Ви благодариме што ја посетивте Nature.com.Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS.За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го оневозможите режимот на компатибилност во Internet Explorer).Во меѓувреме, за да обезбедиме континуирана поддршка, ќе ја направиме страницата без стилови и JavaScript.
Постои потреба од сигурен систем ин витро кој може точно да ја репродуцира физиолошката средина на срцето за тестирање на лекови.Ограничената достапност на системи за култура на ткиво на човечко срце доведе до неточни толкувања на ефектите на срцевите лекови.Овде, развивме модел на култура на срцево ткиво (CTCM) кој електромеханички ги стимулира срцевите парчиња и се подложува на физиолошко истегнување во текот на систолната и дијастолната фаза на срцевиот циклус.По 12 дена култура, овој пристап делумно ја подобри одржливоста на срцевите делови, но не го зачува целосно нивниот структурен интегритет.Затоа, по скрининг на мали молекули, откривме дека додавањето на 100 nM тријодотиронин (T3) и 1 μM дексаметазон (Dex) во нашиот медиум ја одржува микроструктурата на деловите 12 дена.Во комбинација со третманот T3/Dex, системот CTCM ги одржуваше транскрипционите профили, одржливоста, метаболичката активност и структурниот интегритет на исто ниво како свежото срцево ткиво во текот на 12 дена.Дополнително, прекумерното истегнување на срцевото ткиво во културата индуцира хипертрофична срцева сигнализација, обезбедувајќи докази за способноста на CTCM да имитира хипертрофични состојби предизвикани од срцево истегнување.Како заклучок, CTCM може да ја моделира физиологијата и патофизиологијата на срцето во културата во долги временски периоди, овозможувајќи сигурен скрининг на лекови.
Пред клиничкото истражување, потребни се сигурни ин витро системи кои можат точно да го репродуцираат физиолошкото опкружување на човечкото срце.Таквите системи треба да имитираат изменето механичко истегнување, отчукувањата на срцето и електрофизиолошките својства.Животинските модели вообичаено се користат како скрининг платформа за срцева физиологија со ограничена доверливост во одразувањето на ефектите на лековите во човечкото срце1,2.На крајот на краиштата, Идеалниот експериментален модел на култура на срцеви ткива (CTCM) е модел кој е високо чувствителен и специфичен за различни терапевтски и фармаколошки интервенции, прецизно репродуцирајќи ја физиологијата и патофизиологијата на човечкото срце3.Отсуството на таков систем го ограничува откривањето на нови третмани за срцева слабост4,5 и доведе до кардиотоксичност на лекот како главна причина за излегување од пазарот6.
Во текот на изминатата деценија, осум некардиоваскуларни лекови беа повлечени од клиничка употреба бидејќи предизвикуваат продолжување на QT интервалот што доведува до вентрикуларни аритмии и ненадејна смрт7.Така, постои зголемена потреба за сигурни стратегии за претклинички скрининг за да се процени кардиоваскуларната ефикасност и токсичност.Неодамнешната употреба на човечки индуцирани плурипотентни кардиомиоцити добиени од матични клетки (hiPS-CM) во скрининг на лекови и тестирање на токсичност обезбедува делумно решение за овој проблем.Сепак, незрелата природа на hiPS-CM и недостатокот на повеќеклеточна сложеност на срцевото ткиво се главните ограничувања на овој метод.Неодамнешните студии покажаа дека ова ограничување може делумно да се надмине со користење на раниот hiPS-CM за да се формираат хидрогели на срцево ткиво кратко време по почетокот на спонтаните контракции и постепено зголемување на електричната стимулација со текот на времето.Сепак, овие микроткива на hiPS-CM немаат зрели електрофизиолошки и контрактилни својства на миокардот за возрасни.Покрај тоа, човечкото срцево ткиво има посложена структура, која се состои од хетерогена мешавина на различни типови на клетки, вклучувајќи ендотелијални клетки, неврони и стромални фибробласти, меѓусебно поврзани со специфични групи на протеини од екстрацелуларната матрица.Оваа хетерогеност на не-кардиомиоцитните популации11,12,13 во срцето на возрасен цицач е главна бариера за моделирање на срцево ткиво со користење на поединечни типови на клетки.Овие главни ограничувања ја нагласуваат важноста од развивање методи за култивирање на недопрено миокардно ткиво под физиолошки и патолошки услови.
Одгледани тенки (300 µm) делови од човечкото срце се покажаа како ветувачки модел на недопрен човечки миокард.Овој метод обезбедува пристап до целосен 3Д повеќеклеточен систем сличен на човечкото срцево ткиво.Сепак, до 2019 година, употребата на култивирани срцеви делови беше ограничена со краткото (24 часа) преживување на културата.Ова се должи на голем број фактори, вклучувајќи го недостатокот на физичко-механичко истегнување, интерфејсот воздух-течност и употребата на едноставни медиуми кои не ги поддржуваат потребите на срцевото ткиво.Во 2019 година, неколку истражувачки групи покажаа дека инкорпорирањето на механички фактори во системите за култура на срцево ткиво може да го продолжи животниот век на културата, да ја подобри срцевата експресија и да имитира срцева патологија.Две елегантни студии 17 и 18 покажуваат дека едноаксијалното механичко оптоварување има позитивен ефект врз срцевиот фенотип за време на културата.Сепак, овие студии не го користеа динамичкото тродимензионално физичко-механичко оптоварување на срцевиот циклус, бидејќи срцевите делови беа оптоварени или со изометриски сили на истегнување 17 или со линеарно авксотоничко оптоварување 18 .Овие методи на истегнување на ткиво резултираа со супресија на многу срцеви гени или прекумерна експресија на гени поврзани со абнормални одговори на истегнување.Имено, Питулис и сор.19 разви динамична бања за култура на парче срце за реконструкција на срцевиот циклус користејќи повратна информација од трансдуктор на сила и погони за напнатост.Иако овој систем овозможува попрецизно ин витро моделирање на срцевиот циклус, сложеноста и малата пропусност на методот ја ограничуваат примената на овој систем.Нашата лабораторија неодамна разви поедноставен систем на култура користејќи електрична стимулација и оптимизиран медиум за одржување на одржливоста на делови од свинско и човечко срце ткиво до 6 дена20,21.
Во тековниот ракопис, опишуваме модел на култура на срцево ткиво (CTCM) користејќи делови од свинско срце што вклучува хуморални знаци за рекапитулирање на тридимензионалната срцева физиологија и патофизиолошката дистензија за време на срцевиот циклус.Овој CTCM може да ја зголеми точноста на предклиничкото предвидување на лекот на ниво кое досега не било постигнато со обезбедување на рентабилен, среден кардијален систем кој ја имитира физиологијата/патофизиологијата на срцето на цицачите за предклиничко тестирање на лекови.
Хемодинамските механички сигнали играат клучна улога во одржувањето на функцијата на кардиомиоцитите in vitro 22,23,24.Во тековниот ракопис, развивме CTCM (слика 1а) што може да ја имитира срцевата средина за возрасни со поттикнување и електрична и механичка стимулација на физиолошки фреквенции (1,2 Hz, 72 отчукувања во минута).За да се избегне прекумерно истегнување на ткивото за време на дијастолата, користен е уред за 3D печатење за да се зголеми големината на ткивото за 25% (сл. 1б).Електричното темпо индуцирано од системот C-PACE беше темпирано да започне 100 ms пред систолата користејќи систем за собирање податоци за целосно репродуцирање на срцевиот циклус.Системот за култура на ткиво користи програмабилен пневматски активирач (LB Engineering, Германија) за циклично проширување на флексибилната силиконска мембрана за да предизвика проширување на срцевите парчиња во горната комора.Системот беше поврзан со надворешна воздушна линија преку трансдуктор на притисок, што овозможи прецизно прилагодување на притисокот (± 1 mmHg) и времето (± 1 ms) (сл. 1в).
a Прикачете го ткивниот дел на потпорниот прстен од 7 mm, прикажан во сино, внатре во комората за култура на уредот.Комората за култура е одвоена од воздушната комора со тенка флексибилна силиконска мембрана.Поставете заптивка помеѓу секоја комора за да спречите протекување.Капакот на уредот содржи графитни електроди кои обезбедуваат електрична стимулација.б Шематски приказ на уредот со големо ткиво, водилка и прстен за поддршка.Ткивните делови (кафеави) се поставуваат на преголемиот уред со водечкиот прстен поставен во жлебот на надворешниот раб на уредот.Користејќи го водичот, внимателно поставете го потпорниот прстен обложен со ткивно акрилно лепило над делот од срцевото ткиво.в График кој го прикажува времето на електрична стимулација како функција на притисокот во воздушната комора контролиран од програмабилен пневматски актуатор (PPD).Уред за стекнување податоци се користеше за синхронизирање на електрична стимулација со помош на сензори за притисок.Кога притисокот во комората за култура ќе го достигне зададениот праг, се испраќа импулсен сигнал до C-PACE-EM за да предизвика електрична стимулација.г Слика од четири CTCM поставени на полицата на инкубаторот.Четири уреди се поврзани со еден PPD преку пневматско коло, а сензорите за притисок се вметнуваат во хемостатичниот вентил за да се следи притисокот во пневматското коло.Секој уред содржи шест делови од ткиво.
