Ua tsaug rau koj tuaj xyuas Nature.com. Lub browser version uas koj siv muaj kev txhawb nqa CSS tsawg. Rau qhov kev paub zoo tshaj plaws, peb xav kom koj siv lub browser hloov tshiab (lossis kaw Compatibility Mode hauv Internet Explorer). Lub sijhawm no, kom ntseeg tau tias muaj kev txhawb nqa txuas ntxiv, peb yuav ua rau lub xaib tsis muaj cov qauv thiab JavaScript.
Muaj qhov xav tau rau lub kaw lus hauv vitro txhim khu kev qha uas tuaj yeem tsim kho qhov chaw ib puag ncig ntawm lub plawv kom raug rau kev kuaj tshuaj. Qhov muaj tsawg ntawm cov kab lis kev cai ntawm lub plawv tib neeg tau ua rau muaj kev txhais lus tsis raug ntawm cov teebmeem ntawm cov tshuaj plawv. Ntawm no, peb tau tsim cov qauv kab lis kev cai ntawm lub plawv (CTCM) uas ua rau lub plawv txav mus los thiab dhau los ntawm kev ncab lub cev thaum lub sijhawm systolic thiab diastolic ntawm lub voj voog plawv. Tom qab 12 hnub ntawm kev coj noj coj ua, txoj hauv kev no tau txhim kho qee qhov kev muaj sia nyob ntawm cov ntu plawv, tab sis tsis tau khaws cia lawv cov qauv kev ncaj ncees tag nrho. Yog li ntawd, tom qab kev tshuaj ntsuam me me, peb pom tias qhov ntxiv ntawm 100 nM triiodothyronine (T3) thiab 1 μM dexamethasone (Dex) rau peb cov khoom nruab nrab tau tswj hwm cov qauv ntawm cov ntu rau 12 hnub. Ua ke nrog kev kho mob T3 / Dex, lub kaw lus CTCM tau tswj hwm cov ntaub ntawv sau, kev muaj sia nyob, kev ua ub no ntawm lub cev, thiab kev ncaj ncees ntawm cov qauv ntawm tib theem li cov ntaub so ntswg plawv tshiab rau 12 hnub. Ntxiv mus, kev ncab ntau dhau ntawm cov nqaij ntawm lub plawv hauv kev cog qoob loo ua rau muaj kev cuam tshuam ntawm lub plawv hypertrophic, muab pov thawj rau lub peev xwm ntawm CTCM los ua raws li cov mob hypertrophic uas tshwm sim los ntawm kev ncab lub plawv. Hauv kev xaus, CTCM tuaj yeem ua qauv qhia txog lub cev thiab pathophysiology ntawm lub plawv hauv kev cog qoob loo ntev, ua rau muaj kev tshuaj xyuas tshuaj txhim khu kev qha.
Ua ntej kev tshawb fawb hauv tsev kho mob, xav tau cov txheej txheem hauv vitro uas ntseeg tau uas tuaj yeem tsim kho qhov chaw ib puag ncig ntawm lub plawv tib neeg. Cov txheej txheem zoo li no yuav tsum ua raws li kev hloov pauv ntawm lub cev, lub plawv dhia, thiab cov khoom siv hluav taws xob. Cov qauv tsiaj feem ntau siv ua lub platform tshuaj ntsuam xyuas lub plawv nrog kev ntseeg siab tsawg hauv kev cuam tshuam cov teebmeem ntawm cov tshuaj hauv lub plawv tib neeg1,2. Thaum kawg, Tus Qauv Kev Tshawb Fawb Txog Kab Mob Plawv Zoo (CTCM) yog tus qauv uas muaj kev nkag siab zoo thiab tshwj xeeb rau ntau yam kev kho mob thiab kev kho mob, ua kom raug cov qauv thiab pathophysiology ntawm lub plawv tib neeg3. Qhov tsis muaj cov txheej txheem zoo li no txwv tsis pub tshawb pom cov kev kho mob tshiab rau kev ua tsis tiav ntawm lub plawv4,5 thiab tau ua rau muaj kev lom tshuaj cardiotoxicity ua qhov laj thawj tseem ceeb rau kev tawm ntawm kev ua lag luam6.
Tau kaum xyoo dhau los no, yim hom tshuaj uas tsis yog siv rau lub plawv tau raug rho tawm ntawm kev siv hauv tsev kho mob vim tias lawv ua rau QT ntev zuj zus ua rau lub plawv dhia tsis xwm yeem thiab tuag sai7. Yog li, muaj kev xav tau ntau ntxiv rau cov tswv yim tshuaj ntsuam xyuas ua ntej kev kho mob kom ntseeg tau los ntsuas kev ua haujlwm ntawm lub plawv thiab kev lom. Kev siv tsis ntev los no ntawm tib neeg ua rau pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPS-CM) hauv kev tshuaj ntsuam tshuaj thiab kev kuaj mob lom muab ib feem ntawm kev daws teeb meem rau qhov teeb meem no. Txawm li cas los xij, qhov xwm txheej tsis paub tab ntawm hiPS-CMs thiab qhov tsis muaj ntau lub hlwb ntawm cov nqaij plawv yog cov kev txwv tseem ceeb ntawm txoj kev no. Cov kev tshawb fawb tsis ntev los no tau qhia tias qhov kev txwv no tuaj yeem kov yeej ib feem los ntawm kev siv hiPS-CM thaum ntxov los tsim cov nqaij plawv hydrogels sai tom qab pib ntawm kev cog lus thiab maj mam nce kev txhawb nqa hluav taws xob dhau sijhawm. Txawm li cas los xij, cov hiPS-CM microtissues no tsis muaj cov khoom siv electrophysiological thiab contractile ntawm cov neeg laus myocardium. Ntxiv rau, cov nqaij ntawm lub plawv tib neeg muaj cov qauv nyuaj dua, uas muaj cov sib xyaw ua ke ntawm ntau hom cell, suav nrog cov hlwb endothelial, neurons, thiab stromal fibroblasts, sib txuas los ntawm cov txheej txheem tshwj xeeb ntawm cov protein matrix extracellular. Qhov kev sib txawv ntawm cov pej xeem tsis yog cardiomyocyte11,12,13 hauv lub plawv tsiaj laus yog qhov teeb meem loj rau kev ua qauv ntawm cov nqaij ntawm lub plawv siv cov hom cell ib leeg. Cov kev txwv tseem ceeb no hais txog qhov tseem ceeb ntawm kev tsim cov txheej txheem rau kev cog cov nqaij myocardial uas tsis muaj mob nyob rau hauv cov xwm txheej physiological thiab pathological.
Cov ntu nyias nyias (300 µm) ntawm lub plawv tib neeg tau ua pov thawj tias yog tus qauv zoo ntawm cov leeg nqaij hauv lub plawv tib neeg uas tseem zoo. Txoj kev no muab kev nkag mus rau lub cev 3D multicellular zoo ib yam li cov nqaij plawv tib neeg. Txawm li cas los xij, txog xyoo 2019, kev siv cov ntu plawv uas tau cog qoob loo tau txwv los ntawm kev ciaj sia luv luv (24 teev) ntawm kev cog qoob loo. Qhov no yog vim muaj ntau yam xws li tsis muaj kev ncab lub cev-mechanical, qhov sib txuas ntawm huab cua-kua, thiab kev siv cov xov xwm yooj yim uas tsis txhawb nqa cov kev xav tau ntawm cov nqaij plawv. Xyoo 2019, ntau pawg tshawb fawb tau qhia tias kev koom ua ke ntawm cov yam ntxwv mechanical rau hauv cov kab ke cog qoob loo ntawm cov nqaij plawv tuaj yeem ua rau lub neej ntawm cov kab lis kev cai ntev dua, txhim kho kev qhia tawm ntawm lub plawv, thiab ua raws li cov kab mob plawv. Ob txoj kev tshawb fawb zoo nkauj 17 thiab 18 qhia tias kev thauj khoom uniaxial mechanical muaj qhov cuam tshuam zoo rau cov yam ntxwv ntawm lub plawv thaum lub sijhawm cog qoob loo. Txawm li cas los xij, cov kev tshawb fawb no tsis tau siv qhov kev thauj khoom dynamic peb-seem ntawm lub voj voog plawv, txij li cov ntu plawv tau thauj khoom nrog isometric tensile forces 17 lossis linear auxotonic loading 18. Cov txheej txheem no ntawm kev ncab cov nqaij ua rau muaj kev txwv ntawm ntau cov noob caj noob ces ntawm lub plawv lossis kev qhia ntau dhau ntawm cov noob caj noob ces uas cuam tshuam nrog kev teb ncab tsis zoo. Qhov tseem ceeb, Pitoulis et al. 19 tau tsim lub dab dej kab lis kev cai rau kev tsim kho lub plawv siv cov lus teb rau lub zog thiab kev tsav tsheb nruj. Txawm hais tias lub kaw lus no tso cai rau kev ua qauv lub plawv hauv vitro kom raug dua, qhov nyuaj thiab qhov ua haujlwm tsawg ntawm txoj kev txwv tsis pub siv lub kaw lus no. Peb lub chaw soj nstuam tau tsim lub kaw lus kab lis kev cai yooj yim siv kev txhawb nqa hluav taws xob thiab cov khoom siv zoo tshaj plaws los tswj kev muaj sia nyob ntawm cov ntu ntawm cov nqaij npua thiab cov nqaij plawv tib neeg txog li 6 hnub20,21.
Hauv daim ntawv sau tam sim no, peb piav qhia txog tus qauv kab lis kev cai ntawm lub plawv (CTCM) siv cov ntu ntawm lub plawv npua uas suav nrog cov cim humoral los rov qhia txog peb-seem ntawm lub plawv physiology thiab pathophysiological distension thaum lub sijhawm lub plawv dhia. CTCM no tuaj yeem ua kom qhov tseeb ntawm kev kwv yees tshuaj ua ntej kev kho mob mus rau qib uas tsis tau ua tiav los ntawm kev muab lub plawv system uas pheej yig, nruab nrab-throughput uas ua raws li lub physiology/pathophysiology ntawm lub plawv tsiaj rau kev kuaj tshuaj ua ntej kev kho mob.
Cov teeb liab ntawm lub plawv ua lub luag haujlwm tseem ceeb hauv kev tswj hwm kev ua haujlwm ntawm lub plawv hauv vitro 22, 23, 24. Hauv daim ntawv sau tam sim no, peb tau tsim CTCM (Daim Duab 1a) uas tuaj yeem ua raws li lub plawv ib puag ncig ntawm cov neeg laus los ntawm kev ua kom muaj kev txhawb nqa hluav taws xob thiab kev kho tshuab ntawm cov zaus ntawm lub cev (1.2 Hz, 72 lub plawv dhia ib feeb). Txhawm rau kom tsis txhob muaj kev ncab cov ntaub so ntswg ntau dhau thaum lub sijhawm diastole, lub tshuab luam ntawv 3D tau siv los ua kom cov ntaub so ntswg loj dua 25% (Daim Duab 1b). Kev ua kom lub zog hluav taws xob los ntawm C-PACE system tau teem sijhawm pib 100 ms ua ntej systole siv lub kaw lus tau txais cov ntaub ntawv los ua kom rov ua dua lub voj voog plawv. Lub kaw lus kab lis kev cai siv lub tshuab ua haujlwm pneumatic programmable (LB Engineering, Lub Tebchaws Yelemees) los nthuav dav lub membrane silicone yooj ywm kom ua rau cov hlais plawv nthuav dav hauv chav sab saud. Lub kaw lus tau txuas nrog kab cua sab nraud los ntawm lub tshuab hloov pauv siab, uas ua rau nws muaj peev xwm kho qhov siab (± 1 mmHg) thiab lub sijhawm (± 1 ms) kom raug (Daim Duab 1c).
a Txuas cov nqaij ntawm lub nplhaib txhawb nqa 7 hli, qhia hauv xiav, sab hauv chav kab lis kev cai ntawm lub cuab yeej. Lub chav kab lis kev cai raug cais tawm ntawm chav cua los ntawm daim nyias nyias silicone membrane. Muab ib lub gasket ntawm txhua lub chav kom tiv thaiv kev xau. Lub hau ntawm lub cuab yeej muaj cov electrodes graphite uas muab kev txhawb nqa hluav taws xob. b Daim duab qhia txog lub cuab yeej nqaij loj, lub nplhaib qhia thiab lub nplhaib txhawb nqa. Cov nqaij ntawm lub cuab yeej (xim av) raug muab tso rau ntawm lub cuab yeej loj nrog lub nplhaib qhia tso rau hauv qhov zawj ntawm ntug sab nraud ntawm lub cuab yeej. Siv daim ntawv qhia, ua tib zoo muab lub nplhaib txhawb nqa uas tau coated nrog cov nqaij acrylic nplaum rau saum qhov ntawm cov nqaij ntawm lub plawv. c Daim duab qhia lub sijhawm ntawm kev txhawb nqa hluav taws xob ua haujlwm ntawm lub siab ntawm chav cua tswj los ntawm lub tshuab pneumatic actuator (PPD). Lub cuab yeej tau txais cov ntaub ntawv tau siv los sib dhos kev txhawb nqa hluav taws xob siv cov sensors siab. Thaum lub siab hauv chav kab lis kev cai mus txog qhov chaw teeb tsa, lub teeb liab pulse raug xa mus rau C-PACE-EM los ua kom muaj kev txhawb nqa hluav taws xob. d Daim duab ntawm plaub CTCMs muab tso rau ntawm lub txee incubator. Plaub lub cuab yeej txuas nrog ib lub PPD los ntawm lub voj voog pneumatic, thiab cov ntsuas siab raug ntxig rau hauv lub qhov cua hemostatic los saib xyuas qhov siab hauv lub voj voog pneumatic. Txhua lub cuab yeej muaj rau ntu nqaij.
