Terima kasih kerana melayari Nature.com. Versi pelayar yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad. Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan pelayar yang dikemas kini (atau melumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan memaparkan laman web tanpa gaya dan JavaScript.
Terdapat keperluan untuk sistem in vitro yang andal yang boleh menghasilkan semula persekitaran fisiologi jantung dengan tepat untuk ujian dadah. Ketersediaan sistem kultur tisu jantung manusia yang terhad telah menyebabkan tafsiran kesan ubat jantung yang tidak tepat. Di sini, kami telah membangunkan model kultur tisu jantung (CTCM) yang merangsang hirisan jantung secara elektromekanikal dan mengalami regangan fisiologi semasa fasa sistolik dan diastolik kitaran jantung. Selepas 12 hari kultur, pendekatan ini sebahagiannya meningkatkan daya maju bahagian jantung, tetapi tidak memelihara sepenuhnya integriti strukturnya. Oleh itu, selepas saringan molekul kecil, kami mendapati bahawa penambahan 100 nM triiodothyronine (T3) dan 1 μM dexamethasone (Dex) kepada medium kami mengekalkan mikrostruktur bahagian selama 12 hari. Dalam kombinasi dengan rawatan T3/Dex, sistem CTCM mengekalkan profil transkripsi, daya maju, aktiviti metabolik dan integriti struktur pada tahap yang sama seperti tisu jantung segar selama 12 hari. Di samping itu, regangan tisu jantung yang berlebihan dalam kultur mendorong isyarat jantung hipertrofik, memberikan bukti keupayaan CTCM untuk meniru keadaan hipertrofik yang disebabkan oleh regangan jantung. Kesimpulannya, CTCM boleh memodelkan fisiologi dan patofisiologi jantung dalam kultur dalam tempoh masa yang lama, membolehkan saringan ubat yang boleh dipercayai.
Sebelum penyelidikan klinikal, sistem in vitro yang andal diperlukan yang dapat menghasilkan semula persekitaran fisiologi jantung manusia dengan tepat. Sistem sedemikian harus meniru perubahan regangan mekanikal, kadar denyutan jantung dan sifat elektrofisiologi. Model haiwan biasanya digunakan sebagai platform saringan untuk fisiologi jantung dengan kebolehpercayaan yang terhad dalam mencerminkan kesan ubat dalam jantung manusia1,2. Akhirnya, Model Eksperimen Kultur Tisu Jantung Ideal (CTCM) ialah model yang sangat sensitif dan spesifik untuk pelbagai intervensi terapeutik dan farmakologi, menghasilkan semula fisiologi dan patofisiologi jantung manusia dengan tepat3. Ketiadaan sistem sedemikian mengehadkan penemuan rawatan baharu untuk kegagalan jantung4,5 dan telah menyebabkan kardiotoksisiti ubat sebagai sebab utama untuk keluar dari pasaran6.
Sepanjang dekad yang lalu, lapan ubat bukan kardiovaskular telah ditarik balik daripada penggunaan klinikal kerana ia menyebabkan pemanjangan selang QT yang membawa kepada aritmia ventrikel dan kematian mengejut7. Oleh itu, terdapat keperluan yang semakin meningkat untuk strategi saringan praklinikal yang boleh dipercayai untuk menilai keberkesanan dan ketoksikan kardiovaskular. Penggunaan kardiomiosit terbitan sel stem pluripoten (hiPS-CM) yang diaruh oleh manusia baru-baru ini dalam saringan ubat dan ujian ketoksikan memberikan penyelesaian separa kepada masalah ini. Walau bagaimanapun, sifat hiPS-CM yang tidak matang dan kekurangan kerumitan multiselular tisu jantung adalah batasan utama kaedah ini. Kajian terbaru menunjukkan bahawa batasan ini sebahagiannya boleh diatasi dengan menggunakan hiPS-CM awal untuk membentuk hidrogel tisu jantung sejurus selepas bermulanya pengecutan spontan dan rangsangan elektrik yang semakin meningkat dari semasa ke semasa. Walau bagaimanapun, mikrotisu hiPS-CM ini kekurangan sifat elektrofisiologi dan kontraktil matang miokardium dewasa. Di samping itu, tisu jantung manusia mempunyai struktur yang lebih kompleks, yang terdiri daripada campuran heterogen jenis sel yang berbeza, termasuk sel endotel, neuron dan fibroblas stroma, yang saling berkaitan oleh set protein matriks ekstraselular tertentu. Kepelbagaian populasi bukan kardiomiosit ini11,12,13 dalam jantung mamalia dewasa merupakan penghalang utama kepada pemodelan tisu jantung menggunakan jenis sel individu. Batasan utama ini menekankan kepentingan membangunkan kaedah untuk mengkultur tisu miokardium yang utuh di bawah keadaan fisiologi dan patologi.
Bahagian nipis (300 µm) jantung manusia yang dikultur telah terbukti menjadi model miokardium manusia yang utuh dan berpotensi. Kaedah ini menyediakan akses kepada sistem multiselular 3D lengkap yang serupa dengan tisu jantung manusia. Walau bagaimanapun, sehingga 2019, penggunaan bahagian jantung yang dikultur adalah terhad oleh jangka hayat kultur yang pendek (24 jam). Ini disebabkan oleh beberapa faktor termasuk kekurangan regangan fizikal-mekanikal, antara muka udara-cecair, dan penggunaan media ringkas yang tidak menyokong keperluan tisu jantung. Pada tahun 2019, beberapa kumpulan penyelidikan menunjukkan bahawa menggabungkan faktor mekanikal ke dalam sistem kultur tisu jantung boleh memanjangkan hayat kultur, meningkatkan ekspresi jantung, dan meniru patologi jantung. Dua kajian elegan 17 dan 18 menunjukkan bahawa pemuatan mekanikal uniaxial mempunyai kesan positif terhadap fenotip jantung semasa kultur. Walau bagaimanapun, kajian ini tidak menggunakan pemuatan fiziko-mekanikal tiga dimensi dinamik kitaran jantung, kerana bahagian jantung dimuatkan dengan sama ada daya tegangan isometrik 17 atau pemuatan aukotonik linear 18. Kaedah-kaedah regangan tisu ini mengakibatkan penindasan banyak gen jantung atau ekspresi gen yang berlebihan yang berkaitan dengan tindak balas regangan yang tidak normal. Terutamanya, Pitoulis et al. 19 telah membangunkan mandian kultur hirisan jantung yang dinamik untuk pembinaan semula kitaran jantung menggunakan maklum balas transduser daya dan pemacu ketegangan. Walaupun sistem ini membolehkan pemodelan kitaran jantung in vitro yang lebih tepat, kerumitan dan daya pemprosesan yang rendah bagi kaedah ini mengehadkan aplikasi sistem ini. Makmal kami baru-baru ini telah membangunkan sistem kultur yang dipermudahkan menggunakan rangsangan elektrik dan medium yang dioptimumkan untuk mengekalkan daya maju bahagian tisu jantung babi dan manusia sehingga 6 hari20,21.
Dalam manuskrip semasa, kami menerangkan model kultur tisu jantung (CTCM) menggunakan bahagian jantung babi yang menggabungkan isyarat humoral untuk merekapitulasi fisiologi jantung tiga dimensi dan distensi patofisiologi semasa kitaran jantung. CTCM ini boleh meningkatkan ketepatan ramalan ubat praklinikal ke tahap yang belum pernah dicapai sebelum ini dengan menyediakan sistem jantung pertengahan daya pemprosesan yang kos efektif yang meniru fisiologi/patofisiologi jantung mamalia untuk ujian ubat praklinikal.
Isyarat mekanikal hemodinamik memainkan peranan penting dalam mengekalkan fungsi kardiomiosit secara in vitro 22,23,24. Dalam manuskrip semasa, kami telah membangunkan CTCM (Rajah 1a) yang boleh meniru persekitaran jantung dewasa dengan mendorong rangsangan elektrik dan mekanikal pada frekuensi fisiologi (1.2 Hz, 72 denyutan seminit). Untuk mengelakkan regangan tisu yang berlebihan semasa diastole, peranti percetakan 3D telah digunakan untuk meningkatkan saiz tisu sebanyak 25% (Rajah 1b). Rentak elektrik yang disebabkan oleh sistem C-PACE telah ditetapkan masanya untuk bermula 100 ms sebelum sistol menggunakan sistem pemerolehan data untuk menghasilkan semula kitaran jantung sepenuhnya. Sistem kultur tisu menggunakan penggerak pneumatik boleh atur cara (LB Engineering, Jerman) untuk mengembangkan membran silikon fleksibel secara kitaran bagi menyebabkan pengembangan hirisan jantung di ruang atas. Sistem ini disambungkan ke saluran udara luaran melalui transduser tekanan, yang membolehkan pelarasan tekanan (± 1 mmHg) dan masa (± 1 ms) dengan tepat (Rajah 1c).
a Pasangkan bahagian tisu pada cincin sokongan 7 mm, yang ditunjukkan dalam warna biru, di dalam ruang kultur peranti. Ruang kultur dipisahkan daripada ruang udara oleh membran silikon fleksibel yang nipis. Letakkan gasket di antara setiap ruang untuk mengelakkan kebocoran. Penutup peranti mengandungi elektrod grafit yang memberikan rangsangan elektrik. b Perwakilan skematik peranti tisu besar, cincin panduan dan cincin sokongan. Bahagian tisu (coklat) diletakkan pada peranti bersaiz besar dengan cincin panduan diletakkan di alur di tepi luar peranti. Menggunakan panduan, letakkan cincin sokongan yang disalut dengan pelekat akrilik tisu dengan berhati-hati di atas bahagian tisu jantung. c Graf yang menunjukkan masa rangsangan elektrik sebagai fungsi tekanan ruang udara yang dikawal oleh penggerak pneumatik boleh atur cara (PPD). Peranti pemerolehan data digunakan untuk menyegerakkan rangsangan elektrik menggunakan sensor tekanan. Apabila tekanan dalam ruang kultur mencapai ambang yang ditetapkan, isyarat denyut dihantar ke C-PACE-EM untuk mencetuskan rangsangan elektrik. d Imej empat CTCM yang diletakkan di rak inkubator. Empat peranti disambungkan kepada satu PPD melalui litar pneumatik, dan sensor tekanan dimasukkan ke dalam injap hemostatik untuk memantau tekanan dalam litar pneumatik. Setiap peranti mengandungi enam bahagian tisu.
