkiva med krčenjem in sproščanjem sta ostala konstantna 12 dni v kulturi (slika 2f). Za oceno vpliva električne stimulacije na kontraktilnost med gojenjem smo razvili metodo za določanje aktivne deformacije z uporabo algoritma senčenja (dodatna slika 2a,b) in smo lahko razlikovali med deformacijami z električno stimulacijo in brez nje. Isti prerez srca (slika 2f). V gibljivem območju reza (R6-9) je bila napetost med električno stimulacijo 20 % višja kot brez električne stimulacije, kar kaže na prispevek električne stimulacije h kontraktilni funkciji.
Reprezentativne sledi meritev tlaka v zračni komori, tlaka v tekočinski komori in gibanja tkiva potrjujejo, da tlak v komori spreminja tlak v tekočinski komori, kar povzroči ustrezno gibanje tkivnega rezina. b Reprezentativne sledi odstotnega raztezanja (modra barva) tkivnih rezin, ki ustrezajo odstotnemu raztezanju (oranžna barva). c Izmerjeno gibanje srčnega rezina je skladno z izmerjeno hitrostjo gibanja. (d) Reprezentativne trajektorije cikličnega gibanja (modra črta) in hitrosti (oranžna pikčasta črta) v rezini srca. e Kvantifikacija časa cikla (n = 19 rezin na skupino, od različnih prašičev), časa krčenja (n = 19 rezin na skupino), časa relaksacije (n = 19 rezin na skupino, od različnih prašičev), gibanja tkiva (n = 25 rezin)/skupino od različnih prašičev, najvišje sistolične hitrosti (n = 24(D0), 25(D12) rezin/skupino od različnih prašičev) in najvišje hitrosti relaksacije (n = 24(D0), 25(D12) rezin/skupino od različnih prašičev). Dvostranski Studentov t-test ni pokazal pomembne razlike v nobenem parametru. f Reprezentativne sledi analize deformacij tkivnih rezin z (rdeča) in brez (modra) električne stimulacije, deset regionalnih področij tkivnih rezin iz istega rezina. Spodnje plošče prikazujejo kvantifikacijo odstotne razlike v deformaciji v tkivnih rezinah z in brez električne stimulacije na desetih območjih iz različnih rezin. (n = 8 rezin/skupina od različnih prašičev, izveden je dvostranski Studentov t-test; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 rezin/skupina od različnih prašičev, izveden je dvostranski Studentov t-test; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 rezov/skupino od različnih svinj, izveden dvostranski t-kriterij Stjudenta; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 odsekov/skupina iz različnih prašičev, dvostranski Studentov t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,05）。 (n = 8 rezov/skupino, od različnih svinj, dvostranski kriterij Stjudenta; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 odsekov/skupina, od različnih prašičev, dvostranski Studentov t-test; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Stolpci napak predstavljajo povprečje ± standardni odklon.
V našem prejšnjem statičnem biomimetičnem sistemu za gojenje srčnih rezin [20, 21] smo z električno stimulacijo in optimizacijo sestave gojišča ohranjali sposobnost preživetja, delovanje in strukturno celovitost srčnih rezin 6 dni. Vendar pa so se te številke po 10 dneh močno zmanjšale. Sklicevali se bomo na rezine, gojene v našem prejšnjem statičnem biomimetičnem sistemu za gojenje 20, 21 kontrolnih pogojih (Ctrl) in uporabili naš predhodno optimiziran medij kot pogoje MC in gojenje pod sočasno mehansko in električno stimulacijo (CTCM), imenovano . Najprej smo ugotovili, da mehanska stimulacija brez električne stimulacije ni zadostovala za ohranjanje sposobnosti preživetja tkiva 6 dni (dodatna slika 3a,b). Zanimivo je, da je z uvedbo fizikalno-mehanske in električne stimulacije z uporabo STCM sposobnost preživetja 12-dnevnih srčnih rezin ostala enaka kot pri svežih srčnih rezinah pod pogoji MS, ne pa tudi pod pogoji Ctrl, kot je pokazala analiza MTT (slika 1). 3a). To kaže, da lahko mehanska stimulacija in simulacija srčnega cikla ohranita sposobnost preživetja tkivnih rezin dvakrat dlje, kot je bilo ugotovljeno v našem prejšnjem statičnem sistemu za gojenje. Vendar pa je ocena strukturne integritete tkivnih rezin z imunskim označevanjem srčnega troponina T in koneksina 43 pokazala, da je bila ekspresija koneksina 43 v tkivih MC na 12. dan bistveno višja kot v kontrolnih skupinah na isti dan. Vendar pa enakomerna ekspresija koneksina 43 in tvorba Z-diska nista bili v celoti ohranjeni (slika 3b). Za kvantifikacijo strukturne integritete tkiva uporabljamo ogrodje umetne inteligence (UI)26, cevovod globokega učenja na osnovi slik, ki temelji na barvanju s troponinom-T in koneksinom43, za samodejno kvantifikacijo strukturne integritete in fluorescence srčnih rezin glede na moč lokalizacije. Ta metoda uporablja konvolucijsko nevronsko mrežo (CNN) in ogrodje globokega učenja za zanesljivo kvantifikacijo strukturne integritete srčnega tkiva na avtomatiziran in nepristranski način, kot je opisano v referenci.26. Tkivo MC je pokazalo izboljšano strukturno podobnost na dan 0 v primerjavi s statičnimi kontrolnimi rezinami. Poleg tega je Massonovo trikromsko barvanje pokazalo bistveno nižji odstotek fibroze v pogojih MS v primerjavi s kontrolnimi pogoji na 12. dan gojenja (slika 3c). Čeprav je CTCM 12. dan povečal sposobnost preživetja rezin srčnega tkiva na raven, podobno kot pri svežem srčnem tkivu, ni bistveno izboljšal strukturne celovitosti srčnih rezin.
Stolpični diagram prikazuje kvantifikacijo MTT viabilnosti svežih srčnih rezin (D0) ali kulture srčnih rezin 12 dni bodisi v statični kulturi (D12 Ctrl) bodisi v CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) rezin/skupina od različnih prašičev, izveden je enosmerni ANOVA test; ####p < 0,0001 v primerjavi z D0 in **p < 0,01 v primerjavi z D12 Ctrl). Stolpični diagram prikazuje kvantifikacijo MTT viabilnosti svežih srčnih rezin (D0) ali kulture srčnih rezin 12 dni bodisi v statični kulturi (D12 Ctrl) bodisi v CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) rezin/skupina od različnih prašičev, izveden je enosmerni ANOVA test; ####p < 0,0001 v primerjavi z D0 in **p < 0,01 v primerjavi z D12 Ctrl).Histogram prikazuje kvantifikacijo viabilnosti svežih srčnih rezin MTT (D0) ali kulture srčnih rezin 12 dni v statični kulturi (kontrola D12) ali CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrola D12).) ), 12 (D12 MC) rezin/skupina od različnih prašičev, izveden je enosmerni ANOVA test;####p < 0,0001 v primerjavi z D0 in **p < 0,01 v primerjavi z D12 Ctrl). ####p < 0,0001 v primerjavi z D0 in **p < 0,01 v primerjavi z D12 (kontrola). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向 ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl相比，**p。)histogram, ki prikazuje kvantifikacijo viabilnosti MTT v svežih srčnih rezinah (D0) ali srčnih rezinah, gojenih 12 dni v statični kulturi (kontrola D12) ali CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrola D12)), 12 (D12 MC) rezin/skupine različnih prašičev, enosmerni ANOVA test;####p < 0,0001 v primerjavi z D0, **p < 0,01 v primerjavi z D12 Ctrl). ####p < 0,0001 v primerjavi z D0, **p < 0,01 v primerjavi z D12 (kontrola).b Troponin-T (zelen), koneksin 43 (rdeč) in DAPI (moder) v sveže izoliranih srčnih rezinah (D0) ali srčnih rezinah, gojenih v statičnih pogojih (Ctrl) ali CTCM pogojih (MC) 12 dni) reprezentativnih imunofluorescenčnih slik (slepa lestvica = 100 µm). Kvantifikacija strukturne integritete srčnega tkiva z umetno inteligenco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezin/skupin, vsaka od različnih prašičev, izveden je enosmerni ANOVA test; ####p < 0,0001 v primerjavi z D0 in ****p < 0,0001 v primerjavi z D12 Ctrl). Kvantifikacija strukturne integritete srčnega tkiva z umetno inteligenco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezin/skupine od različnih prašičev, izveden je enosmerni ANOVA test; ####p < 0,0001 v primerjavi z D0 in ****p < 0,0001 v primerjavi z D12 Ctrl). Količinska ocena strukturne celostnosti srčnega tkiva umetnega intelekta (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezov/skupin od različnih svinj, izveden enofaktorski test ANOVA; ####p < 0,0001 v primerjavi z D0 in ****p < 0,0001 v primerjavi z D12 Ctrl). Kvantifikacija strukturne integritete srčnega tkiva z umetno inteligenco (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) odsekov/skupin različnih prašičev, izveden enosmerni ANOVA test; ####p < 0,0001 v primerjavi z D0 in ****p < 0,0001 v primerjavi z D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezin/skupina vsakega od različnih prašičev, enosmerni