Matur nuwun sampun ngunjungi Nature.com. Versi browser sing sampeyan gunakake nduweni dhukungan CSS sing winates. Kanggo pengalaman sing paling apik, disaranake sampeyan nggunakake browser sing wis dianyari (utawa mateni Mode Kompatibilitas ing Internet Explorer). Kangge, kanggo njamin dhukungan sing terus-terusan, kita bakal nampilake situs tanpa gaya lan JavaScript.
Ana kebutuhan kanggo sistem in vitro sing bisa dipercaya sing bisa ngasilake kanthi akurat lingkungan fisiologis jantung kanggo tes obat. Kasedhiyan sistem kultur jaringan jantung manungsa sing winates wis nyebabake interpretasi efek obat jantung sing ora akurat. Ing kene, kita wis ngembangake model kultur jaringan jantung (CTCM) sing kanthi elektromekanis ngrangsang irisan jantung lan ngalami peregangan fisiologis sajrone fase sistolik lan diastolik siklus jantung. Sawise 12 dina kultur, pendekatan iki sebagian nambah kelangsungan urip bagean jantung, nanging ora njaga integritas struktural kanthi lengkap. Mulane, sawise skrining molekul cilik, kita nemokake yen tambahan 100 nM triiodothyronine (T3) lan 1 μM dexamethasone (Dex) menyang medium kita njaga mikrostruktur bagean sajrone 12 dina. Digabungake karo perawatan T3/Dex, sistem CTCM njaga profil transkripsi, kelangsungan urip, aktivitas metabolisme, lan integritas struktural ing tingkat sing padha karo jaringan jantung seger sajrone 12 dina. Kajaba iku, peregangan jaringan jantung sing berlebihan ing kultur nyebabake sinyal jantung hipertrofik, menehi bukti kanggo kemampuan CTCM kanggo niru kondisi hipertrofik sing disebabake dening peregangan jantung. Kesimpulane, CTCM bisa model fisiologi lan patofisiologi jantung ing kultur sajrone wektu sing suwe, saengga bisa nggawe skrining obat sing bisa dipercaya.
Sadurunge riset klinis, dibutuhake sistem in vitro sing bisa dipercaya sing bisa ngasilake lingkungan fisiologis jantung manungsa kanthi akurat. Sistem kasebut kudu niru owah-owahan regangan mekanik, denyut jantung, lan sifat elektrofisiologis. Model kewan umume digunakake minangka platform skrining kanggo fisiologi jantung kanthi linuwih winates ing nggambarake efek obat ing jantung manungsa1,2. Pungkasane, Model Eksperimental Kultur Jaringan Jantung Ideal (CTCM) minangka model sing sensitif banget lan spesifik kanggo macem-macem intervensi terapeutik lan farmakologis, kanthi akurat ngasilake fisiologi lan patofisiologi jantung manungsa3. Anane sistem kasebut mbatesi panemuan perawatan anyar kanggo gagal jantung4,5 lan wis nyebabake kardiotoksikitas obat minangka alesan utama kanggo metu saka pasar6.
Sajrone dasawarsa kepungkur, wolung obat non-kardiovaskular wis ditarik saka panggunaan klinis amarga nyebabake pemanjangan interval QT sing nyebabake aritmia ventrikel lan pati dadakan7. Mangkono, ana kebutuhan sing saya tambah kanggo strategi skrining praklinis sing bisa dipercaya kanggo netepake efektifitas lan toksisitas kardiovaskular. Panggunaan kardiomiosit sing asale saka sel punca pluripoten sing diinduksi manungsa (hiPS-CM) anyar ing skrining obat lan uji toksisitas nyedhiyakake solusi sebagian kanggo masalah iki. Nanging, sifat hiPS-CM sing durung diwasa lan kekurangan kompleksitas multiseluler jaringan jantung minangka watesan utama metode iki. Panliten anyar nuduhake manawa watesan iki bisa diatasi sebagian kanthi nggunakake hiPS-CM awal kanggo mbentuk hidrogel jaringan jantung sakcepete sawise wiwitan kontraksi spontan lan nambah stimulasi listrik kanthi bertahap. Nanging, mikrojaringan hiPS-CM iki ora duwe sifat elektrofisiologis lan kontraktil diwasa saka miokardium diwasa. Kajaba iku, jaringan jantung manungsa duwe struktur sing luwih kompleks, sing kasusun saka campuran heterogen saka macem-macem jinis sel, kalebu sel endotel, neuron, lan fibroblas stroma, sing saling gegandhengan karo set protein matriks ekstraseluler tartamtu. Heterogenitas populasi non-kardiomiosit iki11,12,13 ing jantung mamalia diwasa minangka alangan utama kanggo model jaringan jantung nggunakake jinis sel individu. Watesan utama iki nandheske pentinge ngembangake metode kanggo budidaya jaringan miokardial sing utuh ing kahanan fisiologis lan patologis.
Bagean tipis (300 µm) jantung manungsa sing dikultur wis kabukten dadi model miokardium manungsa sing utuh lan janjeni. Cara iki nyedhiyakake akses menyang sistem multiseluler 3D lengkap sing padha karo jaringan jantung manungsa. Nanging, nganti taun 2019, panggunaan bagean jantung sing dikultur diwatesi dening kaslametan kultur sing cendhak (24 jam). Iki amarga sawetara faktor kalebu kurang regangan fisik-mekanik, antarmuka udara-cair, lan panggunaan media sederhana sing ora ndhukung kabutuhan jaringan jantung. Ing taun 2019, sawetara klompok riset nuduhake manawa nggabungake faktor mekanik menyang sistem kultur jaringan jantung bisa ngluwihi umur kultur, nambah ekspresi jantung, lan niru patologi jantung. Rong panliten elegan 17 lan 18 nuduhake manawa pemuatan mekanik uniaxial duwe efek positif ing fenotipe jantung sajrone kultur. Nanging, panliten kasebut ora nggunakake pemuatan fisiko-mekanik telung dimensi dinamis saka siklus jantung, amarga bagean jantung dimuat karo gaya tarik isometrik 17 utawa pemuatan aukotonik linier 18. Cara-cara peregangan jaringan iki nyebabake penekanan akeh gen jantung utawa ekspresi gen sing berlebihan sing ana gandhengane karo respon peregangan sing ora normal. Khususé, Pitoulis et al. 19 ngembangake rendaman kultur irisan jantung dinamis kanggo rekonstruksi siklus jantung nggunakake umpan balik transduser gaya lan dorongan ketegangan. Sanajan sistem iki ngidini pemodelan siklus jantung in vitro sing luwih akurat, kerumitan lan throughput sing kurang saka metode kasebut mbatesi aplikasi sistem iki. Laboratorium kita bubar ngembangake sistem kultur sing disederhanakake nggunakake stimulasi listrik lan media sing dioptimalake kanggo njaga kelangsungan urip bagean jaringan jantung babi lan manungsa nganti 6 dina20,21.
Ing manuskrip saiki, kita njlèntrèhaké model kultur jaringan jantung (CTCM) nggunakaké bagean jantung babi sing nggabungaké isyarat humoral kanggo ngrekam fisiologi jantung telung dimensi lan distensi patofisiologis sajrone siklus jantung. CTCM iki bisa nambah akurasi prediksi obat praklinis menyang tingkat sing durung tau digayuh sadurungé kanthi nyedhiyakake sistem jantung mid-throughput sing efektif biaya sing niru fisiologi/patofisiologi jantung mamalia kanggo uji obat praklinis.
Sinyal mekanik hemodinamik nduweni peran penting kanggo njaga fungsi kardiomiosit in vitro 22,23,24. Ing manuskrip saiki, kita wis ngembangake CTCM (Gambar 1a) sing bisa niru lingkungan jantung wong diwasa kanthi ngindhuksi stimulasi listrik lan mekanik ing frekuensi fisiologis (1,2 Hz, 72 denyut per menit). Kanggo nyegah peregangan jaringan sing berlebihan sajrone diastole, piranti pencetakan 3D digunakake kanggo nambah ukuran jaringan nganti 25% (Gambar 1b). Pacing listrik sing diinduksi dening sistem C-PACE dijadwalake kanggo miwiti 100 ms sadurunge sistol nggunakake sistem akuisisi data kanggo ngasilake siklus jantung kanthi lengkap. Sistem kultur jaringan nggunakake aktuator pneumatik sing bisa diprogram (LB Engineering, Jerman) kanggo ngembangake membran silikon fleksibel kanthi siklik kanggo nyebabake ekspansi irisan jantung ing ruang ndhuwur. Sistem kasebut disambungake menyang saluran udara eksternal liwat transduser tekanan, sing ngidini nyetel tekanan (± 1 mmHg) lan wektu (± 1 ms) kanthi akurat (Gambar 1c).
a Pasang bagean jaringan menyang cincin dhukungan 7 mm, sing dituduhake nganggo warna biru, ing njero ruang kultur piranti kasebut. Ruang kultur dipisahake saka ruang udara dening membran silikon fleksibel tipis. Pasang gasket ing antarane saben ruang kanggo nyegah bocor. Tutup piranti kasebut ngemot elektroda grafit sing nyedhiyakake stimulasi listrik. b Representasi skematis piranti jaringan gedhe, cincin pandhuan, lan cincin dhukungan. Bagean jaringan (coklat) diselehake ing piranti sing ukuran gedhe kanthi cincin pandhuan diselehake ing alur ing pinggir njaba piranti. Nggunakake pandhuan kasebut, pasang cincin dhukungan sing dilapisi perekat akrilik jaringan kanthi ati-ati ing bagean jaringan jantung. c Grafik sing nuduhake wektu stimulasi listrik minangka fungsi tekanan ruang udara sing dikontrol dening aktuator pneumatik sing bisa diprogram (PPD). Piranti akuisisi data digunakake kanggo nyelarasake stimulasi listrik nggunakake sensor tekanan. Nalika tekanan ing ruang kultur tekan ambang sing disetel, sinyal pulsa dikirim menyang C-PACE-EM kanggo micu stimulasi listrik. d Gambar papat CTCM sing diselehake ing rak inkubator. Papat piranti disambungake menyang siji PPD liwat sirkuit pneumatik, lan sensor tekanan dilebokake ing katup hemostatik kanggo ngawasi tekanan ing sirkuit pneumatik. Saben piranti ngemot enem bagean jaringan.