Користејќи еден пневматски побудувач, можевме да контролираме 4 CTCM уреди, од кои секој можеше да собере 6 делови од ткиво (сл. 1г).Во CTCM, воздушниот притисок во воздушната комора се претвора во синхрон притисок во комората со течност и предизвикува физиолошко проширување на срцевиот дел (Слика 2а и Дополнителен филм 1).Евалуација на истегнување на ткивото на 80 mm Hg.чл.покажаа истегнување на ткивните делови за 25% (сл. 2б).Движењето на ткивото беше оценето со користење на сопствени поставки на камерата (Дополнителна слика 1).Амплитудата и брзината на движењето на ткивото (сл. 2в, г) одговараа на истегнување во текот на срцевиот циклус и времето за време на систолата и дијастолата (сл. 2б).Истегнувањето и брзината на срцевото ткиво за време на контракција и релаксација останаа константни 12 дена во културата (сл. 2f).За да го оцениме ефектот на електричната стимулација врз контрактилноста за време на културата, развивме метод за одредување на активен деформитет користејќи алгоритам за засенчување (Дополнителна слика 2а, б) и успеавме да направиме разлика помеѓу деформитети со и без електрична стимулација.Истиот дел од срцето (Сл. 2Ф).Во подвижниот регион на сечењето (R6-9), напонот за време на електричната стимулација беше 20% поголем отколку во отсуство на електрична стимулација, што укажува на придонесот на електричната стимулација во контрактилната функција.
Репрезентативните траги од притисокот во воздушната комора, притисокот во комората на течноста и мерењата на движењето на ткивото потврдуваат дека притисокот во комората го менува притисокот во комората на течноста, предизвикувајќи соодветно движење на ткивниот дел.б Репрезентативни траги од процентуално истегнување (сино) на ткивните делови што одговараат на проценти истегнување (портокалова).c Измереното движење на срцевиот дел е во согласност со измерената брзина на движење.(г) Репрезентативни траектории на циклично движење (сина линија) и брзина (портокалова испрекината линија) во парче од срцето.e Квантификација на времето на циклусот (n = 19 парчиња по група, од различни свињи), време на контракција (n = 19 парчиња по група), време на релаксација (n = 19 парчиња по група, од различни свињи), движење на ткивото (n = 25 ).парчиња)/група од различни свињи), врвна систолна брзина (n = 24(D0), 25(D12) парчиња/група од различни свињи) и врвна стапка на релаксација (n=24(D0), 25(D12) парчиња/група од различни свињи).Студентскиот t-тест со две опашки не покажа значајна разлика во ниту еден параметар.ѓ Репрезентативна анализа на истегнување траги од ткивни делови со (црвена) и без (сина) електрична стимулација, десет регионални области на ткивни делови од истиот дел.Долните панели ја покажуваат квантификацијата на процентуалната разлика во напрегањето во ткивните делови со и без електрична стимулација во десет области од различни делови. (n = 8 парчиња/група од различни свињи, се врши студентски t-тест со две опашки; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 парчиња/група од различни свињи, се врши студентски t-тест со две опашки; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу од разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 делови/група од различни свињи, студентски t-тест со две опашки; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001，**p <0.01，5p <0.01，5p （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0.0001，**p <0.01，5p <0.01，5p (n = 8 срезов/группу, од разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 секции/група, од различни свињи, студентски t-тест со две опашки; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Лентите за грешка ја претставуваат средната вредност ± стандардна девијација.
Во нашиот претходен статички биомиметички систем за култура на срцеви парчиња [20, 21], ја одржувавме одржливоста, функцијата и структурниот интегритет на срцевите парчиња 6 дена со примена на електрична стимулација и оптимизирање на составот на медиумот.Сепак, по 10 дена, овие бројки нагло се намалија.Ќе се осврнеме на пресеците култивирани во нашиот претходен систем за статичко биомиметичка култура 20, 21 контролни услови (Ctrl) и ќе го користиме нашиот претходно оптимизиран медиум како услови за MC и култура под истовремена механичка и електрична стимулација (CTCM).повикан .Прво, утврдивме дека механичката стимулација без електрична стимулација е недоволна за одржување на одржливоста на ткивото 6 дена (Дополнителна слика 3а,б).Интересно, со воведувањето на физио-механичка и електрична стимулација со помош на STCM, одржливоста на 12-дневните делови на срцето остана иста како и во свежите делови на срцето под услови на MS, но не и во услови на Ctrl, како што е прикажано со анализата на МТТ (сл. 1).3а).Ова сугерира дека механичката стимулација и симулација на срцевиот циклус може да ги одржи ткивните делови одржливи двапати подолго отколку што беше објавено во нашиот претходен систем за статичка култура.Сепак, проценката на структурниот интегритет на ткивните делови со имуноозначување на срцевиот тропонин Т и коннексин 43 покажа дека експресијата на коннексин 43 е значително повисока во MC ткивата на ден 12 отколку кај контролите истиот ден.Сепак, еднообразната експресија на коннексин 43 и формирањето на Z-диск не беа целосно одржувани (сл. 3б).Ние користиме рамка за вештачка интелигенција (АИ) за да го квантифицираме ткивниот структурен интегритет26, цевковод за длабоко учење базиран на слика базиран на боење на тропонин-Т и конексин43 за автоматско квантифицирање на структурниот интегритет и флуоресценцијата на срцевите парчиња во однос на јачината на локализацијата.Овој метод користи Конволуциона невронска мрежа (CNN) и рамка за длабоко учење за веродостојно квантифицирање на структурниот интегритет на срцевото ткиво на автоматизиран и непристрасен начин, како што е опишано во референцата.26. MC ткивото покажа подобрена структурна сличност со денот 0 во споредба со статичките контролни делови.Дополнително, Масоновото боење со трихром откри значително помал процент на фиброза под услови на МС во споредба со контролните услови на 12-тиот ден од културата (сл. 3в).Додека CTCM ја зголеми одржливоста на деловите на срцевото ткиво на ден 12 на ниво слично на она на свежото срцево ткиво, тоа не го подобри значително структурниот интегритет на срцевите делови.
