Grazie per visità Nature.com.A versione di u navigatore chì aduprate hà un supportu CSS limitatu.Per a megliu sperienza, ricumandemu chì utilizate un navigatore aghjurnatu (o disattivà u Modu di Compatibilità in Internet Explorer).Intantu, per assicurà un supportu cuntinuatu, renderemu u situ senza stili è JavaScript.
Ci hè bisognu di un sistema in vitro affidabile chì pò ripruduce accuratamente l'ambiente fisiulogicu di u core per a prova di droga.A dispunibilità limitata di i sistemi di cultura di tissuti cardiaci umani hà purtatu à interpretazioni imprecisi di l'effetti di a droga cardiaca.Quì, avemu sviluppatu un mudellu di cultura di tissuti cardiaci (CTCM) chì stimula electromechanically fette di cori è sottumette un stretchu fisiologicu durante e fasi sistolica è diastolica di u ciclu cardiacu.Dopu à 12 ghjorni di cultura, stu approcciu hà migliuratu parzialmente a viabilità di e rùbbriche di cori, ma ùn hà micca priservatu cumplettamente a so integrità strutturale.Dunque, dopu a screening di picculi molecule, truvamu chì l'aghjunzione di 100 nM triiodothyronine (T3) è 1 μM dexamethasone (Dex) à u nostru mediu mantene a microstruttura di e sezioni per 12 ghjorni.In cumbinazione cù u trattamentu T3 / Dex, u sistema CTCM hà mantinutu i profili di trascrizzione, a viabilità, l'attività metabolica è l'integrità strutturale à u listessu livellu di u tissutu cori frescu per 12 ghjorni.Inoltre, l'allungamentu eccessivu di u tessulu cardiacu in a cultura induce a signalazione cardiaca ipertrofica, chì furnisce evidenza per l'abilità di CTCM per imità e cundizioni ipertrofiche indotte da stiramento cardiacu.In cunclusioni, CTCM pò mudificà a fisiologia è a fisiopatologia di u cori in cultura per longu periudi di tempu, chì permette un screening affidabile di droga.
Prima di a ricerca clinica, sò necessarii sistemi in vitro affidabili chì ponu riproduce accuratamente l'ambiente fisiulogicu di u core umanu.Tali sistemi duveranu imite u stretchamentu meccanicu alteratu, a freccia cardiaca è e proprietà elettrofisiologiche.I mudelli animali sò comunmente usati cum'è una piattaforma di screening per a fisiologia cardiaca cù affidabilità limitata in riflettendu l'effetti di droghe in u core umanu1,2.In ultimamente, u Modellu Sperimentale di Cultura di Tessulu Cardiacu Ideale (CTCM) hè un mudellu assai sensibile è specificu per diverse intervenzioni terapeutiche è farmacologiche, riproducendu accuratamente a fisiologia è a fisiopatologia di u core umanu3.L'absenza di un tali sistema limita a scuperta di novi trattamenti per l'insufficienza cardiaca4,5 è hà purtatu à a cardiotoxicità di a droga cum'è un mutivu maiò per esce da u mercatu6.
In l'ultima decada, ottu droghe non-cardiovascular sò state ritirate da l'usu clinicu perchè causanu un allungamentu di l'intervallu QT chì porta à aritmie ventriculari è morte subita7.Cusì, ci hè una necessità crescente di strategie di screening preclinicu affidabile per valutà l'efficacità è a toxicità cardiovascular.L'usu recente di cardiomiociti derivati ​​da cellule staminali pluripotenti indotte da l'omu (hiPS-CM) in u screening di droga è e teste di toxicità furnisce una suluzione parziale à stu prublema.In ogni casu, a natura immatura di hiPS-CM è a mancanza di cumplessità multicellulare di u tessulu cardiacu sò limitazioni maiò di stu metudu.Studi recenti anu dimustratu chì sta limitazione pò esse in parte superata cù l'usu di l'hiPS-CM iniziale per furmà l'idrogeli di tissuti cardiachi pocu dopu l'iniziu di cuntrazzioni spontanee è aumentendu gradualmente l'estimulazione elettrica cù u tempu.Tuttavia, sti microtissues hiPS-CM mancanu di e proprietà elettrofisiologiche mature è contractile di u miocardiu adultu.Inoltre, u tessulu cardiacu umanu hà una struttura più cumplessa, custituita da una mistura eterogenea di diversi tipi di cellule, cumprese cellule endoteliali, neuroni è fibroblasti stromali, interconnessi da setti specifichi di proteine ​​​​di matrice extracellulare.Questa eterogeneità di pupulazioni non-cardiomiocyte11,12,13 in u core di mammiferi adulti hè una grande barriera per a modellazione di u tessulu cardiacu utilizendu tipi di cellule individuali.Queste limitazioni maiò enfatizanu l'impurtanza di sviluppà metudi per cultivà u tessulu miocardicu intactu in cundizioni fisiologiche è patologiche.
Sections fines cultivate (300 µm) di u core umanu anu dimustratu esse un mudellu promettente di miocardiu umanu intactu.Stu metudu furnisce l'accessu à un sistema multicellulare 3D cumpletu simili à u tessulu di u cori umanu.In ogni casu, finu à u 2019, l'usu di sezioni di cori cultivati ​​era limitatu da a sopravvivenza di a cultura curta (24 h).Questu hè duvuta à una quantità di fatturi chì includenu a mancanza di stretchamentu fisicu-mecànicu, l'interfaccia aria-liquidu, è l'usu di media simplici chì ùn sustene micca i bisogni di u tessulu cardiacu.In u 2019, parechji gruppi di ricerca anu dimustratu chì l'incorporazione di fatturi meccanichi in i sistemi di cultura di tissuti cardiaci pò allargà a vita di a cultura, migliurà l'espressione cardiaca è imite a patologia cardiaca.Dui studii eleganti 17 è 18 mostranu chì a carica meccanica uniaxial hà un effettu pusitivu nantu à u fenotipu cardiacu durante a cultura.In ogni casu, sti studii ùn anu micca utilizatu a carica fisico-meccanica tridimensionale dinamica di u ciculu cardiacu, postu chì e rùbbriche di cori sò stati carricati cù forze di tensione isometrica 17 o carica auxotonica lineale 18 .Questi metudi di stiramentu di tissuti anu risultatu in a suppressione di parechji geni cardiaci o l'espressione di i geni assuciati cù risposti di stretchamentu anormali.In particulare, Pitoulis et al.19 hà sviluppatu un bagnu di cultura dinamica di fette di cori per a ricustruzzione di u ciclu cardiacu utilizendu feedback di trasduttori di forza è unità di tensione.Ancu s'ellu stu sistema permette un mudellu di ciculu cardiacu in vitro più precisu, a cumplessità è a bassa produzzione di u metudu limita l'applicazione di stu sistema.U nostru laburatoriu hà sviluppatu recentemente un sistema di cultura simplificatu cù l'estimulazione elettrica è un mediu ottimizatu per mantene a viabilità di e sezioni di u tessulu di u cori porcinu è umanu finu à 6 ghjorni20,21.
In u manuscrittu attuale, descrivimu un mudellu di cultura di tissuti cardiaci (CTCM) utilizendu sezzioni di u cori porcinu chì incorpora cues umorali per recapitulà a fisiologia cardiaca tridimensionale è a distensione fisiopatologica durante u ciclu cardiacu.Stu CTCM pò aumentà l'accuratezza di a prediczione preclinica di droghe à un livellu mai ottinutu, furnisce un sistema cardiacu di u costu mediu, chì imita a fisiologia / fisiopatologia di u core di i mammiferi per a prova di droga preclinica.
I signali meccanichi emodinamici ghjucanu un rolu criticu in u mantenimentu di a funzione di cardiomiociti in vitro 22,23,24.In u manuscrittu attuale, avemu sviluppatu un CTCM (Figura 1a) chì pò imite l'ambiente cardiacu adultu inducendu stimulazione elettrica è meccanica à frequenze fisiologiche (1.2 Hz, 72 battiti per minutu).Per evitari l'allungamentu di tissutu eccessivu durante a diastole, un dispositivu di stampa 3D hè stata utilizata per aumentà a dimensione di tissutu da 25% (Fig. 1b).U pacing elettricu indottu da u sistema C-PACE hè statu cronometratu per inizià 100 ms prima di sistole utilizendu un sistema di acquisizione di dati per riproduce cumplettamente u ciculu cardiacu.U sistema di cultura di tissuti usa un attuatore pneumaticu programabile (LB Engineering, Germania) per espansione ciclicamente una membrana di silicone flexible per causà espansione di e fette di cori in a camera superiore.U sistema hè stata cunnessu à una linea di l'aria esterna per un transducer di pressione, chì hà permessu di aghjustà accuratamente a pressione (± 1 mmHg) è u tempu (± 1 ms) (Fig. 1c).
a Attach the tissue section to the 7 mm support ring, shown in blue, inside the culture chamber of the device.A camera di cultura hè separata da a camera d'aria da una fina membrana di silicone flexible.Pone una guarnizione trà ogni camera per prevene perdite.A tapa di u dispusitivu cuntene elettrodi di grafite chì furnisce stimulazione elettrica.b Rappresentazione schematica di u dispusitivu di tissutu grande, anellu di guida è anellu di supportu.E rùbbriche di tissuti (marroni) sò posti nantu à u dispusitivu oversized cù l'anellu di guida pusatu in a groove nantu à a riva esterna di u dispusitivu.Utilizendu a guida, mette cù cura l'anellu di supportu rivestitu cù l'adesivo acrilicu di tissutu nantu à a seccione di tissutu cardiacu.c Graficu chì mostra u tempu di stimulazione elettrica in funzione di a pressione di a camera d'aria cuntrullata da un attuatore pneumaticu programabile (PPD).Un dispositivu di acquisizione di dati hè stata utilizata per sincronizà a stimulazione elettrica cù sensori di pressione.Quandu a pressione in a camera di cultura righjunghji u limitu stabilitu, un signalu di impulsu hè mandatu à u C-PACE-EM per attivà a stimulazione elettrica.d Image di quattru CTCM pusati nantu à un riposu di l'incubatore.Quattru apparecchi sò cunnessi à un PPD via un circuitu pneumaticu, è i sensori di pressione sò inseriti in a valvula hemostatica per monitorizà a pressione in u circuitu pneumaticu.Ogni dispusitivu cuntene sei sezzioni di tissuti.
