Nature.com ကိုလာရောက်လည်ပတ်တဲ့အတွက် ကျေးဇူးတင်ပါတယ်။ သင်အသုံးပြုနေသောဘရောက်ဆာဗားရှင်းတွင် CSS ပံ့ပိုးမှုအကန့်အသတ်ရှိသည်။ အကောင်းဆုံးအတွေ့အကြုံအတွက်၊ အပ်ဒိတ်လုပ်ထားသောဘရောက်ဆာ (သို့မဟုတ် Internet Explorer တွင် လိုက်ဖက်ညီသောမုဒ်ကိုပိတ်ပါ) ကိုအသုံးပြုရန် ကျွန်ုပ်တို့အကြံပြုအပ်ပါသည်။ ဤအတောအတွင်း၊ ဆက်လက်ပံ့ပိုးမှုသေချာစေရန်၊ ပုံစံများနှင့် JavaScript မပါဘဲ ဝဘ်ဆိုက်ကို တင်ဆက်ပါမည်။
ဆေးဝါးစစ်ဆေးမှုအတွက် နှလုံး၏ဇီဝကမ္မပတ်ဝန်းကျင်ကို တိကျစွာမျိုးပွားနိုင်သည့် ယုံကြည်စိတ်ချရသော ဗီရိုစနစ်တစ်ခု လိုအပ်ပါသည်။ လူ့နှလုံးတစ်ရှူး ယဉ်ကျေးမှုစနစ်များ အကန့်အသတ်ဖြင့် ရရှိနိုင်မှုသည် နှလုံးဆေးဝါးအကျိုးသက်ရောက်မှု၏ တိကျသောအဓိပ္ပာယ်ဖွင့်ဆိုချက်များကို ဖြစ်ပေါ်စေခဲ့သည်။ ဤတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် နှလုံးစက်ဝန်း၏ systolic နှင့် diastolic အဆင့်များအတွင်း နှလုံးအချပ်များကို လျှပ်စစ်စက်ဖြင့် လှုံ့ဆော်ပေးပြီး ဇီဝကမ္မဆိုင်ရာ ဆွဲဆန့်ခြင်းကို ခံယူသည့် နှလုံးတစ်ရှူးယဉ်ကျေးမှုပုံစံ (CTCM) ကို တီထွင်ထားပါသည်။ ယဉ်ကျေးမှုကို 12 ရက်ကြာပြီးနောက်၊ ဤနည်းလမ်းသည် နှလုံးအပိုင်းများ၏ ရှင်သန်နိုင်စွမ်းကို တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းတိုးတက်စေသော်လည်း ၎င်းတို့၏ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ ခိုင်မာမှုကို အပြည့်အဝမထိန်းသိမ်းနိုင်ပါ။ ထို့ကြောင့်၊ သေးငယ်သောမော်လီကျူးများကို စစ်ဆေးပြီးနောက်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏အလယ်အလတ်သို့ 100 nM triiodothyronine (T3) နှင့် 1 μM dexamethasone (Dex) တို့သည် အပိုင်းများ၏ သေးငယ်သောဖွဲ့စည်းပုံအား 12 ရက်ကြာ ထိန်းသိမ်းထားကြောင်း တွေ့ရှိရပါသည်။ T3/Dex ကုသမှုနှင့်အတူ CTCM စနစ်သည် ကူးယူဖော်ပြနိုင်သော ပရိုဖိုင်များ၊ ရှင်သန်နိုင်စွမ်း၊ ဇီဝဖြစ်စဉ်လုပ်ဆောင်မှုနှင့် ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာ ခိုင်မာမှုတို့ကို 12 ရက်ကြာ ထိန်းသိမ်းထားသည်။ ထို့အပြင်၊ ယဉ်ကျေးမှုတွင် နှလုံးတစ်သျှူးများ အလွန်အကျွံ ဆန့်ထုတ်ခြင်းသည် နှလုံးဆန့်ခြင်းကြောင့် ဖြစ်စေသော hypertrophic အခြေအနေများကို တုပနိုင်သည့် CTCM ၏ စွမ်းရည်အတွက် သက်သေအထောက်အထားများ ပေးစွမ်းနိုင်သော hypertrophic cardiac signaling ကို ဖြစ်စေသည်။ နိဂုံးချုပ်အားဖြင့်၊ CTCM သည် ယဉ်ကျေးမှုရှိ နှလုံး၏ဇီဝကမ္မဗေဒနှင့် ဇီဝကမ္မဗေဒကို အချိန်ကြာမြင့်စွာ စံနမူနာပြုနိုင်ပြီး ယုံကြည်စိတ်ချရသော ဆေးဝါးစစ်ဆေးမှုကို လုပ်ဆောင်နိုင်မည်ဖြစ်သည်။
လက်တွေ့သုတေသနမပြုမီတွင်၊ လူ့နှလုံး၏ဇီဝကမ္မပတ်ဝန်းကျင်ကို တိကျစွာမျိုးပွားနိုင်သော vitro system တွင် အားကိုးအားထားပြုရန်လိုအပ်ပါသည်။ ထိုသို့သောစနစ်များသည် ပြောင်းလဲလာသော စက်ပိုင်းဆိုင်ရာ ဆွဲဆန့်မှု၊ နှလုံးခုန်နှုန်းနှင့် လျှပ်စစ်ဇီဝကမ္မဆိုင်ရာ ဂုဏ်သတ္တိများကို အတုယူသင့်သည်။ တိရိစ္ဆာန်မော်ဒယ်များကို လူ့နှလုံးရှိ ဆေးဝါးများ၏ အာနိသင်များကို ထင်ဟပ်ပြသရာတွင် အကန့်အသတ်ဖြင့် ယုံကြည်စိတ်ချရမှုရှိသော နှလုံးဇီဝကမ္မဗေဒဆိုင်ရာ စစ်ဆေးမှုပလပ်ဖောင်းအဖြစ် အများအားဖြင့် အသုံးပြုကြသည်။ အဆုံးစွန်အားဖြင့်၊ Ideal Cardiac Tissue Culture Experimental Model (CTCM) သည် အမျိုးမျိုးသော ကုထုံးနှင့် ဆေးဝါးဗေဒဆိုင်ရာ ဝင်ရောက်စွက်ဖက်မှုများအတွက် အလွန်အထိခိုက်မခံသော စံနမူနာဖြစ်ပြီး လူ့နှလုံး၏ ဇီဝကမ္မဗေဒနှင့် ဇီဝကမ္မဗေဒဆိုင်ရာ တိကျစွာမျိုးပွားခြင်း ၃။ ထိုသို့သောစနစ်မရှိခြင်းသည် နှလုံးရောဂါအတွက် ကုသမှုအသစ်များရှာဖွေတွေ့ရှိမှုကို ကန့်သတ်ထားပြီး စျေးကွက်မှထွက်ရခြင်း၏အဓိကအကြောင်းရင်းအဖြစ် မူးယစ်ဆေး cardiotoxicity ကိုဖြစ်ပေါ်စေသည်။
လွန်ခဲ့သည့်ဆယ်စုနှစ်များအတွင်း၊ နှလုံးသွေးကြောဆိုင်ရာမဟုတ်သောဆေး ၈ မျိုးကို ၎င်းတို့သည် QT ကြားကာလရှည်လျားမှုကိုဖြစ်စေသောကြောင့် ventricular ပုံမမှန်ခြင်းနှင့် ရုတ်တရက်သေဆုံးခြင်းတို့ကို ဖြစ်စေသောကြောင့် လက်တွေ့အသုံးပြုမှုမှ ရုပ်သိမ်းခဲ့သည်။ ထို့ကြောင့် နှလုံးသွေးကြောဆိုင်ရာ ထိရောက်မှုနှင့် အဆိပ်သင့်မှုကို အကဲဖြတ်ရန် ယုံကြည်စိတ်ချရသော ကြိုတင်စမ်းသပ်စစ်ဆေးမှုဗျူဟာများ လိုအပ်လာပါသည်။ ဆေးဝါးစစ်ဆေးခြင်းနှင့် အဆိပ်သင့်ခြင်းစမ်းသပ်ခြင်းတွင် လူသားမှဖြစ်ပေါ်စေသော pluripotent ပင်မဆဲလ်မှရရှိသော cardiomyocytes (hiPS-CM) ကို မကြာသေးမီကအသုံးပြုခြင်းသည် ဤပြဿနာအတွက် တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းဖြေရှင်းချက်တစ်ခုပေးပါသည်။ သို့သော်၊ hiPS-CMs ၏မရင့်ကျက်သောသဘောသဘာဝနှင့်နှလုံးတစ်ရှူးများ၏ multicellular ရှုပ်ထွေးမှုမရှိခြင်းသည်ဤနည်းလမ်း၏အဓိကကန့်သတ်ချက်များဖြစ်သည်။ မကြာသေးမီက လေ့လာမှုများအရ နှလုံးတစ်ရှူးများ အလိုလိုကျုံ့လာပြီး အချိန်ကြာလာသည်နှင့်အမျှ လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှု တဖြည်းဖြည်း တိုးလာပြီးနောက် မကြာမီတွင် နှလုံးတစ်ရှူး ဟိုက်ဒရိုဂျယ်လ်များကို အစောပိုင်း hiPS-CM ကို အသုံးပြုခြင်းဖြင့် ဤကန့်သတ်ချက်ကို တစ်စိတ်တစ်ပိုင်း ကျော်လွှားနိုင်သည်ဟု မကြာသေးမီက လေ့လာမှုများက ပြသခဲ့သည်။ သို့သော်၊ ဤ hiPS-CM သေးငယ်သောတစ်ရှူးများသည် အရွယ်ရောက်ပြီးသူ myocardium ၏ ရင့်ကျက်သော electrophysiological နှင့် contractile ဂုဏ်သတ္တိများ မရှိပေ။ ထို့အပြင်၊ လူ့နှလုံးတစ်ရှူးတွင် ဆဲလ်အမျိုးအစားများအပြင် endothelial ဆဲလ်များ၊ နျူရွန်များနှင့် stromal fibroblasts အပါအဝင် မတူညီသောဆဲလ်အမျိုးအစားများ၏ ကွဲပြားသောအရောအနှောပါဝင်ပြီး ပိုမိုရှုပ်ထွေးသောဖွဲ့စည်းပုံတစ်ခုရှိသည်။ အရွယ်ရောက်နို့တိုက်သတ္တဝါများ၏နှလုံးရှိ cardiomyocyte မဟုတ်သောလူဦးရေ 11,12,13 ၏မျိုးကွဲကွဲပြားမှုသည်တစ်ဦးချင်းစီဆဲလ်အမျိုးအစားများကိုအသုံးပြု၍ နှလုံးတစ်ရှူးများကိုပုံစံထုတ်ရန်အဓိကအတားအဆီးဖြစ်သည်။ ဤအဓိကကန့်သတ်ချက်များသည် ဇီဝကမ္မနှင့် ဇီဝကမ္မအခြေအနေများအောက်တွင် မပျက်မစီးသော myocardial တစ်သျှူးများကို ပြုစုပျိုးထောင်ရန် နည်းလမ်းများ၏ အရေးပါမှုကို အလေးပေးပါသည်။
လူ့နှလုံး၏ ပါးလွှာသော (300 µm) အပိုင်းများကို ယဉ်ကျေးအောင်ပြုလုပ်ထားပြီး မပျက်မစီးသော လူသား myocardium ၏ အလားအလာရှိသော ပုံစံတစ်ခုဖြစ်ကြောင်း သက်သေပြခဲ့သည်။ ဤနည်းလမ်းသည် လူ့နှလုံးတစ်ရှူးများကဲ့သို့ ပြီးပြည့်စုံသော 3D ဆဲလ်လူလာစနစ်သို့ ဝင်ရောက်ခွင့်ပေးသည်။ သို့သော် 2019 ခုနှစ်အထိ၊ ယဉ်ကျေးသောနှလုံးအပိုင်းများအသုံးပြုမှုကို တိုတောင်းသော (24 နာရီ) ယဉ်ကျေးမှုရှင်သန်မှုဖြင့် ကန့်သတ်ထားသည်။ ၎င်းသည် ရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာ-စက်ပိုင်းဆိုင်ရာဆန့်ထုတ်မှုမရှိခြင်း၊ လေ-အရည်မျက်နှာပြင်နှင့် နှလုံးတစ်ရှူးများ၏လိုအပ်ချက်များကို မပံ့ပိုးနိုင်သော ရိုးရှင်းသောမီဒီယာအသုံးပြုခြင်းအပါအဝင် အကြောင်းအချက်များစွာကြောင့်ဖြစ်သည်။ 2019 ခုနှစ်တွင်၊ များစွာသော သုတေသနအဖွဲ့များသည် နှလုံးတစ်ရှူးယဉ်ကျေးမှုစနစ်များတွင် စက်ပိုင်းဆိုင်ရာအချက်များအား ပေါင်းစပ်ခြင်းဖြင့် ယဉ်ကျေးမှုသက်တမ်းကို သက်တမ်းတိုးစေကာ နှလုံးဖော်ပြမှုကို ပိုမိုကောင်းမွန်စေကာ နှလုံးရောဂါဗေဒကို အတုယူနိုင်ကြောင်း သရုပ်ပြခဲ့သည်။ အံဝင်ခွင်ကျလေ့လာမှု 17 နှင့် 18 နှစ်ခုက uniaxial mechanical loading သည် ယဉ်ကျေးမှုကာလအတွင်း နှလုံး phenotype ပေါ်တွင် အပြုသဘောဆောင်သော သက်ရောက်မှုရှိကြောင်း ပြသသည်။ သို့သော်၊ ဤလေ့လာမှုများသည် နှလုံးစက်ဝန်း၏ ဒိုင်းနမစ်သုံးဖက်မြင် ရူပဗေဒစက်ဝန်းအား မြှင့်တင်ခြင်းကို အသုံးမပြုခဲ့ပေ။ ဤတစ်ရှူးများကို ဆန့်ထုတ်ခြင်းနည်းလမ်းများသည် နှလုံးဗီဇအများအပြားကို ဖိနှိပ်ခြင်း သို့မဟုတ် ပုံမှန်မဟုတ်သော ဆန့်ထုတ်တုံ့ပြန်မှုများနှင့် ဆက်စပ်နေသော မျိုးဗီဇများ လွန်ကဲစွာဖော်ပြခြင်းကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်။ အထူးသဖြင့် Pitoulis et al ။ 19 သည် force transducer တုံ့ပြန်ချက်နှင့် tension drives များကို အသုံးပြု၍ နှလုံးလည်ပတ်မှုပြန်လည်တည်ဆောက်မှုအတွက် တက်ကြွသောနှလုံးအချပ်ယဉ်ကျေးမှုရေချိုးခြင်းကို တီထွင်ခဲ့သည်။ ဤစနစ်သည် vitro cardiac cycle modeling တွင် ပိုမိုတိကျမှုကို ခွင့်ပြုထားသော်လည်း၊ နည်းလမ်း၏ ရှုပ်ထွေးမှုနှင့် နိမ့်ဆင်းမှုတို့သည် ဤစနစ်၏အသုံးချမှုကို ကန့်သတ်ထားသည်။ ကျွန်ုပ်တို့၏ဓာတ်ခွဲခန်းသည် မကြာသေးမီကမှ ရိုးရှင်းသော ယဉ်ကျေးမှုစနစ်အား porcine နှင့် လူ့နှလုံးတစ်သျှူးများ၏ ရှင်သန်နိုင်စွမ်းကို 6 ရက် 20၊21 အထိ ဆက်လက်ထိန်းသိမ်းထားရန် လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုနှင့် အကောင်းဆုံးပြင်ဆင်ထားသော ကြားခံကို အသုံးပြု၍ ရိုးရှင်းသောယဉ်ကျေးမှုစနစ်ကို တီထွင်ခဲ့သည်။
လက်ရှိလက်ရေးစာမူတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် နှလုံးစက်ဝန်းအတွင်း သုံးဖက်မြင် နှလုံးဇီဝကမ္မဗေဒနှင့် နှလုံးလည်ပတ်မှုအတွင်း ဇီဝကမ္မဗေဒဆိုင်ရာ တင်းမာမှုများကို ပြန်လည်စုစည်းရန် ဟာသအချက်များပါ၀င်သည့် porcine heart ၏အပိုင်းများကို အသုံးပြုကာ နှလုံးတစ်ရှူးယဉ်ကျေးမှုပုံစံ (CTCM) ကို ဖော်ပြထားပါသည်။ ဤ CTCM သည် ဆေးကြိုဆေးစစ်ဆေးမှုအတွက် နို့တိုက်သတ္တဝါများ၏ နှလုံး၏ဇီဝကမ္မဗေဒ/ရောဂါဗေဒကို တုပထားသည့် ကုန်ကျစရိတ်သက်သာသော၊ အလယ်အလတ်သောနှလုံးစနစ်အား ပံ့ပိုးပေးခြင်းဖြင့် ယခင်က ဆေးကြိုခန့်မှန်းချက်၏ တိကျမှုကို တိုးမြှင့်နိုင်သည်။
သွေးလှည့်ပတ်မှုဆိုင်ရာအချက်ပြမှုများသည် vitro 22,23,24 တွင် cardiomyocyte လုပ်ဆောင်ချက်ကိုထိန်းသိမ်းရာတွင်အရေးကြီးသောအခန်းကဏ္ဍမှပါဝင်သည်။ လက်ရှိလက်ရေးစာမူတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဇီဝကမ္မကြိမ်နှုန်းများ (1.2 Hz, 72 beats per minute) ဖြင့် အရွယ်ရောက်ပြီးသူ၏ နှလုံးပတ်ဝန်းကျင်ကို အတုယူနိုင်သော CTCM (ပုံ 1a) ကို တီထွင်ထားပါသည်။ diastole ကာလအတွင်း တစ်သျှူးအလွန်အကျွံဆန့်ခြင်းကို ရှောင်ရှားရန် တစ်ရှူးအရွယ်အစား 25% တိုးရန် 3D ပုံနှိပ်စက်ကို အသုံးပြုခဲ့သည် (ပုံ။ 1b)။ C-PACE စနစ်မှ လှုံ့ဆော်ပေးသော လျှပ်စစ်အရှိန်အဟုန်သည် နှလုံးလည်ပတ်မှုကို အပြည့်အဝပြန်ထုတ်ပေးရန်အတွက် ဒေတာရယူမှုစနစ်ဖြင့် systole မတိုင်မီ 100 ms စတင်ရန် အချိန်သတ်မှတ်ထားသည်။ တစ်သျှူးယဉ်ကျေးမှုစနစ်သည် အပေါ်ခန်းရှိ နှလုံးချပ်များကို ချဲ့ထွင်ရန်အတွက် ကွေးညွှတ်နိုင်သော ဆီလီကွန်အမြှေးပါးကို စက်ဘီးဖြင့်ချဲ့ရန်အတွက် ပရိုဂရမ်လုပ်နိုင်သော အဆုတ်အအေးဓာတ်လှုံ့ဆော်စက် (LB Engineering၊ Germany) ကို အသုံးပြုထားသည်။ စနစ်သည် ဖိအား (± 1 mmHg) နှင့် အချိန် (± 1 ms) (ပုံ. 1c) ကို တိကျစွာ ချိန်ညှိနိုင်စေသည့် ဖိအား transducer မှတဆင့် ပြင်ပလေလိုင်းနှင့် ချိတ်ဆက်ထားသည်။
a အပြာရောင်ဖြင့်ပြသထားသည့် 7 မီလီမီတာ ပံ့ပိုးမှုလက်စွပ်တွင် တစ်ရှူးအပိုင်းကို စက်၏ယဉ်ကျေးမှုခန်းအတွင်းတွင် ချိတ်ပါ။ ယဉ်ကျေးမှုအခန်းကို လေထုခန်းနှင့် ပျော့ပြောင်းနိုင်သော ဆီလီကွန်အမြှေးပါးဖြင့် ပိုင်းခြားထားသည်။ ယိုစိမ့်မှုကို ကာကွယ်ရန် အခန်းတစ်ခုစီကြားတွင် gasket တစ်ခုစီထားပါ။ စက်၏အဖုံးတွင် လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုပေးသည့် ဂရပ်ဖိုက်လျှပ်ကူးပစ္စည်းပါရှိသည်။ b ကြီးမားသောတစ်ရှူးကိရိယာ၊ လမ်းညွှန်လက်စွပ်နှင့် ပံ့ပိုးလက်စွပ်တို့၏ သရုပ်ဖော်ပုံ။ တစ်ရှူးအပိုင်းများ (အညိုရောင်) ကို ကိရိယာ၏ အပြင်ဘက်အစွန်းရှိ groove တွင် လမ်းညွှန်လက်စွပ်ဖြင့် အရွယ်အစားကြီးသည့် စက်ပေါ်တွင် ထားရှိထားပါသည်။ လမ်းညွှန်ကိုအသုံးပြု၍ နှလုံးတစ်ရှူး၏အပိုင်းအပေါ်တစ်ရှူး acrylic ကော်ဖြင့်အုပ်ထားသောထောက်ကွင်းကို ဂရုတစိုက်ထားပါ။ c ပရိုဂရမ်mable pneumatic actuator (PPD) မှ ထိန်းချုပ်ထားသော လေခန်းဖိအား၏ လုပ်ဆောင်ချက်အဖြစ် လျှပ်စစ်နှိုးဆွသည့်အချိန်ကို ပြသသည့် ဂရပ်။ ဖိအားအာရုံခံကိရိယာများကို အသုံးပြု၍ လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုကို တစ်ပြိုင်တည်းလုပ်ဆောင်ရန် ဒေတာရယူသည့်ကိရိယာကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ ယဉ်ကျေးမှုခန်းရှိ ဖိအားသည် သတ်မှတ်အဆင့်သို့ရောက်ရှိသောအခါ၊ လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုကို ဖြစ်ပေါ်စေရန်အတွက် C-PACE-EM သို့ သွေးခုန်နှုန်းအချက်ပြမှုတစ်ခု ပေးပို့သည်။ d incubator စင်တစ်ခုပေါ်တွင် CTCM လေးခု၏ပုံ။ စက်လေးခုကို pneumatic circuit မှတစ်ဆင့် PPD တစ်ခုသို့ ချိတ်ဆက်ထားပြီး pneumatic circuit အတွင်းရှိ ဖိအားကို စောင့်ကြည့်ရန် hemostatic valve ထဲသို့ ဖိအားအာရုံခံကိရိယာများ ထည့်သွင်းထားသည်။ စက်တစ်ခုစီတွင် တစ်ရှူးအပိုင်းခြောက်ခုပါရှိသည်။
