Ви благодариме што ја посетивте Nature.com. Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS. За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer). Во меѓувреме, за да обезбедиме континуирана поддршка, ќе ја прикажеме страницата без стилови и JavaScript.
Потребен е сигурен систем ин витро кој може прецизно да ја репродуцира физиолошката средина на срцето за тестирање на лекови. Ограничената достапност на системи за култура на ткиво од човечко срце доведе до неточни толкувања на ефектите на срцевите лекови. Овде, развивме модел на култура на срцево ткиво (CTCM) кој електромеханички ги стимулира срцевите парчиња и се подложува на физиолошко истегнување за време на систолната и дијастолната фаза на срцевиот циклус. По 12 дена култура, овој пристап делумно ја подобри одржливоста на срцевите парчиња, но не го зачува целосно нивниот структурен интегритет. Затоа, по скрининг на мали молекули, откривме дека додавањето на 100 nM тријодотиронин (T3) и 1 μM дексаметазон (Dex) во нашиот медиум ја одржува микроструктурата на парчињата 12 дена. Во комбинација со третман со T3/Dex, системот CTCM ги одржува транскрипциските профили, одржливоста, метаболичката активност и структурниот интегритет на исто ниво како и свежото срцево ткиво 12 дена. Покрај тоа, прекумерното истегнување на срцевото ткиво во културата предизвикува хипертрофично срцево сигнализирање, обезбедувајќи докази за способноста на CTCM да имитира хипертрофични состојби предизвикани од срцево истегнување. Како заклучок, CTCM може да ја моделира физиологијата и патофизиологијата на срцето во култура во текот на долги временски периоди, овозможувајќи сигурен скрининг на лекови.
Пред клиничките истражувања, потребни се сигурни in vitro системи кои можат прецизно да ја репродуцираат физиолошката средина на човечкото срце. Ваквите системи треба да имитираат изменето механичко истегнување, срцев ритам и електрофизиолошки својства. Животинските модели најчесто се користат како платформа за скрининг за срцева физиологија со ограничена сигурност во одразувањето на ефектите на лековите во човечкото срце1,2. На крајот на краиштата, Идеалниот експериментален модел за култура на срцево ткиво (CTCM) е модел кој е многу чувствителен и специфичен за разни терапевтски и фармаколошки интервенции, прецизно репродуцирајќи ја физиологијата и патофизиологијата на човечкото срце3. Отсуството на таков систем го ограничува откривањето на нови третмани за срцева слабост4,5 и доведе до кардиотоксичност на лековите како главна причина за излегување од пазарот6.
Во текот на изминатата деценија, осум некардиоваскуларни лекови се повлечени од клиничка употреба бидејќи предизвикуваат продолжување на QT интервалот, што доведува до вентрикуларни аритмии и ненадејна смрт7. Затоа, постои зголемена потреба од сигурни претклинички стратегии за скрининг за проценка на кардиоваскуларната ефикасност и токсичност. Неодамнешната употреба на кардиомиоцити добиени од човечки индуцирани плурипотентни матични клетки (hiPS-CM) во скринингот на лекови и тестирањето на токсичност обезбедува делумно решение за овој проблем. Сепак, незрелата природа на hiPS-CM и недостатокот на повеќеклеточна комплексност на срцевото ткиво се главни ограничувања на овој метод. Неодамнешните студии покажаа дека ова ограничување може делумно да се надмине со користење на ран hiPS-CM за формирање хидрогели од срцево ткиво кратко време по почетокот на спонтаните контракции и постепено зголемување на електричната стимулација со текот на времето. Сепак, на овие микроткива на hiPS-CM им недостасуваат зрели електрофизиолошки и контрактилни својства на возрасниот миокард. Покрај тоа, човечкото срцево ткиво има посложена структура, која се состои од хетерогена мешавина од различни типови клетки, вклучувајќи ендотелни клетки, неврони и стромални фибробласти, меѓусебно поврзани со специфични групи протеини на екстрацелуларниот матрикс. Оваа хетерогеност на некардиомиоцитни популации11,12,13 кај срцето на возрасни цицачи е главна пречка за моделирање на срцевото ткиво со користење на поединечни типови клетки. Овие големи ограничувања ја нагласуваат важноста на развојот на методи за култивирање на интактно миокардно ткиво под физиолошки и патолошки услови.
Култивираните тенки (300 µm) делови од човечкото срце се покажаа како ветувачки модел на интактен човечки миокард. Овој метод овозможува пристап до комплетен 3D повеќеклеточен систем сличен на човечкото срцево ткиво. Сепак, до 2019 година, употребата на култивирани срцеви делови беше ограничена од краткото (24 часа) преживување на културата. Ова се должи на голем број фактори, вклучувајќи го недостатокот на физичко-механичко истегнување, интерфејсот воздух-течност и употребата на едноставни медиуми кои не ги поддржуваат потребите на срцевото ткиво. Во 2019 година, неколку истражувачки групи покажаа дека вклучувањето на механички фактори во системите за култура на срцево ткиво може да го продолжи животниот век на културата, да ја подобри срцевата експресија и да имитира срцева патологија. Две елегантни студии 17 и 18 покажуваат дека едноосното механичко оптоварување има позитивен ефект врз срцевиот фенотип за време на културата. Сепак, овие студии не го користеа динамичкото тридимензионално физичко-механичко оптоварување на срцевиот циклус, бидејќи срцевите делови беа оптоварени или со изометриски затегнувачки сили 17 или со линеарно ауксотонично оптоварување 18. Овие методи на истегнување на ткивото резултираа со супресија на многу срцеви гени или прекумерна експресија на гени поврзани со абнормални одговори на истегнување. Имено, Питулис и сор. 19 развија динамична културна бања на срцеви парчиња за реконструкција на срцевиот циклус користејќи повратни информации од трансдуцерот на сила и погони за напнатост. Иако овој систем овозможува попрецизно моделирање на срцевиот циклус in vitro, сложеноста и нискиот проток на методот ја ограничуваат примената на овој систем. Нашата лабораторија неодамна разви поедноставен систем за култура користејќи електрична стимулација и оптимизиран медиум за одржување на одржливоста на делови од срцево ткиво од свињи и луѓе до 6 дена 20,21.
Во овој ракопис, опишуваме модел на култура на срцево ткиво (CTCM) користејќи делови од свинско срце што вклучува хуморални знаци за да ја рекапитулираме тродимензионалната срцева физиологија и патофизиолошката дистензија за време на срцевиот циклус. Овој CTCM може да ја зголеми точноста на претклиничкото предвидување на лекови до ниво што никогаш порано не е постигнато со обезбедување економичен, среден проточен срцев систем што ја имитира физиологијата/патофизиологијата на срцето на цицачите за претклиничко тестирање на лекови.
Хемодинамичките механички сигнали играат клучна улога во одржувањето на функцијата на кардиомиоцитите in vitro 22,23,24. Во овој ракопис, развивме CTCM (Слика 1а) кој може да ја имитира срцевата средина кај возрасните со индуцирање и електрична и механичка стимулација на физиолошки фреквенции (1,2 Hz, 72 отчукувања во минута). За да се избегне прекумерно истегнување на ткивото за време на дијастолата, беше користен уред за 3D печатење за да се зголеми големината на ткивото за 25% (Сл. 1б). Електричното пејсирање предизвикано од системот C-PACE беше темпирано да започне 100 ms пред систола користејќи систем за собирање податоци за целосно да се репродуцира срцевиот циклус. Системот за култура на ткиво користи програмабилен пневматски актуатор (LB Engineering, Германија) за циклично проширување на флексибилна силиконска мембрана за да предизвика ширење на срцевите парчиња во горната комора. Системот беше поврзан со надворешен воздушен вод преку предавател на притисок, што овозможи прецизно прилагодување на притисокот (± 1 mmHg) и времето (± 1 ms) (Сл. 1в).
a Прикачете го делот од ткивото на потпорниот прстен од 7 mm, прикажан со сина боја, во внатрешноста на комората за култура на уредот. Комората за култура е одвоена од воздушната комора со тенка флексибилна силиконска мембрана. Поставете заптивка помеѓу секоја комора за да спречите протекување. Капакот на уредот содржи графитни електроди кои обезбедуваат електрична стимулација. b Шематски приказ на големиот уред за ткиво, прстенот за водење и прстенот за потпора. Деловите од ткивото (кафеави) се поставени на преголемиот уред со прстенот за водење поставен во жлебот на надворешниот раб на уредот. Користејќи го водичот, внимателно поставете го прстенот за потпора обложен со акрилен лепак за ткиво врз делот од срцевото ткиво. c Графикон што го прикажува времето на електрична стимулација како функција на притисокот во воздушната комора контролиран од програмабилен пневматски актуатор (PPD). Уред за собирање податоци беше користен за синхронизирање на електричната стимулација со помош на сензори за притисок. Кога притисокот во комората за култура ќе го достигне зададениот праг, до C-PACE-EM се испраќа пулсен сигнал за да се активира електрична стимулација. d Слика од четири CTCM поставени на полица од инкубатор. Четири уреди се поврзани со еден PPD преку пневматско коло, а сензорите за притисок се вметнуваат во хемостатскиот вентил за да се следи притисокот во пневматското коло. Секој уред содржи шест делови од ткиво.
