Շնորհակալություն Nature.com կայք այցելելու համար: Ձեր օգտագործած դիտարկիչի տարբերակն ունի սահմանափակ CSS աջակցություն: Լավագույն փորձի համար խորհուրդ ենք տալիս օգտագործել թարմացված դիտարկիչ (կամ անջատել համատեղելիության ռեժիմը Internet Explorer-ում): Մինչդեռ, շարունակական աջակցությունն ապահովելու համար, մենք կայքը կցուցադրենք առանց ոճերի և JavaScript-ի:
Անհրաժեշտ է հուսալի in vitro համակարգ, որը կարող է ճշգրիտ վերարտադրել սրտի ֆիզիոլոգիական միջավայրը դեղերի թեստավորման համար: Մարդու սրտի հյուսվածքի կուլտուրայի համակարգերի սահմանափակ մատչելիությունը հանգեցրել է սրտային դեղերի ազդեցության սխալ մեկնաբանությունների: Այստեղ մենք մշակել ենք սրտի հյուսվածքի կուլտուրայի մոդել (CTCM), որը էլեկտրամեխանիկորեն խթանում է սրտի կտորները և ենթարկվում է ֆիզիոլոգիական ձգման սրտային ցիկլի սիստոլիկ և դիաստոլիկ փուլերում: 12 օրվա կուլտուրայից հետո այս մոտեցումը մասամբ բարելավել է սրտի կտորների կենսունակությունը, բայց լիովին չի պահպանել դրանց կառուցվածքային ամբողջականությունը: Հետևաբար, փոքր մոլեկուլների սկրինինգից հետո մենք պարզեցինք, որ մեր միջավայրում 100 նՄ տրիյոդթիրոնինի (T3) և 1 մկՄ դեքսամետազոնի (Dex) ավելացումը պահպանել է կտորների միկրոկառուցվածքը 12 օրվա ընթացքում: T3/Dex բուժման հետ համատեղ, CTCM համակարգը պահպանել է տրանսկրիպցիոն պրոֆիլները, կենսունակությունը, նյութափոխանակության ակտիվությունը և կառուցվածքային ամբողջականությունը նույն մակարդակի վրա, ինչ թարմ սրտի հյուսվածքը 12 օրվա ընթացքում: Բացի այդ, կուլտուրայում սրտի հյուսվածքի չափազանց ձգումը առաջացնում է հիպերտրոֆիկ սրտային ազդանշաններ, ինչը ապացույց է հանդիսանում CTCM-ի՝ սրտի ձգման հետևանքով առաջացած հիպերտրոֆիկ վիճակները ընդօրինակելու ունակության համար: Եզրափակելով, CTCM-ն կարող է մոդելավորել սրտի ֆիզիոլոգիան և պաթոֆիզիոլոգիան կուլտուրայի մեջ երկար ժամանակահատվածում, ինչը հնարավորություն է տալիս իրականացնել դեղերի հուսալի սկրինինգ։
Կլինիկական հետազոտություններից առաջ անհրաժեշտ են հուսալի in vitro համակարգեր, որոնք կարող են ճշգրիտ վերարտադրել մարդու սրտի ֆիզիոլոգիական միջավայրը: Նման համակարգերը պետք է ընդօրինակեն մեխանիկական ձգման, սրտի զարկերի հաճախության և էլեկտրաֆիզիոլոգիական հատկությունների փոփոխությունը: Կենդանիների մոդելները սովորաբար օգտագործվում են որպես սրտի ֆիզիոլոգիայի սկրինինգային հարթակ՝ սահմանափակ հուսալիությամբ՝ մարդու սրտում դեղերի ազդեցությունը արտացոլելու համար1,2: Վերջիվերջո, իդեալական սրտի հյուսվածքային կուլտուրայի փորձարարական մոդելը (CTCM) մոդել է, որը բարձր զգայունություն ունի և յուրահատուկ է տարբեր թերապևտիկ և դեղաբանական միջամտությունների համար, ճշգրիտ վերարտադրելով մարդու սրտի ֆիզիոլոգիան և պաթոֆիզիոլոգիան3: Նման համակարգի բացակայությունը սահմանափակում է սրտի անբավարարության նոր բուժումների հայտնաբերումը4,5 և հանգեցրել է դեղերի կարդիոթոքսիկության՝ որպես շուկայից դուրս գալու հիմնական պատճառ6:
Վերջին տասնամյակի ընթացքում ութ ոչ սրտանոթային դեղամիջոցներ հանվել են կլինիկական օգտագործումից, քանի որ դրանք առաջացնում են QT ինտերվալի երկարացում, ինչը հանգեցնում է փորոքային առիթմիաների և հանկարծակի մահվան7: Այսպիսով, աճում է սրտանոթային արդյունավետությունն ու թունավորությունը գնահատելու համար հուսալի նախակլինիկական սկրինինգային ռազմավարությունների անհրաժեշտությունը: Մարդու կողմից ինդուկցված պլուրիպոտենտ ցողունային բջիջներից ստացված կարդիոմիոցիտների (hiPS-CM) վերջերս օգտագործումը դեղերի սկրինինգում և թունավորության թեստավորման մեջ մասնակի լուծում է տալիս այս խնդրին: Այնուամենայնիվ, hiPS-CM-ների անհասուն բնույթը և սրտի հյուսվածքի բազմաբջջային բարդության բացակայությունը այս մեթոդի հիմնական սահմանափակումներն են: Վերջին ուսումնասիրությունները ցույց են տվել, որ այս սահմանափակումը կարող է մասամբ հաղթահարվել՝ վաղ hiPS-CM-ն օգտագործելով սրտի հյուսվածքի հիդրոգելեր ձևավորելու համար ինքնաբուխ կծկումների սկսվելուց կարճ ժամանակ անց և ժամանակի ընթացքում աստիճանաբար ավելացնելով էլեկտրական խթանումը: Այնուամենայնիվ, այս hiPS-CM միկրոհյուսվածքները զուրկ են չափահաս միոկարդի հասուն էլեկտրաֆիզիոլոգիական և կծկվող հատկություններից: Բացի այդ, մարդու սրտի հյուսվածքն ունի ավելի բարդ կառուցվածք, որը բաղկացած է տարբեր բջջային տեսակների տարասեռ խառնուրդից, ներառյալ էնդոթելային բջիջները, նեյրոնները և ստրոմալ ֆիբրոբլաստները, որոնք փոխկապակցված են արտաբջջային մատրիցի սպիտակուցների հատուկ հավաքածուներով: Մեծահասակ կաթնասունների սրտում ոչ կարդիոմիոցիտների պոպուլյացիաների11,12,13 այս տարասեռությունը հիմնական խոչընդոտ է սրտի հյուսվածքը առանձին բջջային տեսակների միջոցով մոդելավորելու համար: Այս հիմնական սահմանափակումները ընդգծում են ֆիզիոլոգիական և պաթոլոգիական պայմաններում ամբողջական միոկարդի հյուսվածքի կուլտիվացման մեթոդների մշակման կարևորությունը:
Մարդու սրտի բարակ (300 մկմ) կուլտուրաների միջոցով ստացված հատվածները ապացուցել են իրենց անձեռնմխելի մարդու միոկարդի խոստումնալից մոդել լինելը: Այս մեթոդը հնարավորություն է տալիս մուտք գործել մարդու սրտի հյուսվածքին նման ամբողջական եռաչափ բազմաբջջային համակարգ: Այնուամենայնիվ, մինչև 2019 թվականը կուլտուրաների միջոցով ստացված հատվածների օգտագործումը սահմանափակված էր կարճ (24 ժամ) կուլտուրայի գոյատևմամբ: Սա պայմանավորված է մի շարք գործոններով, այդ թվում՝ ֆիզիկա-մեխանիկական ձգման բացակայությամբ, օդ-հեղուկ միջերեսով և պարզ միջավայրերի օգտագործմամբ, որոնք չեն բավարարում սրտի հյուսվածքի կարիքները: 2019 թվականին մի քանի հետազոտական ​​խմբեր ցույց տվեցին, որ մեխանիկական գործոնների ներառումը սրտի հյուսվածքի կուլտուրայի համակարգերում կարող է երկարացնել կուլտուրայի կյանքը, բարելավել սրտի արտահայտությունը և ընդօրինակել սրտի պաթոլոգիան: Երկու նրբագեղ ուսումնասիրություններ 17 և 18 ցույց են տալիս, որ միառանցքային մեխանիկական բեռնումը դրական ազդեցություն ունի սրտի ֆենոտիպի վրա կուլտուրայի ընթացքում: Այնուամենայնիվ, այս ուսումնասիրությունները չեն օգտագործել սրտի ցիկլի դինամիկ եռաչափ ֆիզիկա-մեխանիկական բեռնումը, քանի որ սրտի հատվածները բեռնված են եղել կամ իզոմետրիկ ձգման ուժերով 17, կամ գծային աուքսոտոնիկ բեռնվածությամբ 18: Հյուսվածքների ձգման այս մեթոդները հանգեցրին սրտի բազմաթիվ գեների ճնշմանը կամ աննորմալ ձգման արձագանքների հետ կապված գեների գերարտահայտմանը: Հատկանշական է, որ Պիտուլիսը և այլք19 մշակել են սրտի ցիկլի վերականգնման համար դինամիկ սրտի կտորի կուլտուրայի լոգարան՝ օգտագործելով ուժային փոխակերպիչի հետադարձ կապը և լարվածության շարժիչները: Չնայած այս համակարգը թույլ է տալիս ավելի ճշգրիտ in vitro սրտի ցիկլի մոդելավորում, մեթոդի բարդությունը և ցածր թողունակությունը սահմանափակում են այս համակարգի կիրառումը: Մեր լաբորատորիան վերջերս մշակել է պարզեցված կուլտուրայի համակարգ՝ օգտագործելով էլեկտրական խթանում և օպտիմիզացված միջավայր՝ խոզի և մարդու սրտի հյուսվածքի հատվածների կենսունակությունը մինչև 6 օր պահպանելու համար20,21:
Այս ձեռագրում մենք նկարագրում ենք սրտի հյուսվածքի կուլտուրայի մոդել (CTCM)՝ օգտագործելով խոզի սրտի հատվածներ, որը ներառում է հումորալ ազդանշաններ՝ սրտի ցիկլի ընթացքում եռաչափ սրտի ֆիզիոլոգիան և պաթոֆիզիոլոգիական ձգվածությունը ամփոփելու համար: Այս CTCM-ն կարող է բարձրացնել դեղամիջոցների նախակլինիկական կանխատեսման ճշգրտությունը մինչև երբեք չհասած մակարդակի՝ ապահովելով ծախսարդյունավետ, միջին արտադրողականության սրտային համակարգ, որը նմանակում է կաթնասունների սրտի ֆիզիոլոգիան/պաթոֆիզիոլոգիան՝ նախակլինիկական դեղամիջոցների փորձարկման համար:
Հեմոդինամիկ մեխանիկական ազդանշանները կարևոր դեր են խաղում կարդիոմիոցիտների ֆունկցիայի պահպանման գործում in vitro 22,23,24: Այս ձեռագրում մենք մշակել ենք CTCM (Նկար 1ա), որը կարող է ընդօրինակել մեծահասակների սրտի միջավայրը՝ առաջացնելով ինչպես էլեկտրական, այնպես էլ մեխանիկական խթանում ֆիզիոլոգիական հաճախականություններով (1.2 Հց, 72 զարկ րոպեում): Դիաստոլայի ընթացքում հյուսվածքների չափազանց ձգումից խուսափելու համար օգտագործվել է 3D տպագրության սարք՝ հյուսվածքի չափը 25%-ով մեծացնելու համար (Նկար 1բ): C-PACE համակարգի կողմից առաջացած էլեկտրական խթանումը ժամանակագրվել է սիստոլայից 100 մվրկ առաջ սկսելու համար՝ օգտագործելով տվյալների ձեռքբերման համակարգ՝ սրտի ցիկլը լիովին վերարտադրելու համար: Հյուսվածքային կուլտուրայի համակարգը օգտագործում է ծրագրավորվող պնևմատիկ ակտիվատոր (LB Engineering, Գերմանիա)՝ ճկուն սիլիկոնային թաղանթը ցիկլիկորեն ընդարձակելու համար՝ վերին խցիկում սրտի կտորների ընդարձակում առաջացնելու համար: Համակարգը միացված էր արտաքին օդային գծին ճնշման փոխարկիչի միջոցով, ինչը հնարավորություն տվեց ճշգրիտ կարգավորել ճնշումը (± 1 մմ ս.ս.) և ժամանակը (± 1 մվրկ) (Նկար 1գ):
ա) Հյուսվածքային հատվածը ամրացրեք սարքի կուլտուրայի խցիկի ներսում գտնվող 7 մմ հենարանային օղակին, որը ցույց է տրված կապույտ գույնով: Կուլտուրայի խցիկը օդային խցիկից բաժանված է բարակ ճկուն սիլիկոնե թաղանթով: Յուրաքանչյուր խցիկի միջև տեղադրեք միջադիր՝ արտահոսքերը կանխելու համար: Սարքի կափարիչը պարունակում է գրաֆիտային էլեկտրոդներ, որոնք ապահովում են էլեկտրական խթանում: բ) Մեծ հյուսվածքային սարքի, ուղեցույց օղակի և հենարանային օղակի սխեմատիկ ներկայացումը: Հյուսվածքային հատվածները (շագանակագույն) տեղադրվում են մեծ չափի սարքի վրա՝ ուղեցույց օղակը տեղադրելով սարքի արտաքին եզրի ակոսում: Օգտագործելով ուղեցույցը, զգուշորեն տեղադրեք հյուսվածքային ակրիլային սոսինձով պատված հենարանային օղակը սրտի հյուսվածքի հատվածի վրա: գ) Գրաֆիկ, որը ցույց է տալիս էլեկտրական խթանման ժամանակը որպես ծրագրավորվող պնևմատիկ ակտիվատորի (PPD) կողմից կառավարվող օդային խցիկի ճնշման ֆունկցիա: Տվյալների ձեռքբերման սարքն օգտագործվել է էլեկտրական խթանումը համաժամեցնելու համար՝ օգտագործելով ճնշման սենսորներ: Երբ կուլտուրայի խցիկի ճնշումը հասնում է սահմանված շեմին, C-PACE-EM-ին ուղարկվում է իմպուլսային ազդանշան՝ էլեկտրական խթանումը գործարկելու համար: դ) Ինկուբատորի դարակի վրա տեղադրված չորս CTCM-ների պատկեր: Չորս սարքեր միացված են մեկ PPD-ին պնևմատիկ շղթայի միջոցով, և ճնշման սենսորները տեղադրվում են հեմոստատիկ փականի մեջ՝ պնևմատիկ շղթայի ճնշումը վերահսկելու համար: Յուրաքանչյուր սարք պարունակում է վեց հյուսվածքային հատվածներ։