pneumatic actuator တစ်ခုတည်းကို အသုံးပြု၍ CTCM စက် 4 ခုကို ထိန်းချုပ်နိုင်ခဲ့ပြီး တစ်ခုချင်းစီတွင် တစ်ရှုးအပိုင်း 6 ခု (ပုံ 1d) ကို ထိန်းချုပ်နိုင်ခဲ့သည်။ CTCM တွင်၊ လေထုခန်းရှိ လေဖိအားသည် အရည်ခန်းရှိ synchronous ဖိအားအဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲသွားပြီး နှလုံးချပ်၏ ဇီဝကမ္မဆိုင်ရာ ချဲ့ထွင်မှုကို လှုံ့ဆော်ပေးသည် (ပုံ 2a နှင့် နောက်ဆက်တွဲရုပ်ရှင် 1)။ တစ်ရှူးဆန့်ခြင်းကို 80 mm Hg တွင် အကဲဖြတ်ခြင်း။ အနုပညာ။ တစ်သျှူးအပိုင်းများကို 25% ဆန့်ထုတ်ပြသခဲ့သည် (ပုံ။ 2b)။ ဤရာခိုင်နှုန်းဆန့်မှုသည် ပုံမှန်နှလုံးအပိုင်းကျုံ့နိုင်မှု 17,19,25 အတွက် ဇီဝကမ္မဆိုင်ရာဆားcomere အရှည် 2.2-2.3 µm နှင့် ကိုက်ညီကြောင်းပြသထားသည်။ တစ်ရှူးလှုပ်ရှားမှုကို စိတ်ကြိုက်ကင်မရာဆက်တင်များ (နောက်ဆက်တွဲပုံ 1) ကို အသုံးပြု၍ အကဲဖြတ်ခဲ့သည်။ တစ်ရှူးလှုပ်ရှားမှု၏ ပမာဏနှင့် အလျင် (ပုံ 2c၊ ဃ) သည် နှလုံးစက်ဝန်းအတွင်းနှင့် systole နှင့် diastole အတွင်း အချိန်နှင့် ဆက်စပ်နေသည် (ပုံ။ 2b)။ ကျုံ့ခြင်းနှင့် ပြေလျော့သွားချိန်တွင် နှလုံးတစ်သျှူးများ၏ ဆန့်ထွက်မှုနှင့် အလျင်သည် ယဉ်ကျေးမှုတွင် 12 ရက်ကြာ မတည်မြဲခဲ့သည် (ပုံ။ 2f)။ ယဉ်ကျေးမှုအတွင်း ကျုံ့နိုင်မှုအပေါ် လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှု၏ အကျိုးသက်ရောက်မှုကို အကဲဖြတ်ရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် အရိပ်အာဝါသ အယ်လဂိုရီသမ် (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ 2a၊ b) ကို အသုံးပြု၍ တက်ကြွသော ပုံသဏ္ဍာန်ကို ဆုံးဖြတ်ရန်အတွက် နည်းလမ်းတစ်ခုကို တီထွင်ခဲ့ပြီး လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုမရှိဘဲ ပုံသဏ္ဍာန်နှင့် ပုံသဏ္ဍာန်များကို ခွဲခြားနိုင်ခဲ့သည်။ တူညီသောအပိုင်း (ပုံ။ 2f) နှလုံး။ ဖြတ်ခြင်း၏ရွေ့လျားနိုင်သောနေရာ (R6-9) တွင်၊ လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုအတွင်း ဗို့အားသည် လျှပ်စီးကြောင်းနှိုးဆွမှုမရှိခြင်းထက် 20% ပိုများသည်၊ ၎င်းသည် contractile function ကိုလျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှု၏ပံ့ပိုးမှုကိုညွှန်ပြသောလျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုဖြစ်သည်။
လေဝင်ပေါက်ဖိအား၊ အရည်ခန်းဖိအားနှင့် တစ်ရှူးလှုပ်ရှားမှုတိုင်းတာချက်များ၏ ကိုယ်စားလှယ်ခြေရာများသည် အခန်းဖိအားမှ အရည်အခန်းဖိအားကို ပြောင်းလဲစေပြီး တစ်ရှူးအချပ်၏ ဆက်စပ်လှုပ်ရှားမှုကို ဖြစ်ပေါ်စေကြောင်း အတည်ပြုသည်။ b ရာခိုင်နှုန်းဆန့်ခြင်း (လိမ္မော်ရောင်) နှင့် သက်ဆိုင်သော တစ်သျှူးအပိုင်းများ (အပြာ) ၏ ကိုယ်စားပြုခြေရာများ။ c နှလုံးအချပ်၏ တိုင်းတာသည့် ရွေ့လျားမှုသည် တိုင်းတာသည့် ရွေ့လျားမှုအမြန်နှုန်းနှင့် ကိုက်ညီသည်။ (ဃ) နှလုံးအစိပ်အပိုင်းတွင် စက်ဘီးစီးရွေ့လျားမှု (အပြာရောင်မျဉ်း) နှင့် အလျင် (လိမ္မော်ရောင် အစက်အပြောက်မျဉ်း) တို့၏ ကိုယ်စားပြုလမ်းကြောင်းများ။ e လည်ပတ်ချိန်ပမာဏ (n=19 ချပ်၊ အုပ်စုတစ်ခုလျှင် ကွဲပြားသောဝက်များမှ)၊ ကျုံ့ချိန် (n = 19 ချပ်၊ အုပ်စုတစ်ခုလျှင် 19 ချပ်)၊ အပန်းဖြေချိန် (n=19 ချပ်၊ အုပ်စုတစ်ခုလျှင် မတူညီသောဝက်များမှ)၊ တစ်ရှူးလှုပ်ရှားမှု (n = 25)။ မတူညီသောဝက်များမှ အချပ်များ)၊ အထွတ်အထိပ် systolic velocity (n = 24(D0)၊ မတူညီသောဝက်များမှ 25(D12) ချပ်/အုပ်စု) နှင့် အထွတ်အထိပ် ပြေလျော့မှုနှုန်း (n=24(D0)၊ မတူညီသောဝက်များမှ 25(D12) ချပ်/အုပ်စု)။ အမြီးနှစ်ချောင်းရှိသော ကျောင်းသား၏ t-test သည် မည်သည့်ကန့်သတ်ချက်တွင်မဆို သိသာထင်ရှားသော ခြားနားမှုမပြပါ။ f ကိုယ်စားပြု strain ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်း (အနီရောင်) နှင့် (အပြာ) လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုမပါဘဲတစ်သျှူးအပိုင်းများ၏ခြေရာခံများ၊ တူညီသောအပိုင်းမှတစ်သျှူးအပိုင်းများ၏ဒေသဆိုင်ရာနယ်မြေဆယ်ခု။ အောက်ခြေအကန့်များသည် မတူညီသောအပိုင်းများမှ ဧရိယာဆယ်ခုရှိ တစ်ရှူးအပိုင်းများရှိ strain ၏ ရာခိုင်နှုန်းကွာခြားမှုကို ပြသသည်။ (n = မတူညီသော ဝက်များမှ 8 ချပ်/အုပ်စု၊ အမြီးနှစ်ကောင် ကျောင်းသား t-test ကို ပြုလုပ်သည်၊ ****p < 0.0001၊ **p < 0.01၊ *p < 0.05)။ (n = မတူညီသော ဝက်များမှ 8 ချပ်/အုပ်စု၊ အမြီးနှစ်ကောင် ကျောင်းသား t-test ကို ပြုလုပ်သည်၊ ****p < 0.0001၊ **p < 0.01၊ *p < 0.05)။ (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01,*5). (n = မတူညီသော ဝက်များမှ အပိုင်း 8 ပိုင်း/အုပ်စု၊ အမြီးနှစ်ကောင် ကျောင်းသား၏ t-test; ****p<0.0001၊ **p<0.01၊ *p<0.05)။ (n = 8片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05)။ (n = 8片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05)။ (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05)။ (n = 8 အပိုင်း/အုပ်စု၊ မတူညီသောဝက်များမှ၊ အမြီးနှစ်ချောင်းရှိသော ကျောင်းသား၏ t-test; ****p<0.0001၊ **p<0.01၊ *p<0.05)။အမှားဘားများသည် ပျမ်းမျှ ± စံသွေဖည်မှုကို ကိုယ်စားပြုသည်။
ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင် static biomimetic နှလုံးလှီးယဉ်ကျေးမှုစနစ် [20၊ 21] တွင်၊ လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုနှင့် အလယ်အလတ်ဖွဲ့စည်းမှုကို ပိုမိုကောင်းမွန်အောင်ပြုလုပ်ခြင်းဖြင့် နှလုံးချပ်များ၏ ရှင်သန်နိုင်စွမ်း၊ လုပ်ဆောင်မှုနှင့် ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာ ခိုင်မာမှုကို ၆ ရက်ကြာ ထိန်းသိမ်းထားသည်။ သို့သော် 10 ရက်အကြာတွင်ဤကိန်းဂဏန်းများသိသိသာသာကျဆင်းသွားသည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင်အငြိမ်ဇီဝမမိဗေဒယဉ်ကျေးမှုစနစ် 20၊ 21 ထိန်းချုပ်မှုအခြေအနေများ (Ctrl) တွင် မွေးမြူထားသောအပိုင်းများကို ကိုးကားပြီး ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင်ပြုပြင်ထားသောအလတ်စားအား MC အခြေအနေနှင့် ယဉ်ကျေးမှုကို တပြိုင်နက်တည်း စက်ပိုင်းဆိုင်ရာနှင့် လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှု (CTCM) အောက်တွင် အသုံးပြုပါမည်။ ခေါ်သည် ။ ပထမဦးစွာ၊ လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုမပါဘဲ စက်ပိုင်းဆိုင်ရာလှုံ့ဆော်မှုသည် တစ်ရှူးရှင်သန်နိုင်စွမ်းကို 6 ရက်ကြာထိန်းသိမ်းထားရန် မလုံလောက်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 3a၊b)။ စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ STCM ကိုအသုံးပြု၍ physio-mechanical နှင့် electronic stimulation များ၏ နိဒါန်းဖြင့်၊ 12 ရက်ကြာ နှလုံးအပိုင်းများ၏ ရှင်သန်နိုင်စွမ်းသည် MS အခြေအနေအောက်တွင်ရှိသော လတ်ဆတ်သောနှလုံးအပိုင်းများတွင် အတူတူပင်ဖြစ်သော်လည်း MTT ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု (ပုံ- 1) တွင်ပြသထားသည့်အတိုင်း Ctrl အခြေအနေအောက်တွင်မဟုတ်ပေ။ 3a)။ ယင်းက နှလုံးစက်ဝန်း၏ စက်နှိုးဆွမှုနှင့် သရုပ်ဖော်မှုသည် ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင်တည်ငြိမ်ယဉ်ကျေးမှုစနစ်တွင် ဖော်ပြထားသည်ထက် နှစ်ဆကြာအောင် တစ်သျှူးအပိုင်းများကို ရှင်သန်နိုင်စေသည်ဟု အကြံပြုထားသည်။ သို့သော်၊ cardiac troponin T နှင့် connexin 43 ၏ immunolabeling ဖြင့်တစ်သျှူးအစိတ်အပိုင်းများ၏ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာခိုင်မာမှုကိုအကဲဖြတ်ခြင်းတွင် connexin 43 ဖော်ပြမှုသည် MC တစ်ရှူးများတွင် 12 ရက်တည်းတွင်ထိန်းချုပ်ထားသည်ထက်သိသိသာသာပိုမိုမြင့်မားကြောင်းပြသခဲ့သည်။ သို့သော်လည်း ယူနီဖောင်း connexin 43 စကားရပ်နှင့် Z-disc ဖွဲ့စည်းခြင်းကို အပြည့်အဝ မထိန်းသိမ်းနိုင်ခဲ့ (ပုံ။ 3b)။ ကျွန်ုပ်တို့သည် troponin-T နှင့် connexin staining43 ကိုအခြေခံ၍ တစ်သျှူးဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ သမာဓိရှိမှုကို တိုင်းတာရန်အတွက် အတုထောက်လှမ်းရေး (AI) မူဘောင်ကို အသုံးပြုပြီး troponin-T နှင့် connexin staining43 ကိုအခြေခံ၍ တစ်သျှူးဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ သမာဓိရှိမှုကို တိုင်းတာရန်အတွက် အသုံးပြုပါသည်။ ဤနည်းလမ်းသည် ကိုးကားချက်တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း နှလုံးတစ်ရှူးများ၏ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာခိုင်မာမှုကိုစိတ်ချယုံကြည်စွာတွက်ချက်ရန်အတွက် Convolutional Neural Network (CNN) နှင့် နက်နဲသောသင်ယူမှုမူဘောင်ကိုအသုံးပြုသည်။ 26. MC တစ်ရှူးများသည် တည်ငြိမ်ထိန်းချုပ်မှုအပိုင်းများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက နေ့ 0 နှင့် ပိုမိုကောင်းမွန်သော ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာ တူညီမှုကို ပြသခဲ့သည်။ ထို့အပြင်၊ Masson ၏ trichrome စွန်းထင်းမှုသည် MS အခြေအနေများတွင် ယဉ်ကျေးမှု၏ထိန်းချုပ်မှုအခြေအနေများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက သိသိသာသာနိမ့်ကျသောရာခိုင်နှုန်းကိုပြသခဲ့သည် (ပုံ။ 3c)။ CTCM သည် နေ့ 12 တွင် နှလုံးတစ်ရှူးအပိုင်းများ၏ ရှင်သန်နိုင်စွမ်းကို လတ်ဆတ်သောနှလုံးတစ်ရှူးများနှင့် ဆင်တူသည့်အဆင့်သို့ တိုးမြှင့်ခဲ့သော်လည်း၊ ၎င်းသည် နှလုံးအပိုင်းများ၏ တည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာ ကြံ့ခိုင်မှုကို သိသိသာသာ မတိုးတက်ခဲ့ပေ။
ဘားဂရပ်တစ်ခုသည် MTT ၏လတ်ဆတ်သောနှလုံးချပ်များ (D0) သို့မဟုတ် နှလုံးချပ်ယဉ်ကျေးမှု (D12 Ctrl) သို့မဟုတ် CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)၊ 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 # MC) နှလုံးချပ်ယဉ်ကျေးမှုတွင် 12 ရက်ကြာဖြစ်နိုင်ချေကိုပြသသည်; မတူညီသောနည်းလမ်းဖြင့် ဝက်များ # ဝက်များ # ဝက်များ # စမ်းသပ်မှုပြုလုပ်သည် 0.0001 D0 နှင့် **p < 0.01 D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်သည်)။ ဘားဂရပ်တစ်ခုသည် MTT ၏လတ်ဆတ်သောနှလုံးချပ်များ (D0) သို့မဟုတ် နှလုံးချပ်ယဉ်ကျေးမှု (D12 Ctrl) သို့မဟုတ် CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0)၊ 15 (D12 Ctrl) ), 12 (D12 MC) ချပ်များ/အဖွဲ့#VA# ကွဲပြားသောနည်းလမ်းဖြင့် ဝက်များလုပ်ဆောင်သည် 0.0001 D0 နှင့် **p < 0.01 D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်သည်)။တည်ငြိမ်သောယဉ်ကျေးမှု (D12 ထိန်းချုပ်မှု) သို့မဟုတ် CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 ထိန်းချုပ်မှု)) သို့မဟုတ် တည်ငြိမ်သောယဉ်ကျေးမှု (D12 ထိန်းချုပ်မှု) သို့မဟုတ် CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 ထိန်းချုပ်မှု)) ), 12 (D12 MC) ဝက်များ/အုပ်စုတစ်ခုမှ ကွဲပြားသော စမ်းသပ်မှုတစ်ခုဖြစ်သည်။####p < 0,0001 по сравнению с D0 နှင့် **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl)။ ####p < 0.0001 D0 နှင့် **p < 0.01 D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်သည်)။ a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行OV单向AN；相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01)။ a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(楐匇新10)၊ (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p။)တည်ငြိမ်သောယဉ်ကျေးမှု (D12 ထိန်းချုပ်မှု) သို့မဟုတ် CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 ထိန်းချုပ်မှု))) , 12 (D12 MC) အပိုင်းများ/အုပ်စု NOVA စမ်းသပ်မှုတစ်ခုမှ အပိုင်းများ/အုပ်စု၊####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl)။ ####p < 0.0001 D0၊ **p < 0.01 D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်သည်)။b Troponin-T (အစိမ်းရောင်)၊ connexin 43 (အနီရောင်) နှင့် DAPI (အပြာ) သည် လတ်လတ်ဆတ်ဆတ် သီးခြားခွဲထားသော နှလုံးအပိုင်းများ (D0) သို့မဟုတ် တည်ငြိမ်သောအခြေအနေများ (Ctrl) သို့မဟုတ် CTCM အခြေအနေများ (MC) အောက်တွင် 12 ရက်ကြာ) ကိုယ်စားပြု immunofluorescence ပုံများ (အလွတ်စကေး = 100 µm)။ နှလုံးတစ်ရှူးဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ ခိုင်မာမှု (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) အချပ်များ/အုပ်စုတစ်ခုစီမှ ဝက်တစ်ခုစီမှ ဥာဏ်ရည်တု၊ တစ်ကြောင်း ANOVA စမ်းသပ်မှုကို လုပ်ဆောင်သည်; ####p < 0.0001 D0 နှင့် ****p < 0.0001 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါသည်။ နှလုံးတစ်ရှူးဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာ ခိုင်မာမှု (n = 7 (D0)၊ 7 (D12 Ctrl)၊ 5 (D12 MC) ဝက်များမှ တစ်ခုစီအချပ်/အုပ်စုစီ၊ တစ်လမ်းသွား ANOVA စမ်းသပ်မှုကို လုပ်ဆောင်သည်; ####p < 0.0001 D0 နှင့် ****p < 0.001 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါသည်။) Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0) 1 MC), 7 (D0) ၊ срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; D12 Ctrl)။ ဥာဏ်ရည်တု (n = 7 (D0)၊ 7 (D12 Ctrl)၊ 5 (D12 MC)၊ ကွဲပြားသောဝက်များမှ အပိုင်း/အုပ်စုများ၊ တစ်လမ်းသွား ANOVA စမ်းသပ်မှု ပြုလုပ်ခဲ့သည်၊ ####p < 0.0001 နှင့် D0 နှင့် ****p < 1 နှင့် Ctrl နှင့် 120) နှိုင်းယှဉ်)။人工智能量化心脏组织结构完整性(n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) အချပ်/အုပ်စုတစ်ခုစီ၊ မတူညီသောဝက်တစ်ခုစီ၏ ANOVA စမ်းသပ်မှု;####0D 10 < 0 .