Mahalo no kou kipa ʻana iā Nature.com. ʻO ka polokalamu kele pūnaewele āu e hoʻohana nei he kākoʻo CSS kaupalena. No ka ʻike maikaʻi loa, manaʻo mākou e hoʻohana i kahi polokalamu kele pūnaewele hou (a i ʻole e hoʻopau i ke ʻano Compatibility Mode ma Internet Explorer). I kēia manawa, e hōʻoia i ke kākoʻo mau ʻana, e hāʻawi mākou i ka pūnaewele me ka ʻole o nā ʻano a me JavaScript.
Pono ka ʻōnaehana in vitro hilinaʻi e hiki ke hana hou i ke ʻano physiological o ka puʻuwai no ka hoʻāʻo ʻana i ka lāʻau. ʻO ka loaʻa ʻana o nā ʻōnaehana moʻomeheu puʻuwai kanaka i alakaʻi i ka wehewehe pololei ʻole o nā hopena lāʻau lapaʻau naʻau. Maʻaneʻi, ua hoʻomohala mākou i kahi ʻano moʻomeheu cardiac tissue culture (CTCM) e hoʻoulu ai i ka electromechanically i nā ʻāpana puʻuwai a loaʻa i ka physiological stretch i nā manawa systolic a me diastolic o ka pōʻai cardiac. Ma hope o 12 mau lā o ka moʻomeheu, ua hoʻomaikaʻi iki kēia ala i ka hiki ʻana o nā ʻāpana puʻuwai, akā ʻaʻole i mālama pono i ko lākou ʻano pono. No laila, ma hope o ka nānā ʻana i nā mole liʻiliʻi, ua ʻike mākou ʻo ka hoʻohui ʻana o 100 nM triiodothyronine (T3) a me 1 μM dexamethasone (Dex) i kā mākou kikowaena mālama i ka microstructure o nā ʻāpana no nā lā 12. Ma ka hui pū ʻana me ka mālama ʻana iā T3/Dex, ua mālama ka ʻōnaehana CTCM i nā moʻolelo transcriptional, viability, metabolic activity, and structural integrity ma ka pae like me ka puʻuwai hou no nā lā 12. Eia kekahi, ʻo ka hoʻolōʻihi nui ʻana o ka ʻiʻo cardiac i ka moʻomeheu e hoʻoulu i ka hōʻailona cardiac hypertrophic, e hāʻawi ana i nā hōʻike no ka hiki o CTCM ke hoʻohālike i nā kūlana hypertrophic i hoʻoulu ʻia e ka puʻuwai puʻuwai. I ka hopena, hiki i ka CTCM ke hoʻohālike i ka physiology a me ka pathophysiology o ka naʻau i ka moʻomeheu i nā manawa lōʻihi, e hiki ai ke nānā pono i ka lāʻau lapaʻau.
Ma mua o ka noiʻi lapaʻau, pono ʻia nā ʻōnaehana in vitro hiki ke hoʻopuka pololei i ka ʻōnaehana physiological o ka puʻuwai kanaka. Pono ia mau ʻōnaehana e hoʻohālike i ka hoʻololi ʻana i ka mechanical stretch, heart rate, a me nā waiwai electrophysiological. Hoʻohana maʻamau ʻia nā ʻano holoholona ma ke ʻano he papa screening no ka physiology cardiac me ka liʻiliʻi o ka hilinaʻi i ka noʻonoʻo ʻana i nā hopena o nā lāʻau lapaʻau i loko o ka puʻuwai kanaka1,2. ʻO ka hope loa, ʻo ka Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) he kumu hoʻohālike i koʻikoʻi a kikoʻī no nā ʻano hana lapaʻau a me nā lāʻau lapaʻau, e hoʻopuka pololei ana i ka physiology a me ka pathophysiology o ka puʻuwai kanaka3. ʻO ka loaʻa ʻole o ia ʻōnaehana e kaupalena i ka loaʻa ʻana o nā lāʻau lapaʻau hou no ka pau ʻole o ka naʻau4,5 a ua alakaʻi i ka cardiotoxicity lāʻau i kumu nui no ka haʻalele ʻana i ka mākeke6.
I loko o nā makahiki he ʻumi i hala iho nei, ua hoʻihoʻi ʻia nā lāʻau lapaʻau non-cardiovascular mai ka hoʻohana lāʻau lapaʻau no ka mea e hoʻolōʻihi ʻia ka manawa QT e alakaʻi ana i ka ventricular arrhythmias a me ka make koke. No laila, ke hoʻonui nei ka pono no nā hoʻolālā screening preclinical pono e loiloi i ka pono cardiovascular a me nā mea ʻona. ʻO ka hoʻohana hou ʻana i nā cardiomyocytes pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPS-CM) i ka nānā ʻana i ka lāʻau lapaʻau a me ka hoʻāʻo ʻana i nā mea ʻawaʻawa e hāʻawi i kahi hopena ʻāpana i kēia pilikia. Eia nō naʻe, ʻo ke ʻano oʻo ʻole o ka hiPS-CMs a me ka nele o ka paʻakikī multicellular o ka ʻiʻo cardiac nā palena nui o kēia ʻano. Ua hōʻike ʻia nā haʻawina hou e hiki ke hoʻopau ʻia kēia palena ma o ka hoʻohana ʻana i ka hiPS-CM mua e hana i nā hydrogels ʻiʻo cardiac ma hope koke o ka hoʻomaka ʻana o nā kuʻekuʻe kūʻokoʻa a me ka hoʻonui ʻana i ka hoʻoulu uila i ka manawa. Eia naʻe, nele kēia mau hiPS-CM microtissues i nā waiwai electrophysiological a contractile o ka myocardium makua. Eia kekahi, ʻoi aku ka paʻakikī o ka ʻiʻo naʻau o ke kanaka, ʻo ia hoʻi kahi hui heterogeneous o nā ʻano cell like ʻole, me nā cell endothelial, neurons, a me stromal fibroblasts, i hoʻopili ʻia e nā pūʻulu kikoʻī o nā protein matrix extracellular. ʻO kēia heterogeneity o non-cardiomyocyte populations11,12,13 i loko o ka puʻuwai mammalian makua he mea pale nui ia i ka hoʻohālikelike ʻana i ka ʻiʻo cardiac me ka hoʻohana ʻana i nā ʻano kelepona pākahi. Hoʻomaopopo kēia mau palena nui i ke koʻikoʻi o ka hoʻomohala ʻana i nā ala no ka hoʻoulu ʻana i ka ʻiʻo myocardial intact ma lalo o nā kūlana physiological a pathological.
Ua ʻike ʻia nā ʻāpana lahilahi (300 µm) o ka puʻuwai kanaka he kumu hoʻohālike o ka myocardium kanaka. Hāʻawi kēia ʻano hana i kahi ʻōnaehana 3D multicellular piha e like me ka ʻiʻo puʻuwai kanaka. Eia nō naʻe, a hiki i ka makahiki 2019, ua kaupalena ʻia ka hoʻohana ʻana i nā ʻāpana naʻau moʻomeheu e ke ola moʻomeheu pōkole (24 h). ʻO kēia ma muli o nā kumu he nui e like me ka nele o ke kino-mechanical stretch, ka ea-wai interface, a me ka hoʻohana ʻana i nā media maʻalahi i kākoʻo ʻole i nā pono o ka ʻiʻo cardiac. I ka makahiki 2019, ua hōʻike kekahi mau pūʻulu noiʻi i ka hoʻopili ʻana i nā mea mechanical i loko o nā ʻōnaehana moʻomeheu cardiac tissue hiki ke hoʻonui i ke ola moʻomeheu, hoʻomaikaʻi i ka hōʻike ʻana o ka naʻau, a hoʻohālikelike i ka pathology cardiac. ʻElua mau haʻawina nani 17 a me 18 e hōʻike ana he hopena maikaʻi ka hoʻouka mīkini uniaxial i ka phenotype cardiac i ka wā moʻomeheu. Eia naʻe, ʻaʻole i hoʻohana kēia mau haʻawina i ka hoʻouka ʻana i ka physico-mechanical ʻekolu-dimensional o ka pōʻai cardiac, no ka mea, ua hoʻouka ʻia nā ʻāpana puʻuwai me nā mana isometric tensile 17 a i ʻole linear auxotonic loading 18. ʻO kēia mau ʻano o ka hoʻolōʻihi ʻana i ka ʻiʻo ka hopena i ka hoʻopau ʻana i nā genes cardiac he nui a i ʻole ka overexpression o nā genes e pili ana i nā pane kikoʻī ʻole. ʻO ka mea nui, ʻo Pitoulis et al. Ua hoʻomohala ʻo 19 i kahi ʻauʻau moʻomeheu ʻāpana puʻuwai ikaika no ke kūkulu hou ʻana i ka pōʻai puʻuwai me ka hoʻohana ʻana i ka manaʻo transducer ikaika a me nā hoʻokele hoʻopaʻapaʻa. ʻOiai e ʻae kēia ʻōnaehana i ka hoʻohālikelike ʻana i ka pōʻaiapili puʻuwai in vitro, ʻo ka paʻakikī a me ka haʻahaʻa haʻahaʻa o ke ala e kaupalena ʻia ai ka noi o kēia ʻōnaehana. Ua hoʻomohala hou kā mākou hale hana i kahi ʻōnaehana moʻomeheu maʻalahi e hoʻohana ana i ka hoʻoulu ʻana i ka uila a me kahi ʻano i hoʻopaʻa ʻia e mālama i ka hiki ʻana o nā ʻāpana o ka puaʻa a me ka puʻuwai kanaka a hiki i 6 mau lā20,21.
I loko o ka manuscript o kēia manawa, wehewehe mākou i kahi ʻano moʻomeheu cardiac tissue culture (CTCM) me ka hoʻohana ʻana i nā ʻāpana o ka puʻuwai puaʻa e hoʻopili ana i nā cues humoral e hoʻopaʻa hou i ka physiology cardiac ʻekolu-dimensional a me ka distension pathophysiological i ka wā o ka pōʻai cardiac. Hiki i kēia CTCM ke hoʻonui i ka pololei o ka wānana lāʻau pre-clinical i kahi pae i loaʻa ʻole ma mua o ka hoʻolako ʻana i kahi ʻōnaehana cardiac kumu kūʻai, mid-throughput e hoʻohālike i ka physiology / pathophysiology o ka puʻuwai mammalian no ka hoʻāʻo ʻana i ka lāʻau lapaʻau pre-clinical.
He mea koʻikoʻi nā hōʻailona mechanical hemodynamic i ka mālama ʻana i ka hana cardiomyocyte in vitro 22,23,24. Ma ka manuscript o kēia manawa, ua hoʻomohala mākou i kahi CTCM (Figure 1a) hiki ke hoʻohālikelike i ke ʻano o ka naʻau o ke kanaka makua ma o ka hoʻoulu ʻana i ka uila a me ka mechanical stimulation i nā alapine physiological (1.2 Hz, 72 beats i kēlā me kēia minuke). I mea e pale aku ai i ka nui o ke kiko i ka wā diastole, ua hoʻohana ʻia kahi mea paʻi 3D e hoʻonui i ka nui o ka ʻiʻo e 25% (Fig. 1b). Ua hoʻomaka ʻia ka wikiwiki uila e ka ʻōnaehana C-PACE e hoʻomaka i ka 100 ms ma mua o ka systole me ka hoʻohana ʻana i kahi ʻōnaehana loaʻa ʻikepili e hana hou i ka pōʻai puʻuwai. Hoʻohana ka ʻōnaehana moʻomeheu i ka polokalamu pneumatic actuator (LB Engineering, Kelemānia) e hoʻonui i kahi membrane silicone maʻalahi e hoʻonui ai i nā ʻāpana puʻuwai ma ke keʻena luna. Hoʻopili ʻia ka ʻōnaehana i kahi laina ea waho ma o ka transducer kaomi, i hiki ai ke hoʻoponopono pololei i ke kaomi (± 1 mmHg) a me ka manawa (± 1 ms) (Fig. 1c).
a Hoʻopili i ka ʻāpana kiko i ke apo kākoʻo 7 mm, i hōʻike ʻia i ka uliuli, i loko o ke keʻena moʻomeheu o ka mea hana. Hoʻokaʻawale ʻia ke keʻena moʻomeheu mai ke keʻena ea e kahi membrane silicone maʻalahi. E kau i kahi pahu ma waena o kēlā me kēia keʻena e pale ai i ka leak. Aia i loko o ka po'i o ka hāme'a nā electrodes graphite e hā'awi i ka ho'oulu uila. b Hōʻike hoʻohālike o ka mea ʻiʻo nui, ke apo alakaʻi a me ke apo kākoʻo. Hoʻokomo ʻia nā ʻāpana kiko (ʻulaʻula) ma luna o ka mea nui me ke apo alakaʻi i hoʻokomo ʻia i loko o ke awāwa ma ka ʻaoʻao o waho o ka hāmeʻa. Me ka hoʻohana ʻana i ke alakaʻi, e kau pono i ke apo kākoʻo i uhi ʻia me ka ʻili acrylic adhesive ma luna o ka ʻāpana o ka ʻiʻo naʻau. c Kipi e hōʻike ana i ka manawa o ka hoʻoulu ʻana i ka uila ma ke ʻano he hana o ke kaomi o ke keʻena ea i hoʻomalu ʻia e kahi polokalamu pneumatic actuator (PPD). Ua hoʻohana ʻia kahi mea ʻike ʻikepili e hoʻohui i ka hoʻoulu uila me ka hoʻohana ʻana i nā mea ʻike kaomi. Ke piʻi ka paʻi i loko o ke keʻena moʻomeheu i ka paepae i hoʻonohonoho ʻia, hoʻouna ʻia kahi hōʻailona pulse i ka C-PACE-EM e hoʻoulu i ka hoʻoulu uila. d Kiʻi o ʻehā CTCM i kau ʻia ma kahi papa incubator. Hoʻopili ʻia nā mea ʻehā i hoʻokahi PPD ma o kahi kaapuni pneumatic, a ua hoʻokomo ʻia nā mea ʻike kaomi i loko o ka valve hemostatic e nānā i ke kaomi i loko o ke kaapuni pneumatic. Loaʻa i kēlā me kēia mea hana ʻeono mau ʻāpana kiko.