Nggunakake aktuator pneumatik tunggal, kita bisa ngontrol 4 piranti CTCM, sing saben piranti bisa nampung 6 bagean jaringan (Gambar 1d). Ing CTCM, tekanan udara ing ruang udara diowahi dadi tekanan sinkron ing ruang cairan lan nyebabake ekspansi fisiologis irisan jantung (Gambar 2a lan Film Tambahan 1). Evaluasi peregangan jaringan ing 80 mm Hg. Art. nuduhake peregangan bagean jaringan nganti 25% (Gambar 2b). Persentase peregangan iki wis dituduhake cocog karo dawa sarkomer fisiologis 2,2-2,3 µm kanggo kontraktilitas bagean jantung normal17,19,25. Gerakan jaringan ditaksir nggunakake setelan kamera khusus (Gambar Tambahan 1). Amplitudo lan kecepatan gerakan jaringan (Gambar 2c, d) cocog karo peregangan sajrone siklus jantung lan wektu sajrone sistol lan diastol (Gambar 2b). Peregangan lan kecepatan jaringan jantung sajrone kontraksi lan relaksasi tetep konstan sajrone 12 dina ing kultur (Gambar 2f). Kanggo ngevaluasi efek stimulasi listrik marang kontraktilitas sajrone kultur, kita ngembangake metode kanggo nemtokake deformitas aktif nggunakake algoritma shading (Gambar Tambahan 2a, b) lan bisa mbedakake antarane deformitas kanthi lan tanpa stimulasi listrik. Bagean jantung sing padha (Gambar 2f). Ing wilayah potongan sing bisa dipindhah (R6-9), voltase sajrone stimulasi listrik 20% luwih dhuwur tinimbang ora ana stimulasi listrik, sing nuduhake kontribusi stimulasi listrik kanggo fungsi kontraktil.
Jejak representatif saka tekanan ruang udara, tekanan ruang cairan, lan pangukuran gerakan jaringan ngonfirmasi manawa tekanan ruang ngganti tekanan ruang cairan, nyebabake gerakan sing cocog saka irisan jaringan. b Jejak representatif saka persen regangan (biru) saka bagean jaringan sing cocog karo persen regangan (oranye). c Gerakan irisan jantung sing diukur konsisten karo kecepatan gerakan sing diukur. (d) Lintasan representatif saka gerakan siklik (garis biru) lan kecepatan (garis putus-putus oranye) ing irisan jantung. e Kuantifikasi wektu siklus (n = 19 irisan saben klompok, saka babi sing beda), wektu kontraksi (n = 19 irisan saben klompok), wektu relaksasi (n = 19 irisan saben klompok, saka babi sing beda), gerakan jaringan (n = 25). irisan)/klompok saka babi sing beda), kecepatan sistolik puncak (n = 24(D0), 25(D12) irisan/klompok saka babi sing beda) lan tingkat relaksasi puncak (n=24(D0), 25(D12) irisan/klompok saka babi sing beda). Uji-t Two-tailed Student ora nuduhake bedane sing signifikan ing parameter apa wae. f Analisis galur representatif jejak potongan jaringan kanthi stimulasi listrik (abang) lan tanpa (biru), sepuluh area regional potongan jaringan saka bagean sing padha. Panel ngisor nuduhake kuantifikasi persentase bedane galur ing potongan jaringan kanthi lan tanpa stimulasi listrik ing sepuluh area saka bagean sing beda. (n = 8 irisan/klompok saka babi sing beda-beda, uji-t Two-tailed Student ditindakake; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 irisan/klompok saka babi sing beda-beda, uji-t Two-tailed Student ditindakake; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 bagean/klompok saka babi sing beda-beda, uji-t Student rong buntut; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу, saka разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 bagean/klompok, saka babi sing beda-beda, uji-t Student rong buntut; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Batang kesalahan makili rata-rata ± deviasi standar.
Ing sistem kultur irisan jantung biomimetik statis sadurunge [20, 21], kita njaga kelangsungan urip, fungsi, lan integritas struktural irisan jantung sajrone 6 dina kanthi ngetrapake stimulasi listrik lan ngoptimalake komposisi medium. Nanging, sawise 10 dina, angka-angka kasebut mudhun banget. Kita bakal ngrujuk menyang bagean sing dibudidayakake ing sistem kultur biomimetik statis sadurunge 20, 21 kondisi kontrol (Ctrl) lan kita bakal nggunakake medium sing dioptimalake sadurunge minangka kondisi MC lan kultur ing stimulasi mekanik lan listrik simultan (CTCM). sing diarani . Kaping pisanan, kita nemtokake manawa stimulasi mekanik tanpa stimulasi listrik ora cukup kanggo njaga kelangsungan urip jaringan sajrone 6 dina (Gambar Tambahan 3a, b). Menariknya, kanthi introduksi stimulasi fisio-mekanik lan listrik nggunakake STCM, kelangsungan urip bagean jantung 12 dina tetep padha karo bagean jantung seger ing kondisi MS, nanging ora ing kondisi Ctrl, kaya sing dituduhake dening analisis MTT (Gambar 1). 3a). Iki nuduhake manawa stimulasi mekanik lan simulasi siklus jantung bisa njaga bagean jaringan tetep urip kaping pindho luwih suwe tinimbang sing dilapurake ing sistem kultur statis sadurunge. Nanging, penilaian integritas struktural potongan jaringan kanthi imunolabel troponin T jantung lan connexin 43 nuduhake yen ekspresi connexin 43 luwih dhuwur sacara signifikan ing jaringan MC ing dina kaping 12 tinimbang ing kontrol ing dina sing padha. Nanging, ekspresi connexin 43 sing seragam lan pembentukan cakram-Z ora dijaga kanthi lengkap (Gambar 3b). Kita nggunakake kerangka kerja kecerdasan buatan (AI) kanggo ngukur integritas struktural jaringan26, pipa pembelajaran jero adhedhasar gambar adhedhasar troponin-T lan pewarnaan connexin43 kanggo kanthi otomatis ngukur integritas struktural lan fluoresensi irisan jantung babagan kekuatan lokalisasi. Metode iki nggunakake Jaringan Saraf Konvolusional (CNN) lan kerangka kerja pembelajaran jero kanggo ngukur integritas struktural jaringan jantung kanthi dipercaya kanthi cara otomatis lan ora bias, kaya sing diterangake ing referensi. 26. Jaringan MC nuduhake kamiripan struktural sing luwih apik karo dina kaping 0 dibandhingake karo bagean kontrol statis. Kajaba iku, pewarnaan trikrom Masson nuduhake persentase fibrosis sing luwih murah sacara signifikan ing kahanan MS dibandhingake karo kahanan kontrol ing dina kaping 12 kultur (Gambar 3c). Sanajan CTCM nambah kelangsungan urip potongan jaringan jantung ing dina kaping 12 nganti tingkat sing padha karo jaringan jantung seger, nanging ora nambah integritas struktural potongan jantung kanthi signifikan.
