Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com.Versiunea de browser pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS.Pentru cea mai bună experiență, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer).Între timp, pentru a asigura suport continuu, vom reda site-ul fără stiluri și JavaScript.
Este nevoie de un sistem in vitro fiabil care să poată reproduce cu acuratețe mediul fiziologic al inimii pentru testarea medicamentelor.Disponibilitatea limitată a sistemelor de cultură a țesutului cardiac uman a condus la interpretări inexacte ale efectelor medicamentelor cardiace.Aici, am dezvoltat un model de cultură de țesut cardiac (CTCM) care stimulează electromecanic feliile de inimă și suferă o întindere fiziologică în timpul fazelor sistolice și diastolice ale ciclului cardiac.După 12 zile de cultură, această abordare a îmbunătățit parțial viabilitatea secțiunilor cardiace, dar nu a păstrat pe deplin integritatea lor structurală.Prin urmare, după screening-ul cu molecule mici, am constatat că adăugarea a 100 nM de triiodotironină (T3) și 1 μM dexametazonă (Dex) la mediul nostru a menținut microstructura secțiunilor timp de 12 zile.În combinație cu tratamentul T3/Dex, sistemul CTCM a menținut profilurile transcripționale, viabilitatea, activitatea metabolică și integritatea structurală la același nivel cu țesutul proaspăt al inimii timp de 12 zile.În plus, întinderea excesivă a țesutului cardiac în cultură induce semnalizare cardiacă hipertrofică, oferind dovezi pentru capacitatea CTCM de a imita condițiile hipertrofice induse de întinderea cardiacă.În concluzie, CTCM poate modela fiziologia și patofiziologia inimii în cultură pe perioade lungi de timp, permițând screening-ul fiabil al medicamentelor.
Înainte de cercetarea clinică, sunt necesare sisteme in vitro fiabile care pot reproduce cu acuratețe mediul fiziologic al inimii umane.Astfel de sisteme ar trebui să imite întinderea mecanică modificată, ritmul cardiac și proprietățile electrofiziologice.Modelele animale sunt utilizate în mod obișnuit ca platformă de screening pentru fiziologia cardiacă, cu o fiabilitate limitată în reflectarea efectelor medicamentelor în inima umană1,2.În cele din urmă, Modelul Experimental de Cultură de Tesut Cardiic Ideal (CTCM) este un model extrem de sensibil și specific pentru diverse intervenții terapeutice și farmacologice, reproducând cu acuratețe fiziologia și patofiziologia inimii umane3.Absența unui astfel de sistem limitează descoperirea de noi tratamente pentru insuficiența cardiacă4,5 și a condus la cardiotoxicitatea medicamentului ca motiv major pentru ieșirea de pe piață6.
În ultimul deceniu, opt medicamente non-cardiovasculare au fost retrase din utilizarea clinică, deoarece provoacă prelungirea intervalului QT care duce la aritmii ventriculare și moarte subită7.Astfel, există o nevoie tot mai mare de strategii de screening preclinic fiabile pentru a evalua eficacitatea și toxicitatea cardiovasculară.Utilizarea recentă a cardiomiocitelor derivate din celule stem pluripotente induse de om (hiPS-CM) în screeningul medicamentelor și testarea toxicității oferă o soluție parțială la această problemă.Cu toate acestea, natura imatură a hiPS-CM și lipsa complexității multicelulare a țesutului cardiac sunt limitări majore ale acestei metode.Studii recente au arătat că această limitare poate fi depășită parțial prin utilizarea hiPS-CM timpurie pentru a forma hidrogeluri de țesut cardiac la scurt timp după debutul contracțiilor spontane și creșterea treptată a stimulării electrice în timp.Cu toate acestea, acestor microțesuturi hiPS-CM le lipsesc proprietățile electrofiziologice și contractile mature ale miocardului adult.În plus, țesutul cardiac uman are o structură mai complexă, constând dintr-un amestec eterogen de diferite tipuri de celule, inclusiv celule endoteliale, neuroni și fibroblaste stromale, interconectate prin seturi specifice de proteine ​​ale matricei extracelulare.Această eterogenitate a populațiilor non-cardiomiocite11,12,13 în inima mamiferelor adulte este o barieră majoră pentru modelarea țesutului cardiac folosind tipuri individuale de celule.Aceste limitări majore subliniază importanța dezvoltării metodelor de cultivare a țesutului miocardic intact în condiții fiziologice și patologice.
Secțiunile subțiri cultivate (300 µm) ale inimii umane s-au dovedit a fi un model promițător de miocard uman intact.Această metodă oferă acces la un sistem multicelular 3D complet similar cu țesutul cardiac uman.Cu toate acestea, până în 2019, utilizarea secțiunilor cardiace cultivate a fost limitată de supraviețuirea scurtă (24 de ore) a culturii.Acest lucru se datorează unui număr de factori, inclusiv lipsa întinderii fizico-mecanice, interfața aer-lichid și utilizarea unor medii simple care nu suportă nevoile țesutului cardiac.În 2019, mai multe grupuri de cercetare au demonstrat că încorporarea factorilor mecanici în sistemele de cultură a țesutului cardiac poate prelungi viața culturii, poate îmbunătăți expresia cardiacă și poate imita patologia cardiacă.Două studii elegante 17 și 18 arată că încărcarea mecanică uniaxială are un efect pozitiv asupra fenotipului cardiac în timpul culturii.Cu toate acestea, aceste studii nu au folosit încărcarea fizico-mecanică dinamică tridimensională a ciclului cardiac, deoarece secțiunile inimii au fost încărcate fie cu forțe de tracțiune izometrice 17, fie cu încărcare auxotonică liniară 18 .Aceste metode de întindere a țesuturilor au dus la suprimarea multor gene cardiace sau la supraexprimarea genelor asociate cu răspunsuri anormale de întindere.În special, Pitoulis și colab.19 a dezvoltat o baie dinamică de cultură a feliei de inimă pentru reconstrucția ciclului cardiac folosind feedback-ul traductorului de forță și antrenări de tensiune.Deși acest sistem permite modelarea mai precisă a ciclului cardiac in vitro, complexitatea și debitul scăzut al metodei limitează aplicarea acestui sistem.Laboratorul nostru a dezvoltat recent un sistem de cultură simplificat folosind stimularea electrică și un mediu optimizat pentru a menține viabilitatea secțiunilor de țesut cardiac de porc și uman timp de până la 6 zile20,21.
În manuscrisul actual, descriem un model de cultură de țesut cardiac (CTCM) folosind secțiuni ale inimii de porc care încorporează indicii umorale pentru a recapitula fiziologia cardiacă tridimensională și distensia patofiziologică în timpul ciclului cardiac.Acest CTCM poate crește acuratețea predicției pre-clinice de droguri la un nivel niciodată atins până acum prin furnizarea unui sistem cardiac rentabil, cu debit mediu, care imită fiziologia/patofiziologia inimii mamiferelor pentru testarea pre-clinice a medicamentelor.
Semnalele mecanice hemodinamice joacă un rol critic în menținerea funcției cardiomiocitelor in vitro 22,23,24.În manuscrisul actual, am dezvoltat un CTCM (Figura 1a) care poate imita mediul cardiac adult prin inducerea stimulării atât electrice, cât și mecanice la frecvențe fiziologice (1,2 Hz, 72 de bătăi pe minut).Pentru a evita întinderea excesivă a țesutului în timpul diastolei, a fost folosit un dispozitiv de imprimare 3D pentru a crește dimensiunea țesutului cu 25% (Fig. 1b).Stimularea electrică indusă de sistemul C-PACE a fost programată să înceapă cu 100 ms înainte de sistolă folosind un sistem de achiziție de date pentru a reproduce complet ciclul cardiac.Sistemul de cultură de țesuturi folosește un actuator pneumatic programabil (LB Engineering, Germania) pentru a extinde ciclic o membrană flexibilă de silicon pentru a provoca extinderea feliilor de inimă în camera superioară.Sistemul a fost conectat la o linie de aer externă printr-un traductor de presiune, ceea ce a făcut posibilă reglarea precisă a presiunii (± 1 mmHg) și a timpului (± 1 ms) (Fig. 1c).
a Atașați secțiunea de țesut la inelul de sprijin de 7 mm, prezentat cu albastru, în interiorul camerei de cultură a dispozitivului.Camera de cultură este separată de camera de aer printr-o membrană flexibilă subțire de silicon.Puneți o garnitură între fiecare cameră pentru a preveni scurgerile.Capacul dispozitivului conține electrozi de grafit care asigură stimularea electrică.b Reprezentare schematică a dispozitivului de țesut mare, a inelului de ghidare și a inelului de susținere.Secțiunile de țesut (maro) sunt așezate pe dispozitivul supradimensionat cu inelul de ghidare plasat în canelura de pe marginea exterioară a dispozitivului.Folosind ghidajul, așezați cu grijă inelul de sprijin acoperit cu adeziv acrilic pentru țesut peste secțiunea de țesut cardiac.c Grafic care arată timpul de stimulare electrică în funcție de presiunea camerei de aer controlată de un actuator pneumatic programabil (PPD).Un dispozitiv de achiziție de date a fost folosit pentru a sincroniza stimularea electrică folosind senzori de presiune.Când presiunea din camera de cultură atinge pragul setat, un semnal de puls este trimis către C-PACE-EM pentru a declanșa stimularea electrică.d Imaginea a patru CTCM plasate pe un raft de incubator.Patru dispozitive sunt conectate la un PPD printr-un circuit pneumatic, iar senzorii de presiune sunt introduși în supapa hemostatică pentru a monitoriza presiunea din circuitul pneumatic.Fiecare dispozitiv conține șase secțiuni de țesut.