Користејќи еден пневматски актуатор, бевме во можност да контролираме 4 CTCM уреди, од кои секој можеше да собере 6 ткивни пресеци (Сл. 1d). Во CTCM, воздушниот притисок во воздушната комора се претвора во синхрон притисок во течната комора и предизвикува физиолошко ширење на срцевиот пресек (Слика 2a и Дополнителен филм 1). Евалуација на истегнувањето на ткивото при 80 mm Hg. Слика 2b покажа истегнување на ткивните пресеци за 25% (Сл. 2b). Овој процент на истегнување е покажан дека одговара на физиолошка должина на саркомер од 2,2–2,3 µm за нормална контрактилност на срцевиот пресек17,19,25. Движењето на ткивото беше оценето со помош на прилагодени поставки на камерата (Дополнителна слика 1). Амплитудата и брзината на движењето на ткивото (Сл. 2c, d) одговараа на истегнувањето за време на срцевиот циклус и времето за време на систолата и дијастолата (Сл. 2b). Истегнувањето и брзината на срцевото ткиво за време на контракцијата и релаксацијата останаа константни 12 дена во култура (Сл. 2f). За да го процениме ефектот на електричната стимулација врз контрактилноста за време на културата, развивме метод за одредување на активна деформација со користење на алгоритам за сенчење (Дополнителна слика 2а,б) и бевме во можност да направиме разлика помеѓу деформитети со и без електрична стимулација. Истиот дел од срцето (Сл. 2f). Во подвижниот регион на засекот (R6-9), напонот за време на електричната стимулација беше 20% повисок отколку во отсуство на електрична стимулација, што укажува на придонесот на електричната стимулација кон контрактилната функција.
Репрезентативните траги од притисокот во воздушната комора, притисокот во комората на течноста и мерењата на движењето на ткивото потврдуваат дека притисокот во комората го менува притисокот во комората на течноста, предизвикувајќи соодветно движење на ткивниот дел. б Репрезентативните траги од процентот на истегнување (сина) на ткивните делови што одговараат на процентот на истегнување (портокалова). в Измереното движење на срцевиот дел е во согласност со измерената брзина на движење. (г) Репрезентативни траектории на циклично движење (сина линија) и брзина (портокалова испрекината линија) во дел од срцето. д Квантификација на времето на циклусот (n = 19 парчиња по група, од различни свињи), време на контракција (n = 19 парчиња по група), време на релаксација (n = 19 парчиња по група, од различни свињи), движење на ткивото (n = 25 парчиња)/група од различни свињи), врвна систолна брзина (n = 24(D0), 25(D12) парчиња/група од различни свињи) и врвна стапка на релаксација (n = 24(D0), 25(D12) парчиња/група од различни свињи). Двостраниот Студентов t-тест не покажа значајна разлика во ниту еден параметар. f Репрезентативни траги од анализа на деформација на ткивни пресеци со (црвена) и без (сина) електрична стимулација, десет регионални области на ткивни пресеци од истиот пресек. Долните панели ја покажуваат квантификацијата на процентната разлика во деформацијата во ткивни пресеци со и без електрична стимулација во десет области од различни пресеци. (n = 8 парчиња/група од различни свињи, извршен е двостран Студент t-тест; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 парчиња/група од различни свињи, извршен е двостран Студент t-тест; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу од разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 секции/група од различни свињи, двостран Студентов t-тест; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001，**p <0.01，5p <0.01，5p （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001，**p <0.01，5p <0.01，5p (n = 8 срезов/группу, од разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 секции/група, од различни свињи, двостран Студентов t-тест; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Грешките ја претставуваат средната вредност ± стандардна девијација.
Во нашиот претходен статички биомиметички систем за култура на срцеви парчиња [20, 21], ја одржувавме одржливоста, функцијата и структурниот интегритет на срцевите парчиња 6 дена со примена на електрична стимулација и оптимизирање на составот на медиумот. Сепак, по 10 дена, овие бројки нагло се намалија. Ќе се осврнеме на деловите култивирани во нашиот претходен статички биомиметички систем за култура 20, 21 во контролни услови (Ctrl) и ќе го користиме нашиот претходно оптимизиран медиум како MC услови и култура под истовремена механичка и електрична стимулација (CTCM). наречена . Прво, утврдивме дека механичката стимулација без електрична стимулација е недоволна за одржување на одржливоста на ткивото 6 дена (Дополнителна слика 3a,b). Интересно е што со воведувањето на физио-механичка и електрична стимулација со употреба на STCM, одржливоста на 12-дневните срцеви делови остана иста како кај свежите срцеви делови под MS услови, но не и под Ctrl услови, како што е прикажано со MTT анализата (Сл. 1). 3a). Ова сугерира дека механичката стимулација и симулацијата на срцевиот циклус можат да ги одржат ткивните делови одржливи двојно подолго отколку што е објавено во нашиот претходен статички систем за култура. Сепак, проценката на структурниот интегритет на ткивните делови со имунообележување на срцевиот тропонин Т и конексин 43 покажа дека експресијата на конексин 43 беше значително поголема во ткивата на MC на 12-тиот ден отколку кај контролните на истиот ден. Сепак, униформната експресија на конексин 43 и формирањето на Z-диск не беа целосно одржани (Сл. 3б). Користиме рамка со вештачка интелигенција (AI) за да квантифицираме структурниот интегритет на ткивото26, цевковод за длабоко учење базиран на слики базиран на боење на тропонин-Т и конексин43 за автоматско квантифицирање на структурниот интегритет и флуоресценцијата на срцевите делови во однос на јачината на локализацијата. Овој метод користи Конволуциона невронска мрежа (CNN) и рамка за длабоко учење за сигурно квантифицирање на структурниот интегритет на срцевото ткиво на автоматизиран и непристрасен начин, како што е опишано во референцата. 26. Ткивото на MC покажа подобрена структурна сличност на ден 0 во споредба со статичките контролни делови. Покрај тоа, трихромното боење на Масон откри значително помал процент на фиброза под услови на MS во споредба со контролните услови на 12-тиот ден од културата (Сл. 3в). Иако CTCM ја зголеми одржливоста на деловите од срцевото ткиво на 12-тиот ден на ниво слично на она на свежото срцево ткиво, таа не го подобри значително структурниот интегритет на срцевите делови.
Графиконот со столбови ја покажува квантификацијата на одржливоста на MTT на свежи парчиња срце (D0) или култура на парчиња срце во тек на 12 дена, или во статичка култура (D12 Ctrl) или во CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) парчиња/група од различни свињи, извршен е еднонасочен ANOVA тест; ####p < 0,0001 во споредба со D0 и **p < 0,01 во споредба со D12 Ctrl). Графиконот со столбови ја покажува квантификацијата на одржливоста на MTT на свежи парчиња срце (D0) или култура на парчиња срце во тек на 12 дена, или во статичка култура (D12 Ctrl) или во CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) парчиња/група од различни свињи, извршен е еднонасочен ANOVA тест; ####p < 0,0001 во споредба со D0 и **p < 0,01 во споредба со D12 Ctrl).Хистограмот ја покажува квантификацијата на одржливоста на MTT свежи срцеви пресеци (D0) или култура на срцеви пресеци во тек на 12 дена во статичка култура (D12 контрола) или CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 контрола). ) , 12 (D12 MC) пресеци/група од различни свињи, се изведува еднонасочен ANOVA тест;####p < 0,0001 по сравнению со D0 и **p < 0,01 по сравнению со D12 Ctrl). ####p < 0,0001 во споредба со D0 и **p < 0,01 во споредба со D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，ANO化测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比,**p <0,01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，#####p <1D， 与0相比,**p.)хистограм што ја прикажува квантификацијата на одржливоста на MTT во свежи пресеци од срце (D0) или пресеци од срце култивирани 12 дена во статичка култура (контрола D12) или CTCM (MC D12) (n = 18 (D0), 15 (контрола D12)), 12 (MC D12) пресеци/група од различни свињи, еднонасочен ANOVA тест;####p < 0,0001 по сравнению со D0, **p < 0,01 по сравнению со D12 Ctrl). ####p < 0,0001 во споредба со D0, **p < 0,01 во споредба со D12 Ctrl).б Тропонин-Т (зелена), конексин 43 (црвена) и DAPI (сина) во свежо изолирани пресеци од срце (D0) или пресеци од срце култивирани под статички услови (Ctrl) или CTCM услови (MC) во тек на 12 дена) од репрезентативни имунофлуоресцентни слики (слепа скала = 100 µm). Квантификација со вештачка интелигенција на структурниот интегритет на срцевото ткиво (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) парчиња/група, секое од различно свиња, извршен е еднонасочен ANOVA тест; ####p < 0,0001 во споредба со D0 и ****p < 0,0001 во споредба со D12 Ctrl). Квантификација со вештачка интелигенција на структурниот интегритет на срцевото ткиво (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) парчиња/група, секое од различни свињи, извршен е еднонасочен ANOVA тест; ####p < 0,0001 во споредба со D0 и ****p < 0,0001 во споредба со D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный, проводится однофакторный, проводится однофакторный, проводится однофакторный сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Квантификација на структурниот интегритет на срцевото ткиво со вештачка интелигенција (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) пресеци/групи од различни свињи, извршен еднонасочен ANOVA тест; ####p < 0,0001 наспроти D0 и ****p < 0,0001 во споредба со D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) парчиња/група секоја од различни свињи, еднонасочен тест ANOVA.##00p相比，****p <0,0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) парчиња/група секоја од различни свињи, еднонасочен ANOVA тест;与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердичной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односот A ##000 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). Вештачка интелигенција за квантифицирање на структурниот интегритет на срцевото ткиво (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) делови/група, секој од различни свињи, еднонасочен ANOVA тест; ####p<0,0001 наспроти .D0 За споредба ****p < 0,0001 во споредба со D12 Ctrl). в Репрезентативни слики (лево) и квантификација (десно) за срцеви парчиња обоени со Масоново трихромно боење (Scale bare = 500 µm) (n = 10 парчиња/група секое од различна свиња, извршен е еднонасочен ANOVA тест; ####p < 0,0001 во споредба со D0 и ***p < 0,001 во споредба со D12 Ctrl). в Репрезентативни слики (лево) и квантификација (десно) за срцеви парчиња обоени со Масоново трихромно боење (Scale bare = 500 µm) (n = 10 парчиња/група секое од различни свињи, извршен е еднонасочен ANOVA тест; #### p < 0,0001 во споредба со D0 и ***p < 0,001 во споредба со D12 Ctrl). в Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/групне). односторонний тест ANOVA; в Репрезентативни слики (лево) и квантификација (десно) на срцеви пресеци обоени со Масоново трихромно боење (непремачкана скала = 500 µm) (n = 10 пресеци/група од различни свињи, извршен еднонасочен ANOVA тест; #### p < 0,0001 во споредба со D0 и ***p < 0,001 во споредба со D12 Ctrl). в.个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### стр < 0,0001 与D0 相010 与D0 相0 10 丼0 相0 1.相比）. C 用 Masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尣庣度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单#） стр## 自 стр. 0,0001 与D0 相比，***p <0,001 与D12 Ctrl 相比）. в Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализа (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/групипа, како помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению со D12 Ctrl). в Репрезентативни слики (лево) и квантификација (десно) на срцеви пресеци обоени со Масоново трихромно боење (слепа проба = 500 µm) (n = 10 пресеци/група, секој од различна свиња, тестирани со еднонасочна анализа на варијансата;### # p < 0,0001 во споредба со D0, ***p < 0,001 во споредба со D12 Ctrl).Грешките ја претставуваат средната вредност ± стандардна девијација.