test ANOVA;####p < 0,0001 与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezin/skupina vsakega od različnih prašičev, enosmerni test ANOVA;####p < 0,0001与D0 相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Iskusni intelekt za količinsko oceno strukturne celostnosti srčnega tkiva (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) rezov/skupine vsake od različnih svinj, enostranski test ANOVA; ####p <0,0001 v primerjavi z D0 Za izravnavo ****p < 0,0001 v primerjavi z D12 Ctrl). Umetna inteligenca za kvantificiranje strukturne integritete srčnega tkiva (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) odsekov/skupine vsakega od različnih prašičev, enosmerni ANOVA test; ####p<0,0001 v primerjavi z .D0 Za primerjavo ****p < 0,0001 v primerjavi z D12 Ctrl). c Reprezentativne slike (levo) in kvantifikacija (desno) za rezine srca, obarvane z Massonovim trikromskim barvilom (merilo brez debeline = 500 µm) (n = 10 rezin/skupina, vsaka od različnih prašičev, izveden je enosmerni ANOVA test; ####p < 0,0001 v primerjavi z D0 in ***p < 0,001 v primerjavi z D12 Ctrl). c Reprezentativne slike (levo) in kvantifikacija (desno) za rezine srca, obarvane z Massonovim trikromnim barvilom (merilo brez debeline = 500 µm) (n = 10 rezin/skupina od različnih prašičev, izveden je enosmerni ANOVA test; #### p < 0,0001 v primerjavi z D0 in ***p < 0,001 v primerjavi z D12 Ctrl). c Reprezentativne slike (slika) in količinska ocena (popravek) rez srca, okrašenega s trikromatskim krasiteljem Massona (štab brez pokritja = 500 mkm) (n = 10 rezov/skupina od različnih svinj, izveden je dvostranski test ANOVA; #### p < 0,0001 v primerjavi z D0 in ***p < 0,001 v primerjavi z D12 Ctrl). c Reprezentativne slike (levo) in kvantifikacija (desno) srčnih prerezov, obarvanih z Massonovim trikromnim barvilom (nepremazana lestvica = 500 µm) (n = 10 prerezov/skupina od različnih prašičev, izveden enosmerni ANOVA test; #### p < 0,0001 v primerjavi z D0 in ***p < 0,001 v primerjavi z D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 µm）（n = 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl相比）。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Reprezentativne slike (slika) in količinska analiza (popravek) rezov srca, okrašenega s trikromatskim krasiteljem Massona (čista lestvica = 500 mkm) (n = 10 rezov/skupina, vsaka od druge svinje, testirano s pomočjo enofaktorne disperzijske analize ;### #p < 0,0001 v primerjavi z D0, ***p < 0,001 v primerjavi з D12 Ctrl). c Reprezentativne slike (levo) in kvantifikacija (desno) srčnih rezin, obarvanih z Massonovim trikromskim barvilom (slepa vrednost = 500 µm) (n = 10 rezin/skupina, vsaka od drugega prašiča, testirano z enosmerno analizo variance;### # p < 0,0001 v primerjavi z D0, ***p < 0,001 v primerjavi z D12 Ctrl).Stolpci napak predstavljajo povprečje ± standardni odklon.
Postavili smo hipotezo, da bi lahko z dodajanjem majhnih molekul v gojišče izboljšali integriteto kardiomiocitov in zmanjšali razvoj fibroze med gojenjem CTCM. Zato smo zaradi majhnega števila motečih dejavnikov pregledali majhne molekule z uporabo naših statičnih kontrolnih kultur20,21. Za ta pregled so bili izbrani deksametazon (Dex), trijodotironin (T3) in SB431542 (SB). Te majhne molekule so bile predhodno uporabljene v kulturah hiPSC-CM za indukcijo zorenja kardiomiocitov s povečanjem dolžine sarkomerov, T-tubulov in hitrosti prevajanja. Poleg tega je znano, da tako Dex (glukokortikoid) kot SB zavirata vnetje29,30. Zato smo preizkusili, ali bi vključitev ene ali kombinacije teh majhnih molekul izboljšala strukturno integriteto srčnih odsekov. Za začetni pregled je bil odmerek vsake spojine izbran na podlagi koncentracij, ki se običajno uporabljajo v modelih celičnih kultur (1 μM Dex27, 100 nM T327 in 2,5 μM SB31). Po 12 dneh gojenja je kombinacija T3 in dekstrometorfana (Dex) povzročila optimalno strukturno celovitost kardiomiocitov in minimalno preoblikovanje vlaken (dodatni sliki 4 in 5). Poleg tega je uporaba dvojnih ali dvakrat večjih koncentracij T3 in dekstrometorfana povzročila škodljive učinke v primerjavi z normalnimi koncentracijami (dodatna slika 6a,b).
Po začetnem presejanju smo izvedli neposredno primerjavo 4 pogojev gojenja (slika 4a): Ctrl: srčni rezini, gojeni v naši prej opisani statični kulturi z uporabo našega optimiziranega medija; 20.21 TD: T3 in Ctrl s dodanim dekstrozo v sredo; MC: srčni rezini, gojeni v CTCM z uporabo našega prej optimiziranega medija; in MT: CTCM s T3 in dekstrozo, dodanima mediju. Po 12 dneh gojenja je viabilnost tkiv MS in MT ostala enaka kot v svežih tkivih, ocenjenih z MTT testom (slika 4b). Zanimivo je, da dodatek T3 in dekstroze v transvdolbinske kulture (TD) ni povzročil bistvenega izboljšanja viabilnosti v primerjavi s pogoji Ctrl, kar kaže na pomembno vlogo mehanske stimulacije pri ohranjanju viabilnosti srčnih rezin.
Diagram eksperimentalne zasnove, ki prikazuje štiri pogoje gojenja, uporabljene za oceno učinkov mehanske stimulacije in dodajanja T3/Dex na gojišče 12 dni. b Stolpični diagram prikazuje kvantifikacijo viabilnosti 12 dni po gojenju v vseh 4 pogojih gojenja (Ctrl, TD, MC in MT) v primerjavi s svežimi srčnimi rezinami (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD in D12 MT), 12 (D12 MC) rezin/skupine od različnih prašičev, izveden je enosmerni ANOVA test; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 v primerjavi z D0 in **p < 0,01 v primerjavi z D12 Ctrl). b Stolpični diagram prikazuje kvantifikacijo viabilnosti 12 dni po gojenju v vseh 4 pogojih gojenja (Ctrl, TD, MC in MT) v primerjavi s svežimi srčnimi rezinami (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD in D12 MT), 12 (D12 MC) rezin/skupine od različnih prašičev, izveden je enosmerni ANOVA test; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 v primerjavi z D0 in **p < 0,01 v primerjavi z D12 ctrl). b Gistogram prikazuje izmerjeno oceno uspešnosti v 12 dneh po kultiviranju v vseh 4 pogojih kultiviranja (kontrola, TD, MC in MT) v primerjavi s svežimi rezi srca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD in D12 MT), 12 (D12 MC) rezov/skupine od različnih svinj, se izvaja enostranski test ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 v primerjavi z D0 и **p < 0,01 v primerjavi z D12 Ctrl). b Stolpični diagram prikazuje kvantifikacijo viabilnosti 12 dni po gojenju v vseh 4 pogojih gojenja (kontrola, TD, MC in MT) v primerjavi s svežimi srčnimi rezinami (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD in D12 MT), 12 (D12 MC) rezin/skupina od različnih prašičev, enosmerni ANOVA test; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 v primerjavi z D0 in **p < 0,01 v primerjavi z D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0,0001，###p < 0,001 与D0相比，**p < 0,01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Gistogram, ki prikazuje vse 4 pogoje kultiviranja (kontrola, TD, MC in MT) v primerjavi s svežimi rezi srca (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD in D12 MT), od različnih svinj 12 (D12 MC) rezi/skupina, enostranski test ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 v primerjavi z D0, **p <0,01 v primerjavi s kontrolo D12). b Histogram, ki prikazuje vse 4 pogoje gojenja (kontrolni, TD, MC in MT) v primerjavi s svežimi srčnimi rezinami (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD in D12 MT), od različnih prašičev 12 (D12 MC) rezin/skupina, enosmerni ANOVA test; ####p<0,0001, ###p<0,001 v primerjavi z D0, **p<0,01 v primerjavi s kontrolno skupino D12). c Stolpični diagram prikazuje kvantifikacijo pretoka glukoze 12 dni po gojenju v vseh 4 pogojih gojenja (Ctrl, TD, MC in MT) v primerjavi s svežimi srčnimi rezinami (D0) (n = 6 rezin/skupina od različnih prašičev, izveden je enosmerni ANOVA test; ###p < 0,001 v primerjavi z D0 in ***p < 0,001 v primerjavi z D12 Ctrl). c Stolpični diagram prikazuje kvantifikacijo pretoka glukoze 12 dni po gojenju v vseh 4 pogojih gojenja (Ctrl, TD, MC in MT) v primerjavi s svežimi srčnimi rezinami (D0) (n = 6 rezin/skupina od različnih prašičev, izveden je enosmerni ANOVA test; ###p < 0,001 v primerjavi z D0 in ***p < 0,001 v primerjavi z D12 Ctrl). c Gistogram prikazuje izmerjeno oceno toka glukoze v 12 dneh po kultiviranju v vseh 4 pogojih kultiviranja (kontrola, TD, MC in MT) v primerjavi s svežimi rezi srca (D0) (n = 6 rezov/skupino od različnih svinj, enostranski