Ke hoʻohana nei i hoʻokahi mea hana pneumatic, hiki iā mākou ke hoʻomalu i nā mea hana 4 CTCM, hiki i kēlā me kēia mea ke hoʻopaʻa i nā ʻāpana kiko 6 (Fig. 1d). Ma CTCM, ua hoʻololi ʻia ke kaomi ea i loko o ke keʻena ea i ke kaomi synchronous i loko o ke keʻena wai a hoʻoulu i ka hoʻonui physiological o ka ʻāpana puʻuwai (Figure 2a a me ke Kiʻiʻoniʻoni Hoʻohui 1). ʻO ka loiloi o ka kikoo kiko ma 80 mm Hg. Art. hōʻike i ka hohola ʻana o nā ʻāpana kiko e 25% (Fig. 2b). Ua hōʻike ʻia kēia pākēneka e pili ana i ka lōʻihi sarcomere physiological o 2.2-2.3 µm no ka contractility pauku cardiac maʻamau17,19,25. Ua loiloi ʻia ka neʻe ʻana o ka ʻili me ka hoʻohana ʻana i nā hoʻonohonoho kāmela maʻamau (Supplementary Figure 1). ʻO ka amplitude a me ka wikiwiki o ka neʻe ʻana o ka ʻiʻo (Fig. 2c, d) pili i ka hoʻolōʻihi ʻana i ka wā o ka puʻuwai puʻuwai a me ka manawa i ka systole a me ka diastole (Fig. 2b). ʻO ke kikoo a me ka wikiwiki o ka ʻiʻo cardiac i ka wā o ka ʻoki ʻana a me ka hoʻomaha ʻana i mau no nā lā 12 i ka moʻomeheu (Fig. 2f). No ka loiloi i ka hopena o ka hoʻoulu ʻana i ka uila i ka contractility i ka wā moʻomeheu, ua hoʻomohala mākou i kahi ala no ka hoʻoholo ʻana i ka deformity hana me ka hoʻohana ʻana i kahi algorithm shading (Supplementary Fig. 2a, b) a ua hiki ke hoʻokaʻawale i waena o nā deformities me ka ʻole o ka hoʻoulu uila. ʻO ka māhele like o ka puʻuwai (Fig. 2f). Ma ka ʻāpana hoʻoneʻe o ka ʻoki (R6-9), ʻo ka volta i ka wā o ka hoʻoulu uila he 20% kiʻekiʻe ma mua o ka loaʻa ʻole o ka hoʻoulu uila, e hōʻike ana i ka hāʻawi ʻana o ka hoʻoulu uila i ka hana contractile.
Ua hōʻoia nā ʻāpana o ke kaomi o ke keʻena ea, ke kaomi ʻana o ke keʻena wai, a me nā ana neʻe ʻana o ka ʻiʻo e hoʻololi ke kaomi o ke keʻena i ke kaomi ʻana o ke keʻena wai, me ka neʻe ʻana o ka ʻāpana kiko. b Nā ʻāpana hōʻike o ka pākēneka kikoo (uliuli) o nā ʻāpana ʻiʻo e pili ana i ka pākēneka o ke kiko (alani). c Ua kūlike ka neʻe ana o ka ʻāpana puʻuwai me ka wikiwiki o ka neʻe ʻana. (d) Nā alahele o ka neʻe ʻana o ka pōʻai (laina uliuli) a me ka wikiwiki (laina kiko ʻalani) i loko o kahi ʻāpana o ka puʻuwai. e Ka helu o ka manawa pōʻai (n = 19 mau ʻāpana no kēlā me kēia hui, mai nā puaʻa like ʻole), ka manawa ʻoki (n = 19 mau ʻāpana i kēlā me kēia hui), ka manawa hoʻomaha (n = 19 mau ʻāpana no kēlā me kēia hui, mai nā puaʻa like ʻole), ka neʻe ʻana o ke kino (n = 25). ʻāpana)/hui mai nā puaʻa like ʻole), ka wikiwiki systolic kiʻekiʻe (n = 24(D0), 25(D12) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole) a me ka helu hoʻomaha kiʻekiʻe (n=24(D0), 25(D12) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole). ʻAʻohe ʻokoʻa koʻikoʻi o ka hoʻāʻo ʻana o ka Haumāna ʻelua huelo ma kekahi ʻāpana. f Ka nānā 'ana i nā 'āpana 'ula'ula me ka ho'oulu uila 'ole (uliuli), he 'umi 'āpana 'āpana o nā māhele kiko mai ka pauku like. Hōʻike nā ʻaoʻao lalo i ka helu o ka pākēneka o ka ʻokoʻa o ke kaila ma nā ʻāpana kiko me ka hoʻoulu ʻana i ka uila ma nā wahi he ʻumi mai nā ʻāpana like ʻole. (n = 8 mau ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, Hana ʻia ka hoʻāʻo t-haumāna ʻelua; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = 8 mau ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, Hana ʻia ka hoʻāʻo t-haumāna ʻelua; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, ʻelua-huelo ho'āʻo Haumana; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 ʻāpana/hui, mai nā puaʻa like ʻole, ʻelua-huelo hōʻike haumāna haumāna; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Hōʻike nā pahu kuhi i ka mean ± ka hoʻokaʻawale maʻamau.
I kā mākou ʻōnaehana moʻomeheu static biomimetic heart slice [20, 21], mālama mākou i ka viability, hana, a me ka hoʻonohonoho pono o nā ʻāpana puʻuwai no nā lā 6 ma o ka hoʻohana ʻana i ka hoʻoulu uila a me ka hoʻonui ʻana i ka haku mele. Eia naʻe, ma hope o 10 mau lā, ua hāʻule nui kēia mau helu. E nānā mākou i nā ʻāpana i hoʻomaʻamaʻa ʻia i kā mākou ʻōnaehana moʻomeheu biomimetic static mua 20, 21 mau kūlana mana (Ctrl) a e hoʻohana mākou i kā mākou mea i hoʻopaʻa ʻia ma mua e like me nā kūlana MC a me ka moʻomeheu ma lalo o ka hoʻoulu ʻana i ka mechanical a me ka uila (CTCM). kāhea ʻia . ʻO ka mea mua, ua hoʻoholo mākou he lawaʻole ka hoʻouluʻana i ka mechanical me ka hoʻouluʻana i ka uila no ka mālamaʻana i ka ola kino no nā lā 6 (Supplementary Fig. 3a,b). ʻO ka mea e mahalo ai, me ka hoʻokomoʻana i ka physio-mechanical a me ka hoʻoulu uila me ka STCM, ua mau ka viability o nā māhele puʻuwai 12-lā e like me nā'āpana puʻuwai hou ma lalo o nā kūlana MS, akā,ʻaʻole ma lalo o nā kūlana Ctrl, e like me ka hōʻikeʻana o ka MTT analysis (Fig. 1). 3a). Hōʻike kēia i ka hoʻoulu ʻana i ka mechanical a me ka simulation o ka pōʻai cardiac hiki ke mālama i nā ʻāpana kiko i ʻelua mau manawa i hōʻike ʻia ma kā mākou ʻōnaehana moʻomeheu static mua. Eia naʻe, ʻo ka loiloi ʻana i ka paʻa o nā ʻāpana kiko ma o ka immunolabeling o ka cardiac troponin T a me ka connexin 43 i hōʻike i ka ʻōlelo connexin 43 i ʻoi aku ka kiʻekiʻe ma nā kiko MC ma ka lā 12 ma mua o nā mana i ka lā hoʻokahi. Eia naʻe, ʻaʻole i mālama pono ʻia ka ʻōlelo connexin 43 a me ka hoʻokumu Z-disc (Fig. 3b). Hoʻohana mākou i kahi hoʻolālā naʻauao (AI) no ka helu ʻana i ka integrity structural tissue26, kahi pipeline aʻo hohonu e pili ana i ke kiʻi e pili ana i ka troponin-T a me ka connexin staining43 e hoʻopaʻa ʻokoʻa i ka pono o ka hana a me ka fluorescence o nā ʻāpana puʻuwai e pili ana i ka ikaika o ka localization. Ke hoʻohana nei kēia ʻano hana i kahi Convolutional Neural Network (CNN) a me kahi hoʻolālā aʻo hohonu e hoʻohālikelike pono i ka paʻa o ka ʻiʻo cardiac ma ke ʻano automated a me ka ʻole, e like me ka mea i wehewehe ʻia ma ka kuhikuhi. 26. Ua hōʻike ka ʻiʻo MC i ka hoʻomaikaʻi ʻana i ke ʻano like me ka lā 0 i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana mana static. Eia kekahi, ua hōʻike ʻo Masson's trichrome staining i ka haʻahaʻa haʻahaʻa haʻahaʻa o ka fibrosis ma lalo o nā kūlana MS i hoʻohālikelike ʻia i nā kūlana hoʻomalu i ka lā 12 o ka moʻomeheu (Fig. 3c). ʻOiai ua hoʻonui ʻo CTCM i ka hiki ʻana o nā ʻāpana o ka naʻau i ka lā 12 i kahi pae like me ka ʻiʻo o ka naʻau hou, ʻaʻole ia i hoʻomaikaʻi maikaʻi i ka paʻa o nā ʻāpana naʻau.
