ขอบคุณที่เข้าชม Nature.com เบราว์เซอร์ที่คุณใช้อยู่มีการรองรับ CSS อย่างจำกัด เพื่อประสบการณ์การใช้งานที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันล่าสุด (หรือปิดโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าเว็บไซต์จะยังคงได้รับการสนับสนุนต่อไป เราจะแสดงผลเว็บไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
มีความจำเป็นต้องมีระบบในหลอดทดลองที่เชื่อถือได้ซึ่งสามารถจำลองสภาพแวดล้อมทางสรีรวิทยาของหัวใจได้อย่างแม่นยำสำหรับการทดสอบยา ข้อจำกัดของระบบเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อหัวใจมนุษย์ทำให้การตีความผลของยาต่อหัวใจไม่ถูกต้อง ในที่นี้ เราได้พัฒนาระบบเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อหัวใจ (CTCM) ที่กระตุ้นชิ้นส่วนหัวใจด้วยกลไกไฟฟ้าและทำให้เกิดการยืดตัวทางสรีรวิทยาในช่วงระยะซิสโตลิกและไดแอสโตลิกของวงจรการเต้นของหัวใจ หลังจากเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 12 วัน วิธีนี้ช่วยเพิ่มความมีชีวิตของชิ้นส่วนหัวใจได้บางส่วน แต่ไม่สามารถรักษาความสมบูรณ์ของโครงสร้างได้ทั้งหมด ดังนั้น หลังจากคัดกรองโมเลกุลขนาดเล็กแล้ว เราพบว่าการเติมไตรไอโอโดไทโรนีน (T3) 100 นาโนโมลาร์ และเดกซาเมทาโซน (Dex) 1 ไมโครโมลาร์ ลงในอาหารเลี้ยงเซลล์ของเรา ช่วยรักษาสภาพโครงสร้างจุลภาคของชิ้นส่วนได้นาน 12 วัน เมื่อใช้ร่วมกับการรักษาด้วย T3/Dex ระบบ CTCM สามารถรักษาโปรไฟล์การถอดรหัส ความมีชีวิต กิจกรรมเมตาบอลิซึม และความสมบูรณ์ของโครงสร้างได้ในระดับเดียวกับเนื้อเยื่อหัวใจสดเป็นเวลา 12 วัน นอกจากนี้ การยืดเนื้อเยื่อหัวใจมากเกินไปในสภาพเพาะเลี้ยงยังกระตุ้นการส่งสัญญาณหัวใจที่ทำให้เกิดภาวะหัวใจโต ซึ่งเป็นหลักฐานแสดงให้เห็นถึงความสามารถของ CTCM ในการจำลองสภาวะหัวใจโตที่เกิดจากการยืดตัวของหัวใจ สรุปได้ว่า CTCM สามารถจำลองสรีรวิทยาและพยาธิสรีรวิทยาของหัวใจในสภาพเพาะเลี้ยงได้เป็นระยะเวลานาน ทำให้สามารถคัดกรองยาได้อย่างน่าเชื่อถือ
ก่อนที่จะทำการวิจัยทางคลินิก จำเป็นต้องมีระบบในหลอดทดลองที่น่าเชื่อถือซึ่งสามารถจำลองสภาพแวดล้อมทางสรีรวิทยาของหัวใจมนุษย์ได้อย่างแม่นยำ ระบบดังกล่าวควรเลียนแบบการยืดตัวทางกล อัตราการเต้นของหัวใจ และคุณสมบัติทางไฟฟ้าสรีรวิทยาที่เปลี่ยนแปลงไป แบบจำลองสัตว์มักใช้เป็นแพลตฟอร์มการคัดกรองสำหรับสรีรวิทยาของหัวใจ แต่มีความน่าเชื่อถือจำกัดในการสะท้อนผลกระทบของยาในหัวใจมนุษย์1,2 ในที่สุด แบบจำลองการทดลองเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อหัวใจในอุดมคติ (CTCM) คือแบบจำลองที่มีความไวและความจำเพาะสูงสำหรับการแทรกแซงทางการรักษาและเภสัชวิทยาต่างๆ โดยจำลองสรีรวิทยาและพยาธิสรีรวิทยาของหัวใจมนุษย์ได้อย่างแม่นยำ3 การขาดระบบดังกล่าวจำกัดการค้นพบวิธีการรักษาใหม่ๆ สำหรับภาวะหัวใจล้มเหลว4,5 และนำไปสู่ความเป็นพิษต่อหัวใจของยาซึ่งเป็นสาเหตุสำคัญที่ทำให้ยาต้องออกจากตลาด6
ในช่วงทศวรรษที่ผ่านมา ยาที่ไม่เกี่ยวกับระบบหัวใจและหลอดเลือดจำนวน 8 ชนิดถูกถอนออกจากการใช้ในทางคลินิก เนื่องจากทำให้ช่วง QT ยาวขึ้น ส่งผลให้เกิดภาวะหัวใจเต้นผิดจังหวะและเสียชีวิตกะทันหัน7 ดังนั้นจึงมีความต้องการเพิ่มมากขึ้นสำหรับกลยุทธ์การคัดกรองก่อนการใช้ในทางคลินิกที่เชื่อถือได้ เพื่อประเมินประสิทธิภาพและความเป็นพิษต่อระบบหัวใจและหลอดเลือด การใช้เซลล์กล้ามเนื้อหัวใจที่ได้จากเซลล์ต้นกำเนิดแบบเหนี่ยวนำให้เป็นเซลล์หลายศักยภาพของมนุษย์ (hiPS-CM) ในการคัดกรองยาและการทดสอบความเป็นพิษเมื่อเร็ว ๆ นี้ เป็นทางออกบางส่วนของปัญหานี้ อย่างไรก็ตาม ลักษณะที่ไม่สมบูรณ์ของ hiPS-CM และการขาดความซับซ้อนของเซลล์หลายเซลล์ของเนื้อเยื่อหัวใจ เป็นข้อจำกัดที่สำคัญของวิธีการนี้ การศึกษาล่าสุดแสดงให้เห็นว่าข้อจำกัดนี้สามารถเอาชนะได้บางส่วนโดยการใช้ hiPS-CM ในระยะเริ่มต้นเพื่อสร้างไฮโดรเจลของเนื้อเยื่อหัวใจหลังจากเริ่มมีการหดตัวโดยธรรมชาติไม่นาน และค่อย ๆ เพิ่มการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าเมื่อเวลาผ่านไป อย่างไรก็ตาม เนื้อเยื่อขนาดเล็กของ hiPS-CM เหล่านี้ขาดคุณสมบัติทางสรีรวิทยาไฟฟ้าและการหดตัวที่สมบูรณ์ของกล้ามเนื้อหัวใจในผู้ใหญ่ นอกจากนี้ เนื้อเยื่อหัวใจของมนุษย์ยังมีโครงสร้างที่ซับซ้อนกว่า โดยประกอบด้วยเซลล์หลายชนิดผสมกันอย่างไม่เป็นระเบียบ รวมถึงเซลล์บุผนังหลอดเลือด เซลล์ประสาท และไฟโบรบลาสต์ในเนื้อเยื่อเกี่ยวพัน ซึ่งเชื่อมต่อกันด้วยโปรตีนเมทริกซ์นอกเซลล์เฉพาะกลุ่ม ความไม่เป็นระเบียบของประชากรเซลล์ที่ไม่ใช่เซลล์กล้ามเนื้อหัวใจ^11,12,13 ในหัวใจของสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมที่โตเต็มวัยนี้ เป็นอุปสรรคสำคัญต่อการสร้างแบบจำลองเนื้อเยื่อหัวใจโดยใช้เซลล์แต่ละชนิด ข้อจำกัดที่สำคัญเหล่านี้เน้นย้ำถึงความสำคัญของการพัฒนาวิธีการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อกล้ามเนื้อหัวใจที่สมบูรณ์ภายใต้สภาวะทางสรีรวิทยาและพยาธิวิทยา
การเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อหัวใจมนุษย์ส่วนบาง (300 µm) ได้รับการพิสูจน์แล้วว่าเป็นแบบจำลองที่มีศักยภาพของกล้ามเนื้อหัวใจมนุษย์ที่สมบูรณ์ วิธีนี้ช่วยให้เข้าถึงระบบหลายเซลล์ 3 มิติที่สมบูรณ์คล้ายกับเนื้อเยื่อหัวใจมนุษย์ อย่างไรก็ตาม จนถึงปี 2019 การใช้เนื้อเยื่อหัวใจที่เพาะเลี้ยงนั้นถูกจำกัดด้วยอายุการอยู่รอดในการเพาะเลี้ยงที่สั้น (24 ชั่วโมง) ซึ่งเป็นผลมาจากหลายปัจจัย รวมถึงการขาดการยืดตัวทางกายภาพและเชิงกล อินเตอร์เฟซระหว่างอากาศและของเหลว และการใช้สื่อเพาะเลี้ยงแบบง่ายๆ ที่ไม่รองรับความต้องการของเนื้อเยื่อหัวใจ ในปี 2019 กลุ่มวิจัยหลายกลุ่มได้แสดงให้เห็นว่าการรวมปัจจัยเชิงกลเข้ากับระบบการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อหัวใจสามารถยืดอายุการเพาะเลี้ยง ปรับปรุงการแสดงออกของหัวใจ และเลียนแบบพยาธิสภาพของหัวใจได้ งานวิจัยที่ยอดเยี่ยมสองชิ้น 17 และ 18 แสดงให้เห็นว่าการรับแรงเชิงกลแบบแกนเดียวมีผลดีต่อฟีโนไทป์ของหัวใจในระหว่างการเพาะเลี้ยง อย่างไรก็ตาม การศึกษาเหล่านี้ไม่ได้ใช้การโหลดทางกายภาพและกลไกสามมิติแบบไดนามิกของวงจรการเต้นของหัวใจ เนื่องจากส่วนของหัวใจถูกโหลดด้วยแรงดึงแบบไอโซเมตริก 17 หรือการโหลดแบบออโซโทนิกเชิงเส้น 18 วิธีการยืดเนื้อเยื่อเหล่านี้ส่งผลให้เกิดการยับยั้งยีนหัวใจหลายตัวหรือการแสดงออกมากเกินไปของยีนที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองต่อการยืดที่ผิดปกติ ที่น่าสังเกตคือ Pitoulis et al. 19 ได้พัฒนาอ่างเพาะเลี้ยงชิ้นส่วนหัวใจแบบไดนามิกสำหรับการสร้างวงจรการเต้นของหัวใจขึ้นใหม่โดยใช้การป้อนกลับของตัวแปลงแรงและตัวขับแรงดึง แม้ว่าระบบนี้จะช่วยให้การสร้างแบบจำลองวงจรการเต้นของหัวใจในหลอดทดลองมีความแม่นยำมากขึ้น แต่ความซับซ้อนและปริมาณงานที่ต่ำของวิธีการนี้จำกัดการใช้งานของระบบนี้ ห้องปฏิบัติการของเราได้พัฒนาระบบเพาะเลี้ยงที่ง่ายขึ้นเมื่อเร็ว ๆ นี้โดยใช้การกระตุ้นด้วยไฟฟ้าและตัวกลางที่เหมาะสมที่สุดเพื่อรักษาความมีชีวิตของชิ้นส่วนเนื้อเยื่อหัวใจหมูและมนุษย์ได้นานถึง 6 วัน20,21
ในเอกสารฉบับนี้ เราได้อธิบายถึงแบบจำลองการเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อหัวใจ (CTCM) โดยใช้ชิ้นส่วนของหัวใจหมู ซึ่งรวมเอาสัญญาณจากสารคัดหลั่งในร่างกายเพื่อจำลองสรีรวิทยาของหัวใจแบบสามมิติและการขยายตัวทางพยาธิสรีรวิทยาในระหว่างวงจรการเต้นของหัวใจ แบบจำลอง CTCM นี้สามารถเพิ่มความแม่นยำในการทำนายผลการทดสอบยาในระยะก่อนคลินิกได้ในระดับที่ไม่เคยมีมาก่อน โดยนำเสนอระบบหัวใจที่มีประสิทธิภาพ คุ้มค่า และรองรับการทดสอบในระดับปานกลาง ซึ่งเลียนแบบสรีรวิทยา/พยาธิสรีรวิทยาของหัวใจสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนมสำหรับการทดสอบยาในระยะก่อนคลินิก
สัญญาณเชิงกลทางโลหิตพลศาสตร์มีบทบาทสำคัญในการรักษาการทำงานของเซลล์กล้ามเนื้อหัวใจในหลอดทดลอง 22,23,24 ในบทความนี้ เราได้พัฒนา CTCM (รูปที่ 1a) ที่สามารถจำลองสภาพแวดล้อมของหัวใจผู้ใหญ่ได้โดยการกระตุ้นทั้งทางไฟฟ้าและเชิงกลที่ความถี่ทางสรีรวิทยา (1.2 Hz, 72 ครั้งต่อนาที) เพื่อหลีกเลี่ยงการยืดเนื้อเยื่อมากเกินไปในช่วงไดแอสโตล จึงใช้อุปกรณ์การพิมพ์ 3 มิติเพื่อเพิ่มขนาดเนื้อเยื่อขึ้น 25% (รูปที่ 1b) การกระตุ้นด้วยไฟฟ้าที่เกิดจากระบบ C-PACE ถูกตั้งเวลาให้เริ่ม 100 มิลลิวินาทีก่อนซิสโตลโดยใช้ระบบเก็บข้อมูลเพื่อจำลองวงจรการเต้นของหัวใจอย่างสมบูรณ์ ระบบเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อใช้แอคทูเอเตอร์แบบนิวแมติกที่ตั้งโปรแกรมได้ (LB Engineering, เยอรมนี) เพื่อขยายเยื่อซิลิโคนที่มีความยืดหยุ่นเป็นวงจร ทำให้เกิดการขยายตัวของชิ้นส่วนหัวใจในห้องด้านบน ระบบเชื่อมต่อกับท่ออากาศภายนอกผ่านตัวแปลงสัญญาณความดัน ซึ่งทำให้สามารถปรับความดัน (± 1 mmHg) และเวลา (± 1 ms) ได้อย่างแม่นยำ (รูปที่ 1c)
a. ติดชิ้นเนื้อเข้ากับวงแหวนรองรับขนาด 7 มม. ที่แสดงเป็นสีน้ำเงิน ภายในห้องเพาะเลี้ยงของอุปกรณ์ ห้องเพาะเลี้ยงแยกจากห้องอากาศด้วยเยื่อซิลิโคนบางๆ ที่ยืดหยุ่นได้ วางปะเก็นระหว่างแต่ละห้องเพื่อป้องกันการรั่วไหล ฝาของอุปกรณ์มีอิเล็กโทรดกราไฟต์ที่ให้การกระตุ้นด้วยไฟฟ้า b. แผนภาพแสดงอุปกรณ์เพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อขนาดใหญ่ วงแหวนนำทาง และวงแหวนรองรับ ชิ้นเนื้อ (สีน้ำตาล) ถูกวางบนอุปกรณ์ขนาดใหญ่ โดยวางวงแหวนนำทางไว้ในร่องที่ขอบด้านนอกของอุปกรณ์ ใช้ตัวนำทางวางวงแหวนรองรับที่เคลือบด้วยกาวอะคริลิกสำหรับเนื้อเยื่ออย่างระมัดระวังลงบนชิ้นเนื้อหัวใจ c. กราฟแสดงเวลาของการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าเป็นฟังก์ชันของความดันในห้องอากาศที่ควบคุมโดยแอคทูเอเตอร์นิวแมติกแบบตั้งโปรแกรมได้ (PPD) ใช้อุปกรณ์เก็บข้อมูลเพื่อซิงโครไนซ์การกระตุ้นด้วยไฟฟ้าโดยใช้เซ็นเซอร์ความดัน เมื่อความดันในห้องเพาะเลี้ยงถึงเกณฑ์ที่ตั้งไว้ สัญญาณพัลส์จะถูกส่งไปยัง C-PACE-EM เพื่อกระตุ้นด้วยไฟฟ้า d. ภาพของ CTCM สี่ตัวที่วางอยู่บนชั้นวางในตู้อบ อุปกรณ์สี่ชิ้นเชื่อมต่อกับ PPD หนึ่งตัวผ่านวงจรลม และมีการติดตั้งเซ็นเซอร์วัดความดันในวาล์วห้ามเลือดเพื่อตรวจสอบความดันในวงจรลม อุปกรณ์แต่ละชิ้นประกอบด้วยชิ้นเนื้อหกชิ้น
