Vă mulțumim că ați vizitat Nature.com. Versiunea browserului pe care o utilizați are suport limitat pentru CSS. Pentru o experiență optimă, vă recomandăm să utilizați un browser actualizat (sau să dezactivați Modul de compatibilitate în Internet Explorer). Între timp, pentru a asigura asistență continuă, vom reda site-ul fără stiluri și JavaScript.
Există o nevoie de un sistem in vitro fiabil, care să poată reproduce cu acuratețe mediul fiziologic al inimii pentru testarea medicamentelor. Disponibilitatea limitată a sistemelor de cultură a țesutului cardiac uman a dus la interpretări inexacte ale efectelor medicamentelor cardiace. Aici, am dezvoltat un model de cultură a țesutului cardiac (CTCM) care stimulează electromecanic feliile de inimă și suferă o întindere fiziologică în timpul fazelor sistolice și diastolice ale ciclului cardiac. După 12 zile de cultură, această abordare a îmbunătățit parțial viabilitatea secțiunilor de inimă, dar nu a păstrat complet integritatea lor structurală. Prin urmare, după screening-ul cu molecule mici, am constatat că adăugarea a 100 nM triiodotironină (T3) și 1 μM dexametazonă (Dex) în mediul nostru a menținut microstructura secțiunilor timp de 12 zile. În combinație cu tratamentul cu T3/Dex, sistemul CTCM a menținut profilurile transcripționale, viabilitatea, activitatea metabolică și integritatea structurală la același nivel ca țesutul cardiac proaspăt timp de 12 zile. În plus, întinderea excesivă a țesutului cardiac în cultură induce semnalizare cardiacă hipertrofică, oferind dovezi ale capacității CTCM de a imita condițiile hipertrofice induse de întinderea cardiacă. În concluzie, CTCM poate modela fiziologia și fiziopatologia inimii în cultură pe perioade lungi de timp, permițând un screening fiabil al medicamentelor.
Înainte de cercetarea clinică, sunt necesare sisteme in vitro fiabile, care pot reproduce cu acuratețe mediul fiziologic al inimii umane. Astfel de sisteme ar trebui să imite modificări ale întinderii mecanice, ale ritmului cardiac și ale proprietăților electrofiziologice. Modelele animale sunt utilizate în mod obișnuit ca platformă de screening pentru fiziologia cardiacă, cu o fiabilitate limitată în reflectarea efectelor medicamentelor asupra inimii umane1,2. În cele din urmă, Modelul Experimental Ideal de Cultură a Țesuturilor Cardiace (CTCM) este un model extrem de sensibil și specific pentru diverse intervenții terapeutice și farmacologice, reproducând cu acuratețe fiziologia și fiziopatologia inimii umane3. Absența unui astfel de sistem limitează descoperirea de noi tratamente pentru insuficiența cardiacă4,5 și a dus la cardiotoxicitatea medicamentelor ca motiv major pentru ieșirea de pe piață6.
În ultimul deceniu, opt medicamente non-cardiovasculare au fost retrase din utilizarea clinică deoarece provoacă prelungirea intervalului QT, ducând la aritmii ventriculare și moarte subită7. Prin urmare, există o nevoie tot mai mare de strategii de screening preclinice fiabile pentru a evalua eficacitatea și toxicitatea cardiovasculară. Utilizarea recentă a cardiomiocitelor derivate din celule stem pluripotente induse de om (hiPS-CM) în screening-ul medicamentelor și testarea toxicității oferă o soluție parțială la această problemă. Cu toate acestea, natura imatură a hiPS-CM și lipsa complexității multicelulare a țesutului cardiac reprezintă limitări majore ale acestei metode. Studii recente au arătat că această limitare poate fi depășită parțial prin utilizarea hiPS-CM timpurie pentru a forma hidrogeluri de țesut cardiac la scurt timp după debutul contracțiilor spontane și creșterea treptată a stimulării electrice în timp. Cu toate acestea, acestor microțesuturi hiPS-CM le lipsesc proprietățile electrofiziologice și contractile mature ale miocardului adult. În plus, țesutul cardiac uman are o structură mai complexă, constând dintr-un amestec eterogen de diferite tipuri de celule, inclusiv celule endoteliale, neuroni și fibroblaste stromale, interconectate prin seturi specifice de proteine ale matricei extracelulare. Această eterogenitate a populațiilor non-cardiomiocitare11,12,13 din inima mamiferelor adulte reprezintă o barieră majoră în calea modelării țesutului cardiac utilizând tipuri individuale de celule. Aceste limitări majore subliniază importanța dezvoltării unor metode de cultivare a țesutului miocardic intact în condiții fiziologice și patologice.
Secțiunile subțiri (300 µm) cultivate din inima umană s-au dovedit a fi un model promițător de miocard uman intact. Această metodă oferă acces la un sistem multicelular 3D complet, similar țesutului cardiac uman. Cu toate acestea, până în 2019, utilizarea secțiunilor de inimă cultivate a fost limitată de supraviețuirea scurtă a culturii (24 de ore). Acest lucru se datorează unui număr de factori, inclusiv lipsa întinderii fizico-mecanice, interfața aer-lichid și utilizarea unor medii simple care nu susțin nevoile țesutului cardiac. În 2019, mai multe grupuri de cercetare au demonstrat că încorporarea factorilor mecanici în sistemele de cultură a țesutului cardiac poate prelungi durata de viață a culturii, poate îmbunătăți expresia cardiacă și poate imita patologia cardiacă. Două studii elegante 17 și 18 arată că încărcarea mecanică uniaxială are un efect pozitiv asupra fenotipului cardiac în timpul cultivării. Cu toate acestea, aceste studii nu au utilizat încărcarea fizico-mecanică tridimensională dinamică a ciclului cardiac, deoarece secțiunile de inimă au fost încărcate fie cu forțe de tracțiune izometrice 17, fie cu încărcare auxotonică liniară 18. Aceste metode de întindere a țesuturilor au dus la suprimarea multor gene cardiace sau la supraexprimarea genelor asociate cu răspunsuri anormale la întindere. În special, Pitoulis și colab. 19 au dezvoltat o baie dinamică de cultură a secțiunilor de inimă pentru reconstrucția ciclului cardiac utilizând feedback-ul traductorului de forță și acționări prin tensiune. Deși acest sistem permite o modelare in vitro mai precisă a ciclului cardiac, complexitatea și randamentul redus al metodei limitează aplicarea acestui sistem. Laboratorul nostru a dezvoltat recent un sistem de cultură simplificat utilizând stimulare electrică și un mediu optimizat pentru a menține viabilitatea secțiunilor de țesut cardiac porcin și uman timp de până la 6 zile 20,21.
În manuscrisul de față, descriem un model de cultură de țesut cardiac (CTCM) care utilizează secțiuni din inima porcină și care încorporează indicii umorali pentru a recapitula fiziologia cardiacă tridimensională și distensia fiziopatologică în timpul ciclului cardiac. Acest CTCM poate crește precizia predicției preclinice a medicamentelor la un nivel nemaiatins până acum, oferind un sistem cardiac rentabil, cu randament mediu, care imită fiziologia/fiziologia inimii mamiferelor pentru testarea preclinică a medicamentelor.
Semnalele mecanice hemodinamice joacă un rol esențial în menținerea funcției cardiomiocitelor in vitro 22,23,24. În manuscrisul actual, am dezvoltat un CTCM (Figura 1a) care poate imita mediul cardiac adult prin inducerea stimulării electrice și mecanice la frecvențe fiziologice (1,2 Hz, 72 de bătăi pe minut). Pentru a evita întinderea excesivă a țesutului în timpul diastolei, a fost utilizat un dispozitiv de imprimare 3D pentru a crește dimensiunea țesutului cu 25% (Fig. 1b). Stimularea electrică indusă de sistemul C-PACE a fost temporizată să înceapă cu 100 ms înainte de sistolă, utilizând un sistem de achiziție de date pentru a reproduce complet ciclul cardiac. Sistemul de cultură tisulară utilizează un actuator pneumatic programabil (LB Engineering, Germania) pentru a extinde ciclic o membrană flexibilă din silicon, provocând expansiunea feliilor de inimă în camera superioară. Sistemul a fost conectat la o linie de aer externă printr-un traductor de presiune, ceea ce a făcut posibilă reglarea precisă a presiunii (± 1 mmHg) și a timpului (± 1 ms) (Fig. 1c).
a Atașați secțiunea de țesut la inelul de susținere de 7 mm, prezentat cu albastru, în interiorul camerei de cultură a dispozitivului. Camera de cultură este separată de camera de aer printr-o membrană subțire și flexibilă din silicon. Plasați o garnitură între fiecare cameră pentru a preveni scurgerile. Capacul dispozitivului conține electrozi de grafit care asigură stimulare electrică. b Reprezentare schematică a dispozitivului pentru țesut mare, a inelului de ghidare și a inelului de susținere. Secțiunile de țesut (maro) sunt plasate pe dispozitivul supradimensionat, inelul de ghidare fiind plasat în canelura de pe marginea exterioară a dispozitivului. Folosind ghidul, așezați cu grijă inelul de susținere acoperit cu adeziv acrilic tisular peste secțiunea de țesut cardiac. c Grafic care arată timpul de stimulare electrică în funcție de presiunea camerei de aer controlată de un actuator pneumatic programabil (PPD). Un dispozitiv de achiziție de date a fost utilizat pentru a sincroniza stimularea electrică folosind senzori de presiune. Când presiunea din camera de cultură atinge pragul setat, un semnal pulsatoriu este trimis către C-PACE-EM pentru a declanșa stimularea electrică. d Imagine a patru CTCM-uri plasate pe un raft de incubator. Patru dispozitive sunt conectate la un PPD printr-un circuit pneumatic, iar senzorii de presiune sunt introduși în valva hemostatică pentru a monitoriza presiunea din circuitul pneumatic. Fiecare dispozitiv conține șase secțiuni de țesut.