Մեկ պնևմատիկ ակտիվատորի միջոցով մենք կարողացանք կառավարել 4 CTCM սարքեր, որոնցից յուրաքանչյուրը կարող էր պարունակել 6 հյուսվածքային հատված (Նկար 1դ): CTCM-ում օդային խցիկում օդային ճնշումը վերածվում է հեղուկ խցիկում համաժամանակյա ճնշման և առաջացնում է սրտի հատվածի ֆիզիոլոգիական լայնացում (Նկար 2ա և լրացուցիչ տեսանյութ 1): Հյուսվածքի ձգման գնահատումը 80 մմ ս.ս. ճնշման տակ: Նկարը ցույց է տվել հյուսվածքային հատվածների 25%-ով ձգում (Նկար 2բ): Այս տոկոսային ձգումը, ինչպես ցույց է տրվել, համապատասխանում է ֆիզիոլոգիական սարկոմերի 2.2–2.3 մկմ երկարությանը՝ սրտի հատվածի նորմալ կծկման դեպքում17,19,25: Հյուսվածքի շարժումը գնահատվել է տեսախցիկի հատուկ կարգավորումների միջոցով (Լրացուցիչ նկար 1): Հյուսվածքի շարժման ամպլիտուդը և արագությունը (Նկար 2գ, դ) համապատասխանում էին սրտի ցիկլի ընթացքում ձգմանը և սիստոլայի և դիաստոլայի ժամանակին (Նկար 2բ): Սրտի հյուսվածքի ձգումը և արագությունը կծկման և թուլացման ընթացքում մնացել են անփոփոխ 12 օրվա ընթացքում կուլտուրայում (Նկար 2զ): Կուլտուրայի ընթացքում էլեկտրական խթանման ազդեցությունը կծկվողականության վրա գնահատելու համար մենք մշակեցինք ակտիվ դեֆորմացիան որոշելու մեթոդ՝ օգտագործելով ստվերավորման ալգորիթմ (Լրացուցիչ նկ. 2ա,բ) և կարողացանք տարբերակել էլեկտրական խթանմամբ և առանց դրա դեֆորմացիաները: Սրտի նույն հատվածը (նկ. 2զ): Կտրվածքի շարժական շրջանում (R6-9) էլեկտրական խթանման ժամանակ լարումը 20%-ով ավելի բարձր էր, քան էլեկտրական խթանման բացակայության դեպքում, ինչը ցույց է տալիս էլեկտրական խթանման ներդրումը կծկվող ֆունկցիայում:
Օդային խցիկի ճնշման, հեղուկ խցիկի ճնշման և հյուսվածքների շարժման չափումների ներկայացուցչական հետքերը հաստատում են, որ խցիկի ճնշումը փոխում է հեղուկ խցիկի ճնշումը՝ առաջացնելով հյուսվածքի կտորի համապատասխան շարժում։ բ Հյուսվածքային հատվածների տոկոսային ձգման ներկայացուցչական հետքերը (կապույտ), որոնք համապատասխանում են տոկոսային ձգմանը (նարնջագույն)։ գ Սրտի կտորի չափված շարժումը համապատասխանում է շարժման չափված արագությանը։ (դ) Սրտի կտորում ցիկլիկ շարժման ներկայացուցչական հետագծերը (կապույտ գիծ) և արագությունը (նարնջագույն կետավոր գիծ)։ ե Ցիկլի ժամանակի քանակականացումը (n = 19 կտոր մեկ խմբում, տարբեր խոզերից), կծկման ժամանակը (n = 19 կտոր մեկ խմբում, տարբեր խոզերից), թուլացման ժամանակը (n = 19 կտոր մեկ խմբում, տարբեր խոզերից), հյուսվածքի շարժումը (n = 25 կտոր)/խումբ տարբեր խոզերից), գագաթնակետային սիստոլիկ արագությունը (n = 24(D0), 25(D12) կտոր/խումբ տարբեր խոզերից) և գագաթնակետային թուլացման արագությունը (n=24(D0), 25(D12) կտոր/խումբ տարբեր խոզերից)։ Երկկողմանի Ստյուդենտի t-թեստը որևէ պարամետրում էական տարբերություն չի ցույց տվել։ f Հյուսվածքային հատվածների ներկայացուցչական լարվածության վերլուծություն՝ էլեկտրական խթանմամբ (կարմիր) և առանց (կապույտ) էլեկտրական խթանման հետքերով, նույն հատվածի հյուսվածքային հատվածների տասը տարածաշրջանային տարածքներ: Ներքևի վահանակները ցույց են տալիս լարվածության տոկոսային տարբերության քանակականացումը էլեկտրական խթանմամբ և առանց խթանման հյուսվածքային հատվածներում՝ տարբեր հատվածների տասը տարածքներում: (n = 8 կտոր/խումբ տարբեր խոզերից, կատարվում է երկկողմանի Ստյուդենտի t-փորձարկում; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05): (n = 8 կտոր/խումբ տարբեր խոզերից, կատարվում է երկկողմանի Ստյուդենտի t-փորձարկում; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05): (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05): (n = 8 հատված/խումբ տարբեր խոզերից, երկկողմանի Ստյուդենտի t-փորձ; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05): （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001，**p <0.01，5p <0.01，5p （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001，**p <0.01，5p <0.01，5p (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05): (n = 8 բաժին/խումբ, տարբեր խոզերից, երկկողմանի Ստյուդենտի t-թեստ; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05):Սխալի սյուները ներկայացնում են միջին ± ստանդարտ շեղումը։
Մեր նախորդ ստատիկ բիոմիմետիկ սրտի կտորների կուլտուրայի համակարգում [20, 21] մենք պահպանել ենք սրտի կտորների կենսունակությունը, գործառույթը և կառուցվածքային ամբողջականությունը 6 օրվա ընթացքում՝ կիրառելով էլեկտրական խթանում և օպտիմալացնելով միջավայրի կազմը: Սակայն, 10 օր անց այս ցուցանիշները կտրուկ նվազել են: Մենք կանդրադառնանք մեր նախորդ ստատիկ բիոմիմետիկ կուլտուրայի համակարգում 20, 21 վերահսկիչ պայմաններում (Ctrl) կուլտուրայված հատվածներին և կօգտագործենք մեր նախկինում օպտիմիզացված միջավայրը որպես MC պայմաններ և միաժամանակյա մեխանիկական և էլեկտրական խթանման (CTCM) պայմաններում կուլտուրա, որը կոչվում է : Նախ, մենք որոշեցինք, որ էլեկտրական խթանման առանց մեխանիկական խթանումը բավարար չէ հյուսվածքների կենսունակությունը 6 օրվա ընթացքում պահպանելու համար (Լրացուցիչ նկ. 3ա,բ): Հետաքրքիր է, որ STCM-ի միջոցով ֆիզիոմեխանիկական և էլեկտրական խթանման ներդրմամբ 12-օրյա սրտի կտորների կենսունակությունը մնացել է նույնը, ինչ թարմ սրտի կտորներում MS պայմաններում, բայց ոչ Ctrl պայմաններում, ինչպես ցույց է տվել MTT վերլուծությունը (նկ. 1): 3ա): Սա ենթադրում է, որ սրտի ցիկլի մեխանիկական խթանումը և մոդելավորումը կարող են հյուսվածքների կտորները կենսունակ պահել երկու անգամ ավելի երկար, քան նշված էր մեր նախորդ ստատիկ կուլտուրայի համակարգում: Սակայն, սրտի տրոպոնին T-ի և կոնեքսին 43-ի իմունային նշագրման միջոցով հյուսվածքային հատվածների կառուցվածքային ամբողջականության գնահատումը ցույց տվեց, որ կոնեքսին 43-ի արտահայտությունը MC հյուսվածքներում 12-րդ օրը զգալիորեն ավելի բարձր էր, քան վերահսկիչ խմբում նույն օրը: Սակայն, կոնեքսին 43-ի միատարր արտահայտությունը և Z-սկավառակի ձևավորումը լիովին չեն պահպանվել (Նկար 3բ): Մենք օգտագործում ենք արհեստական ​​բանականության (AI) շրջանակ՝ հյուսվածքների կառուցվածքային ամբողջականությունը քանակականացնելու համար26, պատկերի վրա հիմնված խորը ուսուցման խողովակաշար՝ հիմնված տրոպոնին-T-ի և կոնեքսինի ներկման վրա43՝ սրտի հատվածների կառուցվածքային ամբողջականությունը և ֆլուորեսցենցիան ավտոմատ կերպով քանակականացնելու համար՝ տեղայնացման ուժի առումով: Այս մեթոդը օգտագործում է կոնվոլյուցիոն նեյրոնային ցանց (CNN) և խորը ուսուցման շրջանակ՝ սրտի հյուսվածքի կառուցվածքային ամբողջականությունը հուսալիորեն քանակականացնելու համար՝ ավտոմատացված և անաչառ եղանակով, ինչպես նկարագրված է հղումում:26. MC հյուսվածքը ցույց տվեց բարելավված կառուցվածքային նմանություն 0-րդ օրվա համեմատ՝ համեմատած ստատիկ վերահսկիչ հատվածների հետ: Բացի այդ, Մասոնի եռագույն ներկումը ցույց տվեց ֆիբրոզի զգալիորեն ցածր տոկոս MS պայմաններում՝ համեմատած վերահսկիչ պայմանների հետ՝ կուլտուրայի 12-րդ օրը (Նկար 3գ): Թեև CTCM-ն 12-րդ օրը սրտի հյուսվածքի հատվածների կենսունակությունը բարձրացրեց մինչև թարմ սրտի հյուսվածքի նման մակարդակի, այն էապես չբարելավեց սրտի հատվածների կառուցվածքային ամբողջականությունը։
Սյունակային գրաֆիկը ցույց է տալիս թարմ սրտի կտորների (D0) կամ սրտի կտորների կուլտուրայի MTT կենսունակության քանակական որոշումը 12 օրվա ընթացքում՝ կա՛մ ստատիկ կուլտուրայում (D12 Ctrl), կա՛մ CTCM-ում (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) կտոր/խումբ՝ տարբեր խոզերից, կատարվել է միակողմանի ANOVA թեստ. ####p < 0.0001՝ համեմատած D0-ի հետ և **p < 0.01՝ համեմատած D12 Ctrl-ի հետ): Սյունակային գրաֆիկը ցույց է տալիս թարմ սրտի կտորների (D0) կամ սրտի կտորների կուլտուրայի MTT կենսունակության քանակական որոշումը 12 օրվա ընթացքում՝ կա՛մ ստատիկ կուլտուրայում (D12 Ctrl), կա՛մ CTCM-ում (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) կտոր/խումբ՝ տարբեր խոզերից, կատարվել է միակողմանի ANOVA թեստ. ####p < 0.0001՝ համեմատած D0-ի հետ և **p < 0.01՝ համեմատած D12 Ctrl-ի հետ):Հիստոգրամը ցույց է տալիս MTT թարմ սրտի հատվածների (D0) կամ սրտի հատվածների կենսունակության քանակական որոշումը 12 օրվա ընթացքում՝ կա՛մ ստատիկ կուլտուրայում (D12 վերահսկիչ), կա՛մ CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 վերահսկիչ)։ ) ), տարբեր խոզերից 12 (D12 MC) հատվածներ/խմբում, կատարվում է միակողմանի ANOVA թեստ։####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl): ####p < 0.0001՝ համեմատած D0-ի հետ և **p < 0.01՝ համեմատած D12 Ctrl-ի հետ)։ a 条形图显示在静态培养 (D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏 (D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组萌VA北测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比,**p <0.01)։ a 条形图显示在静态培养 (D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏 (D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，#####p <1D，0l相比,**p.)Հիստոգրամ, որը ցույց է տալիս MTT կենսունակության քանակական որոշումը թարմ սրտի հատվածներում (D0) կամ ստատիկ կուլտուրայում (D12 վերահսկիչ) կամ CTCM (D12 MC) 12 օր կուլտիվացված սրտի հատվածներում (n = 18 (D0), 15 (D12 վերահսկիչ)), տարբեր խոզերից 12 (D12 MC) հատվածներում/խմբում, միակողմանի ANOVA թեստ։####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl): ####p < 0.0001՝ համեմատած D0-ի հետ, **p < 0.01՝ համեմատած D12 Ctrl-ի հետ։բ) Տրոպոնին-T (կանաչ), կոնեքսին 43 (կարմիր) և DAPI (կապույտ)՝ թարմ մեկուսացված սրտի հատվածներում (D0) կամ ստատիկ պայմաններում (Ctrl) կամ CTCM պայմաններում (MC) 12 օր կուլտիվացված սրտի հատվածներում) ներկայացուցչական իմունաֆլուորեսցենտային պատկերներում (դատարկ մասշտաբ = 100 մկմ): Սրտի հյուսվածքի կառուցվածքային ամբողջականության քանակական որոշում արհեստական ​​բանականությամբ (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) կտորներ/խումբ՝ յուրաքանչյուրը տարբեր խոզից, իրականացվել է միակողմանի ANOVA թեստ. ####p < 0.0001՝ համեմատած D0-ի հետ և ****p < 0.0001՝ համեմատած D12 Ctrl-ի հետ): Սրտի հյուսվածքի կառուցվածքային ամբողջականության քանակական որոշում արհեստական ​​բանականությամբ (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) կտորներ/խումբ՝ յուրաքանչյուրը տարբեր խոզերից, իրականացվել է միակողմանի ANOVA թեստ. ####p < 0.0001՝ համեմատած D0-ի հետ և ****p < 0.0001՝ համեմատած D12 Ctrl-ի հետ): Количественная оценка структурной целости сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный, проводится однофакторный, проводится однофакторный, проводится однофакторный <0#0 сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl): Սրտի հյուսվածքի կառուցվածքային ամբողջականության քանակական որոշում արհեստական ​​բանականության միջոցով (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) հատումներ/խմբեր տարբեր խոզերից, միակողմանի ANOVA թեստի իրականացում; ####p < 0.0001՝ համեմատած D0-ի և ****p < 0.0001-ի հետ՝ համեմատած D12 Ctrl-ի հետ):人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) կտորներ/խումբ յուրաքանչյուր տարբեր խոզերի, միակողմանի ANOVA թեստ.