相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）။人工智能量化心脏组织结构完整性(n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) အချပ်များ/မတူညီသော ဝက်တစ်ခုစီကို အုပ်စုလိုက်၊ တစ်လမ်းမောင်း ANOVA စမ်းသပ်မှု;###0.0 <10与D0相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）။ Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7D) (D10)၊ срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; Ctrl)။ နှလုံးတစ်ရှူးများ၏ တည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာ ခိုင်မာမှုကို တွက်ချက်ရန် ဥာဏ်ရည်တု (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) အပိုင်းများ/အုပ်စုတစ်ခုစီ၊ မတူညီသော ဝက်တစ်ခုစီ၊ တစ်လမ်းသွား ANOVA စမ်းသပ်မှု; ####p<0.0001 vs .D0 နှိုင်းယှဉ်မှုအတွက် D****p < 10 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ရန်။ c Masson ၏ trichrome အစွန်းအထင်းဖြင့် စွန်းထင်းနေသော နှလုံးချပ်များအတွက် ကိုယ်စားလှယ်ရုပ်ပုံများ (ဘယ်) နှင့် ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်း (ညာဘက်) (Scale bare = 500 µm) (n = 10 ချပ်များ/အုပ်စုတစ်ခုစီ၊ တစ်လမ်းသွား ANOVA စမ်းသပ်မှုကို လုပ်ဆောင်သည်; ####p < 0.0001 D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်၍ 0.0001။ c Masson ၏ trichrome အစွန်းအထင်းဖြင့် စွန်းထင်းနေသော နှလုံးချပ်များအတွက် ကိုယ်စားလှယ်ပုံများ (ဘယ်) နှင့် အရေအတွက် (ညာဘက်) (စကေးအလွတ် = 500 µm) (n = 10 ချပ်များ/အုပ်စုတစ်ခုစီ၊ တစ်လမ်းမောင်း ANOVA စမ်းသပ်မှုကို လုပ်ဆောင်သည်; #### p < 0.0001) D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်၍ 10 နှင့် D0. c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенныхроным Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется < односторост; 0,0001 по сравнению с D0 နှင့် ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl)။ c Masson ၏ trichrome အစွန်းအထင်းဖြင့် စွန်းထင်းနေသော နှလုံးအပိုင်းများ (ဘယ်) နှင့် ကိုယ်စားပြုပုံများ (ဘယ်) နှင့် အရေအတွက် (ညာဘက်) (uncoated scale = 500 µm) (n = 10 အပိုင်းများ/အုပ်စု၊ တစ်လမ်းသွား ANOVA စမ်းသပ်မှုပြုလုပ်ခဲ့သည်; #### p < 0 .0001 D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်၍ D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ထားသော 10 .0001) c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 µm (n = 100)个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p 1相 2 0.0) C用 masson 三色染料的心脏切片的代表性（左左）量化（右）裸尺度裸尺度尦尦尦尦尦度500 µm)(n=10个切片组每组来自不同猪，进行单向单向 Anova 测试；###0#0 <10相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）။ c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенныхро т Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощьою дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl)။ c Masson ၏ trichrome အစွန်းအထင်းဖြင့် စွန်းထင်းနေသော နှလုံးအပိုင်းများ (ဘယ်) နှင့် အရေအတွက် (ညာဘက်) ကိုယ်စားပြုပုံများ (n = 500 µm) (n = 10 အပိုင်း/အုပ်စု၊ မတူညီသောဝက်များမှ တစ်ခုစီ၊ ကွဲလွဲမှု၏တစ်ကြောင်းတည်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုဖြင့် စမ်းသပ်ထားသည် ;### # p < 0.0001 D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ထားသော 10၊ ***p)။အမှားဘားများသည် ပျမ်းမျှ ± စံသွေဖည်မှုကို ကိုယ်စားပြုသည်။
ယဉ်ကျေးမှုအလတ်စားသို့ သေးငယ်သော မော်လီကျူးများ ပေါင်းထည့်ခြင်းဖြင့်၊ cardiomyocyte ခိုင်မာမှုကို မြှင့်တင်နိုင်ပြီး CTCM ယဉ်ကျေးမှုအတွင်း အမျှင်ဓာတ်များ ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုကို လျှော့ချနိုင်မည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ ယူဆပါသည်။ ထို့ကြောင့် ကျွန်ုပ်တို့သည် ကျွန်ုပ်တို့၏ တည်ငြိမ်ထိန်းချုပ်မှုယဉ်ကျေးမှု 20,21 ကိုအသုံးပြု၍ သေးငယ်သော မော်လီကျူးများကို စစ်ဆေးကြည့်ရှုခဲ့ပါသည်။ ဤဖန်သားပြင်အတွက် Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3) နှင့် SB431542 (SB) ကို ရွေးချယ်ထားသည်။ ဤသေးငယ်သောမော်လီကျူးများကို hiPSC-CM ယဉ်ကျေးမှုများတွင် ယခင်က sarcomere အရှည်၊ T-tubules နှင့် conduction velocity တိုးမြှင့်ခြင်းဖြင့် cardiomyocytes များ၏ရင့်ကျက်မှုကို လှုံ့ဆော်ပေးရန်အတွက် ယခင်ကအသုံးပြုခဲ့သည်။ ထို့အပြင်၊ Dex (a glucocorticoid) နှင့် SB နှစ်မျိုးလုံးသည် ရောင်ရမ်းခြင်းကို 29,30 တွင် နှိမ်နင်းရန် လူသိများသည်။ ထို့ကြောင့်၊ ဤမော်လီကျူးငယ်များ တစ်ခု သို့မဟုတ် တစ်ခု ပေါင်းစပ်ပါဝင်ခြင်းသည် နှလုံးအပိုင်းများ၏ တည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာ ခိုင်မာမှုရှိမရှိ စမ်းသပ်ခဲ့သည်။ ကနဦးစစ်ဆေးမှုအတွက်၊ ဒြပ်ပေါင်းတစ်ခုစီ၏ ဆေးပမာဏကို ဆဲလ်ယဉ်ကျေးမှုပုံစံများတွင် အသုံးများသော ပြင်းအားများ (1 μM Dex27၊ 100 nM T327 နှင့် 2.5 μM SB31) ကို အခြေခံ၍ ရွေးချယ်ထားသည်။ ယဉ်ကျေးမှုကို 12 ရက်ကြာပြီးနောက်၊ T3 နှင့် Dex ပေါင်းစပ်မှုသည် အကောင်းဆုံးသော cardiomyocyte ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာ ခိုင်မာမှုနှင့် မျှင်မျှင်ပုံစံမွမ်းမံခြင်း (နောက်ဆက်တွဲပုံ 4 နှင့် 5) ကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်။ ထို့အပြင်၊ ဤပြင်းအား T3 နှင့် Dex ၏ နှစ်ဆ သို့မဟုတ် နှစ်ဆကို အသုံးပြုခြင်းသည် သာမန်ပြင်းအားထက် သာမာန်ပြင်းအားများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ဆိုးရွားသောအကျိုးသက်ရောက်မှုများ ဖြစ်စေသည် (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ။ 6a၊b)။
ကနဦးစစ်ဆေးမှုပြီးနောက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ယဉ်ကျေးမှုအခြေအနေ 4 ခုကို ထိပ်တိုက်နှိုင်းယှဉ်မှုပြုလုပ်ခဲ့သည် (ပုံ 4a)- Ctrl- ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင်ဖော်ပြခဲ့သည့် တည်ငြိမ်ယဉ်ကျေးမှုတွင် ကျွန်ုပ်တို့၏အကောင်းဆုံးဖြစ်အောင်ပြုလုပ်ထားသည့်ကြားခံကို အသုံးပြု၍ ယဉ်ကျေးမှုဆိုင်ရာ နှလုံးသားကဏ္ဍများ; 20.21 TD- T3 နှင့် Ctrl s ကို ဗုဒ္ဓဟူးနေ့တွင် Dex ထည့်ပေးခဲ့သည်။ MC- ကျွန်ုပ်တို့၏ယခင်က ပိုမိုကောင်းမွန်အောင်ပြုလုပ်ထားသော ကြားခံကို အသုံးပြု၍ CTCM တွင် မွေးမြူထားသော နှလုံးကဏ္ဍများ။ နှင့် MT- T3 နှင့် Dex ပါသော CTCM ကို ကြားခံသို့ ထည့်သည်။ စိုက်ပျိုးပြီး 12 ရက်အကြာတွင်၊ MS နှင့် MT တစ်ရှူးများ၏ ရှင်သန်နိုင်စွမ်းသည် MTT စစ်ဆေးမှု (ပုံ 4b) မှ အကဲဖြတ်ထားသော လတ်ဆတ်သောတစ်ရှူးများကဲ့သို့ပင် ဆက်လက်တည်ရှိနေပါသည်။ စိတ်ဝင်စားစရာမှာ၊ T3 နှင့် Dex ကို transwell cultures (TD) တွင် ပေါင်းထည့်ခြင်းသည် Ctrl အခြေအနေများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက သိသိသာသာ တိုးတက်မှု မဖြစ်ပေါ်စေဘဲ နှလုံးအပိုင်းများ၏ ရှင်သန်နိုင်စွမ်းကို ထိန်းသိမ်းရာတွင် စက်ပိုင်းဆိုင်ရာ လှုံ့ဆော်မှု၏ အရေးကြီးသော အခန်းကဏ္ဍကို ညွှန်ပြနေသည်။
စက်ပိုင်းဆိုင်ရာ လှုံ့ဆော်မှုနှင့် T3/Dex ဖြည့်စွက်ခြင်း၏ အကျိုးသက်ရောက်မှုများကို အကဲဖြတ်ရန် အသုံးပြုသည့် ယဉ်ကျေးမှုအခြေအနေလေးခုကို သရုပ်ဖော်ထားသည့် စမ်းသပ်ဒီဇိုင်းပုံစံပြကွက်တစ်ခု။ b ဘားဂရပ်သည် ယဉ်ကျေးမှုအခြေအနေ 4 ခုလုံး (Ctrl၊ TD၊ MC နှင့် MT) တွင် ရှင်သန်နိုင်စွမ်းရှိသော 12 ရက်ကြာ ယဉ်ကျေးမှုကို အရေအတွက်ကိုပြသသည် 0.0001၊ ###p < 0.001 D0 နှင့် **p < 0.01 D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်သည်)။ b ဘားဂရပ်သည် ယဉ်ကျေးမှုအခြေအနေ 4 ခုလုံး (Ctrl၊ TD၊ MC နှင့် MT) တွင် ရှင်သန်နိုင်စွမ်းရှိသော 12 ရက်ကြာ ယဉ်ကျေးမှုကို အရေအတွက်ကိုပြသသည် 0.0001၊ ###p < 0.001 D0 နှင့် **p < 0.01 D12 ctrl နှိုင်းယှဉ်)။ b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после кухльтивир ования культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 TD) , D1 (D12 TD1), D1 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 в си0 сер по сравнению с D12 Ctrl)။ b ဘားဂရပ်သည် ယဉ်ကျေးမှုအခြေအနေ 4 ခုလုံး (ထိန်းချုပ်မှု၊ TD၊ MC နှင့် MT) တွင် 12 ရက်လွန်ယဉ်ကျေးမှုတွင် ရှင်သန်နိုင်မှုပမာဏကို ပြသသည် ####p < 0.0001၊ ###p < 0.001 vs. D0 နှင့် **p < 0.01 D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်ထားသည်)။ b 条形图显示所有4种培养条件（Ctrl、TD、MC和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0))、15 (D12 D2 Ctrl 2、1D MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001*曯 < 0.001 与D0与D12控制)။b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению (со свсижием) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний теронний теронний теронний теста<0 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12)။ b ယဉ်ကျေးမှုအခြေအနေ 4 ခုစလုံး (ထိန်းချုပ်မှု၊ TD၊ MC နှင့် MT) ကိုပြသသည့် လတ်ဆတ်သောနှလုံးအပိုင်းများ (D0) (n = 18 (D0)၊ 15 (D12 Ctrl၊ D12 TD နှင့် D12 MT)၊ မတူညီသောဝက် 12 (D12 MC) အပိုင်း/အုပ်စု၊ တစ်လမ်းသွား ANOVA စမ်းသပ်မှု<10၊ #0####0.#0###0. ဆန့်ကျင်ဘက် D0၊ **p<0.01 နှင့် ထိန်းချုပ်မှု D12)။ c ဘားဂရပ်သည် ယဉ်ကျေးမှုအခြေအနေ 4 ခုလုံးတွင် ဂလူးကို့စ်အတက်အကျ၏ ပမာဏကို ပြသသည် c ဘားဂရပ်သည် ယဉ်ကျေးမှုအခြေအနေ 4 ခုလုံးတွင် ဂလူးကို့စ်အတက်အကျ၏ ပမာဏကို ပြသသည် c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во 4 культивхования во культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группуы отнезов/группуы односторонний Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 နှင့် ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl)။ c Histogram သည် ယဉ်ကျေးမှုအခြေအနေ (ထိန်းချုပ်မှု၊ TD၊ MC နှင့် MT) အားလုံးအောက်တွင် ဂလူးကို့စ်အတက်အကျ 12 ရက်ကြာ ပမာဏကိုပြသသည် (ထိန်းချုပ်မှု၊ TD၊ MC နှင့် MT) (D0) ( မတူညီသောဝက်များမှ အပိုင်း 6 ပိုင်း/အုပ်စု၊ တစ်လမ်းသွား ANOVA စမ်းသပ်မှုပြုလုပ်ခဲ့သည် ; ###p < 0.001 D0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်လျှင် D0. ***p1) c 条形图显示所有4种培养条件（Ctrl、TD、MC和MT）与新鲜心脏切片(D0)相比，培养后12天的葡萄糖通量定量(n=6片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA测试；###p < 0.001，渎D < 0.001，渎D与D12 Ctrl 相比)။ C 条形图显示所有 4种条件（（ctrl、td、mc和 mt）新鲜心脏切片切矉切片琛君吸12 天的通量定量（n=6片/组，来自猪， ， ， ， ， ， ， ， 猪猪单向执行ANOVA < 浸0.#05相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）။ c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивилляния культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/груйпаз, односторонний Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (кон). c လတ်ဆတ်သောနှလုံးအပိုင်းများ (D0) (n = 6 အပိုင်း/အုပ်စု၊ မတူညီသောဝက်များမှ၊ တစ်ဖက်သတ်လုပ်ဆောင်ခဲ့သည့် ANOVA စမ်းသပ်မှုများပြုလုပ်ခဲ့သည်၊ ###p < 0.001p < 0.001p နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ယဉ်ကျေးမှုလွန်ပြီးနောက် 12 ရက်တွင် ဂလူးကို့စ်အတက်အကျပမာဏကို ပြသသည့် Histogram သည် (ထိန်းချုပ်မှု)။d ဒေသဆိုင်ရာ တစ်ရှူးအပိုင်းအမှတ် ၁၀ တွင် လတ်ဆတ်သော (အပြာ)၊ နေ့ 12 MC (အစိမ်း) နှင့် နေ့ 12 MT (အနီရောင်) တစ်ရှူးများ (n = 4 ချပ်/အုပ်စု၊ တစ်လမ်းသွား ANOVA စစ်ဆေးမှု၊ အုပ်စုများအကြား သိသာထင်ရှားသော ခြားနားချက်မရှိ)။ e တည်ငြိမ်သောအခြေအနေများ (Ctrl) သို့မဟုတ် MT အခြေအနေ (MT) အောက်တွင် 10-12 ရက်ကြာ နှလုံးကဏ္ဍများ (D0) တွင် ကွဲပြားစွာဖော်ပြသည့် ဗီဇကိုပြသသည့် မီးတောင်ပြကွက်။ f ယဉ်ကျေးမှုအခြေအနေတစ်ခုစီအောက်တွင် မွေးမြူထားသော နှလုံးအပိုင်းများအတွက် sarcomere မျိုးဗီဇများ၏ အပူမြေပုံ။ အမှားဘားများသည် ပျမ်းမျှ ± စံသွေဖည်မှုကို ကိုယ်စားပြုသည်။