Siv ib lub tshuab ua pa xwb, peb tau tswj tau 4 lub cuab yeej CTCM, txhua lub tuaj yeem tuav tau 6 ntu ntawm cov nqaij (Daim Duab 1d). Hauv CTCM, lub siab cua hauv chav cua hloov mus ua lub siab sib xws hauv chav dej thiab ua rau lub plawv nthuav dav (Daim Duab 2a thiab Zaj Yeeb Yam Ntxiv 1). Kev ntsuam xyuas ntawm kev ncab cov nqaij ntawm 80 hli Hg. Kos duab. qhia txog kev ncab ntawm cov nqaij los ntawm 25% (Daim Duab 2b). Qhov feem pua ​​​​​​ntawm kev ncab no tau pom tias sib xws rau qhov ntev ntawm 2.2-2.3 µm rau qhov kev cog lus ntawm lub plawv ib txwm muaj17,19,25. Kev txav ntawm cov nqaij tau soj ntsuam siv cov chaw teeb tsa lub koob yees duab (Daim Duab Ntxiv 1). Qhov loj thiab qhov ceev ntawm kev txav ntawm cov nqaij (Daim Duab 2c, d) sib xws rau kev ncab thaum lub voj voog ntawm lub plawv thiab lub sijhawm thaum systole thiab diastole (Daim Duab 2b). Kev ncab thiab qhov ceev ntawm cov nqaij plawv thaum lub sijhawm cog lus thiab so kom txaus tseem nyob ruaj khov rau 12 hnub hauv kev cog qoob loo (Daim Duab 2f). Txhawm rau soj ntsuam qhov cuam tshuam ntawm kev txhawb nqa hluav taws xob rau kev cog lus thaum lub sijhawm cog qoob loo, peb tau tsim ib txoj hauv kev los txiav txim siab txog kev ua haujlwm tsis zoo siv cov txheej txheem ntxoov ntxoo (Supplementary Fig. 2a, b) thiab peb tuaj yeem paub qhov txawv ntawm kev ua tsis zoo nrog thiab tsis muaj kev txhawb nqa hluav taws xob. Tib ntu ntawm lub plawv (Daim duab 2f). Hauv thaj chaw txav tau ntawm qhov txiav (R6-9), qhov hluav taws xob thaum lub sijhawm txhawb nqa hluav taws xob yog 20% ​​siab dua li qhov tsis muaj kev txhawb nqa hluav taws xob, uas qhia txog kev koom tes ntawm kev txhawb nqa hluav taws xob rau kev ua haujlwm cog lus.
Cov cim qhia txog lub zog ntawm lub tshuab cua, lub zog ntawm lub tshuab dej, thiab kev ntsuas kev txav ntawm cov nqaij ua pov thawj tias lub zog ntawm lub tshuab hloov lub zog ntawm lub tshuab dej, ua rau muaj kev txav ntawm daim nqaij. b cov cim qhia txog feem pua ​​​​​​ntawm kev ncab (xiav) ntawm cov nqaij ntu uas sib raug rau feem pua ​​​​​​ntawm kev ncab (txiv kab ntxwv). c Kev txav uas ntsuas tau ntawm daim plawv yog sib xws nrog qhov ceev ntawm kev txav uas ntsuas tau. (d) Cov kev taw qhia sawv cev ntawm kev txav mus los (kab xiav) thiab qhov ceev (kab txiv kab ntxwv) hauv ib daim ntawm lub plawv. e Kev ntsuas lub sijhawm voj voog (n = 19 daim ib pawg, los ntawm cov npua sib txawv), lub sijhawm cog lus (n = 19 daim ib pawg), lub sijhawm so (n = 19 daim ib pawg, los ntawm cov npua sib txawv), kev txav ntawm cov nqaij (n = 25). daim)/pawg los ntawm cov npua sib txawv), qhov ceev systolic siab tshaj plaws (n = 24 (D0), 25 (D12) daim/pawg los ntawm cov npua sib txawv) thiab qhov ceev so siab tshaj plaws (n = 24 (D0), 25 (D12) daim/pawg los ntawm cov npua sib txawv). Kev xeem t-test ntawm ob tug tub ntxhais kawm tsis qhia qhov sib txawv tseem ceeb hauv txhua qhov parameter. f Kev tshuaj xyuas qhov sib txawv ntawm cov nqaij ntshiv uas muaj (liab) thiab tsis muaj (xiav) kev txhawb nqa hluav taws xob, kaum thaj chaw ntawm cov nqaij ntshiv los ntawm tib seem. Cov vaj huam sib luag hauv qab qhia txog qhov sib txawv ntawm feem pua ​​​​​​ntawm kev txhawb nqa hauv cov nqaij ntshiv uas muaj thiab tsis muaj kev txhawb nqa hluav taws xob hauv kaum thaj chaw los ntawm ntau seem. (n = 8 daim/pawg los ntawm cov npua sib txawv, Two-tailed Student t-test tau ua tiav; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 daim/pawg los ntawm cov npua sib txawv, Two-tailed Student t-test tau ua tiav; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, **p<0,01, (n = 8 ntu/pab pawg los ntawm cov npua sib txawv, ob-tailed Student's t-test; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验； ****p <0.0001，**p <0.01，*p <0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验； ****p <0.0001，**p <0.01，*p <0.05). (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 ntu/pab pawg, los ntawm cov npua sib txawv, ob-tailed Student's t-test; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Cov kab yuam kev sawv cev rau qhov nruab nrab ± tus qauv sib txawv.
Hauv peb lub tshuab ua kab mob plawv biomimetic yav dhau los [20, 21], peb tau tswj hwm qhov muaj sia nyob, kev ua haujlwm, thiab kev ua haujlwm ntawm cov nqaij plawv rau 6 hnub los ntawm kev siv hluav taws xob thiab ua kom zoo dua cov khoom nruab nrab. Txawm li cas los xij, tom qab 10 hnub, cov lej no tau poob qis heev. Peb yuav xa mus rau cov ntu uas tau cog rau hauv peb lub tshuab ua kab mob biomimetic yav dhau los 20, 21 cov xwm txheej tswj hwm (Ctrl) thiab peb yuav siv peb cov khoom nruab nrab uas tau ua kom zoo dua yav dhau los ua MC cov xwm txheej thiab kev cog qoob loo nyob rau hauv kev siv tshuab thiab hluav taws xob tib lub sijhawm (CTCM). hu ua. Ua ntej, peb tau txiav txim siab tias kev siv tshuab tsis muaj kev siv hluav taws xob tsis txaus los tswj cov nqaij kom muaj sia nyob rau 6 hnub (Daim Duab Ntxiv 3a, b). Qhov nthuav yog, nrog rau kev qhia txog kev siv tshuab thiab hluav taws xob siv STCM, qhov muaj sia nyob ntawm 12-hnub cov ntu plawv tseem zoo ib yam li hauv cov ntu plawv tshiab nyob rau hauv MS cov xwm txheej, tab sis tsis nyob rau hauv Ctrl cov xwm txheej, raws li qhia los ntawm MTT kev tshuaj xyuas (Daim Duab 1). 3a). Qhov no qhia tau hais tias kev siv tshuab thiab kev sim ua kom lub plawv dhia ceev tuaj yeem ua kom cov nqaij ntshiv nyob tau ntev ob npaug ntawm qhov tau tshaj tawm hauv peb lub kaw lus kab lis kev cai qub. Txawm li cas los xij, kev ntsuam xyuas qhov kev ncaj ncees ntawm cov nqaij ntshiv los ntawm kev tiv thaiv kab mob plawv troponin T thiab connexin 43 qhia tau hais tias kev qhia tawm connexin 43 siab dua hauv cov nqaij ntshiv MC rau hnub 12 dua li hauv cov neeg tswj rau tib hnub. Txawm li cas los xij, kev qhia tawm connexin 43 thiab kev tsim Z-disc tsis tau khaws cia tag nrho (Daim duab 3b). Peb siv lub moj khaum kev txawj ntse (AI) los ntsuas qhov kev ncaj ncees ntawm cov nqaij ntshiv26, ib txoj kab ke kawm tob raws li duab raws li troponin-T thiab connexin staining43 los ntsuas qhov kev ncaj ncees ntawm cov nqaij ntshiv thiab fluorescence ntawm cov nqaij ntshiv plawv hauv qhov muaj zog ntawm qhov chaw. Txoj kev no siv Convolutional Neural Network (CNN) thiab lub moj khaum kev kawm tob los ntsuas qhov kev ncaj ncees ntawm cov nqaij ntshiv plawv hauv txoj kev tsis siv neeg thiab tsis muaj kev ntxub ntxaug, raws li tau piav qhia hauv qhov siv. 26. Cov nqaij ntshiv MC tau qhia txog kev zoo sib xws ntawm cov qauv rau hnub 0 piv rau cov seem tswj zoo li qub. Ntxiv mus, Masson's trichrome staining qhia tau tias muaj feem pua ​​​​​​tsawg dua ntawm fibrosis nyob rau hauv MS mob piv rau cov mob tswj hwm rau hnub 12 ntawm kev cog qoob loo (Daim duab 3c). Txawm hais tias CTCM ua rau cov nqaij ntawm lub plawv muaj sia nyob ntau dua ntawm hnub 12 mus rau qib zoo ib yam li cov nqaij ntawm lub plawv tshiab, nws tsis tau txhim kho qhov kev ua haujlwm ntawm cov nqaij ntawm lub plawv.