โดยใช้แอคทูเอเตอร์แบบนิวแมติกเพียงตัวเดียว เราสามารถควบคุมอุปกรณ์ CTCM ได้ 4 เครื่อง โดยแต่ละเครื่องสามารถบรรจุชิ้นเนื้อได้ 6 ชิ้น (รูปที่ 1d) ใน CTCM ความดันอากาศในห้องอากาศจะถูกแปลงเป็นความดันแบบซิงโครนัสในห้องของเหลวและกระตุ้นให้ชิ้นเนื้อหัวใจขยายตัวตามสรีรวิทยา (รูปที่ 2a และวิดีโอเสริม 1) การประเมินการยืดตัวของเนื้อเยื่อที่ความดัน 80 มม.ปรอท แสดงให้เห็นว่าชิ้นเนื้อยืดตัวขึ้น 25% (รูปที่ 2b) เปอร์เซ็นต์การยืดตัวนี้แสดงให้เห็นว่าสอดคล้องกับความยาวของซาร์โคเมียร์ตามสรีรวิทยาที่ 2.2–2.3 µm สำหรับการหดตัวของชิ้นเนื้อหัวใจปกติ17,19,25 การเคลื่อนที่ของเนื้อเยื่อได้รับการประเมินโดยใช้การตั้งค่ากล้องแบบกำหนดเอง (รูปเสริม 1) แอมพลิจูดและความเร็วของการเคลื่อนที่ของเนื้อเยื่อ (รูปที่ 2c, d) สอดคล้องกับการยืดตัวในช่วงรอบการเต้นของหัวใจและเวลาในช่วงซิสโตลและไดแอสโตล (รูปที่ 2b) การยืดตัวและความเร็วของเนื้อเยื่อหัวใจระหว่างการหดตัวและการคลายตัวยังคงที่ตลอด 12 วันในการเพาะเลี้ยง (รูปที่ 2f) เพื่อประเมินผลของการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าต่อการหดตัวระหว่างการเพาะเลี้ยง เราได้พัฒนาวิธีการกำหนดความผิดปกติที่เกิดขึ้นโดยใช้อัลกอริทึมการแรเงา (รูปเพิ่มเติมที่ 2a,b) และสามารถแยกแยะความผิดปกติที่มีและไม่มีการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าได้ ในส่วนเดียวกันของหัวใจ (รูปที่ 2f) ในบริเวณที่เคลื่อนที่ได้ของส่วนที่ตัด (R6-9) แรงดันไฟฟ้าในระหว่างการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าสูงกว่าในกรณีที่ไม่มีการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าถึง 20% ซึ่งบ่งชี้ว่าการกระตุ้นด้วยไฟฟ้ามีส่วนช่วยต่อการทำงานของการหดตัว
a) ร่องรอยตัวอย่างของการวัดความดันในห้องอากาศ ความดันในห้องของเหลว และการเคลื่อนที่ของเนื้อเยื่อ ยืนยันว่าการเปลี่ยนแปลงความดันในห้องส่งผลต่อความดันในห้องของเหลว ทำให้เกิดการเคลื่อนที่ของชิ้นเนื้อที่สอดคล้องกัน b) ร่องรอยตัวอย่างของเปอร์เซ็นต์การยืด (สีน้ำเงิน) ของส่วนเนื้อเยื่อที่สอดคล้องกับเปอร์เซ็นต์การยืด (สีส้ม) c) การเคลื่อนที่ที่วัดได้ของชิ้นเนื้อหัวใจสอดคล้องกับความเร็วของการเคลื่อนที่ที่วัดได้ (d) วิถีการเคลื่อนที่แบบวงจร (เส้นสีน้ำเงิน) และความเร็ว (เส้นประสีส้ม) ในชิ้นเนื้อหัวใจ e) การหาปริมาณเวลาของวงจร (n = 19 ชิ้นต่อกลุ่ม จากหมูที่ต่างกัน) เวลาการหดตัว (n = 19 ชิ้นต่อกลุ่ม) เวลาการคลายตัว (n = 19 ชิ้นต่อกลุ่ม จากหมูที่ต่างกัน) การเคลื่อนที่ของเนื้อเยื่อ (n = 25) (ชิ้นเนื้อ)/กลุ่มจากสุกรต่างกัน), ความเร็วซิสโตลิกสูงสุด (n = 24(D0), 25(D12) ชิ้นเนื้อ/กลุ่มจากสุกรต่างกัน) และอัตราการคลายตัวสูงสุด (n=24(D0), 25(D12) ชิ้นเนื้อ/กลุ่มจากสุกรต่างกัน) การทดสอบ t-test แบบสองด้านของ Student แสดงให้เห็นว่าไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในพารามิเตอร์ใดๆ f ร่องรอยการวิเคราะห์ความเครียดที่เป็นตัวแทนของส่วนตัดเนื้อเยื่อที่มี (สีแดง) และไม่มี (สีน้ำเงิน) การกระตุ้นด้วยไฟฟ้า บริเวณ 10 บริเวณของส่วนตัดเนื้อเยื่อจากส่วนเดียวกัน แผงด้านล่างแสดงการหาปริมาณความแตกต่างของเปอร์เซ็นต์ในความเครียดในส่วนตัดเนื้อเยื่อที่มีและไม่มีการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าใน 10 บริเวณจากส่วนต่างๆ (n = 8 ชิ้น/กลุ่ม จากสุกรต่างกัน ทำการทดสอบ t-test แบบสองด้าน ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05) (n = 8 ชิ้น/กลุ่ม จากสุกรต่างกัน ทำการทดสอบ t-test แบบสองด้าน ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05) (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05) (n = 8 ส่วน/กลุ่ม จากสุกรที่ต่างกัน การทดสอบ t ของ Student แบบสองด้าน ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05) （n = 8 ฝา/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验;****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 （n = 8 ฝา/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验;****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05) (n = 8 ส่วน/กลุ่ม จากสุกรต่างกัน การทดสอบ t ของ Student แบบสองด้าน ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05)แถบแสดงความคลาดเคลื่อนแสดงค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน
ในระบบการเพาะเลี้ยงชิ้นเนื้อหัวใจเลียนแบบชีวภาพแบบคงที่ก่อนหน้านี้ของเรา [20, 21] เราสามารถรักษาความมีชีวิต การทำงาน และความสมบูรณ์ของโครงสร้างของชิ้นเนื้อหัวใจได้นาน 6 วันโดยการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าและปรับองค์ประกอบของอาหารเลี้ยงเชื้อให้เหมาะสม อย่างไรก็ตาม หลังจาก 10 วัน ตัวเลขเหล่านี้ลดลงอย่างรวดเร็ว เราจะเรียกชิ้นส่วนที่เพาะเลี้ยงในระบบการเพาะเลี้ยงเลียนแบบชีวภาพแบบคงที่ก่อนหน้านี้ของเรา 20, 21 ว่าสภาวะควบคุม (Ctrl) และเราจะใช้อาหารเลี้ยงเชื้อที่ปรับให้เหมาะสมก่อนหน้านี้ของเราเป็นสภาวะ MC และการเพาะเลี้ยงภายใต้การกระตุ้นทางกลและไฟฟ้าพร้อมกัน (CTCM) ก่อนอื่น เราพบว่าการกระตุ้นทางกลโดยไม่มีการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าไม่เพียงพอที่จะรักษาความมีชีวิตของเนื้อเยื่อได้นาน 6 วัน (ภาพประกอบเพิ่มเติม 3a,b) ที่น่าสนใจคือ เมื่อมีการนำการกระตุ้นทางกายภาพ-กลและไฟฟ้าโดยใช้ STCM มาใช้ ความมีชีวิตของชิ้นส่วนหัวใจอายุ 12 วันยังคงเหมือนกับชิ้นส่วนหัวใจสดภายใต้สภาวะ MS แต่ไม่เหมือนกับภายใต้สภาวะ Ctrl ดังแสดงโดยการวิเคราะห์ MTT (รูปที่ 1 3a) สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่าการกระตุ้นทางกลและการจำลองวงจรการเต้นของหัวใจสามารถทำให้ชิ้นเนื้อมีชีวิตได้นานเป็นสองเท่าของที่รายงานไว้ในระบบการเพาะเลี้ยงแบบคงที่ก่อนหน้านี้ของเรา อย่างไรก็ตาม การประเมินความสมบูรณ์ของโครงสร้างชิ้นเนื้อโดยการติดฉลากภูมิคุ้มกันของโทรโปนิน T และคอนเน็กซิน 43 ของหัวใจแสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของคอนเน็กซิน 43 สูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญในเนื้อเยื่อ MC ในวันที่ 12 เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุมในวันเดียวกัน อย่างไรก็ตาม การแสดงออกของคอนเน็กซิน 43 ที่สม่ำเสมอและการก่อตัวของแผ่น Z ไม่ได้รับการรักษาไว้อย่างสมบูรณ์ (รูปที่ 3b) เราใช้กรอบงานปัญญาประดิษฐ์ (AI) เพื่อวัดปริมาณความสมบูรณ์ของโครงสร้างเนื้อเยื่อ26 ซึ่งเป็นไปป์ไลน์การเรียนรู้เชิงลึกแบบอิงรูปภาพโดยอาศัยการย้อมสีโทรโปนิน T และคอนเน็กซิน43 เพื่อวัดปริมาณความสมบูรณ์ของโครงสร้างและการเรืองแสงของชิ้นเนื้อหัวใจโดยอัตโนมัติในแง่ของความแรงของการระบุตำแหน่ง วิธีนี้ใช้โครงข่ายประสาทเทียมแบบ Convolutional Neural Network (CNN) และกรอบงานการเรียนรู้เชิงลึกเพื่อวัดปริมาณความสมบูรณ์ของโครงสร้างของเนื้อเยื่อหัวใจได้อย่างน่าเชื่อถือในลักษณะอัตโนมัติและไม่ลำเอียง ดังที่อธิบายไว้ในเอกสารอ้างอิง 26. เนื้อเยื่อ MC แสดงให้เห็นความคล้ายคลึงทางโครงสร้างที่ดีขึ้นเมื่อเทียบกับวันที่ 0 เมื่อเปรียบเทียบกับส่วนควบคุมแบบคงที่ นอกจากนี้ การย้อมสีไตรโครมของ Masson ยังเผยให้เห็นเปอร์เซ็นต์ของพังผืดที่ลดลงอย่างมีนัยสำคัญภายใต้สภาวะ MS เมื่อเทียบกับสภาวะควบคุมในวันที่ 12 ของการเพาะเลี้ยง (รูปที่ 3c) แม้ว่า CTCM จะเพิ่มความมีชีวิตของส่วนเนื้อเยื่อหัวใจในวันที่ 12 ให้มีระดับใกล้เคียงกับเนื้อเยื่อหัวใจสด แต่ก็ไม่ได้ปรับปรุงความสมบูรณ์ของโครงสร้างของส่วนเนื้อเยื่อหัวใจอย่างมีนัยสำคัญ
กราฟแท่งแสดงปริมาณความมีชีวิตของชิ้นเนื้อหัวใจสด (D0) หรือชิ้นเนื้อหัวใจที่เพาะเลี้ยงเป็นเวลา 12 วัน โดยการเพาะเลี้ยงแบบคงที่ (D12 Ctrl) หรือใน CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) ชิ้น/กลุ่ม จากสุกรต่างกัน ทำการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว; ####p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D0 และ **p < 0.01 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl) กราฟแท่งแสดงปริมาณความมีชีวิตของเซลล์หัวใจสด (D0) หรือเซลล์หัวใจที่เพาะเลี้ยงเป็นเวลา 12 วัน โดยทดสอบด้วยวิธี MTT ทั้งในรูปแบบการเพาะเลี้ยงแบบคงที่ (D12 Ctrl) หรือใน CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) ชิ้น/กลุ่ม จากสุกรต่างกัน ทำการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว; ####p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D0 และ **p < 0.01 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl)ฮิสโตแกรมแสดงปริมาณความมีชีวิตของชิ้นส่วนหัวใจสด MTT (D0) หรือการเพาะเลี้ยงชิ้นส่วนหัวใจเป็นเวลา 12 วันในสภาวะการเพาะเลี้ยงแบบคงที่ (D12 ควบคุม) หรือ CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 ควบคุม)) ) 12 (D12 MC) ชิ้นส่วน/กลุ่ม จากสุกรที่ต่างกัน โดยทำการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl) ####p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D0 และ **p < 0.01 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl) a 条形Image显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜heart脏切上(D0) 或heart脏切本培养12 天的MTT活力的量化),来自不同猪的12 (D12 MC) 切组/组,进行单向ANOVA 测试;与D0 相比,####p < 0.0001,与D12 Ctrl 相比,**p < 0.01)。 a 条形Image显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜heart脏切上(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC)切组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p。)