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Ci hè bisognu di un sistema in vitro affidabile chì pò riproduce accuratamente l'ambiente fisiologicu di u core per i testi di droghe. A dispunibilità limitata di sistemi di cultura di tessuti cardiaci umani hà purtatu à interpretazioni imprecise di l'effetti di i farmaci cardiaci. Quì, avemu sviluppatu un mudellu di cultura di tessuti cardiaci (CTCM) chì stimula elettromeccanicamente e fette di core è subisce un allungamentu fisiologicu durante e fasi sistoliche è diastoliche di u ciclu cardiacu. Dopu à 12 ghjorni di cultura, questu approcciu hà migliuratu parzialmente a viabilità di e sezioni di core, ma ùn hà micca cunservatu cumpletamente a so integrità strutturale. Dunque, dopu à u screening di piccule molecule, avemu trovu chì l'aggiunta di 100 nM di triiodotironina (T3) è 1 μM di desametasone (Dex) à u nostru mezu hà mantenutu a microstruttura di e sezioni per 12 ghjorni. In cumbinazione cù u trattamentu T3/Dex, u sistema CTCM hà mantenutu i profili trascrizionali, a viabilità, l'attività metabolica è l'integrità strutturale à u listessu livellu di u tissutu cardiacu frescu per 12 ghjorni. Inoltre, l'allungamentu eccessivu di u tissutu cardiacu in cultura induce una segnalazione cardiaca ipertrofica, furnendu evidenza di a capacità di CTCM di imità e cundizioni ipertrofiche indotte da l'allungamentu cardiacu. In conclusione, CTCM pò modellà a fisiologia è a fisiopatologia di u core in cultura per longhi periodi di tempu, permettendu un screening affidabile di i farmaci.
Prima di a ricerca clinica, sò necessarii sistemi in vitro affidabili chì ponu riproduce accuratamente l'ambiente fisiologicu di u core umanu. Tali sistemi devenu imità l'allungamentu meccanicu alteratu, a frequenza cardiaca è e proprietà elettrofisiologiche. I mudelli animali sò cumunamente usati cum'è piattaforma di screening per a fisiologia cardiaca cù una affidabilità limitata in u riflessu di l'effetti di i medicinali in u core umanu1,2. In definitiva, u Modellu Sperimentale di Cultura di Tessuti Cardiaci Ideale (CTCM) hè un mudellu assai sensibile è specificu per diversi interventi terapeutici è farmacologichi, chì riproduce accuratamente a fisiologia è a fisiopatologia di u core umanu3. L'assenza di un tale sistema limita a scuperta di novi trattamenti per l'insufficienza cardiaca4,5 è hà purtatu à a cardiotossicità di i medicinali cum'è una di e ragioni principali per l'uscita da u mercatu6.
In l'ultima dicada, ottu medicinali non cardiovascolari sò stati ritirati da l'usu clinicu perchè causanu un allungamentu di l'intervallu QT chì porta à aritmie ventriculari è morte improvvisa7. Cusì, ci hè un bisognu crescente di strategie di screening preclinicu affidabili per valutà l'efficacia è a tossicità cardiovascolare. L'usu recente di cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte da l'omu (hiPS-CM) in u screening di i medicinali è i testi di tossicità furnisce una suluzione parziale à stu prublema. Tuttavia, a natura immatura di l'hiPS-CM è a mancanza di cumplessità multicellulare di u tissutu cardiacu sò limitazioni maiò di stu metudu. Studi recenti anu dimustratu chì sta limitazione pò esse parzialmente superata aduprendu hiPS-CM precoce per furmà idrogel di tissutu cardiacu pocu dopu l'iniziu di e cuntrazioni spontanee è aumentendu gradualmente a stimulazione elettrica cù u tempu. Tuttavia, questi microtessuti hiPS-CM mancanu di e proprietà elettrofisiologiche è contrattili mature di u miocardiu adultu. Inoltre, u tissutu cardiacu umanu hà una struttura più cumplessa, custituita da una mistura eterogenea di diversi tipi di cellule, cumprese cellule endoteliali, neuroni è fibroblasti stromali, interconnessi da insiemi specifici di proteine di matrice extracellulare. Questa eterogeneità di pupulazioni non cardiomiocitarie11,12,13 in u core di i mammiferi adulti hè un ostaculu maiò à a modellazione di u tissutu cardiacu utilizendu tipi di cellule individuali. Queste limitazioni maiò sottolineanu l'impurtanza di sviluppà metudi per cultivà u tissutu miocardicu intattu in cundizioni fisiologiche è patologiche.
E sezioni fini (300 µm) cultivate di u core umanu anu dimustratu d'esse un mudellu promettente di miocardiu umanu intattu. Stu metudu furnisce accessu à un sistema multicellulare 3D cumpletu simile à u tissutu cardiacu umanu. Tuttavia, finu à u 2019, l'usu di sezioni di core cultivate era limitatu da a corta sopravvivenza di a cultura (24 ore). Questu hè duvutu à una quantità di fattori, cumprese a mancanza di allungamentu fisicu-meccanicu, l'interfaccia aria-liquidu è l'usu di mezi simplici chì ùn sustenenu micca i bisogni di u tissutu cardiacu. In u 2019, parechji gruppi di ricerca anu dimustratu chì l'incorporazione di fattori meccanichi in i sistemi di cultura di tessuti cardiaci pò allargà a vita di a cultura, migliurà l'espressione cardiaca è imità a patologia cardiaca. Dui studii eleganti 17 è 18 mostranu chì u caricu meccanicu uniassiale hà un effettu pusitivu nantu à u fenotipu cardiacu durante a cultura. Tuttavia, sti studii ùn anu micca utilizatu u caricu fisicu-meccanicu tridimensionale dinamicu di u ciclu cardiacu, postu chì e sezioni di core eranu caricate sia cù forze di trazione isometriche 17 sia cù un caricu auxotonicu lineare 18. Questi metudi di stiramentu di i tessuti anu risultatu in a soppressione di parechji geni cardiaci o in a sovraespressione di geni assuciati à risposte anormali di stiramentu. In particulare, Pitoulis et al. 19 anu sviluppatu un bagnu di cultura dinamica di fette di core per a ricustruzione di u ciclu cardiacu utilizendu u feedback di u trasduttore di forza è i motori di tensione. Ancu s'è questu sistema permette una modellazione di u ciclu cardiacu in vitro più precisa, a cumplessità è u bassu rendimentu di u metudu limitanu l'applicazione di questu sistema. U nostru laburatoriu hà recentemente sviluppatu un sistema di cultura simplificatu utilizendu a stimulazione elettrica è un mezu ottimizatu per mantene a viabilità di sezioni di tissutu cardiacu porcinu è umanu finu à 6 ghjorni20,21.
In u manuscrittu attuale, descrivemu un mudellu di cultura di tessuti cardiaci (CTCM) chì utilizza sezioni di u core porcinu chì incorpora segnali umorali per ricapitulà a fisiologia cardiaca tridimensionale è a distensione patofisiologica durante u ciclu cardiacu. Questu CTCM pò aumentà a precisione di a previsione preclinica di i farmaci à un livellu mai ottenutu prima furnendu un sistema cardiacu à rendimentu mediu è economicu chì imita a fisiologia/fisiologia di u core di i mammiferi per i testi preclinichi di i farmaci.
I signali meccanichi emodinamichi ghjocanu un rollu cruciale in u mantenimentu di a funzione di i cardiomiociti in vitro 22,23,24. In u manuscrittu attuale, avemu sviluppatu un CTCM (Figura 1a) chì pò imità l'ambiente cardiacu adultu inducendu una stimulazione elettrica è meccanica à frequenze fisiologiche (1,2 Hz, 72 battiti per minutu). Per evità un allungamentu eccessivu di i tessuti durante a diastole, hè statu utilizatu un dispositivu di stampa 3D per aumentà a dimensione di i tessuti di u 25% (Fig. 1b). A stimolazione elettrica indutta da u sistema C-PACE hè stata temporizzata per inizià 100 ms prima di a sistole utilizendu un sistema di acquisizione dati per riproduce cumpletamente u ciclu cardiacu. U sistema di cultura tissutale utilizza un attuatore pneumaticu programmabile (LB Engineering, Germania) per espande ciclicamente una membrana di silicone flessibile per causà l'espansione di e fette di core in a camera superiore. U sistema hè statu cunnessu à una linea d'aria esterna attraversu un trasduttore di pressione, chì hà permessu di aghjustà accuratamente a pressione (± 1 mmHg) è u tempu (± 1 ms) (Fig. 1c).
a Attaccate a sezione di tissutu à l'anellu di supportu di 7 mm, mostratu in blu, in a camera di cultura di u dispusitivu. A camera di cultura hè separata da a camera d'aria da una membrana fina di silicone flessibile. Pone una guarnizione trà ogni camera per impedisce perdite. U coperchio di u dispusitivu cuntene elettrodi di grafite chì furniscenu stimulazione elettrica. b Rappresentazione schematica di u dispusitivu di tissutu grande, l'anellu di guida è l'anellu di supportu. E sezioni di tissutu (marrone) sò piazzate nantu à u dispusitivu sovradimensionatu cù l'anellu di guida piazzatu in a scanalatura nantu à u bordu esternu di u dispusitivu. Usendu a guida, piazzate cù cura l'anellu di supportu rivestitu di adesivo acrilicu tissutale sopra a sezione di tissutu cardiacu. c Graficu chì mostra u tempu di stimulazione elettrica in funzione di a pressione di a camera d'aria cuntrullata da un attuatore pneumaticu programmabile (PPD). Un dispusitivu di acquisizione dati hè statu utilizatu per sincronizà a stimulazione elettrica utilizendu sensori di pressione. Quandu a pressione in a camera di cultura righjunghji a soglia impostata, un segnale d'impulsu hè mandatu à u C-PACE-EM per attivà a stimulazione elettrica. d Imagine di quattru CTCM piazzati nantu à un scaffale di incubatrice. Quattru dispusitivi sò cunnessi à un PPD via un circuitu pneumaticu, è i sensori di pressione sò inseriti in a valvula emostatica per monitorà a pressione in u circuitu pneumaticu. Ogni dispusitivu cuntene sei sezioni di tissutu.
