Nature.com ની મુલાકાત લેવા બદલ આભાર.તમે જે બ્રાઉઝર સંસ્કરણનો ઉપયોગ કરી રહ્યાં છો તે મર્યાદિત CSS સપોર્ટ ધરાવે છે.શ્રેષ્ઠ અનુભવ માટે, અમે ભલામણ કરીએ છીએ કે તમે અપડેટ કરેલ બ્રાઉઝરનો ઉપયોગ કરો (અથવા Internet Explorer માં સુસંગતતા મોડને અક્ષમ કરો).આ દરમિયાન, સતત સમર્થન સુનિશ્ચિત કરવા માટે, અમે શૈલીઓ અને JavaScript વિના સાઇટને રેન્ડર કરીશું.
દવાના પરીક્ષણ માટે હૃદયના શારીરિક વાતાવરણનું ચોક્કસ પુનઃઉત્પાદન કરી શકે તેવી વિશ્વસનીય ઇન વિટ્રો સિસ્ટમની જરૂર છે.માનવ હૃદયની પેશી સંવર્ધન પ્રણાલીઓની મર્યાદિત ઉપલબ્ધતાને કારણે કાર્ડિયાક દવાની અસરોનું અચોક્કસ અર્થઘટન થયું છે.અહીં, અમે કાર્ડિયાક ટિશ્યુ કલ્ચર મોડલ (CTCM) વિકસાવ્યું છે જે ઇલેક્ટ્રોમિકેનિકલ રીતે હૃદયના ટુકડાને ઉત્તેજિત કરે છે અને કાર્ડિયાક ચક્રના સિસ્ટોલિક અને ડાયસ્ટોલિક તબક્કાઓ દરમિયાન શારીરિક ખેંચાણમાંથી પસાર થાય છે.12 દિવસની સંસ્કૃતિ પછી, આ અભિગમથી હૃદયના ભાગોની કાર્યક્ષમતામાં આંશિક સુધારો થયો, પરંતુ તેની માળખાકીય અખંડિતતાને સંપૂર્ણપણે સાચવી શકી નહીં.તેથી, નાના પરમાણુ સ્ક્રિનિંગ પછી, અમને જાણવા મળ્યું કે અમારા માધ્યમમાં 100 nM ટ્રાઇઓડોથાયરોનિન (T3) અને 1 μM ડેક્સામેથાસોન (Dex) ઉમેરવાથી વિભાગોની માઇક્રોસ્ટ્રક્ચર 12 દિવસ સુધી જળવાઈ રહે છે.T3/Dex સારવાર સાથે સંયોજનમાં, CTCM સિસ્ટમે 12 દિવસ સુધી તાજા હૃદયની પેશીઓની જેમ જ સ્તરે ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ રૂપરેખાઓ, કાર્યક્ષમતા, મેટાબોલિક પ્રવૃત્તિ અને માળખાકીય અખંડિતતા જાળવી રાખી હતી.વધુમાં, કલ્ચરમાં કાર્ડિયાક પેશીનું વધુ પડતું ખેંચાણ હાયપરટ્રોફિક કાર્ડિયાક સિગ્નલિંગને પ્રેરિત કરે છે, જે કાર્ડિયાક સ્ટ્રેચ દ્વારા પ્રેરિત હાયપરટ્રોફિક પરિસ્થિતિઓની નકલ કરવા માટે સીટીસીએમની ક્ષમતા માટે પુરાવા આપે છે.નિષ્કર્ષમાં, CTCM લાંબા સમય સુધી સંસ્કૃતિમાં હૃદયના શરીરવિજ્ઞાન અને પેથોફિઝિયોલોજીનું મોડેલ બનાવી શકે છે, જેનાથી વિશ્વસનીય દવાની તપાસ થઈ શકે છે.
