Mahalo no ke kipa ʻana iā Nature.com. Loaʻa i ka mana polokalamu kele pūnaewele āu e hoʻohana nei ke kākoʻo CSS palena. No ka ʻike maikaʻi loa, paipai mākou iā ʻoe e hoʻohana i kahi polokalamu kele pūnaewele i hōʻano hou ʻia (a i ʻole e hoʻopau i ke ʻano hoʻohālikelike ma Internet Explorer). I kēia manawa, no ka hōʻoia ʻana i ke kākoʻo mau, e hōʻike mākou i ka pūnaewele me ka ʻole o nā kaila a me JavaScript.
Aia kahi pono no kahi ʻōnaehana in vitro hilinaʻi e hiki ke hana hou i ke kaiapuni physiological o ka puʻuwai no ka hoʻāʻo ʻana i ka lāʻau. ʻO ka loaʻa ʻole o nā ʻōnaehana moʻomeheu ʻiʻo puʻuwai kanaka ua alakaʻi i nā wehewehe pololei ʻole o nā hopena lāʻau cardiac. Maanei, ua hoʻomohala mākou i kahi kumu hoʻohālike moʻomeheu ʻiʻo cardiac (CTCM) e hoʻoulu ai i nā ʻāpana puʻuwai electromechanically a hele i ka physiological stretch i ka wā systolic a me diastolic phases o ka cardiac cycle. Ma hope o 12 mau lā o ka moʻomeheu, ua hoʻomaikaʻi iki kēia ʻano hana i ke ola o nā ʻāpana puʻuwai, akā ʻaʻole i mālama piha i ko lākou kūpaʻa kūkulu. No laila, ma hope o ka nānā ʻana i nā mole liʻiliʻi, ua ʻike mākou ʻo ka hoʻohui ʻana o 100 nM triiodothyronine (T3) a me 1 μM dexamethasone (Dex) i kā mākou medium i mālama i ka microstructure o nā ʻāpana no 12 mau lā. I ka hui pū ʻana me ka mālama ʻana iā T3/Dex, ua mālama ka ʻōnaehana CTCM i nā ʻano transcriptional, ke ola, ka hana metabolic, a me ke kūpaʻa kūkulu ma ka pae like me ka ʻiʻo puʻuwai hou no 12 mau lā. Eia kekahi, ʻo ka hoʻolōʻihi nui ʻana o ka ʻiʻo cardiac i ka moʻomeheu e hoʻoulu ai i ka hōʻailona cardiac hypertrophic, e hāʻawi ana i nā hōʻike no ka hiki o CTCM ke hoʻohālike i nā kūlana hypertrophic i hoʻokumu ʻia e ka hoʻolōʻihi cardiac. I ka hopena, hiki i ka CTCM ke hoʻohālike i ka physiology a me ka pathophysiology o ka puʻuwai i loko o ka moʻomeheu i nā wā lōʻihi, e hiki ai ke nānā pono i nā lāʻau lapaʻau.
Ma mua o ka noiʻi lapaʻau, pono nā ʻōnaehana in vitro hilinaʻi e hiki ke hana hou i ke kaiapuni physiological o ka puʻuwai kanaka. Pono kēlā mau ʻōnaehana e hoʻohālike i ka hoʻololi ʻana o ka mechanical stretch, ka helu o ka puʻuwai, a me nā waiwai electrophysiological. Hoʻohana pinepine ʻia nā hiʻohiʻona holoholona ma ke ʻano he kahua nānā no ka physiology cardiac me ka hilinaʻi palena ʻole i ka hōʻike ʻana i nā hopena o nā lāʻau lapaʻau i loko o ka puʻuwai kanaka1,2. ʻO ka mea hope loa, ʻo ka Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) he kumu hoʻohālike i koʻikoʻi loa a kikoʻī no nā ʻano hana therapeutic a me pharmacological like ʻole, e hana hou ana i ka physiology a me ka pathophysiology o ka puʻuwai kanaka3. ʻO ka nele o ia ʻōnaehana e kaupalena i ka ʻike ʻana o nā lāʻau lapaʻau hou no ka hāʻule ʻana o ka puʻuwai4,5 a ua alakaʻi i ka cardiotoxicity lāʻau lapaʻau ma ke ʻano he kumu nui no ka haʻalele ʻana i ka mākeke6.
I loko o nā makahiki he ʻumi i hala iho nei, ua hoʻoneʻe ʻia ʻewalu mau lāʻau lapaʻau ʻaʻole no ka maʻi puʻuwai mai ka hoʻohana ʻana i ka lāʻau lapaʻau no ka mea e hoʻolōʻihi ai lākou i ka manawa QT e alakaʻi ana i nā arrhythmias ventricular a me ka make koke7. No laila, aia kahi pono e hoʻonui nei no nā hoʻolālā loiloi preclinical hilinaʻi e loiloi i ka pono cardiovascular a me ka toxicity. ʻO ka hoʻohana hou ʻana o nā cardiomyocytes i loaʻa mai ke cell stem pluripotent i hoʻoulu ʻia e ke kanaka (hiPS-CM) i ka nānā ʻana i ka lāʻau lapaʻau a me ka hoʻāʻo ʻana i ka toxicity e hāʻawi i kahi hopena hapa i kēia pilikia. Eia nō naʻe, ʻo ke ʻano ʻōpiopio o nā hiPS-CM a me ka nele o ka paʻakikī multicellular o ka ʻiʻo cardiac nā palena nui o kēia ʻano hana. Ua hōʻike ʻia nā haʻawina hou e hiki ke lanakila ʻia kēia palena ma ka hoʻohana ʻana i ka hiPS-CM mua e hana i nā hydrogels ʻiʻo cardiac ma hope koke iho o ka hoʻomaka ʻana o nā ʻaelike spontaneous a me ka hoʻonui mālie ʻana i ka hoʻoulu uila i ka hala ʻana o ka manawa. Eia naʻe, ʻaʻohe o kēia mau microtissues hiPS-CM i nā waiwai electrophysiological a me contractile makua o ka myocardium makua. Eia kekahi, ʻoi aku ka paʻakikī o ka ʻiʻo cardiac kanaka, nona ka hui heterogeneous o nā ʻano cell like ʻole, me nā cell endothelial, neurons, a me nā fibroblasts stromal, i hoʻopili ʻia e nā set kikoʻī o nā protein matrix extracellular. ʻO kēia ʻano like ʻole o nā heluna kanaka ʻaʻole cardiomyocyte11,12,13 i loko o ka puʻuwai mammalian makua he pale nui ia i ke kumu hoʻohālike o ka ʻiʻo cardiac me ka hoʻohana ʻana i nā ʻano cell pākahi. Hoʻokūpaʻa kēia mau palena nui i ke koʻikoʻi o ka hoʻomohala ʻana i nā ʻano hana no ka hoʻoulu ʻana i ka ʻiʻo myocardial piha ma lalo o nā kūlana physiological a me nā pathological.
Ua hōʻoia ʻia nā ʻāpana lahilahi (300 µm) o ka puʻuwai kanaka i hoʻoulu ʻia he kumu hoʻohālike hoʻohiki o ka myocardium kanaka i hoʻopaʻa ʻia. Hāʻawi kēia ʻano hana i ke komo ʻana i kahi ʻōnaehana multicellular 3D piha e like me ka ʻiʻo puʻuwai kanaka. Eia naʻe, a hiki i ka makahiki 2019, ua kaupalena ʻia ka hoʻohana ʻana i nā ʻāpana puʻuwai i hoʻoulu ʻia e ke ola pōkole (24 h) o ka moʻomeheu. ʻO kēia ma muli o kekahi mau kumu e pili ana i ka nele o ke kīkoʻo kino-mekanika, ka interface air-liquid, a me ka hoʻohana ʻana i nā media maʻalahi ʻaʻole e kākoʻo i nā pono o ka ʻiʻo cardiac. I ka makahiki 2019, ua hōʻike kekahi mau hui noiʻi e hiki i ka hoʻokomo ʻana i nā mea mechanical i loko o nā ʻōnaehana moʻomeheu ʻiʻo cardiac ke hoʻolōʻihi i ke ola moʻomeheu, hoʻomaikaʻi i ka hōʻike ʻana o ka puʻuwai, a hoʻohālike i ka pathology cardiac. Hōʻike ʻelua mau haʻawina nani 17 a me 18 he hopena maikaʻi ka hoʻouka ʻana o ka mechanical uniaxial i ka phenotype cardiac i ka wā o ka moʻomeheu. Eia naʻe, ʻaʻole i hoʻohana kēia mau haʻawina i ka hoʻouka ʻana o ka physico-mechanical ʻekolu-dimensional o ke kaʻina cardiac, ʻoiai ua hoʻouka ʻia nā ʻāpana puʻuwai me nā ikaika tensile isometric 17 a i ʻole ka hoʻouka ʻana o ka auxotonic linear 18. ʻO kēia mau ʻano hana o ka hoʻolōʻihi ʻana i nā ʻiʻo i hopena i ka hoʻopau ʻana i nā ʻano genes cardiac he nui a i ʻole ka hoʻonui nui ʻia o nā genes e pili ana i nā pane hoʻolōʻihi maʻamau. ʻIke ʻia, ua hoʻomohala ʻo Pitoulis et al. 19 i kahi ʻauʻau moʻomeheu ʻāpana puʻuwai ikaika no ke kūkulu hou ʻana i ke kaʻina hana cardiac me ka hoʻohana ʻana i ka mana transducer feedback a me nā tension drives. ʻOiai ʻae kēia ʻōnaehana i ka hoʻohālikelike pololei ʻana i ke kaʻina hana cardiac in vitro, ʻo ka paʻakikī a me ka haʻahaʻa o ke ʻano hana e kaupalena ana i ka hoʻohana ʻana o kēia ʻōnaehana. Ua hoʻomohala hou kā mākou keʻena hoʻokolohua i kahi ʻōnaehana moʻomeheu maʻalahi e hoʻohana ana i ka hoʻoulu uila a me kahi medium i hoʻomaikaʻi ʻia e mālama i ke ola o nā ʻāpana o ka puaʻa a me ka ʻiʻo puʻuwai kanaka a hiki i 6 mau lā20,21.
Ma ka palapala lima o kēia manawa, wehewehe mākou i kahi kumu hoʻohālike moʻomeheu ʻiʻo cardiac (CTCM) me ka hoʻohana ʻana i nā ʻāpana o ka puʻuwai puaʻa e hoʻokomo pū ana i nā cues humoral e hana hou i ka physiology cardiac ʻekolu-dimensional a me ka distension pathophysiological i ka wā o ke kaʻina hana cardiac. Hiki i kēia CTCM ke hoʻonui i ka pololei o ka wānana lāʻau lapaʻau pre-clinical i kahi pae i loaʻa ʻole ma mua ma ka hāʻawi ʻana i kahi ʻōnaehana cardiac mid-throughput kūpono, e hoʻohālike ana i ka physiology/pathophysiology o ka puʻuwai mammalian no ka hoʻāʻo lāʻau lapaʻau pre-clinical.
He kuleana koʻikoʻi ko nā hōʻailona mechanical hemodynamic i ka mālama ʻana i ka hana cardiomyocyte ma vitro 22,23,24. Ma ka palapala o kēia manawa, ua hoʻomohala mākou i kahi CTCM (Kiʻi 1a) hiki ke hoʻohālike i ke kaiapuni cardiac makua ma o ka hoʻoulu ʻana i ka hoʻoulu uila a me ka mechanical i nā alapine physiological (1.2 Hz, 72 beats i kēlā me kēia minuke). I mea e pale aku ai i ka hohola nui ʻana o nā ʻiʻo i ka wā diastole, ua hoʻohana ʻia kahi mea paʻi 3D e hoʻonui i ka nui o nā ʻiʻo ma 25% (Kiʻi 1b). Ua hoʻonohonoho ʻia ka wikiwiki uila i hoʻokumu ʻia e ka ʻōnaehana C-PACE e hoʻomaka i 100 ms ma mua o ka systole me ka hoʻohana ʻana i kahi ʻōnaehana loaʻa ʻikepili e hana hou i ke kaʻina hana cardiac. Hoʻohana ka ʻōnaehana moʻomeheu ʻiʻo i kahi actuator pneumatic programmable (LB Engineering, Kelemania) e hoʻonui cyclically i kahi membrane silicone flexible e hoʻonui i nā ʻāpana puʻuwai ma ke keʻena luna. Ua hoʻopili ʻia ka ʻōnaehana i kahi laina ea waho ma o kahi transducer kaomi, kahi i hiki ai ke hoʻoponopono pololei i ke kaomi (± 1 mmHg) a me ka manawa (± 1 ms) (Kiʻi 1c).