Folosind un singur actuator pneumatic, am putut controla 4 dispozitive CTCM, fiecare dintre acestea putând susține 6 secțiuni de țesut (Fig. 1d).În CTCM, presiunea aerului din camera de aer este convertită în presiune sincronă în camera de fluid și induce expansiunea fiziologică a feliei inimii (Figura 2a și filmul suplimentar 1).Evaluarea întinderii tisulare la 80 mm Hg.Artă.a arătat întinderea secțiunilor de țesut cu 25% (Fig. 2b).S-a demonstrat că această întindere procentuală corespunde unei lungimi fiziologice a sarcomerului de 2,2–2,3 µm pentru contractilitatea normală a secțiunii cardiace17,19,25.Mișcarea țesuturilor a fost evaluată folosind setările personalizate ale camerei (Figura 1 suplimentară).Amplitudinea și viteza mișcării țesuturilor (Fig. 2c, d) au corespuns întinderii în timpul ciclului cardiac și timpului în timpul sistolei și diastolei (Fig. 2b).Întinderea și viteza țesutului cardiac în timpul contracției și relaxării au rămas constante timp de 12 zile în cultură (Fig. 2f).Pentru a evalua efectul stimulării electrice asupra contractilității în timpul culturii, am dezvoltat o metodă pentru determinarea deformității active folosind un algoritm de umbrire (Figura suplimentară 2a, b) și am reușit să distingem între deformări cu și fără stimulare electrică.Aceeași secțiune a inimii (Fig. 2f).În regiunea mobilă a tăieturii (R6-9), tensiunea în timpul stimulării electrice a fost cu 20% mai mare decât în ​​absența stimulării electrice, ceea ce indică contribuția stimulării electrice la funcția contractilă.
Urmele reprezentative ale presiunii camerei de aer, ale presiunii din camera de fluid și ale măsurătorilor mișcării țesutului confirmă faptul că presiunea camerei modifică presiunea camerei de fluid, provocând o mișcare corespunzătoare a feliei de țesut.b Urme reprezentative ale întinderii procentuale (albastru) ale secțiunilor de țesut corespunzătoare întinderii procentuale (portocaliu).c Mișcarea măsurată a secțiunii cardiace este în concordanță cu viteza de mișcare măsurată.(d) Traiectorii reprezentative ale mișcării ciclice (linia albastră) și vitezei (linia punctată portocalie) într-o felie a inimii.e Cuantificarea timpului de ciclu (n = 19 felii per grup, de la diferiți porci), timpul de contracție (n = 19 felii pe grup), timpul de relaxare (n = 19 felii pe grup, de la diferiți porci), mișcarea țesuturilor (n = 25 ).felii)/grup de la diferiți porci), viteza sistolică de vârf (n = 24(D0), 25(D12) felii/grup de la diferiți porci) și rata de relaxare maximă (n=24(D0), 25(D12) felii/grup de la diferiți porci).Testul t Student cu două cozi nu a arătat nicio diferență semnificativă în niciun parametru.f Urme reprezentative de analiză a tulpinilor ale secțiunilor de țesut cu stimulare electrică (roșu) și fără (albastru), zece zone regionale de secțiuni de țesut din aceeași secțiune.Panourile de jos arată cuantificarea diferenței procentuale de deformare în secțiuni de țesut cu și fără stimulare electrică în zece zone din secțiuni diferite. (n = 8 felii/grup de la diferiți porci, se efectuează testul t Student cu două cozi; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 felii/grup de la diferiți porci, se efectuează testul t Student cu două cozi; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; *****p<0,1,00,<p<0,0,**p). (n = 8 secțiuni/grup din diferiți porci, testul t Student cu două cozi; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,0,05） （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*p < 0,0,05） (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *5). (n = 8 secțiuni/grup, de la diferiți porci, testul t Student cu două cozi; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Barele de eroare reprezintă media ± abaterea standard.
În sistemul nostru anterior de cultură biomimetică a feliilor de inimă [20, 21], am menținut viabilitatea, funcția și integritatea structurală a feliilor de inimă timp de 6 zile prin aplicarea stimulării electrice și optimizarea compoziției mediului.Cu toate acestea, după 10 zile, aceste cifre au scăzut brusc.Ne vom referi la secțiunile cultivate în sistemul nostru anterior de cultură biomimetică 20, 21 condițiile de control (Ctrl) și vom folosi mediul nostru optimizat anterior ca condiții MC și cultură sub stimulare mecanică și electrică simultană (CTCM).numit .În primul rând, am stabilit că stimularea mecanică fără stimulare electrică a fost insuficientă pentru a menține viabilitatea țesuturilor timp de 6 zile (Figura suplimentară 3a, b).În mod interesant, odată cu introducerea stimulării fizico-mecanice și electrice folosind STCM, viabilitatea secțiunilor inimii de 12 zile a rămas aceeași ca și în secțiunile inimii proaspete în condiții MS, dar nu în condiții Ctrl, așa cum arată analiza MTT (Fig. 1).3a).Acest lucru sugerează că stimularea mecanică și simularea ciclului cardiac pot menține secțiunile de țesut viabile de două ori mai mult decât a raportat în sistemul nostru anterior de cultură statică.Cu toate acestea, evaluarea integrității structurale a secțiunilor de țesut prin imunomarcarea troponinei T cardiace și a conexinei 43 a arătat că expresia conexinei 43 a fost semnificativ mai mare în țesuturile MC în ziua 12 decât la martorii în aceeași zi.Cu toate acestea, expresia uniformă a conexinei 43 și formarea discului Z nu au fost menținute pe deplin (Fig. 3b).Folosim un cadru de inteligență artificială (AI) pentru a cuantifica integritatea structurală a țesuturilor26, o conductă de învățare profundă bazată pe imagini bazată pe colorarea cu troponină-T și conexină43 pentru a cuantifica automat integritatea structurală și fluorescența feliilor de inimă în ceea ce privește puterea localizării.Această metodă utilizează o rețea neuronală convoluțională (CNN) și un cadru de învățare profundă pentru a cuantifica în mod fiabil integritatea structurală a țesutului cardiac într-un mod automat și imparțial, așa cum este descris în referință.26. Țesutul MC a arătat o similaritate structurală îmbunătățită cu ziua 0 în comparație cu secțiunile de control statice.În plus, colorarea tricrom a lui Masson a evidențiat un procent semnificativ mai mic de fibroză în condiții de SM comparativ cu condițiile de control în ziua 12 de cultură (Fig. 3c).În timp ce CTCM a crescut viabilitatea secțiunilor de țesut cardiac în ziua 12 la un nivel similar cu cel al țesutului cardiac proaspăt, nu a îmbunătățit semnificativ integritatea structurală a secțiunilor cardiace.
un grafic cu bare arată cuantificarea viabilității MTT a felurilor de inimă proaspătă (D0) sau a culturii de felii de inimă timp de 12 zile, fie în cultură statică (D12 Ctrl) fie în CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 Ctrl/MC), 12 (D12 Ctrl/MC), se efectuează într-un mod diferit de A## test; 0,0001 față de D0 și **p <0,01 față de D12 Ctrl). un grafic cu bare arată cuantificarea viabilității MTT a felurilor de inimă proaspătă (D0) sau a culturii de felii de inimă timp de 12 zile, fie în cultură statică (D12 Ctrl) fie în CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 Ctrl MC, 12 (D12 Ctrl MC, într-un mod diferit) < 0,0001 față de D0 și **p < 0,01 față de D12 Ctrl).histograma arată cuantificarea viabilității secțiunilor de inimă proaspătă MTT (D0) sau a culturii de secțiuni de inimă timp de 12 zile fie în cultură statică (control D12), fie în CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (control D12).####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 față de D0 și **p < 0,01 față de D12 Ctrl). un 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl)养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA，#0 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA，#0 测踕#0. 001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 o 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl)的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl ，比。**phistograma care arată cuantificarea viabilității MTT în secțiuni de inimă proaspătă (D0) sau secțiuni de inimă cultivate timp de 12 zile în cultură statică (control D12) sau CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (control D12)), 12 (D12 MC) secțiuni/grup de la testul ANOVA unidirecțional;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 față de D0, **p < 0,01 față de D12 Ctrl).b Troponina-T (verde), conexina 43 (roșu) și DAPI (albastru) în secțiuni de inimă proaspăt izolate (D0) sau secțiuni de inimă cultivate în condiții statice (Ctrl) sau condiții CTCM (MC) timp de 12 zile) de imagini reprezentative de imunofluorescență (scara goală = 100 µm). Cuantificarea prin inteligență artificială a integrității structurale a țesutului inimii (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) felii/grup fiecare de la porc diferit, se efectuează testul ANOVA unidirecțional; ####p < 0,0001 față de D0 și ****p < 0,00012 C). Cuantificarea prin inteligență artificială a integrității structurale a țesutului cardiac (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) felii/grup fiecare de la diferiți porci, se efectuează testul ANOVA unidirecțional; ####p < 0,0001 față de D0 și ****p < 0,001 C față de D01). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектой целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (D1), (D12), (D12), (D12), (D1) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравненей, проводится однофакторный тест ANOVA; ию с D12 Ctrl). Cuantificarea integrității structurale a țesutului cardiac prin inteligență artificială (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) secțiuni/grupe de la diferiți porci, test ANOVA unidirecțional efectuat; ####p < 0,0001 vs. cu D0 și ****p < 0,0001 C comparativ cu D).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) felii/grup fiecare dintre porci diferiți, test ANOVA unidirecțional <; ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) felii/grup fiecare dintre diferiţi porci, test ANOVA unidirecţional 0 人####0 曔. ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной тканL (D12), (D12), =77нl (D12), MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs D0 Для сран0вне1 сран0вне1 с D12 Ctrl). Inteligența artificială pentru cuantificarea integrității structurale a țesutului cardiac (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) secțiuni/grup fiecare dintre diferiți porci, test ANOVA unidirecțional; ####p<0,0001 vs .D0 Pentru comparație ****p < 0,0001 C comparativ cu D). c Imagini reprezentative (stânga) și cuantificare (dreapta) pentru feliile de inimă colorate cu colorația tricrom Masson (Scală goală = 500 µm) (n = 10 felii/grup fiecare de la un porc diferit, se efectuează testul ANOVA unidirecțional; ####p < 0,0001 comparativ cu D0 și *** 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 c Imagini reprezentative (stânga) și cuantificare (dreapta) pentru feliile de inimă colorate cu colorația tricrom Masson (Scale bare = 500 µm) (n = 10 felii/grup fiecare de la diferiți porci, se efectuează testul ANOVA unidirecțional; #### p < 0,0001 comparativ cu C0lr și D***). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца сердца, окличественная оценка (справа) срезов сердца, окрынца сителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свистоной свистоня вестоной ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Imagini reprezentative (stânga) și cuantificare (dreapta) a secțiunilor inimii colorate cu colorație tricrom Masson (scara neacoperită = 500 µm) (n = 10 secțiuni/grup de la diferiți porci, test ANOVA unidirecțional efectuat; #### p < 0,0001 comparativ cu D0 și *** 2 Ctr. c. Masson切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比 与D0 相比 与D0 相比，D***0，，***0４，D４４４４，Dp 。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 心脏 切片 的 左 左）度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向#0 单向#0 浛#0#0 Anova ．0.相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца сердца, окличественный анализ (справа) срезов сердца, окрамы сителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, просод свиньи, прою срезов/группа) факторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению Crсl). c Imagini reprezentative (stânga) și cuantificare (dreapta) a secțiunilor inimii colorate cu colorație tricrom Masson (blank = 500 µm) (n = 10 secțiuni/grup, fiecare de la un porc diferit, testate prin analiza unidirecțională a varianței ;### # p < 0,0001 comparativ cu D0, *** 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1Barele de eroare reprezintă media ± abaterea standard.