Бар графиконот покажува квантификација на одржливоста на MTT на свежи парчиња срце (D0) или култура на срцеви парчиња за 12 дена или во статична култура (D12 Ctrl) или во CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) се изведуваат во еден правец: .0001 во споредба со D0 и **p <0.01 во споредба со D12 Ctrl). Бар графиконот покажува квантификација на одржливоста на МТТ на свежи парчиња срце (D0) или култура на срцеви парчиња за 12 дена или во статичка култура (D12 Ctrl) или во CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 MC, во еден правец се изведуваат тестови на еден начин. 0,0001 во споредба со D0 и **p < 0,01 во споредба со D12 Ctrl).хистограмот ја покажува квантификацијата на одржливоста на MTT свежи делови од срце (D0) или култура на срцеви делови за 12 дена или во статичка култура (контрола D12) или CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 контрола).####p < 0,0001 по сравнению со D0 и **p < 0,01 по сравнению со D12 Ctrl). ####p < 0,0001 во споредба со D0 и ** p < 0,01 во споредба со D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养 (D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏D12 MC养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向进行单向ANOVA 测0 001，与D12 Ctrl 相比，**p <0,01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏D0) 中新鲜心脏D0)的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相*)*)хистограм што ја покажува квантификацијата на одржливоста на MTT во свежи делови од срцето (D0) или срцеви делови култивирани 12 дена во статичка култура (контрола D12) или CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 контрола)), 12 (D12 MC) секции/група еднонасочни ANOVA тестови;####p < 0,0001 по сравнению со D0, **p < 0,01 по сравнению со D12 Ctrl). ####p < 0,0001 во споредба со D0, ** p < 0,01 во споредба со D12 Ctrl).б Тропонин-Т (зелено), коннексин 43 (црвено) и DAPI (сино) во свежо изолирани срцеви делови (D0) или срцеви делови култивирани под статички услови (Ctrl) или CTCM услови (MC) за 12 дена) на репрезентативни слики со имунофлуоресценција (празна скала = 100 µm). Извршена е квантификација на структурниот интегритет на срцевото ткиво со вештачка интелигенција (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) парчиња/група од различни свињи, еднонасочен ANOVA тест; ####p < 0,0001 во споредба со D0 и ****p <0,02 Ctr во споредба со D0. Квантификација на вештачката интелигенција на структурниот интегритет на срцевото ткиво (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) парчиња/група секоја од различни свињи, се врши еднонасочен ANOVA тест; ####p <0,0001 во споредба со D0 и ****p <0,02 Ctr. Количественная оценка структурной целности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп срезов/групп спрема разных свиней, проводится однофакторный, проводится однофакторный, проводится однофакторный, проводится однофакторный, проводится однофакторный D0 и ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). Квантификација на структурниот интегритет на срцевото ткиво со вештачка интелигенција (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) секции/групи од различни свињи, изведен еднонасочен ANOVA тест; ####p < 0,0001 наспроти со D0 и ****p <1 Ctrl споредено со D100).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) парчиња/група секоја од различни свињи, еднонасочен тест ANOVA.##00p. ，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односот ANOVA1, односот ANOVA1 внения ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). Вештачка интелигенција за квантифицирање на структурниот интегритет на срцевото ткиво (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) секции/група секоја од различни свињи, еднонасочен ANOVA тест; ####p<0,0001 vs .D0 За споредба ****p <1 Ctrl во споредба со D100). в Репрезентативни слики (лево) и квантификација (десно) за парчиња срце обоени со Масонова трихромна дамка (Скала гола = 500 µm) (n = 10 парчиња/група секоја од различни свињи, еднонасочен ANOVA тест е направен; ####p <0.0001 D. в Репрезентативни слики (лево) и квантификација (десно) за парчиња срце обоени со Масонова трихромна дамка (Скала голи = 500 µm) (n = 10 парчиња/група секоја од различни свињи, се врши еднонасочен ANOVA тест; #### стр <0,0001 D0001 во споредба со D1). в Репрезентативные изображения (слева) и количество оценка (справа) срезов на срце, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб однос без покрытия = 500 mkm) (n = 10 различни тестови/групи ; #### p < 0,0001 по сравнению со D0 и ***p < 0,001 по сравнению со D12 Ctrl). в Репрезентативни слики (лево) и квантификација (десно) на срцеви делови обоени со Масонова трихромна дамка (необложена скала = 500 µm) (n = 10 секции/група од различни свињи, изведен еднонасочен ANOVA тест; #### p <0 ,0001 во споредба со D0 и 10tr <1 C). в.切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### стр < 0,0001 与D0 相比Ｘ00p C. . C 用 Masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度 = 500 μm） （n = 10 个 切片 组 每 组 不同 猪 ， ， 进行 进行 单 单 向 向 向 向 向 向 测试 ； ； #### trl 相比。 в Репрезентативные изображения (слева) и количествен анализа (справа) сорезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/групипа, како кторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению со D12 Ctrl). в Репрезентативни слики (лево) и квантитација (десно) на срцеви делови обоени со Масонова трихромна дамка (празно = 500 µm) (n = 10 секции/група, секој од различна свиња, тестирана со еднонасочна анализа на варијансата;### # p <0.0001 ***p <1 D0, споредено со D0,).Лентите за грешка ја претставуваат средната вредност ± стандардна девијација.
Претпоставивме дека со додавање мали молекули во медиумот за култура, интегритетот на кардиомиоцитите може да се подобри и развојот на фиброзата да се намали за време на CTCM културата.Затоа, направивме скрининг за мали молекули користејќи ги нашите статички контролни култури20,21 поради малиот број на збунувачки фактори.Дексаметазон (Dex), тријодотиронин (T3) и SB431542 (SB) беа избрани за овој екран.Овие мали молекули претходно биле користени во културите на hiPSC-CM за да предизвикаат созревање на кардиомиоцитите со зголемување на должината на саркомерот, Т-тубулите и брзината на спроводливост.Дополнително, познато е дека и Dex (глукокортикоид) и SB го потиснуваат воспалението29,30.Затоа, тестиравме дали вклучувањето на една или комбинација од овие мали молекули ќе го подобри структурниот интегритет на срцевите делови.За првичен скрининг, дозата на секое соединение беше избрана врз основа на концентрациите кои вообичаено се користат во моделите на клеточна култура (1 μM Dex27, 100 nM T327 и 2,5 μM SB31).По 12 дена култура, комбинацијата на T3 и Dex резултираше со оптимален структурен интегритет на кардиомиоцитите и минимално фиброзно ремоделирање (Дополнителни слики 4 и 5).Дополнително, употребата на двојни или двојни овие концентрации на T3 и Dex предизвика штетни ефекти во споредба со нормалните концентрации (Дополнителна слика 6а,б).
По првичниот скрининг, извршивме споредба од глава до глава на 4 услови за култура (слика 4а): Ctrl: срцеви пресеци култивирани во нашата претходно опишана статичка култура со користење на нашиот оптимизиран медиум;20.21 TD: T3 и Ctrl s Додадени Dex во среда;MC: срцеви делови култивирани во CTCM користејќи го нашиот претходно оптимизиран медиум;и MT: CTCM со T3 и Dex додадени на медиумот.По 12 дена од одгледувањето, одржливоста на MS и MT ткивата остана иста како кај свежите ткива оценети со MTT анализа (сл. 4б).Интересно е што додавањето на T3 и Dex во културите на трансбулари (TD) не резултираше со значително подобрување на одржливоста во споредба со условите Ctrl, што укажува на важната улога на механичката стимулација во одржувањето на одржливоста на срцевите делови.
Експериментален дизајн дијаграм кој ги прикажува четирите услови за култура што се користат за евалуација на ефектите од механичката стимулација и дополнувањето на T3/Dex на медиумот за 12 дена. б Графиконот со шипки ја покажува квантификацијата на одржливоста 12 дена по културата во сите 4 услови на култура (Ctrl, TD, MC и MT) во споредба со свежите парчиња срце (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) се изведуваат различни тестови од ##pVA; 0,0001, ###p < 0,001 во споредба со D0 и **p <0,01 во споредба со D12 Ctrl). б Графиконот со шипки ја покажува квантификацијата на одржливоста 12 дена по културата во сите 4 услови на култура (Ctrl, TD, MC и MT) во споредба со свежите парчиња срце (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) се изведуваат различни тестови од ##pVA; 0,0001, ###p < 0,001 во споредба со D0 и **p <0,01 во споредба со D12 ctrl). б Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дена после култирање во сите 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами (D18,D1) (D18trD1) (D18trD1) D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односоронний тест ANOVA; б Графиконот со шипки ја прикажува квантификацијата на одржливоста на 12 дена по културата во сите 4 услови на култура (контрола, TD, MC и MT) во споредба со свежи пресеци на срцето (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC во еден правец) од различни секции/#0. 001, ###p < 0,001 наспроти D0 и ** p < 0,01 од споредено со D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18D 、21tr (D0) (n = 18 (D5) D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，#0##p < 0.0001，#0##p 1 0,01 与D12控制）.b 4 12 (D12 MC) б Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD2 MT2 и D12) группа, односторонний тест ANOVA;####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению со D0, **p <0,01 по сравнению со контролем D12). б. 0, ** p<0,01 наспроти контрола D12). c Бар графиконот ја покажува квантификацијата на флуксот на гликоза 12 дена по културата во сите 4 услови на култура (Ctrl, TD, MC и MT) во споредба со свежите парчиња срце (D0) (n = 6 парчиња/група од различни свињи, направен е еднонасочен ANOVA тест; ###p < 0.000 и 1 tr < 0,001 C, споредено со 1). c Бар графиконот ја покажува квантификацијата на флуксот на гликоза 12 дена по културата во сите 4 услови на култура (Ctrl, TD, MC и MT) во споредба со свежите парчиња срце (D0) (n = 6 парчиња/група од различни свињи, направен е еднонасочен ANOVA тест; ###p < 0.000 и 1 tr < 0,001 C, споредено со 1). c Гистограмма свиривает количественную оценку потока глюкозы через 12 дена после култивирования во сите 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежината среза (6 резами) й, односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению со D0 и ***p < 0,001 по сравнению со D12 Ctrl). c. c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0)相椹2，糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，严10p 0D0. јас сум. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дена после култирање на сите 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнење (6) со сравнење (6) от разных свиней, односоронний Были проведены тесты ANOVA; c.г Парцели за анализа на истегнување на свежи (сини), ден 12 MC (зелени) и 12 ден MT (црвени) ткива на десет регионални точки на ткивен пресек (n = 4 парчиња/група, еднонасочен ANOVA тест; немаше значајна разлика помеѓу групите).д Вулкански график кој покажува диференцијално изразени гени во свежи делови од срцето (D0) во споредба со срцеви делови култивирани под статички услови (Ctrl) или под MT услови (MT) за 10-12 дена.F топлината на гените на саркомер за срцеви делови култивирани под секоја од условите на културата.Лентите за грешки претставуваат средно ± стандардно отстапување.