Dengan menggunakan satu penggerak pneumatik, kami dapat mengawal 4 peranti CTCM, yang setiap satunya boleh memuatkan 6 bahagian tisu (Rajah 1d). Dalam CTCM, tekanan udara dalam ruang udara ditukar kepada tekanan segerak dalam ruang bendalir dan mendorong pengembangan fisiologi hirisan jantung (Rajah 2a dan Filem Tambahan 1). Penilaian regangan tisu pada 80 mm Hg. Art. menunjukkan regangan bahagian tisu sebanyak 25% (Rajah 2b). Peratusan regangan ini telah terbukti sepadan dengan panjang sarkomer fisiologi 2.2–2.3 µm untuk pengecutan bahagian jantung normal17,19,25. Pergerakan tisu dinilai menggunakan tetapan kamera tersuai (Rajah Tambahan 1). Amplitud dan halaju pergerakan tisu (Rajah 2c, d) sepadan dengan regangan semasa kitaran jantung dan masa semasa sistol dan diastol (Rajah 2b). Regangan dan halaju tisu jantung semasa pengecutan dan pengenduran kekal malar selama 12 hari dalam kultur (Rajah 2f). Untuk menilai kesan rangsangan elektrik terhadap kontraktiliti semasa kultur, kami membangunkan kaedah untuk menentukan kecacatan aktif menggunakan algoritma teduhan (Rajah Tambahan 2a, b) dan dapat membezakan antara kecacatan dengan dan tanpa rangsangan elektrik. Bahagian jantung yang sama (Rajah 2f). Di kawasan potongan yang boleh digerakkan (R6-9), voltan semasa rangsangan elektrik adalah 20% lebih tinggi berbanding ketiadaan rangsangan elektrik, yang menunjukkan sumbangan rangsangan elektrik kepada fungsi kontraktil.
Kesan perwakilan tekanan ruang udara, tekanan ruang bendalir, dan ukuran pergerakan tisu mengesahkan bahawa tekanan ruang mengubah tekanan ruang bendalir, menyebabkan pergerakan hirisan tisu yang sepadan. b Kesan perwakilan peratus regangan (biru) bahagian tisu yang sepadan dengan peratus regangan (oren). c Gerakan hirisan jantung yang diukur adalah konsisten dengan kelajuan gerakan yang diukur. (d) Trajektori perwakilan gerakan kitaran (garis biru) dan halaju (garis putus-putus oren) dalam hirisan jantung. e Kuantifikasi masa kitaran (n = 19 hirisan setiap kumpulan, daripada babi yang berbeza), masa pengecutan (n = 19 hirisan setiap kumpulan), masa relaksasi (n = 19 hirisan setiap kumpulan, daripada babi yang berbeza), pergerakan tisu (n = 25 ). hirisan)/kumpulan daripada babi yang berbeza), halaju sistolik puncak (n = 24(D0), 25(D12) hirisan/kumpulan daripada babi yang berbeza) dan kadar relaksasi puncak (n=24(D0), 25(D12) hirisan/kumpulan daripada babi yang berbeza). Ujian-t Pelajar Dua Hujung tidak menunjukkan perbezaan yang ketara dalam sebarang parameter. f Analisis terikan perwakilan jejak keratan tisu dengan rangsangan elektrik (merah) dan tanpa (biru), sepuluh kawasan serantau keratan tisu dari bahagian yang sama. Panel bawah menunjukkan kuantifikasi perbezaan peratusan terikan dalam keratan tisu dengan dan tanpa rangsangan elektrik di sepuluh kawasan dari bahagian yang berbeza. (n = 8 hirisan/kumpulan daripada babi yang berbeza, Ujian-t Pelajar Dua Ekor dijalankan; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 hirisan/kumpulan daripada babi yang berbeza, Ujian-t Pelajar Dua Ekor dijalankan; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 bahagian/kumpulan daripada babi yang berbeza, ujian-t Pelajar dua hujung; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.05）。 (n = 8 срезов/группу, daripada разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 bahagian/kumpulan, daripada babi yang berbeza, ujian-t Pelajar dua hujung; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Bar ralat mewakili min ± sisihan piawai.
Dalam sistem kultur hirisan jantung biomimetik statik kami sebelum ini [20, 21], kami mengekalkan daya maju, fungsi dan integriti struktur hirisan jantung selama 6 hari dengan menggunakan rangsangan elektrik dan mengoptimumkan komposisi medium. Walau bagaimanapun, selepas 10 hari, angka-angka ini menurun mendadak. Kami akan merujuk kepada bahagian yang dikultur dalam keadaan kawalan sistem kultur biomimetik statik 20, 21 kami sebelum ini dan kami akan menggunakan medium yang dioptimumkan sebelum ini sebagai keadaan MC dan kultur di bawah rangsangan mekanikal dan elektrik serentak (CTCM). dipanggil . Pertama, kami menentukan bahawa rangsangan mekanikal tanpa rangsangan elektrik tidak mencukupi untuk mengekalkan daya maju tisu selama 6 hari (Rajah Tambahan 3a, b). Menariknya, dengan pengenalan rangsangan fisio-mekanikal dan elektrik menggunakan STCM, daya maju bahagian jantung 12 hari kekal sama seperti bahagian jantung segar di bawah keadaan MS, tetapi tidak di bawah keadaan Ctrl, seperti yang ditunjukkan oleh analisis MTT (Rajah 1). 3a). Ini menunjukkan bahawa rangsangan mekanikal dan simulasi kitaran jantung boleh memastikan bahagian tisu berdaya maju dua kali ganda lebih lama daripada yang dilaporkan dalam sistem kultur statik kami sebelum ini. Walau bagaimanapun, penilaian integriti struktur keratan tisu melalui pelabelan imunotropik troponin T jantung dan connexin 43 menunjukkan bahawa ekspresi connexin 43 adalah jauh lebih tinggi dalam tisu MC pada hari ke-12 berbanding kawalan pada hari yang sama. Walau bagaimanapun, ekspresi connexin 43 yang seragam dan pembentukan cakera-Z tidak dikekalkan sepenuhnya (Rajah 3b). Kami menggunakan rangka kerja kecerdasan buatan (AI) untuk mengukur integriti struktur tisu26, saluran pembelajaran mendalam berasaskan imej berdasarkan pewarnaan troponin-T dan connexin43 untuk mengukur integriti struktur dan pendarfluor hirisan jantung secara automatik dari segi kekuatan penyetempatan. Kaedah ini menggunakan Rangkaian Neural Konvolusi (CNN) dan rangka kerja pembelajaran mendalam untuk mengukur integriti struktur tisu jantung secara andal secara automatik dan tidak berat sebelah, seperti yang diterangkan dalam rujukan. 26. Tisu MC menunjukkan persamaan struktur yang lebih baik dengan hari ke-0 berbanding keratan kawalan statik. Di samping itu, pewarnaan trikrom Masson mendedahkan peratusan fibrosis yang jauh lebih rendah di bawah keadaan MS berbanding keadaan kawalan pada hari ke-12 kultur (Rajah 3c). Walaupun CTCM meningkatkan daya maju keratan rentas tisu jantung pada hari ke-12 ke tahap yang serupa dengan tisu jantung segar, ia tidak meningkatkan integriti struktur keratan rentas jantung dengan ketara.