ဖက်တီးအက်ဆစ်ဓာတ်တိုးခြင်းမှ glycolysis သို့ပြောင်းခြင်းအပေါ် ဇီဝဖြစ်စဉ်အပေါ်မှီခိုမှုသည် cardiomyocyte dedifferentiation ၏လက္ခဏာတစ်ခုဖြစ်သည်။ အရွယ်မရောက်သေးသော cardiomyocytes များသည် ATP ထုတ်လုပ်မှုအတွက် ဂလူးကို့စ်ကို အဓိကအသုံးပြုပြီး cristae5,32 အနည်းငယ်ရှိသော hypoplastic mitochondria ရှိသည်။ ဂလူးကို့စ်အသုံးပြုမှု ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများသည် MC နှင့် MT အခြေအနေများအောက်တွင်၊ ဂလူးကို့စ်အသုံးပြုမှုသည် နေ့စဥ်ဘ၀တစ်ရှူးများနှင့် ဆင်တူကြောင်းပြသခဲ့သည် (ပုံ 4c)။ သို့သော် Ctrl နမူနာများသည် လတ်ဆတ်သောတစ်ရှူးများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ဂလူးကို့စ်အသုံးပြုမှု သိသိသာသာ တိုးလာကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ CTCM နှင့် T3/Dex ပေါင်းစပ်မှုသည် တစ်သျှူးများ၏ ရှင်သန်နိုင်စွမ်းကို မြှင့်တင်ပေးပြီး 12 ရက်ကြာ မွေးမြူထားသော နှလုံးအပိုင်းများ၏ ဇီဝဖြစ်စဉ်ဆိုင်ရာ ဖီနိုအမျိုးအစားကို ထိန်းသိမ်းထားကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ ထို့အပြင် MT နှင့် MS အခြေအနေများအောက်တွင် 12 ရက်ကြာ ပြင်းထန်သောနှလုံးတစ်ရှူးတွင် strain အဆင့်သည် တူညီကြောင်းပြသခဲ့သည် (ပုံ 4d)။
နှလုံးလှီးတစ်ရှူးများ၏ ကမ္ဘာလုံးဆိုင်ရာ ကူးယူဖော်ပြသည့် ရှုခင်းအပေါ် CTCM နှင့် T3/Dex ၏ အလုံးစုံအကျိုးသက်ရောက်မှုကို ပိုင်းခြားစိတ်ဖြာရန်၊ မတူညီသော ယဉ်ကျေးမှုအခြေအနေ လေးခုစလုံးမှ နှလုံးအချပ်များပေါ်တွင် RNAseq ကို လုပ်ဆောင်ခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲ ဒေတာ 1)။ စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ၊ MT ကဏ္ဍများသည် လတ်ဆတ်သောနှလုံးတစ်ရှူးများနှင့် မြင့်မားသောအသွင်ကူးပြောင်းမှုတူညီမှုကိုပြသခဲ့ပြီး ဗီဇ 13,642 တွင် 16 မျိုးကွဲပြားစွာဖော်ပြခဲ့သည်။ သို့သော်လည်း အစောပိုင်းတွင် ကျွန်ုပ်တို့ပြသခဲ့သည့်အတိုင်း၊ Ctrl ချပ်များသည် ယဉ်ကျေးမှုတွင် 10-12 ရက်ကြာပြီးနောက် ကွဲပြားစွာဖော်ပြသော မျိုးဗီဇ 1229 ခုကို ပြသခဲ့သည် (ပုံ 4e)။ ဤအချက်အလက်များကို နှလုံးနှင့် fibroblast မျိုးဗီဇများ၏ qRT-PCR မှ အတည်ပြုခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ 7a-c)။ စိတ်ဝင်စားစရာမှာ Ctrl ကဏ္ဍများသည် နှလုံးနှင့် ဆဲလ်လည်ပတ်မှုမျိုးဗီဇများကို နှိမ့်ချခြင်းနှင့် ရောင်ရမ်းခြင်းမျိုးဗီဇပရိုဂရမ်များကို အသက်သွင်းခြင်းတို့ကို ပြသခဲ့သည်။ ရေရှည်စိုက်ပျိုးပြီးနောက် ပုံမှန်အားဖြင့် ကွဲပြားမှုဖြစ်ပေါ်ခြင်းသည် MT အခြေအနေများအောက်တွင် လုံးဝလျော့သွားကြောင်း ဤအချက်အလက်များက အကြံပြုပါသည်။ sarcomere မျိုးဗီဇများကို ဂရုတစိုက်လေ့လာခြင်းသည် MT အခြေအနေအောက်တွင်သာ sarcomere (ပုံ. 4f) နှင့် အိုင်းယွန်းချန်နယ် (နောက်ဆက်တွဲပုံ. 9) တို့ကို Ctrl, TD, နှင့် MC အခြေအနေများအောက်တွင် ဖိနှိပ်မှုမှကာကွယ်ပေးထားကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ ဤအချက်အလက်များသည် စက်ပိုင်းဆိုင်ရာနှင့် ဟာသလှုံ့ဆော်မှု (T3/Dex) ပေါင်းစပ်ခြင်းဖြင့် နှလုံးလှီးဖြတ်ခြင်းမှတ်တမ်းသည် ယဉ်ကျေးမှုတွင် 12 ရက်အကြာတွင် လတ်ဆတ်သောနှလုံးချပ်များနှင့် ဆင်တူနေနိုင်ကြောင်း သက်သေပြနေသည်။
နဂိုအတိုင်းနှင့် ဒေသန္တရပုံစံလုပ်ထားသော connexin 43 (ပုံ. 5a) မှပြသထားသည့်အတိုင်း MT အခြေအနေအောက်တွင် 12 ရက်ကြာ အကောင်းဆုံးထိန်းသိမ်းထားသော cardiomyocytes ၏ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာခိုင်မာမှုကို ဤစာသားမှတ်တမ်းရှာဖွေတွေ့ရှိမှုကို ထောက်ခံပါသည်။ ထို့အပြင်၊ MT အခြေအနေအောက်တွင် နှလုံးအပိုင်းရှိ fibrosis သည် Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်ကာ လတ်ဆတ်သောနှလုံးအပိုင်းများ (ပုံ။ 5b) နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက သိသိသာသာ လျော့ကျသွားသည်။ ဤအချက်အလက်များသည် စက်ပိုင်းဆိုင်ရာလှုံ့ဆော်မှုနှင့် T3/Dex ကုသမှုပေါင်းစပ်ခြင်းသည် ယဉ်ကျေးမှုရှိ နှလုံးအပိုင်းများရှိ နှလုံးဖွဲ့စည်းပုံကို ထိထိရောက်ရောက်ထိန်းသိမ်းထားကြောင်း သက်သေပြနေသည်။
လတ်လတ်ဆတ်ဆတ် သီးခြားခွဲထားသော နှလုံးအပိုင်း (D0) တွင် troponin-T (အစိမ်းရောင်)၊ connexin 43 (အနီရောင်) နှင့် DAPI (အပြာ) တို့၏ ကိုယ်စားပြု immunofluorescence ရုပ်ပုံများ သို့မဟုတ် နှလုံးအပိုင်း ယဉ်ကျေးမှုအခြေအနေ (စကေးဘား = 100 µm) တွင် 12 ရက်ကြာ မွေးမြူထားသည်။ ) နှလုံးတစ်ရှူးတည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာ သမာဓိရှိမှုဆိုင်ရာ ဉာဏ်ရည်တု ပမာဏကို တိုင်းတာခြင်း (n = 7 (D0 နှင့် D12 Ctrl)၊ 5 (D12 TD၊ D12 MC နှင့် D12 MT) အချပ်/အုပ်စု၊ ဝက်များမှ တစ်လမ်းမောင်း ANOVA စမ်းသပ်မှုကို လုပ်ဆောင်သည်; ####p < 0.0001 < D0.*0*0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်လျှင် <0.00*0၊ D12 သို့ Ctrl)။ နှလုံးတစ်ရှူးဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ ခိုင်မာမှု (n = 7) (D0 နှင့် D12 Ctrl) ၊ 5 (D12 TD၊ D12 MC နှင့် D12 MT) ဝက်များမှ အချပ်/အုပ်စု၊ တစ်လမ်းသွား ANOVA စမ်းသပ်မှုကို လုပ်ဆောင်သည်၊ #### p < 0.0001 < D0. *0*0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်လျှင် <0.00*0. D12 သို့ Ctrl)။ Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта D 2 (n tеллекта) (n = 7)၊ D12 MC и D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сир 0 не ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)။ ဥာဏ်ရည်တု (n = 7 (D0 နှင့် D12 Ctrl)၊ 5 (D12 TD၊ D12 MC နှင့် D12 MT)၊ အုပ်စု/ဝက်များမှ အပိုင်းများ/အုပ်စု၊ တစ်လမ်းသွား ANOVA စမ်းသပ်မှု ပြုလုပ်ခဲ့သည်၊ #### p < 0.0001 < 0.001 <010*0*0*0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ထားသည်။ D12 Ctrl)။对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7(D0 和D12 Ctrl)、5(D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 戈 爱与D12 Ctrl 相比)။对不同猪的心脏结构完整性（n=7 (d0和 d12 ctrl）（5（d12 td、d12 mc和 d12 mt）巺猄）၊进行单向单向单向测试； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或 ****p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05相比，或 ****p < 0.000 )မတူညီသောဝက်များတွင် ဉာဏ်ရည်တုကိုအသုံးပြု၍ နှလုံးတစ်သျှူးများ၏ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ ခိုင်မာမှုကို အရေအတွက် (n = 7 (D0 နှင့် D12 Ctrl)၊ 5 (D12 TD၊ D12 MC နှင့် D12 MT) အပိုင်း/အုပ်စု) တစ်လမ်းတည်း ANOVA စမ်းသပ်မှုဖြင့်၊#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)။ #### p < 0.0001 D0 နှင့် *p < 0.05 သို့မဟုတ် ****p < 0.0001 D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်သည်)။ b Masson ၏ trichrome အစွန်းအထင်း (စကေးဘား = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, နှင့် D12 MC), 9 (D12 MT) အချပ်များ/အဖွဲ့အတွက် ကိုယ်စားပြုပုံများနှင့် ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်း (စကေးဘား = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, နှင့် D12 MC), 9 (D12 MT) အချပ်/အုပ်စု၊ မတူညီသောဝက်များမှ <#0p#1VA နှင့် စမ်းသပ်မှု #0##0p#NOVA D0 နှင့် ***p < 0.001 သို့ သို့မဟုတ် ****p < 0.0001 D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်သည်)။ b Masson ၏ trichrome အစွန်းအထင်း (စကေးဘား = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, နှင့် D12 MC), 9 (D12 MT) အချပ်များ/အဖွဲ့အတွက် ကိုယ်စားပြုပုံများနှင့် ပမာဏသတ်မှတ်ခြင်း (စကေးဘား = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, နှင့် D12 MC), 9 (D12 MT) အချပ်/အုပ်စု၊ မတူညီသောဝက်များမှ <#0p#1VA နှင့် စမ်းသပ်မှု #0##0p#NOVA D0 နှင့် ***p < 0.001 သို့ သို့မဟုတ် ****p < 0.0001 D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်သည်)။ b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красит (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12)။ b Masson ၏ trichrome အစွန်းအထင်း (စကေးဘား = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD နှင့် D12 MC), 9 (D12 MT) အပိုင်းများ/အုပ်စုများမှ ကိုယ်စားပြုရုပ်ပုံများနှင့် အရေအတွက် ပမာဏများကို ဝက်များမှ ကွဲပြားသော ဝက်များနှင့် <10#.0# နှင့် တစ်လမ်းတည်းလုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ ***p < 0.001 သို့မဟုတ် ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl)။ b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化(比例尺= 500 µm) (n = 10 (D Ctrl 2 နှင့် 12 12) MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相*p < 0.0001 与D0 相* 0.0001 与D12 Ctrl 相比)။ b用 masson 三色染料的心脏切片的代表性和量化（比例尺尺尺 = 500 µm） (d 1 1 0 µm) (d 1 1 ct ၊ td 和 d12 mc) 来自不同的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；##0.#00 <1相比，***p < 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）။ b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом млийсона 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA<0; #0#пособ ANOVA<0; #0 сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl)။ b Masson's trichrome (စကေးဘား = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD နှင့် D12 MC), 9 (D12 MT) အပိုင်းများမှ အပိုင်းများ 9 (D12 MT)၊ ANOVA နည်းလမ်းတစ်ခု၊ တစ်ခုမှ ANOVA နည်းလမ်း <###0# နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါ 0.001 သို့မဟုတ် ****p < 0.0001 D12 Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်သည်)။အမှားဘားများသည် ပျမ်းမျှ ± စံသွေဖည်မှုကို ကိုယ်စားပြုသည်။
နောက်ဆုံးတွင်၊ CTCM ၏ နှလုံးခုန်နှုန်းကို တုပရန် စွမ်းရည်ကို နှလုံးတစ်သျှူးများ ဆန့်ထုတ်မှုကို တိုးမြှင့်ခြင်းဖြင့် အကဲဖြတ်ခဲ့သည်။ CTCM တွင်၊ peak air chamber pressure သည် 80 mmHg မှ 80 mmHg သို့တိုးလာသည်။ အနုပညာ။ (ပုံမှန်) 140 mmHg အထိ Art. (ပုံ။ 6a)။ ဤသည်မှာ 32% တိုးလာခြင်း (ပုံ. 6b) နှင့် သက်ဆိုင်သည် (ပုံ. 6b) သည် ယခင်ကပြသခဲ့သည့် နှလုံးအပိုင်းများအတွက် လိုအပ်သော ဆန့်ထုတ်မှုရာခိုင်နှုန်းသည် လွန်စွာထရိုဖီတွင်မြင်ရသည့်အတိုင်း sarcomere အရှည်ကိုရရှိရန် လိုအပ်သည်။ ကျုံ့ခြင်းနှင့် ပြေလျော့သွားချိန်တွင် နှလုံးတစ်သျှူးများ၏ ဆန့်ထွက်မှုနှင့် အလျင်သည် ယဉ်ကျေးမှု၏ ခြောက်ရက်တာကာလအတွင်း စဉ်ဆက်မပြတ်ရှိနေခဲ့သည် (ပုံ။ 6c)။ MT အခြေအနေများမှ နှလုံးတစ်ရှူးများကို ပုံမှန်ဆန့်ခြင်း (MT (Normal)) သို့မဟုတ် အကြောဆန့်ခြင်းအခြေအနေ (MT (OS)) ကို ခြောက်ရက်ကြာ ထားရှိခဲ့သည်။ ယဉ်ကျေးမှုတွင် လေးရက်အကြာတွင်၊ hypertrophic biomarker NT-ProBNP သည် MT (ပုံမှန်) အခြေအနေများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက MT (OS) အခြေအနေများအောက် အလယ်အလတ်တွင် သိသိသာသာ မြင့်တက်လာသည်။ ထို့အပြင်၊ မွေးမြူပြီး ခြောက်ရက်အကြာတွင် MT (OS) (ပုံ. 7b) ရှိ ဆဲလ်အရွယ်အစားသည် MT နှလုံး (ပုံမှန်) အပိုင်းများနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက သိသိသာသာ တိုးလာပါသည်။ ထို့အပြင်၊ NFATC4 နျူကလီးယား ရွှေ့ပြောင်းခြင်းအား အလွန်ဆန့်သော တစ်ရှူးများတွင် သိသာစွာ တိုးလာသည် (ပုံ။ 7c)။ ဤရလဒ်များသည် သွေးတိုးရောဂါပြီးနောက် လမ်းကြောင်းဆိုင်ရာ ပြန်လည်ပြုပြင်ခြင်း၏ တိုးတက်မှုကို ပြသပြီး CTCM ကိရိယာကို ဆွဲဆန့်ခြင်းကြောင့် နှလုံးခုန်နှုန်းမြင့်လာခြင်းကို လေ့လာရန် ပလပ်ဖောင်းတစ်ခုအဖြစ် အသုံးပြုနိုင်ကြောင်း အယူအဆကို ပံ့ပိုးပေးပါသည်။