Aduprendu un unicu attuatore pneumaticu, simu stati capaci di cuntrullà 4 dispusitivi CTCM, ognunu di i quali pudia cuntene 6 sezzioni di tissutu (Fig. 1d). In CTCM, a pressione di l'aria in a camera d'aria hè cunvertita in pressione sincrona in a camera di fluidu è induce l'espansione fisiologica di a fetta di u core (Figura 2a è Film Supplementare 1). Valutazione di l'allungamentu di i tissuti à 80 mm Hg. Art. hà mostratu un allungamentu di e sezzioni di tissutu di u 25% (Fig. 2b). Stu percentuale di allungamentu hè statu dimustratu chì currisponde à una lunghezza fisiologica di u sarcomeru di 2,2-2,3 µm per una cuntrattilità nurmale di a sezzione cardiaca17,19,25. U muvimentu di i tissuti hè statu valutatu aduprendu paràmetri di camera persunalizati (Figura Supplementare 1). L'ampiezza è a velocità di u muvimentu di i tissuti (Fig. 2c, d) currispondenu à l'allungamentu durante u ciclu cardiacu è à u tempu durante a sistole è a diastole (Fig. 2b). L'allungamentu è a velocità di u tissutu cardiacu durante a cuntrazione è u rilassamentu sò rimasti custanti per 12 ghjorni in cultura (Fig. 2f). Per valutà l'effettu di a stimulazione elettrica nantu à a cuntrattilità durante a cultura, avemu sviluppatu un metudu per determinà a deformità attiva utilizendu un algoritmu di ombreggiatura (Fig. Supplementare 2a,b) è simu stati capaci di distingue trà deformità cù è senza stimulazione elettrica. A listessa sezione di u core (Fig. 2f). In a regione mobile di u tagliu (R6-9), a tensione durante a stimulazione elettrica era 20% più alta chè in assenza di stimulazione elettrica, ciò chì indica u cuntributu di a stimulazione elettrica à a funzione contrattile.
Tracce rappresentative di a pressione di a camera d'aria, di a pressione di a camera di fluidu è di e misurazioni di u muvimentu di i tessuti cunfermanu chì a pressione di a camera cambia a pressione di a camera di fluidu, causendu un muvimentu currispundente di a fetta di tissutu. b Tracce rappresentative di u percentuale di allungamentu (blu) di e sezioni di tissutu currispundenti à u percentuale di allungamentu (aranciu). c U muvimentu misuratu di a fetta cardiaca hè coerente cù a velocità di muvimentu misurata. (d) Traiettorie rappresentative di u muvimentu ciclicu (linea blu) è di a velocità (linea punteggiata aranciu) in una fetta di u core. e Quantificazione di u tempu di ciclu (n = 19 fette per gruppu, da diversi porchi), di u tempu di cuntrazione (n = 19 fette per gruppu), di u tempu di rilassamentu (n = 19 fette per gruppu, da diversi porchi), di u muvimentu di i tessuti (n = 25 fette)/gruppu da diversi porchi), di a velocità sistolica di piccu (n = 24(D0), 25(D12) fette/gruppu da diversi porchi) è di a velocità di rilassamentu di piccu (n=24(D0), 25(D12) fette/gruppu da diversi porchi). U test t di Student à duie code ùn hà mostratu alcuna differenza significativa in alcun parametru. Tracce rappresentative di l'analisi di deformazione di sezioni di tessuti cù (rossu) è senza (blu) stimulazione elettrica, dece zone regiunali di sezioni di tessuti da a stessa sezione. I pannelli inferiori mostranu a quantificazione di a differenza percentuale di deformazione in sezioni di tessuti cù è senza stimulazione elettrica in dece zone da diverse sezioni. (n = 8 fette/gruppu da porchi diversi, hè statu realizatu u test t di Student à duie code; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 fette/gruppu da porchi diversi, hè statu realizatu u test t di Student à duie code; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; *****p<0,1,
In u nostru precedente sistema di cultura di fette di core biomimeticu staticu [20, 21], avemu mantinutu a viabilità, a funzione è l'integrità strutturale di e fette di core per 6 ghjorni applicendu a stimulazione elettrica è ottimizendu a cumpusizione di u mezu. Tuttavia, dopu à 10 ghjorni, queste cifre sò calate bruscamente. Faremu riferimentu à e sezioni cultivate in u nostru precedente sistema di cultura biomimeticu staticu 20, 21 cundizioni di cuntrollu (Ctrl) è useremu u nostru mezu ottimizatu prima cum'è cundizioni MC è cultura sottu stimulazione meccanica è elettrica simultanea (CTCM). chjamatu . Prima, avemu determinatu chì a stimulazione meccanica senza stimulazione elettrica era insufficiente per mantene a viabilità di i tessuti per 6 ghjorni (Fig. Supplementare 3a,b). Hè interessante nutà chì, cù l'introduzione di a stimulazione fisio-meccanica è elettrica cù STCM, a viabilità di e sezioni di core di 12 ghjorni hè rimasta a stessa cum'è in e sezioni di core frescu in cundizioni MS, ma micca in cundizioni Ctrl, cum'è dimustratu da l'analisi MTT (Fig. 1). 3a). Questu suggerisce chì a stimulazione meccanica è a simulazione di u ciclu cardiacu ponu mantene e sezioni di tessuti viabili per u doppiu di u tempu riportatu in u nostru precedente sistema di cultura staticu. Tuttavia, a valutazione di l'integrità strutturale di e sezioni di tissutu per immunomarcatura di a troponina T cardiaca è di a connessina 43 hà dimustratu chì l'espressione di a connessina 43 era significativamente più alta in i tessuti MC u ghjornu 12 chè in i cuntrolli u listessu ghjornu. Tuttavia, l'espressione uniforme di a connessina 43 è a furmazione di u discu Z ùn sò state cumpletamente mantenute (Fig. 3b). Usemu un quadru di intelligenza artificiale (IA) per quantificà l'integrità strutturale di i tessuti26, una pipeline di apprendimentu prufondu basata nantu à l'imagine basata nantu à a culurazione di troponina-T è connessina43 per quantificà automaticamente l'integrità strutturale è a fluorescenza di e fette di core in termini di forza di lucalizazione. Stu metudu usa una Rete Neurale Convoluzionale (CNN) è un quadru di apprendimentu prufondu per quantificà in modu affidabile l'integrità strutturale di u tissutu cardiacu in modu automatizatu è imparziale, cum'è descrittu in a riferenza. 26. U tissutu MC hà dimustratu una similitudine strutturale migliorata à u ghjornu 0 paragunatu à e sezioni di cuntrollu staticu. Inoltre, a culurazione tricromica di Masson hà rivelatu una percentuale significativamente più bassa di fibrosi in cundizioni MS paragunata à e cundizioni di cuntrollu u ghjornu 12 di cultura (Fig. 3c). Mentre chì u CTCM hà aumentatu a viabilità di e sezioni di tissutu cardiacu à u ghjornu 12 à un livellu simile à quellu di u tissutu cardiacu frescu, ùn hà micca migliuratu significativamente l'integrità strutturale di e sezioni di u core.
Un graficu à barre mostra a quantificazione di a viabilità MTT di fette di core fresche (D0) o di culture di fette di core per 12 ghjorni sia in cultura statica (D12 Ctrl) sia in CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) fette/gruppu da porchi diversi, si esegue un test ANOVA à una via; ####p < 0,0001 paragunatu à D0 è **p < 0,01 paragunatu à D12 Ctrl). Un graficu à barre mostra a quantificazione di a viabilità MTT di fette di core fresche (D0) o di cultura di fette di core per 12 ghjorni sia in cultura statica (D12 Ctrl) sia in CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) fette/gruppu da porchi diversi, hè realizatu un test ANOVA à una via; ####p < 0,0001 paragunatu à D0 è **p < 0,01 paragunatu à D12 Ctrl).L'istogramma mostra a quantificazione di a viabilità di sezioni di core frescu MTT (D0) o di cultura di sezioni di core per 12 ghjorni in cultura statica (cuntrollu D12) o CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (cuntrollu D12). ) , 12 (D12 MC) sezioni/gruppu da porchi diversi, hè realizatu un test ANOVA à una via;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 paragunatu à D0 è **p < 0,01 paragunatu à D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D12 MC)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，切片/组衑化化)测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p <0.01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D12 MC) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.00rl12相比，**p。)Istogramma chì mostra a quantificazione di a viabilità MTT in sezioni di core frescu (D0) o sezioni di core cultivate per 12 ghjorni in cultura statica (cuntrollu D12) o CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (cuntrollu D12)), 12 (D12 MC) sezioni/gruppu da porchi diversi, test ANOVA à una via;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 paragunatu à D0, **p < 0,01 paragunatu à D12 Ctrl).b Troponina-T (verde), connessina 43 (rossa) è DAPI (blu) in sezioni di core appena isolate (D0) o sezioni di core cultivate in cundizioni statiche (Ctrl) o in cundizioni CTCM (MC) per 12 ghjorni) d'imaghjini rappresentative di immunofluorescenza (scala bianca = 100 µm). Quantificazione di l'integrità strutturale di u tissutu cardiacu per via di l'intelligenza artificiale (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fette/gruppu ognuna da porchi diversi, hè statu realizatu un test ANOVA à una via; ####p < 0,0001 paragunatu à D0 è ****p < 0,0001 paragunatu à D12 Ctrl). Quantificazione di l'integrità strutturale di u tissutu cardiacu per via di l'intelligenza artificiale (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fette/gruppu ognuna da porchi diversi, hè statu realizatu un test ANOVA à una via; ####p < 0,0001 paragunatu à D0 è ****p < 0,0001 paragunatu à D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интелллектой (D1), C5 (D1), C77 (D1) (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA ####p < 0,0001 проводится однофакторный тест ANOVA; 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Quantificazione di l'integrità strutturale di u tissutu cardiacu per via di l'intelligenza artificiale (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sezioni/gruppi da diversi porchi, test ANOVA à una via realizatu; ####p < 0,0001 vs. cù D0 è ****p < 0,0001 paragunatu à D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fette/gruppo ciascuno di diversi maiali, test ANOVA unidirezionale <1#0 人####0 人工智能量化心脏组织结构完整性;相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) fette/gruppu ciascuna di diverse porci, test ANOVA unidirezionale 0.####0p1 ;与D0相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной тка7 (D12), =7nl (D12) (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001 vs. сравнению с D12 Ctrl). Intelligenza artificiale per quantificà l'integrità strutturale di u tissutu cardiacu (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) sezioni/gruppu ognunu di porchi diversi, test ANOVA à una via; ####p<0,0001 vs .D0 Per paragone ****p < 0,0001 paragunatu à D12 Ctrl). c Imagine rappresentative (à manca) è quantificazione (à diritta) per fette di core colorate cù a colorazione tricromica di Masson (Scala nuda = 500 µm) (n = 10 fette/gruppu ognuna da porchi diversi, hè realizatu un test ANOVA à una via; ####p < 0,0001 paragunatu à D0 è ***p < 0,001 paragunatu à D12 Ctrl). c Imagine rappresentative (à manca) è quantificazione (à diritta) per fette di core colorate cù a colorazione tricromica di Masson (Scala nuda = 500 µm) (n = 10 fette/gruppu ognunu da porchi diversi, hè realizatu un test ANOVA à una via; #### p < 0,0001 paragunatu à D0 è ***p < 0,001 paragunatu à D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрезентативные трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разнынх разни выполняется односторонний тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по; сравнению с D12 Ctrl). c Imagine rappresentative (à manca) è quantificazione (à diritta) di sezioni di core colorate cù a colorazione tricromica di Masson (scala senza rivestimentu = 500 µm) (n = 10 sezioni/gruppu da porchi diversi, test ANOVA à una via realizatu; #### p < 0,0001 paragunatu à D0 è ***p < 0,001 paragunatu à D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺（裸尺化（右）（裸將的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺010µ=个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比 相比 ，D1 测试；相比）。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 尺度 尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 切片 向 君## 向 向0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрезентативные трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой другой протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Imagine rappresentative (à manca) è quantificazione (à diritta) di sezioni di core colorate cù a colorazione tricromica di Masson (biancu = 500 µm) (n = 10 sezioni/gruppu, ognuna da un porcu differente, testate da analisi di varianza à una via; ### # p < 0,0001 paragunatu à D0, ***p < 0,001 paragunatu à D12 Ctrl).E barre d'errore rapprisentanu a media ± deviazione standard.