Utilizendu un unicu attuatore pneumaticu, pudemu cuntrullà i dispusitivi 4 CTCM, chì ognuna puderia cuntene 6 sezzioni di tissuti (Fig. 1d).In CTCM, a pressione di l'aria in a camera d'aria hè cunvertita in pressione sincrona in a camera di fluidu è induce l'espansione fisiologica di a fetta di cori (Figura 2a è Movie Supplementary 1).Evaluazione di l'allungamentu di tissutu à 80 mm Hg.Art.dimustrava stretching di sezzioni di tissuti da 25% (Fig. 2b).Stu trattu percentuale hè statu dimustratu per currisponde à una lunghezza di sarcomere fisiologica di 2,2-2,3 µm per a contractility normale di a sezione cardiaca17,19,25.U muvimentu di u tissutu hè statu valutatu utilizendu paràmetri di càmera persunalizati (Figura supplementaria 1).L'amplitude è a velocità di u muvimentu di u tissutu (Fig. 2c, d) currispondenu à stende durante u ciculu cardiacu è u tempu durante a sistole è a diastole (Fig. 2b).Stretch and rapidità di u tessulu cardiacu durante a cuntrazione è a rilassazione sò stati custanti per 12 ghjorni in cultura (Fig. 2f).Per evaluà l'effettu di l'estimulazione elettrica nantu à a contractility durante a cultura, avemu sviluppatu un metudu per a determinazione di a deformità attiva utilizendu un algoritmu di ombrezza (Figura Supplementaria 2a, b) è pudemu distingue entre deformità cù è senza stimulazione elettrica.A stessa seccione di u core (Fig. 2f).In a regione mobile di u cut (R6-9), a tensione durante l'estimulazione elettrica era 20% più altu ch'è in l'absenza di stimulazione elettrica, chì indica a cuntribuzione di l'estimulazione elettrica à a funzione contractile.
Tracce rapprisintanti di a pressione di a camera di l'aria, a pressione di a camera di fluidu, è e misurazioni di u muvimentu di u tissue cunfirmanu chì a pressione di a camera cambia a pressione di a camera di fluidu, causannu un muvimentu currispundente di a fetta di tissutu.b Tracce rapprisintanti di u percentu di stretchimentu (blu) di e rùbbriche di tissuti chì currispondenu à u percentu di stretch (aranciu).c U muvimentu misuratu di a fetta cardiaca hè coherente cù a velocità misurata di u muvimentu.(d) Traiettorie rappresentative di u muvimentu cíclicu (linea blu) è a velocità (linea punteggiata aranciu) in una fetta di u core.e Quantificazione di u tempu di ciclu (n = 19 fette per gruppu, da diversi porchi), u tempu di cuntrazione (n = 19 fette per gruppu), u tempu di rilassazione (n = 19 fette per gruppu, da diversi porchi), u muvimentu di tissutu (n = 25).fette)/gruppu da diversi porchi), a velocità sistolica piccu (n = 24(D0), 25(D12) fette/gruppu da diversi porchi) è a rata di rilassazione massima (n=24(D0), 25(D12) fette/gruppu da diversi porchi).U test t di Studente à dui coda ùn hà mostratu nisuna differenza significativa in alcun paràmetru.f Tracce d'analisi di strain rapprisentanti di sezzioni di tissuti cù (russu) è senza (blu) stimulazione elettrica, dece zoni regiunale di sezzioni di tissuti da a listessa sezione.I pannelli di fondu mostranu a quantificazione di a diffarenza percentuale in a tensione in sezzioni di tissuti cù è senza stimulazione elettrica in deci spazii da diverse sezioni. (n = 8 fette/gruppu da diversi porchi, u test t-Student à dui coda hè realizatu; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = 8 fette/gruppu da diversi porchi, u test t-Student à dui coda hè realizatu; ****p <0.0001, **p <0.01, *p <0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; *****p<0,1,<p<0,1,<p<0,00,<p<p<0,100). (n = 8 sezioni/gruppu da diversi porchi, test t di Studente à duie code; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.01，*p < 0.01，*p （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.01，*p < 0.01，*p (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *5). (n = 8 sezioni / gruppu, da diversi porchi, test t di Studente à duie code; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).E barre d'errore rapprisentanu a media ± deviazione standard.
In u nostru sistema di cultura di fette di cori biomimeticu staticu precedente [20, 21], avemu mantinutu a viabilità, a funzione è l'integrità strutturale di e fette di cori per 6 ghjorni, appliendu stimulazione elettrica è ottimizendu a cumpusizioni media.In ogni casu, dopu à 10 ghjorni, sti figuri sò cascati bruscamente.Avemu da riferite à e rùbbriche cultivate in u nostru sistema di cultura biomimetica statica precedente 20, 21 cundizioni di cuntrollu (Ctrl) è avemu aduprà u nostru mediu ottimisatu prima cum'è cundizioni MC è cultura sottu stimulazione meccanica è elettrica simultanea (CTCM).chjamatu.Prima, avemu determinatu chì l'estimulazione meccanica senza stimulazione elettrica era insufficiente per mantene a viabilità di u tissutu per i ghjorni 6 (Figura Supplementaria 3a, b).Curiosamente, cù l'intruduzioni di stimulazione fisio-meccanica è elettrica chì utilizanu STCM, a viabilità di e rùbbriche di cori di 12-ghjornu hè stata a stessa cum'è in sezzioni di cori freschi in cundizioni MS, ma micca in cundizioni Ctrl, cum'è mostratu da l'analisi MTT (Fig. 1).3a).Questu suggerisce chì l'estimulazione meccanica è a simulazione di u ciculu cardiacu ponu mantene e sezioni di tissuti viable per duie volte più di quantu informatu in u nostru sistema di cultura statica precedente.In ogni casu, a valutazione di l'integrità strutturale di e sezioni di tissuti da l'immunolabelling di a troponina T cardiaca è a connexin 43 hà dimustratu chì l'espressione di connexin 43 era significativamente più altu in i tessuti MC in u ghjornu 12 cà in i cuntrolli in u stessu ghjornu.In ogni casu, l'espressione uniforme di connexin 43 è a furmazione di Z-disc ùn sò micca stati mantinuti (Fig. 3b).Utilizemu un quadru di intelligenza artificiale (AI) per quantificà l'integrità strutturale di tissuti26, un pipeline di apprendimentu profondu basatu in l'imaghjini basatu in troponin-T è colorazione di connexin43 per quantificà automaticamente l'integrità strutturale è a fluorescenza di fette di cori in termini di forza di localizazione.Stu metudu usa una Rete Neurale Convoluzionale (CNN) è un quadru di apprendimentu prufondu per quantificà in modu affidabile l'integrità strutturale di u tessulu cardiacu in modu automatizatu è imparziale, cum'è descrittu in a riferenza.26. U tissutu MC hà dimustratu una similitudine strutturale mejorata à u ghjornu 0 cumparatu cù e sezioni di cuntrollu staticu.Inoltre, a tintura trichrome di Masson hà revelatu un percentinu significativamente più bassu di fibrosi in cundizioni MS cumparatu cù e cundizioni di cuntrollu in u ghjornu 12 di cultura (Fig. 3c).Mentre chì CTCM hà aumentatu a viabilità di e sezioni di u tessulu di u cori à u ghjornu 12 à un livellu simili à quellu di u tessulu di u cori frescu, ùn hà micca migliurà significativamente l'integrità strutturale di e sezioni di u cori.
