Nature.com သို့ ဝင်ရောက်ကြည့်ရှုသည့်အတွက် ကျေးဇူးတင်ပါသည်။ သင်အသုံးပြုနေသော browser ဗားရှင်းတွင် CSS ပံ့ပိုးမှု အကန့်အသတ်ရှိသည်။ အကောင်းဆုံးအတွေ့အကြုံအတွက်၊ အပ်ဒိတ်လုပ်ထားသော browser ကို အသုံးပြုရန် (သို့မဟုတ် Internet Explorer ရှိ Compatibility Mode ကို ပိတ်ရန်) အကြံပြုအပ်ပါသည်။ ထိုအတောအတွင်း၊ ဆက်လက်ပံ့ပိုးမှုရရှိစေရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဆိုက်ကို styles နှင့် JavaScript မပါဘဲ render လုပ်ပါမည်။
ဆေးဝါးစစ်ဆေးရန်အတွက် နှလုံး၏ ဇီဝကမ္မဗေဒဆိုင်ရာပတ်ဝန်းကျင်ကို တိကျစွာပြန်လည်ထုတ်လုပ်နိုင်သည့် ယုံကြည်စိတ်ချရသော in vitro စနစ်တစ်ခု လိုအပ်ပါသည်။ လူ့နှလုံးတစ်ရှူးယဉ်ကျေးမှုစနစ်များ ရရှိနိုင်မှု အကန့်အသတ်ရှိခြင်းကြောင့် နှလုံးဆေးဝါးအကျိုးသက်ရောက်မှုများကို မတိကျသော အဓိပ္ပာယ်ဖွင့်ဆိုချက်များ ဖြစ်ပေါ်စေခဲ့သည်။ ဤနေရာတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် နှလုံးအပိုင်းအစများကို လျှပ်စစ်စက်ဝန်း၏ systolic နှင့် diastolic အဆင့်များအတွင်း ဇီဝကမ္မဗေဒဆိုင်ရာ ဆန့်ထုတ်မှုကို ဖြတ်သန်းစေသည့် နှလုံးတစ်ရှူးယဉ်ကျေးမှုပုံစံ (CTCM) ကို တီထွင်ခဲ့ပါသည်။ ၁၂ ရက်ကြာ ယဉ်ကျေးမှုပြီးနောက်၊ ဤနည်းလမ်းသည် နှလုံးအပိုင်းအစများ၏ အသက်ရှင်နိုင်စွမ်းကို တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းတိုးတက်စေခဲ့သော်လည်း ၎င်းတို့၏ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ တည်တံ့မှုကို အပြည့်အဝမထိန်းသိမ်းနိုင်ခဲ့ပါ။ ထို့ကြောင့်၊ မော်လီကျူးငယ်စစ်ဆေးပြီးနောက်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ကြားခံသို့ 100 nM triiodothyronine (T3) နှင့် 1 μM dexamethasone (Dex) ထည့်သွင်းခြင်းသည် အပိုင်းအစများ၏ အဏုကြည့်ဖွဲ့စည်းပုံကို ၁၂ ရက်ကြာ ထိန်းသိမ်းထားသည်ကို ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့သည်။ T3/Dex ကုသမှုနှင့် ပေါင်းစပ်ခြင်းဖြင့် CTCM စနစ်သည် transcriptional profiles၊ အသက်ရှင်နိုင်စွမ်း၊ ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာလှုပ်ရှားမှုနှင့် ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ တည်တံ့မှုကို လတ်ဆတ်သောနှလုံးတစ်ရှူးများကဲ့သို့ ၁၂ ရက်ကြာ ထိန်းသိမ်းထားနိုင်ခဲ့သည်။ ထို့အပြင်၊ ဓာတ်ခွဲခန်းတွင် နှလုံးတစ်ရှူးများ အလွန်အကျွံဆန့်ခြင်းသည် hypertrophic နှလုံးအချက်ပြမှုကို ဖြစ်ပေါ်စေပြီး နှလုံးဆန့်ခြင်းကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော hypertrophic အခြေအနေများကို CTCM တုပနိုင်စွမ်းအတွက် အထောက်အထားကို ပေးစွမ်းသည်။ အဆုံးသတ်အနေဖြင့်၊ CTCM သည် နှလုံး၏ ဇီဝကမ္မဗေဒနှင့် ရောဂါဗေဒကို ရေရှည်ပုံစံထုတ်နိုင်ပြီး ယုံကြည်စိတ်ချရသော ဆေးဝါးစစ်ဆေးခြင်းကို ဖြစ်စေနိုင်သည်။
လက်တွေ့သုတေသနမပြုလုပ်မီ၊ လူ့နှလုံး၏ ဇီဝကမ္မဗေဒဆိုင်ရာပတ်ဝန်းကျင်ကို တိကျစွာပြန်လည်ထုတ်လုပ်နိုင်သည့် ယုံကြည်စိတ်ချရသော in vitro စနစ်များ လိုအပ်ပါသည်။ ထိုကဲ့သို့သောစနစ်များသည် ပြောင်းလဲထားသော စက်ပိုင်းဆိုင်ရာဆန့်ထုတ်မှု၊ နှလုံးခုန်နှုန်းနှင့် လျှပ်စစ်ဇီဝကမ္မဗေဒဆိုင်ရာဂုဏ်သတ္တိများကို တုပသင့်သည်။ တိရစ္ဆာန်မော်ဒယ်များကို လူ့နှလုံးတွင် ဆေးဝါးများ၏အကျိုးသက်ရောက်မှုများကို ထင်ဟပ်စေရာတွင် ယုံကြည်စိတ်ချရမှုအကန့်အသတ်ဖြင့် နှလုံးဇီဝကမ္မဗေဒအတွက် စိစစ်ရေးပလက်ဖောင်းအဖြစ် အသုံးများသည်၁၊၂။ အဆုံးစွန်အားဖြင့်၊ Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) သည် ကုထုံးနှင့် ဆေးဝါးဗေဒဆိုင်ရာ ကြားဝင်ဆောင်ရွက်မှုအမျိုးမျိုးအတွက် အလွန်အာရုံခံနိုင်စွမ်းရှိပြီး တိကျသော မော်ဒယ်တစ်ခုဖြစ်ပြီး လူ့နှလုံး၏ ဇီဝကမ္မဗေဒနှင့် ရောဂါဗေဒဆိုင်ရာ ဇီဝကမ္မဗေဒကို တိကျစွာပြန်လည်ထုတ်လုပ်သည်။ ထိုကဲ့သို့သောစနစ်မရှိခြင်းသည် နှလုံးရောဂါအတွက် ကုသမှုအသစ်များရှာဖွေတွေ့ရှိမှုကို ကန့်သတ်ထားသည်၄၊၅ နှင့် ဈေးကွက်မှထွက်ခွာရန် အဓိကအကြောင်းရင်းအဖြစ် ဆေးဝါးကြောင့်ဖြစ်သော နှလုံးအဆိပ်သင့်မှုကို ဖြစ်ပေါ်စေခဲ့သည်၆။
လွန်ခဲ့သောဆယ်စုနှစ်အတွင်း နှလုံးသွေးကြောဆိုင်ရာမဟုတ်သောဆေးဝါးရှစ်မျိုးသည် QT interval prolongation ကိုဖြစ်စေပြီး ventricular arrhythmias နှင့် ရုတ်တရက်သေဆုံးခြင်းကိုဖြစ်စေသောကြောင့် ဆေးခန်းအသုံးပြုမှုမှ ရုပ်သိမ်းခဲ့သည်7။ ထို့ကြောင့် နှလုံးသွေးကြောဆိုင်ရာထိရောက်မှုနှင့် အဆိပ်သင့်မှုကို အကဲဖြတ်ရန် ယုံကြည်စိတ်ချရသော preclinical screening strategies များအတွက် လိုအပ်ချက်တိုးပွားလာနေပါသည်။ ဆေးဝါးစစ်ဆေးခြင်းနှင့် အဆိပ်သင့်မှုစစ်ဆေးခြင်းတွင် human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPS-CM) ကို မကြာသေးမီက အသုံးပြုခြင်းသည် ဤပြဿနာအတွက် တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းဖြေရှင်းချက်ပေးပါသည်။ သို့သော်၊ hiPS-CMs ၏ မရင့်ကျက်သောသဘောသဘာဝနှင့် နှလုံးတစ်ရှူး၏ multicellular complexity မရှိခြင်းသည် ဤနည်းလမ်း၏ အဓိကကန့်သတ်ချက်များဖြစ်သည်။ မကြာသေးမီက လေ့လာမှုများအရ ဤကန့်သတ်ချက်ကို spontaneous contractions စတင်ပြီးနောက် မကြာမီတွင် နှလုံးတစ်ရှူး hydrogels များဖွဲ့စည်းရန်နှင့် အချိန်ကြာလာသည်နှင့်အမျှ လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုကို တဖြည်းဖြည်းတိုးမြှင့်ရန် အစောပိုင်း hiPS-CM ကို အသုံးပြုခြင်းဖြင့် တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းကျော်လွှားနိုင်ကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ သို့သော်၊ ဤ hiPS-CM microtissues များတွင် အရွယ်ရောက်ပြီးသူ myocardium ၏ ရင့်ကျက်သော electrophysiological နှင့် contractile ဂုဏ်သတ္တိများ မရှိပါ။ ထို့အပြင်၊ လူ့နှလုံးတစ်ရှူးတွင် ပိုမိုရှုပ်ထွေးသောဖွဲ့စည်းပုံရှိပြီး၊ endothelial ဆဲလ်များ၊ အာရုံကြောဆဲလ်များနှင့် stromal fibroblasts များအပါအဝင် မတူညီသောဆဲလ်အမျိုးအစားများ၏ ရောနှောမှုပါဝင်ပြီး extracellular matrix ပရိုတိန်းအစုံများဖြင့် အပြန်အလှန်ချိတ်ဆက်ထားသည်။ အရွယ်ရောက်ပြီးသော နို့တိုက်သတ္တဝါများ၏နှလုံးတွင် non-cardiomyocyte လူဦးရေ ၁၁၊ ၁၂၊ ၁၃ ၏ ဤမတူညီမှုသည် တစ်ဦးချင်းဆဲလ်အမျိုးအစားများကို အသုံးပြု၍ နှလုံးတစ်ရှူးပုံစံငယ်ပြုလုပ်ရာတွင် အဓိကအတားအဆီးတစ်ခုဖြစ်သည်။ ဤအဓိကကန့်သတ်ချက်များသည် ဇီဝကမ္မဗေဒနှင့် ရောဂါဗေဒဆိုင်ရာအခြေအနေများအောက်တွင် မပျက်စီးသေးသော myocardial တစ်ရှူးများကို ပြုစုပျိုးထောင်ရန် နည်းလမ်းများ တီထွင်ခြင်း၏ အရေးပါမှုကို အလေးပေးဖော်ပြသည်။
လူ့နှလုံး၏ ပျိုးထောင်ထားသော ပါးလွှာသော (300 µm) အပိုင်းများသည် မပျက်စီးသေးသော လူ့ကြွက်သားဆဲလ်ပုံစံတစ်ခုဖြစ်ကြောင်း သက်သေပြခဲ့သည်။ ဤနည်းလမ်းသည် လူ့နှလုံးတစ်ရှူးနှင့်ဆင်တူသော ပြီးပြည့်စုံသော 3D multicellular system ကို ဝင်ရောက်ခွင့်ပေးသည်။ သို့သော် ၂၀၁၉ ခုနှစ်အထိ ပျိုးထောင်ထားသော နှလုံးအပိုင်းများကို အသုံးပြုခြင်းသည် ပျိုးထောင်မှုရှင်သန်မှုတိုတောင်းသော (၂၄ နာရီ) ကြောင့် အကန့်အသတ်ရှိခဲ့သည်။ ၎င်းမှာ ရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာ-စက်ပိုင်းဆိုင်ရာ ဆန့်ထုတ်မှုမရှိခြင်း၊ လေ-အရည် မျက်နှာပြင်နှင့် နှလုံးတစ်ရှူး၏ လိုအပ်ချက်များကို မပံ့ပိုးပေးသော ရိုးရှင်းသော မီဒီယာများကို အသုံးပြုခြင်း အပါအဝင် အချက်များစွာကြောင့်ဖြစ်သည်။ ၂၀၁၉ ခုနှစ်တွင် သုတေသနအဖွဲ့များစွာက နှလုံးတစ်ရှူး ပျိုးထောင်မှုစနစ်များတွင် စက်ပိုင်းဆိုင်ရာအချက်များကို ထည့်သွင်းခြင်းသည် ပျိုးထောင်မှုသက်တမ်းကို တိုးချဲ့နိုင်ခြင်း၊ နှလုံးဖော်ပြချက်ကို တိုးတက်ကောင်းမွန်စေပြီး နှလုံးရောဂါဗေဒကို တုပနိုင်ကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ ကြော့ရှင်းသော လေ့လာမှုနှစ်ခု ၁၇ နှင့် ၁၈ တွင် uniaxial စက်ပိုင်းဆိုင်ရာ ဝန်ထုပ်ဝန်ပိုးသည် ပျိုးထောင်နေစဉ်အတွင်း နှလုံးပုံစံအပေါ် အပြုသဘောဆောင်သော အကျိုးသက်ရောက်မှုရှိကြောင်း ပြသထားသည်။ သို့သော် ဤလေ့လာမှုများသည် နှလုံးစက်ဝန်း၏ dynamic three-dimensional physico-mechanical loading ကို အသုံးမပြုခဲ့ပါ၊ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် နှလုံးအပိုင်းများကို isometric tensile forces ၁၇ သို့မဟုတ် linear auxotonic loading ၁၈ ဖြင့် တင်ဆောင်ထားသောကြောင့်ဖြစ်သည်။ တစ်ရှူးဆန့်ခြင်း၏ ဤနည်းလမ်းများသည် နှလုံးဆိုင်ရာ မျိုးရိုးဗီဇများစွာကို နှိမ်နင်းခြင်း သို့မဟုတ် ပုံမှန်မဟုတ်သော ဆန့်ထုတ်မှုတုံ့ပြန်မှုများနှင့် ဆက်စပ်နေသော မျိုးရိုးဗီဇများ အလွန်အကျွံဖော်ပြခြင်းကို ဖြစ်ပေါ်စေခဲ့သည်။ မှတ်သားစရာကောင်းသည်မှာ Pitoulis နှင့်အဖွဲ့သည် force transducer feedback နှင့် tension drives များကို အသုံးပြု၍ နှလုံးသံသရာပြန်လည်တည်ဆောက်မှုအတွက် dynamic heart slice culture bath ကို တီထွင်ခဲ့သည်။ ဤစနစ်သည် in vitro နှလုံးသံသရာပုံစံငယ်ကို ပိုမိုတိကျစွာပြုလုပ်နိုင်စေသော်လည်း၊ နည်းလမ်း၏ ရှုပ်ထွေးမှုနှင့် throughput နည်းပါးခြင်းက ဤစနစ်ကို အသုံးချမှုကို ကန့်သတ်ထားသည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ဓာတ်ခွဲခန်းသည် မကြာသေးမီက ဝက်နှင့် လူ့နှလုံးတစ်ရှူးအပိုင်းအစများ၏ အသက်ရှင်သန်မှုကို ရက်ပေါင်း ၆ ရက်အထိ ထိန်းသိမ်းရန် လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုနှင့် အကောင်းဆုံးဖြစ်အောင်ပြုလုပ်ထားသော medium ကို အသုံးပြု၍ ရိုးရှင်းသော culture system တစ်ခုကို တီထွင်ခဲ့သည်20,21။
လက်ရှိလက်ရေးစာမူတွင်၊ ဝက်နှလုံး၏ အစိတ်အပိုင်းများကို အသုံးပြု၍ သုံးဖက်မြင် နှလုံးဇီဝကမ္မဗေဒနှင့် နှလုံးသံသရာအတွင်း ရောဂါဗေဒ/ရောဂါဗေဒဆိုင်ရာ ကျဉ်းမြောင်းမှုကို အကျဉ်းချုပ်ဖော်ပြရန် humoral cues များပါဝင်သော နှလုံးတစ်ရှူးယဉ်ကျေးမှုပုံစံ (CTCM) ကို ကျွန်ုပ်တို့ဖော်ပြထားပါသည်။ ဤ CTCM သည် ဆေးခန်းမတိုင်မီ ဆေးဝါးစမ်းသပ်မှုအတွက် နို့တိုက်သတ္တဝါနှလုံး၏ ဇီဝကမ္မဗေဒ/ရောဂါဗေဒကို အတုယူသည့် ကုန်ကျစရိတ်သက်သာသော၊ အလယ်အလတ်အဆင့် နှလုံးစနစ်ကို ပံ့ပိုးပေးခြင်းဖြင့် ယခင်က မရှိခဲ့ဖူးသော အဆင့်အထိ ဆေးခန်းမတိုင်မီ ဆေးဝါးခန့်မှန်းချက်၏ တိကျမှုကို မြှင့်တင်ပေးနိုင်ပါသည်။
သွေးလည်ပတ်မှုဆိုင်ရာ စက်ပိုင်းဆိုင်ရာ အချက်ပြမှုများသည် in vitro 22,23,24 တွင် cardiomyocyte လုပ်ဆောင်ချက်ကို ထိန်းသိမ်းရာတွင် အရေးပါသော အခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်သည်။ လက်ရှိလက်ရေးစာမူတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဇီဝကမ္မဗေဒဆိုင်ရာ ကြိမ်နှုန်းများ (1.2 Hz၊ တစ်မိနစ်လျှင် 72 ကြိမ်နှုန်း) တွင် လျှပ်စစ်နှင့် စက်ပိုင်းဆိုင်ရာ လှုံ့ဆော်မှု နှစ်မျိုးလုံးကို လှုံ့ဆော်ခြင်းဖြင့် အရွယ်ရောက်ပြီးသူ နှလုံးပတ်ဝန်းကျင်ကို တုပနိုင်သော CTCM (ပုံ 1a) ကို တီထွင်ခဲ့ပါသည်။ diastole အတွင်း တစ်ရှူးများ အလွန်အကျွံဆန့်ထွက်ခြင်းကို ရှောင်ရှားရန်အတွက်၊ တစ်ရှူးအရွယ်အစားကို 25% တိုးမြှင့်ရန် 3D printing ကိရိယာကို အသုံးပြုခဲ့သည် (ပုံ 1b)။ C-PACE စနစ်မှ လှုံ့ဆော်ပေးသော လျှပ်စစ် pacing ကို data acquisition system ကို အသုံးပြု၍ systole မတိုင်မီ 100 ms တွင် စတင်ရန် အချိန်သတ်မှတ်ထားပြီး နှလုံးသံသရာကို အပြည့်အဝ ပြန်လည်ထုတ်လုပ်ခဲ့သည်။ တစ်ရှူးယဉ်ကျေးမှုစနစ်သည် programmable pneumatic actuator (LB Engineering, Germany) ကို အသုံးပြု၍ အပေါ်ခန်းရှိ နှလုံးအပိုင်းအစများ ကျယ်ပြန့်လာစေရန် ပျော့ပျောင်းသော ဆီလီကွန်အမြှေးပါးကို စက်ဝန်းအတိုင်း ချဲ့ထွင်ပေးသည်။ စနစ်ကို pressure transducer မှတစ်ဆင့် ပြင်ပလေလိုင်းနှင့် ချိတ်ဆက်ထားပြီး ဖိအား (± 1 mmHg) နှင့် အချိန် (± 1 ms) ကို တိကျစွာ ချိန်ညှိနိုင်စေသည် (ပုံ 1c)။
က။ တစ်ရှူးအပိုင်းကို ကိရိယာ၏ ယဉ်ကျေးမှုအခန်းအတွင်းရှိ အပြာရောင်ဖြင့်ပြထားသည့် ၇ မီလီမီတာ အထောက်အပံ့ကွင်းတွင် တွဲချိတ်ပါ။ ယဉ်ကျေးမှုအခန်းကို လေအခန်းနှင့် ပါးလွှာသော ပျော့ပျောင်းသော ဆီလီကွန်အမြှေးပါးဖြင့် ခွဲထားသည်။ ယိုစိမ့်မှုများကို ကာကွယ်ရန် အခန်းတစ်ခုစီကြားတွင် gasket တစ်ခု ထားပါ။ ကိရိယာ၏အဖုံးတွင် လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုပေးသည့် ဂရပ်ဖိုက်လျှပ်ကူးပစ္စည်းများ ပါရှိသည်။ ခ။ တစ်ရှူးကြီးကိရိယာ၊ လမ်းညွှန်ကွင်းနှင့် အထောက်အပံ့ကွင်း၏ ပုံကြမ်းပုံဖော်ခြင်း။ တစ်ရှူးအပိုင်းများ (အညိုရောင်) ကို ကိရိယာ၏ အပြင်ဘက်အစွန်းရှိ မြောင်းတွင် ထားရှိပြီး လမ်းညွှန်ကွင်းကို ထားပါ။ လမ်းညွှန်ကို အသုံးပြု၍ နှလုံးတစ်ရှူးအပိုင်းပေါ်တွင် တစ်ရှူး acrylic ကော်ဖြင့် ဖုံးအုပ်ထားသော အထောက်အပံ့ကွင်းကို ဂရုတစိုက် ထားပါ။ ဂ။ ပရိုဂရမ်ရေးသားနိုင်သော pneumatic actuator (PPD) မှ ထိန်းချုပ်ထားသော လေအခန်းဖိအား၏ လုပ်ဆောင်ချက်အဖြစ် လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုအချိန်ကို ပြသသည့် ဂရပ်ဖ်။ ဖိအားအာရုံခံကိရိယာများကို အသုံးပြု၍ လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုကို ထပ်တူကျစေရန် ဒေတာရယူသည့် ကိရိယာတစ်ခုကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ ယဉ်ကျေးမှုအခန်းရှိ ဖိအားသည် သတ်မှတ်ထားသော ကန့်သတ်ချက်သို့ ရောက်ရှိသောအခါ၊ လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုကို လှုံ့ဆော်ရန် pulse signal ကို C-PACE-EM သို့ ပေးပို့သည်။ ဃ။ incubator စင်ပေါ်တွင် ထားရှိသော CTCM လေးခု၏ ပုံ။ PPD တစ်ခုနှင့် ကိရိယာလေးခုကို လေဖိအားပတ်လမ်းမှတစ်ဆင့် ချိတ်ဆက်ထားပြီး လေဖိအားပတ်လမ်းရှိ ဖိအားကို စောင့်ကြည့်ရန်အတွက် ဖိအားအာရုံခံကိရိယာများကို သွေးလည်ပတ်မှုအဆို့ရှင်ထဲသို့ ထည့်သွင်းထားသည်။ ကိရိယာတစ်ခုစီတွင် တစ်ရှူးအပိုင်းခြောက်ပိုင်း ပါဝင်သည်။