Izvaja se test ANOVA; ###p < 0,001 v primerjavi z D0 in ***p < 0,001 v primerjavi з D12 Ctrl). c Histogram prikazuje kvantifikacijo pretoka glukoze 12 dni po gojenju v vseh 4 pogojih gojenja (kontrola, TD, MC in MT) v primerjavi s svežimi srčnimi rezinami (D0) (n = 6 rezin/skupina različnih prašičev, izveden enosmerni ANOVA test; ###p < 0,001 v primerjavi z D0 in ***p < 0,001 v primerjavi z D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 ，培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 猪猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Gistogram, ki prikazuje količinsko oceno toka glukoze v 12 dneh po kultiviranju za vse 4 pogoje kultiviranja (kontrola, TD, MC in MT) v primerjavi s svežimi rezi srca (D0) (n = 6 rezov/skupina, od različnih svinj, ločeno Izveden je bil test ANOVA; ###p < 0,001 v primerjavi z D0, ***p < 0,001 v primerjavi z D12 (kontrola). c Histogram, ki prikazuje kvantifikacijo pretoka glukoze 12 dni po gojenju za vse 4 pogoje gojenja (kontrola, TD, MC in MT) v primerjavi s svežimi srčnimi rezinami (D0) (n = 6 rezin/skupina, od različnih prašičev, enostransko). Kjer so bili izvedeni ANOVA testi, ###p < 0,001 v primerjavi z D0, ***p < 0,001 v primerjavi z D12 (kontrola).d Diagrami analize sevov svežih (modro), 12. dan MC (zeleno) in 12. dan MT (rdeče) tkiv na desetih regionalnih točkah tkivnih rezov (n = 4 rezine/skupino, enosmerni ANOVA test; med skupinami ni bilo pomembne razlike). e Vulkanski diagram, ki prikazuje različno izražene gene v svežih srčnih rezinah (D0) v ​​primerjavi s srčnimi rezinami, gojenimi v statičnih pogojih (Ctrl) ali v MT pogojih (MT) 10–12 dni. f Toplotni zemljevid sarkomernih genov za srčne rezine, gojene v vsakem od pogojev gojenja. Stolpci napak predstavljajo povprečje ± standardni odklon.
Presnovna odvisnost od prehoda iz oksidacije maščobnih kislin v glikolizo je značilnost dediferenciacije kardiomiocitov. Nezreli kardiomiociti primarno uporabljajo glukozo za proizvodnjo ATP in imajo hipoplastične mitohondrije z malo kristami5,32. Analize izkoriščanja glukoze so pokazale, da je bila v pogojih MC in MT izkoriščanje glukoze podobna kot v tkivih 0. dan (slika 4c). Vendar pa so vzorci Ctrl pokazali znatno povečanje izkoriščanja glukoze v primerjavi s svežim tkivom. To kaže, da kombinacija CTCM in T3/Dex izboljša viabilnost tkiva in ohranja presnovni fenotip 12-dnevno gojenih srčnih rezin. Poleg tega je analiza seva pokazala, da so ravni seva 12 dni v pogojih MT in MS ostale enake kot v svežem srčnem tkivu (slika 4d).
Za analizo celotnega vpliva CTCM in T3/Dex na globalno transkripcijsko pokrajino tkiva srčnih rezin smo izvedli RNAseq na srčnih rezinah iz vseh štirih različnih pogojev gojenja (dodatni podatki 1). Zanimivo je, da so rezine MT pokazale visoko transkripcijsko podobnost s svežim srčnim tkivom, saj je bilo od 13.642 genov diferencialno izraženih le 16. Vendar pa so, kot smo pokazali že prej, rezine Ctrl po 10–12 dneh v kulturi pokazale 1229 diferencialno izraženih genov (slika 4e). Te podatke je potrdila qRT-PCR srčnih in fibroblastnih genov (dodatna slika 7a-c). Zanimivo je, da so rezine Ctrl pokazale znižano regulacijo srčnih in celičnih genov ter aktivacijo vnetnih genskih programov. Ti podatki kažejo, da je dediferenciacija, ki se običajno pojavi po dolgotrajnem gojenju, v pogojih MT popolnoma oslabljena (dodatna slika 8a,b). Skrbna študija genov sarkomer je pokazala, da se geni, ki kodirajo sarkomero (slika 4f) in ionski kanal (dodatna slika 9), ohranijo le v pogojih MT, kar jih ščiti pred supresijo v pogojih Ctrl, TD in MC. Ti podatki kažejo, da lahko s kombinacijo mehanske in humoralne stimulacije (T3/Dex) transkriptom srčne rezine ostane podoben svežim srčnim rezinam po 12 dneh v kulturi.
Te transkripcijske ugotovitve podpira dejstvo, da se strukturna celovitost kardiomiocitov v srčnih rezinah najbolje ohrani v pogojih MT 12 dni, kar kaže intaktni in lokalizirani koneksin 43 (slika 5a). Poleg tega je bila fibroza v srčnih rezinah v pogojih MT bistveno zmanjšana v primerjavi s Ctrl in podobna kot pri svežih srčnih rezinah (slika 5b). Ti podatki kažejo, da kombinacija mehanske stimulacije in zdravljenja s T3/Dex učinkovito ohranja srčno strukturo v srčnih rezinah v kulturi.
Reprezentativne imunofluorescenčne slike troponina-T (zeleno), koneksina 43 (rdeče) in DAPI (modro) v sveže izoliranih srčnih rezinah (D0) ali gojenih 12 dni v vseh štirih pogojih gojenja srčnih rezin (merilo = 100 µm). Kvantifikacija strukturne integritete srčnega tkiva z umetno inteligenco (n = 7 (D0 in D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC in D12 MT) rezin/skupine različnih prašičev, izveden je enosmerni ANOVA test; ####p < 0,0001 v primerjavi z D0 in *p < 0,05 ali ****p < 0,0001 v primerjavi z D12 Ctrl). Kvantifikacija strukturne integritete srčnega tkiva z umetno inteligenco (n = 7 (D0 in D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC in D12 MT) rezin/skupine različnih prašičev, izveden je enosmerni ANOVA test; #### p < 0,0001 v primerjavi z D0 in *p < 0,05 ali ****p < 0,0001 v primerjavi z D12 Ctrl). Količinska ocena strukturne celostnosti tkiva srca s pomočjo umetnega intelekta (n = 7 (D0 in D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC in D12 MT) rezov/skupine od različnih svinj, izveden enofaktorski test ANOVA; #### p < 0,0001 v primerjavi z D0 in *p < 0,05 ali ****p < 0,0001 v primerjavi z D12 Ctrl). Kvantifikacija strukturne integritete srčnega tkiva z uporabo umetne inteligence (n = 7 (D0 in D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC in D12 MT) odsekov/skupine različnih prašičev, izveden enosmerni ANOVA test; #### p < 0,0001 v primerjavi z D0 in *p < 0,05 ali ****p < 0,0001 v primerjavi z D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组） < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。Kvantifikacija strukturne integritete srčnega tkiva z uporabo umetne inteligence pri različnih prašičih (n = 7 (D0 in D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC in D12 MT) odsekov/skupina) z enosmernim ANOVA testom;#### p < 0,0001 v primerjavi z D0 in *p < 0,05 ali ****p < 0,0001 v primerjavi z D12 Ctrl). #### p < 0,0001 v primerjavi z D0 in *p < 0,05 ali ****p < 0,0001 v primerjavi z D12 (kontrola). b Reprezentativne slike in kvantifikacija za rezine srca, obarvane z Massonovim trikromnim barvilom (merilo = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD in D12 MC), 9 (D12 MT) rezin/skupina od različnih prašičev, izveden je enosmerni ANOVA test; ####p < 0,0001 v primerjavi z D0 in ***p < 0,001 ali ****p < 0,0001 v primerjavi z D12 Ctrl). b Reprezentativne slike in kvantifikacija za rezine srca, obarvane z Massonovim trikromnim barvilom (merilo = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD in D12 MC), 9 (D12 MT) rezin/skupina od različnih prašičev, izveden je enosmerni ANOVA test; ####p < 0,0001 v primerjavi z D0 in ***p < 0,001 ali ****p < 0,0001 v primerjavi z D12 Ctrl). b Reprezentativne slike in količinska ocena rezov srca, okrašenega s trikromnim krasiteljem Massona (masovna črta = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD in D12 MC), 9 (D12 MT) rezov/skupine od različnih svinj, izvaja se enostranski test ANOVA; ####p < 0,0001 v primerjavi z D0 in ***p < 0,001 ali ****p < 0,0001 v primerjavi z D12 Ctrl). b Reprezentativne slike in kvantifikacija srčnih odsekov, obarvanih z Massonovim trikromnim barvilom (merilo = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD in D12 MC), 9 (D12 MT) odsekov/skupina od različnih prašičev, izvedena enosmerna ANOVA; ####p < 0,0001 v primerjavi z D0 in ***p < 0,001 ali ****p < 0,0001 v primerjavi z D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Reprezentativne slike in količinska ocena rezov srca, okrašenih s trikromom Massona (mašinska črta = 500 mkm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD in D12 MC), 9 (D12 MT) rezov od različnih svinj / skupin, en način ANOVA; ####p < 0,0001 v primerjavi z D0, ***p < 0,001 ali ****p < 0,0001 v primerjavi z D12 Ctrl). b Reprezentativne slike in kvantifikacija srčnih odsekov, obarvanih z Massonovim trikromom (merilo = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD in D12 MC), 9 (D12 MT) odsekov različnih prašičev/skupin, ena metoda ANOVA; ####p < 0,0001 v primerjavi z D0, ***p < 0,001 ali ****p < 0,0001 v primerjavi z D12 Ctrl).Stolpci napak predstavljajo povprečje ± standardni odklon.