Метаболичката зависност од прекинувачот од оксидацијата на масни киселини во гликолизата е белег на кардиомиоцитите деференцијација.Незрелите кардиомиоцити првенствено користат гликоза за производство на АТП и имаат хипопластична митохондрија со неколку Cristae5,32.Анализите за искористување на гликозата покажаа дека под услови на МЦ и МТ, користењето на гликоза беше слично на онаа во ткивата на денот 0 (Слика 4С).Сепак, примероците CTRL покажаа значително зголемување на користењето на гликозата во споредба со свежото ткиво.Ова укажува дека комбинацијата на CTCM и T3/Dex ја подобрува одржливоста на ткивото и го зачувува метаболичкиот фенотип на 12-дневните култивирани срцеви делови.Дополнително, анализата на соеви покажа дека нивоата на сој останаа исти како во свежото срцево ткиво 12 дена под услови на МТ и МС (сл. 4г).
За да го анализираме целокупното влијание на CTCM и T3/Dex врз глобалниот транскрипциски пејзаж на ткивото на срцеви парчиња, извршивме RNAseq на срцеви парчиња од сите четири различни услови на култура (Дополнителни податоци 1).Интересно, MT секциите покажаа висока транскрипциона сличност со свежото срцево ткиво, со само 16 диференцијално изразени од 13.642 гени.Како и да е, како што покажавме порано, парчињата CTRL прикажаа 1229 различно изразени гени по 10-12 дена во културата (Сл. 4Е).Овие податоци беа потврдени со QRT-PCR на гените на срцето и фибробласт (Дополнителен Сл. 7А-Ц).Интересно, секциите Ctrl покажаа надолна регулација на гените на срцевиот и клеточниот циклус и активирање на програмите за воспалителни гени.Овие податоци покажуваат дека со комбинација на механичка и хуморална стимулација (T3/Dex), транскриптомот на срцевиот дел може да остане сличен на свежите парчиња срце по 12 дена во културата.
Овие транскрипциски наоди се поддржани од фактот дека структурниот интегритет на кардиомиоцитите во пресеците на срцето е најдобро зачуван во услови на МТ 12 дена, како што е прикажано со недопрениот и локализиран коннексин 43 (сл. 5а).Дополнително, фиброзата во пресеците на срцето под услови на МТ беше значително намалена во споредба со Ctrl и слично на свежите делови на срцето (сл. 5б).Овие податоци покажуваат дека комбинацијата на механичка стимулација и третман со T3/Dex ефикасно ја зачувува срцевата структура во срцевите делови во културата.
а Репрезентативни слики на имунофлуоресценција на тропонин-Т (зелено), коннексин 43 (црвено) и DAPI (сино) во свежо изолирани срцеви делови (D0) или култивирани 12 дена во сите четири услови на култура на срцеви секции (бар на скала = 100 µm).). Квантификација на вештачка интелигенција на структурниот интегритет на срцевото ткиво (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) парчиња/група од различни свињи, еднонасочен ANOVA тест; л). Квантификација на вештачка интелигенција на структурниот интегритет на срцевото ткиво (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) парчиња/група од различни свињи, еднонасочен ANOVA тест; л). Количестваная Олкнка Стркктклноќ Mc ji d12 mt) sreзоов/grupppu ot roзnых сверной, provedеn ondnonofktornый tasth tastt anova; #### p <0,0001 p <0,0001 Pop ° Csravnю cravnеniю c d12 ctrl). Квантификација на структурниот интегритет на ткивото на срцето со користење на вештачка интелигенција (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) секции/група од различни свињи, изведен еднонасочен ANOVA тест; #### p < 0,0001 во споредба со D0 и *p 0 tr <00p.对 不同 猪 的 心脏 组织 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） 、 5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 切片 切片/组） 进行 智能量 化 ， ， 进行 进行 单向 单向 单向 单向 单向 ； #### p <0.0001 与 d0 和*p0 和*p <0,05与 D12 Ctrl 相比。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 (d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mＥ2 mc智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### стр < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 缛 0 tr相比）.Квантификација на структурниот интегритет на срцевото ткиво со користење на вештачка интелигенција кај различни свињи (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) секции/група) со еднонасочен ANOVA тест;#### P <0,0001 По Сравниению С Д0 и*П <0,05 Или **** П <0,0001 по Сравниению С Д12 ЦТР). #### P <0.0001 во споредба со D0 и*P <0,05 или **** P <0.0001 во споредба со D12 Ctrl). Б репрезентативни слики и квантификација за срцеви парчиња обоени со трихроматска дамка на Масон (скала лента = 500 мм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) парчиња/група од различни свињи, се изведува еднонасочен тест АНОВА; ed до D12 Ctrl). Б репрезентативни слики и квантификација за срцеви парчиња обоени со трихроматска дамка на Масон (скала лента = 500 мм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) парчиња/група од различни свињи, се изведува еднонасочен тест АНОВА; ed до D12 Ctrl). б Репрезентативные изображения и количествена оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 резпу MTD) и D12 TD ых свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 μm）10（1D10D = 500 μm）10D1D0和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析； <1####p 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）. б 用 масон 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化l 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切燉 切燉 切燉 切燉片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分方差分方差分方差分析01. ***p < 0,001，或****p <0,0001 与D12 Ctrl 相比）. б Репрезентативные свирење изображения и количествена оценка срезов сердца, окрашенных трихром Масона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 TD и D12 MC) , один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению со D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению со D12 Ctrl). б Репрезентативни слики и квантификација на пресеците на срцето обоени со Масоновиот трихром (бар на скала = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) секции од различни свињи/група, еден ANOVA метод; во споредба со <0#0#0. ****p < 0,0001 во споредба со D12 Ctrl).Лентите за грешка ја претставуваат средната вредност ± стандардна девијација.
Конечно, способноста на CTCM да имитира срцева хипертрофија беше проценета со зголемување на истегнувањето на срцевото ткиво.Во CTCM, максималниот притисок во воздушната комора се зголеми од 80 mmHg на 80 mmHg.чл.(Нормално истегнување) До 140 ммхг уметност.(Сл. 6а).Ова одговара на 32% зголемување на истегнувањето (сл. 6б), кое претходно беше прикажано како соодветен процентуален истегнување потребен за срцевите делови за да се постигне должина на саркомер слична на онаа што се гледа во хипертрофија.Истегнувањето и брзината на срцевото ткиво за време на контракција и релаксација останаа константни во текот на шест дена од културата (сл. 6в).Срцевото ткиво од условите на МТ беше подложено на нормално истегнување (MT (Нормално)) или услови на прекумерно истегнување (MT (OS)) шест дена.Веќе по четири дена во културата, хипертрофичниот биомаркер NT-ProBNP беше значително покачен во медиумот под MT (OS) услови во споредба со MT (нормални) услови (сл. 7а).Дополнително, по шест дена одгледување, големината на клетките во МТ (ОС) (сл. 7б) значително се зголеми во споредба со деловите на МТ срцето (нормално).Дополнително, нуклеарната транслокација на NFATC4 беше значително зголемена во претерано истегнати ткива (сл. 7в).
Репрезентативните траги од притисокот во воздушната комора, притисокот во комората на течноста и мерењата на движењето на ткивото потврдуваат дека притисокот во комората го менува притисокот во комората на течноста, предизвикувајќи соодветно движење на ткивниот дел.б Репрезентативни кривини на процентот на истегнување и стапката на истегнување за нормално истегнати (портокалови) и претерано растегнати (сини) делови од ткиво.Лентите за грешка ја претставуваат средната вредност ± стандардна девијација.