un graficu à barre mostra a quantificazione di a viabilità MTT di fette di cori freschi (D0) o di colti di fette di cori per 12 ghjorni sia in cultura statica (D12 Ctrl) sia in CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 Ctrl, MC), 12 (D12 MC, MC) in un modu differente da a prova #; 0,0001 paragunatu à D0 è **p <0,01 cumparatu à D12 Ctrl). un graficu à barre mostra a quantificazione di a viabilità MTT di fette di cori freschi (D0) o di colti di fette di cori per 12 ghjorni sia in cultura statica (D12 Ctrl) sia in CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 Ctrl MC), 12 (D12 Ctrl MC, test NOVA, in un modu differente da a prova # pigs/gruppu # NOVA) < 0,0001 paragunatu à D0 è ** p < 0,01 paragunatu à D12 Ctrl).l'istogramma mostra a quantificazione di a viabilità di e sezioni di cori freschi MTT (D0) o di a cultura di sezioni di cori per 12 ghjorni in cultura statica (control D12) o CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (control D12).####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0,0001 paragunatu à D0 è **p <0,01 paragunatu à D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏刿燃脏切燉燃脏切燉爇切养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测#0#0. 001，与D12 Ctrl 相比，**p <0.01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏刌新鲜心脏刪燐燉脏刌捇燉脏刌显示在静态培养的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl ，**比。istogramma chì mostra a quantificazione di a viabilità di MTT in sezioni di cori freschi (D0) o sezioni di cori cultivate per 12 ghjorni in cultura statica (control D12) o CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (control D12)), 12 (D12 MC) sezioni / gruppu da teste ANOVA in una sola via;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0.0001 paragunatu à D0, **p <0.01 paragunatu à D12 Ctrl).b Troponina-T (verde), connexina 43 (rossa) è DAPI (blu) in sezioni cardiache appena isolate (D0) o sezioni cardiache coltivate in condizioni statiche (Ctrl) o condizioni CTCM (MC) per 12 giorni) di immagini rappresentative di immunofluorescenza (scala vuota = 100 µm). A quantificazione di l'intelligenza artificiale di l'integrità strutturale di u tessulu cardiacu (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fette / gruppu ognuna da diversi porchi, test ANOVA unidirezionale hè realizatu; ####p <0.0001 paragunatu à D0 è ****p <0.001 Ctrtrl). Quantificazione di l'intelligenza artificiale di l'integrità strutturale di u tessulu cardiacu (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fette / gruppu ognuna da diversi porchi, test ANOVA unidirezionale hè realizatu; ####p <0.0001 paragunatu à D0 è ****p <0.0001 paragunatu à D10). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектой целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n) , (D12), (D12), (D12), (D12), (D1) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравненится однофакторный тест ANOVA ; ию с D12 Ctrl). Quantificazione di l'integrità strutturale di u tessulu cardiacu da l'intelligenza artificiale (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sezioni / gruppi da diversi porchi, test ANOVA unidirezionale realizatu; ####p <0.0001 vs. cù D0 è ****p <0.0001 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fette/gruppo ciascuno di diversi maiali, test ANOVA unidirezionale <1 人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fette/gruppu ciascuna di diverse porci, test unidirezionale ANOVAp0 人工智; ，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной тка7н (D12), (D12), =77 (D12) MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Д0 Дозных свиней, односторонний тест ANOVA; с D12 Ctrl). Intelligenza artificiale per quantificà l'integrità strutturale di u tessulu cardiacu (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sezioni / gruppu ognuna di diversi porchi, test ANOVA unidirezionale; ####p<0.0001 vs. c Immagini rappresentative (a sinistra) e quantificazione (a destra) per fette di cuore colorate con colorazione tricromatica di Masson (scala nuda = 500 µm) (n = 10 fette/gruppo ciascuna da diversi porci, test ANOVA unidirezionale; ####p < 0.0001 paragunatu à D0 è D0. c Immagini rappresentative (a sinistra) e quantificazione (a destra) per fette di cuore colorate con colorazione tricromatica di Masson (scala nuda = 500 µm) (n = 10 fette/gruppo ciascuna da diversi porci, test ANOVA unidirezionale; #### p < 0.0001 paragunatu à D0 à D0.0. c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца сердца, охрымынца охрынца сителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свинтей, вестоня, вестоно ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Immagini rappresentative (a sinistra) e quantificazione (a destra) di sezioni cardiache colorate con colorazione tricromatica di Masson (scala senza rivestimento = 500 µm) (n = 10 sezioni/gruppo da diversi porci, test ANOVA unidirezionale eseguito; #### p < 0.0001 paragunatu à D0 è *** 2 p < 0.0001 paragunatu à D0.1001). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尪（裸尺化（右）（裸尪（裸尺010µ=（裸尺010µ0切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比与D0 相比与D0 相比，D***0，，***01 。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度尺度 尺度度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova 组 每 不同 猪 ， 进行 单向 单向 Anova ，#0.相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца сердца, окличественный анализ (справа) срезов сердца, окрамы сителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, просод свиньи, просод прозов/группа факторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению Crсl). c Immagini rappresentative (a sinistra) e quantificazione (a destra) di sezioni di cori macchiate con colorazione tricromatica di Masson (bianco = 500 µm) (n = 10 sezioni/gruppo, ciascuna da un porco differente, testata per analisi unidirezionale di varianza; ### # p < 0,0001 paragunatu à D0, *** 0 p < 0,0 *** 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 2, 3).E barre d'errore rapprisentanu a media ± deviazione standard.
Avemu l'ipotesi chì aghjunghjendu picculi moleculi à u mediu di cultura, l'integrità di i cardiomiociti puderia esse migliurata è u sviluppu di fibrosi ridutta durante a cultura CTCM.Avemu dunque screened for small molécules usendu e nostre culture di cuntrollu staticu20,21 per via di u picculu numeru di fattori di cunfusione.Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3) è SB431542 (SB) sò stati scelti per questa pantalla.Queste piccule molécule sò state aduprate prima in i culturi hiPSC-CM per induce a maturazione di i cardiomiociti aumentendu a lunghezza di sarcomere, i tubuli T è a velocità di cunduzzione.Inoltre, Dex (un glucocorticoide) è SB sò cunnisciuti per supprime l'inflammazione29,30.Dunque, avemu pruvatu s'ellu l'inclusione di una o una cumminazione di sti picculi molécule migliurà l'integrità strutturale di e sezioni di u cori.Per u screening iniziale, a dosa di ogni compostu hè stata selezziunata in basa di e cuncentrazioni cumunimenti utilizati in mudelli di cultura cellulare (1 μM Dex27, 100 nM T327 è 2.5 μM SB31).Dopu à 12 ghjorni di cultura, a cumminazzioni di T3 è Dex hà risultatu in una integrità strutturale di cardiomiociti ottimali è un rimodellu fibru minimu (Figure supplementari 4 è 5).Inoltre, l'usu di doppiu o doppiu sti cuncentrazioni di T3 è Dex hà pruduciutu effetti deleteriu cumparatu cù cuncentrazione normale (Figura Supplementaria 6a, b).
Dopu a screening iniziale, avemu realizatu un paraguni testa à testa di e cundizioni di cultura 4 (Figura 4a): Ctrl: sezioni di cori cultivate in a nostra cultura statica descritta prima utilizendu u nostru mediu ottimisatu;20.21 TD: T3 è Ctrl s Added Dex u marcuri;MC: sezioni di cori cultivate in CTCM cù u nostru mediu ottimisatu prima;è MT: CTCM cù T3 è Dex aghjuntu à u mediu.Dopu à 12 ghjorni di cultivazioni, a viabilità di i tissuti MS è MT hè stata a stessa cum'è in tissuti freschi evaluati da l'assay MTT (Fig. 4b).Curiosamente, l'aghjunzione di T3 è Dex à i culturi di transwell (TD) ùn hà micca risultatu in una mellura significativa in a viabilità cumparatu cù e cundizioni Ctrl, chì indicanu un rolu impurtante di l'estimulazione meccanica in u mantenimentu di a viabilità di e sezioni di cori.
un Diagramma di cuncepimentu sperimentale chì rapprisenta e quattru cundizioni di cultura utilizati per evaluà l'effetti di l'estimulazione meccanica è a supplementazione T3/Dex nantu à u mediu per 12 ghjorni. b Un graficu a barre mostra a quantificazione di a viabilità 12 ghjorni dopu à a cultura in tutte e 4 cundizioni di cultura (Ctrl, TD, MC è MT) cumparatu cù fette di cori fresche (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD è D12 MT), 12 (D12 TD, MC, è MT) sò eseguiti in una prova differente da A#p#g#p; 0.0001, ###p <0.001 paragunatu à D0 è **p <0.01 paragunatu à D12 Ctrl). b Un graficu a barre mostra a quantificazione di a viabilità 12 ghjorni dopu à a cultura in tutte e 4 cundizioni di cultura (Ctrl, TD, MC è MT) cumparatu cù fette di cori fresche (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD è D12 MT), 12 (D12 TD, MC, è MT) sò eseguiti in una prova differente da A#p#g#p; 0.0001, ###p <0.001 paragunatu à D0 è **p <0.01 paragunatu à D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после венную оценку жизнеспособности через 12 дней после венную кулроьва ви4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (D0) (Dn1, D18), =1 (D18) (D18) 12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 сорнх 0,0001 0,0001 p < 0,0001 D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b U graficu à barre mostra a quantificazione di viabilità à 12 ghjorni dopu à a cultura in tutte e 4 cundizioni di cultura (controllu, TD, MC, è MT) paragunatu à e sezioni di cori freschi (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, è D12 MT), 12 (D12 MC) sezioni/gruppi differenti, #0; 1, ###p < 0,001 versus D0 è ** p < 0,01 da paragunatu à D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D152)、D12、D12、D12、和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.0001，##0#p < 0.**D#p. 01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнения сравнения сравнению сравнения ца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD è D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, одноппа, одно,#0#0 одно,#0#0 p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Istogramma chì mostra tutte e 4 cundizioni di cultura (controllu, TD, MC è MT) paragunate à e sezioni di cori freschi (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD è D12 MT), da diversi suini 12 (D12 MC) sezioni/gruppu, test ANOVA unidirezionale <; ##0,<; **p <0,01 versus cuntrollu D12). c Bar graph mostra a quantificazione di u flussu di glucose 12 ghjorni dopu à a cultura in tutte e 4 cundizioni di cultura (Ctrl, TD, MC, è MT) cumparatu cù fette di cori freschi (D0) (n = 6 fette / gruppu da diversi porchi, test ANOVA unidirezionale hè realizatu; ###p <0.001, paragunatu à D0.001, paragunatu à D0. c Bar graph mostra a quantificazione di u flussu di glucose 12 ghjorni dopu à a cultura in tutte e 4 cundizioni di cultura (Ctrl, TD, MC, è MT) cumparatu cù fette di cori freschi (D0) (n = 6 fette / gruppu da diversi porchi, test ANOVA unidirezionale hè realizatu; ###p <0.001, paragunatu à D0.001, paragunatu à D0. c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после ственную оценку потока глюкозы через 12 дней после кульво кулхова овиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 сравнению со свежими сердца (D0) свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравненен1и C. c L'istogramma mostra a quantificazione di u flussu di glucose 12 ghjorni dopu à a cultura in tutte e 4 cundizioni di cultura (controllu, TD, MC è MT) cumparatu cù sezioni di cori freschi (D0) (n = 6 sezioni / gruppu da diversi porchi, test ANOVA unidirezionale realizatu; ###p <0.001 cumparatu à D0 è ***p <Ctrl à D0.102). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 盌柹养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 盌柯1＄囌柯1）糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D1，与D0 ，与D0 *** l 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切 片 切 片 切片片后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， 啵 ， ， ， 啵 ， ， 啧 窌 ， 来自 猪 ， NOVA试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней послественную оценку потока глюкозы через 12 дней послественную оценку 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) / по сравнению со свежими срезами сердца (D0) / по сравнению со свежими срезами сердца (D0) ных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 правнению с D0, ***p < 0,001 по сниро по снир (D). c Histogramma chì mostra a quantificazione di u flussu di glucose à 12 ghjorni dopu à a cultura per tutte e 4 cundizioni di cultura (controllu, TD, MC è MT) cumparatu cù sezioni di cori freschi (D0) (n = 6 sezioni / gruppu, da diversi porchi, unilaterali.d Analisi di strain parcelle di tessuti freschi (blu), ghjornu 12 MC (verde) è ghjornu 12 MT (rossu) in dece punti di sezione di tissuti regiunale (n = 4 fette / gruppu, test ANOVA unidirezionale; ùn ci era micca differenza significativa trà i gruppi).e Trama di vulcanu chì mostra geni espressi di manera differenziale in sezioni di cori freschi (D0) cumparatu cù sezzioni di cori cultivate in cundizioni statiche (Ctrl) o in cundizioni MT (MT) per 10-12 ghjorni.f Heatmap di i geni di sarcomere per e rùbbriche di cori cultivate sottu à ognuna di e cundizioni di cultura.E barre d'errore rapprisentanu a media ± deviazione standard.