a E hoʻopili i ka ʻāpana ʻiʻo i ke apo kākoʻo 7 mm, i hōʻike ʻia i ka uliuli, i loko o ke keʻena moʻomeheu o ka hāmeʻa. Ua hoʻokaʻawale ʻia ke keʻena moʻomeheu mai ke keʻena ea e kahi membrane silicone palupalu lahilahi. E kau i kahi gasket ma waena o kēlā me kēia keʻena e pale ai i nā leaka. Aia i loko o ke poʻi o ka hāmeʻa nā electrodes graphite e hāʻawi ana i ka hoʻoulu uila. b Hōʻike kiʻi o ka hāmeʻa ʻiʻo nui, ke apo alakaʻi a me ke apo kākoʻo. Hoʻonoho ʻia nā ʻāpana ʻiʻo (ʻeleʻele) ma luna o ka hāmeʻa nui me ke apo alakaʻi i kau ʻia ma ke awāwa ma ka lihi o waho o ka hāmeʻa. Me ka hoʻohana ʻana i ke alakaʻi, e kau pono i ke apo kākoʻo i uhi ʻia me ka mea hoʻopili acrylic ʻiʻo ma luna o ka ʻāpana o ka ʻiʻo cardiac. c Kiʻi e hōʻike ana i ka manawa o ka hoʻoulu uila ma ke ʻano he hana o ke kaomi o ke keʻena ea i hoʻomalu ʻia e kahi actuator pneumatic programmable (PPD). Ua hoʻohana ʻia kahi mea loaʻa ʻikepili e hoʻonohonoho i ka hoʻoulu uila me ka hoʻohana ʻana i nā mea ʻike kaomi. Ke hiki ke kaomi i loko o ke keʻena moʻomeheu i ka paepae i hoʻonohonoho ʻia, hoʻouna ʻia kahi hōʻailona pulse i ka C-PACE-EM e hoʻoulu i ka hoʻoulu uila. d Kiʻi o ʻehā CTCM i kau ʻia ma kahi papa incubator. Hoʻopili ʻia nā mea ʻehā i hoʻokahi PPD ma o kahi kaapuni pneumatic, a ua hoʻokomo ʻia nā mea ʻike kaomi i loko o ka valve hemostatic e nānā i ke kaomi i loko o ke kaapuni pneumatic. Loaʻa i kēlā me kēia mea hana ʻeono mau ʻāpana ʻiʻo.
Ma ka hoʻohana ʻana i hoʻokahi mea hoʻokani pneumatic, ua hiki iā mākou ke kāohi i 4 mau mea CTCM, hiki i kēlā me kēia ke paʻa i 6 mau ʻāpana ʻiʻo (Kiʻi 1d). Ma CTCM, ua hoʻololi ʻia ke kaomi ea i loko o ke keʻena ea i ke kaomi synchronous i loko o ke keʻena wai a hoʻoulu i ka hoʻonui physiological o ka ʻāpana puʻuwai (Kiʻi 2a a me ke Kiʻiʻoniʻoni Hoʻohui 1). Ka loiloi ʻana o ke kīkoʻo ʻiʻo ma 80 mm Hg. Ua hōʻike ʻo Art. i ke kīkoʻo ʻana o nā ʻāpana ʻiʻo ma 25% (Kiʻi 2b). Ua hōʻike ʻia kēia pakeneka kīkoʻo e pili ana i ka lōʻihi sarcomere physiological o 2.2-2.3 µm no ka contractility ʻāpana cardiac maʻamau17,19,25. Ua loiloi ʻia ka neʻe ʻana o nā ʻiʻo me ka hoʻohana ʻana i nā hoʻonohonoho kāmela maʻamau (Kiʻi Hoʻohui 1). ʻO ka amplitude a me ka wikiwiki o ka neʻe ʻana o nā ʻiʻo (Kiʻi 2c, d) ua pili i ke kīkoʻo i ka wā o ke kaʻapuni cardiac a me ka manawa i ka wā systole a me diastole (Kiʻi 2b). ʻO ke kīkoʻo a me ka wikiwiki o nā ʻiʻo cardiac i ka wā o ka ʻūlū a me ka hoʻomaha ʻana ua mau no 12 mau lā i ka moʻomeheu (Kiʻi 2f). No ka loiloi ʻana i ka hopena o ka hoʻoulu uila ma ka contractility i ka wā o ka hoʻoulu ʻana, ua hoʻomohala mākou i kahi ʻano hana no ka hoʻoholo ʻana i ka deformity hana me ka hoʻohana ʻana i kahi algorithm shading (Kiʻi Hoʻohui 2a, b) a ua hiki ke hoʻokaʻawale ma waena o nā deformities me a me ka ʻole o ka hoʻoulu uila. ʻO ka ʻāpana like o ka puʻuwai (Kiʻi 2f). Ma ka ʻāpana neʻe o ka ʻoki (R6-9), ʻo ke voltage i ka wā o ka hoʻoulu uila he 20% kiʻekiʻe ma mua o ka loaʻa ʻole o ka hoʻoulu uila, e hōʻike ana i ka hāʻawi ʻana o ka hoʻoulu uila i ka hana contractile.
ʻO nā kaha hōʻike o ke kaomi o ke keʻena ea, ke kaomi o ke keʻena wai, a me nā ana o ka neʻe ʻana o nā ʻiʻo e hōʻoia ana e hoʻololi ke kaomi o ke keʻena i ke kaomi o ke keʻena wai, e hana ana i kahi neʻe like o ka ʻāpana ʻiʻo. b Nā kaha hōʻike o ka pakeneka o ke kīkoʻo (polū) o nā ʻāpana ʻiʻo e pili ana i ka pakeneka o ke kīkoʻo (ʻalani). c ʻO ka neʻe ʻana i ana ʻia o ka ʻāpana puʻuwai e kūlike me ka wikiwiki o ka neʻe ʻana i ana ʻia. (d) Nā ala hōʻike o ka neʻe cyclic (laina polū) a me ka wikiwiki (laina kiko ʻalani) i loko o kahi ʻāpana o ka puʻuwai. e Ka helu ʻana o ka manawa pōʻaiapuni (n = 19 ʻāpana no kēlā me kēia hui, mai nā puaʻa like ʻole), ka manawa ʻūlū (n = 19 ʻāpana no kēlā me kēia hui), ka manawa hoʻomaha (n = 19 ʻāpana no kēlā me kēia hui, mai nā puaʻa like ʻole), ka neʻe ʻana o nā ʻiʻo (n = 25 ). ʻāpana)/hui mai nā puaʻa like ʻole), ka wikiwiki systolic kiʻekiʻe (n = 24(D0), 25(D12) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole) a me ka wikiwiki hoʻomaha kiʻekiʻe (n=24(D0), 25(D12) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole). ʻAʻole i hōʻike ka t-test a ka Haumāna ʻElua-tailed i kahi ʻokoʻa koʻikoʻi i kekahi palena. f Nā kaha loiloi ʻano ʻokoʻa o nā ʻāpana ʻiʻo me ka hoʻoulu uila (ʻulaʻula) a me ka ʻole o ka hoʻoulu uila (polū), he ʻumi mau wahi ʻāpana o nā ʻāpana ʻiʻo mai ka ʻāpana like. Hōʻike nā panela lalo i ka helu ʻana o ka ʻokoʻa pakeneka o ke ʻano i nā ʻāpana ʻiʻo me ka ʻole o ka hoʻoulu uila ma nā wahi he ʻumi mai nā ʻāpana like ʻole. (n = 8 ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, ua hana ʻia ka hoʻāʻo-tolu-huelo Haumāna; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, ua hana ʻia ka hoʻāʻo-tolu-huelo Haumāna; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 mau ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, ka hoʻāʻo-t a ka Haumāna ʻelua huelo; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 mau ʻāpana/hui, mai nā puaʻa like ʻole, ka hoʻāʻo-t a ka Haumāna ʻelua huelo; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Hōʻike nā kaha hewa i ka awelika ± ʻokoʻa maʻamau.
Ma kā mākou ʻōnaehana moʻomeheu ʻoki puʻuwai biomimetic static ma mua [20, 21], ua mālama mākou i ke ola, ka hana, a me ke kūpaʻa o nā ʻāpana puʻuwai no 6 mau lā ma o ka hoʻopili ʻana i ka hoʻoulu uila a me ka hoʻomaikaʻi ʻana i ka haku mele waena. Eia naʻe, ma hope o 10 mau lā, ua hāʻule nui kēia mau helu. E kuhikuhi mākou i nā ʻāpana i mahi ʻia i kā mākou ʻōnaehana moʻomeheu biomimetic static ma mua 20, 21 mau kūlana kaohi (Ctrl) a e hoʻohana mākou i kā mākou medium i hoʻomaikaʻi mua ʻia e like me nā kūlana MC a me ka moʻomeheu ma lalo o ka hoʻoulu ʻana o ka mechanical a me ka uila (CTCM). i kapa ʻia . ʻO ka mea mua, ua hoʻoholo mākou ʻaʻole lawa ka hoʻoulu ʻana o ka mechanical me ka hoʻoulu uila ʻole e mālama i ke ola o nā ʻiʻo no 6 mau lā (Kiʻi Hoʻohui. 3a,b). ʻO ka mea hoihoi, me ka hoʻolauna ʻana o ka hoʻoulu ʻana o ka physio-mechanical a me ka uila me ka hoʻohana ʻana iā STCM, ua like ke ola o nā ʻāpana puʻuwai 12 lā me nā ʻāpana puʻuwai hou ma lalo o nā kūlana MS, akā ʻaʻole ma lalo o nā kūlana Ctrl, e like me ka hōʻike ʻana o ka loiloi MTT (Kiʻi 1). 3a). Hōʻike kēia e hiki i ka hoʻoulu ʻana o ka mechanical a me ka simulation o ke kaʻina hana cardiac ke mālama i nā ʻāpana ʻiʻo i ola no ʻelua manawa e like me ka mea i hōʻike ʻia ma kā mākou ʻōnaehana moʻomeheu static ma mua. Eia nō naʻe, ua hōʻike ka loiloi ʻana i ka pono o ke ʻano o nā ʻāpana ʻiʻo ma o ka immunolabeling o ka troponin T cardiac a me ka connexin 43 ua ʻoi aku ka kiʻekiʻe o ka hōʻike ʻana o ka connexin 43 i nā ʻiʻo MC i ka lā 12 ma mua o nā kaohi i ka lā hoʻokahi. Eia nō naʻe, ʻaʻole i mālama piha ʻia ka hōʻike like ʻana o ka connexin 43 a me ka hoʻokumu ʻana o Z-disc (Kiʻi 3b). Hoʻohana mākou i kahi ʻōnaehana akamai artificial (AI) e helu i ka pono o ke ʻano o ka ʻiʻo26, kahi pipeline aʻo hohonu i hoʻokumu ʻia ma ke kiʻi e pili ana i ka troponin-T a me ka connexin staining43 e helu pono i ka pono o ke ʻano a me ka fluorescence o nā ʻāpana puʻuwai ma ke ʻano o ka ikaika o ka localization. Hoʻohana kēia ʻano hana i kahi Convolutional Neural Network (CNN) a me kahi ʻōnaehana aʻo hohonu e helu pono i ka pono o ke ʻano o ka ʻiʻo cardiac ma ke ʻano automated a unbiased, e like me ka mea i wehewehe ʻia ma ka kuhikuhi. 26. Ua hōʻike ka ʻiʻo MC i ka like o ke ʻano i ka lā 0 i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana kaohi static. Eia kekahi, ua hōʻike ka Masson's trichrome staining i kahi pakeneka haʻahaʻa loa o ka fibrosis ma lalo o nā kūlana MS i hoʻohālikelike ʻia me nā kūlana kaohi i ka lā 12 o ka moʻomeheu (Kiʻi 3c). ʻOiai ua hoʻonui ʻo CTCM i ke ola o nā ʻāpana ʻiʻo puʻuwai i ka lā 12 i kahi pae like me ko ka ʻiʻo puʻuwai hou, ʻaʻole ia i hoʻomaikaʻi nui i ka kūpaʻa o ke ʻano o nā ʻāpana puʻuwai.