Daim duab qhia txog kev ntsuas ntawm MTT kev muaj sia nyob ntawm cov nqaij plawv tshiab (D0) lossis cov nqaij plawv kab lis kev cai rau 12 hnub hauv kev kab lis kev cai zoo li qub (D12 Ctrl) lossis hauv CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) daim/pab pawg los ntawm cov npua sib txawv, ib txoj kev xeem ANOVA tau ua tiav; ####p < 0.0001 piv rau D0 thiab **p < 0.01 piv rau D12 Ctrl). Daim duab qhia txog kev ntsuas ntawm MTT kev muaj sia nyob ntawm cov nqaij plawv tshiab (D0) lossis cov nqaij plawv kab lis kev cai rau 12 hnub hauv kev kab lis kev cai zoo li qub (D12 Ctrl) lossis hauv CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) daim/pab pawg los ntawm cov npua sib txawv, ib txoj kev xeem ANOVA tau ua tiav; ####p < 0.0001 piv rau D0 thiab **p < 0.01 piv rau D12 Ctrl).daim histogram qhia txog qhov ntsuas ntawm qhov muaj sia nyob ntawm MTT cov ntu plawv tshiab (D0) lossis kab lis kev cai ntawm cov ntu plawv rau 12 hnub hauv kev kab lis kev cai zoo li qub (D12 tswj) lossis CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 tswj). ) ), 12 (D12 MC) ntu ​​/ pawg los ntawm cov npua sib txawv, kev xeem ANOVA ib txoj kev tau ua tiav;####p <0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 piv rau D0 thiab **p < 0.01 piv rau D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化), 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行OV 单向AN相比, ####p < 0.0001, 与D12 Ctrl 相比, ** p < 0.01) 。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切牸匇的楐匐心脏切牸匇的楐(D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p.)Daim duab histogram qhia txog kev ntsuas ntawm MTT muaj sia nyob hauv cov ntu plawv tshiab (D0) lossis cov ntu plawv uas tau cog rau 12 hnub hauv kev cog qoob loo zoo li qub (D12 tswj) lossis CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 tswj)), 12 (D12 MC) ntu/pawg los ntawm cov npua sib txawv, kev xeem ANOVA ib txoj kev;####p <0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 piv rau D0, **p < 0.01 piv rau D12 Ctrl).b Troponin-T (ntsuab), connexin 43 (liab) thiab DAPI (xiav) nyob rau hauv cov plawv tshiab cais tawm (D0) lossis cov plawv uas tau cog rau hauv qab cov xwm txheej static (Ctrl) lossis CTCM (MC) rau 12 hnub) ntawm cov duab sawv cev immunofluorescence (qauv dawb paug = 100 µm). Kev ntsuas kev txawj ntse ntawm lub plawv cov qauv ntawm cov nqaij ntshiv (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) daim/pab pawg los ntawm cov npua sib txawv, kev sim ANOVA ib txoj kev tau ua tiav; ####p < 0.0001 piv rau D0 thiab ****p < 0.0001 piv rau D12 Ctrl). Kev ntsuas kev txawj ntse ntawm lub plawv cov qauv kev ncaj ncees (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) daim/pawg txhua tus los ntawm cov npua sib txawv, kev sim ANOVA ib txoj kev tau ua tiav; ####p < 0.0001 piv rau D0 thiab ****p < 0.0001 piv rau D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искуственным интеллектом (n = 7 (D52)), 7 (D MC Ctrl) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; D12 Ctrl). Kev ntsuas qhov kev ncaj ncees ntawm cov nqaij ntshiv ntawm lub plawv los ntawm kev txawj ntse (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ntu ​​/ pawg los ntawm cov npua sib txawv, kev sim ANOVA ib txoj kev ua tiav; ####p < 0.0001 vs. nrog D0 thiab ****p < 0.0001 piv rau D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性(n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) slices/pawg txhua tus npua sib txawv, ib-txoj kev ANOVA xeem; ###00D <10 .相比, ****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) slices/pab txhua tus npua sib txawv, ib-txoj kev ANOVA xeem;###0#p 10与D0相比, ****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比). Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7D) Ctrl (D2), срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; Ctrl). Kev txawj ntse dag kom ntsuas qhov kev ncaj ncees ntawm cov nqaij ntshiv plawv (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) ntu/pab pawg ntawm txhua tus npua sib txawv, ib txoj kev xeem ANOVA; ####p<0.0001 vs .D0 Rau kev sib piv ****p < 0.0001 piv rau D12 Ctrl). c Cov duab sawv cev (sab laug) thiab kev ntsuas (sab xis) rau cov plawv uas muaj Masson's trichrome stain (Scale bare = 500 µm) (n = 10 daim/pawg txhua tus los ntawm npua sib txawv, kev sim ANOVA ib txoj kev tau ua tiav; ####p < 0.0001 piv rau D0 thiab ***p < 0.001 piv rau D12 Ctrl). c Cov duab sawv cev (sab laug) thiab kev ntsuas (sab xis) rau cov plawv uas tau pleev xim nrog Masson's trichrome stain (Scale bare = 500 µm) (n = 10 daim/pawg txhua tus los ntawm cov npua sib txawv, kev sim ANOVA ib txoj kev tau ua tiav; #### p < 0.0001 piv rau D0 thiab ***p < 0.001 piv rau D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трим Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется < однт##сторонтет; 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Cov duab sawv cev (sab laug) thiab kev ntsuas (sab xis) ntawm cov ntu plawv uas tau pleev xim nrog Masson's trichrome stain (uncoated scale = 500 µm) (n = 10 ntu/pab pawg los ntawm cov npua sib txawv, kev sim ANOVA ib txoj kev tau ua tiav; #### p < 0 .0001 piv rau D0 thiab ***p < 0.001 piv rau D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度 = 500 µm）个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向 ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p 1 Ctrl < 0.0) C 用 masson 三色染料的心脏切片的代表性（左左）量化（右）裸尺度裸尺度尺尺500 µm) （n = 10 个切片组每组 来自 不同猪，进行单向 单向 Anova 测试；###0#0 p <1.相比,***p <0.001 Nyem rau D12 Ctrl 相比). c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашеннитро трам Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помтрью дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Cov duab sawv cev (sab laug) thiab kev ntsuas (sab xis) ntawm cov ntu plawv uas pleev xim nrog Masson's trichrome stain (dawb paug = 500 µm) (n = 10 ntu/pawg, txhua tus los ntawm ib tug npua sib txawv, sim los ntawm kev tshuaj xyuas ib txoj kev ntawm qhov sib txawv; ### # p < 0.0001 piv rau D0, ***p < 0.001 piv rau D12 Ctrl).Cov kab yuam kev sawv cev rau qhov nruab nrab ± tus qauv sib txawv.
Peb xav tias los ntawm kev ntxiv cov molecule me me rau hauv cov kab lis kev cai, kev ncaj ncees ntawm cardiomyocyte tuaj yeem txhim kho thiab kev loj hlob ntawm fibrosis txo qis thaum lub sijhawm CTCM kab lis kev cai. Yog li ntawd, peb tau tshuaj xyuas cov molecule me me siv peb cov kab lis kev cai tswj hwm static20,21 vim muaj cov yam ntxwv me me. Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), thiab SB431542 (SB) tau raug xaiv rau qhov kev tshuaj ntsuam no. Cov molecule me me no tau siv yav dhau los hauv hiPSC-CM kab lis kev cai los ua kom cov cardiomyocytes loj hlob los ntawm kev nce sarcomere ntev, T-tubules, thiab conduction velocity. Tsis tas li ntawd, ob qho tib si Dex (ib qho glucocorticoid) thiab SB paub tias yuav txo qhov o29,30. Yog li ntawd, peb tau sim seb qhov kev suav nrog ib qho lossis kev sib xyaw ua ke ntawm cov molecule me me no puas yuav txhim kho qhov kev ncaj ncees ntawm cov ntu plawv. Rau kev tshuaj ntsuam thawj zaug, cov koob tshuaj ntawm txhua qhov sib xyaw tau raug xaiv raws li cov concentration feem ntau siv hauv cov qauv kab lis kev cai ntawm tes (1 μM Dex27, 100 nM T327, thiab 2.5 μM SB31). Tom qab 12 hnub ntawm kev cog qoob loo, kev sib xyaw ua ke ntawm T3 thiab Dex ua rau muaj kev ua haujlwm zoo tshaj plaws ntawm cov qauv cardiomyocyte thiab kev hloov kho fibrous tsawg kawg nkaus (Cov Duab Ntxiv 4 thiab 5). Tsis tas li ntawd, kev siv ob npaug lossis ob npaug ntawm cov concentration ntawm T3 thiab Dex tsim cov teebmeem tsis zoo piv rau cov concentration ib txwm muaj (Cov Duab Ntxiv 6a, b).
Tom qab kev tshuaj xyuas thawj zaug, peb tau ua qhov kev sib piv ntawm 4 qhov xwm txheej ntawm kev cog qoob loo (Daim Duab 4a): Ctrl: cov ntu plawv cog rau hauv peb cov kab lis kev cai uas tau piav qhia ua ntej siv peb cov khoom siv kho kom zoo; 20.21 TD: T3 thiab Ctrl s Ntxiv Dex rau hnub Wednesday; MC: cov ntu plawv cog rau hauv CTCM siv peb cov khoom siv kho kom zoo ua ntej; thiab MT: CTCM nrog T3 thiab Dex ntxiv rau hauv cov khoom siv. Tom qab 12 hnub ntawm kev cog qoob loo, qhov muaj sia nyob ntawm MS thiab MT cov ntaub so ntswg tseem zoo ib yam li hauv cov ntaub so ntswg tshiab uas ntsuas los ntawm MTT assay (Daim Duab 4b). Qhov nthuav yog, qhov ntxiv ntawm T3 thiab Dex rau cov kab lis kev cai transwell (TD) tsis ua rau muaj kev txhim kho tseem ceeb hauv kev muaj sia nyob piv rau Ctrl cov xwm txheej, qhia txog lub luag haujlwm tseem ceeb ntawm kev txhawb nqa tshuab hauv kev tswj hwm qhov muaj sia nyob ntawm cov ntu plawv.
Daim duab tsim qauv sim uas piav qhia txog plaub qhov xwm txheej kab lis kev cai siv los ntsuam xyuas cov teebmeem ntawm kev txhawb nqa tshuab thiab T3 / Dex ntxiv rau ntawm cov khoom noj rau 12 hnub. b Daim duab qhia txog kev ntsuas qhov muaj sia nyob 12 hnub tom qab cog qoob loo hauv txhua 4 qhov xwm txheej cog qoob loo (Ctrl, TD, MC, thiab MT) piv rau cov nqaij qaib tshiab (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD thiab D12 MT), 12 (D12 MC) daim/pab pawg los ntawm cov npua sib txawv, kev sim ANOVA ib txoj kev tau ua tiav; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 piv rau D0 thiab **p < 0.01 piv rau D12 Ctrl). b Daim duab qhia txog kev ntsuas qhov muaj sia nyob 12 hnub tom qab cog qoob loo hauv txhua 4 qhov xwm txheej cog qoob loo (Ctrl, TD, MC, thiab MT) piv rau cov nqaij qaib tshiab (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD thiab D12 MT), 12 (D12 MC) daim/pab pawg los ntawm cov npua sib txawv, kev sim ANOVA ib txoj kev tau ua tiav; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 piv rau D0 thiab **p < 0.01 piv rau D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивсяния культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 CTRL, D1), D1 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ###p <0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Daim duab qhia txog qhov ntsuas ntawm kev muaj sia nyob ntawm 12 hnub tom qab cog qoob loo hauv tag nrho 4 qhov xwm txheej cog qoob loo (tswj, TD, MC, thiab MT) piv rau cov ntu tshiab ntawm lub plawv (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, thiab D12 MT), 12 (D12 MC) ntu/pab pawg los ntawm cov npua sib txawv, kev xeem ANOVA ib txoj kev; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 vs. D0 thiab **p < 0.01 piv rau D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 D1 Ctrl 2、D) MT), 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向 ANOVA 测试；####p < 0.0001,###p < 0.001 与D0与D12控制).b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свсижижием (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA <0, #0# по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Daim duab Histogram qhia txog tag nrho 4 yam kab mob (kev tswj, TD, MC thiab MT) piv rau cov ntu tshiab ntawm lub plawv (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD thiab D12 MT), los ntawm cov npua sib txawv 12 (D12 MC) ntu/pab pawg, ib txoj kev xeem ANOVA; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. kev tswj D12). c Daim duab qhia txog qhov ntsuas ntawm cov kua qab zib 12 hnub tom qab kab lis kev cai hauv tag nrho 4 qhov xwm txheej kab lis kev cai (Ctrl, TD, MC, thiab MT) piv rau cov nqaij qaib tshiab (D0) (n = 6 daim/pab pawg los ntawm cov npua sib txawv, kev sim ANOVA ib txoj kev tau ua tiav; ###p < 0.001, piv rau D0 thiab ***p < 0.001 piv rau D12 Ctrl). c Daim duab qhia txog qhov ntsuas ntawm cov kua qab zib 12 hnub tom qab kab lis kev cai hauv tag nrho 4 qhov xwm txheej kab lis kev cai (Ctrl, TD, MC, thiab MT) piv rau cov nqaij qaib tshiab (D0) (n = 6 daim/pab pawg los ntawm cov npua sib txawv, kev sim ANOVA ib txoj kev tau ua tiav; ###p < 0.001, piv rau D0 thiab ***p < 0.001 piv rau D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивховирования во 4 культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группуы отнезов/группуы) односторонний Выполняется тест ANOVA; c Histogram qhia txog kev ntsuas ntawm cov kua qab zib 12 hnub tom qab kab lis kev cai nyob rau hauv tag nrho 4 qhov xwm txheej kab lis kev cai (kev tswj, TD, MC thiab MT) piv rau cov ntu plawv tshiab (D0) (n = 6 ntu/pab pawg los ntawm cov npua sib txawv, kev sim ANOVA ib txoj kev ua tiav; ###p < 0.001 piv rau D0 thiab ***p < 0.001 piv rau D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件 (Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001， 与D Nyem rau D12 Ctrl 相比). C 条形图 显示所有 4 种条件 （（ctrl、td、mc 和 mt）新鲜心脏切片切片切片君君12 天的通量 定量（n = 6 片/组，来自猪，，，，，，，，，，，，，猪猪单向执行ANOVA <1,##0相比,***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比). c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/груйпраз, односторонний Были проведены тесты ANOVA; (контроль). c Daim duab Histogram qhia txog kev ntsuas ntawm cov kua qab zib ntawm 12 hnub tom qab kev cog qoob loo rau tag nrho 4 yam kev mob cog qoob loo (tswj, TD, MC, thiab MT) piv rau cov ntu plawv tshiab (D0) (n = 6 ntu/pab pawg, los ntawm cov npua sib txawv, ib sab xwb. Puas tau ua qhov kev sim ANOVA, ###p < 0.001 piv rau D0, ***p < 0.001 piv rau D12 (tswj).d cov phiaj xwm tshuaj xyuas cov nqaij ntshiv ntawm cov nqaij tshiab (xiav), hnub 12 MC (ntsuab), thiab hnub 12 MT (liab) ntawm kaum qhov chaw seem nqaij hauv cheeb tsam (n = 4 daim/pawg, ib txoj kev xeem ANOVA; tsis muaj qhov sib txawv tseem ceeb ntawm cov pab pawg). e Daim phiaj xwm roob hluav taws qhia txog cov noob caj noob ces sib txawv hauv cov seem plawv tshiab (D0) piv rau cov seem plawv uas cog rau hauv qab cov xwm txheej zoo li qub (Ctrl) lossis nyob rau hauv MT cov xwm txheej (MT) rau 10-12 hnub. f Daim ntawv qhia cua sov ntawm cov noob caj noob ces sarcomere rau cov seem plawv uas cog rau hauv qab txhua qhov xwm txheej cog rau hauv. Cov kab yuam kev sawv cev rau qhov nruab nrab ± tus qauv sib txawv.