Končno je bila sposobnost CTCM za posnemanje srčne hipertrofije ocenjena s povečanjem raztezanja srčnega tkiva. Pri CTCM se je najvišji tlak v zračni komori povečal z 80 mmHg na 80 mmHg. Art. (normalno raztezanje) do 140 mmHg. Art. (slika 6a). To ustreza 32-odstotnemu povečanju raztezanja (slika 6b), kar je bilo prej prikazano kot ustrezen odstotek raztezanja, potreben, da srčni rezini dosežejo dolžino sarkomere, podobno tisti pri hipertrofiji. Raztezanje in hitrost srčnega tkiva med krčenjem in sproščanjem sta ostala konstantna v šestih dneh gojenja (slika 6c). Srčno tkivo iz pogojev MT je bilo šest dni izpostavljeno normalnemu raztezanju (MT (normalno)) ali preraztezanju (MT (OS)). Že po štirih dneh gojenja je bil hipertrofični biomarker NT-ProBNP v gojišču v pogojih MT (OS) znatno povišan v primerjavi z MT (normalno) (slika 7a). Poleg tega se je po šestih dneh gojenja velikost celic v MT (OS) (slika 7b) znatno povečala v primerjavi z odseki srca MT (normalno). Poleg tega se je jedrna translokacija NFATC4 znatno povečala v preraztegnjenih tkivih (slika 7c). Ti rezultati kažejo na progresiven razvoj patološkega preoblikovanja po hiperdistenziji in podpirajo koncept, da se naprava CTCM lahko uporablja kot platforma za preučevanje signalizacije srčne hipertrofije, ki jo povzroča raztezanje.
Reprezentativne sledi meritev tlaka v zračni komori, tlaka v tekočinski komori in gibanja tkiva potrjujejo, da tlak v komori spreminja tlak v tekočinski komori, kar povzroči ustrezno gibanje tkivnega rezina. b Reprezentativne krivulje odstotka raztezanja in hitrosti raztezanja za normalno raztegnjene (oranžne) in preraztegnjene (modre) tkivne rezine. c Stolpični diagram, ki prikazuje čas cikla (n = 19 rezin na skupino, od različnih prašičev), čas krčenja (n = 18–19 rezin na skupino, od različnih prašičev), čas relaksacije (n = 19 rezin na skupino, od različnih prašičev)), amplitudo gibanja tkiva (n = 14 rezin/skupina, od različnih prašičev), najvišjo sistolično hitrost (n = 14 rezin/skupina, od različnih prašičev) in najvišjo hitrost relaksacije (n = 14 (D0), 15 (D6)) rezin/skupin) od različnih prašičev), dvostranski Studentov t-test ni pokazal pomembne razlike v nobenem parametru, kar kaže, da so ti parametri ostali konstantni v 6 dneh gojenja s prenapetostjo. Stolpci napak predstavljajo povprečje ± standardni odklon.
Stolpični graf kvantifikacije koncentracije NT-ProBNP v gojišču iz srčnih rezin, gojenih v pogojih normalnega raztezanja MT (Norm) ali prekomernega raztezanja (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm in D4 MTOS) rezine/skupina iz različnih prašičev, izvedena je dvosmerna ANOVA; **p < 0,01 v primerjavi z normalnim raztezanjem). Stolpični graf kvantifikacije koncentracije NT-ProBNP v gojišču iz srčnih rezin, gojenih v pogojih normalnega raztezanja MT (Norm) ali prekomernega raztezanja (OS) (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm in D4 MTOS) rezine/skupina iz različnih prašičev, izvedena je dvosmerna ANOVA; **p < 0,01 v primerjavi z normalnim raztezanjem).Kvantitativni histogram koncentracije NT-ProBNP v gojišču iz srčnih rezin, gojenih v pogojih normalnega raztezanja MT (norma) ali preraztezanja (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm in D4 MTOS) rezine/skupina od različnih prašičev, izvedena je dvofaktorska analiza variance;**p < 0,01 v primerjavi z normalnim raztezanjem). **p < 0,01 v primerjavi z normalnim raztezanjem). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01). a Kvantifikacija koncentracije NT-ProBNP v rezinah srca, gojenih v pogojih MT normalnega raztezanja (Norm) ali prekomernega raztezanja (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) iz različnih猪的切片/组，可以双向方方发发动; **v primerjavi z običajnim raztezanjem, p < 0,01).histogram Kvantifikacija koncentracij NT-ProBNP v srčnih rezinah, gojenih v pogojih normalnega raztezanja MT (norma) ali preraztezanja (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) in D4 MTOS) rezine/skupina od različnih prašičev, dvosmerna analiza variance;**p < 0,01 v primerjavi z normalnim raztezanjem). **p < 0,01 v primerjavi z normalnim raztezanjem). b Reprezentativne slike srčnih rezin, obarvanih s troponinom-T in WGA (levo), ter kvantifikacija velikosti celic (desno) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) celic/skupina iz 10 različnih rezin različnih prašičev, izveden je dvostranski Studentov t-test; ****p < 0,0001 v primerjavi z normalnim raztezanjem). b Reprezentativne slike srčnih rezin, obarvanih s troponinom-T in WGA (levo), ter kvantifikacija velikosti celic (desno) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) celic/skupina iz 10 različnih rezin različnih prašičev, izveden je dvostranski Studentov t-test; ****p < 0,0001 v primerjavi z normalnim raztezanjem). b Reprezentativne slike rezov srca, okrašenih s troponinom-T in AZP (levo) in količinsko določeno število celic (popravek) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) celic/skupine iz 10 različnih rezov različnih svinj, dva-proizvedena hvostova t-kriterija Stjudenta; ****p < 0,0001 v primerjavi z normalnim raztezanjem). b Reprezentativne slike srčnih odsekov, obarvanih s troponinom-T in AZP (levo), ter kvantifikacija velikosti celic (desno) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) celic/skupino iz 10 različnih odsekov različnih prašičev, izveden je bil dvostranski Studentov t-test; ****p < 0,0001 v primerjavi z normalnim sevom). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）。 b Reprezentativne slike srčnih rezin, obarvanih s kalkareinom-T in WGA (levo), in velikost celic (desno) (n = 330 (D6 MTOS), 369 iz 10 različnih rezin (D6 MTNorm)) Celice/组, t-test z metodo 两方法有尾学生；v primerjavi z normalnim raztezanjem, ****p < 0,0001). b Reprezentativne slike rezov srca, okrašenih s troponinom-T in AZP (levo) in količinska ocena velikosti celic (popravek) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) iz 10 različnih rezov iz različnih svinjskih kletk/skupine, dvostranski kriterij Stjudenta; ****p < 0,0001 v primerjavi z normalnim raztezanjem). b Reprezentativne slike srčnih prerezov, obarvanih s troponinom-T in AZP (levo), in kvantifikacija velikosti celic (desno) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) iz 10 različnih prerezov različnih prašičev) Celice/skupina, dvostranski kriterij Studentov t; ****p < 0,0001 v primerjavi z normalnim sevom). c Reprezentativne slike za srčne rezine MTOS na dan 0 in 6, imunooznačene za troponin-T in NFATC4, ter kvantifikacija translokacije NFATC4 v jedra CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) rezine/skupina od različnih prašičev, izveden je dvostranski Studentov t-test; *p < 0,05). c Reprezentativne slike za srčne rezine MTOS na dan 0 in 6, imunooznačene za troponin-T in NFATC4, ter kvantifikacija translokacije NFATC4 v jedra CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) rezine/skupina od različnih prašičev, izveden je dvostranski Studentov t-test; *p < 0,05). c Reprezentativne slike za reze srca 0 in 6 dni MTOS, imunomehirane za troponin-T in NFATC4, in količinsko oceno translokacij NFATC4 v celicah kavernoznih celic (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) rezov/skupine od različnih svinj, izvaja se dvostranski t-kriterij Stjudenta; *p < 0,05). c Reprezentativne slike za srčne prereze pri 0 in 6 dneh MTOS, imunooznačenih za troponin-T in NFATC4, ter kvantifikacija translokacije NFATC4 v jedru kavernoznih celic (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) rezine/skupina od različnih prašičev) izvedena z dvostranskim Studentovim t-testom; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05). c Reprezentativne slike imunskega označevanja kalkanina-T in NFATC4 第0天和第6天rezine srca MTOS in NFATC4 iz različnih NFATC4 易位至celičnega jedra 的količine化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组,时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Reprezentativne slike rezov srca MTOS na 0 in 6 dni za imunomarkiranje troponinom-T in NFATC4 ter količinsko oceno translokacij NFATC4 v jadra CM od različnih svinj (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) rez/skupina, dva-hvostatski t-kriterij Stjudenta; *p < 0,05). c Reprezentativne slike srčnih rezin MTOS na dan 0 in 6 za imunsko označevanje troponina-T in NFATC4 ter kvantifikacijo translokacije NFATC4 v jedru CM pri različnih prašičih (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) rezine/skupina, dvostranski t-kriterij Studentov; *p < 0,05).Stolpci napak predstavljajo povprečje ± standardni odklon.