Hōʻike kahi pakuhi Bar i ka helu ʻana o ke ola MTT o nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) a i ʻole ka moʻomeheu ʻāpana puʻuwai no 12 mau lā ma ka moʻomeheu static (D12 Ctrl) a i ʻole ma CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala; ####p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D0 a me **p < 0.01 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). Hōʻike kahi pakuhi Bar i ka helu ʻana o ke ola MTT o nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) a i ʻole ka moʻomeheu ʻāpana puʻuwai no 12 mau lā ma ka moʻomeheu static (D12 Ctrl) a i ʻole CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala; ####p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D0 a me **p < 0.01 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl).Hōʻike ka histogram i ka helu ʻana o ke ola o nā ʻāpana puʻuwai hou MTT (D0) a i ʻole ka moʻomeheu o nā ʻāpana puʻuwai no 12 mau lā ma ka moʻomeheu static (mana D12) a i ʻole CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (mana D12). ) ), 12 (D12 MC) nā ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia kahi hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D0 a me **p < 0.01 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片12相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与 D12 Ctrl)histogram e hōʻike ana i ka helu ʻana o ka hiki ke ola o MTT i nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) a i ʻole nā ​​ʻāpana puʻuwai i mahi ʻia no 12 mau lā i ka moʻomeheu static (mana D12) a i ʻole CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (mana D12)), 12 (D12 MC) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D0, **p < 0.01 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl).b Troponin-T (ʻōmaʻomaʻo), connexin 43 (ʻulaʻula) a me DAPI (polū) i nā ʻāpana puʻuwai i hoʻokaʻawale hou ʻia (D0) a i ʻole nā ​​ʻāpana puʻuwai i mahi ʻia ma lalo o nā kūlana static (Ctrl) a i ʻole nā ​​​​kūlana CTCM (MC) no 12 mau lā) o nā kiʻi immunofluorescence ʻelele (pākuʻi hakahaka = 100 µm). ʻO ka helu ʻana o ka naʻauao hana o ka pono o ke kūkulu ʻana o nā ʻiʻo puʻuwai (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ʻāpana/hui kēlā me kēia mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala; ####p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D0 a me ****p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). Ka helu ʻana o ka naʻauao hana i ka pono o ke kūkulu ʻana o nā ʻiʻo puʻuwai (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ʻāpana/hui kēlā me kēia mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala; ####p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D0 a me ****p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). LIKE LIKE LIKE от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению). Ka helu ʻana o ke kūpaʻa o ke ʻano o ka ʻiʻo puʻuwai e ka naʻauao hana (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) mau ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala i hana ʻia; ####p < 0.0001 vs. me D0 a me ****p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ʻāpana/hui o kēlā me kēia puaʻa ʻokoʻa, hoʻāʻo ANOVA ʻaoʻao hoʻokahi;####p01 相0##p01 ， ####p01 相0. < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ʻāpana/hui o kēlā me kēia puaʻa like ʻole, hoʻāʻo ANOVA ʻaoʻao hoʻokahi;##0##p < 10.****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), Ctrl7 (D12) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравню ). ʻO ke akamai hana e ana i ka pono o ke ʻano o ka ʻiʻo puʻuwai (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) mau ʻāpana/hui o kēlā me kēia puaʻa like ʻole, hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala; ####p<0.0001 vs .D0 No ka hoʻohālikelike ʻana ****p <0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). c Nā kiʻi hoʻohālikelike (hema) a me ka helu ʻana (ʻākau) no nā ʻāpana puʻuwai i hoʻoluʻu ʻia me ka pena trichrome a Masson (Scale bare = 500 µm) (n = 10 ʻāpana/hui kēlā me kēia mai ka puaʻa like ʻole, hana ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala; ####p <0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D0 a me ***p <0.001 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). c Nā kiʻi hoʻohālikelike (hema) a me ka helu ʻana (ʻākau) no nā ʻāpana puʻuwai i hoʻoluʻu ʻia me ka pena trichrome a Masson (Scale bare = 500 µm) (n = 10 ʻāpana/hui kēlā me kēia mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala; #### p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D0 a me ***p < 0.001 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным краснамлате без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 p < 0,0001 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Nā kiʻi hoʻohālikelike (hema) a me ka helu ʻana (ʻākau) o nā ʻāpana puʻuwai i hoʻoluʻu ʻia me ka pena trichrome Masson (unahi i uhi ʻole ʻia = 500 µm) (n = 10 mau ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala i hana ʻia; #### p < 0 .0001 i hoʻohālikelike ʻia me D0 a me ***p < 0.001 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度（裸尺度 = 5m0 度= 5个切片/组，每组来自不同的猪，进桌单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.0012 C 。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单君0.##0.与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителка = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперси <##; 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Nā kiʻi hoʻohālikelike (hema) a me ka helu ʻana (ʻākau) o nā ʻāpana puʻuwai i hoʻoluʻu ʻia me ka pena trichrome a Masson (blank = 500 µm) (n = 10 mau ʻāpana/hui, kēlā me kēia mai kahi puaʻa ʻokoʻa, i hoʻāʻo ʻia e ka loiloi hoʻokahi ala o ka ʻokoʻa;### # p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D0, ***p < 0.001 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl).Hōʻike nā kaha hewa i ka awelika ± ʻokoʻa maʻamau.
Ua kuhiakau mākou ma ka hoʻohui ʻana i nā molekala liʻiliʻi i ka medium culture, hiki ke hoʻomaikaʻi ʻia ka pono o ka cardiomyocyte a hoʻemi ʻia ka hoʻomohala ʻana o ka fibrosis i ka wā o ka culture CTCM. No laila, ua nānā mākou no nā molekala liʻiliʻi me ka hoʻohana ʻana i kā mākou mau cultures control static20,21 ma muli o ka liʻiliʻi o nā mea hoʻohuihui. Ua koho ʻia ʻo Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), a me SB431542 (SB) no kēia nānā. Ua hoʻohana mua ʻia kēia mau molekala liʻiliʻi i nā moʻomeheu hiPSC-CM e hoʻoulu i ka oʻo ʻana o nā cardiomyocytes ma ka hoʻonui ʻana i ka lōʻihi o ka sarcomere, nā T-tubules, a me ka wikiwiki o ka conduction. Eia kekahi, ua ʻike ʻia ʻo Dex (he glucocorticoid) a me SB e kāohi i ka mumū29,30. No laila, ua hoʻāʻo mākou inā e hoʻomaikaʻi ka hoʻokomo ʻana o hoʻokahi a i ʻole ka hui pū ʻana o kēia mau molekala liʻiliʻi i ka pono o nā ʻāpana puʻuwai. No ka nānā mua ʻana, ua koho ʻia ka nui o kēlā me kēia hui ma muli o nā ʻano i hoʻohana pinepine ʻia i nā hiʻohiʻona culture cell (1 μM Dex27, 100 nM T327, a me 2.5 μM SB31). Ma hope o 12 mau lā o ka hoʻoulu ʻana, ʻo ka hui pū ʻana o T3 a me Dex i hopena i ka pono kūpono o ke kūkulu ʻana o ka cardiomyocyte a me ka hoʻololi hou ʻana o ka fibrous liʻiliʻi (Nā Kiʻi Hoʻohui 4 a me 5). Eia kekahi, ʻo ka hoʻohana ʻana i ka pālua a pālua paha o kēia mau ʻano o T3 a me Dex i hoʻopuka i nā hopena maikaʻi ʻole i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻano maʻamau (Kiʻi Hoʻohui 6a, b).
Ma hope o ka nānā mua ʻana, ua hana mākou i kahi hoʻohālikelike poʻo-a-poʻo o 4 mau kūlana moʻomeheu (Kiʻi 4a): Ctrl: nā ʻāpana puʻuwai i mahi ʻia i loko o kā mākou moʻomeheu static i wehewehe mua ʻia me ka hoʻohana ʻana i kā mākou medium i hoʻonui ʻia; 20.21 TD: T3 a me Ctrl s Hoʻohui ʻia ʻo Dex i ka Pōʻakolu; MC: nā ʻāpana puʻuwai i mahi ʻia ma CTCM me ka hoʻohana ʻana i kā mākou medium i hoʻonui mua ʻia; a me MT: CTCM me T3 a me Dex i hoʻohui ʻia i ka medium. Ma hope o 12 mau lā o ka mahi ʻana, ua like ka ola o nā ʻiʻo MS a me MT me nā ʻiʻo hou i loiloi ʻia e ka MTT assay (Kiʻi 4b). ʻO ka mea hoihoi, ʻo ka hoʻohui ʻana o T3 a me Dex i nā moʻomeheu transwell (TD) ʻaʻole i hopena i kahi hoʻomaikaʻi koʻikoʻi i ka ola i hoʻohālikelike ʻia me nā kūlana Ctrl, e hōʻike ana i kahi kuleana koʻikoʻi o ka hoʻoulu ʻana o ka mīkini i ka mālama ʻana i ka ola o nā ʻāpana puʻuwai.
he kiʻikuhi hoʻolālā hoʻokolohua e hōʻike ana i nā kūlana moʻomeheu ʻehā i hoʻohana ʻia e loiloi i nā hopena o ka hoʻoulu ʻana o ka mīkini a me ka hoʻopihapiha T3/Dex ma ka medium no 12 mau lā. Hōʻike ka pakuhi pā i ka helu ʻana o ke ola ʻana i 12 mau lā ma hope o ka moʻomeheu ʻana ma nā kūlana moʻomeheu 4 āpau (Ctrl, TD, MC, a me MT) i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a me D12 MT), 12 (D12 MC) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 i hoʻohālikelike ʻia me D0 a me **p < 0.01 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). Hōʻike ka pakuhi pā i ka helu ʻana o ke ola ʻana i 12 mau lā ma hope o ka moʻomeheu ʻana ma nā kūlana moʻomeheu 4 āpau (Ctrl, TD, MC, a me MT) i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a me D12 MT), 12 (D12 MC) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 i hoʻohālikelike ʻia me D0 a me **p < 0.01 i hoʻohālikelike ʻia me D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во вселях 4 ул. (контроль, TD, MC a me MT) e pili ana i ka сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a me D12 MT), 12 (D12 MT), 12 (D12 MT), 12 (D12 MT) разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Hōʻike ka pakuhi pā i ka helu ʻana o ke ola ma 12 mau lā ma hope o ka hoʻoulu ʻana ma nā kūlana hoʻoulu ʻana 4 āpau (mana, TD, MC, a me MT) i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, a me D12 MT), 12 (D12 MC) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 vs. D0 a me **p < 0.01 e hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (Dl5) TD0和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 ，p < 0.001 ，p 0.001 ，p 与 与与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими серди серди (серди и серди) (0 D) 15. <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram e hōʻike ana i nā kūlana moʻomeheu 4 āpau (mana, TD, MC a me MT) i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a me D12 MT), mai nā ʻāpana/hui puaʻa like ʻole 12 (D12 MC), hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. mana D12). Hōʻike ka pakuhi bar i ka helu ʻana o ke kahe glucose 12 mau lā ma hope o ka moʻomeheu ma nā kūlana moʻomeheu 4 āpau (Ctrl, TD, MC, a me MT) i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) (n = 6 ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala; ###p < 0.001, i hoʻohālikelike ʻia me D0 a me ***p < 0.001 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). Hōʻike ka pakuhi bar i ka helu ʻana o ke kahe glucose 12 mau lā ma hope o ka moʻomeheu ma nā kūlana moʻomeheu 4 āpau (Ctrl, TD, MC, a me MT) i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) (n = 6 ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala; ###p < 0.001, i hoʻohālikelike ʻia me D0 a me ***p < 0.001 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всехол 4 лусков (kona, TD, MC a me MT) e pili ana i ka сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, родниностясто ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). Hōʻike ʻo c Histogram i ka helu ʻana o ke kahe glucose 12 mau lā ma hope o ka moʻomeheu ma lalo o nā kūlana moʻomeheu 4 āpau (mana, TD, MC a me MT) i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) (n = 6 mau ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala i hana ʻia; ###p <0.001 i hoʻohālikelike ʻia me D0 a me ***p <0.001 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，厹天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001 ，盎所0 ，与D1与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片12 < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех для всех культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разинних Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram e hōʻike ana i ka helu ʻana o ke kahe glucose i 12 mau lā ma hope o ka hoʻoulu ʻana no nā kūlana moʻomeheu 4 āpau (mana, TD, MC, a me MT) i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) (n = 6 mau ʻāpana/hui, mai nā puaʻa like ʻole, unilateral Ma hea i hana ʻia ai nā hoʻāʻo ANOVA, ###p < 0.001 i hoʻohālikelike ʻia me D0, ***p < 0.001 i hoʻohālikelike ʻia me D12 (mana).d Nā kiʻi loiloi ʻano o nā ʻiʻo hou (uliuli), lā 12 MC (ʻōmaʻomaʻo), a me ka lā 12 MT (ʻulaʻula) ma nā wahi ʻāpana ʻiʻo ʻāpana he ʻumi (n = 4 ʻāpana/hui, hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala; ʻaʻohe ʻokoʻa koʻikoʻi ma waena o nā hui). e Ka kiʻi lua pele e hōʻike ana i nā genes i hōʻike ʻokoʻa ʻia i nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana puʻuwai i mahi ʻia ma lalo o nā kūlana static (Ctrl) a i ʻole ma lalo o nā kūlana MT (MT) no 10-12 mau lā. f Palapala wela o nā genes sarcomere no nā ʻāpana puʻuwai i mahi ʻia ma lalo o kēlā me kēia o nā kūlana moʻomeheu. Hōʻike nā kaha hewa i ka awelika ± ʻokoʻa maʻamau.