တစ်ခုတည်းသော pneumatic actuator ကိုအသုံးပြုခြင်းဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် CTCM ကိရိယာ ၄ ခုကို ထိန်းချုပ်နိုင်ခဲ့ပြီး တစ်ခုစီတွင် တစ်ရှူးအပိုင်း ၆ ပိုင်းကို ထိန်းထားနိုင်သည် (ပုံ 1d)။ CTCM တွင်၊ လေခန်းရှိ လေဖိအားကို အရည်ခန်းရှိ synchronous ဖိအားအဖြစ် ပြောင်းလဲပြီး နှလုံးအပိုင်း၏ ဇီဝကမ္မဗေဒဆိုင်ရာ ချဲ့ထွင်မှုကို ဖြစ်ပေါ်စေသည် (ပုံ 2a နှင့် Supplementary Movie 1)။ 80 mm Hg တွင် တစ်ရှူးဆန့်မှုကို အကဲဖြတ်ခြင်း။ အနုပညာ။ တစ်ရှူးအပိုင်းများ၏ ဆန့်ထွက်မှုကို 25% ပြသခဲ့သည် (ပုံ 2b)။ ဤရာခိုင်နှုန်းဆန့်ထွက်မှုသည် ပုံမှန်နှလုံးအပိုင်း ကျုံ့နိုင်စွမ်းအတွက် ဇီဝကမ္မဗေဒဆိုင်ရာ sarcomere အရှည် 2.2–2.3 µm နှင့် ကိုက်ညီကြောင်း ပြသထားသည်17,19,25။ တစ်ရှူးရွေ့လျားမှုကို custom camera setting များကို အသုံးပြု၍ အကဲဖြတ်ခဲ့သည် (Supplementary Figure 1)။ တစ်ရှူးရွေ့လျားမှု၏ amplitude နှင့် velocity (ပုံ 2c, d) သည် နှလုံးစက်ဝန်းအတွင်း ဆန့်ထွက်မှုနှင့် systole နှင့် diastole အတွင်း အချိန်နှင့် ကိုက်ညီသည် (ပုံ 2b)။ ကျုံ့ခြင်းနှင့် ပြေလျော့ခြင်းအတွင်း နှလုံးတစ်ရှူးဆန့်ထွက်မှုနှင့် velocity သည် culture တွင် 12 ရက်ကြာ တည်ငြိမ်နေခဲ့သည် (ပုံ 2f)။ ဓာတ်ခွဲခန်းတွင် ဓာတ်ခွဲခန်းအတွင်း ကျုံ့နိုင်အားအပေါ် လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှု၏ အကျိုးသက်ရောက်မှုကို အကဲဖြတ်ရန်အတွက်၊ shading algorithm (Supplementary Fig. 2a,b) ကို အသုံးပြု၍ တက်ကြွသော ပုံပျက်မှုကို ဆုံးဖြတ်ရန် နည်းလမ်းတစ်ခုကို ကျွန်ုပ်တို့ တီထွင်ခဲ့ပြီး လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုရှိသော နှင့် မရှိသော ပုံပျက်မှုများကို ခွဲခြားနိုင်ခဲ့သည်။ နှလုံး၏ တူညီသော အပိုင်း (ပုံ 2f)။ ဖြတ်တောက်မှု၏ ရွေ့လျားနိုင်သော ဧရိယာ (R6-9) တွင်၊ လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုအတွင်း ဗို့အားသည် လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုမရှိခြင်းထက် 20% ပိုမိုမြင့်မားပြီး ၎င်းသည် ဓာတ်ခွဲခန်းကျုံ့နိုင်အားအပေါ် လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှု၏ ပံ့ပိုးမှုကို ညွှန်ပြသည်။
လေခန်းဖိအား၊ အရည်ခန်းဖိအားနှင့် တစ်ရှူးလှုပ်ရှားမှုတိုင်းတာမှုများ၏ ကိုယ်စားပြုလက္ခဏာများက အခန်းဖိအားသည် အရည်ခန်းဖိအားကို ပြောင်းလဲစေပြီး တစ်ရှူးအပိုင်း၏ သက်ဆိုင်ရာလှုပ်ရှားမှုကို ဖြစ်ပေါ်စေကြောင်း အတည်ပြုသည်။ b ရာခိုင်နှုန်းဆန့်တန်းမှုနှင့် ကိုက်ညီသော တစ်ရှူးအပိုင်းများ၏ ရာခိုင်နှုန်းဆန့်တန်းမှု (အပြာရောင်) ကိုယ်စားပြုလက္ခဏာများ (လိမ္မော်ရောင်)။ c နှလုံးအပိုင်း၏ တိုင်းတာထားသော ရွေ့လျားမှုသည် တိုင်းတာထားသော ရွေ့လျားမှုအမြန်နှုန်းနှင့် ကိုက်ညီသည်။ (d) နှလုံး၏ အပိုင်းတစ်ခုတွင် စက်ဝန်းရွေ့လျားမှု (အပြာရောင်မျဉ်း) နှင့် အလျင် (လိမ္မော်ရောင် အစက်ချမျဉ်း) ၏ ကိုယ်စားပြုလမ်းကြောင်းများ။ e စက်ဝန်းအချိန် (ဝက်အမျိုးမျိုးမှ အုပ်စုတစ်ခုလျှင် n = ၁၉ ချပ်)၊ ကျုံ့ချိန် (အုပ်စုတစ်ခုလျှင် n = ၁၉ ချပ်)၊ ပြေလျော့ချိန် (ဝက်အမျိုးမျိုးမှ အုပ်စုတစ်ခုလျှင် n = ၁၉ ချပ်)၊ တစ်ရှူးလှုပ်ရှားမှု (n = ၂၅)၊ ဝက်အမျိုးမျိုးမှ အမြင့်ဆုံး systolic velocity (ဝက်အမျိုးမျိုးမှ n = ၂၄(D0)၊ ဝက်အမျိုးမျိုးမှ ၂၅(D12) ချပ်/အုပ်စု) နှင့် အမြင့်ဆုံးပြေလျော့နှုန်း (ဝက်အမျိုးမျိုးမှ n=၂၄(D0)၊ ဝက်အမျိုးမျိုးမှ ၂၅(D12) ချပ်/အုပ်စု) တို့၏ ပမာဏ။ Two-tailed Student's t-test သည် မည်သည့် parameter တွင်မျှ သိသာထင်ရှားသော ကွာခြားချက်မပြပါ။ f လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုရှိသော (အနီရောင်) နှင့် (အပြာရောင်) တစ်ရှူးအပိုင်းများ၏ ကိုယ်စားပြုဆန့်နိုင်အားခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု၊ တူညီသောအပိုင်းမှ တစ်ရှူးအပိုင်းများ၏ ဒေသဆယ်ခု၏ အရိပ်အယောင်များ။ အောက်ခြေကန့်များတွင် မတူညီသောအပိုင်းများမှ နေရာဆယ်ခုတွင် လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုရှိသော နှင့် မရှိသော တစ်ရှူးအပိုင်းများ၏ ဆန့်နိုင်အားရာခိုင်နှုန်းကွာခြားချက်ကို ပြသထားသည်။ (n = မတူညီသော ဝက်များမှ အချပ် ၈ ချပ်/အုပ်စု၊ Two-tailed Student t-test ကို ပြုလုပ်သည်။ ****p < 0.0001၊ **p < 0.01၊ *p < 0.05)။ (n = မတူညီသော ဝက်များမှ အချပ် ၈ ချပ်/အုပ်စု၊ Two-tailed Student t-test ကို ပြုလုပ်သည်။ ****p < 0.0001၊ **p < 0.01၊ *p < 0.05)။ (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01,*5). (n = မတူညီသော ဝက်များမှ အပိုင်း ၈ ခု/အုပ်စု၊ two-tailed Student's t-test; ****p<0.0001၊ **p<0.01၊ *p<0.05)။ (n = 8片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05)။ (n = 8片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05)။ (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05)။ (n = အပိုင်း ၈ ခု/အုပ်စု၊ မတူညီသော ဝက်များမှ၊ two-tailed Student's t-test; ****p<0.0001၊ **p<0.01၊ *p<0.05)။အမှားဘားများသည် ပျမ်းမျှ ± စံသွေဖည်မှုကို ကိုယ်စားပြုသည်။
ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင် static biomimetic နှလုံးအပိုင်းအစ ယဉ်ကျေးမှုစနစ် [၂၀၊ ၂၁] တွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုကို အသုံးပြုခြင်းနှင့် အလတ်စားဖွဲ့စည်းမှုကို အကောင်းဆုံးဖြစ်အောင်ပြုလုပ်ခြင်းဖြင့် နှလုံးအပိုင်းအစများ၏ အသက်ရှင်နိုင်မှု၊ လုပ်ဆောင်ချက်နှင့် ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ တည်တံ့ခိုင်မြဲမှုကို ၆ ရက်ကြာ ထိန်းသိမ်းခဲ့သည်။ သို့သော် ၁၀ ရက်အကြာတွင် ဤကိန်းဂဏန်းများသည် သိသိသာသာကျဆင်းသွားခဲ့သည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင် static biomimetic ယဉ်ကျေးမှုစနစ် ၂၀၊ ၂၁ ထိန်းချုပ်မှုအခြေအနေများ (Ctrl) တွင် မွေးမြူထားသော အပိုင်းများကို ရည်ညွှန်းမည်ဖြစ်ပြီး ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင်က အကောင်းဆုံးဖြစ်အောင်ပြုလုပ်ထားသော အလတ်စားကို MC အခြေအနေများနှင့် တစ်ပြိုင်နက်တည်း စက်ပိုင်းဆိုင်ရာနှင့် လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှု (CTCM) အောက်တွင် မွေးမြူခြင်းကို အသုံးပြုပါမည်။ ဟုခေါ်သည်။ ပထမဦးစွာ၊ လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုမပါဘဲ စက်ပိုင်းဆိုင်ရာလှုံ့ဆော်မှုသည် တစ်ရှူးအသက်ရှင်နိုင်မှုကို ၆ ရက်ကြာ ထိန်းသိမ်းရန် မလုံလောက်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ ၃က၊ ခ)။ စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ STCM ကို အသုံးပြု၍ ဇီဝကမ္မ-စက်ပိုင်းဆိုင်ရာနှင့် လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုကို မိတ်ဆက်ခြင်းဖြင့် ၁၂ ရက်ကြာ နှလုံးအပိုင်းအစများ၏ အသက်ရှင်နိုင်မှုသည် MTT ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုမှပြသထားသည့်အတိုင်း MS အခြေအနေများအောက်တွင် လတ်ဆတ်သော နှလုံးအပိုင်းအစများကဲ့သို့ အတူတူပင်ရှိနေသော်လည်း Ctrl အခြေအနေများအောက်တွင်မူ အတူတူပင်ဖြစ်နေခဲ့သည် (ပုံ ၁)။ ၃က)။ ဒါက နှလုံးစက်ဝန်းကို စက်ပိုင်းဆိုင်ရာလှုံ့ဆော်မှုနဲ့ သရုပ်ဖော်မှုက ကျွန်ုပ်တို့ရဲ့ယခင် static culture system မှာ ဖော်ပြထားတာထက် နှစ်ဆပိုကြာရှည်စွာ တစ်ရှူးအပိုင်းအစတွေကို အသက်ရှင်နေစေနိုင်တယ်ဆိုတာကို အကြံပြုထားပါတယ်။ ဒါပေမယ့် နှလုံး troponin T နဲ့ connexin 43 တို့ကို immunolabeling လုပ်ခြင်းဖြင့် တစ်ရှူးအပိုင်းအစတွေရဲ့ ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ တည်တံ့မှုကို အကဲဖြတ်ခြင်းက connexin 43 ဖော်ပြမှုဟာ တစ်ရက်တည်းမှာ MC တစ်ရှူးတွေမှာ သိသိသာသာမြင့်မားကြောင်း ပြသခဲ့ပါတယ်။ ဒါပေမယ့် တစ်ရှူးတွေရဲ့ တစ်ရှူးတွေရဲ့ တစ်ရှူးဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ တည်တံ့မှုကို တိုင်းတာဖို့ uniform connexin 43 ဖော်ပြမှုနဲ့ Z-disc ဖွဲ့စည်းမှုကို အပြည့်အဝထိန်းသိမ်းထားနိုင်ခြင်း မရှိပါဘူး (ပုံ 3b)။ တစ်ရှူးဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ တည်တံ့မှုကို တိုင်းတာဖို့ artificial intelligence (AI) framework26၊ troponin-T နဲ့ connexin staining43 ကိုအခြေခံတဲ့ image-based deep learning pipeline43 ကို အသုံးပြုပြီး localization ရဲ့အစွမ်းသတ္တိအရ နှလုံးအပိုင်းအစတွေရဲ့ ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ တည်တံ့မှုနဲ့ fluorescence ကို အလိုအလျောက်တိုင်းတာပါတယ်။ ဒီနည်းလမ်းက Convolutional Neural Network (CNN) နဲ့ deep learning framework ကိုအသုံးပြုပြီး reference မှာဖော်ပြထားတဲ့အတိုင်း အလိုအလျောက်နဲ့ ဘက်မလိုက်ဘဲ နှလုံးတစ်ရှူးရဲ့ ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ တည်တံ့မှုကို ယုံကြည်စိတ်ချစွာ တိုင်းတာနိုင်ပါတယ်။ ၂၆။ MC တစ်ရှူးဟာ static control sections တွေနဲ့ နှိုင်းယှဉ်ရင် နေ့ 0 နဲ့ ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ ဆင်တူမှု တိုးတက်လာတာကို ပြသခဲ့ပါတယ်။ ထို့အပြင်၊ Masson's trichrome staining သည် ပိုးမွှားမွေးမြူသည့် ၁၂ ရက်မြောက်နေ့တွင် ထိန်းချုပ်အခြေအနေများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက MS အခြေအနေအောက်တွင် fibrosis ရာခိုင်နှုန်း သိသိသာသာ လျော့နည်းကြောင်း တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ ၃ဂ)။ CTCM သည် ၁၂ ရက်မြောက်နေ့တွင် နှလုံးတစ်ရှူးအပိုင်းများ၏ အသက်ရှင်နိုင်စွမ်းကို လတ်ဆတ်သော နှလုံးတစ်ရှူးများနှင့် ဆင်တူသောအဆင့်သို့ မြှင့်တင်ပေးခဲ့သော်လည်း နှလုံးအပိုင်းများ၏ ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံ တည်တံ့မှုကို သိသိသာသာ တိုးတက်ကောင်းမွန်လာစေခြင်းမရှိပါ။
ဘားဂရပ်တစ်ခုသည် မတူညီသောဝက်များမှ လတ်ဆတ်သော နှလုံးအချပ်များ (D0) သို့မဟုတ် နှလုံးအချပ်များ မွေးမြူခြင်း (D12 Ctrl) တွင် သို့မဟုတ် CTCM (D12 MC) တွင် ၁၂ ရက်ကြာ မွေးမြူခြင်း (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) အချပ်/အုပ်စုကို မွေးမြူခြင်း၊ တစ်လမ်းသွား ANOVA စမ်းသပ်မှုကို ပြုလုပ်သည်။ D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ####p < 0.0001 နှင့် D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက **p < 0.01) ဖြစ်သည်။ ဘားဂရပ်တစ်ခုသည် မတူညီသောဝက်များမှ လတ်ဆတ်သော နှလုံးအချပ်များ (D0) သို့မဟုတ် နှလုံးအချပ်များ မွေးမြူခြင်း (D12 Ctrl) တွင် ၁၂ ရက်ကြာ static culture (D12 Ctrl) သို့မဟုတ် CTCM (D12 MC) တွင် ပြုလုပ်သော (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) အချပ်/အုပ်စုတွင်၊ တစ်လမ်းသွား ANOVA စမ်းသပ်မှုကို ပြုလုပ်သည်။ D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ####p < 0.0001 နှင့် D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက **p < 0.01) ဖြစ်သည်။Histogram သည် မတူညီသော ဝက်များမှ static culture (D12 control) သို့မဟုတ် CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 control) တွင် MTT လတ်ဆတ်သော နှလုံးအပိုင်းအစများ (D0) သို့မဟုတ် နှလုံးအပိုင်းအစများကို ၁၂ ရက်ကြာ မွေးမြူခြင်း (n = 18 (D0), 15 (D12 control)) တွင် တိုင်းတာသည်။ ) ), 12 (D12 MC) အပိုင်းအစများ/အုပ်စုတွင် မွေးမြူခြင်းဖြင့် one-way ANOVA စမ်းသပ်မှုကို ပြုလုပ်သည်။####p < 0,0001 по сравнению с D0 နှင့် **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl)။ ####D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက p < 0.0001 နှင့် D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက **p < 0.01)။ a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行OV单向AN；相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p < ၀.၀၁)။ a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(楐匇新10)၊ (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p။)မတူညီသော ဝက်များမှ လတ်ဆတ်သော နှလုံးအပိုင်းများ (D0) သို့မဟုတ် static culture (D12 control) သို့မဟုတ် CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 control)) ၊ 12 (D12 MC) အပိုင်း/အုပ်စု၊ တစ်လမ်းသွား ANOVA စမ်းသပ်မှုတွင် ၁၂ ရက်ကြာ မွေးမြူထားသော နှလုံးအပိုင်းများတွင် MTT အသက်ရှင်နိုင်မှုကို ပမာဏပြသသည့် histogram;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl)။ ####D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက p < 0.0001၊ D12 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက **p < 0.01 Ctrl)။b) ကိုယ်စားပြု immunofluorescence ပုံများ (blank scale = 100 µm) ၏ အသစ်ခွဲထုတ်ထားသော နှလုံးအပိုင်းများ (D0) သို့မဟုတ် static conditions (Ctrl) သို့မဟုတ် CTCM conditions (MC) conditions (12) အောက်တွင် မွေးမြူထားသော နှလုံးအပိုင်းများတွင် Troponin-T (အစိမ်းရောင်)၊ connexin 43 (အနီရောင်) နှင့် DAPI (အပြာရောင်) တို့ကို တွေ့ရှိရသည်။ နှလုံးတစ်ရှူးဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ တည်တံ့ခိုင်မြဲမှု၏ အတုဥာဏ်ရည်တိုင်းတာခြင်း (n = 7 (D0)၊ 7 (D12 Ctrl)၊ 5 (D12 MC) အပိုင်း/အုပ်စုကို မတူညီသော ဝက်များမှ တစ်လမ်းသွား ANOVA စစ်ဆေးမှု ပြုလုပ်သည်။ D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ####p < 0.0001 နှင့် D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ****p < 0.0001)။ နှလုံးတစ်ရှူးဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ တည်တံ့ခိုင်မြဲမှု၏ အတုဥာဏ်ရည်တိုင်းတာခြင်း (n = 7 (D0)၊ 7 (D12 Ctrl)၊ 5 (D12 MC) အပိုင်းအစများ/အုပ်စုကို မတူညီသော ဝက်များမှ၊ တစ်လမ်းသွား ANOVA စစ်ဆေးမှု ပြုလုပ်သည်။ D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ####p < 0.0001 နှင့် D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ****p < 0.0001)။ Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0) 1 MC), 7 (D0) ၊ срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; D12 Ctrl)။ ဉာဏ်ရည်တုဖြင့် နှလုံးတစ်ရှူး၏ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ တည်တံ့မှုကို တိုင်းတာခြင်း (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) အပိုင်း/အုပ်စုများကို မတူညီသော ဝက်များမှ၊ တစ်လမ်းသွား ANOVA စမ်းသပ်မှု ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ####p < 0.0001 နှင့် D0 နှင့် ****p < 0.0001 တို့ကို D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါ)။人工智能量化心脏组织结构完整性(n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) အချပ်/အုပ်စုတစ်ခုစီ၊ မတူညီသောဝက်တစ်ခုစီ၏ ANOVA စမ်းသပ်မှု;####0D 10 < 0 .