Avemu ipotizzatu chì aghjunghjendu piccule molecule à u mezu di cultura, l'integrità di i cardiomiociti puderia esse migliurata è u sviluppu di a fibrosi riduttu durante a cultura CTCM. Dunque, avemu cercatu piccule molecule aduprendu e nostre culture di cuntrollu staticu20,21 per via di u picculu numeru di fattori cunfundenti. Desametasone (Dex), triiodotironina (T3) è SB431542 (SB) sò stati scelti per questu screening. Queste piccule molecule sò state aduprate prima in culture hiPSC-CM per induce a maturazione di cardiomiociti aumentendu a lunghezza di u sarcomeru, i tubuli T è a velocità di conduzione. Inoltre, sia Dex (un glucocorticoide) sia SB sò cunnisciuti per supprime l'inflammazione29,30. Dunque, avemu testatu se l'inclusione di una o una cumminazione di queste piccule molecule migliurerebbe l'integrità strutturale di e sezioni di u core. Per u screening iniziale, a dosa di ogni compostu hè stata selezziunata in basa à e concentrazioni cumunemente aduprate in i mudelli di cultura cellulare (1 μM Dex27, 100 nM T327 è 2,5 μM SB31). Dopu à 12 ghjorni di cultura, a cumminazione di T3 è Dex hà risultatu in una integrità strutturale ottima di i cardiomiociti è un rimodellamentu fibrosu minimu (Figure supplementari 4 è 5). Inoltre, l'usu di doppie o doppie di queste concentrazioni di T3 è Dex hà pruduttu effetti deleteri paragunati à e concentrazioni nurmali (Fig. supplementaria 6a,b).
Dopu à u screening iniziale, avemu realizatu una paragone testa à testa di 4 cundizioni di cultura (Figura 4a): Ctrl: sezioni di core cultivate in a nostra cultura statica descritta prima utilizendu u nostru mezu ottimizzatu; 20.21 TD: T3 è Ctrl s Dex aghjuntu u mercuri; MC: sezioni di core cultivate in CTCM utilizendu u nostru mezu ottimizzatu prima; è MT: CTCM cù T3 è Dex aghjuntu à u mezu. Dopu à 12 ghjorni di cultura, a viabilità di i tessuti MS è MT hè rimasta a stessa cum'è in i tessuti freschi valutati da u test MTT (Fig. 4b). Hè interessante nutà chì l'aghjunta di T3 è Dex à e culture transwell (TD) ùn hà micca risultatu in un miglioramentu significativu di a viabilità paragunatu à e cundizioni Ctrl, ciò chì indica un rolu impurtante di a stimulazione meccanica in u mantenimentu di a viabilità di e sezioni di core.
Un diagrama di cuncepimentu sperimentale chì rapprisenta e quattru cundizioni di cultura aduprate per valutà l'effetti di a stimulazione meccanica è di a supplementazione T3/Dex nantu à u mezu per 12 ghjorni. b U graficu à barre mostra a quantificazione di a viabilità 12 ghjorni dopu a cultura in tutte e 4 cundizioni di cultura (Ctrl, TD, MC è MT) paragunate à fette di core frescu (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD è D12 MT), 12 (D12 MC) fette/gruppu da diversi porchi, hè statu realizatu un test ANOVA à una via; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 paragunatu à D0 è **p < 0,01 paragunatu à D12 Ctrl). b U graficu à barre mostra a quantificazione di a viabilità 12 ghjorni dopu a cultura in tutte e 4 cundizioni di cultura (Ctrl, TD, MC è MT) paragunate à fette di core frescu (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD è D12 MT), 12 (D12 MC) fette/gruppu da diversi porchi, hè statu realizatu un test ANOVA à una via; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 paragunatu à D0 è **p < 0,01 paragunatu à D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней посленку кулрез всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами срезами серавнению срезами серезами серодц1 (D1) (D1) (D1) (D12 Ctrl, D12 TD è D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b U graficu à barre mostra a quantificazione di a viabilità à 12 ghjorni dopu a cultura in tutte e 4 cundizioni di cultura (cuntrollu, TD, MC è MT) paragunate à e sezioni di core frescu (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD è D12 MT), 12 (D12 MC) sezioni/gruppu da diversi porchi, test ANOVA à una via; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 vs. D0 è **p < 0,01 paragunatu à D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D150)、D12、D12、 TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；#####p < 0.0001，##001，#0.0.0p相比，**p < 0.01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнения сравнению сравнению сравнения сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, отроднос# A##NOVA; <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Istogramma chì mostra tutte e 4 cundizioni di cultura (cuntrollu, TD, MC è MT) paragunate à e sezioni di core frescu (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD è D12 MT), da diversi porchi 12 (D12 MC) sezioni/gruppu, test ANOVA à una via; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. cuntrollu D12). c U graficu à barre mostra a quantificazione di u flussu di glucosiu 12 ghjorni dopu a cultura in tutte e 4 cundizioni di cultura (Ctrl, TD, MC è MT) paragunatu à fette di core frescu (D0) (n = 6 fette/gruppu da porchi diversi, hè realizatu un test ANOVA à una via; ###p < 0,001, paragunatu à D0 è ***p < 0,001 paragunatu à D12 Ctrl). c U graficu à barre mostra a quantificazione di u flussu di glucosiu 12 ghjorni dopu a cultura in tutte e 4 cundizioni di cultura (Ctrl, TD, MC è MT) paragunatu à fette di core frescu (D0) (n = 6 fette/gruppu da porchi diversi, hè realizatu un test ANOVA à una via; ###p < 0,001, paragunatu à D0 è ***p < 0,001 paragunatu à D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после кульвти кульвоза 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца = (D6п) (D6п) от разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c L'istogramma mostra a quantificazione di u flussu di glucosiu 12 ghjorni dopu a cultura in tutte e 4 cundizioni di cultura (cuntrollu, TD, MC è MT) paragunatu à e sezioni di core frescu (D0) (n = 6 sezioni/gruppu da porchi diversi, test ANOVA à una via realizatu; ###p < 0,001 paragunatu à D0 è ***p < 0,001 paragunatu à D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 盌柯1％2）天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；####p < 0,0相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切縇片扇培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， ， ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней послественную оценку потока глюкозы через 12 дней послественную оценку всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC è MT) по сравнению со свежими срезами сердца = (D60) срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Istogramma chì mostra a quantificazione di u flussu di glucosiu à 12 ghjorni dopu a cultura per tutte e 4 cundizioni di cultura (cuntrollu, TD, MC è MT) paragunatu à e sezioni di core frescu (D0) (n = 6 sezioni/gruppu, da porchi diversi, unilaterali Induve sò stati realizati i testi ANOVA, ###p < 0,001 paragunatu à D0, ***p < 0,001 paragunatu à D12 (cuntrollu).d Grafici di analisi di ceppo di tessuti freschi (blu), ghjornu 12 MC (verde) è ghjornu 12 MT (rossu) in dece punti di sezione di tessuti regiunali (n = 4 fette/gruppu, test ANOVA à una via; ùn ci era nisuna differenza significativa trà i gruppi). e Graficu di u vulcanu chì mostra i geni espressi in modu differenziale in sezioni di core freschi (D0) paragunati à e sezioni di core cultivate in cundizioni statiche (Ctrl) o in cundizioni MT (MT) per 10-12 ghjorni. f Mappa di calore di i geni sarcomeri per e sezioni di core cultivate in ognuna di e cundizioni di cultura. E barre d'errore rapprisentanu a media ± deviazione standard.