Translacijske kardiovaskularne raziskave zahtevajo celične modele, ki natančno reproducirajo srčno okolje. V tej študiji je bila razvita in karakterizirana naprava CTCM, ki lahko stimulira ultratanke dele srca. Sistem CTCM vključuje fiziološko sinhronizirano elektromehansko stimulacijo ter obogatitev s tekočino T3 in Dex. Ko so bili deli prašičjega srca izpostavljeni tem dejavnikom, so njihova sposobnost preživetja, strukturna integriteta, presnovna aktivnost in transkripcijska ekspresija po 12 dneh gojenja ostali enaki kot v svežem srčnem tkivu. Poleg tega lahko prekomerno raztezanje srčnega tkiva povzroči hipertrofijo srca zaradi hiperekstenzije. Na splošno ti rezultati podpirajo ključno vlogo fizioloških pogojev gojenja pri ohranjanju normalnega srčnega fenotipa in zagotavljajo platformo za presejanje zdravil.
Številni dejavniki prispevajo k ustvarjanju optimalnega okolja za delovanje in preživetje kardiomiocitov. Najbolj očitni od teh dejavnikov so povezani z (1) medceličnimi interakcijami, (2) elektromehansko stimulacijo, (3) humoralnimi dejavniki in (4) presnovnimi substrati. Fiziološke interakcije med celicami zahtevajo kompleksne tridimenzionalne mreže več tipov celic, ki jih podpira zunajcelični matriks. Takšne kompleksne celične interakcije je težko rekonstruirati in vitro s sokulturo posameznih tipov celic, vendar jih je mogoče enostavno doseči z uporabo organotipske narave srčnih rezin.
Mehansko raztezanje in električna stimulacija kardiomiocitov sta ključnega pomena za ohranjanje srčnega fenotipa33,34,35. Medtem ko se mehanska stimulacija pogosto uporablja za kondicioniranje in zorenje hiPSC-CM, je več elegantnih študij pred kratkim poskušalo z mehansko stimulacijo srčnih rezin v kulturi z uporabo enoosne obremenitve. Te študije kažejo, da ima 2D enoosna mehanska obremenitev pozitiven učinek na fenotip srca med kulturo. V teh študijah so bili rezini srca bodisi obremenjeni z izometričnimi nateznimi silami17, linearno avksotonično obremenitvijo18 ali pa je bil srčni cikel poustvarjen z uporabo povratne informacije pretvornika sile in nateznih pogonov. Vendar te metode uporabljajo enoosno raztezanje tkiva brez optimizacije okolja, kar ima za posledico zaviranje številnih srčnih genov ali prekomerno izražanje genov, povezanih z nenormalnimi odzivi raztezanja. CTCM, opisan tukaj, zagotavlja 3D elektromehanski dražljaj, ki posnema naravni srčni cikel glede na čas cikla in fiziološko raztezanje (25 % raztezanje, 40 % sistola, 60 % diastola in 72 utripov na minuto). Čeprav ta tridimenzionalna mehanska stimulacija sama po sebi ni zadostna za ohranitev celovitosti tkiva, je za ustrezno ohranitev viabilnosti, delovanja in celovitosti tkiva potrebna kombinacija humoralne in mehanske stimulacije s T3/Dex.
Humoralni dejavniki igrajo pomembno vlogo pri modulaciji fenotipa odraslega srca. To je bilo poudarjeno v študijah HiPS-CM, v katerih sta bila T3 in dekstroza (Dex) dodana gojišču za pospešitev zorenja celic. T3 lahko vpliva na transport aminokislin, sladkorjev in kalcija skozi celične membrane36. Poleg tega T3 spodbuja izražanje MHC-α in znižanje MHC-β, kar spodbuja nastanek hitrih miofibril v zrelih kardiomiocitih v primerjavi s počasnimi miofibrilami pri fetalni CM. Pomanjkanje T3 pri bolnikih s hipotiroidizmom povzroči izgubo miofibrilarnih trakov in zmanjšano stopnjo razvoja tonusa37. Dexozofag deluje na glukokortikoidne receptorje in dokazano povečuje kontraktilnost miokarda v izoliranih perfuziranih srcih;38 domneva se, da je to izboljšanje povezano z učinkom na vstop, ki ga poganjajo depoziti kalcija (SOCE)39,40. Poleg tega se dekstrozafag veže na svoje receptorje, kar povzroči širok znotrajcelični odziv, ki zavira imunsko delovanje in vnetje30.
Naši rezultati kažejo, da je fizikalno-mehanska stimulacija (MS) izboljšala splošno delovanje kulture v primerjavi s Ctrl, vendar ni uspela ohraniti viabilnosti, strukturne integritete in srčne ekspresije v 12 dneh gojenja. V primerjavi s Ctrl je dodatek T3 in Dex h kulturam CTCM (MT) izboljšal viabilnost in ohranil podobne transkripcijske profile, strukturno integriteto in presnovno aktivnost s svežim srčnim tkivom 12 dni. Poleg tega je bil z nadzorovanjem stopnje raztezanja tkiva z uporabo STCM ustvarjen model srčne hipertrofije, povzročene s hiperekstenzijo, ki ponazarja vsestranskost sistema STCM. Treba je opozoriti, da čeprav preoblikovanje srca in fibroza običajno vključujeta nedotaknjene organe, katerih celice v krvnem obtoku lahko zagotovijo ustrezne citokine, pa tudi fagocitozo in druge dejavnike preoblikovanja, lahko deli srca še vedno posnemajo fibrotični proces kot odziv na stres in travmo. v miofibroblaste. To je bilo že prej ovrednoteno v tem modelu srčne rezine. Treba je opozoriti, da je mogoče parametre CTCM modulirati s spreminjanjem tlaka/električne amplitude in frekvence, da se simulirajo številna stanja, kot so tahikardija, bradikardija in mehanska podpora krvnega obtoka (mehansko razbremenjeno srce). Zaradi tega je sistem srednje prepusten za testiranje drog. Sposobnost CTCM za modeliranje s preobremenitvijo povzročene srčne hipertrofije utira pot testiranju tega sistema za personalizirano terapijo. Skratka, ta študija dokazuje, da sta mehansko raztezanje in humoralna stimulacija ključnega pomena za vzdrževanje kulture rezin srčnega tkiva.