ฮิสโตแกรมแสดงการหาปริมาณความมีชีวิตของเซลล์ด้วยวิธี MTT ในชิ้นเนื้อหัวใจสด (D0) หรือชิ้นเนื้อหัวใจที่เพาะเลี้ยงเป็นเวลา 12 วันในสภาวะคงที่ (D12 ควบคุม) หรือใน CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 ควบคุม)) โดยแต่ละกลุ่มมี 12 ชิ้น (D12 MC) จากสุกรที่ต่างกัน ทดสอบด้วย ANOVA แบบทางเดียว####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl) ####p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D0, **p < 0.01 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl)b. ภาพแสดงการเรืองแสงของ Troponin-T (สีเขียว), Connexin 43 (สีแดง) และ DAPI (สีน้ำเงิน) ในชิ้นส่วนหัวใจที่แยกออกมาใหม่ (D0) หรือชิ้นส่วนหัวใจที่เพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะคงที่ (Ctrl) หรือสภาวะ CTCM (MC) เป็นเวลา 12 วัน (มาตราส่วนว่าง = 100 µm) การวัดปริมาณความสมบูรณ์ของโครงสร้างเนื้อเยื่อหัวใจด้วยปัญญาประดิษฐ์ (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ชิ้นเนื้อ/กลุ่ม จากหมูที่ต่างกัน โดยทำการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว; ####p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D0 และ ****p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl) การวัดปริมาณความสมบูรณ์ของโครงสร้างเนื้อเยื่อหัวใจด้วยปัญญาประดิษฐ์ (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ชิ้นเนื้อ/กลุ่ม จากสุกรต่างกัน ทำการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว; ####p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D0 และ ****p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl) Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl) การวัดปริมาณความสมบูรณ์ของโครงสร้างเนื้อเยื่อหัวใจด้วยปัญญาประดิษฐ์ (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ส่วน/กลุ่มจากสุกรต่างกัน ทำการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว; ####p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D0 และ ****p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl)人工智能量化จิตวิญญาณ脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ชิ้น/กลุ่ม แต่ละหมูที่แตกต่างกัน, การทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว;####p < 0.0001 ถึง D0 相比,****p < 0.0001 ถึง D12 Ctrl 相比)人工智能量化จิตวิญญาณ脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ชิ้น/กลุ่ม แต่ละหมูที่แตกต่างกัน, การทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว;####p < 0.0001 ถึง D0相比,****p < 0.0001 ถึง D12 Ctrl 相比) Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl) ปัญญาประดิษฐ์เพื่อวัดปริมาณความสมบูรณ์ของโครงสร้างเนื้อเยื่อหัวใจ (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ส่วน/กลุ่ม จากสุกรที่แตกต่างกัน การทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว; ####p<0.0001 เทียบกับ D0 สำหรับการเปรียบเทียบ ****p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl) c. ภาพตัวอย่าง (ซ้าย) และการวิเคราะห์เชิงปริมาณ (ขวา) สำหรับชิ้นเนื้อหัวใจที่ย้อมด้วยสี Masson's trichrome (มาตราส่วน = 500 µm) (n = 10 ชิ้น/กลุ่ม จากหมูต่างกัน ทำการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว; ####p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D0 และ ***p < 0.001 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl) c. ภาพตัวอย่าง (ซ้าย) และการวิเคราะห์เชิงปริมาณ (ขวา) สำหรับชิ้นเนื้อหัวใจที่ย้อมด้วยสี Masson's trichrome (มาตราส่วน = 500 µm) (n = 10 ชิ้น/กลุ่ม จากสุกรต่างกัน ทำการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว; #### p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D0 และ ***p < 0.001 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl) c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl) c. ภาพตัวอย่าง (ซ้าย) และการวัดปริมาณ (ขวา) ของส่วนตัดหัวใจที่ย้อมด้วยสี Masson's trichrome (มาตราส่วนที่ไม่เคลือบ = 500 µm) (n = 10 ส่วนตัด/กลุ่ม จากสุกรต่างกัน ทำการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว; #### p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D0 และ ***p < 0.001 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl) c 用Masson 三色染料染色的heart脏切的代表性Images（左）和量化（右）（裸尺度= 500 µm）（n = 10 คลิกตกลง/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试;#### p < 0.0001 与D0 相比,***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比). C 用masson 三 色 染料 的 heart脏 切ע 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度 裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切พรีเมี่ยม 组 每 组 来自 不同 猪 , 进行 单向 单向 Anova 测试;#### p < 0.0001 与D0 相比,***p < 0.001 ที่ D12 Ctrl 相比). c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c. ภาพตัวอย่าง (ซ้าย) และการวัดปริมาณ (ขวา) ของส่วนตัดหัวใจที่ย้อมด้วยสี Masson's trichrome (ตัวอย่างควบคุม = 500 µm) (n = 10 ส่วนตัด/กลุ่ม แต่ละส่วนตัดมาจากหมูที่แตกต่างกัน ทดสอบโดยการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบทางเดียว ;### # p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D0, ***p < 0.001 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl)แถบแสดงความคลาดเคลื่อนแสดงค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน
เราตั้งสมมติฐานว่าการเติมโมเลกุลขนาดเล็กในอาหารเลี้ยงเซลล์จะช่วยปรับปรุงความสมบูรณ์ของเซลล์กล้ามเนื้อหัวใจและลดการเกิดพังผืดในระหว่างการเพาะเลี้ยง CTCM ดังนั้นเราจึงทำการคัดกรองโมเลกุลขนาดเล็กโดยใช้กลุ่มควบคุมคงที่ของเรา20,21 เนื่องจากมีปัจจัยรบกวนน้อย เราเลือกเดกซาเมทาโซน (Dex), ไตรไอโอโดไทโรนีน (T3) และ SB431542 (SB) สำหรับการคัดกรองนี้ โมเลกุลขนาดเล็กเหล่านี้เคยถูกนำมาใช้ในการเพาะเลี้ยง hiPSC-CM เพื่อกระตุ้นการเจริญเติบโตของเซลล์กล้ามเนื้อหัวใจโดยการเพิ่มความยาวของซาร์โคเมียร์ ท่อ T และความเร็วในการนำไฟฟ้า นอกจากนี้ ทั้งเดกซาเมทาโซน (กลูโคคอร์ติคอยด์) และ SB ยังเป็นที่ทราบกันดีว่าสามารถยับยั้งการอักเสบได้29,30 ดังนั้นเราจึงทดสอบว่าการรวมโมเลกุลขนาดเล็กหนึ่งตัวหรือหลายตัวเข้าด้วยกันจะช่วยปรับปรุงความสมบูรณ์ของโครงสร้างของส่วนต่างๆ ของหัวใจได้หรือไม่ สำหรับการคัดกรองเบื้องต้น ปริมาณของสารประกอบแต่ละชนิดถูกเลือกโดยอิงจากความเข้มข้นที่ใช้กันทั่วไปในแบบจำลองการเพาะเลี้ยงเซลล์ (1 μM Dex27, 100 nM T327 และ 2.5 μM SB31) หลังจากการเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 12 วัน การใช้ T3 และ Dex ร่วมกันส่งผลให้โครงสร้างของเซลล์กล้ามเนื้อหัวใจมีความสมบูรณ์สูงสุดและมีการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างเป็นเส้นใยน้อยที่สุด (ภาพประกอบเพิ่มเติมที่ 4 และ 5) นอกจากนี้ การใช้ T3 และ Dex ในความเข้มข้นเป็นสองเท่าหรือมากกว่าสองเท่าของความเข้มข้นปกติ ทำให้เกิดผลเสียเมื่อเทียบกับความเข้มข้นปกติ (ภาพประกอบเพิ่มเติมที่ 6a,b)
หลังจากการคัดกรองเบื้องต้น เราได้ทำการเปรียบเทียบโดยตรงระหว่างสภาวะการเพาะเลี้ยง 4 สภาวะ (รูปที่ 4a): Ctrl: ชิ้นส่วนหัวใจที่เพาะเลี้ยงในสภาวะการเพาะเลี้ยงแบบคงที่ที่เราได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดยใช้ตัวกลางที่ได้รับการปรับให้เหมาะสมแล้ว; 20.21 TD: T3 และ Ctrl ที่เติม Dex ในวันพุธ; MC: ชิ้นส่วนหัวใจที่เพาะเลี้ยงใน CTCM โดยใช้ตัวกลางที่ได้รับการปรับให้เหมาะสมแล้วก่อนหน้านี้; และ MT: CTCM ที่เติม T3 และ Dex ลงในตัวกลาง หลังจากการเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 12 วัน ความมีชีวิตของเนื้อเยื่อ MS และ MT ยังคงเหมือนกับเนื้อเยื่อสดที่ประเมินโดยการทดสอบ MTT (รูปที่ 4b) ที่น่าสนใจคือ การเติม T3 และ Dex ลงในวัฒนธรรมแบบทรานส์เวลล์ (TD) ไม่ได้ส่งผลให้ความมีชีวิตดีขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับสภาวะ Ctrl ซึ่งบ่งชี้ถึงบทบาทสำคัญของการกระตุ้นทางกลในการรักษาความมีชีวิตของชิ้นส่วนหัวใจ
แผนภาพการออกแบบการทดลองแสดงสภาวะการเพาะเลี้ยงทั้งสี่แบบที่ใช้ในการประเมินผลกระทบของการกระตุ้นทางกลและการเสริม T3/Dex ในตัวกลางเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 12 วัน b. กราฟแท่งแสดงปริมาณความมีชีวิตรอด 12 วันหลังการเพาะเลี้ยงในสภาวะการเพาะเลี้ยงทั้ง 4 แบบ (Ctrl, TD, MC และ MT) เมื่อเทียบกับชิ้นเนื้อหัวใจสด (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MT), 12 (D12 MC) ชิ้น/กลุ่ม จากสุกรต่างกัน ทำการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 เมื่อเทียบกับ D0 และ **p < 0.01 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl) b. กราฟแท่งแสดงปริมาณความมีชีวิตรอด 12 วันหลังการเพาะเลี้ยงในสภาวะการเพาะเลี้ยงทั้ง 4 แบบ (Ctrl, TD, MC และ MT) เมื่อเทียบกับชิ้นเนื้อหัวใจสด (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MT), 12 (D12 MC) ชิ้น/กลุ่ม จากสุกรต่างกัน ทำการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 เมื่อเทียบกับ D0 และ **p < 0.01 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl) b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl) b. กราฟแท่งแสดงปริมาณความมีชีวิตรอด ณ วันที่ 12 หลังการเพาะเลี้ยงในสภาวะการเพาะเลี้ยงทั้ง 4 สภาวะ (ควบคุม, TD, MC และ MT) เมื่อเทียบกับชิ้นส่วนหัวใจสด (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MT), 12 (D12 MC) ชิ้นส่วน/กลุ่ม จากสุกรต่างกัน การทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 เทียบกับ D0 และ **p < 0.01 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl) b 条形Image显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜heart脏切 วอลล์เปเปอร์(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 与D0 相比，**p < 0.01与D12控制).b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MT), หรือ 12 (D12 MC) ให้เลือก, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b. ฮิสโตแกรมแสดงสภาวะการเพาะเลี้ยงทั้ง 4 แบบ (ควบคุม, TD, MC และ MT) เปรียบเทียบกับชิ้นส่วนหัวใจสด (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MT) จากสุกรที่แตกต่างกัน 12 (D12 MC) ชิ้นส่วน/กลุ่ม การทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว; ####p<0.0001, ###p<0.001 เทียบกับ D0, **p<0.01 เทียบกับกลุ่มควบคุม D12) ค. กราฟแท่งแสดงปริมาณการไหลของกลูโคส 12 วันหลังการเพาะเลี้ยงในสภาวะการเพาะเลี้ยงทั้ง 4 แบบ (Ctrl, TD, MC และ MT) เมื่อเทียบกับชิ้นเนื้อหัวใจสด (D0) (n = 6 ชิ้น/กลุ่ม จากสุกรต่างกัน ทำการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว; ###p < 0.001 เมื่อเทียบกับ D0 และ ***p < 0.001 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl) ค. กราฟแท่งแสดงปริมาณการไหลของกลูโคส 12 วันหลังการเพาะเลี้ยงในสภาวะการเพาะเลี้ยงทั้ง 4 แบบ (Ctrl, TD, MC และ MT) เมื่อเทียบกับชิ้นเนื้อหัวใจสด (D0) (n = 6 ชิ้น/กลุ่ม จากสุกรต่างกัน ทำการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว; ###p < 0.001 เมื่อเทียบกับ D0 และ ***p < 0.001 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl) c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 และ ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl) c. ฮิสโตแกรมแสดงปริมาณการไหลของกลูโคส 12 วันหลังการเพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะการเพาะเลี้ยงทั้ง 4 แบบ (ควบคุม, TD, MC และ MT) เมื่อเทียบกับชิ้นส่วนหัวใจสด (D0) (n = 6 ชิ้นส่วน/กลุ่ม จากสุกรต่างกัน ทำการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว ; ###p < 0.001 เมื่อเทียบกับ D0 และ ***p < 