Grafik batang nuduhake kuantifikasi viabilitas MTT saka irisan jantung seger (D0) utawa kultur irisan jantung sajrone 12 dina ing kultur statis (D12 Ctrl) utawa ing CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) irisan/klompok saka babi sing beda, uji ANOVA siji arah ditindakake; ####p < 0,0001 dibandhingake karo D0 lan **p < 0,01 dibandhingake karo D12 Ctrl). Grafik batang nuduhake kuantifikasi viabilitas MTT saka irisan jantung seger (D0) utawa kultur irisan jantung sajrone 12 dina ing kultur statis (D12 Ctrl) utawa ing CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) irisan/klompok saka babi sing beda, uji ANOVA siji arah ditindakake; ####p < 0,0001 dibandhingake karo D0 lan **p < 0,01 dibandhingake karo D12 Ctrl).histogram nuduhake kuantifikasi kelangsungan urip potongan jantung seger MTT (D0) utawa kultur potongan jantung sajrone 12 dina ing kultur statis (kontrol D12) utawa CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrol D12). ) ), 12 (D12 MC) potongan/klompok saka babi sing beda, uji ANOVA siji arah ditindakake;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 dibandhingake karo D0 lan **p < 0.01 dibandhingake karo D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切(D0)片或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单后行单后从相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p <0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切(D0)片，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与 縎画)，D12 Ctrl)histogram sing nuduhake kuantifikasi viabilitas MTT ing potongan jantung seger (D0) utawa potongan jantung sing dikultur sajrone 12 dina ing kultur statis (kontrol D12) utawa CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontrol D12)), 12 (D12 MC) potongan/klompok saka babi sing beda, uji ANOVA siji arah;####p < 0,0001 saka сравнению с D0, **p < 0,01 saka сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 dibandhingake karo D0, **p < 0.01 dibandhingake karo D12 Ctrl).b Troponin-T (ijo), connexin 43 (abang) lan DAPI (biru) ing bagean jantung sing nembe diisolasi (D0) utawa bagean jantung sing dikultur ing kahanan statis (Ctrl) utawa kahanan CTCM (MC) sajrone 12 dina) saka gambar imunofluoresensi sing representatif (skala kosong = 100 µm). Kuantifikasi kecerdasan buatan saka integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) irisan/kelompok saben saka babi sing beda, uji ANOVA siji arah ditindakake; ####p < 0,0001 dibandhingake karo D0 lan ****p < 0,0001 dibandhingake karo D12 Ctrl). Kuantifikasi kecerdasan buatan saka integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) irisan/kelompok saben saka babi sing beda, uji ANOVA siji arah ditindakake; ####p < 0,0001 dibandhingake karo D0 lan ****p < 0,0001 dibandhingake karo D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl/D12), 7 (D12 Ctrl) saka разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; Kuantifikasi integritas struktural jaringan jantung nganggo kecerdasan buatan (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) bagean/klompok saka babi sing beda-beda, uji ANOVA siji arah ditindakake; ####p < 0,0001 vs. karo D0 lan ****p < 0,0001 dibandhingake karo D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) irisan/grup saben babi sing beda-beda, tes ANOVA siji arah;####p01 ，####p01 ， ****001 相0.****p < 0.0001 与 D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) irisan/glompok saben babi sing beda-beda, tes ANOVA siji arah;##0D0 ， 0##p < 0. < 0.0001 与 D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D0), Ctrl12 (D12) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; Kecerdasan buatan kanggo ngukur integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) bagean/klompokake saben babi sing beda, uji ANOVA siji arah; ####p<0,0001 vs .D0 Kanggo perbandingan ****p < 0,0001 dibandhingake karo D12 Ctrl). c Gambar representatif (kiwa) lan kuantifikasi (tengen) kanggo irisan jantung sing diwernani nganggo pewarnaan trikrom Masson (Skala kosong = 500 µm) (n = 10 irisan/klompok saben saka babi sing beda, uji ANOVA siji arah ditindakake; ####p < 0,0001 dibandhingake karo D0 lan ***p < 0,001 dibandhingake karo D12 Ctrl). c Gambar representatif (kiwa) lan kuantifikasi (tengen) kanggo irisan jantung sing diwernani nganggo pewarnaan trikrom Masson (Skala kosong = 500 µm) (n = 10 irisan/klompok saben saka babi sing beda, uji ANOVA siji arah ditindakake; #### p < 0,0001 dibandhingake karo D0 lan ***p < 0,001 dibandhingake karo D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красМалете без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,000001 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Gambar representatif (kiwa) lan kuantifikasi (tengen) saka bagean jantung sing diwernani nganggo pewarnaan trikrom Masson (skala tanpa lapisan = 500 µm) (n = 10 bagean/klompok saka babi sing beda, uji ANOVA siji arah ditindakake; #### p < 0 .0001 dibandhingake karo D0 lan ***p < 0.001 dibandhingake karo D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度 （裸尺度 = 50 n0个切片/组，每组来自不同的猪，进桌单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 C 。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单向 0##0.与D0 相比，***p < 0,001 与 D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителка = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперси <###; 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Gambar representatif (kiwa) lan kuantifikasi (tengen) saka bagean jantung sing diwernani nganggo pewarnaan trikrom Masson (kosong = 500 µm) (n = 10 bagean/klompok, saben saka babi sing beda, diuji kanthi analisis varians siji arah;### # p < 0,0001 dibandhingake karo D0, ***p < 0,001 dibandhingake karo D12 Ctrl).Batang kesalahan makili rata-rata ± deviasi standar.
Kita duwe hipotesis manawa kanthi nambahake molekul cilik menyang medium kultur, integritas kardiomiosit bisa ditingkatake lan perkembangan fibrosis bisa dikurangi sajrone kultur CTCM. Mula, kita nyaring molekul cilik nggunakake kultur kontrol statis kita20,21 amarga jumlah faktor pengganggu sing sithik. Deksametason (Dex), triiodotironin (T3), lan SB431542 (SB) dipilih kanggo skrining iki. Molekul cilik iki sadurunge wis digunakake ing kultur hiPSC-CM kanggo ngindhuksi pematangan kardiomiosit kanthi nambah dawa sarkomer, tubulus-T, lan kecepatan konduksi. Kajaba iku, Dex (glukokortikoid) lan SB dikenal bisa nyegah inflamasi29,30. Mula, kita nguji apa kalebu siji utawa kombinasi molekul cilik iki bakal ningkatake integritas struktural bagean jantung. Kanggo skrining awal, dosis saben senyawa dipilih adhedhasar konsentrasi sing umum digunakake ing model kultur sel (1 μM Dex27, 100 nM T327, lan 2,5 μM SB31). Sawisé 12 dina kultur, kombinasi T3 lan Dex ngasilaké integritas struktural kardiomiosit sing optimal lan remodeling fibrosa minimal (Gambar Tambahan 4 lan 5). Kajaba iku, panggunaan konsentrasi T3 lan Dex sing kaping pindho utawa kaping pindho iki ngasilaké efek sing ngrugèkaké dibandhingaké karo konsentrasi normal (Gambar Tambahan 6a, b).
Sawise skrining awal, kita nindakake perbandingan head-to-head saka 4 kondisi kultur (Gambar 4a): Ctrl: potongan jantung sing dikultur ing kultur statis sing wis diterangake sadurunge nggunakake medium sing dioptimalake; 20.21 TD: T3 lan Ctrl s Nambahake Dex ing dina Rebo; MC: potongan jantung sing dikultur ing CTCM nggunakake medium sing wis dioptimalake sadurunge; lan MT: CTCM karo T3 lan Dex ditambahake ing medium. Sawise 12 dina budidaya, kelangsungan urip jaringan MS lan MT tetep padha karo jaringan seger sing ditaksir dening uji MTT (Gambar 4b). Menariknya, tambahan T3 lan Dex menyang kultur transwell (TD) ora nyebabake peningkatan sing signifikan ing kelangsungan urip dibandhingake karo kondisi Ctrl, sing nuduhake peran penting saka stimulasi mekanik kanggo njaga kelangsungan urip potongan jantung.
Diagram desain eksperimental sing nggambarake papat kondisi kultur sing digunakake kanggo ngevaluasi efek stimulasi mekanik lan suplementasi T3/Dex ing medium sajrone 12 dina. Grafik batang nuduhake kuantifikasi viabilitas 12 dina sawise kultur ing kabeh 4 kondisi kultur (Ctrl, TD, MC, lan MT) dibandhingake karo irisan jantung seger (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD lan D12 MT), 12 (D12 MC) irisan/klompok saka babi sing beda, uji ANOVA siji arah ditindakake; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 dibandhingake karo D0 lan **p < 0,01 dibandhingake karo D12 Ctrl). Grafik batang b nuduhake kuantifikasi viabilitas 12 dina sawise kultur ing kabeh 4 kondisi kultur (Ctrl, TD, MC, lan MT) dibandhingake karo irisan jantung seger (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD lan D12 MT), 12 (D12 MC) irisan/klompok saka babi sing beda, uji ANOVA siji arah ditindakake; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 dibandhingake karo D0 lan **p < 0,01 dibandhingake karo D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всельникових 4 (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12)/D12 грузоп разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Grafik batang nuduhake kuantifikasi viabilitas ing 12 dina sawise kultur ing kabeh 4 kondisi kultur (kontrol, TD, MC, lan MT) dibandhingake karo potongan jantung seger (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, lan D12 MT), 12 (D12 MC) potongan/klompok saka babi sing beda, uji ANOVA siji arah; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 vs. D0 lan **p < 0,01 dibandhingake karo D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D1tr5)、和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 ，p 0.001 与盎与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) b Гистограмама, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) kanggo сравнению со свежими (сежими серди серди) (0 сежими серди сердински) (8 DIRI) 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), saka разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0. <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram sing nuduhake kabeh 4 kondisi kultur (kontrol, TD, MC lan MT) dibandhingake karo potongan jantung seger (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD lan D12 MT), saka babi sing beda-beda 12 (D12 MC) bagean/klompok, uji ANOVA siji arah; ####p<0,0001, ###p<0,001 vs. D0, **p<0,01 vs. kontrol D12). Grafik batang c nuduhake kuantifikasi fluks glukosa 12 dina sawise kultur ing kabeh 4 kondisi kultur (Ctrl, TD, MC, lan MT) dibandhingake karo irisan jantung seger (D0) (n = 6 irisan/klompok saka babi sing beda, uji ANOVA siji arah ditindakake; ###p < 0,001, dibandhingake karo D0 lan ***p < 0,001 dibandhingake karo D12 Ctrl). Grafik batang c nuduhake kuantifikasi fluks glukosa 12 dina sawise kultur ing kabeh 4 kondisi kultur (Ctrl, TD, MC, lan MT) dibandhingake karo irisan jantung seger (D0) (n = 6 irisan/klompok saka babi sing beda, uji ANOVA siji arah ditindakake; ###p < 0,001, dibandhingake karo D0 lan ***p < 0,001 dibandhingake karo D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всенку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всенко 4 лусих (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, терянностя ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 lan ***p < 0,001 dening сравнению с D12 Ctrl). c Histogram nuduhake kuantifikasi fluks glukosa 12 dina sawise kultur ing kabeh 4 kondisi kultur (kontrol, TD, MC lan MT) dibandhingake karo potongan jantung seger (D0) (n = 6 potongan/klompok saka babi sing beda, uji ANOVA siji arah ditindakake; ###p < 0,001 dibandhingake karo D0 lan ***p < 0,001 dibandhingake karo D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，吹天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001 ，*p**0.与 D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切 切片 切片培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单同行< 0,001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмама, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для 4 всех культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, saka разонных Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram sing nuduhake kuantifikasi fluks glukosa ing 12 dina sawise kultur kanggo kabeh 4 kondisi kultur (kontrol, TD, MC, lan MT) dibandhingake karo potongan jantung seger (D0) (n = 6 potongan/klompok, saka babi sing beda, unilateral. Nalika tes ANOVA ditindakake, ###p < 0,001 dibandhingake karo D0, ***p < 0,001 dibandhingake karo D12 (kontrol).d Plot analisis galur jaringan seger (biru), dina kaping 12 MC (ijo), lan dina kaping 12 MT (abang) ing sepuluh titik potongan jaringan regional (n = 4 irisan/klompok, uji ANOVA siji arah; ora ana bedane sing signifikan antarane klompok). e Plot gunung geni sing nuduhake gen sing diekspresikan kanthi beda ing potongan jantung seger (D0) dibandhingake karo potongan jantung sing dikultur ing kahanan statis (Ctrl) utawa ing kahanan MT (MT) sajrone 10-12 dina. f Peta panas gen sarkomer kanggo potongan jantung sing dikultur ing saben kahanan kultur. Batang kesalahan makili rata-rata ± deviasi standar.
