Ташаккур барои боздид аз Nature.com. Версияи браузере, ки шумо истифода мебаред, дастгирии маҳдуди CSS дорад. Барои беҳтарин таҷриба, мо тавсия медиҳем, ки шумо браузери навшударо истифода баред (ё режими мутобиқатро дар Internet Explorer ғайрифаъол кунед). Дар айни замон, барои таъмини дастгирии доимӣ, мо сайтро бе услубҳо ва JavaScript намоиш медиҳем.
Ниёз ба як системаи боэътимоди in vitro вуҷуд дорад, ки метавонад муҳити физиологии дилро барои санҷиши доруворӣ дақиқ такрор кунад. Дастрасии маҳдуди системаҳои парвариши бофтаи дили инсон боиси тафсири нодурусти таъсири дорувории дил шудааст. Дар ин ҷо, мо модели парвариши бофтаи дилро (CTCM) таҳия кардем, ки буридаҳои дилро ба таври электромеханикӣ ҳавасманд мекунад ва дар марҳилаҳои систоликӣ ва диастолии давраи дил кашиши физиологиро аз сар мегузаронад. Пас аз 12 рӯзи парвариш, ин равиш қисман қобилияти зинда мондани қисматҳои дилро беҳтар кард, аммо якпорчагии сохтории онҳоро пурра нигоҳ надошт. Аз ин рӯ, пас аз скрининги молекулаҳои хурд, мо муайян кардем, ки илова кардани 100 нМ триодотиронин (T3) ва 1 мкМ дексаметазон (Dex) ба муҳити мо микросохтори қисматҳоро барои 12 рӯз нигоҳ медорад. Дар якҷоягӣ бо табобати T3/Dex, системаи CTCM профилҳои транскрипсия, қобилияти зинда мондан, фаъолияти метаболикӣ ва якпорчагии сохториро дар ҳамон сатҳе, ки бофтаи тару тозаи дил дорад, барои 12 рӯз нигоҳ дошт. Илова бар ин, дарозшавии аз ҳад зиёди бофтаи дил дар парвариш боиси пайдоиши сигнализатсияи гипертрофии дил мегардад, ки далели қобилияти CTCM барои тақлид кардани шароити гипертрофии аз сабаби дарозшавии дил ба вуҷуд омада мебошад. Хулоса, CTCM метавонад физиология ва патофизиологияи дилро дар парвариш дар тӯли муддати тӯлонӣ моделсозӣ кунад ва имкон медиҳад, ки скрининги боэътимоди дору гузаронида шавад.
Пеш аз таҳқиқоти клиникӣ, системаҳои боэътимоди in vitro лозиманд, ки метавонанд муҳити физиологии дили инсонро дақиқ такрор кунанд. Чунин системаҳо бояд кашиши механикии тағйирёфта, суръати дил ва хосиятҳои электрофизиологиро тақлид кунанд. Моделҳои ҳайвонот одатан ҳамчун платформаи скрининг барои физиологияи дил бо эътимоднокии маҳдуд дар инъикоси таъсири доруҳо дар дили инсон истифода мешаванд1,2. Дар ниҳоят, Модели таҷрибавии идеалии фарҳанги бофтаи дил (CTCM) моделест, ки барои мудохилаҳои гуногуни терапевтӣ ва фармакологӣ хеле ҳассос ва мушаххас буда, физиология ва патофизиологияи дили инсонро дақиқ такрор мекунад3. Набудани чунин система кашфи усулҳои нави табобати норасоии дилро маҳдуд мекунад4,5 ва боиси кардиотоксикии дору ҳамчун сабаби асосии баромадан аз бозор6 шудааст.
Дар даҳсолаи охир, ҳашт доруи ғайридилиовар аз истифодаи клиникӣ хориҷ карда шуданд, зеро онҳо боиси дароз шудани фосилаи QT мешаванд, ки боиси аритмияи меъдачаҳо ва марги ногаҳонӣ мегардад7. Ҳамин тариқ, ниёз ба стратегияҳои боэътимоди скрининги пеш аз клиникӣ барои арзёбии самаранокӣ ва заҳролудшавии дилу рагҳо меафзояд. Истифодаи ахири кардиомиоситҳои плюрипотентии аз ҳуҷайраҳои бунёдӣ гирифташуда (hiPS-CM), ки аз ҷониби инсон ба вуҷуд омадаанд, дар скрининг ва санҷиши заҳролудшавии доруворӣ ҳалли қисман барои ин мушкилот фароҳам меорад. Аммо, табиати нопухтаи hiPS-CM ва набудани мураккабии бисёрҳуҷайравии бофтаи дил маҳдудиятҳои асосии ин усул мебошанд. Тадқиқотҳои ахир нишон доданд, ки ин маҳдудиятро қисман бо истифода аз hiPS-CM-и барвақт барои ташкили гидрогелҳои бофтаи дил каме пас аз оғози кашишхӯриҳои худсарона ва тадриҷан афзоиш додани ҳавасмандкунии электрикӣ бо мурури замон бартараф кардан мумкин аст. Аммо, ин микробофтаҳои hiPS-CM хосиятҳои электрофизиологӣ ва кашишхӯрии пухташудаи миокардии калонсолонро надоранд. Илова бар ин, бофтаи дили инсон сохтори мураккабтар дорад, ки аз омехтаи гетерогении намудҳои гуногуни ҳуҷайраҳо, аз ҷумла ҳуҷайраҳои эндотелиалӣ, нейронҳо ва фибробластҳои стромалӣ иборат аст, ки бо маҷмӯи мушаххаси сафедаҳои матритсаи берунҳуҷайравӣ ба ҳам пайвастанд. Ин гетерогении популятсияҳои ғайрикардиомиоцитҳо11,12,13 дар дили калонсолони ширхӯрон монеаи асосӣ барои моделсозии бофтаи дил бо истифода аз намудҳои алоҳидаи ҳуҷайраҳо мебошад. Ин маҳдудиятҳои асосӣ аҳамияти таҳияи усулҳоро барои парвариши бофтаи миокард дар шароити физиологӣ ва патологӣ таъкид мекунанд.
Қисмҳои тунуки (300 мкм)-и дили инсон, ки дар парвариш истифода шудаанд, модели умедбахши миокардии солим будани инсон буданашон исбот шудааст. Ин усул дастрасӣ ба системаи пурраи бисёрҳуҷайравии сеченака монанд ба бофтаи дили инсонро таъмин мекунад. Аммо, то соли 2019, истифодаи қисматҳои дили парваришшуда аз сабаби зинда мондани кӯтоҳи (24 соат) парвариш маҳдуд буд. Ин аз як қатор омилҳо, аз ҷумла набудани дарозшавии физикӣ-механикӣ, интерфейси ҳаво-моеъ ва истифодаи васоити оддие, ки ниёзҳои бофтаи дилро дастгирӣ намекунанд, вобаста аст. Дар соли 2019, якчанд гурӯҳҳои тадқиқотӣ нишон доданд, ки ворид кардани омилҳои механикӣ ба системаҳои парвариши бофтаи дил метавонад мӯҳлати парваришро дароз кунад, ифодаи дилро беҳтар кунад ва патологияи дилро тақлид кунад. Ду таҳқиқоти зебо 17 ва 18 нишон медиҳанд, ки боркунии механикии яктарафа ҳангоми парвариш ба фенотипи дил таъсири мусбат мерасонад. Аммо, ин таҳқиқот боркунии сеченакаи динамикии физикӣ-механикии давраи дилро истифода накарданд, зеро қисматҳои дил бо қувваҳои кашиши изометрӣ 17 ё боркунии ауксотинии хаттӣ 18 пур карда шуда буданд. Ин усулҳои дароз кардани бофтаҳо боиси саркӯб шудани бисёр генҳои дил ё ифодаи аз ҳад зиёди генҳо, ки бо вокунишҳои ғайримуқаррарии дарозкунӣ алоқаманданд, гардиданд. Қобили зикр аст, ки Питулис ва ҳамкорон 19 ваннаи динамикии парвариши буридаи дилро барои барқарорсозии давраи дил бо истифода аз бозгашти трансдюсери қувва ва ангезандаҳои шиддат таҳия карданд. Гарчанде ки ин система имкон медиҳад, ки моделсозии дақиқтари давраи дил дар in vitro имконпазир гардад, мураккабӣ ва қобилияти пасти интиқоли он истифодаи ин системаро маҳдуд мекунад. Лабораторияи мо ба наздикӣ як системаи соддакардашудаи парваришро бо истифода аз ҳавасмандкунии электрикӣ ва муҳити оптимизатсияшуда барои нигоҳ доштани қобилияти зинда мондани қисмҳои бофтаи хук ва дили инсон барои то 6 рӯз таҳия кардааст20,21.
Дар дастнависи ҷорӣ, мо модели фарҳанги бофтаи дил (CTCM)-ро бо истифода аз қисматҳои дили хук, ки нишонаҳои гуморалиро барои такрори физиологияи сеченака ва васеъшавии патофизиологӣ дар давраи дил дар бар мегирад, тавсиф мекунем. Ин CTCM метавонад дақиқии пешгӯии пеш аз клиникии доруро то сатҳе, ки қаблан ҳеҷ гоҳ ба даст наомада буд, тавассути пешниҳоди системаи дили камхарҷ ва миёнаҳаҷм, ки физиология/патофизиологияи дили ширхӯронро барои санҷиши пеш аз клиникии дору тақлид мекунад, афзоиш диҳад.
Сигналҳои механикии гемодинамикӣ дар нигоҳ доштани вазифаи кардиомиоситҳо дар in vitro нақши муҳим мебозанд 22,23,24. Дар дастнависи ҷорӣ, мо CTCM (Расми 1a)-ро таҳия кардем, ки метавонад муҳити дили калонсолонро тавассути ба вуҷуд овардани ҳам ҳавасмандкунии электрикӣ ва ҳам механикӣ дар басомадҳои физиологӣ (1,2 Гц, 72 зарба дар як дақиқа) тақлид кунад. Барои пешгирӣ аз кашиши аз ҳад зиёди бофта ҳангоми диастола, дастгоҳи чопи 3D барои афзоиши андозаи бофта 25% истифода шуд (Расми 1b). Стимулятори электрикӣ, ки аз ҷониби системаи C-PACE ба вуҷуд омадааст, барои оғоз кардани 100 мс пеш аз систола бо истифода аз системаи ҷамъоварии маълумот барои такрори пурраи давраи дил вақт муайян карда шуд. Системаи парвариши бофта аз як фаъолкунандаи пневматикӣ (LB Engineering, Олмон) истифода мебарад, то мембранаи чандири силикониро ба таври даврӣ васеъ кунад, то васеъшавии буришҳои дилро дар камераи болоӣ ба вуҷуд орад. Система тавассути табдилдиҳандаи фишор ба хати ҳавои беруна пайваст карда шуд, ки имкон дод фишор (± 1 мм.ст.) ва вақт (± 1 мс) дақиқ танзим карда шавад (Расми 1c).
a Қисмати бофтаро ба ҳалқаи такягоҳи 7 мм, ки бо ранги кабуд нишон дода шудааст, дар дохили камераи парвариши дастгоҳ пайваст кунед. Камераи парвариш аз камераи ҳавоӣ бо мембранаи тунуки чандири силиконӣ ҷудо карда шудааст. Барои пешгирӣ аз ихроҷ байни ҳар як камера прокладка гузоред. Сарпӯши дастгоҳ дорои электродҳои графитӣ мебошад, ки ҳавасмандкунии электрикиро таъмин мекунанд. b Намунаи схемавии дастгоҳи калони бофта, ҳалқаи роҳнамо ва ҳалқаи такягоҳ. Қисмҳои бофта (қаҳваранг) дар дастгоҳи калонҳаҷм ҷойгир карда шудаанд ва ҳалқаи роҳнамо дар чуқурии канори берунии дастгоҳ ҷойгир карда шудааст. Бо истифода аз роҳнамо, ҳалқаи такягоҳро, ки бо часпаки акрилии бофта пӯшонида шудааст, бодиққат болои қисмати бофтаи дил ҷойгир кунед. c Графике, ки вақти ҳавасмандкунии электрикиро ҳамчун функсияи фишори камераи ҳаво, ки аз ҷониби як фаъолкунандаи пневматикӣ (PPD) барномарезишаванда идора карда мешавад, нишон медиҳад. Дастгоҳи ҷамъоварии маълумот барои ҳамоҳангсозии ҳавасмандкунии электрикӣ бо истифода аз сенсорҳои фишор истифода шудааст. Вақте ки фишор дар камераи парвариш ба остонаи муқарраршуда мерасад, сигнали импулс ба C-PACE-EM фиристода мешавад, то ҳавасмандкунии электрикиро ба кор барад. d Тасвири чор CTCM, ки дар рафи инкубатор ҷойгир шудаанд. Чор дастгоҳ тавассути схемаи пневматикӣ ба як PPD пайваст карда шудаанд ва сенсорҳои фишор барои назорат кардани фишор дар схемаи пневматикӣ ба клапани гемостатикӣ ворид карда мешаванд. Ҳар як дастгоҳ шаш қисмати бофтаро дар бар мегирад.