Hōʻike ka pakuhi Bar i ka helu ʻana o ka MTT olaola o nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) a i ʻole ka moʻomeheu ʻāpana puʻuwai no 12 mau lā ma ka moʻomeheu static (D12 Ctrl) a i ʻole ma CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) ʻāpana/hui i hana ʻia ma kahi ʻano OVA0##0, <1 ʻaoʻao mai nā puaʻa like ʻole. hoʻohālikelike ʻia me D0 a me **p <0.01 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). Hōʻike ka pakuhi Bar i ka nui o ka MTT ola o nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) a i ʻole ka moʻomeheu ʻāpana puʻuwai no 12 mau lā ma ka moʻomeheu static (D12 Ctrl) a i ʻole ma CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC) ʻāpana/hui hana ʻia ʻo AN##p mai nā ʻano puaʻa like ʻole. 0.0001 hoʻohālikelike ʻia me D0 a me **p <0.01 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl).hōʻike ka histogram i ka helu o ka hiki ʻana o nā ʻāpana puʻuwai hou MTT (D0) a i ʻole ka moʻomeheu o nā ʻāpana naʻau no 12 mau lā ma ka moʻomeheu static (D12 control) a i ʻole CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 control).####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0.0001 hoʻohālikelike ʻia me D0 a me **p <0.01 hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片12相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与 D12 Ctrl)histogram e hōʻike ana i ka nui o ka MTT viability ma nā ʻāpana naʻau hou (D0) a i ʻole nā ​​​​ʻāpana naʻau i moʻomeheu no 12 mau lā ma ka moʻomeheu static (D12 control) a i ʻole CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 control)), 12 (D12 MC) ʻāpana/hui mai nā ʻano puaʻa like ʻole, hoʻokahi ʻaoʻao ANOVA;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D0, **p < 0.01 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl).b Troponin-T ('ōmaʻomaʻo), connexin 43 (ʻulaʻula) a me DAPI (uliuli) ma nā ʻāpana puʻuwai i hoʻokaʻawale hou ʻia (D0) a i ʻole nā ​​​​ʻāpana puʻuwai i moʻomeheu ʻia ma lalo o nā kūlana static (Ctrl) a i ʻole nā ​​kūlana CTCM (MC) no nā lā 12) o nā kiʻi immunofluorescence hōʻikeʻike (palākiō = 100 µm). ʻO ka helu ʻana o ka naʻau akamai o ka ʻili o ka naʻau (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ʻāpana/hui i kēlā me kēia puaʻa like ʻole, hana ʻia kahi hoʻokolohua ANOVA; ####p <0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D0 a me ****p <0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). ʻO ka helu ʻana o ka naʻau o ka puʻuwai (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) nā ʻāpana/hui i kēlā me kēia mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia kahi hoʻokolohua ANOVA; ####p <0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D0 a me ****p <0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). LIKE LIKE LIKE от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению). ʻO ka helu o ka paʻa pono o ka puʻuwai puʻuwai e ka naʻauao (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ʻāpana / pūʻulu mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia kahi hoʻokolohua ANOVA; ####p <0.0001 vs. me D0 a me ****p <0.0001 hoʻohālikelike ʻia me D012 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ʻāpana/hui o kēlā me kēia puaʻa ʻokoʻa, hoʻāʻo ANOVA ʻaoʻao hoʻokahi;####p01 相0##p01 ， ####p01 相0. < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ʻāpana/hui o kēlā me kēia puaʻa like ʻole, hoʻāʻo ANOVA ʻaoʻao hoʻokahi;##0##p < 10.****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), Ctrl7 (D12) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравню ). Naʻauao akamai e hoʻohālikelike i ka paʻa o ke kino o ka naʻau (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ʻāpana / hui i kēlā me kēia puaʻa like ʻole, hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi; c Nā kiʻi makaʻāinana (hema) a me ka helu ʻana (ʻākau) no nā ʻāpana puʻuwai i hoʻopaʻa ʻia me ka stain trichrome o Masson (Scale bare = 500 µm) (n = 10 ʻāpana/hui kēlā me kēia mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi; ####p <0.0001 hoʻohālikelike ʻia me D0 a me ***p1 <0.00). c Nā kiʻi makaʻāinana (hema) a me ka helu ʻana (ʻākau) no nā ʻāpana puʻuwai i hoʻopaʻa ʻia me ka stain trichrome o Masson (Scale bare = 500 µm) (n = 10 ʻāpana/hui kēlā me kēia mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ka hoʻāʻo ANOVA ʻaoʻao hoʻokahi; #### p <0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D0 a me ***ptr <0.0. c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным краснамлате без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 p < 0,0001 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Nā kiʻi makaʻāinana (hema) a me ka helu ʻana (ʻākau) o nā ʻāpana puʻuwai i hoʻopaʻa ʻia me ka ʻili trichrome o Masson (uncoated scale = 500 µm) (n = 10 pauku/hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi; #### p <0 .0001 i hoʻohālikelike ʻia me D0 a me ***p <0.001). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度（裸尺度 = 5m0 度= 5个切片/组，每组来自不同的猪，进桌单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.0012 C 。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单君0.##0.与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителка = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперси <##; 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Nā kiʻi makaʻāinana (hema) a me ka helu ʻana (akau) o nā ʻāpana puʻuwai i hoʻopaʻa ʻia me ka ʻili trichrome o Masson (blank = 500 µm) (n = 10 ʻāpana/hui, kēlā me kēia mai kahi puaʻa ʻokoʻa, i hoʻāʻo ʻia e ka nānā ʻana o ka ʻano like ʻole ;### # p <0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D0, ***p Hōʻike nā pahu kuhi i ka mean ± ka hoʻokaʻawale maʻamau.
Manaʻo mākou ma ka hoʻohui ʻana i nā molekala liʻiliʻi i ka moʻomeheu moʻomeheu, hiki ke hoʻomaikaʻi ʻia ka pono cardiomyocyte a hoʻemi ʻia ka ulu ʻana o ka fibrosis i ka wā o ka moʻomeheu CTCM. No laila, ua nānā mākou no nā mole liʻiliʻi me ka hoʻohana ʻana i kā mākou mau moʻomeheu static control20,21 ma muli o ka liʻiliʻi o nā kumu hoʻohālikelike. Ua koho ʻia ʻo Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), a me SB431542 (SB) no kēia pale. Ua hoʻohana mua ʻia kēia mau molekala liʻiliʻi i nā moʻomeheu hiPSC-CM e hoʻoulu i ka maturation o nā cardiomyocytes ma o ka hoʻonui ʻana i ka lōʻihi sarcomere, T-tubules, a me ka wikiwiki conduction. Eia kekahi, ʻike ʻia ʻo Dex (a glucocorticoid) a me SB e hoʻopau i ka mumū29,30. No laila, ua hoʻāʻo mākou inā ʻo ka hoʻokomo ʻana o hoʻokahi a i ʻole ka hui pū ʻana o kēia mau molekele liʻiliʻi e hoʻomaikaʻi i ka paʻa o nā ʻāpana puʻuwai. No ka nānā mua ʻana, ua koho ʻia ka nui o kēlā me kēia pūhui e pili ana i nā manaʻo i hoʻohana mau ʻia i nā ʻano moʻomeheu cell (1 μM Dex27, 100 nM T327, a me 2.5 μM SB31). Ma hope o 12 mau lā o ka moʻomeheu, ʻo ka hui pū ʻana o T3 a me Dex ka hopena i ka maikaʻi o ka cardiomyocyte structural integrity a me ka liʻiliʻi fibrous remodeling (Supplementary Figures 4 a me 5). Eia hou, hoʻohana ʻelua a pālua paha i kēia mau ʻano o T3 a me Dex i hana i nā hopena deleterious i hoʻohālikelike ʻia i nā ʻano maʻamau (Supplementary Fig. 6a,b).
Ma hope o ka nānā mua ʻana, ua hana mākou i kahi hoʻohālikelike poʻo i ke poʻo o nā kūlana moʻomeheu 4 (Figure 4a): Ctrl: nā ʻāpana naʻau i hoʻomaʻamaʻa ʻia i kā mākou moʻomeheu static i wehewehe mua ʻia me ka hoʻohana ʻana i kā mākou mea i hoʻopaʻa ʻia; 20.21 TD: T3 a me Ctrl s Added Dex ma ka Poakolu; MC: nā ʻāpana naʻau i hoʻomaʻamaʻa ʻia ma CTCM me ka hoʻohana ʻana i kā mākou mea i hoʻopaʻa ʻia ma mua; a me MT: CTCM me T3 a me Dex i hoʻohui ʻia i ke kikowaena. Ma hope o 12 mau lā o ka mahiʻai ʻana, ua like ke ola o nā ʻiʻo MS a me MT e like me nā ʻiʻo hou i loiloi ʻia e ka MTT assay (Fig. 4b). ʻO ka mea e mahalo ai, ʻo ka hoʻohui ʻana o T3 a me Dex i nā moʻomeheu transwell (TD) ʻaʻole i hopena i ka hoʻomaikaʻi nui ʻana i ka viability i hoʻohālikelike ʻia i nā kūlana Ctrl, e hōʻike ana i kahi hana koʻikoʻi o ka hoʻoulu ʻana i ka mechanical i ka mālama ʻana i ka viability o nā ʻāpana naʻau.
he kiʻi hoʻolālā hoʻokolohua e hōʻike ana i nā kūlana moʻomeheu ʻehā i hoʻohana ʻia no ka loiloi ʻana i nā hopena o ka hoʻoulu ʻana i ka mīkini a me ka hoʻohui T3/Dex ma ke kikowaena no 12 lā. b Hōʻike ka pakuhi Bar i ka nui o ka ola 12 lā ma hope o ka moʻomeheu ma nā kūlana moʻomeheu 4 (Ctrl, TD, MC, a me MT) i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a me D12 MT), 12 (D12 MC) nā ʻāpana/hui hoʻokahi ʻaoʻao mai nā puaʻa like ʻole. 0.0001, ###p < 0.001 hoʻohālikelike ʻia me D0 a me **p <0.01 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). b Hōʻike ka pakuhi Bar i ka nui o ka ola 12 lā ma hope o ka moʻomeheu ma nā kūlana moʻomeheu 4 (Ctrl, TD, MC, a me MT) i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a me D12 MT), 12 (D12 MC) nā ʻāpana/hui hoʻokahi ʻaoʻao mai nā puaʻa like ʻole. 0.0001, ###p < 0.001 hoʻohālikelike ʻia me D0 a me **p <0.01 hoʻohālikelike ʻia me D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во вселях 4 ул. (контроль, TD, MC a me MT) e pili ana i ka сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a me D12 MT), 12 (D12 MT), 12 (D12 MT), 12 (D12 MT) разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сtrрансе ). b Hōʻike ka pakuhi pahu i ka nui o ka hiki ke ola ma 12 mau lā ma hope o ka moʻomeheu i nā kūlana moʻomeheu 4 āpau (ka mana, TD, MC, a me MT) i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, a me D12 MT), 12 (D12 MC) pauku / ##pOVA; 0.0001, ###p < 0.001 vs. D0 a me **p <0.01 ma ka hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (Dl5) TD0和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 ，p < 0.001 ，p 0.001 ，p 与 与与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими серди серди (серди и серди) (0 D) 15. <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram e hōʻike ana i nā kūlana moʻomeheu 4 (ka mana, TD, MC a me MT) i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD a me D12 MT), mai nā ʻāpana puaʻa like ʻole 12 (D12 MC) ʻāpana/hui, hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala; ####p<0.0. **p<0.01 vs. mana D12). c Bar graph hōʻike i ka quantification of glucose flux 12 lā ma hope o ka moʻomeheu ma nā kūlana moʻomeheu 4 (Ctrl, TD, MC, a me MT) i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) (n = 6 ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi; ###p <0.001, hoʻohālikelike ʻia me D0 a me ***p <0.001). c Bar graph hōʻike i ka quantification of glucose flux 12 lā ma hope o ka moʻomeheu ma nā kūlana moʻomeheu 4 (Ctrl, TD, MC, a me MT) i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) (n = 6 ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi; ###p <0.001, hoʻohālikelike ʻia me D0 a me ***p <0.001). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всехол 4 лусков (kona, TD, MC a me MT) e pili ana i ka сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, родниностясто ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). Hōʻike ka Histogram i ka helu o ka glucose flux 12 lā ma hope o ka moʻomeheu ma lalo o nā kūlana moʻomeheu 4 (ka mana, TD, MC a me MT) i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) (n = 6 mau ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia kahi hoʻokolohua ANOVA; ###p <0.001 i hoʻohālikelike ʻia me D0 a me ***p <0.001 Ctrl i hoʻohālikelike ʻia me D12). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，厹天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001 ，盎所0 ，与D1与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片12 < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех для всех культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разинних Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram e hōʻike ana i ka nui o ka glucose flux ma 12 lā ma hope o ka moʻomeheu no nā kūlana moʻomeheu 4 āpau (ka mana, TD, MC, a me MT) i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana naʻau hou (D0) (n = 6 ʻāpana / hui, mai nā puaʻa like ʻole, unilateral Ua hana ʻia nā hoʻokolohua ANOVA, ###p <0.001 i hoʻohālikelike ʻia me D0, ***p <0.d Nā ʻāpana hoʻoheheʻe ʻana o nā mea hou (uliuli), lā 12 MC ('ōmaʻomaʻo), a me ka lā 12 MT (ʻulaʻula) ma nā wahi ʻāpana ʻāpana ʻāpana he ʻumi (n = 4 ʻāpana/hui, hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala; ʻaʻohe ʻokoʻa nui ma waena o nā hui). e hōʻike ana i nā ʻano genes i hōʻike ʻokoʻa ʻia ma nā ʻāpana puʻuwai hou (D0) i hoʻohālikelike ʻia me nā ʻāpana puʻuwai i moʻomeheu ʻia ma lalo o nā kūlana paʻa (Ctrl) a i ʻole ma lalo o nā kūlana MT (MT) no 10-12 lā. f Heatmap o nā genes sarcomere no nā ʻāpana naʻau i moʻomeheu ʻia ma lalo o kēlā me kēia kūlana moʻomeheu. Hōʻike nā pahu kuhi i ka mean ± ka hoʻokaʻawale maʻamau.