相比，****p <0,0001 与D12 Ctrl 相比）։人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) շերտ/խումբ յուրաքանչյուր տարբեր խոզեր, միակողմանի ANOVA թեստ;与D0相比，****p <0,0001 与D12 Ctrl 相比）։ Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней vs. v. Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl): Արհեստական ​​բանականություն՝ սրտի հյուսվածքի կառուցվածքային ամբողջականության քանակական որոշման համար (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) հատվածներ/խումբ՝ տարբեր խոզերի յուրաքանչյուրից, միակողմանի ANOVA թեստ; ####p<0.0001 ընդդեմ .D0 Համեմատության համար ****p < 0.0001՝ համեմատած D12 Ctrl-ի հետ): գ Մասոնի եռագույն ներկով ներկված սրտի կտորների ներկայացուցչական պատկերներ (ձախից) և քանակական որոշում (աջից) (Scale bare = 500 մկմ) (n = 10 կտոր/խումբ՝ յուրաքանչյուրը տարբեր խոզից, կատարվել է միակողմանի ANOVA թեստ. ####p < 0.0001՝ համեմատած D0-ի հետ և ***p < 0.001՝ համեմատած D12 Ctrl-ի հետ): գ Մասոնի եռագույն ներկով ներկված սրտի կտորների ներկայացուցչական պատկերներ (ձախից) և քանակական որոշում (աջից) (Scale bare = 500 մկմ) (n = 10 կտոր/խումբ՝ տարբեր խոզերից, կատարվել է միակողմանի ANOVA թեստ. #### p < 0.0001՝ համեմատած D0-ի հետ և ***p < 0.001՝ համեմատած D12 Ctrl-ի հետ): c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Massona (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/групу). համեմատական ​​тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). գ Մասոնի եռագույն ներկով ներկված սրտի հատվածների ներկայացուցչական պատկերներ (ձախից) և քանակականացում (աջից) (չծածկված մասշտաբ = 500 մկմ) (n = 10 հատված/խումբ տարբեր խոզերից, կատարվել է միակողմանի ANOVA թեստ. #### p < 0.0001՝ համեմատած D0-ի հետ և ***p < 0.001՝ համեմատած D12 Ctrl-ի հետ): c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（表性图像（左）和量化（右）（裸）（裸尺个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相0，10 与D0 相0，相比）։ C 用 Masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尣庣度度裸尺度 = 500 μm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单# 向 单向 单#向 Ան 0,0001 与D0 相比，***p <0,001 与D12 Ctrl 相比）։ c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 մկմ) (n = 10 срезов/групыпа, բողոքի այլ կերպ. помощью однофакторного дисперсионного վերլուծություն ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl): գ Մասոնի եռագույն ներկով ներկված սրտի հատվածների ներկայացուցչական պատկերներ (ձախ) և քանակական որոշում (աջ) (դատարկ = 500 մկմ) (n = 10 հատված/խումբ, յուրաքանչյուրը տարբեր խոզից, ստուգված միակողմանի դիսպերսիայի վերլուծությամբ ;### # p < 0.0001՝ համեմատած D0-ի հետ, ***p < 0.001՝ համեմատած D12 Ctrl-ի հետ):Սխալի սյուները ներկայացնում են միջին ± ստանդարտ շեղումը։
Մենք ենթադրեցինք, որ կուլտուրայի միջավայրում փոքր մոլեկուլներ ավելացնելով՝ կարելի է բարելավել սրտամկանի բջիջների ամբողջականությունը և նվազեցնել ֆիբրոզի զարգացումը CTCM կուլտուրայի ընթացքում: Հետևաբար, մենք մեր ստատիկ վերահսկիչ կուլտուրաների միջոցով ստուգեցինք փոքր մոլեկուլները20,21՝ շփոթեցնող գործոնների փոքր թվի պատճառով: Այս ստուգման համար ընտրվեցին դեքսամետազոնը (Dex), տրիիոդթիրոնինը (T3) և SB431542 (SB): Այս փոքր մոլեկուլները նախկինում օգտագործվել են hiPSC-CM կուլտուրաներում՝ սրտամկանի բջիջների հասունացումը խթանելու համար՝ սարկոմերի երկարությունը, T-խողովակները և հաղորդականության արագությունը մեծացնելու միջոցով: Բացի այդ, հայտնի է, որ և՛ Dex-ը (գլյուկոկորտիկոիդ), և՛ SB-ն ճնշում են բորբոքումը29,30: Հետևաբար, մենք ստուգեցինք, թե արդյոք այս փոքր մոլեկուլներից մեկի կամ դրանց համադրության ներառումը կբարելավի սրտի հատվածների կառուցվածքային ամբողջականությունը: Սկզբնական ստուգման համար յուրաքանչյուր միացության դեղաչափը ընտրվեց բջջային կուլտուրայի մոդելներում սովորաբար օգտագործվող կոնցենտրացիաների հիման վրա (1 μM Dex27, 100 nM T327 և 2.5 μM SB31): 12-օրյա կուլտուրայից հետո, T3-ի և Dex-ի համադրությունը հանգեցրեց կարդիոմիոցիտների օպտիմալ կառուցվածքային ամբողջականության և նվազագույն մանրաթելային վերակառուցման (Լրացուցիչ նկարներ 4 և 5): Բացի այդ, T3-ի և Dex-ի կրկնակի կամ կրկնակի կոնցենտրացիաների օգտագործումը վնասակար ազդեցություն ունեցավ նորմալ կոնցենտրացիաների համեմատ (Լրացուցիչ նկար 6ա,բ):
Սկզբնական սկրինինգից հետո մենք կատարեցինք 4 կուլտուրայի պայմանների անմիջական համեմատություն (Նկար 4ա). Ctrl՝ սրտի հատվածներ, որոնք կուլտիվացվել են մեր նախկինում նկարագրված ստատիկ կուլտուրայում՝ օգտագործելով մեր օպտիմիզացված միջավայրը. 20.21 TD՝ T3 և Ctrl s-ը չորեքշաբթի օրը ավելացրել են Dex. MC՝ սրտի հատվածներ, որոնք կուլտիվացվել են CTCM-ում՝ օգտագործելով մեր նախկինում օպտիմիզացված միջավայրը. և MT՝ CTCM՝ միջավայրում ավելացված T3-ով և Dex-ով: 12 օրվա կուլտիվացումից հետո MS և MT հյուսվածքների կենսունակությունը մնացել է նույնը, ինչ MTT անալիզով գնահատված թարմ հյուսվածքներում (Նկար 4բ): Հետաքրքիր է, որ T3-ի և Dex-ի ավելացումը տրանսվելային կուլտուրաներին (TD) չի հանգեցրել կենսունակության զգալի բարելավման՝ համեմատած Ctrl պայմանների հետ, ինչը ցույց է տալիս մեխանիկական խթանման կարևոր դերը սրտի հատվածների կենսունակությունը պահպանելու գործում:
Փորձարարական դիզայնի դիագրամ, որը պատկերում է չորս կուլտուրայի պայմաններ, որոնք օգտագործվել են մեխանիկական խթանման և T3/Dex հավելումների ազդեցությունը միջավայրի վրա 12 օրվա ընթացքում գնահատելու համար։ բ Սյունակային գրաֆիկը ցույց է տալիս կենսունակության քանակական որոշումը կուլտուրայից 12 օր անց բոլոր 4 կուլտուրային պայմաններում (Ctrl, TD, MC և MT)՝ համեմատած թարմ սրտի կտորների հետ (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD և D12 MT), 12 (D12 MC) կտոր/խումբ՝ տարբեր խոզերից, կատարվել է միակողմանի ANOVA թեստ. ####p < 0.0001, ###p < 0.001՝ համեմատած D0-ի հետ և **p < 0.01՝ համեմատած D12 Ctrl-ի հետ): բ Սյունակային գրաֆիկը ցույց է տալիս կենսունակության քանակական որոշումը կուլտուրայից 12 օր անց բոլոր 4 կուլտուրային պայմաններում (Ctrl, TD, MC և MT)՝ համեմատած թարմ սրտի կտորների հետ (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD և D12 MT), 12 (D12 MC) կտոր/խումբ՝ տարբեր խոզերից, կատարվել է միակողմանի ANOVA թեստ. ####p < 0.0001, ###p < 0.001՝ համեմատած D0-ի հետ և **p < 0.01՝ համեմատած D12 ctrl-ի հետ): b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (վերահսկել, TD, MC եւ MT) по сравнению со свежими срезами (D101 (D101) (D101) (D101 (D10) (D10) (D10) (D10) (D10) (D10) (D10) (D10) (D101) (D10) (D101) (D101) (D101) (D101) (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с. 0,01 по сравнению с D12 Ctrl): բ Սյունակային գրաֆիկը ցույց է տալիս կենսունակության քանակական որոշումը կուլտուրայից 12 օր անց բոլոր 4 կուլտուրային պայմաններում (վերահսկիչ, TD, MC և MT)՝ համեմատած թարմ սրտի հատվածների հետ (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD և D12 MT), 12 (D12 MC) հատվածներ/խումբ՝ տարբեր խոզերից, միակողմանի ANOVA թեստ; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 ընդդեմ D0-ի և **p < 0.01՝ համեմատած D12 Ctrl-ի հետ): b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18、21trC TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.00000p <0.00001相比，**p <0.01 与D12控制）։բ 4 12 (Դ12 ՄԿ) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD2 и D12), (D12 TD2 и D12): MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению со контролем D12). բ Հիստոգրամ, որը ցույց է տալիս բոլոր 4 կուլտուրային պայմանները (վերահսկիչ, TD, MC և MT)՝ համեմատած թարմ սրտի հատվածների հետ (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD և D12 MT), տարբեր խոզերից 12 (D12 MC) հատվածներ/խմբ, միակողմանի ANOVA թեստ; ####p<0.0001, ###p<0.001 ընդդեմ D0-ի, **p<0.01 ընդդեմ վերահսկիչ D12-ի): գ Սյունակային գրաֆիկը ցույց է տալիս գլյուկոզի հոսքի քանակական որոշումը կուլտուրայից 12 օր անց բոլոր 4 կուլտուրային պայմաններում (Ctrl, TD, MC և MT)՝ համեմատած թարմ սրտի կտորների հետ (D0) (n = 6 կտոր/խումբ՝ տարբեր խոզերից, կատարվել է միակողմանի ANOVA թեստ. ###p < 0.001՝ համեմատած D0-ի հետ և ***p < 0.001՝ համեմատած D12 Ctrl-ի հետ): գ Սյունակային գրաֆիկը ցույց է տալիս գլյուկոզի հոսքի քանակական որոշումը կուլտուրայից 12 օր անց բոլոր 4 կուլտուրային պայմաններում (Ctrl, TD, MC և MT)՝ համեմատած թարմ սրտի կտորների հետ (D0) (n = 6 կտոր/խումբ՝ տարբեր խոզերից, կատարվել է միակողմանի ANOVA թեստ. ###p < 0.001՝ համեմատած D0-ի հետ և ***p < 0.001՝ համեմատած D12 Ctrl-ի հետ): c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (վերահսկել, TD, MC եւ MT) по сравнению со свежими срезами (6 резами) разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). գ Հիստոգրամը ցույց է տալիս գլյուկոզի հոսքի քանակական որոշումը կուլտուրայից 12 օր անց բոլոր 4 կուլտուրային պայմաններում (վերահսկիչ, TD, MC և MT)՝ համեմատած թարմ սրտի հատվածների հետ (D0) (n = 6 հատված/խումբ՝ տարբեր խոզերից, կատարվել է միակողմանի ANOVA թեստ; ###p < 0.001՝ համեմատած D0-ի հետ և ***p < 0.001՝ համեմատած D12 Ctrl-ի հետ): c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相毹弌弌天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；#0#0p <0.相比，***p <0,001 与D12 Ctrl 相比）։ C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 切片培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 , 来自 猪 , , , , , , , , ,猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p <0,001 与D12 Ctrl 相比）։ c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования за всех 4 условий культивирования (կառավարում, TD, MC եւ MT) по сравнению со свежи (6) срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). գ Հիստոգրամ, որը ցույց է տալիս գլյուկոզի հոսքի քանակական որոշումը կուլտուրայից 12 օր անց բոլոր 4 կուլտուրային պայմանների համար (վերահսկիչ, TD, MC և MT)՝ համեմատած թարմ սրտի հատումների հետ (D0) (n = 6 հատում/խումբ, տարբեր խոզերից, միակողմանի): Կատարվել են ANOVA թեստեր, ###p < 0.001՝ համեմատած D0-ի հետ, ***p < 0.001՝ համեմատած D12-ի հետ (վերահսկիչ):դ Թարմ (կապույտ), 12-րդ օրվա MC (կանաչ) և 12-րդ օրվա MT (կարմիր) հյուսվածքների լարվածության վերլուծության գրաֆիկներ տասը տարածաշրջանային հյուսվածքային կտրվածքի կետերում (n = 4 շերտ/խումբ, միակողմանի ANOVA թեստ. խմբերի միջև էական տարբերություն չկար): ե Հրաբխային գրաֆիկ, որը ցույց է տալիս թարմ սրտի կտրվածքներում (D0) տարբերակված արտահայտված գեները՝ համեմատած ստատիկ պայմաններում (Ctrl) կամ MT պայմաններում (MT) 10-12 օրվա ընթացքում մշակված սրտի կտրվածքների հետ: զ Մշակույթի յուրաքանչյուր պայմաններում մշակված սրտի կտրվածքների սարկոմերային գեների ջերմային քարտեզ: Սխալի սյուները ներկայացնում են միջին ± ստանդարտ շեղումը:
Մետաբոլիկ կախվածությունը ճարպաթթուների օքսիդացումից գլիկոլիզի անցումից կարդիոմիոցիտների դեդիֆերենցիացիայի բնորոշ նշան է: Անհասուն կարդիոմիոցիտները հիմնականում օգտագործում են գլյուկոզը ԱԵՖ-ի արտադրության համար և ունեն հիպոպլաստիկ միտոքոնդրիաներ՝ քիչ կրիստայով5,32: Գլյուկոզի օգտագործման վերլուծությունները ցույց տվեցին, որ MC և MT պայմաններում գլյուկոզի օգտագործումը նման էր 0-րդ օրվա հյուսվածքների օգտագործմանը (Նկար 4գ): Այնուամենայնիվ, Ctrl նմուշները ցույց տվեցին գլյուկոզի օգտագործման զգալի աճ՝ թարմ հյուսվածքի համեմատ: Սա ցույց է տալիս, որ CTCM-ի և T3/Dex-ի համադրությունը բարելավում է հյուսվածքների կենսունակությունը և պահպանում 12-օրյա կուլտուրայի սրտի հատվածների մետաբոլիկ ֆենոտիպը: Բացի այդ, լարվածության վերլուծությունը ցույց տվեց, որ լարվածության մակարդակը մնացել է նույնը, ինչ թարմ սրտի հյուսվածքում 12 օրվա ընթացքում MT և MS պայմաններում (Նկար 4դ):
Սրտի կտորի հյուսվածքի գլոբալ տրանսկրիպցիոն լանդշաֆտի վրա CTCM-ի և T3/Dex-ի ընդհանուր ազդեցությունը վերլուծելու համար մենք կատարեցինք RNAseq սրտի կտորների վրա՝ բոլոր չորս տարբեր կուլտուրային պայմաններում (Լրացուցիչ տվյալներ 1): Հետաքրքիր է, որ MT հատվածները ցույց տվեցին բարձր տրանսկրիպցիոն նմանություն թարմ սրտի հյուսվածքի հետ՝ 13,642 գեներից միայն 16-ը տարբերակված արտահայտված: Այնուամենայնիվ, ինչպես ցույց տվեցինք ավելի վաղ, Ctrl հատվածները 10-12 օր կուլտուրայում ցուցադրեցին 1229 տարբերակված արտահայտված գեներ (Նկար 4ե): Այս տվյալները հաստատվեցին սրտի և ֆիբրոբլաստների գեների qRT-PCR-ով (Լրացուցիչ նկար 7ա-գ): Հետաքրքիր է, որ Ctrl հատվածները ցույց տվեցին սրտի և բջջային ցիկլի գեների նվազում և բորբոքային գեների ծրագրերի ակտիվացում: Այս տվյալները ենթադրում են, որ դեդիֆերենցիացիան, որը սովորաբար տեղի է ունենում երկարատև կուլտուրայից հետո, լիովին թուլանում է MT պայմաններում (Լրացուցիչ նկար 8ա,բ): Սարկոմերների գեների ուշադիր ուսումնասիրությունը ցույց տվեց, որ միայն մետաղական մեմբրանների (MT) պայմաններում են պահպանվում սարկոմերը (Նկար 4f) և իոնային անցուղին (Լրացուցիչ Նկ. 9) կոդավորող գեները՝ պաշտպանելով դրանք ճնշումից Ctrl, TD և MC պայմաններում: Այս տվյալները ցույց են տալիս, որ մեխանիկական և հումորալ խթանման (T3/Dex) համադրությամբ սրտի կտորի տրանսկրիպտոմը կարող է մնալ նման թարմ սրտի կտորներին 12 օր կուլտուրայում:
Այս տրանսկրիպցիոն արդյունքները հաստատվում են այն փաստով, որ սրտի հատվածներում կարդիոմիոցիտների կառուցվածքային ամբողջականությունը լավագույնս պահպանվում է մետաղաթերապիայի պայմաններում 12 օրվա ընթացքում, ինչպես ցույց է տալիս ամբողջական և տեղայնացված կոնեքսին 43-ը (Նկար 5ա): Բացի այդ, մետաղաթերապիայի պայմաններում սրտի հատվածներում ֆիբրոզը զգալիորեն նվազել է Ctrl-ի համեմատ և նման է թարմ սրտի հատվածներին (Նկար 5բ): Այս տվյալները ցույց են տալիս, որ մեխանիկական խթանման և T3/Dex բուժման համադրությունը արդյունավետորեն պահպանում է սրտի կառուցվածքը սրտի հատվածներում կուլտուրայում:
Տրոպոնին-T-ի (կանաչ), կոնեքսին 43-ի (կարմիր) և DAPI-ի (կապույտ) ներկայացուցչական իմունաֆլուորեսցենտային պատկերներ՝ թարմ մեկուսացված սրտի հատվածներում (D0) կամ 12 օր կուլտիվացված սրտի բոլոր չորս հատվածների կուլտիվացման պայմաններում (սանդղակի գիծ = 100 մկմ): Սրտի հյուսվածքի կառուցվածքային ամբողջականության արհեստական ​​բանականությամբ քանակական որոշում (n = 7 (D0 և D12 Ctrl), տարբեր խոզերից 5 (D12 TD, D12 MC և D12 MT) շերտ/խումբ, իրականացվել է միակողմանի ANOVA թեստ. ####p < 0.0001՝ համեմատած D0-ի հետ և *p < 0.05, կամ ****p < 0.0001՝ համեմատած D12 Ctrl-ի հետ): Սրտի հյուսվածքի կառուցվածքային ամբողջականության արհեստական ​​բանականությամբ քանակական որոշում (n = 7 (D0 և D12 Ctrl), տարբեր խոզերից 5 (D12 TD, D12 MC և D12 MT) շերտ/խումբ, իրականացվել է միակողմանի ANOVA թեստ. #### p < 0.0001՝ համեմատած D0-ի հետ և *p < 0.05, կամ ****p < 0.0001՝ համեմատած D12 Ctrl-ի հետ): Количественная оценка структурной целости ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезов/группу од разных свиней, т. 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 կամ ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl): Սրտի հյուսվածքի կառուցվածքային ամբողջականության քանակական որոշում՝ օգտագործելով արհեստական ​​բանականություն (n = 7 (D0 և D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC և D12 MT) հատվածներ/խումբ տարբեր խոզերից, միակողմանի ANOVA թեստի իրականացում; #### p < 0.0001՝ համեմատած D0-ի հետ և *p < 0.05 կամ ****p < 0.0001՝ համեմատած D12 Ctrl-ի հետ):对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和0*p < 0,0001 与D0 和0*p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）։对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 (n = 7 (d0 和 d12 ctrl) （5 (d12 td 、 d12 mc）2 mc人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0.0. 0,0001 与D12 Ctrl 相比）։Սրտի հյուսվածքի կառուցվածքային ամբողջականության քանակական որոշում արհեստական ​​բանականության միջոցով տարբեր խոզերի մոտ (n = 7 (D0 և D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC և D12 MT) հատվածներ/խումբ)՝ միակողմանի ANOVA թեստով։#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl): #### p < 0.0001՝ համեմատած D0-ի հետ և *p < 0.05 կամ ****p < 0.0001՝ համեմատած D12 Ctrl-ի հետ)։ բ Մասոնի եռագույն ներկով ներկված սրտի կտորների ներկայացուցչական պատկերներ և քանակական որոշում (Մասշտաբի սանդղակ = 500 մկմ) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD և D12 MC), տարբեր խոզերից վերցված 9 (D12 MT) կտոր/խումբ, կատարվել է միակողմանի ANOVA թեստ. ####p < 0.0001՝ համեմատած D0-ի հետ և ***p < 0.001, կամ ****p < 0.0001՝ համեմատած D12 Ctrl-ի հետ): բ Մասոնի եռագույն ներկով ներկված սրտի կտորների ներկայացուցչական պատկերներ և քանակական որոշում (Մասշտաբի սանդղակ = 500 մկմ) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD և D12 MC), տարբեր խոզերից վերցված 9 (D12 MT) կտոր/խումբ, կատարվել է միակողմանի ANOVA թեստ. ####p < 0.0001՝ համեմատած D0-ի հետ և ***p < 0.001, կամ ****p < 0.0001՝ համեմատած D12 Ctrl-ի հետ): b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Massona (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D121 TD9), и D121 TD9 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). բ Մասոնի եռագույն ներկով ներկված սրտի հատվածների ներկայացուցչական պատկերներ և քանակական որոշում (մասշտաբի գիծ = 500 մկմ) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD և D12 MC), տարբեր խոզերից 9 (D12 MT) հատվածներ/խումբ, կատարված միակողմանի ANOVA-ով; ####p < 0.0001 ընդդեմ D0-ի և ***p < 0.001 կամ ****p < 0.0001 ընդդեմ D12 Ctrl-ի): b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 μm）10（0D = Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单曠素方同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单曠素方差弉与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）։ b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析他 中方差分析； 0.#0#0p.相比，***p <0.001，或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）։ b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихром Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), / группы, один- способ ANOVA; բ Մասոնի եռագույնով ներկված սրտի հատվածների ներկայացուցչական պատկերներ և քանակական որոշում (մասշտաբի գիծ = 500 մկմ) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD և D12 MC), տարբեր խոզերի/խմբի 9 (D12 MT) հատվածներ, մեկ ANOVA մեթոդ; ####p < 0.0001՝ համեմատած D0-ի հետ, ***p < 0.001 կամ ****p < 0.0001՝ համեմատած D12 Ctrl-ի հետ):Սխալի սյուները ներկայացնում են միջին ± ստանդարտ շեղումը։
Վերջապես, սրտի հիպերտրոֆիան ընդօրինակելու CTCM-ի ունակությունը գնահատվել է սրտային հյուսվածքի ձգման ավելացման միջոցով: CTCM-ում օդային խցիկի առավելագույն ճնշումը աճել է 80 մմ ս.ս.-ից մինչև 80 մմ ս.ս. (նորմալ ձգում) մինչև 140 մմ ս.ս. (Նկար 6ա): Սա համապատասխանում է ձգման 32% աճին (Նկար 6բ), որը նախկինում ցույց էր տրվել որպես համապատասխան տոկոսային ձգում, որը անհրաժեշտ է սրտի հատվածների համար՝ հիպերտրոֆիայի դեպքում դիտվող սարկոմերի երկարությանը նման երկարություն ստանալու համար: Կծկման և թուլացման ընթացքում սրտի հյուսվածքի ձգումը և արագությունը մնացել են անփոփոխ վեց օրվա կուլտուրայի ընթացքում (Նկար 6գ): ՄՏ պայմաններում ստացված սրտի հյուսվածքը վեց օր ենթարկվել է նորմալ ձգման (ՄՏ (նորմալ)) կամ գերձգման պայմաններում (ՄՏ (OS)): Չորս օր կուլտուրայից հետո հիպերտրոֆիկ բիոմարկերը NT-ProBNP-ն զգալիորեն բարձրացել էր միջավայրում՝ ՄՏ (OS) պայմաններում՝ համեմատած ՄՏ (նորմալ) պայմանների հետ (Նկար 7ա): Բացի այդ, վեցօրյա կուլտուրայից հետո, MT-ում (OS) բջիջների չափը (Նկար 7բ) զգալիորեն մեծացել է MT սրտի հատվածների համեմատ (նորմալ): Բացի այդ, NFATC4 միջուկային տեղափոխումը զգալիորեն մեծացել է գերձգված հյուսվածքներում (Նկար 7գ): Այս արդյունքները ցույց են տալիս հիպերդեստենսիայից հետո պաթոլոգիական վերակառուցման աստիճանական զարգացումը և հաստատում են այն գաղափարը, որ CTCM սարքը կարող է օգտագործվել որպես հարթակ ձգմամբ առաջացած սրտի հիպերտրոֆիայի ազդանշանային ուղին ուսումնասիրելու համար:
Օդային խցիկի ճնշման, հեղուկ խցիկի ճնշման և հյուսվածքների շարժման չափումների ներկայացուցչական հետքերը հաստատում են, որ խցիկի ճնշումը փոխում է հեղուկ խցիկի ճնշումը՝ առաջացնելով հյուսվածքի կտորի համապատասխան շարժում։ բ Նորմալ ձգված (նարնջագույն) և գերձգված (կապույտ) հյուսվածքի հատվածների ներկայացուցչական ձգման տոկոսային և ձգման արագության կորերը։ գ Սյունակային գրաֆիկ, որը ցույց է տալիս ցիկլի ժամանակը (n = 19 կտոր մեկ խմբում, տարբեր խոզերից), կծկման ժամանակը (n = 18-19 կտոր մեկ խմբում, տարբեր խոզերից), թուլացման ժամանակը (n = 19 կտոր մեկ խմբում, տարբեր խոզերից)), հյուսվածքի շարժման ամպլիտուդը (n = 14 կտոր/խումբ, տարբեր խոզերից), գագաթնակետային սիստոլիկ արագությունը (n = 14 կտոր/խումբ, տարբեր խոզերից) և գագաթնակետային թուլացման արագությունը (n = 14 (D0), 15 (D6) (հատվածներ/խմբեր) տարբեր խոզերից), երկկողմանի Ստյուդենտի t-թեստը որևէ պարամետրում նշանակալի տարբերություն չի ցույց տվել, ինչը ցույց է տալիս, որ այս պարամետրերը մնացել են անփոփոխ 6 օրվա ընթացքում՝ գերլարմամբ կուլտուրայի ընթացքում։ Սխալի սյուները ներկայացնում են միջին ± ստանդարտ շեղումը։