Бо истифода аз як фаъолкунандаи пневматикӣ, мо тавонистем 4 дастгоҳи CTCM-ро идора кунем, ки ҳар кадоми онҳо метавонистанд 6 қисмати бофтаро нигоҳ доранд (Расми 1d). Дар CTCM, фишори ҳаво дар камераи ҳаво ба фишори синхронӣ дар камераи моеъ табдил дода мешавад ва васеъшавии физиологии буриши дилро ба вуҷуд меорад (Расми 2a ва Филми иловагии 1). Арзёбии дарозшавии бофта дар 80 мм симоб. Дар расм нишон дода шудааст, ки дарозшавии қисматҳои бофта 25% аст (Расми 2b). Нишон дода шудааст, ки ин дарозшавии фоизӣ ба дарозии физиологии саркомери 2.2-2.3 мкм барои кашишпазирии муқаррарии қисмати дил мувофиқат мекунад17,19,25. Ҳаракати бофта бо истифода аз танзимоти камераи фармоишӣ арзёбӣ карда шуд (Расми иловагии 1). Амплитуда ва суръати ҳаракати бофта (Расми 2c, d) ба дарозшавӣ дар давраи дил ва вақт дар давоми систола ва диастола мувофиқат мекард (Расми 2b). Дарозшавӣ ва суръати бофтаи дил ҳангоми кашиш ва истироҳат дар тӯли 12 рӯз дар фарҳанг доимӣ боқӣ монд (Расми 2f). Барои арзёбии таъсири ангезиши электрикӣ ба қобилияти кашишхӯрӣ ҳангоми парвариш, мо усули муайян кардани деформатсияи фаъолро бо истифода аз алгоритми соякунӣ таҳия кардем (Расми иловагии 2a,b) ва тавонистем деформатсияҳоро бо ангезиши электрикӣ ва бе он фарқ кунем. Ҳамон қисмати дил (Расми 2f). Дар минтақаи ҳаракаткунандаи буриш (R6-9), шиддат ҳангоми ангезиши электрикӣ 20% нисбат ба набудани ангезиши электрикӣ баландтар буд, ки ин саҳми ангезиши электрикиро ба функсияи кашишхӯрӣ нишон медиҳад.
Андозагириҳои нишондиҳандаи фишори камераи ҳавоӣ, фишори камераи моеъ ва ҳаракати бофтаҳо тасдиқ мекунанд, ки фишори камера фишори камераи моеъро тағйир медиҳад ва боиси ҳаракати мувофиқи буриши бофта мегардад. b Андозагириҳои нишондиҳандаи фоизи дарозшавии (кабуд) қисматҳои бофта, ки ба фоизи дарозшавии (норанҷӣ) мувофиқат мекунанд, мувофиқанд. c Ҳаракати ченшудаи буриши дил бо суръати ченшудаи ҳаракат мувофиқ аст. (d) Траекторияҳои нишондиҳандаи ҳаракати даврӣ (хати кабуд) ва суръат (хати нуқтадори норанҷӣ) дар як буриши дил. e Миқдори вақти давра (n = 19 бурида дар як гурӯҳ, аз хукҳои гуногун), вақти кашиш (n = 19 бурида дар як гурӯҳ), вақти истироҳат (n = 19 бурида дар як гурӯҳ, аз хукҳои гуногун), ҳаракати бофта (n = 25). буридаҳо)/гурӯҳ аз хукҳои гуногун), суръати авҷи систоликӣ (n = 24(D0), 25(D12) бурида/гурӯҳ аз хукҳои гуногун) ва суръати авҷи истироҳат (n = 24(D0), 25(D12) бурида/гурӯҳ аз хукҳои гуногун). Санҷиши дуҷонибаи t-и Студент дар ягон параметр фарқияти назаррас нишон надод. f Нишонаҳои таҳлили намояндагии шиддати қисматҳои бофта бо ангезиши барқии (сурх) ва бе (кабуд), даҳ минтақаи минтақавии қисматҳои бофта аз ҳамон қисмат. Панелҳои поёнӣ миқдори фарқияти фоизии шиддатро дар қисматҳои бофта бо ва бе ангезиши барқӣ дар даҳ минтақа аз қисматҳои гуногун нишон медиҳанд. (n = 8 бурида/гурӯҳ аз хукҳои гуногун, санҷиши t-и дудуми донишҷӯ гузаронида мешавад; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 бурида/гурӯҳ аз хукҳои гуногун, санҷиши t-и дудуми донишҷӯ гузаронида мешавад; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу аз разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 қисм/гурӯҳ аз хукҳои гуногун, санҷиши дудумаи t-и Стюдент; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0,0001，**p <0,01，*5）0. （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p <0,0001，**p <0,01，*5）0. (n = 8 срезов/группу, аз разных свиней, дувусторонний меъёр Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 қисм/гурӯҳ, аз хукҳои гуногун, санҷиши дудумаи t-и Стюдент; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Хатогиҳо миёнаи ± инҳирофи стандартиро нишон медиҳанд.
Дар системаи парвариши буридаи дили статикии биомиметикии қаблии мо [20, 21], мо қобилияти зинда мондан, вазифа ва якпорчагии сохтории буридаҳои дилро дар тӯли 6 рӯз бо истифода аз ҳавасмандкунии барқӣ ва беҳтар кардани таркиби муҳити зист нигоҳ доштем. Аммо, пас аз 10 рӯз, ин рақамҳо якбора коҳиш ёфтанд. Мо ба қисматҳое, ки дар шароити назоратии системаи парвариши биомиметикии статикии қаблии мо парвариш карда шудаанд, ишора хоҳем кард 20, 21 (Ctrl) ва мо муҳити қаблан оптимизатсияшудаи худро ҳамчун шароити MC ва парвариш дар зери ҳавасмандкунии механикӣ ва барқии ҳамзамон (CTCM) истифода хоҳем бурд. Аввалан, мо муайян кардем, ки ҳавасмандкунии механикӣ бе ҳавасмандкунии барқӣ барои нигоҳ доштани қобилияти зинда мондани бофтаҳо дар тӯли 6 рӯз нокифоя аст (Расми иловагӣ 3a,b). Ҷолиб он аст, ки бо ҷорӣ намудани ҳавасмандкунии физикӣ-механикӣ ва барқӣ бо истифода аз STCM, қобилияти зинда мондани қисматҳои 12-рӯзаи дил дар шароити MS ҳамон тавре ки дар қисматҳои нави дил дар шароити MS боқӣ монд, аммо на дар шароити Ctrl, чунон ки таҳлили MTT нишон додааст (Расми 1). 3a). Ин нишон медиҳад, ки ҳавасмандкунии механикӣ ва симулятсияи давраи дил метавонад қисматҳои бофтаро ду маротиба зиёдтар аз он чизе, ки дар системаи парвариши статикии қаблии мо гузориш шудааст, қобилияти зинда монданро нигоҳ дорад. Аммо, арзёбии якпорчагии сохтории қисматҳои бофта тавассути иммуноглобулинкунии тропонини дил T ва коннексин 43 нишон дод, ки ифодаи коннексин 43 дар бофтаҳои MC дар рӯзи 12 нисбат ба гурӯҳи назоратӣ дар ҳамон рӯз ба таври назаррас баландтар буд. Аммо, ифодаи якхелаи коннексин 43 ва ташаккули Z-диск пурра нигоҳ дошта нашуд (Расми 3б). Мо барои чен кардани якпорчагии сохтории бофта26 аз чаҳорчӯбаи зеҳни сунъӣ (AI) истифода мебарем, лӯлаи омӯзиши амиқ дар асоси тасвир, ки ба рангкунии тропонин-T ва коннексин43 асос ёфтааст, то якпорчагии сохторӣ ва флуоресценсияи буришҳои дилро аз ҷиҳати қувваи маҳаллисозӣ ба таври худкор чен кунад. Ин усул аз Шабакаи асабии печида (CNN) ва чаҳорчӯбаи омӯзиши амиқ барои чен кардани якпорчагии сохтории бофтаи дил бо роҳи автоматӣ ва бетарафона, тавре ки дар истинод тавсиф шудааст, истифода мебарад. 26. Бофтаи MC дар муқоиса бо қисматҳои назоратии статикӣ ба рӯзи 0 монандӣ беҳтари сохторӣ нишон дод. Илова бар ин, рангкунии трихромии Массон дар шароити MS дар муқоиса бо шароити назоратӣ дар рӯзи 12-уми парвариш фоизи хеле пасттари фиброзро нишон дод (Расми 3c). Дар ҳоле ки CTCM қобилияти зинда мондани қисмҳои бофтаи дилро дар рӯзи 12 то сатҳе, ки ба сатҳи бофтаи тару тозаи дил монанд аст, афзоиш дод, он якпорчагии сохтории қисмҳои дилро ба таври назаррас беҳтар накард.
Графики сутунӣ миқдори зинда мондани MTT-и буридаҳои тару тозаи дил (D0) ё буридаҳои дилро барои 12 рӯз ё дар парвариши статикӣ (D12 Ctrl) ё дар CTCM (D12 MC) нишон медиҳад (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) бурида/гурӯҳ аз хукҳои гуногун, санҷиши ANOVA бо як роҳ анҷом дода мешавад; ####p < 0.0001 дар муқоиса бо D0 ва **p < 0.01 дар муқоиса бо D12 Ctrl). Графики сутунӣ миқдори зинда мондани MTT-и буридаҳои тару тозаи дил (D0) ё буридаҳои дилро барои 12 рӯз ё дар парвариши статикӣ (D12 Ctrl) ё дар CTCM (D12 MC) нишон медиҳад (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) бурида/гурӯҳ аз хукҳои гуногун, санҷиши ANOVA бо як роҳ анҷом дода мешавад; ####p < 0.0001 дар муқоиса бо D0 ва **p < 0.01 дар муқоиса бо D12 Ctrl).Гистограмма миқдори зинда мондани қисматҳои тару тозаи дили MTT (D0) ё парвариши қисматҳои дилро барои 12 рӯз дар парвариши статикӣ (назорати D12) ё CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (назорати D12). ), 12 (D12 MC) қисмат/гурӯҳ аз хукҳои гуногун нишон медиҳад, санҷиши яктарафаи ANOVA гузаронида мешавад;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 дар муқоиса бо D0 ва **p < 0.01 дар муқоиса бо D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，切片/组，卛运测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p <，2tr与D相比，**p。)гистограммае, ки миқдори зинда мондани MTT-ро дар қисматҳои тару тозаи дил (D0) ё қисматҳои дил, ки барои 12 рӯз дар парвариши статикӣ (назорати D12) ё CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (назорати D12)), 12 қисм/гурӯҳ (D12 MC) аз хукҳои гуногун парвариш карда шудаанд, санҷиши яктарафаи ANOVA;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 дар муқоиса бо D0, **p < 0.01 дар муқоиса бо D12 Ctrl).b Тропонин-Т (сабз), коннексин 43 (сурх) ва DAPI (кабуд) дар қисматҳои нави ҷудошудаи дил (D0) ё қисматҳои дил, ки дар шароити статикӣ (Ctrl) ё шароити CTCM (MC) барои 12 рӯз парвариш карда шудаанд) бо тасвирҳои иммунофлуоресцентии намояндагӣ (миқёси холӣ = 100 µm). Миқдори зеҳни сунъӣ муайян кардани якпорчагии сохтории бофтаи дил (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) бурида/гурӯҳбандӣ аз хукҳои гуногун, санҷиши яктарафаи ANOVA гузаронида мешавад; ####p < 0.0001 дар муқоиса бо D0 ва ****p < 0.0001 дар муқоиса бо D12 Ctrl). Миқдори зеҳни сунъӣ муайян кардани якпорчагии сохтории бофтаи дил (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) бурида/гурӯҳ аз хукҳои гуногун, санҷиши яктарафаи ANOVA гузаронида мешавад; ####p < 0.0001 дар муқоиса бо D0 ва ****p < 0.0001 дар муқоиса бо D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп аз свинейҳои гуногун, проводится однофакторный тест ANOVA <1, #0#0; ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Миқдори муайянкунии якпорчагии сохтории бофтаи дил тавассути зеҳни сунъӣ (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) қисмат/гурӯҳ аз хукҳои гуногун, санҷиши яктарафаи ANOVA гузаронида шуд; ####p < 0.0001 дар муқоиса бо D0 ва ****p < 0.0001 дар муқоиса бо D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) бурида/гурӯҳи ҳар як хуки гуногун, санҷиши яктарафаи ANOVA #0 #0 #0.0;相比，****p <0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) бурида/гурӯҳи ҳар як хукҳои гуногун, санҷиши якҷонибаи ANOVA#01;#0.与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект барои количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой аз свинейҳои гуногун, односторонний тест ANOVA; #, #0#0ляп <0, D#0****p. < 0,0001 по сравнению бо D12 Ctrl). Ақли сунъӣ барои муайян кардани якпорчагии сохтории бофтаи дил (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) қисмат/гурӯҳбандии ҳар як хукҳои гуногун, санҷиши яктарафаи ANOVA; ####p<0.0001 vs .D0 Барои муқоиса ****p < 0.0001 дар муқоиса бо D12 Ctrl). c Тасвирҳои намояндагӣ (чап) ва муайянкунии миқдорӣ (рост) барои буришҳои дил, ки бо ранги трихромии Массон ранг карда шудаанд (Scale bare = 500 µm) (n = 10 буриш/гурӯҳ аз ҳар як хуки гуногун, санҷиши яктарафаи ANOVA гузаронида мешавад; ####p < 0.0001 дар муқоиса бо D0 ва ***p < 0.001 дар муқоиса бо D12 Ctrl). c Тасвирҳои намояндагӣ (чап) ва муайянкунии миқдорӣ (рост) барои буришҳои дил, ки бо ранги трихромии Массон ранг карда шудаанд (Scale bare = 500 µm) (n = 10 буриш/гурӯҳ аз ҳар як аз хукҳои гуногун, санҷиши яктарафаи ANOVA гузаронида мешавад; #### p < 0.0001 дар муқоиса бо D0 ва ***p < 0.001 дар муқоиса бо D12 Ctrl). в Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб бе покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу аз разных свиней, выпностний тест ANO# #; 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Тасвирҳои намояндагӣ (чап) ва муайянкунии миқдорӣ (рост)-и қисматҳои дил, ки бо ранги трихромии Массон ранг карда шудаанд (миқёси бепӯшиш = 500 µm) (n = 10 қисм/гурӯҳ аз хукҳои гуногун, санҷиши яктарафаи ANOVA гузаронида шуд; #### p < 0.0001 дар муқоиса бо D0 ва ***p < 0.001 дар муқоиса бо D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸=專右）（裸=專0µnＺ 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 ，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 ，每组来自不同的猪， Ctrl 相比）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 庺度裸尺度 = 500 μm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单向 An # # 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）. в Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждий аз другой свиньитор, потенсиали протестантҳо) анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Тасвирҳои намояндагӣ (чап) ва миқдорӣ (рост)-и қисматҳои дил, ки бо ранги трихромии Массон ранг карда шудаанд (холӣ = 500 µm) (n = 10 қисмат/гурӯҳ, ҳар кадоме аз хуки гуногун, бо таҳлили яктарафаи дисперсия санҷида шудаанд;### # p < 0.0001 дар муқоиса бо D0, ***p < 0.001 дар муқоиса бо D12 Ctrl).Хатогиҳо миёнаи ± инҳирофи стандартиро нишон медиҳанд.