Čeprav tukaj predstavljeni podatki kažejo, da je CTCM zelo obetavna platforma za modeliranje intaktnega miokarda, ima ta metoda gojenja nekaj omejitev. Glavna omejitev gojenja CTCM je, da na rezine nalaga neprekinjene dinamične mehanske obremenitve, kar onemogoča aktivno spremljanje krčenja srčnih rezin med vsakim ciklom. Poleg tega je zaradi majhnosti srčnih rezin (7 mm) možnost ocenjevanja sistolične funkcije zunaj gojitvenih sistemov z uporabo tradicionalnih senzorjev sile omejena. V tem rokopisu to omejitev delno premagamo z ocenjevanjem optične napetosti kot indikatorja kontraktilne funkcije. Vendar pa bo ta omejitev zahtevala nadaljnje delo in jo je mogoče v prihodnosti odpraviti z uvedbo metod za optično spremljanje delovanja srčnih rezin v kulturi, kot je optično kartiranje z uporabo kalcija in napetostno občutljivih barvil. Druga omejitev CTCM je, da delovni model ne manipulira s fiziološko napetostjo (prednapetost in naknadna obremenitev). Pri CTCM je bil tlak induciran v nasprotnih smereh, da se je v zelo velikih tkivih reproduciralo 25 % fiziološkega raztezanja v diastoli (polno raztezanje) in sistoli (dolžina krčenja med električno stimulacijo). To omejitev je treba v prihodnjih zasnovah CTCM odpraviti z ustreznim pritiskom na srčno tkivo z obeh strani in z uporabo natančnih razmerij med tlakom in prostornino, ki se pojavljajo v srčnih prekatih.
Preoblikovanje, ki ga povzroča prekomerno raztezanje in je opisano v tem rokopisu, je omejeno na posnemanje hipertrofičnih signalov hiperraztezanja. Tako lahko ta model pomaga pri preučevanju hipertrofične signalizacije, ki jo povzroča raztezanje, brez potrebe po humoralnih ali nevronskih dejavnikih (ki v tem sistemu ne obstajajo). Potrebne so nadaljnje študije za povečanje multiplicitete CTCM, na primer sokultiviranje z imunskimi celicami, krožečimi plazemskimi humoralnimi faktorji in inervacija pri sokultiviranju z nevronskimi celicami bodo izboljšale možnosti modeliranja bolezni s CTCM.
V tej študiji je bilo uporabljenih trinajst prašičev. Vsi postopki na živalih so bili izvedeni v skladu z institucionalnimi smernicami in jih je odobril Odbor za institucionalno oskrbo in uporabo živali Univerze v Louisvillu. Aortni lok je bil stisnjen s klemo in srce je bilo perfuzirano z 1 l sterilne kardioplegije (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/ml heparina, pH do 7,4); Srca so bila shranjena v ledeno mrzli kardioplegični raztopini, dokler niso bila prenesena v laboratorij na ledu, kar je običajno <10 min. Srca so bila shranjena v ledeno mrzli kardioplegični raztopini, dokler niso bila prenesena v laboratorij na ledu, kar je običajno <10 min. srca hranila v ledeni kardioplegični raztopini za prenos v laboratorij na ledu, kar običajno traja <10 min. Srca so bila shranjena v ledeno mrzli kardioplegični raztopini do transporta v laboratorij na ledu, kar običajno traja <10 minut.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Držite srce v ledjani kardioplegiji do transportiranja v laboratoriju na ldu, običajno <10 min. Srca hranite na ledeni kardioplegiji do prevoza v laboratorij na ledu, običajno <10 min.
Naprava CTCM je bila razvita v programski opremi za računalniško podprto načrtovanje (CAD) SolidWorks. Gojilne komore, razdelilniki in zračne komore so izdelane iz prozorne akrilne plastike, obdelane s CNC stroji. Oporni obroč s premerom 7 mm je izdelan iz polietilena visoke gostote (HDPE) na sredini in ima utor za O-obroč, v katerega se vstavi silikonski O-obroč, ki se uporablja za tesnjenje medija pod njim. Tanka silikatna membrana ločuje gojilno komoro od ločilne plošče. Silikonska membrana je lasersko izrezana iz 0,02″ debele silikonske plošče in ima trdoto 35A. Spodnje in zgornje silikonsko tesnilo sta lasersko izrezana iz 1/16″ debele silikonske plošče in imata trdoto 50A. Za pritrditev bloka in ustvarjanje zrakotesne tesnilne mase se uporabljajo vijaki in krilne matice iz nerjavečega jekla 316L.
Namensko tiskano vezje (PCB) je zasnovano za integracijo s sistemom C-PACE-EM. Priključki Swiss Machine na tiskanem vezju so povezani z grafitnimi elektrodami s posrebrenimi bakrenimi žicami in bronastimi vijaki 0-60, privitimi v elektrode. Tiskano vezje je nameščeno v pokrovu 3D-tiskalnika.
Napravo CTCM krmili programabilni pnevmatski aktuator (PPD), ki ustvarja nadzorovan krvni tlak, podoben srčnemu ciklu. Ko se tlak v zračni komori poveča, se fleksibilna silikonska membrana razširi navzgor in potisne medij pod tkivo. Območje tkiva se nato zaradi iztisnjene tekočine raztegne, kar posnema fiziološko raztezanje srca med diastolo. Na vrhuncu sprostitve je bila z grafitnimi elektrodami uporabljena električna stimulacija, ki je zmanjšala tlak v zračni komori in povzročila krčenje tkivnih odsekov. V notranjosti cevi je hemostatski ventil s tlačnim senzorjem za zaznavanje tlaka v zračnem sistemu. Tlak, ki ga zazna tlačni senzor, se dovaja v zbiralnik podatkov, priključen na prenosni računalnik. To omogoča neprekinjeno spremljanje tlaka v plinski komori. Ko je bil dosežen najvišji tlak v komori (standardno 80 mmHg, 140 mmHg OS), je bila naprava za zajem podatkov naročena, da pošlje signal sistemu C-PACE-EM za generiranje dvofaznega napetostnega signala za 2 ms, nastavljenega na 4 V.
Pridobljeni so bili srčni rezi in pogoji gojenja v 6 vdolbinicah so bili izvedeni na naslednji način: odvzeta srca so bila prenesena iz prenosne posode na pladenj s hladno (4 °C) kardioplegijo. Levi prekat je bil izoliran s sterilnim rezilom in razrezan na koščke velikosti 1–2 cm3. Te tkivne bloke so bili pritrjeni na tkivne nosilce s tkivnim lepilom in postavljeni v vibrirajočo mikrotomsko tkivno kopel, ki je vsebovala Tyrodeovo raztopino in bila nenehno oksigenirana (3 g/L 2,3-butandione monooksima (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g)), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glukoze (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M raztopine), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M raztopine), do 1 L ddH2O). Vibracijski mikrotom je bil nastavljen za rezanje 300 µm debelih rezin s frekvenco 80 Hz, horizontalno amplitudo vibracij 2 mm in hitrostjo napredovanja 0,03 mm/s. Tkivna kopel je bila obdana z ledom, da se raztopina ohladi, temperatura pa se je vzdrževala pri 4 °C. Tkivne rezine so bile prenesene iz mikrotomske kopeli v inkubacijsko kopel, ki je vsebovala stalno oksigenirano raztopino Tyrode na ledu, dokler niso bile pridobljene dovolj rezin za eno gojitveno ploščo. Za transjamične kulture so bile tkivne rezine pritrjene na sterilne 6 mm široke poliuretanske nosilce in postavljene v 6 ml optimiziranega medija (medij 199, 1x dodatek ITS, 10 % FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalni in 2X antibiotik-protiglivično sredstvo). Na tkivne rezine je bila uporabljena električna stimulacija (10 V, frekvenca 1,2 Hz) preko C-Pace. Za pogoje TD sta bila sveža T3 in Dex dodana v koncentraciji 100 nM in 1 μM ob vsaki menjavi medija. Gojišče je pred zamenjavo trikrat na dan nasičeno s kisikom. Tkivne rezine so gojili v inkubatorju pri 37 °C in 5 % CO2.
Za kulture CTCM so bili tkivni rezini nameščeni na 3D-tiskalnik po meri v petrijevki, ki je vsebovala modificirano Tyrodejevo raztopino. Naprava je zasnovana tako, da poveča velikost rezine srca za 25 % površine podpornega obroča. To se naredi zato, da se rezini srca po prenosu iz Tyrodejeve raztopine v medij in med diastolo ne raztegnejo. Z uporabo histoakrilnega lepila so bili rezini debeline 300 µm pritrjeni na podporni obroč s premerom 7 mm. Po pritrditvi tkivnih rezin na podporni obroč odrežite odvečne tkivne rezine in pritrjene tkivne rezine postavite nazaj v kopel Tyrodejeve raztopine na ledu (4 °C), dokler ni bilo pripravljenih dovolj rezin za eno napravo. Skupni čas obdelave za vse naprave ne sme presegati 2 ur. Ko je bilo 6 tkivnih rezin pritrjenih na njihove podporne obroče, je bila naprava CTCM sestavljena. Komora za gojenje CTCM je bila predhodno napolnjena z 21 ml predoksigeniranega medija. Tkivne rezine prenesite v komoro za gojenje in s pipeto previdno odstranite morebitne zračne mehurčke. Rezino tkiva nato vstavite v luknjo in jo nežno pritisnete na svoje mesto. Na koncu namestite pokrovček elektrode na napravo in jo prenesite v inkubator. Nato priključite CTCM na zračno cev in sistem C-PACE-EM. Pnevmatski aktuator se odpre in zračni ventil odpre CTCM. Sistem C-PACE-EM je bil konfiguriran tako, da med dvofaznim stimuliranjem 2 ms dovaja 4 V pri 1,2 Hz. Medij se je menjal dvakrat na dan, elektrode pa enkrat na dan, da se prepreči kopičenje grafita na elektrodah. Po potrebi lahko rezine tkiva odstranimo iz njihovih gojiščev, da odstranimo morebitne zračne mehurčke, ki so morda padli podnje. Za pogoje zdravljenja z MT je bil T3/Dex dodan svež ob vsaki menjavi medija s 100 nM T3 in 1 μM Dex. Naprave CTCM so bile gojene v inkubatorju pri 37 °C in 5 % CO2.