Квантитативен хистограм на концентрацијата на NT-ProBNP во културен медиум од срцеви парчиња култивирани во услови на нормално MT растегнување (норма) или прекумерно истегнување (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm и D4). MTOS) парчиња /група од различни свињи изведена варијанса**p < 0,01 по сравнению со нормальным растяжением). ** P <0,01 во споредба со нормалното истегнување). a 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分分，p <0,01）. Квантификација на концентрацијата на NT-ProBNP во срцеви парчиња култивирани под MT нормално растегнување (Норма) или прекумерно истегнување (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) од различни动; **во споредба со нормално истегнување, p <0,01).хистограм Квантификација на концентрациите на NT-ProBNP во парчиња срце култивирани во услови на нормално истегнување на МТ (норма) или прекумерно истегнување (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) и D4 MTOS) парчиња/група од различни свињи, двонасочна анализа на варијанса;**p < 0,01 по сравнению со нормальным растяжением). ** P <0,01 во споредба со нормалното истегнување). б Репрезентативни слики за парчиња срце обоени со тропонин-T и WGA (лево) и квантификација на големината на клетката (десно) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клетки/група од 10 различни парчиња од различни свињи, се изведува студентски t-тест со две опашки 1 во споредба со нормалното; б Репрезентативни слики за парчиња срце обоени со тропонин-T и WGA (лево) и квантификација на големината на клетката (десно) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клетки/група од 10 различни парчиња од различни свињи. б Репрезентативни слики на пресеци на срцето обоени со тропонин-T и AZP (лево) и квантификација на големината на клетките (десно) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клетки/група од 10 различни секции од различни свињи, студентски т-тест со две опашки беше направен во споредба со 000p. b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表n =3 ），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学甸t比，****p <0,0001）. б Репрезентативни слики на парчиња срце обоени со калкареин-T и WGA (лево) и големина на ќелија (десно) (n = 330 (D6 MTOS), 369 од 10 различни парчиња (D6 MTNorm)) Клетки/组，两方法有得0,0001). б Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm различен) из10 , двусторонние критерий Стьюдента;****p < 0,0001 по сравнению со нормальным растяжением). б Репрезентативни слики на срцеви делови обоени со тропонин-T и AZP (лево) и квантификација на големината на клетката (десно) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) од 10 различни делови од различни свињи) Клетки/група, критериум со две опашки Студентски t;****p < 0,0001 во споредба со нормалното напрегање). в Репрезентативни слики за ден 0 и 6 ден MTOS парчиња срце имуно означени за тропонин-T и NFATC4 и квантификација на транслокацијата на NFATC4 во јадрата на CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) парчиња/група од различни свињи, се врши Двоопашена студентска т.5. в Репрезентативни слики за ден 0 и 6 ден MTOS парчиња срце имуно означени за тропонин-T и NFATC4 и квантификација на транслокацијата на NFATC4 во јадрата на CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) парчиња/група од различни свињи, изведена е две-опашка. * p < 0,05). C 用 于 肌钙 蛋白 -t 和 nfatc4 免疫 标记 的 第 0 天 和 第 6 天 mtos 心脏 切片 的 代表性 图像 ， 以及 来自 不同 的 的 nfatc4 易位 至 cm 细胞 核 核 的 的 （（n = 4 (d0) 、 3 (d6 mtos) 检验 检验 组 组。 c Репрезентативни слики на имуноозначување на калканин-Т и NFATC4 第0天和第6天MTOS срцеви парчиња и NFATC4 од различно јадро на NFATC4 易位至CM клеточно јадро的количина化 (n = 4 (D6MTOS),间双尾学生et 电影；*p <0,05). в Репрезентативные изображения сорезов сердца MTOS на 0 и 6 ден за иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и количественная оценка транслокации NFATC4 во ядра CM от разных свипај (n = 3 (Dрез-МТ) двапати, -критерий Стьюдента; *p < 0,05). в Репрезентативни слики на MTOS срцеви парчиња на ден 0 и 6 за имуноозначување на тропонин-T и NFATC4 и квантификација на транслокација на NFATC4 во јадрото на CM од различни свињи (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) парчиња/група, со две опашки <0'0;Лентите за грешка претставуваат средна ± стандардна девијација.
Преводните кардиоваскуларни истражувања бараат клеточни модели кои прецизно ја репродуцираат срцевата средина.Во оваа студија, беше развиен и карактеризиран уред CTCM кој може да стимулира ултратенки делови на срцето.Системот CTCM вклучува физиолошки синхронизирана електромеханичка стимулација и збогатување на течности T3 и DEX.Кога деловите од свинско срце беа изложени на овие фактори, нивната одржливост, структурен интегритет, метаболичка активност и транскрипциската експресија останаа исти како кај свежото срцево ткиво по 12 дена од културата.Покрај тоа, прекумерното истегнување на срцевото ткиво може да предизвика хипертрофија на срцето предизвикана од хиперекстензија.Генерално, овие резултати ја поддржуваат критичната улога на условите за физиолошка култура во одржувањето на нормален срцев фенотип и обезбедуваат платформа за скрининг на лекови.
Многу фактори придонесуваат за создавање оптимална средина за функционирање и опстанок на кардиомиоцитите.Најочигледните од овие фактори се поврзани со (1) меѓуклеточни интеракции, (2) електромеханичка стимулација, (3) хуморални фактори и (4) метаболички супстрати.Физиолошките интеракции клетка до клетка бараат сложени тридимензионални мрежи од повеќе типови на клетки поддржани од екстрацелуларна матрица.Ваквите сложени клеточни интеракции тешко се реконструираат ин витро со ко-култура на поединечни типови на клетки, но може лесно да се постигнат со користење на органотипната природа на срцевите делови.
Механичкото истегнување и електричната стимулација на кардиомиоцитите се клучни за одржување на срцевиот фенотип33,34,35.Додека механичката стимулација е широко користена за климатизација и созревање на hiPSC-CM, неколку елегантни студии неодамна се обидоа со механичка стимулација на срцеви парчиња во културата користејќи едноаксијално оптоварување.Овие студии покажуваат дека 2D едноаксијалното механичко оптоварување има позитивен ефект врз фенотипот на срцето за време на културата.Во овие студии, деловите на срцето биле или оптоварени со изометриски затегнувачки сили17, линеарно авксотонично оптоварување18 или срцевиот циклус бил пресоздаден со помош на повратни информации од трансдуцерот на сила и погони за напнатост.Сепак, овие методи користат едноаксијално истегнување на ткивото без оптимизација на животната средина, што резултира со супресија на многу срцеви гени или прекумерна експресија на гени поврзани со абнормални одговори на истегнување.CTCM опишан овде обезбедува 3D електромеханички стимул кој го имитира природниот срцев циклус во однос на времетраењето на циклусот и физиолошкото истегнување (25% истегнување, 40% систола, 60% дијастола и 72 отчукувања во минута).Иако оваа тридимензионална механичка стимулација сама по себе не е доволна за одржување на интегритетот на ткивото, потребна е комбинација од хуморална и механичка стимулација со користење на T3/Dex за адекватно одржување на одржливоста, функцијата и интегритетот на ткивото.
Хуморалните фактори играат важна улога во модулирањето на фенотипот на срцето кај возрасните.Ова беше истакнато во студиите за колкови-CM во кои T3 и DEX беа додадени во медиумите за култура за да се забрза созревањето на клетките.Т3 може да влијае на транспортот на амино киселини, шеќери и калциум преку клеточните мембрани36.Дополнително, Т3 промовира изразување на MHC-α и надолна регулација на MHC-β, промовирајќи го формирањето на миофибрили со брзо грчење кај зрелите кардиомиоцити во споредба со бавните миофибрили кај феталниот CM.Недостатокот на Т3 кај пациенти со хипотироид резултира со губење на миофибриларните ленти и намалена стапка на развој на тонот37.Декс делува на рецепторите на гликокортикоиди и се покажа дека ја зголемува контрактилноста на миокардот во изолирани перфузирани срца;38 се смета дека ова подобрување е поврзано со ефектот врз влезот воден од депозитите на калциум (SOCE) 39,40.Покрај тоа, Dex се врзува за неговите рецептори, предизвикувајќи широк интрацелуларен одговор кој ја потиснува имунолошката функција и воспалението30.