A dipendenza metabolica da u cambiamentu da l'ossidazione di l'acidi grassi à a glicolisi hè una caratteristica di a dedifferenziazione di i cardiomiociti. I cardiomiociti immaturi utilizanu principalmente glucosiu per a pruduzzione di ATP è anu mitocondri ipoplastichi cù poche criste5,32. L'analisi di l'utilizazione di u glucosiu anu dimustratu chì in cundizioni MC è MT, l'utilizazione di u glucosiu era simile à quella in i tessuti di u ghjornu 0 (Figura 4c). Tuttavia, i campioni Ctrl anu dimustratu un aumentu significativu di l'utilizazione di u glucosiu paragunatu à u tissutu frescu. Questu indica chì a cumminazione di CTCM è T3/Dex migliora a viabilità tissutale è priserva u fenotipu metabolicu di e sezioni di core cultivate di 12 ghjorni. Inoltre, l'analisi di a deformazione hà dimustratu chì i livelli di deformazione sò rimasti listessi cum'è in u tissutu cardiacu frescu per 12 ghjorni in cundizioni MT è MS (Fig. 4d).
Per analizà l'impattu generale di CTCM è T3/Dex nant'à u paisaghju trascrizionale glubale di u tissutu cardiacu, avemu realizatu RNAseq nant'à fette cardiache da tutte e quattru diverse cundizioni di cultura (Dati Supplementari 1). Hè interessante nutà chì e sezioni MT anu mostratu una alta similitudine trascrizionale cù u tissutu cardiacu frescu, cù solu 16 geni espressi in modu differenziale trà 13.642. Tuttavia, cum'è avemu dimustratu prima, e fette Ctrl anu mostratu 1229 geni espressi in modu differenziale dopu à 10-12 ghjorni in cultura (Fig. 4e). Quessi dati sò stati cunfirmati da qRT-PCR di geni cardiaci è di fibroblasti (Fig. Supplementare 7a-c). Hè interessante nutà chì e sezioni Ctrl anu mostratu una downregulation di i geni cardiaci è di u ciclu cellulare è l'attivazione di prugrammi genichi inflammatorii. Quessi dati suggerenu chì a dedifferenziazione, chì si verifica nurmalmente dopu à a cultura à longu andà, hè cumpletamente attenuata in cundizioni MT (Fig. Supplementare 8a,b). Un studiu attentu di i geni di i sarcomeri hà dimustratu chì solu in cundizioni MT sò cunservati i geni chì codificanu u sarcomeru (Fig. 4f) è u canale ionicu (Fig. Supplementare 9), pruteggenduli da a soppressione in cundizioni Ctrl, TD è MC. Quessi dati dimustranu chì cù una cumbinazione di stimulazione meccanica è umorale (T3/Dex), u trascrittoma di a fetta di core pò rimanere simile à e fette di core fresche dopu à 12 ghjorni in cultura.
Questi risultati trascrizionali sò sustinuti da u fattu chì l'integrità strutturale di i cardiomiociti in e sezioni di u core hè megliu cunservata in cundizioni MT per 12 ghjorni, cum'è dimustratu da a connessina 43 intatta è lucalizzata (Fig. 5a). Inoltre, a fibrosi in e sezioni di u core in cundizioni MT hè stata significativamente ridutta paragunata à Ctrl è simile à e sezioni di u core frescu (Fig. 5b). Questi dati dimustranu chì a cumbinazione di stimulazione meccanica è trattamentu T3/Dex cunserva efficacemente a struttura cardiaca in e sezioni di u core in cultura.
Imagine rappresentative di immunofluorescenza di troponina-T (verde), connessina 43 (rossa) è DAPI (blu) in sezioni di core appena isolate (D0) o cultivate per 12 ghjorni in tutte e quattru cundizioni di cultura di sezioni di core (barra di scala = 100 µm). Quantificazione di l'integrità strutturale di u tissutu cardiacu per via di l'intelligenza artificiale (n = 7 (D0 è D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC è D12 MT) fette/gruppu da porchi diversi, hè statu realizatu un test ANOVA à una via; ####p < 0,0001 paragunatu à D0 è *p < 0,05, o ****p < 0,0001 paragunatu à D12 Ctrl). Quantificazione di l'integrità strutturale di u tissutu cardiacu per via di l'intelligenza artificiale (n = 7 (D0 è D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC è D12 MT) fette/gruppu da porchi diversi, hè statu realizatu un test ANOVA à una via; #### p < 0,0001 paragunatu à D0 è *p < 0,05, o ****p < 0,0001 paragunatu à D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного = инта20 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC è D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA <1 # по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Quantificazione di l'integrità strutturale di u tissutu cardiacu utilizendu l'intelligenza artificiale (n = 7 (D0 è D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC è D12 MT) sezioni/gruppu da diversi porchi, test ANOVA à una via realizatu; #### p < 0,0001 paragunatu à D0 è *p < 0,05 o ****p < 0,0001 paragunatu à D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p （ 0.0001 与D0 和*p ） 和*p <（ 测试； 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc （mt （d12 mc）人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 我**** p < 0,05 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。Quantificazione di l'integrità strutturale di u tissutu cardiacu cù l'intelligenza artificiale in diversi porchi (n = 7 (D0 è D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC è D12 MT) sezioni/gruppu) cù un test ANOVA à una via;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 paragunatu à D0 è *p < 0,05 o ****p < 0,0001 paragunatu à D12 Ctrl). b Imagine rappresentative è quantificazione per fette di core colorate cù a colorazione tricromica di Masson (Barra di scala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD è D12 MC), 9 (D12 MT) fette/gruppu da porchi diversi, hè statu realizatu un test ANOVA à una via; ####p < 0,0001 paragunatu à D0 è ***p < 0,001, o ****p < 0,0001 paragunatu à D12 Ctrl). b Imagine rappresentative è quantificazione per fette di core colorate cù a colorazione tricromica di Masson (Barra di scala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD è D12 MC), 9 (D12 MT) fette/gruppu da porchi diversi, hè statu realizatu un test ANOVA à una via; ####p < 0,0001 paragunatu à D0 è ***p < 0,001, o ****p < 0,0001 paragunatu à D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных трашенных трашенных траственная Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/групапу, срезов/гтрупа вови выполняется односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p <; 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Imagine rappresentative è quantificazione di sezioni di core colorate cù a colorazione tricromica di Masson (barra di scala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD è D12 MC), 9 (D12 MT) sezioni/gruppu da diversi porchi, ANOVA à una via realizata; ####p < 0,0001 vs. D0 è ***p < 0,001 o ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）㼈D12010（D1010 Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方单因素方##＆0.与D0 相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm = 500 µm = 500 µm d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,00 方差分析；####p < 0,00 攸< 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных тросонная (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиных свинупи способ ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001; по сравнению с D12 Ctrl). b Imagine rappresentative è quantificazione di sezioni di core colorate cù tricromia di Masson (barra di scala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD è D12 MC), 9 (D12 MT) sezioni da diversi porchi/gruppu, un metudu ANOVA; ####p < 0,0001 paragunatu à D0, ***p < 0,001 o ****p < 0,0001 paragunatu à D12 Ctrl).E barre d'errore rapprisentanu a media ± deviazione standard.
Infine, a capacità di CTCM d'imità l'ipertrofia cardiaca hè stata valutata aumentendu l'allungamentu di u tissutu cardiacu. In CTCM, a pressione massima di a camera d'aria hè aumentata da 80 mmHg à 80 mmHg. Art. (allungamentu nurmale) finu à 140 mmHg Art. (Fig. 6a). Questu currisponde à un aumentu di 32% di l'allungamentu (Fig. 6b), chì hè statu mostratu prima cum'è a percentuale currispundente di allungamentu necessaria per chì e sezioni di u core ottenganu una lunghezza di sarcomero simile à quella vista in l'ipertrofia. L'allungamentu è a velocità di u tissutu cardiacu durante a cuntrazione è u rilassamentu sò rimasti custanti durante sei ghjorni di cultura (Fig. 6c). U tissutu cardiacu da e cundizioni MT hè statu sottumessu à allungamentu nurmale (MT (Normale)) o cundizioni di sovra-allungamentu (MT (OS)) per sei ghjorni. Digià dopu à quattru ghjorni di cultura, u biomarcatore ipertroficu NT-ProBNP era significativamente elevatu in u mezu in cundizioni MT (OS) paragunatu à e cundizioni MT (nurmali) (Fig. 7a). Inoltre, dopu à sei ghjorni di cultura, a dimensione di e cellule in MT (OS) (Fig. 7b) hè aumentata significativamente paragunata à e sezioni di core MT (nurmale). Inoltre, a traslocazione nucleare di NFATC4 hè stata significativamente aumentata in i tessuti sovrastirati (Fig. 7c). Questi risultati mostranu u sviluppu progressivu di u rimodellamentu patologicu dopu l'iperdistensione è sustenenu u cuncettu chì u dispusitivu CTCM pò esse adupratu cum'è una piattaforma per studià a segnalazione di l'ipertrofia cardiaca indotta da u stiramentu.
Tracce rappresentative di a pressione di a camera d'aria, di a pressione di a camera di fluidu è di e misurazioni di u muvimentu di i tessuti cunfermanu chì a pressione di a camera cambia a pressione di a camera di fluidu, causendu un muvimentu currispundente di a fetta di tissutu. b Curve rappresentative di percentuale di stiramentu è di velocità di stiramentu per sezioni di tissutu nurmalmente stirate (aranciu) è sovrastirate (blu). c Graficu à barre chì mostra u tempu di ciclu (n = 19 fette per gruppu, da porchi diversi), u tempu di cuntrazione (n = 18-19 fette per gruppu, da porchi diversi), u tempu di rilassamentu (n = 19 fette per gruppu, da porchi diversi)), l'ampiezza di u muvimentu di i tessuti (n = 14 fette/gruppu, da porchi diversi), a velocità sistolica di piccu (n = 14 fette/gruppu, da porchi diversi) è a velocità di rilassamentu di piccu (n = 14 (D0), 15 (D6)) sezioni/gruppi) da porchi diversi), u test t di Student à duie code ùn hà mostratu alcuna differenza significativa in alcun parametru, indicendu chì questi parametri sò rimasti custanti durante 6 ghjorni di cultura cù sovratensione. E barre d'errore rapprisentanu a media ± deviazione standard.