လေဝင်ပေါက်ဖိအား၊ အရည်ခန်းဖိအားနှင့် တစ်ရှူးလှုပ်ရှားမှုတိုင်းတာချက်များ၏ ကိုယ်စားလှယ်ခြေရာများသည် အခန်းဖိအားမှ အရည်အခန်းဖိအားကို ပြောင်းလဲစေပြီး တစ်ရှူးအချပ်၏ ဆက်စပ်လှုပ်ရှားမှုကို ဖြစ်ပေါ်စေကြောင်း အတည်ပြုသည်။ b ပုံမှန်အားဖြင့် ဆန့်သော (လိမ္မော်ရောင်) နှင့် ဆန့်ဆန့် (အပြာ) တစ်သျှူးအပိုင်းများအတွက် ကိုယ်စားပြု ဆန့် ရာခိုင်နှုန်းနှင့် ဆန့်နှုန်း မျဉ်းကွေးများ။ c လည်ပတ်ချိန်ကိုပြသသည့်ဘားဂရပ် (n = အုပ်စုတစ်ခုလျှင် 19 ချပ်၊ မတူညီသောဝက်များမှ)၊ ကျုံ့ချိန် (n = 18-19 ချပ်၊ တစ်အုပ်စုလျှင် 18-19 ချပ်၊ မတူညီသောဝက်များမှ)၊ အပန်းဖြေချိန် (n = 19 ချပ်၊ အုပ်စုတစ်ခုလျှင် 19 ချပ်၊ မတူညီသောဝက်များမှ) ), တစ်ရှူးလှုပ်ရှားမှုအတိုင်းအတာ (n = 14 ချပ်/အုပ်စု၊ မတူညီသောဝက်များမှ) peak1, ကွဲပြားသော systolic (ကွဲပြားသောဝက်များ) ဝက်များ) နှင့် အထွတ်အထိပ် အပန်းဖြေမှုနှုန်း (n = 14 (D0)၊ 15 (D6) ) ကွဲပြားသော ဝက်များမှ အပိုင်းများ/အုပ်စုများ)) အမြီးနှစ်ကောင် ကျောင်းသား၏ t-test သည် မည်သည့် parameter တွင်မဆို သိသိသာသာ ကွာခြားမှုမတွေ့ရပေ၊ ဤကန့်သတ်ချက်များသည် ယဉ်ကျေးမှု၏ 6 ရက်အတွင်း ဗို့အားလွန်ကဲစွာ တည်ရှိနေကြောင်း ညွှန်ပြပါသည်။ အမှားဘားများသည် ပျမ်းမျှ ± စံသွေဖည်မှုကို ကိုယ်စားပြုသည်။
MT သာမာန်ဆန့် (Norm) သို့မဟုတ် အကြောဆန့်ခြင်း (OS) အခြေအနေများ (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, နှင့် D4 MTOS) နှလုံးချပ်များမှ ဘားဂရပ်များ၏ အာရုံစူးစိုက်မှုပမာဏကို MT သာမာန်ဆန့် (Norm) သို့မဟုတ် အကြောဆန့်ခြင်း (OS) အခြေအနေများ (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, နှင့် D4 MTOS)) အချပ်/အုပ်စု၊ MT-ပုံမှန်ဆန့်ခြင်း (Norm) သို့မဟုတ် အကြောဆန့်ခြင်း (OS) အခြေအနေများ (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, နှင့် D4 MTOS) ချပ်/အုပ်စု၊ ကွဲပြားသောဝက်များမှ ချပ်/အုပ်စု၊ နှိုင်းယှဥ်၍ 0pNOVA ဖြစ်သည်။ပုံမှန် MT stretch (ပုံမှန်) သို့မဟုတ် overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, နှင့် D4)။MTOS) ကွဲပြားသော ဝက်များမှ အချပ်များ/အုပ်စု၊ ကွဲလွဲမှုကို အချက်နှစ်ချက်ဖြင့် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပြီး လုပ်ဆောင်ထားသည်၊**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением)။ ** p < 0.01 သည် ပုံမှန်အဆန့်နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက)။ a 在MT 正常拉伸(စံ) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓叇的匝MTNorm)、3(D2 MTOS、D4 MTNorm和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析； <*与渣常。) MT ပုံမှန်ဆန့်ခြင်း (Norm) သို့မဟုတ် လွန်ဆွဲခြင်း (OS) အခြေအနေများ (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) အောက်တွင် မွေးမြူထားသော နှလုံးချပ်များတွင် NT-ProBNP အာရုံစူးစိုက်မှုပမာဏ ပမာဏ၊猪的切片/组，可以双向方方发发动 ** ပုံမှန် ဆန့်တန်းခြင်းနှင့် နှိုင်းယှဉ်ခြင်း၊ p < 0.01)။histogram ပုံမှန် MT stretch (ပုံမှန်) သို့မဟုတ် overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) နှင့် D4 MTOS) ကွဲပြားသောဝက်များမှ အချပ်များ/အုပ်စုများ၊**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением)။ ** p < 0.01 သည် ပုံမှန်အဆန့်နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက)။ b troponin-T နှင့် WGA (ဘယ်) နှင့် ဆဲလ်အရွယ်အစားပမာဏသတ်မှတ်ခြင်း (ညာဘက်) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) မှ 369 (D6 MTNorm) ဆဲလ်/အုပ်စု၊ မတူညီသောဝက်များမှ 10 ချပ်မှ ဆဲလ်/အုပ်စု၊ အမြီးနှစ်ချောင်းရှိသော ကျောင်းသား t-test ကို < 1 နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါသည်။ *0p။ b troponin-T နှင့် WGA (ဘယ်) နှင့် ဆဲလ်အရွယ်အစားပမာဏသတ်မှတ်ခြင်း (ညာဘက်) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ဆဲလ်/အုပ်စု၊ မတူညီသောဝက်များမှ 10 ချပ်မှ ဆဲလ်များ/အုပ်စု၊ အမြီးနှစ်ချောင်းရှိသော ကျောင်းသား t-test ကို <10) နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါသည်။ b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количесятведнона размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разовный свиразный хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b troponin-T နှင့် AZP (ဘယ်) နှင့် ဆဲလ်အရွယ်အစားပမာဏသတ်မှတ်ခြင်း (ညာဘက်) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) မှ ဆဲလ်/အုပ်စု 369 (D6 MTNorm) ကွဲပြားသော အပိုင်း 10 မှ ကွဲပြားသော ဝက်များမှ ကွဲပြားသော အပိုင်း 10 မှ ဆဲလ်/အုပ်စု၊ အမြီးနှစ်ချောင်းရှိသော ကျောင်းသား၏ t-0p0 နှင့် နှိုင်းယှဉ်၍ ပုံမှန်စမ်းသပ်မှု 1. b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330 MTOS)，来自不同猪的10个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t 检验Ｘ与歋尾学生t 检验Ｘ与歋0.0001)။ b calcarein-T နှင့် WGA (ဘယ်) နှင့် ဆဲလ်အရွယ်အစား (ညာဘက်) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm)) ဆဲလ် 10 ချပ်မှ 369) ဆဲလ်များ/组, 两方法有尾学生t စမ်းသပ်ပြီး*** ပုံမှန်အားဖြင့် ပါ၀င်ခြင်း၊ 0.0001)။ b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количест ве клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группрой, д Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением)။ b troponin-T နှင့် AZP (ဘယ်ဘက်) နှင့် ဆဲလ်အရွယ်အစား (ညာဘက်) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) မှ 369 (D6 MTNorm) ကွဲပြားသော အပိုင်း 10 ခုမှ ကွဲပြားသော အပိုင်း 10 မှ) ဆဲလ်များ/အုပ်စု၊ မြီးနှစ်ချောင်း စံသတ်မှတ်ချက် ကျောင်းသား၏ ****p < 0.0001 သည် ပုံမှန် strain နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါသည်။) c နေ့ 0 နှင့် 6 MTOS အတွက် ကိုယ်စားလှယ်ပုံများ troponin-T နှင့် NFATC4 အတွက် immunolabeled ပြုလုပ်ထားသော နှလုံးအချပ်များနှင့် NFATC4 ၏ nuclei သို့ CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) အချပ်များ/အုပ်စု) < အမြီးနှစ်ချောင်းရှိသော ကျောင်းသားသို့ ရွှေ့ပြောင်းခြင်း၏ ပမာဏ။ *0 t-5 ကို စမ်းသပ်ပါသည်။ c troponin-T နှင့် NFATC4 အတွက် immunolabeled ပြုလုပ်ထားသော နေ့ 0 နှင့် 6 MTOS နှလုံးအချပ်များနှင့် NFATC4 ၏ nuclei သို့ CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) သို့ ရွှေ့ပြောင်းခြင်း၏ ပမာဏကို တိုင်းတာခြင်း)။ c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Тв и NFATC4 оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , двусторонний t-критерий Стьюдента; c 0 နှင့် 6 ရက်အတွင်း MTOS တွင် နှလုံးအပိုင်းအတွက် ကိုယ်စားပြုပုံများ၊ troponin-T နှင့် NFATC4 အတွက် immunolabeled နှင့် တွင်းနက်ဆဲလ်များ၏ နျူကလိယရှိ NFATC4 ရွှေ့ပြောင်းခြင်းဆိုင်ရာ အရေအတွက် (n = 4 (D0)၊ 3 (D6 MTOS) အချပ်များ/အုပ်စု၊ ကွဲပြားသောဝက်များမှ ကျောင်းသား) ၏ အမြီးနှစ်ကြောင်းစမ်းသပ်မှု ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ *p < 0.05)။ c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化(n = 4 (D0) 爇 MT) 、3 (D/6爇)、进行双尾学生t 检验；*p < 0.05)။ c calcanin-T နှင့် NFATC4 immunolabeling 第0天和第6天MTOS နှလုံးအချပ်များနှင့် NFATC4 ကွဲပြားသော NFATC4 易位至CM ဆဲလ်နျူကလီးယပ်စ်的quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6礄礄礄))时间双尾学生et 电影；*p < 0.05)။ c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-да- хвостатый t-кет; ၀၊၀၅)။ c နေ့ 0 နှင့် 6 တွင် Troponin-T နှင့် NFATC4 immunolabeling အတွက် MTOS နှလုံးအချပ်များ၏ ကိုယ်စားလှယ်ပုံများ (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) ချပ်/အုပ်စု၊ CM ၏ nucleus ရှိ NFATC4 ရွှေ့ပြောင်းခြင်း၏ ပမာဏ)။အမှားဘားများသည် ± စံသွေဖည်မှုကို ကိုယ်စားပြုသည်။
ဘာသာပြန်နှလုံးသွေးကြောဆိုင်ရာ သုတေသနပြုချက်သည် နှလုံးပတ်ဝန်းကျင်ကို တိကျစွာမျိုးပွားနိုင်သော ဆယ်လူလာမော်ဒယ်များ လိုအပ်သည်။ ဤလေ့လာမှုတွင်၊ CTCM ကိရိယာကို တီထွင်ခဲ့ပြီး နှလုံး၏ ultrathin အပိုင်းများကို လှုံ့ဆော်ပေးနိုင်သော သွင်ပြင်လက္ခဏာကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။ CTCM စနစ်တွင် ဇီဝကမ္မဆိုင်ရာ ထပ်တူကျသော လျှပ်စစ်စက်ပိုင်းဆိုင်ရာ နှိုးဆွမှုနှင့် T3 နှင့် Dex အရည် ကြွယ်ဝမှုတို့ ပါဝင်သည်။ porcine heart အပိုင်းများကို ဤအချက်များနှင့် ထိတွေ့သောအခါ၊ ၎င်းတို့၏ ရှင်သန်နိုင်စွမ်း၊ ဖွဲ့စည်းပုံဆိုင်ရာ ကြံ့ခိုင်မှု၊ ဇီဝဖြစ်စဉ်လုပ်ဆောင်မှုနှင့် ကူးပြောင်းမှုဆိုင်ရာ ဖော်ပြမှုတို့သည် ယဉ်ကျေးမှုကို 12 ရက်အကြာတွင် လတ်ဆတ်သော နှလုံးတစ်ရှူးများတွင် အတူတူပင်ဖြစ်ပါသည်။ ထို့အပြင်၊ နှလုံးတစ်သျှူးများကို အလွန်အကျွံ ဆန့်ထုတ်ခြင်းသည် hyperextension ကြောင့်ဖြစ်သော နှလုံး၏ hypertrophy ကို ဖြစ်စေနိုင်သည်။ ယေဘုယျအားဖြင့်၊ ဤရလဒ်များသည် ပုံမှန်နှလုံး phenotype ကိုထိန်းသိမ်းထားရန်နှင့် ဆေးဝါးစစ်ဆေးခြင်းအတွက် ပလပ်ဖောင်းတစ်ခုပေးဆောင်ရန် ဇီဝကမ္မယဉ်ကျေးမှုအခြေအနေများ၏ အရေးကြီးသောအခန်းကဏ္ဍမှ ပံ့ပိုးပေးပါသည်။
အကြောင်းရင်းများစွာသည် cardiomyocytes များ၏လုပ်ဆောင်မှုနှင့်ရှင်သန်မှုအတွက်အကောင်းဆုံးပတ်ဝန်းကျင်ကိုဖန်တီးရန်အထောက်အကူဖြစ်စေသည်။ ဤအချက်များအနက် အထင်ရှားဆုံးမှာ (၁) ဆဲလ်အချင်းချင်း အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှု၊ (၂) လျှပ်စစ်စက်ပိုင်းဆိုင်ရာ လှုံ့ဆော်မှု၊ (၃) ဟာသအချက်များနှင့် (၄) ဇီဝဖြစ်စဉ်အလွှာများနှင့် ဆက်စပ်နေသည်။ ဇီဝကမ္မဆဲလ်မှ ဆဲလ်အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများသည် extracellular matrix မှပံ့ပိုးပေးသော ဆဲလ်အမျိုးအစားများစွာ၏ ရှုပ်ထွေးသော သုံးဖက်မြင်ကွန်ရက်များ လိုအပ်သည်။ ရှုပ်ထွေးသော ဆယ်လူလာ အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုများသည် တစ်ဦးချင်းဆဲလ်အမျိုးအစားများ၏ ပေါင်းစပ်ယဉ်ကျေးမှုဖြင့် ဗီတိုအတွင်း ပြန်လည်တည်ဆောက်ရန် ခက်ခဲသော်လည်း နှလုံးအပိုင်းများ၏ ဇီဝရုပ်သဘာဝကို အသုံးပြု၍ လွယ်ကူစွာ ရရှိနိုင်သည်။
cardiomyocytes ၏စက်ပိုင်းဆိုင်ရာဆန့်ထုတ်ခြင်းနှင့်လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုသည် cardiac phenotype33,34,35 ကိုထိန်းသိမ်းရန်အရေးကြီးပါသည်။ စက်ပိုင်းဆိုင်ရာ နှိုးဆွမှုကို hiPSC-CM အေးစက်မှုနှင့် ရင့်ကျက်မှုအတွက် ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့် အသုံးပြုနေသော်လည်း မကြာသေးမီက အံဝင်ခွင်ကျသော လေ့လာမှုများစွာသည် uniaxial loading ကို အသုံးပြု၍ ယဉ်ကျေးမှုရှိ နှလုံးချပ်များကို စက်ပိုင်းဆိုင်ရာ လှုံ့ဆော်မှုကို ကြိုးပမ်းခဲ့သည်။ ဤလေ့လာမှုများက 2D uniaxial mechanical loading သည် ယဉ်ကျေးမှုအတွင်း နှလုံး၏ phenotype အပေါ် အပြုသဘောဆောင်သော သက်ရောက်မှုရှိကြောင်း ပြသသည်။ ဤလေ့လာမှုများတွင် နှလုံး၏အပိုင်းများကို isometric tensile force17၊ linear auxotonic loading18 သို့မဟုတ် force transducer feedback နှင့် tension drives များသုံးပြီး နှလုံးလည်ပတ်မှုအား ပြန်လည်ဖန်တီးထားသည်။ သို့သော်၊ ဤနည်းလမ်းများသည် uniaxial တစ်သျှူးများကို ပတ်ဝန်းကျင် ပိုမိုကောင်းမွန်အောင် မလုပ်ဆောင်ဘဲ ဆန့်ထုတ်ခြင်းကို အသုံးပြုကာ နှလုံးဗီဇအများအပြားကို ဖိနှိပ်ခြင်း သို့မဟုတ် ပုံမှန်မဟုတ်သော ဆန့်ထုတ်မှုတုံ့ပြန်မှုများနှင့် ဆက်စပ်နေသော မျိုးဗီဇများ အလွန်အကျွံဖော်ပြခြင်းကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်။ ဤနေရာတွင်ဖော်ပြထားသော CTCM သည် စက်ဝိုင်းအချိန်နှင့် ဇီဝကမ္မဆိုင်ရာဆန့်ထုတ်မှု (25% stretch, 40% systole, 60% diastole, နှင့် 72 beats per minutes) တို့တွင် သဘာဝနှလုံးလည်ပတ်မှုကို တုပသည့် 3D လျှပ်စစ်စက်နှိုးဆော်မှုကို ပံ့ပိုးပေးပါသည်။ ဤသုံးဖက်မြင်စက်မှုနှိုးဆွမှုသည် တစ်ရှူးများ၏ကြံ့ခိုင်မှုကို ထိန်းသိမ်းရန်တစ်ခုတည်းနှင့်မလုံလောက်သော်လည်း၊ T3/Dex ကိုအသုံးပြု၍ တစ်သျှူးများ၏ရှင်သန်နိုင်စွမ်း၊ လုပ်ဆောင်မှုနှင့် ကြံ့ခိုင်မှုကို လုံလောက်စွာထိန်းသိမ်းထားရန်အတွက် ဟာသနှင့်စက်ပိုင်းဆိုင်ရာနှိုးဆွမှုပေါင်းစပ်မှုလိုအပ်ပါသည်။