Мо фарзия кардем, ки бо илова кардани молекулаҳои хурд ба муҳити парвариш, якпорчагии кардиомиоцитҳоро ҳангоми парвариши CTCM беҳтар кардан ва инкишофи фиброзро кам кардан мумкин аст. Аз ин рӯ, мо молекулаҳои хурдро бо истифода аз фарҳангҳои назоратии статикии худ20,21 аз сабаби шумораи ками омилҳои омехтакунанда скрининг кардем. Дексаметазон (Dex), трийодотиронин (T3) ва SB431542 (SB) барои ин скрининг интихоб карда шуданд. Ин молекулаҳои хурд қаблан дар фарҳангҳои hiPSC-CM барои ба вуҷуд овардани пухташавии кардиомиоцитҳо тавассути афзоиши дарозии саркомерҳо, найчаҳои Т ва суръати гузаронандагӣ истифода мешуданд. Илова бар ин, ҳам Dex (глюкокортикоид) ва ҳам SB маълуманд, ки илтиҳобро пахш мекунанд29,30. Аз ин рӯ, мо санҷидаем, ки оё дохил кардани яке ё маҷмӯи ин молекулаҳои хурд якпорчагии сохтории қисмҳои дилро беҳтар мекунад. Барои скрининги ибтидоӣ, вояи ҳар як пайвастагӣ дар асоси консентратсияҳое, ки одатан дар моделҳои парвариши ҳуҷайра истифода мешаванд (1 μM Dex27, 100 nM T327 ва 2.5 μM SB31) интихоб карда шуд. Пас аз 12 рӯзи парвариш, якҷоя кардани T3 ва Dex ба якпорчагии сохтории беҳтарини кардиомиоцитҳо ва аз нав сохтани нахҳои ҳадди ақал оварда расонд (Расми иловагӣ 4 ва 5). Илова бар ин, истифодаи дукарата ё дукаратаи ин консентратсияҳои T3 ва Dex дар муқоиса бо консентратсияҳои муқаррарӣ таъсири зараровар дошт (Расми иловагӣ 6a,b).
Пас аз скрининги ибтидоӣ, мо муқоисаи рӯ ба рӯ бо 4 шароити парваришро анҷом додем (Расми 4a): Ctrl: қисматҳои дил, ки дар фарҳанги статикии қаблан тавсифшудаи мо бо истифода аз муҳити оптимизатсияшудаи мо парвариш карда шуданд; 20.21 TD: T3 ва Ctrl рӯзи чоршанбе Dex илова карданд; MC: қисматҳои дил, ки дар CTCM бо истифода аз муҳити қаблан оптимизатсияшудаи мо парвариш карда шуданд; ва MT: CTCM бо илова кардани T3 ва Dex ба муҳити зист. Пас аз 12 рӯзи парвариш, қобилияти зинда мондани бофтаҳои MS ва MT ҳамон тавре ки дар бофтаҳои тару тозае, ки бо санҷиши MTT арзёбӣ шудаанд, боқӣ монд (Расми 4b). Ҷолиб он аст, ки илова кардани T3 ва Dex ба фарҳангҳои трансвелл (TD) боиси беҳбудии назарраси зинда мондан дар муқоиса бо шароити Ctrl нашуд, ки нишон медиҳад, ки нақши муҳими ҳавасмандкунии механикӣ дар нигоҳ доштани қобилияти зинда мондани қисматҳои дил.
Диаграммаи тарроҳии таҷрибавӣ, ки чор шароити парваришро нишон медиҳад, ки барои арзёбии таъсири ҳавасмандкунии механикӣ ва иловаҳои T3/Dex ба муҳити зист барои 12 рӯз истифода мешаванд. b Графики сутунӣ нишон медиҳад, ки миқдори зиндамонӣ 12 рӯз пас аз парвариш дар ҳамаи 4 шароити парвариш (Ctrl, TD, MC ва MT) дар муқоиса бо буришҳои тару тозаи дил (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ва D12 MT), 12 (D12 MC) буриш/гурӯҳ аз хукҳои гуногун, санҷиши яктарафаи ANOVA гузаронида мешавад; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 дар муқоиса бо D0 ва **p < 0.01 дар муқоиса бо D12 Ctrl). b Графики сутунӣ нишон медиҳад, ки қобилияти зинда мондан 12 рӯз пас аз парвариш дар ҳамаи 4 шароити парвариш (Ctrl, TD, MC ва MT) дар муқоиса бо буришҳои тару тозаи дил (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ва D12 MT), 12 (D12 MC) буриш/гурӯҳ аз хукҳои гуногун, санҷиши яктарафаи ANOVA гузаронида мешавад; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 дар муқоиса бо D0 ва **p < 0.01 дар муқоиса бо D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности дар давоми 12 дней баъд аз культивирование дар ҳама 4 усулҳои фарҳангӣ (контрол, TD, MC ва MT) по сравнению бо свежими срезами сердца (D0) (D0,12tr), (D0,18), TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу аз разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; b Графики сутунӣ муайянкунии миқдории зиндамонӣ дар 12 рӯзи пас аз парвариш дар ҳамаи 4 шароити парвариш (назорат, TD, MC ва MT)-ро дар муқоиса бо қисматҳои тару тозаи дил (D0) нишон медиҳад (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ва D12 MT), 12 (D12 MC) қисм/гурӯҳ аз хукҳои гуногун, санҷиши яктарафаи ANOVA; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 дар муқоиса бо D0 ва **p < 0.01 дар муқоиса бо D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D1 、 1 Dl) TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001；####p < 0.0001（0.0.0.相比，**p < 0,01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая дар ҳама 4 усулҳои фарҳангӣ (контрол, TD, MC ва MT) по сравнению бо свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от 1 2 MCD срезы/группа, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Гистограммае, ки ҳамаи 4 шароити парваришро (назорат, TD, MC ва MT) дар муқоиса бо қисматҳои тару тозаи дил (D0) нишон медиҳад (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ва D12 MT), аз хукҳои гуногун 12 қисм/гурӯҳ (D12 MC), санҷиши яктарафаи ANOVA; ####p<0.0001, ###p<0.001 нисбат ба D0, **p<0.01 нисбат ба D12 назоратӣ). Графики сутунӣ c Миқдори ҷараёни глюкозаро 12 рӯз пас аз парвариш дар ҳар 4 шароити парвариш (Ctrl, TD, MC ва MT) дар муқоиса бо буришҳои тару тозаи дил (D0) нишон медиҳад (n = 6 буриш/гурӯҳ аз хукҳои гуногун, санҷиши яктарафаи ANOVA гузаронида мешавад; ###p < 0.001, дар муқоиса бо D0 ва ***p < 0.001 дар муқоиса бо D12 Ctrl). Графики сутунӣ c Миқдори ҷараёни глюкозаро 12 рӯз пас аз парвариш дар ҳар 4 шароити парвариш (Ctrl, TD, MC ва MT) дар муқоиса бо буришҳои тару тозаи дил (D0) нишон медиҳад (n = 6 буриш/гурӯҳ аз хукҳои гуногун, санҷиши яктарафаи ANOVA гузаронида мешавад; ###p < 0.001, дар муқоиса бо D0 ва ***p < 0.001 дар муқоиса бо D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней пас аз культивирование дар ҳама 4 усули фарҳангӣ (контрол, TD, MC и MT) по сравнению бо свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезавӣ), Выполняется тест ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). Гистограммаи c Миқдори ҷараёни глюкозаро 12 рӯз пас аз парвариш дар ҳар 4 шароити парвариш (назорат, TD, MC ва MT) дар муқоиса бо қисматҳои тару тозаи дил (D0) нишон медиҳад (n = 6 қисмат/гурӯҳ аз хукҳои гуногун, санҷиши яктарафаи ANOVA гузаронида шуд; ###p < 0.001 дар муқоиса бо D0 ва ***p < 0.001 дар муқоиса бо D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比2弅包天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；##01；###p < 0.相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片， 培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001，与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы дар давоми 12 дней баъд аз культивирование барои ҳама 4 усули фарҳангӣ (контрол, TD, MC и MT) дар по сравнению бо свежими срезами сердца (D0) (n =/ односторонний Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контрол). c Гистограммае, ки миқдори ҷараёни глюкозаро дар 12 рӯзи пас аз парвариш барои ҳамаи 4 шароити парвариш (назорат, TD, MC ва MT) дар муқоиса бо қисматҳои тару тозаи дил (D0) нишон медиҳад (n = 6 қисмат/гурӯҳ, аз хукҳои гуногун, яктарафа. Санҷишҳои ANOVA гузаронида шуданд, ###p < 0.001 дар муқоиса бо D0, ***p < 0.001 дар муқоиса бо D12 (назорат).d Графикаҳои таҳлили штаммҳои бофтаҳои тару тоза (кабуд), рӯзи 12 MC (сабз) ва рӯзи 12 MT (сурх) дар даҳ нуқтаи буридани бофтаи минтақавӣ (n = 4 бурида/гурӯҳ, санҷиши яктарафа ANOVA; байни гурӯҳҳо фарқияти назаррас вуҷуд надошт). e Графикаи вулқон, ки генҳои ифодашудаи гуногунро дар қисматҳои тару тозаи дил (D0) дар муқоиса бо қисматҳои дил, ки дар шароити статикӣ (Ctrl) ё дар шароити MT (MT) барои 10-12 рӯз парвариш карда шудаанд, нишон медиҳад. f Харитаи гармии генҳои саркомер барои қисматҳои дил, ки дар ҳар як шароити парвариш парвариш карда шудаанд. Хатогиҳо миёнаи ± инҳирофи стандартиро нишон медиҳанд.