Ketergantungan metabolik marang owah-owahan saka oksidasi asam lemak menyang glikolisis minangka ciri khas dediferensiasi kardiomiosit. Kardiomiosit sing durung diwasa utamane nggunakake glukosa kanggo produksi ATP lan duwe mitokondria hipoplastik kanthi sawetara krista5,32. Analisis pemanfaatan glukosa nuduhake yen ing kahanan MC lan MT, pemanfaatan glukosa padha karo ing jaringan dina 0 (Gambar 4c). Nanging, sampel Ctrl nuduhake peningkatan sing signifikan ing pemanfaatan glukosa dibandhingake karo jaringan seger. Iki nuduhake yen kombinasi CTCM lan T3/Dex nambah kelangsungan urip jaringan lan njaga fenotipe metabolik saka bagean jantung sing dikultur 12 dina. Kajaba iku, analisis galur nuduhake yen tingkat galur tetep padha karo ing jaringan jantung seger sajrone 12 dina ing kahanan MT lan MS (Gambar 4d).
Kanggo nganalisis dampak sakabèhé saka CTCM lan T3/Dex ing lanskap transkripsi global jaringan irisan jantung, kita nindakake RNAseq ing irisan jantung saka kabeh papat kondisi kultur sing béda (Data Tambahan 1). Menariknya, bagean MT nuduhake kamiripan transkripsi sing dhuwur karo jaringan jantung seger, kanthi mung 16 sing diekspresikan kanthi béda saka 13.642 gen. Nanging, kaya sing dituduhake sadurunge, irisan Ctrl nampilake 1229 gen sing diekspresikan kanthi béda sawise 10-12 dina ing kultur (Gambar 4e). Data iki dikonfirmasi dening qRT-PCR gen jantung lan fibroblast (Gambar Tambahan 7a-c). Menariknya, bagean Ctrl nuduhake downregulation gen jantung lan siklus sel lan aktivasi program gen inflamasi. Data iki nuduhake yen dediferensiasi, sing biasane kedadeyan sawise kultur jangka panjang, dilemahake kanthi lengkap ing kondisi MT (Gambar Tambahan 8a, b). Panliten sing tliti babagan gen sarkomer nuduhake yen mung ing kahanan MT gen sing ngode sarkomer (Gambar 4f) lan saluran ion (Gambar Tambahan 9) sing bisa dilestarikake, nglindhungi saka penekanan ing kahanan Ctrl, TD, lan MC. Data iki nuduhake yen kanthi kombinasi stimulasi mekanik lan humoral (T3/Dex), transkriptom irisan jantung bisa tetep padha karo irisan jantung seger sawise 12 dina ing kultur.
Temuan transkripsi iki didhukung dening kasunyatan manawa integritas struktural kardiomiosit ing bagean jantung paling apik dijaga ing kahanan MT sajrone 12 dina, kaya sing dituduhake dening connexin 43 sing utuh lan terlokalisasi (Gambar 5a). Kajaba iku, fibrosis ing bagean jantung ing kahanan MT suda sacara signifikan dibandhingake karo Ctrl lan padha karo bagean jantung seger (Gambar 5b). Data iki nuduhake manawa kombinasi stimulasi mekanik lan perawatan T3/Dex kanthi efektif njaga struktur jantung ing bagean jantung ing kultur.
Gambar imunofluoresensi representatif saka troponin-T (ijo), connexin 43 (abang), lan DAPI (biru) ing bagean jantung sing nembe diisolasi (D0) utawa dikultur sajrone 12 dina ing kabeh papat kondisi kultur bagean jantung (skala bar = 100 µm). ). Kuantifikasi kecerdasan buatan saka integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0 lan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC lan D12 MT) irisan/klompok saka babi sing beda, uji ANOVA siji arah ditindakake; ####p < 0,0001 dibandhingake karo D0 lan *p < 0,05, utawa ****p < 0,0001 dibandhingake karo D12 Ctrl). Kuantifikasi kecerdasan buatan saka integritas struktural jaringan jantung (n = 7 (D0 lan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC lan D12 MT) irisan/klompok saka babi sing beda, uji ANOVA siji arah ditindakake; #### p < 0,0001 dibandhingake karo D0 lan *p < 0,05, utawa ****p < 0,0001 dibandhingake karo D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 2 и TD12), D15 D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравнению с D0 ,**** и по < 0,**** и по < 0,**** и по < 0,**** и по сравнению karo D12 Ctrl). Kuantifikasi integritas struktural jaringan jantung nggunakake kecerdasan buatan (n = 7 (D0 lan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC lan D12 MT) bagean/klompok saka babi sing beda, uji ANOVA siji arah ditindakake; #### p < 0,0001 dibandhingake karo D0 lan *p < 0,05 utawa ****p < 0,0001 dibandhingake karo D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD,D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 ，書戰 0.05 ，書有0.与 D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 组） d1智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比 ， Ctr 0.相比）.Kuantifikasi integritas struktural jaringan jantung nggunakake kecerdasan buatan ing macem-macem babi (n = 7 (D0 lan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC lan D12 MT) bagean/klompok) kanthi uji ANOVA siji arah;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 utawa ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 dibandhingake karo D0 lan *p < 0.05 utawa ****p < 0.0001 dibandhingake karo D12 Ctrl). b Gambar representatif lan kuantifikasi kanggo irisan jantung sing diwernani nganggo pewarnaan trikrom Masson (Bar skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, lan D12 MC), 9 (D12 MT) irisan/klompok saka babi sing beda, uji ANOVA siji arah ditindakake; ####p < 0,0001 dibandhingake karo D0 lan ***p < 0,001, utawa ****p < 0,0001 dibandhingake karo D12 Ctrl). b Gambar representatif lan kuantifikasi kanggo irisan jantung sing diwernani nganggo pewarnaan trikrom Masson (Bar skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, lan D12 MC), 9 (D12 MT) irisan/klompok saka babi sing beda, uji ANOVA siji arah ditindakake; ####p < 0,0001 dibandhingake karo D0 lan ***p < 0,001, utawa ****p < 0,0001 dibandhingake karo D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массов сердца ( мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний ##0 сторонний ##0 сторонний ##0. сравнению с D0 lan ***p < 0,001 utawa ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Gambar representatif lan kuantifikasi potongan jantung sing diwernani nganggo pewarnaan trikrom Masson (skala bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD lan D12 MC), 9 (D12 MT) potongan/klompok saka babi sing beda-beda, ditindakake ANOVA siji arah; ####p < 0,0001 vs. D0 lan ***p < 0,001 utawa ****p < 0,0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）！D = 10（D 10） TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） = 500 µm） ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比 ，*0*** 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (мастабная = 50) (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA ####p < 0,0001 по, *** сра люсин свинный свиней; ****p < 0,0001 по сравнению karo D12 Ctrl). b Gambar representatif lan kuantifikasi potongan jantung sing diwernani nganggo trikrom Masson (skala bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD lan D12 MC), 9 potongan (D12 MT) saka babi/klompok sing beda, siji metode ANOVA; ####p < 0,0001 dibandhingake karo D0, ***p < 0,001 utawa ****p < 0,0001 dibandhingake karo D12 Ctrl).Batang kesalahan makili rata-rata ± deviasi standar.
Pungkasan, kemampuan CTCM kanggo niru hipertrofi jantung ditaksir kanthi nambah peregangan jaringan jantung. Ing CTCM, tekanan ruang udara puncak mundhak saka 80 mmHg dadi 80 mmHg. Art. (peregangan normal) nganti 140 mmHg Art. (Gambar 6a). Iki cocog karo kenaikan 32% ing peregangan (Gambar 6b), sing sadurunge dituduhake minangka persentase peregangan sing cocog sing dibutuhake kanggo bagean jantung kanggo entuk dawa sarkomer sing padha karo sing katon ing hipertrofi. Peregangan lan kecepatan jaringan jantung sajrone kontraksi lan relaksasi tetep konstan sajrone nem dina kultur (Gambar 6c). Jaringan jantung saka kondisi MT kena peregangan normal (MT (Normal)) utawa kondisi overstretch (MT (OS)) sajrone nem dina. Sawise patang dina kultur, biomarker hipertrofik NT-ProBNP tambah akeh ing medium ing kondisi MT (OS) dibandhingake karo kondisi MT (normal) (Gambar 7a). Kajaba iku, sawise nem dina kultur, ukuran sel ing MT (OS) (Gambar 7b) tambah akeh dibandhingake karo bagean jantung MT (normal). Kajaba iku, translokasi nuklir NFATC4 tambah akeh ing jaringan sing keluwihan peregangan (Gambar 7c). Asil kasebut nuduhake perkembangan progresif saka remodeling patologis sawise hiperdistensi lan ndhukung konsep manawa piranti CTCM bisa digunakake minangka platform kanggo nyinaoni sinyal hipertrofi jantung sing disebabake peregangan.