Una quantificazione à barre di a cuncentrazione di NT-ProBNP in i mezi di cultura da fette di core cultivate sottu cundizioni di allungamentu nurmale MT (Norm) o di sovraallungamentu (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, è D4 MTOS) fette/gruppu da porchi diversi, ANOVA à duie vie hè stata realizata; **p < 0,01 paragunatu à l'allungamentu nurmale). Una quantificazione di a cuncentrazione di NT-ProBNP in un graficu à barre in i mezi di cultura da fette di core cultivate in cundizioni di allungamentu normale MT (Norm) o di sovraallungamentu (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, è D4 MTOS) fette/gruppu da porchi diversi, ANOVA à duie vie hè stata realizata; **p < 0,01 paragunatu à l'allungamentu normale).Istogramma quantitativu di a cuncentrazione di NT-ProBNP in u mezu di cultura da fette di core cultivate in cundizioni di allungamentu MT nurmale (norma) o sovraallungamentu (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, è D4).MTOS) fette / gruppu da porchi diversi, hè stata realizata un'analisi di varianza à dui fattori;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). p < 0,01 paragunatu à l'allungamentu nurmale). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01） a Quantificazione di a cuncentrazione di NT-ProBNP in fette di cori cultivate in cundizioni MT di stretch normale (Norm) o overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) da diverse猪的切片/组，可以双向方方发发动 **paragunatu cù l'allungamentu normale, p <0,01).Quantificazione di l'istogramma di e concentrazioni di NT-ProBNP in fette di core cultivate in cundizioni di allungamentu MT nurmale (norma) o sovraallungamentu (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) è D4 MTOS) fette/gruppu da porchi diversi, analisi di varianza à duie vie;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). p < 0,01 paragunatu à l'allungamentu nurmale). b Imagine rappresentative per fette di core colorate cù troponina-T è WGA (sinistra) è quantificazione di a dimensione di e cellule (destra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellule/gruppu da 10 fette diverse da porchi diversi, hè statu realizatu u test t di Student à duie code; ****p < 0,0001 paragunatu à l'allungamentu nurmale). b Imagine rappresentative per fette di core colorate cù troponina-T è WGA (sinistra) è quantificazione di a dimensione di e cellule (destra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellule/gruppu da 10 fette diverse da porchi diversi, hè statu realizatu u test t di Student à duie code; ****p < 0,0001 paragunatu à l'allungamentu nurmale). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слесоги) слесова определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезных срезных срезных срезных срезох срезок два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Imagine rappresentative di sezioni di core colorate cù troponina-T è AZP (sinistra) è quantificazione di a dimensione di e cellule (destra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) cellule/gruppu da 10 sezioni diverse da porchi diversi, hè statu realizatu u test t di Student à duie code; ****p < 0,0001 paragunatu à a ceppa nurmale). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表切的代表怏30表怏（右）染色的心脏切片的代表MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）。 b Imagine rappresentative di fette di core colorate cù calcareina-T è WGA (sinistra) è dimensione di e cellule (destra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 da 10 fette diverse (D6 MTNorm)) Cellule/mm, test t di precisione; paragunatu à u stiramentu nurmale, ****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слества) чнных оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разныей разныех Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным; sfracicamentu). b Imagine rappresentative di sezioni di core colorate cù troponina-T è AZP (sinistra) è quantificazione di a dimensione di e cellule (destra) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) da 10 sezioni diverse da porchi diversi) Cellule/gruppu, criteriu à duie code t di Student; ****p < 0,0001 paragunatu à a ceppa nurmale). c Imagine rappresentative per u ghjornu 0 è u ghjornu 6 di fette di core MTOS immunomarcate per troponina-T è NFATC4 è quantificazione di a traslocazione di NFATC4 à i nuclei di CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fette/gruppu da porchi diversi, hè statu realizatu u test t di Student à duie code; *p < 0,05). c Imagine rappresentative per u ghjornu 0 è u ghjornu 6 di fette di core MTOS immunomarcate per troponina-T è NFATC4 è quantificazione di a traslocazione di NFATC4 à i nuclei di CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fette/gruppu da porchi diversi, U test t di Student à duie code hè statu realizatu; *p < 0,05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для трозентативные для трозентативные для трозентативные количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезурапу/горнозных клеток свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента *p < 0,05). c Imagine rappresentative per sezioni di core à 0 è 6 ghjorni MTOS, immunomarcate per troponina-T è NFATC4, è quantificazione di a traslocazione di NFATC4 in u nucleu di e cellule cavernose (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fette/gruppu da porchi diversi) anu realizatu un test t di Student à duie code; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化 3 (D0) = 4 (D0)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0.05)。 c Immagini rappresentative di calcanin-T e NFATC4 immunomarcatura fette di cuore 第0天和第6天MTOS, e NFATC4 da diverse quantità NFATC4 易位至CM di nucleo cellulare的quantità化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS,)时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки троповки тропоТи тропоТ 4 количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез-а,груственней t-критерий Стьюдента * p < 0,05). c Imagine rappresentative di fette di core MTOS à i ghjorni 0 è 6 per l'immunomarcatura di troponina-T è NFATC4 è a quantificazione di a traslocazione di NFATC4 in u nucleu di CM da diversi porchi (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) fette/gruppu, criteriu t à duie code di Student; *p < 0,05).E barre d'errore rapprisentanu a media ± deviazione standard.
A ricerca cardiovasculare traslazionale richiede mudelli cellulari chì riproducenu accuratamente l'ambiente cardiacu. In questu studiu, hè statu sviluppatu è caratterizatu un dispositivu CTCM chì pò stimulà sezioni ultrasottili di u core. U sistema CTCM include a stimulazione elettromeccanica fisiologicamente sincronizata è l'arricchimentu di fluidi T3 è Dex. Quandu e sezioni di core porcine sò state esposte à questi fattori, a so viabilità, integrità strutturale, attività metabolica è espressione trascrizionale sò rimaste listesse cum'è in u tissutu cardiacu frescu dopu à 12 ghjorni di cultura. Inoltre, un allungamentu eccessivu di u tissutu cardiacu pò causà ipertrofia di u core causata da l'iperestensione. In generale, questi risultati sustenenu u rolu criticu di e cundizioni di cultura fisiologiche in u mantenimentu di un fenotipu cardiacu nurmale è furniscenu una piattaforma per u screening di i farmaci.
Parechji fattori cuntribuiscenu à creà un ambiente ottimale per u funziunamentu è a sopravvivenza di i cardiomiociti. I più evidenti di questi fattori sò ligati à (1) interazioni intercellulari, (2) stimulazione elettromeccanica, (3) fattori umorali, è (4) substrati metabolichi. L'interazioni fisiologiche cellula à cellula richiedenu reti tridimensionali cumplesse di parechji tipi di cellule supportate da una matrice extracellulare. Tali interazioni cellulari cumplesse sò difficiuli da ricustruisce in vitro per cocultura di tipi di cellule individuali, ma ponu esse facilmente ottenute aduprendu a natura organotipica di e sezioni di u core.
L'allungamentu meccanicu è a stimulazione elettrica di i cardiomiociti sò cruciali per mantene u fenotipu cardiacu33,34,35. Mentre a stimulazione meccanica hè stata largamente aduprata per u cundiziunamentu è a maturazione di hiPSC-CM, parechji studii eleganti anu recentemente pruvatu a stimulazione meccanica di fette di core in cultura utilizendu u caricamentu uniassiale. Quessi studii mostranu chì u caricamentu meccanicu uniassiale 2D hà un effettu pusitivu nantu à u fenotipu di u core durante a cultura. In questi studii, e sezioni di u core sò state caricate cù forze di trazione isometriche17, caricamentu auxotonicu lineare18, o u ciclu cardiacu hè statu ricreatu utilizendu u feedback di u trasduttore di forza è i drive di tensione. Tuttavia, questi metudi utilizanu l'allungamentu tissutale uniassiale senza ottimizazione ambientale, risultendu in a soppressione di parechji geni cardiaci o in a sovraespressione di geni assuciati à risposte anormali di allungamentu. U CTCM descrittu quì furnisce un stimulu elettromeccanicu 3D chì imita u ciclu cardiacu naturale in termini di tempu di ciclu è allungamentu fisiologicu (25% allungamentu, 40% sistole, 60% diastole è 72 battiti per minutu). Ancu s'è sta stimulazione meccanica tridimensionale ùn hè micca sufficiente per mantene l'integrità di i tessuti, una cumminazione di stimulazione umorale è meccanica cù T3/Dex hè necessaria per mantene adeguatamente a viabilità, a funzione è l'integrità di i tessuti.
I fattori umorali ghjocanu un rollu impurtante in a modulazione di u fenotipu di u core adultu. Questu hè statu messu in evidenza in studii HiPS-CM in i quali T3 è Dex sò stati aghjunti à i mezi di cultura per accelerà a maturazione cellulare. T3 pò influenzà u trasportu di aminoacidi, zuccheri è calciu attraversu e membrane cellulari36. Inoltre, T3 prumove l'espressione di MHC-α è a downregulation di MHC-β, prumove a furmazione di miofibrille à contrazione rapida in cardiomiociti maturi paragunatu à miofibrille à contrazione lenta in CM fetale. A carenza di T3 in i pazienti ipotiroidei provoca a perdita di bande miofibrillari è una riduzione di u tassu di sviluppu di u tonu37. Dex agisce nantu à i recettori glucocorticoidi è hè statu dimustratu chì aumenta a cuntrattilità miocardica in i cori perfusi isolati;38 si pensa chì questu miglioramentu sia ligatu à l'effettu nantu à l'entrata guidata da depositi di calciu (SOCE)39,40. Inoltre, Dex si lega à i so recettori, pruvucendu una larga risposta intracellulare chì sopprime a funzione immune è l'inflammazione30.