Вобастагии метаболикӣ аз гузариш аз оксидшавии кислотаи равғанӣ ба гликолиз аломати фарқкунандаи кардиомиоцитҳо мебошад. Кардиомиоцитҳои нопухта асосан глюкозаро барои истеҳсоли ATP истифода мебаранд ва митохондрияҳои гипопластикӣ бо кам будани кристалҳо доранд5,32. Таҳлили истифодаи глюкоза нишон дод, ки дар шароити MC ва MT, истифодаи глюкоза ба истифодаи бофтаҳои рӯзи 0 монанд буд (Расми 4c). Аммо, намунаҳои Ctrl афзоиши назарраси истифодаи глюкозаро дар муқоиса бо бофтаи тару тоза нишон доданд. Ин нишон медиҳад, ки якҷояшавии CTCM ва T3/Dex қобилияти бофтаро беҳтар мекунад ва фенотипи метаболикии қисматҳои дили 12-рӯзаро дар давоми парвариш нигоҳ медорад. Илова бар ин, таҳлили штамм нишон дод, ки сатҳи штамм дар шароити MT ва MS барои 12 рӯз мисли бофтаи тару тозаи дил боқӣ монд (Расми 4d).
Барои таҳлили таъсири умумии CTCM ва T3/Dex ба манзараи транскрипсияи ҷаҳонии бофтаи буриши дил, мо RNAseq-ро дар буришҳои дил аз ҳар чор шароити гуногуни парвариш анҷом додем (Маълумоти иловагӣ 1). Ҷолиб он аст, ки қисматҳои MT шабоҳати баланди транскрипсияро ба бофтаи тару тозаи дил нишон доданд, ки танҳо 16 аз 13,642 ген ба таври гуногун ифода карда шуданд. Аммо, тавре ки мо қаблан нишон додем, буришҳои Ctrl пас аз 10-12 рӯз дар парвариш 1229 гени ба таври гуногун ифодашударо нишон доданд (Расми 4e). Ин маълумотҳо бо ёрии qRT-PCR-и генҳои дил ва фибробласт тасдиқ карда шуданд (Расми иловагӣ 7a-c). Ҷолиб он аст, ки қисматҳои Ctrl пастшавии генҳои давраи дил ва ҳуҷайра ва фаъолшавии барномаҳои генҳои илтиҳобиро нишон доданд. Ин маълумотҳо нишон медиҳанд, ки дедифференсия, ки одатан пас аз парвариши дарозмуддат рух медиҳад, дар шароити MT комилан суст мешавад (Расми иловагӣ 8a,b). Таҳқиқоти бодиққати генҳои саркомер нишон дод, ки танҳо дар шароити MT генҳое, ки саркомерро (Расми 4f) ва канали ионро (Расми иловагӣ 9) рамзгузорӣ мекунанд, нигоҳ дошта мешаванд ва онҳоро аз пахшкунӣ дар шароити Ctrl, TD ва MC муҳофизат мекунанд. Ин маълумотҳо нишон медиҳанд, ки бо якҷояшавии ҳавасмандкунии механикӣ ва гуморалӣ (T3/Dex), транскриптомаи буриши дил пас аз 12 рӯз дар парвариш метавонад ба буришҳои тару тозаи дил монанд бошад.
Ин бозёфтҳои транскрипсионӣ бо он далел тасдиқ карда мешаванд, ки якпорчагии сохтории кардиомиоцитҳо дар қисматҳои дил беҳтарин дар шароити MT барои 12 рӯз нигоҳ дошта мешавад, чунон ки аз ҷониби коннексин 43 солим ва маҳаллишуда нишон дода шудааст (Расми 5a). Илова бар ин, фиброз дар қисматҳои дил дар шароити MT дар муқоиса бо Ctrl ва монанд ба қисматҳои тару тозаи дил ба таври назаррас коҳиш ёфтааст (Расми 5b). Ин маълумотҳо нишон медиҳанд, ки якҷояшавии ҳавасмандкунии механикӣ ва табобати T3/Dex сохтори дилро дар қисматҳои дил дар парвариш самаранок нигоҳ медорад.
Тасвирҳои иммунофлуоресцентии намояндагии тропонин-Т (сабз), коннексин 43 (сурх) ва DAPI (кабуд) дар қисматҳои навҷудошудаи дил (D0) ё дар тӯли 12 рӯз дар ҳар чор шароити парвариши қисмати дил (сатҳи миқёс = 100 µm) парвариш карда шудаанд. Миқдори зеҳни сунъӣ муайян кардани якпорчагии сохтории бофтаи дил (n = 7 (D0 ва D12 Ctrl), 5 бурида/гурӯҳ (D12 TD, D12 MC ва D12 MT) аз хукҳои гуногун, санҷиши яктарафаи ANOVA гузаронида мешавад; ####p < 0.0001 дар муқоиса бо D0 ва *p < 0.05, ё ****p < 0.0001 дар муқоиса бо D12 Ctrl). Миқдори зеҳни сунъӣ муайян кардани якпорчагии сохтории бофтаи дил (n = 7 (D0 ва D12 Ctrl), 5 бурида/гурӯҳ (D12 TD, D12 MC ва D12 MT) аз хукҳои гуногун, санҷиши яктарафаи ANOVA гузаронида мешавад; #### p < 0.0001 дар муқоиса бо D0 ва *p < 0.05, ё ****p < 0.0001 дар муқоиса бо D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллект (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ва D12 MT) срезов/группу аз разных свиней, проведенный p# # #ВА# 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 ё ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Муайян кардани миқдории якпорчагии сохтории бофтаи дил бо истифода аз зеҳни сунъӣ (n = 7 (D0 ва D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ва D12 MT) қисмат/гурӯҳ аз хукҳои гуногун, санҷиши яктарафаи ANOVA гузаронида шуд; #### p < 0.0001 дар муқоиса бо D0 ва *p < 0.05 ё ****p < 0.0001 дар муқоиса бо D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD,D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*5 減. 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 ） 12 mc人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05p 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。Муайян кардани миқдории якпорчагии сохтории бофтаи дил бо истифода аз зеҳни сунъӣ дар хукҳои гуногун (n = 7 (D0 ва D12 Ctrl), 5 (қисмҳо/гурӯҳҳои D12 TD, D12 MC ва D12 MT)) бо озмоиши яктарафаи ANOVA;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 ё ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 дар муқоиса бо D0 ва *p < 0.05 ё ****p < 0.0001 дар муқоиса бо D12 Ctrl). b Тасвирҳои намояндагӣ ва муайянкунии миқдорӣ барои буришҳои дил, ки бо ранги трихромии Массон ранг карда шудаанд (сатри миқёс = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ва D12 MC), 9 (D12 MT) буриш/гурӯҳ аз хукҳои гуногун, санҷиши яктарафаи ANOVA гузаронида мешавад; ####p < 0.0001 дар муқоиса бо D0 ва ***p < 0.001, ё ****p < 0.0001 дар муқоиса бо D12 Ctrl). b Тасвирҳои намояндагӣ ва муайянкунии миқдорӣ барои буришҳои дил, ки бо ранги трихромии Массон ранг карда шудаанд (сатри миқёс = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ва D12 MC), 9 (D12 MT) буриш/гурӯҳ аз хукҳои гуногун, санҷиши яктарафаи ANOVA гузаронида мешавад; ####p < 0.0001 дар муқоиса бо D0 ва ***p < 0.001, ё ****p < 0.0001 дар муқоиса бо D12 Ctrl). б Намояндагии изображения ва количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ва D12 MT разг12), 9 (с) свиней, выполняется односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 ё ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Тасвирҳои намояндагӣ ва муайян кардани миқдории қисматҳои дил, ки бо рангкунии трихромии Массон ранг карда шудаанд (сатри миқёс = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ва D12 MC), 9 қисмат/гурӯҳ (D12 MT) аз хукҳои гуногун, ANOVA-и яктарафа иҷро карда шудаанд; ####p < 0.0001 бар зидди D0 ва ***p < 0.001 ё ****p < 0.0001 бар зидди D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 μm）1（D1（0 = Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差）0#p#0#.与D0 相比，***p < 0,001，或****p <0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm（0dn = d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比，***p <0.0001 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 б Намояндагии изображения ва количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 аз MT) способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 ё ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Тасвирҳои намояндагӣ ва муайян кардани миқдории қисматҳои дил, ки бо трихроми Массон ранг карда шудаанд (сатри миқёс = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ва D12 MC), 9 қисмат (D12 MT) аз хукҳо/гурӯҳҳои гуногун, як усули ANOVA; ####p < 0.0001 дар муқоиса бо D0, ***p < 0.001 ё ****p < 0.0001 дар муқоиса бо D12 Ctrl).Хатогиҳо миёнаи ± инҳирофи стандартиро нишон медиҳанд.
Ниҳоят, қобилияти CTCM барои тақлид кардани гипертрофияи дил бо афзоиши кашиши бофтаи дил арзёбӣ карда шуд. Дар CTCM, фишори авҷи камераи ҳаво аз 80 мм симоб то 80 мм симоб зиёд шуд. Арт. (кашиши муқаррарӣ) то 140 мм симоб Арт. (Расми 6a). Ин ба афзоиши 32% кашиш мувофиқат мекунад (Расми 6b), ки қаблан ҳамчун кашиши фоизии мувофиқ барои қисматҳои дил барои ба даст овардани дарозии саркомера монанд ба гипертрофия нишон дода шуда буд. Дарозшавӣ ва суръати бофтаи дил ҳангоми кашиш ва истироҳат дар давоми шаш рӯзи парвариш доимӣ боқӣ монд (Расми 6c). Бофтаи дил аз шароити MT барои шаш рӯз ба кашиши муқаррарӣ (MT (Нормалӣ)) ё шароити аз ҳад зиёд кашиш (MT (OS)) дучор карда шуд. Аллакай пас аз чор рӯз дар парвариш, биомаркери гипертрофикии NT-ProBNP дар муҳити MT (OS) дар муқоиса бо шароити MT (нормалӣ) ба таври назаррас баланд шуд (Расми 7a). Илова бар ин, пас аз шаш рӯзи парвариш, андозаи ҳуҷайра дар MT (OS) (Расми 7б) дар муқоиса бо қисматҳои дили MT (муқаррарӣ) ба таври назаррас афзоиш ёфт. Илова бар ин, транслокатсияи ҳастаии NFATC4 дар бофтаҳои аз ҳад зиёд дарозшуда ба таври назаррас афзоиш ёфт (Расми 7в). Ин натиҷаҳо рушди прогрессивии ремоделизатсияи патологиро пас аз гиперкашиш нишон медиҳанд ва консепсияро дастгирӣ мекунанд, ки дастгоҳи CTCM метавонад ҳамчун платформа барои омӯзиши сигнализатсияи гипертрофияи дил, ки аз сабаби кашиш ба вуҷуд омадааст, истифода шавад.
Андозагириҳои фишори камераи ҳавоӣ, фишори камераи моеъ ва ҳаракати бофтаҳо тасдиқ мекунанд, ки фишори камера фишори камераи моеъро тағйир медиҳад ва боиси ҳаракати мувофиқи буриши бофта мегардад. b Каҷҳои фоизии дарозшавӣ ва суръати дарозшавӣ барои қисматҳои бофтаи муқаррарӣ дарозшуда (норанҷӣ) ва аз ҳад зиёд дарозшуда (кабуд). c Графики сутунӣ, ки вақти давраро (n = 19 бурида дар як гурӯҳ, аз хукҳои гуногун), вақти кашишхӯрӣ (n = 18-19 бурида дар як гурӯҳ, аз хукҳои гуногун), вақти истироҳат (n = 19 бурида дар як гурӯҳ, аз хукҳои гуногун), амплитудаи ҳаракати бофтаро (n = 14 бурида/гурӯҳ, аз хукҳои гуногун), суръати авҷи систоликӣ (n = 14 бурида/гурӯҳ, аз хукҳои гуногун) ва суръати авҷи истироҳат (n = 14 (D0), 15 (D6)) қисмат/гурӯҳҳо) аз хукҳои гуногун) нишон медиҳад, озмоиши t-и дудумаи Студент дар ягон параметр фарқияти назаррас нишон надод, ки нишон медиҳад, ки ин параметрҳо дар давоми 6 рӯзи парвариш бо шиддати аз ҳад зиёд доимӣ мондаанд. Хатогиҳо миёнаи ± инҳирофи стандартиро нишон медиҳанд.