相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）။人工智能量化心脏组织结构完整性(n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) အချပ်များ/မတူညီသော ဝက်တစ်ခုစီကို အုပ်စုလိုက်၊ တစ်လမ်းမောင်း ANOVA စမ်းသပ်မှု;###0.0 <10与D0相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）။ Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7D) (D10)၊ срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; Ctrl)။ နှလုံးတစ်ရှူး၏ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ တည်တံ့မှုကို ပမာဏသတ်မှတ်ရန် အတုဥာဏ်ရည် (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) မတူညီသော ဝက်များ၏ အပိုင်း/အုပ်စုတစ်ခုစီ၊ တစ်လမ်းသွား ANOVA စမ်းသပ်မှု; ####p<0.0001 vs .D0 နှိုင်းယှဉ်ချက်အတွက် ****p < 0.0001 D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါ)။ c Masson's trichrome stain ဖြင့် ဆေးဆိုးထားသော နှလုံးအချပ်များအတွက် ကိုယ်စားပြုပုံများ (ဘယ်ဘက်) နှင့် ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်း (ညာဘက်) (Scale bare = 500 µm) (ဝက်အမျိုးမျိုးမှ n = 10 အချပ်/အုပ်စုတစ်ခုစီ၊ one-way ANOVA စမ်းသပ်မှုကို ပြုလုပ်သည်။ D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ####p < 0.0001 နှင့် D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ***p < 0.001)။ c Masson's trichrome stain ဖြင့် ဆေးဆိုးထားသော နှလုံးအချပ်များအတွက် ကိုယ်စားပြုပုံများ (ဘယ်ဘက်) နှင့် ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်း (ညာဘက်) (Scale bare = 500 µm) (ဝက်အမျိုးမျိုးမှ n = 10 အချပ်/အုပ်စုတစ်ခုစီ၊ one-way ANOVA စမ်းသပ်မှုကို ပြုလုပ်သည်။ D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက #### p < 0.0001 နှင့် D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ***p < 0.001)။ c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенныхроным Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется < односторост; 0,0001 по сравнению с D0 နှင့် ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl)။ c Masson's trichrome stain (uncoated scale = 500 µm) ဖြင့် ဆေးဆိုးထားသော နှလုံးအပိုင်းများ၏ ကိုယ်စားပြုပုံများ (ဘယ်ဘက်) နှင့် ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်း (ညာဘက်) (မတူညီသော ဝက်များမှ n = 10 အပိုင်း/အုပ်စု၊ one-way ANOVA စမ်းသပ်မှု ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက #### p < 0 .0001 နှင့် D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ***p < 0.001)။ c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 µm (n = 100)个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p 1相 2 0.0) C用 masson 三色染料的心脏切片的代表性（左左）量化（右）裸尺度裸尺度尦尦尦尦尦度500 µm)(n=10个切片组每组来自不同猪，进行单向单向 Anova 测试；###0#0 <10相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比)။ c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенныхро т Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощьою дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl)။ c Masson's trichrome stain (blank = 500 µm) ဖြင့် ဆေးဆိုးထားသော နှလုံးအပိုင်းများ၏ ကိုယ်စားပြုပုံများ (ဘယ်ဘက်) နှင့် ပမာဏ (ညာဘက်) (n = အပိုင်း ၁၀/အုပ်စု၊ တစ်ခုစီသည် မတူညီသော ဝက်မှဖြစ်ပြီး၊ variance ၏ one-way analysis ဖြင့် စမ်းသပ်ထားသည် ;### # D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက p < 0.0001၊ D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ***p < 0.001)။အမှားဘားများသည် ပျမ်းမျှ ± စံသွေဖည်မှုကို ကိုယ်စားပြုသည်။
ယဉ်ကျေးမှုအလတ်စားထဲသို့ မော်လီကျူးငယ်များထည့်သွင်းခြင်းဖြင့် CTCM ယဉ်ကျေးမှုအတွင်း cardiomyocyte တည်တံ့မှုကို တိုးတက်ကောင်းမွန်စေပြီး fibrosis ဖွံ့ဖြိုးမှုကို လျော့နည်းစေနိုင်သည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ ယူဆခဲ့ပါသည်။ ထို့ကြောင့် ကျွန်ုပ်တို့သည် ရှုပ်ထွေးစေသောအချက်များ နည်းပါးခြင်းကြောင့် ကျွန်ုပ်တို့၏ static control ယဉ်ကျေးမှုများကို အသုံးပြု၍ မော်လီကျူးငယ်များကို စစ်ဆေးခဲ့ပါသည်20,21။ ဤစစ်ဆေးမှုအတွက် Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), နှင့် SB431542 (SB) တို့ကို ရွေးချယ်ခဲ့ပါသည်။ ဤမော်လီကျူးငယ်များကို hiPSC-CM ယဉ်ကျေးမှုများတွင် sarcomere အရှည်၊ T-tubules နှင့် conduction velocity ကို တိုးမြှင့်ခြင်းဖြင့် cardiomyocytes များ ရင့်ကျက်လာစေရန်အတွက် ယခင်က အသုံးပြုခဲ့ပါသည်။ ထို့အပြင်၊ Dex (glucocorticoid တစ်ခု) နှင့် SB နှစ်မျိုးလုံးသည် ရောင်ရမ်းမှုကို နှိမ်နင်းသည်ဟု သိရှိကြသည်29,30။ ထို့ကြောင့် ဤမော်လီကျူးငယ်များထဲမှ တစ်ခု သို့မဟုတ် ပေါင်းစပ်ထည့်သွင်းခြင်းသည် နှလုံးအပိုင်းများ၏ ဖွဲ့စည်းပုံတည်တံ့မှုကို တိုးတက်ကောင်းမွန်စေမည်လားဆိုသည်ကို ကျွန်ုပ်တို့ စမ်းသပ်ခဲ့ပါသည်။ ကနဦးစစ်ဆေးမှုအတွက်၊ ဒြပ်ပေါင်းတစ်ခုစီ၏ ဆေးပမာဏကို ဆဲလ်ယဉ်ကျေးမှုပုံစံများတွင် အသုံးများသော အာရုံစူးစိုက်မှုများ (1 μM Dex27, 100 nM T327, နှင့် 2.5 μM SB31) အပေါ် အခြေခံ၍ ရွေးချယ်ခဲ့သည်။ ၁၂ ရက်ကြာ ပြုစုပျိုးထောင်ပြီးနောက် T3 နှင့် Dex ပေါင်းစပ်မှုသည် အကောင်းဆုံး cardiomyocyte ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ တည်တံ့မှုနှင့် အနည်းဆုံးသော အမျှင်ပြန်လည်ပြုပြင်မှုကို ဖြစ်ပေါ်စေသည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ ၄ နှင့် ၅)။ ထို့အပြင်၊ T3 နှင့် Dex ၏ ဤပါဝင်မှု နှစ်ဆ သို့မဟုတ် နှစ်ဆကို အသုံးပြုခြင်းသည် ပုံမှန်ပါဝင်မှုများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက အန္တရာယ်ရှိသော အကျိုးသက်ရောက်မှုများကို ဖြစ်ပေါ်စေသည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ ၆က၊ ခ)။
ကနဦးစစ်ဆေးပြီးနောက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ယဉ်ကျေးမှုအခြေအနေ ၄ ခုကို ဦးခေါင်းချင်းယှဉ်နှိုင်းယှဉ်ခဲ့ပါသည် (ပုံ ၄က)- Ctrl: ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင်ဖော်ပြခဲ့သော static culture တွင် ကျွန်ုပ်တို့၏ optimized medium ကို အသုံးပြု၍ မွေးမြူထားသော နှလုံးအပိုင်းအစများ၊ 20.21 TD: T3 နှင့် Ctrl သည် ဗုဒ္ဓဟူးနေ့တွင် Dex ထည့်သွင်းခဲ့သည်၊ MC: ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင် optimized medium ကို အသုံးပြု၍ CTCM တွင် မွေးမြူထားသော နှလုံးအပိုင်းအစများ၊ နှင့် MT: T3 နှင့် Dex ကို medium ထဲသို့ထည့်သွင်းထားသော CTCM။ စိုက်ပျိုးပြီး ၁၂ ရက်အကြာတွင် MS နှင့် MT တစ်ရှူးများ၏ အသက်ရှင်နိုင်စွမ်းသည် MTT assay ဖြင့် အကဲဖြတ်ထားသော လတ်ဆတ်သောတစ်ရှူးများကဲ့သို့ အတူတူပင်ရှိနေခဲ့သည် (ပုံ ၄ခ)။ စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ transwell cultures (TD) တွင် T3 နှင့် Dex ကိုထည့်သွင်းခြင်းသည် Ctrl အခြေအနေများနှင့်နှိုင်းယှဉ်ပါက အသက်ရှင်နိုင်စွမ်းတွင် သိသိသာသာတိုးတက်မှုမရရှိခဲ့ဘဲ နှလုံးအပိုင်းအစများ၏ အသက်ရှင်နိုင်စွမ်းကို ထိန်းသိမ်းရာတွင် စက်ပိုင်းဆိုင်ရာလှုံ့ဆော်မှု၏ အရေးပါသောအခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်ကြောင်း ညွှန်ပြနေသည်။
စက်ပိုင်းဆိုင်ရာလှုံ့ဆော်မှုနှင့် T3/Dex ဖြည့်စွက်မှု၏ ၁၂ ရက်ကြာ အလယ်အလတ်အပေါ် အကျိုးသက်ရောက်မှုများကို အကဲဖြတ်ရန်အသုံးပြုသည့် ယဉ်ကျေးမှုအခြေအနေလေးခုကို သရုပ်ဖော်ထားသည့် စမ်းသပ်ဒီဇိုင်းပုံ။ ခ ဘားဂရပ်သည် ယဉ်ကျေးမှုအခြေအနေ ၄ ခုလုံး (Ctrl၊ TD၊ MC နှင့် MT) တွင် မွေးမြူပြီး ၁၂ ရက်အတွင်း အသက်ရှင်နိုင်မှုပမာဏကို ယဉ်ကျေးမှုအခြေအနေ ၄ ခုလုံး (Ctrl၊ TD၊ MC နှင့် MT) တွင် ပမာဏကို နှိုင်းယှဉ်ပြသထားသည် (n = ၁၈ (D0)၊ ၁၅ (D12 Ctrl၊ D12 TD နှင့် D12 MT)၊ ၁၂ (D12 MC) ባህሪ/အုပ်စု၊ တစ်လမ်းသွား ANOVA စမ်းသပ်မှုကို ပြုလုပ်သည်။ ####p < 0.0001၊ D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ###p < 0.001 နှင့် D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက **p < 0.01)။ ခ ဘားဂရပ်သည် ယဉ်ကျေးမှုအခြေအနေ ၄ ခုလုံး (Ctrl၊ TD၊ MC နှင့် MT) တွင် မွေးမြူပြီး ၁၂ ရက်အတွင်း အသက်ရှင်နိုင်မှုပမာဏကို ယဉ်ကျေးမှုအခြေအနေ ၄ ခုလုံး (Ctrl၊ TD၊ MC နှင့် MT) တွင် ပမာဏကို နှိုင်းယှဉ်ပြသထားသည် (n = ၁၈ (D0)၊ ၁၅ (D12 Ctrl၊ D12 TD နှင့် D12 MT)၊ ၁၂ (D12 MC) ဝက်အတုံး/အုပ်စု၊ တစ်လမ်းသွား ANOVA စမ်းသပ်မှုကို ပြုလုပ်သည်။ ####p < 0.0001၊ D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ###p < 0.001 နှင့် D12 ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက **p < 0.01)။ b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после кухльтивир ования культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 TD) , D1 (D12 TD1), D1 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 နှင့် **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl)။ ခ။ ဘားဂရပ်သည် ယဉ်ကျေးမှုအခြေအနေ ၄ ခုလုံး (ထိန်းချုပ်မှု၊ TD၊ MC နှင့် MT) တွင် ယဉ်ကျေးမှုပြီးနောက် ၁၂ ရက်အတွင်း အသက်ရှင်နိုင်မှုပမာဏကို ယဉ်ကျေးမှုအခြေအနေ ၄ ခုလုံး (ထိန်းချုပ်မှု၊ TD၊ MC နှင့် MT) တွင် ပြသထားသည်။ (n = ၁၈ (D0)၊ ၁၅ (D12 Ctrl၊ D12 TD နှင့် D12 MT)၊ ၁၂ (D12 MC) အပိုင်း/အုပ်စု၊ မတူညီသောဝက်များမှ၊ တစ်လမ်းသွား ANOVA စမ်းသပ်မှု၊ ####p < 0.0001၊ ###p < 0.001 vs. D0 နှင့် **p < 0.01 D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက)။ b 条形图显示所有4种培养条件（Ctrl、TD、MC和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0))、15 (D12 D2 Ctrl 2、1D MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001*曯 < 0.001 与D0与D12控制)။ခ ၄ ၁၂ (D၁၂ MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению (со свсижием) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний теронний теронний теронний теста<0 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12)။ b ဝက် ၁၂ ကောင် (D12 MC) အပိုင်း/အုပ်စုမှ မွေးမြူရေးအခြေအနေ ၄ ခုလုံး (ထိန်းချုပ်မှု၊ TD၊ MC နှင့် MT) နှင့် လတ်ဆတ်သော နှလုံးအပိုင်းများ (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD နှင့် D12 MT)၊ one-way ANOVA စမ်းသပ်မှု၊ မတူညီသော ဝက် ၁၂ ကောင် (D12 MC) အပိုင်း/အုပ်စုမှ၊ one-way ANOVA စမ်းသပ်မှု; ####p<0.0001၊ ###p<0.001 vs. D0၊ **p<0.01 vs. ထိန်းချုပ် D12) မှ ပြသထားသော ဟစ်စတိုဂရမ်။ ဂ။ ယဉ်ကျေးမှုအခြေအနေ ၄ မျိုးလုံး (Ctrl၊ TD၊ MC နှင့် MT) တွင် ယဉ်ကျေးမှုပြုလုပ်ပြီး ၁၂ ရက်အကြာတွင် ဂလူးကို့စ်စီးဆင်းမှုကို လတ်ဆတ်သော နှလုံးအချပ်များ (D0) နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပြထားသည့် ဘားဂရပ်ကို ပြသထားသည် (ဝက်အမျိုးမျိုးမှ n = ၆ ချပ်/အုပ်စု၊ တစ်လမ်းသွား ANOVA စမ်းသပ်မှုကို ပြုလုပ်သည်။ ###p < 0.001၊ D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက နှင့် ***p < 0.001၊ D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက)။ ဂ။ ယဉ်ကျေးမှုအခြေအနေ ၄ မျိုးလုံး (Ctrl၊ TD၊ MC နှင့် MT) တွင် ယဉ်ကျေးမှုပြုလုပ်ပြီး ၁၂ ရက်အကြာတွင် ဂလူးကို့စ်စီးဆင်းမှုကို လတ်ဆတ်သော နှလုံးအချပ်များ (D0) နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပြထားသည့် ဘားဂရပ်ကို ပြသထားသည် (ဝက်အမျိုးမျိုးမှ n = ၆ ချပ်/အုပ်စု၊ တစ်လမ်းသွား ANOVA စမ်းသပ်မှုကို ပြုလုပ်သည်။ ###p < 0.001၊ D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက နှင့် ***p < 0.001၊ D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက)။ c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во 4 культивхования во культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группуы отнезов/группуы односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 နှင့် ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl)။ c Histogram သည် ပိုးသတ်ပြီး ၁၂ ရက်အကြာတွင် ပိုးသတ်အခြေအနေ ၄ ခုလုံး (ထိန်းချုပ်မှု၊ TD၊ MC နှင့် MT) အောက်တွင် ဂလူးကို့စ်စီးဆင်းမှုကို လတ်ဆတ်သော နှလုံးအပိုင်းများ (D0) နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပြသည် (n = မတူညီသော ဝက်များမှ အပိုင်း ၆ ပိုင်း/အုပ်စု၊ တစ်လမ်းသွား ANOVA စမ်းသပ်မှု ပြုလုပ်ခဲ့သည်; D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ###p < 0.001 နှင့် D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ***p < 0.001)။ c 条形图显示所有4种培养条件（Ctrl、TD、MC和MT）与新鲜心脏切片(D0)相比，培养后12天的葡萄糖通量定量(n=6片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA测试；###p < 0.001，渎D < 0.001，渎D与D12 Ctrl 相比)။ C 条形图显示所有 4种条件（（ctrl、td、mc和 mt）新鲜心脏切片切矉切片琛君吸12 天的通量定量（n=6片/组，来自猪， ， ， ， ， ， ， ， 猪猪单向执行ANOVA < 浸0.