Graf Bar menunjukkan kuantifikasi daya maju MTT bagi hirisan jantung segar (D0) atau kultur hirisan jantung selama 12 hari sama ada dalam kultur statik (D12 Ctrl) atau dalam CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) hirisan/kumpulan daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dijalankan; ####p < 0.0001 berbanding D0 dan **p < 0.01 berbanding D12 Ctrl). Graf Bar menunjukkan kuantifikasi daya maju MTT bagi hirisan jantung segar (D0) atau kultur hirisan jantung selama 12 hari sama ada dalam kultur statik (D12 Ctrl) atau dalam CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) hirisan/kumpulan daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dijalankan; ####p < 0.0001 berbanding D0 dan **p < 0.01 berbanding D12 Ctrl).histogram menunjukkan kuantifikasi daya maju keratan jantung segar MTT (D0) atau kultur keratan jantung selama 12 hari sama ada dalam kultur statik (kawalan D12) atau CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kawalan D12). ) ), 12 (D12 MC) keratan/kumpulan daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dijalankan;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 berbanding D0 dan **p < 0.01 berbanding D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单后行单曑行单后行单向行相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl)，D12 Ctrl)histogram menunjukkan kuantifikasi daya maju MTT dalam keratan jantung segar (D0) atau keratan jantung yang dikultur selama 12 hari dalam kultur statik (kawalan D12) atau CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kawalan D12)), 12 (D12 MC) keratan/kumpulan daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 berbanding D0, **p < 0.01 berbanding D12 Ctrl).b Troponin-T (hijau), connexin 43 (merah) dan DAPI (biru) dalam bahagian jantung yang baru diasingkan (D0) atau bahagian jantung yang dikultur di bawah keadaan statik (Ctrl) atau keadaan CTCM (MC) selama 12 hari) bagi imej imunofluoresen yang mewakili (skala kosong = 100 µm). Kuantifikasi kecerdasan buatan bagi integriti struktur tisu jantung (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) hirisan/kumpulan setiap satu daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dijalankan; ####p < 0.0001 berbanding D0 dan ****p < 0.0001 berbanding D12 Ctrl). Kuantifikasi kecerdasan buatan bagi integriti struktur tisu jantung (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) hirisan/kumpulan setiap satu daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dijalankan; ####p < 0.0001 berbanding D0 dan ****p < 0.0001 berbanding D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной тппни искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl/D12), MC5 от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению). Kuantifikasi integriti struktur tisu jantung melalui kecerdasan buatan (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) bahagian/kumpulan daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dijalankan; ####p < 0.0001 vs. dengan D0 dan ****p < 0.0001 berbanding dengan D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) hirisan/kumpulan setiap babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala;##p00 < 盎0##p01 ，##p01 相0##p0 盎0##p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) hirisan/kumpulan setiap babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala;##0D0，0##p0，0##p0，0##p0，0##p0，0##p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), Ctrl7 (D12) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001 lwn. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнения; Kecerdasan buatan untuk mengukur integriti struktur tisu jantung (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) bahagian/kumpulan setiap babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala; ####p<0.0001 vs .D0 Sebagai perbandingan ****p < 0.0001 berbanding D12 Ctrl). c Imej perwakilan (kiri) dan kuantifikasi (kanan) untuk hirisan jantung yang diwarnakan dengan pewarnaan trikrom Masson (Skala kosong = 500 µm) (n = 10 hirisan/kumpulan setiap satu daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dilakukan; ####p < 0.0001 berbanding D0 dan ***p < 0.001 berbanding D12 Ctrl). c Imej perwakilan (kiri) dan kuantifikasi (kanan) untuk hirisan jantung yang diwarnakan dengan pewarnaan trikrom Masson (Skala kosong = 500 µm) (n = 10 hirisan/kumpulan setiap satu daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dilakukan; #### p < 0.0001 berbanding D0 dan ***p < 0.001 berbanding D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) dan количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красимласа без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 DIRI *** 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Imej perwakilan (kiri) dan kuantifikasi (kanan) bahagian jantung yang diwarnakan dengan pewarnaan trikrom Masson (skala tidak bersalut = 500 µm) (n = 10 bahagian/kumpulan daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dijalankan; #### p < 0 .0001 berbanding D0 dan ***p < 0.001 berbanding D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度 （裸尺度 = 5个切片/组，每组来自不同的猪，进桌单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比，***p < 0.0012 C 。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单向 0##0.与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) dan количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихроямным класителка = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперси ####; 0,0001 по сравнению с D0, ***m < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Imej perwakilan (kiri) dan kuantiti (kanan) bahagian jantung yang diwarnakan dengan pewarnaan trikrom Masson (kosong = 500 µm) (n = 10 bahagian/kumpulan, setiap satu daripada babi yang berbeza, diuji dengan analisis varians sehala;### # p < 0.0001 berbanding D0, ***p < 0.001 berbanding D12 Ctrl).Bar ralat mewakili min ± sisihan piawai.
Kami membuat hipotesis bahawa dengan menambah molekul kecil ke dalam medium kultur, integriti kardiomiosit dapat ditingkatkan dan perkembangan fibrosis dapat dikurangkan semasa kultur CTCM. Oleh itu, kami menyaring molekul kecil menggunakan kultur kawalan statik kami20,21 kerana bilangan faktor pengganggu yang kecil. Deksametason (Dex), triiodotironin (T3), dan SB431542 (SB) telah dipilih untuk saringan ini. Molekul kecil ini sebelum ini telah digunakan dalam kultur hiPSC-CM untuk mendorong kematangan kardiomiosit dengan meningkatkan panjang sarkomer, tubul-T, dan halaju konduksi. Di samping itu, kedua-dua Dex (glukokortikoid) dan SB diketahui dapat menyekat keradangan29,30. Oleh itu, kami menguji sama ada kemasukan satu atau gabungan molekul kecil ini akan meningkatkan integriti struktur bahagian jantung. Untuk saringan awal, dos setiap sebatian dipilih berdasarkan kepekatan yang biasa digunakan dalam model kultur sel (1 μM Dex27, 100 nM T327, dan 2.5 μM SB31). Selepas 12 hari kultur, gabungan T3 dan Dex menghasilkan integriti struktur kardiomiosit yang optimum dan pembentukan semula berserat yang minimum (Rajah Tambahan 4 dan 5). Di samping itu, penggunaan kepekatan T3 dan Dex yang berganda atau berganda ini menghasilkan kesan buruk berbanding kepekatan normal (Rajah Tambahan 6a, b).
Selepas saringan awal, kami melakukan perbandingan secara langsung bagi 4 keadaan kultur (Rajah 4a): Ctrl: bahagian jantung yang dikultur dalam kultur statik yang diterangkan sebelum ini menggunakan medium yang dioptimumkan; 20.21 TD: T3 dan Ctrl s Menambah Dex pada hari Rabu; MC: bahagian jantung yang dikultur dalam CTCM menggunakan medium yang dioptimumkan sebelum ini; dan MT: CTCM dengan T3 dan Dex ditambah ke dalam medium. Selepas 12 hari penanaman, daya maju tisu MS dan MT kekal sama seperti dalam tisu segar yang dinilai melalui ujian MTT (Rajah 4b). Menariknya, penambahan T3 dan Dex kepada kultur transwell (TD) tidak menghasilkan peningkatan daya maju yang ketara berbanding dengan keadaan Ctrl, menunjukkan peranan penting rangsangan mekanikal dalam mengekalkan daya maju bahagian jantung.
Gambar rajah reka bentuk eksperimen yang menggambarkan empat keadaan kultur yang digunakan untuk menilai kesan rangsangan mekanikal dan suplemen T3/Dex pada medium selama 12 hari. Graf bar menunjukkan kuantifikasi daya maju 12 hari selepas kultur dalam semua 4 keadaan kultur (Ctrl, TD, MC, dan MT) berbanding dengan hirisan jantung segar (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MT), 12 (D12 MC) hirisan/kumpulan daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dijalankan; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 berbanding D0 dan **p < 0.01 berbanding D12 Ctrl). Graf bar menunjukkan kuantifikasi daya maju 12 hari selepas kultur dalam semua 4 keadaan kultur (Ctrl, TD, MC, dan MT) berbanding dengan hirisan jantung segar (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MT), 12 (D12 MC) hirisan/kumpulan daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dijalankan; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 berbanding D0 dan **p < 0.01 berbanding D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во вселякових 4 (контроль, TD, MC dan MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12зоппп)/D12зоп разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Graf bar menunjukkan kuantifikasi daya maju pada 12 hari selepas kultur dalam semua 4 keadaan kultur (kawalan, TD, MC, dan MT) berbanding dengan keratan jantung segar (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, dan D12 MT), 12 (D12 MC) keratan/kumpulan daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 vs. D0 dan **p < 0.01 berbanding dengan D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D1tr5)、TD0和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p < 0.001 ，p<0.001 ，p**0.001 与与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими (серди серди) (серди серди) (серди серди) (серди с 8) 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), daripada разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001, ####p <0,0001, ####p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0001, ###p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,0001, ###p <0,0001, #0##p <0,0001, #0##p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Histogram menunjukkan semua 4 keadaan kultur (kawalan, TD, MC dan MT) berbanding dengan bahagian jantung segar (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MT), daripada bahagian/kumpulan 12 babi (D12 MC) yang berbeza, ujian ANOVA sehala; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. kawalan D12). Graf bar c menunjukkan kuantifikasi fluks glukosa 12 hari selepas kultur dalam semua 4 keadaan kultur (Ctrl, TD, MC dan MT) berbanding dengan hirisan jantung segar (D0) (n = 6 hirisan/kumpulan daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dijalankan; ###p < 0.001, berbanding dengan D0 dan ***p < 0.001 berbanding dengan D12 Ctrl). Graf bar c menunjukkan kuantifikasi fluks glukosa 12 hari selepas kultur dalam semua 4 keadaan kultur (Ctrl, TD, MC dan MT) berbanding dengan hirisan jantung segar (D0) (n = 6 hirisan/kumpulan daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dijalankan; ###p < 0.001, berbanding dengan D0 dan ***p < 0.001 berbanding dengan D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всенку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всеох 4 лусирок (контроль, TD, MC dan MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группу от разных свиней, ротниностястий ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 dan ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). Histogram c menunjukkan kuantifikasi fluks glukosa 12 hari selepas kultur di bawah semua 4 keadaan kultur (kawalan, TD, MC dan MT) berbanding dengan keratan jantung segar (D0) (n = 6 keratan/kumpulan daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dijalankan; ###p < 0.001 berbanding D0 dan ***p < 0.001 berbanding D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，厹天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001 ，相所 0.001 ，*与D1与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， ， 猪 猪单曕行< 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех дло4 всех культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от ,разинних Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Histogram menunjukkan kuantifikasi fluks glukosa pada 12 hari selepas kultur untuk semua 4 keadaan kultur (kawalan, TD, MC, dan MT) berbanding dengan bahagian jantung segar (D0) (n = 6 bahagian/kumpulan, daripada babi yang berbeza, unilateral. Ujian ANOVA dijalankan, ###p < 0.001 berbanding D0, ***p < 0.001 berbanding D12 (kawalan).d Plot analisis terikan tisu segar (biru), MC hari ke-12 (hijau), dan MT hari ke-12 (merah) pada sepuluh titik keratan tisu serantau (n = 4 keping/kumpulan, ujian ANOVA sehala; tiada perbezaan yang ketara antara kumpulan). e Plot gunung berapi menunjukkan gen yang diekspresikan secara berbeza dalam keratan jantung segar (D0) berbanding keratan jantung yang dikultur di bawah keadaan statik (Ctrl) atau di bawah keadaan MT (MT) selama 10-12 hari. f Peta haba gen sarkomer untuk keratan jantung yang dikultur di bawah setiap keadaan kultur. Bar ralat mewakili min ± sisihan piawai.