Претпоставивме дека со додавање на мали молекули во медиумот за култура, интегритетот на кардиомиоцитите може да се подобри и развојот на фиброза да се намали за време на CTCM културата. Затоа, скриниравме за мали молекули користејќи ги нашите статички контролни култури20,21 поради малиот број на збунувачки фактори. Дексаметазон (Dex), тријодотиронин (T3) и SB431542 (SB) беа избрани за овој скрининг. Овие мали молекули претходно се користени во hiPSC-CM култури за да се индуцира созревање на кардиомиоцити со зголемување на должината на саркомерите, Т-тубулите и брзината на спроводливост. Покрај тоа, познато е дека и Dex (гликокортикоид) и SB го потиснуваат воспалението29,30. Затоа, тестиравме дали вклучувањето на една или комбинација од овие мали молекули би го подобрило структурниот интегритет на срцевите пресеци. За почетен скрининг, дозата на секое соединение беше избрана врз основа на концентрациите што најчесто се користат во моделите на клеточни култури (1 μM Dex27, 100 nM T327 и 2,5 μM SB31). По 12 дена култура, комбинацијата на Т3 и Dex резултираше со оптимален структурен интегритет на кардиомиоцитите и минимално фиброзно ремоделирање (Дополнителни слики 4 и 5). Покрај тоа, употребата на двојни или двојни овие концентрации на Т3 и Dex предизвика штетни ефекти во споредба со нормалните концентрации (Дополнителна слика 6а,б).
По почетниот скрининг, извршивме директна споредба на 4 услови на култура (Слика 4а): Ctrl: срцеви пресеци култивирани во нашата претходно опишана статичка култура користејќи го нашиот оптимизиран медиум; 20.21 TD: T3 и Ctrl s додадени Dex во среда; MC: срцеви пресеци култивирани во CTCM користејќи го нашиот претходно оптимизиран медиум; и MT: CTCM со додадени T3 и Dex во медиумот. По 12 дена култивирање, одржливоста на MS и MT ткивата остана иста како и кај свежите ткива оценети со MTT тест (Сл. 4б). Интересно е што додавањето на T3 и Dex во трансвел културите (TD) не резултираше со значително подобрување на одржливоста во споредба со условите на Ctrl, што укажува на важна улога на механичката стимулација во одржувањето на одржливоста на срцевите пресеци.
Дијаграм на експериментален дизајн што ги прикажува четирите услови на култура што се користат за проценка на ефектите од механичка стимулација и суплементација со T3/Dex на медиум во тек на 12 дена. б. Графиконот со столпчиња ја покажува квантификацијата на одржливоста 12 дена по културата во сите 4 услови на култура (Ctrl, TD, MC и MT) во споредба со свежи парчиња срце (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) парчиња/група од различни свињи, извршен е еднонасочен ANOVA тест; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 во споредба со D0 и **p < 0,01 во споредба со D12 Ctrl). б. Графиконот со столпчиња ја покажува квантификацијата на одржливоста 12 дена по културата во сите 4 услови на култура (Ctrl, TD, MC и MT) во споредба со свежи парчиња срце (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) парчиња/група од различни свињи, извршен е еднонасочен ANOVA тест; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 во споредба со D0 и **p < 0,01 во споредба со D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественню оценку жизнеспособности через 12 дена после култирање во сите 4 условиях култивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежи срезами (D10D) (D101) (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA ###p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению; 0,01 по сравнению со D12 Ctrl). б Графиконот со столпчиња ја покажува квантификацијата на одржливоста 12 дена по културата во сите 4 услови на култура (контрола, TD, MC и MT) во споредба со свежи пресеци од срце (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) пресеци/група од различни свињи, еднонасочен ANOVA тест; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 наспроти D0 и **p < 0,01 во споредба со D12 Ctrl). b. TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0000001Ｘ相比,**p <0,01 与D12控制）.б 4 12 (Д12 МЦ) б Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12), (1D12 TD и D12) MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA ###p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению со контролем D12). б Хистограм што ги прикажува сите 4 услови на култура (контрола, TD, MC и MT) во споредба со свежи пресеци од срце (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), од различни свињи 12 (D12 MC) пресеци/група, еднонасочен ANOVA тест; ####p<0,0001, ###p<0,001 наспроти D0, **p<0,01 наспроти контрола D12). в Графиконот со столпчиња ја покажува квантификацијата на флуксот на гликоза 12 дена по културата во сите 4 услови на култура (Ctrl, TD, MC и MT) во споредба со свежи парчиња срце (D0) (n = 6 парчиња/група од различни свињи, извршен е еднонасочен ANOVA тест; ###p < 0,001, во споредба со D0 и ***p < 0,001 во споредба со D12 Ctrl). в Графиконот со столпчиња ја покажува квантификацијата на флуксот на гликоза 12 дена по културата во сите 4 услови на култура (Ctrl, TD, MC и MT) во споредба со свежи парчиња срце (D0) (n = 6 парчиња/група од различни свињи, извршен е еднонасочен ANOVA тест; ###p < 0,001, во споредба со D0 и ***p < 0,001 во споредба со D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценка потока глюкозы через 12 дена после култивирования во сите 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежина (6 резами) разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA ###p < 0,001 по сравнению со D0 и ***p < 0,001 по сравнению со D12 Ctrl). в Хистограмот покажува квантификација на флуксот на гликоза 12 дена по културата под сите 4 услови на култура (контрола, TD, MC и MT) во споредба со свежи срцеви пресеци (D0) (n = 6 пресеци/група од различни свињи, извршен еднонасочен ANOVA тест; ###p < 0,001 во споредба со D0 и ***p < 0,001 во споредба со D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相毹2，天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；#0#0p <0.相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. в Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дена после култирање за сите 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению (60) со свежина (60 дена) срезов/группа, от разных свиней, односотронний Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению со D12 (контрола). в Хистограм што ја покажува квантификацијата на флуксот на гликоза 12 дена по културата за сите 4 услови на култура (контрола, TD, MC и MT) во споредба со свежи пресеци од срце (D0) (n = 6 пресеци/група, од различни свињи, еднострани. Беа извршени ANOVA тестови, ###p < 0,001 во споредба со D0, ***p < 0,001 во споредба со D12 (контрола).d Графикони за анализа на соеви на свежи (сини), MC (зелени) и MT (црвени) ткива на 12-ти ден на десет регионални точки на пресекот на ткивото (n = 4 парчиња/група, еднонасочен ANOVA тест; немаше значајна разлика помеѓу групите). e Графикон на вулкан што ги прикажува различно експресираните гени во свежи пресеци на срце (D0) во споредба со пресеци на срце култивирани под статички услови (Ctrl) или под MT услови (MT) во тек на 10-12 дена. f Топлинска мапа на гени на саркомер за пресеци на срце култивирани под секој од условите на култура. Лентите за грешка ја претставуваат средната вредност ± стандардната девијација.