Kev vam khom rau kev hloov pauv ntawm cov roj fatty acid oxidation mus rau glycolysis yog ib qho cim ntawm cardiomyocyte dedifferentiation. Cov cardiomyocytes tsis loj hlob feem ntau siv glucose rau ATP tsim thiab muaj hypoplastic mitochondria nrog ob peb cristae5,32. Kev tshuaj xyuas kev siv glucose qhia tau hais tias nyob rau hauv MC thiab MT cov xwm txheej, kev siv glucose zoo ib yam li cov ntaub so ntswg hnub 0 (Daim Duab 4c). Txawm li cas los xij, Ctrl cov qauv qhia tau hais tias muaj kev nce ntxiv ntawm kev siv glucose piv rau cov ntaub so ntswg tshiab. Qhov no qhia tau hais tias kev sib xyaw ua ke ntawm CTCM thiab T3 / Dex txhim kho cov ntaub so ntswg muaj sia nyob thiab khaws cov qauv metabolic ntawm 12-hnub kab lis kev cai plawv. Tsis tas li ntawd, kev tshuaj xyuas kev ntxhov siab qhia tau hais tias cov theem ntxhov siab tseem zoo ib yam li hauv cov ntaub so ntswg plawv tshiab rau 12 hnub nyob rau hauv MT thiab MS cov xwm txheej (Daim Duab 4d).
Txhawm rau tshuaj xyuas qhov cuam tshuam tag nrho ntawm CTCM thiab T3/Dex rau thaj chaw thoob ntiaj teb ntawm cov nqaij ntshiv plawv, peb tau ua RNAseq ntawm cov nqaij ntshiv plawv los ntawm plaub qhov xwm txheej sib txawv ntawm kev coj noj coj ua (Cov Ntaub Ntawv Ntxiv 1). Qhov nthuav yog, MT seem tau qhia txog kev sau ntawv zoo sib xws rau cov nqaij ntshiv plawv tshiab, nrog tsuas yog 16 qhov sib txawv ntawm 13,642 noob. Txawm li cas los xij, raws li peb tau qhia ua ntej, Ctrl slices tau pom 1229 noob sib txawv tom qab 10-12 hnub hauv kev coj noj coj ua (Daim Duab 4e). Cov ntaub ntawv no tau lees paub los ntawm qRT-PCR ntawm cov noob plawv thiab fibroblast (Daim Duab Ntxiv 7a-c). Qhov nthuav yog, Ctrl seem tau qhia txog kev txo qis ntawm cov noob plawv thiab lub voj voog ntawm tes thiab kev ua haujlwm ntawm cov kev pab cuam noob caj noob ces. Cov ntaub ntawv no qhia tias kev sib txawv, uas feem ntau tshwm sim tom qab kev coj noj coj ua ntev, raug txo qis tag nrho hauv qab MT cov xwm txheej (Daim Duab Ntxiv 8a, b). Kev kawm txog cov noob caj noob ces sarcomere qhia tau tias tsuas yog nyob rau hauv MT cov xwm txheej yog cov noob caj noob ces encoding sarcomere (Daim duab 4f) thiab ion channel (Supplementary Fig. 9) khaws cia, tiv thaiv lawv ntawm kev txwv nyob rau hauv Ctrl, TD, thiab MC cov xwm txheej. Cov ntaub ntawv no qhia tau tias nrog kev sib xyaw ua ke ntawm kev siv tshuab thiab humoral stimulation (T3 / Dex), lub plawv daim transcriptome tuaj yeem nyob zoo ib yam li cov plawv daim tshiab tom qab 12 hnub hauv kab lis kev cai.
Cov kev tshawb pom no tau txhawb nqa los ntawm qhov tseeb tias qhov kev ua tiav ntawm cov qauv ntawm cardiomyocytes hauv cov ntu plawv yog qhov zoo tshaj plaws khaws cia rau hauv qab MT rau 12 hnub, raws li qhia los ntawm cov connexin 43 uas tsis muaj qhov tsis zoo thiab nyob hauv zos (Daim duab 5a). Tsis tas li ntawd, fibrosis hauv cov ntu plawv nyob rau hauv MT cov xwm txheej tau txo qis piv rau Ctrl thiab zoo ib yam li cov ntu plawv tshiab (Daim duab 5b). Cov ntaub ntawv no qhia tau hais tias kev sib xyaw ua ke ntawm kev txhawb nqa tshuab thiab kev kho mob T3 / Dex zoo khaws cia cov qauv plawv hauv cov ntu plawv hauv kab lis kev cai.
cov duab sawv cev immunofluorescence ntawm troponin-T (ntsuab), connexin 43 (liab), thiab DAPI (xiav) hauv cov plawv tshiab cais tawm (D0) lossis cog rau 12 hnub hauv tag nrho plaub qhov xwm txheej kab lis kev cai ntawm lub plawv (scale bar = 100 µm). Kev ntsuas kev txawj ntse ntawm lub plawv cov qauv ntawm lub plawv (n = 7 (D0 thiab D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC thiab D12 MT) daim/pab pawg los ntawm cov npua sib txawv, kev sim ANOVA ib txoj kev tau ua tiav; ####p < 0.0001 piv rau D0 thiab *p < 0.05, lossis ****p < 0.0001 piv rau D12 Ctrl). Kev ntsuas kev txawj ntse ntawm lub plawv cov qauv ntawm cov nqaij mos (n = 7 (D0 thiab D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC thiab D12 MT) daim/pab pawg los ntawm cov npua sib txawv, kev sim ANOVA ib txoj kev tau ua tiav; #### p < 0.0001 piv rau D0 thiab *p < 0.05, lossis ****p < 0.0001 piv rau D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта D 5D 1 TD (n = 7) D12 MC и D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; ****p <0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Kev ntsuas qhov kev ncaj ncees ntawm cov nqaij ntawm lub plawv siv kev txawj ntse dag (n = 7 (D0 thiab D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC thiab D12 MT) ntu/pab pawg los ntawm cov npua sib txawv, kev sim ANOVA ib txoj kev ua tiav; #### p < 0.0001 piv rau D0 thiab *p < 0.05 lossis ****p < 0.0001 piv rau D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7(D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12） MT). Nyem rau D12 Ctrl 相比).对不同猪的心脏结构 完整性（n = 7 (d0 和 d12 ctrl）（5）（d12 td、d12 mc 和 d12 mt）巺茄）进行单向 单向 测试 ； ########### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或 ****p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或 ****p < Ctrl 与 1.000)Kev ntsuas qhov kev ncaj ncees ntawm cov nqaij ntshiv ntawm lub plawv siv kev txawj ntse hauv cov npua sib txawv (n = 7 (D0 thiab D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC thiab D12 MT) ntu ​​/ pawg) nrog kev xeem ANOVA ib txoj kev;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 piv rau D0 thiab *p < 0.05 lossis ****p < 0.0001 piv rau D12 Ctrl). b Cov duab sawv cev thiab kev ntsuas rau cov plawv uas muaj xim nrog Masson's trichrome stain (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, thiab D12 MC), 9 (D12 MT) daim/pab pawg los ntawm cov npua sib txawv, kev sim ANOVA ib txoj kev tau ua tiav; ####p < 0.0001 piv rau D0 thiab ***p < 0.001, lossis ****p < 0.0001 piv rau D12 Ctrl). b Cov duab sawv cev thiab kev ntsuas rau cov plawv uas muaj xim nrog Masson's trichrome stain (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, thiab D12 MC), 9 (D12 MT) daim/pab pawg los ntawm cov npua sib txawv, kev sim ANOVA ib txoj kev tau ua tiav; ####p < 0.0001 piv rau D0 thiab ***p < 0.001, lossis ****p < 0.0001 piv rau D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красит (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, односторонний тест ANOVA; ua D12 Ctrl). b Cov duab sawv cev thiab kev ntsuas ntawm cov ntu plawv uas tau pleev xim nrog Masson's trichrome stain (scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD thiab D12 MC), 9 (D12 MT) ntu/pab pawg los ntawm cov npua sib txawv, ua ib txoj kev ANOVA; ####p < 0.0001 vs. D0 thiab ***p < 0.001 lossis ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用 Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺 = 500 µm） (n = 10 (D Ctrl 1, D 2, 1 2) MC），来自不同猪的9个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；#####p < 0.0001 <0.0001 与D0 相p * 1 * p * 0.0001 与D0 相0.0001 与D12 Ctrl 相比). b 用 masson 三色染料的心脏切片的代表性和 量化（比例尺尺 尺 = 500 µm） （ d 1 1 0 µm） td 和 d12 mc) 来自 不同的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；#####p < 0.0001 与D0 相 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массята (ка блийсона 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA <0, ##по0; сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Cov duab sawv cev thiab kev ntsuas ntawm cov ntu plawv uas tau pleev xim nrog Masson's trichrome (scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD thiab D12 MC), 9 (D12 MT) ntu ​​los ntawm cov npua/pab pawg sib txawv, ib txoj kev ANOVA; ####p < 0.0001 piv rau D0, ***p < 0.001 lossis ****p < 0.0001 piv rau D12 Ctrl).Cov kab yuam kev sawv cev rau qhov nruab nrab ± tus qauv sib txawv.
Thaum kawg, lub peev xwm ntawm CTCM los ua raws li lub plawv hypertrophy tau raug soj ntsuam los ntawm kev nce cov nqaij ntshiv plawv ncab. Hauv CTCM, qhov siab tshaj plaws hauv chav cua tau nce ntawm 80 mmHg mus rau 80 mmHg. Kos duab. (ncab ib txwm) txog li 140 mmHg Kos duab. (Daim duab 6a). Qhov no sib raug rau 32% nce hauv kev ncab (Daim duab 6b), uas tau pom ua ntej raws li feem pua ​​​​​​ntawm kev ncab uas xav tau rau cov ntu plawv kom ua tiav qhov ntev sarcomere zoo ib yam li qhov pom hauv hypertrophy. Kev ncab thiab qhov ceev ntawm cov nqaij ntshiv plawv thaum lub sijhawm contraction thiab so tseem nyob ruaj khov thaum rau hnub ntawm kev cog qoob loo (Daim duab 6c). Cov nqaij ntshiv plawv los ntawm MT cov xwm txheej tau raug rau kev ncab ib txwm (MT (Ib txwm)) lossis cov xwm txheej overstretch (MT (OS)) rau rau hnub. Twb tom qab plaub hnub hauv kev cog qoob loo, tus cim biotrophic NT-ProBNP tau nce siab heev hauv nruab nrab hauv MT (OS) cov xwm txheej piv rau MT (ib txwm) cov xwm txheej (Daim duab 7a). Ntxiv mus, tom qab rau hnub ntawm kev cog qoob loo, qhov loj ntawm cov cell hauv MT (OS) (Daim duab 7b) tau nce ntxiv ntau dua piv rau cov ntu ntawm MT lub plawv (ib txwm). Ntxiv mus, NFATC4 nuclear translocation tau nce ntxiv ntau dua hauv cov ntaub so ntswg uas ncab dhau (Daim duab 7c). Cov txiaj ntsig no qhia txog kev txhim kho ntawm kev kho dua tshiab tom qab hyperdistension thiab txhawb nqa lub tswv yim tias CTCM lub cuab yeej tuaj yeem siv ua lub platform los kawm txog kev ncab-induced cardiac hypertrophy signaling.