Kebergantungan metabolik pada peralihan daripada pengoksidaan asid lemak kepada glikolisis merupakan ciri utama dediferensiasi kardiomiosit. Kardiomiosit yang tidak matang terutamanya menggunakan glukosa untuk penghasilan ATP dan mempunyai mitokondria hipoplastik dengan sedikit krista5,32. Analisis penggunaan glukosa menunjukkan bahawa di bawah keadaan MC dan MT, penggunaan glukosa adalah serupa dengan tisu hari ke-0 (Rajah 4c). Walau bagaimanapun, sampel Ctrl menunjukkan peningkatan ketara dalam penggunaan glukosa berbanding tisu segar. Ini menunjukkan bahawa gabungan CTCM dan T3/Dex meningkatkan daya tahan tisu dan memelihara fenotip metabolik bahagian jantung yang dikultur selama 12 hari. Di samping itu, analisis ketegangan menunjukkan bahawa tahap ketegangan kekal sama seperti dalam tisu jantung segar selama 12 hari di bawah keadaan MT dan MS (Rajah 4d).
Untuk menganalisis impak keseluruhan CTCM dan T3/Dex terhadap landskap transkripsi global tisu hirisan jantung, kami menjalankan RNAseq pada hirisan jantung daripada keempat-empat keadaan kultur yang berbeza (Data Tambahan 1). Menariknya, bahagian MT menunjukkan persamaan transkripsi yang tinggi dengan tisu jantung segar, dengan hanya 16 gen yang diekspresikan secara berbeza daripada 13,642 gen. Walau bagaimanapun, seperti yang kami tunjukkan sebelum ini, hirisan Ctrl memaparkan 1229 gen yang diekspresikan secara berbeza selepas 10–12 hari dalam kultur (Rajah 4e). Data ini disahkan oleh qRT-PCR gen jantung dan fibroblas (Rajah Tambahan 7a-c). Menariknya, bahagian Ctrl menunjukkan penurunan regulasi gen jantung dan kitaran sel serta pengaktifan program gen keradangan. Data ini menunjukkan bahawa dediferensiasi, yang biasanya berlaku selepas pengkulturan jangka panjang, dilemahkan sepenuhnya di bawah keadaan MT (Rajah Tambahan 8a,b). Kajian teliti terhadap gen sarkomer menunjukkan bahawa hanya di bawah keadaan MT gen yang mengekod sarkomer (Rajah 4f) dan saluran ion (Rajah Tambahan 9) dipelihara, melindunginya daripada penindasan di bawah keadaan Ctrl, TD, dan MC. Data ini menunjukkan bahawa dengan gabungan rangsangan mekanikal dan humoral (T3/Dex), transkriptom hirisan jantung boleh kekal serupa dengan hirisan jantung segar selepas 12 hari dalam kultur.
Penemuan transkripsi ini disokong oleh fakta bahawa integriti struktur kardiomiosit dalam bahagian jantung paling baik dipelihara di bawah keadaan MT selama 12 hari, seperti yang ditunjukkan oleh connexin 43 yang utuh dan setempat (Rajah 5a). Di samping itu, fibrosis dalam bahagian jantung di bawah keadaan MT berkurangan dengan ketara berbanding Ctrl dan serupa dengan bahagian jantung segar (Rajah 5b). Data ini menunjukkan bahawa gabungan rangsangan mekanikal dan rawatan T3/Dex berkesan memelihara struktur jantung dalam bahagian jantung dalam kultur.
Imej imunofluoresen perwakilan troponin-T (hijau), connexin 43 (merah), dan DAPI (biru) dalam bahagian jantung yang baru diasingkan (D0) atau dikultur selama 12 hari dalam keempat-empat keadaan kultur bahagian jantung (skala bar = 100 µm). ). Kuantifikasi kecerdasan buatan bagi integriti struktur tisu jantung (n = 7 (D0 dan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC dan D12 MT) hirisan/kumpulan daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dijalankan; ####p < 0.0001 berbanding D0 dan *p < 0.05, atau ****p < 0.0001 berbanding D12 Ctrl). Kuantifikasi kecerdasan buatan bagi integriti struktur tisu jantung (n = 7 (D0 dan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC dan D12 MT) hirisan/kumpulan daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dijalankan; #### p < 0.0001 berbanding D0 dan *p < 0.05, atau ****p < 0.0001 berbanding D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 2 и TD12), D0 2 D15 D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравнению с D0 ,**** и0 и по < 0,**** и0 и по < 0,**** *p < 0,**** *p < 0,**** сравнению с D12 Ctrl). Kuantifikasi integriti struktur tisu jantung menggunakan kecerdasan buatan (n = 7 (D0 dan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC dan D12 MT) bahagian/kumpulan daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dijalankan; #### p < 0.0001 berbanding D0 dan *p < 0.05 atau ****p < 0.0001 berbanding D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 ，書書0 < 0.05 ，書有与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 组） d1智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比 ， 戸 成 0.05 相比 ， 戎0**p1 ， 戎0**p1相比）。Kuantifikasi integriti struktur tisu jantung menggunakan kecerdasan buatan dalam babi yang berbeza (n = 7 (D0 dan D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC dan D12 MT) bahagian/kumpulan) dengan ujian ANOVA sehala;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 atau ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 berbanding D0 dan *p < 0.05 atau ****p < 0.0001 berbanding D12 Ctrl). b Imej perwakilan dan kuantifikasi untuk hirisan jantung yang diwarnakan dengan pewarnaan trikrom Masson (Bar skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, dan D12 MC), 9 (D12 MT) hirisan/kumpulan daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dilakukan; ####p < 0.0001 berbanding D0 dan ***p < 0.001, atau ****p < 0.0001 berbanding D12 Ctrl). b Imej perwakilan dan kuantifikasi untuk hirisan jantung yang diwarnakan dengan pewarnaan trikrom Masson (Bar skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, dan D12 MC), 9 (D12 MT) hirisan/kumpulan daripada babi yang berbeza, ujian ANOVA sehala dilakukan; ####p < 0.0001 berbanding D0 dan ***p < 0.001, atau ****p < 0.0001 berbanding D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона Массона (массона) мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний терносторонний ##0, ##0 ANOVA; сравнению с D0 dan ***p < 0,001 atau ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Imej perwakilan dan kuantifikasi keratan jantung yang diwarnakan dengan pewarnaan trikrom Masson (bar skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MC), 9 (D12 MT) keratan/kumpulan daripada babi yang berbeza, dilakukan ANOVA sehala; ####p < 0.0001 vs. D0 dan ***p < 0.001 atau ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）！1D = 10（D1D TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 < 个001 0.001，或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） = 500 µm） = 500 µm） ） ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比 ，我0**p < ， 我0**p < ， 我0**p < ， 我0** 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения dan количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная = лим50) (D0, D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA ####p < 0,0001 по , ***##p < 0,0001 по , *** лю сра , *** сра ; ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Imej perwakilan dan kuantifikasi keratan jantung yang diwarnakan dengan trikrom Masson (bar skala = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD dan D12 MC), 9 keratan (D12 MT) daripada babi/kumpulan yang berbeza, satu kaedah ANOVA; ####p < 0.0001 berbanding D0, ***p < 0.001 atau ****p < 0.0001 berbanding D12 Ctrl).Bar ralat mewakili min ± sisihan piawai.
Akhir sekali, keupayaan CTCM untuk meniru hipertrofi jantung dinilai dengan meningkatkan regangan tisu jantung. Dalam CTCM, tekanan ruang udara puncak meningkat daripada 80 mmHg kepada 80 mmHg. Art. (regangan normal) sehingga 140 mmHg Art. (Rajah 6a). Ini sepadan dengan peningkatan 32% dalam regangan (Rajah 6b), yang sebelum ini ditunjukkan sebagai peratusan regangan yang sepadan yang diperlukan untuk bahagian jantung mencapai panjang sarkomer yang serupa dengan yang dilihat dalam hipertrofi. Regangan dan halaju tisu jantung semasa pengecutan dan pengenduran kekal malar semasa enam hari kultur (Rajah 6c). Tisu jantung daripada keadaan MT tertakluk kepada regangan normal (MT (Normal)) atau keadaan regangan berlebihan (MT (OS)) selama enam hari. Selepas empat hari dalam kultur, penanda bio hipertrofik NT-ProBNP meningkat dengan ketara dalam medium di bawah keadaan MT (OS) berbanding dengan keadaan MT (normal) (Rajah 7a). Di samping itu, selepas enam hari kultur, saiz sel dalam MT (OS) (Rajah 7b) meningkat dengan ketara berbanding dengan bahagian jantung MT (normal). Di samping itu, translokasi nuklear NFATC4 meningkat dengan ketara dalam tisu yang terlalu meregang (Rajah 7c). Keputusan ini menunjukkan perkembangan progresif pembentukan semula patologi selepas hiperdistensi dan menyokong konsep bahawa peranti CTCM boleh digunakan sebagai platform untuk mengkaji isyarat hipertrofi jantung yang disebabkan oleh regangan.
Kesan perwakilan tekanan ruang udara, tekanan ruang bendalir, dan ukuran pergerakan tisu mengesahkan bahawa tekanan ruang mengubah tekanan ruang bendalir, menyebabkan pergerakan hirisan tisu yang sepadan. b Lengkung peratusan regangan dan kadar regangan perwakilan untuk keratan tisu yang diregangkan secara normal (oren) dan diregangkan secara berlebihan (biru). c Graf bar menunjukkan masa kitaran (n = 19 hirisan setiap kumpulan, daripada babi yang berbeza), masa pengecutan (n = 18-19 hirisan setiap kumpulan, daripada babi yang berbeza), masa pengenduran (n = 19 hirisan setiap kumpulan, daripada babi yang berbeza) ), amplitud pergerakan tisu (n = 14 hirisan/kumpulan, daripada babi yang berbeza), halaju sistolik puncak (n = 14 hirisan/kumpulan, daripada babi yang berbeza) dan kadar pengenduran puncak (n = 14 (D0), 15 (D6) ) keratan/kumpulan) daripada babi yang berbeza), ujian-t Pelajar dua hujung tidak menunjukkan perbezaan yang ketara dalam sebarang parameter, menunjukkan bahawa parameter ini kekal malar selama 6 hari kultur dengan voltan lampau. Bar ralat mewakili min ± sisihan piawai.