Нашите резултати покажуваат дека физичката механичка стимулација (MS) ја подобрила севкупната изведба на културата во споредба со Ctrl, но не успеала да ја одржи одржливоста, структурниот интегритет и срцевата експресија во текот на 12 дена во културата.Во споредба со Ctrl, додавањето на T3 и Dex во CTCM (MT) културите ја подобри одржливоста и одржуваше слични профили на транскрипција, структурен интегритет и метаболичка активност со свежо срцево ткиво за 12 дена.Дополнително, со контролирање на степенот на истегнување на ткивото, беше создаден модел на срцева хипертрофија индуцирана од хиперекстензија користејќи STCM, што ја илустрира разновидноста на системот STCM.Треба да се забележи дека иако срцевиот ремоделирање и фиброза обично вклучуваат недопрени органи чии циркулирачки клетки можат да ги обезбедат соодветните цитокини, како и фагоцитозата и другите фактори на ремоделирање, делови од срцето сепак можат да го имитираат фиброзниот процес како одговор на стресот и траумата.во миофибробластите.Ова е претходно оценето во овој модел на срцеви парчиња.Треба да се забележи дека параметрите на CTCM може да се модулираат со промена на притисокот/електричната амплитуда и фреквенцијата за да се симулираат многу состојби како што се тахикардија, брадикардија и механичка циркулаторна поддршка (механичко неоптоварено срце).Ова го прави системот средна пропусност за тестирање на лекови.Способноста на CTCM да ја моделира срцевата хипертрофија предизвикана од прекумерен напор го отвора патот за тестирање на овој систем за персонализирана терапија.
Иако податоците презентирани овде сугерираат дека CTCM е многу ветувачка платформа за моделирање на недопрениот миокард, овој метод на култура има некои ограничувања.Главното ограничување на CTCM културата е тоа што наметнува континуирани динамични механички стресови на парчињата, што ја исклучува можноста за активно следење на контракциите на срцевите парчиња за време на секој циклус.Дополнително, поради малата големина на срцевите делови (7 mm), способноста за проценка на систолната функција надвор од културните системи со користење на традиционални сензори за сила е ограничена.Во тековниот ракопис, ние делумно го надминуваме ова ограничување со евалуација на оптичкиот напон како индикатор за контрактилната функција.Сепак, ова ограничување ќе бара понатамошна работа и може да се реши во иднина со воведување методи за оптичко следење на функцијата на срцевите парчиња во културата, како што е оптичко мапирање со користење на калциум и напонски чувствителни бои.Друго ограничување на CTCM е дека работниот модел не манипулира со физиолошкиот стрес (преоптоварување и преоптоварување).Во CTCM, притисокот беше индуциран во спротивни насоки за да се репродуцира 25% физиолошко истегнување во дијастола (целосно истегнување) и систола (должина на контракција за време на електрична стимулација) во многу големи ткива.Ова ограничување треба да се отстрани во идните дизајни на CTCM со соодветен притисок врз срцевото ткиво од двете страни и со примена на точните односи притисок-волумен што се јавуваат во коморите на срцето.
Ремоделирањето предизвикано од прекумерно истегнување, објавено во овој ракопис, е ограничено на имитирање на хипертрофични хиперрастечни сигнали.Така, овој модел може да помогне во проучувањето на хипертрофичната сигнализација предизвикана од истегнување без потреба од хуморални или нервни фактори (кои не постојат во овој систем).Потребни се дополнителни студии за да се зголеми мноштвото на CTCM, на пример, ко-култивирање со имуните клетки, циркулирачките хуморални фактори на плазмата и инервација при ко-култивирање со невронски клетки ќе ги подобрат можностите за моделирање на болеста со CTCM.
Во оваа студија се користеле тринаесет свињи.Сите процедури за животни беа извршени во согласност со институционалните упатства и беа одобрени од Комитетот за институционална нега и употреба на животните на Универзитетот во Луисвил.Аортниот лак беше прицврстен и срцето беше перфузирано со 1 L стерилна кардиоплегија (110 mM NaCl, 1,2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL хепарин, pH до 7); срцата беа конзервирани во ледено ладен кардиоплегичен раствор се додека не се транспортираат во лабораторија на мраз кој обично е <10 мин. срцата беа конзервирани во ледено ладен кардиоплегичен раствор се додека не се транспортираат во лабораторија на мраз кој обично е <10 мин. Сердца хранили во ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки во лабораториите на льду, што обычно занимает <10 мин. срцата беа складирани во ладен кардиоплегичен раствор до транспортот до лабораторијата на мраз, што обично трае <10 мин.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钞将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钞 Держите сердца во ледяной кардиоплегии до транспортировки во лабораториите на льду, обычно <10 мин. Чувајте ги срцата на ледена кардиоплегија до транспортот во лабораторија на мраз, обично <10 мин.
Уредот CTCM е развиен во софтверот SolidWorks компјутерски потпомогнат дизајн (CAD).Коморите за култура, разделувачите и воздушните комори се направени од CNC проѕирна акрилна пластика.Тенка силика мембрана ја одделува комората за култура од сепарациската плоча.Силиконската мембрана е ласерски исечена од силиконски лим со дебелина од 0,02″ и има цврстина од 35А.Долните и горните силиконски дихтунзи се ласерски исечени од силиконски лим со дебелина од 1/16 инчи и имаат цврстина од 50 А.За прицврстување на блокот и создавање херметички заптивка се користат завртки од не'рѓосувачки челик од 316L и навртки за крила.
Наменската плоча за печатено коло (PCB) е дизајнирана да се интегрира со системот C-PACE-EM.Приклучоците за конектори на швајцарската машина на ПХБ се поврзани со графитни електроди со сребрени бакарни жици и бронзени завртки 0-60 зашрафени во електродите.Печатеното коло се става во капакот на 3D печатачот.
Уредот CTCM се контролира со програмабилен пневматски побудувач (PPD) кој создава контролиран циркулаторен притисок сличен на срцевиот циклус.Како што се зголемува притисокот во воздушната комора, флексибилната силиконска мембрана се шири нагоре, принудувајќи го медиумот под местото на ткивото.Областа на ткивото потоа ќе се протега со ова исфрлање на течност, имитирајќи го физиолошкото проширување на срцето за време на дијастолата.На врвот на релаксација, електричната стимулација беше применета преку графитни електроди, кои го намалија притисокот во воздушната комора и предизвикаа контракција на ткивните делови.Внатре во цевката има хемостатски вентил со сензор за притисок за откривање на притисокот во системот за воздух.Притисокот што го чувствува сензорот за притисок се применува на собирач на податоци поврзан со лаптопот.Ова овозможува континуирано следење на притисокот во комората за гас.Кога беше постигнат максималниот притисок во комората (стандарден 80 mmHg, 140 mmHg ОС), на уредот за собирање податоци му беше наредено да испрати сигнал до системот C-PACE-EM за да генерира двофазен напонски сигнал за 2 ms, поставен на 4 V.
Добиени се срцеви пресеци и условите за култура во 6 бунари беа изведени на следниов начин: Префрлете ги собраните срца од садот за пренос во послужавник што содржи ладна (4°C) кардиоплегија.Левата комора беше изолирана со стерилно сечило и исечена на парчиња од 1-2 cm3.Вибрирачкиот микротом беше поставен да сече парчиња со дебелина од 300 µm на фреквенција од 80 Hz, хоризонтална амплитуда на вибрации од 2 mm и брзина на напредување од 0,03 mm/s.Ткивната бања беше опкружена со мраз за да се задржи растворот ладен и температурата се одржуваше на 4°C.Пренесете ги ткивните делови од бањата со микротом во бања за инкубација која содржи континуирано оксигениран раствор на Тирод на мраз додека не се добијат доволно делови за една културна плоча.За трансбунарски култури, ткивните делови беа прикачени на стерилни полиуретански носачи со ширина од 6 mm и беа ставени во 6 ml оптимизиран медиум (199 медиум, 1x ITS додаток, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-алкален и 2X антибиотик-антифунгални).Електрична стимулација (10 V, фреквенција 1,2 Hz) беше применета на ткивните делови преку C-Pace.За TD услови, свежи T3 и Dex беа додадени на 100 nM и 1 μM при секоја промена на медиумот.Медиумот е заситен со кислород пред замена 3 пати на ден.Ткивните делови беа култивирани во инкубатор на 37°C и 5% CO2.