Jejak representatif saka tekanan ruang udara, tekanan ruang cairan, lan pangukuran gerakan jaringan ngonfirmasi manawa tekanan ruang ngganti tekanan ruang cairan, nyebabake gerakan sing cocog saka irisan jaringan. b Persentase peregangan representatif lan kurva tingkat peregangan kanggo bagean jaringan sing biasane diregang (oranye) lan sing diregang banget (biru). c Grafik batang sing nuduhake wektu siklus (n = 19 irisan saben klompok, saka babi sing beda), wektu kontraksi (n = 18-19 irisan saben klompok, saka babi sing beda), wektu relaksasi (n = 19 irisan saben klompok, saka babi sing beda) ), amplitudo gerakan jaringan (n = 14 irisan/klompok, saka babi sing beda), kecepatan sistolik puncak (n = 14 irisan/klompok, saka babi sing beda) lan tingkat relaksasi puncak (n = 14 (D0), 15 (D6) ) bagean/klompok) saka babi sing beda), uji-t Student rong buntut ora nuduhake bedane sing signifikan ing parameter apa wae, nuduhake manawa parameter kasebut tetep konstan sajrone 6 dina kultur kanthi overvoltage. Batang kesalahan makili rata-rata ± deviasi standar.
Kuantifikasi grafik batang saka konsentrasi NT-ProBNP ing media kultur saka irisan jantung sing dikultur ing kondisi MT normal stretch (Norm) utawa overstretching (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, lan D4 MTOS) irisan/klompok saka babi sing beda, ANOVA rong arah ditindakake; **p < 0,01 dibandhingake karo stretch normal). Kuantifikasi grafik batang saka konsentrasi NT-ProBNP ing media kultur saka irisan jantung sing dikultur ing kondisi MT normal stretch (Norm) utawa overstretching (OS) (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, lan D4 MTOS) irisan/klompok saka babi sing beda, ANOVA rong arah ditindakake; **p < 0,01 dibandhingake karo stretch normal).Histogram kuantitatif konsentrasi NT-ProBNP ing medium kultur saka irisan jantung sing dikultur ing kahanan MT stretch normal (norm) utawa overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, lan D4).MTOS) irisan /klompok saka babi sing beda, analisis varians rong faktor ditindakake;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 dibandhingake karo regangan normal). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的曾度4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；p中方差分析；中不与中中文0.01). a Kuantifikasi konsentrasi NT-ProBNP ing irisan jantung sing dikultur miturut kondisi MT normal stretch (Norm) utawa overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) saka macem-macem ** dibandhingake karo regangan normal, p <0.01).histogram Kuantifikasi konsentrasi NT-ProBNP ing irisan jantung sing dikultur ing kahanan MT stretch normal (norm) utawa overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) lan D4 MTOS) irisan/klompok saka babi sing beda, analisis varians rong arah;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0,01 dibandhingake karo regangan normal). b Gambar representatif kanggo irisan jantung sing diwernani troponin-T lan WGA (kiwa) lan kuantifikasi ukuran sel (tengen) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sel/klompok saka 10 irisan sing beda saka babi sing beda, uji-t Two-tailed Student ditindakake; ****p < 0,0001 dibandhingake karo regangan normal). b Gambar representatif kanggo irisan jantung sing diwernani troponin-T lan WGA (kiwa) lan kuantifikasi ukuran sel (tengen) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sel/klompok saka 10 irisan sing beda saka babi sing beda, uji-t Student rong buntut ditindakake; ****p < 0,0001 dibandhingake karo regangan normal). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного опленикрадрад (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хтвоться; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Gambar representatif saka potongan jantung sing diwernani troponin-T lan AZP (kiwa) lan kuantifikasi ukuran sel (tengen) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sel/klompok saka 10 potongan sing beda saka babi sing beda, uji-t Student rong sisi ditindakake; ****p < 0,0001 dibandhingake karo galur normal). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性（3n3图MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）。 b Gambar representatif irisan jantung sing diwernani calcarein-T lan WGA (kiwa) lan ukuran sel (tengen) (n = 330 (D6 MTOS), 369 saka 10 irisan sing beda (D6 MTNorm)) Sel/组，uji t 两方法有尾学；dibandhingake karo peregangan normal，****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оцленка (разменка) 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий С;0,0**** критерий Ста;юд0 сравнению с нормальным растяжением). b Gambar representatif saka potongan jantung sing diwernani troponin-T lan AZP (kiwa) lan kuantifikasi ukuran sel (tengen) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) saka 10 potongan sing beda saka babi sing beda) Sel/klompok, kriteria rong sisi Student's t; ****p < 0,0001 dibandhingake karo galur normal). c Gambar representatif kanggo irisan jantung MTOS dina 0 lan dina 6 sing diwenehi label imun kanggo troponin-T lan NFATC4 lan kuantifikasi translokasi NFATC4 menyang inti CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) irisan/klompok saka babi sing beda, uji-t Two-tailed Student ditindakake; *p < 0,05). c Gambar representatif kanggo irisan jantung MTOS dina 0 lan dina 6 sing diwenehi label imun kanggo troponin-T lan NFATC4 lan kuantifikasi translokasi NFATC4 menyang inti CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) irisan/klompok saka babi sing beda, uji-t Two-tailed Student ditindakake; *p < 0,05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, и колинч транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , вылнядяетсрикрирой Стьюдента; *p < 0,05). c Gambar representatif kanggo potongan jantung ing MTOS 0 lan 6 dina, diimunolabel kanggo troponin-T lan NFATC4, lan kuantifikasi translokasi NFATC4 ing inti sel kavernosa (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) irisan/klompok saka babi sing beda) ditindakake uji-t Student rong sisi; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)片) 3 (D0)片进行双尾学生t 检验；*p < 0.05). c Gambar perwakilan immunolabeling calcanin-T lan NFATC4 第0天和第6天MTOS irisan jantung, lan NFATC4 saka NFATC4 易位至CM sel nukleus 的 quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) /爇时间双尾学生et 电影；*p < 0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS ing 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и колинч транслокации NFATC4 ing ядра CM saka разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Сть0, *0). c Gambar representatif irisan jantung MTOS ing dina 0 lan 6 kanggo imunolabel troponin-T lan NFATC4 lan kuantifikasi translokasi NFATC4 ing inti CM saka babi sing beda (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) irisan/klompok, kriteria-t rong buntut Student's; *p < 0,05).Batang kesalahan makili rata-rata ± deviasi standar.
Riset kardiovaskular translasi mbutuhake model seluler sing kanthi akurat ngasilake lingkungan jantung. Ing panliten iki, piranti CTCM dikembangake lan dikarakterisasi sing bisa ngrangsang bagean jantung sing tipis banget. Sistem CTCM kalebu stimulasi elektromekanis sing disinkronake sacara fisiologis lan pengayaan cairan T3 lan Dex. Nalika bagean jantung babi kapapar faktor kasebut, kelangsungan urip, integritas struktural, aktivitas metabolisme, lan ekspresi transkripsi tetep padha karo jaringan jantung seger sawise 12 dina kultur. Kajaba iku, peregangan jaringan jantung sing berlebihan bisa nyebabake hipertrofi jantung sing disebabake dening hiperekstensi. Sakabèhé, asil kasebut ndhukung peran penting saka kondisi kultur fisiologis kanggo njaga fenotipe jantung normal lan nyedhiyakake platform kanggo skrining obat.
Akeh faktor sing nyumbang kanggo nggawe lingkungan sing optimal kanggo fungsi lan kaslametané kardiomiosit. Faktor sing paling jelas iki ana hubungane karo (1) interaksi antar sel, (2) stimulasi elektromekanis, (3) faktor humoral, lan (4) substrat metabolik. Interaksi sel-ke-sel fisiologis mbutuhake jaringan telung dimensi sing kompleks saka pirang-pirang jinis sel sing didhukung dening matriks ekstraseluler. Interaksi seluler sing kompleks kaya ngono angel direkonstruksi in vitro kanthi kultur bebarengan jinis sel individu, nanging bisa ditindakake kanthi gampang nggunakake sifat organotipik saka bagean jantung.
Peregangan mekanik lan stimulasi listrik kardiomiosit penting banget kanggo njaga fenotipe jantung33,34,35. Sanajan stimulasi mekanik wis digunakake sacara wiyar kanggo kondisioning lan pematangan hiPSC-CM, sawetara panliten sing elegan bubar nyoba stimulasi mekanik irisan jantung ing kultur nggunakake pemuatan uniaxial. Panliten kasebut nuduhake yen pemuatan mekanik uniaxial 2D duwe efek positif marang fenotipe jantung sajrone kultur. Ing panliten kasebut, bagean jantung diisi karo gaya tarik isometrik17, pemuatan auksotonik linier18, utawa siklus jantung digawe maneh nggunakake umpan balik transduser gaya lan dorongan ketegangan. Nanging, metode kasebut nggunakake peregangan jaringan uniaxial tanpa optimasi lingkungan, sing nyebabake penekanan akeh gen jantung utawa ekspresi gen sing berlebihan sing ana gandhengane karo respon peregangan sing ora normal. CTCM sing diterangake ing kene nyedhiyakake stimulus elektromekanis 3D sing niru siklus jantung alami babagan wektu siklus lan peregangan fisiologis (peregangan 25%, sistol 40%, diastol 60%, lan 72 denyut per menit). Senajan stimulasi mekanik telung dimensi iki wae ora cukup kanggo njaga integritas jaringan, kombinasi stimulasi humoral lan mekanik nggunakake T3/Dex dibutuhake kanggo njaga kelangsungan hidup, fungsi, lan integritas jaringan kanthi cukup.