Pengkuantitian graf bar bagi kepekatan NT-ProBNP dalam media kultur daripada hirisan jantung yang dikultur di bawah keadaan regangan normal MT (Norm) atau regangan berlebihan (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm dan D4 MTOS) hirisan/kumpulan daripada babi yang berbeza, ANOVA dua hala dilakukan; **p < 0.01 berbanding regangan normal). Pengkuantitian graf bar bagi kepekatan NT-ProBNP dalam media kultur daripada hirisan jantung yang dikultur di bawah keadaan regangan normal MT (Norm) atau regangan berlebihan (OS) (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, dan D4 MTOS) hirisan/kumpulan daripada babi yang berbeza, ANOVA dua hala dilakukan; **p < 0.01 berbanding regangan normal).Histogram kuantitatif kepekatan NT-ProBNP dalam medium kultur daripada hirisan jantung yang dikultur di bawah keadaan regangan MT normal (norma) atau regangan berlebihan (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, dan D4).MTOS) hirisan/kumpulan daripada babi yang berbeza, analisis varians dua faktor dilakukan;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 berbanding regangan biasa). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度的条度的条度4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；p中方差分析；中与中中与0.01）. a Kuantifikasi kepekatan NT-ProBNP dalam hirisan jantung yang dikultur di bawah keadaan regangan biasa (Norm) atau overstretch (OS) MT (n ​​= 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) daripada 猪的切片/绑，可以喌双; **berbanding dengan regangan biasa, p < 0.01).histogram Kuantifikasi kepekatan NT-ProBNP dalam hirisan jantung yang dikultur di bawah keadaan hirisan/kumpulan regangan MT (norma) atau regangan berlebihan (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) dan D4 MTOS) normal daripada babi yang berbeza, analisis varians dua hala;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 berbanding regangan biasa). b Imej perwakilan untuk hirisan jantung yang diwarnakan dengan troponin-T dan WGA (kiri) dan kuantifikasi saiz sel (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sel/kumpulan daripada 10 hirisan berbeza daripada babi berbeza, Ujian-t Pelajar Dua Ekor dilakukan; ****p < 0.0001 berbanding regangan biasa). b Imej perwakilan untuk hirisan jantung yang diwarnakan dengan troponin-T dan WGA (kiri) dan kuantifikasi saiz sel (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sel/kumpulan daripada 10 hirisan berbeza daripada babi berbeza, Ujian-t Pelajar Dua Ekor dilakukan; ****p < 0.0001 berbanding regangan normal). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) dan количественного опеникрадрадца (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хтевится хтеврюстой ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Imej perwakilan bahagian jantung yang diwarnakan dengan troponin-T dan AZP (kiri) dan kuantifikasi saiz sel (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) sel/kumpulan daripada 10 bahagian berbeza daripada babi berbeza, ujian-t Pelajar dua hujung telah dilakukan; ****p < 0.0001 berbanding strain normal). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性（3n0 MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比，****p < 0.0001）。 b Imej perwakilan hirisan jantung yang diwarnakan dengan calcarein-T dan WGA (kiri) dan saiz sel (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 daripada 10 hirisan berbeza (D6 MTNorm)) Sel/组，ujian t 两方法有尾学；berbanding dengan regangan normal，****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) dan количественная озменка разменка (разменка) 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группа, двусторонние критерий Ста;юд0н сравнению с нормальным растяжением). b Imej perwakilan bahagian jantung yang diwarnakan dengan troponin-T dan AZP (kiri) dan kuantifikasi saiz sel (kanan) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) daripada 10 bahagian berbeza daripada babi berbeza) Sel/kumpulan, kriteria dua hujung t Pelajar; ****p < 0.0001 berbanding strain normal). c Imej perwakilan untuk hirisan jantung MTOS hari ke-0 dan hari ke-6 yang diimunolabel untuk troponin-T dan NFATC4 dan kuantifikasi translokasi NFATC4 kepada nukleus CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) hirisan/kumpulan daripada babi yang berbeza, Ujian-t Pelajar Dua Ekor dilakukan; *p < 0.05). c Imej perwakilan untuk hirisan jantung MTOS hari ke-0 dan hari ke-6 yang diimunolabel untuk troponin-T dan NFATC4 dan kuantifikasi translokasi NFATC4 kepada nukleus CM (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) hirisan/kumpulan daripada babi yang berbeza, Ujian-t Pelajar Dua Ekor dilakukan; *p < 0.05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 dan 6 hari MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, dan колицнч транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , вылнядяетстрикрикрой Стьюдента; *p < 0,05). c Imej perwakilan untuk bahagian jantung pada MTOS 0 dan 6 hari, diimunolabel untuk troponin-T dan NFATC4, dan kuantifikasi translokasi NFATC4 dalam nukleus sel kavernous (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) hirisan/kumpulan daripada babi yang berbeza) dilakukan dengan ujian-t Pelajar dua ekor; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、 MTOS) 3 (D0)、进行双尾学生t 检验；*p < 0.05). c Imej perwakilan imunolabeling calcanin-T dan NFATC4 第0天和第6天MTOS hirisan jantung, dan NFATC4 daripada nukleus sel NFATC4 易位至CM yang berbeza的quantity化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切时间双尾学生et 电影；*p < 0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS dalam 0 dan 6 hari untuk иммуномаркировки тропонином-Т dan NFATC4 dan колицнч транслокации NFATC4 в ядра CM daripada разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Синта, *юдента <0; *юдента. c Imej perwakilan hirisan jantung MTOS pada hari 0 dan 6 untuk pelabelan imunotropin-T dan NFATC4 dan kuantifikasi translokasi NFATC4 dalam nukleus CM daripada babi yang berbeza (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) hirisan/kumpulan, kriteria-t dua hujung Pelajar; *p < 0.05).Bar ralat mewakili min ± sisihan piawai.
Penyelidikan kardiovaskular translasi memerlukan model selular yang menghasilkan semula persekitaran jantung dengan tepat. Dalam kajian ini, peranti CTCM telah dibangunkan dan dicirikan yang boleh merangsang bahagian jantung yang sangat nipis. Sistem CTCM merangkumi rangsangan elektromekanikal yang disegerakkan secara fisiologi dan pengayaan cecair T3 dan Dex. Apabila bahagian jantung babi didedahkan kepada faktor-faktor ini, daya maju, integriti struktur, aktiviti metabolik dan ekspresi transkripsi kekal sama seperti dalam tisu jantung segar selepas 12 hari kultur. Di samping itu, regangan tisu jantung yang berlebihan boleh menyebabkan hipertrofi jantung yang disebabkan oleh hiperekstensi. Secara keseluruhan, keputusan ini menyokong peranan penting keadaan kultur fisiologi dalam mengekalkan fenotip jantung yang normal dan menyediakan platform untuk saringan ubat.
Banyak faktor menyumbang kepada penciptaan persekitaran optimum untuk fungsi dan kemandirian kardiomiosit. Faktor yang paling jelas berkaitan dengan (1) interaksi antara sel, (2) rangsangan elektromekanikal, (3) faktor humoral, dan (4) substrat metabolik. Interaksi sel-ke-sel fisiologi memerlukan rangkaian tiga dimensi kompleks pelbagai jenis sel yang disokong oleh matriks ekstraselular. Interaksi selular yang kompleks sedemikian sukar untuk dibina semula secara in vitro melalui kultur bersama jenis sel individu, tetapi boleh dicapai dengan mudah menggunakan sifat organotip bahagian jantung.
Regangan mekanikal dan rangsangan elektrik kardiomiosit adalah penting untuk mengekalkan fenotip jantung33,34,35. Walaupun rangsangan mekanikal telah digunakan secara meluas untuk pengkondisian dan pematangan hiPSC-CM, beberapa kajian yang elegan baru-baru ini telah mencuba rangsangan mekanikal hirisan jantung dalam kultur menggunakan pemuatan uniaksial. Kajian ini menunjukkan bahawa pemuatan mekanikal uniaksial 2D mempunyai kesan positif pada fenotip jantung semasa kultur. Dalam kajian ini, bahagian jantung sama ada dimuatkan dengan daya tegangan isometrik17, pemuatan aukotonik linear18, atau kitaran jantung dicipta semula menggunakan maklum balas transduser daya dan pemacu ketegangan. Walau bagaimanapun, kaedah ini menggunakan regangan tisu uniaksial tanpa pengoptimuman persekitaran, mengakibatkan penindasan banyak gen jantung atau ekspresi berlebihan gen yang berkaitan dengan tindak balas regangan yang tidak normal. CTCM yang diterangkan di sini menyediakan rangsangan elektromekanikal 3D yang meniru kitaran jantung semula jadi dari segi masa kitaran dan regangan fisiologi (regangan 25%, sistol 40%, diastol 60%, dan 72 denyutan seminit). Walaupun rangsangan mekanikal tiga dimensi ini sahaja tidak mencukupi untuk mengekalkan integriti tisu, gabungan rangsangan humoral dan mekanikal menggunakan T3/Dex diperlukan untuk mengekalkan daya tahan, fungsi dan integriti tisu dengan secukupnya.