#05相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比)။ c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивилляния культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/груйпаз, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (ကွန်တရိုလီ)။ c ပိုးသတ်ပြီး ၁၂ ရက်အကြာတွင် ပိုးသတ်အခြေအနေ ၄ ခုလုံး (ထိန်းချုပ်မှု၊ TD၊ MC နှင့် MT) အတွက် ပိုးသတ်အခြေအနေအသစ် (D0) နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ဂလူးကို့စ်စီးဆင်းမှုကို ပမာဏပြသသည့် ဟစ်စတိုဂရမ် (n = 6 ပိုင်း/အုပ်စု၊ မတူညီသော ဝက်များမှ၊ တစ်ဖက်သတ်)။ ANOVA စစ်ဆေးမှုများကို ပြုလုပ်ခဲ့ပါသလား။ D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ###p < 0.001၊ D12 (ထိန်းချုပ်မှု) နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ***p < 0.001။ဃ။ ဒေသတွင်းတစ်ရှူးအပိုင်းအစဆယ်ခုတွင် လတ်ဆတ်သော (အပြာရောင်)၊ ၁၂ ရက်မြောက် MC (အစိမ်းရောင်) နှင့် ၁၂ ရက်မြောက် MT (အနီရောင်) တစ်ရှူးများ၏ မျိုးကွဲခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုပုံများ (n = ၄ ပိုင်း/အုပ်စု၊ တစ်လမ်းသွား ANOVA စမ်းသပ်မှု; အုပ်စုများအကြား သိသာထင်ရှားသော ကွာခြားချက်မရှိပါ)။ ဃ။ တည်ငြိမ်သောအခြေအနေများ (Ctrl) သို့မဟုတ် MT အခြေအနေများ (MT) အောက်တွင် ၁၀-၁၂ ရက်ကြာ ပြုစုပျိုးထောင်ထားသော နှလုံးအပိုင်းအစများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက လတ်ဆတ်သော နှလုံးအပိုင်းအစများ (D0) တွင် ကွဲပြားစွာဖော်ပြသော မျိုးဗီဇများကို ပြသသည့် မီးတောင်ပုံ။ ဃ။ ပြုစုပျိုးထောင်ထားသော အခြေအနေတစ်ခုစီအောက်တွင် ပြုစုပျိုးထောင်ထားသော နှလုံးအပိုင်းအစများအတွက် sarcomere မျိုးဗီဇများ၏ အပူမြေပုံ။ အမှားဘားများသည် ပျမ်းမျှ ± စံသွေဖည်မှုကို ကိုယ်စားပြုသည်။
ဖက်တီးအက်ဆစ်ဓာတ်တိုးခြင်းမှ ဂလိုင်ကိုလိုင်းဆစ်သို့ပြောင်းလဲခြင်းအပေါ် ဇီဝဖြစ်စဉ်မှီခိုမှုသည် cardiomyocyte dedifferentiation ၏ ထင်ရှားသောလက္ခဏာတစ်ခုဖြစ်သည်။ မရင့်ကျက်သေးသော cardiomyocytes များသည် ATP ထုတ်လုပ်ရန်အတွက် ဂလူးကို့စ်ကို အဓိကအသုံးပြုပြီး cristae5,32 အနည်းငယ်သာရှိသော hypoplastic mitochondria ရှိသည်။ ဂလူးကို့စ်အသုံးပြုမှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများက MC နှင့် MT အခြေအနေများအောက်တွင် ဂလူးကို့စ်အသုံးပြုမှုသည် နေ့ 0 တစ်ရှူးများနှင့် ဆင်တူကြောင်းပြသခဲ့သည် (ပုံ 4c)။ သို့သော် Ctrl နမူနာများသည် လတ်ဆတ်သောတစ်ရှူးများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ဂလူးကို့စ်အသုံးပြုမှုတွင် သိသိသာသာတိုးလာကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ ၎င်းသည် CTCM နှင့် T3/Dex ပေါင်းစပ်မှုသည် တစ်ရှူးရှင်သန်နိုင်မှုကို မြှင့်တင်ပေးပြီး ၁၂ ရက်ကြာ ပြုပြင်ထားသော နှလုံးအပိုင်းများ၏ ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ phenotype ကို ထိန်းသိမ်းထားကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ ထို့အပြင်၊ strain analysis သည် MT နှင့် MS အခြေအနေများအောက်တွင် ၁၂ ရက်ကြာ strain အဆင့်များသည် လတ်ဆတ်သော နှလုံးတစ်ရှူးများကဲ့သို့ အတူတူပင်ရှိနေကြောင်းပြသခဲ့သည် (ပုံ 4d)။
CTCM နှင့် T3/Dex တို့၏ နှလုံးအပိုင်းတစ်ရှူး၏ ကမ္ဘာလုံးဆိုင်ရာ transcriptional ရှုခင်းအပေါ် အလုံးစုံသက်ရောက်မှုကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် မတူညီသော ယဉ်ကျေးမှုအခြေအနေလေးခုလုံးမှ နှလုံးအပိုင်းများပေါ်တွင် RNAseq ကို လုပ်ဆောင်ခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲဒေတာ ၁)။ စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ MT အပိုင်းများသည် လတ်ဆတ်သော နှလုံးတစ်ရှူးနှင့် မြင့်မားသော transcriptional ဆင်တူမှုကို ပြသခဲ့ပြီး မျိုးဗီဇ ၁၃,၆၄၂ ခုတွင် ၁၆ ခုသာ ကွဲပြားစွာဖော်ပြခဲ့သည်။ သို့သော်၊ ကျွန်ုပ်တို့အစောပိုင်းက ပြသခဲ့သည့်အတိုင်း Ctrl အပိုင်းများသည် ယဉ်ကျေးမှုတွင် ၁၀-၁၂ ရက်အကြာတွင် ကွဲပြားစွာဖော်ပြသော မျိုးဗီဇ ၁၂၂၉ ခုကို ပြသခဲ့သည် (ပုံ ၄e)။ ဤဒေတာများကို နှလုံးနှင့် fibroblast မျိုးဗီဇများ၏ qRT-PCR ဖြင့် အတည်ပြုခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ ၇a-ဂ)။ စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ Ctrl အပိုင်းများသည် နှလုံးနှင့် ဆဲလ်စက်ဝန်း မျိုးဗီဇများ လျော့နည်းသွားခြင်းနှင့် ရောင်ရမ်းမှု မျိုးဗီဇပရိုဂရမ်များကို အသက်ဝင်စေခြင်းကို ပြသခဲ့သည်။ ဤဒေတာများသည် ရေရှည်ယဉ်ကျေးမှုပြီးနောက် ပုံမှန်အားဖြင့် ဖြစ်ပေါ်လေ့ရှိသော dedifferentiation သည် MT အခြေအနေများအောက်တွင် လုံးဝလျော့နည်းသွားကြောင်း အကြံပြုထားသည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ ၈a၊ခ)။ sarcomere မျိုးဗီဇများကို ဂရုတစိုက်လေ့လာမှုအရ MT အခြေအနေများအောက်တွင်သာ sarcomere (ပုံ ၄f) နှင့် ion channel (နောက်ဆက်တွဲပုံ ၉) ကို encode လုပ်ထားသော မျိုးဗီဇများသည် Ctrl၊ TD နှင့် MC အခြေအနေများအောက်တွင် နှိမ်နင်းမှုမှ ကာကွယ်ပေးပြီး ထိန်းသိမ်းထားသည်ကို ပြသသည်။ ဤဒေတာများအရ စက်ပိုင်းဆိုင်ရာနှင့် humoral လှုံ့ဆော်မှု (T3/Dex) ပေါင်းစပ်ခြင်းဖြင့် heart slice transcriptome သည် မွေးမြူရေးတွင် ၁၂ ရက်ကြာပြီးနောက် လတ်ဆတ်သော နှလုံးအပိုင်းအစများနှင့် ဆင်တူနေနိုင်ကြောင်း ပြသသည်။
ဤမှတ်တမ်းတွေ့ရှိချက်များကို နှလုံးအပိုင်းများရှိ cardiomyocytes များ၏ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ တည်တံ့မှုကို MT အခြေအနေအောက်တွင် ၁၂ ရက်ကြာ အကောင်းဆုံးထိန်းသိမ်းထားနိုင်သည်ဟူသောအချက်ဖြင့် ထောက်ခံထားပြီး၊ ၎င်းကို အပြည့်အဝတည်ရှိပြီး ဒေသအလိုက် connexin 43 (ပုံ ၅က) မှပြသထားသည်။ ထို့အပြင်၊ MT အခြေအနေများအောက်တွင် နှလုံးအပိုင်းများရှိ fibrosis သည် Ctrl နှင့်နှိုင်းယှဉ်ပါက သိသိသာသာလျော့နည်းသွားပြီး နှလုံးအပိုင်းအသစ်များနှင့် ဆင်တူသည် (ပုံ ၅ခ)။ ဤဒေတာများက စက်ပိုင်းဆိုင်ရာလှုံ့ဆော်မှုနှင့် T3/Dex ကုသမှုပေါင်းစပ်ခြင်းသည် ဓာတ်ခွဲခန်းတွင် နှလုံးအပိုင်းများရှိ နှလုံးဖွဲ့စည်းပုံကို ထိရောက်စွာထိန်းသိမ်းပေးကြောင်း ပြသသည်။
troponin-T (အစိမ်းရောင်)၊ connexin 43 (အနီရောင်) နှင့် DAPI (အပြာရောင်) တို့၏ ကိုယ်စားပြု immunofluorescence ပုံရိပ်များ (a)။ နှလုံးအပိုင်းလေးပိုင်းလုံးတွင် သီးခြားခွဲထားသော သို့မဟုတ် ၁၂ ရက်ကြာ မွေးမြူထားသည် (scale bar = 100 µm)။ နှလုံးတစ်ရှူးဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ တည်တံ့ခိုင်မြဲမှု၏ အတုဥာဏ်ရည်တိုင်းတာခြင်း (n = 7 (D0 နှင့် D12 Ctrl)၊ မတူညီသော ဝက်များမှ 5 (D12 TD၊ D12 MC နှင့် D12 MT) အပိုင်း/အုပ်စု၊ တစ်လမ်းသွား ANOVA စစ်ဆေးမှု ပြုလုပ်သည်။ D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ####p < 0.0001 နှင့် *p < 0.05၊ သို့မဟုတ် D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ****p < 0.0001)။ နှလုံးတစ်ရှူးဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ တည်တံ့ခိုင်မြဲမှု၏ အတုဥာဏ်ရည်တိုင်းတာခြင်း (n = 7 (D0 နှင့် D12 Ctrl)၊ မတူညီသော ဝက်များမှ 5 (D12 TD၊ D12 MC နှင့် D12 MT) အပိုင်း/အုပ်စု၊ တစ်လမ်းသွား ANOVA စမ်းသပ်မှုကို ပြုလုပ်သည်။ #### D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက p < 0.0001 နှင့် *p < 0.05၊ သို့မဟုတ် D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ****p < 0.0001)။ Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта D 2 (n tеллекта) (n = 7)၊ D12 MC и D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сир 0 не ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)။ အတုဥာဏ်ရည် (n = 7 (D0 နှင့် D12 Ctrl)၊ မတူညီသော ဝက်များမှ အပိုင်း/အုပ်စု 5 (D12 TD၊ D12 MC နှင့် D12 MT) ကို အသုံးပြု၍ နှလုံးတစ်ရှူး၏ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ တည်တံ့မှုကို တိုင်းတာခြင်း၊ တစ်လမ်းသွား ANOVA စမ်းသပ်မှု ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ #### D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက p < 0.0001 နှင့် D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက *p < 0.05 သို့မဟုတ် ****p < 0.0001)။对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7(D0 和D12 Ctrl)、5(D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 戈 爱与D12 Ctrl 相比)။对不同猪的心脏结构完整性（n=7 (d0和 d12 ctrl）（5（d12 td、d12 mc和 d12 mt）巺猄）၊进行单向单向单向测试； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或 ****p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05相比，或 ****p < 0.000 )တစ်လမ်းသွား ANOVA စမ်းသပ်မှုဖြင့် မတူညီသော ဝက်များ (n = 7 (D0 နှင့် D12 Ctrl)၊ 5 (D12 TD၊ D12 MC နှင့် D12 MT) အပိုင်း/အုပ်စု) တွင် ဉာဏ်ရည်တုကို အသုံးပြု၍ နှလုံးတစ်ရှူး၏ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ တည်တံ့မှုကို တိုင်းတာခြင်း။#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)။ #### D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက p < 0.0001 နှင့် D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက *p < 0.05 သို့မဟုတ် ****p < 0.0001)။ b Masson's trichrome stain ဖြင့် ဆေးဆိုးထားသော နှလုံးအချပ်များအတွက် ကိုယ်စားပြုပုံများနှင့် ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်း (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0၊ D12 Ctrl၊ D12 TD နှင့် D12 MC)၊ မတူညီသော ဝက်များမှ အချပ် ၉ ခု (D12 MT)၊ တစ်လမ်းသွား ANOVA စမ်းသပ်မှုကို ပြုလုပ်သည်။ D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ####p < 0.0001 နှင့် ***p < 0.001၊ သို့မဟုတ် D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ****p < 0.0001)။ b Masson's trichrome stain ဖြင့် ဆေးဆိုးထားသော နှလုံးအချပ်များအတွက် ကိုယ်စားပြုပုံများနှင့် ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်း (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0၊ D12 Ctrl၊ D12 TD နှင့် D12 MC)၊ မတူညီသော ဝက်များမှ အချပ် ၉ ခု (D12 MT)၊ တစ်လမ်းသွား ANOVA စမ်းသပ်မှုကို ပြုလုပ်သည်။ D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ####p < 0.0001 နှင့် ***p < 0.001၊ သို့မဟုတ် D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ****p < 0.0001)။ b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красит (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)။ b Masson's trichrome stain (scale bar = 500 µm) ဖြင့် ဆေးဆိုးထားသော နှလုံးအပိုင်းများ၏ ကိုယ်စားပြုပုံများနှင့် ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်း (n = 10 (D0၊ D12 Ctrl၊ D12 TD နှင့် D12 MC)၊ မတူညီသော ဝက်များမှ အပိုင်း ၉ ခု (D12 MT)/အုပ်စု၊ one-way ANOVA ပြုလုပ်ထားသည်။ ####p < 0.0001 vs. D0 နှင့် ***p < 0.001 သို့မဟုတ် ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl)။ b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化(比例尺= 500 µm) (n = 10 (D Ctrl 2 နှင့် 12 12) MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相*p < 0.0001 与D0 相* 0.0001 与D12 Ctrl 相比)။ b用 masson 三色染料的心脏切片的代表性和量化（比例尺尺尺 = 500 µm） (d 1 1 0 µm) (d 1 1 ct ၊ td 和 d12 mc) 来自不同的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片切片切片切片切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相 < 1***p ， 0***p < 0.0001 与D0 相< 0***p ， 0.0001 与D12 Ctrl 相比)။ b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом млийсона 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA<0; #0#пособ ANOVA<0; #0 сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)။ b Masson's trichrome (scale bar = 500 µm) ဖြင့် ဆေးဆိုးထားသော နှလုံးအပိုင်းများ၏ ကိုယ်စားပြုပုံများနှင့် ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်း (n = 10 (D0၊ D12 Ctrl၊ D12 TD နှင့် D12 MC)၊ မတူညီသော ဝက်များ/အုပ်စုမှ အပိုင်း ၉ ပိုင်း (D12 MT)၊ ANOVA နည်းလမ်းတစ်ခုတည်း။ D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ####p < 0.0001၊ D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ***p < 0.001 သို့မဟုတ် ****p < 0.0001)။အမှားဘားများသည် ပျမ်းမျှ ± စံသွေဖည်မှုကို ကိုယ်စားပြုသည်။