ક્લિનિકલ સંશોધન પહેલાં, વિટ્રો સિસ્ટમ્સની વિશ્વસનીયતા જરૂરી છે જે માનવ હૃદયના શારીરિક વાતાવરણને ચોક્કસ રીતે પુનઃઉત્પાદિત કરી શકે.આવી સિસ્ટમોએ બદલાયેલ યાંત્રિક ખેંચાણ, હૃદયના ધબકારા અને ઇલેક્ટ્રોફિઝીયોલોજીકલ ગુણધર્મોની નકલ કરવી જોઈએ.માનવીય હૃદયમાં દવાઓની અસરોને પ્રતિબિંબિત કરવા માટે મર્યાદિત વિશ્વસનીયતા સાથે કાર્ડિયાક ફિઝિયોલોજીના સ્ક્રીનીંગ પ્લેટફોર્મ તરીકે સામાન્ય રીતે પશુ મોડેલોનો ઉપયોગ થાય છે.આખરે, આદર્શ કાર્ડિયાક ટિશ્યુ કલ્ચર એક્સપેરિમેન્ટલ મોડલ (CTCM) એ એક મોડેલ છે જે અત્યંત સંવેદનશીલ અને વિવિધ રોગનિવારક અને ફાર્માકોલોજિકલ હસ્તક્ષેપો માટે વિશિષ્ટ છે, જે માનવ હૃદયના શરીરવિજ્ઞાન અને પેથોફિઝિયોલોજીનું ચોક્કસ પુનઃઉત્પાદન કરે છે.આવી સિસ્ટમની ગેરહાજરી હૃદયની નિષ્ફળતા 4,5 માટે નવી સારવારની શોધને મર્યાદિત કરે છે અને બજારમાંથી બહાર નીકળવાના મુખ્ય કારણ તરીકે ડ્રગ કાર્ડિયોટોક્સિસિટી તરફ દોરી જાય છે.
છેલ્લા એક દાયકામાં, 8 નોન-કાર્ડિયોવેસ્ક્યુલર દવાઓ ક્લિનિકલ ઉપયોગમાંથી પાછી ખેંચી લેવામાં આવી છે કારણ કે તેઓ ક્યુટી અંતરાલ લંબાવવાનું કારણ બને છે જે વેન્ટ્રિક્યુલર એરિથમિયા અને અચાનક મૃત્યુ તરફ દોરી જાય છે7.આમ, કાર્ડિયોવેસ્ક્યુલર અસરકારકતા અને ઝેરી અસરનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે વિશ્વસનીય પ્રીક્લિનિકલ સ્ક્રિનિંગ વ્યૂહરચનાઓની વધતી જતી જરૂરિયાત છે.ડ્રગ સ્ક્રિનિંગ અને ટોક્સિસિટી ટેસ્ટિંગમાં માનવ-પ્રેરિત પ્લુરીપોટન્ટ સ્ટેમ સેલ-ડેરિવ્ડ કાર્ડિયોમાયોસાઇટ્સ (hiPS-CM) નો તાજેતરનો ઉપયોગ આ સમસ્યાનો આંશિક ઉકેલ પૂરો પાડે છે.જો કે, hiPS-CM ની અપરિપક્વ પ્રકૃતિ અને કાર્ડિયાક પેશીઓની બહુકોષીય જટિલતાનો અભાવ આ પદ્ધતિની મુખ્ય મર્યાદાઓ છે.તાજેતરના અભ્યાસોએ દર્શાવ્યું છે કે સ્વયંસ્ફુરિત સંકોચનની શરૂઆતના થોડા સમય પછી અને સમય જતાં ધીમે ધીમે વિદ્યુત ઉત્તેજના વધારીને કાર્ડિયાક ટિશ્યુ હાઇડ્રોજેલ્સ બનાવવા માટે પ્રારંભિક hiPS-CMનો ઉપયોગ કરીને આ મર્યાદાને આંશિક રીતે દૂર કરી શકાય છે.જો કે, આ hiPS-CM માઇક્રોટીસ્યુમાં પુખ્ત મ્યોકાર્ડિયમના પરિપક્વ ઇલેક્ટ્રોફિઝીયોલોજીકલ અને સંકોચનીય ગુણધર્મોનો અભાવ હોય છે.વધુમાં, માનવ કાર્ડિયાક પેશી વધુ જટિલ માળખું ધરાવે છે, જેમાં વિવિધ પ્રકારના કોષોના વિજાતીય મિશ્રણનો સમાવેશ થાય છે, જેમાં એન્ડોથેલિયલ કોશિકાઓ, ચેતાકોષો અને સ્ટ્રોમલ ફાઈબ્રોબ્લાસ્ટ્સનો સમાવેશ થાય છે, જે એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર મેટ્રિક્સ પ્રોટીનના ચોક્કસ સેટ દ્વારા એકબીજા સાથે જોડાયેલા હોય છે.પુખ્ત સ્તન્ય પ્રાણીઓમાં ગર્ભમાં રહેલા બચ્ચાની રક્ષા માટેનું આચ્છાદન 11,12,13 નોન-કાર્ડિયોમાયોસાઇટ વસ્તીની આ વિવિધતા વ્યક્તિગત કોષોના પ્રકારોનો ઉપયોગ કરીને કાર્ડિયાક પેશીના મોડેલિંગ માટે મુખ્ય અવરોધ છે.આ મુખ્ય મર્યાદાઓ શારીરિક અને રોગવિજ્ઞાનવિષયક પરિસ્થિતિઓ હેઠળ અખંડ મ્યોકાર્ડિયલ પેશીઓના સંવર્ધન માટેની પદ્ધતિઓ વિકસાવવાના મહત્વ પર ભાર મૂકે છે.