Cov cim qhia txog lub zog ntawm lub chamber cua, lub zog ntawm lub chamber kua, thiab kev ntsuas kev txav ntawm cov nqaij ua pov thawj tias lub zog ntawm lub chamber hloov lub zog ntawm lub chamber kua, ua rau muaj kev txav ntawm daim nqaij ua ke. b Cov feem pua ​​​​​​ntawm kev ncab thiab cov kab nkhaus rau cov nqaij uas ncab ib txwm (txiv kab ntxwv) thiab cov nqaij uas ncab ntau dhau (xiav). c Daim duab qhia lub sijhawm voj voog (n = 19 daim ib pawg, los ntawm cov npua sib txawv), lub sijhawm cog lus (n = 18-19 daim ib pawg, los ntawm cov npua sib txawv), lub sijhawm so (n = 19 daim ib pawg, los ntawm cov npua sib txawv) ), qhov loj ntawm kev txav ntawm cov nqaij (n = 14 daim/pawg, los ntawm cov npua sib txawv), qhov ceev ntawm lub zog systolic siab tshaj plaws (n = 14 daim/pawg, los ntawm cov npua sib txawv) thiab qhov ceev ntawm kev so siab tshaj plaws (n = 14 (D0), 15 (D6) ) ntu/pawg) los ntawm cov npua sib txawv), ob-tailed Student's t-test tsis qhia qhov sib txawv tseem ceeb hauv txhua qhov parameter, qhia tias cov parameter no tseem nyob ruaj khov thaum 6 hnub ntawm kev cog qoob loo nrog overvoltage. Cov kab yuam kev sawv cev rau qhov nruab nrab ± tus qauv sib txawv.
Ib daim duab qhia txog kev ntsuas ntawm NT-ProBNP concentration hauv cov kab lis kev cai los ntawm cov plawv uas cog rau hauv MT ib txwm ncab (Norm) lossis overstretching (OS) cov xwm txheej (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, thiab D4 MTOS) daim/pab pawg los ntawm cov npua sib txawv, Ob-txoj kev ANOVA tau ua; **p < 0.01 piv rau qhov ncab ib txwm). Ib daim duab qhia txog kev ntsuas ntawm NT-ProBNP concentration hauv cov kab lis kev cai los ntawm cov plawv txiav uas cog rau hauv MT ib txwm ncab (Norm) lossis overstretching (OS) cov xwm txheej (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, thiab D4 MTOS) daim / pawg los ntawm cov npua sib txawv, Ob-txoj kev ANOVA tau ua tiav; **p < 0.01 piv rau kev ncab ib txwm).Daim duab histogram ntawm NT-ProBNP concentration hauv cov kab lis kev cai los ntawm cov plawv txiav uas cog rau hauv qab cov xwm txheej ntawm MT ncab (norm) lossis overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, thiab D4).MTOS) daim / pawg los ntawm cov npua sib txawv, kev tshuaj xyuas ob yam ntawm qhov sib txawv tau ua tiav;**p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 piv rau qhov ncab ib txwm muaj). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的匢MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm 和D4 MTOS) 来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析； **与正常. Kev Ntsuas ntawm NT-ProBNP concentration nyob rau hauv lub plawv slices cultured nyob rau hauv MT ib txwm stretch (Norm) los yog overstretch (OS) tej yam kev mob (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) los ntawm txawv猪的切片/组，可以双向方方发发动 ** piv nrog ib txwm ncab, p <0.01).histogram Kev ntsuas ntawm NT-ProBNP cov concentration hauv cov plawv txiav uas cog rau hauv qab cov xwm txheej ntawm MT ncab (norm) lossis overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) thiab D4 MTOS) daim/pab pawg los ntawm cov npua sib txawv, kev tshuaj xyuas ob txoj kev ntawm qhov sib txawv;**p <0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 piv rau qhov ncab ib txwm muaj). b cov duab sawv cev rau cov plawv uas muaj xim nrog troponin-T thiab WGA (sab laug) thiab qhov loj ntawm lub cell (sab xis) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) lub cell/pab pawg los ntawm 10 daim sib txawv los ntawm cov npua sib txawv, Two-tailed Student t-test tau ua tiav; ****p < 0.0001 piv rau qhov ncab ib txwm muaj). b cov duab sawv cev rau cov plawv uas muaj xim nrog troponin-T thiab WGA (sab laug) thiab kev ntsuas qhov loj ntawm lub hlwb (sab xis) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) lub hlwb/pab pawg los ntawm 10 daim sib txawv los ntawm cov npua sib txawv, Two-tailed Student t-test tau ua tiav; ****p < 0.0001 piv rau qhov ncab ib txwm muaj). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗ П (слева) и количесятвено размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разовных свиней, хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Cov duab sawv cev ntawm cov ntu plawv uas muaj troponin-T thiab AZP (sab laug) thiab kev ntsuas qhov loj ntawm lub hlwb (sab xis) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) lub hlwb/pab pawg los ntawm 10 ntu sib txawv los ntawm cov npua sib txawv, ob-tailed Student's t-test tau ua tiav; ****p < 0.0001 piv rau qhov mob ib txwm muaj). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330 MTOS)，来自不同猪的10个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验；与歋。 0.0001). b Cov duab sawv cev ntawm cov plawv txiav uas muaj calcarein-T thiab WGA (sab laug) thiab qhov loj ntawm lub cell (sab xis) (n = 330 (D6 MTOS), 369 los ntawm 10 daim sib txawv (D6 MTNorm)) Cells/组，两方法有尾学生t test；piv nrog kev ncab ib txwm，****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количеся ванка зест венка клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/групрта, д Стьюдента; ****p <0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b cov duab sawv cev ntawm cov ntu plawv uas muaj troponin-T thiab AZP (sab laug) thiab kev ntsuas qhov loj ntawm lub cell (sab xis) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) los ntawm 10 ntu sib txawv los ntawm cov npua sib txawv) Cov cell/pab pawg, ob-tailed criterion Tub ntxhais kawm t; ****p < 0.0001 piv rau qhov mob ib txwm muaj). c Cov duab sawv cev rau hnub 0 thiab hnub 6 MTOS lub plawv txiav immunolabeled rau troponin-T thiab NFATC4 thiab kev ntsuas ntawm kev hloov pauv ntawm NFATC4 mus rau lub nuclei ntawm CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) daim/pab pawg los ntawm cov npua sib txawv, Two-tailed Student t-test tau ua tiav; *p < 0.05). c Cov duab sawv cev rau hnub 0 thiab hnub 6 MTOS lub plawv txiav immunolabeled rau troponin-T thiab NFATC4 thiab kev ntsuas ntawm kev hloov pauv ntawm NFATC4 mus rau lub nuclei ntawm CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) daim/pab pawg los ntawm cov npua sib txawv, Two-tailed Student t-test tau ua tiav; *p < 0.05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Тл и NFATC оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , двусторонний t-критерий Стьюдента *p <0,05). c Cov duab sawv cev rau cov ntu plawv ntawm 0 thiab 6 hnub MTOS, immunolabeled rau troponin-T thiab NFATC4, thiab kev ntsuas ntawm NFATC4 translocation hauv lub nucleus ntawm cavernous cells (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) daim/pab pawg los ntawm cov npua sib txawv) ua ob-tailed Student's t-test; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化 (n = 4 (D0) OS MT), 3 (D / 6)进行双尾学生t 检验；*p <0.05). c Cov duab sawv cev ntawm calcanin-T thiab NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS lub plawv hlais, thiab NFATC4 los ntawm txawv NFATC4 易位至CM cell nucleus的quantity 化 (n = 4 (D0), OS 3 / 刼 MT,时间双尾学生et 电影；*p <0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS ntawm 0 thiab 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t- два- хвостатый t- 0.05 Nws.). c Cov duab sawv cev ntawm MTOS lub plawv txiav thaum hnub 0 thiab 6 rau troponin-T thiab NFATC4 immunolabeling thiab kev ntsuas ntawm NFATC4 translocation hauv lub nucleus ntawm CM los ntawm cov npua sib txawv (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) daim/pab pawg, ob-tailed t-criterion Tub Ntxhais Kawm; *p < 0.05).Cov kab yuam kev sawv cev rau qhov nruab nrab ± tus qauv sib txawv.
Kev tshawb fawb txog kev hloov pauv ntawm lub plawv xav tau cov qauv cellular uas ua kom raug qhov chaw ntawm lub plawv. Hauv kev tshawb fawb no, ib lub cuab yeej CTCM tau tsim thiab piav qhia uas tuaj yeem txhawb nqa cov ntu ntawm lub plawv uas nyias heev. Lub kaw lus CTCM suav nrog kev ua kom lub cev sib dhos ua ke ntawm lub cev thiab T3 thiab Dex kua dej nplua nuj. Thaum cov ntu ntawm lub plawv npua raug rau cov yam no, lawv lub neej muaj sia nyob, kev ua haujlwm ntawm cov qauv, kev ua haujlwm ntawm lub cev, thiab kev qhia tawm tseem zoo ib yam li cov nqaij ntawm lub plawv tshiab tom qab 12 hnub ntawm kev cog qoob loo. Tsis tas li ntawd, kev ncab ntau dhau ntawm cov nqaij ntawm lub plawv tuaj yeem ua rau lub plawv loj hlob los ntawm kev ncab ntau dhau. Tag nrho, cov txiaj ntsig no txhawb nqa lub luag haujlwm tseem ceeb ntawm cov xwm txheej ntawm kev cog qoob loo hauv kev tswj hwm lub plawv zoo li qub thiab muab lub platform rau kev tshuaj xyuas tshuaj.
Muaj ntau yam ua rau muaj kev tsim kom muaj ib puag ncig zoo tshaj plaws rau kev ua haujlwm thiab kev ciaj sia ntawm cov cardiomyocytes. Qhov pom tseeb tshaj plaws ntawm cov yam no yog cuam tshuam nrog (1) kev sib cuam tshuam ntawm cov hlwb, (2) kev txhawb nqa electromechanical, (3) cov yam ntxwv humoral, thiab (4) cov khoom siv metabolic. Kev sib cuam tshuam ntawm lub hlwb-rau-cell xav tau cov tes hauj lwm peb-seem ntawm ntau hom hlwb txhawb nqa los ntawm cov khoom siv sab nraud. Cov kev sib cuam tshuam ntawm cov hlwb nyuaj no nyuaj rau rov tsim dua hauv vitro los ntawm kev sib koom ua ke ntawm cov hlwb ib leeg, tab sis tuaj yeem ua tiav yooj yim siv cov xwm txheej organotypic ntawm cov ntu plawv.
Kev ncab ntawm lub plawv thiab kev siv hluav taws xob los txhawb lub plawv yog qhov tseem ceeb rau kev tswj hwm lub plawv phenotype33,34,35. Txawm hais tias kev siv tshuab los txhawb lub plawv tau siv dav rau kev kho thiab kev loj hlob ntawm hiPSC-CM, ntau txoj kev tshawb fawb zoo nkauj tau sim ua kom lub plawv txiav hauv kev cog qoob loo siv kev thauj khoom uniaxial. Cov kev tshawb fawb no qhia tau tias 2D uniaxial mechanical loading muaj qhov cuam tshuam zoo rau lub plawv thaum cog qoob loo. Hauv cov kev tshawb fawb no, cov ntu ntawm lub plawv tau thauj khoom nrog isometric tensile forces17, linear auxotonic loading18, lossis lub voj voog plawv tau rov tsim dua siv cov lus teb rau lub zog transducer thiab tension drives. Txawm li cas los xij, cov txheej txheem no siv uniaxial tissue stretch yam tsis muaj kev ua kom zoo dua ib puag ncig, ua rau muaj kev txwv ntawm ntau lub plawv genes lossis overexpression ntawm cov noob cuam tshuam nrog kev teb ncab tsis zoo. CTCM piav qhia ntawm no muab 3D electromechanical stimulus uas ua raws li lub voj voog plawv ntuj hauv cov nqe lus ntawm lub sijhawm voj voog thiab kev ncab ntawm lub cev (25% ncab, 40% systole, 60% diastole, thiab 72 beats ib feeb). Txawm hais tias qhov kev txhawb nqa peb sab no tsis txaus los tswj cov ntaub so ntswg kom ruaj khov, kev sib xyaw ua ke ntawm kev txhawb nqa humoral thiab kev siv tshuab siv T3 / Dex yog qhov yuav tsum tau ua kom cov ntaub so ntswg muaj sia nyob, ua haujlwm, thiab ua kom ruaj khov.