ဟာသအချက်များသည် အရွယ်ရောက်ပြီးသူ၏နှလုံးပုံစံကို ပြုပြင်ပြောင်းလဲရာတွင် အရေးကြီးသောအခန်းကဏ္ဍမှ ပါဝင်ပါသည်။ ဆဲလ်များ ရင့်ကျက်မှုကို အရှိန်မြှင့်ရန် T3 နှင့် Dex ကို ယဉ်ကျေးမှုမီဒီယာတွင် ထည့်သွင်းခဲ့သည့် HiPS-CM လေ့လာမှုများတွင် ၎င်းကို မီးမောင်းထိုးပြခဲ့သည်။ T3 သည် ဆဲလ်အမြှေးပါးများတစ်လျှောက် အမိုင်နိုအက်ဆစ်များ၊ သကြားများနှင့် ကယ်လ်စီယမ်သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးကို လွှမ်းမိုးနိုင်သည်36။ ထို့အပြင်၊ T3 သည် MHC-α ထုတ်ဖော်ပြောဆိုမှုနှင့် MHC-β နှိမ့်ချမှုတို့ကို မြှင့်တင်ပေးသည်၊ အရွယ်ရောက်ပြီးသော cardiomyocytes တွင် အကြောဆွဲခြင်း myofibrils များကို သန္ဓေသား CM တွင် နှေးကွေးသော အကြောဆွဲခြင်း myofibrils များနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက လျင်မြန်သောအကြောဆွဲခြင်း myofibrils ဖွဲ့စည်းမှုကို မြှင့်တင်ပေးသည်။ hypothyroid လူနာများတွင် T3 ချို့တဲ့ခြင်းကြောင့် myofibrillar bands များ ဆုံးရှုံးပြီး အသံတိုးနှုန်း လျော့နည်းသွားခြင်း37။ Dex သည် glucocorticoid receptors များပေါ်တွင်လုပ်ဆောင်ပြီး အထီးကျန်နေသောနှလုံးများတွင် myocardial contractility ကိုတိုးမြင့်စေကြောင်းပြသထားသည်။ 38 ဤတိုးတက်မှုသည် calcium deposit-driven entry (SOCE) 39,40 နှင့် ဆက်စပ်နေသည်ဟု ယူဆပါသည်။ ထို့အပြင်၊ Dex သည် ၎င်း၏ receptors များနှင့် ချိတ်ဆက်ပြီး ကျယ်ပြန့်သော အတွင်းဆဲလ် တုံ့ပြန်မှုကို ဖြစ်ပေါ်စေပြီး ခုခံအားလုပ်ဆောင်ချက်နှင့် ရောင်ရမ်းမှု 30 ကို တားဆီးပေးသည်။
ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များက Ctrl နှင့်နှိုင်းယှဉ်ပါက ရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာနှိုးဆွမှု (MS) သည် ယဉ်ကျေးမှုတွင် 12 ရက်အတွင်း ရှင်သန်နိုင်စွမ်း၊ ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာ သမာဓိနှင့် နှလုံးဖော်ပြမှုကို မထိန်းသိမ်းနိုင်ခဲ့သည်ကို ညွှန်ပြပါသည်။ Ctrl နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက T3 နှင့် Dex မှ CTCM (MT) ယဉ်ကျေးမှုများကို ပေါင်းထည့်ခြင်းသည် ရှင်သန်နိုင်စွမ်းကို တိုးတက်စေပြီး အလားတူ စာသားမှတ်တမ်းပရိုဖိုင်များ၊ ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံဆိုင်ရာ ခိုင်မာမှုနှင့် ဇီဝဖြစ်ပျက်မှုဆိုင်ရာ လုပ်ဆောင်ချက်များကို ၁၂ ရက်ကြာ ထိန်းသိမ်းထားသည်။ ထို့အပြင်၊ တစ်ရှူးဆွဲဆန့်မှုအတိုင်းအတာကို ထိန်းချုပ်ခြင်းဖြင့်၊ STCM စနစ်၏ ဘက်စုံစွမ်းဆောင်နိုင်မှုကို သရုပ်ဖော်သည့် STCM ကို အသုံးပြု၍ hyperextension-induced cardiac hypertrophy မော်ဒယ်ကို ဖန်တီးခဲ့သည်။ နှလုံးပြန်လည်ပြုပြင်ခြင်းနှင့် fibrosis သည် ပုံမှန်အားဖြင့် သင့်လျော်သော cytokines များအပြင် phagocytosis နှင့် အခြားသောပြန်လည်ပြုပြင်ခြင်းဆိုင်ရာအချက်များပေးစွမ်းနိုင်သည့် မကောင်းတဲ့ကိုယ်တွင်းအင်္ဂါများပါရှိသော်လည်း နှလုံး၏အပိုင်းများသည် ဖိစီးမှုနှင့် စိတ်ဒဏ်ရာများကိုတုံ့ပြန်ရာတွင် fibrotic လုပ်ငန်းစဉ်ကို အတုယူနိုင်သေးသည်။ myofibroblasts များထဲသို့။ ၎င်းကို ဤနှလုံးအချပ်ပုံစံတွင် ယခင်က အကဲဖြတ်ထားပါသည်။ tachycardia၊ bradycardia နှင့် စက်ပိုင်းဆိုင်ရာ သွေးလည်ပတ်မှုဆိုင်ရာ ပံ့ပိုးမှု (စက်ပိုင်းဆိုင်ရာ မတင်ဆောင်ထားသော နှလုံး) ကဲ့သို့သော အခြေအနေများစွာကို တုပရန် CTCM ဘောင်များကို ဖိအား/လျှပ်စစ် လွှဲခွင်နှင့် ကြိမ်နှုန်းတို့ကို ပြောင်းလဲခြင်းဖြင့် ပြုပြင်နိုင်သည်ကို သတိပြုသင့်သည်။ ၎င်းသည် စနစ်အား မူးယစ်ဆေးဝါးစမ်းသပ်မှုအတွက် အလယ်အလတ်ဖြတ်တောက်မှုဖြစ်စေသည်။ CTCM ၏ စွမ်းရည်သည် အလွန်အကျွံ ပြင်းထန်သော နှလုံးခုန်နှုန်းကို အတုယူရန် စွမ်းရည် က ဤစနစ်ကို စိတ်ကြိုက် ကုထုံးအတွက် စမ်းသပ်ရန် လမ်းခင်းပေးပါသည်။ နိဂုံးချုပ်အားဖြင့်၊ လက်ရှိလေ့လာမှုသည် နှလုံးတစ်ရှူးအပိုင်းများ၏ ယဉ်ကျေးမှုကို ထိန်းသိမ်းရန်အတွက် စက်ပိုင်းဆိုင်ရာ ဆန့်ထုတ်ခြင်းနှင့် ဟာသနှောခြင်းတို့သည် အရေးကြီးကြောင်း သရုပ်ပြပါသည်။
ဤနေရာတွင်တင်ပြထားသောအချက်အလက်များအရ CTCM သည် နဂိုအတိုင်းရှိသော myocardium ကို ပုံစံထုတ်ရန်အတွက် အလွန်အလားအလာကောင်းသော ပလက်ဖောင်းတစ်ခုဖြစ်သည်ဟု အကြံပြုထားသော်လည်း ဤယဉ်ကျေးမှုနည်းလမ်းတွင် ကန့်သတ်ချက်များရှိသည်။ CTCM ယဉ်ကျေးမှု၏ အဓိက ကန့်သတ်ချက်မှာ အချပ်များပေါ်တွင် စဉ်ဆက်မပြတ် လှုပ်ရှားနေသော စက်ပိုင်းဆိုင်ရာ ဖိစီးမှုများကို ထိန်းထားနိုင်သောကြောင့်၊ ၎င်းသည် စက်ဝိုင်းတစ်ခုစီတွင် နှလုံးအချပ်များ ကျုံ့သွားခြင်းကို တက်ကြွစွာ စောင့်ကြည့်နိုင်မှုကို တားဆီးထားသည်။ ထို့အပြင်၊ နှလုံးအပိုင်း (၇ မီလီမီတာ) သေးငယ်သောကြောင့်၊ ရိုးရာအင်အားအာရုံခံကိရိယာများကို အသုံးပြု၍ ယဉ်ကျေးမှုစနစ်ပြင်ပရှိ systolic လုပ်ဆောင်ချက်ကို အကဲဖြတ်နိုင်စွမ်းမှာ အကန့်အသတ်ရှိသည်။ လက်ရှိလက်ရေးစာမူတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် contractile လုပ်ဆောင်မှု၏ညွှန်ပြချက်တစ်ခုအဖြစ် optical voltage ကိုအကဲဖြတ်ခြင်းဖြင့် ဤကန့်သတ်ချက်ကို တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းကျော်ဖြတ်ပြီးဖြစ်သည်။ သို့သော်၊ ဤကန့်သတ်ချက်သည် နောက်ထပ်လုပ်ဆောင်ရန် လိုအပ်မည်ဖြစ်ပြီး၊ ကယ်လ်စီယမ်နှင့် ဗို့အားကိုထိခိုက်နိုင်သော ဆိုးဆေးများအသုံးပြု၍ ယဉ်ကျေးမှုရှိ နှလုံးချပ်များ၏လုပ်ဆောင်မှုကို အလင်းပြန်စောင့်ကြည့်ခြင်းအတွက် နည်းလမ်းများကို မိတ်ဆက်ခြင်းဖြင့် အနာဂတ်တွင် ဖြေရှင်းနိုင်မည်ဖြစ်သည်။ CTCM ၏နောက်ထပ်ကန့်သတ်ချက်မှာ အလုပ်နမူနာသည် ဇီဝကမ္မဆိုင်ရာဖိစီးမှု (preload နှင့် afterload) ကို စီမံထားခြင်းမရှိပါ။ CTCM တွင်၊ အလွန်ကြီးမားသောတစ်ရှူးများတွင် diastole (အပြည့်အဝဆန့်) နှင့် systole (လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုအတွင်းကျုံ့သွားသည့်အရှည်) တွင် 25% ဇီဝကမ္မဆိုင်ရာဆန့်ထုတ်မှုကို မျိုးပွားရန် ဆန့်ကျင်ဘက်လမ်းကြောင်းများတွင် ဖိအားဖြစ်စေခဲ့သည်။ နှစ်ဖက်စလုံးမှ နှလုံးတစ်ရှူးအပေါ် လုံလောက်သောဖိအားနှင့် နှလုံးအခန်းများအတွင်း ဖြစ်ပေါ်သည့် တိကျသောဖိအား-အသံအတိုးအကျယ်ဆက်ဆံရေးကို အသုံးပြုခြင်းဖြင့် အနာဂတ် CTCM ဒီဇိုင်းများတွင် ဤကန့်သတ်ချက်ကို ဖယ်ရှားသင့်သည်။
ဤစာမူတွင် အစီရင်ခံတင်ပြထားသော အကြောဆန့်ခြင်းကြောင့် ပြုပြင်မွမ်းမံခြင်းသည် hypertrophic hyperstretch အချက်ပြမှုများကို အတုခိုးခြင်းသာဖြစ်သည်။ ထို့ကြောင့်၊ ဤပုံစံသည် ရယ်မောစရာ သို့မဟုတ် အာရုံကြောဆိုင်ရာအချက်များ (ဤစနစ်တွင်မရှိသည့်) မလိုအပ်ဘဲ ဆန့်-လှုံ့ဆော်မှုရှိသော hypertrophic အချက်ပြမှုကို လေ့လာရာတွင် ကူညီပေးနိုင်သည်။ ဥပမာအားဖြင့် CTCM ၏ပွားများမှုကို တိုးမြှင့်ရန် နောက်ထပ်လေ့လာမှုများ လိုအပ်သည်၊ ဥပမာ၊ ခုခံအားဆဲလ်များနှင့် တွဲဖက်စိုက်ပျိုးခြင်း၊ ပလာစမာ ဟာသအချက်များ ပျံ့နှံ့ခြင်းနှင့် အာရုံကြောဆဲလ်များနှင့် တွဲဖက်မွေးမြူသည့်အခါ အတွင်းပိုင်း CTCM ဖြင့် ရောဂါပုံစံပြခြင်း၏ ဖြစ်နိုင်ခြေများကို မြှင့်တင်ပေးမည်ဖြစ်သည်။
ဤလေ့လာမှုတွင် ဝက်ကောင်ရေ ဆယ့်သုံးကောင်ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ တိရစ္ဆာန်လုပ်ထုံးလုပ်နည်းအားလုံးကို အဖွဲ့အစည်းဆိုင်ရာ လမ်းညွှန်ချက်များနှင့်အညီ လုပ်ဆောင်ခဲ့ပြီး University of Louisville Institutional Animal Care and Use Committee မှ အတည်ပြုခဲ့သည်။ aortic arch ကို ချုပ်ထားပြီး နှလုံးကို မြုံနေသော cardioplegia 1 L (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH အထိ 7.4); ပုံမှန်အားဖြင့် <10 မိနစ်ထက် ပိုသော ရေခဲဖြင့် ဓါတ်ခွဲခန်းသို့ ပို့ဆောင်သည်အထိ နှလုံးများကို ရေခဲအအေးခံ၍ နှလုံးသွေးကြောပိတ်ဖြေရှင်းချက်ဖြင့် သိမ်းဆည်းထားသည်။ ပုံမှန်အားဖြင့် <10 မိနစ်ထက် ပိုသော ရေခဲဖြင့် ဓါတ်ခွဲခန်းသို့ ပို့ဆောင်သည်အထိ နှလုံးများကို ရေခဲအအေးခံ၍ နှလုံးသွေးကြောပိတ်ဖြေရှင်းချက်ဖြင့် သိမ်းဆည်းထားသည်။ сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обы နှလုံးအား ရေခဲဖြင့် ဓါတ်ခွဲခန်းသို့ ပို့ဆောင်သည်အထိ ရေခဲအေးသော နှလုံးသွေးကြောတွင်း ဖြေရှင်းချက်တွင် သိမ်းဆည်းထားကာ ပုံမှန်အားဖြင့် <10 မိနစ် ကြာသည်။将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟။将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟။ Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. ပုံမှန်အားဖြင့် <10 မိနစ် ရေခဲဖြင့် ဓာတ်ခွဲခန်းသို့ ပို့ဆောင်သည်အထိ နှလုံးကို ရေခဲပြင်တွင် ထားပါ။
CTCM ကိရိယာကို SolidWorks ကွန်ပြူတာအကူအညီပေးသည့်ဒီဇိုင်း (CAD) ဆော့ဖ်ဝဲလ်တွင် တီထွင်ခဲ့သည်။ ယဉ်ကျေးမှုအခန်းများ၊ အပိုင်းပိုင်းများနှင့် လေဝင်ခန်းများကို CNC ကြည်လင်သော acrylic ပလပ်စတစ်ဖြင့် ပြုလုပ်ထားသည်။ 7 မီလီမီတာ အချင်းရှိ အရန်လက်စွပ်ကို အလယ်ဗဟိုရှိ မြင့်မားသောသိပ်သည်းဆ ပိုလီအေသလင်း (HDPE) ဖြင့် ပြုလုပ်ထားပြီး အောက်ခံမီဒီယာကို တံဆိပ်ခတ်ရန် အသုံးပြုသည့် ဆီလီကွန်အိုလက်စွပ်ကို လိုက်လျောညီထွေဖြစ်စေရန် o-ring groove ပါရှိသည်။ ပါးလွှာသော ဆီလီကာအမြှေးပါးသည် ယဉ်ကျေးမှုအခန်းကို ခွဲထွက်ပန်းကန်နှင့် ပိုင်းခြားထားသည်။ ဆီလီကွန်အမြှေးပါးသည် 0.02" အထူ ဆီလီကွန်စာရွက်မှ လေဆာဖြတ်တောက်ပြီး မာကျောမှု 35A ရှိသည်။ အောက်ခြေနှင့် အပေါ်ပိုင်း ဆီလီကွန် gasket များကို 1/16" အထူ ဆီလီကွန်စာရွက်မှ လေဆာဖြတ်ထားပြီး မာကျောမှု 50A ရှိသည်။ 316L Stainless Steel ဝက်အူများနှင့် တောင်အခွံမာသီးများကို ပိတ်ဆို့ခြင်းနှင့် လေလုံသောတံဆိပ်ဖန်တီးခြင်းအတွက် အသုံးပြုပါသည်။
သီးခြားပုံနှိပ်ထားသော ဆားကစ်ဘုတ် (PCB) ကို C-PACE-EM စနစ်ဖြင့် ပေါင်းစပ်ရန် ဒီဇိုင်းထုတ်ထားသည်။ PCB ရှိ swiss machine connector sockets များကို ငွေရောင်ချထားသော ကြေးနီဝါယာကြိုးများဖြင့် ဂရပ်ဖိုက်လျှပ်ကူးပစ္စည်းများနှင့် ချိတ်ဆက်ထားပြီး ကြေးဝါ 0-60 screw များကို electrodes အတွင်းသို့ လှည့်သွားပါသည်။ ပရင့်ထုတ်ထားသော ဆားကစ်ဘုတ်ကို 3D ပရင်တာ၏ အဖုံးတွင် ထည့်ထားသည်။
CTCM ကိရိယာအား နှလုံးစက်ဝန်းနှင့်ဆင်တူသော ထိန်းချုပ်ထားသော သွေးလည်ပတ်မှုဖိအားကို ဖန်တီးပေးသည့် ပရိုဂရမ်လုပ်နိုင်သော အမှုန်အမွှား (PPD) ဖြင့် ထိန်းချုပ်ထားသည်။ လေခန်းအတွင်းရှိ ဖိအားများ တိုးလာသည်နှင့်အမျှ၊ ပြောင်းလွယ်ပြင်လွယ် ဆီလီကွန်အမြှေးပါးသည် အထက်သို့ ကျယ်လာပြီး တစ်သျှူးဆိုဒ်အောက်ရှိ ကြားခံအား တွန်းအားပေးသည်။ ထို့နောက် ဤအရည်များကို ထုတ်ပစ်ခြင်းဖြင့် နှလုံး၏ ဇီဝကမ္မ ချဲ့ထွင်မှုကို တုပခြင်းဖြင့် တစ်သျှူးဧရိယာကို ဆန့်ထုတ်ပါမည်။ အပန်းဖြေမှု၏ အထွတ်အထိပ်တွင်၊ လေခန်းအတွင်းရှိ ဖိအားကို လျှော့ချပေးပြီး တစ်ရှူးအပိုင်းများကို ကျုံ့စေသည့် ဂရပ်ဖိုက်လျှပ်ကူးပစ္စည်းများမှတစ်ဆင့် လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှုကို သက်ရောက်စေသည်။ ပိုက်အတွင်းပိုင်းသည် လေထုစနစ်အတွင်းရှိ ဖိအားကိုသိရှိရန် ဖိအားအာရုံခံကိရိယာတစ်ခုပါရှိသော hemostatic valve ဖြစ်သည်။ ဖိအားအာရုံခံကိရိယာမှ ခံစားရသော ဖိအားကို လက်ပ်တော့နှင့် ချိတ်ဆက်ထားသော ဒေတာစုဆောင်းသူထံ သက်ရောက်သည်။ ၎င်းသည် ဓာတ်ငွေ့ခန်းအတွင်း ဖိအားကို စဉ်ဆက်မပြတ် စောင့်ကြည့်နိုင်စေသည်။ အမြင့်ဆုံးအခန်းဖိအားသို့ရောက်ရှိသောအခါ (စံနှုန်း 80 mmHg၊ 140 mmHg OS)၊ ဒေတာဝယ်ယူသည့်ကိရိယာအား 2 ms အတွက် biphasic ဗို့အားအချက်ပြမှုတစ်ခုထုတ်လုပ်ရန် C-PACE-EM စနစ်သို့ အချက်ပြပေးပို့ရန် အမိန့်ပေးခဲ့ပါသည်။