0.001 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl) c 条形上显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜heart脏切 วอลล์เปเปอร์(D0) 相比，培养后12 天的葡萄糖通量定量（n = 6 รูปภาพ/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试;###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形Image 显示 所มี 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 heart脏 切ئ 切ئ 切相比 ， 培养 后 后 12 天 的通量 定量 （n = 6 ฝา/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单向执行ANOVA 测试;###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比). c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль) c. ฮิสโตแกรมแสดงปริมาณการไหลของกลูโคสที่ 12 วันหลังการเพาะเลี้ยงสำหรับสภาวะการเพาะเลี้ยงทั้ง 4 แบบ (ควบคุม, TD, MC และ MT) เปรียบเทียบกับชิ้นส่วนหัวใจสด (D0) (n = 6 ชิ้นส่วน/กลุ่ม จากสุกรต่างกัน ข้างเดียว) ทำการทดสอบ ANOVA แล้ว ###p < 0.001 เมื่อเทียบกับ D0, ***p < 0.001 เมื่อเทียบกับ D12 (ควบคุม)d. แผนภาพการวิเคราะห์สายพันธุ์ของเนื้อเยื่อสด (สีน้ำเงิน), เนื้อเยื่อ MC วันที่ 12 (สีเขียว) และเนื้อเยื่อ MT วันที่ 12 (สีแดง) ณ จุดตัดเนื้อเยื่อ 10 จุด (n = 4 ชิ้น/กลุ่ม, การทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว; ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกลุ่ม) e. แผนภาพภูเขาไฟแสดงยีนที่แสดงออกแตกต่างกันในชิ้นเนื้อหัวใจสด (D0) เมื่อเทียบกับชิ้นเนื้อหัวใจที่เพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะคงที่ (Ctrl) หรือภายใต้สภาวะ MT (MT) เป็นเวลา 10-12 วัน f. แผนภาพความร้อนของยีนซาร์โคเมียร์สำหรับชิ้นเนื้อหัวใจที่เพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะการเพาะเลี้ยงแต่ละแบบ แถบแสดงข้อผิดพลาดแสดงค่าเฉลี่ย ± ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน
การพึ่งพาการเผาผลาญโดยการเปลี่ยนจากการออกซิเดชันของกรดไขมันไปเป็นไกลโคไลซิสเป็นลักษณะเด่นของการลดระดับความแตกต่างของเซลล์กล้ามเนื้อหัวใจ เซลล์กล้ามเนื้อหัวใจที่ยังไม่เจริญเต็มที่ส่วนใหญ่ใช้กลูโคสในการผลิต ATP และมีไมโทคอนเดรียที่มีขนาดเล็กกว่าปกติและมีคริสตาเพียงเล็กน้อย5,32 การวิเคราะห์การใช้กลูโคสแสดงให้เห็นว่าภายใต้สภาวะ MC และ MT การใช้กลูโคสคล้ายคลึงกับเนื้อเยื่อในวันที่ 0 (รูปที่ 4c) อย่างไรก็ตาม ตัวอย่าง Ctrl แสดงให้เห็นการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในการใช้กลูโคสเมื่อเทียบกับเนื้อเยื่อสด ซึ่งบ่งชี้ว่าการรวมกันของ CTCM และ T3/Dex ช่วยเพิ่มความมีชีวิตของเนื้อเยื่อและรักษารูปแบบการเผาผลาญของส่วนหัวใจที่เพาะเลี้ยงเป็นเวลา 12 วัน นอกจากนี้ การวิเคราะห์สายพันธุ์แสดงให้เห็นว่าระดับสายพันธุ์ยังคงเหมือนกับในเนื้อเยื่อหัวใจสดเป็นเวลา 12 วันภายใต้สภาวะ MT และ MS (รูปที่ 4d)
เพื่อวิเคราะห์ผลกระทบโดยรวมของ CTCM และ T3/Dex ต่อภาพรวมของการถอดรหัสทางพันธุกรรมของเนื้อเยื่อหัวใจ เราได้ทำการวิเคราะห์ RNAseq ในชิ้นเนื้อหัวใจจากสภาวะการเพาะเลี้ยงทั้งสี่แบบ (ข้อมูลเสริม 1) ที่น่าสนใจคือ ชิ้นเนื้อ MT แสดงความคล้ายคลึงกันของการถอดรหัสทางพันธุกรรมสูงกับเนื้อเยื่อหัวใจสด โดยมีเพียง 16 ยีนที่แสดงออกแตกต่างกันจากทั้งหมด 13,642 ยีน อย่างไรก็ตาม ดังที่เราได้แสดงไว้ก่อนหน้านี้ ชิ้นเนื้อ Ctrl แสดงยีนที่แสดงออกแตกต่างกัน 1229 ยีนหลังจากเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 10-12 วัน (รูปที่ 4e) ข้อมูลเหล่านี้ได้รับการยืนยันโดย qRT-PCR ของยีนหัวใจและไฟโบรบลาสต์ (รูปเสริม 7a-c) ที่น่าสนใจคือ ชิ้นเนื้อ Ctrl แสดงการลดลงของการแสดงออกของยีนหัวใจและยีนวงจรเซลล์ และการกระตุ้นโปรแกรมยีนอักเสบ ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าการลดระดับความแตกต่างของเซลล์ ซึ่งปกติจะเกิดขึ้นหลังจากการเพาะเลี้ยงเป็นเวลานาน จะถูกยับยั้งอย่างสมบูรณ์ภายใต้สภาวะ MT (รูปเสริม 8a,b) จากการศึกษาอย่างละเอียดเกี่ยวกับยีนซาร์โคเมียร์ พบว่าภายใต้สภาวะ MT เท่านั้นที่ยีนที่เข้ารหัสซาร์โคเมียร์ (รูปที่ 4f) และช่องไอออน (รูปเพิ่มเติมที่ 9) จะได้รับการอนุรักษ์ไว้ ป้องกันไม่ให้ถูกยับยั้งภายใต้สภาวะ Ctrl, TD และ MC ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่า ด้วยการกระตุ้นทางกลและทางเคมีร่วมกัน (T3/Dex) ทรานสคริปโตมของชิ้นเนื้อหัวใจสามารถคงสภาพคล้ายกับชิ้นเนื้อหัวใจสดได้หลังจากเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 12 วัน
ผลการศึกษาการถอดรหัสทางพันธุกรรมเหล่านี้ได้รับการสนับสนุนจากข้อเท็จจริงที่ว่าโครงสร้างของเซลล์กล้ามเนื้อหัวใจในส่วนตัดของหัวใจได้รับการรักษาไว้ได้ดีที่สุดภายใต้สภาวะ MT เป็นเวลา 12 วัน ดังแสดงโดยคอนเน็กซิน 43 ที่ยังคงสภาพสมบูรณ์และอยู่เฉพาะที่ (รูปที่ 5a) นอกจากนี้ พังผืดในส่วนตัดของหัวใจภายใต้สภาวะ MT ลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม และคล้ายกับส่วนตัดของหัวใจสด (รูปที่ 5b) ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการกระตุ้นทางกลร่วมกับการรักษาด้วย T3/Dex ช่วยรักษาสภาพโครงสร้างของหัวใจในส่วนตัดของหัวใจที่เพาะเลี้ยงได้อย่างมีประสิทธิภาพ
a ภาพแสดงตัวอย่างการย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ของโทรโปนิน-ที (สีเขียว), คอนเน็กซิน 43 (สีแดง) และ DAPI (สีน้ำเงิน) ในชิ้นเนื้อหัวใจที่แยกออกมาใหม่ (D0) หรือชิ้นเนื้อหัวใจที่เพาะเลี้ยงเป็นเวลา 12 วันในสภาวะการเพาะเลี้ยงชิ้นเนื้อหัวใจทั้งสี่แบบ (แถบมาตราส่วน = 100 µm) การวัดปริมาณความสมบูรณ์ของโครงสร้างเนื้อเยื่อหัวใจด้วยปัญญาประดิษฐ์ (n = 7 (D0 และ D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC และ D12 MT) ชิ้น/กลุ่ม จากสุกรต่างกัน ทำการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว; ####p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D0 และ *p < 0.05 หรือ ****p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl) การวัดปริมาณความสมบูรณ์ของโครงสร้างเนื้อเยื่อหัวใจด้วยปัญญาประดิษฐ์ (n = 7 (D0 และ D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC และ D12 MT) ชิ้น/กลุ่ม จากสุกรต่างกัน ทำการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว; #### p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D0 และ *p < 0.05 หรือ ****p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl) Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 และ D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 หรือ ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl) การวัดปริมาณความสมบูรณ์ของโครงสร้างเนื้อเยื่อหัวใจโดยใช้ปัญญาประดิษฐ์ (n = 7 (D0 และ D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC และ D12 MT) ส่วน/กลุ่ม จากสุกรที่ต่างกัน ทำการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว; #### p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D0 และ *p < 0.05 หรือ ****p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl)对不同猪的heart脏组结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切ス/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试;#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl相比).对 不同 猪 的 heart脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组） 人工 智能量 化进行 单向 单向 测试 ; ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或***p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比).การวัดปริมาณความสมบูรณ์ของโครงสร้างเนื้อเยื่อหัวใจโดยใช้ปัญญาประดิษฐ์ในสุกรที่แตกต่างกัน (n = 7 (D0 และ D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC และ D12 MT) ส่วน/กลุ่ม) ด้วยการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl) #### p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D0 และ *p < 0.05 หรือ ****p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl) b. ภาพตัวอย่างและการหาปริมาณของชิ้นเนื้อหัวใจที่ย้อมด้วยสี Masson's trichrome (แถบมาตราส่วน = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MC), 9 (D12 MT) ชิ้น/กลุ่ม จากสุกรที่ต่างกัน ทำการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว; ####p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D0 และ ***p < 0.001 หรือ ****p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl) b. ภาพตัวอย่างและการหาปริมาณของชิ้นเนื้อหัวใจที่ย้อมด้วยสี Masson's trichrome (แถบมาตราส่วน = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MC), 9 (D12 MT) ชิ้น/กลุ่ม จากสุกรที่ต่างกัน ทำการทดสอบ ANOVA แบบทางเดียว; ####p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D0 และ ***p < 0.001 หรือ ****p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl) b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний การวิเคราะห์ความแปรปรวน; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl) b. ภาพตัวอย่างและการหาปริมาณของชิ้นส่วนหัวใจที่ย้อมด้วยสี Masson's trichrome (แถบมาตราส่วน = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MC), 9 (D12 MT) ชิ้นส่วน/กลุ่ม จากสุกรที่ต่างกัน ทำการวิเคราะห์ความแปรปรวนทางเดียว (ANOVA); ####p < 0.0001 เทียบกับ D0 และ ***p < 0.001 หรือ ****p < 0.0001 เทียบกับ D12 Ctrl) b 用Masson 三色染料染色的的代表性和量化（比例尺= 500 µm）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切组，进行单因素方差分析;####p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 ที่ D12 Ctrl 相比). b 用 แมสสัน 三 色 染料 的 heart脏 切โฟกัส 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl 、 d12 td和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切โฟกัส 切lust 切lust 切lust 切ئ 切ئ 切ئ 切ע 切ע 切文 切り 切ئ 切素 切 切ئ 切ئ 切ע/组,进行单因素方差分析;####p < 0.0001 与D0 相比,***p < 0.001,或****p < 0.0001 ถึง D12 Ctrl 相比) b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка) = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 หรือ ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl) b. ภาพตัวอย่างและการหาปริมาณของชิ้นส่วนหัวใจที่ย้อมด้วยสีไตรโครมของมาสสัน (แถบมาตราส่วน = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD และ D12 MC), 9 (D12 MT) ชิ้นส่วนจากสุกรต่างกัน/กลุ่ม, วิธี ANOVA หนึ่งวิธี; ####p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D0, ***p < 0.001 หรือ ****p < 0.0001 เมื่อเทียบกับ D12 Ctrl)แถบแสดงความคลาดเคลื่อนแสดงค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน
สุดท้ายนี้ ความสามารถของ CTCM ในการเลียนแบบภาวะหัวใจโตถูกประเมินโดยการเพิ่มการยืดตัวของเนื้อเยื่อหัวใจ ใน CTCM ความดันสูงสุดในห้องอากาศเพิ่มขึ้นจาก 80 mmHg เป็น 80 mmHg Art. (การยืดตัวปกติ) จนถึง 140 mmHg Art. (รูปที่ 6a) ซึ่งสอดคล้องกับการเพิ่มขึ้นของการยืดตัว 32% (รูปที่ 6b) ซึ่งก่อนหน้านี้แสดงให้เห็นแล้วว่าเป็นเปอร์เซ็นต์การยืดตัวที่จำเป็นสำหรับส่วนของหัวใจเพื่อให้ได้ความยาวของซาร์โคเมียร์ที่คล้ายกับที่พบในภาวะหัวใจโต การยืดตัวและความเร็วของเนื้อเยื่อหัวใจระหว่างการหดตัวและการคลายตัวยังคงที่ตลอดระยะเวลาการเพาะเลี้ยงหกวัน (รูปที่ 6c) เนื้อเยื่อหัวใจจากสภาวะ MT ถูกนำไปอยู่ในสภาวะการยืดตัวปกติ (MT (Normal)) หรือสภาวะการยืดตัวมากเกินไป (MT (OS)) เป็นเวลาหกวัน หลังจากเพาะเลี้ยงเพียงสี่วัน ตัวบ่งชี้ทางชีวภาพของภาวะหัวใจโต NT-ProBNP ก็เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในตัวกลางภายใต้สภาวะ MT (OS) เมื่อเทียบกับสภาวะ MT (normal) (รูปที่ 7a) นอกจากนี้ หลังจากเพาะเลี้ยงเป็นเวลาหกวัน ขนาดของเซลล์ใน MT (OS) (รูปที่ 7b) เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับส่วนของหัวใจ MT (ปกติ) ยิ่งไปกว่านั้น การเคลื่อนย้ายนิวเคลียสของ NFATC4 เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในเนื้อเยื่อที่ยืดมากเกินไป (รูปที่ 7c) ผลลัพธ์เหล่านี้แสดงให้เห็นถึงการพัฒนาอย่างต่อเนื่องของการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างทางพยาธิวิทยาหลังจากการยืดตัวมากเกินไป และสนับสนุนแนวคิดที่ว่าอุปกรณ์ CTCM สามารถใช้เป็นแพลตฟอร์มในการศึกษาการส่งสัญญาณการเจริญเติบโตของหัวใจที่เกิดจากการยืดตัวได้
a. ร่องรอยตัวอย่างของการวัดความดันในห้องอากาศ ความดันในห้องของเหลว และการเคลื่อนที่ของเนื้อเยื่อ ยืนยันว่าการเปลี่ยนแปลงความดันในห้องส่งผลต่อความดันในห้องของเหลว ทำให้ชิ้นเนื้อเคลื่อนที่ตามไปด้วย b. เส้นโค้งแสดงเปอร์เซ็นต์การยืดและอัตราการยืดของชิ้นเนื้อที่ยืดตามปกติ (สีส้ม) และยืดเกิน (สีน้ำเงิน) c. กราฟแท่งแสดงเวลาของรอบ (n = 19 ชิ้นต่อกลุ่ม จากหมูต่างกัน) เวลาการหดตัว (n = 18-19 ชิ้นต่อกลุ่ม จากหมูต่างกัน) เวลาการคลายตัว (n = 19 ชิ้นต่อกลุ่ม จากหมูต่างกัน) แอมพลิจูดของการเคลื่อนที่ของเนื้อเยื่อ (n = 14 ชิ้น/กลุ่ม จากหมูต่างกัน) ความเร็วซิสโตลิกสูงสุด (n = 14 ชิ้น/กลุ่ม จากหมูต่างกัน) และอัตราการคลายตัวสูงสุด (n = 14 (D0), 15 (D6) ชิ้น/กลุ่ม) จากหมูต่างกัน) การทดสอบ t-test แบบสองด้านของ Student แสดงให้เห็นว่าไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในพารามิเตอร์ใดๆ ซึ่งบ่งชี้ว่าพารามิเตอร์เหล่านี้คงที่ตลอด 6 วันของการเพาะเลี้ยงด้วยแรงดันไฟฟ้าเกิน แถบแสดงความคลาดเคลื่อนแสดงค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน
ก. กราฟแท่งแสดงปริมาณความเข้มข้นของ NT-ProBNP ในอาหารเลี้ยงเซลล์จากชิ้นเนื้อหัวใจที่เพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะการยืดปกติ (Norm) หรือการยืดเกิน (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm และ D4 MTOS) ชิ้น/กลุ่ม จากสุกรต่างกัน ทำการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบสองทาง (Two-way ANOVA); **p < 0.01 เมื่อเทียบกับการยืดปกติ) ก. กราฟแท่งแสดงปริมาณความเข้มข้นของ NT-ProBNP ในอาหารเลี้ยงเซลล์จากชิ้นเนื้อหัวใจที่เพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะการยืดปกติ (Norm) หรือการยืดเกิน (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm และ D4 MTOS) ชิ้นเนื้อต่อกลุ่มจากสุกรต่างกัน ทำการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบสองทาง (Two-way ANOVA); **p < 0.01 เมื่อเทียบกับการยืดปกติ)ฮิสโตแกรมเชิงปริมาณของความเข้มข้นของ NT-ProBNP ในตัวกลางเพาะเลี้ยงจากชิ้นส่วนหัวใจที่เพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะการยืด MT ปกติ (norm) หรือการยืดเกิน (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm และ D4).MTOS) ชิ้นส่วน/กลุ่ม จากสุกรที่ต่างกัน ทำการวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบสองปัจจัย**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 เมื่อเทียบกับการยืดปกติ** a ในMT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的heart脏切上培养基中NT-ProBNP 浓度的条形下化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm และ D4 MTOS） คำสั่งย่อย/组，进行双向方差分析;**与正常拉伸相比，p < 0.01） ปริมาณความเข้มข้นของ NT-ProBNP ในชิ้นหัวใจที่เพาะเลี้ยงภายใต้เงื่อนไขการยืดปกติของ MT (Norm) หรือการยืดเกิน (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm และ D4 MTOS) จาก 猪的切/组，可以双向方方发发动; **เมื่อเทียบกับปกติ การยืดตัว, p < 0.01)ฮิสโตแกรม การหาปริมาณความเข้มข้นของ NT-ProBNP ในชิ้นเนื้อหัวใจที่เพาะเลี้ยงภายใต้สภาวะการยืด MT ปกติ (norm) หรือการยืดเกิน (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) และ D4 MTOS) ชิ้น/กลุ่ม จากสุกรที่ต่างกัน การวิเคราะห์ความแปรปรวนแบบสองทาง**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 เมื่อเทียบกับการยืดปกติ** b. ภาพตัวอย่างของชิ้นเนื้อหัวใจที่ย้อมด้วยโทรโปนิน-ทีและ WGA (ซ้าย) และการวัดขนาดเซลล์ (ขวา) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) เซลล์/กลุ่ม จากชิ้นเนื้อ 10 ชิ้นที่แตกต่างกันจากสุกรต่างกัน ทำการทดสอบ t-test แบบสองด้าน ****p < 0.0001 เมื่อเทียบกับการยืดตัวปกติ) b. ภาพตัวอย่างของชิ้นเนื้อหัวใจที่ย้อมด้วยโทรโปนิน-ทีและ WGA (ซ้าย) และการวัดขนาดเซลล์ (ขวา) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) เซลล์/กลุ่ม จากชิ้นเนื้อ 10 ชิ้นที่แตกต่างกันจากสุกรต่างกัน ทำการทดสอบ t-test แบบสองด้าน ****p < 0.0001 เมื่อเทียบกับการยืดตัวปกติ) b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b. ภาพตัวอย่างของส่วนตัดหัวใจที่ย้อมด้วยโทรโปนิน-ทีและ AZP (ซ้าย) และการวัดขนาดเซลล์ (ขวา) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) เซลล์/กลุ่ม จากส่วนตัด 10 ส่วนที่แตกต่างกันจากสุกรที่ต่างกัน ทำการทดสอบ t-test แบบสองด้าน; ****p < 0.0001 เมื่อเทียบกับสายพันธุ์ปกติ) b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大右量化（右）染色的heart脏切的代表性代表性代表性代表性代表性代表性代不同猪的10 ดาวน์โหลด 369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验;与正常拉伸相比，****p < 0.0001）。 b ภาพตัวอย่างของชิ้นเนื้อหัวใจที่ย้อมด้วยแคลคารีน-ทีและดับเบิลยูจีเอ (ซ้าย) และขนาดเซลล์ (ขวา) (n = 330 (D6 MTOS), 369 จากชิ้นเนื้อ 10 ชิ้นที่แตกต่างกัน (D6 MTNorm)) Cells/组，两方法有尾学生t test；compared with normal stretching，****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) หรือ 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние นักเขียน Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b. ภาพตัวอย่างของส่วนตัดหัวใจที่ย้อมด้วยโทรโปนิน-ทีและ AZP (ซ้าย) และการวัดขนาดเซลล์ (ขวา) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) จากส่วนตัด 10 ส่วนที่แตกต่างกันจากสุกรต่างกัน) เซลล์/กลุ่ม เกณฑ์สองด้าน การทดสอบ t ของนักเรียน; ****p < 0.0001 เมื่อเทียบกับสายพันธุ์ปกติ) c. ภาพตัวอย่างของชิ้นเนื้อหัวใจ MTOS วันที่ 0 และวันที่ 6 ที่ติดฉลากภูมิคุ้มกันสำหรับโทรโปนิน-ทีและ NFATC4 และการหาปริมาณการเคลื่อนย้ายของ NFATC4 ไปยังนิวเคลียสของเซลล์กล้ามเนื้อหัวใจ (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ชิ้น/กลุ่ม จากสุกรต่างกัน ทำการทดสอบ t-test แบบสองด้าน; *p < 0.05) c. ภาพตัวอย่างของชิ้นเนื้อหัวใจ MTOS วันที่ 0 และวันที่ 6 ที่ติดฉลากภูมิคุ้มกันสำหรับโทรโปนิน-ทีและ NFATC4 และการหาปริมาณการเคลื่อนย้ายของ NFATC4 ไปยังนิวเคลียสของเซลล์กล้ามเนื้อหัวใจ (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ชิ้น/กลุ่ม จากสุกรต่างกัน ทำการทดสอบ t-test แบบสองด้าน; *p < 0.05) c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонинина-Т и NFATC4, и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента; *พี < 0,05) c. ภาพตัวอย่างของส่วนตัดหัวใจที่ 0 และ 6 วันหลัง MTOS ที่ติดฉลากภูมิคุ้มกันสำหรับโทรโปนิน-ทีและ NFATC4 และการหาปริมาณการเคลื่อนย้ายของ NFATC4 ในนิวเคลียสของเซลล์คาเวอร์นัส (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ชิ้น/กลุ่ม จากสุกรที่ต่างกัน) ทำการทดสอบ t-test แบบสองด้าน; *p < 0.05) c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS heart脏切上的代表性以及来自不同猪的NFATC4易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0),3 (D6 MTOS) 切ע/组, 进行双尾学生t 检验;*p < 0.05)。 c ภาพตัวแทนของ calcanin-T และ NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS ชิ้นหัวใจ และ NFATC4 จาก NFATC4 ที่แตกต่างกัน 易位至CM นิวเคลียสของเซลล์ 的quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组,时间双尾学生et 电影;*p < 0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *พี < 0,05) c. ภาพตัวอย่างของชิ้นเนื้อหัวใจ MTOS ในวันที่ 0 และ 6 สำหรับการติดฉลากภูมิคุ้มกันของโทรโปนิน-T และ NFATC4 และการหาปริมาณการเคลื่อนย้ายของ NFATC4 ในนิวเคลียสของ CM จากสุกรที่แตกต่างกัน (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ชิ้น/กลุ่ม, การทดสอบ t แบบสองด้านตามเกณฑ์ของ Student; *p < 0.05)แถบแสดงความคลาดเคลื่อนแสดงค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน
งานวิจัยด้านหัวใจและหลอดเลือดเชิงแปลผลจำเป็นต้องใช้แบบจำลองเซลล์ที่จำลองสภาพแวดล้อมของหัวใจได้อย่างแม่นยำ ในการศึกษาครั้งนี้ ได้มีการพัฒนาและศึกษาคุณสมบัติของอุปกรณ์ CTCM ที่สามารถกระตุ้นส่วนตัดบางพิเศษของหัวใจได้ ระบบ CTCM ประกอบด้วยการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าเชิงกลที่ซิงโครไนซ์ทางสรีรวิทยา และการเสริมด้วยของเหลว T3 และ Dex เมื่อส่วนตัดของหัวใจหมูสัมผัสกับปัจจัยเหล่านี้ ความมีชีวิต ความสมบูรณ์ของโครงสร้าง กิจกรรมทางเมตาบอลิซึม และการแสดงออกทางพันธุกรรมยังคงเหมือนกับเนื้อเยื่อหัวใจสดหลังจากเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 12 วัน นอกจากนี้ การยืดเนื้อเยื่อหัวใจมากเกินไปอาจทำให้เกิดภาวะหัวใจโตเนื่องจากการยืดตัวมากเกินไป โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้สนับสนุนบทบาทสำคัญของสภาวะการเพาะเลี้ยงทางสรีรวิทยาในการรักษาสภาพหัวใจให้เป็นปกติ และเป็นพื้นฐานสำหรับการคัดกรองยา