ʻO ka hilinaʻi metabolic i ka hoʻololi ʻana mai ka oxidation fatty acid i ka glycolysis he hōʻailona ia o ka cardiomyocyte dedifferentiation. Hoʻohana nui nā cardiomyocytes immature i ka glucose no ka hana ʻana o ATP a he mitochondria hypoplastic me ka liʻiliʻi o nā cristae5,32. Ua hōʻike ʻia nā loiloi hoʻohana glucose ma lalo o nā kūlana MC a me MT, ua like ka hoʻohana ʻana o ka glucose me ko nā ʻiʻo o ka lā 0 (Kiʻi 4c). Eia naʻe, ua hōʻike nā laʻana Ctrl i ka piʻi nui ʻana o ka hoʻohana ʻana o ka glucose i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻiʻo hou. Hōʻike kēia i ka hui pū ʻana o CTCM a me T3/Dex e hoʻonui i ke ola o nā ʻiʻo a mālama i ka phenotype metabolic o nā ʻāpana puʻuwai i hoʻoulu ʻia i 12 lā. Eia kekahi, ua hōʻike ka loiloi strain ua like nā pae strain me nā ʻiʻo puʻuwai hou no 12 mau lā ma lalo o nā kūlana MT a me MS (Kiʻi 4d).
No ka nānā ʻana i ka hopena holoʻokoʻa o CTCM a me T3/Dex ma ke ʻano hoʻololi honua o ka ʻiʻo ʻoki puʻuwai, ua hana mākou i ka RNAseq ma nā ʻāpana puʻuwai mai nā kūlana moʻomeheu ʻehā like ʻole (ʻIkepili Hoʻohui 1). ʻO ka mea hoihoi, ua hōʻike nā ʻāpana MT i ke ʻano like kiʻekiʻe o ka hoʻololi ʻana me ka ʻiʻo puʻuwai hou, me 16 wale nō i hōʻike ʻokoʻa ʻia mai loko mai o 13,642 mau genes. Eia naʻe, e like me kā mākou i hōʻike ai ma mua, ua hōʻike nā ʻāpana Ctrl i 1229 mau genes i hōʻike ʻokoʻa ʻia ma hope o 10-12 mau lā i ka moʻomeheu (Kiʻi 4e). Ua hōʻoia ʻia kēia mau ʻikepili e qRT-PCR o nā genes puʻuwai a me fibroblast (Kiʻi Hoʻohui 7a-c). ʻO ka mea hoihoi, ua hōʻike nā ʻāpana Ctrl i ka hoʻohaʻahaʻa ʻana o nā genes cardiac a me ke kaʻina hana cell a me ka hoʻoulu ʻana o nā papahana gene inflammatory. Hōʻike kēia mau ʻikepili ua hoʻemi loa ʻia ka dedifferentiation, ka mea maʻamau ma hope o ka moʻomeheu lōʻihi, ma lalo o nā kūlana MT (Kiʻi Hoʻohui 8a,b). Ua hōʻike ʻia ma ke aʻo pono ʻana i nā genes sarcomere ma lalo o nā kūlana MT wale nō i mālama ʻia ai nā genes e hoʻopili ana i ka sarcomere (Kiʻi 4f) a me ke kahawai ion (Kiʻi Hoʻohui 9), e pale ana iā lākou mai ka hoʻopau ʻana ma lalo o nā kūlana Ctrl, TD, a me MC. Hōʻike kēia mau ʻikepili me ka hui pū ʻana o ka hoʻoulu ʻana o ka mechanical a me ka humoral (T3/Dex), hiki i ka transcriptome ʻoki puʻuwai ke noho like me nā ʻāpana puʻuwai hou ma hope o 12 mau lā i ka moʻomeheu.
Ua kākoʻo ʻia kēia mau ʻike transcriptional e ka ʻoiaʻiʻo ʻo ka pono o ke kūkulu ʻana o nā cardiomyocytes i nā ʻāpana puʻuwai e mālama maikaʻi ʻia ma lalo o nā kūlana MT no 12 mau lā, e like me ka mea i hōʻike ʻia e ka connexin 43 i hoʻopaʻa ʻia a kūloko ʻia (Kiʻi 5a). Eia kekahi, ua emi nui ka fibrosis i nā ʻāpana puʻuwai ma lalo o nā kūlana MT i hoʻohālikelike ʻia me Ctrl a like me nā ʻāpana puʻuwai hou (Kiʻi 5b). Hōʻike kēia mau ʻikepili i ka hui pū ʻana o ka hoʻoulu ʻana o ka mīkini a me ka mālama ʻana iā T3/Dex e mālama pono i ke kūkulu ʻana o ka puʻuwai i nā ʻāpana puʻuwai i ka moʻomeheu.
he mau kiʻi immunofluorescence hōʻike o troponin-T (ʻōmaʻomaʻo), connexin 43 (ʻulaʻula), a me DAPI (polū) i nā ʻāpana puʻuwai i hoʻokaʻawale hou ʻia (D0) a i hoʻoulu ʻia no 12 mau lā ma nā kūlana hoʻoulu ʻāpana puʻuwai ʻehā (ka pā unahi = 100 µm). ). ʻO ka helu ʻana o ka naʻauao hana o ka pono o ke kūkulu ʻana o nā ʻiʻo puʻuwai (n = 7 (D0 a me D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC a me D12 MT) nā ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala; ####p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D0 a me *p < 0.05, a i ʻole ****p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). ʻO ka helu ʻana o ka naʻauao hana o ka pono o ke kūkulu ʻana o nā ʻiʻo puʻuwai (n = 7 (D0 a me D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC a me D12 MT) nā ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala; #### p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D0 a me *p < 0.05, a i ʻole ****p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D12 D12), MC (D0 2 D15) D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравнению с D0 ,**** и и по < 0,**** и по < 0,**** и по < 0,**** и по сравнению с D12 Ctrl). Ka helu ʻana o ke kūpaʻa o ke ʻano o ka ʻiʻo puʻuwai me ka hoʻohana ʻana i ka naʻauao hana (n = 7 (D0 a me D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC a me D12 MT) nā ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala i hana ʻia; #### p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D0 a me *p < 0.05 a i ʻole ****p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 ，書新 0.05 ，書曾与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mc 和 d1智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相月0 ， 戸0*p < 0.05 相比 ， 戸0****00 ， 戸 相比 ， 戸0l0 D0 与D0相比）.Ka helu ʻana o ke kūpaʻa o ke ʻano o ka ʻiʻo puʻuwai me ka hoʻohana ʻana i ka naʻauao hana i nā puaʻa like ʻole (n = 7 (D0 a me D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC a me D12 MT) ʻāpana/hui) me kahi hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 a ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D0 a me *p < 0.05 a i ʻole ****p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). b Nā kiʻi hoʻohālikelike a me ka helu ʻana no nā ʻāpana puʻuwai i hoʻoluʻu ʻia me ka pena trichrome a Masson (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, a me D12 MC), 9 (D12 MT) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala; ####p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D0 a me ***p < 0.001, a i ʻole ****p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). b Nā kiʻi hoʻohālikelike a me ka helu ʻana no nā ʻāpana puʻuwai i hoʻoluʻu ʻia me ka pena trichrome a Masson (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, a me D12 MC), 9 (D12 MT) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala; ####p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D0 a me ***p < 0.001, a i ʻole ****p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона 0 = массона мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется одностосторонний те1 <##0сторонний те сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Nā kiʻi hoʻohālikelike a me ka helu ʻana o nā ʻāpana puʻuwai i hoʻoluʻu ʻia me ka pena trichrome a Masson (ka pā unahi = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD a me D12 MC), 9 (D12 MT) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, i hana ʻia hoʻokahi ala ANOVA; ####p < 0.0001 vs. D0 a me ***p < 0.001 a i ʻole ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）！1D = 10（D10）（n = 2、D1 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 < 中文**p < 0.0001 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） = 500 µm） = 500 µm） ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相p比 ， 我0*p 比 ，**** 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная = лим50) (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA ####p < 0,0001 Dе свиней; ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Nā kiʻi hoʻohālikelike a me ka helu ʻana o nā ʻāpana puʻuwai i hoʻoluʻu ʻia me ka trichrome a Masson (ka pā unahi = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD a me D12 MC), 9 mau ʻāpana (D12 MT) mai nā puaʻa/hui like ʻole, hoʻokahi ʻano ANOVA; ####p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D0, ***p < 0.001 a i ʻole ****p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl).Hōʻike nā kaha hewa i ka awelika ± ʻokoʻa maʻamau.
ʻO ka mea hope loa, ua loiloi ʻia ka hiki o CTCM ke hoʻohālike i ka hypertrophy cardiac ma ka hoʻonui ʻana i ka hoʻolōʻihi ʻana o nā ʻiʻo cardiac. Ma CTCM, ua piʻi ka nui o ke kaomi o ke keʻena ea mai 80 mmHg a i 80 mmHg. Art. (hoʻolōʻihi maʻamau) a hiki i 140 mmHg Art. (Kiʻi 6a). Pili kēia i ka piʻi ʻana o 32% i ka hoʻolōʻihi ʻana (Kiʻi 6b), i hōʻike mua ʻia ʻo ia ka pakeneka hoʻolōʻihi e pono ai no nā ʻāpana puʻuwai e hoʻokō i ka lōʻihi sarcomere e like me ka mea i ʻike ʻia ma ka hypertrophy. Ua mau ka hoʻolōʻihi a me ka wikiwiki o nā ʻiʻo cardiac i ka wā o ka ʻūlū a me ka hoʻomaha ʻana i nā lā ʻeono o ka moʻomeheu (Kiʻi 6c). Ua hoʻokau ʻia nā ʻiʻo cardiac mai nā kūlana MT i ka hoʻolōʻihi maʻamau (MT (Normal)) a i ʻole nā ​​kūlana overstretch (MT (OS)) no nā lā ʻeono. Ma hope o ʻehā lā i ka moʻomeheu, ua hoʻokiʻekiʻe nui ʻia ka biomarker hypertrophic NT-ProBNP i loko o ka medium ma lalo o nā kūlana MT (OS) i hoʻohālikelike ʻia me nā kūlana MT (maʻamau) (Kiʻi 7a). Eia kekahi, ma hope o ʻeono lā o ka moʻomeheu ʻana, ua piʻi nui ka nui o ke kelepona ma MT (OS) (Kiʻi 7b) i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana o ka puʻuwai MT (maʻamau). Eia kekahi, ua hoʻonui nui ʻia ka hoʻoili ʻana o ka nuklea NFATC4 i nā ʻiʻo i hoʻolōʻihi ʻia (Kiʻi 7c). Hōʻike kēia mau hopena i ka hoʻomohala holomua o ka hana hou ʻana o ka pathological ma hope o ka hyperdistension a kākoʻo i ka manaʻo e hiki ke hoʻohana ʻia ka hāmeʻa CTCM ma ke ʻano he kahua e aʻo ai i ka hōʻailona hypertrophy cardiac i hoʻoulu ʻia e ka stretch.
ʻO nā kaha hōʻike o ke kaomi o ke keʻena ea, ke kaomi o ke keʻena wai, a me nā ana o ka neʻe ʻana o nā ʻiʻo e hōʻoia ana e hoʻololi ke kaomi o ke keʻena i ke kaomi o ke keʻena wai, e hana ana i kahi neʻe like o ka ʻāpana ʻiʻo. b ʻO ka pakeneka hoʻolōʻihi hōʻike a me nā piʻo wikiwiki hoʻolōʻihi no nā ʻāpana ʻiʻo i hoʻolōʻihi maʻamau ʻia (ʻalani) a me nā ʻāpana ʻiʻo i hoʻolōʻihi nui ʻia (polū). c Ka pakuhi pā e hōʻike ana i ka manawa pōʻaiapuni (n = 19 ʻāpana no kēlā me kēia hui, mai nā puaʻa like ʻole), ka manawa ʻūlū (n = 18-19 ʻāpana no kēlā me kēia hui, mai nā puaʻa like ʻole), ka manawa hoʻomaha (n = 19 ʻāpana no kēlā me kēia hui, mai nā puaʻa like ʻole) ), ka nui o ka neʻe ʻana o nā ʻiʻo (n = 14 ʻāpana/hui, mai nā puaʻa like ʻole), ka wikiwiki systolic kiʻekiʻe (n = 14 ʻāpana/hui, mai nā puaʻa like ʻole) a me ka wikiwiki hoʻomaha kiʻekiʻe (n = 14 (D0), 15 (D6) ) nā ʻāpana/nā hui) mai nā puaʻa like ʻole), ʻaʻole i hōʻike ka t-test a ka Haumāna ʻelua-tailed i kekahi ʻokoʻa koʻikoʻi i kekahi palena, e hōʻike ana ua mau kēia mau palena i ka wā o 6 mau lā o ka moʻomeheu me ka overvoltage. Hōʻike nā kaha hewa i ka awelika ± ka ʻokoʻa maʻamau.