Za pridobitev raztegnjenih trajektorij srčnih rezin je bil razvit poseben sistem kamer. Uporabljena je bila SLR kamera (Canon Rebel T7i, Canon, Tokio, Japonska) z makro objektivom Navitar Zoom 7000 18-108 mm (Navitar, San Francisco, Kalifornija). Vizualizacija je bila izvedena pri sobni temperaturi po zamenjavi medija s svežim medijem. Kamera je bila postavljena pod kotom 51° in video je bil posnet s 30 sličicami na sekundo. Najprej je bila uporabljena odprtokodna programska oprema (MUSCLEMOTION43) s programom Image-J za kvantifikacijo gibanja srčnih rezin. Maska je bila ustvarjena z uporabo programa MATLAB (MathWorks, Natick, MA, ZDA) za določitev območij zanimanja za rezine utripajočega srca, da se izognemo šumu. Ročno segmentirane maske so bile uporabljene na vseh slikah v zaporedju sličic in nato posredovane vtičniku MUSCLEMOTION. Muscle Motion uporablja povprečno intenzivnost slikovnih pik v vsakem kadru za kvantifikacijo njegovega gibanja glede na referenčni okvir. Podatki so bili posneti, filtrirani in uporabljeni za kvantifikacijo časa cikla in oceno raztezanja tkiva med srčnim ciklom. Posneti videoposnetek je bil naknadno obdelan z digitalnim filtrom prvega reda z ničelno fazo. Za kvantifikacijo raztezanja tkiva (od vrha do vrha) je bila izvedena analiza od vrha do vrha, da se loči med vrhovi in ​​​​dolbinami v posnetem signalu. Poleg tega se izvede odstranjevanje trenda z uporabo polinoma 6. reda za odpravo drifta signala. Programska koda je bila razvita v MATLAB-u za določanje globalnega gibanja tkiva, časa cikla, časa relaksacije in časa krčenja (dodatna programska koda 44).
Za analizo deformacije smo z uporabo istih videoposnetkov, ustvarjenih za oceno mehanskega raztezanja, najprej izsledili dve sliki, ki predstavljata vrhove gibanja (najvišjo (zgornjo) in najnižjo (spodnjo) točko gibanja) v skladu s programsko opremo MUSCLEMOTION. Nato smo segmentirali področja tkiva in na segmentirano tkivo uporabili obliko algoritma senčenja (dodatna slika 2a). Segmentirano tkivo smo nato razdelili na deset podpovršin, napetost na vsaki površini pa smo izračunali z naslednjo enačbo: Deformacija = (Sup-Sdown)/Sdown, kjer sta Sup in Sdown razdalji oblike od zgornje oziroma spodnje sence tkanine (dodatna slika .2b).
Srčne rezine smo fiksirali 48 ur v 4 % paraformaldehidu. Fiksirana tkiva smo 1 uro dehidrirali v 10 % in 20 % saharozi, nato pa čez noč v 30 % saharozi. Rezine smo nato vgradili v spojino za optimalno temperaturo rezanja (spojina OCT) in postopoma zamrznili v kopeli izopentana/suhega ledu. Vgradne bloke OCT shranjujte pri -80 °C do ločitve. Stekelca smo pripravili kot rezine debeline 8 μm.
Za odstranitev OCT iz srčnih rezin segrevajte preparate na grelnem bloku pri 95 °C 5 minut. Na vsak preparat dodajte 1 ml PBS in inkubirajte 30 minut pri sobni temperaturi, nato pa prereze prepojite z nastavitvijo 0,1 % Triton-X v PBS za 15 minut pri sobni temperaturi. Da preprečite vezavo nespecifičnih protiteles na vzorec, dodajte na preparate 1 ml 3 % raztopine BSA in inkubirajte 1 uro pri sobni temperaturi. BSA smo nato odstranili in preparate sprali s PBS. Vsak vzorec označite s svinčnikom. V 90 minutah smo dodali primarna protitelesa (razredčena 1:200 v 1% BSA) (koneksin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) in troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960), nato pa še sekundarna protitelesa (razredčena 1:200 v 1% BSA) proti mišjemu Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079) in kunčjemu Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) za dodatnih 90 minut. Trikratno spiranje s PBS. Za razlikovanje med ciljnim obarvanjem in ozadjem smo kot kontrolo uporabili le sekundarno protitelo. Nazadnje smo dodali jedrno barvilo DAPI in preparate postavili v vectashield (Vector Laboratories) ter zatesnili z lakom za nohte. -x povečava) in mikroskop Keyence s 40-kratno povečavo.
Za barvanje WGA je bil uporabljen WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) v koncentraciji 5 μg/ml v PBS, ki je bil nanesen na fiksne rezine 30 minut pri sobni temperaturi. Nato so bila stekelca oprana s PBS in na vsako stekelce je bilo dodano sudansko črno barvilo ter inkubirana 30 minut. Nato so bila stekelca oprana s PBS in dodano je bilo vgradno gojišče vectashield. Stekelca so bila vizualizirana na mikroskopu Keyence pri 40-kratni povečavi.
OCT smo iz vzorcev odstranili, kot je opisano zgoraj. Po odstranitvi OCT smo preparate čez noč potopili v Bouinovo raztopino. Nato smo preparate za 1 uro spirali z destilirano vodo in jih nato za 10 minut postavili v Bibrichovo raztopino aloe kislinskega fuksina. Nato smo preparate sprali z destilirano vodo in za 10 minut postavili v raztopino 5 % fosfomolibdena/5 % fosfovolframove kisline. Brez izpiranja smo preparate za 15 minut prenesli neposredno v raztopino anilinskega modrega. Nato smo preparate sprali z destilirano vodo in za 2 minuti postavili v 1 % raztopino ocetne kisline. Predmetne preparate smo posušili v 200 N etanolu in prenesli v ksilen. Obarvane preparate smo vizualizirali z mikroskopom Keyence z 10-kratno povečavo. Odstotek površine fibroze smo kvantificirali s programsko opremo Keyence Analyzer.
Preizkus viabilnosti celic CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornija), kataloška številka V13154, v skladu s protokolom proizvajalca z nekaj spremembami. Za zagotovitev enakomerne velikosti tkiva med analizo MTT je bil uporabljen kirurški luknjač s premerom 6 mm. Tkiva so bila posamično nanesena v vdolbinice 12-vdolbinske plošče, ki je vsebovala substrat MTT, v skladu s protokolom proizvajalca. Rezine so bile inkubirane pri 37 °C 3 ure, živo tkivo pa je presnovilo substrat MTT, da se tvori vijolična formazanova spojina. Raztopino MTT nadomestite z 1 ml DMSO in inkubirajte pri 37 °C 15 minut, da se iz srčnih rezin ekstrahira vijolični formazan. Vzorce so razredčili v razmerju 1:10 v DMSO v 96-vdolbinskih ploščah s prozornim dnom, intenzivnost vijolične barve pa je bila izmerjena pri 570 nm z uporabo bralnika plošč Cytation (BioTek). Odčitki so bili normalizirani glede na težo vsake rezine srca.
Medij za srčne rezine smo zamenjali z medijem, ki je vseboval 1 μCi/ml [5-3H]-glukoze (Moravek Biochemicals, Brea, CA, ZDA), za test izkoriščanja glukoze, kot je bilo opisano prej. Po 4 urah inkubacije smo v odprto mikrocentrifugalno epruveto, ki je vsebovala 100 µl 0,2 N HCl, dodali 100 µl medija. Nato smo epruveto postavili v scintilacijsko epruveto, ki je vsebovala 500 μl dH2O, da smo 72 ur pri 37 °C uparili [3H]2O. Nato smo mikrocentrifugalno epruveto odstranili iz scintilacijske epruvete in dodali 10 ml scintilacijske tekočine. Scintilacijsko štetje smo izvedli z analizatorjem tekočinske scintilacije Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, ZDA). Izkoriščenost glukoze je bila nato izračunana ob upoštevanju specifične aktivnosti [5-3H]-glukoze, nepopolnega ravnovesja in ozadja, redčenja [5-3H]- z neoznačeno glukozo in učinkovitosti scintilacijskega števca. Podatki so normalizirani glede na maso delov srca.