နှလုံးအပိုင်းများကို ရယူပြီး ရေတွင်း 6 တွင်းရှိ ယဉ်ကျေးမှုအခြေအနေများကို အောက်ပါအတိုင်းလုပ်ဆောင်ခဲ့သည်- ရိတ်သိမ်းထားသောနှလုံးများကို လွှဲပြောင်းအိုးမှ အအေးဓာတ် (4°C.) cardioplegia ပါဝင်သော ဗန်းတစ်ခုသို့ လွှဲပြောင်းပါ။ ဘယ်ဘက် ventricle ကို ပိုးသတ်ထားသော ဓါးဖြင့် ခွဲထုတ်ပြီး ၁-၂ စင်တီမီတာ ၃ အပိုင်းပိုင်း ဖြတ်ထားသည်။ ဤတစ်ရှူးတုံးများကို တစ်ရှူးကော်ဖြင့် ထောက်ထားပြီး Tyrode ၏ဖြေရှင်းချက်ပါရှိသော တုန်ခါသော microtome တစ်ရှူးရေချိုးခန်းတွင် ထားရှိကာ စဉ်ဆက်မပြတ်အောက်ဆီဂျင် (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g) . ), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM (10 mM), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M ဖြေရှင်းချက်), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M ဖြေရှင်းချက်), 1 L ddH2O အထိ။ တုန်ခါမှုမိုက်ခရိုတိုမီသည် အကြိမ်ရေ 80 Hz၊ အလျားလိုက်တုန်ခါမှုပမာဏ 2 မီလီမီတာနှင့် ကြိုတင်နှုန်း 0.03 မီလီမီတာ/စက္ကန့်ဖြင့် 300 µm အထူအချပ်များကို ဖြတ်တောက်ရန် သတ်မှတ်ထားသည်။ တစ်ရှူးရေချိုးခန်းကို အရည်အေးအောင်ထားရန် ရေခဲများဖြင့် ဝိုင်းရံထားပြီး အပူချိန် 4°C တွင် ထိန်းသိမ်းထားသည်။ မိုက်ခရိုတိုမီရေချိုးခန်းမှ တစ်ရှူးအပိုင်းများကို ယဉ်ကျေးမှုပန်းကန်တစ်ခုအတွက် လုံလောက်သောအပိုင်းများရရှိသည်အထိ ရေခဲပေါ်တွင် အောက်ဆီဂျင်ပါ၀င်သော Tyrode ဖြေရှင်းချက်အဆက်မပြတ်ပါဝင်သော ပေါက်ဖွားသည့်ရေချိုးခန်းသို့ လွှဲပြောင်းပါ။ လမ်းကြောင်းပြောင်းယဉ်ကျေးမှုအတွက်၊ တစ်ရှူးအပိုင်းများကို ပိုးမွှား 6 မီလီမီတာ ကျယ်ဝန်းသော polyurethane အထောက်အပံ့များနှင့်အတူ ချိတ်ဆက်ထားပြီး 6 ml ကို optimized medium (199 အလတ်စား၊ 1x ITS ဖြည့်စွက်စာ၊ 10% FBS၊ 5 ng/ml VEGF၊ 10 ng/ml FGF-alkaline နှင့် 2X ပဋိဇီဝပိုးသတ်ဆေး)။ လျှပ်စစ်လှုံ့ဆော်မှု (10 V၊ ကြိမ်နှုန်း 1.2 Hz) ကို C-Pace မှတဆင့် တစ်ရှူးကဏ္ဍများသို့ သက်ရောက်ခဲ့သည်။ TD အခြေအနေများအတွက်၊ အလတ်စားပြောင်းလဲမှုတစ်ခုစီတွင် 100 nM နှင့် 1 μM တွင် လတ်ဆတ်သော T3 နှင့် Dex ကို ထည့်ထားသည်။ အစားထိုးမလဲလှယ်မီ အလယ်အလတ်သည် အောက်ဆီဂျင်နှင့် ပြည့်နေပြီး တစ်နေ့လျှင် ၃ ကြိမ်။ တစ်ရှူးအပိုင်းများကို 37°C နှင့် 5% CO2 တွင် မွေးမြူထုတ်လုပ်ထားပါသည်။
CTCM ယဉ်ကျေးမှုများအတွက်၊ ပြုပြင်ထားသော Tyrode ၏ဖြေရှင်းချက်ပါရှိသော Petri ပန်းကန်တွင် စိတ်ကြိုက်ပြုလုပ်ထားသော 3D ပရင်တာပေါ်တွင် တစ်ရှူးအပိုင်းများကို ထားရှိခဲ့သည်။ အဆိုပါကိရိယာသည် ပံ့ပိုးလက်စွပ်၏ ဧရိယာ၏ 25% ဖြင့် နှလုံးချပ်၏ အရွယ်အစားကို တိုးမြှင့်ရန် ဒီဇိုင်းထုတ်ထားသည်။ Tyrode ၏ဖြေရှင်းချက်မှအလတ်စားနှင့် diastole အတွင်းသို့လွှဲပြောင်းပြီးနောက်နှလုံး၏အပိုင်းများကိုမဆန့်စေရန်ဤအရာကိုလုပ်ဆောင်သည်။ histoacrylic ကော်ကို အသုံးပြု၍ အထူ 300 µm အပိုင်းများကို အချင်း 7 မီလီမီတာ အချင်းရှိသော ပံ့ပိုးလက်စွပ်ပေါ်တွင် တပ်ဆင်ထားသည်။ တစ်ရှူးအပိုင်းများကို လက်စွပ်တွင် ချိတ်ပြီးနောက် ပိုလျှံနေသော တစ်ရှူးအပိုင်းများကို ဖြတ်ပြီး ကိရိယာတစ်ခုအတွက် လုံလောက်သည့်အပိုင်းများကို ပြင်ဆင်ပြီးသည်အထိ Tyrode solution ၏ ရေချိုးခန်းထဲသို့ ပြန်ထည့်ကာ တွဲထားသော တစ်ရှူးအပိုင်းများကို ရေခဲ (4°C) ထဲသို့ ပြန်ထည့်ပါ။ စက်အားလုံးအတွက် စုစုပေါင်းလုပ်ဆောင်ချိန်သည် 2 နာရီထက် မပိုသင့်ပါ။ တစ်ရှူးအပိုင်း ၆ ပိုင်းကို ၎င်းတို့၏ ပံ့ပိုးကွင်းများနှင့် ချိတ်ဆက်ပြီးနောက် CTCM ကိရိယာကို တပ်ဆင်ခဲ့သည်။ CTCM ယဉ်ကျေးမှုအခန်းတွင် 21 ml ကြိုတင်အောက်စီဂျင်ထုတ်လတ်မှုဖြင့် ကြိုတင်ဖြည့်ထားသည်။ တစ်ရှူးအပိုင်းများကို ယဉ်ကျေးမှုခန်းသို့ လွှဲပြောင်းပြီး ပိုက်ပိုက်ဖြင့် လေပူဖောင်းများကို ဂရုတစိုက် ဖယ်ရှားပါ။ ထို့နောက် တစ်ရှူးအပိုင်းကို အပေါက်ထဲသို့ လမ်းညွှန်ပြီး နေရာကို ညင်သာစွာ ဖိပေးပါ။ နောက်ဆုံးတွင်၊ ကိရိယာပေါ်တွင် လျှပ်ကူးပစ္စည်းထုပ်ကို ထားကာ ကိရိယာကို မီးဖွားခန်းသို့ လွှဲပြောင်းပါ။ ထို့နောက် CTCM ကို လေပြွန်နှင့် C-PACE-EM စနစ်သို့ ချိတ်ဆက်ပါ။ pneumatic actuator ပွင့်လာပြီး လေ valve သည် CTCM ကိုဖွင့်သည်။ C-PACE-EM စနစ်သည် 2 ms အတွက် biphasic pacing ကာလအတွင်း 4 V ကို 1.2 Hz တွင် ပေးပို့ရန် စီစဉ်ထားသည်။ လျှပ်ကူးပစ္စည်းပေါ်တွင် ဂရပ်ဖိုက်များစုပုံခြင်းကို ရှောင်ရှားရန်အတွက် ကြားခံအား တစ်နေ့လျှင် နှစ်ကြိမ် ပြောင်းလဲပြီး လျှပ်ကူးပစ္စည်းကို တစ်နေ့တစ်ကြိမ် ပြောင်းလဲပါသည်။ လိုအပ်ပါက တစ်ရှူးအပိုင်းများကို ၎င်းတို့၏ ယဉ်ကျေးမှုရေတွင်းများမှ ဖယ်ရှားနိုင်ပြီး ၎င်းတို့အောက်တွင် ကျရောက်နိုင်သည့် လေပူဖောင်းများကို ဖယ်ရှားနိုင်သည်။ MT ကုသမှုအခြေအနေများအတွက်၊ T3/Dex ကို 100 nM T3 နှင့် 1 μM Dex တို့ဖြင့် လတ်ဆတ်သောပြောင်းလဲမှုတစ်ခုစီဖြင့် လတ်ဆတ်စွာထည့်သွင်းထားသည်။ CTCM ကိရိယာများကို 37°C နှင့် 5% CO2 တွင် မွေးမြူထုတ်လုပ်ထားပါသည်။
နှလုံးအချပ်များ ဆန့်သည့်နေရာများရရှိရန် အထူးကင်မရာစနစ်ကို တီထွင်ခဲ့သည်။ SLR ကင်မရာ (Canon Rebel T7i၊ Canon၊ Tokyo၊ Japan) ကို Navitar Zoom 7000 18-108mm macro မှန်ဘီလူး (Navitar၊ San Francisco, CA) ဖြင့် အသုံးပြုခဲ့သည်။ ကြားခံအား လတ်ဆတ်သောအလတ်စားဖြင့် အစားထိုးပြီးနောက် အခန်းအပူချိန်တွင် ပုံဖော်ခြင်းအား လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ ကင်မရာသည် 51° ထောင့်တွင် နေရာချထားပြီး ဗီဒီယိုကို တစ်စက္ကန့်လျှင် 30 frames ဖြင့် ရိုက်ကူးပါသည်။ ပထမဦးစွာ၊ နှလုံးချပ်များ၏ရွေ့လျားမှုကိုရေတွက်ရန်အတွက် open source software (MUSCLEMOTION43) ကို Image-J ဖြင့်အသုံးပြုခဲ့သည်။ မျက်နှာဖုံးကို MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) သုံးပြီး ဆူညံသံများကို ရှောင်ရှားရန် နှလုံးချပ်များကို ရိုက်ရန်အတွက် စိတ်ဝင်စားသည့် ဒေသများကို သတ်မှတ်ရန် ဖန်တီးထားသည်။ ကိုယ်တိုင် အပိုင်းပိုင်းခွဲထားသော မျက်နှာဖုံးများကို ဖရိမ်အစီအစဥ်ရှိ ပုံအားလုံးတွင် အသုံးချပြီး MUSCLEMOTION ပလပ်အင်သို့ ပေးပို့ပါသည်။ Muscle Motion သည် ရည်ညွှန်းဘောင်နှင့် ဆက်စပ်၍ ၎င်း၏ရွေ့လျားမှုကို တွက်ချက်ရန်အတွက် frame တစ်ခုစီရှိ pixels များ၏ ပျမ်းမျှပြင်းထန်မှုကို အသုံးပြုသည်။ ဒေတာများကို မှတ်တမ်းတင်ခြင်း၊ စစ်ထုတ်ပြီး လည်ပတ်ချိန်ကို တွက်ချက်ရန်နှင့် နှလုံးစက်ဝန်းအတွင်း တစ်ရှူးဆန့်ခြင်းကို အကဲဖြတ်ရန် အသုံးပြုပါသည်။ မှတ်တမ်းတင်ထားသော ဗီဒီယိုသည် ပထမအမှာစာ သုညအဆင့် ဒစ်ဂျစ်တယ် စစ်ထုတ်မှုကို အသုံးပြုပြီး နောက်ပိုင်းတွင် လုပ်ဆောင်သည်။ တစ်သျှူးဆွဲဆန့်ခြင်း (အထွတ်အထိပ်မှ အထွတ်အထိပ်သို့) တိုင်းတာရန်၊ မှတ်တမ်းတင်ထားသော အချက်ပြရှိ အထွတ်အထိပ်များနှင့် ကျင်းများကြားကို ပိုင်းခြားရန် အထွတ်အထိပ်မှ အထွတ်အထိပ်ပိုင်းခြားစိတ်ဖြာမှုကို လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ ထို့အပြင်၊ signal drift ကိုဖယ်ရှားရန် 6th order polynomial ကိုအသုံးပြု၍ detrending ကိုလုပ်ဆောင်သည်။ ပရိုဂရမ်ကုဒ်ကို MATLAB တွင် ကမ္ဘာလုံးဆိုင်ရာ တစ်ရှူးလှုပ်ရှားမှု၊ စက်ဝန်းအချိန်၊ အနားယူချိန်နှင့် ကျုံ့ချိန် (နောက်ဆက်တွဲ ပရိုဂရမ်ကုဒ် 44) ကို ဆုံးဖြတ်ရန်အတွက် ပရိုဂရမ်ကုဒ်ကို MATLAB တွင် တီထွင်ခဲ့သည်။
ပြင်းထန်မှုခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက်၊ စက်ပိုင်းဆိုင်ရာအကြောဆန့်ခြင်းအတွက်ဖန်တီးထားသည့်တူညီသောဗီဒီယိုများကိုအသုံးပြု၍ MUSCLEMOTION ဆော့ဖ်ဝဲအရ ရွေ့လျားမှုအထွတ်အထိပ်များကိုကိုယ်စားပြုသည့်ရုပ်ပုံနှစ်ပုံကို ဦးစွာခြေရာခံကြည့်ရှုခဲ့သည်။ ထို့နောက် ကျွန်ုပ်တို့သည် တစ်သျှူးဒေသများကို အပိုင်းပိုင်းခွဲပြီး အပိုင်းလိုက်တစ်ရှူးသို့ အရိပ်ပေးသည့် အယ်လဂိုရီသမ်ပုံစံကို အသုံးပြုသည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 2a)။ ထို့နောက် အပိုင်းလိုက်တစ်ရှူးကို အပေါ်ယံမျက်နှာပြင်ဆယ်ခုအဖြစ် ပိုင်းခြားပြီး မျက်နှာပြင်တစ်ခုစီရှိ ဖိအားကို အောက်ပါညီမျှခြင်းဖြင့် တွက်ချက်ခဲ့သည်- Strain = (Sup-Sdown)/Sdown၊ Sup နှင့် Sdown တို့သည် အထည်၏ အပေါ်နှင့်အောက်ခြေ အရိပ်များ၏ ပုံသဏ္ဍာန်အကွာအဝေးများဖြစ်သည် (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ။ 2b)။
နှလုံးအပိုင်းများကို ၄၈ နာရီကြာ 4% paraformaldehyde ဖြင့် ပြုပြင်ထားသည်။ ပုံသေတစ်ရှူးများသည် 10% နှင့် 20% sucrose တွင် 1 နာရီကြာပြီးနောက် 30% sucrose တစ်ညအိပ်သည်။ ထို့နောက် အပိုင်းများကို အကောင်းဆုံးဖြတ်တောက်သည့် အပူချိန်ဒြပ်ပေါင်း (OCT compound) တွင် ထည့်သွင်းပြီး isopentane/ခြောက်သွေ့သော ရေခဲရေချိုးခန်းတွင် တဖြည်းဖြည်း အေးခဲသွားခဲ့သည်။ OCT မြှပ်နှံထားသော ဘလောက်များကို -80°C တွင် ခွဲထားသည်အထိ သိမ်းဆည်းပါ။ အထူ 8 µm ရှိသော အပိုင်းများအဖြစ် ဆလိုက်များကို ပြင်ဆင်ထားပါသည်။
နှလုံးအပိုင်းများမှ OCT ကို ဖယ်ရှားရန် 95°C တွင် အပူပေးတုံးတစ်ခုပေါ်ရှိ ဆလိုက်များကို 5 မိနစ်ကြာ အပူပေးပါ။ ဆလိုက်တစ်ခုစီတွင် 1 ml PBS ကိုထည့်ကာ အခန်းအပူချိန်တွင် မိနစ် 30 ခန့် ဖုတ်ပြီး အခန်းအပူချိန်တွင် 0.1% Triton-X ကို PBS တွင် 15 မိနစ်သတ်မှတ်ခြင်းဖြင့် အပိုင်းများကို စိမ့်ဝင်စေသည်။ နမူနာတွင် သီးခြားမဟုတ်သော ပဋိပစ္စည်းများ ချိတ်တွယ်ခြင်းမှ ကာကွယ်ရန်၊ ဆလိုက်များတွင် 3% BSA ဖြေရှင်းချက် 1 ml ကို ထည့်ပြီး အခန်းအပူချိန်တွင် 1 နာရီကြာ သားဖောက်ပါ။ ထို့နောက် BSA ကိုဖယ်ရှားပြီး slides များကို PBS ဖြင့်ဆေးကြောခဲ့သည်။ နမူနာတစ်ခုစီကို ခဲတံဖြင့်မှတ်သားပါ။ မူလပဋိပစ္စည်း (1% BSA တွင် 1:200 ကို ရောပြီး) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) နှင့် troponin-T (သာမိုသိပ္ပံနည်းကျ; #MA5-12960) (connexin 43) (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) နှင့် troponin-T (သာမိုသိပ္ပံနည်းကျ; #MA5-12960) ကို 90 မိနစ်ကျော်တွင် ပေါင်းထည့်ခဲ့သည်၊ BSA) မောက်စ် Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079)၊ ယုန် Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) ကို နောက်ထပ် မိနစ် 90 ကြာ PBS ဖြင့် ၃ ကြိမ် ဆေးကြောပြီး နောက်ခံမှ စွန်းထင်းနေသော ပစ်မှတ်ကို ခွဲခြားသိရှိရန်၊ နောက်ဆုံးတွင် PI တွင် ထည့်သွင်းထားသော ပဋိပစ္စည်းကိုသာ အသုံးပြုခဲ့သည်။ vectashield (Vector Laboratories) နှင့် လက်သည်းဆိုးဆေး -x ချဲ့ခြင်း) နှင့် 40x ချဲ့ထားသော Keyence အဏုစကုပ်။
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) PBS တွင် 5 μg/ml တွင် WGA ကို စွန်းထင်းစေရန် အသုံးပြုခဲ့ပြီး အခန်းအပူချိန်တွင် မိနစ် 30 ကြာ ပုံသေအခန်းများသို့ အသုံးချခဲ့သည်။ ထို့နောက် ဆလိုက်များကို PBS ဖြင့် ဆေးကြောပြီး ဆူဒန်အနက်ရောင်ကို ဆလိုက်တစ်ခုစီတွင် ထည့်ကာ မိနစ် 30 ကြာ ပေါက်ဖွားသည်။ ထို့နောက် slides များကို PBS ဖြင့် ဆေးကြောပြီး vectashield မြှပ်နှံထားသော ကြားခံအား ပေါင်းထည့်ခဲ့သည်။ ဆလိုက်များကို 40x ချဲ့ခြင်းဖြင့် Keyence အဏုကြည့်မှန်ဘီလူးပေါ်တွင် မြင်ယောင်နေပါသည်။
OCT ကို အထက်ဖော်ပြပါ နမူနာများမှ ဖယ်ရှားခဲ့သည်။ OCT ကိုဖယ်ရှားပြီးနောက် Bouin ၏ဖြေရှင်းချက်တွင်ဆလိုက်များကိုတစ်ညလုံးနှစ်မြှုပ်ပါ။ ထို့နောက် ဆလိုက်များကို ပေါင်းခံရေဖြင့် ၁ နာရီကြာ ဆေးကြောပြီးနောက် Bibrich ရှားစောင်းလက်ပတ်အက်ဆစ် fuchsin အရည်တွင် ၁၀ မိနစ်ကြာ ထားပေးပါ။ ထို့နောက် ဆလိုက်များကို ပေါင်းခံရေဖြင့် ဆေးကြောပြီး 5% phosphomolybdenum / 5% phosphotungstic acid ၏အဖြေတစ်ခုတွင် 10 မိနစ်ခန့်ထားပါ။ ရေမဆေးဘဲ ဆလိုက်များကို aniline အပြာရောင်ဖြေရှင်းချက်ထဲသို့ 15 မိနစ်ခန့် တိုက်ရိုက်လွှဲပြောင်းပါ။ ထို့နောက် ဆလိုက်များကို ပေါင်းခံရေဖြင့် ဆေးကြောပြီး 1% acetic acid solution တွင် ၂ မိနစ်ခန့်ထားပါ။ ဆလိုက်များကို 200 N အီသနောဖြင့် အခြောက်ခံပြီး xylene သို့ လွှဲပြောင်းပေးသည်။ စွန်းထင်းနေသောဆလိုက်များကို 10x ရည်ရွယ်ချက်ဖြင့် Keyence အဏုကြည့်မှန်ပြောင်းကို အသုံးပြု၍ မြင်သာစေသည်။ Keyence Analyzer ဆော့ဖ်ဝဲလ်ကို အသုံးပြု၍ Fibrosis ဧရိယာ ရာခိုင်နှုန်းကို တွက်ချက်ခဲ့သည်။
CyQUANT™ MTT Cell Viability Assay (Invitrogen၊ Carlsbad, CA)၊ ထုတ်လုပ်သူ၏ ပရိုတိုကောအချို့အရ ကက်တလောက်နံပါတ် V13154၊ အထူးသဖြင့်၊ MTT ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွင်း တူညီသောတစ်ရှူးအရွယ်အစားသေချာစေရန် အချင်း 6 မီလီမီတာရှိသော ခွဲစိတ်မှုဖောက်စက်ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ ထုတ်လုပ်သူ၏ပရိုတိုကောအရ MTT အလွှာပါရှိသော 12 တွင်းပြား၏ရေတွင်းထဲသို့ တစ်ရှူးများကို တစ်ဦးချင်းချထားသည်။ အပိုင်းများကို 37°C. တွင် 3 နာရီကြာ ပေါက်ဖွားပြီး သက်ရှိတစ်ရှူးများသည် MTT အလွှာကို ခရမ်းရောင် ဖော်မာဇန်ဒြပ်ပေါင်းအဖြစ် အသွင်ပြောင်းသည်။ MTT ဖြေရှင်းချက်အား 1 ml DMSO ဖြင့် အစားထိုးပြီး နှလုံးအပိုင်းများမှ ခရမ်းရောင်ဖော်မာဇန်ကို ထုတ်ယူရန် 37°C တွင် 15 မိနစ်ကြာ ဖုတ်ပေးပါ။ နမူနာများကို DMSO တွင် 96-ကောင်းစွာရှင်းလင်းသောအောက်ခြေပြားများနှင့် 570 nm တွင်တိုင်းတာသော ခရမ်းရောင်အရောင်ပြင်းအား DMSO တွင် 1:10 ကို Cytation plate reader (BioTek) ဖြင့် တိုင်းတာသည်။ စာဖတ်ခြင်းကို နှလုံးအချပ်တစ်ခုစီ၏ အလေးချိန်အတိုင်း ပုံမှန်ဖြစ်စေခဲ့သည်။