Faktor humoral memainkan peranan penting dalam memodulasi fenotip jantung dewasa. Ini telah diserlahkan dalam kajian HiPS-CM di mana T3 dan Dex telah ditambah kepada media kultur untuk mempercepatkan kematangan sel. T3 boleh mempengaruhi pengangkutan asid amino, gula dan kalsium merentasi membran sel36. Di samping itu, T3 menggalakkan ekspresi MHC-α dan penurunan regulasi MHC-β, menggalakkan pembentukan miofibril sentakan pantas dalam kardiomiosit matang berbanding miofibril sentakan perlahan dalam CM janin. Kekurangan T3 pada pesakit hipotiroid mengakibatkan kehilangan jalur miofibril dan kadar perkembangan tonus yang berkurangan37. Dex bertindak pada reseptor glukokortikoid dan telah terbukti meningkatkan pengecutan miokardium dalam jantung perfusi terpencil; 38 peningkatan ini dianggap berkaitan dengan kesan pada kemasukan berasaskan deposit kalsium (SOCE) 39,40. Di samping itu, Dex mengikat pada reseptornya, menyebabkan tindak balas intraselular yang luas yang menyekat fungsi imun dan keradangan30.
Keputusan kami menunjukkan bahawa rangsangan mekanikal fizikal (MS) meningkatkan prestasi kultur keseluruhan berbanding Ctrl, tetapi gagal mengekalkan daya maju, integriti struktur dan ekspresi jantung selama 12 hari dalam kultur. Berbanding Ctrl, penambahan T3 dan Dex kepada kultur CTCM (MT) meningkatkan daya maju dan mengekalkan profil transkripsi, integriti struktur dan aktiviti metabolik yang serupa dengan tisu jantung segar selama 12 hari. Di samping itu, dengan mengawal tahap regangan tisu, model hipertrofi jantung yang disebabkan oleh hiperekstensi telah dicipta menggunakan STCM, yang menggambarkan fleksibiliti sistem STCM. Perlu diingatkan bahawa walaupun pembentukan semula jantung dan fibrosis biasanya melibatkan organ utuh yang sel-selnya yang beredar boleh menyediakan sitokin yang sesuai serta fagositosis dan faktor pembentukan semula yang lain, bahagian jantung masih boleh meniru proses fibrotik sebagai tindak balas kepada tekanan dan trauma. Ini telah dinilai sebelum ini dalam model hirisan jantung ini. Perlu diingatkan bahawa parameter CTCM boleh dimodulasi dengan mengubah amplitud dan frekuensi tekanan/elektrik untuk mensimulasikan banyak keadaan seperti takikardia, bradikardia dan sokongan peredaran mekanikal (jantung tanpa beban mekanikal). Ini menjadikan sistem ini sebagai daya pemprosesan sederhana untuk ujian ubat. Keupayaan CTCM untuk memodelkan hipertrofi jantung yang disebabkan oleh terlalu banyak tenaga membuka jalan untuk menguji sistem ini untuk terapi yang diperibadikan. Kesimpulannya, kajian ini menunjukkan bahawa regangan mekanikal dan rangsangan humoral adalah penting untuk mengekalkan kultur bahagian tisu jantung.
Walaupun data yang dibentangkan di sini menunjukkan bahawa CTCM merupakan platform yang sangat menjanjikan untuk pemodelan miokardium yang utuh, kaedah kultur ini mempunyai beberapa batasan. Batasan utama kultur CTCM ialah ia mengenakan tekanan mekanikal dinamik berterusan pada hirisan, yang menghalang keupayaan untuk memantau secara aktif pengecutan hirisan jantung semasa setiap kitaran. Di samping itu, disebabkan saiz bahagian jantung yang kecil (7 mm), keupayaan untuk menilai fungsi sistolik di luar sistem kultur menggunakan sensor daya tradisional adalah terhad. Dalam manuskrip semasa, kami sebahagiannya mengatasi batasan ini dengan menilai voltan optik sebagai penunjuk fungsi pengecutan. Walau bagaimanapun, batasan ini memerlukan kerja selanjutnya dan mungkin ditangani pada masa hadapan dengan memperkenalkan kaedah untuk pemantauan optik fungsi hirisan jantung dalam kultur, seperti pemetaan optik menggunakan kalsium dan pewarna sensitif voltan. Satu lagi batasan CTCM ialah model kerja tidak memanipulasi tekanan fisiologi (pramuat dan selepas beban). Dalam CTCM, tekanan diinduksi dalam arah yang bertentangan untuk menghasilkan semula regangan fisiologi 25% dalam diastol (regangan penuh) dan sistol (tempoh pengecutan semasa rangsangan elektrik) dalam tisu yang sangat besar. Batasan ini harus dihapuskan dalam reka bentuk CTCM masa hadapan dengan tekanan yang mencukupi pada tisu jantung dari kedua-dua belah pihak dan dengan menggunakan hubungan tekanan-isipadu yang tepat yang berlaku di dalam ruang jantung.
Pengubahsuaian yang disebabkan oleh regangan berlebihan yang dilaporkan dalam manuskrip ini terhad kepada meniru isyarat hiperregangan hipertrofik. Oleh itu, model ini dapat membantu dalam kajian isyarat hipertrofik yang disebabkan oleh regangan tanpa memerlukan faktor humoral atau saraf (yang tidak wujud dalam sistem ini). Kajian lanjut diperlukan untuk meningkatkan kepelbagaian CTCM, contohnya, pengkulturan bersama dengan sel imun, faktor humoral plasma yang beredar, dan persarafan apabila pengkulturan bersama dengan sel neuron akan meningkatkan kemungkinan pemodelan penyakit dengan CTCM.
Tiga belas ekor babi telah digunakan dalam kajian ini. Semua prosedur haiwan telah dijalankan mengikut garis panduan institusi dan telah diluluskan oleh Jawatankuasa Penjagaan dan Penggunaan Haiwan Institusi Universiti Louisville. Lengkungan aorta telah diapit dan jantung telah diperfusikan dengan 1 L kardioplegia steril (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL heparin, pH sehingga 7.4); Jantung diawet dalam larutan kardioplegik yang sejuk sehingga diangkut ke makmal di atas ais yang biasanya <10 minit. Jantung diawet dalam larutan kardioplegik yang sejuk sehingga diangkut ke makmal di atas ais yang biasanya <10 minit. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <. Jantung disimpan dalam larutan kardioplegik yang sejuk sehingga diangkut ke makmal di atas ais, yang biasanya mengambil masa <10 minit.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟。 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 minit. Pastikan jantung berada di atas ais atau kardioplegia sehingga dibawa ke makmal di atas ais, biasanya <10 minit.
Peranti CTCM telah dibangunkan dalam perisian reka bentuk berbantukan komputer (CAD) SolidWorks. Ruang kultur, pembahagi dan ruang udara diperbuat daripada plastik akrilik jernih CNC. Cincin sandaran berdiameter 7mm diperbuat daripada polietilena ketumpatan tinggi (HDPE) di bahagian tengah dan mempunyai alur cincin-o untuk menampung cincin-o silikon yang digunakan untuk menutup media di bawahnya. Membran silika nipis memisahkan ruang kultur daripada plat pemisahan. Membran silikon dipotong laser daripada kepingan silikon setebal 0.02″ dan mempunyai kekerasan 35A. Gasket silikon bawah dan atas dipotong laser daripada kepingan silikon setebal 1/16″ dan mempunyai kekerasan 50A. Skru keluli tahan karat 316L dan nat sayap digunakan untuk mengikat blok dan mencipta pengedap kedap udara.
Papan litar bercetak (PCB) khusus direka bentuk untuk disepadukan dengan sistem C-PACE-EM. Soket penyambung mesin Swiss pada PCB disambungkan kepada elektrod grafit melalui wayar kuprum bersalut perak dan skru gangsa 0-60 yang diskrukan ke dalam elektrod. Papan litar bercetak diletakkan di dalam penutup pencetak 3D.
Peranti CTCM dikawal oleh penggerak pneumatik boleh atur cara (PPD) yang menghasilkan tekanan peredaran terkawal yang serupa dengan kitaran jantung. Apabila tekanan di dalam ruang udara meningkat, membran silikon fleksibel mengembang ke atas, memaksa medium ke bawah tapak tisu. Kawasan tisu kemudiannya akan diregangkan oleh pengusiran cecair ini, meniru pengembangan fisiologi jantung semasa diastole. Pada puncak relaksasi, rangsangan elektrik dikenakan melalui elektrod grafit, yang mengurangkan tekanan di dalam ruang udara dan menyebabkan pengecutan bahagian tisu. Di dalam paip terdapat injap hemostatik dengan sensor tekanan untuk mengesan tekanan dalam sistem udara. Tekanan yang dikesan oleh sensor tekanan dikenakan pada pengumpul data yang disambungkan ke komputer riba. Ini membolehkan pemantauan berterusan tekanan di dalam ruang gas. Apabila tekanan ruang maksimum dicapai (standard 80 mmHg, 140 mmHg OS), peranti pemerolehan data diperintahkan untuk menghantar isyarat kepada sistem C-PACE-EM untuk menjana isyarat voltan dwifasa selama 2 ms, ditetapkan kepada 4 V.
Bahagian jantung telah diperoleh dan keadaan kultur dalam 6 telaga telah dilakukan seperti berikut: Pindahkan jantung yang dituai dari bekas pemindahan ke dulang yang mengandungi kardioplegia sejuk (4° C). Ventrikel kiri diasingkan dengan bilah steril dan dipotong menjadi kepingan 1-2 cm3. Blok tisu ini dilekatkan pada penyokong tisu dengan pelekat tisu dan diletakkan di dalam rendaman tisu mikrotom bergetar yang mengandungi larutan Tyrode dan dioksigenkan secara berterusan (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g) , 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-glukosa (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M larutan), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml 1 M larutan), sehingga 1 L ddH2O). Mikrotom bergetar ditetapkan untuk memotong hirisan setebal 300 µm pada frekuensi 80 Hz, amplitud getaran mendatar 2 mm, dan kadar pendahuluan 0.03 mm/s. Tab mandi tisu dikelilingi oleh ais untuk memastikan larutan sejuk dan suhu dikekalkan pada 4°C. Pindahkan bahagian tisu dari tab mandi mikrotom ke tab mandi pengeraman yang mengandungi larutan Tyrode beroksigen berterusan di atas ais sehingga bahagian yang mencukupi diperolehi untuk satu plat kultur. Untuk kultur transwell, bahagian tisu dilekatkan pada penyokong poliuretana steril selebar 6 mm dan diletakkan dalam 6 ml medium yang dioptimumkan (199 medium, 1x suplemen ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkali dan 2X antibiotik-antifungal). Rangsangan elektrik (10 V, frekuensi 1.2 Hz) dikenakan pada bahagian tisu melalui C-Pace. Untuk keadaan TD, T3 dan Dex segar ditambah pada 100 nM dan 1 μM pada setiap pertukaran medium. Medium tersebut ditepu dengan oksigen sebelum penggantian 3 kali sehari. Keratan tisu dikultur dalam inkubator pada suhu 37°C dan 5% CO2.