Метаболичката зависност од преминот од оксидација на масни киселини на гликолиза е белег на дедиференцијација на кардиомиоцитите. Незрелите кардиомиоцити првенствено користат гликоза за производство на ATP и имаат хипопластични митохондрии со малку кристи5,32. Анализите на искористувањето на гликозата покажаа дека под услови на MC и MT, искористувањето на гликозата беше слично на она во ткивата на ден 0 (Слика 4c). Сепак, примероците од Ctrl покажаа значително зголемување на искористувањето на гликозата во споредба со свежото ткиво. Ова укажува дека комбинацијата на CTCM и T3/Dex ја подобрува одржливоста на ткивото и го зачувува метаболичкиот фенотип на 12-дневните култивирани срцеви пресеци. Покрај тоа, анализата на напрегање покажа дека нивоата на напрегање останале исти како кај свежото срцево ткиво во тек на 12 дена под услови на MT и MS (Слика 4d).
За да го анализираме целокупното влијание на CTCM и T3/Dex врз глобалниот транскрипциски пејзаж на ткивото од срцеви парчиња, извршивме RNAseq на срцеви парчиња од сите четири различни услови на култура (Дополнителни податоци 1). Интересно е што MT деловите покажаа висока транскрипциска сличност со свежото срцево ткиво, со само 16 диференцијално експресирани од 13.642 гени. Сепак, како што покажавме претходно, Ctrl деловите прикажаа 1229 диференцијално експресирани гени по 10-12 дена во култура (Сл. 4e). Овие податоци беа потврдени со qRT-PCR на срцеви и фибробластни гени (Дополнителна слика 7a-c). Интересно е што Ctrl деловите покажаа намалување на срцевите и клеточните гени и активирање на воспалителните генски програми. Овие податоци сугерираат дека дедиференцијацијата, која нормално се јавува по долготрајно култивирање, е целосно атенуирана под услови на MT (Дополнителна слика 8a,b). Внимателното проучување на саркомерните гени покажа дека само под услови на MT се зачувани гените што го кодираат саркомерот (сл. 4f) и јонскиот канал (дополнителна слика 9), заштитувајќи ги од супресија под услови на Ctrl, TD и MC. Овие податоци покажуваат дека со комбинација на механичка и хуморална стимулација (T3/Dex), транскриптомот на срцевиот дел може да остане сличен на свежите срцеви делови по 12 дена во култура.
Овие транскрипциски наоди се поткрепени со фактот дека структурниот интегритет на кардиомиоцитите во срцевите пресеци најдобро се зачувува под услови на MT во тек на 12 дена, како што покажува интактниот и локализиран конексин 43 (сл. 5а). Покрај тоа, фиброзата во срцевите пресеци под услови на MT беше значително намалена во споредба со Ctrl и слично на свежите срцеви пресеци (сл. 5б). Овие податоци покажуваат дека комбинацијата од механичка стимулација и третман со T3/Dex ефикасно ја зачувува срцевата структура во срцевите пресеци во културата.
Репрезентативни имунофлуоресцентни слики на тропонин-Т (зелена), конексин 43 (црвена) и DAPI (сина) во свежо изолирани пресеци од срце (D0) или култивирани 12 дена во сите четири услови на култура на пресеци од срце (скала = 100 µm). Квантификација со вештачка интелигенција на структурниот интегритет на срцевото ткиво (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) парчиња/група од различни свињи, извршен е еднонасочен ANOVA тест; ####p < 0,0001 во споредба со D0 и *p < 0,05, или ****p < 0,0001 во споредба со D12 Ctrl). Квантификација со вештачка интелигенција на структурниот интегритет на срцевото ткиво (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) парчиња/група од различни свињи, извршен е еднонасочен ANOVA тест; #### p < 0,0001 во споредба со D0 и *p < 0,05, или ****p < 0,0001 во споредба со D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целости ткани сердца со помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) сорезов/группу од разных свиней, 0,0001 по сравнению со D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). Квантификација на структурниот интегритет на срцевото ткиво со употреба на вештачка интелигенција (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) секции/група од различни свињи, извршен еднонасочен ANOVA тест; #### p < 0,0001 во споредба со D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 во споредба со D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和0*p < 0,0001 与D0 和0*p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 (d0 和 d12 ctrl） (5 （d12 td 、 d12 m）2 mc人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## стр < 0,0001 与D0 和*p <0****. 0,0001 与D12 Ctrl 相比）.Квантификација на структурниот интегритет на срцевото ткиво со употреба на вештачка интелигенција кај различни свињи (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) секции/група) со еднонасочен ANOVA тест;#### p < 0,0001 по сравнению со D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). #### p < 0,0001 во споредба со D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 во споредба со D12 Ctrl). б Репрезентативни слики и квантификација за срцеви парчиња обоени со Масоново трихромно боење (Скала лента = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) парчиња/група од различни свињи, извршен е еднонасочен ANOVA тест; ####p < 0,0001 во споредба со D0 и ***p < 0,001, или ****p < 0,0001 во споредба со D12 Ctrl). б Репрезентативни слики и квантификација за срцеви парчиња обоени со Масоново трихромно боење (Скала лента = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) парчиња/група од различни свињи, извршен е еднонасочен ANOVA тест; ####p < 0,0001 во споредба со D0 и ***p < 0,001, или ****p < 0,0001 во споредба со D12 Ctrl). б Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красител Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12D2MT9), и D12D2MT9 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). б Репрезентативни слики и квантификација на срцеви пресеци обоени со Масоново трихромно боење (скала = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) пресеци/група од различни свињи, извршена еднонасочна ANOVA; ####p < 0,0001 наспроти D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 наспроти D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 μm）10（0D = Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单曠素方差素方同猪的9与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. б 用 масон 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析； 0.#0#D； 00.相比，***p <0,001，或****p <0,0001 与D12 Ctrl 相比）. б Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихром Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC) / группы, один- способ ANOVA; б Репрезентативни слики и квантификација на срцеви пресеци обоени со Масонов трихром (скала = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) пресеци од различни свињи/група, еден ANOVA метод; ####p < 0,0001 во споредба со D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 во споредба со D12 Ctrl).Грешките ја претставуваат средната вредност ± стандардна девијација.
Конечно, способноста на CTCM да имитира срцева хипертрофија беше оценета со зголемување на истегнувањето на срцевото ткиво. Во CTCM, врвниот притисок во воздушната комора се зголеми од 80 mmHg на 80 mmHg. Арт. (нормално истегнување) до 140 mmHg Арт. (Сл. 6a). Ова одговара на зголемување од 32% на истегнување (Сл. 6b), што претходно беше прикажано како соодветен процент на истегнување потребен за срцеви пресеци за да се постигне должина на саркомер слична на онаа што се гледа кај хипертрофија. Истегнувањето и брзината на срцевото ткиво за време на контракција и релаксација останаа константни во текот на шест дена од културата (Сл. 6c). Срцевото ткиво од услови на MT беше подложено на нормално истегнување (MT (Нормално)) или услови на прекумерно истегнување (MT (OS)) во текот на шест дена. Веќе по четири дена во култура, хипертрофичниот биомаркер NT-ProBNP беше значително зголемен во медиумот под услови на MT (OS) во споредба со услови на MT (нормално) (Сл. 7a). Дополнително, по шест дена култивирање, големината на клетките во MT (OS) (сл. 7б) значително се зголеми во споредба со деловите од срцето на MT (нормално). Дополнително, нуклеарната транслокација на NFATC4 беше значително зголемена кај преистегнатите ткива (сл. 7в). Овие резултати покажуваат прогресивен развој на патолошко ремоделирање по хипердистензија и ја поддржуваат концепцијата дека CTCM уредот може да се користи како платформа за проучување на сигнализацијата на срцева хипертрофија предизвикана од истегнување.
Репрезентативните траги од притисокот во воздушната комора, притисокот во комората на течноста и мерењата на движењето на ткивото потврдуваат дека притисокот во комората го менува притисокот во комората на течноста, предизвикувајќи соодветно движење на парчето ткиво. б Репрезентативни криви на процент на истегнување и брзина на истегнување за нормално истегнати (портокалови) и преистегнати (сини) делови од ткивото. в Графикон со столбови што го прикажува времето на циклусот (n = 19 парчиња по група, од различни свињи), времето на контракција (n = 18-19 парчиња по група, од различни свињи), времето на релаксација (n = 19 парчиња по група, од различни свињи)), амплитудата на движење на ткивото (n = 14 парчиња/група, од различни свињи), максималната систолна брзина (n = 14 парчиња/група, од различни свињи) и максималната брзина на релаксација (n = 14 (D0), 15 (D6) делови/групи) од различни свињи), двостраниот Студентов t-тест не покажа значајна разлика во ниту еден параметар, што укажува дека овие параметри останале константни во текот на 6 дена култура со пренапон. Лентите за грешка ја претставуваат средната вредност ± стандардната девијација.