માનવ હૃદયના સંસ્કારી પાતળા (300 µm) વિભાગો અખંડ માનવ મ્યોકાર્ડિયમનું આશાસ્પદ મોડેલ સાબિત થયા છે.આ પદ્ધતિ માનવ હૃદયની પેશીઓ જેવી જ સંપૂર્ણ 3D મલ્ટિસેલ્યુલર સિસ્ટમની ઍક્સેસ પ્રદાન કરે છે.જો કે, 2019 સુધી, સંસ્કારી હૃદય વિભાગોનો ઉપયોગ ટૂંકા (24 કલાક) સંસ્કૃતિ અસ્તિત્વ દ્વારા મર્યાદિત હતો.આ ભૌતિક-મિકેનિકલ સ્ટ્રેચ, એર-લિક્વિડ ઇન્ટરફેસ અને કાર્ડિયાક ટિશ્યુની જરૂરિયાતોને સમર્થન ન આપતા સાદા માધ્યમોનો ઉપયોગ સહિત સંખ્યાબંધ પરિબળોને કારણે છે.2019 માં, કેટલાક સંશોધન જૂથોએ દર્શાવ્યું હતું કે કાર્ડિયાક ટિશ્યુ કલ્ચર સિસ્ટમ્સમાં યાંત્રિક પરિબળોનો સમાવેશ કરવાથી સંસ્કૃતિનું જીવન લંબાય છે, કાર્ડિયાક અભિવ્યક્તિમાં સુધારો થાય છે અને કાર્ડિયાક પેથોલોજીની નકલ થઈ શકે છે.બે ભવ્ય અભ્યાસ 17 અને 18 દર્શાવે છે કે અક્ષીય યાંત્રિક લોડિંગ સંસ્કૃતિ દરમિયાન કાર્ડિયાક ફેનોટાઇપ પર હકારાત્મક અસર કરે છે.જો કે, આ અભ્યાસોએ કાર્ડિયાક ચક્રના ગતિશીલ ત્રિ-પરિમાણીય ભૌતિક-મિકેનિકલ લોડિંગનો ઉપયોગ કર્યો ન હતો, કારણ કે હૃદયના વિભાગો ક્યાં તો આઇસોમેટ્રિક ટેન્સાઇલ ફોર્સ 17 અથવા રેખીય ઑક્સોટોનિક લોડિંગ 18 સાથે લોડ કરવામાં આવ્યા હતા.ટીશ્યુ સ્ટ્રેચિંગની આ પદ્ધતિઓ ઘણા કાર્ડિયાક જનીનોના દમન અથવા અસામાન્ય ખેંચાણ પ્રતિભાવો સાથે સંકળાયેલા જનીનોના અતિશય અભિવ્યક્તિમાં પરિણમી હતી.નોંધનીય રીતે, પિટોલિસ એટ અલ.19 એ ફોર્સ ટ્રાન્સડ્યુસર ફીડબેક અને ટેન્શન ડ્રાઈવનો ઉપયોગ કરીને કાર્ડિયાક સાયકલ પુનઃનિર્માણ માટે ડાયનેમિક હાર્ટ સ્લાઈસ કલ્ચર બાથ વિકસાવ્યું છે.જો કે આ સિસ્ટમ વિટ્રો કાર્ડિયાક સાયકલ મોડેલિંગમાં વધુ સચોટતા માટે પરવાનગી આપે છે, પદ્ધતિની જટિલતા અને ઓછી થ્રુપુટ આ સિસ્ટમના ઉપયોગને મર્યાદિત કરે છે.અમારી લેબોરેટરીએ તાજેતરમાં 6 દિવસ સુધી પોર્સિન અને માનવ હૃદયની પેશીઓની કાર્યક્ષમતા જાળવવા માટે ઇલેક્ટ્રિકલ સ્ટીમ્યુલેશન અને ઑપ્ટિમાઇઝ માધ્યમનો ઉપયોગ કરીને એક સરળ કલ્ચર સિસ્ટમ વિકસાવી છે.