ʻO ka hilinaʻi ʻana i ka metabolism i ka hoʻololi ʻana mai ka hoʻohemo ʻana i ka waikawa momona i ka glycolysis kahi hōʻailona o ka dedifferentiation cardiomyocyte. Hoʻohana mua nā cardiomyocytes ʻaʻole i ka glucose no ka hana ATP a loaʻa iā hypoplastic mitochondria me ka liʻiliʻi cristae5,32. Ua hōʻike ʻia nā loiloi hoʻohana ʻana i ka glucose ma lalo o nā kūlana MC a me MT, ua like ka hoʻohana ʻana i ka glucose me ka lā 0 mau kiko (Figure 4c). Eia naʻe, ua hōʻike ʻia nā laʻana Ctrl i ka piʻi nui ʻana o ka hoʻohana ʻana i ka glucose i hoʻohālikelike ʻia me ka ʻiʻo hou. Hōʻike kēia i ka hui pū ʻana o CTCM a me T3/Dex e hoʻonui i ka ola kino a mālama i ka metabolic phenotype o nā ʻāpana naʻau moʻomeheu 12-lā. Eia hou, ua hōʻike ka hōʻike ʻana i ke ʻano o ka hoʻopaʻapaʻa e like me ka ʻiʻo puʻuwai hou no nā lā 12 ma lalo o nā kūlana MT a me MS (Fig. 4d).
No ka nānā ʻana i ka hopena holoʻokoʻa o CTCM a me T3 / Dex ma ka ʻāina transcriptional honua o ka ʻāpana ʻāpana cardiac, ua hana mākou i ka RNAseq ma nā ʻāpana cardiac mai nā kūlana moʻomeheu ʻehā (Supplementary Data 1). ʻO ka mea mahalo, ua hōʻike nā ʻāpana MT i ka like ʻana o ka transcriptional kiʻekiʻe me ka ʻiʻo puʻuwai hou, me 16 wale nō i hōʻike ʻokoʻa ʻia mai 13,642 genes. Eia naʻe, e like me kā mākou i hōʻike mua ai, ua hōʻike nā ʻāpana Ctrl i 1229 i hōʻike ʻia i nā genes ma hope o 10-12 mau lā i ka moʻomeheu (Fig. 4e). Ua hōʻoia ʻia kēia mau ʻikepili e ka qRT-PCR o ka puʻuwai a me ka fibroblast genes (Supplementary Fig. 7a-c). ʻO ka mea e mahalo ai, ua hōʻike nā ʻāpana Ctrl i ka hoʻohaʻahaʻa ʻana i nā genes puʻuwai a me nā cell cycle a me ka hoʻāla ʻana o nā papahana gene inflammatory. Hōʻike kēia mau ʻikepili i ka dedifferentiation, ka mea maʻamau ma hope o ka moʻomeheu lōʻihi, ua hoʻopau ʻia ma lalo o nā kūlana MT (Supplementary Fig. 8a,b). ʻO ka nānā pono ʻana i nā genes sarcomere i hōʻike ʻia aia ma lalo o nā kūlana MT wale nō nā genes e hoʻopili ana i ka sarcomere (Fig. 4f) a me ke kahawai ion (Supplementary Fig. 9) mālama ʻia, e pale ana iā lākou mai ka hoʻopau ʻana ma lalo o nā kūlana Ctrl, TD, a me MC. Hōʻike kēia mau ʻikepili me ka hui pū ʻana o ka mechanical and humoral stimulation (T3/Dex), hiki ke noho like ka transcriptome ʻāpana puʻuwai me nā ʻāpana puʻuwai hou ma hope o 12 mau lā i ka moʻomeheu.
Ua kākoʻo ʻia kēia mau ʻike transcriptional e ka ʻoiaʻiʻo o ka mālama pono ʻana o ka cardiomyocytes i nā ʻāpana puʻuwai ma lalo o nā kūlana MT no nā lā 12, e like me ka mea i hōʻike ʻia e ka connexin intact a localized 43 (Fig. 5a). Eia kekahi, ua hoʻemi nui ʻia ka fibrosis ma nā ʻāpana naʻau ma lalo o nā kūlana MT i ka hoʻohālikelike ʻia me Ctrl a like me nā ʻāpana naʻau hou (Fig. 5b). Hōʻike kēia mau ʻikepili i ka hui pū ʻana o ka hoʻoulu ʻana i ka mechanical a me ka mālama ʻana i ka T3/Dex e mālama pono i ke ʻano o ka naʻau i nā ʻāpana naʻau i ka moʻomeheu.
He kiʻi immunofluorescence Lunamakaʻāinana o troponin-T ('ōmaʻomaʻo), connexin 43 (ʻulaʻula), a me DAPI (uliuli) ma nā ʻāpana puʻuwai i hoʻokaʻawale hou ʻia (D0) a i ʻole moʻomeheu no 12 mau lā ma nā kūlana moʻomeheu ʻehā ʻehā (paʻa pālākiō = 100 µm). ). ʻO ka helu ʻana o ka naʻau akamai o ka puʻuwai hoʻonohonoho pono (n = 7 (D0 a me D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC a me D12 MT) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi; Ctrl). ʻO ka helu ʻana o ka naʻau akamai o ka paʻa o ke kino o ka naʻau (n = 7 (D0 a me D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC a me D12 MT) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi; Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D12 D12), MC (D0 2 D15) D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравнению с D0 ,**** и и по < 0,**** и по < 0,**** и по < 0,**** и по сравнению с D12 Ctrl). Ka helu ʻana o ka paʻa paʻa o ka puʻuwai puʻuwai me ka hoʻohana ʻana i ka naʻauao artificial (n = 7 (D0 a me D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC a me D12 MT) ʻāpana / hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia kahi hoʻokolohua ANOVA hoʻokahi; Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 ，書新 0.05 ，書曾与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mc 和 d1智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相月0 ， 戸0*p < 0.05 相比 ， 戸0****00 ， 戸 相比 ， 戸0l0 D0 与D0相比）.ʻO ka helu o ka paʻa paʻa o ka ʻiʻo cardiac me ka hoʻohana ʻana i ka naʻauao kūlohelohe i nā puaʻa like ʻole (n = 7 (D0 a me D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC a me D12 MT) ʻāpana / hui) me kahi hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 a ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p <0.0001 hoʻohālikelike ʻia me D0 a me *p <0.05 a i ʻole ****p <0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). b Nā kiʻi hōʻikeʻike a me ka helu ʻana no nā ʻāpana puʻuwai i hoʻopaʻa ʻia me ka ʻōpala trichrome a Masson (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, a me D12 MC), 9 (D12 MT) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hoʻohālikelike ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala i ka ##0##0 <1; *** 0.001, a i ʻole ****p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). b Nā kiʻi hōʻikeʻike a me ka helu ʻana no nā ʻāpana puʻuwai i hoʻopaʻa ʻia me ka ʻōpala trichrome a Masson (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, a me D12 MC), 9 (D12 MT) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hoʻohālikelike ʻia ka hoʻāʻo ANOVA hoʻokahi ala i ka ##0##0 <1; *** 0.001, a i ʻole ****p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона 0 = массона мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется одностосторонний те1 <##0сторонний те сравнению с D0 и ***p < 0,001 a i ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Nā kiʻi hōʻikeʻike a me ka helu ʻana o nā ʻāpana puʻuwai i hoʻopaʻa ʻia me ka ʻeleʻele trichrome o Masson (scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD a me D12 MC), 9 (D12 MT) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia <1p . 0.001 a i ʻole ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）！1D = 10（D10）（n = 2、D1 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 < 中文**p < 0.0001 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） = 500 µm） = 500 µm） ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分##00（0 .##析？相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная = лим50) (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA ####p < 0,0001 Dе свиней; ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Nā kiʻi hōʻike a me ka helu ʻana o nā ʻāpana puʻuwai i hoʻopaʻa ʻia me ka trichrome o Masson (bar scale = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD a me D12 MC), 9 (D12 MT) ʻāpana mai nā puaʻa/hui like ʻole, hoʻokahi ala ANOVA; ##000 <0. ****p <0.0001 hoʻohālikelike ʻia me D12 Ctrl).Hōʻike nā pahu kuhi i ka mean ± ka hoʻokaʻawale maʻamau.
ʻO ka mea hope loa, ua loiloi ʻia ka hiki o CTCM e hoʻohālikelike i ka hypertrophy cardiac ma o ka hoʻonui ʻana i ke kiko o ka naʻau. Ma CTCM, piʻi ka piʻi ʻana o ke keʻena ea kiʻekiʻe mai 80 mmHg a i 80 mmHg. Art. (ka lōʻihi maʻamau) a hiki i 140 mmHg Art. (Fig. 6a). Ua like kēia me ka piʻi ʻana o 32% i ka kikoo (Fig. 6b), i hōʻike mua ʻia e like me ka pākēneka pili i koi ʻia no nā ʻāpana puʻuwai e loaʻa ai kahi lōʻihi sarcomere e like me ka mea i ʻike ʻia i ka hypertrophy. ʻO ke kikoo a me ka wikiwiki o ka ʻiʻo puʻuwai i ka wā o ka hoʻopaʻa ʻana a me ka hoʻomaha i mau i nā lā ʻeono o ka moʻomeheu (Fig. 6c). Ua hoʻokuʻu ʻia ka ʻiʻo cardiac mai nā kūlana MT i ka maʻamau (MT (Normal)) a i ʻole nā ​​kūlana overstretch (MT (OS)) no nā lā ʻeono. Ma hope o nā lā ʻehā i ka moʻomeheu, ua hoʻokiʻekiʻe nui ʻia ka hypertrophic biomarker NT-ProBNP i ka waena ma lalo o nā kūlana MT (OS) i hoʻohālikelike ʻia me nā kūlana MT (maʻamau) (Fig. 7a). Eia kekahi, ma hope o nā lā ʻeono o ka moʻomeheu, ua hoʻonui nui ʻia ka nui o ka cell ma MT (OS) (Fig. 7b) i hoʻohālikelike ʻia i nā ʻāpana o ka naʻau MT (maʻamau). Eia kekahi, ua hoʻonui nui ʻia ka translocation nuklea NFATC4 i nā ʻiʻo overstretched (Fig. 7c). Hōʻike kēia mau hopena i ka holomua holomua o ka hoʻoponopono hou ʻana o ka pathological ma hope o ka hyperdistension a kākoʻo i ka manaʻo e hiki ke hoʻohana ʻia ka mea CTCM ma ke ʻano he kahua e aʻo ai i ka hōʻailona hypertrophy cardiac stretch-induced.
Ua hōʻoia nā ʻāpana o ke kaomi o ke keʻena ea, ke kaomi ʻana o ke keʻena wai, a me nā ana neʻe ʻana o ka ʻiʻo e hoʻololi ke kaomi o ke keʻena i ke kaomi ʻana o ke keʻena wai, me ka neʻe ʻana o ka ʻāpana kiko. b E hōʻike i nā pākēneka hoʻolōʻihi a me nā ʻāpana kikoo kikoʻī no nā ʻāpana kikoo maʻamau (ʻalani) a me nā ʻāpana kikoo (uliuli). c Paʻi pahu e hōʻike ana i ka manawa pōʻaiapili (n = 19 mau ʻāpana no kēlā me kēia hui, mai nā puaʻa like ʻole), ka manawa ʻokiʻoki (n = 18-19 mau ʻāpana no kēlā me kēia hui, mai nā puaʻa like ʻole), manawa hoʻomaha (n = 19 ʻāpana no kēlā me kēia hui, mai nā puaʻa like ʻole) ), ka nui o ka neʻe ʻana o ka ʻiʻo (n = 14 ʻāpana/hui, mai nā puaʻa like ʻole) peak relaxation rate (n = 14 (D0), 15 (D6) ) pauku / pūʻulu) mai nā puaʻa like ʻole), ʻaʻole i hōʻike ʻia ka ʻokoʻa koʻikoʻi o ka haumāna t-hōʻike ʻelua huelo ma kekahi ʻāpana, e hōʻike ana ua mau kēia mau ʻāpana i nā lā 6 o ka moʻomeheu me ka overvoltage. Hōʻike nā pahu kuhi i ka mean ± ka hoʻokaʻawale maʻamau.