Квантификација на концентрацијата на NT-ProBNP во медиум за култура од парчиња од срце култивирани под услови на нормално истегнување на MT (Норма) или прекумерно истегнување (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm и D4 MTOS) парчиња/група од различни свињи, Извршена е двонасочна ANOVA; **p < 0,01 во споредба со нормалното истегнување). Квантификација на концентрацијата на NT-ProBNP во медиум за култура од парчиња од срце култивирани под услови на нормално истегнување на MT (Норма) или прекумерно истегнување (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm и D4 MTOS) парчиња/група од различни свињи, Извршена е двонасочна ANOVA; **p < 0,01 во споредба со нормалното истегнување).Квантитативна хистограма на концентрацијата на NT-ProBNP во култиваторска подлога од парчиња од срце култивирани во услови на нормално истегнување на MT (норма) или прекумерно истегнување (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm и D4).MTOS) парчиња/група од различни свињи, извршена е двофакторска анализа на варијансата;**p < 0,01 по сравнению со нормальным растяжением). **p < 0,01 во споредба со нормалното истегнување). a 在MT 正常拉伸(Норма) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0,01). Квантификација на концентрацијата на NT-ProBNP во срцеви парчиња култивирани под MT нормално растегнување (Норма) или прекумерно истегнување (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) од различни猪的切片/组，可以双向方方发发动 **во споредба со нормално истегнување, p <0,01).хистограм Квантификација на концентрациите на NT-ProBNP во парчиња од срце култивирани во услови на нормално истегнување на MT (норма) или прекумерно истегнување (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) и D4 MTOS) парчиња/група од различни свињи, двонасочна анализа на варијансата;**p < 0,01 по сравнению со нормальным растяжением). **p < 0,01 во споредба со нормалното истегнување). б Репрезентативни слики за парчиња од срце обоени со тропонин-Т и WGA (лево) и квантификација на големината на клетките (десно) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клетки/група од 10 различни парчиња од различни свињи, извршен е двостран Студент t-тест; ****p < 0,0001 во споредба со нормалното истегнување). б Репрезентативни слики за парчиња од срце обоени со тропонин-Т и WGA (лево) и квантификација на големината на клетките (десно) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клетки/група од 10 различни парчиња од различни свињи, извршен е двостран Студент t-тест; ****p < 0,0001 во споредба со нормалното истегнување). б Репрезентативные изображения сорезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количествена група определена размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клетк свиней, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению со нормальным растяжением). б Репрезентативни слики од срцеви пресеци обоени со тропонин-Т и AZP (лево) и квантификација на големината на клетките (десно) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клетки/група од 10 различни пресеци од различни свињи, извршен е двостран Студентов t-тест; ****p < 0,0001 во споредба со нормалниот сој). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表漈右）染色的心脏切片的代表MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001). б Репрезентативни слики од парчиња срце обоени со калкареин-Т и WGA (лево) и големина на клетките (десно) (n = 330 (D6 MTOS), 369 од 10 различни парчиња (D6 MTNorm)) Клетки/млеко, тест на калкареин-Т во споредба со нормално истегнување, ****p < 0,0001). б Репрезентативные изображения сорезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm развразны) из 10 Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению со нормальным растяжением). б Репрезентативни слики од срцеви пресеци обоени со тропонин-Т и AZP (лево) и квантификација на големината на клетките (десно) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) од 10 различни пресеци од различни свињи) Клетки/група, двостран критериум Студентов t; ****p < 0,0001 во споредба со нормалниот сој). в Репрезентативни слики за MTOS срцеви парчиња од ден 0 и ден 6 имунообележани за тропонин-Т и NFATC4 и квантификација на транслокацијата на NFATC4 во јадрата на CMs (n = 4 (D0), 3 (MTOS D6) парчиња/група од различни свињи, извршен е двостран Студент t-тест; *p < 0,05). в Репрезентативни слики за MTOS срцеви парчиња од ден 0 и ден 6 имунообележани за тропонин-Т и NFATC4 и квантификација на транслокацијата на NFATC4 во јадрата на CMs (n = 4 (D0), 3 (MTOS D6) парчиња/група од различни свињи, извршен е двостран Студент t-тест; *p < 0,05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дена MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, и количественная оценка транслокации NFATC4 во ядра кавернозных клеток (D0n) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента *p < 0,05). в Репрезентативни слики за срцеви пресеци на MTOS на 0 и 6 дена, имунообележани за тропонин-Т и NFATC4, и квантификација на транслокацијата на NFATC4 во јадрото на кавернозните клетки (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) парчиња/група од различни свињи) извршен двостран Студентов t-тест; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化 (4 （0n)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p <0,05)". c Репрезентативни слики на имуноозначување на калканин-Т и NFATC4 第0天和第6天MTOS срцеви парчиња и NFATC4 од различно јадро на NFATC4 易位至CM клеточно јадро的количество化 (n = 4 (D6MTOS),时间双尾学生et 电影；*p <0,05). в Репрезентативные изображения сорезов сердца MTOS на 0 и 6 ден за иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и количественная оценка транслокации NFATC4 во ядра CM от разных свипај (n = 3 (D, MT6) два, хвостатый t-критерий Стьюдента *p < 0,05). в Репрезентативни слики од срцеви парчиња од MTOS на ден 0 и 6 за имунообележување на тропонин-Т и NFATC4 и квантификација на транслокацијата на NFATC4 во јадрото на CM од различни свињи (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) парчиња/група, двостран t-критериум Студент; *p < 0,05).Грешките претставуваат средна вредност ± стандардна девијација.
Транслационите кардиоваскуларни истражувања бараат клеточни модели кои прецизно ја репродуцираат срцевата средина. Во оваа студија, развиен е и карактеризиран CTCM уред кој може да стимулира ултратенки делови од срцето. CTCM системот вклучува физиолошки синхронизирана електромеханичка стимулација и збогатување со течности T3 и Dex. Кога делови од свинско срце биле изложени на овие фактори, нивната одржливост, структурен интегритет, метаболичка активност и транскрипциска експресија останале исти како кај свежото срцево ткиво по 12 дена култура. Покрај тоа, прекумерното истегнување на срцевото ткиво може да предизвика хипертрофија на срцето предизвикана од хиперекстензија. Генерално, овие резултати ја поддржуваат критичната улога на условите за физиолошка култура во одржувањето на нормален срцев фенотип и обезбедуваат платформа за скрининг на лекови.
Многу фактори придонесуваат за создавање оптимална средина за функционирање и преживување на кардиомиоцитите. Најочигледните од овие фактори се поврзани со (1) меѓуклеточни интеракции, (2) електромеханичка стимулација, (3) хуморални фактори и (4) метаболички супстрати. Физиолошките интеракции од клетка до клетка бараат сложени тридимензионални мрежи од повеќе типови клетки поддржани од екстрацелуларен матрикс. Ваквите сложени клеточни интеракции тешко се реконструираат in vitro со кокултура на поединечни типови клетки, но лесно може да се постигнат со користење на органотипската природа на срцевите пресеци.
Механичкото истегнување и електричната стимулација на кардиомиоцитите се критични за одржување на срцевиот фенотип33,34,35. Иако механичката стимулација е широко користена за условување и созревање на hiPSC-CM, неколку елегантни студии неодамна се обидоа со механичка стимулација на срцеви парчиња во култура користејќи едноаксијално оптоварување. Овие студии покажуваат дека 2D едноаксијалното механичко оптоварување има позитивен ефект врз фенотипот на срцето за време на културата. Во овие студии, делови од срцето беа или оптоварени со изометриски затегнувачки сили17, линеарно ауксотонично оптоварување18, или срцевиот циклус беше рекреиран користејќи повратни информации од трансдуцерот на сила и погони за напнатост. Сепак, овие методи користат едноаксијално истегнување на ткивото без оптимизација на животната средина, што резултира со супресија на многу срцеви гени или прекумерна експресија на гени поврзани со абнормални одговори на истегнување. CTCM опишан овде обезбедува 3D електромеханички стимул што го имитира природниот срцев циклус во однос на времето на циклусот и физиолошкото истегнување (25% истегнување, 40% систола, 60% дијастола и 72 отчукувања во минута). Иако оваа тродимензионална механичка стимулација сама по себе не е доволна за одржување на интегритетот на ткивото, потребна е комбинација од хуморална и механичка стимулација со употреба на T3/Dex за соодветно одржување на одржливоста, функцијата и интегритетот на ткивото.