Faktor humoral nduweni peran penting kanggo modulasi fenotipe jantung wong diwasa. Iki disorot ing panliten HiPS-CM ing ngendi T3 lan Dex ditambahake ing media kultur kanggo nyepetake pematangan sel. T3 bisa mengaruhi transportasi asam amino, gula, lan kalsium ngliwati membran sel36. Kajaba iku, T3 ningkatake ekspresi MHC-α lan downregulation MHC-β, ningkatake pembentukan miofibril kedutan cepet ing kardiomiosit diwasa dibandhingake karo miofibril kedutan alon ing CM janin. Kekurangan T3 ing pasien hipotiroid nyebabake ilang pita miofibril lan tingkat perkembangan nada sing luwih murah37. Dex tumindak ing reseptor glukokortikoid lan wis dituduhake nambah kontraktilitas miokard ing jantung perfusi sing terisolasi;38 perbaikan iki dianggep ana hubungane karo efek ing entri sing didorong deposit kalsium (SOCE)39,40. Kajaba iku, Dex kaiket karo reseptor, nyebabake respon intraseluler sing amba sing nyuda fungsi kekebalan lan inflamasi30.
Asil panaliten nuduhake yen stimulasi mekanik fisik (MS) ningkatake kinerja kultur sakabèhé dibandhingake karo Ctrl, nanging gagal njaga kelangsungan urip, integritas struktural, lan ekspresi jantung sajrone 12 dina ing kultur. Dibandhingake karo Ctrl, tambahan T3 lan Dex menyang kultur CTCM (MT) ningkatake kelangsungan urip lan njaga profil transkripsi, integritas struktural, lan aktivitas metabolik sing padha karo jaringan jantung seger sajrone 12 dina. Kajaba iku, kanthi ngontrol tingkat peregangan jaringan, model hipertrofi jantung sing diinduksi hiperekstensi digawe nggunakake STCM, sing nggambarake fleksibilitas sistem STCM. Perlu dicathet yen sanajan remodeling jantung lan fibrosis biasane nglibatake organ utuh sing sel sirkulasi bisa nyedhiyakake sitokin sing cocog uga fagositosis lan faktor remodeling liyane, bagean jantung isih bisa niru proses fibrotik minangka respon kanggo stres lan trauma. dadi miofibroblas. Iki wis dievaluasi sadurunge ing model irisan jantung iki. Perlu dicathet yen parameter CTCM bisa dimodulasi kanthi ngganti amplitudo lan frekuensi tekanan/listrik kanggo simulasi akeh kondisi kayata takikardia, bradikardia, lan dhukungan sirkulasi mekanik (jantung sing ora dimuat mekanik). Iki ndadekake sistem iki dadi throughput medium kanggo uji coba obat. Kemampuan CTCM kanggo model hipertrofi jantung sing disebabake dening overexertion mbukak dalan kanggo nguji sistem iki kanggo terapi sing dipersonalisasi. Kesimpulane, panliten iki nuduhake yen peregangan mekanik lan stimulasi humoral penting banget kanggo njaga kultur bagean jaringan jantung.
Sanajan data sing diwenehake ing kene nuduhake yen CTCM minangka platform sing janjeni banget kanggo model miokardium sing utuh, metode kultur iki nduweni sawetara watesan. Watesan utama kultur CTCM yaiku menehi tekanan mekanik dinamis terus-terusan ing irisan, sing nyegah kemampuan kanggo ngawasi kontraksi irisan jantung kanthi aktif sajrone saben siklus. Kajaba iku, amarga ukuran bagean jantung sing cilik (7 mm), kemampuan kanggo ngevaluasi fungsi sistolik ing njaba sistem kultur nggunakake sensor gaya tradisional diwatesi. Ing manuskrip saiki, kita sebagian ngatasi watesan iki kanthi ngevaluasi voltase optik minangka indikator fungsi kontraktil. Nanging, watesan iki mbutuhake karya luwih lanjut lan bisa ditangani ing mangsa ngarep kanthi ngenalake metode kanggo pemantauan optik fungsi irisan jantung ing kultur, kayata pemetaan optik nggunakake kalsium lan pewarna sensitif voltase. Watesan liyane saka CTCM yaiku model kerja ora manipulasi stres fisiologis (preload lan afterload). Ing CTCM, tekanan diinduksi ing arah sing ngelawan kanggo ngasilake 25% peregangan fisiologis ing diastole (peregangan lengkap) lan sistole (dawa kontraksi sajrone stimulasi listrik) ing jaringan sing gedhe banget. Watesan iki kudu diilangi ing desain CTCM ing mangsa ngarep kanthi tekanan sing cukup ing jaringan jantung saka loro-lorone sisih lan kanthi ngetrapake hubungan tekanan-volume sing tepat sing kedadeyan ing bilik jantung.
Remodeling sing disebabake dening overstretch sing dilapurake ing manuskrip iki diwatesi mung kanggo niru sinyal hiperstretch hipertrofik. Dadi, model iki bisa mbantu sinau babagan sinyal hipertrofik sing disebabake dening peregangan tanpa butuh faktor humoral utawa saraf (sing ora ana ing sistem iki). Panliten luwih lanjut dibutuhake kanggo nambah multiplisitas CTCM, contone, ko-kultur karo sel imun, faktor humoral plasma sing sirkulasi, lan persarafan nalika ko-kultur karo sel neuronal bakal nambah kemungkinan pemodelan penyakit karo CTCM.
Telulas babi digunakake ing panliten iki. Kabeh prosedur kewan ditindakake miturut pedoman kelembagaan lan disetujoni dening Komite Perawatan lan Panggunaan Kewan Kelembagaan Universitas Louisville. Lengkungan aorta dijepit lan jantung diperfusi nganggo 1 L kardioplegia steril (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH nganti 7,4); Jantung-jantung kasebut disimpen ing larutan kardioplegik sing adhem banget nganti digawa menyang laboratorium nganggo es sing biasane <10 menit. Jantung-jantung kasebut disimpen ing larutan kardioplegik sing adhem banget nganti digawa menyang laboratorium nganggo es sing biasane <10 menit. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <. Jantung disimpen ing larutan kardioplegik sing adhem banget nganti diangkut menyang laboratorium nganggo es, sing biasane butuh wektu <10 menit.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Jaga jantung tetep ing kondisi es kanggo kardioplegia nganti digawa menyang laboratorium nganggo es, biasane <10 menit.
Piranti CTCM dikembangake nganggo piranti lunak desain sing dibantu komputer (CAD) SolidWorks. Ruang kultur, pembagi, lan ruang udara digawe saka plastik akrilik bening CNC. Cincin serep diameter 7mm digawe saka polietilen kapadhetan dhuwur (HDPE) ing tengah lan duwe alur o-ring kanggo nampung cincin-o silikon sing digunakake kanggo nutup media ing ngisore. Membran silika tipis misahake ruang kultur saka piring pamisah. Membran silikon dipotong laser saka lembaran silikon kandel 0,02″ lan duwe kekerasan 35A. Gasket silikon ngisor lan ndhuwur dipotong laser saka lembaran silikon kandel 1/16″ lan duwe kekerasan 50A. Sekrup baja tahan karat 316L lan mur swiwi digunakake kanggo ngencengi blok lan nggawe segel kedap udara.
Papan sirkuit cetak (PCB) khusus dirancang kanggo diintegrasikake karo sistem C-PACE-EM. Soket konektor mesin Swiss ing PCB disambungake menyang elektroda grafit nganggo kabel tembaga berlapis perak lan sekrup perunggu 0-60 sing disekrup menyang elektroda. Papan sirkuit cetak diselehake ing tutup printer 3D.
Piranti CTCM dikontrol dening aktuator pneumatik sing bisa diprogram (PPD) sing nggawe tekanan sirkulasi sing dikontrol kaya siklus jantung. Nalika tekanan ing njero ruang udara mundhak, membran silikon fleksibel ngembang munggah, meksa medium kasebut mlebu ing sangisore situs jaringan. Area jaringan banjur bakal ditarik dening pengusiran cairan iki, niru ekspansi fisiologis jantung sajrone diastole. Ing puncak relaksasi, stimulasi listrik ditrapake liwat elektroda grafit, sing nyuda tekanan ing ruang udara lan nyebabake kontraksi bagean jaringan. Ing njero pipa ana katup hemostatik kanthi sensor tekanan kanggo ndeteksi tekanan ing sistem udara. Tekanan sing dirasakake dening sensor tekanan ditrapake menyang kolektor data sing disambungake menyang laptop. Iki ngidini pemantauan terus-terusan tekanan ing njero ruang gas. Nalika tekanan ruang maksimum tekan (standar 80 mmHg, 140 mmHg OS), piranti akuisisi data diprentahake kanggo ngirim sinyal menyang sistem C-PACE-EM kanggo ngasilake sinyal voltase bifasik sajrone 2 ms, disetel dadi 4 V.