Am emis ipoteza că prin adăugarea de molecule mici la mediul de cultură, integritatea cardiomiocitelor ar putea fi îmbunătățită și dezvoltarea fibrozei ar putea fi redusă în timpul culturii CTCM.Prin urmare, am căutat molecule mici folosind culturile noastre de control static20,21 datorită numărului mic de factori de confuzie.Dexametazona (Dex), triiodotironina (T3) și SB431542 (SB) au fost alese pentru acest ecran.Aceste molecule mici au fost utilizate anterior în culturile hiPSC-CM pentru a induce maturarea cardiomiocitelor prin creșterea lungimii sarcomerului, a tubilor T și a vitezei de conducere.În plus, atât Dex (un glucocorticoid) cât și SB sunt cunoscute pentru suprimarea inflamației29,30.Prin urmare, am testat dacă includerea uneia sau a unei combinații a acestor molecule mici ar îmbunătăți integritatea structurală a secțiunilor inimii.Pentru screening-ul inițial, doza fiecărui compus a fost selectată pe baza concentrațiilor utilizate în mod obișnuit în modelele de cultură celulară (1 μM Dex27, 100 nM T327 și 2,5 μM SB31).După 12 zile de cultură, combinația dintre T3 și Dex a dus la o integritate structurală optimă a cardiomiocitelor și o remodelare fibroasă minimă (Figurile suplimentare 4 și 5).În plus, utilizarea dublării sau dublei acestor concentrații de T3 și Dex a produs efecte dăunătoare în comparație cu concentrațiile normale (Fig. 6a, b suplimentare).
După screening-ul inițial, am efectuat o comparație cap la cap a 4 condiții de cultură (Figura 4a): Ctrl: secțiuni de inimă cultivate în cultura statică descrisă anterior folosind mediul nostru optimizat;20.21 TD: T3 și Ctrl s Added Dex miercuri;MC: secțiuni de inimă cultivate în CTCM folosind mediul nostru optimizat anterior;și MT: CTCM cu T3 și Dex adăugate la mediu.După 12 zile de cultivare, viabilitatea țesuturilor MS și MT a rămas aceeași ca și în țesuturile proaspete evaluate prin testul MTT (Fig. 4b).În mod interesant, adăugarea de T3 și Dex la culturile transwell (TD) nu a avut ca rezultat o îmbunătățire semnificativă a viabilității în comparație cu condițiile Ctrl, indicând un rol important al stimulării mecanice în menținerea viabilității secțiunilor cardiace.
o diagramă de proiectare experimentală care ilustrează cele patru condiții de cultură utilizate pentru a evalua efectele stimulării mecanice și suplimentării T3/Dex pe mediu timp de 12 zile. b Graficul cu bare arată cuantificarea viabilității la 12 zile după cultură în toate cele 4 condiții de cultură (Ctrl, TD, MC și MT) în comparație cu felii de inimă proaspătă (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD și D12 MT), 12 (D12 TD, MC și MT) de la un fel de teste diferite; 0,0001, ###p < 0,001 în comparație cu D0 și **p < 0,01 în comparație cu D12 Ctrl). b Graficul cu bare arată cuantificarea viabilității la 12 zile după cultură în toate cele 4 condiții de cultură (Ctrl, TD, MC și MT) în comparație cu felii de inimă proaspătă (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD și D12 MT), 12 (D12 TD, MC și MT) de la un fel de teste diferite; 0,0001, ###p < 0,001 față de D0 și **p < 0,01 față de D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после венную оценку жизнеспособности через 12 дней после венную ви4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (D0) (D01, D18 = D18) (D01, D18 = D18) 12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,00001 сорна 0,00001 0,000 0001 0 D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Graficul cu bare arată cuantificarea viabilității la 12 zile după cultură în toate cele 4 condiții de cultură (martor, TD, MC și MT) în comparație cu secțiunile de inimă proaspătă (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD și D12 MT), 12 (D12 MC) secțiuni/grupe diferite de teste ANOVA, #-0; 1, ###p < 0,001 față de D0 și **p < 0,01 în comparație cu D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D150)、D12、D12、MT）与新鲜心脏切片(D0)和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.0001，#，，，，D##p 01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнения сравнения сравнению сравнения ца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD și D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, однопа, ###0сторо,##0нторов, p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histograma care arată toate cele 4 condiții de cultură (martor, TD, MC și MT) în comparație cu secțiunile de inimă proaspătă (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD și D12 MT), de la diferiți porci 12 (D12 MC) secțiuni/grup, test ANOVA unidirecțional, #.###0. **p<0,01 față de controlul D12). c Graficul cu bare arată cuantificarea fluxului de glucoză la 12 zile după cultură în toate cele 4 condiții de cultură (Ctrl, TD, MC și MT) în comparație cu felii de inimă proaspătă (D0) (n = 6 felii/grup de la diferiți porci, se efectuează testul ANOVA unidirecțional; ###p < 0,001, comparativ cu D0.0. c Graficul cu bare arată cuantificarea fluxului de glucoză la 12 zile după cultură în toate cele 4 condiții de cultură (Ctrl, TD, MC și MT) în comparație cu felii de inimă proaspătă (D0) (n = 6 felii/grup de la diferiți porci, se efectuează testul ANOVA unidirecțional; ###p < 0,001, comparativ cu D0.0. c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после ственную оценку потока глюкозы через 12 дней после курьволе кулховта овиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 правнению свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравненению сравнению). c Histograma arată cuantificarea fluxului de glucoză la 12 zile post-cultură în toate cele 4 condiții de cultură (martor, TD, MC și MT) în comparație cu secțiuni de inimă proaspătă (D0) (n = 6 secțiuni/grup de la diferiți porci, test ANOVA unidirecțional efectuat; ###p < 0,001 comparativ cu D0 și ***p < 0 la D002). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 盌柯1＄囌柯1）糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 ，与D0 ， 与D0 ， ， 0*** l 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切縇片 切片片后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， 定量 ， ， 定量 ， A试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней послева и после виль 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (пра Сравнению) ных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сниро по снию с D0. c Histograma care arată cuantificarea fluxului de glucoză la 12 zile după cultură pentru toate cele 4 condiții de cultură (martor, TD, MC și MT) în comparație cu secțiunile de inimă proaspătă (D0) (n = 6 secțiuni/grup, de la diferiți porci, unilaterale. Au fost efectuate teste ANOVA, ###p < 0,001 comparativ cu controlul (D0, 0,101).d Diagrame de analiză a tulpinilor de țesuturi proaspete (albastre), MC din ziua 12 (verde) și din ziua 12 MT (roșu) la zece puncte regionale de secțiune de țesut (n = 4 felii/grup, test ANOVA unidirecțional; nu a existat nicio diferență semnificativă între grupuri).e Graficul vulcanului care arată gene exprimate diferențial în secțiuni de inimă proaspătă (D0) în comparație cu secțiuni de inimă cultivate în condiții statice (Ctrl) sau în condiții MT (MT) timp de 10-12 zile.f Harta termică a genelor de sarcomere pentru secțiuni de inimă cultivate în fiecare dintre condițiile de cultură.Barele de eroare reprezintă media ± abaterea standard.