I nostri risultati indicanu chì a stimulazione meccanica fisica (MS) hà migliuratu e prestazioni generali di a cultura paragunatu à Ctrl, ma ùn hà micca riesciutu à mantene a viabilità, l'integrità strutturale è l'espressione cardiaca per più di 12 ghjorni in cultura. Paragunatu à Ctrl, l'aggiunta di T3 è Dex à e culture CTCM (MT) hà migliuratu a viabilità è hà mantinutu profili di trascrizione simili, integrità strutturale è attività metabolica cù tissutu cardiacu frescu per 12 ghjorni. Inoltre, cuntrullendu u gradu di allungamentu tissutale, hè statu creatu un mudellu di ipertrofia cardiaca indotta da iperestensione utilizendu STCM, chì illustra a versatilità di u sistema STCM. Ci vole à nutà chì, ancu se u rimodellamentu cardiacu è a fibrosi implicanu di solitu organi intatti chì e cellule circulanti ponu furnisce e citochine adatte, è ancu a fagocitosi è altri fattori di rimodellamentu, e sezioni di u core ponu ancu imità u prucessu fibroticu in risposta à u stress è u traumu in miofibroblasti. Questu hè statu valutatu prima in questu mudellu di fetta cardiaca. Ci vole à nutà chì i parametri CTCM ponu esse modulati cambiendu a pressione / ampiezza elettrica è a frequenza per simulà parechje cundizioni cum'è a tachicardia, a bradicardia è u supportu circulatoriu meccanicu (core scaricatu meccanicamente). Questu face di u sistema un rendimentu mediu per i testi di droghe. A capacità di CTCM di mudellà l'ipertrofia cardiaca indotta da u sovraeserciziu apre a strada per testà stu sistema per una terapia persunalizata. In conclusione, u presente studiu dimostra chì l'allungamentu meccanicu è a stimulazione umorale sò cruciali per mantene a cultura di sezioni di tissutu cardiacu.
Ancu s'è i dati prisentati quì suggerenu chì CTCM hè una piattaforma assai promettente per a mudellazione di u miocardiu intattu, stu metudu di cultura hà qualchì limitazione. A principale limitazione di a cultura CTCM hè chì impone stress meccanichi dinamichi cuntinui nantu à e fette, ciò chì impedisce a capacità di monitorà attivamente e cuntrazioni di e fette cardiache durante ogni ciclu. Inoltre, per via di a piccula dimensione di e sezioni cardiache (7 mm), a capacità di valutà a funzione sistolica fora di i sistemi di cultura utilizendu sensori di forza tradiziunali hè limitata. In u manuscrittu attuale, superemu parzialmente sta limitazione valutendu a tensione ottica cum'è indicatore di a funzione contrattile. Tuttavia, sta limitazione richiederà più travagliu è pò esse affrontata in u futuru introducendu metudi per u monitoraghju otticu di a funzione di e fette di core in cultura, cum'è a mappatura ottica utilizendu coloranti sensibili à u calciu è à a tensione. Un'altra limitazione di CTCM hè chì u mudellu di travagliu ùn manipula micca u stress fisiologicu (precaricu è postcaricu). In CTCM, a pressione hè stata indotta in direzzioni opposte per riproduce un allungamentu fisiologicu di u 25% in diastole (allungamentu cumpletu) è sistole (lunghezza di a cuntrazione durante a stimulazione elettrica) in tessuti assai grandi. Questa limitazione deve esse eliminata in i futuri disinni CTCM esercendu una pressione adatta nantu à u tissutu cardiacu da i dui lati è applicendu e relazioni esatte pressione-volume chì si verificanu in e camere di u core.
U rimodellamentu induttu da u sovraestensimentu riportatu in questu manuscrittu hè limitatu à imità i signali di iperestensimentu ipertroficu. Cusì, questu mudellu pò aiutà in u studiu di a segnalazione ipertrofica indutta da u stiramentu senza a necessità di fattori umorali o neurali (chì ùn esistenu micca in questu sistema). Ulteriori studii sò necessarii per aumentà a multiplicità di CTCM, per esempiu, a co-cultura cù e cellule immunitarie, i fattori umorali di u plasma circulante è l'innervazione quandu a co-cultura cù e cellule neuronali migliurà e pussibilità di modellazione di e malatie cù CTCM.
Tredeci porchi sò stati utilizati in questu studiu. Tutte e procedure nantu à l'animali sò state realizate in cunfurmità cù e linee guida istituziunali è sò state appruvate da u Cumitatu Istituziunale per a Cura è l'Usu di l'Animali di l'Università di Louisville. L'arcu aorticu hè statu chjappatu è u core hè statu perfusu cù 1 L di cardioplegia sterile (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL eparina, pH finu à 7,4); I cori sò stati cunservati in una soluzione cardioplegica ghiacciata finu à u trasportu à u laburatoriu nantu à u ghjacciu, chì hè di solitu <10 min. I cori sò stati cunservati in una soluzione cardioplegica ghiacciata finu à u trasportu à u laburatoriu nantu à u ghjacciu, chì hè di solitu <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на, лчдон на занимает <10 мин. I cori sò stati cunservati in una suluzione cardioplegica ghiacciata finu à u trasportu à u laburatoriu nantu à u ghjacciu, chì di solitu dura <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 Mantene i cori nantu à a cardioplegia di ghiaccio finu à u trasportu à u laburatoriu nantu à u ghiaccio, di solitu <10 min.
U dispusitivu CTCM hè statu sviluppatu in u software di cuncepimentu assistitu da computer (CAD) SolidWorks. E camere di cultura, i divisori è e camere d'aria sò fatti di plastica acrilica trasparente CNC. L'anellu di supportu di 7 mm di diametru hè fattu di polietilene d'alta densità (HDPE) in u centru è hà una scanalatura per o-ring per accoglie l'o-ring in silicone utilizatu per sigillà i media sottu. Una sottile membrana di silice separa a camera di cultura da a piastra di separazione. A membrana di silicone hè tagliata à laser da un fogliu di silicone di 0,02″ di spessore è hà una durezza di 35A. E guarnizioni di silicone inferiore è superiore sò tagliate à laser da un fogliu di silicone di 1/16″ di spessore è anu una durezza di 50A. Viti è dadi à alette in acciaio inox 316L sò aduprati per fissà u bloccu è creà una sigillatura ermetica.
Una scheda di circuitu stampatu (PCB) dedicata hè cuncipita per esse integrata cù u sistema C-PACE-EM. I connettori di a macchina svizzera nantu à u PCB sò cunnessi à l'elettrodi di grafite da fili di rame placcati in argentu è viti di bronzu 0-60 avvitate in l'elettrodi. A scheda di circuitu stampatu hè piazzata in u coperchio di a stampante 3D.
U dispusitivu CTCM hè cuntrullatu da un attuatore pneumaticu programmabile (PPD) chì crea una pressione circulatoria cuntrullata simile à un ciclu cardiacu. Quandu a pressione in a camera d'aria aumenta, a membrana di silicone flessibile si espande versu l'altu, furzendu u mediu sottu à u situ di u tissutu. L'area di u tissutu serà tandu allungata da sta espulsione di fluidu, imitendu l'espansione fisiologica di u core durante a diastole. À u piccu di rilassamentu, a stimulazione elettrica hè stata applicata per mezu di elettrodi di grafite, chì anu riduttu a pressione in a camera d'aria è anu causatu a cuntrazione di e sezioni di tissutu. Dentru à u tubu ci hè una valvula emostatica cù un sensore di pressione per rilevà a pressione in u sistema d'aria. A pressione rilevata da u sensore di pressione hè applicata à un cullettore di dati cunnessu à u laptop. Questu permette un monitoraghju continuu di a pressione in a camera di gas. Quandu a pressione massima di a camera hè stata raggiunta (standard 80 mmHg, 140 mmHg OS), u dispusitivu di acquisizione di dati hè statu urdinatu di mandà un signale à u sistema C-PACE-EM per generà un signale di tensione bifasicu per 2 ms, impostu à 4 V.
E sezioni di core sò state ottenute è e cundizioni di cultura in 6 pozzi sò state realizate cum'è seguita: Trasferite i cori raccolti da u vasu di trasferimentu à un vassoio chì cuntene cardioplegia fredda (4°C). U ventriculu sinistro hè statu isolatu cù una lama sterile è tagliatu in pezzi di 1-2 cm3. Quessi blocchi di tissutu sò stati attaccati à supporti di tissutu cù adesivo tissutale è posti in un bagnu di tissutu microtomu vibrante chì cuntene a soluzione di Tyrode è ossigenatu continuamente (3 g/L 2,3-butanedione monoossima (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glucosiu (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml soluzione 1 M), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml soluzione 1 M), finu à 1 L ddH2O). U microtomu vibrante hè statu impostu per taglià fette di 300 µm di spessore à una frequenza di 80 Hz, una ampiezza di vibrazione orizzontale di 2 mm è una velocità di avanzamentu di 0,03 mm/s. U bagnu di tissutu hè statu circundatu da ghiaccio per mantene a soluzione fresca è a temperatura hè stata mantenuta à 4°C. Trasferite e sezioni di tissutu da u bagnu di microtomu à un bagnu d'incubazione chì cuntene una soluzione Tyrode ossigenata continuamente nantu à ghiaccio finu à ottene abbastanza sezioni per una piastra di cultura. Per e culture transwell, e sezioni di tissutu sò state attaccate à supporti di poliuretanu sterili di 6 mm di larghezza è piazzate in 6 ml di mezu ottimizatu (mezzu 199, supplementu ITS 1x, FBS 10%, VEGF 5 ng/ml, FGF-alcalinu 10 ng/ml è antibioticu-antifunginu 2X). A stimulazione elettrica (10 V, frequenza 1,2 Hz) hè stata applicata à e sezioni di tissutu attraversu u C-Pace. Per e cundizioni TD, T3 è Dex freschi sò stati aghjunti à 100 nM è 1 μM à ogni cambiamentu di mezu. U mezu hè saturatu d'ossigenu prima di esse rimpiazzatu 3 volte à ghjornu. E sezioni di tissutu sò state cultivate in un incubatore à 37°C è 5% CO2.