ปัจจัยหลายประการมีส่วนช่วยสร้างสภาพแวดล้อมที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการทำงานและการอยู่รอดของเซลล์กล้ามเนื้อหัวใจ ปัจจัยที่เห็นได้ชัดที่สุดเหล่านี้เกี่ยวข้องกับ (1) ปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์ (2) การกระตุ้นด้วยไฟฟ้าเชิงกล (3) ปัจจัยทางเคมี และ (4) สารตั้งต้นทางเมตาบอลิซึม ปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์ในทางสรีรวิทยาต้องอาศัยเครือข่ายสามมิติที่ซับซ้อนของเซลล์หลายชนิดซึ่งได้รับการสนับสนุนจากเมทริกซ์นอกเซลล์ ปฏิสัมพันธ์ระหว่างเซลล์ที่ซับซ้อนเช่นนี้ยากที่จะสร้างขึ้นใหม่ในหลอดทดลองโดยการเพาะเลี้ยงร่วมกันของเซลล์แต่ละชนิด แต่สามารถทำได้ง่ายโดยใช้ลักษณะออร์แกโนไทป์ของส่วนตัดหัวใจ
การยืดเชิงกลและการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าของเซลล์กล้ามเนื้อหัวใจมีความสำคัญต่อการรักษาสภาพของหัวใจ33,34,35 ในขณะที่การกระตุ้นเชิงกลถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในการปรับสภาพและการเจริญเติบโตของ hiPSC-CM งานวิจัยที่น่าสนใจหลายชิ้นเมื่อเร็ว ๆ นี้ได้พยายามกระตุ้นเชิงกลของชิ้นส่วนหัวใจในวัฒนธรรมโดยใช้การโหลดแบบแกนเดียว งานวิจัยเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าการโหลดเชิงกลแบบแกนเดียว 2 มิติมีผลดีต่อลักษณะของหัวใจในระหว่างการเพาะเลี้ยง ในงานวิจัยเหล่านี้ ส่วนของหัวใจจะถูกโหลดด้วยแรงดึงแบบไอโซเมตริก17 การโหลดแบบออโซโทนิกเชิงเส้น18 หรือวงจรการเต้นของหัวใจถูกสร้างขึ้นใหม่โดยใช้การป้อนกลับของตัวแปลงแรงและการขับเคลื่อนแรงดึง อย่างไรก็ตาม วิธีการเหล่านี้ใช้การยืดเนื้อเยื่อแบบแกนเดียวโดยไม่มีการปรับสภาพแวดล้อมให้เหมาะสม ส่งผลให้มีการยับยั้งยีนหัวใจหลายตัวหรือมีการแสดงออกมากเกินไปของยีนที่เกี่ยวข้องกับการตอบสนองต่อการยืดที่ผิดปกติ CTCM ที่อธิบายไว้ในที่นี้ให้การกระตุ้นทางกลไฟฟ้าแบบสามมิติที่เลียนแบบวงจรการเต้นของหัวใจตามธรรมชาติในแง่ของเวลาของวงจรและการยืดตัวทางสรีรวิทยา (การยืดตัว 25%, การหดตัว 40%, การคลายตัว 60% และ 72 ครั้งต่อนาที) แม้ว่าการกระตุ้นทางกลแบบสามมิติเพียงอย่างเดียวจะไม่เพียงพอที่จะรักษาความสมบูรณ์ของเนื้อเยื่อ แต่จำเป็นต้องใช้การกระตุ้นทางของเหลวและการกระตุ้นทางกลร่วมกันโดยใช้ T3/Dex เพื่อรักษาความมีชีวิต การทำงาน และความสมบูรณ์ของเนื้อเยื่ออย่างเหมาะสม
ปัจจัยทางด้านสารน้ำมีบทบาทสำคัญในการปรับเปลี่ยนลักษณะเฉพาะของหัวใจในผู้ใหญ่ เรื่องนี้ได้รับการเน้นย้ำในการศึกษา HiPS-CM ซึ่งมีการเติม T3 และ Dex ลงในอาหารเลี้ยงเซลล์เพื่อเร่งการเจริญเติบโตของเซลล์ T3 อาจมีอิทธิพลต่อการขนส่งกรดอะมิโน น้ำตาล และแคลเซียมผ่านเยื่อหุ้มเซลล์36 นอกจากนี้ T3 ยังส่งเสริมการแสดงออกของ MHC-α และการลดระดับ MHC-β ซึ่งส่งเสริมการสร้างไมโอไฟบริลแบบหดตัวเร็วในเซลล์กล้ามเนื้อหัวใจที่เจริญเต็มที่เมื่อเทียบกับไมโอไฟบริลแบบหดตัวช้าในเซลล์กล้ามเนื้อหัวใจของทารกในครรภ์ การขาด T3 ในผู้ป่วยภาวะไทรอยด์ฮอร์โมนต่ำส่งผลให้สูญเสียแถบไมโอไฟบริลและอัตราการพัฒนาของโทนลดลง37 Dex ออกฤทธิ์ต่อตัวรับกลูโคคอร์ติคอยด์และแสดงให้เห็นว่าสามารถเพิ่มความสามารถในการหดตัวของกล้ามเนื้อหัวใจในหัวใจที่แยกออกมาและได้รับการหล่อเลี้ยง 38 การปรับปรุงนี้เชื่อว่าเกี่ยวข้องกับผลกระทบต่อการเข้าสู่เซลล์ที่ขับเคลื่อนด้วยการสะสมของแคลเซียม (SOCE) 39,40 นอกจากนี้ Dex ยังจับกับตัวรับของมัน ทำให้เกิดการตอบสนองภายในเซลล์ในวงกว้างซึ่งยับยั้งการทำงานของระบบภูมิคุ้มกันและการอักเสบ30
ผลการศึกษาของเราบ่งชี้ว่า การกระตุ้นทางกล (MS) ช่วยปรับปรุงประสิทธิภาพการเพาะเลี้ยงโดยรวมเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม แต่ไม่สามารถรักษาความมีชีวิต ความสมบูรณ์ของโครงสร้าง และการแสดงออกของยีนหัวใจได้ตลอด 12 วันในการเพาะเลี้ยง เมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม การเติม T3 และ Dex ลงในวัฒนธรรม CTCM (MT) ช่วยปรับปรุงความมีชีวิตและรักษาโปรไฟล์การถอดรหัส ความสมบูรณ์ของโครงสร้าง และกิจกรรมการเผาผลาญที่คล้ายคลึงกับเนื้อเยื่อหัวใจสดเป็นเวลา 12 วัน นอกจากนี้ การควบคุมระดับการยืดของเนื้อเยื่อยังได้สร้างแบบจำลองภาวะหัวใจโตที่เกิดจากการยืดมากเกินไปโดยใช้ STCM ซึ่งแสดงให้เห็นถึงความอเนกประสงค์ของระบบ STCM ควรสังเกตว่า แม้ว่าการปรับโครงสร้างและการเกิดพังผืดของหัวใจมักเกี่ยวข้องกับอวัยวะที่สมบูรณ์ซึ่งเซลล์ที่ไหลเวียนสามารถให้ไซโตไคน์ที่เหมาะสม รวมถึงการกลืนกินและปัจจัยการปรับโครงสร้างอื่นๆ แต่ส่วนต่างๆ ของหัวใจยังคงสามารถเลียนแบบกระบวนการเกิดพังผืดเพื่อตอบสนองต่อความเครียดและการบาดเจ็บได้ โดยสามารถเปลี่ยนเซลล์หัวใจเป็นไมโอไฟโบรบลาสต์ได้ ซึ่งได้รับการประเมินไว้ก่อนหน้านี้ในแบบจำลองชิ้นส่วนหัวใจนี้ ควรสังเกตว่าพารามิเตอร์ของ CTCM สามารถปรับเปลี่ยนได้โดยการเปลี่ยนความดัน/แอมพลิจูดทางไฟฟ้าและความถี่ เพื่อจำลองสภาวะต่างๆ เช่น ภาวะหัวใจเต้นเร็ว ภาวะหัวใจเต้นช้า และการสนับสนุนการไหลเวียนโลหิตด้วยกลไก (หัวใจที่ไม่มีภาระทางกล) ซึ่งทำให้ระบบนี้มีประสิทธิภาพในระดับปานกลางสำหรับการทดสอบยา ความสามารถของ CTCM ในการจำลองภาวะหัวใจโตที่เกิดจากการออกแรงมากเกินไป ปูทางไปสู่การทดสอบระบบนี้สำหรับการบำบัดเฉพาะบุคคล โดยสรุป การศึกษาในปัจจุบันแสดงให้เห็นว่าการยืดทางกลและการกระตุ้นจากสารคัดหลั่งมีความสำคัญอย่างยิ่งต่อการรักษาการเพาะเลี้ยงชิ้นส่วนเนื้อเยื่อหัวใจ
แม้ว่าข้อมูลที่นำเสนอในที่นี้จะบ่งชี้ว่า CTCM เป็นแพลตฟอร์มที่มีศักยภาพสูงสำหรับการสร้างแบบจำลองกล้ามเนื้อหัวใจที่สมบูรณ์ แต่ก็มีข้อจำกัดบางประการเกี่ยวกับวิธีการเพาะเลี้ยงนี้ ข้อจำกัดหลักของการเพาะเลี้ยง CTCM คือการสร้างแรงกดทางกลแบบไดนามิกอย่างต่อเนื่องต่อชิ้นเนื้อ ซึ่งทำให้ไม่สามารถตรวจสอบการหดตัวของชิ้นเนื้อหัวใจในแต่ละรอบได้อย่างต่อเนื่อง นอกจากนี้ เนื่องจากขนาดของชิ้นเนื้อหัวใจมีขนาดเล็ก (7 มม.) ความสามารถในการประเมินการทำงานของซิสโตลิกภายนอกระบบการเพาะเลี้ยงโดยใช้เซ็นเซอร์วัดแรงแบบดั้งเดิมจึงมีจำกัด ในบทความนี้ เราได้เอาชนะข้อจำกัดนี้บางส่วนโดยการประเมินแรงดันไฟฟ้าเชิงแสงเป็นตัวบ่งชี้การทำงานของการหดตัว อย่างไรก็ตาม ข้อจำกัดนี้จำเป็นต้องมีการวิจัยเพิ่มเติมและอาจได้รับการแก้ไขในอนาคตโดยการแนะนำวิธีการตรวจสอบการทำงานของชิ้นเนื้อหัวใจในวัฒนธรรมด้วยแสง เช่น การทำแผนที่ด้วยแสงโดยใช้สีย้อมที่ไวต่อแคลเซียมและแรงดันไฟฟ้า ข้อจำกัดอีกประการหนึ่งของ CTCM คือแบบจำลองการทำงานไม่ได้ควบคุมความเครียดทางสรีรวิทยา (พรีโหลดและอาฟเตอร์โหลด) ใน CTCM นั้น แรงดันจะถูกสร้างขึ้นในทิศทางตรงกันข้ามเพื่อจำลองการยืดตัวทางสรีรวิทยา 25% ในช่วงไดแอสโตล (ยืดตัวเต็มที่) และซิสโตล (ความยาวของการหดตัวระหว่างการกระตุ้นด้วยไฟฟ้า) ในเนื้อเยื่อขนาดใหญ่มาก ข้อจำกัดนี้ควรได้รับการแก้ไขในการออกแบบ CTCM ในอนาคต โดยการใช้แรงดันที่เหมาะสมกับเนื้อเยื่อหัวใจจากทั้งสองด้าน และโดยการประยุกต์ใช้ความสัมพันธ์ระหว่างแรงดันและปริมาตรที่เกิดขึ้นในห้องหัวใจอย่างแม่นยำ
การปรับโครงสร้างที่เกิดจากการยืดมากเกินไปที่รายงานในเอกสารฉบับนี้จำกัดอยู่เพียงการจำลองสัญญาณการยืดมากเกินไปที่ทำให้เกิดภาวะกล้ามเนื้อโตเกิน ดังนั้นแบบจำลองนี้จึงสามารถช่วยในการศึกษาการส่งสัญญาณที่ทำให้เกิดภาวะกล้ามเนื้อโตเกินโดยไม่จำเป็นต้องใช้ปัจจัยทางด้านของเหลวหรือระบบประสาท (ซึ่งไม่มีอยู่ในระบบนี้) จำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติมเพื่อเพิ่มความหลากหลายของ CTCM ตัวอย่างเช่น การเพาะเลี้ยงร่วมกับเซลล์ภูมิคุ้มกัน ปัจจัยทางด้านของเหลวในพลาสมาที่ไหลเวียน และการสร้างเส้นประสาท เมื่อการเพาะเลี้ยงร่วมกับเซลล์ประสาทจะช่วยเพิ่มความเป็นไปได้ในการสร้างแบบจำลองโรคด้วย CTCM
ในการศึกษาครั้งนี้ใช้สุกรจำนวน 13 ตัว ขั้นตอนการทดลองกับสัตว์ทั้งหมดดำเนินการตามแนวทางของสถาบันและได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการดูแลและใช้สัตว์ทดลองของมหาวิทยาลัยลุยส์วิลล์ ทำการหนีบส่วนโค้งของหลอดเลือดแดงใหญ่และทำการล้างหัวใจด้วยสารละลายคาร์ดิโอเพลเจียปลอดเชื้อ 1 ลิตร (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, เฮปาริน 5 U/mL, pH สูงสุด 7.4); หัวใจจะถูกเก็บรักษาไว้ในสารละลายคาร์ดิโอเพลจิกที่เย็นจัดจนกว่าจะถูกขนส่งไปยังห้องปฏิบัติการโดยแช่เย็น ซึ่งโดยปกติจะใช้เวลาไม่เกิน 10 นาที หัวใจจะถูกเก็บรักษาไว้ในสารละลายคาร์ดิโอเพลจิกที่เย็นจัดจนกว่าจะถูกขนส่งไปยังห้องปฏิบัติการโดยแช่เย็น ซึ่งโดยปกติจะใช้เวลาไม่เกิน 10 นาที сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 นาที หัวใจจะถูกเก็บไว้ในสารละลายคาร์ดิโอเพลจิกที่เย็นจัดจนกว่าจะถูกขนส่งไปยังห้องปฏิบัติการโดยแช่เย็น ซึ่งโดยปกติจะใช้เวลาน้อยกว่า 10 นาที将heart脏保存在冰冷的heart脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将heart脏保存在冰冷的heart脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 นาที. เก็บหัวใจไว้ในสารละลายคาร์ดิโอเพลเจียที่เย็นจัดจนกว่าจะนำส่งห้องปฏิบัติการโดยแช่เย็นไว้ ซึ่งโดยปกติจะใช้เวลาน้อยกว่า 10 นาที
อุปกรณ์ CTCM ถูกพัฒนาขึ้นโดยใช้ซอฟต์แวร์ SolidWorks สำหรับการออกแบบโดยใช้คอมพิวเตอร์ช่วย (CAD) ห้องเพาะเลี้ยง แผ่นกั้น และห้องอากาศ ทำจากพลาสติกอะคริลิกใสที่ตัดด้วยเครื่อง CNC วงแหวนรองรับขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 7 มม. ทำจากโพลีเอทิลีนความหนาแน่นสูง (HDPE) ตรงกลาง และมีร่องสำหรับใส่โอริงซิลิโคนเพื่อปิดผนึกอาหารเลี้ยงเชื้อด้านล่าง แผ่นเมมเบรนซิลิกาบางๆ กั้นห้องเพาะเลี้ยงออกจากแผ่นกั้น แผ่นเมมเบรนซิลิโคนตัดด้วยเลเซอร์จากแผ่นซิลิโคนหนา 0.02 นิ้ว และมีความแข็ง 35A ปะเก็นซิลิโคนด้านล่างและด้านบนตัดด้วยเลเซอร์จากแผ่นซิลิโคนหนา 1/16 นิ้ว และมีความแข็ง 50A ใช้สกรูและน็อตปีกผีเสื้อสแตนเลส 316L สำหรับยึดบล็อกและสร้างซีลกันอากาศ
แผงวงจรพิมพ์ (PCB) เฉพาะได้รับการออกแบบมาเพื่อใช้งานร่วมกับระบบ C-PACE-EM ซ็อกเก็ตตัวเชื่อมต่อแบบ Swiss Machine Connector บน PCB เชื่อมต่อกับอิเล็กโทรดกราไฟต์ด้วยสายทองแดงชุบเงินและสกรูบรอนซ์ขนาด 0-60 ที่ขันเข้ากับอิเล็กโทรด จากนั้นจึงวางแผงวงจรพิมพ์ไว้ในฝาครอบของเครื่องพิมพ์ 3 มิติ