နောက်ဆုံးအနေနဲ့ CTCM ရဲ့ နှလုံးသွေးကြောကျယ်လာမှုကို တုပနိုင်စွမ်းကို နှလုံးတစ်ရှူးဆန့်နိုင်စွမ်းကို တိုးမြှင့်ခြင်းဖြင့် အကဲဖြတ်ခဲ့ပါတယ်။ CTCM မှာ အမြင့်ဆုံးလေခန်းဖိအားဟာ 80 mmHg မှ 80 mmHg အထိ မြင့်တက်လာခဲ့ပါတယ်။ ပုံမှန်ဆန့်တန်းမှု (ပုံမှန်ဆန့်တန်းမှု) ဟာ 140 mmHg အထိ မြင့်တက်လာခဲ့ပါတယ် (ပုံ 6a)။ ဒါက ဆန့်တန်းမှု 32% တိုးလာမှုနဲ့ ကိုက်ညီပါတယ် (ပုံ 6b)၊ အရင်က နှလုံးအပိုင်းတွေအတွက် သွေးကြောကျယ်လာမှုမှာ တွေ့ရတဲ့အတိုင်း sarcomere အရှည်ရရှိဖို့ လိုအပ်တဲ့ သက်ဆိုင်ရာ ရာခိုင်နှုန်းဆန့်တန်းမှုအဖြစ် ပြသခဲ့ပါတယ်။ ကျုံ့ဝင်ခြင်းနဲ့ ပြေလျော့ခြင်းအတွင်း နှလုံးတစ်ရှူးရဲ့ ဆန့်တန်းမှုနဲ့ အလျင်ဟာ မွေးမြူရေးလုပ်တဲ့ ခြောက်ရက်တာကာလအတွင်း တည်ငြိမ်နေခဲ့ပါတယ် (ပုံ 6c)။ MT အခြေအနေများမှ နှလုံးတစ်ရှူးကို ခြောက်ရက်ကြာ ပုံမှန်ဆန့်တန်းမှု (MT (ပုံမှန်)) သို့မဟုတ် အလွန်အကျွံဆန့်တန်းမှုအခြေအနေ (MT (OS)) ကို မွေးမြူရေးလုပ်ခဲ့ပါတယ်။ မွေးမြူရေးလုပ်တဲ့ လေးရက်အကြာမှာတော့ MT (ပုံမှန်) အခြေအနေနဲ့ နှိုင်းယှဉ်ရင် MT (OS) အခြေအနေများအောက်ရှိ အလယ်အလတ်မှာ မြင့်မားတဲ့ ဇီဝအမှတ်အသား NT-ProBNP ဟာ MT (ပုံမှန်) အခြေအနေနဲ့ နှိုင်းယှဉ်ရင် သိသိသာသာ မြင့်တက်လာခဲ့ပါတယ် (ပုံ 7a)။ ထို့အပြင်၊ ခြောက်ရက်ကြာ ပြုစုပျိုးထောင်ပြီးနောက်၊ MT (OS) ရှိ ဆဲလ်အရွယ်အစားသည် (ပုံမှန်) MT နှလုံး၏ အစိတ်အပိုင်းများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက သိသိသာသာ တိုးလာသည် (ပုံ ၇ခ)။ ထို့အပြင်၊ NFATC4 နျူကလီးယား ရွှေ့ပြောင်းမှုသည် ဆန့်ထွက်နေသော တစ်ရှူးများတွင် သိသိသာသာ တိုးလာသည် (ပုံ ၇ဂ)။ ဤရလဒ်များသည် အလွန်အကျွံ ကျဉ်းမြောင်းပြီးနောက် ရောဂါဗေဒဆိုင်ရာ ပြန်လည်ပြုပြင်ခြင်း၏ တိုးတက်ပြောင်းလဲမှုကို ပြသပြီး CTCM ကိရိယာကို ဆန့်ထွက်မှုကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာသော နှလုံးသွေးကြောချဲ့ခြင်း အချက်ပြမှုကို လေ့လာရန် ပလက်ဖောင်းတစ်ခုအဖြစ် အသုံးပြုနိုင်သည်ဟူသော အယူအဆကို ထောက်ခံပါသည်။
လေခန်းဖိအား၊ အရည်ခန်းဖိအားနှင့် တစ်ရှူးရွေ့လျားမှုတိုင်းတာမှုများ၏ ကိုယ်စားပြုလက္ခဏာများက အခန်းဖိအားသည် အရည်ခန်းဖိအားကို ပြောင်းလဲစေပြီး တစ်ရှူးအပိုင်း၏ သက်ဆိုင်ရာရွေ့လျားမှုကို ဖြစ်ပေါ်စေကြောင်း အတည်ပြုသည်။ b ပုံမှန်ဆန့်ထားသော (လိမ္မော်ရောင်) နှင့် အလွန်အကျွံဆန့်ထားသော (အပြာရောင်) တစ်ရှူးအပိုင်းများအတွက် ကိုယ်စားပြုဆန့်ထုတ်ရာခိုင်နှုန်းနှင့် ဆန့်ထုတ်နှုန်းမျဉ်းကွေးများ။ c စက်ဝန်းအချိန် (ဝက်အမျိုးမျိုးမှ အုပ်စုတစ်ခုလျှင် n = ၁၉ ချပ်)၊ ကျုံ့ချိန် (ဝက်အမျိုးမျိုးမှ အုပ်စုတစ်ခုလျှင် n = ၁၈-၁၉ ချပ်)၊ ပြေလျော့ချိန် (ဝက်အမျိုးမျိုးမှ အုပ်စုတစ်ခုလျှင် n = ၁၉ ချပ်)၊ တစ်ရှူးရွေ့လျားမှုပမာဏ (ဝက်အမျိုးမျိုးမှ အုပ်စုတစ်ခုလျှင် n = ၁၄ ချပ်)၊ အမြင့်ဆုံး systolic velocity (ဝက်အမျိုးမျိုးမှ အုပ်စုတစ်ခုလျှင် n = ၁၄ ချပ်) နှင့် အမြင့်ဆုံးပြေလျော့နှုန်း (ဝက်အမျိုးမျိုးမှ အပိုင်း/အုပ်စုများ)၊ two-tailed Student's t-test သည် မည်သည့် parameter တွင်မျှ သိသာထင်ရှားသောကွာခြားချက်မပြဘဲ overvoltage ဖြင့် မွေးမြူသည့်ရက် ၆ ရက်အတွင်း ဤ parameter များသည် တသမတ်တည်းရှိနေကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ Error bar များသည် ပျမ်းမျှ ± standard deviation ကိုကိုယ်စားပြုသည်။
MT ပုံမှန်ဆန့်ထုတ်မှု (Norm) သို့မဟုတ် အလွန်အကျွံဆန့်ထုတ်ခြင်း (OS) အခြေအနေများအောက်တွင် မွေးမြူထားသော နှလုံးအချပ်များမှ ယဉ်ကျေးမှုမီဒီယာတွင် NT-ProBNP ပါဝင်မှု၏ ဘားဂရပ်ပမာဏ (n = 4 (D2 MTNorm)၊ မတူညီသော ဝက်များမှ 3 (D2 MTOS၊ D4 MTNorm နှင့် D4 MTOS) အချပ်/အုပ်စု၊ နှစ်လမ်းသွား ANOVA ကို လုပ်ဆောင်သည်။ ပုံမှန်ဆန့်ထုတ်မှုနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက **p < 0.01)။ a) MT ပုံမှန်ဆန့်ထုတ်မှု (Norm) သို့မဟုတ် အလွန်အကျွံဆန့်ထုတ်ခြင်း (OS) အခြေအနေများအောက်တွင် မွေးမြူထားသော နှလုံးအချပ်များမှ ယဉ်ကျေးမှုမီဒီယာတွင် NT-ProBNP ပါဝင်မှု၏ ဘားဂရပ်ပမာဏ (n ​​= 4 (D2 MTNorm)၊ မတူညီသောဝက်များမှ 3 (D2 MTOS၊ D4 MTNorm နှင့် D4 MTOS) အချပ်/အုပ်စု၊ နှစ်လမ်းသွား ANOVA ကို လုပ်ဆောင်သည်။ ပုံမှန်ဆန့်ထုတ်မှုနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက **p < 0.01)။မတူညီသော ဝက်များမှ ပုံမှန် MT ဆန့်တန်းမှု (norm) သို့မဟုတ် အလွန်အကျွံဆန့်တန်းမှု (OS) (n = 4 (D2 MTNorm)၊ 3 (D2 MTOS၊ D4 MTNorm နှင့် D4).MTOS) ዘዴ/အုပ်စုအောက်တွင် မွေးမြူထားသော နှလုံးအပိုင်းအစများမှ ယဉ်ကျေးမှုအလတ်စားတွင် NT-ProBNP ပါဝင်မှု၏ ပမာဏဆိုင်ရာ ဟစ်စတိုဂရမ်၊ ကွဲလွဲမှု၏ နှစ်ဆင့်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ပြုလုပ်သည်။**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением)။ ပုံမှန်ဆန့်ထုတ်မှုနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက p < 0.01)။ a 在MT 正常拉伸(စံ) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓叇的匝MTNorm)、3(D2 MTOS、D4 MTNorm和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析； <*与渣常。) MT ပုံမှန်ဆန့်ခြင်း (Norm) သို့မဟုတ် လွန်ဆွဲခြင်း (OS) အခြေအနေများ (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) အောက်တွင် မွေးမြူထားသော နှလုံးချပ်များတွင် NT-ProBNP အာရုံစူးစိုက်မှုပမာဏ ပမာဏ၊猪的切片/组，可以双向方方发发动 ** ပုံမှန် ဆန့်တန်းခြင်းနှင့် နှိုင်းယှဉ်ခြင်း၊ p < 0.01)။ပုံမှန် MT ဆန့်တန်းမှု (norm) သို့မဟုတ် အလွန်အကျွံဆန့်တန်းမှု (OS) (n = 4 (D2 MTNorm)၊ 3 (D2 MTOS၊ D4 MTNorm) နှင့် D4 MTOS) ၏ အခြေအနေအောက်တွင် မွေးမြူထားသော နှလုံးအချပ်များတွင် NT-ProBNP ပါဝင်မှု ပမာဏကို ဟစ်စတိုဂရမ်၊ မတူညီသော ဝက်များမှ ကွဲပြားမှု၏ နှစ်လမ်းသွား ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု။**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением)။ ပုံမှန်ဆန့်ထုတ်မှုနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက p < 0.01)။ b troponin-T နှင့် WGA (ဘယ်ဘက်) ဖြင့် ဆေးဆိုးထားသော နှလုံးအချပ်များအတွက် ကိုယ်စားပြုပုံများနှင့် ဆဲလ်အရွယ်အစား ပမာဏတိုင်းတာခြင်း (ညာဘက်) (n = 330 (D6 MTOS)၊ မတူညီသော ဝက်များမှ မတူညီသော အချပ် ၁၀ ခုမှ ဆဲလ်/အုပ်စု 369 (D6 MTNorm)၊ Two-tailed Student t-test ကို ပြုလုပ်သည်။ ပုံမှန်ဆန့်ထုတ်မှုနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ****p < 0.0001)။ ခ troponin-T နှင့် WGA (ဘယ်ဘက်) ဖြင့် ဆေးဆိုးထားသော နှလုံးအချပ်များအတွက် ကိုယ်စားပြုပုံများနှင့် ဆဲလ်အရွယ်အစား ပမာဏတိုင်းတာခြင်း (ညာဘက်) (n = 330 (D6 MTOS)၊ မတူညီသော ဝက်များမှ မတူညီသော အချပ် ၁၀ ခုမှ ဆဲလ်/အုပ်စု 369 (D6 MTNorm)၊ Two-tailed Student t-test ကို ပြုလုပ်သည်။ ပုံမှန်ဆန့်ထုတ်မှုနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ****p < 0.0001)။ b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количесятведнона размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разовный свиразный хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). ခ troponin-T နှင့် AZP ဖြင့် ဆေးဆိုးထားသော နှလုံးအပိုင်းများ၏ ကိုယ်စားပြုပုံများ (ဘယ်ဘက်) နှင့် ဆဲလ်အရွယ်အစား ပမာဏတိုင်းတာခြင်း (ညာဘက်) (n = 330 (D6 MTOS)၊ မတူညီသော ဝက်များမှ အပိုင်း ၁၀ ပိုင်းမှ ဆဲလ်/အုပ်စု 369 (D6 MTNorm)၊ two-tailed Student's t-test ကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ပုံမှန် strain နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ****p < 0.0001)။ b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330 MTOS)，来自不同猪的10个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验Ｘ与歋尾学生t 检验Ｘ与歋0.0001)။ b calcarein-T နှင့် WGA ဖြင့် ဆေးဆိုးထားသော နှလုံးချပ်များ၏ ကိုယ်စားပြုပုံများ (ဘယ်ဘက်) နှင့် ဆဲလ်အရွယ်အစား (ညာဘက်) (n = 330 (D6 MTOS)၊ မတူညီသော ၁၀ ချပ်မှ 369 (D6 MTNorm))။ ဆဲလ်များ/စမ်းသပ်မှု၊ ပုံမှန်ဆန့်ခြင်းနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက၊ ****p < 0.0001)။ b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количест ве клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группрой, д Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением)။ b troponin-T နှင့် AZP ဖြင့် ဆေးဆိုးထားသော နှလုံးအပိုင်းများ၏ ကိုယ်စားပြုပုံများ (ဘယ်ဘက်) နှင့် ဆဲလ်အရွယ်အစား ပမာဏ (ညာဘက်) (n = 330 (D6 MTOS)၊ 369 (D6 MTNorm) ကွဲပြားသော ဝက်များမှ အပိုင်း ၁၀ ပိုင်းမှ) ဆဲလ်/အုပ်စု၊ အမြီးနှစ်ဖက် စံနှုန်း ကျောင်းသား၏ t; ပုံမှန်မျိုးကွဲနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ****p < 0.0001)။ c troponin-T နှင့် NFATC4 အတွက် immunolabeled လုပ်ထားသော ၀ နှင့် ၆ ရက်မြောက် MTOS နှလုံးအပိုင်းအစများအတွက် ကိုယ်စားပြုပုံများနှင့် NFATC4 ၏ CMs ၏ nuclei သို့ translocation ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်း (n = 4 (D0)၊ မတူညီသော ဝက်များမှ ၃ (D6 MTOS) အပိုင်းအစများ/အုပ်စု၊ Two-tailed Student t-test ကို ပြုလုပ်သည်။ *p < 0.05)။ c troponin-T နှင့် NFATC4 အတွက် immunolabeled လုပ်ထားသော ၀ နှင့် ၆ ရက်မြောက် MTOS နှလုံးအပိုင်းအစများအတွက် ကိုယ်စားပြုပုံများနှင့် NFATC4 ၏ CMs ၏ nuclei သို့ translocation ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်း (n = 4 (D0)၊ မတူညီသော ဝက်များမှ ၃ (D6 MTOS) အပိုင်းအစများ/အုပ်စု၊ Two-tailed Student t-test ကို ပြုလုပ်သည်။ *p < 0.05)။ c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Тв и NFATC4 оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , двусторонний t-критерий Стьюдента; c troponin-T နှင့် NFATC4 အတွက် immunolabeled လုပ်ထားသော ၀ နှင့် ၆ ရက် MTOS တွင် နှလုံးအပိုင်းများအတွက် ကိုယ်စားပြုပုံများနှင့် cavernous cells များ၏ nucleus တွင် NFATC4 translocation ၏ ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်း (n = 4 (D0)၊ မတူညီသော ဝက်များမှ ၃ (D6 MTOS) အချပ်/အုပ်စု) two-tailed Student's t-test ကို ပြုလုပ်ထားသည်။ *p < 0.05)။ c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化(n = 4 (D0) 爇 MT) 、3 (D/6爇)、进行双尾学生t 检验；*p < 0.05)။ c calcanin-T နှင့် NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS နှလုံးအချပ်များနှင့် NFATC4 ကွဲပြားသော NFATC4 易位至CM ဆဲလ်နျူကလီးယပ်စ်的quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6礄礄礄))时间双尾学生et 电影；*p < 0.05)။ c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-да- хвостатый t-кет; ၀၊၀၅)။ c မတူညီသော ဝက်များ (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) အပိုင်း/အုပ်စု၊ two-tailed t -criterion Student's; *p < 0.05) မှ CM ၏ nucleus တွင် troponin-T နှင့် NFATC4 immunolabeling အတွက် 0 နှင့် 6 ရက်မြောက်နေ့တွင် MTOS နှလုံးအပိုင်းအစများ၏ ကိုယ်စားပြုပုံများ။အမှားဘားများသည် ပျမ်းမျှ ± စံသွေဖည်မှုကို ကိုယ်စားပြုသည်။
Translational Cardiovascular Research တွင် နှလုံးပတ်ဝန်းကျင်ကို တိကျစွာပြန်လည်ထုတ်လုပ်နိုင်သော ဆဲလ်မော်ဒယ်များ လိုအပ်သည်။ ဤလေ့လာမှုတွင် နှလုံး၏ အလွန်ပါးလွှာသော အပိုင်းများကို လှုံ့ဆော်ပေးနိုင်သည့် CTCM ကိရိယာတစ်ခုကို တီထွင်ခဲ့ပြီး လက္ခဏာရပ်များ ပြသခဲ့သည်။ CTCM စနစ်တွင် ဇီဝကမ္မဗေဒအရ ထပ်တူပြုထားသော လျှပ်စစ်စက်ပိုင်းဆိုင်ရာ လှုံ့ဆော်မှုနှင့် T3 နှင့် Dex အရည်ကြွယ်ဝမှုတို့ ပါဝင်သည်။ ဝက်နှလုံးအပိုင်းများကို ဤအချက်များနှင့် ထိတွေ့စေသောအခါ ၎င်းတို့၏ အသက်ရှင်နိုင်မှု၊ ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ တည်တံ့မှု၊ ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ လှုပ်ရှားမှုနှင့် မှတ်တမ်းဆိုင်ရာ ဖော်ပြမှုတို့သည် ၁၂ ရက်ကြာ မွေးမြူပြီးနောက် လတ်ဆတ်သော နှလုံးတစ်ရှူးများကဲ့သို့ပင် ရှိနေခဲ့သည်။ ထို့အပြင် နှလုံးတစ်ရှူးများ အလွန်အကျွံဆန့်ထုတ်ခြင်းသည် hyperextension ကြောင့် နှလုံး၏ hypertrophy ကို ဖြစ်စေနိုင်သည်။ အလုံးစုံသော် ဤရလဒ်များသည် ပုံမှန်နှလုံး phenotype ကို ထိန်းသိမ်းရာတွင် ဇီဝကမ္မဗေဒဆိုင်ရာ မွေးမြူရေးအခြေအနေများ၏ အရေးပါသော အခန်းကဏ္ဍကို ထောက်ခံပြီး ဆေးဝါးစစ်ဆေးခြင်းအတွက် ပလက်ဖောင်းတစ်ခု ပံ့ပိုးပေးပါသည်။
နှလုံးကြွက်သားဆဲလ်များ၏ လုပ်ဆောင်မှုနှင့် ရှင်သန်မှုအတွက် အကောင်းဆုံးပတ်ဝန်းကျင်တစ်ခု ဖန်တီးရာတွင် အချက်များစွာ ပါဝင်သည်။ ဤအချက်များအနက် အထင်ရှားဆုံးမှာ (1) ဆဲလ်အချင်းချင်း အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုများ (2) လျှပ်စစ်စက်ပိုင်းဆိုင်ရာ လှုံ့ဆော်မှု၊ (3) ဟူမာရယ်အချက်များ နှင့် (4) ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ အောက်ခံများနှင့် ဆက်စပ်နေသည်။ ဆဲလ်မှ ဆဲလ်သို့ ဇီဝကမ္မဗေဒဆိုင်ရာ အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုများသည် ဆဲလ်ပြင်ပ မက်ထရစ်ဖြင့် ပံ့ပိုးပေးထားသော ဆဲလ်အမျိုးအစားများစွာ၏ ရှုပ်ထွေးသော သုံးဖက်မြင်ကွန်ရက်များ လိုအပ်သည်။ ထိုကဲ့သို့သော ရှုပ်ထွေးသော ဆဲလ် အပြန်အလှန် ဆက်သွယ်မှုများကို တစ်ဦးချင်း ဆဲလ်အမျိုးအစားများကို ပူးတွဲမွေးမြူခြင်းဖြင့် ဓာတ်ခွဲခန်းတွင် ပြန်လည်တည်ဆောက်ရန် ခက်ခဲသော်လည်း နှလုံးအပိုင်းများ၏ အော်ဂနိုတိုင်ပစ် သဘောသဘာဝကို အသုံးပြု၍ အလွယ်တကူ ရရှိနိုင်သည်။