He kiʻi paʻi pahu helu o ka NT-ProBNP hoʻopaʻa ʻia i loko o ka media moʻomeheu mai nā ʻāpana puʻuwai i moʻomeheu ʻia ma lalo o ke kūlana maʻamau MT (Norm) a i ʻole ka overstretching (OS) kūlana (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, a me D4 MTOS) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, Hana ʻia ʻo ANOVA ʻelua ala; **p <0.01. He kiʻikuhi Bar ka helu ʻana o ka NT-ProBNP i loko o ka media moʻomeheu mai nā ʻāpana puʻuwai i hoʻoulu ʻia ma lalo o ke kūlana maʻamau MT (Norm) a i ʻole ka overstretching (OS) kūlana (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, a me D4 MTOS) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, Hana ʻia ʻo ANOVA ʻelua ala; **p <0.01 maʻamau.Histogram quantitative o ka NT-ProBNP hoʻopaʻa 'ia i loko o ka moʻomeheu'āpana mai naʻau slices moʻomeheu ma lalo o nā kūlana o ka maʻamau MT kikoo (maʻamau) a overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, a me D4).MTOS) paʻi / pūʻulu mai nā puaʻa like ʻole, hana ʻia ʻelua-factor analysis of varice;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 i hoʻohālikelike ʻia me ke kiko maʻamau). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的曾度4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；p不不为不不为0.01） Ka helu o ka NT-ProBNP i loko o nā ʻāpana puʻuwai i hoʻoulu ʻia ma lalo o ke kūlana maʻamau MT (Norm) a i ʻole overstretch (OS) kūlana (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) mai nā ʻano like ʻole. ** hoʻohālikelike ʻia me ka hoʻolōʻihi maʻamau, p <0.01).histogram Ka helu ʻana o ka NT-ProBNP i loko o nā ʻāpana puʻuwai i moʻomeheu ʻia ma lalo o nā kūlana o ka MT maʻamau (maʻamau) a i ʻole overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) a me D4 MTOS) mau ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, ʻelua ʻaoʻao ka nānā ʻana o ka ʻokoʻa;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 i hoʻohālikelike ʻia me ke kiko maʻamau). b Nā kiʻi makaʻāinana no nā ʻāpana puʻuwai i hoʻopaʻa ʻia me ka troponin-T a me WGA (hema) a me ka helu ʻana o ka nui o ke kelepona (akau) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) pūʻulu/hui mai 10 mau ʻāpana like ʻole mai nā puaʻa like ʻole, Hana ʻia ka hoʻāʻo t-haumāna ʻelua; ****p <0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me ke kiko maʻamau). b Nā kiʻi makaʻāinana no nā ʻāpana puʻuwai i hoʻopaʻa ʻia me ka troponin-T a me WGA (hema) a me ka helu ʻana o ka nui o ke kelepona (akau) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) pūʻulu/hui mai 10 mau ʻāpana ʻokoʻa mai nā puaʻa like ʻole, Hana ʻia ka hoʻāʻo t-haumāna ʻelua; ****p <0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me ke kiko maʻamau). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного опеникрадрад (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится х t-стой х t-стой ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Nā kiʻi makaʻāinana o nā ʻāpana puʻuwai i hoʻopaʻa ʻia me ka troponin-T a me AZP (hema) a me ka helu ʻana o ka nui o ka cell (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) pūʻulu / pūʻulu mai 10 mau ʻāpana like ʻole mai nā puaʻa like ʻole, ua hana ʻia ka t-test a ka haumāna; ****p <0.001 i hoʻohālikelike ʻia i ka strain maʻamau). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性（小量化（右）染色的心脏切片的代表性（图图MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比，****p < 0.0001）。 b Nā kiʻi hōʻikeʻike o nā ʻāpana puʻuwai i hoʻopaʻa ʻia me ka calcarein-T a me WGA (hema) a me ka nui o ke kelepona (akau) (n = 330 (D6 MTOS), 369 mai 10 mau ʻāpana like ʻole (D6 MTNorm)) Cells/组，两方法有尾学生t test；0.0 pared test；0. b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) a me количественная оцленка (расленка) 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Ста;юд0н сравнению с нормальным растяжением). b Nā kiʻi hōʻikeʻike o nā ʻāpana puʻuwai i hoʻopaʻa ʻia me ka troponin-T a me AZP (hema) a me ka helu ʻana o ka nui o ka cell (akau) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) mai 10 mau ʻāpana like ʻole mai nā puaʻa like ʻole) Cells/group, two-tailed criterion Student's t; ****p < 0.0001 i hoʻohālikelike ʻia me ke ʻano maʻamau). c Nā kiʻi makaʻāinana no ka lā 0 a me ka lā 6 MTOS nā ʻāpana puʻuwai immunolabeled no ka troponin-T a me ka NFATC4 a me ka helu ʻana o ka unuhi ʻana o NFATC4 i ka nuclei o CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole, Hana ʻia ka hoʻāʻo t-haumālua ʻelua; *p <0.05). c Nā kiʻi makaʻāinana no ka lā 0 a me ka lā 6 MTOS mau ʻāpana puʻuwai immunolabeled no ka troponin-T a me NFATC4 a me ka helu ʻana o ka unuhi ʻana o NFATC4 i ka nuclei o CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ʻāpana/hui mai nā puaʻa like ʻole , Hana ʻia ka ho'āʻo t-haumāna ʻelua; *p <0.0. c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, и колицяч транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , вылнядяетскристроя Стьюдента; *p < 0,05). c Lunamakaainana kiʻi no naʻau pauku ma 0 a me 6 lā MTOS, immunolabeled no troponin-T a me NFATC4, a me quantification o NFATC4 translocation i loko o ka nucleus o cavernous keena (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) slices / hui mai okoa puaʻa) hana elua-huelo haumāna t-ho'āʻo; *p <0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)片 3 (D0)片进行双尾学生t 检验；*p < 0.05). c Nā kiʻi makaʻāinana o ka calcanin-T a me ka NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS nā ʻāpana puʻuwai, a me ka NFATC4 mai nā NFATC4 易位至CM cell nucleus的quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) / 爇时间双尾学生et 电影；*p < 0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS ma 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и колицнч транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Синта, *0). c Nā kiʻi ʻelele o nā ʻāpana puʻuwai MTOS i ka lā 0 a me 6 no ka troponin-T a me NFATC4 immunolabeling a me ka helu ʻana o ka NFATC4 translocation i loko o ka nucleus o CM mai nā puaʻa like ʻole (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ʻāpana/hui, ʻelua-huelo t -criterion haumāna; *p <0.05).Hōʻike nā pahu hewa i ka mean ± deviation maʻamau.
Pono ka noiʻi ʻana i ka maʻi cardiovascular i nā hiʻohiʻona kelepona e hoʻopuka pololei i ke ʻano o ka naʻau. I loko o kēia haʻawina, ua hoʻomohala ʻia kahi mea CTCM a hiki ke hoʻoulu i nā ʻāpana ultrathin o ka puʻuwai. Aia ka ʻōnaehana CTCM i ka hoʻoulu ʻana i ka electromechanical physiologically synchronized a me ka hoʻonui ʻana i ka wai T3 a me Dex. I ka wā i ʻike ʻia ai nā ʻāpana puʻuwai puaʻa i kēia mau mea, ʻo ko lākou viability, structural integrity, metabolic activity, a me transcriptional expression i mau like me ka puʻuwai hou ma hope o 12 mau lā o ka moʻomeheu. Eia kekahi, ʻo ka hoʻolōʻihi ʻana o ka ʻiʻo cardiac hiki ke hoʻoulu i ka hypertrophy o ka puʻuwai i hoʻokumu ʻia e ka hyperextension. Ma keʻano holoʻokoʻa, kākoʻo kēia mau hopena i ke kuleana koʻikoʻi o nā kūlana moʻomeheu physiological i ka mālama ʻana i kahi phenotype cardiac maʻamau a hāʻawi i kahi kahua no ka nānā ʻana i ka lāʻau.
Nui nā kumu i ka hoʻokumu ʻana i kahi kaiapuni maikaʻi loa no ka hana a me ke ola ʻana o nā cardiomyocytes. ʻO ka mea maopopo loa o kēia mau mea pili i (1) intercellular interactions, (2) electromechanical stimulation, (3) humoral factor, a (4) metabolic substrates. Pono nā pilina pili kino-a-cell i nā ʻupena ʻekolu-dimensional paʻakikī o nā ʻano kelepona lehulehu i kākoʻo ʻia e kahi matrix extracellular. He paʻakikī ke kūkulu hou ʻana o ia mau pilina pili kelepona paʻakikī i loko o ka vitro e ka moʻomeheu hui o kēlā me kēia ʻano kelepona, akā hiki ke maʻalahi me ka hoʻohana ʻana i ke ʻano organotypic o nā ʻāpana naʻau.
He mea koʻikoʻi ka hoʻolōʻihi ʻana i ka mīkini a me ka hoʻoulu ʻana i ka uila o nā cardiomyocytes no ka mālama ʻana i ka phenotype cardiac33,34,35. ʻOiai ua hoʻohana nui ʻia ka hoʻoulu ʻana i ka mīkini no ka hiPSC-CM conditioning a me ka maturation, ua hoʻāʻo kekahi mau haʻawina nani i ka hoʻoulu ʻana i nā ʻāpana puʻuwai i ka moʻomeheu me ka hoʻohana ʻana i ka uniaxial loading. Hōʻike kēia mau haʻawina he hopena maikaʻi ka 2D uniaxial mechanical loading i ka phenotype o ka puʻuwai i ka wā moʻomeheu. I loko o kēia mau haʻawina, ua hoʻouka ʻia nā ʻāpana o ka puʻuwai me ka isometric tensile forces17, linear auxotonic loading18, a i ʻole ua hana hou ʻia ka pōʻai puʻuwai me ka hoʻohana ʻana i ka mana transducer ikaika a me nā hoʻokele hoʻopaʻapaʻa. Eia nō naʻe, hoʻohana kēia mau ʻano i ka uniaxial tissue stretch me ka ʻole o ka loiloi kaiapuni, ka hopena i ka hoʻopau ʻana i nā genes cardiac he nui a i ʻole overexpression o nā genes e pili ana i nā pane kikoʻī. ʻO ka CTCM i wehewehe ʻia ma ʻaneʻi e hāʻawi i kahi 3D electromechanical stimulus e hoʻohālikelike i ka pōʻai cardiac kūlohelohe ma ke ʻano o ka manawa pōʻai a me ka hoʻolōʻihi physiological (25% stretch, 40% systole, 60% diastole, a me 72 beats i kēlā me kēia minuke). ʻOiai ʻaʻole lawa kēia ʻano hoʻonaninani ʻekolu wale nō no ka mālama ʻana i ka pono o ka ʻiʻo, pono ka hui pū ʻana o ka humoral a me ka mechanical stimulation me ka hoʻohana ʻana i ka T3 / Dex e mālama pono i ka ola kino, ka hana, a me ka pono.
He kuleana koʻikoʻi nā mea hoʻomākeʻaka i ka hoʻololi ʻana i ka phenotype naʻau makua. Ua hōʻike ʻia kēia ma nā haʻawina HiPS-CM kahi i hoʻohui ʻia ai ʻo T3 a me Dex i ka media moʻomeheu e hoʻolalelale i ka maturation cell. Hiki i ka T3 ke hoʻoikaika i ka lawe ʻana i nā ʻakika amino, nā kō a me ka calcium ma waena o nā membrane cell36. Eia kekahi, hoʻolaha ʻo T3 i ka ʻōlelo MHC-α a me ka MHC-β downregulation, e hāpai ana i ka hoʻokumu ʻana o nā myofibrils twitch wikiwiki i nā cardiomyocytes makua i hoʻohālikelike ʻia me ka lohi twitch myofibrils i ka fetal CM. ʻO ka nele o T3 i nā poʻe maʻi hypothyroid ka hopena i ka nalowale o nā kaula myofibrillar a me ka emi ʻana o ka hoʻomohala ʻana o ka leo37. Hana ʻo Dex i nā mea loaʻa glucocorticoid a ua hōʻike ʻia e hoʻonui i ka contractility myocardial i nā puʻuwai perfused kaʻawale; 38 manaʻo ʻia e pili ana kēia hoʻomaikaʻi ʻana i ka hopena ma ka hoʻokomo ʻana i ka hoʻokomo ʻana i ka waihona calcium (SOCE) 39,40. Eia kekahi, hoʻopaʻa ʻo Dex i kāna mau mea loaʻa, e hana ana i kahi pane intracellular ākea e kāohi i ka hana immune a me ka mumū30.