อุปกรณ์ CTCM ถูกควบคุมโดยแอคทูเอเตอร์แบบนิวแมติกที่ตั้งโปรแกรมได้ (PPD) ซึ่งสร้างแรงดันการไหลเวียนที่ควบคุมได้คล้ายกับวงจรการเต้นของหัวใจ เมื่อแรงดันภายในห้องอากาศเพิ่มขึ้น เยื่อซิลิโคนที่มีความยืดหยุ่นจะขยายตัวขึ้นด้านบน ดันตัวกลางใต้บริเวณเนื้อเยื่อ บริเวณเนื้อเยื่อจะถูกยืดออกโดยการขับของเหลวนี้ ซึ่งเลียนแบบการขยายตัวทางสรีรวิทยาของหัวใจในระหว่างช่วงคลายตัว ในช่วงที่ผ่อนคลายสูงสุด จะมีการกระตุ้นด้วยไฟฟ้าผ่านอิเล็กโทรดกราไฟต์ ซึ่งจะลดแรงดันในห้องอากาศและทำให้ส่วนของเนื้อเยื่อหดตัว ภายในท่อมีวาล์วห้ามเลือดพร้อมเซ็นเซอร์วัดแรงดันเพื่อตรวจจับแรงดันในระบบอากาศ แรงดันที่ตรวจจับได้โดยเซ็นเซอร์วัดแรงดันจะถูกส่งไปยังตัวเก็บข้อมูลที่เชื่อมต่อกับแล็ปท็อป ซึ่งช่วยให้สามารถตรวจสอบแรงดันภายในห้องก๊าซได้อย่างต่อเนื่อง เมื่อความดันในห้องถึงระดับสูงสุด (มาตรฐาน 80 mmHg, 140 mmHg OS) อุปกรณ์เก็บข้อมูลจะได้รับคำสั่งให้ส่งสัญญาณไปยังระบบ C-PACE-EM เพื่อสร้างสัญญาณแรงดันไฟฟ้าแบบสองเฟสเป็นเวลา 2 มิลลิวินาที โดยตั้งค่าไว้ที่ 4 โวลต์
ได้ทำการตัดชิ้นส่วนหัวใจและทำการเพาะเลี้ยงในหลุมเพาะเลี้ยง 6 หลุม ดังนี้: ย้ายหัวใจที่เก็บเกี่ยวได้จากภาชนะถ่ายโอนไปยังถาดที่มีสารละลายคาร์ดิโอเพลเจียเย็น (4°C) แยกโพรงหัวใจด้านซ้ายด้วยใบมีดปลอดเชื้อและตัดเป็นชิ้นขนาด 1-2 cm³ ชิ้นเนื้อเหล่านี้ถูกยึดติดกับแผ่นรองเนื้อเยื่อด้วยกาวติดเนื้อเยื่อและวางในอ่างเนื้อเยื่อไมโครโทมแบบสั่นที่มีสารละลายไทโรดและเติมออกซิเจนอย่างต่อเนื่อง (3 กรัม/ลิตร 2,3-บิวเทนไดโอนโมโนออกไซม์ (BDM), 140 mM NaCl (8.18 กรัม), 6 mM KCl (0.447 กรัม), 10 mM D-กลูโคส (1.86 กรัม), 10 mM HEPES (2.38 กรัม), 1 mM MgCl₂ (1 มล. สารละลาย 1 M), 1.8 mM CaCl₂ (1.8 มล. สารละลาย 1 M), จนครบ 1 ลิตร ddH₂O) ตั้งค่าไมโครโทมแบบสั่นให้ตัดชิ้นเนื้อหนา 300 µm ที่ความถี่ 80 Hz, แอมพลิจูดการสั่นในแนวนอน 2 มม. และอัตราการเคลื่อนที่ 0.03 มม./วินาที อ่างแช่ชิ้นเนื้อล้อมรอบด้วยน้ำแข็งเพื่อรักษาอุณหภูมิของสารละลายให้เย็น และรักษาอุณหภูมิไว้ที่ 4°C ย้ายชิ้นเนื้อจากอ่างไมโครโทมไปยังอ่างบ่มที่มีสารละลายไทโรดที่เติมออกซิเจนอย่างต่อเนื่องบนน้ำแข็งจนกว่าจะได้ชิ้นเนื้อเพียงพอสำหรับจานเพาะเลี้ยงหนึ่งจาน สำหรับการเพาะเลี้ยงแบบทรานส์เวลล์ ชิ้นเนื้อจะถูกติดบนแผ่นรองโพลียูรีเทนปลอดเชื้อกว้าง 6 มม. และวางในอาหารเลี้ยงเชื้อที่เหมาะสม 6 มล. (อาหารเลี้ยงเชื้อ 199, สารเสริม ITS 1 เท่า, FBS 10%, VEGF 5 ng/ml, FGF-อัลคาไลน์ 10 ng/ml และยาปฏิชีวนะ-ยาต้านเชื้อรา 2 เท่า) กระตุ้นด้วยไฟฟ้า (10 V, ความถี่ 1.2 Hz) กับชิ้นเนื้อผ่าน C-Pace สำหรับสภาวะ TD นั้น จะมีการเติม T3 และ Dex สดในปริมาณ 100 nM และ 1 μM ในแต่ละครั้งที่เปลี่ยนอาหารเลี้ยงเซลล์ อาหารเลี้ยงเซลล์จะถูกทำให้มีออกซิเจนอิ่มตัวก่อนเปลี่ยน 3 ครั้งต่อวัน ชิ้นส่วนเนื้อเยื่อจะถูกเพาะเลี้ยงในตู้อบที่อุณหภูมิ 37°C และความเข้มข้นของ CO2 5%
สำหรับการเพาะเลี้ยง CTCM นั้น ชิ้นเนื้อจะถูกวางบนเครื่องพิมพ์ 3 มิติที่ทำขึ้นเองในจานเพาะเชื้อที่มีสารละลายไทโรดที่ดัดแปลงแล้ว อุปกรณ์นี้ได้รับการออกแบบมาเพื่อเพิ่มขนาดของชิ้นเนื้อหัวใจให้มากขึ้น 25% ของพื้นที่วงแหวนรองรับ เพื่อป้องกันไม่ให้ชิ้นเนื้อหัวใจยืดตัวหลังจากย้ายจากสารละลายไทโรดไปยังตัวกลาง และในระหว่างช่วงหัวใจคลายตัว โดยใช้กาวฮิสโตอะคริลิก ชิ้นเนื้อหนา 300 ไมโครเมตรจะถูกยึดติดบนวงแหวนรองรับขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 7 มิลลิเมตร หลังจากติดชิ้นเนื้อเข้ากับวงแหวนรองรับแล้ว ให้ตัดส่วนเกินของชิ้นเนื้อออก และนำชิ้นเนื้อที่ติดแล้วกลับไปแช่ในสารละลายไทโรดบนน้ำแข็ง (4°C) จนกว่าจะได้ชิ้นเนื้อเพียงพอสำหรับอุปกรณ์หนึ่งชิ้น เวลาในการประมวลผลทั้งหมดสำหรับอุปกรณ์ทั้งหมดไม่ควรเกิน 2 ชั่วโมง หลังจากติดชิ้นเนื้อ 6 ชิ้นเข้ากับวงแหวนรองรับแล้ว อุปกรณ์ CTCM ก็จะถูกประกอบขึ้น ห้องเพาะเลี้ยง CTCM จะถูกเติมด้วยตัวกลางที่มีออกซิเจนไว้ล่วงหน้า 21 มิลลิลิตร นำชิ้นเนื้อไปใส่ในห้องเพาะเลี้ยงและกำจัดฟองอากาศออกอย่างระมัดระวังด้วยปิเปต จากนั้นนำชิ้นเนื้อใส่ลงในรูและกดเบาๆ ให้เข้าที่ สุดท้ายวางฝาครอบอิเล็กโทรดบนอุปกรณ์และนำอุปกรณ์ไปไว้ในตู้อบ จากนั้นเชื่อมต่อ CTCM กับท่ออากาศและระบบ C-PACE-EM ตัวกระตุ้นแบบนิวแมติกจะเปิดออกและวาล์วอากาศจะเปิด CTCM ระบบ C-PACE-EM ถูกตั้งค่าให้จ่ายแรงดัน 4 V ที่ความถี่ 1.2 Hz ระหว่างการกระตุ้นแบบสองเฟสเป็นเวลา 2 มิลลิวินาที เปลี่ยนอาหารเลี้ยงเซลล์วันละสองครั้งและเปลี่ยนอิเล็กโทรดวันละครั้งเพื่อหลีกเลี่ยงการสะสมของกราไฟต์บนอิเล็กโทรด หากจำเป็น สามารถนำชิ้นเนื้อออกจากหลุมเพาะเลี้ยงเพื่อไล่ฟองอากาศที่อาจตกลงไปใต้ชิ้นเนื้อได้ สำหรับสภาวะการรักษา MT จะเติม T3/Dex ใหม่ทุกครั้งที่เปลี่ยนอาหารเลี้ยงเซลล์ โดยใช้ T3 100 nM และ Dex 1 μM อุปกรณ์ CTCM ถูกเพาะเลี้ยงในตู้อบที่อุณหภูมิ 37°C และ 5% CO2
เพื่อให้ได้ภาพวิถีการเคลื่อนที่แบบยืดหดของชิ้นส่วนหัวใจ จึงได้พัฒนาระบบกล้องพิเศษขึ้น โดยใช้กล้อง SLR (Canon Rebel T7i, Canon, โตเกียว, ญี่ปุ่น) ร่วมกับเลนส์มาโคร Navitar Zoom 7000 18-108 มม. (Navitar, ซานฟรานซิสโก, แคลิฟอร์เนีย) ทำการบันทึกภาพที่อุณหภูมิห้องหลังจากเปลี่ยนตัวกลางเพาะเลี้ยงด้วยตัวกลางใหม่ วางตำแหน่งกล้องทำมุม 51° และบันทึกวิดีโอที่ 30 เฟรมต่อวินาที ขั้นแรก ใช้ซอฟต์แวร์โอเพนซอร์ส (MUSCLEMOTION43) ร่วมกับ Image-J เพื่อวัดปริมาณการเคลื่อนที่ของชิ้นส่วนหัวใจ สร้างมาสก์โดยใช้ MATLAB (MathWorks, Natick, MA, สหรัฐอเมริกา) เพื่อกำหนดขอบเขตที่สนใจสำหรับชิ้นส่วนหัวใจที่กำลังเต้นอยู่ เพื่อหลีกเลี่ยงสัญญาณรบกวน นำมาสก์ที่แบ่งส่วนด้วยตนเองไปใช้กับภาพทั้งหมดในลำดับเฟรม แล้วส่งต่อไปยังปลั๊กอิน MUSCLEMOTION Muscle Motion ใช้ค่าความเข้มเฉลี่ยของพิกเซลในแต่ละเฟรมเพื่อวัดปริมาณการเคลื่อนที่เทียบกับเฟรมอ้างอิง ข้อมูลถูกบันทึก กรอง และนำมาใช้เพื่อหาปริมาณเวลาของวงจรและประเมินการยืดตัวของเนื้อเยื่อในระหว่างวงจรการเต้นของหัวใจ วิดีโอที่บันทึกไว้ได้รับการประมวลผลภายหลังโดยใช้ตัวกรองดิจิทัลแบบศูนย์เฟสลำดับที่หนึ่ง เพื่อหาปริมาณการยืดตัวของเนื้อเยื่อ (จากจุดสูงสุดถึงจุดต่ำสุด) ได้ทำการวิเคราะห์จากจุดสูงสุดถึงจุดต่ำสุดเพื่อแยกความแตกต่างระหว่างจุดสูงสุดและจุดต่ำสุดในสัญญาณที่บันทึกไว้ นอกจากนี้ยังได้ทำการกำจัดแนวโน้มโดยใช้พหุนามลำดับที่ 6 เพื่อขจัดความคลาดเคลื่อนของสัญญาณ รหัสโปรแกรมถูกพัฒนาขึ้นใน MATLAB เพื่อกำหนดการเคลื่อนไหวของเนื้อเยื่อโดยรวม เวลาของวงจร เวลาการคลายตัว และเวลาการหดตัว (รหัสโปรแกรมเสริม 44)
สำหรับการวิเคราะห์ความเครียด โดยใช้คลิปวิดีโอเดียวกันกับที่สร้างขึ้นสำหรับการประเมินการยืดเชิงกล เราได้ทำการลากเส้นตามภาพสองภาพที่แสดงถึงจุดสูงสุดของการเคลื่อนไหว (จุดสูงสุด (ด้านบน) และจุดต่ำสุด (ด้านล่าง) ของการเคลื่อนไหว) ตามซอฟต์แวร์ MUSCLEMOTION จากนั้นเราได้แบ่งส่วนเนื้อเยื่อและใช้ขั้นตอนวิธีแรเงาแบบหนึ่งกับเนื้อเยื่อที่แบ่งส่วนแล้ว (ภาพประกอบเพิ่มเติมที่ 2a) เนื้อเยื่อที่แบ่งส่วนแล้วถูกแบ่งออกเป็นสิบพื้นผิวย่อย และคำนวณความเครียดบนแต่ละพื้นผิวโดยใช้สมการต่อไปนี้: ความเครียด = (Sup-Sdown)/Sdown โดยที่ Sup และ Sdown คือระยะห่างของรูปร่างจากเงาด้านบนและด้านล่างของผ้าตามลำดับ (ภาพประกอบเพิ่มเติมที่ 2b)
ชิ้นส่วนหัวใจถูกตรึงด้วยสารพาราฟอร์มาลดีไฮด์ 4% เป็นเวลา 48 ชั่วโมง เนื้อเยื่อที่ตรึงแล้วถูกทำให้แห้งด้วยสารละลายซูโครส 10% และ 20% เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นแช่ในสารละลายซูโครส 30% ข้ามคืน จากนั้นชิ้นส่วนถูกฝังในสารประกอบอุณหภูมิการตัดที่เหมาะสม (OCT compound) และแช่แข็งอย่างค่อยเป็นค่อยไปในอ่างไอโซเพนเทน/น้ำแข็งแห้ง เก็บบล็อกฝัง OCT ไว้ที่อุณหภูมิ -80 °C จนกว่าจะแยกชิ้นส่วน สไลด์ถูกเตรียมเป็นชิ้นส่วนที่มีความหนา 8 ไมโครเมตร
เพื่อกำจัด OCT ออกจากชิ้นส่วนหัวใจ ให้ให้ความร้อนแก่สไลด์บนแผ่นให้ความร้อนที่อุณหภูมิ 95 °C เป็นเวลา 5 นาที เติม PBS 1 มล. ลงในแต่ละสไลด์ และบ่มไว้ 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นทำให้ชิ้นส่วนซึมผ่านโดยการแช่ Triton-X 0.1% ใน PBS เป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิห้อง เพื่อป้องกันไม่ให้แอนติบอดีที่ไม่จำเพาะจับกับตัวอย่าง ให้เติมสารละลาย BSA 3% 1 มล. ลงบนสไลด์ และบ่มไว้ 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นจึงนำ BSA ออกและล้างสไลด์ด้วย PBS ทำเครื่องหมายแต่ละตัวอย่างด้วยดินสอ เติมแอนติบอดีปฐมภูมิ (เจือจาง 1:200 ใน BSA 1%) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) และ troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960)) เป็นเวลา 90 นาที จากนั้นเติมแอนติบอดีทุติยภูมิ (เจือจาง 1:200 ใน BSA 1%) ต่อต้านเมาส์ Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079) และต่อต้านกระต่าย Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) เป็นเวลาอีก 90 นาที ล้าง 3 ครั้งด้วย PBS เพื่อแยกความแตกต่างระหว่างการย้อมสีเป้าหมายกับพื้นหลัง เราใช้เฉพาะแอนติบอดีทุติยภูมิเป็นตัวควบคุม สุดท้าย เติมสีย้อมนิวเคลียส DAPI และวางสไลด์ใน vectashield (Vector Laboratories) แล้วปิดผนึกด้วยน้ำยาทาเล็บ (กำลังขยาย -x) และกล้องจุลทรรศน์ Keyence ที่กำลังขยาย 40x
ใช้ WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) ที่ความเข้มข้น 5 μg/ml ใน PBS สำหรับการย้อมสี WGA โดยนำไปทาลงบนชิ้นเนื้อที่ตรึงไว้แล้วเป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง จากนั้นล้างสไลด์ด้วย PBS และเติม Sudan black ลงในแต่ละสไลด์แล้วบ่มไว้เป็นเวลา 30 นาที จากนั้นล้างสไลด์ด้วย PBS อีกครั้งและเติมสารฝังตัว Vectashield ลงไป นำสไลด์ไปตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์ Keyence ที่กำลังขยาย 40 เท่า
นำ OCT ออกจากตัวอย่างตามที่อธิบายไว้ข้างต้น หลังจากนำ OCT ออกแล้ว ให้แช่สไลด์ในสารละลาย Bouin ค้างคืน จากนั้นล้างสไลด์ด้วยน้ำกลั่นเป็นเวลา 1 ชั่วโมง แล้วแช่ในสารละลาย Bibrich aloe acid fuchsin เป็นเวลา 10 นาที จากนั้นล้างสไลด์ด้วยน้ำกลั่นอีกครั้ง แล้วแช่ในสารละลาย phosphomolybdenum 5%/phosphotungstic acid 5% เป็นเวลา 10 นาที โดยไม่ต้องล้าง ให้นำสไลด์ไปแช่ในสารละลาย aniline blue เป็นเวลา 15 นาที จากนั้นล้างสไลด์ด้วยน้ำกลั่นอีกครั้ง แล้วแช่ในสารละลายกรดอะซิติก 1% เป็นเวลา 2 นาที ทำให้สไลด์แห้งในเอทานอล 200 N แล้วย้ายไปแช่ในไซลีน นำสไลด์ที่ย้อมสีแล้วไปดูด้วยกล้องจุลทรรศน์ Keyence โดยใช้เลนส์กำลังขยาย 10 เท่า คำนวณเปอร์เซ็นต์พื้นที่ของพังผืดโดยใช้ซอฟต์แวร์ Keyence Analyzer