За CTCM културите, ткивните делови беа поставени на 3D печатач направен по нарачка во петриева чинија што содржи модифициран раствор на Tyrode.Уредот е дизајниран да ја зголеми големината на парчето на срцето за 25% од областа на прстенот за поддршка.Ова е направено така што деловите на срцето не се протегаат откако ќе бидат префрлени од растворот на Тирод во медиумот и за време на дијастолата.Користејќи хистоакрилен лепак, деловите со дебелина од 300 µm беа фиксирани на потпорен прстен со дијаметар од 7 mm.Откако ќе ги закачите деловите од ткивото на потпорниот прстен, отсечете ги вишокот делови од ткивото и ставете ги закачените делови од ткивото назад во бањата со раствор од Tyrode на мраз (4°C) додека не се подготват доволно делови за еден уред.Вкупното време на обработка за сите уреди не треба да надминува 2 часа.Откако 6 делови од ткиво беа прикачени на нивните потпорни прстени, уредот CTCM беше склопен.Комората за култура CTCM е претходно наполнета со 21 ml претходно оксигенирана средина.Префрлете ги ткивните делови во комората за култура и внимателно отстранете ги воздушните меури со пипета.Потоа, делот од ткивото се воведува во дупката и нежно се притиска на своето место.На крајот, ставете го капачето на електродата на уредот и префрлете го уредот во инкубаторот.Потоа поврзете го CTCM со воздушната цевка и системот C-PACE-EM.Пневматскиот погон се отвора и вентилот за воздух го отвора CTCM.Системот C-PACE-EM беше конфигуриран да дава 4 V на 1,2 Hz за време на двофазно темпо од 2 ms.Медиумот се менуваше два пати на ден, а електродите се менуваа еднаш дневно за да се избегне акумулација на графит на електродите.Доколку е потребно, делови од ткиво може да се отстранат од нивните културни бунари за да се исфрлат сите воздушни меури што можеби паднале под нив.За услови на третман на МТ, T3/DEX беше додаден свежо со секоја средна промена со 100 nm T3 и 1 μM DEX.Уредите CTCM беа култивирани во инкубатор на 37°C и 5% CO2.
За да се добијат истегнати траектории на парчиња срце, беше развиен специјален систем за камера.Се користеше SLR фотоапарат (Canon Rebel T7i, Canon, Токио, Јапонија) со макро објектив Navitar Zoom 7000 18-108 mm (Navitar, Сан Франциско, Калифорнија).Визуелизацијата беше извршена на собна температура по замена на медиумот со свеж медиум.Камерата е позиционирана под агол од 51 °, а видеото е снимено на 30 рамки во секунда.Прво, софтверот со отворен извор (Musclemotion43) се користеше со Image-J за да се измери движењето на срцевите парчиња.Маската е создадена со помош на MATLAB (MathWorks, Natick, MA, САД) за да се дефинираат регионите од интерес за отчукувањата на срцето за да се избегне бучава.Рачно сегментираните маски се применуваат на сите слики во низа кадри, а потоа се пренесуваат на приклучокот MUSCLEMOTION.Muscle Motion го користи просечниот интензитет на пикселите во секоја рамка за да го измери неговото движење во однос на референтната рамка.Податоците беа снимени, филтрирани и користени за квантифицирање на времето на циклусот и процена на истегнување на ткивото за време на срцевиот циклус.Снименото видео беше пост-обработено со помош на дигитален филтер од нулта фаза од прв ред.За да се измери истегнувањето на ткивото (од врв до врв), беше направена анализа од врв до врв за да се направи разлика помеѓу врвовите и коритата во снимениот сигнал.Дополнително, детрендирањето се изведува со користење на полином од 6-ти ред за да се елиминира движењето на сигналот.Програмскиот код беше развиен во MATLAB за да се одреди глобалното движење на ткивото, времето на циклусот, времето на релаксација и времето на контракција (Дополнителен програмски код 44).
За анализа на истегнување, користејќи ги истите видеа создадени за механичко проценување на истегнување, најпрво следевме две слики кои претставуваат врвови на движење (највисоката (горната) и најниската (долната) точка на движење) според софтверот MUSCLEMOTION.Потоа ги сегментиравме ткивните региони и применивме форма на алгоритам за засенчување на сегментираното ткиво (Дополнителна слика 2а).Сегментираното ткиво потоа беше поделено на десет подповршини, а напрегањето на секоја површина беше пресметано со следнава равенка: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, каде што Sup и Sdown се растојанието на обликот од горните и долните сенки на ткаенината, соодветно (Дополнителна слика .2б).
Срцевите делови беа фиксирани во 4% параформалдехид за 48 часа.Фиксираните ткива беа дехидрирани во 10% и 20% сахароза за 1 час, а потоа во 30% сахароза преку ноќ.Секциите потоа беа вградени во соединение за оптимална температура на сечење (OCT соединение) и постепено се замрзнаа во бања со изопентан/сув мраз.Чувајте ги блоковите за вградување OCT на -80 °C до одвојување.Слајдовите беа подготвени како пресеци со дебелина од 8 μm.
За да го отстраните OCT од срцевите делови, загрејте ги слајдовите на грејниот блок на 95 °C 5 мин.Додадете 1 ml PBS на секој слајд и инкубирајте 30 минути на собна температура, а потоа проникнете ги деловите со поставување 0,1% Triton-X во PBS 15 минути на собна температура.За да спречите врзување на неспецифичните антитела за примерокот, додадете 1 ml 3% раствор на BSA на слајдовите и инкубирајте 1 час на собна температура.BSA потоа беше отстранет и слајдовите беа измиени со PBS.Означете го секој примерок со молив.Примарните антитела (разредени 1:200 во 1% BSA) (конексин 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) и тропонин-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) беа додадени во текот на 90 минути, а потоа секундарни 0,00 BSA антитела се додадени во 1%: 488 (Thermo Scientific; #A16079), против зајакот Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) дополнителни 90 минути Измиени 3 пати со PBS За да се разликува целното боење од позадината, го користевме само секундарното антитело како контрола. -x зголемување) и Keyence микроскоп со 40x зголемување.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) на 5 μg/ml во PBS се користеше за WGA боење и се нанесуваше на фиксирани делови 30 минути на собна температура.Слајдовите потоа беа измиени со PBS и Суданската црна беше додадена на секој слајд и инкубираше 30 минути.Слајдовите потоа беа измиени со PBS и додадени се медиум за вградување Vectashield.Слајдовите беа визуелизирани на Keyence микроскоп со 40x зголемување.
OCT беше отстранет од примероците како што е опишано погоре.Откако ќе го отстраните OCT, потопете ги слајдовите во растворот на Bouin преку ноќ.Слајдовите потоа се исплакнаа со дестилирана вода 1 час и потоа се ставаа во раствор на фуксин од алое киселина Bibrich 10 минути.Потоа слајдовите беа измиени со дестилирана вода и ставени во раствор од 5% фосфомолибден/5% фосфотонгстична киселина 10 минути.Без плакнење, префрлете ги слајдовите директно во растворот со анилин сина боја 15 минути.Потоа слајдовите беа измиени со дестилирана вода и ставени во 1% раствор на оцетна киселина 2 минути.Слајдовите беа исушени во 200 N етанол и префрлени во ксилен.Обоените слајдови беа визуелизирани со помош на микроскоп Keyence со цел 10x.Процентот на површината на фиброзата беше квантифициран со помош на софтверот Keyence Analyzer.
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA), каталог број V13154, според протоколот на производителот со некои модификации.Конкретно, користен е хируршки удар со дијаметар од 6 mm за да се обезбеди униформа големина на ткивото за време на анализата на МТТ.Ткивата беа поединечно поплочени во бунарите на плоча со 12 бунари што содржи МТТ супстрат според протоколот на производителот.Секциите се инкубираат на 37°C 3 часа и живото ткиво го метаболизира МТТ супстратот за да формира виолетова формазанска соединение.Заменете го MTT растворот со 1 ml DMSO и инкубирајте на 37 °C 15 минути за да се извлече пурпурниот формазан од срцевите делови.Примероците беа разредени 1:10 во DMSO во плочи со проѕирно дно со 96 бунари и интензитетот на виолетова боја измерен на 570 nm со помош на читач на Cytation плоча (BioTek).Читањата беа нормализирани според тежината на секое парче од срцето.