Cov yam ntxwv humoral ua lub luag haujlwm tseem ceeb hauv kev hloov kho tus cwj pwm ntawm lub plawv laus. Qhov no tau hais txog hauv kev tshawb fawb HiPS-CM uas T3 thiab Dex tau ntxiv rau hauv cov kab lis kev cai kom ua kom lub hlwb loj hlob sai. T3 yuav cuam tshuam rau kev thauj cov amino acids, qab zib thiab calcium hla cov hlwb cell36. Tsis tas li ntawd, T3 txhawb nqa MHC-α kev qhia tawm thiab MHC-β downregulation, txhawb nqa kev tsim cov myofibrils ceev ceev hauv cov cardiomyocytes laus piv rau cov myofibrils qeeb qeeb hauv fetal CM. T3 tsis txaus hauv cov neeg mob hypothyroid ua rau poob ntawm myofibrillar bands thiab txo qis ntawm kev loj hlob ntawm lub suab37. Dex ua haujlwm rau glucocorticoid receptors thiab tau pom tias ua rau myocardial contractility nce hauv cov plawv perfused cais; 38 qhov kev txhim kho no xav tias muaj feem cuam tshuam nrog cov nyhuv rau calcium deposit-driven entry (SOCE) 39,40. Tsis tas li ntawd, Dex khi rau nws cov receptors, ua rau muaj kev teb dav dav hauv lub hlwb uas tswj kev ua haujlwm tiv thaiv kab mob thiab o 30.
Peb cov txiaj ntsig qhia tau hais tias kev siv lub cev ua kom lub cev muaj zog (MS) tau txhim kho kev ua haujlwm ntawm cov kab lis kev cai piv rau Ctrl, tab sis tsis tau tswj hwm kev muaj sia nyob, kev ua haujlwm ntawm cov qauv, thiab kev qhia tawm ntawm lub plawv dhau 12 hnub hauv kev kab lis kev cai. Piv rau Ctrl, kev ntxiv T3 thiab Dex rau CTCM (MT) cov kab lis kev cai tau txhim kho kev muaj sia nyob thiab tswj hwm cov ntaub ntawv sau zoo sib xws, kev ua haujlwm ntawm cov qauv, thiab kev ua haujlwm ntawm cov metabolism nrog cov nqaij ntawm lub plawv tshiab rau 12 hnub. Tsis tas li ntawd, los ntawm kev tswj hwm qib ntawm kev ncab cov nqaij, tus qauv hyperextension-induced cardiac hypertrophy tau tsim los ntawm kev siv STCM, qhia txog kev ua tau zoo ntawm STCM system. Nws yuav tsum tau sau tseg tias txawm hais tias kev kho dua tshiab ntawm lub plawv thiab fibrosis feem ntau cuam tshuam nrog cov kab mob uas cov hlwb ncig tuaj yeem muab cov cytokines tsim nyog nrog rau phagocytosis thiab lwm yam kev kho dua tshiab, cov ntu ntawm lub plawv tseem tuaj yeem ua raws li cov txheej txheem fibrotic teb rau kev ntxhov siab thiab kev raug mob. Qhov no tau raug soj ntsuam yav dhau los hauv tus qauv txiav plawv no. Nws yuav tsum tau sau tseg tias CTCM cov kev cai tuaj yeem hloov kho los ntawm kev hloov pauv siab / hluav taws xob amplitude thiab zaus los ua qauv ntau yam mob xws li tachycardia, bradycardia, thiab kev txhawb nqa kev ncig (lub plawv tsis muaj zog). Qhov no ua rau lub kaw lus ua ib qho chaw nruab nrab rau kev kuaj tshuaj. Lub peev xwm ntawm CTCM los ua qauv qhia txog kev ua haujlwm ntau dhau los ntawm lub plawv dhia ceev tau qhib txoj hauv kev rau kev sim lub kaw lus no rau kev kho mob tus kheej. Xaus lus, kev tshawb fawb tam sim no qhia tau hais tias kev ncab tshuab thiab kev txhawb nqa humoral yog qhov tseem ceeb rau kev tswj hwm cov kab lis kev cai ntawm cov nqaij plawv.
Txawm hais tias cov ntaub ntawv uas tau nthuav tawm ntawm no qhia tias CTCM yog ib lub platform zoo heev rau kev ua qauv rau cov leeg nqaij tsis muaj zog, txoj kev kab lis kev cai no muaj qee qhov kev txwv. Qhov kev txwv tseem ceeb ntawm CTCM kab lis kev cai yog tias nws tsim cov kev ntxhov siab dynamic mechanical rau ntawm cov slices, uas tiv thaiv lub peev xwm los saib xyuas cov leeg nqaij contractions thaum lub sijhawm txhua lub voj voog. Tsis tas li ntawd, vim yog qhov me me ntawm cov seem plawv (7 hli), lub peev xwm los soj ntsuam kev ua haujlwm systolic sab nraum cov kab lis kev cai siv cov sensors zog ib txwm muaj kev txwv. Hauv cov ntawv sau tam sim no, peb ib feem kov yeej qhov kev txwv no los ntawm kev soj ntsuam qhov hluav taws xob optical ua qhov qhia txog kev ua haujlwm contractile. Txawm li cas los xij, qhov kev txwv no yuav xav tau kev ua haujlwm ntxiv thiab tej zaum yuav raug daws teeb meem yav tom ntej los ntawm kev qhia cov txheej txheem rau kev saib xyuas qhov muag ntawm kev ua haujlwm ntawm cov leeg nqaij hauv kab lis kev cai, xws li optical mapping siv calcium thiab voltage-sensitive dyes. Lwm qhov kev txwv ntawm CTCM yog tias tus qauv ua haujlwm tsis tswj kev ntxhov siab physiological (preload thiab afterload). Hauv CTCM, siab tau raug induced hauv cov lus qhia rov qab los tsim 25% physiological stretch hauv diastole (tag nrho stretch) thiab systole (ntev ntawm contraction thaum lub sijhawm hluav taws xob stimulation) hauv cov ntaub so ntswg loj heev. Qhov kev txwv no yuav tsum tau tshem tawm hauv cov qauv CTCM yav tom ntej los ntawm kev nias kom txaus rau cov nqaij ntawm lub plawv los ntawm ob sab thiab los ntawm kev siv cov kev sib raug zoo ntawm lub siab thiab qhov ntim uas tshwm sim hauv cov chav ntawm lub plawv.
Qhov kev hloov kho dua tshiab uas tshwm sim los ntawm kev ncab ntau dhau uas tau tshaj tawm hauv daim ntawv sau no tsuas yog siv rau kev ua raws li cov cim hypertrophic hyperstretch xwb. Yog li, tus qauv no tuaj yeem pab hauv kev kawm txog kev ncab cov cim hypertrophic yam tsis tas yuav muaj cov humoral lossis neural factors (uas tsis muaj nyob hauv lub cev no). Yuav tsum muaj kev tshawb fawb ntxiv kom ua rau muaj ntau yam ntawm CTCM, piv txwv li, kev sib koom ua ke nrog cov hlwb tiv thaiv kab mob, kev ncig cov plasma humoral factors, thiab kev txhawb nqa thaum sib koom ua ke nrog cov hlwb neuronal yuav txhim kho qhov ua tau ntawm kev ua qauv kab mob nrog CTCM.
Muaj kaum peb tus npua siv rau hauv txoj kev tshawb no. Txhua txoj kev kho mob tsiaj tau ua raws li cov lus qhia ntawm lub koom haum thiab tau txais kev pom zoo los ntawm Pawg Neeg Saib Xyuas thiab Siv Tsiaj ntawm University of Louisville. Lub aortic arch tau clamped thiab lub plawv tau perfused nrog 1 L ntawm sterile cardioplegia (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH txog li 7.4); cov plawv tau khaws cia rau hauv cov dej khov txias cardioplegic kom txog thaum thauj mus rau chav kuaj mob ntawm dej khov uas feem ntau yog <10 feeb. cov plawv tau khaws cia rau hauv cov dej khov txias cardioplegic kom txog thaum thauj mus rau chav kuaj mob ntawm dej khov uas feem ntau yog <10 feeb. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обаторовки в лабораторию на льду, что обаты cov plawv tau khaws cia rau hauv cov dej khov txias cardioplegic kom txog thaum thauj mus rau chav kuaj mob hauv dej khov, uas feem ntau siv sijhawm tsawg dua 10 feeb.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常 <10分钟.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常 <10分钟. Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Khaws lub plawv rau hauv dej khov cardioplegia kom txog thaum thauj mus rau chav kuaj mob rau hauv dej khov, feem ntau yog tsawg dua 10 feeb.
Lub cuab yeej CTCM tau tsim los ntawm SolidWorks computer-aided design (CAD) software. Cov chav kab lis kev cai, cov khoom faib thiab cov chav cua yog ua los ntawm CNC clear acrylic yas. Lub nplhaib thaub qab 7 hli txoj kab uas hla yog ua los ntawm high density polyethylene (HDPE) nyob rau hauv nruab nrab thiab muaj ib lub o-ring groove los haum rau lub silicone o-ring siv los kaw cov xov xwm hauv qab. Ib daim nyias nyias silica cais lub chav kab lis kev cai ntawm lub phaj sib cais. Lub silicone membrane yog laser txiav los ntawm 0.02″ tuab silicone daim ntawv thiab muaj qhov nyuaj ntawm 35A. Cov gaskets silicone hauv qab thiab sab saum toj yog laser txiav los ntawm 1/16″ tuab silicone daim ntawv thiab muaj qhov nyuaj ntawm 50A. 316L stainless hlau ntsia hlau thiab tis txiv ntoo yog siv rau kev khi lub thaiv thiab tsim kom muaj lub foob airtight.
Ib lub rooj tsavxwm luam tawm tshwj xeeb (PCB) tau tsim los kom sib xyaw nrog lub kaw lus C-PACE-EM. Cov qhov txuas ntawm lub tshuab swiss ntawm PCB tau txuas nrog cov electrodes graphite los ntawm cov xov hlau tooj liab uas tau plated nyiaj thiab cov ntsia hlau tooj liab 0-60 uas tau ntsia rau hauv cov electrodes. Lub rooj tsavxwm luam tawm tau muab tso rau hauv lub hau ntawm lub tshuab luam ntawv 3D.
Lub cuab yeej CTCM raug tswj los ntawm lub tshuab ua haujlwm pneumatic (PPD) uas tsim kom muaj kev tswj hwm lub zog ntawm lub plawv zoo ib yam li lub voj voog ntawm lub plawv. Thaum lub zog hauv chav cua nce ntxiv, daim nyias nyias silicone nthuav dav mus rau sab saud, yuam cov khoom nruab nrab hauv qab qhov chaw ntawm cov ntaub so ntswg. Thaj chaw ntawm cov ntaub so ntswg ces yuav raug ncab los ntawm qhov kev tshem tawm ntawm cov kua no, ua raws li kev nthuav dav ntawm lub plawv thaum lub sijhawm diastole. Thaum lub sijhawm so, kev txhawb nqa hluav taws xob tau siv los ntawm graphite electrodes, uas txo qhov siab hauv chav cua thiab ua rau cov ntu ntawm cov ntaub so ntswg sib cog lus. Sab hauv cov yeeb nkab yog lub qhov cua hemostatic nrog lub sensor siab los ntes lub zog hauv lub tshuab cua. Lub zog uas lub sensor siab hnov ​​​​​​tau siv rau lub cuab yeej sau cov ntaub ntawv txuas nrog lub laptop. Qhov no tso cai rau kev saib xyuas tas mus li ntawm lub zog hauv chav roj. Thaum lub zog siab tshaj plaws hauv chav tau mus txog (tus qauv 80 mmHg, 140 mmHg OS), lub cuab yeej tau txais cov ntaub ntawv tau raug txib kom xa lub teeb liab mus rau C-PACE-EM system los tsim lub teeb liab hluav taws xob biphasic rau 2 ms, teeb tsa rau 4 V.