ทำการทดสอบความมีชีวิตของเซลล์ด้วยชุดทดสอบ CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA) หมายเลขแคตตาล็อก V13154 ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต โดยมีการปรับเปลี่ยนบางส่วน โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ใช้เครื่องเจาะเนื้อเยื่อขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 6 มม. เพื่อให้แน่ใจว่าเนื้อเยื่อมีขนาดสม่ำเสมอระหว่างการวิเคราะห์ MTT นำเนื้อเยื่อแต่ละชิ้นไปเพาะเลี้ยงในหลุมของจานเพาะเลี้ยง 12 หลุมที่มีสารตั้งต้น MTT ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต นำชิ้นเนื้อไปบ่มที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 3 ชั่วโมง เนื้อเยื่อที่มีชีวิตจะเผาผลาญสารตั้งต้น MTT เพื่อสร้างสารประกอบฟอร์มาซานสีม่วง แทนที่สารละลาย MTT ด้วย DMSO 1 มล. และบ่มที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 15 นาที เพื่อสกัดฟอร์มาซานสีม่วงจากชิ้นเนื้อหัวใจ เจือจางตัวอย่าง 1:10 ใน DMSO ในจานเพาะเลี้ยง 96 หลุมแบบก้นใส และวัดความเข้มของสีม่วงที่ 570 นาโนเมตรโดยใช้เครื่องอ่านจานเพาะเลี้ยง Cytation (BioTek) ค่าที่ได้จะถูกปรับให้เป็นมาตรฐานตามน้ำหนักของแต่ละชิ้นเนื้อหัวใจ
เปลี่ยนอาหารเลี้ยงเซลล์หัวใจเป็นอาหารเลี้ยงเซลล์ที่มี [5-3H]-กลูโคส 1 μCi/ml (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) สำหรับการทดสอบการใช้กลูโคสตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ หลังจากบ่มเป็นเวลา 4 ชั่วโมง ให้เติมอาหารเลี้ยงเซลล์ 100 µl ลงในหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์แบบเปิดที่มี HCl 0.2 N 100 µl จากนั้นวางหลอดลงในหลอดวัดการเรืองแสงที่มีน้ำกลั่น 500 μl เพื่อระเหย [3H]2O เป็นเวลา 72 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37°C จากนั้นนำหลอดไมโครเซนตริฟิวจ์ออกจากหลอดวัดการเรืองแสงและเติมของเหลวสำหรับวัดการเรืองแสง 10 ml ทำการนับการเรืองแสงโดยใช้เครื่องวิเคราะห์การเรืองแสงของเหลว Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA) จากนั้นจึงคำนวณการใช้กลูโคสโดยคำนึงถึงกิจกรรมจำเพาะของ [5-3H]-กลูโคส สมดุลที่ไม่สมบูรณ์และพื้นหลัง การเจือจางของ [5-3H]-กลูโคสที่ไม่มีฉลาก และประสิทธิภาพของเครื่องนับการเรืองแสง ข้อมูลได้รับการปรับให้เป็นมาตรฐานตามมวลของส่วนต่างๆ ของหัวใจ
หลังจากบดเนื้อเยื่อให้เป็นเนื้อเดียวกันใน Trizol แล้ว จึงแยก RNA ออกจากชิ้นส่วนหัวใจโดยใช้ชุดอุปกรณ์ Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต การเตรียมไลบรารี RNAsec การจัดลำดับ และการวิเคราะห์ข้อมูลดำเนินการดังต่อไปนี้:
ใช้ RNA ปริมาณ 1 ไมโครกรัมต่อตัวอย่างเป็นสารตั้งต้นในการเตรียมไลบรารี RNA สร้างไลบรารีสำหรับการจัดลำดับโดยใช้ชุดอุปกรณ์ NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit สำหรับ Illumina (NEB, สหรัฐอเมริกา) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต และเพิ่มรหัสดัชนีลงในลำดับคุณลักษณะสำหรับแต่ละตัวอย่าง โดยสรุปคือ แยก mRNA ออกจาก RNA ทั้งหมดโดยใช้ลูกปัดแม่เหล็กที่ติดกับโอลิโกนิวคลีโอไทด์โพลี-T ทำการแตกตัวโดยใช้ไอออนบวกสองวาเลนซ์ที่อุณหภูมิสูงในบัฟเฟอร์ปฏิกิริยาการสังเคราะห์สายแรกของ NEBNext (5X) สังเคราะห์ cDNA สายแรกโดยใช้ไพรเมอร์เฮกซาเมอร์แบบสุ่มและเอนไซม์รีเวอร์สทรานสคริปเทส M-MuLV (RNase H-) จากนั้นสังเคราะห์ cDNA สายที่สองโดยใช้ DNA โพลีเมอเรส I และ RNase H ส่วนปลายที่ยื่นออกมาจะถูกแปลงเป็นปลายทู่โดยกิจกรรมของเอ็กโซนิวคลีเอส/โพลีเมอเรส หลังจากเติมอะดีนีนที่ปลาย 3′ ของชิ้นส่วน DNA แล้ว จะทำการติด NEBNext Adapter ที่มีโครงสร้างห่วงผม (hairpin loop) เข้ากับชิ้นส่วนนั้นเพื่อเตรียมสำหรับการไฮบริดไดเซชัน สำหรับการคัดเลือกชิ้นส่วน cDNA ที่มีความยาวที่ต้องการ 150-200 bp นั้น ชิ้นส่วนไลบรารีจะถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ระบบ AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA) จากนั้นใช้เอนไซม์ USER Enzyme (NEB, USA) 3 μl ร่วมกับ cDNA ที่คัดเลือกขนาดแล้วและเชื่อมต่อกับอะแดปเตอร์ เป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิ 37°C แล้วจึงทำปฏิกิริยาต่ออีก 5 นาทีที่อุณหภูมิ 95°C ก่อนทำการ PCR จากนั้นทำการ PCR โดยใช้ Phusion High-Fidelity DNA polymerase, ไพรเมอร์ PCR สากล และไพรเมอร์ดัชนี (X) สุดท้าย ผลิตภัณฑ์ PCR จะถูกทำให้บริสุทธิ์ (ระบบ AMPure XP) และประเมินคุณภาพของไลบรารีบนระบบ Agilent Bioanalyzer 2100 จากนั้นจึงทำการลำดับเบสของไลบรารี cDNA โดยใช้เครื่องลำดับเบส Novaseq ไฟล์ภาพดิบจาก Illumina ถูกแปลงเป็นข้อมูลการอ่านดิบโดยใช้ CASAVA Base Calling ข้อมูลดิบจะถูกจัดเก็บในไฟล์รูปแบบ FASTQ(fq) ซึ่งประกอบด้วยลำดับการอ่านและคุณภาพเบสที่เกี่ยวข้อง เลือก HISAT2 เพื่อจับคู่ข้อมูลการอ่านลำดับที่ผ่านการกรองแล้วกับจีโนมอ้างอิง Sscrofa11.1 โดยทั่วไป HISAT2 รองรับจีโนมทุกขนาด รวมถึงจีโนมที่มีขนาดใหญ่กว่า 4 พันล้านเบส และมีการตั้งค่าเริ่มต้นสำหรับพารามิเตอร์ส่วนใหญ่ การจัดเรียงลำดับการอ่านการเชื่อมต่อจากข้อมูล RNA Seq สามารถทำได้อย่างมีประสิทธิภาพโดยใช้ HISAT2 ซึ่งเป็นระบบที่เร็วที่สุดในปัจจุบัน โดยมีความแม่นยำเท่ากันหรือดีกว่าวิธีการอื่น ๆ
ความอุดมสมบูรณ์ของทรานสคริปต์สะท้อนถึงระดับการแสดงออกของยีนโดยตรง ระดับการแสดงออกของยีนถูกประเมินโดยความอุดมสมบูรณ์ของทรานสคริปต์ (จำนวนการเรียงลำดับ) ที่เกี่ยวข้องกับจีโนมหรือเอ็กซอน จำนวนการอ่านเป็นสัดส่วนกับระดับการแสดงออกของยีน ความยาวของยีน และความลึกของการเรียงลำดับ FPKM (fragments per thousand base pairs of transcript sequenced per million base pairs) ถูกคำนวณและค่า P ของการแสดงออกที่แตกต่างกันถูกกำหนดโดยใช้แพ็กเกจ DESeq2 จากนั้นเราคำนวณอัตราการค้นพบที่ผิดพลาด (FDR) สำหรับแต่ละค่า P โดยใช้วิธี Benjamini-Hochberg9 โดยอิงจากฟังก์ชัน “p.adjust” ในตัวของ R
RNA ที่แยกได้จากชิ้นส่วนหัวใจถูกแปลงเป็น cDNA ที่ความเข้มข้น 200 ng/μl โดยใช้ SuperScript IV Vilo Master mix จาก Thermo (Thermo, หมายเลขแคตตาล็อก 11756050) ทำการวิเคราะห์ Quantitative RT-PCR โดยใช้แผ่นปฏิกิริยาโปร่งใส Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384 หลุม (Thermo, หมายเลขแคตตาล็อก 4483319) และกาว Microamp Optical Adhesive (Thermo, หมายเลขแคตตาล็อก 4311971) ส่วนผสมของปฏิกิริยาประกอบด้วย Taqman Fast Advanced Master mix 5 µl (Thermo, หมายเลขแคตตาล็อก 4444557), Taqman Primer 0.5 µl และน้ำ 3.5 µl ผสมลงในแต่ละหลุม ทำการทดสอบ qPCR ตามรอบมาตรฐาน และวัดค่า CT โดยใช้เครื่อง PCR แบบเรียลไทม์ Applied Biosystems Quantstudio 5 (โมดูล 384 หลุม; หมายเลขผลิตภัณฑ์ A28135) ไพรเมอร์ Taqman ซื้อจาก Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1)) ค่า CT ของตัวอย่างทั้งหมดถูกปรับให้เป็นมาตรฐานโดยใช้ยีนควบคุมภายใน GAPDH
การประเมินการปลดปล่อย NT-ProBNP จากสื่อกลางทำโดยใช้ชุดตรวจ NT-ProBNP (สำหรับสุกร) (หมายเลขแคตตาล็อก MBS2086979, MyBioSource) ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต โดยสรุปคือ เติมตัวอย่างและสารมาตรฐานอย่างละ 250 µl ลงในแต่ละหลุมซ้ำกัน ทันทีหลังจากเติมตัวอย่างแล้ว ให้เติม Assay Reagent A จำนวน 50 µl ลงในแต่ละหลุม เขย่าเพลทเบาๆ แล้วปิดผนึกด้วยสารปิดผนึก จากนั้นนำเม็ดทดสอบไปบ่มที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง จากนั้นดูดสารละลายออกและล้างหลุม 4 ครั้งด้วยสารละลายล้าง 1X จำนวน 350 µl โดยบ่มสารละลายล้างแต่ละครั้งเป็นเวลา 1-2 นาที จากนั้นเติม Assay Reagent B จำนวน 100 µl ลงในแต่ละหลุมและปิดผนึกด้วยสารปิดผนึกเพลท เขย่าเม็ดทดสอบเบาๆ และบ่มที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 30 นาที ดูดสารละลายออกและล้างหลุม 5 ครั้งด้วยสารละลายล้าง 1X ปริมาณ 350 µl เติมสารละลายซับสเตรต 90 µl ลงในแต่ละหลุมและปิดผนึกเพลท บ่มเพลทที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 10-20 นาที เติมสารละลายหยุดปฏิกิริยา 50 µl ลงในแต่ละหลุม จากนั้นวัดค่าทันทีโดยใช้เครื่องอ่านเพลท Cytation (BioTek) ที่ตั้งค่าไว้ที่ 450 nm
ได้ทำการวิเคราะห์กำลังการทดสอบเพื่อเลือกขนาดกลุ่มที่จะให้กำลังการทดสอบมากกว่า 80% ในการตรวจจับการเปลี่ยนแปลงสัมบูรณ์ 10% ในพารามิเตอร์ด้วยอัตราความผิดพลาดประเภทที่ 1 ร้อยละ 5 ได้ทำการวิเคราะห์กำลังการทดสอบเพื่อเลือกขนาดกลุ่มที่จะให้กำลังการทดสอบมากกว่า 80% ในการตรวจจับการเปลี่ยนแปลงสัมบูรณ์ 10% ในพารามิเตอร์ด้วยอัตราความผิดพลาดประเภทที่ 1 ร้อยละ 5 Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. ได้ทำการวิเคราะห์กำลังการทดสอบเพื่อเลือกขนาดกลุ่มที่จะให้กำลังการทดสอบมากกว่า 80% ในการตรวจจับการเปลี่ยนแปลงพารามิเตอร์สัมบูรณ์ 10% โดยมีอัตราความผิดพลาดประเภทที่ 1 อยู่ที่ 5%进行功效分析以选择将提供> 80%功效以检测参数中10%绝对变化和5％I型错误率的组大化。进行功效分析以选择将提供> 80%功效以检测参数中10%绝对变化和5％I型错误率的组大化。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. ได้ทำการวิเคราะห์กำลังการทดสอบเพื่อเลือกขนาดกลุ่มตัวอย่างที่จะให้กำลังการทดสอบมากกว่า 80% ในการตรวจจับการเปลี่ยนแปลงพารามิเตอร์สัมบูรณ์ 10% และอัตราความผิดพลาดประเภทที่ 1 5%ก่อนเริ่มการทดลอง ได้ทำการสุ่มเลือกชิ้นส่วนเนื้อเยื่อ การวิเคราะห์ทั้งหมดเป็นการวิเคราะห์แบบปิดบังเงื่อนไข และจะเปิดเผยข้อมูลตัวอย่างหลังจากวิเคราะห์ข้อมูลทั้งหมดเสร็จสิ้นแล้ว ใช้โปรแกรม GraphPad Prism (ซานดิเอโก รัฐแคลิฟอร์เนีย) ในการวิเคราะห์ทางสถิติทั้งหมด สำหรับสถิติทั้งหมด ค่า p-value ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติเมื่อมีค่าน้อยกว่า 0.05 สำหรับสถิติทั้งหมด ค่า p-value ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติเมื่อค่า <0.05 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. สำหรับสถิติทั้งหมด ค่า p-value ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติเมื่อค่า <0.05对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. สำหรับสถิติทั้งหมด ค่า p-value ถือว่ามีนัยสำคัญทางสถิติเมื่อค่า <0.05ทำการทดสอบ t-test แบบสองด้านกับข้อมูลที่มีการเปรียบเทียบเพียง 2 ครั้ง ใช้ ANOVA แบบทางเดียวหรือสองทางเพื่อหาความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างกลุ่มหลายกลุ่ม เมื่อทำการทดสอบ post hoc จะใช้การแก้ไขของ Tukey เพื่อพิจารณาการเปรียบเทียบหลายครั้ง ข้อมูล RNAsec มีข้อควรพิจารณาทางสถิติพิเศษเมื่อคำนวณ FDR และ p.adjust ดังที่อธิบายไว้ในส่วนวิธีการ
สำหรับข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับการออกแบบการศึกษา โปรดดูบทคัดย่อของ Nature Research Report ที่เชื่อมโยงกับบทความนี้