A dependenza metabolica da u cambiamentu da l'ossidazione di l'acidu grassu à a glicolisi hè un segnu distintivu di a dediferenciazione di i cardiomiociti.I cardiomiociti immaturi utilizanu principalmente glucose per a produzzione di ATP è anu mitocondri ipoplasichi cù pocu cristae5,32.L'analisi di l'utilizazione di glucose anu dimustratu chì in e cundizioni MC è MT, l'utilizazione di glucose era simile à quella in i tessuti di u ghjornu 0 (Figura 4c).Tuttavia, i campioni Ctrl anu dimustratu un incrementu significativu in l'utilizazione di glucose cumparatu cù u tissutu frescu.Questu indica chì a cumminazzioni di CTCM è T3/Dex aumenta a viabilità di u tissutu è cunserva u fenotipu metabolicu di sezioni di cori cultivati ​​di 12 ghjorni.Inoltre, l'analisi di strain hà dimustratu chì i livelli di strain sò stati listessi in u tessulu di u cori frescu per 12 ghjorni in MT è MS cundizioni (Fig. 4d).
Per analizà l'impattu generale di CTCM è T3 / Dex nantu à u paisaghju trascrizionale globale di u tissutu di fette cardiache, avemu realizatu RNAseq nantu à fette cardiache da tutte e quattru cundizioni di cultura differenti (Dati supplementari 1).Curiosamente, e sezioni MT dimustravanu una somiglianza trascrizionale elevata cù u tissutu di u core frescu, cù solu 16 espressi in modu differenziale da 13,642 geni.In ogni casu, cum'è avemu dimustratu prima, i slices Ctrl mostranu 1229 genes espressi di manera differenziale dopu à 10-12 ghjorni in cultura (Fig. 4e).Questi dati sò stati cunfirmati da qRT-PCR di i geni di cori è fibroblasti (Figura supplementaria 7a-c).Curiosamente, e sezioni Ctrl anu dimustratu a regulazione di i geni di u ciculu cardiacu è di u ciculu cellulare è l'attivazione di i prugrammi di geni infiammatori.Questi dati suggerenu chì a dedifferentiation, chì normalmente si trova dopu à a cultura longu, hè completamente attenuata in cundizioni MT (Figura Supplementaria 8a, b).Un studiu attentu di i genesi di sarcomere hà dimustratu chì solu in cundizioni MT sò i geni chì codificanu u sarcomere (Fig. 4f) è u canali ionicu (Figura Supplementaria 9) cunservati, pruteggendu da a suppressione sottu Ctrl, TD, è cundizioni MC.Questi dati dimustranu chì cù una cumminazione di stimulazione meccanica è umorale (T3/Dex), u transcriptome di fette di cori pò esse simili à fette di cori freschi dopu à 12 ghjorni in cultura.
Queste scuperte trascrizionale sò sustinuti da u fattu chì l'integrità strutturale di i cardiomyocytes in e sezioni di u cori hè megliu cunsirvatu in cundizioni MT per i ghjorni 12, cum'è mostratu da a connexin intacta è localizata 43 (Fig. 5a).Inoltre, a fibrosi in e rùbbriche di cori in e cundizioni di MT hè stata significativamente ridutta cumparatu cù Ctrl è simili à e sezioni di cori freschi (Fig. 5b).Queste dati dimustranu chì a cumminazzioni di stimulazione meccanica è trattamentu T3 / Dex preserva in modu efficace a struttura cardiaca in sezioni di cori in cultura.
a Immagini di immunofluorescenza rappresentative di troponina-T (verde), connexina 43 (rossa) e DAPI (blu) in sezioni cardiache appena isolate (D0) o coltivate per 12 giorni in tutte e quattro le condizioni di cultura di sezione cardiaca (barra di scala = 100 µm).). Quantificazione di l'intelligenza artificiale di l'integrità strutturale di u tessulu cardiacu (n = 7 (D0 è D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC è D12 MT) fette / gruppu da diversi porchi, test ANOVA unidirezionale hè realizatu; ####p < 0,0001 paragunatu à D0 è 0,0 * p < 0,0 * 1, < 0. trl). Quantificazione di l'intelligenza artificiale di l'integrità strutturale di u tessulu cardiacu (n = 7 (D0 è D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC è D12 MT) fette / gruppu da diversi porchi, test ANOVA unidirezionale hè realizatu; #### p < 0,0001 paragunatu à D0 è 0,0 * 1 p < 0,0 * 1, < 0,0 * 1, < 0,0 * 1 p. trl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного = инт12 (D) 5 (D12 TD, D12 MC è D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; ####0 p < проведен однофакторный тест ANOVA; 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Questificazione di l'integretti Strutturale di tessuto artificiale chì prupone l'intelligenza artificiale (n = 7 (DEST 6.05 o **** Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和建廿艺建MT（D12）工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,00001 与D01对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 、 d12 mc） 和 d12 mc）智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相 比 且 0.05 相 比 0.0 比 0.0相比）。Quantificazione di l'integrità strutturale di u tessulu cardiacu utilizendu intelligenza artificiale in diversi porchi (n = 7 (D0 è D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC è D12 MT) sezioni / gruppu) cù una prova ANOVA unidirezionale;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p <0,0001 paragunatu à D0 è *p <0,05 o ****p <0,0001 paragunatu à D12 Ctrl). b Immagini rappresentative e quantificazione per fette di cori macchiate con colorazione tricromatica di Masson (Barra di scala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, e D12 MC), 9 (D12 MT) fette/gruppi da diversi porci, unidirezionale comparato con test ANOVA *** # 0. < 0,001, o ****p < 0,0001 paragunatu à D12 Ctrl). b Immagini rappresentative e quantificazione per fette di cori macchiate con colorazione tricromatica di Masson (Barra di scala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, e D12 MC), 9 (D12 MT) fette/gruppi da diversi porci, unidirezionale comparato con test ANOVA *** # 0. < 0,001, o ****p < 0,0001 paragunatu à D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных трашенных трашенных трашенных траственная оценка срезов сердца а (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от раныно вот разнод сторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ct). b Immagini rappresentative e quantificazione di sezioni cardiache colorate con colorazione tricromatica di Masson (scala bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) sezioni/gruppo da diversi porci, eseguite ANOVA unidirezionale < 0,0 # 0,0 p 0. **** p < 0,0001 versus D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）（D1 TD10、（D1010、（D1010和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；个（D12 MT）切片(组) 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） （ 500 （ （ （ ） （ （ ） rl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析， 分析， 析， 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析， 析， 析， 析） < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных трашенных тросо ая линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / грусиней / грусиней / грусиней / грусиней / груспи, срезов срезов от разных свиней / грусиней / груспи, груспи, груспи, срезов 01 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Immagini rappresentative e quantificazione di sezioni cardiache colorate con tricromo di Masson (scala bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD e D12 MC), 9 (D12 MT) sezioni da diversi porci/gruppi, un metudu ANOVA; ####p <***0. 0.0001 paragunatu à D12 Ctrl).E barre d'errore rapprisentanu a media ± deviazione standard.
Infine, a capacità di CTCM per imite l'ipertrofia cardiaca hè stata valutata da l'aumentu di l'allungamentu di u tissutu cardiacu.In CTCM, a prissioni di a camera d'aria di piccu cresce da 80 mmHg à 80 mmHg.Art.(allungamentu nurmale) finu à 140 mmHg Art.(Fig. 6a).Questu currisponde à un incrementu di 32% in u stretch (Fig. 6b), chì prima era indicatu cum'è u percentualità currispundente necessariu per e rùbbriche di cori per ottene una lunghezza di sarcomere simili à quella vistu in ipertrofia.Stretch and rapidità di u tessulu cardiacu durante a cuntrazzioni è a rilassazione si mantenenu custanti durante sei ghjorni di cultura (Fig. 6c).U tissutu cardiacu da e cundizioni MT hè statu sottumessu à u stretchamentu normale (MT (Normale)) o cundizzioni overstretch (MT (OS)) per sei ghjorni.Dighjà dopu à quattru ghjorni in cultura, u biomarcatore ipertroficu NT-ProBNP era significativamente elevatu in u mediu sottu MT (OS) cundizzioni cumparatu cù MT (normali) cundizioni (Fig. 7a).Inoltre, dopu à sei ghjorni di cultivà, a dimensione di a cellula in MT (OS) (Fig. 7b) hà aumentatu significativamente cumparatu cù sezzioni di u core MT (normale).Inoltre, a traslocazione nucleare NFATC4 hè stata significativamente aumentata in tissuti overstretched (Fig. 7c).Questi risultati mostranu u sviluppu progressivu di remodeling patologicu dopu à iperdistensione è sustene u cuncettu chì u dispusitivu CTCM pò esse usatu cum'è una piattaforma per studià a signalazione di l'ipertrofia cardiaca indotta da stretch.