a Графики сутунӣ миқдории консентратсияи NT-ProBNP дар муҳити парвариш аз буридаҳои дил, ки дар шароити дарозкунии муқаррарии MT (Norm) ё аз ҳад зиёд дарозкунӣ (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 бурида/гурӯҳ (D2 MTOS, D4 MTNorm ва D4 MTOS) аз хукҳои гуногун парвариш карда шудаанд, ANOVA-и дуҷониба иҷро карда мешавад; **p <0.01 дар муқоиса бо дарозкунии муқаррарӣ). a) Миқдори консентратсияи NT-ProBNP дар муҳити парвариш аз буридаҳои дил, ки дар шароити дарозкунии муқаррарии MT (Norm) ё аз ҳад зиёд дарозкунӣ (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm ва D4 MTOS) бурида/гурӯҳ аз хукҳои гуногун парвариш карда шудаанд, графики сутунӣ, ANOVA-и дуҷониба иҷро карда мешавад; **p <0.01 дар муқоиса бо дарозкунии муқаррарӣ).Гистограммаи миқдории консентратсияи NT-ProBNP дар муҳити парвариш аз буридаҳои дил, ки дар шароити муқаррарии дарозшавии MT (меъёр) ё аз ҳад зиёд дарозшавӣ (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm ва D4).MTOS) буридаҳо/гурӯҳ аз хукҳои гуногун парвариш карда шудаанд, таҳлили ду омилии дисперсия гузаронида шуд;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 дар муқоиса бо дарозшавии муқаррарӣ). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比， p < 0.01 Миқдори консентратсияи NT-ProBNP дар қисмҳои дил, ки дар шароити дарозии муқаррарии MT (Норм) ё аз ҳад зиёд (OS) парвариш карда мешаванд (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) аз гуногун猪的切片/组，可以双向方方发发动; **муқоиса бо дарозкунии муқаррарӣ, p <0,01).гистограмма Муайян кардани миқдории консентратсияи NT-ProBNP дар буришҳои дил, ки дар шароити муқаррарии дарозшавии MT (меъёр) ё аз ҳад зиёд дарозшавӣ (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) ва D4 MTOS) буришҳо/гурӯҳ аз хукҳои гуногун парвариш карда шудаанд, таҳлили дуҷонибаи дисперсия;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 дар муқоиса бо дарозшавии муқаррарӣ). b Тасвирҳои намояндагӣ барои буридаҳои дил, ки бо тропонин-T ва WGA ранг карда шудаанд (чап) ва миқдори ҳуҷайраҳо (рост) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ҳуҷайра/гурӯҳ аз 10 буридаи гуногун аз хукҳои гуногун, озмоиши t-и дудуми донишҷӯ гузаронида мешавад; ****p <0.0001 дар муқоиса бо дарозшавии муқаррарӣ). b Тасвирҳои намояндагӣ барои буридаҳои дил, ки бо тропонин-T ва WGA ранг карда шудаанд (чап) ва миқдори ҳуҷайраҳо (рост) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ҳуҷайра/гурӯҳ аз 10 буридаи гуногун аз хукҳои гуногун, озмоиши t-и дудуми Student гузаронида мешавад; ****p <0.0001 дар муқоиса бо дарозшавии муқаррарӣ). б Намояндагии изображенияҳои срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) ва количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) аз клеток/группҳо, два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Тасвирҳои намояндагии қисматҳои дил, ки бо тропонин-T ва AZP ранг карда шудаанд (чап) ва муайян кардани андозаи ҳуҷайра (рост) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ҳуҷайра/гурӯҳ аз 10 қисмати гуногун аз хукҳои гуногун, санҷиши t-и Стюденти дудумӣ гузаронида шуд; ****p <0.0001 дар муқоиса бо штамми муқаррарӣ). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的心脏切片的心脏切片的代表切片的代表切片的代表） MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾t学检验；与正常拉伸相比，****p <0,0001）。 b Тасвирҳои намояндагии буришҳои дил, ки бо калькареин-Т ва WGA ранг карда шудаанд (чап) ва андозаи ҳуҷайра (рост) (n = 330 (D6 MTOS), 369 аз 10 буриши гуногун (D6 MTNorm)) Ҳуҷайраҳо/санҷиши сунъӣ; дар муқоиса бо дарозшавии муқаррарӣ,****p < 0.0001). б Намояндагии изображенияҳои срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) ва количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) аз 10 срезиҷӣ, двусторонние меъёр Стьюдента; b Тасвирҳои намояндагии қисматҳои дил, ки бо тропонин-T ва AZP ранг карда шудаанд (чап) ва муайян кардани андозаи ҳуҷайра (рост) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) аз 10 қисмати гуногун аз хукҳои гуногун) Ҳуҷайраҳо/гурӯҳ, меъёри дуҷуфт t-и Стюдент; ****p < 0.0001 дар муқоиса бо шиддати муқаррарӣ). c Тасвирҳои намояндагӣ барои буришҳои дили MTOS дар рӯзи 0 ва рӯзи 6, ки барои тропонин-T ва NFATC4 иммуноглобулин карда шудаанд ва миқдори транслокатсияи NFATC4 ба ядроҳои CMs (n = 4 (D0), 3 буриш/гурӯҳ (D6 MTOS) аз хукҳои гуногун, озмоиши t-и дудуми Student гузаронида мешавад; *p <0.05). c Тасвирҳои намояндагӣ барои буришҳои дили MTOS дар рӯзи 0 ва рӯзи 6, ки барои тропонин-T ва NFATC4 иммуноглобулин карда шудаанд ва миқдори транслокатсияи NFATC4 ба ядроҳои CMs (n = 4 (D0), 3 буриш/гурӯҳ (D6 MTOS) аз хукҳои гуногун, озмоиши t-и дудуми Student гузаронида мешавад; *p <0.05). в Намояндагии изображения барои сердца 0 ва 6 дней MTOS, иммуномеченых барои тропонина-Т ва NFATC4, ва количественная осенка транслокации NFATC4 дар ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (срезгов MTOS) , выполняется дувусторонний t-критерий Стьюдента *p < 0,05); c Тасвирҳои намояндагӣ барои буришҳои дил дар рӯзҳои 0 ва 6-уми MTOS, ки барои тропонин-T ва NFATC4 иммуноглобулин карда шудаанд ва миқдори транслокатсияи NFATC4 дар ядрои ҳуҷайраҳои кавернозӣ (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) бурида/гурӯҳ аз хукҳои гуногун), ки озмоиши дуҷонибаи t-и Студентро анҷом доданд; *p <0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化！D3D (MT4（6) =切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)。 c Тасвирҳои намояндагии калканин-Т ва NFATC4 иммунолабелинги 第0天和第6天MTOS буридаҳои дил ва NFATC4 аз ядрои ҳуҷайраҳои гуногуни NFATC4 易位至CM миқдори 化 (n = 4 (D0), 3 爻 D)时间双尾学生et 电影；*p <0,05). в Намояндагии изображения срезов сердца MTOS дар 0 ва 6 день барои иммуномаркировки тропонином-Т ва NFATC4 ва количественная осенка транслокации NFATC4 дар ядра CM аз ҳар як свиней (n = 4 (D0), 3 (D6/MTOS), t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c Тасвирҳои намояндагии буришҳои дили MTOS дар рӯзҳои 0 ва 6 барои иммуноглобулинии тропонин-T ва NFATC4 ва муайян кардани миқдори транслокатсияи NFATC4 дар ядрои CM аз хукҳои гуногун (n = 4 (D0), 3 буриш/гурӯҳ (D6 MTOS), меъёри дуқутбаи t аз рӯи меъёри Студент; *p <0.05).Хатогиҳо инҳирофи миёна ± стандартиро нишон медиҳанд.
Тадқиқоти транслятсионӣ дар дилу рагҳо ба моделҳои ҳуҷайравӣ ниёз доранд, ки муҳити дилро дақиқ такрор мекунанд. Дар ин таҳқиқот, дастгоҳи CTCM таҳия ва тавсиф карда шуд, ки метавонад қисматҳои ултра тунуки дилро ҳавасманд кунад. Системаи CTCM ҳавасмандкунии электромеханикии ҳамоҳангшудаи физиологӣ ва ғанӣ гардонидани моеъи T3 ва Dex-ро дар бар мегирад. Вақте ки қисматҳои дили хук ба ин омилҳо дучор шуданд, қобилияти зинда мондан, якпорчагии сохторӣ, фаъолияти метаболикӣ ва ифодаи транскрипсионии онҳо пас аз 12 рӯзи парвариш ҳамон тавре ки дар бофтаи тару тозаи дил боқӣ монданд. Илова бар ин, дарозшавии аз ҳад зиёди бофтаи дил метавонад боиси гипертрофияи дил гардад, ки аз гиперэкстензия ба вуҷуд меояд. Умуман, ин натиҷаҳо нақши муҳими шароити парвариши физиологиро дар нигоҳ доштани фенотипи муқаррарии дил дастгирӣ мекунанд ва барои скрининги доруворӣ замина фароҳам меоранд.
Омилҳои зиёде ба фароҳам овардани муҳити оптималӣ барои фаъолият ва зинда мондани кардиомиоситҳо мусоидат мекунанд. Равшантарин омилҳо бо (1) таъсири мутақобилаи байниҳуҷайравӣ, (2) ҳавасмандкунии электромеханикӣ, (3) омилҳои гуморалӣ ва (4) субстратҳои метаболикӣ алоқаманданд. Таъсири мутақобилаи физиологии ҳуҷайра ба ҳуҷайраҳо ба шабакаҳои мураккаби сеченака аз намудҳои сершумори ҳуҷайраҳо, ки аз ҷониби матритсаи берун азҳуҷайравӣ дастгирӣ мешаванд, ниёз дорад. Чунин таъсири мутақобилаи мураккаби ҳуҷайравӣ бо роҳи ҳампарвариши намудҳои алоҳидаи ҳуҷайраҳо дар in vitro барқарор кардан душвор аст, аммо бо истифода аз хусусияти органотипии қисматҳои дил ба осонӣ ба даст овардан мумкин аст.
Дароз кардани механикӣ ва ҳавасмандкунии электрикии кардиомиоситҳо барои нигоҳ доштани фенотипи дил муҳиманд33,34,35. Дар ҳоле ки ҳавасмандкунии механикӣ барои кондитсионерӣ ва пухта расидани hiPSC-CM ба таври васеъ истифода шудааст, якчанд таҳқиқоти зебо ба наздикӣ ҳавасмандкунии механикии буридаҳои дилро дар фарҳанг бо истифода аз боркунии якҷониба санҷидаанд. Ин таҳқиқот нишон медиҳанд, ки боркунии механикии якҷониба дар ду андоза ба фенотипи дил ҳангоми парвариш таъсири мусбат мерасонад. Дар ин таҳқиқот, қисматҳои дил ё бо қувваҳои кашиши изометрӣ17, боркунии ауксотинии хаттӣ18 пур карда шуданд ё давраи дил бо истифода аз бозгашти трансдюсери қувва ва ангезаҳои шиддат аз нав сохта шуд. Аммо, ин усулҳо аз дарозкунии бофтаи якҷониба бидуни оптимизатсияи муҳити зист истифода мебаранд, ки боиси саркӯбии бисёр генҳои дил ё аз ҳад зиёд ифода ёфтани генҳо, ки бо вокунишҳои ғайримуқаррарии дарозкунӣ алоқаманданд, мегардад. CTCM, ки дар ин ҷо тавсиф шудааст, ангезаи электромеханикии сеандозаро пешниҳод мекунад, ки давраи табиии дилро аз ҷиҳати вақти давра ва дарозкунии физиологӣ (25% дарозкунӣ, 40% систола, 60% диастола ва 72 зарба дар як дақиқа) тақлид мекунад. Гарчанде ки ин ҳавасмандкунии механикии сеченака танҳо барои нигоҳ доштани якпорчагии бофта кофӣ нест, барои нигоҳ доштани қобилияти кофӣ барои зинда мондан, функсия ва якпорчагии бофтаҳо якҷоя кардани ҳавасмандкунии гуморалӣ ва механикӣ бо истифода аз T3/Dex зарур аст.
Омилҳои гуморалӣ дар танзими фенотипи дили калонсолон нақши муҳим мебозанд. Ин дар таҳқиқоти HiPS-CM қайд карда шуд, ки дар онҳо T3 ва Dex ба муҳити парвариш барои суръат бахшидан ба пухта расидани ҳуҷайраҳо илова карда шуданд. T3 метавонад ба интиқоли аминокислотаҳо, шакар ва калсий тавассути мембранаҳои ҳуҷайра таъсир расонад36. Илова бар ин, T3 ифодаи MHC-α ва пастшавии MHC-β-ро мусоидат мекунад ва ташаккули миофибриллаҳои зудкашидаро дар кардиомиоцитҳои пухта дар муқоиса бо миофибриллаҳои сусткашида дар CM-и ҷанин мусоидат мекунад. Норасоии T3 дар беморони гирифтори гипотиреоз боиси аз даст додани бандҳои миофибриллӣ ва коҳиши суръати инкишофи тонуси бадан мегардад37. Dex ба ретсепторҳои глюкокортикоид таъсир мерасонад ва нишон дода шудааст, ки кашишхӯрии миокардро дар дилҳои ҷудогонаи перфузияшуда зиёд мекунад;38 ин беҳбудӣ бо таъсир ба воридшавии калсий вобаста аст (SOCE)39,40. Илова бар ин, Dex ба ретсепторҳои худ пайваст мешавад ва вокуниши васеи дохилиҳуҷайравиро ба вуҷуд меорад, ки функсияи иммунӣ ва илтиҳобро пахш мекунад30.