Untuk kultur CTCM, keratan tisu diletakkan pada pencetak 3D buatan khas dalam piring Petri yang mengandungi larutan Tyrode yang diubah suai. Peranti ini direka bentuk untuk meningkatkan saiz hirisan jantung sebanyak 25% daripada luas cincin sokongan. Ini dilakukan supaya bahagian jantung tidak meregang selepas dipindahkan dari larutan Tyrode ke medium dan semasa diastole. Menggunakan gam histoakrilik, keratan setebal 300 µm dipasang pada cincin sokongan berdiameter 7 mm. Selepas melekatkan keratan tisu pada cincin sokongan, potong keratan tisu berlebihan dan letakkan semula keratan tisu yang dilekatkan ke dalam tab mandi larutan Tyrode di atas ais (4°C) sehingga bahagian yang mencukupi telah disediakan untuk satu peranti. Jumlah masa pemprosesan untuk semua peranti tidak boleh melebihi 2 jam. Selepas 6 keratan tisu dilekatkan pada cincin sokongannya, peranti CTCM dipasang. Ruang kultur CTCM diisi terlebih dahulu dengan 21 ml medium pra-oksigen. Pindahkan keratan tisu ke ruang kultur dan keluarkan sebarang gelembung udara dengan berhati-hati menggunakan pipet. Bahagian tisu kemudiannya dipandu ke dalam lubang dan ditekan perlahan-lahan pada tempatnya. Akhir sekali, letakkan penutup elektrod pada peranti dan pindahkan peranti ke inkubator. Kemudian sambungkan CTCM ke tiub udara dan sistem C-PACE-EM. Penggerak pneumatik terbuka dan injap udara membuka CTCM. Sistem C-PACE-EM dikonfigurasikan untuk menghantar 4 V pada 1.2 Hz semasa rentak dwifasa selama 2 ms. Medium ditukar dua kali sehari dan elektrod ditukar sekali sehari untuk mengelakkan pengumpulan grafit pada elektrod. Jika perlu, bahagian tisu boleh dikeluarkan dari telaga kulturnya untuk mengeluarkan sebarang gelembung udara yang mungkin jatuh di bawahnya. Untuk keadaan rawatan MT, T3/Dex ditambah segar dengan setiap pertukaran medium dengan 100 nM T3 dan 1 μM Dex. Peranti CTCM dikultur dalam inkubator pada suhu 37°C dan 5% CO2.
Untuk mendapatkan trajektori hirisan jantung yang diregangkan, sistem kamera khas telah dibangunkan. Kamera SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Jepun) telah digunakan dengan kanta makro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA). Visualisasi telah dilakukan pada suhu bilik selepas menggantikan medium dengan medium baharu. Kamera diletakkan pada sudut 51° dan video dirakam pada 30 bingkai sesaat. Pertama, perisian sumber terbuka (MUSCLEMOTION43) telah digunakan dengan Image-J untuk mengukur pergerakan hirisan jantung. Topeng telah dicipta menggunakan MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) untuk menentukan kawasan yang diminati untuk memukul hirisan jantung bagi mengelakkan hingar. Topeng yang disegmenkan secara manual digunakan pada semua imej dalam jujukan bingkai dan kemudian dihantar ke pemalam MUSCLEMOTION. Muscle Motion menggunakan keamatan purata piksel dalam setiap bingkai untuk mengukur pergerakannya berbanding bingkai rujukan. Data telah direkodkan, ditapis dan digunakan untuk mengukur masa kitaran dan menilai regangan tisu semasa kitaran jantung. Video yang dirakam telah diproses secara pasca menggunakan penapis digital fasa sifar tertib pertama. Untuk mengukur regangan tisu (puncak ke puncak), analisis puncak ke puncak telah dilakukan untuk membezakan antara puncak dan palung dalam isyarat yang dirakam. Di samping itu, detrending dilakukan menggunakan polinomial tertib ke-6 untuk menghapuskan hanyutan isyarat. Kod program telah dibangunkan dalam MATLAB untuk menentukan gerakan tisu global, masa kitaran, masa pengenduran dan masa pengecutan (Kod Program Tambahan 44).
Untuk analisis terikan, menggunakan video yang sama yang dicipta untuk penilaian regangan mekanikal, kami mula-mula mengesan dua imej yang mewakili puncak gerakan (titik gerakan tertinggi (atas) dan terendah (bawah)) mengikut perisian MUSCLEMOTION. Kemudian kami menyegmentasikan kawasan tisu dan menggunakan satu bentuk algoritma teduhan pada tisu yang tersegmentasi (Rajah Tambahan 2a). Tisu yang tersegmentasi kemudiannya dibahagikan kepada sepuluh permukaan bawah, dan tegasan pada setiap permukaan dikira menggunakan persamaan berikut: Terikan = (Sup-Sdown)/Sdown, di mana Sup dan Sdown masing-masing ialah jarak bentuk dari bayang-bayang atas dan bawah fabrik (Rajah Tambahan .2b).
Keratan jantung telah difiksasi dalam 4% paraformaldehid selama 48 jam. Tisu yang difiksasi telah dinyahhidratkan dalam 10% dan 20% sukrosa selama 1 jam, kemudian dalam 30% sukrosa semalaman. Keratan tersebut kemudiannya dibenamkan dalam sebatian suhu pemotongan optimum (sebatian OCT) dan dibekukan secara beransur-ansur dalam mandian isopentana/ais kering. Simpan blok pembenaman OCT pada -80 °C sehingga terpisah. Slaid disediakan sebagai keratan dengan ketebalan 8 μm.
Untuk menanggalkan OCT daripada bahagian jantung, panaskan slaid di atas blok pemanasan pada suhu 95 °C selama 5 minit. Tambahkan 1 ml PBS ke setiap slaid dan inkubasi selama 30 minit pada suhu bilik, kemudian resapi bahagian tersebut dengan menetapkan 0.1% Triton-X dalam PBS selama 15 minit pada suhu bilik. Untuk mengelakkan antibodi bukan spesifik daripada mengikat pada sampel, tambahkan 1 ml larutan BSA 3% ke dalam slaid dan inkubasi selama 1 jam pada suhu bilik. BSA kemudian dikeluarkan dan slaid dibasuh dengan PBS. Tandakan setiap sampel dengan pensel. Antibodi primer (dicairkan 1:200 dalam 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) dan troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) telah ditambah selama 90 minit, kemudian antibodi sekunder (dicairkan 1:200 dalam 1% BSA) terhadap tikus Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079), terhadap arnab Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) selama 90 minit tambahan. Dibasuh 3 kali dengan PBS Untuk membezakan pewarnaan sasaran daripada latar belakang, kami hanya menggunakan antibodi sekunder sebagai kawalan. Akhir sekali, pewarnaan nuklear DAPI telah ditambah dan slaid diletakkan di dalam vectashield (Vector Laboratories) dan dimeteraikan dengan pengilat kuku. Pembesaran -x) dan mikroskop Keyence dengan pembesaran 40x.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) pada 5 μg/ml dalam PBS telah digunakan untuk pewarnaan WGA dan disapu pada bahagian tetap selama 30 minit pada suhu bilik. Slaid kemudian dibasuh dengan PBS dan Sudan black ditambah pada setiap slaid dan diinkubasi selama 30 minit. Slaid kemudian dibasuh dengan PBS dan medium penyematan vectashield ditambah. Slaid divisualisasikan pada mikroskop Keyence pada pembesaran 40x.
OCT telah dikeluarkan daripada sampel seperti yang diterangkan di atas. Selepas mengeluarkan OCT, rendamkan slaid dalam larutan Bouin semalaman. Slaid kemudiannya dibilas dengan air suling selama 1 jam dan kemudian diletakkan dalam larutan fuchsin asid aloe Bibrich selama 10 minit. Kemudian slaid dibasuh dengan air suling dan diletakkan dalam larutan 5% fosfomolibdenum/5% asid fosfotungstik selama 10 minit. Tanpa membilas, pindahkan slaid terus ke dalam larutan biru anilin selama 15 minit. Kemudian slaid dibasuh dengan air suling dan diletakkan dalam larutan asid asetik 1% selama 2 minit. Slaid dikeringkan dalam 200 N etanol dan dipindahkan ke dalam xilena. Slaid yang diwarnakan divisualisasikan menggunakan mikroskop Keyence dengan objektif 10x. Peratusan luas fibrosis diukur menggunakan perisian Keyence Analyzer.
Ujian Daya Tahan Sel MTT CyQUANT™ (Invitrogen, Carlsbad, CA), nombor katalog V13154, mengikut protokol pengilang dengan beberapa pengubahsuaian. Khususnya, penebuk pembedahan dengan diameter 6 mm telah digunakan untuk memastikan saiz tisu yang seragam semasa analisis MTT. Tisu telah disalut secara individu ke dalam telaga plat 12-telaga yang mengandungi substrat MTT mengikut protokol pengilang. Bahagian-bahagian tersebut diinkubasi pada suhu 37° C selama 3 jam dan tisu hidup memetabolismekan substrat MTT untuk membentuk sebatian formazan ungu. Gantikan larutan MTT dengan 1 ml DMSO dan inkubasi pada suhu 37°C selama 15 minit untuk mengekstrak formazan ungu daripada bahagian jantung. Sampel telah dicairkan 1:10 dalam DMSO dalam plat bawah jernih 96-telaga dan keamatan warna ungu diukur pada 570 nm menggunakan pembaca plat Cytation (BioTek). Bacaan telah dinormalkan kepada berat setiap hirisan jantung.