Tracce rapprisintanti di a pressione di a camera di l'aria, a pressione di a camera di fluidu, è e misurazioni di u muvimentu di u tissue cunfirmanu chì a pressione di a camera cambia a pressione di a camera di fluidu, causannu un muvimentu currispundente di a fetta di tissutu.b Percentuale di allungamentu rapprisentante è curve di tassi di stiratura per sezzioni di tissuti normalmente allungati (aranciu) è soprastesi (blu).c Graficu a barre chì mostra u tempu di u ciculu (n = 19 fette per gruppu, da diversi porchi), u tempu di cuntrazione (n = 18-19 fette per gruppu, da diversi porchi), u tempu di rilassazione (n = 19 fette per gruppu, da diversi porchi) ), l'amplitude di u muvimentu di tissutu (n = 14 fette / gruppu), (n = 14 fette / gruppu, peak = slices / slices, 4 slices / slices differente, 4 slices = 1 slices, 4 da differente porchi) è piccu rilassazione rate (n = 14 (D0), 15 (D6) ) rùbbriche / gruppi) da differente porchi), two-tailed Student's t-test mustrò nuddu diffirenza significativu in ogni paràmetru, indicando chì sti paràmetri ferma custanti duranti 6 ghjorni di cultura cù overvoltage.E barre d'errore rapprisentanu a media ± deviazione standard.
a Bar graph quantification di a cuncentrazione di NT-ProBNP in media di cultura da fette di cori cultivate sottu MT normale stretch (Norm) o overstretching (OS) cundizioni (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, e D4 MTOS) fette / gruppu da diversi porchi, ANOVA bidirezionale hè eseguita < 0; ** 1 p normale). a Bar graph quantification di a cuncentrazione di NT-ProBNP in i media di cultura da fette di cori cultivate in cundizioni MT di stretch normale (Norm) o overstretching (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, e D4 MTOS) fette / gruppu da diversi porchi, ANOVA bidirezionale hè eseguita < 0.** 1p standard.Histogramma quantitativo di a cuncentrazione di NT-ProBNP in u mediu di cultura da fette di cori cultivate in cundizioni di normale MT stretch (norm) o overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, and D4).MTOS) fette / gruppu da diversi porchi, analisi di varianza à dui fattori hè realizatu;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0,01 paragunatu à u stretchu normale). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓坡培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓坡度彄4閄坡培养的心脏(D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分枎，来自不同猪的切片/组，进行双向方差分枎；丣析）攸丯攛攸攛攛0.01）。 a Quantificazione di a concentrazione di NT-ProBNP in fette di cori coltivate in cundizioni MT di stretch normale (Norm) o overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) da diverse 猪的切片/组切片/组，可仑奏叹滄叹滄叹滄; paragunatu cù l'allungamentu normale, p <0.01).histogram Quantification of NT-ProBNP cuncentrazione in fette di cori cultivate in cundizioni di normale MT stretch (norma) o overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) è D4 MTOS) fette / gruppu da diversi porchi, analisi bidirezionale di varianza;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0,01 paragunatu à u stretchu normale). b Imàghjini rapprisentanti per fette di cori macchiate cù troponina-T è WGA (a sinistra) è a quantificazione di a dimensione di e cellule (a destra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellule / gruppu da 10 fette diverse da diversi porchi, u test t-Student Two-tailed hè realizatu; ****0 p < 10 paragunatu à u normale. b Immagini rappresentative per fette di cori macchiate cù troponina-T è WGA (a manca) è a quantificazione di a dimensione di e cellule (a destra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellule / gruppu da 10 fette diverse da diversi porchi, Test t-Student à dui coda hè realizatu; 0****0 p <10 paragunatu à u normale. b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слестова) срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слестова) ения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от срезов от срезов от срезов от веры тся хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Imàghjini rapprisentanti di sezioni di cori macchiate cù troponina-T è AZP (a manca) è a quantificazione di a dimensione di e cellule (a destra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellule / gruppu da 10 sezioni diverse da diversi porchi, a prova t di Studente à dui code hè stata realizata; **** p < 1 0). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表切的代表性30（M ，来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生有尾学生 有尾学生t 棸学生t ，丛锟 漸帛锟 漉棸锟，**** p < 0,0001）。 b Immagini rappresentative di fette di cori macchiate cù calcarein-T è WGA (a sinistra) è a dimensione di a cellula (a destra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 da 10 fette diverse (D6 MTNorm)) Cellule / 组，两方法有尾学compared with standard ，00000000. ). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слестова) сердца размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свируней пи, свируней пи критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Imaghjini rapprisintanti di e rùbbriche di cori macchiati cù troponin-T è AZP (left) è quantificazione di a dimensione di cellula (right) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) da 10 sezioni differenti da diversi porchi) Cells / gruppu, criteriu di dui coda Student's t;**** p < 0,0001 paragunatu à a tensione normale). c Imàghjini rapprisentanti per u ghjornu 0 è u ghjornu 6 fette di cori MTOS immunolabeled per troponin-T è NFATC4 è quantificazione di a traslocazione di NFATC4 à i nuclei di CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fette / gruppu da diversi porchi, * Two-tailed Student t-test hè realizatu.0;05). c Immagini rappresentative per u ghjornu 0 è u ghjornu 6 fette di cori MTOS immunomarcate per troponin-T è NFATC4 è quantificazione di a traslocazione di NFATC4 à i nuclei di CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fette / gruppu da diversi porchi, * Student t-test à dui coda; c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для трозентативных для трозентативных для трозентативные для тропон4, тро-пон и трозентативные енная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу срезов/группу озных онхот овя пыных клеток я двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Immagini rappresentative per e sezioni di cori à 0 è 6 ghjorni MTOS, immunomarcate per troponin-T è NFATC4, è quantificazione di traslocazione NFATC4 in u nucleu di cellule cavernose (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fette / gruppu da diversi porchi) realizatu dui-tested Student's t;*p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表怏，标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表怏囌标记的第的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生双尾学的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生双尾学生t 5锟t 0骀) <0. c Immagini rappresentative di calcanin-T e NFATC4 immunomarcatura fette di cuore 第0天和第6天MTOS, è NFATC4 da diverse quantità NFATC4 易位至CM nucleus cell 的quantità化 (n = 4 (D0), 3 (D6天和第6天天天MTOS,)学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропировки тропозов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропировки тропозов тропоТи 4 енная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два-статры юдента; *p <0,05). c Immagini rappresentative di fette di cori MTOS à u ghjornu 0 è 6 per l'immunomarcazione di troponin-T è NFATC4 è quantificazione di a traslocazione NFATC4 in u nucleu di CM da diversi porchi (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fette / gruppu, t -criterio di dui coda Student's 0.0;E barre d'errore rapprisentanu a media ± deviazione standard.
A ricerca cardiovascular traslazionale richiede mudelli cellulari chì riproducenu accuratamente l'ambiente cardiacu.In questu studiu, un dispositivu CTCM hè statu sviluppatu è carattarizatu chì pò stimulà rùbbriche ultrathin di u core.U sistema CTCM include stimulazione elettromeccanica fisiologicamente sincronizata è arricchimentu di fluidu T3 è Dex.Quandu i sezzioni di cori porcini sò stati esposti à questi fattori, a so viabilità, integrità strutturale, attività metabolica è espressione trascrizionale restanu a stessa cum'è in u tissutu cori frescu dopu à 12 ghjorni di cultura.Inoltre, l'allungamentu eccessivu di u tessulu cardiacu pò causà ipertrofia di u core causata da iperestensione.In generale, questi risultati sustenenu u rolu criticu di e cundizioni di cultura fisiologica in u mantenimentu di un fenotipu cardiacu normale è furnisce una piattaforma per a screening di droga.
Parechji fattori cuntribuiscenu à creà un ambiente ottimali per u funziunamentu è a sopravvivenza di i cardiomiociti.I più evidenti di sti fattori sò ligati à (1) interazzioni intercellulari, (2) stimulazione elettromeccanica, (3) fatturi umorali, è (4) substrati metabolichi.L'interazzione fisiologica cellula à cellula necessitanu reti tridimensionali complesse di tipi multipli di cellule supportate da una matrice extracellulare.Tali interazzioni cellulari cumplessi sò difficiuli di ricustruisce in vitro per co-cultura di tipi di cellule individuali, ma ponu esse facilmente ottenute cù a natura organotipica di e sezioni di cori.
L'allungamentu meccanicu è l'estimulazione elettrica di i cardiomiociti sò critichi per mantene u fenotipu cardiacu33,34,35.Mentre a stimulazione meccanica hè stata largamente usata per u cundizionamentu è a maturazione hiPSC-CM, parechji studii eleganti anu recentemente pruvatu à stimulazione meccanica di fette di cori in cultura cù carica uniaxial.Sti studii mostra chì 2D uniaxial loading miccanicu hà un effettu pusitivu nant'à u fenotipu di u core durante a cultura.In questi studii, e sezioni di u cori sò stati caricati cù forze di tensione isometriche17, carica auxotonica lineale18, o u ciculu cardiacu hè statu ricreatu utilizendu feedback di trasduttore di forza è impulsi di tensione.In ogni casu, sti metudi utilizanu stretchu di tissutu uniaxial senza ottimisazione ambientale, risultatu in a suppressione di parechji geni cardiaci o sopraespressione di geni assuciati à risposti di stretchamentu anormali.U CTCM deskrittu quì furnisce un stimulu elettromeccanicu 3D chì imita u ciculu cardiacu naturali in quantu à u tempu di u ciculu è u stretchamentu fisiulogicu (25% stretch, 40% systole, 60% diastole, è 72 beats per minute).Ancu s'è sta stimulazione meccanica tridimensionale sola ùn hè micca abbastanza per mantene l'integrità di u tissutu, una cumminazione di stimulazione umorale è meccanica cù T3 / Dex hè necessaria per mantene bè a viabilità, a funzione è l'integrità di i tessuti.