Per e culture CTCM, e sezioni di tissutu sò state piazzate nantu à una stampante 3D fatta à misura in una piastra di Petri chì cuntene una suluzione Tyrode mudificata. U dispusitivu hè cuncipitu per aumentà a dimensione di a fetta di u core di u 25% di l'area di l'anellu di supportu. Questu hè fattu in modu chì e sezioni di u core ùn si stendenu micca dopu esse state trasferite da a suluzione Tyrode à u mezu è durante a diastole. Usendu colla istoacrilica, e sezioni di 300 µm di spessore sò state fissate nantu à un anellu di supportu di 7 mm di diametru. Dopu avè attaccatu e sezioni di tissutu à l'anellu di supportu, tagliate e sezioni di tissutu in eccessu è rimettite e sezioni di tissutu attaccate in u bagnu di suluzione Tyrode nantu à u ghjacciu (4°C) finu à chì sò state preparate abbastanza sezioni per un dispusitivu. U tempu tutale di trasfurmazione per tutti i dispusitivi ùn deve micca superà e 2 ore. Dopu chì 6 sezioni di tissutu sò state attaccate à i so anelli di supportu, u dispusitivu CTCM hè statu assemblatu. A camera di cultura CTCM hè pre-riempita cù 21 ml di mezu pre-ossigenatu. Trasferite e sezioni di tissutu in a camera di cultura è eliminate cù cura qualsiasi bolle d'aria cù una pipetta. A sezione di tissutu hè tandu guidata in u foru è pressata delicatamente in u so postu. Infine, mette u tappu di l'elettrodu nantu à u dispusitivu è trasferisce u dispusitivu à l'incubatore. Dopu, cunnette u CTCM à u tubu di l'aria è à u sistema C-PACE-EM. L'attuatore pneumaticu si apre è a valvula di l'aria apre u CTCM. U sistema C-PACE-EM hè statu cunfiguratu per furnisce 4 V à 1,2 Hz durante a stimolazione bifasica per 2 ms. U mezu hè statu cambiatu duie volte à ghjornu è l'elettrodi sò stati cambiati una volta à ghjornu per evità l'accumulazione di grafite nantu à l'elettrodi. Se necessariu, e sezioni di tissutu ponu esse rimosse da i so pozzi di cultura per espulsà qualsiasi bolle d'aria chì puderanu esse cascate sottu à elli. Per e cundizioni di trattamentu MT, T3/Dex hè statu aghjuntu frescu cù ogni cambiamentu di mezu cù 100 nM T3 è 1 μM Dex. I dispusitivi CTCM sò stati cultivati in un incubatore à 37°C è 5% CO2.
Per ottene traiettorie allungate di fette di core, hè statu sviluppatu un sistema di camera speciale. Una camera SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Giappone) hè stata aduprata cù un obiettivu macro Navitar Zoom 7000 18-108 mm (Navitar, San Francisco, CA). A visualizazione hè stata effettuata à temperatura ambiente dopu avè rimpiazzatu u mediu cù un mediu frescu. A camera hè posizionata à un angulu di 51° è u video hè registratu à 30 fotogrammi per seconda. Prima, hè statu utilizatu un software open source (MUSCLEMOTION43) cù Image-J per quantificà u muvimentu di e fette di core. A maschera hè stata creata utilizendu MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) per definisce e regioni d'interessu per e fette di core battente per evità u rumore. E maschere segmentate manualmente sò applicate à tutte l'imagine in una sequenza di fotogrammi è poi passate à u plug-in MUSCLEMOTION. Muscle Motion utilizza l'intensità media di i pixel in ogni fotogramma per quantificà u so muvimentu in relazione à u fotogramma di riferimentu. I dati sò stati registrati, filtrati è utilizati per quantificà u tempu di ciclu è valutà l'allungamentu di i tessuti durante u ciclu cardiacu. U video arregistratu hè statu post-processatu aduprendu un filtru digitale di fase zero di primu ordine. Per quantificà l'allungamentu di i tessuti (piccu à piccu), hè stata realizata un'analisi piccu à piccu per distingue trà picchi è valli in u signale arregistratu. Inoltre, u detrending hè realizatu aduprendu un polinomiu di 6u ordine per eliminà a deriva di u signale. U codice di u prugramma hè statu sviluppatu in MATLAB per determinà u muvimentu globale di i tessuti, u tempu di ciclu, u tempu di rilassamentu è u tempu di cuntrazione (Codice di u prugramma supplementu 44).
Per l'analisi di a deformazione, utilizendu i stessi video creati per a valutazione di l'allungamentu meccanicu, avemu prima tracciatu duie imagine chì rapprisentanu i picchi di muvimentu (i punti di muvimentu più alti (superiori) è più bassi (inferiori)) secondu u software MUSCLEMOTION. Dopu avemu segmentatu e regioni di u tissutu è applicatu una forma d'algoritmu di ombreggiatura à u tissutu segmentatu (Figura Supplementare 2a). U tissutu segmentatu hè statu dopu divisu in dece sottusuperficie, è a tensione nantu à ogni superficia hè stata calculata utilizendu a seguente equazione: Deformazione = (Sup-Sdown)/Sdown, induve Sup è Sdown sò e distanze di a forma da l'ombre superiori è inferiori di u tissutu, rispettivamente (Figura Supplementare .2b).
E sezioni di u core sò state fissate in paraformaldeide à 4% per 48 ore. I tessuti fissati sò stati disidratati in saccarosu à 10% è 20% per 1 ora, dopu in saccarosu à 30% per a notte. E sezioni sò state poi incluse in un cumpostu di temperatura di taglio ottima (cumpostu OCT) è congelate gradualmente in un bagnu isopentano/ghiaccio secco. Conservate i blocchi di inclusione OCT à -80 °C finu à a separazione. I vetrini sò stati preparati cum'è sezioni cù un spessore di 8 μm.
Per caccià l'OCT da e sezioni di u core, scaldate i vetrini nantu à un bloccu riscaldante à 95 °C per 5 minuti. Aghjunghjite 1 ml di PBS à ogni vetrino è incubate per 30 minuti à temperatura ambiente, poi permeate e sezioni impostendu 0,1% Triton-X in PBS per 15 minuti à temperatura ambiente. Per impedisce chì l'anticorpi non specifichi si leghinu à u campione, aghjunghjite 1 ml di soluzione di BSA à 3% à i vetrini è incubate per 1 ora à temperatura ambiente. A BSA hè stata poi rimossa è i vetrini sò stati lavati cù PBS. Marcate ogni campione cù una matita. Anticorpi primari (diluiti 1:200 in 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) è troponina-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) sò stati aghjunti in 90 minuti, dopu anticorpi secundarii (diluiti 1:200 in 1% BSA) contr'à Alexa Fluor 488 di topo (Thermo Scientific; #A16079), contr'à Alexa Fluor 594 di cunigliulu (Thermo Scientific; #T6391) per altri 90 minuti. Lavati 3 volte cù PBS. Per distingue a culurazione di u bersagliu da u sfondate, avemu utilizatu solu l'anticorpu secundariu cum'è cuntrollu. Infine, hè stata aghjunta a culurazione nucleare DAPI è i vetrini sò stati posti in un vectashield (Vector Laboratories) è sigillati cù smalto per unghie. Ingrandimentu -x) è microscopiu Keyence cù ingrandimentu 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) à 5 μg/ml in PBS hè statu utilizatu per a culurazione WGA è applicatu à sezioni fisse per 30 minuti à temperatura ambiente. I vetrini sò stati poi lavati cù PBS è u neru Sudan hè statu aghjuntu à ogni vetrino è incubati per 30 minuti. I vetrini sò stati poi lavati cù PBS è hè statu aghjuntu u mediu d'inclusione vectashield. I vetrini sò stati visualizati nantu à un microscopiu Keyence à un ingrandimentu 40x.
L'OCT hè statu eliminatu da i campioni cum'è descrittu sopra. Dopu avè eliminatu l'OCT, immergete i vetrini in a soluzione di Bouin per a notte. I vetrini sò stati poi sciacquati cù acqua distillata per 1 ora è poi posti in una soluzione di fucsina àcida d'aloe Bibrich per 10 minuti. Dopu, i vetrini sò stati lavati cù acqua distillata è posti in una soluzione di 5% di fosfomolibdenu / 5% di acidu fosfotungsticu per 10 minuti. Senza sciacquà, trasferite i vetrini direttamente in a soluzione di blu d'anilina per 15 minuti. Dopu, i vetrini sò stati lavati cù acqua distillata è posti in una soluzione di 1% di acidu aceticu per 2 minuti. I vetrini sò stati asciugati in etanolu 200 N è trasferiti in xilene. I vetrini colorati sò stati visualizzati cù un microscopiu Keyence cù un obiettivu 10x. A percentuale di l'area di fibrosi hè stata quantificata cù u software Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), numeru di catalogu V13154, secondu u protocolu di u fabricatore cù alcune mudificazioni. In particulare, hè statu utilizatu un punch chirurgicu cù un diametru di 6 mm per assicurà una dimensione uniforme di i tessuti durante l'analisi MTT. I tessuti sò stati piastrati individualmente in i pozzetti di una piastra à 12 pozzetti chì cuntene u substratu MTT secondu u protocolu di u fabricatore. E sezioni sò incubate à 37° C per 3 ore è u tissutu vivu metabolizza u substratu MTT per furmà un cumpostu di formazan viola. Rimpiazzà a suluzione MTT cù 1 ml di DMSO è incubate à 37°C per 15 minuti per estrarre u formazan viola da e sezioni di u core. I campioni sò stati diluiti 1:10 in DMSO in piastre à fondu trasparente à 96 pozzetti è l'intensità di u culore viola hè stata misurata à 570 nm utilizendu un lettore di piastre Cytation (BioTek). E letture sò state nurmalizate à u pesu di ogni fetta di u core.