Hōʻike kā mākou mau hopena i ka hoʻoikaika kino ʻana o ka mechanical stimulation (MS) i ka hana moʻomeheu holoʻokoʻa i hoʻohālikelike ʻia me Ctrl, akā ʻaʻole i mālama i ka viability, structural integrity, a me ka hōʻike cardiac ma luna o 12 mau lā ma ka moʻomeheu. Hoʻohālikelike ʻia me Ctrl, ʻo ka hoʻohui ʻana o T3 a me Dex i nā moʻomeheu CTCM (MT) i hoʻomaikaʻi maikaʻi ʻia a mālama ʻia nā moʻolelo transcription like, kūpaʻa ʻano, a me ka hana metabolic me ka ʻiʻo puʻuwai hou no nā lā 12. Eia hou, ma ka hoʻomaluʻana i ke kiʻekiʻe o ke kiko o ke kiko, ua hanaʻia kekahiʻano hypertrophy cardiac hypertrophy i hoʻokomoʻia me ka hoʻohanaʻana i STCM, e hōʻike ana i ka maʻalahi o ka pūnaewele STCM. Pono e hoʻomaopopo ʻia ʻoiai ʻo ka hoʻoponopono hou ʻana o ka naʻau a me ka fibrosis e hoʻopili mau i nā ʻāpana paʻa i hiki ke hāʻawi i nā cytokines kūpono e like me ka phagocytosis a me nā mea hoʻoponopono ʻē aʻe, hiki i nā ʻāpana o ka puʻuwai ke hoʻohālike i ke kaʻina fibrotic i pane i ke kaumaha a me ka trauma. i loko o ka myofibroblasts. Ua loiloi mua ʻia kēia i loko o kēia ʻano ʻāpana puʻuwai. Pono e hoʻomaopopo ʻia e hiki ke hoʻololi ʻia nā ʻāpana CTCM ma o ka hoʻololi ʻana i ke kaomi / amplitude uila a me ka pinepine e hoʻohālikelike i nā kūlana he nui e like me tachycardia, bradycardia, a me ke kākoʻo circulatory mechanical (mechanical unloaded heart). Hoʻolilo kēia i ka ʻōnaehana i waena o ka hoʻāʻo ʻana i ka lāʻau. ʻO ka hiki o CTCM ke hoʻohālike i ka overexertion-induced cardiac hypertrophy i ke ala no ka hoʻāʻo ʻana i kēia ʻōnaehana no ka lapaʻau pilikino. I ka hopena, hōʻike ka haʻawina i kēia manawa he mea koʻikoʻi ka hoʻolōʻihi mechanical a me ka hoʻoulu ʻana i ka humoral no ka mālama ʻana i ka moʻomeheu o nā ʻāpana ʻiʻo cardiac.
ʻOiai ʻo ka ʻikepili i hōʻike ʻia ma ʻaneʻi e hōʻike ana he kahua hoʻohiki maikaʻi loa ʻo CTCM no ka hoʻohālikelike ʻana i ka myocardium paʻa, aia kekahi mau palena o kēia ʻano moʻomeheu. ʻO ka palena nui o ka moʻomeheu CTCM ʻo ia ka hoʻokau ʻana i nā koʻikoʻi mechanical ikaika i nā ʻāpana, kahi e pale ai i ka hiki ke nānā pono i nā ʻāpana ʻāpana cardiac i kēlā me kēia pōʻai. Eia kekahi, ma muli o ka liʻiliʻi liʻiliʻi o nā ʻāpana cardiac (7 mm), hiki ke loiloi i ka hana systolic ma waho o nā ʻōnaehana moʻomeheu me ka hoʻohana ʻana i nā mea ʻike mana kuʻuna. Ma ka manuscript o kēia manawa, ua lanakila mākou i kēia palena ma ka loiloi ʻana i ka volta optical ma ke ʻano he hōʻailona o ka hana contractile. Eia nō naʻe, e koi ʻia kēia palena i ka hana hou a hiki ke hoʻoponopono ʻia i ka wā e hiki mai ana ma ka hoʻokomo ʻana i nā ala no ka nānā ʻana i ka hana o nā ʻāpana puʻuwai i ka moʻomeheu, e like me ka hoʻohana ʻana i nā mea hoʻoheheʻe calcium a me nā mea uila. ʻO kekahi palena ʻē aʻe o CTCM ʻo ia ʻaʻole hoʻopunipuni ke kumu hana i ke kaumaha physiological (preload a afterload). I loko o CTCM, ua hoʻokomo ʻia ke kaomi ma nā ʻaoʻao ʻē aʻe e hana hou i ka 25% physiological stretch i ka diastole (full stretch) a me ka systole (lōʻihi o ka hoʻopaʻa ʻana i ka wā hoʻoulu uila) i loko o nā ʻiʻo nui loa. Pono e hoʻoneʻe ʻia kēia palena i nā hoʻolālā CTCM e hiki mai ana ma ke kaomi ʻana i ka ʻiʻo puʻuwai mai nā ʻaoʻao ʻelua a me ka hoʻopili ʻana i nā pilina pili puʻe-nui e kū nei i loko o nā keʻena o ka puʻuwai.
ʻO ka overstretch-induced remodeling i hōʻike ʻia ma kēia palapala i kaupalena ʻia i ka hoʻohālikelike ʻana i nā hōʻailona hypertrophic hyperstretch. No laila, hiki i kēia kŘkohu ke kōkua i ke aʻo ʻana i ka hōʻailona hypertrophic stretch-induced me ka ʻole o ka pono o nā mea hoʻohenehene a neural paha (ʻaʻole i loaʻa i kēia ʻōnaehana). Pono nā haʻawina hou aʻe e hoʻonui i ka nui o CTCM, no ka laʻana, ka hui pū ʻana me nā cell immune, circulating plasma humoral factor, a me ka innervation i ka wā e hui pū ai me nā cell neuronal e hoʻomaikaʻi i nā hiki ke hoʻohālikelike ʻia me ka CTCM.
He ʻumikūmākolu puaʻa i hoʻohana ʻia ma kēia haʻawina. Ua hana ʻia nā kaʻina hana holoholona a pau e like me nā alakaʻi alakaʻi a ua ʻae ʻia e ke Kōmike mālama holoholona a me ka hoʻohana ʻana o ke Kulanui o Louisville Institutional Animal Care. Ua hoʻopaʻa ʻia ka ʻāʻī aortic a ua honi ʻia ka puʻuwai me 1 L o ka cardioplegia sterile (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH a hiki i 7.4); mālama ʻia nā naʻau i loko o ka wai hau anuanu a hiki i ka lawe ʻia ʻana i ke keʻena hau i ka manawa maʻamau <10 min. mālama ʻia nā naʻau i loko o ka wai hau anuanu a hiki i ka lawe ʻia ʻana i ke keʻena hau i ka manawa maʻamau <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимат <10нимат. Ua mālama ʻia nā naʻau i loko o ka wai hau anuanu a hiki i ka lawe ʻana i ka hale hana ma ka hau, ʻo ia ka mea maʻamau <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. E mālama i nā naʻau ma ka hau cardioplegia a hiki i ka lawe ʻana i ke keʻena hana ma ka hau, maʻamau <10 min.
Ua hoʻomohala ʻia ka polokalamu CTCM ma SolidWorks computer-aided design (CAD) lako polokalamu. ʻO nā keʻena moʻomeheu, nā mea hoʻokaʻawale a me nā keʻena ea i hana ʻia me ka ʻilika acrylic maʻemaʻe CNC. Hana ʻia ke apo hope 7mm anawaena me ka polyethylene kiʻekiʻe (HDPE) i waenakonu a loaʻa iā ia kahi o-ring groove e hoʻokomo i ke apo silicone i hoʻohana ʻia e sila i ka media ma lalo. Hoʻokaʻawale ʻia ke keʻena moʻomeheu mai ka pā kaʻawale. Ua ʻoki ʻia ka membrane silicone mai ka 0.02 ″ mānoanoa silicone sheet a he 35A ka paʻakikī. ʻO ka lalo a me luna silicone gaskets i ʻoki ʻia mai ka 1/16 ″ ʻāpana silicone mānoanoa a loaʻa ka paʻakikī o 50A. Hoʻohana ʻia nā wili kila kila 316L a me nā nati ʻēheu no ka hoʻopaʻa ʻana i ka poloka a hana i kahi sila paʻa ea.
Hoʻolālā ʻia kahi papa kaapuni paʻi paʻi ʻia (PCB) e hoʻohui pū me ka ʻōnaehana C-PACE-EM. Hoʻopili ʻia nā kumu hoʻohui mīkini swiss ma ka PCB i nā electrodes graphite e nā uea keleawe-plated keleawe a me nā wili keleawe 0-60 i hoʻopili ʻia i loko o nā electrodes. Hoʻokomo ʻia ka papa kaapuni paʻi i ka uhi o ka mīkini paʻi 3D.
Hoʻomalu ʻia ka mea CTCM e kahi programmable pneumatic actuator (PPD) e hana ana i ke kaomi ʻana o ke kahe e like me ka pōʻai cardiac. I ka piʻi ʻana o ke kaomi i loko o ke keʻena ea, hoʻonui ʻia ka membrane silicone maʻalahi i luna, e koi ana i ka waena ma lalo o ka pūnaewele kiko. E hohola ʻia ka ʻāpana o ka ʻili e kēia kipaku ʻana i ka wai, e hoʻohālikelike i ka hoʻonui ʻana o ka puʻuwai i ka wā diastole. I ka piko o ka hoʻomaha, ua hoʻohana ʻia ka hoʻoulu ʻana i ka uila ma o nā electrodes graphite, kahi i hoʻemi ai i ke kaomi i loko o ke keʻena ea a hoʻemi i nā ʻāpana kiko. Aia i loko o ka paipu he pahu hemostatic me kahi mea ʻike kaomi e ʻike ai i ke kaomi o ka ʻōnaehana ea. Hoʻohana ʻia ke kaomi i ʻike ʻia e ka mea ʻike kaomi i kahi ʻohi ʻikepili i pili i ka kamepiula. ʻAe kēia i ka nānā mau ʻana i ke kaomi i loko o ke keʻena kinoea. I ka loaʻa ʻana o ke kaomi o ke keʻena kiʻekiʻe (80 mmHg maʻamau, 140 mmHg OS), ua kauoha ʻia ka mea lawe ʻikepili e hoʻouna i kahi hōʻailona i ka ʻōnaehana C-PACE-EM e hana i kahi hōʻailona uila biphasic no 2 ms, i hoʻonohonoho ʻia i 4 V.
Ua loaʻa nā ʻāpana puʻuwai a ua hana ʻia nā kūlana moʻomeheu i loko o nā luawai 6 penei: E hoʻololi i nā puʻuwai i ʻohi ʻia mai ka moku hoʻoili i kahi pā i loaʻa ke anu (4° C.) cardioplegia. Ua hoʻokaʻawale ʻia ka ventricle hema me kahi ʻāpana sterile a ʻokiʻoki i nā ʻāpana o 1-2 cm3. Hoʻopili ʻia kēia mau poloka ʻiʻo i nā kākoʻo ʻiʻo me ka mea hoʻopili kiko a waiho ʻia i loko o kahi ʻauʻau ʻauʻau microtome vibrating i loaʻa ka hopena o Tyrode a hoʻomau i ka oxygenated (3 g / L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g) . ), 6 mM KCl (0.407M), 6 mM KCl (0.447 m), gluse (0.447 m) 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M solution), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M solution), a hiki i ka 1 L ddH2O). Ua hoʻonohonoho ʻia ka microtome vibrating e ʻoki i nā ʻāpana mānoanoa 300 µm ma ke alapine o 80 Hz, kahi amplitude vibration ākea o 2 mm, a me ka wikiwiki mua o 0.03 mm/s. Ua hoʻopuni ʻia ka ʻauʻau ʻauʻau e ka hau no ka hoʻomaʻamaʻa ʻana o ka hopena a mālama ʻia ka mahana ma 4 ° C. E hoʻololi i nā ʻāpana ʻiʻo mai ka ʻauʻau microtome i kahi ʻauʻau incubation i loaʻa i ka wai hoʻoheheʻe Tyrode hoʻomau i ka hau a loaʻa nā ʻāpana nui no ka pā moʻomeheu hoʻokahi. No nā moʻomeheu transwell, ua hoʻopili ʻia nā ʻāpana kiko i nā kākoʻo polyurethane ākea 6 mm ākea a waiho ʻia i loko o 6 ml o ka medium optimized (199 medium, 1x ITS supplement, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkaline a me 2X antibiotic-antifungal). Hoʻohana ʻia ka hoʻoulu uila (10 V, frequency 1.2 Hz) i nā ʻāpana kiko ma o ka C-Pace. No nā kūlana TD, ua hoʻohui ʻia ʻo T3 a me Dex hou ma 100 nM a me 1 μM i kēlā me kēia loli. Hoʻopiha ʻia ka medium me ka oxygen ma mua o ka hoʻololi ʻana i 3 mau manawa i ka lā. Hoʻoulu ʻia nā ʻāpana ʻāpana i loko o kahi incubator ma 37 ° C a me 5% CO2.