Dependența metabolică de trecerea de la oxidarea acizilor grași la glicoliză este un semn distinctiv al dediferențierii cardiomiocitelor.Cardiomiocitele imature folosesc în principal glucoză pentru producerea de ATP și au mitocondrii hipoplazice cu puține criste5,32.Analizele de utilizare a glucozei au arătat că în condițiile MC și MT, utilizarea glucozei a fost similară cu cea din țesuturile din ziua 0 (Figura 4c).Cu toate acestea, probele Ctrl au arătat o creștere semnificativă a utilizării glucozei în comparație cu țesutul proaspăt.Acest lucru indică faptul că combinația de CTCM și T3/Dex îmbunătățește viabilitatea țesuturilor și păstrează fenotipul metabolic al secțiunilor cardiace cultivate de 12 zile.În plus, analiza tulpinii a arătat că nivelurile de tulpină au rămas aceleași ca în țesutul proaspăt al inimii timp de 12 zile în condiții MT și MS (Fig. 4d).
Pentru a analiza impactul general al CTCM și T3/Dex asupra peisajului transcripțional global al țesutului felii cardiace, am efectuat RNAseq pe felii cardiace din toate cele patru condiții de cultură diferite (Date suplimentare 1).Interesant, secțiunile MT au arătat o asemănare transcripțională ridicată cu țesutul proaspăt al inimii, cu doar 16 exprimate diferențiat din 13.642 de gene.Cu toate acestea, așa cum am arătat mai devreme, feliile Ctrl au afișat 1229 de gene exprimate diferențial după 10-12 zile în cultură (Fig. 4e).Aceste date au fost confirmate de qRT-PCR a genelor inimii și fibroblastelor (Fig. 7a-c suplimentare).Interesant, secțiunile Ctrl au arătat o reglare în jos a genelor cardiace și ale ciclului celular și activarea programelor de gene inflamatorii.Aceste date sugerează că dediferențierea, care are loc în mod normal după cultivarea pe termen lung, este complet atenuată în condiții MT (Fig. 8a, b suplimentară).Studiul atent al genelor sarcomerului a arătat că numai în condiții MT sunt păstrate genele care codifică sarcomerul (Fig. 4f) și canalul ionic (Figura 9 suplimentară), protejându-le de suprimare în condiții Ctrl, TD și MC.Aceste date demonstrează că, cu o combinație de stimulare mecanică și umorală (T3/Dex), transcriptomul felii de inimă poate rămâne similar cu feliile de inimă proaspătă după 12 zile în cultură.
Aceste constatări transcripționale sunt susținute de faptul că integritatea structurală a cardiomiocitelor în secțiunile inimii este cel mai bine păstrată în condiții MT timp de 12 zile, așa cum se arată de conexina 43 intactă și localizată (Fig. 5a).În plus, fibroza în secțiunile cardiace în condiții MT a fost redusă semnificativ în comparație cu Ctrl și similar cu secțiunile inimii proaspete (Fig. 5b).Aceste date demonstrează că combinația dintre stimularea mecanică și tratamentul T3/Dex păstrează în mod eficient structura cardiacă în secțiunile cardiace în cultură.
a Imagini reprezentative de imunofluorescență ale troponinei-T (verde), conexinei 43 (roșu) și DAPI (albastru) în secțiuni cardiace proaspăt izolate (D0) sau cultivate timp de 12 zile în toate cele patru condiții de cultură a secțiunii cardiace (bară de scară = 100 µm).). Cuantificarea prin inteligență artificială a integrității structurale a țesutului cardiac (n = 7 (D0 și D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC și D12 MT) felii/grup de la diferiți porci, se efectuează testul ANOVA unidirecțional; ####p < 0,0001 față de D0 și *p2, < 0,0 p * 1, < 0,0 **** trl). Cuantificarea prin inteligență artificială a integrității structurale a țesutului inimii (n = 7 (D0 și D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC și D12 MT) felii/grup de la diferiți porci, se efectuează testul ANOVA unidirecțional; #### p < 0,0001 față de D0 și *p2, < 0,0 p * 1, < 0,0 p. trl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного = интель (Dr 1) 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0 пено сх в 0,с 0 0 p < 0 пен0 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Cuantificarea integrității structurale a țesutului cardiac folosind inteligență artificială (n = 7 (D0 și D12 CTRL), 5 (D12 TD, D12 MC și D12 MT) secțiuni/grup de porci diferiți, test ANOVA unic, efectuate; #### P <0,0001 în comparație cu D0 și*p <0,05 sau **** p <0.0001 comparat cu D12 CTRL).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和/D12 和廿艺 廿艺 廈 MT工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,00001 与D0 和*p < 0,05 相比，或****p < 0,00001 与D01炯对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 td 、 d12 mc （ 和 d12 mc） 和 d12 ）智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相 0,05 相 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0相比）。Cuantificarea integrității structurale a țesutului cardiac folosind inteligența artificială la diferiți porci (n = 7 (D0 și D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC și D12 MT) secțiuni/grup) cu un test ANOVA unidirecțional;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 comparativ cu D0 și *p < 0,05 sau ****p < 0,0001 față de D12 Ctrl). b Imagini reprezentative și cuantificare pentru felii de inimă colorate cu colorație tricrom Masson (Bară de scară = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD și D12 MC), 9 (D12 MT) felii/grup de la diferiți porci, unidirecționat și testul ANOVA##0 este efectuat <***0##0p; < 0,001 sau ****p < 0,0001 comparativ cu D12 Ctrl). b Imagini reprezentative și cuantificare pentru felii de inimă colorate cu colorație tricrom Masson (Bară de scară = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD și D12 MC), 9 (D12 MT) felii/grup de la diferiți porci, unidirecționat și testul ANOVA##0 este efectuat <***0##0p; < 0,001 sau ****p < 0,0001 comparativ cu D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных трашенных трашенных трашенных траственная оценка срезов сердца а (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от раныно разнот разноя сторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению сl D12 Ct). b Imagini reprezentative și cuantificarea secțiunilor de inimă colorate cu colorație tricrom Masson (bară de scară = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD și D12 MC), 9 (D12 MT) secțiuni/grup de la diferiți porci, efectuate ANOVA unidirecțională <; #0.##0.p.0. ****p < 0,0001 față de D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm））（D1010（D1010（D1010（D1010和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析； 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析； 个析； 个 析； 析； 缔 析； 缔４４４４４４４４４４４４４４４ 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） 10 （ （ 500 µm（ （ 10 （ （ （ （ ） rl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 爇片 切片 爇片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析，01 分析， 析， 析， 片 切片/组，进行单因素方差分析， 析 01 < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных трашенных тросо ая линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD și D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусней / грусопы,#0; 01 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Imagini reprezentative și cuantificarea secțiunilor de inimă colorate cu tricromul Masson (bară de scară = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD și D12 MC), 9 (D12 MT) secțiuni de la diferiți porci/grup, o metodă ANOVA; 0,0001 comparativ cu D12 Ctrl).Barele de eroare reprezintă media ± abaterea standard.
În cele din urmă, capacitatea CTCM de a imita hipertrofia cardiacă a fost evaluată prin creșterea întinderii țesutului cardiac.În CTCM, presiunea maximă în camera de aer a crescut de la 80 mmHg la 80 mmHg.Artă.(întindere normală) până la 140 mmHg Art.(Fig. 6a).Aceasta corespunde unei creșteri de 32% a întinderii (Fig. 6b), care a fost prezentat anterior ca întinderea procentuală corespunzătoare necesară pentru secțiunile inimii pentru a obține o lungime a sarcomerului similară cu cea observată în hipertrofie.Întinderea și viteza țesutului cardiac în timpul contracției și relaxării au rămas constante pe parcursul a șase zile de cultură (Fig. 6c).Țesutul cardiac din condițiile MT a fost supus unor condiții normale de întindere (MT (Normal)) sau condiții de supraîntindere (MT (OS)) timp de șase zile.Deja după patru zile de cultură, biomarkerul hipertrofic NT-ProBNP a fost semnificativ crescut în mediu în condiții MT (OS) comparativ cu condițiile MT (normale) (Fig. 7a).În plus, după șase zile de cultură, dimensiunea celulei în MT (OS) (Fig. 7b) a crescut semnificativ în comparație cu secțiunile inimii MT (normale).În plus, translocarea nucleară NFATC4 a fost semnificativ crescută în țesuturile supraîntinse (Fig. 7c).Aceste rezultate arată dezvoltarea progresivă a remodelării patologice după hiperdistensiune și susțin conceptul că dispozitivul CTCM poate fi utilizat ca o platformă pentru a studia semnalizarea hipertrofiei cardiace induse de întindere.