I fatturi umorali ghjucanu un rolu impurtante in a modulazione di u fenotipu di u core adultu.Questu hè statu evidenziatu in i studii HiPS-CM in quale T3 è Dex sò stati aghjuntu à i medii di cultura per accelerà a maturazione cellulare.T3 pò influenzà u trasportu di aminoacidi, zuccheri è calciu à traversu a membrana cellulare36.Inoltre, T3 prumove l'espressione MHC-α è a downregulation di MHC-β, prumove a furmazione di miofibrille à contrazione rapida in i cardiomiociti maturi cumparatu cù miofibrille à contrazione lenta in CM fetale.A carenza di T3 in i malati di ipotiroidi si traduce in a perdita di bande miofibrillari è un ritmu ridottu di sviluppu di u tonu37.Dex agisce nantu à i receptori di glucocorticoidi è hè statu dimustratu per aumentà a contractility myocardial in cori perfusi isolati;38 chì sta migliione hè pensata per esse ligata à l'effettu nantu à l'ingressu di calcium deposit-driven entry (SOCE) 39,40.Inoltre, Dex si unisce à i so receptori, causendu una risposta intracellulare larga chì supprime a funzione immune è a inflamazioni30.
I nostri risultati indicanu chì l'estimulazione fisica meccanica (MS) hà migliuratu u rendimentu generale di a cultura cumparatu à Ctrl, ma hà fallutu per mantene a viabilità, l'integrità strutturale è l'espressione cardiaca per 12 ghjorni in cultura.Paragunatu à Ctrl, l'aghjunzione di T3 è Dex à e culturi CTCM (MT) hà migliuratu a viabilità è hà mantinutu profili di trascrizzione simili, integrità strutturale è attività metabolica cù u tissutu cori frescu per 12 ghjorni.Inoltre, cuntrullendu u gradu di stretchamentu di tissutu, un mudellu di ipertrofia cardiaca indotta da iperestensione hè statu creatu cù STCM, illustrandu a versatilità di u sistema STCM.Semu devi esse nutatu chì ancu chì a remodelazione cardiaca è a fibrosi generalmente implicanu organi intactu chì e cellule circulanti ponu furnisce i citocines appropritati è ancu fagocitosi è altri fatturi di rimodulazione, e sezioni di u cori ponu ancu imite u prucessu fibroticu in risposta à u stress è u traumu.in miofibroblasti.Questu hè statu evaluatu prima in stu mudellu di fetta cardiaca.Semu devi esse nutatu chì i paràmetri CTCM ponu esse modulati cambiendu a pressione / amplitude elettrica è a frequenza per simulà parechje cundizioni cum'è tachycardia, bradicardia, è supportu circulatori meccanicu (core senza carica meccanica).Questu fa u sistema un throughput mediu per a prova di droga.L'abilità di CTCM per mudificà l'ipertrofia cardiaca indotta da l'overesertion apre a strada per pruvà stu sistema per a terapia persunalizata.In cunclusioni, u presente studiu dimostra chì u stretchamentu meccanicu è l'estimulazione umorale sò critichi per mantene a cultura di sezioni di tissuti cardiaci.
Ancu s'è i dati presentati quì suggerenu chì CTCM hè una piattaforma assai promettente per u modellu di u miocardiu intactu, stu metudu di cultura hà alcune limitazioni.A limitazione principale di a cultura CTCM hè chì impone tensioni meccaniche dinamiche cuntinui nantu à e fette, chì impediscenu a capacità di monitorà attivamente e cuntrazzioni di fette cardiache durante ogni ciculu.Inoltre, per via di a piccula dimensione di e sezioni cardiache (7 mm), a capacità di evaluà a funzione sistolica fora di i sistemi di cultura cù sensori di forza tradiziunali hè limitata.In u manuscrittu attuale, superemu parzialmente sta limitazione evaluendu a tensione ottica cum'è un indicatore di a funzione contractile.Tuttavia, sta limitazione hà bisognu di più travagliu è pò esse trattatu in u futuru intruducendu metudi per u monitoraghju otticu di a funzione di fette di cori in a cultura, cum'è a mappatura otticu cù calciu è coloranti sensibili à a tensione.Una altra limitazione di CTCM hè chì u mudellu di travagliu ùn manipule micca u stress fisiulogicu (preload and afterload).In CTCM, a pressione hè stata indotta in direzzione opposta per ripruduce u stretchu fisiologicu di 25% in diastole (stretch full) è sistole (lunghezza di cuntrazzioni durante l'estimulazione elettrica) in tissuti assai grande.Questa limitazione deve esse eliminata in i futuri disinni di CTCM da una pressione adeguata nantu à u tessulu cardiacu da i dui lati è da l'applicazione di e relazioni esatta pressione-volume chì si trovanu in e camere di u core.
A rimodellazione indotta da overstretch rappurtata in stu manuscrittu hè limitata à mimicà i segnali ipertrofichi di iperstretch.Cusì, stu mudellu pò aiutà in u studiu di signalazione ipertrofica inducida da stretch-induced senza a necessità di fatturi umorali o neurali (chì ùn esiste micca in questu sistema).Ulteriori studii sò necessarii per aumentà a multiplicità di CTCM, per esempiu, a co-cultura cù e cellule immune, i fatturi umorali di u plasma circulante, è l'innervazione quandu a co-cultura cù e cellule neuronali migliurà e pussibulità di mudeli di malatie cù CTCM.
Tredeci porchi sò stati usati in stu studiu.Tutte e prucedure di l'animali sò stati realizati in cunfurmità cù e linee istituzionali è sò stati appruvati da u Cumitatu Istituziunale di Cura è Uso di l'Animali di l'Università di Louisville.L'arcu aorticu hè statu clampatu è u core hè perfusu cù 1 L di cardioplegia sterile (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH finu à 7,4); i cori sò stati cunservati in una suluzione cardioplegic ghiacciata finu à u trasportu à u labburatoriu nantu à u ghjacciu chì hè di solitu <10 min. i cori sò stati cunservati in una suluzione cardioplegic ghiacciata finu à u trasportu à u labburatoriu nantu à u ghjacciu chì hè di solitu <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на, лчдон на ет <10 мин. i cori sò stati guardati in una suluzione cardioplegic ghiacciata finu à u trasportu à u laboratoriu nantu à u ghjacciu, chì generalmente pigghia <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 Mantene i cori nantu à a cardioplegia di ghiaccio finu à u trasportu à u laboratoriu nantu à u ghjacciu, generalmente <10 min.
U dispusitivu CTCM hè statu sviluppatu in u software SolidWorks di cuncepimentu assistitu da computer (CAD).E camere di cultura, divisori è camere d'aria sò fatti di plastica acrilica trasparente CNC.L'anellu di back-up di 7 mm di diametru hè fattu di polietilene d'alta densità (HDPE) in u centru è hà una scanalatura di o-ring per accoglie l'o-ring di silicone utilizatu per sigillà i media sottu.Una fina membrana di silice separa a camera di cultura da a piastra di separazione.A membrana di silicone hè tagliata à laser da una foglia di silicone di 0,02 "di grossu è hà una durezza di 35A.I guarnizioni di silicone in fondu è in cima sò tagliati à laser da foglia di silicone di 1/16 "di grossu è anu una durezza di 50A.Viti in acciaio inossidabile 316L è dadi alari sò aduprati per attaccà u bloccu è creà un sigillu ermeticu.
Un circuitu stampatu dedicatu (PCB) hè pensatu per esse integratu cù u sistema C-PACE-EM.I sockets di cunnessu di a macchina svizzera nantu à u PCB sò cunnessi à l'elettrodi di grafite da i fili di rame argentati è viti di bronzu 0-60 avvitati in l'elettrodi.U circuitu stampatu hè situatu in a tappa di l'impresora 3D.
U dispusitivu CTCM hè cuntrullatu da un attuatore pneumaticu programabile (PPD) chì crea una pressione circulatoria cuntrullata simile à un ciculu cardiacu.Quandu a prissioni in a camera d'aria aumenta, a membrana di silicone flexible si espansione in u sopra, furzendu u mediu sottu à u situ di tissutu.L'area di u tissutu sarà allora allungata da questa espulsione di fluidu, mimitendu l'espansione fisiologica di u core durante a diastole.À u piccu di rilassazione, l'estimulazione elettrica hè stata appiicata per l'elettrodi di grafite, chì riduce a pressione in a camera d'aria è hà causatu a cuntrazione di e sezioni di tissuti.Dentru a pipa hè una vàlvula hemostatic cun un sensor di pressione per detectà a pressione in u sistema di l'aria.A pressione sensata da u sensoru di pressione hè appiicata à un cullettore di dati cunnessu à u laptop.Questu permette un monitoraghju cuntinuu di a pressione in a camera di gas.Quandu a pressione massima di a camera hè stata righjunta (standard 80 mmHg, 140 mmHg OS), u dispusitivu di acquisizione di dati hè statu urdinatu per mandà un signalu à u sistema C-PACE-EM per generà un signalu di tensione bifasicu per 2 ms, stabilitu à 4 V.
I sezzioni di u cori sò stati ottenuti è e cundizioni di cultura in i pozzi 6 sò stati realizati cum'è seguente: Trasferisce i cori colti da u vasu di trasferimentu à una tavola chì cuntene fretu (4 ° C.) cardioplegia.U ventriculu left hè stata isolata cù una lama sterile è tagliata in pezzi di 1-2 cm3.Questi blocchi di tissuti sò stati attaccati à supporti di tissuti cù adesivu di tissuti è posti in un bagnu di tissuti microtome vibrante chì cuntene a suluzione di Tyrode è ossigenati continuamente (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g) . ), (6 mM-14M KM (8.18 g). ), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M solution), 1,8 mM CaCl2 ( 1,8 ml 1 M suluzione), finu à 1 L ddH2O).U microtomu vibrante hè statu stabilitu per tagliate fette di 300 µm di grossu à una frequenza di 80 Hz, una amplitude di vibrazione horizontale di 2 mm, è una velocità di avanzata di 0,03 mm/s.U bagnu di tissutu hè circundatu di ghiaccio per mantene a suluzione fresca è a temperatura hè stata mantenuta à 4 ° C.Trasferisce e sezioni di tissuti da u bagnu di microtomu à un bagnu d'incubazione chì cuntene una soluzione di Tyrode ossigenata continuamente nantu à u ghjacciu finu à chì abbastanza sezioni sò ottenute per una piastra di cultura.Per i culturi transwell, e sezioni di tissuti sò stati attaccati à supporti di poliuretano sterili di 6 mm di larghezza è posti in 6 ml di mediu ottimizzatu (199 medium, 1x supplement ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkaline è 2X antibiotic-antifungal).L'estimulazione elettrica (10 V, frequenza 1.2 Hz) hè stata appiicata à e sezioni di tissuti attraversu u C-Pace.Per e cundizioni TD, T3 è Dex freschi sò stati aghjuntu à 100 nM è 1 μM à ogni cambiamentu di mediu.U mediu hè saturatu cù l'ossigenu prima di rimpiazzà 3 volte à ghjornu.Sezzioni di tissuti sò stati cultivati ​​in un incubatore à 37 ° C è 5% CO2.