No nā moʻomeheu CTCM, ua kau ʻia nā ʻāpana kiko ma luna o kahi mīkini paʻi 3D i hana ʻia i loko o kahi pā Petri i loaʻa ka hopena o Tyrode i hoʻololi ʻia. Hoʻolālā ʻia ka hāmeʻa e hoʻonui i ka nui o ka ʻāpana o ka puʻuwai e 25% o ka wahi o ke apo kākoʻo. Hana ʻia kēia i ʻole e kikoo nā ʻāpana o ka puʻuwai ma hope o ka neʻe ʻana mai ka hopena o Tyrode i ka waena a i ka wā diastole. Me ka hoʻohana ʻana i ke kāpili histoacrylic, ua hoʻopaʻa ʻia nā ʻāpana 300 µm mānoanoa ma ke apo kākoʻo 7 mm ke anawaena. Ma hope o ka hoʻopili ʻana i nā ʻāpana ʻiʻo i ke apo kākoʻo, e ʻoki i nā ʻāpana kikoo keu a hoʻihoʻi i nā ʻāpana kiko i hoʻopili ʻia i loko o ka ʻauʻau o Tyrode solution ma ka hau (4°C) a hiki i ka hoʻomākaukau ʻana i nā ʻāpana nui no ka mea hoʻokahi. ʻAʻole pono ka nui o ka manawa hana no nā mea hana a pau ma mua o 2 mau hola. Ma hope o ka hoʻopili ʻia ʻana o 6 mau ʻāpana kiko i ko lākou mau apo kākoʻo, ua ʻākoakoa ʻia ka mea CTCM. Hoʻopiha mua ʻia ka keʻena moʻomeheu CTCM me 21 ml pre-oxygenated medium. E hoʻoneʻe i nā ʻāpana kiko i ke keʻena moʻomeheu a wehe pono i nā ʻōpū ea me ka pipette. A laila alakaʻi ʻia ka ʻāpana kiko i loko o ka lua a kaomi mālie i kahi. ʻO ka hope, kau i ka pāpale electrode ma luna o ka mea hana a hoʻololi i ka mea hana i ka incubator. A laila hoʻohui i ka CTCM i ka paipu ea a me ka ʻōnaehana C-PACE-EM. Wehe ka pneumatic actuator a wehe ka valve ea i ka CTCM. Ua hoʻonohonoho ʻia ka ʻōnaehana C-PACE-EM e hāʻawi i ka 4 V ma 1.2 Hz i ka wā biphasic pacing no 2 ms. Ua hoʻololi ʻia ka medium i ʻelua manawa i ka lā a ua hoʻololi ʻia nā electrodes i hoʻokahi manawa i ka lā e pale i ka hōʻiliʻili ʻana o ka graphite ma nā electrodes. Inā pono, hiki ke hoʻoneʻe ʻia nā ʻāpana ʻiʻo mai ko lākou mau pūnāwai moʻomeheu e kipaku aku i nā ʻōpū ea i hāʻule ma lalo o lākou. No nā kūlana lapaʻau MT, ua hoʻohui hou ʻia ʻo T3/Dex me kēlā me kēia hoʻololi waena me 100 nM T3 a me 1 μM Dex. Hoʻoulu ʻia nā mea CTCM i loko o kahi incubator ma 37 ° C a me 5% CO2.
No ka loaʻa ʻana o nā trajectories o nā ʻāpana puʻuwai, ua kūkulu ʻia kahi ʻōnaehana kamera kūikawā. Ua hoʻohana ʻia kahi pahupaʻikiʻi SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Iapana) me kahi lens macro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA). Hana ʻia ka nānā ʻana ma ka lumi wela ma hope o ka hoʻololi ʻana i ka ʻano me ka mea hou. Hoʻonoho ʻia ka pahupaʻikiʻi ma kahi kihi 51° a hoʻopaʻa ʻia ke wikiō ma 30 mau kiʻi i kēlā me kēia kekona. ʻO ka mua, ua hoʻohana ʻia ka polokalamu open source (MUSCLEMOTION43) me Image-J e helu i ka neʻe ʻana o nā ʻāpana puʻuwai. Ua hana ʻia ka mask me ka hoʻohana ʻana iā MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) e wehewehe i nā wahi hoihoi no ka paʻi ʻana i nā ʻāpana puʻuwai e pale aku i ka walaʻau. Hoʻopili ʻia nā masks māhele lima i nā kiʻi āpau i ke kaʻina kiʻi a laila hāʻawi ʻia i ka plug-in MUSCLEMOTION. Hoʻohana ka Muscle Motion i ka awelika ikaika o nā pika i kēlā me kēia kiʻi e helu i kona neʻe e pili ana i ke kiʻi kuhikuhi. Hoʻopaʻa ʻia ka ʻikepili, kānana a hoʻohana ʻia e helu i ka manawa pōʻaiapili a nānā i ke kiko kiko i ka wā o ka pōʻai cardiac. Ua hoʻopaʻa ʻia ka wikiō i hoʻopaʻa ʻia ma hope o ka hoʻohana ʻana i kahi kānana kikohoʻe zero-phase. No ka helu ʻana i ka kiko kiko (peak-to-peak), ua hana ʻia ka nānā ʻana o ka piko-i-peak e ʻike ai ma waena o nā piko a me nā pā i ka hōʻailona i hoʻopaʻa ʻia. Eia kekahi, hana ʻia ka detrending me ka hoʻohana ʻana i ka polynomial kauoha 6 e hoʻopau i ka drift hōʻailona. Ua hoʻomohala ʻia ka code program ma MATLAB e hoʻoholo i ka neʻe ʻana o ke kino honua, ka manawa pōʻai, ka manawa hoʻomaha, a me ka manawa hoʻopaʻa (Supplementary Program Code 44).
No ka kānana kānana, me ka hoʻohana ʻana i nā wikiō like i hana ʻia no ka loiloi mechanical stretch, ua ʻimi mua mākou i ʻelua kiʻi e hōʻike ana i nā piko o ka neʻe (nā wahi kiʻekiʻe (luna) a haʻahaʻa (lalo) o ka neʻe) e like me ka polokalamu MUSCLEMOTION. A laila hoʻokaʻawale mākou i nā ʻāpana ʻāpana a hoʻopili i kahi ʻano o ka shading algorithm i ka ʻāpana ʻāpana (Supplementary Fig. 2a). A laila, ua māhele ʻia ka ʻiʻo i hoʻokaʻawale ʻia i ʻumi lalo, a ua helu ʻia ke koʻikoʻi ma kēlā me kēia ʻili me ka hoʻohana ʻana i ka hoohalike penei: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, kahi ʻo Sup a me Sdown nā mamao o ke ʻano mai ka malu luna a me lalo o ka lole.
Hoʻopaʻa ʻia nā ʻāpana puʻuwai i 4% paraformaldehyde no 48 mau hola. Ua hoʻomaʻemaʻe ʻia nā ʻiʻo paʻa i ka 10% a me 20% sucrose no 1 h, a laila ma 30% sucrose i ka pō. Hoʻokomo ʻia nā ʻāpana i loko o ka pūhui wela ʻoki maikaʻi loa (OCT compound) a maloʻo mālie i loko o kahi ʻauʻau hau isopentane/ maloʻo. E mālama i nā poloka hoʻokomo OCT ma -80 °C a hiki i ka wā e kaʻawale ai. Ua hoʻomākaukau ʻia nā paheʻe e like me nā ʻāpana me ka mānoanoa o 8 μm.
No ka wehe ʻana i ka OCT mai nā ʻāpana puʻuwai, e hoʻomehana i nā kiʻi paheʻe ma kahi poloka wela ma 95 °C no 5 min. E hoʻohui i ka 1 ml PBS i kēlā me kēia paheʻe a hoʻomoʻa no 30 mau minuke i ka mahana o ka lumi, a laila e hoʻopili i nā ʻāpana ma ka hoʻonohonoho ʻana i ka 0.1% Triton-X i PBS no 15 mau minuke ma ke ana wela. No ka pale ʻana i nā antibodies kikoʻī ʻole mai ka hoʻopaʻa ʻana i ka hāpana, e hoʻohui i 1 ml o 3% BSA solution i nā paheʻe a hoʻomoʻa no 1 hola ma ka lumi wela. Wehe ʻia ka BSA a holoi ʻia nā paheʻe me ka PBS. E kaha i kēlā me kēia hāpana me kahi penikala. ʻO nā antibodies mua (diluted 1:200 i ka 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) a me troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) ua hoʻohui ʻia ma luna o 90 mau minuke, a laila hoʻohui ʻia nā antibodies kiʻekiʻe 1 (%20000) i nā ʻiole kiʻekiʻe (20000) 488 (Thermo Scientific; #A16079), kūʻē i ka rabbit Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) no 90 mau minuke Holoi 3 manawa me ka PBS No ka hoʻokaʻawale ʻana i ka pale ʻana mai ke kua, ua hoʻohana wale mākou i ka antibody lua ma ke ʻano he mana. hoʻopaʻa ʻia me ka poli kui -x hoʻonui) a me ka microscope Keyence me ka hoʻonui 40x.
Ua hoʻohana ʻia ʻo WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) ma 5 μg/ml ma PBS no ka hoʻopaʻa ʻana o WGA a hoʻohana ʻia i nā ʻāpana paʻa no 30 mau minuke i ka lumi wela. A laila holoi ʻia nā paheʻe me ka PBS a ua hoʻohui ʻia ka ʻeleʻele Sudan i kēlā me kēia paheʻe a hoʻokomo ʻia no 30 mau minuke. Ua holoi ʻia nā paheʻe me ka PBS a ua hoʻohui ʻia ka vectashield embedding medium. Ua ʻike ʻia nā kiʻi kiʻi ma kahi microscope Keyence ma ka hoʻonui 40x.
Ua wehe ʻia ʻo OCT mai nā laʻana e like me ka mea i hōʻike ʻia ma luna. Ma hope o ka wehe ʻana i ka OCT, e hoʻokomo i nā paheʻe i loko o ka solution a Bouin i ka pō. Holoi ʻia nā paheʻe me ka wai i hoʻomaʻemaʻe ʻia no 1 hola a laila waiho ʻia i loko o kahi solution Bibrich aloe acid fuchsin no 10 mau minuke. A laila holoi ʻia nā paheʻe me ka wai hoʻoheheʻe ʻia a waiho ʻia i loko o kahi hopena o 5% phosphomolybdenum / 5% phosphotungstic acid no 10 mau minuke. Me ka holoi ʻole ʻana, e hoʻololi pololei i nā paheʻe i loko o ka solution polū aniline no 15 mau minuke. A laila holoi ʻia nā paheʻe me ka wai i hoʻoheheʻe ʻia a waiho ʻia i loko o kahi solution 1% acetic acid no 2 mau minuke. Hoʻomaloʻo ʻia nā paheʻe i 200 N ethanol a hoʻololi ʻia i xylene. ʻIke ʻia nā kiʻi paheʻe me ka microscope Keyence me kahi pahuhopu 10x. Ua helu ʻia ka pākēneka ʻāpana fibrosis me ka polokalamu Keyence Analyzer.
ʻO CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), helu helu V13154, e like me ka protocol o ka mea hana me kekahi mau hoʻololi. ʻO ka mea nui, ua hoʻohana ʻia kahi punch ʻokiʻoki me ke anawaena o 6 mm e hōʻoia i ka nui o ka ʻiʻo like ʻole i ka wā o ka loiloi MTT. Hoʻopili ʻia nā ʻupena i loko o nā pūnāwai o kahi pā punawai 12 i loaʻa ka substrate MTT e like me ke kaʻina hana a ka mea hana. Hoʻomoʻa ʻia nā ʻāpana ma 37 ° C. no 3 mau hola a hoʻololi ka ʻiʻo ola i ka substrate MTT e hana i kahi pūhui formazan poni. E hoʻololi i ka solution MTT me 1 ml DMSO a hoʻomoʻa ma 37 °C no 15 mau minuke e unuhi i ka formazan poni mai nā ʻāpana puʻuwai. Ua hoʻoheheʻe ʻia nā laʻana i ka 1:10 ma DMSO i nā papa lalo 96-maikaʻi a me ka ikaika o ka kala poni i ana ʻia ma 570 nm me ka hoʻohana ʻana i kahi mea heluhelu Cytation plate (BioTek). Ua maʻamau ka heluhelu ʻana i ke kaumaha o kēlā me kēia ʻāpana o ka puʻuwai.