Urmele reprezentative ale presiunii camerei de aer, ale presiunii din camera de fluid și ale măsurătorilor mișcării țesutului confirmă faptul că presiunea camerei modifică presiunea camerei de fluid, provocând o mișcare corespunzătoare a feliei de țesut.b Curbele reprezentative pentru procentul de întindere și rata de întindere pentru secțiunile de țesut normal întinse (portocaliu) și supraîntindere (albastru).c Grafic cu bare care arată timpul ciclului (n = 19 felii per grup, de la diferiți porci), timpul de contracție (n = 18-19 felii pe grup, de la diferiți porci), timpul de relaxare (n = 19 felii pe grup, de la diferiți porci) ), amplitudinea mișcării țesuturilor (n = 14 felii / grup), viteza (peak = 1 grupă de porci), viteză (peak = 1 grupă), viteză = 1 pile/grup de la diferiți porci) și rata maximă de relaxare (n = 14 (D0), 15 (D6) ) secțiuni/grupe) de la diferiți porci), testul t Student cu două cozi nu a arătat nicio diferență semnificativă în niciun parametru, indicând faptul că acești parametri au rămas constanți pe parcursul a 6 zile de cultură cu supratensiune.Barele de eroare reprezintă media ± abaterea standard.
a Cuantificare grafică a concentrației de NT-ProBNP în mediul de cultură din felii de inimă cultivate în condiții MT de întindere normală (Norm) sau supraîntindere (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm și D4 MTOS) felii/grup de la diferiți porci, se efectuează ANOVA bidirecțională < 0 întindere normală.**1p. o Cuantificare grafică a concentrației de NT-ProBNP în mediul de cultură din felii de inimă cultivate în condiții MT de întindere normală (Norm) sau supraîntindere (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm și D4 MTOS) felii/grup de la diferiți porci, se efectuează ANOVA bidirecțională < 0,01p.Histograma cantitativă a concentrației NT-ProBNP în mediul de cultură din felii de inimă cultivate în condiții de întindere MT normală (normă) sau supraîntindere (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm și D4).MTOS) felii/grup de la diferiți porci, se efectuează analiza bifactorială a varianței;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 comparativ cu întinderea normală). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓坡閼坡齄浓坡培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；差分析；丣析）来自不同猪的切片/组． 0,01）。 a Cuantificarea concentrației de NT-ProBNP în felii de inimă cultivate în condiții MT de întindere normală (Norm) sau de supraîntindere (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) din diferite comparativ cu întinderea normală, p < 0,01).histogramă Cuantificarea concentrațiilor de NT-ProBNP în felii de inimă cultivate în condiții de întindere MT normală (normă) sau supraîntindere (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) și D4 MTOS) felii/grup de la diferiți porci, analiza bidirecțională a varianței;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 comparativ cu întinderea normală). b Imagini reprezentative pentru felii de inimă colorate cu troponină-T și WGA (stânga) și cuantificarea mărimii celulei (dreapta) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) celule/grup din 10 felii diferite de la porci diferiți, se efectuează testul t Student cu două cozi; ****p<1, comparativ cu 000000. b Imagini reprezentative pentru felii de inimă colorate cu troponină-T și WGA (stânga) și cuantificarea mărimii celulei (dreapta) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) celule/grup din 10 felii diferite de la porci diferiți, se efectuează testul t Student cu două cozi; ****0 p<10. b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слестова) АЗП (слестова) пичнных тропонином-Т ения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезных срезов от срезов от-вори,зния празмера клеток (справа) тся хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Imagini reprezentative ale secțiunilor inimii colorate cu troponină-T și AZP (stânga) și cuantificarea mărimii celulei (dreapta) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) celule/grup din 10 secțiuni diferite de la porci diferiți, a fost efectuat testul t Student cu două cozi; ****p < 0 în comparație cu 0000 normal). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表弈左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性30（（（30（（） ，来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生有尾学生切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生有尾学生t 棸丛䔟 漋棸锟t 漉減锟 漉減锟，****p < 0,0001）。 b Imagini reprezentative ale feliilor de inimă colorate cu calcarein-T și WGA (stânga) și dimensiunea celulei (dreapta) (n = 330 (D6 MTOS), 369 din 10 felii diferite (D6 MTNorm)) Celule/组，两方法有尾孕有尾学compararea cu testul de întindere ****0，0，0，0，0，0，00， ). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слестнава) ичнтативные размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свируней пи, Крунетпи, Курнеток критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Imagini reprezentative ale secțiunilor inimii colorate cu troponin-T și AZP (stânga) și cuantificarea mărimii celulei (dreapta) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) din 10 secțiuni diferite de la diferiți porci) Celule/grup, criteriul cu două cozi Student's t;****p < 0,0001 comparativ cu tulpina normală). c Imagini reprezentative pentru feliile de inimă MTOS din ziua 0 și ziua 6 imunomarcate pentru troponină-T și NFATC4 și cuantificarea translocării NFATC4 la nucleele CM-urilor (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) felii/grup de la diferiți porci, testul t Student cu două cozi se efectuează.005). c Imagini reprezentative pentru feliile de inimă MTOS din ziua 0 și ziua 6 imunomarcate pentru troponină-T și NFATC4 și cuantificarea translocării NFATC4 la nucleele CM-urilor (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) felii/grup de la diferiți porci, * testul Student cu două cozi; t-p este efectuat). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тро-пон и тро-по и тро-по и трозентативные енная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группау овсов/группу осви нырта озных клеток я двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Imagini reprezentative pentru secțiuni de inimă la 0 și 6 zile MTOS, imunomarcate pentru troponina-T și NFATC4 și cuantificarea translocației NFATC4 în nucleul celulelor cavernoase (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) felii/grup de la diferiți porci) efectuate cu două cozi;*p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表怏，标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表怏，标记的第天和第6的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生双尾学生双尾学生t 0)〪) <0.*锟t 0. c Imagini reprezentative ale feliilor de inimă 第0天和第6天MTOS de imunomarcare cu calcanin-T și NFATC4 și NFATC4 din diferite nuclee de celule NFATC4 易位至CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS,) 易位至CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS,)学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тромуномаркировки тром поТи тром по 4 енная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два-статры Стрех юдента; *p < 0,05). c Imagini reprezentative ale feliilor de inimă MTOS în zilele 0 și 6 pentru imunomarcarea troponinei-T și NFATC4 și cuantificarea translocației NFATC4 în nucleul CM de la diferiți porci (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) felii/grup, criteriul t cu două cozi.Barele de eroare reprezintă media ± abaterea standard.
Cercetarea cardiovasculară translațională necesită modele celulare care reproduc cu acuratețe mediul cardiac.În acest studiu, a fost dezvoltat și caracterizat un dispozitiv CTCM care poate stimula secțiuni ultrasubțiri ale inimii.Sistemul CTCM include stimularea electromecanica sincronizata fiziologic si imbogatirea fluidelor T3 si Dex.Când secțiunile inimii porcine au fost expuse la acești factori, viabilitatea lor, integritatea structurală, activitatea metabolică și expresia transcripțională au rămas aceleași ca în țesutul proaspăt al inimii după 12 zile de cultură.În plus, întinderea excesivă a țesutului cardiac poate provoca hipertrofia inimii cauzată de hiperextensie.În general, aceste rezultate susțin rolul critic al condițiilor de cultură fiziologică în menținerea unui fenotip cardiac normal și oferă o platformă pentru screeningul medicamentelor.
Mulți factori contribuie la crearea unui mediu optim pentru funcționarea și supraviețuirea cardiomiocitelor.Cei mai evidenti dintre acești factori sunt legați de (1) interacțiuni intercelulare, (2) stimulare electromecanică, (3) factori umorali și (4) substraturi metabolice.Interacțiunile fiziologice celulă-celulă necesită rețele tridimensionale complexe de mai multe tipuri de celule susținute de o matrice extracelulară.Astfel de interacțiuni celulare complexe sunt dificil de reconstruit in vitro prin co-cultură a unor tipuri de celule individuale, dar pot fi realizate cu ușurință folosind natura organotipică a secțiunilor inimii.
Întinderea mecanică și stimularea electrică a cardiomiocitelor sunt critice pentru menținerea fenotipului cardiac33,34,35.În timp ce stimularea mecanică a fost utilizată pe scară largă pentru condiționarea și maturarea hiPSC-CM, mai multe studii elegante au încercat recent stimularea mecanică a feliilor de inimă în cultură folosind încărcarea uniaxială.Aceste studii arată că încărcarea mecanică uniaxială 2D are un efect pozitiv asupra fenotipului inimii în timpul culturii.În aceste studii, secțiunile inimii au fost fie încărcate cu forțe de tracțiune izometrice17, încărcare auxotonică liniară18, fie ciclul cardiac a fost recreat folosind feedback-ul traductorului de forță și antrenări de tensiune.Cu toate acestea, aceste metode folosesc întinderea uniaxială a țesutului fără optimizarea mediului, ceea ce duce la suprimarea multor gene cardiace sau supraexprimarea genelor asociate cu răspunsuri anormale de întindere.CTCM descris aici oferă un stimul electromecanic 3D care imită ciclul cardiac natural în ceea ce privește durata ciclului și întinderea fiziologică (25% întindere, 40% sistolă, 60% diastolă și 72 de bătăi pe minut).Deși această stimulare mecanică tridimensională singură nu este suficientă pentru a menține integritatea țesuturilor, este necesară o combinație de stimulare umorală și mecanică folosind T3/Dex pentru a menține în mod adecvat viabilitatea, funcția și integritatea țesuturilor.