Хуморалните фактори играат важна улога во модулирањето на фенотипот на срцето кај возрасните. Ова беше истакнато во студиите HiPS-CM во кои Т3 и Dex беа додадени во медиумот за култура за да се забрза созревањето на клетките. Т3 може да влијае на транспортот на аминокиселини, шеќери и калциум низ клеточните мембрани36. Покрај тоа, Т3 ја промовира експресијата на MHC-α и намалувањето на MHC-β, промовирајќи формирање на миофибрили со брзо грчење кај зрели кардиомиоцити во споредба со миофибрилите со бавно грчење кај феталниот CM. Недостатокот на Т3 кај пациенти со хипотироидизам резултира со губење на миофибриларните ленти и намалена стапка на развој на тонус37. Dex делува на глукокортикоидните рецептори и е покажано дека ја зголемува контрактилноста на миокардот кај изолирани перфузирани срца; 38 се смета дека ова подобрување е поврзано со ефектот врз влегувањето предизвикано од наслаги на калциум (SOCE) 39,40. Покрај тоа, Dex се врзува за своите рецептори, предизвикувајќи широк интрацелуларен одговор што ја потиснува имунолошката функција и воспалението30.
Нашите резултати покажуваат дека физичката механичка стимулација (MS) ги подобрила целокупните перформанси на културата во споредба со Ctrl, но не успеала да ја одржи одржливоста, структурниот интегритет и срцевата експресија во текот на 12 дена во културата. Во споредба со Ctrl, додавањето на T3 и Dex во CTCM (MT) културите ја подобрило одржливоста и одржувало слични транскрипциски профили, структурен интегритет и метаболичка активност со свежо срцево ткиво во текот на 12 дена. Покрај тоа, со контролирање на степенот на истегнување на ткивото, креиран е модел на срцева хипертрофија предизвикана од хиперекстензија со користење на STCM, што ја илустрира разновидноста на STCM системот. Треба да се напомене дека иако срцевото ремоделирање и фиброзата обично вклучуваат интактни органи чии циркулирачки клетки можат да обезбедат соодветни цитокини, како и фагоцитоза и други фактори на ремоделирање, делови од срцето сè уште можат да го имитираат фибротичниот процес како одговор на стрес и траума во миофибробласти. Ова е претходно оценето во овој модел на срцев дел. Треба да се напомене дека параметрите на CTCM можат да се модулираат со промена на притисокот/електричната амплитуда и фреквенцијата за да се симулираат многу состојби како што се тахикардија, брадикардија и механичка циркулаторна поддршка (механичко неоптоварено срце). Ова го прави системот среден пропусен опсег за тестирање на лекови. Способноста на CTCM да моделира срцева хипертрофија предизвикана од прекумерен напор го отвора патот за тестирање на овој систем за персонализирана терапија. Како заклучок, оваа студија покажува дека механичкото истегнување и хуморалната стимулација се критични за одржување на културата на делови од срцево ткиво.
Иако податоците презентирани овде сугерираат дека CTCM е многу ветувачка платформа за моделирање на интактен миокард, овој метод на култура има некои ограничувања. Главното ограничување на CTCM културата е тоа што наметнува континуирани динамички механички стресови на парчињата, што ја исклучува можноста за активно следење на контракциите на срцевите парчиња за време на секој циклус. Покрај тоа, поради малата големина на срцевите делови (7 mm), можноста за евалуација на систолната функција надвор од системите за култура со користење на традиционални сензори за сила е ограничена. Во овој ракопис, делумно го надминуваме ова ограничување со евалуација на оптичкиот напон како индикатор за контрактилна функција. Сепак, ова ограничување ќе бара понатамошна работа и може да се реши во иднина со воведување методи за оптичко следење на функцијата на срцевите парчиња во културата, како што е оптичко мапирање со употреба на калциум и бои чувствителни на напон. Друго ограничување на CTCM е тоа што работниот модел не манипулира со физиолошкиот стрес (претходно и после оптоварување). Во CTCM, притисокот беше индуциран во спротивни насоки за да се репродуцира 25% физиолошко истегнување во дијастола (целосно истегнување) и систола (должина на контракција за време на електрична стимулација) во многу големи ткива. Ова ограничување треба да се отстрани во идните дизајни на CTCM со соодветен притисок врз срцевото ткиво од двете страни и со примена на точните односи притисок-волумен што се јавуваат во срцевите коморите.
Преуредувањето предизвикано од прекумерно истегнување, објавено во овој ракопис, е ограничено на имитирање на хипертрофични сигнали за хиперистегнување. Така, овој модел може да помогне во проучувањето на хипертрофичната сигнализација предизвикана од истегнување без потреба од хуморални или невронски фактори (кои не постојат во овој систем). Потребни се понатамошни студии за да се зголеми мноштвото на CTCM, на пример, кокултивирање со имуни клетки, циркулирачки плазматски хуморални фактори и инервација кога кокултивирањето со невронски клетки ќе ги подобри можностите за моделирање на болести со CTCM.
Во оваа студија беа користени тринаесет свињи. Сите процедури врз животните беа извршени во согласност со институционалните упатства и беа одобрени од Комитетот за институционална грижа и употреба на животни при Универзитетот во Луисвил. Аортниот лак беше стегнат и срцето беше перфузирано со 1 литар стерилна кардиоплегија (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL хепарин, pH до 7,4); Срцата беа зачувани во ледено ладен кардиоплегичен раствор сè додека не беа транспортирани во лабораторија на мраз, што обично е <10 минути. Срцата беа зачувани во ледено ладен кардиоплегичен раствор сè додека не беа транспортирани во лабораторија на мраз, што обично е <10 минути. Сердца хранили во ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки во лабораториите на льду, што обычно занимает <10 мин. Срцата беа складирани во ледено ладен кардиоплегичен раствор до транспортот во лабораторијата на мраз, што обично трае <10 минути.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钞将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钞 Держите сердца во ледяной кардиоплегии до транспортировки во лабораториите на льду, обычно <10 мин. Чувајте ги срцата на мраз кардиоплегија до транспортот во лабораторијата на мраз, обично <10 минути.
Уредот CTCM е развиен во софтверот за компјутерски потпомогнато дизајнирање (CAD) на SolidWorks. Коморите за култура, разделувачите и воздушните комори се направени од CNC проѕирна акрилна пластика. Резервниот прстен со дијаметар од 7 mm е направен од полиетилен со висока густина (HDPE) во центарот и има жлеб за О-прстен за сместување на силиконскиот О-прстен што се користи за запечатување на медиумот под него. Тенка силициумска мембрана ја одделува комората за култура од плочата за одвојување. Силиконската мембрана е ласерски исечена од силиконски лист со дебелина од 0,02″ и има тврдост од 35A. Долните и горните силиконски дихтунзи се ласерски исечени од силиконски лист со дебелина од 1/16″ и имаат тврдост од 50A. За прицврстување на блокот и создавање херметичко запечатување се користат завртки и крилести навртки од не'рѓосувачки челик 316L.
Наменска печатена плочка (PCB) е дизајнирана да биде интегрирана со системот C-PACE-EM. Приклучоците за швајцарски машини на PCB се поврзани со графитни електроди преку посребрени бакарни жици и бронзени завртки 0-60 навртени во електродите. Печатената плочка е поставена во капакот на 3D печатачот.
Уредот CTCM е контролиран од програмабилен пневматски актуатор (PPD) кој создава контролиран циркулаторен притисок сличен на срцевиот циклус. Како што се зголемува притисокот во воздушната комора, флексибилната силиконска мембрана се шири нагоре, принудувајќи го медиумот под местото на ткивото. Површината на ткивото потоа ќе се растегне со ова исфрлање на течност, имитирајќи го физиолошкото ширење на срцето за време на дијастолата. На врвот на релаксација, електричната стимулација се применува преку графитни електроди, кои го намалуваат притисокот во воздушната комора и предизвикуваат контракција на деловите од ткивото. Внатре во цевката има хемостатски вентил со сензор за притисок за детектирање на притисокот во воздушниот систем. Притисокот што го детектира сензорот за притисок се применува на собирач на податоци поврзан со лаптопот. Ова овозможува континуирано следење на притисокот во гасната комора. Кога ќе се достигне максималниот притисок во комората (стандарден 80 mmHg, 140 mmHg OS), на уредот за собирање податоци му е наредено да испрати сигнал до системот C-PACE-EM за да генерира бифазен напонски сигнал за 2 ms, поставен на 4 V.
Беа добиени срцеви пресеци и условите за култура во 6 бунари беа извршени на следниов начин: Собраните срца од садот за пренос се префрлаат во послужавник што содржи ладна (4°C) кардиоплегија. Левата комора е изолирана со стерилно сечило и се сече на парчиња од 1-2 cm3. Овие ткивни блокови се прикачени на ткивни носачи со ткивно лепило и се ставаат во вибрирачка микротомска бања за ткиво што содржи Тиродов раствор и континуирано оксигенирана (3 g/L 2,3-бутандион монооксим (BDM), 140 mM NaCl (8,18 g). ), 6 mM KCl (0,447 g), 10 mM D-глукоза (1,86 g), 10 mM HEPES (2,38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M раствор), 1,8 mM CaCl2 (1,8 ml 1 M раствор), до 1 L ddH2O). Вибрирачкиот микротом беше поставен да сече парчиња со дебелина од 300 µm со фреквенција од 80 Hz, амплитуда на хоризонтални вибрации од 2 mm и брзина на движење од 0,03 mm/s. Ткивната бања беше опкружена со мраз за да се одржи растворот ладен, а температурата се одржуваше на 4°C. Префрлете ги ткивните делови од микротомската бања во инкубациска бања што содржи континуирано оксигениран раствор на Tyrode на мраз додека не се добијат доволно делови за една културна плоча. За трансвел култури, ткивните делови беа прикачени на стерилни полиуретански носачи со ширина од 6 mm и поставени во 6 ml оптимизиран медиум (199 медиум, 1x додаток ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-алкален и 2X антибиотик-антифунгален). Електрична стимулација (10 V, фреквенција 1,2 Hz) беше применета на ткивните делови преку C-Pace. За TD услови, свеж T3 и Dex беа додадени на 100 nM и 1 μM при секоја промена на медиумот. Медиумот се заситува со кислород пред замена 3 пати на ден. Пресеците од ткивото беа култивирани во инкубатор на 37°C и 5% CO2.