Po homogenizaciji tkiva v Trizolu smo iz srčnih rezin izolirali RNA z uporabo kompleta Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 v skladu s protokolom proizvajalca. Priprava knjižnice RNAsec, sekvenciranje in analiza podatkov so bili izvedeni na naslednji način:
Kot izhodni material za pripravo knjižnice RNA je bil uporabljen 1 μg RNA na vzorec. Sekvencne knjižnice so bile ustvarjene z uporabo kompleta za pripravo knjižnic RNA NEBNext UltraTM za Illumino (NEB, ZDA) v skladu s priporočili proizvajalca, atributnim zaporedjem pa so bile za vsak vzorec dodane indeksne kode. Na kratko, mRNA je bila očiščena iz celotne RNA z uporabo magnetnih kroglic, pritrjenih s poli-T oligonukleotidi. Fragmentacija je bila izvedena z uporabo dvovalentnih kationov pri visoki temperaturi v NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). Prva veriga cDNA je bila sintetizirana z uporabo naključnih heksamernih primerjev in reverzne transkriptaze M-MuLV (RNase H-). Druga veriga cDNA je bila nato sintetizirana z uporabo DNA polimeraze I in RNase H. Preostali previsi se s pomočjo aktivnosti eksonukleaze/polimeraze pretvorijo v tope konce. Po adenilaciji 3' konca fragmenta DNA je nanj pritrjen adapter NEBNext s strukturo lasnice, da se pripravi na hibridizacijo. Za izbiro fragmentov cDNA prednostne dolžine 150-200 bp. Fragmenti knjižnice so bili očiščeni z uporabo sistema AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, ZDA). Nato so bili 3 μl encima USER (NEB, ZDA) z velikostno izbrano cDNA, ligirano z adapterjem, uporabljeni 15 minut pri 37 °C in nato 5 minut pri 95 °C pred PCR. PCR je bil nato izveden z uporabo DNA polimeraze Phusion High-Fidelity, univerzalnih primerjev za PCR in primerjev Index (X). Nazadnje so bili produkti PCR očiščeni (sistem AMPure XP) in kakovost knjižnice ocenjena na sistemu Agilent Bioanalyzer 2100. Knjižnica cDNA je bila nato sekvencirana z uporabo sekvencerja Novaseq. Surove slikovne datoteke iz Illumine so bile pretvorjene v surove odčitke z uporabo CASAVA Base Calling. Surovi podatki so shranjeni v datotekah formata FASTQ(fq), ki vsebujejo odčitane sekvence in ustrezne bazne kakovosti. Izberite HISAT2, da se filtrirani odčitki sekvenciranja ujemajo z referenčnim genomom Sscrofa11.1. Na splošno HISAT2 podpira genome vseh velikosti, vključno z genomi, večjimi od 4 milijard baz, in za večino parametrov so nastavljene privzete vrednosti. Spajanje odčitkov iz podatkov RNA Seq je mogoče učinkovito poravnati z uporabo HISAT2, trenutno najhitrejšega sistema, z enako ali boljšo natančnostjo kot katera koli druga metoda.
Število transkriptov neposredno odraža raven izražanja genov. Ravni izražanja genov se ocenjujejo s številom transkriptov (število sekvenc), povezanih z genomom ali eksoni. Število odčitkov je sorazmerno z ravnmi izražanja genov, dolžino gena in globino sekvenciranja. Izračunali smo FPKM (fragmente na tisoč baznih parov sekvenciranih transkriptov na milijon baznih parov) in določili P-vrednosti diferencialne ekspresije z uporabo paketa DESeq2. Nato smo za vsako vrednost P izračunali stopnjo lažnih odkritij (FDR) z uporabo metode Benjamini-Hochberg9, ki temelji na vgrajeni R-funkciji »p.adjust«.
RNA, izolirana iz srčnih odsekov, je bila pretvorjena v cDNA pri koncentraciji 200 ng/μl z uporabo mešanice SuperScript IV Vilo Master Mix podjetja Thermo (Thermo, kat. št. 11756050). Kvantitativna RT-PCR je bila izvedena z uporabo prozorne reakcijske plošče Applied Biosystems Endura Plate Microamp s 384 vdolbinicami (Thermo, kat. št. 4483319) in optičnega lepila microamp (Thermo, kat. št. 4311971). Reakcijska mešanica je bila sestavljena iz 5 µl mešanice Taqman Fast Advanced Master Mix (Thermo, kat. št. 4444557), 0,5 µl Taqman Primer in 3,5 µl H2O, pomešanih na vdolbinico. Izvedeni so bili standardni cikli qPCR in vrednosti CT so bile izmerjene z uporabo instrumenta za PCR v realnem času Applied Biosystems Quantstudio 5 (modul s 384 vdolbinicami; številka izdelka A28135). Primerje Taqman smo kupili pri podjetju Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Vrednosti CT vseh vzorcev smo normalizirali na gen za vzdrževanje GAPDH.
Sproščanje NT-ProBNP iz medija je bilo ocenjeno z uporabo kompleta NT-ProBNP (pig) (kat. št. MBS2086979, MyBioSource) v skladu s protokolom proizvajalca. Na kratko, v vsako vdolbinico je bilo v dvojniku dodanih 250 µl vsakega vzorca in standarda. Takoj po dodajanju vzorca je bilo v vsako vdolbinico dodanih 50 µl testnega reagenta A. Ploščo nežno pretresite in zatesnite s tesnilnim sredstvom. Nato so bile tablete inkubirane pri 37 °C 1 uro. Nato je bila raztopina aspirirana in vdolbinice 4-krat sperene s 350 µl 1X raztopine za izpiranje, pri čemer je bila raztopina za izpiranje inkubirana 1-2 minuti vsakič. Nato je bilo dodanih 100 µl testnega reagenta B na vdolbinico in zatesnjeno s tesnilnim sredstvom za ploščo. Tableta je bila nežno pretresena in inkubirana pri 37 °C 30 minut. Raztopino je bilo aspirirano in vdolbinice 5-krat sperene s 350 µl 1X raztopine za izpiranje. V vsako vdolbinico dodajte 90 µl raztopine substrata in ploščo zaprite. Ploščo inkubirajte pri 37 °C 10–20 minut. V vsako vdolbinico dodajte 50 µl raztopine za zaustavitev reakcije. Ploščo smo takoj izmerili z bralnikom plošč Cytation (BioTek), nastavljenim na 450 nm.
Za izbiro velikosti skupin, ki bodo zagotovile >80 % moči za zaznavanje 10 % absolutne spremembe parametra s 5 % stopnjo napake tipa I, so bile izvedene analize moči. Izvedene so bile analize moči za izbiro velikosti skupin, ki bodo zagotovile > 80 % moči za zaznavanje 10 % absolutne spremembe parametra s 5 % stopnjo napake tipa I. Analiza moči je bila izvedena za izbiro velikosti skupine, ki zagotavlja >80 % moči za odkrite spremembe 10 % absolutnega parametra s 5 % pogoste napake tipa I. Izvedena je bila analiza moči za izbiro velikosti skupin, ki bi zagotovile >80 % moč za zaznavanje 10 % absolutne spremembe parametrov s 5 % stopnjo napake tipa I.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Izvedena je bila analiza moči za izbiro velikosti skupine, ki je zagotavljala > 80 % moči za odkrite spremembe 10 % absolutnih parametrov in 5 % frekvence napak tipa I. Izvedena je bila analiza moči za izbiro velikosti skupine, ki bi zagotovila > 80 % moči za zaznavanje 10 % absolutne spremembe parametrov in 5 % stopnje napak tipa I.Tkivni rezini so bili naključno izbrani pred poskusom. Vse analize so bile pogojno slepe in vzorci so bili dekodirani šele po analizi vseh podatkov. Za izvedbo vseh statističnih analiz je bila uporabljena programska oprema GraphPad Prism (San Diego, Kalifornija). Za vse statistične podatke so bile p-vrednosti ocenjene kot pomembne pri vrednostih <0,05. Za vse statistike so bile p-vrednosti ocenjene kot pomembne pri vrednostih <0,05. Za celotno statistiko so se p-značilnosti štele za pomembne pri pomenih <0,05. Za vse statistike so bile p-vrednosti ocenjene kot pomembne pri vrednostih <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Za celotno statistiko so se p-značilnosti štele za pomembne pri pomenih <0,05. Za vse statistike so bile p-vrednosti ocenjene kot pomembne pri vrednostih <0,05.Na podatkih je bil izveden dvostranski Studentov t-test z le dvema primerjavama. Za določitev značilnosti med več skupinami je bila uporabljena enosmerna ali dvosmerna ANOVA. Pri izvajanju post hoc testov je bil uporabljen Tukeyjev popravek za upoštevanje več primerjav. Podatki RNAsec imajo posebne statistične vidike pri izračunu FDR in p.adjust, kot je opisano v razdelku Metode.
Za več informacij o zasnovi študije glejte povzetek poročila o raziskavah narave, ki je povezan s tem člankom.