Folosind un singur actuator pneumatic, am reușit să controlăm 4 dispozitive CTCM, fiecare dintre acestea putând conține 6 secțiuni de țesut (Fig. 1d). În CTCM, presiunea aerului din camera de aer este convertită în presiune sincronă în camera de fluid și induce expansiunea fiziologică a secțiunii inimii (Figura 2a și Filmul suplimentar 1). Evaluarea întinderii țesutului la 80 mm Hg. Art. a arătat o întindere a secțiunilor de țesut cu 25% (Fig. 2b). S-a demonstrat că acest procent de întindere corespunde unei lungimi fiziologice a sarcomerului de 2,2–2,3 µm pentru o contractilitate normală a secțiunii cardiace17,19,25. Mișcarea țesutului a fost evaluată folosind setări personalizate ale camerei (Figura suplimentară 1). Amplitudinea și viteza mișcării țesutului (Fig. 2c, d) au corespuns întinderii în timpul ciclului cardiac și timpului în timpul sistolei și diastolei (Fig. 2b). Întinderea și viteza țesutului cardiac în timpul contracției și relaxării au rămas constante timp de 12 zile în cultură (Fig. 2f). Pentru a evalua efectul stimulării electrice asupra contractilității în timpul culturii, am dezvoltat o metodă de determinare a deformității active utilizând un algoritm de umbrire (Fig. suplimentară 2a,b) și am putut distinge între deformitățile cu și fără stimulare electrică. Aceeași secțiune a inimii (Fig. 2f). În regiunea mobilă a inciziei (R6-9), tensiunea în timpul stimulării electrice a fost cu 20% mai mare decât în absența stimulării electrice, ceea ce indică contribuția stimulării electrice la funcția contractilă.
Urme reprezentative ale presiunii camerei de aer, presiunii camerei de fluid și măsurătorilor mișcării țesuturilor confirmă faptul că presiunea camerei modifică presiunea camerei de fluid, provocând o mișcare corespunzătoare a feliei de țesut. b Urme reprezentative ale procentului de întindere (albastru) a secțiunilor de țesut corespunzătoare procentului de întindere (portocaliu). c Mișcarea măsurată a feliei cardiace este în concordanță cu viteza de mișcare măsurată. (d) Traiectorii reprezentative ale mișcării ciclice (linia albastră) și vitezei (linia punctată portocalie) într-o felie de inimă. e Cuantificarea timpului de ciclu (n = 19 felii per grup, de la porci diferiți), a timpului de contracție (n = 19 felii per grup), a timpului de relaxare (n = 19 felii per grup, de la porci diferiți), a mișcării țesuturilor (n = 25 felii/grup de la porci diferiți), a vitezei sistolice maxime (n = 24(D0), 25(D12) felii/grup de la porci diferiți) și a ratei de relaxare maxime (n=24(D0), 25(D12) felii/grup de la porci diferiți). Testul t Student bilateral nu a arătat nicio diferență semnificativă în niciun parametru. Urme reprezentative ale analizei de deformare a secțiunilor de țesut cu (roșu) și fără (albastru) stimulare electrică, zece zone regionale ale secțiunilor de țesut din aceeași secțiune. Panourile de jos arată cuantificarea diferenței procentuale de deformare în secțiunile de țesut cu și fără stimulare electrică în zece zone din secțiuni diferite. (n = 8 felii/grup de la porci diferiți, s-a efectuat testul t Student bilateral; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 felii/grup de la porci diferiți, s-a efectuat testul t Student bilateral; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; *****p<0,1,00,
În sistemul nostru anterior de cultură static biomimetică a feliilor de inimă [20, 21], am menținut viabilitatea, funcția și integritatea structurală a feliilor de inimă timp de 6 zile prin aplicarea stimulării electrice și optimizarea compoziției mediului. Cu toate acestea, după 10 zile, aceste cifre au scăzut brusc. Ne vom referi la secțiunile cultivate în condițiile de control (Ctrl) ale sistemului nostru anterior de cultură static biomimetică 20, 21 și vom folosi mediul nostru optimizat anterior ca condiții MC și cultură sub stimulare mecanică și electrică simultană (CTCM), numită . Mai întâi, am stabilit că stimularea mecanică fără stimulare electrică a fost insuficientă pentru a menține viabilitatea țesuturilor timp de 6 zile (Fig. suplimentară 3a,b). Interesant este că, odată cu introducerea stimulării fizico-mecanice și electrice folosind STCM, viabilitatea secțiunilor de inimă de 12 zile a rămas aceeași ca în secțiunile de inimă proaspătă în condiții MS, dar nu și în condiții Ctrl, așa cum arată analiza MTT (Fig. 1). 3a). Acest lucru sugerează că stimularea mecanică și simularea ciclului cardiac pot menține secțiunile de țesut viabile pentru o perioadă de două ori mai lungă decât cea raportată în sistemul nostru anterior de cultură statică. Cu toate acestea, evaluarea integrității structurale a secțiunilor de țesut prin imunomarcarea troponinei T cardiace și a conexinei 43 a arătat că expresia conexinei 43 a fost semnificativ mai mare în țesuturile MC în ziua 12 decât în lotul de control în aceeași zi. Cu toate acestea, expresia uniformă a conexinei 43 și formarea discului Z nu au fost menținute complet (Fig. 3b). Folosim un cadru de inteligență artificială (IA) pentru a cuantifica integritatea structurală a țesuturilor26, o conductă de învățare profundă bazată pe imagini, bazată pe colorarea cu troponină-T și conexină43, pentru a cuantifica automat integritatea structurală și fluorescența feliilor de inimă în ceea ce privește puterea localizării. Această metodă utilizează o Rețea Neuronală Convoluțională (CNN) și un cadru de învățare profundă pentru a cuantifica în mod fiabil integritatea structurală a țesutului cardiac într-un mod automat și imparțial, așa cum este descris în referință.26. Țesutul MC a prezentat o similaritate structurală îmbunătățită față de ziua 0 în comparație cu secțiunile de control statice. În plus, colorarea cu tricrom Masson a relevat un procent semnificativ mai mic de fibroză în condiții MS comparativ cu condițiile de control în ziua 12 de cultură (Fig. 3c). Deși CTCM a crescut viabilitatea secțiunilor de țesut cardiac în ziua 12 la un nivel similar cu cel al țesutului cardiac proaspăt, nu a îmbunătățit semnificativ integritatea structurală a secțiunilor cardiace.
O diagramă cu bare prezintă cuantificarea viabilității MTT a feliilor de inimă proaspete (D0) sau a culturii feliilor de inimă timp de 12 zile, fie în cultură statică (D12 Ctrl), fie în CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) felii/grup de la porci diferiți, efectuându-se testul ANOVA într-o singură direcție; ####p < 0,0001 comparativ cu D0 și **p < 0,01 comparativ cu D12 Ctrl). O diagramă cu bare prezintă cuantificarea viabilității MTT a feliilor de inimă proaspete (D0) sau a culturii feliilor de inimă timp de 12 zile, fie în cultură statică (D12 Ctrl), fie în CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) felii/grup de la porci diferiți, efectuându-se testul ANOVA într-o singură direcție; ####p < 0,0001 comparativ cu D0 și **p < 0,01 comparativ cu D12 Ctrl).Histograma prezintă cuantificarea viabilității secțiunilor de inimă proaspătă MTT (D0) sau a culturii secțiunilor de inimă timp de 12 zile fie în cultură statică (control D12), fie în CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (control D12). ) , 12 (D12 MC) secțiuni/grup de la porci diferiți, se efectuează un test ANOVA cu o singură direcție;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 comparativ cu D0 și **p < 0,01 comparativ cu D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片(D12 MC)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组衏化)测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片(D12 MC) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.00rlD12相比，**p。)histogramă care prezintă cuantificarea viabilității MTT în secțiuni de inimă proaspătă (D0) sau secțiuni de inimă cultivate timp de 12 zile în cultură statică (control D12) sau CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (control D12)), 12 (D12 MC) secțiuni/grup de la porci diferiți, test ANOVA cu o singură direcție;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 comparativ cu D0, **p < 0,01 comparativ cu D12 (Ctrl).b Troponina-T (verde), conexina 43 (roșu) și DAPI (albastru) în secțiuni de inimă proaspăt izolate (D0) sau secțiuni de inimă cultivate în condiții statice (Ctrl) sau în condiții CTCM (MC) timp de 12 zile) ale imaginilor reprezentative de imunofluorescență (scară goală = 100 µm). Cuantificarea integrității structurale a țesutului cardiac prin intermediul inteligenței artificiale (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) felii/grup fiecare de la porci diferiți, s-a efectuat testul ANOVA unidirecțional; ####p < 0,0001 comparativ cu D0 și ****p < 0,0001 comparativ cu D12 Ctrl). Cuantificarea integrității structurale a țesutului cardiac prin intermediul inteligenței artificiale (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) felii/grup fiecare de la porci diferiți, s-a efectuat testul ANOVA unidirecțional; ####p < 0,0001 comparativ cu D0 și ****p < 0,0001 comparativ cu D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интелленным интеллектом (D0 2), Ct 77 (D1), C12 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA ####p < 0,0001 по сни срав однофакторный; 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Cuantificarea integrității structurale a țesutului cardiac prin inteligență artificială (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) secțiuni/grupuri de la porci diferiți, test ANOVA unidirecțional efectuat; ####p < 0,0001 vs. cu D0 și ****p < 0,0001 comparativ cu D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) felii/grup fiecare porc diferit, test ANOVA unidirecțional <1#0###0p0 ;相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) felii/grup fiecare dintre diferiţi porci, test ANOVA unidirecţional <0####0p0;与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной тканl (D10), =77нl (D12), (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001 vs. сравнению с D12 Ctrl). Inteligență artificială pentru cuantificarea integrității structurale a țesutului cardiac (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) secțiuni/grup pentru fiecare porc diferit, test ANOVA cu o singură direcție; ####p<0,0001 vs .D0 Pentru comparație ****p < 0,0001 comparativ cu D12 Ctrl). c Imagini reprezentative (stânga) și cuantificare (dreapta) pentru felii de inimă colorate cu colorant tricrom Masson (Scară bară = 500 µm) (n = 10 felii/grup fiecare de la porc diferit, se efectuează testul ANOVA unidirecțional; ####p < 0,0001 comparativ cu D0 și ***p < 0,001 comparativ cu D12 Ctrl). c Imagini reprezentative (stânga) și cuantificare (dreapta) pentru felii de inimă colorate cu colorant tricrom Masson (Scară bară = 500 µm) (n = 10 felii/grup fiecare de la porci diferiți, se efectuează testul ANOVA unidirecțional; #### p < 0,0001 comparativ cu D0 și ***p < 0,001 comparativ cu D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, ошенкраш трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разнынх разныным) выполняется односторонний тест ANOVA; сравнению с D12 Ctrl). c Imagini reprezentative (stânga) și cuantificare (dreapta) ale secțiunilor de inimă colorate cu colorant tricrom Masson (scară neacoperită = 500 µm) (n = 10 secțiuni/grup de la porci diferiți, s-a efectuat testul ANOVA unidirecțional; #### p < 0,0001 comparativ cu D0 și ***p < 0,001 comparativ cu D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺化（右）（裸尺化（右）（裸尺化（右）（裸尺尺10µ=m5）个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比 相比 ，D0***1 <，l2相比）。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 尺度 尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 吕向 向 吋### 向### 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, онкрашественный анализ (справа) трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой другой протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Imagini reprezentative (stânga) și cuantificare (dreapta) ale secțiunilor de inimă colorate cu colorant tricrom Masson (blank = 500 µm) (n = 10 secțiuni/grup, fiecare de la un porc diferit, testate prin analiză unidirecțională a varianței; ### # p < 0,0001 comparativ cu D0, ***p < 0,001 comparativ cu D12 Ctrl).Barele de eroare reprezintă media ± deviația standard.