Factorii umorali joacă un rol important în modularea fenotipului cardiac adult.Acest lucru a fost evidențiat în studiile HiPS-CM în care T3 și Dex au fost adăugate la mediile de cultură pentru a accelera maturarea celulelor.T3 poate influența transportul aminoacizilor, zaharurilor și calciului prin membranele celulare36.În plus, T3 promovează expresia MHC-α și reglarea în jos a MHC-β, promovând formarea de miofibrile cu contracție rapidă în cardiomiocitele mature în comparație cu miofibrilele cu contracție lentă din CM fetală.Deficiența de T3 la pacienții cu hipotiroidie are ca rezultat pierderea benzilor miofibrilare și o rată redusă de dezvoltare a tonusului37.Dex acționează asupra receptorilor de glucocorticoizi și s-a dovedit că crește contractilitatea miocardică în inimile izolate perfuzate;38 se crede că această îmbunătățire este legată de efectul asupra intrării determinate de depozite de calciu (SOCE) 39,40.În plus, Dex se leagă de receptorii săi, provocând un răspuns intracelular larg care suprimă funcția imunitară și inflamația30.
Rezultatele noastre indică faptul că stimularea fizică mecanică (MS) a îmbunătățit performanța generală a culturii în comparație cu Ctrl, dar nu a reușit să mențină viabilitatea, integritatea structurală și expresia cardiacă timp de 12 zile în cultură.În comparație cu Ctrl, adăugarea de T3 și Dex la culturile CTCM (MT) a îmbunătățit viabilitatea și a menținut profiluri de transcripție similare, integritatea structurală și activitatea metabolică cu țesut cardiac proaspăt timp de 12 zile.În plus, prin controlul gradului de întindere a țesutului, a fost creat un model de hipertrofie cardiacă indusă de hiperextensie folosind STCM, ilustrând versatilitatea sistemului STCM.Trebuie remarcat faptul că, deși remodelarea cardiacă și fibroza implică de obicei organe intacte ale căror celule circulante pot furniza citokinele adecvate, precum și fagocitoza și alți factori de remodelare, secțiuni ale inimii pot imita în continuare procesul fibrotic ca răspuns la stres și traume.în miofibroblaste.Acest lucru a fost evaluat anterior în acest model de felie cardiacă.Trebuie remarcat faptul că parametrii CTCM pot fi modulați prin modificarea presiunii/amplitudinii electrice și a frecvenței pentru a simula multe condiții, cum ar fi tahicardia, bradicardia și suportul circulator mecanic (cord mecanic neîncărcat).Acest lucru face ca sistemul să fie un debit mediu pentru testarea medicamentelor.Capacitatea CTCM de a modela hipertrofia cardiacă indusă de suprasolicitare deschide calea pentru testarea acestui sistem pentru terapie personalizată.În concluzie, prezentul studiu demonstrează că întinderea mecanică și stimularea umorală sunt esențiale pentru menținerea culturii secțiunilor de țesut cardiac.
Deși datele prezentate aici sugerează că CTCM este o platformă foarte promițătoare pentru modelarea miocardului intact, această metodă de cultură are unele limitări.Principala limitare a culturii CTCM este că impune tensiuni mecanice dinamice continue asupra feliilor, ceea ce exclude capacitatea de a monitoriza în mod activ contracțiile secțiunii cardiace în timpul fiecărui ciclu.În plus, datorită dimensiunii mici a secțiunilor cardiace (7 mm), capacitatea de a evalua funcția sistolice în afara sistemelor de cultură folosind senzori de forță tradiționali este limitată.În manuscrisul actual, depășim parțial această limitare prin evaluarea tensiunii optice ca indicator al funcției contractile.Cu toate acestea, această limitare va necesita lucrări suplimentare și poate fi abordată în viitor prin introducerea de metode pentru monitorizarea optică a funcției feliilor de inimă în cultură, cum ar fi cartografierea optică folosind coloranți sensibili la calciu și la tensiune.O altă limitare a CTCM este că modelul de lucru nu manipulează stresul fiziologic (preîncărcare și postîncărcare).În CTCM, presiunea a fost indusă în direcții opuse pentru a reproduce o întindere fiziologică de 25% în diastolă (întindere completă) și sistolă (lungimea contracției în timpul stimulării electrice) în țesuturi foarte mari.Această limitare ar trebui eliminată în viitoarele proiecte CTCM prin presiune adecvată asupra țesutului cardiac de ambele părți și prin aplicarea relațiilor exacte presiune-volum care apar în camerele inimii.
Remodelarea indusă de supraîntindere raportată în acest manuscris se limitează la imitarea semnalelor hipertrofice de hiperîntindere.Astfel, acest model poate ajuta în studiul semnalizării hipertrofice induse de întindere fără a fi nevoie de factori umorali sau neuronali (care nu există în acest sistem).Sunt necesare studii suplimentare pentru a crește multiplicitatea CTCM, de exemplu, co-cultivarea cu celulele imune, factorii umorali plasmatici circulanți și inervația atunci când co-cultivarea cu celulele neuronale va îmbunătăți posibilitățile de modelare a bolii cu CTCM.
În acest studiu au fost utilizați treisprezece porci.Toate procedurile pe animale au fost efectuate în conformitate cu ghidurile instituționale și au fost aprobate de Comitetul Instituțional pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor de la Universitatea din Louisville.Arcul aortic a fost fixat și inima a fost perfuzată cu 1 L de cardioplegie sterilă (110 mM NaCI, 1,2 mM CaCI2, 16 mM KCI, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHC03, 5 U/mL heparină, pH până la 7,4); inimile au fost conservate în soluție cardioplegică rece ca gheața până când au fost transportate la laborator pe gheață care este de obicei <10 min. inimile au fost conservate în soluție cardioplegică rece ca gheața până când au fost transportate la laborator pe gheață care este de obicei <10 min. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на, лчдон на ет <10 мин. inimile au fost depozitate în soluție cardioplegică rece ca gheață până la transportul la laborator pe gheață, ceea ce durează de obicei <10 min.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 Păstrați inimile pe gheață cardioplegia până la transportul la laborator pe gheață, de obicei <10 min.
Dispozitivul CTCM a fost dezvoltat în software-ul SolidWorks de proiectare asistată de calculator (CAD).Camerele de cultură, divizoarele și camerele de aer sunt realizate din plastic acrilic transparent CNC.Inelul de rezervă cu diametrul de 7 mm este fabricat din polietilenă de înaltă densitate (HDPE) în centru și are o canelură pentru inelul O pentru a găzdui inelul O din silicon folosit pentru etanșarea suportului de dedesubt.O membrană subțire de silice separă camera de cultură de placa de separare.Membrana de silicon este tăiată cu laser dintr-o foaie de silicon de 0,02 inchi grosime și are o duritate de 35A.Garniturile din silicon de jos și de sus sunt tăiate cu laser din folie de silicon de 1/16 inch grosime și au o duritate de 50A.Șuruburile și piulițele aripioare din oțel inoxidabil 316L sunt folosite pentru fixarea blocului și crearea unei etanșări etanșe.
O placă de circuit imprimat (PCB) dedicată este proiectată pentru a fi integrată cu sistemul C-PACE-EM.Prizele conectorului elvețian al mașinii de pe PCB sunt conectate la electrozi de grafit prin fire de cupru placate cu argint și șuruburi de bronz 0-60 înșurubate în electrozi.Placa de circuit imprimat este plasată în capacul imprimantei 3D.
Dispozitivul CTCM este controlat de un actuator pneumatic programabil (PPD) care creează o presiune circulatorie controlată similară unui ciclu cardiac.Pe măsură ce presiunea din interiorul camerei de aer crește, membrana flexibilă de silicon se extinde în sus, forțând mediul sub locul țesutului.Zona de țesut va fi apoi întinsă prin această expulzare a lichidului, mimând expansiunea fiziologică a inimii în timpul diastolei.La vârful relaxării, stimularea electrică a fost aplicată prin electrozi de grafit, care au redus presiunea în camera de aer și au cauzat contracția secțiunilor de țesut.În interiorul țevii este o supapă hemostatică cu un senzor de presiune pentru a detecta presiunea din sistemul de aer.Presiunea detectată de senzorul de presiune este aplicată unui colector de date conectat la laptop.Acest lucru permite monitorizarea continuă a presiunii din interiorul camerei de gaz.Când a fost atinsă presiunea maximă în cameră (standard 80 mmHg, 140 mmHg OS), dispozitivul de achiziție de date a fost comandat să trimită un semnal către sistemul C-PACE-EM pentru a genera un semnal de tensiune bifazic timp de 2 ms, setat la 4 V.
S-au obţinut secţiuni de inimă şi s-au efectuat condiţiile de cultură în 6 godeuri după cum urmează: Se transferă inimile recoltate din vasul de transfer pe o tavă care conţine cardioplegie la rece (4°C).Ventriculul stâng a fost izolat cu o lamă sterilă și tăiat în bucăți de 1-2 cm3.Aceste blocuri de țesut au fost atașate la suporturi de țesut cu adeziv pentru țesut și plasate într-o baie de țesut cu microtom vibrant care conține soluție Tyrode și oxigenate continuu (3 g/L 2,3-butandionă monooximă (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g) ), (6 mM-K14M, 6 mM (8,18 g) . ), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCI2 (1 ml soluţie 1 M), 1,8 mM CaCI2 (1,8 ml soluţie 1 M), până la 1 L ddH20).Microtomul vibrant a fost setat să taie felii groase de 300 µm la o frecvență de 80 Hz, o amplitudine a vibrației orizontale de 2 mm și o viteză de avans de 0,03 mm/s.Baia de țesut a fost înconjurată de gheață pentru a menține soluția rece și temperatura a fost menținută la 4°C.Se transferă secțiuni de țesut din baia de microtom într-o baie de incubare care conține soluție de Tyrode oxigenată continuu pe gheață până când se obțin suficiente secțiuni pentru o placă de cultură.Pentru culturile transwell, secțiunile de țesut au fost atașate la suporturi sterile din poliuretan de 6 mm lățime și plasate în 6 ml de mediu optimizat (mediu 199, 1 x supliment ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alcalin și 2X antibiotic-antifungic).Stimularea electrică (10 V, frecvență 1,2 Hz) a fost aplicată secțiunilor de țesut prin C-Pace.Pentru condițiile TD, T3 și Dex proaspete au fost adăugate la 100 nM și 1 μM la fiecare schimbare de mediu.Mediul este saturat cu oxigen înainte de înlocuire de 3 ori pe zi.Secțiunile de țesut au fost cultivate într-un incubator la 37°C și 5% CO2.