વર્તમાન હસ્તપ્રતમાં, અમે પોર્સિન હાર્ટના વિભાગોનો ઉપયોગ કરીને કાર્ડિયાક ટિશ્યુ કલ્ચર મોડલ (CTCM)નું વર્ણન કરીએ છીએ જે હ્રદય ચક્ર દરમિયાન ત્રિ-પરિમાણીય કાર્ડિયાક ફિઝિયોલોજી અને પેથોફિઝિયોલોજિકલ ડિસ્ટેન્શનને પુનઃપ્રાપ્ત કરવા માટે રમૂજી સંકેતોનો સમાવેશ કરે છે.આ CTCM પ્રી-ક્લિનિકલ દવાના પરીક્ષણ માટે સસ્તન પ્રાણીના હૃદયના ફિઝિયોલોજી/પેથોફિઝિયોલોજીની નકલ કરતી ખર્ચ-અસરકારક, મધ્ય-થ્રુપુટ કાર્ડિયાક સિસ્ટમ પ્રદાન કરીને પ્રી-ક્લિનિકલ ડ્રગ અનુમાનની ચોકસાઈને અગાઉ ક્યારેય પ્રાપ્ત ન કરી હોય તેવા સ્તરે વધારી શકે છે.
હેમોડાયનેમિક યાંત્રિક સંકેતો વિટ્રો 22,23,24 માં કાર્ડિયોમાયોસાઇટ કાર્યને જાળવવામાં મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકા ભજવે છે.વર્તમાન હસ્તપ્રતમાં, અમે એક CTCM (આકૃતિ 1a) વિકસાવ્યું છે જે શારીરિક ફ્રીક્વન્સીઝ (1.2 Hz, 72 ધબકારા પ્રતિ મિનિટ) પર વિદ્યુત અને યાંત્રિક બંને ઉત્તેજના પ્રેરિત કરીને પુખ્ત કાર્ડિયાક વાતાવરણની નકલ કરી શકે છે.ડાયસ્ટોલ દરમિયાન વધુ પડતા પેશીના ખેંચાણને ટાળવા માટે, 25% (ફિગ. 1b) દ્વારા પેશીના કદને વધારવા માટે 3D પ્રિન્ટીંગ ઉપકરણનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.C-PACE સિસ્ટમ દ્વારા પ્રેરિત ઇલેક્ટ્રિકલ પેસિંગને કાર્ડિયાક ચક્રને સંપૂર્ણ રીતે પુનઃઉત્પાદિત કરવા માટે ડેટા એક્વિઝિશન સિસ્ટમનો ઉપયોગ કરીને સિસ્ટોલ પહેલાં 100 ms શરૂ કરવાનો સમય નક્કી કરવામાં આવ્યો હતો.ટીશ્યુ કલ્ચર સિસ્ટમ ઉપલા ચેમ્બરમાં હૃદયના ટુકડાને વિસ્તરણ કરવા માટે લવચીક સિલિકોન પટલને ચક્રીય રીતે વિસ્તૃત કરવા માટે પ્રોગ્રામેબલ ન્યુમેટિક એક્ટ્યુએટર (LB એન્જિનિયરિંગ, જર્મની) નો ઉપયોગ કરે છે.સિસ્ટમ પ્રેશર ટ્રાન્સડ્યુસર દ્વારા બાહ્ય એર લાઇન સાથે જોડાયેલ હતી, જેણે દબાણ (± 1 mmHg) અને સમય (± 1 ms) (ફિગ. 1c) ને સચોટ રીતે ગોઠવવાનું શક્ય બનાવ્યું હતું.