ʻO ka helu ʻana o ka pakuhi Bar o ka nui o NT-ProBNP i loko o nā pāpaho moʻomeheu mai nā ʻāpana puʻuwai i mahi ʻia ma lalo o nā kūlana MT maʻamau (Norm) a i ʻole overstretching (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, a me D4 MTOS) nā ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ʻelua ala ANOVA; **p < 0.01 i hoʻohālikelike ʻia me ke kīkoʻo maʻamau). ʻO ka helu ʻana o ka pakuhi Bar o ka nui o NT-ProBNP i loko o nā pāpaho moʻomeheu mai nā ʻāpana puʻuwai i mahi ʻia ma lalo o nā kūlana MT maʻamau (Norm) a i ʻole overstretching (OS) (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, a me D4 MTOS) nā ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ʻelua ala ANOVA; **p < 0.01 i hoʻohālikelike ʻia me ke kīkoʻo maʻamau).ʻO ka histogram quantitative o ka nui o NT-ProBNP i loko o ka medium culture mai nā ʻāpana puʻuwai i mahi ʻia ma lalo o nā kūlana o ka MT stretch maʻamau (norm) a i ʻole overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, a me D4).MTOS) nā ʻāpana /hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ka loiloi ʻelua-factor o ka variance;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 i hoʻohālikelike ʻia me ke kīkoʻo maʻamau). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的曾度4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；p不不为不不为0.01） Ka helu o ka NT-ProBNP i loko o nā ʻāpana puʻuwai i hoʻoulu ʻia ma lalo o ke kūlana maʻamau MT (Norm) a i ʻole overstretch (OS) kūlana (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) mai nā ʻano like ʻole. ** hoʻohālikelike ʻia me ka hoʻolōʻihi maʻamau, p <0.01).histogram Ka helu ʻana o nā ʻāpana NT-ProBNP i loko o nā ʻāpana puʻuwai i mahi ʻia ma lalo o nā kūlana o ka MT stretch maʻamau (norm) a i ʻole overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) a me D4 MTOS) nā ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, ka nānā ʻana i ka ʻokoʻa ʻelua ala;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 i hoʻohālikelike ʻia me ke kīkoʻo maʻamau). b Nā kiʻi hoʻohālikelike no nā ʻāpana puʻuwai i hoʻoluʻu ʻia me ka troponin-T a me WGA (hema) a me ka helu ʻana o ka nui o ke kelepona (ʻākau) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) mau kelepona/hui mai 10 mau ʻāpana like ʻole mai nā puaʻa like ʻole, ua hana ʻia ka hoʻāʻo t-haumāna ʻelua huelo; ****p <0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me ke kīkoʻo maʻamau). b Nā kiʻi hoʻohālikelike no nā ʻāpana puʻuwai i hoʻoluʻu ʻia me ka troponin-T a me WGA (hema) a me ka helu ʻana o ka nui o ke kelepona (ʻākau) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) mau kelepona/hui mai 10 mau ʻāpana like ʻole mai nā puaʻa like ʻole, ua hana ʻia ka hoʻāʻo t-haumāna ʻelua huelo; ****p <0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me ke kīkoʻo maʻamau). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного опеникрадрад (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится х t-стой х t-стой ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Nā kiʻi hoʻohālikelike o nā ʻāpana puʻuwai i hoʻoluʻu ʻia me ka troponin-T a me AZP (hema) a me ka helu ʻana o ka nui o ke kelepona (ʻākau) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) mau kelepona/hui mai 10 mau ʻāpana like ʻole mai nā puaʻa like ʻole, ua hana ʻia ka hoʻāʻo t-haumāna ʻelua huelo; ****p <0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me ke ʻano maʻamau). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性（小量化（右）染色的心脏切片的代表性（图图MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比，****p < 0.0001）。 b Nā kiʻi hoʻohālikelike o nā ʻāpana puʻuwai i hoʻoluʻu ʻia me ka calcarein-T a me WGA (hema) a me ka nui o ke kelepona (ʻākau) (n = 330 (D6 MTOS), 369 mai 10 mau ʻāpana like ʻole (D6 MTNorm)) Nā Kelepona/ʻano like ʻole, hoʻāʻo ʻia ka hoʻonui ʻana o ka puʻuwai i ka hoʻohālikelike ʻana; i hoʻohālikelike ʻia me ke kīkoʻo maʻamau, *****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) a me количественная оцленка (расленка) 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Ста;юд0н сравнению с нормальным растяжением). b Nā kiʻi hoʻohālikelike o nā ʻāpana puʻuwai i hoʻoluʻu ʻia me ka troponin-T a me AZP (hema) a me ka helu ʻana o ka nui o ke kelepona (ʻākau) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) mai 10 mau ʻāpana like ʻole mai nā puaʻa like ʻole) Nā kelepona/hui, ʻelua huelo pae hoʻohālikelike Haumāna t; ****p <0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me ke ʻano maʻamau). c Nā kiʻi hoʻohālikelike no ka lā 0 a me ka lā 6 MTOS nā ʻāpana puʻuwai i immunolabeled no troponin-T a me NFATC4 a me ka helu ʻana o ka translocation o NFATC4 i nā nuclei o CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ka hoʻāʻo t-haumāna ʻelua-tailed; *p < 0.05). c Nā kiʻi hoʻohālikelike no ka lā 0 a me ka lā 6 MTOS nā ʻāpana puʻuwai i hoʻopaʻa ʻia no troponin-T a me NFATC4 a me ka helu ʻana o ka hoʻololi ʻana o NFATC4 i nā nuclei o CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ka hoʻāʻo t-haumāna ʻelua huelo; *p < 0.05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, и колицяч транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , вылнядяетскристроя Стьюдента; *p < 0,05). c Nā kiʻi hoʻohālikelike no nā ʻāpana puʻuwai ma 0 a me 6 mau lā MTOS, immunolabeled no troponin-T a me NFATC4, a me ka helu ʻana o ka translocation NFATC4 i loko o ka nucleus o nā cell cavernous (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole) i hana ʻia i ka hoʻāʻo t-haumāna ʻelua-tailed; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)片 3 (D0)片进行双尾学生t 检验；*p < 0.05). c Nā kiʻi makaʻāinana o ka calcanin-T a me ka NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS nā ʻāpana puʻuwai, a me ka NFATC4 mai nā NFATC4 易位至CM cell nucleus的quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) / 爇时间双尾学生et 电影；*p < 0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS ma 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и колицнч транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Синта, *0). c Nā kiʻi hoʻohālikelike o nā ʻāpana puʻuwai MTOS i ka lā 0 a me 6 no ka troponin-T a me ka NFATC4 immunolabeling a me ka helu ʻana o ka translocation NFATC4 i loko o ka nucleus o CM mai nā puaʻa like ʻole (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ʻāpana/hui, ʻelua-huelo t-criterion Student's; *p < 0.05).Hōʻike nā kaha hewa i ka awelika ± ʻokoʻa maʻamau.
Pono ka noiʻi cardiovascular Translational i nā hiʻohiʻona cellular e hana hou i ke kaiapuni cardiac. Ma kēia haʻawina, ua hoʻomohala ʻia a wehewehe ʻia kahi hāmeʻa CTCM e hiki ke hoʻoulu i nā ʻāpana ultrathin o ka puʻuwai. Hoʻokomo pū ka ʻōnaehana CTCM i ka hoʻoulu ʻana o ka electromechanical physiologically synchronized a me ka hoʻonui ʻana o ka wai T3 a me Dex. I ka wā i hōʻike ʻia ai nā ʻāpana puʻuwai puaʻa i kēia mau mea, ua like ko lākou ola, ka pono o ke ʻano, ka hana metabolic, a me ka hōʻike transcriptional me ka ʻiʻo puʻuwai hou ma hope o 12 mau lā o ka moʻomeheu. Eia kekahi, ʻo ka hoʻolōʻihi nui ʻana o ka ʻiʻo cardiac hiki ke hana i ka hypertrophy o ka puʻuwai i hoʻokumu ʻia e ka hyperextension. Ma keʻano holoʻokoʻa, kākoʻo kēia mau hopena i ke kuleana koʻikoʻi o nā kūlana moʻomeheu physiological i ka mālama ʻana i kahi phenotype cardiac maʻamau a hāʻawi i kahi kahua no ka nānā ʻana i nā lāʻau lapaʻau.
He nui nā kumu e kōkua i ka hoʻokumu ʻana i kahi kūlana kūpono no ka hana a me ke ola ʻana o nā cardiomyocytes. ʻO ka mea maopopo loa o kēia mau kumu e pili ana i (1) nā pilina intercellular, (2) ka hoʻoulu ʻana electromechanical, (3) nā kumu humoral, a me (4) nā substrates metabolic. Pono nā pilina physiological cell-to-cell i nā pūnaewele ʻekolu-dimensional paʻakikī o nā ʻano cell he nui i kākoʻo ʻia e kahi matrix extracellular. He paʻakikī ke hana hou i kēlā mau pilina cellular paʻakikī in vitro e ka co-culture o nā ʻano cell pākahi, akā hiki ke hoʻokō maʻalahi me ka hoʻohana ʻana i ke ʻano organotypic o nā ʻāpana puʻuwai.
He mea koʻikoʻi ka hoʻolōʻihi mīkini a me ka hoʻoulu uila o nā cardiomyocytes no ka mālama ʻana i ka phenotype cardiac33,34,35. ʻOiai ua hoʻohana nui ʻia ka hoʻoulu ʻana o ka mīkini no ka hoʻomaʻamaʻa ʻana a me ka hoʻomāʻamaʻa ʻana o ka hiPSC-CM, ua hoʻāʻo hou kekahi mau haʻawina nani i ka hoʻoulu ʻana o ka mīkini o nā ʻāpana puʻuwai i ka moʻomeheu me ka hoʻohana ʻana i ka hoʻouka uniaxial. Hōʻike kēia mau haʻawina he hopena maikaʻi ka hoʻouka ʻana o ka mīkini uniaxial 2D i ka phenotype o ka puʻuwai i ka wā o ka moʻomeheu. I loko o kēia mau haʻawina, ua hoʻouka ʻia nā ʻāpana o ka puʻuwai me nā ikaika tensile isometric17, ka hoʻouka linear auxotonic18, a i ʻole ua hana hou ʻia ke kaʻapuni cardiac me ka hoʻohana ʻana i ka manaʻo transducer ikaika a me nā hoʻokele tension. Eia nō naʻe, hoʻohana kēia mau ʻano hana i ka hoʻolōʻihi ʻana o ka ʻiʻo uniaxial me ka ʻole o ka hoʻonui ʻana i ke kaiapuni, e hopena ana i ka hoʻopau ʻana i nā genes cardiac he nui a i ʻole ka overexpression o nā genes e pili ana me nā pane hoʻolōʻihi maʻamau. Hāʻawi ka CTCM i wehewehe ʻia ma ʻaneʻi i kahi hoʻoulu electromechanical 3D e hoʻohālike i ke kaʻapuni cardiac kūlohelohe ma ke ʻano o ka manawa kaʻapuni a me ka hoʻolōʻihi physiological (25% hoʻolōʻihi, 40% systole, 60% diastole, a me 72 mau kuʻi i kēlā me kēia minuke). ʻOiai ʻaʻole lawa kēia hoʻoulu ʻana o ka mīkini ʻekolu-dimensional wale nō e mālama i ka pono o nā ʻiʻo, pono ka hui pū ʻana o ka hoʻoulu ʻana o ka humoral a me ka mechanical me ka hoʻohana ʻana iā T3/Dex e mālama pono i ke ola, ka hana, a me ka pono o nā ʻiʻo.
He kuleana koʻikoʻi ko nā kumu humoral i ka hoʻololi ʻana i ke ʻano o ka puʻuwai makua. Ua hōʻike ʻia kēia ma nā haʻawina HiPS-CM kahi i hoʻohui ʻia ai ʻo T3 lāua ʻo Dex i nā media moʻomeheu e hoʻolalelale i ka ulu ʻana o ke kelepona. Hiki iā T3 ke hoʻololi i ka lawe ʻana o nā waikawa amino, nā kō a me ka calcium ma waena o nā membrane cell36. Eia kekahi, hoʻolaha ʻo T3 i ka hōʻike ʻana o MHC-α a me ka downregulation MHC-β, e hoʻolaha ana i ka hoʻokumu ʻana o nā myofibrils twitch wikiwiki i nā cardiomyocytes makua i hoʻohālikelike ʻia me nā myofibrils twitch lohi i ka CM fetal. ʻO ka hemahema o T3 i nā maʻi hypothyroid e hopena i ka nalowale ʻana o nā kāʻei myofibrillar a me ka emi ʻana o ka ulu ʻana o ke kani37. Hana ʻo Dex i nā mea loaʻa glucocorticoid a ua hōʻike ʻia e hoʻonui i ka myocardial contractility i nā puʻuwai perfused i hoʻokaʻawale ʻia; 38 manaʻo ʻia kēia hoʻomaikaʻi ʻana e pili ana i ka hopena ma ke komo ʻana o ka waihona calcium (SOCE) 39,40. Eia kekahi, hoʻopaʻa ʻo Dex i kāna mau mea loaʻa, e hana ana i kahi pane intracellular ākea e kāohi ana i ka hana pale a me ka mumū30.