Bagian jantung dijupuk lan kondisi kultur ing 6 sumur ditindakake kaya ing ngisor iki: Pindahake jantung sing dipanen saka wadhah transfer menyang tray sing ngemot kardioplegia adhem (4° C). Ventrikel kiwa diisolasi nganggo piso steril lan dipotong dadi potongan-potongan 1-2 cm3. Blok jaringan iki dipasang ing dhukungan jaringan nganggo perekat jaringan lan diselehake ing bak jaringan mikrotom sing geter sing ngemot larutan Tyrode lan terus dioksigenasi (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g). , 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-glukosa (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (larutan 1 ml 1 M), 1,8 mM CaCl2 (larutan 1,8 ml 1 M), nganti 1 L ddH2O). Mikrotom geter disetel kanggo ngethok irisan kandel 300 µm kanthi frekuensi 80 Hz, amplitudo getaran horisontal 2 mm, lan tingkat kemajuan 0,03 mm/s. Bak jaringan diubengi es supaya larutan tetep adhem lan suhu dijaga ing 4°C. Pindahake bagean jaringan saka bak mikrotom menyang bak inkubasi sing ngemot larutan Tyrode sing terus-terusan dioksigenasi ing es nganti bagean sing cukup dipikolehi kanggo siji piring kultur. Kanggo kultur transwell, bagean jaringan dipasang ing dhukungan poliuretan steril ambane 6 mm lan diselehake ing 6 ml medium sing dioptimalake (199 medium, 1x suplemen ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkali lan 2X antibiotik-antifungal). Stimulasi listrik (10 V, frekuensi 1,2 Hz) ditrapake ing bagean jaringan liwat C-Pace. Kanggo kondisi TD, T3 lan Dex seger ditambahake ing 100 nM lan 1 μM ing saben pangowahan medium. Medium kasebut dijenuhi oksigen sadurunge panggantos kaping 3 sedina. Bagean jaringan dikultur ing inkubator ing suhu 37°C lan 5% CO2.
Kanggo kultur CTCM, potongan jaringan dilebokake ing printer 3D khusus ing cawan Petri sing ngemot larutan Tyrode sing dimodifikasi. Piranti iki dirancang kanggo nambah ukuran irisan jantung nganti 25% saka area cincin dhukungan. Iki ditindakake supaya bagean jantung ora mulur sawise ditransfer saka larutan Tyrode menyang medium lan sajrone diastole. Nggunakake lem histoakrilik, bagean kanthi kandel 300 µm dipasang ing cincin dhukungan kanthi diameter 7 mm. Sawise masang bagean jaringan menyang cincin dhukungan, potong bagean jaringan sing berlebihan lan lebokake bagean jaringan sing dipasang maneh menyang bak larutan Tyrode ing es (4°C) nganti bagean sing cukup wis disiapake kanggo siji piranti. Total wektu pangolahan kanggo kabeh piranti ora kena ngluwihi 2 jam. Sawise 6 bagean jaringan dipasang ing cincin dhukungan, piranti CTCM dirakit. Ruang kultur CTCM wis diisi karo 21 ml medium pra-oksigen. Pindahake bagean jaringan menyang ruang kultur lan kanthi ati-ati copot gelembung udara nganggo pipet. Bagean jaringan banjur dituntun menyang bolongan lan dipencet alon-alon ing panggonane. Pungkasan, pasang tutup elektroda ing piranti lan pindhah piranti menyang inkubator. Banjur sambungake CTCM menyang tabung udara lan sistem C-PACE-EM. Aktuator pneumatik mbukak lan katup udara mbukak CTCM. Sistem C-PACE-EM dikonfigurasi kanggo ngirim 4 V ing 1,2 Hz sajrone pacing bifasik sajrone 2 ms. Medium diganti kaping pindho sedina lan elektroda diganti sapisan sedina kanggo nyegah akumulasi grafit ing elektroda. Yen perlu, bagean jaringan bisa dicopot saka sumur kultur kanggo ngetokake gelembung udara sing bisa uga tiba ing sangisore. Kanggo kondisi perawatan MT, T3/Dex ditambahake seger karo saben pangowahan medium nganggo 100 nM T3 lan 1 μM Dex. Piranti CTCM dibudidayakake ing inkubator ing suhu 37°C lan 5% CO2.
Kanggo njupuk lintasan irisan jantung sing diulur, sistem kamera khusus dikembangake. Kamera SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Jepang) digunakake nganggo lensa makro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA). Visualisasi ditindakake ing suhu ruangan sawise ngganti medium nganggo medium anyar. Kamera diposisikan ing sudut 51° lan video direkam ing 30 pigura per detik. Kaping pisanan, piranti lunak sumber terbuka (MUSCLEMOTION43) digunakake nganggo Image-J kanggo ngetung gerakan irisan jantung. Topeng digawe nggunakake MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) kanggo nemtokake wilayah sing disenengi kanggo ngalahake irisan jantung supaya ora ana gangguan. Topeng sing disegmentasi kanthi manual ditrapake ing kabeh gambar ing urutan pigura banjur dikirim menyang plug-in MUSCLEMOTION. Muscle Motion nggunakake intensitas rata-rata piksel ing saben pigura kanggo ngetung gerakane relatif marang pigura referensi. Data direkam, disaring lan digunakake kanggo ngetung wektu siklus lan netepake peregangan jaringan sajrone siklus jantung. Video sing direkam diolah maneh nggunakake filter digital fase nol orde pertama. Kanggo ngukur peregangan jaringan (puncak-ke-puncak), analisis puncak-ke-puncak ditindakake kanggo mbedakake antarane puncak lan lembah ing sinyal sing direkam. Kajaba iku, detrending ditindakake nggunakake polinomial orde kaping 6 kanggo ngilangi penyimpangan sinyal. Kode program dikembangake ing MATLAB kanggo nemtokake gerakan jaringan global, wektu siklus, wektu relaksasi, lan wektu kontraksi (Kode Program Tambahan 44).
Kanggo analisis regangan, nggunakake video sing padha sing digawe kanggo penilaian regangan mekanik, kita pisanan nglacak rong gambar sing makili puncak gerakan (titik gerakan paling dhuwur (ndhuwur) lan paling endhek (ngisor)) miturut piranti lunak MUSCLEMOTION. Banjur kita segmentasi wilayah jaringan lan ngetrapake bentuk algoritma shading menyang jaringan sing tersegmentasi (Gambar Tambahan 2a). Jaringan sing tersegmentasi banjur dipérang dadi sepuluh permukaan ngisor, lan stres ing saben permukaan diitung nggunakake persamaan ing ngisor iki: Regangan = (Sup-Sdown)/Sdown, ing ngendi Sup lan Sdown minangka jarak bentuk saka bayangan ndhuwur lan ngisor kain, masing-masing (Gambar Tambahan .2b).
Bagian jantung difiksasi ing paraformaldehida 4% sajrone 48 jam. Jaringan sing difiksasi didehidrasi ing sukrosa 10% lan 20% sajrone 1 jam, banjur ing sukrosa 30% sewengi. Bagian kasebut banjur dilebokake ing senyawa suhu pemotongan optimal (senyawa OCT) lan mboko sithik dibekukan ing bak isopentana/es garing. Simpen blok penyisipan OCT ing suhu -80 °C nganti dipisahake. Slide disiapake minangka bagian kanthi kekandelan 8 μm.
Kanggo mbusak OCT saka bagean jantung, panasake slide ing blok pemanas ing suhu 95 °C suwene 5 menit. Tambahake 1 ml PBS menyang saben slide lan inkubasi suwene 30 menit ing suhu kamar, banjur permeate bagean kanthi nyetel 0,1% Triton-X ing PBS suwene 15 menit ing suhu kamar. Kanggo nyegah antibodi non-spesifik kaiket karo sampel, tambahake 1 ml larutan BSA 3% menyang slide lan inkubasi suwene 1 jam ing suhu kamar. BSA banjur dicopot lan slide dicuci nganggo PBS. Tandhani saben sampel nganggo pensil. Antibodi primer (diencerke 1:200 ing 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) lan troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) ditambahake sajrone 90 menit, banjur antibodi sekunder (diencerke 1:200 ing 1% BSA) nglawan tikus Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), nglawan terwelu Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) sajrone 90 menit tambahan Dikumbah kaping 3 nganggo PBS Kanggo mbedakake pewarnaan target saka latar mburi, kita mung nggunakake antibodi sekunder minangka kontrol. Pungkasan, pewarnaan nuklir DAPI ditambahake lan slide dilebokake ing vectashield (Vector Laboratories) lan ditutup nganggo cat kuku. pembesaran -x) lan mikroskop Keyence kanthi pembesaran 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) kanthi konsentrasi 5 μg/ml ing PBS digunakake kanggo pewarnaan WGA lan ditrapake ing bagean sing wis ditemtokake sajrone 30 menit ing suhu ruangan. Slide banjur dikumbah nganggo PBS lan Sudan black ditambahake ing saben slide lan diinkubasi sajrone 30 menit. Slide banjur dikumbah nganggo PBS lan medium vectashield embedding ditambahake. Slide divisualisasikake ing mikroskop Keyence kanthi pembesaran 40x.
OCT dicopot saka sampel kaya sing diterangake ing ndhuwur. Sawise OCT dicopot, lebokake slide ing larutan Bouin sewengi. Slide banjur dibilas nganggo banyu suling suwene 1 jam banjur dilebokake ing larutan fuchsin asam aloe Bibrich suwene 10 menit. Banjur slide dikumbah nganggo banyu suling lan dilebokake ing larutan fosfomolibdenum 5%/asam fosfotungstat 5% suwene 10 menit. Tanpa dibilas, pindhah slide langsung menyang larutan biru anilin suwene 15 menit. Banjur slide dikumbah nganggo banyu suling lan dilebokake ing larutan asam asetat 1% suwene 2 menit. Slide dikeringake ing etanol 200 N lan ditransfer menyang xilena. Slide sing diwernani divisualisasikake nggunakake mikroskop Keyence kanthi objektif 10x. Persentase area fibrosis diukur nggunakake piranti lunak Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), nomer katalog V13154, miturut protokol pabrikan kanthi sawetara modifikasi. Utamane, punch bedhah kanthi diameter 6 mm digunakake kanggo njamin ukuran jaringan sing seragam sajrone analisis MTT. Jaringan kasebut dilapisi kanthi individu menyang sumur piring 12-sumur sing ngemot substrat MTT miturut protokol pabrikan. Bagean kasebut diinkubasi ing suhu 37° C sajrone 3 jam lan jaringan urip metabolisme substrat MTT kanggo mbentuk senyawa formazan ungu. Ganti larutan MTT nganggo 1 ml DMSO lan inkubasi ing suhu 37°C sajrone 15 menit kanggo njupuk formazan ungu saka bagean jantung. Sampel diencerake 1:10 ing DMSO ing piring ngisor sing bening 96-sumur lan intensitas warna ungu diukur ing 570 nm nggunakake pembaca piring Cytation (BioTek). Pembacaan dinormalisasi miturut bobot saben irisan jantung.