Cov ntu plawv tau txais thiab cov xwm txheej kab lis kev cai hauv 6 lub qhov tau ua raws li nram no: Hloov cov plawv uas tau sau los ntawm lub thawv hloov mus rau lub tais uas muaj qhov txias (4° C.) cardioplegia. Lub plawv sab laug tau cais nrog rab riam sterile thiab txiav ua tej daim ntawm 1-2 cm3. Cov pob nqaij no tau txuas rau cov ntaub so ntswg nrog cov nplaum ntaub so ntswg thiab muab tso rau hauv lub dab dej microtome vibrating uas muaj Tyrode's solution thiab oxygenated tas li (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g). ), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-glucose (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M kua), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M kua), txog li 1 L ddH2O). Lub microtome vibrating tau teeb tsa kom txiav cov hlais tuab 300 µm ntawm qhov zaus ntawm 80 Hz, qhov siab ntawm kab rov tav ntawm 2 hli, thiab tus nqi ua ntej ntawm 0.03 mm/s. Lub dab da dej ntaub so ntswg tau puag ncig los ntawm dej khov kom cov tshuaj txias thiab qhov kub tau tswj hwm ntawm 4 ° C. Hloov cov ntu ntaub so ntswg los ntawm lub dab da dej microtome mus rau lub dab da dej incubation uas muaj cov tshuaj Tyrode oxygenated tas li ntawm dej khov kom txog thaum tau txais cov ntu txaus rau ib lub phaj kab lis kev cai. Rau cov kab lis kev cai transwell, cov ntu ntaub so ntswg tau txuas rau cov polyurethane sterile 6 hli dav thiab muab tso rau hauv 6 ml ntawm cov khoom siv kho kom zoo (199 nruab nrab, 1x ITS ntxiv, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkaline thiab 2X tshuaj tua kab mob-antifungal). Kev txhawb nqa hluav taws xob (10 V, zaus 1.2 Hz) tau siv rau cov ntu ntaub so ntswg los ntawm C-Pace. Rau cov xwm txheej TD, T3 tshiab thiab Dex tau ntxiv ntawm 100 nM thiab 1 μM ntawm txhua qhov kev hloov pauv nruab nrab. Cov khoom nruab nrab tau muab cov pa oxygen rau hauv ua ntej hloov 3 zaug hauv ib hnub. Cov ntu ntawm cov nqaij tau cog rau hauv lub tshuab ua kom sov ntawm 37 ° C thiab 5% CO2.
Rau cov kab lis kev cai CTCM, cov ntu ntawm cov nqaij tau muab tso rau ntawm lub tshuab luam ntawv 3D uas tau tsim tshwj xeeb hauv lub tais Petri uas muaj cov kua Tyrode hloov kho. Lub cuab yeej no tau tsim los ua kom qhov loj ntawm daim plawv nce ntxiv 25% ntawm thaj chaw ntawm lub nplhaib txhawb nqa. Qhov no tau ua kom cov ntu ntawm lub plawv tsis ncab tom qab raug hloov los ntawm Tyrode cov kua mus rau qhov nruab nrab thiab thaum lub sijhawm diastole. Siv cov kua nplaum histoacrylic, cov ntu 300 µm tuab tau kho rau ntawm lub nplhaib txhawb nqa 7 hli hauv txoj kab uas hla. Tom qab txuas cov ntu ntawm cov nqaij rau lub nplhaib txhawb nqa, txiav cov ntu ntawm cov nqaij ntau dhau thiab muab cov ntu ntawm cov nqaij txuas rov qab rau hauv lub dab dej ntawm Tyrode cov kua rau ntawm dej khov (4 ° C) kom txog thaum muaj cov ntu txaus tau npaj rau ib lub cuab yeej. Lub sijhawm ua tiav tag nrho rau txhua lub cuab yeej yuav tsum tsis pub tshaj 2 teev. Tom qab 6 ntu ntawm cov nqaij tau txuas rau lawv cov nplhaib txhawb nqa, lub cuab yeej CTCM tau sib sau ua ke. Lub chamber kab lis kev cai CTCM tau ntim ua ntej nrog 21 ml pre-oxygenated nruab nrab. Hloov cov ntu ntawm cov nqaij mus rau lub chamber kab lis kev cai thiab ua tib zoo tshem tawm cov pa npuas nrog lub pipette. Tom qab ntawd, cov nqaij ntu raug coj mus rau hauv lub qhov thiab maj mam nias rau hauv qhov chaw. Thaum kawg, muab lub hau electrode tso rau ntawm lub cuab yeej thiab hloov lub cuab yeej mus rau lub incubator. Tom qab ntawd txuas CTCM rau lub raj cua thiab C-PACE-EM system. Lub pneumatic actuator qhib thiab lub cua valve qhib CTCM. Lub C-PACE-EM system tau teeb tsa los xa 4 V ntawm 1.2 Hz thaum lub sijhawm biphasic pacing rau 2 ms. Cov khoom nruab nrab tau hloov ob zaug hauv ib hnub thiab cov electrodes tau hloov ib zaug hauv ib hnub kom tsis txhob muaj graphite sib sau ua ke ntawm cov electrodes. Yog tias tsim nyog, cov nqaij ntu tuaj yeem raug tshem tawm ntawm lawv cov qhov cog qoob loo kom tshem tawm cov pa npuas uas yuav poob rau hauv qab lawv. Rau cov xwm txheej kho MT, T3/Dex tau ntxiv tshiab nrog txhua qhov kev hloov pauv nruab nrab nrog 100 nM T3 thiab 1 μM Dex. Cov khoom siv CTCM tau cog qoob loo hauv lub incubator ntawm 37°C thiab 5% CO2.
Yuav kom tau txais cov kev taw qhia ntawm cov plawv, ib lub koob yees duab tshwj xeeb tau tsim. Lub koob yees duab SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Nyiv) tau siv nrog Navitar Zoom 7000 18-108mm macro lens (Navitar, San Francisco, CA). Kev pom tau ua tiav ntawm chav tsev kub tom qab hloov cov khoom nruab nrab nrog cov khoom nruab nrab tshiab. Lub koob yees duab tau muab tso rau ntawm lub kaum sab xis 51 ° thiab cov yeeb yaj kiab tau kaw ntawm 30 thav duab ib ob. Ua ntej, software qhib qhov chaw (MUSCLEMOTION43) tau siv nrog Image-J los ntsuas qhov kev txav ntawm cov plawv. Lub ntsej muag tau tsim los ntawm kev siv MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) los txhais cov cheeb tsam uas xav tau rau kev ntaus cov plawv kom tsis txhob muaj suab nrov. Cov ntsej muag faib ua ntu tes tau siv rau txhua daim duab hauv cov kab ke thav duab thiab tom qab ntawd xa mus rau MUSCLEMOTION plug-in. Muscle Motion siv qhov nruab nrab ntawm cov pixels hauv txhua thav duab los ntsuas nws qhov kev txav piv rau lub thav duab siv. Cov ntaub ntawv tau kaw, lim thiab siv los ntsuas lub sijhawm voj voog thiab ntsuas qhov ncab ntawm cov nqaij thaum lub voj voog plawv. Cov yeeb yaj kiab kaw tau raug ua tiav tom qab siv thawj-txheej txheem xoom-theem digital lim. Txhawm rau ntsuas qhov ncab ntawm cov ntaub so ntswg (ncej mus rau ncej), kev tshuaj xyuas ncej mus rau ncej tau ua tiav los paub qhov txawv ntawm cov ncov thiab qhov qis hauv cov teeb liab kaw. Tsis tas li ntawd, kev tshem tawm yog ua tiav siv 6th order polynomial kom tshem tawm cov teeb liab hloov pauv. Cov lej program tau tsim hauv MATLAB los txiav txim siab txog kev txav ntawm cov ntaub so ntswg thoob ntiaj teb, lub sijhawm voj voog, lub sijhawm so, thiab lub sijhawm contraction (Supplementary Program Code 44).
Rau kev tshuaj xyuas kev nyuaj siab, siv cov yeeb yaj kiab tib yam uas tsim los rau kev ntsuam xyuas kev ncab ntawm lub cev, peb xub nrhiav ob daim duab uas sawv cev rau qhov siab tshaj plaws ntawm kev txav mus los (qhov siab tshaj plaws (sab saud) thiab qis tshaj plaws (qis tshaj) ntawm kev txav mus los) raws li MUSCLEMOTION software. Tom qab ntawd peb faib cov cheeb tsam ntawm cov ntaub so ntswg thiab siv ib daim ntawv ntawm cov txheej txheem ntxoov ntxoo rau cov ntaub so ntswg uas tau faib ua ntu (Daim Duab Ntxiv 2a). Cov ntaub so ntswg uas tau faib ua kaum qhov chaw hauv qab, thiab kev ntxhov siab ntawm txhua qhov chaw tau suav los ntawm kev siv cov qauv hauv qab no: Kev nyuaj siab = (Sup-Sdown) / Sdown, qhov twg Sup thiab Sdown yog qhov deb ntawm cov duab los ntawm cov duab ntxoov ntxoo sab saud thiab hauv qab ntawm cov ntaub, raws li (Daim Duab Ntxiv 2b).
Cov ntu plawv tau kho rau hauv 4% paraformaldehyde rau 48 teev. Cov ntaub so ntswg kho tau qhuav rau hauv 10% thiab 20% sucrose rau 1 teev, tom qab ntawd hauv 30% sucrose ib hmos. Cov ntu tom qab ntawd tau muab tso rau hauv qhov kub thiab txias zoo tshaj plaws (OCT compound) thiab maj mam khov rau hauv lub dab dej isopentane / dej khov qhuav. Khaws cov pob zeb OCT ntawm -80 ° C kom txog thaum sib cais. Cov ntawv swb tau npaj ua ntu nrog tuab ntawm 8 μm.
Yuav kom tshem tau OCT ntawm cov ntu plawv, ua kom cov slides sov rau ntawm lub thaiv cua sov ntawm 95 ° C rau 5 feeb. Ntxiv 1 ml PBS rau txhua slides thiab incubate rau 30 feeb ntawm chav tsev kub, tom qab ntawd nkag mus rau hauv cov ntu los ntawm kev teeb tsa 0.1% Triton-X hauv PBS rau 15 feeb ntawm chav tsev kub. Txhawm rau tiv thaiv cov tshuaj tiv thaiv tsis tshwj xeeb los ntawm kev khi rau cov qauv, ntxiv 1 ml ntawm 3% BSA kua rau cov slides thiab incubate rau 1 teev ntawm chav tsev kub. Tom qab ntawd BSA raug tshem tawm thiab cov slides raug ntxuav nrog PBS. Kos txhua tus qauv nrog cwj mem. Cov tshuaj tiv thaiv kab mob thawj zaug (diluted 1:200 hauv 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) thiab troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) tau ntxiv rau 90 feeb, tom qab ntawd cov tshuaj tiv thaiv kab mob thib ob (diluted 1:200 hauv 1% BSA) tawm tsam nas Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), tawm tsam luav Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) rau ntxiv 90 feeb Ntxuav 3 zaug nrog PBS Txhawm rau kom paub qhov txawv ntawm cov xim pleev xim los ntawm keeb kwm yav dhau los, peb tsuas yog siv cov tshuaj tiv thaiv kab mob thib ob ua kev tswj hwm. Thaum kawg, DAPI nuclear stain tau ntxiv thiab cov slides tau muab tso rau hauv vectashield (Vector Laboratories) thiab kaw nrog cov xim rau tes. -x magnification) thiab Keyence microscope nrog 40x magnification.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) ntawm 5 μg/ml hauv PBS tau siv rau WGA staining thiab siv rau cov seem ruaj khov rau 30 feeb ntawm chav tsev kub. Tom qab ntawd, cov slides tau ntxuav nrog PBS thiab ntxiv Sudan dub rau txhua slides thiab incubated rau 30 feeb. Tom qab ntawd, cov slides tau ntxuav nrog PBS thiab ntxiv vectashield embedding medium. Cov slides tau pom ntawm lub tshuab Keyence microscope ntawm 40x magnification.