Per i culturi CTCM, e sezioni di tissuti sò stati posti nantu à una stampante 3D customizata in una piastra di Petri chì cuntene a suluzione di Tyrode modificata.U dispusitivu hè pensatu per aumentà a dimensione di a fetta di u core da 25% di l'area di l'anellu di supportu.Questu hè fattu per chì e rùbbriche di u cori ùn si stende micca dopu esse trasferitu da a suluzione di Tyrode à u mediu è durante a diastole.À l'aide de colle histoacrylique, des sections de 300 µm d'épaisseur sont fixées sur un anneau de support de 7 mm de diamètre.Dopu avè aghjustatu e rùbbriche di tissutu à l'anellu di supportu, tagliate l'excedente di rùbbriche di tissutu è rinfriscà e rùbbriche di tissutu attaccati in u bagnu di suluzione Tyrode nantu à u ghjacciu (4 ° C) finu à chì abbastanza rùbbriche sò state preparate per un dispositivu.U tempu tutale di trasfurmazioni per tutti i dispositi ùn deve micca più di 2 ore.Dopu chì 6 sezzioni di tissuti sò stati attaccati à i so anelli di supportu, u dispusitivu CTCM hè statu assemblatu.A camera di cultura CTCM hè pre-piena cù 21 ml di mediu pre-ossigenatu.Trasferisce e rùbbriche di tissutu à a camera di cultura è sguassate cù cura ogni bolle d'aria cù una pipetta.A seccione di tissuti hè allora guidata in u pirtusu è pressatu delicatamente in u locu.Infine, mette u capu di l'elettrodu nantu à u dispusitivu è trasfiriu u dispusitivu à l'incubatore.Allora cunnette u CTCM à u tubu di l'aria è u sistema C-PACE-EM.L'attuatore pneumaticu apre è a valvula d'aria apre u CTCM.U sistema C-PACE-EM hè statu cunfiguratu per furnisce 4 V à 1.2 Hz durante u pacing biphasic per 2 ms.U mediu hè cambiatu duie volte à ghjornu è l'elettrodi sò cambiati una volta à ghjornu per evità l'accumulazione di grafite nantu à l'elettrodi.In casu di necessariu, seccioni di tissuti ponu esse eliminati da i so pozzi di cultura per espulsà ogni bolle d'aria chì pò esse cascatu sottu.Per e cundizioni di trattamentu MT, T3/Dex hè stata aghjunta fresca cù ogni cambiamentu mediu cù 100 nM T3 è 1 μM Dex.I dispusitivi CTCM sò stati cultivati ​​in un incubatore à 37 ° C è 5% CO2.
Per ottene traiettorie allungate di fette di cori, hè statu sviluppatu un sistema di càmera speciale.Una camera SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) hè stata aduprata cù una lente macro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA).A visualizazione hè stata realizata à a temperatura di l'ambienti dopu à rimpiazzà u mediu cù mediu frescu.A camera hè posizionata à un angolo di 51 ° è u video hè registratu à 30 frames per seconda.Prima, u software open source (MUSCLEMOTION43) hè stata utilizata cù Image-J per quantificà u muvimentu di fette di cori.A maschera hè stata creata cù MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) per definisce e regioni d'interessu per batte fette di cori per evità u rumore.E maschere segmentate manualmente sò applicate à tutte l'imaghjini in una sequenza di fotogrammi è poi passate à u plug-in MUSCLEMOTION.Muscle Motion usa l'intensità media di i pixel in ogni quadru per quantificà u so muvimentu relative à u quadru di riferimentu.I dati sò stati arregistrati, filtrati è utilizati per quantificà u tempu di u ciculu è evaluà l'allungamentu di u tissutu durante u ciculu cardiacu.U video arregistratu hè statu post-processatu cù un filtru digitale di fase zero di primu ordine.Per quantificà l'allungamentu di u tissutu (piccu à piccu), l'analisi di piccu à piccu hè stata realizata per distingue trà i picchi è i bassi in u signale registratu.Inoltre, a detrending hè realizatu utilizendu un polinomiu di 6th ordine per eliminà a deriva di u signale.U codice di u prugramma hè statu sviluppatu in MATLAB per determinà u muvimentu di u tissutu globale, u tempu di u ciclu, u tempu di rilassazione è u tempu di cuntrazione (Codice Supplementariu 44).
Per l'analisi di strain, utilizendu i stessi video creati per a valutazione di stretchimentu meccanicu, avemu prima tracciatu duie imagine chì rapprisentanu i picchi di muvimentu (i punti di muvimentu più altu (superior) è più bassu (bassu) secondu u software MUSCLEMOTION.Dopu avemu segmentatu e regioni di tissuti è appiicà una forma d'algoritmu di ombrezza à u tissutu segmentatu (Figura supplementaria 2a).U tissutu segmentatu hè statu divisu in deci subsuperfici, è l'estressi nantu à ogni superficia hè stata calculata cù l'equazione seguente: Strain = (Sup-Sdown) / Sdown, induve Sup è Sdown sò e distanze di a forma da l'ombra superiore è di u fondu di u tela, rispettivamente (Figura Supplementaria .2b).
Sezzioni di u cori sò stati fissi in 4% paraformaldehyde per 48 ore.I tissuti fissi sò stati disidratati in 10% è 20% sucrose per 1 h, dopu in 30% sucrose per a notte.I rùbbriche sò stati poi incrustati in un compostu di temperatura di taglio ottimali (compostu OCT) è gradualmente congelati in un bagnu isopentane / ghiaccio seccu.Conservate i blocchi di incrustazione OCT à -80 ° C finu à a separazione.I diapositivi sò stati preparati cum'è sezioni cù un spessore di 8 μm.
Per caccià l'OCT da e rùbbriche di cori, riscalda i diapositive nantu à un bloccu di calefazione à 95 ° C per 5 min.Aghjunghjite 1 ml di PBS à ogni diapositiva è incubate per 30 minuti à a temperatura di l'ambienti, dopu permeate e sezioni mettendu 0,1% Triton-X in PBS per 15 minuti à a temperatura di l'ambienti.Per prevene l'anticorpi non specifichi di ubligatoriu à a mostra, aghjunghje 1 ml di suluzione 3% BSA à i diapositive è incubate per 1 ora à a temperatura di l'ambienti.U BSA hè stata eliminata è i vetri sò lavati cù PBS.Marca ogni mostra cù un lapis.Anticorpi primari (diluiti 1:200 in 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) è troponina-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) sò stati aggiunti più di 90 minuti, poi anticorpi secondari contra 1148200 (Alexa) (Thermo Scientific; #A16079), contr'à u cunigliu Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) per 90 minuti supplementari Lavatu 3 volte cù PBS Per distinguere a tintura di destinazione da u fondu, avemu usatu solu l'anticorpu secundariu cum'è cuntrollu. Infine, a macchia nucleare DAPI hè stata aghjunta è i diapositivi sò stati posti in un magnificu Laboratoriu è lucidatu. è microscopiu Keyence cù ingrandimentu 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) à 5 μg/ml in PBS hè stata utilizata per a tintura WGA è appiicata à sezioni fissi per 30 minuti à a temperatura di l'ambienti.I diapositivi sò stati poi lavati cù PBS è u Sudan neru hè aghjuntu à ogni slide è incubatu per 30 minuti.I diapositivi sò stati poi lavati cù PBS è u mediu d'incorporazione vectashield hè statu aghjuntu.I diapositivi sò stati visualizati nantu à un microscopiu Keyence à un ingrandimentu 40x.
L'OCT hè stata eliminata da i campioni cum'è descrittu sopra.Dopu avè eliminatu l'OCT, immerse i diapositive in a suluzione di Bouin per a notte.I diapositivi sò stati poi lavati cù l'acqua distillata per 1 ora è dopu posti in una suluzione Bibrich aloe acid fuchsin per 10 minuti.Allora i diapositivi sò lavati cù acqua distillata è posti in una suluzione di 5% fosfomolibdenu / 5% àcitu fosfotungsticu per 10 minuti.Senza risciacquare, trasferisce i diapositivi direttamente in a suluzione anilina blu per 15 minuti.Allora i diapositivi sò lavati cù l'acqua distillata è pusatu in una suluzione di l'acidu acìticu 1% per 2 minuti.I diapositivi sò stati secchi in etanol 200 N è trasferiti à xilene.I diapositivi macchiati sò stati visualizati cù un microscopiu Keyence cù un scopu 10x.U percentualità di l'area di fibrosi hè stata quantificata cù u software Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), numeru di catalogu V13154, secondu u protocolu di u fabricatore cù alcune mudificazioni.In particulare, un punch kirurggicu cù un diametru di 6 mm hè stata utilizata per assicurà a dimensione di tissutu uniforme durante l'analisi MTT.I tissuti sò stati individualmente placcati in i pozzi di una piastra di 12 pozzi chì cuntene sustrato MTT secondu u protocolu di u fabricatore.I rùbbriche sò incubati à 37 ° C. per l'ora di 3 è u tessulu vivu metabolizeghja u sustrato MTT per furmà un compostu formazan purple.Sustituisci a suluzione MTT cù 1 ml DMSO è incubate à 37 ° C per 15 minuti per caccià u formazan viola da e sezioni di cori.I campioni sò stati diluiti 1:10 in DMSO in 96 pozzetti di fondu chjaru è l'intensità di u culore viola misurata à 570 nm cù un lettore di piastra Cytation (BioTek).Lettura sò nurmalizzati à u pesu di ogni fetta di u core.