Media irisan jantung diganti karo media sing ngandhut 1 μCi/ml [5-3H]-glukosa (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) kanggo uji pemanfaatan glukosa kaya sing wis diterangake sadurunge. Sawise inkubasi 4 jam, tambahake 100 µl medium menyang tabung mikrosentrifugasi sing mbukak sing ngandhut 100 µl 0,2 N HCl. Banjur tabung kasebut dilebokake ing tabung sintilasi sing ngandhut 500 μl dH2O kanggo nguapke [3H]2O sajrone 72 jam ing suhu 37°C. Banjur copot tabung mikrosentrifugasi saka tabung sintilasi lan tambahake 10 ml cairan sintilasi. Cacah sintilasi ditindakake nggunakake penganalisis sintilasi cair Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). Panggunaan glukosa banjur diitung kanthi nganggep aktivitas spesifik [5-3H]-glukosa, keseimbangan lan latar mburi sing ora lengkap, pengenceran [5-3H]-dadi glukosa sing ora diwenehi label, lan efisiensi counter sintilasi. Data kasebut dinormalisasi menyang massa bagean jantung.
Sawisé homogenisasi jaringan ing Trizol, RNA diisolasi saka potongan jantung nggunakake Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 miturut protokol pabrikan. Persiapan perpustakaan RNAsec, sekuensing, lan analisis data ditindakake kaya ing ngisor iki:
1 μg RNA saben sampel digunakake minangka bahan wiwitan kanggo nyiapake perpustakaan RNA. Perpustakaan sekuensing digawe nggunakake Kit Persiapan Perpustakaan RNA NEBNext UltraTM kanggo Illumina (NEB, USA) miturut rekomendasi pabrikan, lan kode indeks ditambahake menyang urutan atribut kanggo saben sampel. Secara ringkes, mRNA dimurnèkaké saka total RNA nggunakake manik-manik magnetik sing dipasang karo oligonukleotida poli-T. Fragmentasi ditindakake nggunakake kation divalen ing suhu dhuwur ing Buffer Reaksi Sintesis Untai Pertama NEBNext (5X). cDNA untaian pertama disintesis nggunakake primer heksamer acak lan transkriptase terbalik M-MuLV (RNase H-). cDNA untaian kapindho banjur disintesis nggunakake DNA polimerase I lan RNase H. Overhang sing isih ana diowahi dadi ujung tumpul kanthi aktivitas eksonuklease/polimerase. Sawise adenilasi ujung 3′ fragmen DNA, Adaptor NEBNext kanthi struktur loop hairpin dipasang kanggo nyiapake hibridisasi. Kanggo pemilihan fragmen cDNA kanthi dawa sing disenengi 150-200 bp. Fragmen perpustakaan dimurnèkaké nggunakaké sistem AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA). Banjur, 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) karo cDNA sing dipilih ukuran sing diikat nganggo adaptor digunakaké suwéné 15 menit ing suhu 37°C lan banjur suwéné 5 menit ing suhu 95°C sadurungé PCR. PCR banjur ditindakaké nggunakaké Phusion High-Fidelity DNA polymerase, primer PCR universal, lan primer Index (X). Pungkasan, produk PCR dimurnèkaké (sistem AMPure XP) lan kualitas perpustakaan ditaksir ing sistem Agilent Bioanalyzer 2100. Perpustakaan cDNA banjur diurut nggunakaké Novaseq sequencer. File gambar mentah saka Illumina diowahi dadi bacaan mentah nggunakaké CASAVA Base Calling. Data mentah disimpen ing file format FASTQ(fq) sing ngemot urutan bacaan lan kualitas basa sing cocog. Pilih HISAT2 kanggo cocogaké bacaan sekuensing sing disaring karo genom referensi Sscrofa11.1. Umumé, HISAT2 ndhukung genom kanthi ukuran apa waé, kalebu genom sing luwih gedhé saka 4 milyar basa, lan nilai standar disetel kanggo umumé parameter. Pembacaan splicing saka data RNA Seq bisa diselarasake kanthi efisien nggunakake HISAT2, sistem paling cepet sing kasedhiya saiki, kanthi akurasi sing padha utawa luwih apik tinimbang metode liyane.
Akehe transkrip langsung nggambarake tingkat ekspresi gen. Tingkat ekspresi gen ditaksir saka akehe transkrip (cacah sekuensing) sing ana gandhengane karo genom utawa ekson. Jumlah bacaan sebanding karo tingkat ekspresi gen, dawa gen, lan ambane sekuensing. FPKM (fragmen saben sewu pasangan basa saka transkrip sing diurutake saben yuta pasangan basa) diitung lan nilai-P saka ekspresi diferensial ditemtokake nggunakake paket DESeq2. Banjur kita ngetung tingkat panemuan palsu (FDR) kanggo saben nilai P nggunakake metode Benjamini-Hochberg9 adhedhasar fungsi-R bawaan "p.adjust".
RNA sing diisolasi saka potongan jantung diowahi dadi cDNA kanthi konsentrasi 200 ng/μl nggunakake campuran SuperScript IV Vilo Master saka Thermo (Thermo, cat. no. 11756050). RT-PCR kuantitatif ditindakake nggunakake piring reaksi transparan Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-sumur (Thermo, cat. no. 4483319) lan perekat optik microamp (Thermo, cat. no. 4311971). Campuran reaksi kasebut kasusun saka 5 µl campuran Taqman Fast Advanced Master (Thermo, cat # 4444557), 0,5 µl Taqman Primer lan 3,5 µl H2O sing dicampur saben sumur. Siklus qPCR standar dilakokake lan nilai CT diukur nggunakake instrumen PCR wektu nyata Applied Biosystems Quantstudio 5 (modul 384-sumur; produk # A28135). Primer Taqman dituku saka Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Nilai CT saka kabeh sampel dinormalisasi menyang gen housekeeping GAPDH.
Pelepasan media NT-ProBNP ditaksir nggunakake kit NT-ProBNP (pig) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) miturut protokol pabrikan. Secara ringkes, 250 µl saben sampel lan standar ditambahake kaping pindho menyang saben sumur. Sanalika sawise nambahake sampel, tambahake 50 µl Reagen Assay A menyang saben sumur. Goyangake piring kanthi alon-alon lan segel nganggo sealant. Banjur tablet diinkubasi ing suhu 37°C sajrone 1 jam. Banjur aspirasi larutan lan cuci sumur kaping 4 nganggo 350 µl larutan cuci 1X, inkubasi larutan cuci sajrone 1-2 menit saben wektu. Banjur tambahake 100 µl Reagen Assay B saben sumur lan segel nganggo sealant piring. Tablet digoyangake alon-alon lan diinkubasi ing suhu 37°C sajrone 30 menit. Aspirasi larutan lan cuci sumur kaping 5 nganggo 350 µl larutan cuci 1X. Tambahna 90 µl larutan substrat menyang saben sumur lan tutup piring kasebut. Inkubasi piring kasebut ing suhu 37°C suwene 10-20 menit. Tambahna 50 µl Stop Solution menyang saben sumur. Piring kasebut langsung diukur nggunakake pembaca piring Cytation (BioTek) sing disetel ing 450 nm.
Analisis daya ditindakake kanggo milih ukuran grup sing bakal nyedhiyakake daya >80% kanggo ndeteksi owah-owahan absolut 10% ing parameter kanthi tingkat kesalahan Tipe I 5%. Analisis daya ditindakake kanggo milih ukuran grup sing bakal nyedhiyakake daya >80% kanggo ndeteksi owah-owahan absolut 10% ing parameter kanthi tingkat kesalahan Tipe I 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Analisis daya ditindakake kanggo milih ukuran klompok sing bakal nyedhiyakake daya >80% kanggo ndeteksi owah-owahan parameter absolut 10% kanthi tingkat kesalahan Tipe I 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I减的生。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I减的生。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаруложютя изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Analisis daya ditindakake kanggo milih ukuran grup sing bakal nyedhiyakake daya >80% kanggo ndeteksi owah-owahan parameter absolut 10% lan tingkat kesalahan tipe I 5%.Bagian jaringan dipilih kanthi acak sadurunge eksperimen. Kabeh analisis didekode tanpa syarat lan sampel mung didekode sawise kabeh data dianalisis. Piranti lunak GraphPad Prism (San Diego, CA) digunakake kanggo nindakake kabeh analisis statistik. Kanggo kabeh statistik, nilai-p dianggep signifikan ing nilai <0,05. Kanggo kabeh statistik, nilai-p dianggep signifikan ing nilai <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Kanggo kabeh statistik, nilai-p dianggep signifikan ing nilai <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Kanggo kabeh statistik, nilai-p dianggep signifikan ing nilai <0,05.Uji-t Student rong arah ditindakake ing data mung nganggo 2 perbandingan. ANOVA siji arah utawa rong arah digunakake kanggo nemtokake signifikansi antarane pirang-pirang klompok. Nalika nindakake tes post hoc, koreksi Tukey diterapake kanggo ngetung pirang-pirang perbandingan. Data RNAsec duwe pertimbangan statistik khusus nalika ngetung FDR lan p.adjust kaya sing diterangake ing bagean Metode.
Kanggo informasi luwih lengkap babagan desain panliten, deleng abstrak Laporan Riset Alam sing ana gandhengane karo artikel iki.