Медиумите од срцеви парчиња беа заменети со медиум што содржи 1 μCi/ml [5-3H]-гликоза (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) за анализа на искористување на гликоза како што беше претходно опишано.По 4 часа инкубација, додадете 100 µl медиум во отворена микроцентрифуга цевка која содржи 100 µl 0,2 N HCl.Потоа цевката била ставена во цевка за сцинтилација која содржи 500 μl dH2O за да испари [3H]2O 72 часа на 37°C.Потоа извадете ја цевката за микроцентрифуга од цевката за сцинтилација и додадете 10 ml течност за сцинтилација.Броењето на сцинтилацијата беше изведено со помош на анализатор за течна сцинтилација Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA).Употребата на гликоза потоа беше пресметана земајќи ја предвид специфичната активност на [5-3H]-гликоза, нецелосна рамнотежа и позадина, разредување на [5-3H]-до неозначена гликоза и контра ефикасност на сцинтилацијата.Податоците се нормализираат на масата на делови од срцето.
По хомогенизацијата на ткивото во Тризол, РНК беше изолирана од срцеви делови користејќи Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 според протоколот на производителот.Подготовката на библиотеката RNASEC, секвенционирањето и анализата на податоците беа извршени на следниов начин:
Како почетен материјал за подготовка на библиотеката РНК се користеше 1 μg РНК по примерок.Библиотеките за секвенционирање беа генерирани со помош на комплетот за подготовка на библиотеката NEBNext UltraTM RNA за Illumina (NEB, САД) следејќи ги препораките на производителот, а кодовите на индексите беа додадени во секвенците на атрибути за секој примерок.Накратко, mRNA беше прочистена од вкупната РНК користејќи магнетни зрна прикачени со поли-Т олигонуклеотиди.Фрагментацијата се врши со употреба на двовалентни катјони на висока температура во NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X).Првиот ланец cDNA беше синтетизиран со користење на случајни хексамерни прајмери ​​и M-MuLV реверзна транскриптаза (RNase H-).Втората нишка cDNA потоа се синтетизира со користење на ДНК полимераза I и RNase H. Останатите настрешници се претвораат во тапи краеви со активност на егзонуклеаза/полимераза.По аденилација на 3' крајот на фрагментот на ДНК, NEBNext адаптер со структура на јамка за фиба е прикачен на него за да се подготви за хибридизација.За избор на cDNA фрагменти со претпочитана должина 150-200 bp.фрагментите од библиотеката беа прочистени со помош на системот AMPure XP (Бекман Култер, Беверли, САД).Потоа, 3 μl КОРИСНИЧКИ ензим (NEB, САД) со избрана големина на cDNA, поврзана со адаптер, се користеше 15 минути на 37°C и потоа 5 минути на 95°C пред PCR.Потоа беше изведена PCR со користење на Phusion High-Fidelity DNA полимераза, универзални PCR прајмери ​​и Index (X) прајмери.Конечно, производите на PCR беа прочистени (AMPure XP систем) и квалитетот на библиотеката беше проценет на систем Agilent Bioanalyzer 2100.Библиотеката cDNA потоа беше секвенционирана со помош на Novaseq секвенсер.Датотеките со необработени слики од Illumina беа претворени во необработени читања со помош на CASAVA Base Calling.Необработените податоци се складираат во датотеки со формат FASTQ(fq) кои содржат секвенци за читање и соодветни базни квалитети.Изберете HISAT2 за да ги усогласите читањата на филтрираната секвенца со референтниот геном Sscrofa11.1.Општо земено, HISAT2 поддржува геноми од која било големина, вклучувајќи геноми поголеми од 4 милијарди бази, а стандардните вредности се поставени за повеќето параметри.Спојувањето на читањата од податоците на RNA Seq може ефикасно да се порамни со користење на HISAT2, најбрзиот систем моментално достапен, со иста или подобра прецизност од кој било друг метод.
Изобилството на транскрипти директно го одразува нивото на генска експресија.Нивоата на генска експресија се проценуваат со изобилството на транскрипти (броење на секвенционирање) поврзани со геномот или егзоните.Бројот на читања е пропорционален на нивоата на генска експресија, должината на генот и длабочината на секвенционирањето.Беа пресметани FPKM (фрагменти по илјада базни парови на транскрипти секвенционирани на милион базни парови) и беа утврдени P-вредностите на диференцијалната експресија со помош на пакетот DESeq2.Потоа ја пресметавме стапката на лажно откривање (FDR) за секоја вредност на P користејќи го методот Бенџамини-Хохберг9 заснован на вградената R-функција „p.adjust“.
РНК изолирана од срцеви секции беше конвертирана во cDNA во концентрација од 200 ng/μl со користење на мешавината SuperScript IV Vilo Master од Thermo (Термо, кат. бр. 11756050).Квантитативната RT-PCR беше изведена со употреба на проѕирна реакциона плоча на Applied Biosystems Endura Plate Microamp со 384 бунари (Thermo, кат. бр. 4483319) и оптичко лепило со микроампер (Thermo, кат. бр. 4311971).Реакционата смеса се состоеше од 5 µl Taqman Fast Advanced Master микс (Thermo, cat # 4444557), 0,5 µl Taqman Primer и 3,5 µl H2O измешани по бунар.Беа извршени стандардни qPCR циклуси и вредностите на КТ беа измерени со помош на инструмент за PCR во реално време Applied Biosystems Quantstudio 5 (модул со 384 бунари; производ # A28135).Taqman прајмерите се купени од Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL8m1 (Ss03375629_u1), RGL8m1 (Ss0908795_m1) 8_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss08_245 се нормализирани примероците од 801000000000000000009_u1) ГАПДХ.
Објавувањето на медиумите на NT-ProBNP беше оценето со користење на комплетот NT-ProBNP (свиња) (Кат. бр. MBS2086979, MyBioSource) според протоколот на производителот.Накратко, 250 мл од секој примерок и стандард се додадени во дупликат на секоја бунар.Веднаш по додавањето на примерокот, додајте 50 µl Реагенс за анализа А во секоја буна.Нежно протресете ја плочата и запечатете ја со заптивната смеса.Потоа таблетите се инкубираат на 37°C за 1 час.Потоа аспирирајте го растворот и измијте ги бунарите 4 пати со 350 µl 1X раствор за миење, инкубирајте го растворот за миење 1-2 минути секој пат.Потоа додадете 100 µl Реагенс за анализа Б по бунар и запечатете со заптивната смеса за плочи.Таблетата беше нежно протресена и инкубирана на 37°C 30 минути.Аспирирајте го растворот и измијте ги бунарите 5 пати со 350 µl 1X раствор за миење.Додадете 90 µl раствор на подлогата во секоја буна и затворете ја плочата.Инкубирајте ја плочата на 37°C 10-20 минути.Додадете 50 мл стоп решение за секој бунар.Плочата веднаш беше измерена со помош на читач на плочи Cytation (BioTek) поставен на 450 nm.
Беа извршени анализи на моќност за да се изберат големини на групи кои ќе обезбедат >80% моќ за откривање на апсолутна промена на параметарот од 10% со стапка на грешка од тип I од 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечатување >80% мощности за обнаружения 10% апсолютного изменения параметра со 5% частотой ошибок тип I. Извршена е анализа на моќноста за да се изберат големини на групи кои ќе обезбедат >80% моќ за откривање на 10% апсолутна промена на параметарот со стапка на грешка од тип I од 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％褧测参数中10％绝对变化和5％褧型进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％褧测参数中10％绝对变化和5％褧型 Был проведен анализа на мощности за выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности за обнаружения 10% апсолютного изменения параметри и 5% частоты ошибок тип I. Ткивните делови беа по случаен избор пред експериментот.Сите анализи беа условно слепи и примероците беа декодирани само откако сите податоци беа анализирани.Софтверот GraphPad Prism (Сан Диего, Калифорнија) беше искористен за извршување на сите статистички анализи. За сите статистики, p-вредностите се сметаа за значајни при вредности <0,05. За сите статистики, p-вредностите се сметаа за значајни при вредности <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. За сите статистики, p-вредностите се сметаа за значајни при вредности <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. За сите статистики, p-вредностите се сметаа за значајни при вредности <0,05.T-тестот со две опашки беше спроведен на податоците со само 2 споредби.Еднонасочна или двонасочна АНОВА се користеше за да се утврди значењето помеѓу повеќе групи.При извршување на пост хок тестови, корекцијата на Туки беше применета за да се земат предвид повеќекратните споредби.Податоците од RNAsec имаат посебни статистички размислувања при пресметување на FDR и p.прилагодете како што е опишано во делот Методи.
За повеќе информации за дизајнот на студијата, видете го апстрактот на извештајот за истражување на природата поврзан со овој напис.