Hōʻike kā mākou mau hopena ua hoʻomaikaʻi ka hoʻoulu ʻana o ke kino (MS) i ka hana moʻomeheu holoʻokoʻa i hoʻohālikelike ʻia me Ctrl, akā ʻaʻole i mālama i ke ola, ka pono o ke kūkulu ʻana, a me ka hōʻike ʻana o ka puʻuwai ma mua o 12 mau lā i ka moʻomeheu. Ke hoʻohālikelike ʻia me Ctrl, ua hoʻomaikaʻi ka hoʻohui ʻana o T3 a me Dex i nā moʻomeheu CTCM (MT) i ke ola a mālama i nā ʻano transcription like, ka pono o ke kūkulu ʻana, a me ka hana metabolic me nā ʻiʻo puʻuwai hou no 12 mau lā. Eia kekahi, ma ka kaohi ʻana i ke kekelē o ka ʻiʻo, ua hana ʻia kahi kumu hoʻohālike hypertrophy cardiac i hoʻoulu ʻia e ka hyperextension me ka hoʻohana ʻana iā STCM, e hōʻike ana i ka versatility o ka ʻōnaehana STCM. Pono e hoʻomaopopo ʻia ʻoiai ʻo ka hoʻoponopono hou ʻana o ka puʻuwai a me ka fibrosis e pili pinepine i nā ʻōpū i hoʻopaʻa ʻia nona nā cell circulating hiki ke hāʻawi i nā cytokines kūpono a me phagocytosis a me nā mea hoʻoponopono hou ʻē aʻe, hiki i nā ʻāpana o ka puʻuwai ke hoʻohālike i ke kaʻina hana fibrotic i ka pane ʻana i ke kaumaha a me ka trauma. i loko o myofibroblasts. Ua loiloi mua ʻia kēia ma kēia kumu hoʻohālike ʻoki cardiac. Pono e hoʻomaopopo ʻia hiki ke hoʻololi ʻia nā palena CTCM ma ka hoʻololi ʻana i ka amplitude pressure/electrical a me ka pinepine e hoʻohālike i nā kūlana he nui e like me ka tachycardia, bradycardia, a me ke kākoʻo circulatory mechanical (puʻuwai unloaded mechanical). ʻO kēia ka mea e hoʻolilo ai i ka ʻōnaehana i mea hoʻohana waena no ka hoʻāʻo ʻana i ka lāʻau lapaʻau. ʻO ka hiki o CTCM ke hoʻohālike i ka hypertrophy cardiac i hoʻoulu ʻia e ka overexertment e hoʻomākaukau i ke ala no ka hoʻāʻo ʻana i kēia ʻōnaehana no ka lāʻau lapaʻau pilikino. I ka hopena, hōʻike ka haʻawina o kēia manawa he mea koʻikoʻi ka hoʻolōʻihi mechanical a me ka hoʻoulu humoral no ka mālama ʻana i ka moʻomeheu o nā ʻāpana ʻiʻo cardiac.
ʻOiai ke hōʻike nei ka ʻikepili i hōʻike ʻia ma ʻaneʻi he kahua hoʻohiki nui ʻo CTCM no ke kumu hoʻohālike ʻana i ka myocardium i hoʻopaʻa ʻia, aia kekahi mau palena o kēia ʻano moʻomeheu. ʻO ka palena nui o ka moʻomeheu CTCM ʻo ia ka hoʻokau ʻana i nā kaumaha mechanical dynamic mau ma nā ʻāpana, kahi e pale ai i ka hiki ke nānā pono i nā ʻoki ʻoki cardiac i kēlā me kēia pōʻaiapuni. Eia kekahi, ma muli o ka liʻiliʻi o nā ʻāpana cardiac (7 mm), ua kaupalena ʻia ka hiki ke loiloi i ka hana systolic ma waho o nā ʻōnaehana moʻomeheu me ka hoʻohana ʻana i nā sensor ikaika kuʻuna. Ma ka palapala lima o kēia manawa, ua lanakila hapa mākou i kēia palena ma ka loiloi ʻana i ka voltage optical ma ke ʻano he hōʻailona o ka hana contractile. Eia naʻe, e koi ana kēia palena i ka hana hou a hiki ke hoʻoponopono ʻia i ka wā e hiki mai ana ma ka hoʻolauna ʻana i nā ʻano no ka nānā ʻana i ka hana o nā ʻāpana puʻuwai i ka moʻomeheu, e like me ka palapala ʻāina optical me ka hoʻohana ʻana i ka calcium a me nā dyes voltage-sensitive. ʻO kekahi palena o CTCM ʻo ia ka hoʻohālike hana ʻaʻole e hoʻoponopono i ke kaumaha physiological (preload a me afterload). Ma CTCM, ua hoʻokomo ʻia ke kaomi ma nā ʻaoʻao ʻē aʻe e hana hou i ka 25% physiological stretch ma diastole (full stretch) a me systole (ka lōʻihi o ka contraction i ka wā o ka hoʻoulu uila) i nā ʻiʻo nui loa. Pono e wehe ʻia kēia palena i nā hoʻolālā CTCM e hiki mai ana ma o ke kaomi kūpono ma luna o ka ʻiʻo cardiac mai nā ʻaoʻao ʻelua a ma ka hoʻopili ʻana i nā pilina kaomi-leo pololei e kū nei i loko o nā keʻena o ka puʻuwai.
ʻO ka hoʻoponopono hou ʻana i hoʻoulu ʻia e ka overstretch i hōʻike ʻia ma kēia palapala lima ua kaupalena ʻia i ka hoʻohālike ʻana i nā hōʻailona hyperstretch hypertrophic. No laila, hiki i kēia kumu hoʻohālike ke kōkua i ke aʻo ʻana i ka hōʻailona hypertrophic i hoʻoulu ʻia e ka stretch me ka ʻole o ka pono no nā mea humoral a neural paha (ʻaʻole i loaʻa i kēia ʻōnaehana). Pono nā haʻawina hou aʻe e hoʻonui i ka lehulehu o CTCM, no ka laʻana, ka co-culture me nā cell immune, nā mea humoral plasma circulating, a me ka innervation i ka wā e hoʻomaikaʻi ai ka co-culture me nā cell neuronal i nā hiki ke hoʻohālike i ka maʻi me CTCM.
Ua hoʻohana ʻia he ʻumikumamākolu puaʻa ma kēia noiʻi. Ua hana ʻia nā kaʻina hana holoholona āpau e like me nā alakaʻi o ka ʻoihana a ua ʻāpono ʻia e ke Komite Mālama a me ka Hoʻohana Holoholona o ke Kulanui o Louisville. Ua hoʻopaʻa ʻia ke kīkoʻo aortic a ua hoʻopiha ʻia ka puʻuwai me 1 L o ka cardioplegia sterile (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH a hiki i ka 7.4); Ua mālama ʻia nā puʻuwai i loko o ka hopena cardioplegic anu a hiki i ka lawe ʻia ʻana i ka hale hana ma luna o ka hau ʻo ia hoʻi <10 min. Ua mālama ʻia nā puʻuwai i loko o ka hopena cardioplegic anu a hiki i ka lawe ʻia ʻana i ka hale hana ma luna o ka hau ʻo ia hoʻi <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимат <10нимат. Ua mālama ʻia nā puʻuwai i loko o kahi hopena cardioplegic anu a hiki i ka lawe ʻia ʻana i ka hale hana ma luna o ka hau, kahi maʻamau e lawe ana <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. E hoʻomau i ka puʻuwai ma ka hau a hiki i ka lawe ʻia ʻana i ka hale hana ma luna o ka hau, ʻo ka maʻamau <10 min.
Ua hoʻomohala ʻia ka hāmeʻa CTCM ma ka polokalamu hoʻolālā kōkua kamepiula SolidWorks (CAD). Hana ʻia nā keʻena moʻomeheu, nā mea hoʻokaʻawale a me nā keʻena ea i ka plastic acrylic CNC maopopo. Hana ʻia ke apo hoʻihoʻi 7mm ke anawaena me ka polyethylene density kiʻekiʻe (HDPE) ma ke kikowaena a he ʻauwaha apo-o e hoʻokipa i ke apo-o silicone i hoʻohana ʻia e sila i ka media ma lalo. Hoʻokaʻawale kahi membrane silica lahilahi i ke keʻena moʻomeheu mai ka papa hoʻokaʻawale. ʻOki ʻia ka membrane silicone e ka laser mai ka pepa silicone mānoanoa 0.02″ a he paʻakikī o 35A. ʻOki ʻia nā gaskets silicone lalo a me luna mai ka pepa silicone mānoanoa 1/16″ a he paʻakikī o 50A. Hoʻohana ʻia nā wili kila kila 316L a me nā nati ʻēheu no ka hoʻopaʻa ʻana i ka poloka a me ka hana ʻana i kahi sila airtight.
Ua hoʻolālā ʻia kahi papa kaapuni paʻi i hoʻolaʻa ʻia (PCB) e hoʻohui ʻia me ka ʻōnaehana C-PACE-EM. Hoʻopili ʻia nā kumu hoʻohui mīkini Swiss ma ka PCB i nā electrodes graphite e nā uea keleawe i uhi ʻia i ke kālā a me nā wili keleawe 0-60 i wili ʻia i loko o nā electrodes. Hoʻokomo ʻia ka papa kaapuni paʻi i loko o ka uhi o ka mīkini paʻi 3D.
Hoʻokele ʻia ka hāmeʻa CTCM e kahi mea hoʻokō pneumatic programmable (PPD) e hana ana i kahi kaomi kaapuni i kāohi ʻia e like me ke kaʻapuni cardiac. Ke piʻi aʻe ke kaomi i loko o ke keʻena ea, hoʻonui ka membrane silicone palupalu i luna, e koi ana i ka medium ma lalo o kahi kiko. A laila e hohola ʻia ka ʻāpana o ka ʻiʻo e kēia kipaku ʻana o ka wai, e hoʻohālike ana i ka hoʻonui ʻana o ka puʻuwai i ka wā diastole. I ka piko o ka hoʻomaha ʻana, ua hoʻopili ʻia ka hoʻoulu uila ma o nā electrodes graphite, kahi i hoʻemi ai i ke kaomi i loko o ke keʻena ea a hoʻoulu i ka ʻūlū ʻana o nā ʻāpana ʻiʻo. I loko o ka paipu he valve hemostatic me kahi sensor kaomi e ʻike i ke kaomi i loko o ka ʻōnaehana ea. Hoʻopili ʻia ke kaomi i ʻike ʻia e ka sensor kaomi i kahi mea hōʻiliʻili ʻikepili i pili i ka kamepiula lawe lima. ʻAe kēia i ka nānā mau ʻana i ke kaomi i loko o ke keʻena kinoea. I ka hiki ʻana i ke kaomi o ke keʻena kiʻekiʻe loa (maʻamau 80 mmHg, 140 mmHg OS), ua kauoha ʻia ka hāmeʻa loaʻa ʻikepili e hoʻouna i kahi hōʻailona i ka ʻōnaehana C-PACE-EM e hana i kahi hōʻailona voltage biphasic no 2 ms, i hoʻonohonoho ʻia i 4 V.
Ua loaʻa nā ʻāpana puʻuwai a ua hana ʻia nā kūlana moʻomeheu i loko o 6 mau lua penei: E hoʻoili i nā puʻuwai i hōʻiliʻili ʻia mai ka ipu hoʻoili i kahi pā e loaʻa ana ka cardioplegia anu (4° C.). Ua hoʻokaʻawale ʻia ka ventricle hema me kahi pahi sterile a ʻokiʻoki ʻia i mau ʻāpana o 1-2 cm3. Ua hoʻopili ʻia kēia mau poloka ʻiʻo i nā kākoʻo ʻiʻo me ka mea hoʻopili ʻiʻo a waiho ʻia i loko o kahi ʻauʻau ʻiʻo microtome haʻalulu e loaʻa ana ka hopena o Tyrode a hoʻomau ʻia ka oxygen (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g). , 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-glucose (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M solution), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M solution), a hiki i ka 1 L ddH2O). Ua hoʻonohonoho ʻia ka microtome haʻalulu e ʻoki i nā ʻāpana mānoanoa he 300 µm ma ke alapine (frequency) o 80 Hz, kahi amplitude haʻalulu ākea o 2 mm, a me ka wikiwiki o 0.03 mm/s. Ua hoʻopuni ʻia ka ʻauʻau ʻiʻo e ka hau e mālama i ka hoʻonā anuanu a ua mālama ʻia ka mahana ma 4°C. E hoʻololi i nā ʻāpana ʻiʻo mai ka ʻauʻau microtome i kahi ʻauʻau hoʻoulu ʻia e loaʻa ana ka hoʻonā Tyrode oxygenated mau ma luna o ka hau a hiki i ka loaʻa ʻana o nā ʻāpana lawa no hoʻokahi pā moʻomeheu. No nā moʻomeheu transwell, ua hoʻopili ʻia nā ʻāpana ʻiʻo i nā kākoʻo polyurethane sterile 6 mm ka laulā a kau ʻia i loko o 6 ml o ka medium optimized (199 medium, 1x ITS supplement, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkaline a me 2X antibiotic-antifungal). Ua hoʻopili ʻia ka hoʻoulu uila (10 V, alapine 1.2 Hz) i nā ʻāpana ʻiʻo ma o ka C-Pace. No nā kūlana TD, ua hoʻohui ʻia ʻo T3 hou a me Dex ma 100 nM a me 1 μM i kēlā me kēia hoʻololi waena. Hoʻopiha ʻia ka waena me ka oxygen ma mua o ka hoʻololi ʻana i 3 mau manawa i ka lā. Ua mahi ʻia nā ʻāpana ʻiʻo i loko o kahi incubator ma 37°C a me 5% CO2.