Натиҷаҳои мо нишон медиҳанд, ки ҳавасмандкунии механикии физикӣ (MS) дар муқоиса бо Ctrl самаранокии умумии парваришро беҳтар кард, аммо дар тӯли 12 рӯз дар парвариш қобилияти зинда мондан, якпорчагии сохторӣ ва ифодаи дилро нигоҳ надошт. Дар муқоиса бо Ctrl, илова кардани T3 ва Dex ба фарҳангҳои CTCM (MT) қобилияти зинда монданро беҳтар кард ва профилҳои шабеҳи транскрипсия, якпорчагии сохторӣ ва фаъолияти метаболикиро бо бофтаи тару тозаи дил барои 12 рӯз нигоҳ дошт. Илова бар ин, бо назорати дараҷаи дарозшавии бофта, модели гипертрофияи дил, ки аз гиперэкстензия ба вуҷуд омадааст, бо истифода аз STCM сохта шуд, ки чандирии системаи STCM-ро нишон медиҳад. Бояд қайд кард, ки гарчанде ки аз нав сохтан ва фиброз одатан узвҳои солимро дар бар мегирад, ки ҳуҷайраҳои гардиши онҳо метавонанд ситокинҳои мувофиқ, инчунин фагоцитоз ва дигар омилҳои аз нав сохташавандаро таъмин кунанд, қисматҳои дил метавонанд раванди фибротикиро дар посух ба стресс ва осеб тақлид кунанд. ба миофибробластҳо. Ин қаблан дар ин модели буриши дил арзёбӣ шуда буд. Бояд қайд кард, ки параметрҳои CTCM-ро метавон бо тағир додани амплитудаи фишор/электрикӣ ва басомад барои тақлид кардани бисёр ҳолатҳо, ба монанди тахикардия, брадикардия ва дастгирии механикии гардиши хун (дили механикии бебор), танзим кард. Ин системаро барои санҷиши маводи мухаддир ба як иқтидори миёна табдил медиҳад. Қобилияти CTCM барои моделсозии гипертрофияи дил, ки аз фишори аз ҳад зиёд ба вуҷуд омадааст, роҳро барои санҷиши ин система барои терапияи фардӣ ҳамвор мекунад. Хулоса, таҳқиқоти мазкур нишон медиҳад, ки кашиши механикӣ ва ҳавасмандкунии гуморалӣ барои нигоҳ доштани парвариши қисмҳои бофтаи дил муҳиманд.
Гарчанде ки маълумоти дар ин ҷо овардашуда нишон медиҳанд, ки CTCM як платформаи хеле умедбахш барои моделсозии миокардии солим аст, ин усули парвариш баъзе маҳдудиятҳо дорад. Маҳдудияти асосии парвариши CTCM дар он аст, ки он ба буришҳо фишорҳои механикии динамикии пайвастаро ворид мекунад, ки имконияти назорати фаъолонаи кашишхӯрии буришҳои дилро дар давоми ҳар як давра маҳдуд мекунад. Илова бар ин, аз сабаби андозаи хурди буришҳои дил (7 мм), имконияти арзёбии функсияи систоликӣ берун аз системаҳои парвариш бо истифода аз сенсорҳои анъанавии қувва маҳдуд аст. Дар дастнависи ҷорӣ, мо ин маҳдудиятро қисман бо арзёбии шиддати оптикӣ ҳамчун нишондиҳандаи функсияи кашишхӯрӣ бартараф мекунем. Аммо, ин маҳдудият кори бештарро талаб мекунад ва метавонад дар оянда бо ҷорӣ кардани усулҳои мониторинги оптикии функсияи буришҳои дил дар парвариш, ба монанди харитасозии оптикӣ бо истифода аз рангҳои калсий ва ҳассос ба шиддат, ҳал карда шавад. Маҳдудияти дигари CTCM дар он аст, ки модели корӣ стресси физиологиро (пеш аз боркунӣ ва пас аз боркунӣ) идора намекунад. Дар CTCM, фишор дар самтҳои муқобил ба вуҷуд оварда шуд, то кашиши физиологии 25% дар диастола (кашиши пурра) ва систола (дарозии кашишхӯрӣ ҳангоми ҳавасмандкунии барқӣ) дар бофтаҳои хеле калон такрор шавад. Ин маҳдудият бояд дар тарҳҳои ояндаи CTCM бо роҳи фишори кофӣ ба бофтаи дил аз ҳарду тараф ва бо татбиқи муносибатҳои дақиқи фишор-ҳаҷм, ки дар камераҳои дил ба амал меоянд, бартараф карда шавад.
Таҷдиди сохтори аз ҳад зиёд дарозшавӣ, ки дар ин дастнавис гузориш шудааст, танҳо ба тақлид кардани сигналҳои гипертрофии гипертрофӣ маҳдуд аст. Ҳамин тариқ, ин модел метавонад дар омӯзиши сигнализатсияи гипертрофии аз кашиш ба вуҷуд омада бидуни ниёз ба омилҳои гуморалӣ ё асабӣ (ки дар ин система вуҷуд надоранд) кӯмак расонад. Барои афзоиши сершумории CTCM таҳқиқоти минбаъда лозиманд, масалан, парвариши якҷоя бо ҳуҷайраҳои иммунӣ, омилҳои гуморалии плазмаи гардишкунанда ва иннерватсия ҳангоми парвариши якҷоя бо ҳуҷайраҳои нейронӣ имконоти моделсозии бемориро бо CTCM беҳтар мекунад.
Дар ин таҳқиқот сездаҳ хук истифода шуданд. Ҳамаи амалиётҳои ҳайвонот мувофиқи дастурҳои муассисавӣ анҷом дода шуданд ва аз ҷониби Кумитаи нигоҳубин ва истифодаи муассисавии ҳайвоноти Донишгоҳи Луисвил тасдиқ карда шуданд. Қавси аорта маҳкам карда шуд ва ба дил 1 литр кардиоплегияи стерилӣ (110 мМ NaCl, 1.2 мМ CaCl2, 16 мМ KCl, 16 мМ MgCl2, 10 мМ NaHCO3, 5 U/mL гепарин, рН то 7.4) перфузия карда шуд; Дилҳо дар маҳлули кардиоплегикии яхбаста то интиқол ба лаборатория дар рӯи ях, ки одатан камтар аз 10 дақиқа давом мекунад, нигоҳ дошта мешуданд. Дилҳо дар маҳлули кардиоплегикии яхбаста то интиқол ба лаборатория дар рӯи ях, ки одатан камтар аз 10 дақиқа давом мекунад, нигоҳ дошта мешуданд. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе то транспортировка дар лабораторию дар льду, ки дар бораи занимает <10 мин. Дилҳо дар маҳлули кардиоплегикии яхбаста то интиқол ба лаборатория дар рӯи ях, ки одатан камтар аз 10 дақиқа вақтро мегирад, нигоҳ дошта мешуданд.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10刂钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10刂钟 Держите сердца в ледяной кардиоплегии барои наклиёт дар лабораторию дар льду, обычно <10 мин. Дилҳоро дар болои ях нигоҳ доред, то он даме, ки кардиоплегияро ба лаборатория дар болои ях интиқол диҳед, одатан <10 дақиқа.
Дастгоҳи CTCM дар нармафзори тарроҳии компютерии SolidWorks (CAD) таҳия шудааст. Камераҳои кишт, тақсимкунандагон ва камераҳои ҳавоӣ аз пластики акрилии шаффофи CNC сохта шудаанд. Ҳалқаи эҳтиётии диаметри 7 мм дар марказ аз полиэтилени зичии баланд (HDPE) сохта шудааст ва дорои чуқурии ҳалқаи O мебошад, ки ҳалқаи O-ро ҷойгир мекунад, ки барои мӯҳр кардани муҳити зери он истифода мешавад. Мембранаи тунуки силикон камераи киштро аз лавҳаи ҷудокунанда ҷудо мекунад. Мембранаи силикон аз варақаи силиконии ғафсии 0.02 дюйм бо лазер бурида шудааст ва сахтии 35А дорад. Прокладкаҳои силиконии поёнӣ ва болоӣ аз варақаи силиконии ғафсии 1/16 дюйм бо лазер бурида шудаанд ва сахтии 50А доранд. Винтҳо ва гайкаҳои болҳои 316L аз пӯлоди зангногир барои мустаҳкам кардани блок ва эҷоди мӯҳри ҳавоногузар истифода мешаванд.
Тахтаи схемаи чопии махсус (PCB) барои ҳамгироӣ бо системаи C-PACE-EM тарҳрезӣ шудааст. Розеткаҳои пайвасткунандаи мошини швейтсарӣ дар тахтаи электронии PCB бо истифода аз симҳои мисии нуқрагин ва винтҳои биринҷии 0-60, ки ба электродҳо печонида шудаанд, ба электродҳои графитӣ пайваст карда шудаанд. Тахтаи схемаи чопӣ дар муқоваи принтери 3D ҷойгир карда шудааст.
Дастгоҳи CTCM аз ҷониби як фаъолкунандаи пневматикӣ (PPD) идора карда мешавад, ки фишори гардиши гардиши идорашавандаро ба монанди давраи дил эҷод мекунад. Ҳангоми афзоиши фишор дар дохили камераи ҳаво, мембранаи чандири силикон ба боло васеъ мешавад ва муҳитро дар зери минтақаи бофта маҷбур мекунад. Сипас, минтақаи бофта бо ин ихроҷи моеъ дароз карда мешавад, ки васеъшавии физиологии дилро ҳангоми диастола тақлид мекунад. Дар авҷи истироҳат, ҳавасмандкунии электрикӣ тавассути электродҳои графитӣ татбиқ карда шуд, ки фишорро дар камераи ҳаво коҳиш дод ва боиси кашишхӯрии қисмҳои бофта гардид. Дар дохили қубур клапани гемостатик бо сенсори фишор барои муайян кардани фишор дар системаи ҳаво мавҷуд аст. Фишори аз ҷониби сенсори фишор муайяншуда ба коллекторе, ки ба ноутбук пайваст аст, татбиқ карда мешавад. Ин имкон медиҳад, ки фишор дар дохили камераи газ мунтазам назорат карда шавад. Вақте ки фишори максималии камера ба даст омад (стандартии 80 мм симоб, 140 мм симоб OS), ба дастгоҳи ҷамъоварии маълумот фармон дода шуд, ки ба системаи C-PACE-EM сигнал фиристад, то сигнали шиддати дуфазаро барои 2 мс, ки ба 4 В муқаррар шудааст, тавлид кунад.
Буридаҳои дил гирифта шуданд ва шароити парвариш дар 6 чоҳ чунин анҷом дода шуданд: Дилҳои ҷамъовардашударо аз зарфи интиқол ба табақчае, ки кардиоплегияи хунук (4°C) дорад, интиқол диҳед. Меъдаи чап бо теғи стерилизатсияшуда ҷудо карда шуда, ба қисмҳои 1-2 см3 бурида шуд. Ин блокҳои бофта бо часпаки бофта ба такягоҳҳои бофта пайваст карда шуданд ва дар ваннаи бофтаи микротомии ларзишӣ, ки дорои маҳлули Тирод буд, ҷойгир карда шуданд ва пайваста оксиген карда шуданд (3 г/л 2,3-бутандион монооксим (BDM), 140 мМ NaCl (8.18 г), 6 мМ KCl (0.447 г), 10 мМ D-глюкоза (1.86 г), 10 мМ HEPES (2.38 г), 1 мМ MgCl2 (1 мл маҳлули 1 М), 1.8 мМ CaCl2 (1.8 мл маҳлули 1 М), то 1 л ddH2O). Микротоми ларзишӣ барои буридани буридани буришҳои ғафсии 300 мкм бо басомади 80 Гц, амплитудаи ларзиши уфуқии 2 мм ва суръати пешрафти 0,03 мм/с муқаррар карда шуд. Ҳаммоми бофта бо ях иҳота шуда буд, то маҳлул хунук бошад ва ҳарорат дар 4°C нигоҳ дошта мешуд. Қисмҳои бофтаро аз ҳаммоми микротом ба ҳаммоми инкубатсионӣ, ки дорои маҳлули пайваста оксигеншудаи Тирод дар ях аст, то он даме ки қисматҳои кофӣ барои як лавҳаи кишт ба даст оварда шаванд, интиқол диҳед. Барои киштҳои трансвеллӣ, қисматҳои бофта ба такягоҳҳои полиуретании стерилизатсияшудаи 6 мм паҳноӣ пайваст карда шуда, дар 6 мл муҳити оптималӣ (199 муҳити 199, 1x иловаи ITS, 10% FBS, 5 нг/мл VEGF, 10 нг/мл FGF-ишқорӣ ва 2X антибиотик-зиддизамбӯруғӣ) ҷойгир карда шуданд. Ҳавасмандкунии электрикӣ (10 В, басомади 1,2 Гц) ба қисматҳои бофта тавассути C-Pace татбиқ карда шуд. Барои шароити TD, T3 ва Dex-и тару тоза дар ҳар як ивазшавии муҳит дар 100 нМ ва 1 мкМ илова карда шуданд. Муҳит пеш аз иваз кардан 3 маротиба дар як рӯз бо оксиген сер карда мешавад. Қисмҳои бофта дар инкубатор дар ҳарорати 37°C ва 5% CO2 парвариш карда шуданд.