За CTCM културите, ткивните делови беа поставени на 3D печатач по нарачка во Петриева шолја што содржи модифициран раствор на Тирод. Уредот е дизајниран да ја зголеми големината на пресекот на срцето за 25% од површината на потпорниот прстен. Ова е направено за да не се растегнат деловите од срцето по префрлањето од растворот на Тирод во медиумот и за време на дијастолата. Користејќи хистоакрилен лепак, делови со дебелина од 300 µm беа фиксирани на потпорен прстен со дијаметар од 7 mm. Откако ќе ги прикачите деловите од ткивото на потпорниот прстен, отсечете го вишокот делови од ткивото и вратете ги прикачените делови од ткивото во бањата со раствор на Тирод на мраз (4°C) додека не се подготват доволно делови за еден уред. Вкупното време на обработка за сите уреди не треба да надминува 2 часа. Откако 6 делови од ткивото беа прикачени на нивните потпорни прстени, уредот CTCM беше склопен. Комората за култура CTCM е претходно наполнета со 21 ml претходно оксигениран медиум. Префрлете ги деловите од ткивото во комората за култура и внимателно отстранете ги сите воздушни меурчиња со пипета. Потоа, делот од ткивото се води во дупката и нежно се притиска на своето место. Конечно, ставете го капачето на електродата на уредот и префрлете го уредот во инкубаторот. Потоа поврзете го CTCM со воздушната цевка и системот C-PACE-EM. Пневматскиот актуатор се отвора и воздушниот вентил го отвора CTCM. Системот C-PACE-EM беше конфигуриран да испорачува 4 V на 1,2 Hz за време на бифазно пејсирање во тек на 2 ms. Медиумот се менуваше двапати на ден, а електродите се менуваа еднаш на ден за да се избегне акумулација на графит на електродите. Доколку е потребно, деловите од ткивото може да се отстранат од нивните бунари за култура за да се исфрлат сите воздушни меурчиња што можеби паднале под нив. За услови на третман со MT, T3/Dex беше додаден свеж со секоја промена на медиумот со 100 nM T3 и 1 μM Dex. CTCM уредите беа култивирани во инкубатор на 37°C и 5% CO2.
За да се добијат истегнати траектории на срцеви парчиња, развиен е посебен систем на камери. Користена е SLR камера (Canon Rebel T7i, Canon, Токио, Јапонија) со макро објектив Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, Сан Франциско, Калифорнија). Визуелизацијата е извршена на собна температура по замена на медиумот со свеж медиум. Камерата е позиционирана под агол од 51° и видеото се снима со 30 слики во секунда. Прво, софтвер со отворен код (MUSCLEMOTION43) е користен со Image-J за квантифицирање на движењето на срцевите парчиња. Маската е креирана со користење на MATLAB (MathWorks, Natick, MA, САД) за да се дефинираат региони од интерес за срцеви парчиња што чукаат за да се избегне шум. Рачно сегментираните маски се применуваат на сите слики во низа слики, а потоа се пренесуваат на приклучокот MUSCLEMOTION. Muscle Motion го користи просечниот интензитет на пикселите во секоја рамка за да го квантифицира неговото движење во однос на референтната рамка. Податоците се снимени, филтрирани и користени за квантифицирање на времето на циклусот и проценка на истегнувањето на ткивото за време на срцевиот циклус. Снименото видео беше дополнително обработено со помош на дигитален филтер од нулта фаза од прв ред. За да се квантифицира истегнувањето на ткивото (од врв до врв), беше извршена анализа од врв до врв за да се разликуваат врвовите и падовите во снимениот сигнал. Дополнително, отстранувањето на трендовите се врши со помош на полином од 6-ти ред за да се елиминира отстапувањето на сигналот. Програмскиот код беше развиен во MATLAB за да се одреди глобалното движење на ткивото, времето на циклусот, времето на релаксација и времето на контракција (Дополнителен програмски код 44).
За анализа на деформација, користејќи ги истите видеа креирани за проценка на механичко истегнување, прво ги следевме две слики што ги претставуваат врвовите на движење (највисоките (горни) и најниските (долни) точки на движење) според софтверот MUSCLEMOTION. Потоа ги сегментиравме регионите на ткивото и применивме еден вид алгоритам за сенчење на сегментираното ткиво (Дополнителна слика 2а). Сегментираното ткиво потоа беше поделено на десет подповршини, а напрегањето на секоја површина беше пресметано со помош на следната равенка: Деформација = (Sup-Sdown)/Sdown, каде што Sup и Sdown се растојанијата на обликот од горните и долните сенки на ткаенината, соодветно (Дополнителна слика 2б).
Срцевите пресеци беа фиксирани во 4% параформалдехид во тек на 48 часа. Фиксираните ткива беа дехидрирани во 10% и 20% сахароза во тек на 1 час, а потоа во 30% сахароза преку ноќ. Потоа пресеците беа вградени во соединение со оптимална температура на сечење (OCT соединение) и постепено замрзнати во бања со изопентан/сув мраз. Блоковите за вградени OCT се чуваат на -80 °C до одвојување. Слајдовите беа подготвени како пресеци со дебелина од 8 μm.
За да се отстрани OCT од срцевите пресеци, загрејте ги плочките на грејна единица на 95 °C во тек на 5 минути. Додадете 1 ml PBS на секое стакло и инкубирајте 30 минути на собна температура, потоа пробијте ги пресеците со поставување на 0,1% Triton-X во PBS во тек на 15 минути на собна температура. За да спречите врзување на неспецифични антитела за примерокот, додадете 1 ml 3% раствор на BSA на плочките и инкубирајте 1 час на собна температура. Потоа BSA беше отстранета, а плочките беа измиени со PBS. Означете го секој примерок со молив. Примарни антитела (разредени 1:200 во 1% BSA) (конексин 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) и тропонин-Т (Thermo Scientific; #MA5-12960) беа додадени во текот на 90 минути, потоа секундарни антитела (разредени 1:200 во 1% BSA) против глувчешки Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), против зајачки Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) дополнителни 90 минути. Измиени 3 пати со PBS. За да се разликува боењето на целта од позадината, го користевме само секундарното антитело како контрола. Конечно, додадено е DAPI нуклеарно боење и плочките беа поставени во vectashield (Vector Laboratories) и запечатени со лак за нокти. -x зголемување) и Keyence микроскоп со 40x зголемување.
За WGA боење беше употребен WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) во концентрација од 5 μg/ml во PBS и беше нанесен на фиксирани делови 30 минути на собна температура. Потоа, плочките беа измиени со PBS и на секое стакло беше додадено црно судан и инкубирано 30 минути. Потоа, плочките беа измиени со PBS и беше додаден медиум за вградување vectashield. Плочите беа визуелизирани на микроскоп Keyence со зголемување од 40x.
OCT беше отстранет од примероците како што е опишано погоре. По отстранувањето на OCT, плочките се потопуваат во растворот на Буин преку ноќ. Потоа плочките беа исплакнати со дестилирана вода 1 час, а потоа ставени во раствор од алое киселина фуксин од Бибрич 10 минути. Потоа плочките беа измиени со дестилирана вода и ставени во раствор од 5% фосфомолибден/5% фосфоволфрамска киселина 10 минути. Без плакнење, плочките беа префрлени директно во растворот од анилин сино 15 минути. Потоа плочките беа измиени со дестилирана вода и ставени во раствор од 1% оцетна киселина 2 минути. Плочите беа сушени во 200 N етанол и префрлени во ксилен. Обоените плочки беа визуелизирани со помош на микроскоп Keyence со 10x објектив. Процентот на површина на фиброза беше квантифициран со помош на софтверот Keyence Analyzer.
Тест за одржливост на клетките CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Карлсбад, Калифорнија), каталошки број V13154, според протоколот на производителот со некои модификации. Поточно, за да се обезбеди униформна големина на ткивото за време на анализата на MTT, користен е хируршки перфоратор со дијаметар од 6 mm. Ткивата се поединечно поставени во бунарите на плоча со 12 бунари што содржи MTT супстрат според протоколот на производителот. Секциите се инкубираат на 37°C 3 часа, а живото ткиво го метаболизира MTT супстратот за да формира соединение на виолетов формазан. Заменете го растворот на MTT со 1 ml DMSO и инкубирајте на 37°C 15 минути за да се екстрахира виолетовиот формазан од срцевите секции. Примероците се разредуваат 1:10 во DMSO во плочи со проѕирно дно од 96 бунари, а интензитетот на виолетовата боја е измерен на 570 nm со помош на читач на плочи со цитирање (BioTek). Отчитувањата се нормализирани на тежината на секој дел од срцето.