OCT raug tshem tawm ntawm cov qauv raws li tau piav qhia saum toj no. Tom qab tshem tawm OCT, muab cov slides tso rau hauv Bouin's solution ib hmos. Tom qab ntawd, cov slides raug ntxuav nrog dej distilled rau 1 teev thiab tom qab ntawd muab tso rau hauv Bibrich aloe acid fuchsin solution rau 10 feeb. Tom qab ntawd, cov slides raug ntxuav nrog dej distilled thiab muab tso rau hauv cov tshuaj 5% phosphomolybdenum/5% phosphotungstic acid rau 10 feeb. Tsis tas yuav ntxuav, muab cov slides ncaj qha rau hauv cov tshuaj aniline xiav rau 15 feeb. Tom qab ntawd, cov slides raug ntxuav nrog dej distilled thiab muab tso rau hauv cov tshuaj 1% acetic acid rau 2 feeb. Cov slides raug ziab hauv 200 N ethanol thiab hloov mus rau xylene. Cov slides uas muaj xim tau pom siv lub tshuab Keyence microscope nrog lub hom phiaj 10x. Feem pua ​​ntawm thaj chaw fibrosis tau ntsuas siv Keyence Analyzer software.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), daim ntawv teev npe tus lej V13154, raws li cov txheej txheem ntawm cov chaw tsim khoom nrog qee qhov kev hloov kho. Tshwj xeeb, lub tshuab punch nrog txoj kab uas hla ntawm 6 hli tau siv los xyuas kom meej tias cov ntaub so ntswg loj sib npaug thaum lub sijhawm tshuaj xyuas MTT. Cov ntaub so ntswg tau plated ib leeg rau hauv qhov dej ntawm 12-qhov phaj uas muaj MTT substrate raws li cov txheej txheem ntawm cov chaw tsim khoom. Cov seem raug incubated ntawm 37° C. rau 3 teev thiab cov ntaub so ntswg muaj sia metabolizes MTT substrate los tsim cov tshuaj formazan xim av. Hloov cov tshuaj MTT nrog 1 ml DMSO thiab incubate ntawm 37 ° C rau 15 feeb kom rho tawm cov tshuaj formazan xim av los ntawm cov ntu plawv. Cov qauv tau diluted 1:10 hauv DMSO hauv 96-qhov ntshiab hauv qab phaj thiab qhov xim av ntsuas ntawm 570 nm siv Cytation phaj nyeem ntawv (BioTek). Kev nyeem ntawv tau normalized rau qhov hnyav ntawm txhua daim ntawm lub plawv.
Cov khoom siv txiav plawv tau hloov nrog cov khoom siv uas muaj 1 μCi/ml [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) rau kev ntsuas kev siv glucose raws li tau piav qhia ua ntej. Tom qab 4 teev ntawm kev sib xyaw, ntxiv 100 µl ntawm cov khoom siv rau hauv lub raj qhib microcentrifuge uas muaj 100 µl ntawm 0.2 N HCl. Tom qab ntawd lub raj tau muab tso rau hauv lub raj scintillation uas muaj 500 μl ntawm dH2O kom ua pa [3H]2O rau 72 teev ntawm 37°C. Tom qab ntawd tshem lub raj microcentrifuge ntawm lub raj scintillation thiab ntxiv 10 ml ntawm cov kua scintillation. Kev suav cov scintillation tau ua tiav siv Tri-Carb 2900TR kua scintillation analyzer (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). Tom qab ntawd, kev siv cov piam thaj (glucose usage) raug suav los ntawm kev xav txog [5-3H]-glucose specific activity, incomplete equilibrium thiab keeb kwm yav dhau los, dilution ntawm [5-3H]-rau cov piam thaj uas tsis muaj cim, thiab scintillation counter efficiency. Cov ntaub ntawv raug normalized rau qhov loj ntawm cov seem ntawm lub plawv.
Tom qab cov ntaub so ntswg homogenization hauv Trizol, RNA raug rho tawm ntawm cov ntu plawv siv Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 raws li cov txheej txheem ntawm cov chaw tsim khoom. Kev npaj tsev qiv ntawv RNAsec, kev txheeb xyuas thiab kev tshuaj xyuas cov ntaub ntawv tau ua raws li nram no:
1 μg ntawm RNA rau ib qho qauv tau siv ua cov khoom pib rau kev npaj lub tsev qiv ntawv RNA. Cov tsev qiv ntawv sequencing tau tsim los ntawm kev siv NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit rau Illumina (NEB, USA) ua raws li cov lus pom zoo ntawm cov chaw tsim khoom, thiab cov lej ntsuas tau ntxiv rau cov kab lus qhia rau txhua qhov qauv. Hauv luv luv, mRNA tau purified los ntawm tag nrho RNA siv cov hlaws dai magnetic txuas nrog poly-T oligonucleotides. Fragmentation yog ua tiav siv divalent cations ntawm qhov kub siab hauv NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). Thawj strand cDNA tau synthesized siv random hexamer primers thiab M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-). Qhov thib ob strand cDNA ces synthesized siv DNA polymerase I thiab RNase H. Cov overhangs seem raug hloov mus rau blunt kawg los ntawm exonuclease / polymerase kev ua ub no. Tom qab adenylation ntawm 3′ kawg ntawm DNA fragment, NEBNext Adapter nrog lub voj voog hairpin txuas rau nws los npaj nws rau hybridization. Rau kev xaiv cov cDNA fragments ntawm qhov ntev nyiam 150-200 bp. cov fragments tsev qiv ntawv tau raug lim siv AMPure XP system (Beckman Coulter, Beverly, USA). Tom qab ntawd, 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) nrog rau qhov loj-xaiv cDNA khi nrog lub adapter tau siv rau 15 feeb ntawm 37 ° C thiab tom qab ntawd rau 5 feeb ntawm 95 ° C ua ntej PCR. PCR tau ua tiav los ntawm kev siv Phusion High-Fidelity DNA polymerase, universal PCR primers, thiab Index (X) primers. Thaum kawg, cov khoom PCR tau raug lim (AMPure XP system) thiab qhov zoo ntawm tsev qiv ntawv tau soj ntsuam ntawm Agilent Bioanalyzer 2100 system. Lub tsev qiv ntawv cDNA tau raug sequenced siv Novaseq sequencer. Cov ntaub ntawv duab raw los ntawm Illumina tau hloov mus rau kev nyeem raw siv CASAVA Base Calling. Cov ntaub ntawv raw tau khaws cia rau hauv FASTQ (fq) cov ntaub ntawv hom ntawv uas muaj cov kab lus nyeem thiab cov yam ntxwv zoo sib xws. Xaiv HISAT2 kom phim cov ntawv nyeem sequencing uas tau lim rau Sscrofa11.1 genome siv. Feem ntau, HISAT2 txhawb nqa cov genomes ntawm txhua qhov loj me, suav nrog cov genomes loj dua 4 billion lub hauv paus, thiab cov nqi tsis raug teeb tsa rau feem ntau cov kev teeb tsa. Kev nyeem splicing los ntawm RNA Seq cov ntaub ntawv tuaj yeem sib phim zoo siv HISAT2, lub kaw lus ceev tshaj plaws tam sim no muaj, nrog tib yam lossis zoo dua qhov tseeb dua li lwm txoj kev.
Qhov muaj ntau ntawm cov ntawv sau qhia ncaj qha qhia txog qib ntawm kev qhia tawm ntawm cov noob caj noob ces. Cov qib kev qhia tawm ntawm cov noob caj noob ces raug soj ntsuam los ntawm qhov muaj ntau ntawm cov ntawv sau qhia ( suav cov lej sib lawv liag) cuam tshuam nrog cov noob caj noob ces lossis exons. Tus naj npawb ntawm kev nyeem yog sib npaug rau cov qib kev qhia tawm ntawm cov noob caj noob ces, qhov ntev ntawm cov noob caj noob ces, thiab qhov tob ntawm cov lej sib lawv liag. FPKM (cov khoom ib txhiab tus khub ntawm cov ntawv sau qhia uas tau muab sib lawv liag ib lab tus khub) tau suav thiab P-tus nqi ntawm kev qhia tawm sib txawv tau txiav txim siab siv pob DESeq2. Tom qab ntawd peb tau suav tus nqi tshawb pom cuav (FDR) rau txhua tus nqi P siv txoj kev Benjamini-Hochberg9 raws li R-function "p.adjust".
RNA cais tawm ntawm cov ntu plawv tau hloov mus rau cDNA ntawm qhov concentration ntawm 200 ng/μl siv SuperScript IV Vilo Master sib tov los ntawm Thermo (Thermo, cat. no. 11756050). Quantitative RT-PCR tau ua tiav siv Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well transparent reaction plate (Thermo, cat. no. 4483319) thiab microamp optical adhesive (Thermo, cat. no. 4311971). Cov tshuaj sib tov muaj 5 µl Taqman Fast Advanced Master sib tov (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer thiab 3.5 µl H2O sib tov rau ib lub qhov. Cov voj voog qPCR txheem tau khiav thiab cov nqi CT tau ntsuas siv Applied Biosystems Quantstudio 5 real-time PCR instrument (384-well module; khoom # A28135). Cov primers Taqman tau yuav los ntawm Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) Cov nqi CT ntawm txhua qhov qauv tau raug kho kom zoo rau cov noob GAPDH.
Kev tso tawm xov xwm ntawm NT-ProBNP tau raug soj ntsuam siv cov khoom siv NT-ProBNP (npua) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) raws li cov txheej txheem ntawm cov chaw tsim khoom. Hauv luv luv, 250 µl ntawm txhua tus qauv thiab tus qauv tau ntxiv ua ob zaug rau txhua lub qhov. Tam sim ntawd tom qab ntxiv cov qauv, ntxiv 50 µl ntawm Assay Reagent A rau txhua lub qhov. Maj mam co lub phaj thiab kaw nrog sealant. Tom qab ntawd cov ntsiav tshuaj tau incubated ntawm 37°C rau 1 teev. Tom qab ntawd nqus cov tshuaj thiab ntxuav cov qhov 4 zaug nrog 350 µl ntawm 1X ntxuav kua, incubated cov tshuaj ntxuav rau 1-2 feeb txhua zaus. Tom qab ntawd ntxiv 100 µl ntawm Assay Reagent B rau ib lub qhov thiab kaw nrog phaj sealant. Lub ntsiav tshuaj tau maj mam co thiab incubated ntawm 37°C rau 30 feeb. Nqus cov tshuaj thiab ntxuav cov qhov 5 zaug nrog 350 µl ntawm 1X ntxuav kua. Ntxiv 90 µl ntawm cov kua substrate rau txhua lub qhov thiab kaw lub phaj. Incubate lub phaj ntawm 37°C rau 10-20 feeb. Ntxiv 50 µl Stop Solution rau txhua lub qhov. Lub phaj tau ntsuas tam sim ntawd siv Cytation (BioTek) phaj nyeem teeb tsa ntawm 450 nm.
Kev tshuaj xyuas lub zog tau ua los xaiv qhov loj ntawm pawg uas yuav muab >80% lub zog los ntes 10% qhov kev hloov pauv tag nrho hauv qhov parameter nrog 5% Hom I qhov yuam kev. Kev tshuaj xyuas lub zog tau ua los xaiv qhov loj ntawm pawg uas yuav muab >80% lub zog los ntes 10% qhov kev hloov pauv tag nrho hauv qhov parameter nrog 5% Hom I qhov yuam kev. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат > 80% мощности для обята рубеспечат изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Kev tshuaj xyuas lub zog tau ua los xaiv cov pawg loj uas yuav muab >80% lub zog los ntes 10% qhov kev hloov pauv parameter nrog 5% Hom I qhov yuam kev.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I尯野进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I尯野 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обеж оберние абсолютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Ib qho kev tshuaj xyuas lub zog tau ua tiav los xaiv qhov loj ntawm pawg uas yuav muab >80% lub zog los ntes 10% kev hloov pauv ntawm qhov tsis sib xws thiab 5% hom I qhov yuam kev.Cov ntu ntawm cov ntaub so ntswg raug xaiv ua ntej ua ntej kev sim. Tag nrho cov kev tshuaj xyuas tsis pom kev mob thiab cov qauv tau raug txhais tsuas yog tom qab tag nrho cov ntaub ntawv tau raug tshuaj xyuas. GraphPad Prism software (San Diego, CA) tau siv los ua txhua qhov kev tshuaj xyuas suav lej. Rau txhua qhov kev suav txheeb cais, p-tus nqi tau suav tias yog qhov tseem ceeb ntawm cov nqi <0.05. Rau txhua qhov kev suav txheeb cais, p-tus nqi tau suav tias yog qhov tseem ceeb ntawm cov nqi <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Rau txhua qhov kev suav txheeb cais, p-tus nqi tau suav tias yog qhov tseem ceeb ntawm cov nqi <0.05.对于所有统计数据，p 值在值 <0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值 <0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Rau txhua qhov kev suav txheeb cais, p-tus nqi tau suav tias yog qhov tseem ceeb ntawm cov nqi <0.05.Kev xeem t ob-tailed Student tau ua tiav rau cov ntaub ntawv nrog tsuas yog 2 qhov kev sib piv. Ib txoj kev lossis ob txoj kev ANOVA tau siv los txiav txim siab qhov tseem ceeb ntawm ntau pawg. Thaum ua qhov kev xeem post hoc, Tukey txoj kev kho tau siv los suav nrog ntau qhov kev sib piv. Cov ntaub ntawv RNAsec muaj kev txiav txim siab tshwj xeeb thaum xam FDR thiab p.adjust raws li tau piav qhia hauv ntu Txoj Kev.
Yog xav paub ntxiv txog kev tsim qauv kev kawm, mus saib daim ntawv qhia luv luv ntawm Nature Research Report uas txuas nrog tsab xov xwm no.