Pentru culturile CTCM, secțiunile de țesut au fost plasate pe o imprimantă 3D personalizată într-o cutie Petri care conținea soluție Tyrode modificată.Dispozitivul este conceput pentru a crește dimensiunea feliei inimii cu 25% din suprafața inelului de sprijin.Acest lucru se face astfel încât secțiunile inimii să nu se întindă după ce au fost transferate din soluția Tyrode în mediu și în timpul diastolei.Folosind adeziv histoacrilic, secțiunile cu grosimea de 300 µm au fost fixate pe un inel suport cu diametrul de 7 mm.După atașarea secțiunilor de țesut la inelul de susținere, tăiați secțiunile de țesut în exces și plasați secțiunile de țesut atașate înapoi în baia de soluție Tyrode pe gheață (4°C) până când au fost pregătite suficiente secțiuni pentru un dispozitiv.Timpul total de procesare pentru toate dispozitivele nu trebuie să depășească 2 ore.După ce 6 secțiuni de țesut au fost atașate la inelele lor de susținere, dispozitivul CTCM a fost asamblat.Camera de cultură CTCM este pre-umplută cu 21 ml mediu pre-oxigenat.Transferați secțiunile de țesut în camera de cultură și îndepărtați cu grijă orice bule de aer cu o pipetă.Secțiunea de țesut este apoi ghidată în orificiu și presată ușor în poziție.În cele din urmă, așezați capacul electrodului pe dispozitiv și transferați dispozitivul în incubator.Apoi conectați CTCM la tubul de aer și la sistemul C-PACE-EM.Actuatorul pneumatic se deschide, iar supapa de aer deschide CTCM.Sistemul C-PACE-EM a fost configurat pentru a furniza 4 V la 1,2 Hz în timpul stimularii bifazice timp de 2 ms.Mediul a fost schimbat de două ori pe zi, iar electrozii au fost schimbați o dată pe zi pentru a evita acumularea de grafit pe electrozi.Dacă este necesar, secțiuni de țesut pot fi îndepărtate din godeurile lor de cultură pentru a elimina orice bule de aer care ar fi putut cădea sub ele.Pentru condițiile de tratament cu MT, T3/Dex a fost adăugat proaspăt cu fiecare schimbare de mediu cu 100 nM T3 și 1 μM Dex.Dispozitivele CTCM au fost cultivate într-un incubator la 37°C și 5% CO2.
Pentru a obține traiectorii întinse ale feliilor de inimă, a fost dezvoltat un sistem special de camere.O cameră SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japonia) a fost folosită cu un obiectiv macro Navitar Zoom 7000 18-108 mm (Navitar, San Francisco, CA).Vizualizarea a fost efectuată la temperatura camerei după înlocuirea mediului cu mediu proaspăt.Camera este poziționată la un unghi de 51° și video este înregistrat la 30 de cadre pe secundă.În primul rând, software-ul open source (MUSCLEMOTION43) a fost folosit cu Image-J pentru a cuantifica mișcarea feliilor de inimă.Masca a fost creată folosind MATLAB (MathWorks, Natick, MA, SUA) pentru a defini regiunile de interes pentru feliile de inimă bătătoare pentru a evita zgomotul.Măștile segmentate manual sunt aplicate tuturor imaginilor dintr-o secvență de cadre și apoi trecute la plug-in-ul MUSCLEMOTION.Muscle Motion folosește intensitatea medie a pixelilor din fiecare cadru pentru a-și cuantifica mișcarea în raport cu cadrul de referință.Datele au fost înregistrate, filtrate și utilizate pentru a cuantifica timpul ciclului și pentru a evalua întinderea țesutului în timpul ciclului cardiac.Videoclipul înregistrat a fost post-procesat folosind un filtru digital cu fază zero de ordinul întâi.Pentru a cuantifica întinderea țesuturilor (de la vârf la vârf), a fost efectuată o analiză de la vârf la vârf pentru a distinge între vârfuri și minime în semnalul înregistrat.În plus, detendința este efectuată folosind un polinom de ordinul 6 pentru a elimina deviația semnalului.Codul programului a fost dezvoltat în MATLAB pentru a determina mișcarea globală a țesuturilor, timpul ciclului, timpul de relaxare și timpul de contracție (Codul programului suplimentar 44).
Pentru analiza deformarii, folosind aceleași videoclipuri create pentru evaluarea întinderii mecanice, am urmărit mai întâi două imagini reprezentând vârfuri de mișcare (cele mai înalte (sus) și cele mai joase (inferioare) puncte de mișcare) conform software-ului MUSCLEMOTION.Apoi am segmentat regiunile de țesut și am aplicat o formă de algoritm de umbrire țesutului segmentat (Fig. 2a suplimentară).Țesutul segmentat a fost apoi împărțit în zece subsuprafețe, iar stresul pe fiecare suprafață a fost calculat folosind următoarea ecuație: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, unde Sup și Sdown sunt distanțele formei de la umbrele de sus și de jos ale țesăturii, respectiv (Fig. 2b suplimentară).
Secțiunile inimii au fost fixate în paraformaldehidă 4% timp de 48 de ore.Țesuturile fixe au fost deshidratate în zaharoză 10% și 20% timp de 1 oră, apoi în zaharoză 30% peste noapte.Secțiunile au fost apoi încorporate în compus cu temperatură optimă de tăiere (compus OCT) și congelate treptat într-o baie de izopentan/gheață carbonică.Păstrați blocurile de încorporare OCT la -80 °C până la separare.Lamele au fost pregătite ca secțiuni cu o grosime de 8 μm.
Pentru a elimina OCT din secțiunile inimii, încălziți lamele pe un bloc de încălzire la 95 ° C timp de 5 minute.Se adaugă 1 ml PBS la fiecare lamă și se incubează timp de 30 de minute la temperatura camerei, apoi se permează secțiunile prin setarea 0,1% Triton-X în PBS timp de 15 minute la temperatura camerei.Pentru a preveni legarea anticorpilor nespecifici de probă, adăugați 1 ml de soluție de BSA 3% pe lame și incubați timp de 1 oră la temperatura camerei.BSA a fost apoi îndepărtat și lamelele au fost spălate cu PBS.Marcați fiecare probă cu un creion.Anticorpi primari (diluați 1:200 în 1% BSA) (conexina 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) și troponina-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) au fost adăugați în decurs de 90 de minute, apoi s-au adăugat anticorpi secundari împotriva 14% BSAdilu de șoarece (Alexa 8:200) (Thermo Scientific; #A16079), împotriva iepurelui Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) timp de încă 90 de minute. Spălată de 3 ori cu PBS Pentru a distinge colorarea țintă de fundal, am folosit doar anticorpul secundar ca martor. În cele din urmă, a fost adăugată colorația nucleară DAPI și lamelele au fost plasate într-un proces de lustruire a țintei și lustruit de laborator. și microscop Keyence cu mărire de 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) la 5 μg/ml în PBS a fost utilizat pentru colorarea WGA și aplicat pe secțiuni fixe timp de 30 de minute la temperatura camerei.Lamelele au fost apoi spălate cu PBS și a fost adăugat negru Sudan la fiecare lamă și incubat timp de 30 de minute.Lamelele au fost apoi spălate cu PBS și s-a adăugat mediu de încorporare vectashield.Lamele au fost vizualizate pe un microscop Keyence la o mărire de 40x.
OCT a fost îndepărtat din probe așa cum este descris mai sus.După îndepărtarea OCT, scufundați lamelele în soluția lui Bouin peste noapte.Lamele au fost apoi clătite cu apă distilată timp de 1 oră și apoi plasate într-o soluție de fucsină cu acid aloe Bibrich timp de 10 minute.Apoi lamelele au fost spălate cu apă distilată și plasate într-o soluție de 5% fosfomolibden/5% acid fosfotungstic timp de 10 minute.Fără clătire, transferați lamele direct în soluția de albastru de anilină timp de 15 minute.Apoi lamelele au fost spălate cu apă distilată și plasate într-o soluție de acid acetic 1% timp de 2 minute.Lamele au fost uscate în etanol 200 N și transferate în xilen.Lamele colorate au fost vizualizate folosind un microscop Keyence cu un obiectiv de 10x.Procentul de suprafață de fibroză a fost cuantificat folosind software-ul Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), numărul de catalog V13154, conform protocolului producătorului cu unele modificări.În special, a fost folosit un pumn chirurgical cu un diametru de 6 mm pentru a asigura o dimensiune uniformă a țesutului în timpul analizei MTT.Țesuturile au fost placate individual în godeurile unei plăci cu 12 godeuri care conținea substrat MTT conform protocolului producătorului.Secțiunile sunt incubate la 37°C timp de 3 ore și țesutul viu metabolizează substratul MTT pentru a forma un compus de formazan violet.Se înlocuiește soluția MTT cu 1 ml DMSO și se incubează la 37 °C timp de 15 minute pentru a extrage formazanul violet din secțiunile inimii.Probele au fost diluate 1:10 în DMSO în plăci cu fund transparent cu 96 de godeuri și intensitatea culorii violet măsurată la 570 nm folosind un cititor de plăci Cytation (BioTek).Citirile au fost normalizate la greutatea fiecărei felii de inimă.