Am emis ipoteza că prin adăugarea de molecule mici în mediul de cultură, integritatea cardiomiocitelor ar putea fi îmbunătățită, iar dezvoltarea fibrozei ar putea fi redusă în timpul culturii CTCM. Prin urmare, am efectuat screening pentru molecule mici folosind culturile noastre de control statice20,21, datorită numărului mic de factori de confuzie. Dexametazona (Dex), triiodotironina (T3) și SB431542 (SB) au fost alese pentru acest screening. Aceste molecule mici au fost utilizate anterior în culturile hiPSC-CM pentru a induce maturarea cardiomiocitelor prin creșterea lungimii sarcomerului, a tubulilor T și a vitezei de conducere. În plus, atât Dex (un glucocorticoid), cât și SB sunt cunoscute pentru suprimarea inflamației29,30. Prin urmare, am testat dacă includerea uneia sau a unei combinații a acestor molecule mici ar îmbunătăți integritatea structurală a secțiunilor cardiace. Pentru screening-ul inițial, doza fiecărui compus a fost selectată pe baza concentrațiilor utilizate în mod obișnuit în modelele de cultură celulară (1 μM Dex27, 100 nM T327 și 2,5 μM SB31). După 12 zile de cultură, combinația de T3 și Dex a dus la o integritate structurală optimă a cardiomiocitelor și o remodelare fibroasă minimă (Figurile suplimentare 4 și 5). În plus, utilizarea unor concentrații duble sau duble de T3 și Dex a produs efecte dăunătoare în comparație cu concentrațiile normale (Figurile suplimentare 6a,b).
După screening-ul inițial, am efectuat o comparație directă a 4 condiții de cultură (Figura 4a): Ctrl: secțiuni de inimă cultivate în cultura statică descrisă anterior, utilizând mediul nostru optimizat; 20,21 TD: T3 și Ctrl cu Dex adăugat miercuri; MC: secțiuni de inimă cultivate în CTCM utilizând mediul nostru optimizat anterior; și MT: CTCM cu T3 și Dex adăugate în mediu. După 12 zile de cultivare, viabilitatea țesuturilor MS și MT a rămas aceeași ca în țesuturile proaspete evaluate prin testul MTT (Fig. 4b). Interesant este că adăugarea de T3 și Dex la culturile transwell (TD) nu a dus la o îmbunătățire semnificativă a viabilității în comparație cu condițiile Ctrl, indicând un rol important al stimulării mecanice în menținerea viabilității secțiunilor de inimă.
O diagramă de design experimental care ilustrează cele patru condiții de cultură utilizate pentru a evalua efectele stimulării mecanice și ale suplimentării cu T3/Dex pe mediu timp de 12 zile. b Graficul cu bare prezintă cuantificarea viabilității la 12 zile după cultură în toate cele 4 condiții de cultură (Ctrl, TD, MC și MT) comparativ cu feliile de inimă proaspătă (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD și D12 MT), 12 (D12 MC) felii/grup de la porci diferiți, s-a efectuat testul ANOVA cu o singură direcție; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 comparativ cu D0 și **p < 0,01 comparativ cu D12 Ctrl). b Graficul cu bare prezintă cuantificarea viabilității la 12 zile după cultură în toate cele 4 condiții de cultură (Ctrl, TD, MC și MT) comparativ cu feliile de inimă proaspătă (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD și D12 MT), 12 (D12 MC) felii/grup de la porci diferiți, s-a efectuat testul ANOVA cu o singură direcție; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 comparativ cu D0 și **p < 0,01 comparativ cu D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней послеви кулрьта кулрез всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами срезами серезами серодц1 (D1) (D1) (D1) (D1) (D12 Ctrl, D12 TD și D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Graficul cu bare prezintă cuantificarea viabilității la 12 zile după cultură în toate cele 4 condiții de cultură (control, TD, MC și MT) comparativ cu secțiunile de inimă proaspătă (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD și D12 MT), 12 (D12 MC) secțiuni/grup de la porci diferiți, test ANOVA cu o singură direcție; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 vs. D0 și **p < 0,01 comparativ cu D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D10l)、D12、D12、D12 TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，##D01，0.#01，相比，**p < 0,01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнения сравнению сравнения сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, одннос#тороднос#торонос#торонос; <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogramă care prezintă toate cele 4 condiții de cultură (control, TD, MC și MT) comparativ cu secțiuni de inimă proaspătă (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD și D12 MT), de la porci diferiți, 12 (D12 MC) secțiuni/grup, test ANOVA cu o singură direcție; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. control D12). c Graficul cu bare prezintă cuantificarea fluxului de glucoză la 12 zile după cultură în toate cele 4 condiții de cultură (Ctrl, TD, MC și MT) comparativ cu feliile de inimă proaspătă (D0) (n = 6 felii/grup de la porci diferiți, s-a efectuat testul ANOVA unidirecțional; ###p < 0,001, comparativ cu D0 și ***p < 0,001 comparativ cu D12 Ctrl). c Graficul cu bare prezintă cuantificarea fluxului de glucoză la 12 zile după cultură în toate cele 4 condiții de cultură (Ctrl, TD, MC și MT) comparativ cu feliile de inimă proaspătă (D0) (n = 6 felii/grup de la porci diferiți, s-a efectuat testul ANOVA unidirecțional; ###p < 0,001, comparativ cu D0 și ***p < 0,001 comparativ cu D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после кульвти кульвта 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца = (D0воп/срению) от разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). Histograma prezintă cuantificarea fluxului de glucoză la 12 zile după cultură în toate cele 4 condiții de cultură (control, TD, MC și MT) comparativ cu secțiunile de inimă proaspătă (D0) (n = 6 secțiuni/grup de la porci diferiți, s-a efectuat testul ANOVA unidirecțional; ###p < 0,001 comparativ cu D0 și ***p < 0,001 comparativ cu D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 盌柯厹1）天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；####p < 0.0不相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切縇片扇培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， ， ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней послетвиле верез всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D60) (n = D60) срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogramă care prezintă cuantificarea fluxului de glucoză la 12 zile după cultură pentru toate cele 4 condiții de cultură (control, TD, MC și MT) comparativ cu secțiunile de inimă proaspătă (D0) (n = 6 secțiuni/grup, de la porci diferiți, teste ANOVA unilaterale, ###p < 0,001 comparativ cu D0, ***p < 0,001 comparativ cu D12 (control).d Diagramele de analiză a tulpinilor pentru țesuturi proaspete (albastru), MC în ziua 12 (verde) și MT în ziua 12 (roșu) la zece puncte regionale de secțiune a țesuturilor (n = 4 secțiuni/grup, test ANOVA unidirecțional; nu a existat nicio diferență semnificativă între grupuri). e Diagrama Volcano care prezintă gene exprimate diferențial în secțiuni de inimă proaspete (D0) comparativ cu secțiunile de inimă cultivate în condiții statice (Ctrl) sau în condiții MT (MT) timp de 10-12 zile. f Harta termică a genelor sarcomerilor pentru secțiunile de inimă cultivate în fiecare dintre condițiile de cultură. Barele de eroare reprezintă media ± deviația standard.