a ઉપકરણના કલ્ચર ચેમ્બરની અંદર વાદળી રંગમાં બતાવેલ 7 મીમી સપોર્ટ રીંગ સાથે ટીશ્યુ સેક્શન જોડો.કલ્ચર ચેમ્બરને એર ચેમ્બરથી પાતળા લવચીક સિલિકોન પટલ દ્વારા અલગ કરવામાં આવે છે.લીક અટકાવવા માટે દરેક ચેમ્બર વચ્ચે ગાસ્કેટ મૂકો.ઉપકરણના ઢાંકણમાં ગ્રેફાઇટ ઇલેક્ટ્રોડ હોય છે જે વિદ્યુત ઉત્તેજના પ્રદાન કરે છે.b મોટા પેશી ઉપકરણ, માર્ગદર્શિકા રિંગ અને સપોર્ટ રિંગની યોજનાકીય રજૂઆત.પેશીના વિભાગો (બ્રાઉન) મોટા કદના ઉપકરણ પર ઉપકરણની બહારની ધાર પરના ખાંચામાં માર્ગદર્શક રિંગ સાથે મૂકવામાં આવે છે.માર્ગદર્શિકાનો ઉપયોગ કરીને, કાર્ડિયાક ટિશ્યુના વિભાગ પર ટીશ્યુ એક્રેલિક એડહેસિવ સાથે કોટેડ સપોર્ટ રિંગને કાળજીપૂર્વક મૂકો.c પ્રોગ્રામેબલ ન્યુમેટિક એક્ટ્યુએટર (PPD) દ્વારા નિયંત્રિત એર ચેમ્બરના દબાણના કાર્ય તરીકે વિદ્યુત ઉત્તેજનાના સમયને દર્શાવતો ગ્રાફ.પ્રેશર સેન્સર્સનો ઉપયોગ કરીને વિદ્યુત ઉત્તેજનાને સિંક્રનાઇઝ કરવા માટે ડેટા એક્વિઝિશન ડિવાઇસનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.જ્યારે કલ્ચર ચેમ્બરમાં દબાણ સેટ થ્રેશોલ્ડ સુધી પહોંચે છે, ત્યારે વિદ્યુત ઉત્તેજનાને ટ્રિગર કરવા માટે C-PACE-EM ને પલ્સ સિગ્નલ મોકલવામાં આવે છે.d ઇન્ક્યુબેટર શેલ્ફ પર મૂકવામાં આવેલી ચાર CTCMની છબી.ચાર ઉપકરણો વાયુયુક્ત સર્કિટ દ્વારા એક PPD સાથે જોડાયેલા હોય છે, અને ન્યુમેટિક સર્કિટમાં દબાણને મોનિટર કરવા માટે હિમોસ્ટેટિક વાલ્વમાં પ્રેશર સેન્સર દાખલ કરવામાં આવે છે.દરેક ઉપકરણમાં છ પેશી વિભાગો હોય છે.