Media hirisan jantung telah digantikan dengan media yang mengandungi 1 μCi/ml [5-3H]-glukosa (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) untuk ujian penggunaan glukosa seperti yang diterangkan sebelum ini. Selepas 4 jam pengeraman, tambahkan 100 µl medium ke dalam tiub mikroempar terbuka yang mengandungi 100 µl 0.2 N HCl. Kemudian tiub tersebut diletakkan di dalam tiub sintilasi yang mengandungi 500 μl dH2O untuk menyejatkan [3H]2O selama 72 jam pada suhu 37°C. Kemudian keluarkan tiub mikroempar dari tiub sintilasi dan tambahkan 10 ml cecair sintilasi. Pengiraan sintilasi telah dilakukan menggunakan penganalisis sintilasi cecair Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). Penggunaan glukosa kemudiannya dikira dengan mengambil kira aktiviti spesifik [5-3H]-glukosa, keseimbangan dan latar belakang yang tidak lengkap, pencairan [5-3H]-kepada glukosa tidak berlabel, dan kecekapan balas sintilasi. Data dinormalkan kepada jisim bahagian jantung.
Selepas homogenisasi tisu dalam Trizol, RNA diasingkan daripada bahagian jantung menggunakan Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 mengikut protokol pengeluar. Penyediaan, penjujukan dan analisis data perpustakaan RNAsec telah dilakukan seperti berikut:
1 μg RNA setiap sampel telah digunakan sebagai bahan permulaan untuk penyediaan pustaka RNA. Pustaka penjujukan telah dijana menggunakan Kit Persediaan Pustaka RNA NEBNext UltraTM untuk Illumina (NEB, USA) mengikut cadangan pengilang, dan kod indeks telah ditambah pada jujukan atribut untuk setiap sampel. Secara ringkas, mRNA telah ditulenkan daripada jumlah RNA menggunakan manik magnet yang dilekatkan dengan oligonukleotida poli-T. Fragmentasi dijalankan menggunakan kation divalen pada suhu tinggi dalam Penimbal Tindak Balas Sintesis Untaian Pertama NEBNext (5X). cDNA untaian pertama disintesis menggunakan primer heksamer rawak dan transkriptase terbalik M-MuLV (RNase H-). cDNA untaian kedua kemudiannya disintesis menggunakan DNA polimerase I dan RNase H. Baki overhang ditukar kepada hujung tumpul melalui aktiviti eksonuklease/polimerase. Selepas adenilasi hujung 3′ serpihan DNA, Penyesuai NEBNext dengan struktur gelung jepit rambut dilekatkan padanya untuk menyediakannya untuk penghibridan. Untuk pemilihan serpihan cDNA dengan panjang pilihan 150-200 bp. Serpihan perpustakaan telah ditulenkan menggunakan sistem AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA). Kemudian, 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) dengan cDNA terpilih saiz yang diligasi dengan penyesuai telah digunakan selama 15 minit pada suhu 37°C dan kemudian selama 5 minit pada suhu 95°C sebelum PCR. PCR kemudiannya dilakukan menggunakan polimerase DNA Fidelity Tinggi Phusion, primer PCR universal dan primer Indeks (X). Akhir sekali, produk PCR telah ditulenkan (sistem AMPure XP) dan kualiti perpustakaan dinilai pada sistem Agilent Bioanalyzer 2100. Perpustakaan cDNA kemudiannya dijujukan menggunakan penjujukan Novaseq. Fail imej mentah daripada Illumina ditukar kepada bacaan mentah menggunakan CASAVA Base Calling. Data mentah disimpan dalam fail format FASTQ(fq) yang mengandungi jujukan bacaan dan kualiti asas yang sepadan. Pilih HISAT2 untuk memadankan bacaan penjujukan yang ditapis dengan genom rujukan Sscrofa11.1. Secara amnya, HISAT2 menyokong genom daripada sebarang saiz, termasuk genom yang lebih besar daripada 4 bilion bes, dan nilai lalai ditetapkan untuk kebanyakan parameter. Bacaan penyambungan daripada data Jujukan RNA boleh diselaraskan dengan cekap menggunakan HISAT2, sistem terpantas yang tersedia pada masa ini, dengan ketepatan yang sama atau lebih baik daripada kaedah lain.
Kelimpahan transkrip secara langsung mencerminkan tahap ekspresi gen. Tahap ekspresi gen dinilai oleh kelimpahan transkrip (kiraan penjujukan) yang berkaitan dengan genom atau ekson. Bilangan bacaan adalah berkadar dengan tahap ekspresi gen, panjang gen dan kedalaman penjujukan. FPKM (serpihan setiap seribu pasangan asas transkrip yang dijujukan setiap juta pasangan asas) dikira dan nilai-P bagi ekspresi pembezaan ditentukan menggunakan pakej DESeq2. Kami kemudian mengira kadar penemuan palsu (FDR) untuk setiap nilai P menggunakan kaedah Benjamini-Hochberg9 berdasarkan fungsi-R terbina dalam "p.adjust".
RNA yang diasingkan daripada keratan jantung telah ditukar kepada cDNA pada kepekatan 200 ng/μl menggunakan campuran SuperScript IV Vilo Master daripada Thermo (Thermo, no. kat. 11756050). RT-PCR kuantitatif telah dilakukan menggunakan plat tindak balas lutsinar Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-perigi (Thermo, no. kat. 4483319) dan pelekat optik mikroamp (Thermo, no. kat. 4311971). Campuran tindak balas terdiri daripada 5 µl campuran Taqman Fast Advanced Master (Thermo, no. kat. 4444557), 0.5 µl Taqman Primer dan 3.5 µl H2O yang dicampurkan setiap perigi. Kitaran qPCR standard telah dijalankan dan nilai CT telah diukur menggunakan instrumen PCR masa nyata Applied Biosystems Quantstudio 5 (modul 384-perigi; produk # A28135). Primer Taqman telah dibeli daripada Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Nilai CT semua sampel telah dinormalisasikan kepada gen pengemasan GAPDH.
Pelepasan media NT-ProBNP telah dinilai menggunakan kit NT-ProBNP (babi) (No. Cat. MBS2086979, MyBioSource) mengikut protokol pengilang. Secara ringkas, 250 µl setiap sampel dan piawai telah ditambah secara berganda ke dalam setiap telaga. Sejurus selepas menambah sampel, tambahkan 50 µl Reagen Asai A ke dalam setiap telaga. Goncangkan plat dengan lembut dan tutup dengan pengedap. Kemudian tablet diinkubasi pada suhu 37°C selama 1 jam. Kemudian sedut larutan dan basuh telaga sebanyak 4 kali dengan 350 µl larutan cucian 1X, inkubasi larutan cucian selama 1-2 minit setiap kali. Kemudian tambahkan 100 µl Reagen Asai B setiap telaga dan tutup dengan pengedap plat. Tablet digoncangkan dengan lembut dan diinkubasi pada suhu 37°C selama 30 minit. Sedut larutan dan basuh telaga sebanyak 5 kali dengan 350 µl larutan cucian 1X. Tambahkan 90 µl larutan substrat ke dalam setiap telaga dan tutup plat. Inkubasi plat pada suhu 37°C selama 10-20 minit. Tambahkan 50 µl Stop Solution ke dalam setiap telaga. Plat diukur serta-merta menggunakan pembaca plat Cytation (BioTek) yang ditetapkan pada 450 nm.
Analisis kuasa telah dijalankan untuk memilih saiz kumpulan yang akan memberikan kuasa >80% untuk mengesan perubahan mutlak 10% dalam parameter dengan kadar ralat Jenis I 5%. Analisis kuasa telah dijalankan untuk memilih saiz kumpulan yang akan memberikan kuasa >80% untuk mengesan perubahan mutlak 10% dalam parameter dengan kadar ralat Jenis I 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаруженибт 10% изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Analisis kuasa telah dijalankan untuk memilih saiz kumpulan yang akan memberikan kuasa >80% untuk mengesan perubahan parameter mutlak 10% dengan kadar ralat Jenis I 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5＇I将秋金进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5＇I将秋金 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаруложлотябня изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Analisis kuasa telah dijalankan untuk memilih saiz kumpulan yang akan memberikan kuasa >80% untuk mengesan perubahan parameter mutlak 10% dan kadar ralat jenis I 5%.Keratan tisu dipilih secara rawak sebelum eksperimen. Semua analisis adalah buta keadaan dan sampel dinyahkod hanya selepas semua data dianalisis. Perisian GraphPad Prism (San Diego, CA) telah digunakan untuk melaksanakan semua analisis statistik. Bagi semua statistik, nilai-p dianggap signifikan pada nilai <0.05. Bagi semua statistik, nilai-p dianggap signifikan pada nilai <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Bagi semua statistik, nilai-p dianggap signifikan pada nilai <0.05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Bagi semua statistik, nilai-p dianggap signifikan pada nilai <0.05.Ujian-t Pelajar Dua Hujung telah dijalankan ke atas data dengan hanya 2 perbandingan. ANOVA sehala atau dua hala telah digunakan untuk menentukan kepentingan antara berbilang kumpulan. Semasa menjalankan ujian post hoc, pembetulan Tukey telah digunakan untuk mengambil kira berbilang perbandingan. Data RNAsec mempunyai pertimbangan statistik khas semasa mengira FDR dan p.adjust seperti yang diterangkan dalam bahagian Kaedah.
Untuk maklumat lanjut tentang reka bentuk kajian, lihat abstrak Laporan Penyelidikan Alam Semula Jadi yang dipautkan dengan artikel ini.