Dependența metabolică de trecerea de la oxidarea acizilor grași la glicoliză este o caracteristică a dediferențierii cardiomiocitelor. Cardiomiocitele imature utilizează în principal glucoza pentru producerea de ATP și au mitocondrii hipoplazice cu puține criste5,32. Analizele de utilizare a glucozei au arătat că, în condiții MC și MT, utilizarea glucozei a fost similară cu cea din țesuturile din ziua 0 (Figura 4c). Cu toate acestea, probele Ctrl au arătat o creștere semnificativă a utilizării glucozei în comparație cu țesutul proaspăt. Acest lucru indică faptul că combinația de CTCM și T3/Dex îmbunătățește viabilitatea țesuturilor și păstrează fenotipul metabolic al secțiunilor cardiace cultivate timp de 12 zile. În plus, analiza tulpinilor a arătat că nivelurile de tulpini au rămas aceleași ca în țesutul cardiac proaspăt timp de 12 zile în condiții MT și MS (Fig. 4d).
Pentru a analiza impactul general al CTCM și T3/Dex asupra peisajului transcripțional global al țesutului cardiac, am efectuat RNAseq pe felii cardiace din toate cele patru condiții de cultură diferite (Date suplimentare 1). Interesant este că secțiunile MT au prezentat o similaritate transcripțională ridicată cu țesutul cardiac proaspăt, cu doar 16 gene exprimate diferențial din 13.642. Cu toate acestea, așa cum am arătat anterior, feliile Ctrl au afișat 1229 de gene exprimate diferențial după 10-12 zile de cultură (Fig. 4e). Aceste date au fost confirmate prin qRT-PCR al genelor cardiace și fibroblastelor (Fig. suplimentare 7a-c). Interesant este că secțiunile Ctrl au arătat o reglare negativă a genelor cardiace și ale ciclului celular și activarea programelor genetice inflamatorii. Aceste date sugerează că dediferențierea, care apare în mod normal după cultivarea pe termen lung, este complet atenuată în condiții MT (Fig. suplimentare 8a,b). Un studiu atent al genelor sarcomerilor a arătat că numai în condiții MT sunt conservate genele care codifică sarcomerul (Fig. 4f) și canalul ionic (Fig. suplimentară 9), protejându-le de supresie în condiții Ctrl, TD și MC. Aceste date demonstrează că, printr-o combinație de stimulare mecanică și umorală (T3/Dex), transcriptomul feliei de inimă poate rămâne similar cu feliile de inimă proaspete după 12 zile de cultură.
Aceste descoperiri transcripționale sunt susținute de faptul că integritatea structurală a cardiomiocitelor din secțiunile de inimă este cel mai bine păstrată în condiții MT timp de 12 zile, așa cum arată conexina 43 intactă și localizată (Fig. 5a). În plus, fibroza din secțiunile de inimă în condiții MT a fost semnificativ redusă în comparație cu Ctrl și similar cu secțiunile de inimă proaspete (Fig. 5b). Aceste date demonstrează că combinația dintre stimularea mecanică și tratamentul cu T3/Dex păstrează eficient structura cardiacă în secțiunile de inimă în cultură.
Imagini reprezentative de imunofluorescență ale troponinei-T (verde), conexinei 43 (roșu) și DAPI (albastru) în secțiuni de inimă proaspăt izolate (D0) sau cultivate timp de 12 zile în toate cele patru condiții de cultură a secțiunilor de inimă (bare de scală = 100 µm). Cuantificarea prin inteligență artificială a integrității structurale a țesutului cardiac (n = 7 (D0 și D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC și D12 MT) felii/grup de la porci diferiți, s-a efectuat testul ANOVA cu o singură direcție; ####p < 0,0001 comparativ cu D0 și *p < 0,05, sau ****p < 0,0001 comparativ cu D12 Ctrl). Cuantificarea prin inteligență artificială a integrității structurale a țesutului cardiac (n = 7 (D0 și D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC și D12 MT) felii/grup de la porci diferiți, s-a efectuat testul ANOVA unidirecțional; #### p < 0,0001 comparativ cu D0 și *p < 0,05, sau ****p < 0,0001 comparativ cu D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного = инта1 (D01 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC și D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA p сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Cuantificarea integrității structurale a țesutului cardiac folosind inteligența artificială (n = 7 (D0 și D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC și D12 MT) secțiuni/grup de la porci diferiți, test ANOVA unidirecțional efectuat; #### p < 0,0001 comparativ cu D0 și *p < 0,05 sau ****p < 0,0001 comparativ cu D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p ）戇*p < ）切片/组） 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc （mc （mc）人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0,0001 与D0 和*p ，或**** p < 0,05 或**** p < 0,05 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。Cuantificarea integrității structurale a țesutului cardiac folosind inteligența artificială la diferiți porci (n = 7 (D0 și D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC și D12 MT) secțiuni/grup) cu un test ANOVA cu o singură direcție;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 comparativ cu D0 și *p < 0,05 sau ****p < 0,0001 comparativ cu D12 Ctrl). b Imagini reprezentative și cuantificare pentru felii de inimă colorate cu colorant tricrom Masson (bare de scală = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD și D12 MC), 9 (D12 MT) felii/grup de la porci diferiți, s-a efectuat testul ANOVA unidirecțional; ####p < 0,0001 comparativ cu D0 și ***p < 0,001 sau ****p < 0,0001 comparativ cu D12 Ctrl). b Imagini reprezentative și cuantificare pentru felii de inimă colorate cu colorant tricrom Masson (bare de scală = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD și D12 MC), 9 (D12 MT) felii/grup de la porci diferiți, s-a efectuat testul ANOVA unidirecțional; ####p < 0,0001 comparativ cu D0 și ***p < 0,001 sau ****p < 0,0001 comparativ cu D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных трашенных трашенных трашенных трашентативные Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/групапу, срезов/групай зони пуй выполняется односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p <; 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Imagini reprezentative și cuantificarea secțiunilor de inimă colorate cu colorant tricrom Masson (bare de scală = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD și D12 MC), 9 (D12 MT) secțiuni/grup de la porci diferiți, ANOVA unidirecțională efectuată; ####p < 0,0001 vs. D0 și ***p < 0,001 sau ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）㼈D12010（D12010 Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单单同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单单因素方##0，<1#0.与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm = 500 µmd d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,00 日 方差分析； < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных тросихнаро (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD și D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиродипы / гринупи способ ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001; по сравнению с D12 Ctrl). b Imagini reprezentative și cuantificarea secțiunilor de inimă colorate cu tricrom Masson (bare de scală = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD și D12 MC), 9 (D12 MT) secțiuni de la porci/grup diferiți, o metodă ANOVA; ####p < 0,0001 comparativ cu D0, ***p < 0,001 sau ****p < 0,0001 comparativ cu D12 Ctrl).Barele de eroare reprezintă media ± deviația standard.
În cele din urmă, capacitatea CTCM de a imita hipertrofia cardiacă a fost evaluată prin creșterea întinderii țesutului cardiac. În CTCM, presiunea maximă din camera de aer a crescut de la 80 mmHg la 80 mmHg (întindere normală) până la 140 mmHg (Fig. 6a). Aceasta corespunde unei creșteri de 32% a întinderii (Fig. 6b), care a fost demonstrată anterior ca procentul corespunzător de întindere necesar pentru ca secțiunile inimii să atingă o lungime a sarcomerului similară cu cea observată în hipertrofie. Întinderea și viteza țesutului cardiac în timpul contracției și relaxării au rămas constante pe parcursul a șase zile de cultură (Fig. 6c). Țesutul cardiac din condiții MT a fost supus unor condiții de întindere normală (MT (Normal)) sau de supraîntindere (MT (OS)) timp de șase zile. Deja după patru zile de cultură, biomarkerul hipertrofic NT-ProBNP a fost semnificativ crescut în mediu în condiții MT (OS) comparativ cu condițiile MT (normale) (Fig. 7a). În plus, după șase zile de cultivare, dimensiunea celulelor din MT (OS) (Fig. 7b) a crescut semnificativ în comparație cu secțiunile de inimă MT (normale). În plus, translocația nucleară NFATC4 a fost semnificativ crescută în țesuturile supra-întinse (Fig. 7c). Aceste rezultate arată dezvoltarea progresivă a remodelării patologice după hiperdistensie și susțin conceptul că dispozitivul CTCM poate fi utilizat ca platformă pentru studierea semnalizării hipertrofiei cardiace induse de întindere.