Ua pani ʻia ka media ʻāpana puʻuwai me ka media i loaʻa ka 1 μCi/ml [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) no ka hoʻohana ʻana i ka glucose e like me ka mea i wehewehe mua ʻia. Ma hope o 4 mau hola o ka hoʻoulu ʻana, e hoʻohui i 100 µl o ka medium i kahi paipu microcentrifuge hāmama me 100 µl o 0.2 N HCl. A laila ua hoʻokomo ʻia ka paipu i loko o kahi paipu scintillation i loaʻa iā 500 μl o dH2O e hoʻoheheʻe [3H]2O no 72 mau hola ma 37°C. A laila e wehe i ka paipu microcentrifuge mai ka paipu scintillation a hoʻohui i 10 ml o ka wai scintillation. Hoʻohana ʻia nā helu Scintillation me ka Tri-Carb 2900TR liquid scintillation analyzer (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). A laila ua helu ʻia ka hoʻohana ʻana i ka glucose me ka noʻonoʻo ʻana i ka hana kikoʻī [5-3H]-glucose, ke kaulike ʻole a me ka hope, ka hoʻoheheʻe ʻana o [5-3H]-i ka glucose i hōʻailona ʻole ʻia, a me ka pono counter scintillation. Hoʻonohonoho ʻia ka ʻikepili i ka nui o nā ʻāpana o ka puʻuwai.
Ma hope o ka homogenization o nā kiko ma Trizol, ua hoʻokaʻawale ʻia ʻo RNA mai nā ʻāpana puʻuwai me ka hoʻohana ʻana i ka Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 e like me ka protocol o ka mea hana. Ua hana ʻia ka hoʻomākaukau ʻana o ka waihona waihona RNAsec, sequencing a me ka nānā ʻana i ka ʻikepili penei:
Ua hoʻohana ʻia ʻo 1 μg o RNA no kēlā me kēia laʻana i mea hoʻomaka no ka hoʻomākaukau ʻana i ka waihona RNA. Hana ʻia nā hale waihona puke me ka NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit no Illumina (NEB, USA) ma muli o nā ʻōlelo aʻoaʻo a ka mea hana, a ua hoʻohui ʻia nā code index i nā kaʻina hana no kēlā me kēia laʻana. I ka pōkole, ua hoʻomaʻemaʻe ʻia ka mRNA mai ka huina RNA me ka hoʻohana ʻana i nā peʻa magnetic i hoʻopili ʻia me nā poly-T oligonucleotides. Lawe ʻia ka ʻāpana me ka hoʻohana ʻana i nā cations divalent i ka wela kiʻekiʻe ma NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). Hoʻopili ʻia ka cDNA strand mua me ka hoʻohana ʻana i nā primer hexamer random a me M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-). Hoʻopili ʻia ke kaula cDNA ʻelua me ka DNA polymerase I a me RNase H. Hoʻololi ʻia nā koena overhangs i nā hopena blunt e ka hana exonuclease/polymerase. Ma hope o ka adenylation o ka hopena 3′ o ka ʻāpana DNA, ua hoʻopili ʻia kahi NEBNext Adapter me kahi ʻano lauoho lauoho e hoʻomākaukau ai no ka hybridization. No ke koho ʻana i nā ʻāpana cDNA o ka lōʻihi makemake ʻia 150-200 bp. ua hoʻomaʻemaʻe ʻia nā ʻāpana waihona me ka ʻōnaehana AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA). A laila, ua hoʻohana ʻia ʻo 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) me ka cDNA i koho nui ʻia me kahi mea hoʻopili no 15 mau minuke ma 37 ° C a laila no 5 mau minuke ma 95 ° C ma mua o PCR. A laila ua hana ʻia ka PCR me ka hoʻohana ʻana i ka Phusion High-Fidelity DNA polymerase, nā kumu mua PCR āpau, a me nā kumu mua Index (X). ʻO ka hope, ua hoʻomaʻemaʻe ʻia nā huahana PCR (pūnaewele AMPure XP) a nānā ʻia ka maikaʻi o ka waihona ma kahi ʻōnaehana Agilent Bioanalyzer 2100. Ua hoʻonohonoho ʻia ka waihona cDNA me ka hoʻohana ʻana i kahi sequencer Novaseq. Ua hoʻololi ʻia nā faila kiʻi makaʻu mai Illumina i nā heluhelu maka me ka hoʻohana ʻana i ka CASAVA Base Calling. Mālama ʻia ka ʻikepili maka ma nā faila FASTQ(fq) i loaʻa nā kaʻina heluhelu a me nā ʻano kumu kūpono. Koho i ka HISAT2 e hoʻohālikelike i ka helu helu ʻana i kānana me ka Sscrofa11.1 reference genome. Ma ka laulā, kākoʻo ʻo HISAT2 i nā genomes o kēlā me kēia nui, me nā genomes ʻoi aku ka nui ma mua o 4 biliona kumu, a ua hoʻonohonoho ʻia nā waiwai paʻamau no ka hapa nui. Hiki ke hoʻolikelike ʻia ka heluhelu ʻana mai ka ʻikepili RNA Seq me ka hoʻohana ʻana iā HISAT2, ka ʻōnaehana wikiwiki loa i loaʻa i kēia manawa, me ka pololei a ʻoi aku ka maikaʻi ma mua o nā ʻano hana ʻē aʻe.
Hōʻike pololei ka nui o nā transcripts i ke kiʻekiʻe o ka hōʻike gene. ʻIke ʻia nā pae hōʻike Gene e ka nui o nā transcripts (sequencing count) pili me ka genome a i ʻole exons. Hoʻohālikelike ka helu o nā heluhelu i nā pae hōʻike gene, ka lōʻihi o ka gene, a me ka hohonu o ke kaʻina. Ua helu ʻia ʻo FPKM (nā ʻāpana no kēlā me kēia kaukani kumu pālua o ka transcript i hoʻopaʻa ʻia i kēlā me kēia miliona base pairs) a ua hoʻoholo ʻia nā waiwai P o ka ʻōlelo ʻokoʻa me ka hoʻohana ʻana i ka pā DESeq2. A laila, helu mākou i ka helu ʻike wahaheʻe (FDR) no kēlā me kēia waiwai P me ka hoʻohana ʻana i ka Benjamini-Hochberg method9 e pili ana i ka hana R i kūkulu ʻia "p.adjust".
Ua hoʻololi ʻia ʻo RNA i hoʻokaʻawale ʻia mai nā ʻāpana puʻuwai i cDNA ma kahi ʻano o 200 ng / μl me ka hoʻohana ʻana i ka SuperScript IV Vilo Master mix mai Thermo (Thermo, cat. No. 11756050). Ua hana 'ia ka Quantitative RT-PCR me ka Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well transparent reaction plate (Thermo, cat. No. 4483319) a me ka microamp optical adhesive (Thermo, cat. No. 4311971). ʻO ka hui ʻana he 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer a me 3.5 µl H2O i hui ʻia i kēlā me kēia luawai. Ua holo ʻia nā pōʻai qPCR maʻamau a ua ana ʻia nā waiwai CT me ka Applied Biosystems Quantstudio 5 mea hana PCR manawa maoli (384-well module; huahana # A28135). Ua kūʻai ʻia nā primer Taqman mai Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868) (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss8) nā waiwai a pau. Ua hoʻohālikelike ʻia nā laʻana i ka gene keeping house GAPDH.
Ua loiloi ʻia ka hoʻokuʻu ʻana o ka media o NT-ProBNP me ka hoʻohana ʻana i ka kit NT-ProBNP (puaʻa) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) e like me ka protocol o ka mea hana. ʻO ka pōkole, ua hoʻohui ʻia he 250 µl o kēlā me kēia laʻana a me ka maʻamau i ʻelua i kēlā me kēia luawai. Ma hope koke o ka hoʻohui ʻana i ka hāpana, e hoʻohui i 50 µl o Assay Reagent A i kēlā me kēia pūnāwai. E lulu mālie i ka pā a hoʻopaʻa me ka sealant. A laila hoʻokomo ʻia nā papa ma 37 ° C no 1 hola. A laila e hoʻomoʻi i ka hopena a holoi i nā pūnāwai 4 manawa me 350 µl o 1X solution holoi, e hoʻomoʻa i ka wai holoi no 1-2 mau minuke i kēlā me kēia manawa. A laila e hoʻohui i 100 µl o Assay Reagent B i kēlā me kēia pūnāwai a hoʻopaʻa ʻia me ka sealant pā. Hoʻoluliluli mālie ʻia ka papa ma 37 ° C no 30 mau minuke. E hoʻomoʻi i ka wai hoʻonā a holoi i nā pūnāwai 5 manawa me 350 µl o ka wai holoi holoi 1X. E hoʻohui i 90 µl o ka substrate solution i kēlā me kēia pūnāwai a hoʻopaʻa i ka pā. Hoʻopili i ka pā ma 37 ° C no 10-20 mau minuke. E hoʻohui i 50 µl Stop Solution i kēlā me kēia pūnāwai. Ua ana koke ʻia ka pā me ka Cytation (BioTek) plate reader i hoʻonohonoho ʻia ma 450 nm.
Ua hana ʻia nā kānana mana e koho i ka nui o ka hui e hāʻawi ai i ka mana> 80% e ʻike i kahi hoʻololi piha ʻana o 10% i ka ʻāpana me kahi helu hewa 5% Type I. Ua hana ʻia nā kānana mana e koho i ka nui o ka hui e hāʻawi ai i ka mana> 80% e ʻike i kahi hoʻololi piha ʻana o 10% i ka ʻāpana me kahi helu hewa 5% Type I. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Hana ʻia ka nānā ʻana i ka mana no ke koho ʻana i ka nui o ka hui e hāʻawi ai i ka mana> 80% e ʻike ai i ka 10% hoʻololi ʻokoʻa piha me ka 5% Type I error rate.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I功效以检测参数中10％绝对变化和5％I小田金。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I功效以检测参数中10％绝对变化和5％I小田金。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаругложлениа изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Ua hana ʻia kahi loiloi mana no ke koho ʻana i ka nui o ka hui e hāʻawi i ka mana> 80% e ʻike ai i ka 10% hoʻololi hoʻololi pono a me 5% ʻano helu hapa I.Ua koho wale ʻia nā ʻāpana kiko ma mua o ka hoʻokolohua. He makapō nā hōʻike a pau a ua unuhi ʻia nā laʻana ma hope o ke kālailai ʻia ʻana o nā ʻikepili āpau. Ua hoʻohana ʻia ka polokalamu GraphPad Prism (San Diego, CA) e hana i nā ʻikepili helu āpau. No nā helu helu a pau, ua manaʻo nui ʻia nā p-waiwai ma nā waiwai <0.05. No nā helu helu āpau, ua manaʻo nui ʻia nā p-values ​​i nā waiwai <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. No nā helu helu āpau, ua manaʻo nui ʻia nā p-values ​​i nā waiwai <0.05.对于所有统计数据，p 值在会<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在会<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. No nā helu helu āpau, ua manaʻo nui ʻia nā p-values ​​i nā waiwai <0.05.Ua hana ʻia ka hoʻāʻo-t a ka Haumāna huelo ʻelua ma ka ʻikepili me nā hoʻohālikelike 2 wale nō. Ua hoʻohana ʻia ʻo ANOVA hoʻokahi ala a ʻelua ala paha e hoʻoholo ai i ke koʻikoʻi ma waena o nā hui lehulehu. I ka hana ʻana i nā hoʻāʻo post hoc, ua hoʻohana ʻia ka hoʻoponopono ʻana a Tukey i ka helu no nā hoʻohālikelike lehulehu. Loaʻa i ka ʻikepili RNAsec nā manaʻo helu helu kūikawā i ka helu ʻana i ka FDR a me ka p.adjust e like me ka mea i wehewehe ʻia ma ka ʻāpana Methods.
No ka ʻike hou aku e pili ana i ka hoʻolālā haʻawina, e ʻike i ka abstract Nature Research Report i pili i kēia ʻatikala.