NT-ProBNP կոնցենտրացիայի քանակական որոշումը սյունակային գրաֆիկով` տարբեր խոզերից ստացված սրտի կտորներից ստացված կուլտուրային միջավայրում, որոնք կուլտիվացվել են MT նորմալ ձգման (Նորմա) կամ գերձգման (OS) պայմաններում (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm և D4 MTOS) կտոր/խումբ: Կատարվել է երկկողմանի ANOVA. **p < 0.01` նորմալ ձգման համեմատ): NT-ProBNP կոնցենտրացիայի քանակական որոշումը սյունակային գրաֆիկով` տարբեր խոզերից ստացված սրտի կտորներից ստացված կուլտուրային միջավայրում, որոնք կուլտիվացվել են MT նորմալ ձգման (Նորմա) կամ գերձգման (OS) պայմաններում (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm և D4 MTOS) կտոր/խումբ: Կատարվել է երկկողմանի ANOVA; **p < 0.01` նորմալ ձգման համեմատ):Տարբեր խոզերից ստացված սրտի կտորներից ստացված NT-ProBNP կոնցենտրացիայի քանակական հիստոգրամը կուլտիվ միջավայրում, որը կուլտիվացվել է նորմալ MT ձգման (նորմա) կամ գերձգման (OS) պայմաններում (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm և D4) կտորներ/խումբ, իրականացվել է դիսպերսիայի երկգործոն վերլուծություն։**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01՝ համեմատած նորմալ ձգման հետ): a 在MT 正常拉伸 (Նորմ) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTՆորմ)、3（D2 MTOS、D4 MTՆորմ 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0.01): NT-ProBNP կոնցենտրացիայի քանակականացում սրտի կտորներում, որոնք մշակվել են MT նորմալ ձգման (Նորմ) կամ գերձգման (OS) պայմաններում (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm և D4 MTOS) տարբեր猪的切片/组，可以双向方方发发动 **համեմատած նորմալ ձգման հետ, p <0.01):Հիստոգրամ։ Տարբեր խոզերից ստացված սրտի կտորներում NT-ProBNP կոնցենտրացիաների քանակական որոշում՝ նորմալ MT ձգման (նորմա) կամ գերձգման (OS) պայմաններում (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) և D4 MTOS) կտորներ/խումբ, դիսպերսիայի երկկողմանի վերլուծություն։**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01՝ համեմատած նորմալ ձգման հետ): բ Տրոպոնին-T-ով և WGA-ով ներկված սրտի կտորների ներկայացուցչական պատկերներ (ձախից) և բջիջների չափի քանակական որոշում (աջից) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) բջիջ/խումբ՝ տարբեր խոզերի 10 տարբեր կտորներից, իրականացվել է երկկողմանի Ստյուդենտի t-թեստ. ****p < 0.0001՝ համեմատած նորմալ ձգման հետ): բ Տրոպոնին-T-ով և WGA-ով ներկված սրտի կտորների ներկայացուցչական պատկերներ (ձախից) և բջիջների չափի քանակական որոշում (աջից) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) բջիջ/խումբ՝ տարբեր խոզերի 10 տարբեր կտորներից, իրականացվել է երկկողմանի Ստյուդենտի t-թեստ. ****p < 0.0001՝ համեմատած նորմալ ձգման հետ): b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного որոշակիություն размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). բ Տրոպոնին-T-ով և AZP-ով ներկված սրտի հատվածների ներկայացուցչական պատկերներ (ձախից) և բջիջների չափի քանակական որոշում (աջից) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) բջիջներ/խումբ՝ տարբեր խոզերի 10 տարբեր հատվածներից, կատարվել է երկկողմանի Ստյուդենտի t-թեստ. ****p < 0.0001՝ համեմատած նորմալ շտամի հետ): b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的心脏切片的代表漇的代表MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比，****p < 0.0001): բ Կալկարեին-T-ով և WGA-ով ներկված սրտի կտորների ներկայացուցչական պատկերներ (ձախից) և բջիջների չափսերի (աջից) (n = 330 (D6 MTOS), 369 10 տարբեր կտորներից (D6 MTNorm)): Բջիջներ/մետաղական բիոմիելիտի, ցինկի բիոմիելիտի թեստ. համեմատած նորմալ ձգման հետ. ****p < 0.0001): b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm razы) из 10. Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). բ Տրոպոնին-T-ով և AZP-ով ներկված սրտի հատվածների ներկայացուցչական պատկերներ (ձախից) և բջիջների չափի քանակական որոշում (աջից) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) տարբեր խոզերի 10 տարբեր հատվածներից): Բջիջներ/խումբ, երկկողմանի չափանիշ՝ Ստյուդենտի t; ****p < 0.0001՝ համեմատած նորմալ շտամի հետ): գ 0-րդ և 6-րդ օրերի MTOS սրտի կտորների ներկայացուցչական պատկերներ, որոնք իմունային նշագրված են տրոպոնին-T-ի և NFATC4-ի համար, և NFATC4-ի տեղափոխման քանակական որոշումը CM-ների կորիզներ (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) կտոր/խումբ տարբեր խոզերից, իրականացվել է երկկողմանի Ստյուդենտի t-փորձարկում; *p < 0.05): գ 0-րդ և 6-րդ օրերի MTOS սրտի կտորների ներկայացուցչական պատկերներ, որոնք իմունային նշագրված են տրոպոնին-T-ի և NFATC4-ի համար, և NFATC4-ի տեղափոխման քանակական որոշումը CM-ների կորիզներ (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) կտոր/խումբ տարբեր խոզերից, իրականացվել է երկկողմանի Ստյուդենտի t-փորձարկում; *p < 0.05): c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (D00) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента *p < 0,05). գ Երկկողմանի Ստյուդենտի t-թեստի միջոցով սրտի հատվածների ներկայացուցչական պատկերներ MTOS-ի 0 և 6 օրերի դրությամբ, որոնք իմունային նշագրված են տրոպոնին-T-ի և NFATC4-ի համար, և NFATC4 տեղափոխման քանակական որոշումը քարանձավային բջիջների կորիզում (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) կտոր/խումբ տարբեր խոզերից) կատարվել են։ c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化 (4 （0n)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p <0.05)»։ գ calcanin-T-ի և NFATC4-ի իմունային պիտակավորման 第0天和第6天MTOS սրտի կտորների և NFATC4-ի ներկայացուցչական պատկերներ՝ տարբեր NFATC4 易位至CM բջիջների միջուկից 的 քանակություն化 (n = 4 (D6 MTOS),时间双尾学生et 电影；*p <0.05): c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свипай (n = 4 (D6/MT) хвостатый t-критерий Стьюдента *p < 0,05). գ MTOS սրտի կտորների ներկայացուցչական պատկերներ 0-րդ և 6-րդ օրերին՝ տրոպոնին-T-ի և NFATC4 իմունային նշագրման և NFATC4 տեղափոխման քանակական որոշման համար CM-ի կորիզում տարբեր խոզերի մոտ (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) կտոր/խումբ, երկկողմանի t-չափանիշ՝ Ստյուդենտի; *p < 0.05):Սխալի սյուները ներկայացնում են միջին ± ստանդարտ շեղում։
Թարգմանչական սրտանոթային հետազոտությունները պահանջում են բջջային մոդելներ, որոնք ճշգրիտ վերարտադրում են սրտի միջավայրը: Այս ուսումնասիրության մեջ մշակվել և բնութագրվել է CTCM սարք, որը կարող է խթանել սրտի գերբարակ հատվածները: CTCM համակարգը ներառում է ֆիզիոլոգիապես համաժամեցված էլեկտրամեխանիկական խթանում և T3 և Dex հեղուկով հարստացում: Երբ խոզի սրտի հատվածները ենթարկվեցին այս գործոններին, դրանց կենսունակությունը, կառուցվածքային ամբողջականությունը, նյութափոխանակության ակտիվությունը և տրանսկրիպցիոն արտահայտությունը մնացին նույնը, ինչ թարմ սրտի հյուսվածքում 12 օրվա կուլտուրայից հետո: Բացի այդ, սրտի հյուսվածքի չափազանց ձգումը կարող է առաջացնել սրտի հիպերտրոֆիա՝ գերձգման պատճառով: Ընդհանուր առմամբ, այս արդյունքները հաստատում են ֆիզիոլոգիական կուլտուրայի պայմանների կարևոր դերը սրտի նորմալ ֆենոտիպը պահպանելու գործում և հարթակ են ստեղծում դեղերի սկրինինգի համար:
Կարդիոմիոցիտների գործունեության և գոյատևման համար օպտիմալ միջավայրի ստեղծմանը նպաստում են բազմաթիվ գործոններ: Այս գործոններից ամենաակնհայտը կապված է (1) միջբջջային փոխազդեցությունների, (2) էլեկտրամեխանիկական խթանման, (3) հումորալ գործոնների և (4) նյութափոխանակության սուբստրատների հետ: Ֆիզիոլոգիական բջիջ-բջիջ փոխազդեցությունները պահանջում են բազմակի բջջային տեսակների բարդ եռաչափ ցանցեր, որոնք աջակցվում են արտաբջջային մատրիցով: Նման բարդ բջջային փոխազդեցությունները դժվար է վերականգնել in vitro՝ առանձին բջջային տեսակների համատեղ կուլտուրայով, բայց դրանք կարող են հեշտությամբ իրականացվել՝ օգտագործելով սրտի հատվածների օրգանոտիպային բնույթը:
Կարդիոմիոցիտների մեխանիկական ձգումը և էլեկտրական խթանումը կարևոր են սրտի ֆենոտիպի պահպանման համար33,34,35: Մինչդեռ մեխանիկական խթանումը լայնորեն օգտագործվել է hiPSC-CM-ի պայմանավորման և հասունացման համար, մի քանի նրբագեղ ուսումնասիրություններ վերջերս փորձել են սրտի կտորների մեխանիկական խթանում իրականացնել կուլտուրայում՝ օգտագործելով միառանցքային բեռնում: Այս ուսումնասիրությունները ցույց են տալիս, որ 2D միառանցքային մեխանիկական բեռնումը դրական ազդեցություն ունի սրտի ֆենոտիպի վրա կուլտուրայի ընթացքում: Այս ուսումնասիրություններում սրտի հատվածները կամ բեռնվել են իզոմետրիկ ձգման ուժերով17, գծային աուքսոտոնիկ բեռնմամբ18, կամ սրտի ցիկլը վերստեղծվել է ուժի փոխակերպիչի հետադարձ կապի և լարվածության շարժիչների միջոցով: Այնուամենայնիվ, այս մեթոդները օգտագործում են միառանցքային հյուսվածքի ձգում՝ առանց շրջակա միջավայրի օպտիմալացման, ինչը հանգեցնում է սրտի բազմաթիվ գեների ճնշմանը կամ աննորմալ ձգման արձագանքների հետ կապված գեների գերարտահայտմանը: Այստեղ նկարագրված CTCM-ն ապահովում է եռաչափ էլեկտրամեխանիկական խթան, որը նմանակում է բնական սրտի ցիկլը՝ ցիկլի ժամանակի և ֆիզիոլոգիական ձգման առումով (25% ձգում, 40% սիստոլա, 60% դիաստոլա և 72 զարկ րոպեում): Չնայած այս եռաչափ մեխանիկական խթանումը միայնակ բավարար չէ հյուսվածքների ամբողջականությունը պահպանելու համար, հյուսվածքների կենսունակությունը, գործառույթը և ամբողջականությունը բավարար կերպով պահպանելու համար անհրաժեշտ է T3/Dex-ի միջոցով հումորալ և մեխանիկական խթանման համադրություն։
Հումորալ գործոնները կարևոր դեր են խաղում չափահաս սրտի ֆենոտիպի մոդուլացման գործում: Սա ընդգծվել է HiPS-CM ուսումնասիրություններում, որոնցում T3-ը և Dex-ը ավելացվել են կուլտուրային միջավայրին՝ բջիջների հասունացումը արագացնելու համար: T3-ը կարող է ազդել ամինաթթուների, շաքարների և կալցիումի բջջային թաղանթների միջով տեղափոխման վրա36: Բացի այդ, T3-ը խթանում է MHC-α էքսպրեսիան և MHC-β-ի իջեցված ռեգուլյացիան՝ նպաստելով արագ կծկվող միոֆիբրիլների ձևավորմանը հասուն կարդիոմիոցիտներում՝ համեմատած պտղի CM-ի դանդաղ կծկվող միոֆիբրիլների հետ: Հիպոթիրեոզով հիվանդների մոտ T3 անբավարարությունը հանգեցնում է միոֆիբրիլյար գոտիների կորստի և տոնուսի զարգացման արագության նվազմանը37: Dex-ը ազդում է գլյուկոկորտիկոիդային ընկալիչների վրա և ցույց է տրվել, որ մեծացնում է միոկարդի կծկվողականությունը մեկուսացված պերֆուզացված սրտերում.38 Այս բարելավումը, ենթադրաբար, կապված է կալցիումի նստվածքի միջոցով մուտքի (SOCE) վրա ազդեցության հետ39,40: Բացի այդ, Dex-ը կապվում է իր ընկալիչների հետ՝ առաջացնելով լայն ներբջջային արձագանք, որը ճնշում է իմունային ֆունկցիան և բորբոքումը30:
Մեր արդյունքները ցույց են տալիս, որ ֆիզիկական մեխանիկական խթանումը (ՖՄԽ) բարելավել է ընդհանուր կուլտուրայի կատարողականը Ctrl-ի համեմատ, սակայն չի կարողացել պահպանել կենսունակությունը, կառուցվածքային ամբողջականությունը և սրտի արտահայտությունը 12 օրվա ընթացքում կուլտուրայում: Ctrl-ի համեմատ, T3-ի և Dex-ի ավելացումը CTCM (MT) կուլտուրաներին բարելավել է կենսունակությունը և պահպանել նմանատիպ տրանսկրիպցիոն պրոֆիլներ, կառուցվածքային ամբողջականություն և նյութափոխանակության ակտիվություն թարմ սրտի հյուսվածքի հետ 12 օրվա ընթացքում: Բացի այդ, հյուսվածքի ձգման աստիճանը վերահսկելով, STCM-ի միջոցով ստեղծվել է հիպերձգմամբ պայմանավորված սրտի հիպերտրոֆիայի մոդել, որը ցույց է տալիս STCM համակարգի բազմակողմանիությունը: Պետք է նշել, որ չնայած սրտի վերակառուցումը և ֆիբրոզը սովորաբար ներառում են ամբողջական օրգաններ, որոնց շրջանառող բջիջները կարող են ապահովել համապատասխան ցիտոկիններ, ինչպես նաև ֆագոցիտոզ և այլ վերակառուցման գործոններ, սրտի հատվածները դեռ կարող են ընդօրինակել ֆիբրոզային գործընթացը սթրեսի և վնասվածքի դեպքում՝ միոֆիբրոբլաստների մեջ: Սա նախկինում գնահատվել է այս սրտի կտրվածքի մոդելում: Պետք է նշել, որ CTCM պարամետրերը կարող են մոդուլացվել՝ փոխելով ճնշումը/էլեկտրական ամպլիտուդը և հաճախականությունը՝ մոդելավորելու բազմաթիվ պայմաններ, ինչպիսիք են տախիկարդիան, բրադիկարդիան և մեխանիկական շրջանառության աջակցությունը (մեխանիկական չբեռնված սիրտ): Սա համակարգը դարձնում է միջին թողունակությամբ դեղամիջոցների թեստավորման համար: CTCM-ի կարողությունը մոդելավորելու գերլարվածության հետևանքով առաջացած սրտի հիպերտրոֆիան հիմք է հանդիսանում այս համակարգը անհատականացված թերապիայի համար փորձարկելու համար: Եզրափակելով՝ ներկայիս ուսումնասիրությունը ցույց է տալիս, որ մեխանիկական ձգումը և հումորալ խթանումը կարևոր են սրտի հյուսվածքի հատվածների մշակույթը պահպանելու համար:
Չնայած այստեղ ներկայացված տվյալները ենթադրում են, որ CTCM-ն շատ խոստումնալից հարթակ է ամբողջական միոկարդի մոդելավորման համար, այս կուլտուրայի մեթոդն ունի որոշ սահմանափակումներ: CTCM կուլտուրայի հիմնական սահմանափակումն այն է, որ այն շերտերի վրա անընդհատ դինամիկ մեխանիկական լարվածություն է առաջացնում, ինչը խոչընդոտում է սրտի շերտերի կծկումները յուրաքանչյուր ցիկլի ընթացքում ակտիվորեն վերահսկելու հնարավորությանը: Բացի այդ, սրտի հատվածների փոքր չափի (7 մմ) պատճառով, սիստոլիկ ֆունկցիան կուլտուրայի համակարգերից դուրս գնահատելու հնարավորությունը ավանդական ուժի սենսորների միջոցով սահմանափակ է: Ներկայիս ձեռագրում մենք մասամբ հաղթահարում ենք այս սահմանափակումը՝ գնահատելով օպտիկական լարումը որպես կծկման ֆունկցիայի ցուցանիշ: Այնուամենայնիվ, այս սահմանափակումը կպահանջի հետագա աշխատանք և կարող է լուծվել ապագայում՝ կուլտուրայում սրտի շերտերի ֆունկցիայի օպտիկական մոնիթորինգի մեթոդներ ներդնելով, ինչպիսիք են օպտիկական քարտեզագրումը կալցիումի և լարման նկատմամբ զգայուն ներկանյութերի միջոցով: CTCM-ի մեկ այլ սահմանափակումն այն է, որ աշխատանքային մոդելը չի ​​մանիպուլացնում ֆիզիոլոգիական լարվածությունը (նախաբեռնվածություն և հետբեռնվածություն): CTCM-ում ճնշումը առաջացել է հակառակ ուղղություններով՝ շատ մեծ հյուսվածքներում դիաստոլայում (լրիվ ձգում) և սիստոլայում (կծկման տևողություն էլեկտրական խթանման ընթացքում) 25% ֆիզիոլոգիական ձգում վերարտադրելու համար: Այս սահմանափակումը պետք է վերացվի ապագա CTCM նախագծերում՝ սրտի հյուսվածքի վրա երկու կողմերից բավարար ճնշում գործադրելով և սրտի խոռոչներում առկա ճնշում-ծավալ ճշգրիտ հարաբերությունները կիրառելով։
Այս ձեռագրում նկարագրված գերձգմամբ պայմանավորված վերակառուցումը սահմանափակվում է հիպերտրոֆիկ հիպերձգմամբ ազդանշանների նմանակմամբ: Այսպիսով, այս մոդելը կարող է օգնել ձգմամբ պայմանավորված հիպերտրոֆիկ ազդանշանների ուսումնասիրությանը՝ առանց հումորալ կամ նեյրոնային գործոնների անհրաժեշտության (որոնք այս համակարգում գոյություն չունեն): Հետագա ուսումնասիրություններ են անհրաժեշտ CTCM-ի բազմապատկությունը մեծացնելու համար, օրինակ՝ իմունային բջիջների, շրջանառվող պլազմայի հումորալ գործոնների և ներներվացիայի հետ համատեղ կուլտուրաների կիրառումը, երբ նեյրոնային բջիջների հետ համատեղ կուլտուրաների կիրառումը կբարելավի հիվանդության մոդելավորման հնարավորությունները CTCM-ի միջոցով:
Այս ուսումնասիրության մեջ օգտագործվել է տասներեք խոզ։ Կենդանիների հետ կապված բոլոր ընթացակարգերը կատարվել են հաստատության ուղեցույցներին համապատասխան և հաստատվել են Լուիսվիլի համալսարանի կենդանիների խնամքի և օգտագործման հաստատության կոմիտեի կողմից։ Աորտայի կամարը սեղմվել է, և սիրտը պերֆուզիայի է ենթարկվել 1 լիտր ստերիլ կարդիոպլեգիայի միջոցով (110 մՄ NaCl, 1.2 մՄ CaCl2, 16 մՄ KCl, 16 մՄ MgCl2, 10 մՄ NaHCO3, 5 ՄՄ/մլ հեպարին, pH մինչև 7.4)։ Սրտերը պահպանվել են սառցե կարդիոպլեգիկ լուծույթում մինչև լաբորատորիա սառույցի վրա տեղափոխելը, որը սովորաբար տևում է <10 րոպե։ Սրտերը պահպանվել են սառցե կարդիոպլեգիկ լուծույթում մինչև լաբորատորիա սառույցի վրա տեղափոխելը, որը սովորաբար տևում է <10 րոպե։ сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. Սրտերը պահվել են սառցե կարդիոպլեգիկ լուծույթում մինչև լաբորատորիա սառույցի վրա տեղափոխելը, որը սովորաբար տևում է <10 րոպե։将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钞将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钞 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Սրտերը պահեք սառույցի վրա՝ կարդիոպլեգիայի դեպքում, մինչև լաբորատորիա տեղափոխելը սառույցի վրա, սովորաբար <10 րոպե։
CTCM սարքը մշակվել է SolidWorks համակարգչային նախագծման (CAD) ծրագրով: Մշակույթի խցիկները, բաժանիչները և օդային խցիկները պատրաստված են CNC թափանցիկ ակրիլային պլաստիկից: 7 մմ տրամագծով պահուստային օղակը կենտրոնում պատրաստված է բարձր խտության պոլիէթիլենից (HDPE) և ունի o-օղակաձև ակոս՝ սիլիկոնե o-օղակը տեղավորելու համար, որն օգտագործվում է ներքևի միջավայրը կնքելու համար: Բարակ սիլիկատային թաղանթը բաժանում է մշակույթի խցիկը բաժանման թիթեղից: Սիլիկոնային թաղանթը լազերային կտրված է 0.02 դյույմ հաստությամբ սիլիկոնային թերթիկից և ունի 35A կարծրություն: Ստորին և վերին սիլիկոնային միջադիրները լազերային կտրված են 1/16 դյույմ հաստությամբ սիլիկոնային թերթիկից և ունեն 50A կարծրություն: Բլոկը ամրացնելու և հերմետիկ կնքում ստեղծելու համար օգտագործվում են 316L չժանգոտվող պողպատե պտուտակներ և թևավոր ընկույզներ:
Հատուկ տպագիր միացման տախտակը (PCB) նախատեսված է C-PACE-EM համակարգի հետ ինտեգրվելու համար: PCB-ի վրա գտնվող շվեյցարական մեքենայի միակցիչների միացումները միացված են գրաֆիտային էլեկտրոդներին արծաթապատ պղնձե լարերով և բրոնզե 0-60 պտուտակներով, որոնք պտուտակված են էլեկտրոդների մեջ: Տպագիր միացման տախտակը տեղադրված է 3D տպիչի կափարիչի մեջ:
CTCM սարքը կառավարվում է ծրագրավորվող պնևմատիկ ակտիվատորով (PPD), որը ստեղծում է սրտի ցիկլին նման կառավարվող շրջանառության ճնշում: Օդային խցիկի ներսում ճնշման բարձրացմանը զուգընթաց, ճկուն սիլիկոնե թաղանթը ընդարձակվում է դեպի վեր՝ ստիպելով միջավայրը հյուսվածքի տակ: Հյուսվածքի տարածքը այնուհետև ձգվում է հեղուկի այս արտանետման միջոցով՝ ընդօրինակելով սրտի ֆիզիոլոգիական ընդարձակումը դիաստոլայի ժամանակ: Թուլացման գագաթնակետին էլեկտրական խթանումը կիրառվում է գրաֆիտային էլեկտրոդների միջոցով, որոնք նվազեցնում են օդային խցիկի ճնշումը և առաջացնում հյուսվածքային հատվածների կծկում: Խողովակի ներսում կա հեմոստատիկ փական՝ ճնշման սենսորով, որը հայտնաբերում է օդային համակարգում ճնշումը: Ճնշման սենսորով զգացվող ճնշումը կիրառվում է նոութբուքին միացված տվյալների հավաքագրիչի վրա: Սա թույլ է տալիս անընդհատ վերահսկել գազային խցիկի ներսում ճնշումը: Երբ խցիկի առավելագույն ճնշումը հասնում է (ստանդարտ 80 մմ ս.ս., 140 մմ ս.ս. OS), տվյալների հավաքագրման սարքին հրահանգ է տրվում ազդանշան ուղարկել C-PACE-EM համակարգին՝ 2 մվրկ տևողությամբ երկփուլ լարման ազդանշան ստեղծելու համար, որը սահմանված է 4 Վ:
Սրտի կտրվածքներ ստացվեցին, և 6 հորատանցքերում մշակության պայմանները կատարվեցին հետևյալ կերպ. հավաքված սրտերը տեղափոխման անոթից տեղափոխվեցին սառը (4°C) կարդիոպլեգիա պարունակող սկուտեղի մեջ: Ձախ փորոքը մեկուսացվեց ստերիլ շեղբով և կտրվեց 1-2 սմ3 կտորների: Այս հյուսվածքային բլոկները հյուսվածքային սոսինձով ամրացվեցին հյուսվածքային հենարաններին և տեղադրվեցին Թայրոդի լուծույթ պարունակող թրթռացող միկրոտոմային հյուսվածքային լոգարանի մեջ և անընդհատ թթվածնով հարստացվեցին (3 գ/լ 2,3-բութանդիոն մոնոօքսիմ (BDM), 140 մՄ NaCl (8.18 գ) ), 6 մՄ KCl (0.447 գ), 10 մՄ D-գլյուկոզ (1.86 գ), 10 մՄ HEPES (2.38 գ), 1 մՄ MgCl2 (1 մլ 1 Մ լուծույթ), 1.8 մՄ CaCl2 (1.8 մլ 1 Մ լուծույթ), մինչև 1 լ ddH2O): Թրթռացող միկրոտոմը կարգավորվել էր 300 մկմ հաստությամբ կտորներ կտրելու համար՝ 80 Հց հաճախականությամբ, 2 մմ հորիզոնական տատանման ամպլիտուդով և 0.03 մմ/վրկ արագությամբ։ Հյուսվածքային լոգարանը շրջապատված էր սառույցով՝ լուծույթը զով պահելու համար, և ջերմաստիճանը պահպանվում էր 4°C-ի վրա։ Հյուսվածքային հատվածները միկրոտոմային լոգարանից տեղափոխեք ինկուբացիոն լոգարան, որը պարունակում է սառույցի վրա անընդհատ թթվածնով հարստացված Tyrode լուծույթ, մինչև որ ստացվեն բավարար հատվածներ մեկ կուլտուրայի ափսեի համար։ Տրանսհոսքային կուլտուրաների համար հյուսվածքային հատվածները ամրացվել են ստերիլ 6 մմ լայնությամբ պոլիուրեթանային հենարանների և տեղադրվել են 6 մլ օպտիմիզացված միջավայրի մեջ (199 միջավայր, 1x ITS հավելում, 10% FBS, 5 նգ/մլ VEGF, 10 նգ/մլ FGF-ալկալային և 2X հակաբիոտիկ-հակասնկային)։ C-Pace-ի միջոցով հյուսվածքային հատվածներին կիրառվել է էլեկտրական խթանում (10 Վ, հաճախականություն 1.2 Հց)։ TD պայմանների համար յուրաքանչյուր միջավայրի փոփոխության ժամանակ թարմ T3 և Dex ավելացվել են 100 նՄ և 1 մկՄ կոնցենտրացիաներով։ Միջավայրը փոխարինելուց առաջ օրական 3 անգամ հագեցած է թթվածնով։ Հյուսվածքային հատվածները կուլտիվացվել են ինկուբատորում 37°C ջերմաստիճանում և 5% CO2-ում։