Барои парвариши CTCM, қисмҳои бофта дар принтери 3D-и фармоишӣ дар косаи Петри, ки дорои маҳлули тағйирёфтаи Тирод буд, ҷойгир карда шуданд. Дастгоҳ барои зиёд кардани андозаи буридаи дил ба андозаи 25% масоҳати ҳалқаи такягоҳ тарҳрезӣ шудааст. Ин кор барои он анҷом дода мешавад, ки қисмҳои дил пас аз интиқол аз маҳлули Тирод ба муҳити атроф ва ҳангоми диастола дароз нашаванд. Бо истифода аз часпаки гистоакрилӣ, қисмҳои ғафсии 300 мкм дар ҳалқаи такягоҳ бо диаметри 7 мм мустаҳкам карда шуданд. Пас аз пайваст кардани қисмҳои бофта ба ҳалқаи такягоҳ, қисмҳои зиёдатии бофтаро буред ва қисмҳои бофтаи пайвастшударо дубора ба ваннаи маҳлули Тирод дар ях (4°C) ҷойгир кунед, то он даме ки қисмҳои кофӣ барои як дастгоҳ омода карда шаванд. Вақти умумии коркард барои ҳамаи дастгоҳҳо набояд аз 2 соат зиёд бошад. Пас аз пайваст кардани 6 қисмати бофта ба ҳалқаҳои такягоҳашон, дастгоҳи CTCM васл карда шуд. Камераи парвариши CTCM бо муҳити пешакӣ оксигеншудаи 21 мл пешакӣ пур карда шудааст. Қисмҳои бофтаро ба камераи парвариш интиқол диҳед ва ҳама гуна ҳубобчаҳои ҳаворо бо пипетка бодиққат тоза кунед. Сипас қисмати бофта ба сӯрох равона карда шуда, оҳиста ба ҷои худ пахш карда мешавад. Дар ниҳоят, сарпӯши электродро ба дастгоҳ гузоред ва дастгоҳро ба инкубатор интиқол диҳед. Сипас CTCM-ро ба найчаи ҳаво ва системаи C-PACE-EM пайваст кунед. Фаъолкунандаи пневматикӣ кушода мешавад ва клапани ҳаво CTCM-ро мекушояд. Системаи C-PACE-EM барои интиқоли 4 В дар 1,2 Гц ҳангоми суръати дуфаза барои 2 мс танзим карда шудааст. Муҳит ду маротиба дар як рӯз иваз карда мешуд ва электродҳо як маротиба дар як рӯз иваз карда мешуданд, то аз ҷамъшавии графит дар электродҳо пешгирӣ карда шавад. Дар ҳолати зарурӣ, қисмҳои бофтаро аз чоҳҳои парвариши худ хориҷ кардан мумкин аст, то ҳама гуна ҳубобчаҳои ҳавоеро, ки метавонанд ба зери онҳо афтанд, берун кунанд. Барои шароити коркарди MT, T3/Dex бо ҳар як иваз кардани муҳит бо 100 нМ T3 ва 1 мкМ Dex тару тоза илова карда мешуд. Дастгоҳҳои CTCM дар инкубатор дар ҳарорати 37°C ва 5% CO2 парвариш карда мешуданд.
Барои ба даст овардани траекторияҳои дарозшудаи буришҳои дил, системаи махсуси камера таҳия карда шуд. Камераи SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Токио, Ҷопон) бо линзаи макрои Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, Сан-Франсиско, Калифорния) истифода шуд. Тасвиркунӣ пас аз иваз кардани васила бо васила дар ҳарорати хонагӣ анҷом дода шуд. Камера дар кунҷи 51° ҷойгир карда шудааст ва видео бо суръати 30 кадр дар як сония сабт карда мешавад. Аввалан, нармафзори кушодаасос (MUSCLEMOTION43) бо Image-J барои муайян кардани ҳаракати буришҳои дил истифода шуд. Ниқоб бо истифода аз MATLAB (MathWorks, Natick, MA, ИМА) барои муайян кардани минтақаҳои таваҷҷӯҳ барои зарбаи буришҳои дил барои пешгирӣ аз садо сохта шудааст. Ниқобҳои дастӣ ба ҳамаи тасвирҳо дар пайдарпайии кадр татбиқ карда мешаванд ва сипас ба плагини MUSCLEMOTION интиқол дода мешаванд. Muscle Motion шиддати миёнаи пикселҳоро дар ҳар як кадр барои муайян кардани ҳаракати он нисбат ба кадри истинод истифода мебарад. Маълумот сабт, филтр ва барои муайян кардани вақти давра ва арзёбии дарозшавии бофтаҳо дар давраи дил истифода шуданд. Видеои сабтшуда бо истифода аз филтри рақамии дараҷаи сифрии дараҷаи аввал коркард карда шуд. Барои муайян кардани дарозшавии бофтаҳо (аз қулла ба қулла), таҳлили қулла ба қулла барои фарқ кардани қуллаҳо ва пастшавии сигнали сабтшуда анҷом дода шуд. Илова бар ин, коҳиши тамоюл бо истифода аз полиномияи дараҷаи 6 барои бартараф кардани гардиши сигнал анҷом дода мешавад. Рамзи барнома дар MATLAB барои муайян кардани ҳаракати глобалии бофтаҳо, вақти давра, вақти истироҳат ва вақти кашишхӯрӣ таҳия шудааст (Рамзи иловагии барнома 44).
Барои таҳлили шиддат, бо истифода аз ҳамон видеоҳое, ки барои арзёбии механикии кашиш таҳия шудаанд, мо аввал ду тасвиреро пайгирӣ кардем, ки қуллаҳои ҳаракатро (нуқтаҳои баландтарин (болоӣ) ва пасттарин (поёнтар)-и ҳаракат) мувофиқи нармафзори MUSCLEMOTION нишон медиҳанд. Сипас мо минтақаҳои бофтаро сегмент кардем ва як шакли алгоритми соякуниро ба бофтаи сегментшуда татбиқ кардем (Расми иловагии 2a). Сипас бофтаи сегментшуда ба даҳ қабати зеризаминӣ тақсим карда шуд ва фишор дар ҳар як сатҳ бо истифода аз муодилаи зерин ҳисоб карда шуд: Strain = (Sup-Sdown)/Sdown, ки дар он Sup ва Sdown мутаносибан масофаи шакл аз сояҳои боло ва поёнии матоъ мебошанд (Расми иловагии 2b).
Қисмҳои дил дар 4% параформалдегид ба муддати 48 соат фиксатсия карда шуданд. Бофтаҳои фиксатсияшуда дар 10% ва 20% сахароза ба муддати 1 соат хушк карда шуданд ва сипас дар 30% сахароза шабона хушк карда шуданд. Сипас, қисмҳо дар пайвастагии ҳарорати оптималии буридан (пайвастагии OCT) ҷойгир карда шуданд ва тадриҷан дар ваннаи изопентан/яхи хушк ях карда шуданд. Блокҳои ҷойгиркунии OCT-ро дар -80 °C то ҷудошавӣ нигоҳ доред. Слайдҳо ҳамчун қисмҳо бо ғафсии 8 мкм омода карда шуданд.
Барои хориҷ кардани OCT аз қисматҳои дил, слайдҳоро дар блоки гармидиҳӣ дар 95 °C барои 5 дақиқа гарм кунед. Ба ҳар як слайд 1 мл PBS илова кунед ва дар ҳарорати хонагӣ барои 30 дақиқа инкубатсия кунед, сипас қисматҳоро бо гузоштани 0,1% Triton-X дар PBS барои 15 дақиқа дар ҳарорати хонагӣ пур кунед. Барои пешгирӣ аз пайвастшавии антителоҳои ғайримушаххас ба намуна, 1 мл маҳлули 3% BSA-ро ба слайдҳо илова кунед ва дар ҳарорати хонагӣ барои 1 соат инкубатсия кунед. Сипас BSA хориҷ карда шуд ва слайдҳо бо PBS шуста шуданд. Ҳар як намунаро бо қалам қайд кунед. Антителоҳои аввалия (1:200 дар 1% BSA омехта кардашуда) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) ва тропонин-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) дар тӯли 90 дақиқа илова карда шуданд, сипас антителоҳои дуюмдараҷа (1:200 дар 1% BSA омехта кардашуда) бар зидди муш Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), бар зидди харгӯш Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) барои 90 дақиқаи иловагӣ илова карда шуданд. 3 маротиба бо PBS шуста шуд. Барои фарқ кардани рангкунии ҳадаф аз замина, мо танҳо антителои дуюмдараҷаро ҳамчун назорат истифода бурдем. Дар ниҳоят, рангкунии ҳастаии DAPI илова карда шуд ва слайдҳо дар майдони vectashield (Vector Laboratories) ҷойгир карда шуданд ва бо лаки нохун мӯҳр карда шуданд. -x калонкунӣ) ва микроскопи Keyence бо 40x калонкунӣ.
Барои рангкунии WGA WGA Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) бо миқдори 5 мкг/мл дар PBS истифода шуд ва ба қисмҳои собит барои 30 дақиқа дар ҳарорати хонагӣ молида шуд. Сипас слайдҳо бо PBS шуста шуданд ва ба ҳар як слайд сиёҳи Судан илова карда шуд ва барои 30 дақиқа инкубатсия карда шуд. Сипас слайдҳо бо PBS шуста шуданд ва муҳити ҷойгиркунии векташиелд илова карда шуд. Слайдҳо дар микроскопи Кейнс бо бузургии 40x намоиш дода шуданд.
ОКТ аз намунаҳо тавре ки дар боло тавсиф шудааст, хориҷ карда шуд. Пас аз хориҷ кардани ОКТ, слайдҳоро як шабонарӯз дар маҳлули Буин тар кунед. Сипас слайдҳо бо оби тозашуда ба муддати 1 соат шуста шуданд ва сипас ба муддати 10 дақиқа дар маҳлули фуксин кислотаи алои Бибрих ҷойгир карда шуданд. Сипас слайдҳо бо оби тозашуда шуста шуданд ва ба муддати 10 дақиқа дар маҳлули 5% фосфомолибден/5% кислотаи фосфовольфрам ҷойгир карда шуданд. Бе шустан, слайдҳоро мустақиман ба маҳлули кабуди анилин ба муддати 15 дақиқа интиқол диҳед. Сипас слайдҳо бо оби тозашуда шуста шуданд ва ба маҳлули 1% кислотаи сирко ба муддати 2 дақиқа ҷойгир карда шуданд. Слайдҳо дар этаноли 200 Н хушк карда шуда, ба ксилол интиқол дода шуданд. Слайдҳои рангкардашуда бо истифода аз микроскопи Кейнс бо объективи 10x тасвир карда шуданд. Фоизи майдони фиброз бо истифода аз нармафзори Кейнс Анализатор муайян карда шуд.
Таҳлили қобилияти ҳуҷайраҳои CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния), рақами каталоги V13154, мувофиқи протоколи истеҳсолкунанда бо баъзе тағйирот. Аз ҷумла, барои таъмини андозаи якхелаи бофта ҳангоми таҳлили MTT, як сӯрохи ҷарроҳӣ бо диаметри 6 мм истифода шуд. Бофтаҳо мувофиқи протоколи истеҳсолкунанда ба чоҳҳои табақи 12-чоҳӣ, ки дорои субстрати MTT буд, алоҳида часпонида шуданд. Қисмҳо дар ҳарорати 37°C ба муддати 3 соат инкубатсия карда мешаванд ва бофтаи зинда субстрати MTT-ро метаболиз мекунад, то пайвастагии формазани арғувониро ташкил диҳад. Маҳлули MTT-ро бо 1 мл DMSO иваз кунед ва дар ҳарорати 37°C ба муддати 15 дақиқа инкубатсия кунед, то формазани арғувониро аз қисматҳои дил истихроҷ кунед. Намунаҳо дар табақҳои поёнии 96-чоҳӣ бо таносуби 1:10 дар DMSO ҳал карда шуданд ва шиддати ранги арғувонӣ дар 570 нм бо истифода аз хонандаи табақи Cytation (BioTek) чен карда шуд. Хонданҳо ба вазни ҳар як буридаи дил ба меъёр дароварда шуданд.