Urmele reprezentative ale presiunii camerei de aer, presiunii camerei de fluid și măsurătorilor mișcării țesutului confirmă faptul că presiunea camerei modifică presiunea camerei de fluid, provocând o mișcare corespunzătoare a feliei de țesut. b Curbe reprezentative ale procentului de întindere și ale ratei de întindere pentru secțiuni de țesut întinse normal (portocaliu) și supraîntinse (albastru). c Grafic cu bare care arată timpul ciclului (n = 19 felii per grup, de la porci diferiți), timpul de contracție (n = 18-19 felii per grup, de la porci diferiți), timpul de relaxare (n = 19 felii per grup, de la porci diferiți), amplitudinea mișcării țesutului (n = 14 felii/grup, de la porci diferiți), viteza sistolică maximă (n = 14 felii/grup, de la porci diferiți) și rata de relaxare maximă (n = 14 (D0), 15 (D6)) secțiuni/grupuri) de la porci diferiți. Testul t Student bilateral nu a arătat nicio diferență semnificativă în niciun parametru, indicând faptul că acești parametri au rămas constanți pe parcursul a 6 zile de cultură cu supratensiune. Barele de eroare reprezintă media ± deviația standard.
o cuantificare sub formă de grafic cu bare a concentrației de NT-ProBNP în mediile de cultură din felii de inimă cultivate în condiții de întindere normală MT (Norm) sau de supraîntindere (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm și D4 MTOS) felii/grup de la porci diferiți. S-a efectuat o analiză ANOVA bidirecțională; **p < 0,01 comparativ cu întinderea normală). Cuantificarea concentrației de NT-ProBNP în mediile de cultură, sub formă de grafic cu bare, provenită de la felii de inimă cultivate în condiții de întindere normală MT (Norm) sau de supraîntindere (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm și D4 MTOS) felii/grup de la porci diferiți. S-a efectuat o analiză ANOVA bidirecțională; **p < 0,01 comparativ cu întinderea normală).Histograma cantitativă a concentrației de NT-ProBNP în mediul de cultură din felii de inimă cultivate în condiții de întindere MT normală (normă) sau supraîntindere (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm și D4 MTOS) felii/grup de la porci diferiți, s-a efectuat o analiză a varianței cu doi factori;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 comparativ cu întinderea normală). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01） a Cuantificarea concentrației de NT-ProBNP în felii de inimă cultivate în condiții MT de întindere normală (Norm) sau supraîntindere (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) din diferite猪的切片/组，可以双向方方发发动 **comparativ cu întinderea normală, p < 0,01).Cuantificarea histogramei a concentrațiilor de NT-ProBNP în felii de inimă cultivate în condiții de întindere MT normală (normă) sau supraîntindere (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) și D4 MTOS) felii/grup de la porci diferiți, analiză bidirecțională a varianței;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 comparativ cu întinderea normală). b Imagini reprezentative pentru felii de inimă colorate cu troponină-T și WGA (stânga) și cuantificarea dimensiunii celulelor (dreapta) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) celule/grup din 10 felii diferite de la porci diferiți, se efectuează testul t Student bilateral; ****p < 0,0001 comparativ cu întinderea normală). b Imagini reprezentative pentru felii de inimă colorate cu troponină-T și WGA (stânga) și cuantificarea dimensiunii celulelor (dreapta) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) celule/grup din 10 felii diferite de la porci diferiți, s-a efectuat testul t Student bilateral; ****p < 0,0001 comparativ cu întinderea normală). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слестова) ичнтативные определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезных срезных срезных срезных срезох срезных срезных два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Imagini reprezentative ale secțiunilor de inimă colorate cu troponină-T și AZP (stânga) și cuantificarea dimensiunii celulelor (dreapta) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) celule/grup din 10 secțiuni diferite de la porci diferiți, s-a efectuat testul t Student bilateral; ****p < 0,0001 comparativ cu tulpina normală). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表切的代表性30大小量化（右）染色的心脏切片的代表性300表怏MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）。 b Imagini reprezentative ale feliilor de inimă colorate cu calcareină-T și WGA (stânga) și dimensiunea celulelor (dreapta) (n = 330 (D6 MTOS), 369 din 10 felii diferite (D6 MTNorm)) Celule/citoză, testul t de întindere normală; comparativ cu întinderea normală, ****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слестова) ичнтативные оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разныей разныей Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным; (a se vedea, de asemenea, "răsturnare"). b Imagini reprezentative ale secțiunilor de inimă colorate cu troponină-T și AZP (stânga) și cuantificarea dimensiunii celulelor (dreapta) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) din 10 secțiuni diferite de la porci diferiți) Celule/grup, criteriu bilateral t Student; ****p < 0,0001 comparativ cu tulpina normală). c Imagini reprezentative pentru secțiunile de inimă MTOS din ziua 0 și ziua 6, marcate imunologic pentru troponina-T și NFATC4, și cuantificarea translocării NFATC4 în nucleele CM-urilor (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) secțiuni/grup de la porci diferiți, s-a efectuat testul t Student bilateral; *p < 0,05). c Imagini reprezentative pentru secțiunile de inimă MTOS din ziua 0 și ziua 6, marcate imunologic pentru troponina-T și NFATC4, și cuantificarea translocării NFATC4 în nucleele CM-urilor (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) secțiuni/grup de la porci diferiți, s-a efectuat testul t Student bilateral; *p < 0,05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропо и тро-пон и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезнурапу/горнозных клеток свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента *p < 0,05). Imagini reprezentative pentru secțiuni de inimă la 0 și 6 zile MTOS, marcate imunologic pentru troponina-T și NFATC4 și cuantificarea translocării NFATC4 în nucleul celulelor cavernoase (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) felii/grup de la porci diferiți) s-a efectuat testul t Student bilateral; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化 （D0)〖（D06 = 4 (D0)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)。 c Imagini reprezentative ale feliilor de inimă 第0天和第6天MTOS de imunomarcare cu calcanin-T și NFATC4 și NFATC4 din diferite NFATC4 易位至CM nucleu de celule 的cantitate化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS,)时间双尾学生et 电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тромпоТи тромпоТ 4 количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезных/грутай пывиней t-критерий Стьюдента *p < 0,05). c Imagini reprezentative ale feliilor de inimă MTOS în ziua 0 și 6 pentru imunomarcarea troponinei-T și NFATC4 și cuantificarea translocării NFATC4 în nucleul CM de la diferiți porci (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) felii/grup, criteriul t bilateral Student; *p < 0,05).Barele de eroare reprezintă media ± deviația standard.
Cercetarea cardiovasculară translațională necesită modele celulare care reproduc cu acuratețe mediul cardiac. În acest studiu, a fost dezvoltat și caracterizat un dispozitiv CTCM care poate stimula secțiuni ultrafine ale inimii. Sistemul CTCM include stimulare electromecanică sincronizată fiziologic și îmbogățire cu fluide T3 și Dex. Când secțiunile de inimă porcină au fost expuse la acești factori, viabilitatea, integritatea structurală, activitatea metabolică și expresia transcripțională a acestora au rămas aceleași ca în țesutul cardiac proaspăt după 12 zile de cultură. În plus, întinderea excesivă a țesutului cardiac poate provoca hipertrofia inimii cauzată de hiperextensie. Per ansamblu, aceste rezultate susțin rolul critic al condițiilor fiziologice de cultură în menținerea unui fenotip cardiac normal și oferă o platformă pentru screening-ul medicamentelor.
Mulți factori contribuie la crearea unui mediu optim pentru funcționarea și supraviețuirea cardiomiocitelor. Cei mai evidenți dintre acești factori sunt legați de (1) interacțiunile intercelulare, (2) stimularea electromecanică, (3) factorii umorali și (4) substraturile metabolice. Interacțiunile fiziologice celulă-celulă necesită rețele tridimensionale complexe de tipuri multiple de celule susținute de o matrice extracelulară. Astfel de interacțiuni celulare complexe sunt dificil de reconstruit in vitro prin co-cultura tipurilor individuale de celule, dar pot fi realizate cu ușurință folosind natura organotipică a secțiunilor de inimă.
Întinderea mecanică și stimularea electrică a cardiomiocitelor sunt esențiale pentru menținerea fenotipului cardiac33,34,35. Deși stimularea mecanică a fost utilizată pe scară largă pentru condiționarea și maturarea hiPSC-CM, mai multe studii elegante au încercat recent stimularea mecanică a feliilor de inimă în cultură utilizând încărcare uniaxială. Aceste studii arată că încărcarea mecanică uniaxială 2D are un efect pozitiv asupra fenotipului inimii în timpul culturii. În aceste studii, secțiuni ale inimii au fost fie încărcate cu forțe de tracțiune izometrice17, încărcare auxotonică liniară18, fie ciclul cardiac a fost recreat folosind feedback-ul traductorului de forță și acționări de tensiune. Cu toate acestea, aceste metode utilizează întinderea uniaxială a țesutului fără optimizare de mediu, rezultând suprimarea multor gene cardiace sau supraexprimarea genelor asociate cu răspunsuri anormale de întindere. CTCM descris aici oferă un stimul electromecanic 3D care imită ciclul cardiac natural în ceea ce privește timpul de ciclu și întinderea fiziologică (25% întindere, 40% sistolă, 60% diastolă și 72 de bătăi pe minut). Deși această stimulare mecanică tridimensională nu este suficientă pentru a menține integritatea țesuturilor, o combinație de stimulare umorală și mecanică utilizând T3/Dex este necesară pentru a menține în mod adecvat viabilitatea, funcția și integritatea țesuturilor.
Factorii umorali joacă un rol important în modularea fenotipului inimii adulte. Acest lucru a fost evidențiat în studiile HiPS-CM în care T3 și Dex au fost adăugate în mediile de cultură pentru a accelera maturarea celulară. T3 poate influența transportul aminoacizilor, zaharurilor și calciului prin membranele celulare36. În plus, T3 promovează expresia MHC-α și reglarea în jos a MHC-β, promovând formarea miofibrilelor cu contracție rapidă în cardiomiocitele mature, comparativ cu miofibrilele cu contracție lentă în cardiomiocitele fetale. Deficiența de T3 la pacienții hipotiroidieni duce la pierderea benzilor miofibrilare și la o rată redusă de dezvoltare a tonusului37. Dex acționează asupra receptorilor glucocorticoizi și s-a demonstrat că crește contractilitatea miocardică în inimile perfuzate izolate;38 se consideră că această îmbunătățire este legată de efectul asupra intrării determinate de depozitele de calciu (SOCE)39,40. În plus, Dex se leagă de receptorii săi, provocând un răspuns intracelular amplu care suprimă funcția imună și inflamația30.