No nā moʻomeheu CTCM, ua kau ʻia nā ʻāpana ʻiʻo ma luna o kahi mīkini paʻi 3D i hana kūikawā ʻia i loko o kahi kīʻaha Petri me ka hopena Tyrode i hoʻololi ʻia. Ua hoʻolālā ʻia ka hāmeʻa e hoʻonui i ka nui o ka ʻāpana o ka puʻuwai ma 25% o ka ʻāpana o ke apo kākoʻo. Hana ʻia kēia i ʻole e kīkoʻo nā ʻāpana o ka puʻuwai ma hope o ka hoʻoili ʻia ʻana mai ka hopena Tyrode i ka medium a i ka wā diastole. Me ka hoʻohana ʻana i ka glue histoacrylic, ua hoʻopaʻa ʻia nā ʻāpana 300 µm ka mānoanoa ma luna o ke apo kākoʻo 7 mm ke anawaena. Ma hope o ka hoʻopili ʻana i nā ʻāpana ʻiʻo i ke apo kākoʻo, e ʻoki i nā ʻāpana ʻiʻo keu a hoʻihoʻi i nā ʻāpana ʻiʻo i hoʻopili ʻia i loko o ka ʻauʻau o ka hopena Tyrode ma luna o ka hau (4°C) a hiki i ka hoʻomākaukau ʻana i nā ʻāpana lawa no hoʻokahi hāmeʻa. ʻAʻole pono e ʻoi aku ka manawa hana no nā hāmeʻa āpau ma mua o 2 mau hola. Ma hope o ka hoʻopili ʻia ʻana o 6 mau ʻāpana ʻiʻo i ko lākou mau apo kākoʻo, ua hoʻākoakoa ʻia ka hāmeʻa CTCM. Ua hoʻopiha mua ʻia ke keʻena moʻomeheu CTCM me 21 ml medium pre-oxygenated. E hoʻololi i nā ʻāpana ʻiʻo i ke keʻena moʻomeheu a wehe pono i nā pehu ea me ka pipette. A laila alakaʻi ʻia ka ʻāpana ʻiʻo i loko o ka lua a kaomi mālie i kona wahi. ʻO ka hope loa, e kau i ke poʻi electrode ma luna o ka hāmeʻa a hoʻoili i ka hāmeʻa i ka incubator. A laila e hoʻopili i ka CTCM i ka paipu ea a me ka ʻōnaehana C-PACE-EM. Wehe ka actuator pneumatic a wehe ka valve ea i ka CTCM. Ua hoʻonohonoho ʻia ka ʻōnaehana C-PACE-EM e hāʻawi i ka 4 V ma 1.2 Hz i ka wā o ka biphasic pacing no 2 ms. Ua hoʻololi ʻia ka medium i ʻelua manawa i ka lā a ua hoʻololi ʻia nā electrodes i hoʻokahi manawa i ka lā e pale aku i ka hōʻiliʻili ʻana o ka graphite ma nā electrodes. Inā pono, hiki ke wehe ʻia nā ʻāpana ʻiʻo mai kā lākou mau lua moʻomeheu e kipaku i nā pehu ea i hāʻule paha ma lalo o lākou. No nā kūlana mālama MT, ua hoʻohui hou ʻia ʻo T3/Dex me kēlā me kēia hoʻololi medium me 100 nM T3 a me 1 μM Dex. Ua ulu ʻia nā hāmeʻa CTCM i loko o kahi incubator ma 37°C a me 5% CO2.
No ka loaʻa ʻana o nā ala i hoʻolōʻihi ʻia o nā ʻāpana puʻuwai, ua hoʻomohala ʻia kahi ʻōnaehana kāmela kūikawā. Ua hoʻohana ʻia kahi kāmela SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Iapana) me kahi aniani macro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, Kapalakiko, CA). Ua hana ʻia ka nānā ʻana ma ka mahana o ka lumi ma hope o ke pani ʻana i ka medium me ka medium hou. Hoʻonoho ʻia ke kāmela ma kahi kihi 51° a hoʻopaʻa ʻia ke wikiō ma 30 mau kiʻi i kekona. ʻO ka mea mua, ua hoʻohana ʻia ka polokalamu open source (MUSCLEMOTION43) me Image-J e helu i ka neʻe ʻana o nā ʻāpana puʻuwai. Ua hana ʻia ka pale maka me ka hoʻohana ʻana iā MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) e wehewehe i nā wahi hoihoi no ka hahau ʻana i nā ʻāpana puʻuwai e pale aku i ka walaʻau. Hoʻopili ʻia nā pale maka i hoʻokaʻawale ʻia me ka lima i nā kiʻi āpau i loko o kahi kaʻina mōlina a laila hoʻouna ʻia i ka plug-in MUSCLEMOTION. Hoʻohana ʻo Muscle Motion i ka ikaika awelika o nā pikela i kēlā me kēia mōlina e helu i kona neʻe ʻana e pili ana i ka mōlina kuhikuhi. Ua hoʻopaʻa ʻia nā ʻikepili, kānana ʻia a hoʻohana ʻia e helu i ka manawa pōʻaiapuni a loiloi i ka hoʻolōʻihi ʻana o nā ʻiʻo i ka wā o ke kaʻina puʻuwai. Ua hoʻoponopono ʻia ke wikiō i hoʻopaʻa ʻia ma hope o ka hoʻohana ʻana i kahi kānana kikohoʻe zero-phase mua. No ka helu ʻana i ka hohola ʻana o nā ʻiʻo (peak-to-peak), ua hana ʻia ka nānā ʻana o ka peak-to-peak e hoʻokaʻawale ma waena o nā peaks a me nā troughs i loko o ka hōʻailona i hoʻopaʻa ʻia. Eia kekahi, hana ʻia ka detrending me ka hoʻohana ʻana i kahi polynomial kauoha 6 e hoʻopau i ka drift signal. Ua hoʻomohala ʻia ke code papahana ma MATLAB e hoʻoholo i ka neʻe ʻana o nā ʻiʻo honua, ka manawa pōʻaiapuni, ka manawa hoʻomaha, a me ka manawa ʻūlū (Supplementary Program Code 44).
No ka loiloi ʻana i ke kaumaha, me ka hoʻohana ʻana i nā wikiō like i hana ʻia no ka loiloi hoʻolōʻihi mechanical, ua kaha mua mākou i ʻelua kiʻi e hōʻike ana i nā piko neʻe (nā kiko kiʻekiʻe loa (luna) a me nā kiko haʻahaʻa loa (haʻahaʻa) e like me ka polokalamu MUSCLEMOTION. A laila ua hoʻokaʻawale mākou i nā ʻāpana ʻiʻo a hoʻopili i kahi ʻano algorithm shading i ka ʻiʻo i māhele ʻia (Kiʻi Hoʻohui 2a). A laila ua māhele ʻia ka ʻiʻo i māhele ʻia i ʻumi mau ʻili, a ua helu ʻia ke kaumaha ma kēlā me kēia ʻili me ka hoʻohana ʻana i ka hoʻohālikelike penei: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, kahi ʻo Sup a me Sdown nā mamao o ke ʻano mai nā aka o luna a me lalo o ka lole, kēlā me kēia (Kiʻi Hoʻohui .2b).
Ua hoʻopaʻa ʻia nā ʻāpana puʻuwai i loko o 4% paraformaldehyde no 48 mau hola. Ua hoʻomaloʻo ʻia nā ʻiʻo i hoʻopaʻa ʻia i loko o 10% a me 20% sucrose no 1 hola, a laila i loko o 30% sucrose i ka pō. A laila ua hoʻokomo ʻia nā ʻāpana i loko o ka hui mahana ʻoki maikaʻi loa (hui OCT) a hoʻopaʻahau mālie ʻia i loko o kahi ʻauʻau isopentane/hau maloʻo. E mālama i nā poloka hoʻokomo OCT ma -80 °C a hiki i ka hoʻokaʻawale ʻana. Ua hoʻomākaukau ʻia nā slide ma ke ʻano he mau ʻāpana me ka mānoanoa o 8 μm.
No ka wehe ʻana i ka OCT mai nā ʻāpana puʻuwai, e hoʻomehana i nā paheʻe ma kahi poloka hoʻomehana ma 95 °C no 5 min. E hoʻohui i 1 ml PBS i kēlā me kēia paheʻe a hoʻomoʻa no 30 mau minuke ma ka mahana o ka lumi, a laila e hoʻokomo i nā ʻāpana ma ke kau ʻana i ka 0.1% Triton-X ma PBS no 15 mau minuke ma ka mahana o ka lumi. No ka pale ʻana i nā antibodies kikoʻī ʻole mai ka hoʻopaʻa ʻana i ka hāpana, e hoʻohui i 1 ml o ka hopena 3% BSA i nā paheʻe a hoʻomoʻa no 1 hola ma ka mahana o ka lumi. A laila ua wehe ʻia ka BSA a ua holoi ʻia nā paheʻe me PBS. E kaha i kēlā me kēia hāpana me ka penikala. Ua hoʻohui ʻia nā antibodies mua (hoʻoheheʻe ʻia 1:200 i loko o 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) a me troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) ma luna o 90 mau minuke, a laila ua hoʻohui ʻia nā antibodies lua (hoʻoheheʻe ʻia 1:200 i loko o 1% BSA) e kūʻē i ka ʻiole Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), e kūʻē i ka rabbit Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) no 90 mau minuke hou aku. Ua holoi ʻia i 3 mau manawa me PBS No ka hoʻokaʻawale ʻana i ka pena ʻana i ka pahuhopu mai ke kua, ua hoʻohana wale mākou i ka antibody lua ma ke ʻano he kaohi. ʻO ka hope loa, ua hoʻohui ʻia ka pena nuklea DAPI a ua kau ʻia nā slide i loko o kahi vectashield (Vector Laboratories) a ua hoʻopaʻa ʻia me ka polish kui. -x hoʻonui) a me ka microscope Keyence me ka hoʻonui 40x.
Ua hoʻohana ʻia ʻo WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) ma 5 μg/ml ma PBS no ka hoʻoluʻu ʻana i ka WGA a ua hoʻopili ʻia i nā ʻāpana paʻa no 30 mau minuke ma ka mahana o ka lumi. A laila ua holoi ʻia nā paheʻe me PBS a ua hoʻohui ʻia ka ʻeleʻele Sudan i kēlā me kēia paheʻe a ua hoʻomoʻa ʻia no 30 mau minuke. A laila ua holoi ʻia nā paheʻe me PBS a ua hoʻohui ʻia ka mea hoʻokomo vectashield. Ua ʻike ʻia nā paheʻe ma kahi microscope Keyence ma ka hoʻonui ʻana o 40x.
Ua wehe ʻia ʻo OCT mai nā laʻana e like me ka mea i wehewehe ʻia ma luna. Ma hope o ka wehe ʻana i ka OCT, e hoʻoluʻu i nā slide i loko o ka hopena o Bouin i ka pō. A laila ua holoi ʻia nā slide me ka wai i hoʻoheheʻe ʻia no 1 hola a laila waiho ʻia i loko o kahi hopena Bibrich aloe acid fuchsin no 10 mau minuke. A laila ua holoi ʻia nā slide me ka wai i hoʻoheheʻe ʻia a waiho ʻia i loko o kahi hopena o 5% phosphomolybdenum/5% phosphotungstic acid no 10 mau minuke. Me ka holoi ʻole ʻana, e hoʻoili pololei i nā slide i loko o ka hopena aniline blue no 15 mau minuke. A laila ua holoi ʻia nā slide me ka wai i hoʻoheheʻe ʻia a waiho ʻia i loko o kahi hopena 1% acetic acid no 2 mau minuke. Ua hoʻomaloʻo ʻia nā slide i loko o 200 N ethanol a hoʻoili ʻia i xylene. Ua nānā ʻia nā slide i hoʻoluʻu ʻia me ka hoʻohana ʻana i kahi microscope Keyence me kahi pahuhopu 10x. Ua helu ʻia ka pakeneka ʻāpana Fibrosis me ka hoʻohana ʻana i ka polokalamu Keyence Analyzer.