CTCM կուլտուրաների համար հյուսվածքային կտրվածքները տեղադրվել են հատուկ պատրաստված 3D տպիչի վրա՝ Պետրիի ամանի մեջ, որը պարունակում էր Թայրոդի մոդիֆիկացված լուծույթ: Սարքը նախատեսված է սրտի կտրվածքի չափը հենարանային օղակի մակերեսի 25%-ով մեծացնելու համար: Սա արվում է այնպես, որ սրտի կտրվածքները չձգվեն Թայրոդի լուծույթից միջավայր տեղափոխելուց և դիաստոլայի ընթացքում: Օգտագործելով հիստոակրիլային սոսինձ, 300 մկմ հաստությամբ կտրվածքները ամրացվել են 7 մմ տրամագծով հենարանային օղակի վրա: Հյուսվածքային կտրվածքները հենարանային օղակին ամրացնելուց հետո կտրել ավելորդ հյուսվածքային կտրվածքները և կցված հյուսվածքային կտրվածքները վերադարձնել Թայրոդի լուծույթի լոգարանի մեջ՝ սառույցի վրա (4°C), մինչև մեկ սարքի համար բավարար կտրվածքներ պատրաստվեն: Բոլոր սարքերի ընդհանուր մշակման ժամանակը չպետք է գերազանցի 2 ժամը: 6 հյուսվածքային կտրվածքներ իրենց հենարանային օղակներին ամրացնելուց հետո հավաքվել է CTCM սարքը: CTCM կուլտուրայի խցիկը նախապես լցված է 21 մլ նախապես թթվածնով հարստացված միջավայրով: Տեղափոխել հյուսվածքային կտրվածքները կուլտուրայի խցիկ և զգուշորեն հեռացնել օդային պղպջակները պիպետով: Այնուհետև հյուսվածքային հատվածը ուղղորդվում է անցքի մեջ և նրբորեն սեղմվում է իր տեղում։ Վերջապես, տեղադրվում է էլեկտրոդի կափարիչը սարքի վրա և սարքը տեղափոխվում ինկուբատոր։ Այնուհետև միացվում է CTCM-ը օդային խողովակին և C-PACE-EM համակարգին։ Պնևմատիկ ակտիվատորը բացվում է, և օդային փականը բացում է CTCM-ը։ C-PACE-EM համակարգը կարգավորված էր երկփուլային խթանման ընթացքում 2 մվրկ տևողությամբ 1.2 Հց հաճախականությամբ 4 Վ լարում մատակարարելու համար։ Միջավայրը փոխվել է օրը երկու անգամ, իսկ էլեկտրոդները՝ օրը մեկ անգամ՝ էլեկտրոդների վրա գրաֆիտի կուտակումից խուսափելու համար։ Անհրաժեշտության դեպքում, հյուսվածքային հատվածները կարող են հանվել իրենց կուլտուրայի անցքերից՝ դրանց տակ ընկած օդային պղպջակները դուրս մղելու համար։ ՄՏ մշակման պայմանների համար, T3/Dex-ը թարմ ավելացվել է յուրաքանչյուր միջավայրի փոփոխության հետ՝ 100 նՄ T3-ով և 1 μM Dex-ով։ CTCM սարքերը կուլտուրացվել են ինկուբատորում 37°C ջերմաստիճանում և 5% CO2-ով։
Սրտի կտորների ձգված հետագծերը ստանալու համար մշակվել է հատուկ տեսախցիկի համակարգ: Օգտագործվել է SLR տեսախցիկ (Canon Rebel T7i, Canon, Տոկիո, Ճապոնիա)՝ Navitar Zoom 7000 18-108 մմ մակրո օբյեկտիվով (Navitar, Սան Ֆրանցիսկո, Կալիֆոռնիա): Վիզուալիզացիան իրականացվել է սենյակային ջերմաստիճանում՝ միջավայրը թարմ միջավայրով փոխարինելուց հետո: Տեսախցիկը տեղադրված է 51° անկյան տակ, և տեսանյութը ձայնագրվել է վայրկյանում 30 կադր հաճախականությամբ: Սկզբում բաց կոդով ծրագրակազմը (MUSCLEMOTION43) օգտագործվել է Image-J-ի հետ՝ սրտի կտորների շարժը քանակականացնելու համար: Դիմակը ստեղծվել է MATLAB-ի (MathWorks, Natick, Մասաչուսեթս, ԱՄՆ) միջոցով՝ բաբախող սրտի կտորների հետաքրքրության շրջանները սահմանելու և աղմուկից խուսափելու համար: Ձեռքով հատվածավորված դիմակները կիրառվում են կադրային հաջորդականության բոլոր պատկերների վրա, ապա փոխանցվում են MUSCLEMOTION հավելվածին: Muscle Motion-ը օգտագործում է յուրաքանչյուր կադրի պիքսելների միջին ինտենսիվությունը՝ դրա շարժումը հղման կադրի նկատմամբ քանակականացնելու համար: Տվյալները գրանցվել, զտվել և օգտագործվել են ցիկլի ժամանակը քանակականացնելու և սրտի ցիկլի ընթացքում հյուսվածքների ձգումը գնահատելու համար: Ձայնագրված տեսանյութը հետմշակվել է առաջին կարգի զրոյական փուլի թվային ֆիլտրի միջոցով: Հյուսվածքների ձգումը (գագաթնակետից գագաթ) քանակականացնելու համար կատարվել է գագաթնակետից գագաթ վերլուծություն՝ ձայնագրված ազդանշանում գագաթնակետերն ու անկումները տարբերակելու համար: Բացի այդ, միտումների փոփոխությունը կատարվում է 6-րդ կարգի բազմանդամի միջոցով՝ ազդանշանի շեղումը վերացնելու համար: Ծրագրի կոդը մշակվել է MATLAB-ում՝ հյուսվածքների գլոբալ շարժումը, ցիկլի ժամանակը, թուլացման ժամանակը և կծկման ժամանակը որոշելու համար (Լրացուցիչ ծրագրի կոդ 44):
Լարվածության վերլուծության համար, օգտագործելով մեխանիկական ձգման գնահատման համար ստեղծված նույն տեսանյութերը, մենք նախ գծեցինք երկու պատկեր, որոնք ներկայացնում էին շարժման գագաթները (շարժման ամենաբարձր (վերին) և ամենացածր (ստորին) կետերը՝ համաձայն MUSCLEMOTION ծրագրի: Այնուհետև մենք հատվածավորեցինք հյուսվածքների հատվածները և կիրառեցինք ստվերավորման ալգորիթմի մի տեսակ հատվածավորված հյուսվածքի վրա (Լրացուցիչ նկ. 2ա): Այնուհետև հատվածավորված հյուսվածքը բաժանվեց տասը ենթամակերեսների, և յուրաքանչյուր մակերեսի վրա լարումը հաշվարկվեց հետևյալ հավասարման միջոցով. Լարվածություն = (Sup-Sdown)/Sdown, որտեղ Sup-ը և Sdown-ը համապատասխանաբար գործվածքի վերին և ստորին ստվերներից ձևի հեռավորություններն են (Լրացուցիչ նկ. 2բ):
Սրտի կտրվածքները ֆիքսվել են 4% պարաֆորմալդեհիդի մեջ 48 ժամ։ Ֆիքսված հյուսվածքները ջրազրկվել են 10% և 20% սախարոզում 1 ժամ, ապա՝ 30% սախարոզում ամբողջ գիշեր։ Այնուհետև կտրվածքները տեղադրվել են օպտիմալ կտրման ջերմաստիճանի միացության մեջ (OCT միացություն) և աստիճանաբար սառեցվել են իզոպենտան/չոր սառույցի լոգարանում։ OCT ներդրման բլոկները պահել -80°C ջերմաստիճանում մինչև բաժանումը։ Սահիկները պատրաստվել են որպես 8 մկմ հաստությամբ կտրվածքներ։
Սրտի հատվածներից OCT-ն հեռացնելու համար սահիկները տաքացրեք տաքացման բլոկի վրա 95°C ջերմաստիճանում 5 րոպե: Յուրաքանչյուր սահիկին ավելացրեք 1 մլ PBS և ինկուբացեք 30 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում, այնուհետև ներթափանցեք հատվածները՝ 0.1% Triton-X-ը PBS-ի մեջ դնելով 15 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում: Ոչ սպեցիֆիկ հակամարմինների նմուշին կապվելը կանխելու համար սահիկներին ավելացրեք 1 մլ 3% BSA լուծույթ և ինկուբացեք 1 ժամ սենյակային ջերմաստիճանում: Այնուհետև BSA-ն հեռացվեց, և սահիկները լվացվեցին PBS-ով: Մատիտով նշեք յուրաքանչյուր նմուշը: 90 րոպեի ընթացքում ավելացվել են առաջնային հակամարմիններ (նոսրացված 1:200 հարաբերակցությամբ 1% BSA-ում) (կոնեքսին 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) և տրոպոնին-T (Thermo Scientific; #MA5-12960), այնուհետև մկան Alexa Fluor 488-ի (Thermo Scientific; #A16079) և ճագարի Alexa Fluor 594-ի (Thermo Scientific; #T6391) դեմ՝ երկրորդային հակամարմիններ (նոսրացված 1:200 հարաբերակցությամբ 1% BSA-ում)՝ ևս 90 րոպե։ Լվացվել է 3 անգամ PBS-ով։ Նպատակային ներկումը ֆոնից տարբերելու համար մենք որպես վերահսկիչ օգտագործել ենք միայն երկրորդային հակամարմինը։ Վերջապես, ավելացվել է DAPI միջուկային ներկը, և սլայդները տեղադրվել են vectashield-ի (Vector Laboratories) մեջ և կնքվել եղունգների լաքով (-x մեծացում) և Keyence մանրադիտակով՝ 40x մեծացմամբ։
WGA ներկման համար օգտագործվել է WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) 5 մկգ/մլ PBS կոնցենտրացիայով և 30 րոպե սենյակային ջերմաստիճանում տեղադրվել է ֆիքսված հատվածների վրա: Այնուհետև սլայդները լվացվել են PBS-ով, և յուրաքանչյուր սլայդին ավելացվել է Սուդանի սև գույն, և ինկուբացվել են 30 րոպե: Այնուհետև սլայդները լվացվել են PBS-ով և ավելացվել է vectashield ներդրման միջավայր: Սլայդները տեսողականացվել են Keyence մանրադիտակի վրա 40x մեծացմամբ:
OCT-ն հանվել է նմուշներից վերը նկարագրված եղանակով: OCT-ն հեռացնելուց հետո սլայդները գիշերը ընկղմվել են Բուինսի լուծույթի մեջ: Այնուհետև սլայդները լվացվել են թորած ջրով 1 ժամ, ապա 10 րոպե տեղադրվել են Բիբրիչի ալոե թթվի ֆուքսինի լուծույթի մեջ: Այնուհետև սլայդները լվացվել են թորած ջրով և 10 րոպե տեղադրվել 5% ֆոսֆոմոլիբդեն/5% ֆոսֆորվոլֆրամաթթվի լուծույթի մեջ: Առանց լվանալու, սլայդները 15 րոպեով անմիջապես տեղափոխել են անիլինի կապույտ լուծույթի մեջ: Այնուհետև սլայդները լվացվել են թորած ջրով և 2 րոպե տեղադրվել 1% քացախաթթվի լուծույթի մեջ: Սլայդները չորացվել են 200 Ն էթանոլում և տեղափոխվել քսիլոլի մեջ: Գունավորված սլայդները տեսանելի են դարձել Keyence մանրադիտակի միջոցով՝ 10x օբյեկտիվով: Ֆիբրոզի մակերեսի տոկոսը քանակականացվել է Keyence Analyzer ծրագրի միջոցով:
CyQUANT™ MTT բջջային կենսունակության փորձարկում (Invitrogen, Carlsbad, CA), կատալոգի համար V13154, ըստ արտադրողի արձանագրության՝ որոշ փոփոխություններով։ Մասնավորապես, MTT վերլուծության ընթացքում հյուսվածքի միատարր չափն ապահովելու համար օգտագործվել է 6 մմ տրամագծով վիրաբուժական դակիչ։ Հյուսվածքները անհատապես տեղադրվել են MTT հիմք պարունակող 12-փոսիկանոց ափսեի փոսիկների մեջ՝ ըստ արտադրողի արձանագրության։ Կտրվածքները ինկուբացվել են 37°C ջերմաստիճանում 3 ժամ, և կենդանի հյուսվածքը նյութափոխանակում է MTT հիմքը՝ առաջացնելով մանուշակագույն ֆորմազանային միացություն։ Փոխարինեք MTT լուծույթը 1 մլ DMSO-ով և ինկուբացեք 37°C ջերմաստիճանում 15 րոպե՝ սրտի կտրվածքներից մանուշակագույն ֆորմազանը արդյունահանելու համար։ Նմուշները նոսրացվել են DMSO-ում 1:10 հարաբերակցությամբ 96-փոսիկանոց թափանցիկ հատակային ափսեներում, և մանուշակագույն գույնի ինտենսիվությունը չափվել է 570 նմ-ում՝ օգտագործելով Cytation ափսեի ընթերցիչ (BioTek): Ցուցումները նորմալացվել են սրտի յուրաքանչյուր կտորի քաշին համապատասխան։
Սրտի կտորի միջավայրը փոխարինվել է 1 μCi/մլ [5-3H]-գլյուկոզ պարունակող միջավայրով (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA), ինչպես նկարագրվել է նախկինում։ Ինկուբացիայից 4 ժամ անց, 100 մկլ միջավայր ավելացվել է 100 մկլ 0.2 N HCl պարունակող բաց միկրոցենտրիֆուգային խողովակի մեջ։ Այնուհետև խողովակը տեղադրվել է 500 մկլ dH2O պարունակող սցինտիլյացիոն խողովակի մեջ՝ [3H]2O-ն 72 ժամ 37°C ջերմաստիճանում գոլորշիացնելու համար։ Այնուհետև միկրոցենտրիֆուգային խողովակը հանվել է սցինտիլյացիոն խողովակից և ավելացվել է 10 մլ սցինտիլյացիոն հեղուկ։ Սցինտիլյացիոն հաշվարկները կատարվել են Tri-Carb 2900TR հեղուկ սցինտիլյացիոն վերլուծիչի միջոցով (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA)։ Այնուհետև գլյուկոզի օգտագործումը հաշվարկվել է՝ հաշվի առնելով [5-3H]-գլյուկոզի սպեցիֆիկ ակտիվությունը, ոչ լրիվ հավասարակշռությունը և ֆոնը, [5-3H]-ի նոսրացումը չնշագրված գլյուկոզի հետ և սցինտիլյացիոն հաշվիչի արդյունավետությունը: Տվյալները նորմալացվել են սրտի հատվածների զանգվածի համար:
Տրիզոլում հյուսվածքների հոմոգենացումից հետո, արտադրողի արձանագրության համաձայն, սրտի հատվածներից ՌՆԹ-ն մեկուսացվել է Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874-ի միջոցով: RNAsec գրադարանի պատրաստումը, հաջորդականացումը և տվյալների վերլուծությունը կատարվել են հետևյալ կերպ.