I media di fette di cori sò stati rimpiazzati cù media chì cuntenenu 1 μCi/ml [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) per l'analisi di l'utilizazione di glucose cum'è descrittu prima.Dopu à 4 ore di incubazione, aghjunghje 100 µl di medium à un tubu di microcentrifuga aperta chì cuntene 100 µl di HCl 0,2 N.Allora u tubu hè stata postu in un tubu di scintillazione chì cuntene 500 μl di dH2O per evaporà [3H]2O per 72 ore à 37 ° C.Allora sguassate u tubu di microcentrifuge da u tubu di scintillazione è aghjunghje 10 ml di fluidu di scintillazione.I conte di scintillazione sò stati realizati cù un analizzatore di scintillazione liquida Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA).L'utilizazione di u glucose hè stata calculata in cunsiderà l'attività specifica di [5-3H]-glucose, l'equilibriu incompletu è u fondu, a diluzione di [5-3H]-à glucose senza marcatu, è l'efficienza di u contatore di scintillazione.I dati sò nurmalizzati à a massa di rùbbriche di u core.
Dopu l'omogeneizazione di tissuti in Trizol, l'RNA hè statu isolatu da e sezioni di cori utilizendu u Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 secondu u protocolu di u fabricatore.A preparazione di a biblioteca di RNAsec, a sequenza è l'analisi di dati sò state realizate cume:
1 μg di RNA per mostra hè stata utilizata cum'è materiale di partenza per a preparazione di a biblioteca di RNA.Biblioteche di sequenza sò stati generati utilizendu u Kit di Preparazione di Biblioteche RNA NEBNext UltraTM per Illumina (NEB, USA) in seguitu à i cunsiglii di u fabricatore, è i codici d'indici sò stati aghjuntu à e sequenze di attributi per ogni mostra.In breve, l'ARNm hè statu purificatu da l'RNA tutale usendu perle magnetiche attaccate cù oligonucleotidi poli-T.A frammentazione hè realizata cù cationi divalenti à alta temperatura in NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).L'ADNc di u primu filu hè stata sintetizzata utilizendu primer esameri casuali è trascrittasi inversa M-MuLV (RNase H-).A seconda fila cDNA hè sintetizzata cù l'ADN polimerasi I è RNase H. L'overhangs restanti sò cunvertiti in estremità smussate da l'attività exonuclease / polimerasi.Dopu l'adenilazione di l'estremità 3' di u fragmentu di DNA, un NEBNext Adapter cù una struttura di loop hairpin hè attaccatu à questu per preparà per l'ibridazione.Per a selezzione di frammenti di cDNA di lunghezza preferita 150-200 bp.I frammenti di biblioteca sò stati purificati cù u sistema AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA).Allora, 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) cù cDNA di taglia selezziunata ligatu cù un adattatore hè stata utilizata per 15 minuti à 37 ° C è dopu per 5 minuti à 95 ° C prima di PCR.A PCR hè stata poi eseguita cù l'ADN polimerasi Phusion High-Fidelity, primers PCR universali è primers Index (X).Infine, i prudutti PCR sò stati purificati (sistema AMPure XP) è a qualità di a libreria valutata nantu à un sistema Agilent Bioanalyzer 2100.A biblioteca di cDNA hè stata poi sequenziata cù un sequencer Novaseq.I schedarii di l'imaghjini crudi da Illumina sò stati cunvertiti in letture crude cù CASAVA Base Calling.I dati crudi sò almacenati in i fugliali di furmatu FASTQ (fq) chì cuntenenu sequenze di leghje è qualità di basa currispondenti.Selezziunate HISAT2 per currisponde à e leghje di sequenza filtrata à u genoma di riferimentu Sscrofa11.1.In generale, HISAT2 supporta genomi di ogni dimensione, cumpresi genomi più grande di 4 miliardi di basi, è i valori predeterminati sò stabiliti per a maiò parte di i parametri.Splicing reads from RNA Seq data pò esse allineatu in modu efficiente utilizendu HISAT2, u sistema più veloce attualmente dispunibule, cù a stessa precisione o megliu cà qualsiasi altru metudu.
L'abbundanza di trascrizioni riflette direttamente u livellu di l'espressione genica.I livelli di espressione genica sò valutati da l'abbundanza di trascrizioni (conte di sequenza) assuciati cù u genoma o esoni.U numaru di letture hè proporzionale à i livelli di espressione genica, a lunghezza di u genu è a prufundità di sequenza.FPKM (frammenti per mille coppie di basi di trascrizione sequenziata per milione di coppie di basi) sò stati calculati è i valori P di espressione differenziale sò stati determinati cù u pacchettu DESeq2.Dopu avemu calculatu a tarifa di scuperta falsa (FDR) per ogni valore P utilizendu u metudu Benjamini-Hochberg9 basatu annantu à a funzione R integrata "p.adjust".
L'ARN isolatu da e sezioni di cori hè stata cunvertita in cDNA à una cuncentrazione di 200 ng/μl cù u SuperScript IV Vilo Master mix da Thermo (Thermo, cat. n. 11756050).A RT-PCR quantitativa hè stata realizata utilizendu una piastra di reazione trasparente di Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well (Thermo, cat. no. 4483319) è microamp adesivo otticu (Thermo, cat. no. 4311971).La miscela di reazione era composta da 5 µl di Taqman Fast Advanced Master Mix (Thermo, cat # 4444557), 0,5 µl di Taqman Primer e 3,5 µl di H2O miscelati per pozzetto.I cicli standard qPCR sò stati eseguiti è i valori CT sò stati misurati cù un strumentu di PCR in tempu reale Applied Biosystems Quantstudio 5 (modulu di 384 pozzetti; pruduttu # A28135).I primers Taqman sò stati acquistati da Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06908795_m1), ACTN901_ms80, GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) I valori di a casa GATA sò stati normalizzati à tutti i campioni CTDH.
A liberazione media di NT-ProBNP hè stata valutata cù u kit NT-ProBNP (pig) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) secondu u protocolu di u fabricatore.In breve, 250 µl di ogni campione è standard sò stati aggiunti in duplicate à ogni pozzu.Immediatamente dopu l'aghjunzione di u campione, aghjunghje 50 µl di reattivu di analisi A à ogni pozzu.Scuzzulate delicatamente a piastra è sigillate cù u sigillante.Allora i pasticchi sò stati incubati à 37 ° C per 1 ora.Allora aspirate a suluzione è lavate i pozzi 4 volte cù 350 µl di soluzione di lavaggio 1X, incubando a suluzione di lavatu per 1-2 minuti ogni volta.Puis ajouter 100 µl de réactif d'essai B par puits et sceller avec un sigillant à plaques.A tableta hè stata agitata è incubata à 37 ° C per 30 minuti.Aspirate a suluzione è lavate i pozzi 5 volte cù 350 µl di soluzione di lavaggio 1X.Ajouter 90 µl de solution de substrat à chaque puits et sceller la plaque.Incubate a piastra à 37 ° C per 10-20 minuti.Aggiungere 50 µl di Stop Solution in ogni pozzetto.A piastra hè stata immediatamente misurata cù un lettore di piastra Cytation (BioTek) stabilitu à 450 nm.
L'analisi di putenza sò state eseguite per sceglie e dimensioni di u gruppu chì furniscenu> 80% di putenza per detectà un cambiamentu assolutu di 10% in u paràmetru cù una rata di errore di 5% Type I. L'analisi di putenza sò state eseguite per sceglie e dimensioni di u gruppu chì furniscenu> 80% di putenza per detectà un cambiamentu assolutu di 10% in u paràmetru cù una rata di errore di 5% Type I. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощноя ти1 бора групп солютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. L'analisi di putenza hè stata realizata per selezziunà e dimensioni di u gruppu chì furnisceranu> 80% di putenza per detectà u 10% di cambiamentu di paràmetru assolutu cù una rata di errore di 5% Type I.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％化和5％的垯绥检测参数中10％绝对变化和5％的垯玄的绥检进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％化和5％的垯绥检测参数中10％绝对变化和5％的垯玄的绥检 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мтощнора группы абсолютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Un analisi di putenza hè stata realizata per selezziunà una dimensione di u gruppu chì furnisce> 80% di putenza per detectà u 10% di cambiamentu di paràmetru assolutu è u 5% di u tipu d'errore I.Sezzioni di tissuti sò stati scelti aleatoriamente prima di l'esperimentu.Tutte l'analisi eranu cundizzioni cecu è i campioni sò stati decodificati solu dopu chì tutte e dati sò stati analizati.U software GraphPad Prism (San Diego, CA) hè stata utilizata per fà tutte l'analisi statistiche. Per tutte e statistiche, i valori p sò stati cunsiderati significativi à i valori <0,05. Per tutte e statistiche, i valori p sò stati cunsiderati significativi à i valori <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Per tutte e statistiche, i valori p sò stati cunsiderati significativi à i valori <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Per tutte e statistiche, i valori p sò stati cunsiderati significativi à i valori <0,05.T-test di Studenti à dui coda hè statu realizatu nantu à e dati cù solu 2 paraguni.ANOVA unidirezionale o bidirezionale hè stata utilizata per determinà u significatu trà parechji gruppi.Quandu eseguite testi post hoc, a correzione di Tukey hè stata applicata per cuntà parechje paraguni.I dati RNAsec anu cunsiderà statistiche speciale quandu u calculu FDR è p.adjust cum'è discrittu in a seccione Methods.
Per più infurmazione nantu à u disignu di studiu, vede l'abstrattu di u Rapportu di Ricerca di Natura ligata à questu articulu.