ʻO CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), helu papa inoa V13154, e like me ke kaʻina hana a ka mea hana me kekahi mau hoʻololi. Ma ke ʻano kūikawā, ua hoʻohana ʻia kahi punch ʻokiʻoki me ke anawaena o 6 mm e hōʻoia i ka nui like o nā ʻiʻo i ka wā o ka nānā ʻana o MTT. Ua hoʻopili pākahi ʻia nā ʻiʻo i loko o nā lua o kahi pā 12-lua e loaʻa ana ka substrate MTT e like me ke kaʻina hana a ka mea hana. Hoʻomoʻa ʻia nā ʻāpana ma 37° C. no 3 mau hola a hoʻololi ka ʻiʻo ola i ka substrate MTT e hana i kahi hui formazan poni. E hoʻololi i ka hopena MTT me 1 ml DMSO a hoʻomoʻa ma 37°C no 15 mau minuke e unuhi i ka formazan poni mai nā ʻāpana puʻuwai. Ua hoʻoheheʻe ʻia nā laʻana 1:10 ma DMSO i loko o nā papa lalo maopopo 96-lua a ua ana ʻia ka ikaika o ke kala poni ma 570 nm me ka hoʻohana ʻana i kahi mea heluhelu pā Cytation (BioTek). Ua hoʻomaʻamaʻa ʻia nā heluhelu i ke kaumaha o kēlā me kēia ʻāpana o ka puʻuwai.
Ua pani ʻia ka pāpaho ʻoki puʻuwai me ka pāpaho e loaʻa ana he 1 μCi/ml [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) no ka hoʻāʻo hoʻohana glucose e like me ka mea i wehewehe mua ʻia. Ma hope o 4 mau hola o ka hoʻoulu ʻana, e hoʻohui i 100 µl o ka medium i kahi paipu microcentrifuge hāmama e loaʻa ana he 100 µl o 0.2 N HCl. A laila ua kau ʻia ka paipu i loko o kahi paipu scintillation e loaʻa ana he 500 μl o dH2O e hoʻoheheʻe i ka [3H]2O no 72 mau hola ma 37°C. A laila e wehe i ka paipu microcentrifuge mai ka paipu scintillation a hoʻohui i 10 ml o ka wai scintillation. Ua hana ʻia nā helu scintillation me ka hoʻohana ʻana i kahi mea loiloi scintillation wai Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). A laila ua helu ʻia ka hoʻohana ʻana o ka glucose me ka noʻonoʻo ʻana i ka hana kikoʻī [5-3H]-glucose, ke kaulike piha ʻole a me ke kua, ka hoʻoheheʻe ʻana o [5-3H]-i ka glucose i lepili ʻole ʻia, a me ka pono o ka scintillation counter. Hoʻonohonoho ʻia ka ʻikepili i ka nui o nā ʻāpana o ka puʻuwai.
Ma hope o ka homogenization o nā ʻiʻo ma Trizol, ua hoʻokaʻawale ʻia ʻo RNA mai nā ʻāpana puʻuwai me ka hoʻohana ʻana i ka Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 e like me ke kaʻina hana a ka mea hana. Ua hana ʻia ka hoʻomākaukau ʻana o ka waihona puke RNAsec, ka hoʻonohonoho ʻana a me ka nānā ʻana i ka ʻikepili penei:
Ua hoʻohana ʻia he 1 μg o RNA no kēlā me kēia laʻana ma ke ʻano he mea hoʻomaka no ka hoʻomākaukau ʻana o ka waihona puke RNA. Ua hana ʻia nā waihona puke hoʻonohonoho me ka hoʻohana ʻana i ka NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit no Illumina (NEB, USA) ma hope o nā ʻōlelo a ka mea hana, a ua hoʻohui ʻia nā code index i nā moʻo ʻano no kēlā me kēia laʻana. I ka pōkole, ua hoʻomaʻemaʻe ʻia ka mRNA mai ka RNA holoʻokoʻa me ka hoʻohana ʻana i nā beads magnetic i hoʻopili ʻia me nā poly-T oligonucleotides. Hoʻokō ʻia ka fragmentation me ka hoʻohana ʻana i nā cations divalent ma ke kiʻekiʻe wela ma NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). Ua synthesized ʻia ke kaula mua cDNA me ka hoʻohana ʻana i nā primers hexamer random a me M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-). A laila synthesized ʻia ke kaula ʻelua cDNA me ka hoʻohana ʻana i ka DNA polymerase I a me RNase H. Hoʻololi ʻia nā overhangs i koe i nā wēlau blunt e ka hana exonuclease/polymerase. Ma hope o ka adenylation o ka hopena 3′ o ka ʻāpana DNA, ua hoʻopili ʻia kahi NEBNext Adapter me kahi ʻano loop hairpin iā ia e hoʻomākaukau ai no ka hybridization. No ke koho ʻana i nā ʻāpana cDNA o ka lōʻihi makemake ʻia 150-200 bp. Ua hoʻomaʻemaʻe ʻia nā ʻāpana waihona puke me ka hoʻohana ʻana i ka ʻōnaehana AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA). A laila, ua hoʻohana ʻia ka 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) me ka cDNA i koho ʻia me ka nui i hoʻopaʻa ʻia me kahi adapter no 15 mau minuke ma 37°C a laila no 5 mau minuke ma 95°C ma mua o ka PCR. A laila ua hana ʻia ka PCR me ka hoʻohana ʻana i ka Phusion High-Fidelity DNA polymerase, nā primers PCR universal, a me nā primers Index (X). ʻO ka hope loa, ua hoʻomaʻemaʻe ʻia nā huahana PCR (ʻōnaehana AMPure XP) a ua loiloi ʻia ka maikaʻi o ka waihona puke ma kahi ʻōnaehana Agilent Bioanalyzer 2100. A laila ua hoʻonohonoho ʻia ka waihona puke cDNA me ka hoʻohana ʻana i kahi sequencer Novaseq. Ua hoʻololi ʻia nā faila kiʻi maka mai Illumina i nā heluhelu maka me ka hoʻohana ʻana i ka CASAVA Base Calling. Mālama ʻia ka ʻikepili maka i nā faila ʻano FASTQ(fq) i loaʻa nā moʻo heluhelu a me nā ʻano kumu like. E koho iā HISAT2 e hoʻohālikelike i nā heluhelu moʻo i kānana ʻia i ka genome kuhikuhi Sscrofa11.1. Ma keʻano laulā, kākoʻo ʻo HISAT2 i nā genomes o kēlā me kēia nui, me nā genomes i ʻoi aku ma mua o 4 biliona mau kumu, a ua hoʻonohonoho ʻia nā waiwai paʻamau no ka hapa nui o nā palena. Hiki ke hoʻohālikelike pono ʻia nā heluhelu splicing mai ka ʻikepili RNA Seq me ka hoʻohana ʻana iā HISAT2, ka ʻōnaehana wikiwiki loa i loaʻa i kēia manawa, me ka pololei like a ʻoi aku paha ma mua o nā ʻano hana ʻē aʻe.
Hōʻike pololei ka nui o nā transcripts i ka pae o ka hōʻike ʻana o ka gene. Loiloi ʻia nā pae hōʻike gene e ka nui o nā transcripts (helu sequencing) e pili ana me ka genome a i ʻole exons. Pili ka helu o nā heluhelu i nā pae hōʻike gene, ka lōʻihi o ka gene, a me ka hohonu sequencing. Ua helu ʻia ʻo FPKM (nā ʻāpana no nā tausani mau hui kumu o ka transcript sequencing no nā miliona mau hui kumu) a ua hoʻoholo ʻia nā waiwai P o ka hōʻike ʻokoʻa me ka hoʻohana ʻana i ka pūʻolo DESeq2. A laila ua helu mākou i ka helu ʻike wahaheʻe (FDR) no kēlā me kēia waiwai P me ka hoʻohana ʻana i ke ʻano Benjamini-Hochberg9 e pili ana i ka hana R i kūkulu ʻia "p.adjust".
Ua hoʻololi ʻia ka RNA i hoʻokaʻawale ʻia mai nā ʻāpana puʻuwai i cDNA ma kahi nui o 200 ng/μl me ka hoʻohana ʻana i ka hui SuperScript IV Vilo Master mai Thermo (Thermo, cat. no. 11756050). Ua hana ʻia ka Quantitative RT-PCR me ka hoʻohana ʻana i kahi Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well transparent reaction plate (Thermo, cat. no. 4483319) a me ka microamp optical adhesive (Thermo, cat. no. 4311971). ʻO ka hui hana he 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer a me 3.5 µl H2O i hui pū ʻia no kēlā me kēia lua. Ua holo ʻia nā pōʻaiapuni qPCR maʻamau a ua ana ʻia nā waiwai CT me ka hoʻohana ʻana i kahi mea hana PCR manawa maoli ʻo Applied Biosystems Quantstudio 5 (384-well module; huahana # A28135). Ua kūʻai ʻia nā primer Taqman mai Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Ua hoʻohālikelike ʻia nā waiwai CT o nā laʻana āpau i ka gene housekeeping GAPDH.
Ua loiloi ʻia ka hoʻokuʻu ʻana o NT-ProBNP ma o ka hoʻohana ʻana i ka pahu NT-ProBNP (puaʻa) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) e like me ke kaʻina hana a ka mea hana. I ka pōkole, ua hoʻohui ʻia he 250 µl o kēlā me kēia laʻana a me ke kūlana ma ke ʻano pālua i kēlā me kēia lua. Ma hope koke iho o ka hoʻohui ʻana i ka laʻana, e hoʻohui i 50 µl o Assay Reagent A i kēlā me kēia lua. E lūlū mālie i ka pā a sila me ka sila. A laila ua hoʻomoʻa ʻia nā papa ma 37°C no 1 hola. A laila e omo i ka hopena a holoi i nā lua i 4 mau manawa me 350 µl o ka hopena holoi 1X, e hoʻomoʻa ana i ka hopena holoi no 1-2 mau minuke i kēlā me kēia manawa. A laila e hoʻohui i 100 µl o Assay Reagent B no kēlā me kēia lua a sila me ka sila pā. Ua lūlū mālie ʻia ka papa a hoʻomoʻa ʻia ma 37°C no 30 mau minuke. E omo i ka hopena a holoi i nā lua i 5 mau manawa me 350 µl o ka hopena holoi 1X. E hoʻohui i 90 µl o ka hopena substrate i kēlā me kēia lua a sila i ka pā. E hoʻomoʻa i ka pā ma 37°C no 10-20 mau minuke. E hoʻohui i 50 µl Stop Solution i kēlā me kēia lua. Ua ana koke ʻia ka pā me ka hoʻohana ʻana i kahi mea heluhelu pā Cytation (BioTek) i hoʻonohonoho ʻia ma 450 nm.
Ua hana ʻia nā loiloi mana e koho i nā nui o nā hui e hāʻawi i ka mana >80% e ʻike i kahi loli piha o 10% i ke kaulike me ka helu hewa Type I 5%. Ua hana ʻia nā loiloi mana e koho i nā nui o nā hui e hāʻawi i ka mana >80% e ʻike i kahi loli piha o 10% i ke kaulike me ka helu hewa Type I 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Ua hana ʻia ka loiloi mana e koho i nā nui o nā hui e hāʻawi i ka mana >80% e ʻike i ka loli palena piha 10% me ka helu hewa Type I 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I功效以检测参数中10％绝对变化和5％I小田金。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I功效以检测参数中10％绝对变化和5％I小田金。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаругложлениа изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Ua hana ʻia kahi loiloi mana e koho i ka nui o ka hui e hāʻawi i ka mana >80% e ʻike i ka 10% o ka loli palena piha a me ka 5% o ka helu hewa ʻano I.Ua koho wale ʻia nā ʻāpana ʻiʻo ma mua o ka hoʻokolohua. Ua makapō ke kūlana o nā loiloi a pau a ua wehewehe ʻia nā laʻana ma hope o ka loiloi ʻia ʻana o nā ʻikepili a pau. Ua hoʻohana ʻia ka polokalamu GraphPad Prism (San Diego, CA) e hana i nā loiloi helu āpau. No nā helu helu āpau, ua manaʻo ʻia he koʻikoʻi nā waiwai-p ma nā waiwai <0.05. No nā helu helu āpau, ua manaʻo ʻia he koʻikoʻi nā p-values ​​​​ma nā waiwai <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. No nā helu helu āpau, ua manaʻo ʻia he koʻikoʻi nā p-values ​​​​ma nā waiwai <0.05.对于所有统计数据，p 值在会<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在会<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. No nā helu helu āpau, ua manaʻo ʻia he koʻikoʻi nā p-values ​​​​ma nā waiwai <0.05.Ua hana ʻia ka hoʻāʻo-t a ka Haumāna ʻelua-huelo ma ka ʻikepili me 2 mau hoʻohālikelike wale nō. Ua hoʻohana ʻia ka ANOVA hoʻokahi ala a ʻelua ala paha e hoʻoholo ai i ke koʻikoʻi ma waena o nā hui he nui. I ka wā e hana ai i nā hoʻokolohua post hoc, ua hoʻopili ʻia ka hoʻoponopono ʻana a Tukey e helu ai i nā hoʻohālikelike he nui. Loaʻa i ka ʻikepili RNAsec nā noʻonoʻo helu kūikawā i ka wā e helu ai iā FDR a me p.adjust e like me ka mea i wehewehe ʻia ma ka ʻāpana Methods.
No ka ʻike hou aku e pili ana i ka hoʻolālā haʻawina, e ʻike i ka hōʻuluʻulu manaʻo o ka Nature Research Report i hoʻopili ʻia i kēia ʻatikala.