ՌՆԹ գրադարանի պատրաստման համար որպես մեկնարկային նյութ օգտագործվել է 1 մկգ ՌՆԹ յուրաքանչյուր նմուշում: Հաջորդականացման գրադարանները ստեղծվել են Illumina-ի համար նախատեսված NEBNext UltraTM RNA գրադարանի պատրաստման հավաքածուի միջոցով (NEB, ԱՄՆ)՝ հետևելով արտադրողի առաջարկություններին, և ինդեքսի կոդերը ավելացվել են յուրաքանչյուր նմուշի ատրիբուտային հաջորդականություններին: Հակիրճ ասած, mRNA-ն մաքրվել է ընդհանուր ՌՆԹ-ից՝ օգտագործելով պոլի-T օլիգոնուկլեոտիդներով ամրացված մագնիսական գնդիկներ: Ֆրագմենտացիան իրականացվել է երկարժեք կատիոնների միջոցով բարձր ջերմաստիճանում՝ NEBNext առաջին շղթայի սինթեզի ռեակցիայի բուֆերում (5X): Առաջին շղթայի կԴՆԹ-ն սինթեզվել է պատահական հեքսամեր պրայմերների և M-MuLV հակադարձ տրանսկրիպտազի (RNase H-) միջոցով: Այնուհետև երկրորդ շղթայի կԴՆԹ-ն սինթեզվել է ԴՆԹ պոլիմերազ I-ի և RNase H-ի միջոցով: Մնացած ելուստները վերածվում են բութ ծայրերի՝ էկզոնուկլեազ/պոլիմերազային ակտիվության միջոցով: ԴՆԹ բեկորի 3' ծայրի ադենիլացումից հետո դրան ամրացվում է NEBNext ադապտեր՝ մազակալի օղակաձև կառուցվածքով՝ այն հիբրիդացմանը նախապատրաստելու համար: Նախընտրելի 150-200 զույգ հիմքով cDNA բեկորների ընտրության համար գրադարանի բեկորները մաքրվել են AMPure XP համակարգի միջոցով (Beckman Coulter, Beverly, USA): Այնուհետև, 3 մկլ USER Enzyme (NEB, USA)՝ չափսով ընտրված cDNA-ով, որը միացված էր ադապտերով, օգտագործվել է 15 րոպե 37°C ջերմաստիճանում, ապա 5 րոպե 95°C ջերմաստիճանում՝ ՊՇՌ-ից առաջ: Այնուհետև ՊՇՌ-ն իրականացվել է Phusion High-Fidelity DNA պոլիմերազի, ունիվերսալ ՊՇՌ պրայմերների և Index (X) պրայմերների միջոցով: Վերջապես, ՊՇՌ արգասիքները մաքրվել են (AMPure XP համակարգ) և գրադարանի որակը գնահատվել է Agilent Bioanalyzer 2100 համակարգի վրա: Այնուհետև cDNA գրադարանը հաջորդականացվել է Novaseq հաջորդականացնողի միջոցով: Illumina-ից ստացված հում պատկերի ֆայլերը վերածվել են հում ընթերցումների՝ օգտագործելով CASAVA Base Calling-ը: Հում տվյալները պահվում են FASTQ(fq) ձևաչափի ֆայլերում, որոնք պարունակում են ընթերցման հաջորդականություններ և համապատասխան հիմքային որակներ: Ընտրեք HISAT2-ը՝ ֆիլտրացված հաջորդականության ընթերցումները Sscrofa11.1 հղման գենոմին համապատասխանեցնելու համար: Ընդհանուր առմամբ, HISAT2-ը աջակցում է ցանկացած չափի գենոմներ, ներառյալ 4 միլիարդ հիմքից մեծ գենոմներ, և լռելյայն արժեքներ են սահմանված պարամետրերի մեծ մասի համար: RNA Seq տվյալներից սպլայսինգ ընթերցումները կարող են արդյունավետորեն համաձայնեցվել HISAT2-ի միջոցով, որը ներկայումս առկա ամենաարագ համակարգն է, նույն կամ ավելի լավ ճշգրտությամբ, քան ցանկացած այլ մեթոդ:
Տրանսկրիպտների առատությունն ուղղակիորեն արտացոլում է գեների արտահայտման մակարդակը: Գեների արտահայտման մակարդակը գնահատվում է գենոմի կամ էկզոնների հետ կապված տրանսկրիպտների առատությամբ (հաջորդականության քանակ): Կարդացումների քանակը համեմատական ​​է գեների արտահայտման մակարդակներին, գեների երկարությանը և հաջորդականության խորությանը: Հաշվարկվել են FPKM-ը (տրանսկրիպտի հաջորդականացված հազար հիմքային զույգերի համար բեկորներ մեկ միլիոն հիմքային զույգի համար) և դիֆերենցիալ արտահայտման P-արժեքները որոշվել են DESeq2 փաթեթի միջոցով: Այնուհետև մենք հաշվարկել ենք կեղծ հայտնաբերման մակարդակը (FDR) յուրաքանչյուր P արժեքի համար՝ օգտագործելով Բենջամինի-Հոխբերգի մեթոդը9՝ հիմնվելով ներկառուցված «p.adjust» R-ֆունկցիայի վրա:
Սրտի հատվածներից մեկուսացված ՌՆԹ-ն փոխակերպվել է կԴՆԹ-ի 200 նգ/մկլ կոնցենտրացիայով՝ օգտագործելով Thermo ընկերության SuperScript IV Vilo Master խառնուրդը (Thermo, կատ. համար 11756050): Քանակական RT-PCR-ը իրականացվել է Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-խոռոչային թափանցիկ ռեակցիոն ափսեի (Thermo, կատ. համար 4483319) և միկրոամպերային օպտիկական սոսինձի (Thermo, կատ. համար 4311971) միջոցով: Ռեակցիոն խառնուրդը բաղկացած էր 5 մկլ Taqman Fast Advanced Master խառնուրդից (Thermo, կատ. համար 4444557), 0.5 մկլ Taqman Primer-ից և 3.5 մկլ H2O-ից, որոնք խառնվել էին յուրաքանչյուր խոռոչի համար: Կատարվել են ստանդարտ qPCR ցիկլեր, և CT արժեքները չափվել են Applied Biosystems Quantstudio 5 իրական ժամանակի PCR սարքի միջոցով (384-խոռոչային մոդուլ; ապրանքի համար A28135): Թաքմանի պրայմերները ձեռք են բերվել Thermo-ից (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1): Բոլոր նմուշների CT արժեքները նորմալացվել են GAPDH գենի նկատմամբ:
NT-ProBNP-ի միջավայրի արտազատումը գնահատվել է NT-ProBNP հավաքածուի (խոզ) միջոցով (կատալոգի համար՝ MBS2086979, MyBioSource)՝ համաձայն արտադրողի արձանագրության: Հակիրճ ասած, յուրաքանչյուր փոսիկին կրկնապատկվել է յուրաքանչյուր նմուշի և ստանդարտի 250 մկլ: Նմուշը ավելացնելուց անմիջապես հետո յուրաքանչյուր փոսիկին ավելացվել է 50 մկլ փորձարկման ռեակտիվ A: Զգուշորեն թափահարել թիթեղը և կնքել այն կնքիչով: Այնուհետև հաբերը ինկուբացվել են 37°C ջերմաստիճանում 1 ժամ: Այնուհետև լուծույթը ներծծվել է և փոսիկները լվացվել են 4 անգամ 350 մկլ 1X լվացման լուծույթով՝ ինկուբացելով լվացման լուծույթը յուրաքանչյուր անգամ 1-2 րոպե: Այնուհետև յուրաքանչյուր փոսիկին ավելացվել է 100 մկլ փորձարկման ռեակտիվ B և կնքվել թիթեղի կնքիչով: Հաբը զգուշորեն թափահարվել է և ինկուբացվել է 37°C ջերմաստիճանում 30 րոպե: Լուծույթը ներծծվել է և փոսիկները լվացվել են 5 անգամ 350 մկլ 1X լվացման լուծույթով: Յուրաքանչյուր անցքի մեջ ավելացրեք 90 մկլ սուբստրատի լուծույթ և փակեք թիթեղը։ Թիթեղը ինկուբացրեք 37°C ջերմաստիճանում 10-20 րոպե։ Յուրաքանչյուր անցքի մեջ ավելացրեք 50 մկլ կանգառի լուծույթ։ Թիթեղը անմիջապես չափվել է 450 նմ-ի վրա տեղադրված Cytation (BioTek) թիթեղի ընթերցիչով։
Հզորության վերլուծություններ են իրականացվել՝ ընտրելու այն խմբերի չափերը, որոնք կապահովեն >80% հզորություն՝ պարամետրի 10% բացարձակ փոփոխությունը հայտնաբերելու համար՝ 5% I տիպի սխալի մակարդակով։ Հզորության վերլուծություններ են իրականացվել՝ ընտրելու այն խմբերի չափերը, որոնք կապահովեն >80% հզորություն՝ պարամետրի 10% բացարձակ փոփոխությունը հայտնաբերելու համար՝ 5% I տիպի սխալի մակարդակով։ Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечаток >80% мощности для обнаружения 10% absolutnogo изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Հզորության վերլուծություն է իրականացվել՝ ընտրելու այնպիսի խմբերի չափեր, որոնք կապահովեին >80% հզորություն՝ 10% բացարձակ պարամետրի փոփոխություն հայտնաբերելու համար՝ 5% I տիպի սխալի մակարդակով։进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% թույլատրելիություն для обнаружения 10% absolutnogo изменения параметров и 5% частоты ошибок տիպի I. Հզորության վերլուծություն է իրականացվել՝ ընտրելու խմբի այնպիսի չափ, որը կապահովի >80% հզորություն՝ 10% բացարձակ պարամետրի փոփոխություն և 5% I տիպի սխալի մակարդակ հայտնաբերելու համար։Հյուսվածքային հատվածները պատահականորեն ընտրվել են փորձից առաջ: Բոլոր վերլուծությունները կատարվել են պայմանականորեն կույր, և նմուշները վերծանվել են միայն բոլոր տվյալների վերլուծությունից հետո: Բոլոր վիճակագրական վերլուծությունները կատարելու համար օգտագործվել է GraphPad Prism ծրագիրը (Սան Դիեգո, Կալիֆոռնիա): Բոլոր վիճակագրական տվյալների համար p-արժեքները համարվել են նշանակալի <0.05 արժեքների դեպքում։ Բոլոր վիճակագրական տվյալների համար p-արժեքները համարվել են նշանակալի <0.05 արժեքների դեպքում։ Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Բոլոր վիճակագրական տվյալների համար p-արժեքները համարվել են նշանակալի <0.05 արժեքների դեպքում։对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Բոլոր վիճակագրական տվյալների համար p-արժեքները համարվել են նշանակալի <0.05 արժեքների դեպքում։Երկկողմանի Ստյուդենտի t-թեստը կատարվել է տվյալների վրա՝ ընդամենը 2 համեմատությամբ: Միակողմանի կամ երկկողմանի ANOVA-ն օգտագործվել է մի քանի խմբերի միջև նշանակալիությունը որոշելու համար: Հետհոկ թեստեր կատարելիս կիրառվել է Թյուքիի ուղղումը՝ բազմաթիվ համեմատությունները հաշվի առնելու համար: RNAsec տվյալները հատուկ վիճակագրական նկատառումներ ունեն FDR-ը և p.adjust-ը հաշվարկելիս, ինչպես նկարագրված է «Մեթոդներ» բաժնում:
Ուսումնասիրության դիզայնի վերաբերյալ լրացուցիչ տեղեկությունների համար տե՛ս Nature Research Report-ի ամփոփագիրը, որը հղված է այս հոդվածին։