Муҳити буриши дил бо муҳитҳое, ки дорои 1 μCi/мл [5-3H]-глюкоза (Moravek Biochemicals, Brea, CA, ИМА) буданд, барои санҷиши истифодаи глюкоза, тавре ки қаблан тавсиф шуда буд, иваз карда шуд. Пас аз 4 соати инкубатсия, 100 мкл муҳитро ба найчаи кушодаи микросентрифуга, ки дорои 100 мкл 0,2 N HCl буд, илова кунед. Сипас, найча ба найчаи сцинтиллятсионӣ, ки дорои 500 мкл dH2O буд, ҷойгир карда шуд, то [3H]2O-ро барои 72 соат дар ҳарорати 37°C бухор кунад. Сипас, найчаи микросентрифугаро аз найчаи сцинтиллятсионӣ хориҷ кунед ва 10 мл моеъи сцинтиллятсионӣ илова кунед. Ҳисобкунии сцинтиллятсионӣ бо истифода аз таҳлилгари сцинтиллятсияи моеъи Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, ИМА) анҷом дода шуд. Сипас истифодаи глюкоза бо назардошти фаъолияти хоси [5-3H]-глюкоза, мувозинати нопурра ва замина, обшавии [5-3H]-ба глюкозаи бе нишона ва самаранокии муқобили сцинтилятсия ҳисоб карда шуд. Маълумот ба массаи қисмҳои дил ба меъёр дароварда мешаванд.
Пас аз гомогенизатсияи бофтаҳо дар Тризол, РНК аз қисматҳои дил бо истифода аз Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 мувофиқи протоколи истеҳсолкунанда ҷудо карда шуд. Омодасозӣ, пайдарпайӣ ва таҳлили маълумот дар китобхонаи RNAsec чунин анҷом дода шуданд:
1 мкг РНК барои як намуна ҳамчун маводи ибтидоӣ барои тайёр кардани китобхонаи РНК истифода шуд. Китобхонаҳои пайдарпайӣ бо истифода аз Маҷмӯаи омодасозии китобхонаи NEBNext UltraTM RNA барои Illumina (NEB, ИМА) мувофиқи тавсияҳои истеҳсолкунанда тавлид карда шуданд ва рамзҳои индекс ба пайдарпайиҳои атрибутӣ барои ҳар як намуна илова карда шуданд. Хулоса, mRNA аз РНК-и умумӣ бо истифода аз муҳраҳои магнитӣ, ки бо олигонуклеотидҳои поли-Т пайваст карда шудаанд, тоза карда шуд. Фрагментатсия бо истифода аз катионҳои дувалентӣ дар ҳарорати баланд дар буфери реаксияи синтези риштаи аввали NEBNext (5X) анҷом дода мешавад. Риштаи аввали кДНК бо истифода аз праймерҳои тасодуфии гексамер ва транскриптазаи баръакси M-MuLV (RNase H-) синтез карда шуд. Сипас риштаи дуюми кДНК бо истифода аз ДНК полимеразаи I ва RNase H синтез карда мешавад. Қисмҳои боқимонда тавассути фаъолияти экзонуклеаза/полимераза ба нӯгҳои кунд табдил дода мешаванд. Пас аз аденилизатсияи нӯги 3'-и порчаи ДНК, адаптери NEBNext бо сохтори ҳалқаи мӯйшакл ба он пайваст карда мешавад, то онро барои гибридизатсия омода кунад. Барои интихоби пораҳои cDNA бо дарозии афзалиятноки 150-200 bp. пораҳои китобхона бо истифода аз системаи AMPure XP (Бекман Коултер, Беверли, ИМА) тоза карда шуданд. Сипас, 3 мкл ферменти USER (NEB, ИМА) бо андозаи интихобшудаи cDNA, ки бо адаптер пайваст карда шудааст, пеш аз PCR барои 15 дақиқа дар 37°C ва сипас барои 5 дақиқа дар 95°C истифода шуд. Сипас PCR бо истифода аз полимеразаи ДНК-и Phusion High-Fidelity, праймерҳои универсалии PCR ва праймерҳои Index (X) анҷом дода шуд. Дар ниҳоят, маҳсулоти PCR тоза карда шуданд (системаи AMPure XP) ва сифати китобхона дар системаи Agilent Bioanalyzer 2100 арзёбӣ карда шуд. Сипас китобхонаи cDNA бо истифода аз секвенсери Novaseq секвенсия карда шуд. Файлҳои тасвири хом аз Illumina бо истифода аз CASAVA Base Calling ба хонишҳои хом табдил дода шуданд. Маълумоти хом дар файлҳои формати FASTQ(fq) нигоҳ дошта мешавад, ки пайдарпайии хониш ва сифатҳои мувофиқи асосиро дар бар мегиранд. Барои мувофиқ кардани хондани пайдарпайии филтршуда бо геноми истинодии Sscrofa11.1, HISAT2-ро интихоб кунед. Умуман, HISAT2 геномҳои ҳар андозаро, аз ҷумла геномҳои аз 4 миллиард пойгоҳ калонтарро дастгирӣ мекунад ва арзишҳои пешфарз барои аксари параметрҳо муқаррар карда мешаванд. Хонишҳои пайвастшавӣ аз маълумоти RNA Seq метавонанд бо истифода аз HISAT2, зудтарин системаи мавҷуда, бо ҳамон ё беҳтар аз ҳама гуна усули дигар, самаранок ҳамоҳанг карда шаванд.
Фаровонии транскриптҳо сатҳи ифодаи генро мустақиман инъикос мекунад. Сатҳи ифодаи генҳо аз рӯи фаровонии транскриптҳо (шумораи пайдарпайӣ), ки бо геном ё экзонҳо алоқаманданд, арзёбӣ карда мешавад. Шумораи хондаҳо ба сатҳи ифодаи генҳо, дарозии генҳо ва чуқурии пайдарпайӣ мутаносиб аст. FPKM (порчаҳо барои ҳазор ҷуфти асосии транскрипт, ки барои як миллион ҷуфти асосӣ пайдарпайӣ шудаанд) ҳисоб карда шуданд ва арзишҳои P-и ифодаи дифференсиалӣ бо истифода аз бастаи DESeq2 муайян карда шуданд. Сипас, мо суръати кашфи бардурӯғро (FDR) барои ҳар як арзиши P бо истифода аз усули Бенҷамини-Ҳохберг9, ки ба функсияи дарунсохти R "p.adjust" асос ёфтааст, ҳисоб кардем.
РНК-и аз қисматҳои дил ҷудошуда бо консентратсияи 200 нг/мкл ба кДНК табдил дода шуд, ки ин бо истифода аз омехтаи SuperScript IV Vilo Master аз Thermo (Thermo, рақами 11756050) анҷом дода шуд. Ташхиси миқдории RT-PCR бо истифода аз плитаи реаксияи шаффофи Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-чоҳи (Thermo, рақами 4483319) ва часпаки оптикии микроамп (Thermo, рақами 4311971) анҷом дода шуд. Омехтаи реаксия аз 5 мкл Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, рақами 4444557), 0.5 мкл Taqman Primer ва 3.5 мкл H2O омехта барои ҳар як чоҳ иборат буд. Сиклҳои стандартии qPCR иҷро карда шуданд ва арзишҳои CT бо истифода аз асбоби PCR-и воқеии Applied Biosystems Quantstudio 5 (модули 384-чоҳи; маҳсулот # A28135) чен карда шуданд. Праймерҳои Такман аз Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1) харидорӣ карда шуданд. Арзишҳои CT-и ҳамаи намунаҳо ба гени хонагӣ GAPDH ба меъёр дароварда шуданд.
Нашри NT-ProBNP дар ВАО бо истифода аз маҷмӯаи NT-ProBNP (хук) (рақами кат. MBS2086979, MyBioSource) мувофиқи протоколи истеҳсолкунанда арзёбӣ карда шуд. Хулоса, 250 мкл аз ҳар як намуна ва стандарт ба ҳар як чоҳ ду маротиба илова карда шуд. Фавран пас аз илова кардани намуна, ба ҳар як чоҳ 50 мкл реагенти озмоиши А илова кунед. Табақро нарм такон диҳед ва бо герметик мӯҳр кунед. Сипас лавҳаҳо дар ҳарорати 37°C барои 1 соат инкубатсия карда шуданд. Сипас маҳлулро ҷаббида, чоҳҳоро 4 маротиба бо 350 мкл маҳлули шустушӯи 1X бишӯед ва ҳар дафъа маҳлули шустушӯро 1-2 дақиқа инкубатсия кунед. Сипас ба ҳар як чоҳ 100 мкл реагенти озмоиши B илова кунед ва бо герметики табақ мӯҳр кунед. Лавҳаро нарм такон дода, дар ҳарорати 37°C барои 30 дақиқа инкубатсия кунед. Маҳлулро ҷаббида, чоҳҳоро 5 маротиба бо 350 мкл маҳлули шустушӯи 1X бишӯед. Ба ҳар як чоҳ 90 мкл маҳлули субстрат илова кунед ва пластинаро мӯҳр кунед. Пластинаро дар ҳарорати 37°C барои 10-20 дақиқа инкубатсия кунед. Ба ҳар як чоҳ 50 мкл маҳлули Stop илова кунед. Пластинаро фавран бо истифода аз хонандаи пластинаи Cytation (BioTek), ки дар 450 нм насб шудааст, чен карданд.
Таҳлили қувва барои интихоби андозаи гурӯҳҳо гузаронида шуд, ки қудрати >80% -ро барои муайян кардани тағйироти мутлақи 10% дар параметр бо сатҳи хатогии 5% навъи I таъмин мекунанд. Таҳлили қувва барои интихоби андозаи гурӯҳҳо анҷом дода шуд, ки қудрати >80% -ро барои муайян кардани тағйироти мутлақи 10% дар параметр бо сатҳи хатогии 5% навъи I таъмин мекунанд. Анализ мощности бо выполнен барои выбора размеров группа, которые обеспечат >80% мощности барои обнаружения 10% абсолютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Таҳлили қувва барои интихоби андозаи гурӯҳҳое, ки қудрати >80% -ро барои муайян кардани тағйироти мутлақи параметрҳои 10% бо сатҳи хатогии 5% навъи I таъмин мекунанд, гузаронида шуд.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности барои выбора размера группы, который обеспечил бо > 80% имконпазир барои обнаружения 10% абсолютного изменения параметров ва 5% частоты ошибок типа I. Барои интихоби андозаи гурӯҳе, ки қудрати >80% -ро барои муайян кардани 10% тағйироти мутлақи параметр ва 5% сатҳи хатогии навъи I таъмин мекунад, таҳлили қувва гузаронида шуд.Қисмҳои бофта пеш аз таҷриба ба таври тасодуфӣ интихоб карда шуданд. Ҳамаи таҳлилҳо аз ҳолати ноаён гузаронида шуданд ва намунаҳо танҳо пас аз таҳлили ҳамаи маълумот рамзкушоӣ карда шуданд. Барои анҷом додани ҳамаи таҳлилҳои оморӣ нармафзори GraphPad Prism (Сан Диего, Калифорния) истифода шуд. Барои ҳама омор, арзишҳои p дар арзишҳои <0.05 назаррас ҳисобида шуданд. Барои ҳама омор, арзишҳои p дар арзишҳои <0.05 муҳим ҳисобида шуданд. Барои маълумоти статистикии п-значенияхо <0,05. Барои ҳама омор, арзишҳои p дар арзишҳои <0.05 муҳим ҳисобида шуданд.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Барои маълумоти статистикии п-значенияхо <0,05. Барои ҳама омор, арзишҳои p дар арзишҳои <0.05 муҳим ҳисобида шуданд.Санҷиши t-и дутарафа дар маълумот бо танҳо 2 муқоиса гузаронида шуд. ANOVA-и яктарафа ё дутарафа барои муайян кардани аҳамият байни гурӯҳҳои сершумор истифода шуд. Ҳангоми гузаронидани санҷишҳои пас аз анҷом, ислоҳи Туки барои ба назар гирифтани муқоисаҳои сершумор истифода шуд. Маълумоти RNAsec ҳангоми ҳисоб кардани FDR ва p.adjust, тавре ки дар бахши Усулҳо тавсиф шудааст, мулоҳизаҳои махсуси оморӣ доранд.
Барои маълумоти бештар дар бораи тарҳи таҳқиқот, ба хулосаи гузориши тадқиқоти табиат, ки ба ин мақола пайванд дорад, нигаред.