Медиумот за срцеви парчиња беше заменет со медиум што содржи 1 μCi/ml [5-3H]-глукоза (Moravek Biochemicals, Brea, CA, САД) за анализа на искористување на гликоза како што е претходно опишано. По 4 часа инкубација, додадете 100 µl медиум во отворена микроцентрифугална епрувета што содржи 100 µl 0,2 N HCl. Потоа, епруветата беше ставена во сцинтилациска епрувета што содржи 500 µl dH2O за да испари [3H]2O 72 часа на 37°C. Потоа извадете ја микроцентрифугалната епрувета од сцинтилациската епрувета и додадете 10 ml течност за сцинтилација. Броењето на сцинтилацијата беше извршено со помош на анализатор на течна сцинтилација Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, САД). Потоа беше пресметано искористувањето на гликозата земајќи ја предвид специфичната активност на [5-3H]-глукозата, нецелосната рамнотежа и позадината, разредувањето на [5-3H]-во необележана гликоза и ефикасноста на сцинтилациониот бројач. Податоците се нормализирани на масата на деловите од срцето.
По хомогенизацијата на ткивото во Trizol, РНК беше изолирана од срцеви пресеци со помош на Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 според протоколот на производителот. Подготовката на библиотеката RNAsec, секвенционирањето и анализата на податоците беа извршени на следниов начин:
1 μg РНК по примерок беше користен како почетен материјал за подготовка на РНК библиотеката. Библиотеките за секвенцирање беа генерирани со користење на комплетот за подготовка на РНК библиотеката NEBNext UltraTM за Illumina (NEB, САД) следејќи ги препораките на производителот, а индексните кодови беа додадени на атрибутните секвенци за секој примерок. Накратко, mRNA беше прочистена од вкупната РНК со користење на магнетни зрна прикачени со поли-Т олигонуклеотиди. Фрагментацијата се изведува со користење на двовалентни катјони на висока температура во NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). Првата нишка cDNA беше синтетизирана со користење на случајни хексамерни прајмери ​​и M-MuLV обратна транскриптаза (RNase H-). Втората нишка cDNA потоа се синтетизира со користење на ДНК полимераза I и RNase H. Останатите надвиснувања се претвораат во тапи краеви со активност на егзонуклеаза/полимераза. По аденилацијата на 3' крајот на ДНК фрагментот, на него е прикачен NEBNext адаптер со структура на јамка во форма на фиба за да се подготви за хибридизација. За селекција на фрагменти од cDNA со претпочитана должина од 150-200 bp, фрагментите од библиотеката беа прочистени со користење на системот AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, САД). Потоа, 3 μl USER Enzyme (NEB, САД) со cDNA избрана по големина лигирана со адаптер беа користени 15 минути на 37°C, а потоа 5 минути на 95°C пред PCR. PCR потоа беше извршена со користење на Phusion High-Fidelity DNA полимераза, универзални PCR прајмери ​​и Index (X) прајмери. Конечно, PCR производите беа прочистени (систем AMPure XP) и квалитетот на библиотеката беше оценет на систем Agilent Bioanalyzer 2100. Библиотеката со cDNA потоа беше секвенционирана со користење на секвенцер Novaseq. Суровите датотеки со слики од Illumina беа конвертирани во сурови читања со користење на CASAVA Base Calling. Суровите податоци се чуваат во датотеки во формат FASTQ(fq) што содржат секвенци за читање и соодветни квалитети на базите. Изберете HISAT2 за да ги усогласите филтрираните читања за секвенционирање со референтниот геном Sscrofa11.1. Општо земено, HISAT2 поддржува геноми од која било големина, вклучувајќи геноми поголеми од 4 милијарди бази, а стандардните вредности се поставени за повеќето параметри. Читањата за спојување од податоците за RNA Seq можат ефикасно да се усогласат со користење на HISAT2, најбрзиот систем што е моментално достапен, со иста или подобра точност од кој било друг метод.
Изобилството на транскрипти директно го одразува нивото на генска експресија. Нивоата на генска експресија се проценуваат според изобилството на транскрипти (број на секвенционирање) поврзани со геномот или екзоните. Бројот на читања е пропорционален на нивоата на генска експресија, должината на генот и длабочината на секвенционирање. FPKM (фрагменти на илјада базни парови од секвенционирани транскрипти на милион базни парови) беа пресметани и P-вредностите на диференцијалната експресија беа одредени со користење на пакетот DESeq2. Потоа ја пресметавме стапката на лажно откривање (FDR) за секоја P вредност користејќи го методот Бенџамини-Хохберг9 врз основа на вградената R-функција „p.adjust“.
РНК изолирана од срцеви пресеци беше конвертирана во кДНК со концентрација од 200 ng/μl користејќи го SuperScript IV Vilo Master mix од Thermo (Thermo, каталошки бр. 11756050). Квантитативната RT-PCR беше извршена со користење на Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-бунарска транспарентна реакциона плоча (Thermo, каталошки бр. 4483319) и микроамперски оптички лепак (Thermo, каталошки бр. 4311971). Реакционата смеса се состоеше од 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, каталошки бр. 4444557), 0,5 µl Taqman Primer и 3,5 µl H2O измешани по бунар. Беа извршени стандардни qPCR циклуси и CT вредностите беа измерени со користење на Applied Biosystems Quantstudio 5 PCR инструмент во реално време (модул од 384 бунари; производ бр. A28135). Прајмерите Taqman беа купени од Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). CT вредностите на сите примероци беа нормализирани на генот за одржување на квалитетот GAPDH.
Ослободувањето на NT-ProBNP од медиумот беше оценето со помош на комплетот NT-ProBNP (свиња) (кат. бр. MBS2086979, MyBioSource) според протоколот на производителот. Накратко, 250 µl од секој примерок и стандард беа додадени во дупликат во секоја бунарница. Веднаш по додавањето на примерокот, додадете 50 µl од реагенсот за анализа А во секоја бунарница. Нежно протресете ја плочата и затворете ја со средство за заптивање. Потоа таблетите беа инкубирани на 37°C во тек на 1 час. Потоа аспирирајте го растворот и измијте ги бунарите 4 пати со 350 µl од 1X раствор за перење, инкубирајќи го растворот за перење 1-2 минути секој пат. Потоа додадете 100 µl од реагенсот за анализа Б по бунарница и затворете ја со средство за заптивање на плочата. Таблетата беше нежно протресена и инкубирана на 37°C во тек на 30 минути. Аспирирајте го растворот и измијте ги бунарите 5 пати со 350 µl од 1X раствор за перење. Додадете 90 µl раствор на супстрат во секоја вдлабнатина и запечатете ја плочата. Инкубирајте ја плочата на 37°C 10-20 минути. Додадете 50 µl раствор за стопирање во секоја вдлабнатина. Плочата веднаш беше измерена со помош на читач на плочи Cytation (BioTek) поставен на 450 nm.
Беа извршени анализи на моќност за да се изберат големини на групи кои ќе обезбедат >80% моќност за откривање на апсолутна промена од 10% во параметарот со стапка на грешка од тип I од 5%. Беа извршени анализи на моќност за да се изберат големини на групите кои ќе обезбедат >80% моќност за откривање на апсолутна промена од 10% во параметарот со стапка на грешка од тип I од 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечатување >80% мощности за обнаружения 10% апсолютного изменения параметра со 5% частотой ошибок тип I. Анализата на моќноста беше извршена за да се изберат големини на групи што би обезбедиле >80% моќност за откривање на 10% апсолутна промена на параметарот со стапка на грешка од тип I од 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализа на мощности за выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности за обнаружения 10% апсолютного изменения параметри и 5% частоты ошибок тип I. Беше извршена анализа на моќноста за да се избере големина на групата што би обезбедила >80% моќност за откривање на 10% апсолутна промена на параметарот и 5% стапка на грешка од тип I.Пресеците од ткивото беа случајно избрани пред експериментот. Сите анализи беа слепи за состојбата, а примероците беа декодирани дури откако сите податоци беа анализирани. За извршување на сите статистички анализи беше користен софтверот GraphPad Prism (Сан Диего, Калифорнија). За сите статистики, p-вредностите се сметаа за значајни при вредности <0,05. За сите статистики, p-вредностите се сметаа за значајни при вредности <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. За сите статистики, p-вредностите се сметаа за значајни при вредности <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. За сите статистики, p-вредностите се сметаа за значајни при вредности <0,05.Двостраниот Студентов t-тест беше извршен врз податоците со само 2 споредби. Еднонасочна или двонасочна ANOVA беше користена за да се утврди значајноста помеѓу повеќе групи. При извршување на post hoc тестови, Тукиевата корекција беше применета за да се земат предвид повеќекратните споредби. Податоците од RNAsec имаат посебни статистички размислувања при пресметување на FDR и p.adjust како што е опишано во делот Методи.
За повеќе информации за дизајнот на студијата, видете го апстрактот од Nature Research Report поврзан со оваа статија.