နှလုံးပုံသဏ္ဍာန်ကို ထိန်းသိမ်းရန်အတွက် cardiomyocytes များ၏ စက်ပိုင်းဆိုင်ရာဆန့်ခြင်းနှင့် လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုသည် အရေးကြီးပါသည်33,34,35။ hiPSC-CM တည်ငြိမ်မှုနှင့် ရင့်ကျက်မှုအတွက် စက်ပိုင်းဆိုင်ရာလှုံ့ဆော်မှုကို ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့်အသုံးပြုခဲ့သော်လည်း၊ မကြာသေးမီက ကောင်းမွန်သောလေ့လာမှုများစွာသည် uniaxial loading ကို အသုံးပြု၍ ယဉ်ကျေးမှုတွင် နှလုံးအပိုင်းအစများကို စက်ပိုင်းဆိုင်ရာလှုံ့ဆော်မှုကို ကြိုးစားခဲ့ကြသည်။ ဤလေ့လာမှုများအရ 2D uniaxial mechanical loading သည် ယဉ်ကျေးမှုအတွင်း နှလုံး၏ပုံသဏ္ဍာန်အပေါ် အပြုသဘောဆောင်သောအကျိုးသက်ရောက်မှုရှိကြောင်း ပြသသည်။ ဤလေ့လာမှုများတွင်၊ နှလုံး၏အစိတ်အပိုင်းများကို isometric tensile forces17၊ linear auxotonic loading18 ဖြင့် တင်ဆောင်ထားသည် သို့မဟုတ် force transducer feedback နှင့် tension drives များကို အသုံးပြု၍ နှလုံးစက်ဝန်းကို ပြန်လည်ဖန်တီးခဲ့သည်။ သို့သော်၊ ဤနည်းလမ်းများသည် ပတ်ဝန်းကျင်ဆိုင်ရာ optimization မပါဘဲ uniaxial တစ်ရှူးဆန့်ခြင်းကို အသုံးပြုသောကြောင့် နှလုံးမျိုးဗီဇများစွာကို နှိမ်နင်းခြင်း သို့မဟုတ် ပုံမှန်မဟုတ်သော ဆန့်ထုတ်မှုတုံ့ပြန်မှုများနှင့် ဆက်စပ်နေသော မျိုးဗီဇများ၏ အလွန်အကျွံဖော်ပြမှုကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်။ ဤနေရာတွင်ဖော်ပြထားသော CTCM သည် စက်ဝန်းအချိန်နှင့် ဇီဝကမ္မဆိုင်ရာဆန့်ထုတ်မှု (25% stretch၊ 40% systole၊ 60% diastole နှင့် တစ်မိနစ်လျှင် 72 ကြိမ်) အရ သဘာဝနှလုံးစက်ဝန်းကို တုပသည့် 3D electromechanical လှုံ့ဆော်မှုကို ပေးပါသည်။ ဤသုံးဖက်မြင်စက်ပိုင်းဆိုင်ရာလှုံ့ဆော်မှုတစ်ခုတည်းသည် တစ်ရှူးများ၏ တည်တံ့ခိုင်မြဲမှုကို ထိန်းသိမ်းရန် မလုံလောက်သော်လည်း၊ တစ်ရှူးများ၏ အသက်ရှင်နိုင်မှု၊ လုပ်ဆောင်ချက်နှင့် တည်တံ့ခိုင်မြဲမှုကို လုံလောက်စွာထိန်းသိမ်းရန်အတွက် T3/Dex ကို အသုံးပြု၍ ရွှံ့ရုပ်နှင့် စက်ပိုင်းဆိုင်ရာလှုံ့ဆော်မှုပေါင်းစပ်မှု လိုအပ်ပါသည်။
အရွယ်ရောက်ပြီးသူ နှလုံးပုံစံကို ပြုပြင်ပြောင်းလဲရာတွင် humoral factors များသည် အရေးကြီးသော အခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်သည်။ ဤအချက်ကို HiPS-CM လေ့လာမှုများတွင် မီးမောင်းထိုးပြခဲ့ပြီး ဆဲလ်များ ရင့်ကျက်မှုကို အရှိန်မြှင့်တင်ရန် T3 နှင့် Dex တို့ကို culture media ထဲသို့ ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ T3 သည် amino acid၊ သကြားနှင့် ကယ်လ်စီယမ်တို့ကို ဆဲလ်အမြှေးပါးများတစ်လျှောက် သယ်ယူပို့ဆောင်မှုကို လွှမ်းမိုးနိုင်သည်36။ ထို့အပြင်၊ T3 သည် MHC-α expression နှင့် MHC-β downregulation ကို မြှင့်တင်ပေးပြီး fetal CM တွင် slow twitch myofibrils နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ရင့်ကျက်သော cardiomyocytes များတွင် fast twitch myofibrils ဖွဲ့စည်းမှုကို မြှင့်တင်ပေးသည်။ hypothyroid လူနာများတွင် T3 ချို့တဲ့ခြင်းသည် myofibrillar bands များ ဆုံးရှုံးခြင်းနှင့် tone ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုနှုန်း လျော့နည်းစေခြင်း37 ကို ဖြစ်ပေါ်စေပါသည်။ Dex သည် glucocorticoid receptors များအပေါ် သက်ရောက်မှုရှိပြီး isolated perfused hearts များတွင် myocardial contractility ကို တိုးစေကြောင်း ပြသထားသည်။38 ဤတိုးတက်မှုသည် calcium deposit-driven entry (SOCE) အပေါ် အကျိုးသက်ရောက်မှုနှင့် ဆက်စပ်နေသည်ဟု ယူဆရသည်39,40။ ထို့အပြင်၊ Dex သည် ၎င်း၏ receptors များနှင့် ချိတ်ဆက်ပြီး ကိုယ်ခံအားလုပ်ဆောင်ချက်နှင့် ရောင်ရမ်းမှုကို ဖိနှိပ်သည့် ကျယ်ပြန့်သော intracellular response ကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်30။
ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များက ရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာစက်ပိုင်းဆိုင်ရာလှုံ့ဆော်မှု (MS) သည် Ctrl နှင့်နှိုင်းယှဉ်ပါက ယဉ်ကျေးမှုစွမ်းဆောင်ရည်ကို တိုးတက်စေသော်လည်း ယဉ်ကျေးမှုတွင် ၁၂ ရက်ကြာ အသက်ရှင်နိုင်မှု၊ ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာတည်တံ့မှုနှင့် နှလုံးဖော်ပြမှုကို ထိန်းသိမ်းရန် ပျက်ကွက်ခဲ့ကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ Ctrl နှင့်နှိုင်းယှဉ်ပါက CTCM (MT) ယဉ်ကျေးမှုများတွင် T3 နှင့် Dex ထည့်သွင်းခြင်းသည် အသက်ရှင်နိုင်မှုတိုးတက်စေပြီး နှလုံးတစ်ရှူးအသစ်များဖြင့် ၁၂ ရက်ကြာ အလားတူ transcription profile များ၊ ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာတည်တံ့မှုနှင့် ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာလှုပ်ရှားမှုများကို ထိန်းသိမ်းထားသည်။ ထို့အပြင် တစ်ရှူးဆန့်နိုင်စွမ်းအတိုင်းအတာကို ထိန်းချုပ်ခြင်းဖြင့် STCM ကို အသုံးပြု၍ hyperextension မှလှုံ့ဆော်ပေးသော နှလုံး hypertrophy မော်ဒယ်ကို ဖန်တီးခဲ့ပြီး STCM စနစ်၏ ပြောင်းလွယ်ပြင်လွယ်ရှိမှုကို သရုပ်ဖော်သည်။ နှလုံးပြန်လည်ပြုပြင်ခြင်းနှင့် အမာရွတ်ဖြစ်ခြင်းတို့သည် ပုံမှန်အားဖြင့် လည်ပတ်နေသောဆဲလ်များတွင် သင့်လျော်သော cytokines များအပြင် phagocytosis နှင့် အခြားပြန်လည်ပြုပြင်ခြင်းအချက်များကို ပေးစွမ်းနိုင်သည့် မပျက်စီးသေးသော အင်္ဂါများပါဝင်လေ့ရှိသော်လည်း နှလုံး၏အစိတ်အပိုင်းများသည် ဖိစီးမှုနှင့် ဒဏ်ရာကို တုံ့ပြန်သည့်အနေဖြင့် fibrotic လုပ်ငန်းစဉ်ကို myofibroblasts များထဲသို့ တုပနိုင်သေးကြောင်း သတိပြုသင့်သည်။ ၎င်းကို ယခင်က ဤနှလုံးအပိုင်းပုံစံတွင် အကဲဖြတ်ခဲ့ပြီးဖြစ်သည်။ CTCM parameters များကို tachycardia၊ bradycardia နှင့် စက်ပိုင်းဆိုင်ရာသွေးလည်ပတ်မှုပံ့ပိုးမှု (စက်ပိုင်းဆိုင်ရာ unloaded heart) ကဲ့သို့သော အခြေအနေများစွာကို တုပရန် ဖိအား/လျှပ်စစ် amplitude နှင့် frequency ကို ပြောင်းလဲခြင်းဖြင့် modulate လုပ်နိုင်ကြောင်း သတိပြုသင့်သည်။ ဒါကြောင့် ဒီစနစ်ကို ဆေးဝါးစစ်ဆေးခြင်းအတွက် ကြားခံတစ်ခု ဖြစ်စေပါတယ်။ CTCM ရဲ့ အလွန်အကျွံ အားစိုက်ထုတ်မှုကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာတဲ့ နှလုံးသွေးကြောကျဉ်းရောဂါကို ပုံစံထုတ်နိုင်စွမ်းဟာ ဒီစနစ်ကို ပုဂ္ဂိုလ်ရေးသီးသန့်ကုထုံးအတွက် စမ်းသပ်ဖို့ လမ်းခင်းပေးပါတယ်။ အဆုံးသတ်အနေနဲ့ လက်ရှိလေ့လာမှုက စက်ပိုင်းဆိုင်ရာဆန့်ထုတ်မှုနဲ့ အရည်ဓာတ်လှုံ့ဆော်မှုဟာ နှလုံးတစ်ရှူးအပိုင်းအစတွေရဲ့ ယဉ်ကျေးမှုကို ထိန်းသိမ်းရာမှာ အရေးပါကြောင်း ပြသနေပါတယ်။
ဤနေရာတွင် တင်ပြထားသော အချက်အလက်များက CTCM သည် နှလုံးကြွက်သားများကို ပုံစံထုတ်ရန်အတွက် အလွန်အလားအလာကောင်းသော ပလက်ဖောင်းတစ်ခုဖြစ်ကြောင်း အကြံပြုထားသော်လည်း၊ ဤယဉ်ကျေးမှုနည်းလမ်းတွင် ကန့်သတ်ချက်အချို့ရှိသည်။ CTCM ယဉ်ကျေးမှု၏ အဓိကကန့်သတ်ချက်မှာ ၎င်းသည် နှလုံးအပိုင်းအစများပေါ်တွင် စဉ်ဆက်မပြတ် ပြောင်းလဲနေသော စက်ပိုင်းဆိုင်ရာ ဖိစီးမှုများကို သက်ရောက်စေပြီး၊ ၎င်းသည် နှလုံးအပိုင်းအစများ ကျုံ့ခြင်း စက်ဝန်းတစ်ခုစီတွင် တက်ကြွစွာ စောင့်ကြည့်နိုင်စွမ်းကို တားဆီးပေးသည်။ ထို့အပြင်၊ နှလုံးအပိုင်းအစများ၏ အရွယ်အစားသေးငယ်ခြင်း (၇ မီလီမီတာ) ကြောင့်၊ ရိုးရာအားအာရုံခံကိရိယာများကို အသုံးပြု၍ ယဉ်ကျေးမှုစနစ်များပြင်ပတွင် systolic လုပ်ဆောင်ချက်ကို အကဲဖြတ်နိုင်စွမ်းမှာ အကန့်အသတ်ရှိသည်။ လက်ရှိလက်ရေးစာမူတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် optical voltage ကို ကျုံ့နိုင်သောလုပ်ဆောင်ချက်၏ အညွှန်းကိန်းတစ်ခုအဖြစ် အကဲဖြတ်ခြင်းဖြင့် ဤကန့်သတ်ချက်ကို တစ်စိတ်တစ်ပိုင်း ကျော်လွှားနိုင်သည်။ သို့သော်၊ ဤကန့်သတ်ချက်သည် နောက်ထပ်အလုပ်များ လိုအပ်မည်ဖြစ်ပြီး အနာဂတ်တွင် ကယ်လ်စီယမ်နှင့် voltage-sensitive ဆိုးဆေးများကို အသုံးပြု၍ optical mapping ကဲ့သို့သော ယဉ်ကျေးမှုတွင် နှလုံးအပိုင်းအစများ၏ လုပ်ဆောင်ချက်ကို optical စောင့်ကြည့်ခြင်းနည်းလမ်းများကို မိတ်ဆက်ခြင်းဖြင့် ဖြေရှင်းနိုင်သည်။ CTCM ၏ နောက်ထပ်ကန့်သတ်ချက်တစ်ခုမှာ အလုပ်လုပ်သောပုံစံသည် ဇီဝကမ္မဆိုင်ရာဖိစီးမှု (preload နှင့် afterload) ကို မကိုင်တွယ်ပါ။ CTCM တွင်၊ အလွန်ကြီးမားသောတစ်ရှူးများတွင် diastole (အပြည့်အဝဆန့်ခြင်း) နှင့် systole (လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုအတွင်း ကျုံ့ခြင်းအရှည်) တွင် ဆန့်ကျင်ဘက်ဦးတည်ချက်များဖြင့် ဖိအားကို လှုံ့ဆော်ပေးခဲ့သည်။ နှစ်ဖက်စလုံးမှ နှလုံးတစ်ရှူးပေါ်တွင် လုံလောက်သောဖိအားဖြင့်လည်းကောင်း၊ နှလုံး၏အခန်းများတွင် ဖြစ်ပေါ်သည့် တိကျသောဖိအား-ထုထည်ဆက်နွယ်မှုများကို အသုံးပြုခြင်းဖြင့်လည်းကောင်း အနာဂတ် CTCM ဒီဇိုင်းများတွင် ဤကန့်သတ်ချက်ကို ဖယ်ရှားသင့်သည်။
ဤလက်ရေးစာမူတွင် ဖော်ပြထားသော အလွန်အကျွံဆန့်ထုတ်မှုကြောင့်ဖြစ်ပေါ်လာသော ပြန်လည်ပြုပြင်ခြင်းသည် hypertrophic hyperstretch အချက်ပြမှုများကို တုပခြင်းအတွက်သာ ကန့်သတ်ထားသည်။ ထို့ကြောင့် ဤမော်ဒယ်သည် humoral သို့မဟုတ် neural factors (ဤစနစ်တွင်မရှိပါ) မလိုအပ်ဘဲ stretch-induced hypertrophic အချက်ပြမှုကို လေ့လာရာတွင် ကူညီပေးနိုင်ပါသည်။ CTCM ၏ များပြားမှုကို တိုးမြှင့်ရန်အတွက် နောက်ထပ်လေ့လာမှုများ လိုအပ်ပါသည်။ ဥပမာအားဖြင့် ကိုယ်ခံအားဆဲလ်များနှင့် ပူးတွဲမွေးမြူခြင်း၊ plasma humoral factors များ လည်ပတ်ခြင်းနှင့် neuronal ဆဲလ်များနှင့် ပူးတွဲမွေးမြူသည့်အခါ innervation တို့သည် CTCM ဖြင့် ရောဂါမော်ဒယ်လ်ပြုလုပ်ခြင်း၏ ဖြစ်နိုင်ခြေများကို မြှင့်တင်ပေးမည်ဖြစ်သည်။
ဤလေ့လာမှုတွင် ဝက် ၁၃ ကောင်ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ တိရစ္ဆာန်လုပ်ထုံးလုပ်နည်းအားလုံးကို အဖွဲ့အစည်းဆိုင်ရာလမ်းညွှန်ချက်များနှင့်အညီ လုပ်ဆောင်ခဲ့ပြီး Louisville တက္ကသိုလ် အဖွဲ့အစည်းဆိုင်ရာ တိရစ္ဆာန်စောင့်ရှောက်မှုနှင့် အသုံးပြုမှုကော်မတီမှ အတည်ပြုခဲ့သည်။ သွေးကြောမကြီးကို ညှပ်ပြီး နှလုံးကို ပိုးသတ်ထားသော cardioplegia ၁ လီတာ (110 mM NaCl၊ 1.2 mM CaCl2၊ 16 mM KCl၊ 16 mM MgCl2၊ 10 mM NaHCO3၊ 5 U/mL heparin၊ pH 7.4 အထိ) ဖြင့် ဖြည့်သွင်းပေးခဲ့သည်။ နှလုံးများကို ရေခဲဖြင့် ဓာတ်ခွဲခန်းသို့ ပို့ဆောင်ခြင်းမပြုမီ ရေခဲအေးသော cardioplegic solution တွင် သိမ်းဆည်းထားပြီး ပုံမှန်အားဖြင့် မိနစ် ၁၀ အောက်ကြာပါသည်။ နှလုံးများကို ရေခဲဖြင့် ဓာတ်ခွဲခန်းသို့ ပို့ဆောင်ခြင်းမပြုမီ ရေခဲအေးသော cardioplegic solution တွင် သိမ်းဆည်းထားပြီး ပုံမှန်အားဖြင့် မိနစ် ၁၀ အောက်ကြာပါသည်။ сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обы နှလုံးများကို ရေခဲဖြင့် ဓာတ်ခွဲခန်းသို့ ပို့ဆောင်ခြင်းမပြုမီ ရေခဲအေးသော cardioplegic solution တွင် သိမ်းဆည်းထားပြီး၊ ၎င်းသည် ပုံမှန်အားဖြင့် မိနစ် ၁၀ အောက် ကြာမြင့်ပါသည်။将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟။将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟။ Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. ရေခဲပေါ်တွင် ဓာတ်ခွဲခန်းသို့ ပို့ဆောင်သည်အထိ နှလုံးကို ရေခဲပေါ်တွင် နှလုံးအထူးကုဆရာဝန်နှင့် တိုင်ပင်ပါ။ များသောအားဖြင့် မိနစ် ၁၀ အောက်။
CTCM ကိရိယာကို SolidWorks ကွန်ပျူတာအကူအညီဖြင့် ဒီဇိုင်း (CAD) ဆော့ဖ်ဝဲလ်တွင် တီထွင်ခဲ့သည်။ ယဉ်ကျေးမှုအခန်းများ၊ ပိုင်းခြားကိရိယာများနှင့် လေဝင်လေထွက်ခန်းများကို CNC ကြည်လင်သော acrylic ပလတ်စတစ်ဖြင့် ပြုလုပ်ထားသည်။ အချင်း ၇ မီလီမီတာရှိသော back-up ring ကို အလယ်ဗဟိုတွင် high density polyethylene (HDPE) ဖြင့် ပြုလုပ်ထားပြီး အောက်ခံမီဒီယာကို လုံအောင်ပိတ်ရန်အသုံးပြုသော silicone o-ring ကို ထားရန် o-ring groove ပါရှိသည်။ ပါးလွှာသော silica membrane သည် ယဉ်ကျေးမှုအခန်းကို ခွဲထုတ်ပြားမှ ခွဲထုတ်ထားသည်။ silicone membrane ကို ၀.၀၂ လက်မအထူရှိသော silicone sheet မှ လေဆာဖြင့် ဖြတ်တောက်ထားပြီး မာကျောမှု 35A ရှိသည်။ အောက်ခြေနှင့် အပေါ်ဆုံး silicone gasket များကို ၁/၁၆ လက်မအထူရှိသော silicone sheet မှ လေဆာဖြင့် ဖြတ်တောက်ထားပြီး မာကျောမှု 50A ရှိသည်။ 316L stainless steel screws နှင့် wing nuts များကို block ကို တပ်ဆင်ရန်နှင့် airtight seal ဖန်တီးရန်အတွက် အသုံးပြုသည်။
C-PACE-EM စနစ်နှင့် ပေါင်းစပ်အသုံးပြုရန် သီးသန့်ပုံနှိပ်ဆားကစ်ဘုတ် (PCB) ကို ဒီဇိုင်းထုတ်ထားသည်။ PCB ရှိ ဆွစ်စက်ချိတ်ဆက်ကိရိယာပေါက်များကို ငွေရောင်ဖြင့်ပြုလုပ်ထားသော ကြေးဝါဝါယာကြိုးများနှင့် ကြေးဝါ 0-60 ဝက်အူများဖြင့် ဂရပ်ဖိုက်လျှပ်ကူးပစ္စည်းများနှင့် ချိတ်ဆက်ထားသည်။ ပုံနှိပ်ဆားကစ်ဘုတ်ကို 3D ပရင်တာ၏အဖုံးတွင် ထားရှိသည်။
CTCM ကိရိယာကို နှလုံးစက်ဝန်းနှင့်ဆင်တူသော ထိန်းချုပ်ထားသော သွေးလည်ပတ်မှုဖိအားကို ဖန်တီးပေးသည့် ပရိုဂရမ်ရေးဆွဲနိုင်သော လေဖိအားထိန်းကိရိယာ (PPD) ဖြင့် ထိန်းချုပ်ထားသည်။ လေခန်းအတွင်းရှိ ဖိအားမြင့်တက်လာသည်နှင့်အမျှ ပျော့ပျောင်းသော ဆီလီကွန်အမြှေးပါးသည် အပေါ်သို့ ကျယ်ပြန့်လာပြီး တစ်ရှူးနေရာအောက်ရှိ အလတ်စားကို ဖိအားပေးသည်။ ထို့နောက် တစ်ရှူးဧရိယာကို အရည်ထုတ်လွှတ်ခြင်းဖြင့် ဆန့်ထွက်စေပြီး diastole အတွင်း နှလုံး၏ ဇီဝကမ္မဗေဒဆိုင်ရာ ချဲ့ထွင်မှုကို အတုယူသည်။ အထွတ်အထိပ်တွင် ဂရပ်ဖိုက်လျှပ်ကူးပစ္စည်းများမှတစ်ဆင့် လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုကို အသုံးပြုခဲ့ပြီး လေခန်းအတွင်းရှိ ဖိအားကို လျှော့ချပေးပြီး တစ်ရှူးအပိုင်းများကို ကျုံ့စေခဲ့သည်။ ပိုက်အတွင်းတွင် လေစနစ်ရှိ ဖိအားကို ထောက်လှမ်းရန် ဖိအားအာရုံခံကိရိယာပါရှိသော သွေးလည်ပတ်မှုအဆို့ရှင်တစ်ခုရှိသည်။ ဖိအားအာရုံခံကိရိယာမှ အာရုံခံထားသော ဖိအားကို လက်ပ်တော့နှင့် ချိတ်ဆက်ထားသော ဒေတာစုဆောင်းကိရိယာသို့ ပေးပို့သည်။ ၎င်းသည် ဓာတ်ငွေ့ခန်းအတွင်းရှိ ဖိအားကို စဉ်ဆက်မပြတ် စောင့်ကြည့်နိုင်စေပါသည်။ အမြင့်ဆုံးအခန်းဖိအား (စံ 80 mmHg၊ 140 mmHg OS) ရောက်ရှိသောအခါ၊ ဒေတာရယူသည့်ကိရိယာကို C-PACE-EM စနစ်သို့ အချက်ပြမှုပေးပို့ရန် 4 V ဟုသတ်မှတ်ထားပြီး 2 ms အတွက် နှစ်ဆင့်ဗို့အားအချက်ပြမှုကို ထုတ်လုပ်ရန် အမိန့်ပေးခဲ့သည်။