Rezultatele noastre indică faptul că stimularea fizico-mecanică (MS) a îmbunătățit performanța generală a culturii în comparație cu Ctrl, dar nu a reușit să mențină viabilitatea, integritatea structurală și expresia cardiacă pe o perioadă de 12 zile în cultură. Comparativ cu Ctrl, adăugarea de T3 și Dex la culturile CTCM (MT) a îmbunătățit viabilitatea și a menținut profiluri de transcripție similare, integritatea structurală și activitatea metabolică cu țesut cardiac proaspăt timp de 12 zile. În plus, prin controlul gradului de întindere a țesutului, a fost creat un model de hipertrofie cardiacă indusă de hiperextensie folosind STCM, ilustrând versatilitatea sistemului STCM. Trebuie menționat că, deși remodelarea cardiacă și fibroza implică de obicei organe intacte ale căror celule circulante pot furniza citokinele adecvate, precum și fagocitoza și alți factori de remodelare, secțiuni ale inimii pot totuși imita procesul fibrotic ca răspuns la stres și traume în miofibroblaste. Acest lucru a fost evaluat anterior în acest model de secțiune cardiacă. Trebuie menționat că parametrii CTCM pot fi modulați prin modificarea presiunii/amplitudinii electrice și a frecvenței pentru a simula multe afecțiuni, cum ar fi tahicardia, bradicardia și suportul circulator mecanic (inimă descărcată mecanic). Acest lucru face ca sistemul să fie un sistem cu randament mediu pentru testarea medicamentelor. Capacitatea CTCM de a modela hipertrofia cardiacă indusă de suprasolicitare deschide calea pentru testarea acestui sistem pentru terapia personalizată. În concluzie, prezentul studiu demonstrează că întinderea mecanică și stimularea umorală sunt esențiale pentru menținerea culturii secțiunilor de țesut cardiac.
Deși datele prezentate aici sugerează că CTCM este o platformă foarte promițătoare pentru modelarea miocardului intact, această metodă de cultură are unele limitări. Principala limitare a culturii CTCM este aceea că impune solicitări mecanice dinamice continue asupra secțiunilor, ceea ce împiedică capacitatea de a monitoriza activ contracțiile secțiunilor cardiace în timpul fiecărui ciclu. În plus, din cauza dimensiunilor mici ale secțiunilor cardiace (7 mm), capacitatea de a evalua funcția sistolică în afara sistemelor de cultură utilizând senzori de forță tradiționali este limitată. În manuscrisul actual, depășim parțial această limitare prin evaluarea tensiunii optice ca indicator al funcției contractile. Cu toate acestea, această limitare va necesita lucrări suplimentare și poate fi abordată în viitor prin introducerea unor metode de monitorizare optică a funcției secțiunilor cardiace în cultură, cum ar fi cartografierea optică utilizând coloranți sensibili la calciu și voltaj. O altă limitare a CTCM este aceea că modelul de lucru nu manipulează stresul fiziologic (preîncărcare și postîncărcare). În CTCM, presiunea a fost indusă în direcții opuse pentru a reproduce o întindere fiziologică de 25% în diastolă (întindere completă) și sistolă (lungimea contracției în timpul stimulării electrice) în țesuturi foarte mari. Această limitare ar trebui eliminată în viitoarele proiecte CTCM prin aplicarea unei presiuni adecvate asupra țesutului cardiac din ambele părți și prin aplicarea relațiilor exacte presiune-volum care apar în camerele inimii.
Remodelarea indusă de supraîntindere raportată în acest manuscris se limitează la imitarea semnalelor hipertrofice de hiperîntindere. Astfel, acest model poate ajuta în studiul semnalizării hipertrofice induse de întindere fără a fi nevoie de factori umorali sau neuronali (care nu există în acest sistem). Sunt necesare studii suplimentare pentru a crește multiplicitatea CTCM, de exemplu, co-cultivarea cu celule imune, factorii umorali din plasma circulantă și inervația atunci când se co-cultivează cu celule neuronale va îmbunătăți posibilitățile de modelare a bolilor cu CTCM.
În acest studiu au fost utilizați treisprezece porci. Toate procedurile pe animale au fost efectuate în conformitate cu ghidurile instituționale și au fost aprobate de Comitetul pentru Îngrijirea și Utilizarea Animalelor din cadrul Universității din Louisville. Arcul aortic a fost clampat, iar inima a fost perfuzată cu 1 L de cardioplegie sterilă (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparină, pH până la 7,4); Inimile au fost conservate în soluție cardioplegică rece ca gheața până la transportul la laborator pe gheață, ceea ce durează de obicei <10 minute. Inimile au fost conservate în soluție cardioplegică rece ca gheața până la transportul la laborator pe gheață, ceea ce durează de obicei <10 minute. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на лчытон, льдон занимает <10 мин. Inimile au fost păstrate în soluție cardioplegică răcită cu gheață până la transportul la laborator pe gheață, ceea ce durează de obicei <10 minute.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 Păstrați inimile pe gheață în caz de cardioplegie până la transportul la laborator pe gheață, de obicei <10 min.
Dispozitivul CTCM a fost dezvoltat cu ajutorul software-ului de proiectare asistată de calculator (CAD) SolidWorks. Camerele de cultură, divizoarele și camerele de aer sunt fabricate din plastic acrilic transparent CNC. Inelul de susținere cu diametrul de 7 mm este fabricat din polietilenă de înaltă densitate (HDPE) în centru și are o canelură pentru inelul O pentru a găzdui inelul O din silicon utilizat pentru etanșarea mediului de dedesubt. O membrană subțire de siliciu separă camera de cultură de placa de separare. Membrana de silicon este tăiată cu laser dintr-o foaie de silicon cu grosimea de 0,02″ și are o duritate de 35A. Garniturile de silicon inferioare și superioare sunt tăiate cu laser dintr-o foaie de silicon cu grosimea de 1/16″ și au o duritate de 50A. Șuruburi și piulițe cu fluture din oțel inoxidabil 316L sunt utilizate pentru fixarea blocului și crearea unei etanșări etanșe.
O placă de circuit imprimat (PCB) dedicată este concepută pentru a fi integrată cu sistemul C-PACE-EM. Mufele conectorilor swiss machine de pe PCB sunt conectate la electrozi de grafit prin fire de cupru placate cu argint și șuruburi de bronz 0-60 înșurubate în electrozi. Placa de circuit imprimat este plasată în carcasa imprimantei 3D.
Dispozitivul CTCM este controlat de un actuator pneumatic programabil (PPD) care creează o presiune circulatorie controlată, similară cu un ciclu cardiac. Pe măsură ce presiunea din interiorul camerei de aer crește, membrana flexibilă din silicon se extinde în sus, forțând mediul să treacă sub țesut. Zona de țesut va fi apoi întinsă prin această expulzare a fluidului, imitând expansiunea fiziologică a inimii în timpul diastolei. În punctul culminant al relaxării, s-a aplicat stimulare electrică prin electrozi de grafit, care au redus presiunea din camera de aer și au provocat contracția secțiunilor de țesut. În interiorul conductei se află o valvă hemostatică cu un senzor de presiune pentru a detecta presiunea din sistemul de aer. Presiunea detectată de senzorul de presiune este aplicată unui colector de date conectat la laptop. Acest lucru permite monitorizarea continuă a presiunii din interiorul camerei de gaz. Când s-a atins presiunea maximă din cameră (standard 80 mmHg, 140 mmHg OS), dispozitivul de achiziție de date a fost comandat să trimită un semnal către sistemul C-PACE-EM pentru a genera un semnal de tensiune bifazic timp de 2 ms, setat la 4 V.
Au fost obținute secțiuni de inimă, iar condițiile de cultură în 6 godeuri au fost efectuate după cum urmează: Transferul inimilor recoltate din vasul de transfer într-o tavă care conține cardioplegie rece (4°C). Ventriculul stâng a fost izolat cu o lamă sterilă și tăiat în bucăți de 1-2 cm3. Aceste blocuri de țesut au fost atașate pe suporturi de țesut cu adeziv tisular și plasate într-o baie de țesut cu microtom vibrator care conține soluție Tyrode și oxigenată continuu (3 g/L 2,3-butandionă monooximă (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glucoză (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml soluție 1 M), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml soluție 1 M), până la 1 L ddH2O). Microtomul vibrator a fost setat să taie felii cu grosimea de 300 µm la o frecvență de 80 Hz, o amplitudine a vibrației orizontale de 2 mm și o viteză de avans de 0,03 mm/s. Baia de țesut a fost înconjurată de gheață pentru a menține soluția rece, iar temperatura a fost menținută la 4°C. Transferați secțiunile de țesut din baia de microtom într-o baie de incubare care conține soluție Tyrode oxigenată continuu pe gheață până când se obțin suficiente secțiuni pentru o placă de cultură. Pentru culturile transwell, secțiunile de țesut au fost atașate la suporți sterili de poliuretan cu lățimea de 6 mm și plasate în 6 ml de mediu optimizat (mediu 199, supliment ITS 1x, FBS 10%, VEGF 5 ng/ml, FGF-alcalin 10 ng/ml și antibiotic-antifungic 2X). Stimularea electrică (10 V, frecvență 1,2 Hz) a fost aplicată secțiunilor de țesut prin C-Pace. Pentru condițiile TD, s-au adăugat T3 și Dex proaspete la 100 nM și 1 μM la fiecare schimbare de mediu. Mediul este saturat cu oxigen înainte de înlocuire, de 3 ori pe zi. Secțiunile de țesut au fost cultivate într-un incubator la 37°C și 5% CO2.