Mediul de felie de inimă a fost înlocuit cu mediu care conține 1 μCi/ml [5-3H]-glucoză (Moravek Biochemicals, Brea, CA, SUA) pentru analiza utilizării glucozei așa cum s-a descris anterior.După 4 ore de incubare, adăugați 100 µl de mediu într-un tub deschis de microcentrifugă care conține 100 µl de HCI 0,2 N.Apoi tubul a fost plasat într-un tub de scintilație care conține 500 μl de dH2O pentru a se evapora [3H]2O timp de 72 de ore la 37°C.Apoi scoateți tubul de microcentrifugă din tubul de scintilație și adăugați 10 ml de lichid de scintilație.Numărările de scintilație au fost efectuate folosind un analizor de scintilație lichidă Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, SUA).Utilizarea glucozei a fost apoi calculată luând în considerare activitatea specifică [5-3H]-glucoză, echilibrul incomplet și fundalul, diluția [5-3H]-la glucoză nemarcată și eficiența contorului de scintilație.Datele sunt normalizate la masa secțiunilor inimii.
După omogenizarea țesuturilor în Trizol, ARN-ul a fost izolat din secțiuni de inimă folosind Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 conform protocolului producătorului.Prepararea bibliotecii RNAsec, secvențierea și analiza datelor au fost efectuate după cum urmează:
1 μg de ARN per probă a fost utilizat ca materie primă pentru prepararea bibliotecii de ARN.Bibliotecile de secvențiere au fost generate utilizând kitul de pregătire a bibliotecii ARN NEBNext UltraTM pentru Illumina (NEB, SUA) urmând recomandările producătorului, iar codurile index au fost adăugate la secvențele de atribute pentru fiecare probă.Pe scurt, ARNm a fost purificat din ARN total folosind granule magnetice atașate cu oligonucleotide poli-T.Fragmentarea este efectuată utilizând cationi divalenți la temperatură ridicată în tampon de reacție NEBNext First Strand Synthesis (5X).ADNc prima catenă a fost sintetizat folosind primeri hexameri aleatori și transcriptază inversă M-MuLV (RNază H-).A doua catenă de ADNc este apoi sintetizată utilizând ADN polimeraza I şi RNază H. Protuberantele rămase sunt transformate în capete contondente prin activitatea exonuclează/polimerază.După adenilarea capătului 3′ al fragmentului de ADN, un adaptor NEBNext cu o structură de buclă în ac de păr este atașat la acesta pentru a-l pregăti pentru hibridizare.Pentru selectarea fragmentelor de ADNc cu lungimea preferată 150-200 bp.fragmentele bibliotecii au fost purificate folosind sistemul AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, SUA).Apoi, 3 μl USER Enzyme (NEB, SUA) cu ADNc selectat în funcție de dimensiunea ligat cu un adaptor a fost utilizat timp de 15 minute la 37 ° C și apoi timp de 5 minute la 95 ° C înainte de PCR.PCR a fost apoi efectuată utilizând ADN polimerază Phusion High-Fidelity, primeri PCR universali și primeri Index (X).În cele din urmă, produsele PCR au fost purificate (sistemul AMPure XP) și calitatea bibliotecii a fost evaluată pe un sistem Agilent Bioanalyzer 2100.Biblioteca de ADNc a fost apoi secvențiată utilizând un secvențior Novaseq.Fișierele imagini brute de la Illumina au fost convertite în citiri brute folosind CASAVA Base Calling.Datele brute sunt stocate în fișiere în format FASTQ(fq) care conțin secvențe citite și calitățile de bază corespunzătoare.Selectați HISAT2 pentru a potrivi citirile de secvențiere filtrate cu genomul de referință Sscrofa11.1.În general, HISAT2 acceptă genomuri de orice dimensiune, inclusiv genomuri mai mari de 4 miliarde de baze, iar valorile implicite sunt setate pentru majoritatea parametrilor.Citirile de splicing din datele ARN Seq pot fi aliniate eficient folosind HISAT2, cel mai rapid sistem disponibil în prezent, cu aceeași precizie sau mai bună decât orice altă metodă.
Abundența transcrierilor reflectă în mod direct nivelul de expresie a genelor.Nivelurile de expresie a genelor sunt evaluate prin abundența transcrierilor (numărul de secvențiere) asociate cu genomul sau exonii.Numărul de citiri este proporțional cu nivelurile de expresie a genelor, lungimea genei și adâncimea de secvențiere.Au fost calculate FPKM (fragmente per mie de perechi de baze de transcriere secvențiate per milion de perechi de baze) și au fost determinate valorile P ale expresiei diferențiale folosind pachetul DESeq2.Apoi am calculat rata de descoperire falsă (FDR) pentru fiecare valoare P utilizând metoda Benjamini-Hochberg9 bazată pe funcția R încorporată „p.adjust”.
ARN izolat din secțiuni de inimă a fost convertit în cADN la o concentrație de 200 ng/μl utilizând amestecul SuperScript IV Vilo Master de la Thermo (Thermo, nr. cat. 11756050).RT-PCR cantitativ a fost efectuat folosind o placă de reacție transparentă cu 384 de godeuri Applied Biosystems Endura Plate Microamp (Thermo, nr. cat. 4483319) și un adeziv optic microamp (Thermo, nr. cat. 4311971).Amestecul de reacție a constat din 5 pl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat # 4444557), 0,5 pl Taqman Primer și 3,5 pl H2O amestecat per godeu.Au fost executate cicluri standard de qPCR și valorile CT au fost măsurate folosind un instrument de PCR în timp real Applied Biosystems Quantstudio 5 (modul cu 384 de godeuri; produs # A28135).Primerii Taqman au fost achiziționați de la Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06908795_m1), (ACTN0686_mS90), (ACTN0686_mS) GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1).
Eliberarea media a NT-ProBNP a fost evaluată utilizând kitul NT-ProBNP (porc) (Cat. Nr. MBS2086979, MyBioSource) conform protocolului producătorului.Pe scurt, 250 pl din fiecare probă și standard au fost adăugați în duplicat în fiecare godeu.Imediat după adăugarea probei, adăugați 50 µl de reactiv de testare A în fiecare godeu.Agitați ușor placa și sigilați cu material de etanșare.Apoi tabletele au fost incubate la 37°C timp de 1 oră.Apoi se aspiră soluția și se spală godeurile de 4 ori cu 350 µl de soluție de spălare 1X, incubând soluția de spălare timp de 1-2 minute de fiecare dată.Apoi adăugați 100 µl de reactiv de testare B per godeu și sigilați cu etanșant pentru plăci.Tableta a fost agitată ușor și incubată la 37°C timp de 30 de minute.Aspirați soluția și spălați godeurile de 5 ori cu 350 µl de soluție de spălare 1X.Adăugați 90 µl de soluție de substrat în fiecare godeu și sigilați placa.Se incubează placa la 37°C timp de 10-20 minute.Adăugați 50 µl de soluție de oprire în fiecare godeu.Placa a fost măsurată imediat folosind un cititor de plăci Cytation (BioTek) setat la 450 nm.
Au fost efectuate analize de putere pentru a alege dimensiunile grupurilor care vor oferi >80% putere pentru a detecta o modificare absolută de 10% a parametrului cu o rată de eroare de tip I de 5%. Au fost efectuate analize de putere pentru a alege dimensiunile grupurilor care vor oferi >80% putere pentru a detecta o modificare absolută de 10% a parametrului cu o rată de eroare de tip I de 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощноя ти10% солютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Analiza puterii a fost efectuată pentru a selecta dimensiunile grupurilor care ar furniza >80% putere pentru a detecta o modificare absolută a parametrilor de 10% cu o rată de eroare de tip I de 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％的和和5％的的玥检测参数中10进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％的和和5％的的玥检测参数中10 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мобора размера группы, который обеспечил бы > 80% мобора мозмера группы абсолютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. A fost efectuată o analiză de putere pentru a selecta o dimensiune a grupului care să ofere >80% putere pentru a detecta 10% modificare absolută a parametrilor și 5% rata de eroare de tip I.Secțiunile de țesut au fost selectate aleatoriu înainte de experiment.Toate analizele au fost oarbe și probele au fost decodificate numai după ce toate datele au fost analizate.Software-ul GraphPad Prism (San Diego, CA) a fost folosit pentru a efectua toate analizele statistice. Pentru toate statisticile, valorile p au fost considerate semnificative la valori <0,05. Pentru toate statisticile, valorile p au fost considerate semnificative la valori <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Pentru toate statisticile, valorile p au fost considerate semnificative la valori <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Pentru toate statisticile, valorile p au fost considerate semnificative la valori <0,05.Testul t Student cu două cozi a fost efectuat pe date cu doar 2 comparații.ANOVA unidirecțională sau bidirecțională a fost utilizată pentru a determina semnificația între mai multe grupuri.La efectuarea testelor post-hoc, corecția lui Tukey a fost aplicată pentru a ține cont de comparații multiple.Datele RNAsec au considerații statistice speciale atunci când se calculează FDR și p.adjust, așa cum este descris în secțiunea Metode.
Pentru mai multe informații despre proiectarea studiului, consultați rezumatul Raportului de cercetare în natură legat de acest articol.