နှလုံးအပိုင်းအစများကို ရယူခဲ့ပြီး ရေတွင်း ၆ တွင်းတွင် မွေးမြူရေးအခြေအနေများကို အောက်ပါအတိုင်း လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်- ရိတ်သိမ်းထားသော နှလုံးများကို လွှဲပြောင်းအိုးမှ အအေး (၄°C) cardioplegia ပါရှိသော ဗန်းထဲသို့ လွှဲပြောင်းပါ။ ဘယ်ဘက် ventricle ကို ပိုးသတ်ထားသော ဓားဖြင့် ခွဲထုတ်ပြီး 1-2 cm3 အပိုင်းအစများအဖြစ် ဖြတ်တောက်ခဲ့သည်။ ဤတစ်ရှူးတုံးများကို တစ်ရှူးကော်ဖြင့် တစ်ရှူးအထောက်အပံ့များတွင် ကပ်ထားပြီး Tyrode's solution ပါရှိသော တုန်ခါနေသော microtome တစ်ရှူးရေချိုးကန်ထဲတွင် ထားပြီး အောက်ဆီဂျင် အဆက်မပြတ်ထည့်သွင်းထားသည် (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g) . ), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-glucose (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M solution), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M solution), 1 L ddH2O အထိ)။ တုန်ခါနေသော microtome ကို 80 Hz ကြိမ်နှုန်း၊ 2 mm အလျားလိုက်တုန်ခါမှုပမာဏနှင့် 0.03 mm/s ကြိုတင်နှုန်းဖြင့် 300 µm အထူရှိသော အချပ်များကို ဖြတ်တောက်ရန် သတ်မှတ်ထားသည်။ တစ်ရှူးရေချိုးကန်ကို ရေခဲဖြင့် ဝိုင်းရံထားပြီး အရည်ကို အေးနေစေရန်နှင့် အပူချိန်ကို 4°C တွင် ထိန်းသိမ်းထားရန် ထိန်းထားသည်။ တစ်ရှူးအပိုင်းများကို ယဉ်ကျေးမှုပြားတစ်ခုအတွက် လုံလောက်သော အပိုင်းများရရှိသည်အထိ ရေခဲပေါ်တွင် အောက်ဆီဂျင်အဆက်မပြတ်ပါဝင်သော Tyrode အရည်ပါသည့် incubation bath သို့ လွှဲပြောင်းပါ။ transwell ယဉ်ကျေးမှုများအတွက် တစ်ရှူးအပိုင်းများကို ပိုးသတ်ထားသော 6 mm အကျယ် polyurethane အထောက်အပံ့များနှင့် တွဲချိတ်ပြီး အကောင်းဆုံးဖြစ်အောင်ပြုလုပ်ထားသော medium (199 medium၊ 1x ITS ဖြည့်စွက်ဆေး၊ 10% FBS၊ 5 ng/ml VEGF၊ 10 ng/ml FGF-alkaline နှင့် 2X ပဋိဇီဝဆေး-မှိုသတ်ဆေး) 6 ml တွင် ထားရှိသည်။ လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှု (10 V၊ ကြိမ်နှုန်း 1.2 Hz) ကို C-Pace မှတစ်ဆင့် တစ်ရှူးအပိုင်းများသို့ ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ TD အခြေအနေများအတွက်၊ medium ပြောင်းလဲမှုတိုင်းတွင် လတ်ဆတ်သော T3 နှင့် Dex ကို 100 nM နှင့် 1 μM တွင် ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ တစ်နေ့လျှင် ၃ ကြိမ် အစားထိုးခြင်းမပြုမီ အောက်ဆီဂျင်ဖြင့် အလယ်အလတ်အဆင့်ကို ဖြည့်တင်းပေးရမည်။ တစ်ရှူးအပိုင်းအစများကို ၃၇°C နှင့် ၅% CO2 တွင် incubator တွင် မွေးမြူခဲ့သည်။
CTCM ယဉ်ကျေးမှုများအတွက်၊ တစ်ရှူးအပိုင်းအစများကို ပြုပြင်ထားသော Tyrode's solution ပါ၀င်သည့် Petri dish ထဲတွင် custom-made 3D printer ပေါ်တွင် ထားရှိသည်။ ဤကိရိယာကို နှလုံးအပိုင်းအစ၏ အရွယ်အစားကို support ring ဧရိယာ၏ 25% တိုးမြှင့်ရန် ဒီဇိုင်းထုတ်ထားသည်။ Tyrode's solution မှ medium သို့ လွှဲပြောင်းပြီးနောက်နှင့် diastole အတွင်း နှလုံး၏ အပိုင်းအစများ မဆန့်ထွက်စေရန် ဤသို့ပြုလုပ်သည်။ histoacrylic ကော်ကို အသုံးပြု၍ 300 µm အထူရှိသော အပိုင်းအစများကို အချင်း 7 mm ရှိသော support ring ပေါ်တွင် တပ်ဆင်ထားသည်။ တစ်ရှူးအပိုင်းအစများကို support ring တွင် တပ်ဆင်ပြီးနောက်၊ အပိုတစ်ရှူးအပိုင်းအစများကို ဖြတ်ပြီး တပ်ဆင်ထားသော တစ်ရှူးအပိုင်းအစများကို ရေခဲ (4°C) ပေါ်ရှိ Tyrode solution ၏ ရေချိုးကန်ထဲသို့ device တစ်ခုအတွက် အပိုင်းအစများ လုံလောက်စွာ ပြင်ဆင်ပြီးသည်အထိ ပြန်ထည့်ပါ။ device အားလုံးအတွက် စုစုပေါင်း လုပ်ဆောင်ချိန်သည် 2 နာရီထက် မပိုသင့်ပါ။ တစ်ရှူးအပိုင်းအစ 6 ခုကို ၎င်းတို့၏ support ring များတွင် တပ်ဆင်ပြီးနောက် CTCM device ကို တပ်ဆင်ခဲ့သည်။ CTCM ယဉ်ကျေးမှုအခန်းကို pre-oxygenated medium 21 ml ဖြင့် ကြိုတင်ဖြည့်ထားသည်။ တစ်ရှူးအပိုင်းအစများကို ယဉ်ကျေးမှုအခန်းသို့ လွှဲပြောင်းပြီး pipette ဖြင့် လေပူဖောင်းများကို ဂရုတစိုက် ဖယ်ရှားပါ။ တစ်ရှူးအပိုင်းကို အပေါက်ထဲသို့ လမ်းညွှန်ပြီး နေရာတကျ ညင်သာစွာ ဖိသွင်းပါ။ နောက်ဆုံးတွင်၊ ကိရိယာပေါ်တွင် အီလက်ထရုတ်အဖုံးကို တင်ပြီး ကိရိယာကို incubator သို့ လွှဲပြောင်းပါ။ ထို့နောက် CTCM ကို လေပြွန်နှင့် C-PACE-EM စနစ်နှင့် ချိတ်ဆက်ပါ။ လေဖိအားထိန်းကိရိယာ ပွင့်လာပြီး လေအဆို့ရှင်သည် CTCM ကို ဖွင့်သည်။ C-PACE-EM စနစ်ကို biphasic pacing အတွင်း 2 ms အတွက် 1.2 Hz တွင် 4 V ပေးပို့ရန် ပြင်ဆင်ထားသည်။ အီလက်ထရုတ်များပေါ်တွင် ဂရပ်ဖိုက်စုပုံခြင်းကို ရှောင်ရှားရန် အီလက်ထရုတ်များကို တစ်နေ့တစ်ကြိမ် ပြောင်းလဲသည်။ လိုအပ်ပါက တစ်ရှူးအပိုင်းများကို ၎င်းတို့၏ culture well များမှ ဖယ်ရှားပြီး ၎င်းတို့အောက်တွင် ကျဆင်းသွားနိုင်သော လေပူဖောင်းများကို ထုတ်ပစ်နိုင်သည်။ MT ကုသမှုအခြေအနေများအတွက်၊ 100 nM T3 နှင့် 1 μM Dex ဖြင့် medium ပြောင်းလဲမှုတိုင်းနှင့်အတူ T3/Dex ကို အသစ်ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ CTCM ကိရိယာများကို incubator တွင် 37°C နှင့် 5% CO2 တွင် မွေးမြူခဲ့သည်။
နှလုံးအပိုင်းအစများ၏ ဆန့်ထွက်နေသော လမ်းကြောင်းများကို ရရှိရန် အထူးကင်မရာစနစ်တစ်ခုကို တီထွင်ခဲ့သည်။ SLR ကင်မရာ (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japan) ကို Navitar Zoom 7000 18-108mm macro lens (Navitar, San Francisco, CA) နှင့်အတူ အသုံးပြုခဲ့သည်။ ကြားခံအသစ်ဖြင့် အစားထိုးပြီးနောက် အခန်းအပူချိန်တွင် မြင်ယောင်မှုကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ကင်မရာကို 51° ထောင့်တွင် ထားပြီး ဗီဒီယိုကို တစ်စက္ကန့်လျှင် 30 frames ဖြင့် မှတ်တမ်းတင်ထားသည်။ ပထမဦးစွာ၊ နှလုံးအပိုင်းအစများ၏ ရွေ့လျားမှုကို ပမာဏသတ်မှတ်ရန် open source software (MUSCLEMOTION43) ကို Image-J နှင့်အတူ အသုံးပြုခဲ့သည်။ ဆူညံသံများကို ရှောင်ရှားရန် နှလုံးအပိုင်းအစများ ခုန်ရန် စိတ်ဝင်စားဖွယ်နေရာများကို သတ်မှတ်ရန် MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) ကို အသုံးပြု၍ မျက်နှာဖုံးကို ဖန်တီးခဲ့သည်။ လက်ဖြင့် အပိုင်းပိုင်းခွဲထားသော မျက်နှာဖုံးများကို frame sequence ရှိ ရုပ်ပုံအားလုံးတွင် အသုံးပြုပြီးနောက် MUSCLEMOTION plug-in သို့ ပေးပို့သည်။ Muscle Motion သည် reference frame နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ၎င်း၏ရွေ့လျားမှုကို ပမာဏသတ်မှတ်ရန် frame တစ်ခုစီရှိ pixels များ၏ ပျမ်းမျှပြင်းထန်မှုကို အသုံးပြုသည်။ အချက်အလက်များကို မှတ်တမ်းတင်၊ စစ်ထုတ်ပြီး နှလုံးစက်ဝန်းအချိန်ကို ပမာဏသတ်မှတ်ရန်နှင့် တစ်ရှူးဆန့်ထွက်မှုကို အကဲဖြတ်ရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။ မှတ်တမ်းတင်ထားသော ဗီဒီယိုကို ပထမအဆင့် သုညအဆင့် ဒစ်ဂျစ်တယ် စစ်ထုတ်ကိရိယာကို အသုံးပြု၍ post-process လုပ်ခဲ့သည်။ တစ်ရှူးဆန့်အား (peak-to-peak) ကို ပမာဏသတ်မှတ်ရန်အတွက်၊ မှတ်တမ်းတင်ထားသော အချက်ပြမှုတွင် ထိပ်များနှင့် နိမ့်ကျမှုများကို ခွဲခြားရန် ထိပ်မှထိပ်သို့ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ထို့အပြင်၊ အချက်ပြ ရွေ့လျားမှုကို ဖယ်ရှားရန် 6th order polynomial ကို အသုံးပြု၍ detrending ကို ပြုလုပ်သည်။ ကမ္ဘာလုံးဆိုင်ရာ တစ်ရှူးရွေ့လျားမှု၊ စက်ဝန်းအချိန်၊ ပြေလျော့ချိန်နှင့် ကျုံ့ချိန်တို့ကို ဆုံးဖြတ်ရန် MATLAB တွင် ပရိုဂရမ်ကုဒ်ကို တီထွင်ခဲ့သည် (Supplementary Program Code 44)။
စက်ပိုင်းဆိုင်ရာဆန့်ထုတ်မှုအကဲဖြတ်ခြင်းအတွက် ဖန်တီးထားသော ဗီဒီယိုများကို အသုံးပြု၍ ဆန့်နိုင်အားခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက်၊ MUSCLEMOTION ဆော့ဖ်ဝဲအရ ရွေ့လျားမှုထိပ်များ (ရွေ့လျားမှု၏ အမြင့်ဆုံး (အပေါ်) နှင့် အနိမ့်ဆုံး (အောက်) အမှတ်များ) ကိုကိုယ်စားပြုသည့် ရုပ်ပုံနှစ်ပုံကို ဦးစွာခြေရာခံခဲ့ပါသည်။ ထို့နောက် ကျွန်ုပ်တို့သည် တစ်ရှူးဒေသများကို အပိုင်းပိုင်းခွဲပြီး အပိုင်းပိုင်းခွဲထားသော တစ်ရှူးများတွင် အရိပ်အယ်လဂိုရီသမ်ပုံစံကို အသုံးပြုခဲ့ပါသည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ ၂က)။ ထို့နောက် အပိုင်းပိုင်းခွဲထားသော တစ်ရှူးကို မျက်နှာပြင်ဆယ်ခုအဖြစ် ပိုင်းခြားခဲ့ပြီး မျက်နှာပြင်တစ်ခုစီပေါ်ရှိ ဖိအားကို အောက်ပါညီမျှခြင်းကို အသုံးပြု၍ တွက်ချက်ခဲ့သည်- ဆန့်နိုင်အား = (Sup-Sdown)/Sdown၊ ဤတွင် Sup နှင့် Sdown တို့သည် အထည်၏ အပေါ်နှင့်အောက် အရိပ်များမှ ပုံသဏ္ဍာန်၏ အကွာအဝေးများ အသီးသီးဖြစ်သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ ၂ခ)။
နှလုံးအပိုင်းအစများကို ၄% ပါရာဖော်မယ်လ်ဒီဟိုက်တွင် ၄၈ နာရီကြာ ပြုပြင်ထားသည်။ ပြုပြင်ထားသောတစ်ရှူးများကို ၁၀% နှင့် ၂၀% ဆူးခရို့စ်တွင် ၁ နာရီကြာ ရေဓာတ်ခန်းခြောက်စေပြီးနောက် ၃၀% ဆူးခရို့စ်တွင် တစ်ညလုံးထားခဲ့သည်။ ထို့နောက် အပိုင်းအစများကို အကောင်းဆုံးဖြတ်တောက်သည့်အပူချိန်ဒြပ်ပေါင်း (OCT ဒြပ်ပေါင်း) တွင်ထည့်သွင်းပြီး isopentane/ခြောက်သွေ့သောရေခဲကန်တွင် တဖြည်းဖြည်းအေးခဲစေခဲ့သည်။ ခွဲထုတ်သည်အထိ OCT ထည့်သွင်းထားသောဘလောက်များကို -၈၀ °C တွင်သိမ်းဆည်းပါ။ ဆလိုက်များကို ၈ μm အထူရှိသော အပိုင်းအစများအဖြစ် ပြင်ဆင်ခဲ့သည်။
နှလုံးအပိုင်းများမှ OCT ကိုဖယ်ရှားရန်၊ အပူပေးဘလောက်ပေါ်တွင် ဆလိုက်များကို ၉၅ ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင် ၅ မိနစ်အပူပေးပါ။ ဆလိုက်တစ်ခုစီတွင် PBS ၁ မီလီလီတာထည့်ပြီး အခန်းအပူချိန်တွင် ၃၀ မိနစ်ခန့်ထားပြီးနောက် အခန်းအပူချိန်တွင် ၁၅ မိနစ်ခန့် PBS တွင် 0.1% Triton-X ကိုထားခြင်းဖြင့် အပိုင်းများထဲသို့ စိမ့်ဝင်သွားအောင်ပြုလုပ်ပါ။ သီးခြားမဟုတ်သော ပဋိပစ္စည်းများသည် နမူနာနှင့် ချိတ်ဆက်ခြင်းမှ ကာကွယ်ရန်အတွက်၊ ဆလိုက်များထဲသို့ ၃% BSA ပျော်ရည် ၁ မီလီလီတာထည့်ပြီး အခန်းအပူချိန်တွင် ၁ နာရီကြာထားပါ။ ထို့နောက် BSA ကိုဖယ်ရှားပြီး ဆလိုက်များကို PBS ဖြင့်ဆေးကြောပါ။ နမူနာတစ်ခုစီကို ခဲတံဖြင့်မှတ်သားပါ။ မူလပဋိပစ္စည်းများ (၁% BSA တွင် ၁:၂၀၀ ရောစပ်ပြီး ရောစပ်ထားသည်) (connexin 43 (Abcam; #AB11370)၊ NFATC4 (Abcam; #AB99431) နှင့် troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) ကို မိနစ် ၉၀ အတွင်း ထည့်သွင်းပြီးနောက် ဒုတိယပဋိပစ္စည်းများ (၁% BSA တွင် ၁:၂၀၀ ရောစပ်ပြီး ရောစပ်ထားသည်) ကို ကြွက် Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079) နှင့် ယုန် Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) တို့နှင့် နောက်ထပ် မိနစ် ၉၀ ကြာ PBS ဖြင့် ၃ ကြိမ်ဆေးကြောခဲ့သည်။ ပစ်မှတ်အစွန်းအထင်းကို နောက်ခံမှ ခွဲခြားသိရှိနိုင်ရန်အတွက် ဒုတိယပဋိပစ္စည်းကိုသာ ထိန်းချုပ်ကိရိယာအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။ နောက်ဆုံးတွင် DAPI nuclear stain ကို ထည့်သွင်းခဲ့ပြီး ဆလိုက်များကို vectashield (Vector Laboratories) တွင် ထည့်ပြီး လက်သည်းဆိုးဆေးဖြင့် လုံအောင်ပိတ်ခဲ့သည်။ (-x ချဲ့ထွင်မှု) နှင့် Keyence မိုက်ခရိုစကုပ်ဖြင့် ၄၀x ချဲ့ထွင်မှုရှိသည်။
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) ကို PBS တွင် 5 μg/ml ဖြင့် WGA ဆိုးဆေးအတွက် အသုံးပြုပြီး အခန်းအပူချိန်တွင် 30 မိနစ်ခန့် ပုံသေအပိုင်းများတွင် လိမ်းခဲ့သည်။ ထို့နောက် ဆလိုက်များကို PBS ဖြင့်ဆေးကြောပြီး Sudan black ကို ဆလိုက်တစ်ခုစီတွင်ထည့်ပြီး 30 မိနစ်ခန့် incubation လုပ်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် ဆလိုက်များကို PBS ဖြင့်ဆေးကြောပြီး vectashield embedding medium ကိုထည့်သွင်းခဲ့သည်။ ဆလိုက်များကို Keyence မိုက်ခရိုစကုပ်တွင် 40x magnification ဖြင့် မြင်သာအောင်ပြသခဲ့သည်။
အထက်တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း OCT ကို နမူနာများမှ ဖယ်ရှားခဲ့သည်။ OCT ကို ဖယ်ရှားပြီးနောက်၊ ဆလိုက်များကို Bouin's solution တွင် တစ်ညလုံးနှစ်မြှုပ်ပါ။ ထို့နောက် ဆလိုက်များကို ပေါင်းခံရေဖြင့် ၁ နာရီကြာဆေးကြောပြီးနောက် Bibrich aloe acid fuchsin solution တွင် ၁၀ မိနစ်ခန့်ထည့်ပါ။ ထို့နောက် ဆလိုက်များကို ပေါင်းခံရေဖြင့်ဆေးကြောပြီး ၅% phosphomolybdenum/၅% phosphotungstic acid ပါဝင်သော solution တွင် ၁၀ မိနစ်ခန့်ထည့်ပါ။ ရေမဆေးဘဲ၊ ဆလိုက်များကို aniline blue solution ထဲသို့ တိုက်ရိုက် ၁၅ မိနစ်ခန့်ထည့်ပါ။ ထို့နောက် ဆလိုက်များကို ပေါင်းခံရေဖြင့်ဆေးကြောပြီး ၁% acetic acid solution တွင် ၂ မိနစ်ခန့်ထည့်ပါ။ ဆလိုက်များကို 200 N ethanol တွင် အခြောက်ခံပြီး xylene သို့ လွှဲပြောင်းခဲ့သည်။ အရောင်ခြယ်ထားသော ဆလိုက်များကို Keyence မိုက်ခရိုစကုပ်ကို အသုံးပြု၍ 10x objective ဖြင့် မြင်သာအောင်ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ Fibrosis area percentage ကို Keyence Analyzer software ကို အသုံးပြု၍ တွက်ချက်ခဲ့သည်။