Pentru culturile CTCM, secțiunile de țesut au fost plasate pe o imprimantă 3D personalizată într-o placă Petri care conține soluție Tyrode modificată. Dispozitivul este conceput pentru a mări dimensiunea feliei inimii cu 25% din suprafața inelului de susținere. Acest lucru se face astfel încât secțiunile inimii să nu se întindă după transferul din soluția Tyrode în mediu și în timpul diastolei. Folosind lipici histoacrilic, secțiuni cu grosimea de 300 µm au fost fixate pe un inel de susținere cu diametrul de 7 mm. După atașarea secțiunilor de țesut la inelul de susținere, se taie excesul de secțiuni de țesut și se plasează secțiunile de țesut atașate înapoi în baia de soluție Tyrode pe gheață (4°C) până când au fost pregătite suficiente secțiuni pentru un dispozitiv. Timpul total de procesare pentru toate dispozitivele nu trebuie să depășească 2 ore. După ce 6 secțiuni de țesut au fost atașate la inelele lor de susținere, dispozitivul CTCM a fost asamblat. Camera de cultură CTCM este preumplută cu 21 ml de mediu preoxigenat. Transferați secțiunile de țesut în camera de cultură și îndepărtați cu grijă orice bule de aer cu o pipetă. Secțiunea de țesut este apoi ghidată în orificiu și apăsată ușor în poziție. În final, plasați capacul electrodului pe dispozitiv și transferați dispozitivul în incubator. Apoi, conectați CTCM la tubul de aer și la sistemul C-PACE-EM. Actuatorul pneumatic se deschide, iar supapa de aer deschide CTCM. Sistemul C-PACE-EM a fost configurat să furnizeze 4 V la 1,2 Hz în timpul stimulării bifazice timp de 2 ms. Mediul a fost schimbat de două ori pe zi, iar electrozii au fost schimbați o dată pe zi pentru a evita acumularea de grafit pe electrozi. Dacă este necesar, secțiunile de țesut pot fi scoase din godeurile lor de cultură pentru a elimina orice bule de aer care ar fi putut cădea sub ele. Pentru condițiile de tratament MT, T3/Dex a fost adăugat proaspăt la fiecare schimbare de mediu cu 100 nM T3 și 1 μM Dex. Dispozitivele CTCM au fost cultivate într-un incubator la 37°C și 5% CO2.
Pentru a obține traiectorii întinse ale feliilor de inimă, a fost dezvoltat un sistem special de camere. S-a utilizat o cameră SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japonia) cu un obiectiv macro Navitar Zoom 7000 18-108 mm (Navitar, San Francisco, CA). Vizualizarea a fost efectuată la temperatura camerei după înlocuirea mediului cu mediu proaspăt. Camera este poziționată la un unghi de 51°, iar înregistrarea video este efectuată la 30 de cadre pe secundă. Mai întâi, s-a utilizat software-ul open source (MUSCLEMOTION43) cu Image-J pentru a cuantifica mișcarea feliilor de inimă. Masca a fost creată folosind MATLAB (MathWorks, Natick, MA, SUA) pentru a defini regiuni de interes pentru feliile de inimă care bat, pentru a evita zgomotul. Măștile segmentate manual sunt aplicate tuturor imaginilor dintr-o secvență de cadre și apoi transmise plugin-ului MUSCLEMOTION. Muscle Motion utilizează intensitatea medie a pixelilor din fiecare cadru pentru a cuantifica mișcarea sa în raport cu cadrul de referință. Datele au fost înregistrate, filtrate și utilizate pentru a cuantifica timpul ciclului și a evalua întinderea țesutului în timpul ciclului cardiac. Înregistrarea video a fost post-procesată folosind un filtru digital de fază zero de ordinul întâi. Pentru a cuantifica întinderea țesutului (vârf-vârf), a fost efectuată o analiză vârf-vârf pentru a distinge între vârfuri și minime în semnalul înregistrat. În plus, detrending-ul este efectuat folosind un polinom de ordinul 6 pentru a elimina deviația semnalului. Codul programului a fost dezvoltat în MATLAB pentru a determina mișcarea globală a țesuturilor, timpul de ciclu, timpul de relaxare și timpul de contracție (Cod program suplimentar 44).
Pentru analiza deformației, folosind aceleași videoclipuri create pentru evaluarea întinderii mecanice, am trasat mai întâi două imagini reprezentând vârfurile de mișcare (punctele cele mai înalte (superioare) și cele mai joase (inferioare) ale mișcării) conform software-ului MUSCLEMOTION. Apoi am segmentat regiunile țesutului și am aplicat o formă de algoritm de umbrire țesutului segmentat (Fig. suplimentară 2a). Țesutul segmentat a fost apoi împărțit în zece subsuprafețe, iar tensiunea pe fiecare suprafață a fost calculată folosind următoarea ecuație: Deformație = (Sup-Sdown)/Sdown, unde Sup și Sdown sunt distanțele formei față de umbrele de sus și respectiv de jos ale țesăturii (Fig. suplimentară 2b).
Secțiunile de inimă au fost fixate în paraformaldehidă 4% timp de 48 de ore. Țesuturile fixate au fost deshidratate în zaharoză 10% și 20% timp de 1 oră, apoi în zaharoză 30% peste noapte. Secțiunile au fost apoi încorporate în compus pentru temperatură optimă de tăiere (compus OCT) și congelate treptat într-o baie de izopentan/gheață carbonică. Blocurile de încorporare OCT se depozitează la -80 °C până la separare. Lamele au fost preparate ca secțiuni cu o grosime de 8 μm.
Pentru a îndepărta OCT de pe secțiunile inimii, încălziți lamele pe un bloc încălzitor la 95 °C timp de 5 minute. Adăugați 1 ml de PBS pe fiecare lamă și incubați timp de 30 de minute la temperatura camerei, apoi permeați secțiunile prin setarea unei soluții de Triton-X 0,1% în PBS timp de 15 minute la temperatura camerei. Pentru a preveni legarea anticorpilor nespecifici de probă, adăugați 1 ml de soluție de BSA 3% pe lame și incubați timp de 1 oră la temperatura camerei. BSA a fost apoi îndepărtată, iar lamele au fost spălate cu PBS. Marcați fiecare probă cu un creion. Anticorpi primari (diluați 1:200 în 1% BSA) (conexină 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) și troponină-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) au fost adăugați timp de 90 de minute, apoi anticorpi secundari (diluați 1:200 în 1% BSA) împotriva Alexa Fluor 488 de șoarece (Thermo Scientific; #A16079), împotriva Alexa Fluor 594 de iepure (Thermo Scientific; #T6391) timp de încă 90 de minute. Spălați de 3 ori cu PBS. Pentru a distinge colorarea țintă de fundal, am folosit doar anticorpul secundar ca și control. În final, s-a adăugat colorant nuclear DAPI, iar lamele au fost plasate într-un Vectashield (Vector Laboratories) și sigilate cu lac de unghii. (mărire de -x) și un microscop Keyence cu mărire de 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) la 5 μg/ml în PBS a fost utilizat pentru colorarea WGA și aplicat pe secțiunile fixate timp de 30 de minute la temperatura camerei. Lamele au fost apoi spălate cu PBS și s-a adăugat negru de Sudan pe fiecare lamă și incubate timp de 30 de minute. Lamele au fost apoi spălate cu PBS și s-a adăugat mediu de includere Vectashield. Lamele au fost vizualizate la un microscop Keyence la o mărire de 40x.
OCT-ul a fost îndepărtat din probe așa cum este descris mai sus. După îndepărtarea OCT-ului, lamele au fost imersate în soluția Bouin peste noapte. Lamele au fost apoi clătite cu apă distilată timp de 1 oră și apoi plasate într-o soluție Bibrich de aloe vera și fucsină timp de 10 minute. Apoi, lamele au fost spălate cu apă distilată și plasate într-o soluție de 5% fosfomolibden/5% acid fosfotungstic timp de 10 minute. Fără clătire, lamele au fost transferate direct în soluția de albastru de anilină timp de 15 minute. Apoi, lamele au fost spălate cu apă distilată și plasate într-o soluție de acid acetic 1% timp de 2 minute. Lamele au fost uscate în etanol 200 N și transferate în xilen. Lamele colorate au fost vizualizate folosind un microscop Keyence cu obiectiv 10x. Procentul de suprafață de fibroză a fost cuantificat folosind software-ul Keyence Analyzer.
Testul de viabilitate celulară CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), număr de catalog V13154, conform protocolului producătorului cu unele modificări. În special, s-a utilizat un perforator chirurgical cu un diametru de 6 mm pentru a asigura o dimensiune uniformă a țesutului în timpul analizei MTT. Țesuturile au fost placate individual în godeurile unei plăci cu 12 godeuri care conține substrat MTT, conform protocolului producătorului. Secțiunile sunt incubate la 37°C timp de 3 ore, iar țesutul viu metabolizează substratul MTT pentru a forma un compus formazan violet. Se înlocuiește soluția MTT cu 1 ml DMSO și se incubează la 37°C timp de 15 minute pentru a extrage formazan violet din secțiunile de inimă. Probele au fost diluate 1:10 în DMSO în plăci cu fund transparent cu 96 de godeuri, iar intensitatea culorii violet a fost măsurată la 570 nm utilizând un cititor de plăci Cytation (BioTek). Citirile au fost normalizate la greutatea fiecărei felii de inimă.