U mediu di coltura per fette di core hè statu rimpiazzatu cù un mediu chì cuntene 1 μCi/ml di [5-3H]-glucosiu (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) per u test di utilizzazione di u glucosiu cum'è descrittu prima. Dopu à 4 ore d'incubazione, aghjunghje 100 µl di mediu à una provetta di microcentrifuga aperta chì cuntene 100 µl di HCl 0,2 N. Dopu, a provetta hè stata piazzata in una provetta di scintillazione chì cuntene 500 μl di dH2O per evaporà [3H]2O per 72 ore à 37°C. Dopu, caccià a provetta di microcentrifuga da a provetta di scintillazione è aghjunghje 10 ml di fluidu di scintillazione. I conti di scintillazione sò stati effettuati cù un analizzatore di scintillazione liquida Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). L'utilizazione di u glucosiu hè stata dopu calculata tenendu contu di l'attività specifica di u glucosiu [5-3H], l'equilibriu incompletu è u fondu, a diluzione di u glucosiu [5-3H] à u glucosiu senza marcatura è l'efficienza di u contatore di scintillazione. I dati sò nurmalizati à a massa di e sezioni di u core.
Dopu l'omogeneizazione di i tessuti in Trizol, l'ARN hè statu isolatu da sezioni di core utilizendu u Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 secondu u protocolu di u fabricatore. A preparazione di a biblioteca RNAsec, u sequenziamentu è l'analisi di i dati sò stati realizati cum'è seguita:
1 μg di RNA per campione hè statu utilizatu cum'è materiale di partenza per a preparazione di a biblioteca di RNA. E biblioteche di sequenziamentu sò state generate utilizendu u Kit di Preparazione di Librerie di RNA NEBNext UltraTM per Illumina (NEB, USA) seguendu e raccomandazioni di u fabricatore, è i codici d'indice sò stati aghjunti à e sequenze di attributi per ogni campione. In breve, l'mRNA hè statu purificatu da l'RNA tutale utilizendu perle magnetiche attaccate cù oligonucleotidi poli-T. A frammentazione hè realizata utilizendu cationi bivalenti à alta temperatura in NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). U cDNA di u primu filamentu hè statu sintetizatu utilizendu primer esameri aleatorii è trascrittasi inversa M-MuLV (RNase H-). U cDNA di u secondu filamentu hè poi sintetizatu utilizendu DNA polimerasi I è RNase H. E sporgenze rimanenti sò cunvertite in estremità smussate da l'attività esonucleasi/polimerasi. Dopu l'adenilazione di l'estremità 3' di u frammentu di DNA, un Adattatore NEBNext cù una struttura à cappiu hè attaccatu per preparallu per l'ibridazione. Per a selezzione di frammenti di cDNA di lunghezza preferita 150-200 bp. I frammenti di a biblioteca sò stati purificati cù u sistema AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA). Dopu, 3 μl di USER Enzyme (NEB, USA) cù cDNA sceltu per a dimensione è ligatu cù un adattatore hè statu utilizatu per 15 minuti à 37°C è dopu per 5 minuti à 95°C prima di a PCR. A PCR hè stata dopu realizata cù a DNA polimerasi Phusion High-Fidelity, primer PCR universali è primer Index (X). Infine, i prudutti PCR sò stati purificati (sistema AMPure XP) è a qualità di a biblioteca hè stata valutata nantu à un sistema Agilent Bioanalyzer 2100. A biblioteca di cDNA hè stata dopu sequenziata cù un sequenziatore Novaseq. I fugliali d'imagine grezze da Illumina sò stati cunvertiti in letture grezze cù CASAVA Base Calling. I dati grezzi sò almacenati in fugliali di furmatu FASTQ(fq) chì cuntenenu sequenze di lettura è qualità di basa currispondenti. Selezziunate HISAT2 per currisponde à e letture di sequenziamentu filtrate à u genomu di riferimentu Sscrofa11.1. In generale, HISAT2 supporta genomi di qualsiasi dimensione, cumpresi genomi più grandi di 4 miliardi di basi, è i valori predefiniti sò stabiliti per a maiò parte di i parametri. E letture di splicing da i dati di RNA Seq ponu esse allineate in modu efficiente cù HISAT2, u sistema u più veloce attualmente dispunibule, cù a stessa o megliu precisione chè qualsiasi altru metudu.
L'abbundanza di trascritti riflette direttamente u livellu d'espressione genica. I livelli d'espressione genica sò valutati da l'abbundanza di trascritti (conteggio di sequenziamento) assuciati à u genomu o à l'esoni. U numeru di letture hè proporzionale à i livelli d'espressione genica, a lunghezza di u genu è a prufundità di sequenziamento. I FPKM (frammenti per mille coppie di basi di trascritti sequenziati per milione di coppie di basi) sò stati calculati è i valori P di l'espressione differenziale sò stati determinati utilizendu u pacchettu DESeq2. Avemu dopu calculatu u tassu di falsa scuperta (FDR) per ogni valore P utilizendu u metudu Benjamini-Hochberg9 basatu annantu à a funzione R integrata "p.adjust".
L'ARN isolatu da e sezioni di u core hè statu cunvertitu in cDNA à una cuncentrazione di 200 ng/μl utilizendu a miscela SuperScript IV Vilo Master di Thermo (Thermo, cat. n. 11756050). A RT-PCR quantitativa hè stata realizata utilizendu una piastra di reazione trasparente Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well (Thermo, cat. n. 4483319) è un adesivo otticu microamp (Thermo, cat. n. 4311971). A miscela di reazione era custituita da 5 µl di miscela Taqman Fast Advanced Master (Thermo, cat # 4444557), 0,5 µl di Taqman Primer è 3,5 µl di H2O mischiati per pozzetto. I cicli qPCR standard sò stati eseguiti è i valori CT sò stati misurati utilizendu un strumentu PCR in tempu reale Applied Biosystems Quantstudio 5 (modulu 384-well; pruduttu # A28135). I primer Taqman sò stati acquistati da Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). I valori CT di tutti i campioni sò stati nurmalizati à u genu di mantenimentu GAPDH.
A liberazione di u mezu di NT-ProBNP hè stata valutata cù u kit NT-ProBNP (pig) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) secondu u protocolu di u fabricatore. In breve, 250 µl di ogni campione è standard sò stati aghjunti in duplicatu à ogni pozzettu. Subitu dopu l'aghjuntu di u campione, aghjunghje 50 µl di Reagente di Saggio A à ogni pozzettu. Scuzzulate delicatamente a piastra è sigillate cù sigillante. Dopu, e compresse sò state incubate à 37°C per 1 ora. Dopu, aspirate a soluzione è lavate i pozzetti 4 volte cù 350 µl di soluzione di lavaggio 1X, incubendu a soluzione di lavaggio per 1-2 minuti ogni volta. Dopu, aghjunghje 100 µl di Reagente di Saggio B per pozzettu è sigillate cù sigillante per piastre. A compressa hè stata scuzzulata delicatamente è incubata à 37°C per 30 minuti. Aspirate a soluzione è lavate i pozzetti 5 volte cù 350 µl di soluzione di lavaggio 1X. Aghjunghjite 90 µl di suluzione di substratu à ogni pozzettu è sigillate a piastra. Incubate a piastra à 37°C per 10-20 minuti. Aghjunghjite 50 µl di Soluzione di Stop à ogni pozzettu. A piastra hè stata immediatamente misurata cù un lettore di piastre Cytation (BioTek) impostu à 450 nm.
L'analisi di putenza sò state realizate per sceglie e dimensioni di u gruppu chì furnisceranu una putenza >80% per rilevà un cambiamentu assolutu di u 10% in u parametru cù un tassu d'errore di Tipu I di u 5%. L'analisi di putenza sò state realizate per sceglie e dimensioni di u gruppu chì furnisceranu una putenza >80% per rilevà un cambiamentu assolutu di 10% in u parametru cù un tassu d'errore di Tipu I di 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощнос тибора групп 10% абсолютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. L'analisi di putenza hè stata realizata per selezziunà e dimensioni di i gruppi chì furniscenu una putenza >80% per rilevà un cambiamentu di parametri assolutu di u 10% cù un tassu d'errore di Tipu I di u 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мтощнло обнаружения 10% абсолютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Un'analisi di putenza hè stata realizata per selezziunà una dimensione di gruppu chì furnissi una putenza >80% per rilevà un cambiamentu di parametri assolutu di u 10% è un tassu d'errore di tipu I di u 5%.E sezioni di tessuti sò state selezziunate à casu prima di l'esperimentu. Tutte l'analisi eranu in cecu è i campioni sò stati decodificati solu dopu chì tutti i dati eranu stati analizati. U software GraphPad Prism (San Diego, CA) hè statu utilizatu per fà tutte l'analisi statistiche. Per tutte e statistiche, i valori p sò stati cunsiderati significativi à valori <0,05. Per tutte e statistiche, i valori p sò stati cunsiderati significativi à valori <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Per tutte e statistiche, i valori p sò stati cunsiderati significativi à valori <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Per tutte e statistiche, i valori p sò stati cunsiderati significativi à valori <0,05.U test t di Student à duie code hè statu realizatu nantu à i dati cù solu 2 paraguni. L'ANOVA à una via o à duie vie hè stata aduprata per determinà a significatività trà parechji gruppi. Quandu si realizavanu testi post hoc, a currezzione di Tukey hè stata applicata per tene contu di paraguni multipli. I dati RNAsec anu cunsiderazioni statistiche particulari quandu si calcula FDR è p.adjust cum'è descrittu in a sezione Metodi.
Per più infurmazione nantu à u disignu di u studiu, vedi u riassuntu di u Rapportu di Ricerca Naturale ligatu à questu articulu.
Data di publicazione: 28 di settembre di u 2022