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA)၊ ကတ်တလောက်နံပါတ် V13154၊ ထုတ်လုပ်သူ၏ လုပ်ထုံးလုပ်နည်းအရ ပြုပြင်မွမ်းမံမှုအချို့ဖြင့် ပြုလုပ်ထားသည်။ အထူးသဖြင့် MTT ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွင်း တစ်ရှူးအရွယ်အစား တစ်ပြေးညီဖြစ်စေရန် အချင်း ၆ မီလီမီတာရှိသော ခွဲစိတ်မှုထိုးတံကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ ထုတ်လုပ်သူ၏ လုပ်ထုံးလုပ်နည်းအရ MTT အောက်ခံပါဝင်သော ၁၂-well plate ၏ well များထဲသို့ တစ်ရှူးများကို တစ်ခုချင်းစီ ချထားခဲ့သည်။ အပိုင်းများကို ၃၇°C တွင် ၃ နာရီကြာ ထားရှိပြီး အသက်ရှင်သောတစ်ရှူးသည် MTT အောက်ခံကို ဇီဝဖြစ်စဉ်ပြောင်းလဲစေပြီး ခရမ်းရောင် formazan ဒြပ်ပေါင်းတစ်ခု ဖွဲ့စည်းပေးသည်။ နှလုံးအပိုင်းများမှ ခရမ်းရောင် formazan ကို ထုတ်ယူရန် MTT ပျော်ရည်ကို 1 ml DMSO ဖြင့် အစားထိုးပြီး ၃၇°C တွင် ၁၅ မိနစ်ကြာ ထားရှိသည်။ နမူနာများကို DMSO တွင် ၉၆-well clear bottom plate များတွင် ၁:၁၀ ရောစပ်ပြီး Cytation plate reader (BioTek) ကို အသုံးပြု၍ 570 nm တွင် ခရမ်းရောင်ပြင်းထန်မှုကို တိုင်းတာခဲ့သည်။ နှလုံး၏ အပိုင်းတစ်ခုစီ၏ အလေးချိန်အတိုင်း ဖတ်ရှုမှုများကို ပုံမှန်ဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။
နှလုံးအပိုင်းအစ မီဒီယာကို ယခင်ကဖော်ပြခဲ့သည့်အတိုင်း ဂလူးကို့စ်အသုံးပြုမှု စမ်းသပ်မှုအတွက် 1 μCi/ml [5-3H]-ဂလူးကို့စ် (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) ပါဝင်သော မီဒီယာဖြင့် အစားထိုးခဲ့သည်။ ၄ နာရီကြာ incubation ပြုလုပ်ပြီးနောက်၊ 0.2 N HCl 100 µl ပါရှိသော ပွင့်လင်းသော မိုက်ခရိုစင်ထရီဖျျု့ပြွန်ထဲသို့ အလယ်အလတ် 100 µl ထည့်ပါ။ ထို့နောက် ပြွန်ကို dH2O 500 μl ပါရှိသော scintillation ပြွန်ထဲတွင် 37°C တွင် ၇၂ နာရီကြာ [3H]2O ကို အငွေ့ပျံစေခဲ့သည်။ ထို့နောက် မိုက်ခရိုစင်ထရီဖျျု့ပြွန်ကို scintillation ပြွန်မှ ဖယ်ရှားပြီး scintillation အရည် 10 ml ထည့်ပါ။ Scintillation ရေတွက်မှုများကို Tri-Carb 2900TR အရည် scintillation analyzer (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA) ကို အသုံးပြု၍ ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် ဂလူးကို့စ်အသုံးပြုမှုကို [5-3H]-ဂလူးကို့စ်တိကျသောလှုပ်ရှားမှု၊ မပြည့်စုံသောမျှခြေနှင့်နောက်ခံ၊ [5-3H]-ကို အညွှန်းမတပ်ထားသော ဂလူးကို့စ်သို့ ရောစပ်ခြင်းနှင့် scintillation counter ထိရောက်မှုတို့ကို ထည့်သွင်းစဉ်းစား၍ တွက်ချက်ခဲ့သည်။ အချက်အလက်များကို နှလုံး၏အစိတ်အပိုင်းများ၏ ဒြပ်ထုအဖြစ် ပုံမှန်ဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ထားသည်။
Trizol တွင် တစ်ရှူးများကို homogenization လုပ်ပြီးနောက်၊ ထုတ်လုပ်သူ၏ protocol အရ Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 ကို အသုံးပြု၍ နှလုံးအပိုင်းများမှ RNA ကို ခွဲထုတ်ခဲ့သည်။ RNAsec library ပြင်ဆင်မှု၊ sequencing နှင့် data analysis တို့ကို အောက်ပါအတိုင်း လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်-
RNA စာကြည့်တိုက်ပြင်ဆင်မှုအတွက် နမူနာတစ်ခုလျှင် RNA 1 μg ကို အစပြုပစ္စည်းအဖြစ်အသုံးပြုခဲ့သည်။ ထုတ်လုပ်သူ၏ အကြံပြုချက်များအတိုင်း Illumina အတွက် NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit (NEB, USA) ကို အသုံးပြု၍ Sequencing စာကြည့်တိုက်များကို ထုတ်လုပ်ခဲ့ပြီး နမူနာတစ်ခုစီအတွက် attribute sequences များတွင် index code များကို ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ အကျဉ်းချုပ်ပြောရလျှင် mRNA ကို poly-T oligonucleotides များဖြင့် တွဲထားသော magnetic beads များကို အသုံးပြု၍ total RNA မှ သန့်စင်ခဲ့သည်။ NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) တွင် အပူချိန်မြင့်မားသော divalent cations များကို အသုံးပြု၍ fragmentation ကို ပြုလုပ်သည်။ ပထမ strand cDNA ကို random hexamer primers များနှင့် M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-) ကို အသုံးပြု၍ ပေါင်းစပ်ထားသည်။ ဒုတိယ strand cDNA ကို DNA polymerase I နှင့် RNase H ကို အသုံးပြု၍ ပေါင်းစပ်ထားသည်။ ကျန်ရှိနေသော overhangs များကို exonuclease/polymerase activity ဖြင့် blunt ends များအဖြစ် ပြောင်းလဲသည်။ DNA fragment ၏ 3′ end ကို adenylation ပြုလုပ်ပြီးနောက်၊ hybridization အတွက် ပြင်ဆင်ရန် hairpin loop structure ရှိသော NEBNext Adapter ကို ၎င်းနှင့် ချိတ်ဆက်ထားသည်။ နှစ်သက်ရာအရှည် 150-200 bp ရှိသော cDNA အပိုင်းအစများကို ရွေးချယ်ရန်အတွက် AMPure XP စနစ် (Beckman Coulter, Beverly, USA) ကို အသုံးပြု၍ စာကြည့်တိုက်အပိုင်းအစများကို သန့်စင်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် adapter နှင့် ချိတ်ဆက်ထားသော အရွယ်အစားရွေးချယ်ထားသော cDNA ပါသည့် 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) ကို 37°C တွင် 15 မိနစ်နှင့် ထို့နောက် 95°C တွင် 5 မိနစ်ကြာ PCR ကိုအသုံးပြုခဲ့သည်။ ထို့နောက် PCR ကို Phusion High-Fidelity DNA polymerase၊ universal PCR primers နှင့် Index (X) primers များကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ နောက်ဆုံးတွင် PCR ထုတ်ကုန်များကို သန့်စင်ခဲ့သည် (AMPure XP စနစ်) နှင့် စာကြည့်တိုက်အရည်အသွေးကို Agilent Bioanalyzer 2100 စနစ်တွင် အကဲဖြတ်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် cDNA စာကြည့်တိုက်ကို Novaseq sequencer ကို အသုံးပြု၍ sequence လုပ်ခဲ့သည်။ Illumina မှ Raw image ဖိုင်များကို CASAVA Base Calling ကို အသုံးပြု၍ raw reads အဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲခဲ့သည်။ Raw data ကို read sequences များနှင့် သက်ဆိုင်ရာ base qualities များပါရှိသော FASTQ(fq) format ဖိုင်များတွင် သိမ်းဆည်းထားသည်။ စစ်ထုတ်ထားသော sequencing read များကို Sscrofa11.1 reference genome နှင့် ကိုက်ညီစေရန် HISAT2 ကိုရွေးချယ်ပါ။ ယေဘုယျအားဖြင့် HISAT2 သည် 4 billion bases ထက်ပိုကြီးသော genome များအပါအဝင် မည်သည့်အရွယ်အစားမဆိုရှိသော genome များကို ပံ့ပိုးပေးပြီး parameter အများစုအတွက် default values ​​များကို သတ်မှတ်ထားသည်။ RNA Seq data မှ splicing read များကို လက်ရှိရရှိနိုင်သော အမြန်ဆုံးစနစ်ဖြစ်သည့် HISAT2 ကို အသုံးပြု၍ အခြားနည်းလမ်းထက် တူညီသော သို့မဟုတ် ပိုမိုကောင်းမွန်သော တိကျမှုဖြင့် ထိရောက်စွာ ချိန်ညှိနိုင်သည်။
မှတ်တမ်းများ ပေါများခြင်းသည် မျိုးဗီဇဖော်ပြမှုအဆင့်ကို တိုက်ရိုက်ထင်ဟပ်စေသည်။ မျိုးဗီဇဖော်ပြမှုအဆင့်များကို မျိုးဗီဇ သို့မဟုတ် exon များနှင့်ဆက်စပ်နေသော မှတ်တမ်းများ ပေါများခြင်း (အစီအစဉ်ရေတွက်မှု) ဖြင့် အကဲဖြတ်သည်။ ဖတ်ရှုမှုအရေအတွက်သည် မျိုးဗီဇဖော်ပြမှုအဆင့်၊ မျိုးဗီဇအရှည်နှင့် အစီအစဉ်အနက်တို့နှင့် အချိုးကျသည်။ FPKM (အခြေခံအတွဲတစ်သန်းလျှင် အစီအစဉ်စီထားသော မှတ်တမ်းများ၏ အခြေခံအတွဲတစ်ထောင်လျှင် အပိုင်းအစများ) ကို တွက်ချက်ပြီး DESeq2 package ကို အသုံးပြု၍ differential expression ၏ P-value ​​များကို ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် ကျွန်ုပ်တို့သည် built-in R-function “p.adjust” ကို အခြေခံ၍ Benjamini-Hochberg နည်းလမ်း ၉ ကို အသုံးပြု၍ P တန်ဖိုးတစ်ခုစီအတွက် false discovery rate (FDR) ကို တွက်ချက်ခဲ့သည်။
နှလုံးအပိုင်းအစများမှ ခွဲထုတ်ထားသော RNA ကို Thermo (Thermo, cat. no. 11756050) မှ SuperScript IV Vilo Master အရောအနှောကို အသုံးပြု၍ 200 ng/μl အာရုံစူးစိုက်မှုတွင် cDNA သို့ ပြောင်းလဲခဲ့သည်။ Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well transparent reaction plate (Thermo, cat. no. 4483319) နှင့် microamp optical adhesive (Thermo, cat. no. 4311971) ကို အသုံးပြု၍ Quantitative RT-PCR ကို လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ ဓာတ်ပြုမှုအရောအနှောတွင် 5 µl Taqman Fast Advanced Master အရောအနှော (Thermo, cat # 4444557)၊ 0.5 µl Taqman Primer နှင့် 3.5 µl H2O ရောစပ်ထားခြင်းတို့ ပါဝင်ခဲ့သည်။ စံ qPCR လည်ပတ်မှုများကို လုပ်ဆောင်ခဲ့ပြီး CT တန်ဖိုးများကို Applied Biosystems Quantstudio 5 real-time PCR ကိရိယာ (384-well module; product # A28135) ကို အသုံးပြု၍ တိုင်းတာခဲ့သည်။ Taqman primers များကို Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) မှ ဝယ်ယူခဲ့သည်။ နမူနာအားလုံး၏ CT တန်ဖိုးများကို housekeeping gene GAPDH အဖြစ် ပုံမှန်ဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။
NT-ProBNP ၏ မီဒီယာထုတ်ပြန်ချက်ကို ထုတ်လုပ်သူ၏ လုပ်ထုံးလုပ်နည်းအရ NT-ProBNP ကိရိယာ (ဝက်) (Cat. No. MBS2086979, MyBioSource) ကို အသုံးပြု၍ အကဲဖြတ်ခဲ့သည်။ အကျဉ်းချုပ်ပြောရလျှင် နမူနာတစ်ခုစီနှင့် စံသတ်မှတ်ချက် ၂၅၀ µl ကို well တစ်ခုစီတွင် ထပ်ထည့်ခဲ့သည်။ နမူနာထည့်ပြီးနောက် ချက်ချင်းပင် Assay Reagent A ၅၀ µl ကို well တစ်ခုစီတွင် ထည့်ပါ။ plate ကို ညင်သာစွာလှုပ်ပြီး sealant ဖြင့် လုံအောင်ပိတ်ပါ။ ထို့နောက် ဆေးပြားများကို ၃၇°C တွင် ၁ နာရီကြာ ထားခဲ့သည်။ ထို့နောက် အရည်ကို စုပ်ယူပြီး 1X wash solution ၃၅၀ µl ဖြင့် well များကို ၄ ကြိမ်ဆေးကြောပါ၊ တစ်ကြိမ်လျှင် 1-2 မိနစ်ကြာ ထားခဲ့သည်။ ထို့နောက် well တစ်ခုလျှင် Assay Reagent B ၁၀၀ µl ထည့်ပြီး plate sealant ဖြင့် လုံအောင်ပိတ်ပါ။ ဆေးပြားကို ညင်သာစွာလှုပ်ပြီး ၃၇°C တွင် ၃၀ မိနစ်ကြာ ထားခဲ့သည်။ အရည်ကို စုပ်ယူပြီး 1X wash solution ၃၅၀ µl ဖြင့် well များကို ၅ ကြိမ်ဆေးကြောပါ။ အပေါက်တစ်ခုစီထဲသို့ substrate solution 90 µl ထည့်ပြီး plate ကိုပိတ်ပါ။ plate ကို 37°C တွင် 10-20 မိနစ်ကြာ incubation လုပ်ပါ။ well တစ်ခုစီထဲသို့ Stop Solution 50 µl ထည့်ပါ။ 450 nm တွင်တပ်ဆင်ထားသော Cytation (BioTek) plate reader ကို အသုံးပြု၍ plate ကိုချက်ချင်းတိုင်းတာခဲ့သည်။
အမျိုးအစား I အမှားနှုန်း ၅% ဖြင့် ပါရာမီတာတွင် ၁၀% ပကတိပြောင်းလဲမှုကို ထောက်လှမ်းရန် > ၈၀% ပါဝါပေးစွမ်းမည့် အုပ်စုအရွယ်အစားများကို ရွေးချယ်ရန် ပါဝါခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ အမျိုးအစား I အမှားနှုန်း ၅% ဖြင့် ပါရာမီတာတွင် ၁၀% ပကတိပြောင်းလဲမှုကို ထောက်လှမ်းရန် > ၈၀% ပါဝါပေးစွမ်းမည့် အုပ်စုအရွယ်အစားများကို ရွေးချယ်ရန် ပါဝါခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности дногности дноля обяж 10% изменения параметра с 5% частотой ошибок типа ငါ။ အမျိုးအစား I အမှားနှုန်း ၅% ဖြင့် ၁၀% ပကတိကန့်သတ်ချက်ပြောင်းလဲမှုကို ထောက်လှမ်းရန် >၈၀% ပါဝါပေးစွမ်းမည့် အုပ်စုအရွယ်အစားများကို ရွေးချယ်ရန် ပါဝါခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％凰珎进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％凰珎 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для 10 % мощности для обеспечил абсолютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. ၁၀% ပကတိကန့်သတ်ချက်ပြောင်းလဲမှုနှင့် ၅% အမျိုးအစား I အမှားနှုန်းကို ထောက်လှမ်းရန် >၈၀% ပါဝါပေးစွမ်းမည့် အုပ်စုအရွယ်အစားကို ရွေးချယ်ရန် ပါဝါခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။စမ်းသပ်မှုမပြုလုပ်မီ တစ်ရှူးအပိုင်းအစများကို ကျပန်းရွေးချယ်ခဲ့သည်။ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအားလုံးကို အခြေအနေကို မျက်ကွယ်ပြုထားပြီး အချက်အလက်အားလုံးကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပြီးမှသာ နမူနာများကို ကုဒ်ဖြည်ခဲ့သည်။ စာရင်းအင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအားလုံးကို လုပ်ဆောင်ရန် GraphPad Prism ဆော့ဖ်ဝဲ (ဆန်ဒီယေဂို၊ ကယ်လီဖိုးနီးယား) ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ စာရင်းအင်းအားလုံးအတွက်၊ p-တန်ဖိုးများကို တန်ဖိုးများ <0.05 တွင် သိသာထင်ရှားသည်ဟု ယူဆခဲ့သည်။ စာရင်းအင်းအားလုံးအတွက်၊ p-တန်ဖိုးများကို တန်ဖိုးများ <0.05 တွင် သိသာထင်ရှားသည်ဟု ယူဆခဲ့သည်။ Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05။ စာရင်းအင်းအားလုံးအတွက်၊ p-တန်ဖိုးများကို တန်ဖိုးများ <0.05 တွင် သိသာထင်ရှားသည်ဟု ယူဆခဲ့သည်။对于所有统计数据，p 值在值<0.05时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05။ စာရင်းအင်းအားလုံးအတွက်၊ p-တန်ဖိုးများကို တန်ဖိုးများ <0.05 တွင် သိသာထင်ရှားသည်ဟု ယူဆခဲ့သည်။Two-tailed Student's t-test ကို နှိုင်းယှဉ်မှု ၂ ခုသာဖြင့် အချက်အလက်ပေါ်တွင် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ အုပ်စုများစွာအကြား အရေးပါမှုကို ဆုံးဖြတ်ရန် One-way သို့မဟုတ် two-way ANOVA ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ post hoc စမ်းသပ်မှုများကို လုပ်ဆောင်သည့်အခါ နှိုင်းယှဉ်မှုများစွာကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားရန် Tukey's correction ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ Methods အပိုင်းတွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း FDR နှင့် p.adjust တွက်ချက်သည့်အခါ RNAsec အချက်အလက်တွင် အထူးစာရင်းအင်းဆိုင်ရာ ထည့်သွင်းစဉ်းစားရမည့်အချက်များ ရှိပါသည်။
လေ့လာမှုဒီဇိုင်းနှင့်ပတ်သက်သည့် နောက်ထပ်အချက်အလက်များအတွက် ဤဆောင်းပါးနှင့် ဆက်စပ်ထားသော Nature Research Report အနှစ်ချုပ်ကို ကြည့်ပါ။