Mediul de cultură pentru felii de inimă a fost înlocuit cu mediu conținând 1 μCi/ml [5-3H]-glucoză (Moravek Biochemicals, Brea, CA, SUA) pentru testul de utilizare a glucozei, așa cum s-a descris anterior. După 4 ore de incubare, se adaugă 100 µl de mediu într-un tub de microcentrifugă deschis, conținând 100 µl de HCl 0,2 N. Apoi, tubul a fost plasat într-un tub de scintilație conținând 500 μl de dH2O pentru a evapora [3H]2O timp de 72 de ore la 37°C. Apoi, se scoate tubul de microcentrifugă din tubul de scintilație și se adaugă 10 ml de fluid de scintilație. Numărările de scintilație au fost efectuate utilizând un analizor de scintilație lichidă Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, SUA). Utilizarea glucozei a fost apoi calculată luând în considerare activitatea specifică a glucozei [5-3H], echilibrul incomplet și fondul, diluția glucozei [5-3H] în glucoză nemarcată și eficiența contorului de scintilație. Datele sunt normalizate în funcție de masa secțiunilor inimii.
După omogenizarea țesuturilor în Trizol, ARN-ul a fost izolat din secțiuni de inimă utilizând kitul Qiagen miRNeasy Micro #210874, conform protocolului producătorului. Pregătirea bibliotecii RNAsec, secvențierea și analiza datelor au fost efectuate după cum urmează:
Ca material de pornire pentru prepararea bibliotecii de ARN s-a utilizat 1 μg de ARN per probă. Bibliotecile de secvențiere au fost generate folosind kitul de preparare a bibliotecii de ARN NEBNext UltraTM pentru Illumina (NEB, SUA), urmând recomandările producătorului, iar coduri index au fost adăugate la secvențele de atribute pentru fiecare probă. Pe scurt, ARNm a fost purificat din ARN-ul total folosind sfere magnetice atașate cu oligonucleotide poli-T. Fragmentarea se efectuează folosind cationi divalenți la temperatură înaltă în tamponul de reacție de sinteză a primei catene NEBNext (5X). ADNc-ul primei catene a fost sintetizat folosind primeri hexameri aleatori și transcriptază inversă M-MuLV (RNase H-). ADNc-ul celei de-a doua catene este apoi sintetizat folosind ADN polimeraza I și RNase H. Consolele rămase sunt convertite în capete bonte prin activitatea exonucleazei/polimerazei. După adenilarea capătului 3′ al fragmentului de ADN, se atașează la acesta un adaptor NEBNext cu o structură de buclă în ac de păr pentru a-l pregăti pentru hibridizare. Pentru selecția fragmentelor de ADNc cu lungimea preferată de 150-200 pb. Fragmentele bibliotecii au fost purificate folosind sistemul AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, SUA). Apoi, s-au utilizat 3 μl de enzimă USER (NEB, SUA) cu ADNc selectat în funcție de dimensiune, ligat cu un adaptor, timp de 15 minute la 37°C și apoi timp de 5 minute la 95°C înainte de PCR. PCR a fost apoi efectuat folosind ADN polimeraza Phusion High-Fidelity, primeri PCR universali și primeri Index (X). În final, produsele PCR au fost purificate (sistemul AMPure XP), iar calitatea bibliotecii a fost evaluată pe un sistem Agilent Bioanalyzer 2100. Biblioteca de ADNc a fost apoi secvențiată folosind un secvențiator Novaseq. Fișierele de imagine brute de la Illumina au fost convertite în citiri brute folosind CASAVA Base Calling. Datele brute sunt stocate în fișiere în format FASTQ(fq) care conțin secvențe citite și calitățile bazelor corespunzătoare. Selectați HISAT2 pentru a potrivi citirile de secvențiere filtrate cu genomul de referință Sscrofa11.1. În general, HISAT2 acceptă genomuri de orice dimensiune, inclusiv genomuri mai mari de 4 miliarde de baze, iar pentru majoritatea parametrilor sunt setate valori implicite. Citirile de splicing din datele RNA Seq pot fi aliniate eficient folosind HISAT2, cel mai rapid sistem disponibil în prezent, cu aceeași precizie sau o precizie mai bună decât orice altă metodă.
Abundența transcrierilor reflectă direct nivelul de expresie genică. Nivelurile de expresie genică sunt evaluate prin abundența transcrierilor (numărul de secvențieri) asociate cu genomul sau exonii. Numărul de citiri este proporțional cu nivelurile de expresie genică, lungimea genei și adâncimea de secvențiere. Au fost calculate FPKM (fragmente per mia de perechi de baze ale transcrierilor secvențiate per milion de perechi de baze), iar valorile P ale expresiei diferențiale au fost determinate folosind pachetul DESeq2. Apoi am calculat rata de descoperire falsă (FDR) pentru fiecare valoare P folosind metoda Benjamini-Hochberg9, bazată pe funcția R încorporată „p.adjust”.
ARN-ul izolat din secțiuni de inimă a fost convertit în ADNc la o concentrație de 200 ng/μl utilizând amestecul SuperScript IV Vilo Master de la Thermo (Thermo, nr. cat. 11756050). RT-PCR cantitativ a fost efectuat utilizând o placă de reacție transparentă Applied Biosystems Endura Plate Microamp cu 384 de godeuri (Thermo, nr. cat. 4483319) și un adeziv optic microamp (Thermo, nr. cat. 4311971). Amestecul de reacție a constat din 5 µl de amestec Taqman Fast Advanced Master (Thermo, nr. cat. 4444557), 0,5 µl de primer Taqman și 3,5 µl de H2O amestecate per godeu. Au fost rulate cicluri standard de qPCR, iar valorile CT au fost măsurate utilizând un instrument PCR în timp real Applied Biosystems Quantstudio 5 (modul cu 384 de godeuri; nr. produs A28135). Primerii Taqman au fost achiziționați de la Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Valorile CT ale tuturor probelor au fost normalizate la gena housekeeping GAPDH.
Eliberarea în mediu a NT-ProBNP a fost evaluată utilizând kitul NT-ProBNP (pig) (nr. cat. MBS2086979, MyBioSource), conform protocolului producătorului. Pe scurt, s-au adăugat în duplicat 250 µl din fiecare probă și standard în fiecare godeu. Imediat după adăugarea probei, se adaugă 50 µl de Reactiv de Test A în fiecare godeu. Se agită ușor placa și se sigilează cu material de etanșare. Apoi, tabletele au fost incubate la 37°C timp de 1 oră. Se aspiră apoi soluția și se spală godeurile de 4 ori cu 350 µl de soluție de spălare 1X, incubând soluția de spălare timp de 1-2 minute de fiecare dată. Apoi se adaugă 100 µl de Reactiv de Test B per godeu și se sigilează cu material de etanșare pentru placă. Tableta a fost agitată ușor și incubată la 37°C timp de 30 de minute. Se aspiră soluția și se spală godeurile de 5 ori cu 350 µl de soluție de spălare 1X. Adăugați 90 µl de soluție de substrat în fiecare godeu și sigilați placa. Incubați placa la 37°C timp de 10-20 de minute. Adăugați 50 µl de soluție de oprire în fiecare godeu. Placa a fost măsurată imediat folosind un cititor de plăci Cytation (BioTek) setat la 450 nm.
Au fost efectuate analize de putere pentru a alege dimensiunile grupurilor care vor oferi o putere >80% pentru a detecta o modificare absolută de 10% a parametrului cu o rată de eroare de tip I de 5%. Au fost efectuate analize de putere pentru a alege dimensiunile grupurilor care vor oferi o putere >80% pentru a detecta o modificare absolută de 10% a parametrului cu o rată de eroare de tip I de 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощносто беспечат 10% абсолютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Analiza puterii a fost efectuată pentru a selecta dimensiuni ale grupurilor care ar oferi o putere >80% pentru a detecta o modificare absolută a parametrilor de 10% cu o rată de eroare de tip I de 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощнло обнаружения 10% абсолютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. A fost efectuată o analiză a puterii pentru a selecta o dimensiune a grupului care să ofere o putere >80% pentru a detecta o modificare absolută a parametrilor de 10% și o rată de eroare de tip I de 5%.Secțiunile de țesut au fost selectate aleatoriu înainte de experiment. Toate analizele au fost realizate în regim de oarbă, iar probele au fost decodificate numai după analizarea tuturor datelor. Software-ul GraphPad Prism (San Diego, CA) a fost utilizat pentru efectuarea tuturor analizelor statistice. Pentru toate statisticile, valorile p au fost considerate semnificative la valori <0,05. Pentru toate statisticile, valorile p au fost considerate semnificative la valori <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Pentru toate statisticile, valorile p au fost considerate semnificative la valori <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Pentru toate statisticile, valorile p au fost considerate semnificative la valori <0,05.Testul t Student bilateral a fost efectuat pe date cu doar 2 comparații. A fost utilizată ANOVA unidirecțională sau bidirecțională pentru a determina semnificația între grupuri multiple. La efectuarea testelor post-hoc, s-a aplicat corecția Tukey pentru a ține cont de comparațiile multiple. Datele RNAsec au considerații statistice speciale la calcularea FDR și a ajustării p, așa cum este descris în secțiunea Metode.
Pentru mai multe informații despre designul studiului, consultați rezumatul Raportului de Cercetare Naturală, care face trimitere la acest articol.
Data publicării: 28 septembrie 2022