ယခင်က ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း ဂလူးကို့စ်အသုံးပြုမှု စစ်ဆေးမှုအတွက် 1 μCi/ml [5-3H]-glucose (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) ပါဝင်သော နှလုံးလှီးမီဒီယာကို အစားထိုးခဲ့သည်။ ပေါက်ဖွားပြီး 4 နာရီကြာပြီးနောက်၊ 0.2 N HCl 100 µl ပါရှိသော အဖွင့် microcentrifuge ပြွန်တစ်ခုသို့ အလယ်အလတ် 100 µl ကိုထည့်ပါ။ ထို့နောက် 37°C တွင် 72 နာရီကြာ အငွေ့ပျံစေရန် dH2O 500 μl ပါရှိသော ပြွန်ကို စူးစူးစိုက်စိုက်ပြွန်တွင် ထည့်ထားသည်။ ထို့နောက် စူးရှသောပြွန်မှ မိုက်ခရိုစင်ထရီဖန်းပြွန်ကို ဖယ်ရှားပြီး 10 ml of scintillation fluid ကိုထည့်ပါ။ Tri-Carb 2900TR အရည်ကို ခြစ်ထုတ်ခြင်း (Packard Bioscience ကုမ္ပဏီ၊ Meriden၊ CT၊ USA) ကို အသုံးပြု၍ ရှုံ့ချခြင်း အရေအတွက်များကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် ဂလူးကို့စ်အသုံးပြုမှုကို [5-3H]-ဂလူးကို့စ်သတ်သတ်မှတ်မှတ်လုပ်ဆောင်မှု၊ မပြည့်စုံသောမျှခြေနှင့် နောက်ခံ၊ [5-3H]-တံဆိပ်မတပ်ထားသော ဂလူးကို့စ်မှ ပျော့သွားခြင်းနှင့် စူးရှခြင်း တန်ပြန်ထိရောက်မှုတို့ကို ထည့်သွင်းတွက်ချက်ထားသည်။ ဒေတာများကို နှလုံး၏ အစိတ်အပိုင်းများ၏ ထုထည်အတိုင်း ပုံမှန်ဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ထားသည်။
Trizol တွင် တစ်ရှူးတစ်ရှူးကို တစ်သားတည်းဖြစ်အောင်ပြုလုပ်ပြီးနောက်၊ ထုတ်လုပ်သူ၏ပရိုတိုကောအရ Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 ကိုအသုံးပြု၍ RNA ကို နှလုံးအပိုင်းများမှခွဲထုတ်ခဲ့သည်။ RNAsec စာကြည့်တိုက်ပြင်ဆင်မှု၊ စီစစ်ခြင်းနှင့် ဒေတာခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများကို အောက်ပါအတိုင်း လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။
နမူနာတစ်ခုလျှင် RNA ၏ 1 μg ကို RNA စာကြည့်တိုက်ပြင်ဆင်မှုအတွက် အစပြုပစ္စည်းအဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။ ထုတ်လုပ်သူ၏ အကြံပြုချက်များနှင့်အညီ NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit for Illumina (NEB, USA) ကို အသုံးပြု၍ Sequencing libraries များကို ထုတ်လုပ်ခဲ့ပြီး နမူနာတစ်ခုစီအတွက် အညွှန်းကိန်းများကို ရည်ညွှန်းချက် အတွဲများထဲသို့ ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ အတိုချုပ်အားဖြင့်၊ mRNA သည် poly-T oligonucleotides နှင့် ချိတ်ဆက်ထားသော သံလိုက်ပုတီးစေ့များကို အသုံးပြု၍ စုစုပေါင်း RNA မှ သန့်စင်ခဲ့သည်။ Fragmentation ကို NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X) တွင် မြင့်မားသော အပူချိန်တွင် divalent cations များကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်သည်။ ပထမဆုံး cDNA ကြိုးကို ကျပန်း hexamer primers နှင့် M-MuLV reverse transcriptase (RNase H-) တို့ကို အသုံးပြု၍ ပေါင်းစပ်ထားပါသည်။ ထို့နောက် ဒုတိယကြိုး cDNA ကို DNA polymerase I နှင့် RNase H တို့ကို အသုံးပြု၍ ပေါင်းစပ်ပေါင်းစပ်ထားသည်။ ကျန်ရှိသော အစွန်းများကို exonuclease/polymerase လုပ်ဆောင်ချက်ဖြင့် တုံးသွားစေသည်။ DNA အပိုင်းအစ၏ 3′ အဆုံးကို ဖယ်ထုတ်ပြီးနောက်၊ ၎င်းကို ပေါင်းစပ်ပြုလုပ်ရန်အတွက် ပြင်ဆင်ရန်အတွက် ဆံညှပ်ကွင်းတည်ဆောက်ပုံပါရှိသော NEBNext Adapter ကို ၎င်းနှင့်တွဲထားသည်။ နှစ်သက်ရာအရှည် 150-200 bp ၏ cDNA အပိုင်းအစများကို ရွေးချယ်ရန်အတွက်။ စာကြည့်တိုက်အပိုင်းအစများကို AMPure XP စနစ် (Beckman Coulter, Beverly, USA) အသုံးပြု၍ သန့်စင်ခဲ့သည်။ ထို့နောက်၊ 3 μl USER Enzyme (NEB၊ USA) အား ဒက်တာတစ်ခုဖြင့် ချိတ်ဆက်ထားသော 3 μl USER Enzyme (NEB၊ USA) ကို 37°C တွင် 15 မိနစ်နှင့် PCR မတိုင်မီ 95°C တွင် 5 မိနစ်ကြာ အသုံးပြုခဲ့သည်။ ထို့နောက် PCR ကို Phusion High-Fidelity DNA polymerase၊ universal PCR primers နှင့် Index (X) primers တို့ကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ နောက်ဆုံးတွင်၊ PCR ထုတ်ကုန်များကို သန့်စင်ပြီး (AMPure XP စနစ်) နှင့် Agilent Bioanalyzer 2100 စနစ်တွင် စာကြည့်တိုက်အရည်အသွေးကို အကဲဖြတ်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် cDNA စာကြည့်တိုက်ကို Novaseq sequencer ကို အသုံးပြု၍ စီတန်းထားပါသည်။ CASAVA Base Calling ကို အသုံးပြု၍ Illumina မှ ရုပ်ပုံအကြမ်းဖတ်ဖိုင်များကို အကြမ်းဖတ်အဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲခဲ့သည်။ အကြမ်းထည်ဒေတာကို FASTQ(fq) ဖော်မတ်ဖိုင်များတွင် ဖတ်ရှုပြီး ဆက်တိုက်များနှင့် သက်ဆိုင်သော အခြေခံအရည်အသွေးများ ပါဝင်ပါသည်။ Sscrofa11.1 အကိုးအကားဂျီနိုမ်သို့ စစ်ထုတ်ထားသော စီတန်းစီခြင်းများနှင့် ကိုက်ညီရန် HISAT2 ကို ရွေးပါ။ ယေဘူယျအားဖြင့်၊ HISAT2 သည် အခြေ 4 ဘီလီယံထက်ကြီးသော ဂျီနိုမ်များ အပါအဝင် မည်သည့်အရွယ်အစားရှိ ဂျီနိုမ်များကို ပံ့ပိုးပေးကာ ပုံသေတန်ဖိုးများကို ကန့်သတ်ချက်အများစုအတွက် သတ်မှတ်ထားသည်။ RNA Seq ဒေတာမှ ဖတ်ရှုခြင်းများကို ပေါင်းစပ်ခြင်းသည် လက်ရှိရရှိနိုင်သည့် အမြန်ဆုံးစနစ်ဖြစ်သည့် HISAT2 ကို အသုံးပြု၍ ထိရောက်စွာ ချိန်ညှိနိုင်ပြီး အခြားနည်းလမ်းများထက် တူညီသော သို့မဟုတ် ပိုမိုကောင်းမွန်သော တိကျမှုဖြင့် ချိန်ညှိနိုင်သည်။
စာသားမှတ်တမ်းများ များပြားခြင်းသည် မျိုးရိုးဗီဇဖော်ပြမှုအဆင့်ကို တိုက်ရိုက်ထင်ဟပ်စေသည်။ မျိုးရိုးဗီဇဖော်ပြမှုအဆင့်များကို ဂျီနိုမ် သို့မဟုတ် exons များနှင့်ဆက်စပ်သော စာသားမှတ်တမ်းများ (စီစစ်ခြင်းအရေအတွက်) များပြားခြင်းဖြင့် အကဲဖြတ်သည်။ ဖတ်ရှုမှုအရေအတွက်သည် မျိုးရိုးဗီဇဖော်ပြမှုအဆင့်၊ ဗီဇအရှည်နှင့် စီစစ်ခြင်းအတိမ်အနက်နှင့် အချိုးကျပါသည်။ FPKM (အခြေခံအတွဲတစ်ထောင်လျှင် အစိတ်စိတ်အမွှာမွှာ အတွဲတစ်ထောင်လျှင် အခြေအမြစ်အတွဲများ) ကို တွက်ချက်ပြီး DESeq2 ပက်ကေ့ချ်ကို အသုံးပြု၍ P-values ​​များကို ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ ထို့နောက်တွင် ထည့်သွင်းထားသော R-function “p.adjust” ကိုအခြေခံ၍ Benjamini-Hochberg method9 ကို အသုံးပြု၍ P တန်ဖိုးတစ်ခုစီအတွက် မှားယွင်းသောရှာဖွေတွေ့ရှိမှုနှုန်း (FDR) ကို တွက်ချက်ခဲ့ပါသည်။
နှလုံးအပိုင်းများမှခွဲထုတ်ထားသော RNA ကို အပူချိန် 200 ng/μl တွင် အပူချိန် 200 ng/μl ဖြင့် cDNA အဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲသွားပါသည်။ Quantitative RT-PCR ကို Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-ကောင်းစွာ ဖောက်ထွင်းမြင်ရသော တုံ့ပြန်မှုပန်းကန် (Thermo၊ cat. No. 4483319) နှင့် microamp optical adhes (Thermo, cat. no. 4311971) ကို အသုံးပြုထားသည်။ တုံ့ပြန်မှုအရောအနှောတွင် 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat #4444557), 0.5 µl Taqman Primer နှင့် 3.5 µl H2O တို့ ပါဝင်ပါသည်။ Standard qPCR လည်ပတ်မှုများကို လုပ်ဆောင်ပြီး CT တန်ဖိုးများကို Applied Biosystems Quantstudio 5 ဖြင့် အချိန်နှင့်တပြေးညီ PCR တူရိယာ (384-well module; product #A28135) ဖြင့် တိုင်းတာသည်။ Taqman primers များကို Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06888_m1), RGL1 (Ss068N6) ထံမှ ဝယ်ယူခဲ့သည်။ (Ss01009508_mH၊ နမူနာအားလုံးကို အိမ်ထိန်း GAPDH ဗီဇသို့ ပုံမှန်ဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။
ထုတ်လုပ်သူ၏ပရိုတိုကောအရ NT-ProBNP ၏မီဒီယာထုတ်လွှတ်မှုကို NT-ProBNP ကိရိယာ (ဝက်) (ကြောင်နံပါတ် MBS2086979၊ MyBioSource) ကိုအသုံးပြု၍ အကဲဖြတ်ခဲ့သည်။ အတိုချုပ်အားဖြင့်၊ နမူနာတစ်ခုစီနှင့် စံနှုန်းတစ်ခုစီ၏ 250 µl ကို ရေတွင်းတစ်ခုစီတွင် ထပ်တူထည့်သွင်းထားသည်။ နမူနာကိုထည့်ပြီးနောက်ချက်ချင်း၊ ရေတွင်းတစ်ခုစီတွင် Assay Reagent A ၏ 50 µl ကိုထည့်ပါ။ ပန်းကန်ပြားကို ညင်သာစွာလှုပ်ခါပြီး sealant ဖြင့် တံဆိပ်ခတ်ပါ။ ထို့နောက် ဆေးပြားများကို အပူချိန် ၃၇ ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင် ၁ နာရီကြာ ဖုတ်ထားသည်။ ထို့နောက် ဖျော်ရည်ကို သုတ်လိမ်းပြီး ရေတွင်းများကို 1X 350 µl ဆေးရည် 350 µl ဖြင့် တစ်ကြိမ်လျှင် 1-2 မိနစ်ခန့် မွှေပေးပါ။ ထို့နောက် ရေတွင်းတစ်ခုလျှင် Assay Reagent B 100 µl ထည့်ပြီး Plate Sealant ဖြင့် တံဆိပ်ခတ်ပါ။ တက်ဘလက်ကို ညင်သာစွာလှုပ်ယမ်းပြီး 37°C တွင် မိနစ် 30 ကြာ ပေါက်ဖွားသည်။ ဖျော်ရည်ကို သုတ်လိမ်းပြီး ရေတွင်းကို 1X 350 µl ဖြင့် 5 ကြိမ် ဆေးကြောပါ။ ရေတွင်းတစ်ခုစီသို့ ဆပ်ပြာမှုန့် 90 µl ကိုထည့်ကာ ပန်းကန်ပြားကို တံဆိပ်ခတ်ပါ။ ပန်းကန်ပြားကို အပူချိန် 37°C တွင် 10-20 မိနစ်ခန့် ဖုတ်ပါ။ ရေတွင်းတစ်ခုစီတွင် 50 µl Stop Solution ကိုထည့်ပါ။ ပန်းကန်ပြားအား 450 nm တွင် သတ်မှတ်ထားသော Cytation (BioTek) plate reader ဖြင့် ချက်ချင်းတိုင်းတာသည်။
5% Type I အမှားအယွင်းနှုန်းဖြင့် ပါရာမီတာတွင် 10% ပကတိပြောင်းလဲမှုကို ရှာဖွေရန် 80% ပါဝါပေးမည့် အုပ်စုအရွယ်အစားများကို ရွေးချယ်ရန်အတွက် ပါဝါခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများကို ပြုလုပ်ခဲ့ပါသည်။ 5% Type I အမှားအယွင်းနှုန်းဖြင့် ပါရာမီတာတွင် 10% ပကတိပြောင်းလဲမှုကို ရှာဖွေရန် 80% ပါဝါပေးမည့် အုပ်စုအရွယ်အစားများကို ရွေးချယ်ရန်အတွက် ပါဝါခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုများကို ပြုလုပ်ခဲ့ပါသည်။ Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности дногности дноля обяж 10% изменения параметра с 5% частотой ошибок типа ငါ။ Type I အမှားနှုန်း 5% ဖြင့် 10% ပကတိပါရာမီတာပြောင်းလဲမှုကို ရှာဖွေရန် 80% ပါဝါ > 80% ပံ့ပိုးပေးမည့် အုပ်စုအရွယ်အစားများကို ရွေးချယ်ရန်အတွက် ပါဝါခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို လုပ်ဆောင်ပါသည်။进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％凰珎进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％凰珎 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для 10 % мощности для обеспечил абсолютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. 10% ပကတိ ကန့်သတ်ဘောင်ပြောင်းလဲမှုနှင့် 5% အမျိုးအစား I အမှားအယွင်းနှုန်းကို သိရှိရန် 80% ပါဝါ > 80% ပံ့ပိုးပေးမည့် အုပ်စုအရွယ်အစားကို ရွေးချယ်ရန်အတွက် ပါဝါခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတစ်ခု လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။စမ်းသပ်မှုမတိုင်မီ တစ်ရှူးအပိုင်းများကို ကျပန်းရွေးချယ်ခဲ့သည်။ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအားလုံးသည် အခြေအနေ မျက်မမြင်ဖြစ်ပြီး ဒေတာအားလုံးကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပြီးမှသာ နမူနာများကို ကုဒ်ဝှက်ထားသည်။ GraphPad Prism ဆော့ဖ်ဝဲ (San Diego, CA) ကို စာရင်းအင်းပိုင်းခြားစိတ်ဖြာမှုအားလုံးကို လုပ်ဆောင်ရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။ စာရင်းအင်းအားလုံးအတွက်၊ p-တန်ဖိုးများကို တန်ဖိုး <0.05 တွင် သိသာထင်ရှားစွာ သတ်မှတ်ခဲ့သည်။ စာရင်းအင်းအားလုံးအတွက်၊ p-တန်ဖိုးများကို တန်ဖိုး <0.05 တွင် သိသာထင်ရှားစွာ သတ်မှတ်ခဲ့သည်။ Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05။ စာရင်းအင်းအားလုံးအတွက်၊ p-တန်ဖိုးများကို တန်ဖိုး <0.05 တွင် သိသာထင်ရှားစွာ သတ်မှတ်ခဲ့သည်။对于所有统计数据，p 值在值<0.05时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05။ စာရင်းအင်းအားလုံးအတွက်၊ p-တန်ဖိုးများကို တန်ဖိုး <0.05 တွင် သိသာထင်ရှားစွာ သတ်မှတ်ခဲ့သည်။အမြီးနှစ်ချောင်းရှိသော ကျောင်းသား၏ t-test ကို နှိုင်းယှဉ်မှု 2 ခုသာရှိသော အချက်အလက်ပေါ်တွင် ပြုလုပ်ခဲ့ပါသည်။ အုပ်စုများစွာကြားတွင် အရေးပါမှုကို ဆုံးဖြတ်ရန်အတွက် တစ်လမ်း သို့မဟုတ် နှစ်လမ်း ANOVA ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ Post hoc စာမေးပွဲများကို လုပ်ဆောင်သောအခါ၊ Tukey ၏ အမှားပြင်ဆင်ချက်ကို နှိုင်းယှဉ်မှုများစွာအတွက် ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ RNAsec ဒေတာသည် FDR နှင့် p.adjust ကဏ္ဍတွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း FDR တွက်ချက်သည့်အခါ အထူးစာရင်းအင်းထည့်သွင်းစဉ်းစားမှုများ ရှိပါသည်။
လေ့လာမှုဒီဇိုင်းဆိုင်ရာ နောက်ထပ်အချက်အလက်များအတွက်၊ ဤဆောင်းပါးနှင့် ချိတ်ဆက်ထားသော Nature Research Report abstract ကို ကြည့်ပါ။