એક ન્યુમેટિક એક્ટ્યુએટરનો ઉપયોગ કરીને, અમે 4 CTCM ઉપકરણોને નિયંત્રિત કરવામાં સક્ષમ હતા, જેમાંથી દરેક 6 પેશી વિભાગો (ફિગ. 1d) પકડી શકે છે.CTCM માં, હવાના ચેમ્બરમાં હવાનું દબાણ પ્રવાહી ચેમ્બરમાં સિંક્રનસ દબાણમાં રૂપાંતરિત થાય છે અને હૃદયના ટુકડાના શારીરિક વિસ્તરણને પ્રેરિત કરે છે (આકૃતિ 2a અને પૂરક મૂવી 1).80 mm Hg પર ટીશ્યુ સ્ટ્રેચનું મૂલ્યાંકન.કલા.25% (ફિગ. 2b) દ્વારા પેશી વિભાગોનું ખેંચાણ દર્શાવ્યું.આ ટકાવારી સ્ટ્રેચ સામાન્ય કાર્ડિયાક સેક્શન કોન્ટ્રાક્ટિલિટી17,19,25 માટે 2.2–2.3 µm ની ફિઝિયોલોજિકલ સરકોમેર લંબાઈને અનુરૂપ હોવાનું દર્શાવવામાં આવ્યું છે.કસ્ટમ કેમેરા સેટિંગ્સનો ઉપયોગ કરીને ટીશ્યુ મૂવમેન્ટનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું હતું (પૂરક આકૃતિ 1).પેશી ચળવળનું કંપનવિસ્તાર અને વેગ (ફિગ. 2c, d) કાર્ડિયાક ચક્ર દરમિયાન અને સિસ્ટોલ અને ડાયસ્ટોલ (ફિગ. 2b) દરમિયાનના સમયને અનુરૂપ છે.સંકોચન અને છૂટછાટ દરમિયાન હૃદયની પેશીઓનો ખેંચાણ અને વેગ સંસ્કૃતિમાં 12 દિવસ સુધી સ્થિર રહે છે (ફિગ. 2f).સંસ્કૃતિ દરમિયાન સંકોચન પર વિદ્યુત ઉત્તેજનાની અસરનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે, અમે શેડિંગ અલ્ગોરિધમ (પૂરક ફિગ. 2a,b) નો ઉપયોગ કરીને સક્રિય વિકૃતિ નક્કી કરવા માટેની એક પદ્ધતિ વિકસાવી છે અને વિદ્યુત ઉત્તેજના સાથે અને તેના વિના વિકૃતિઓ વચ્ચે તફાવત કરવામાં સક્ષમ છીએ.હૃદયનો સમાન વિભાગ (ફિગ. 2f).કટ (R6-9) ના જંગમ પ્રદેશમાં, વિદ્યુત ઉત્તેજનાની ગેરહાજરીમાં વિદ્યુત ઉત્તેજના દરમિયાન વોલ્ટેજ 20% વધારે હતું, જે સંકોચનીય કાર્યમાં વિદ્યુત ઉત્તેજનાનું યોગદાન સૂચવે છે.
એર ચેમ્બર પ્રેશર, ફ્લુઇડ ચેમ્બર પ્રેશર અને ટીશ્યુ ચળવળના માપના પ્રતિનિધિ નિશાનો પુષ્ટિ કરે છે કે ચેમ્બર દબાણ પ્રવાહી ચેમ્બરના દબાણમાં ફેરફાર કરે છે, જે પેશીના ટુકડાને અનુરૂપ હિલચાલનું કારણ બને છે.b ટકા સ્ટ્રેચ (નારંગી) ને અનુરૂપ પેશી વિભાગોના ટકા સ્ટ્રેચ (વાદળી) ના પ્રતિનિધિ નિશાન.c કાર્ડિયાક સ્લાઇસની માપેલી ગતિ ગતિની માપેલી ગતિ સાથે સુસંગત છે.(d) હૃદયના સ્લાઇસમાં ચક્રીય ગતિ (વાદળી રેખા) અને વેગ (નારંગી ટપકાંવાળી રેખા) ના પ્રતિનિધિ માર્ગો.e ચક્ર સમયનું પ્રમાણીકરણ (n = 19 જૂથ દીઠ સ્લાઇસેસ, વિવિધ ડુક્કરમાંથી), સંકોચન સમય (n = 19 જૂથ દીઠ સ્લાઇસેસ), આરામનો સમય (n = 19 જૂથ દીઠ સ્લાઇસેસ, વિવિધ ડુક્કરમાંથી), પેશીઓની હિલચાલ (n = 25 ).વિવિધ ડુક્કરમાંથી સ્લાઇસેસ)/જૂથ), પીક સિસ્ટોલિક વેગ (n = 24(D0), 25(D12) સ્લાઇસેસ/વિવિધ ડુક્કરમાંથી જૂથ) અને પીક રિલેક્સેશન રેટ (n=24(D0), 25(D12) સ્લાઇસેસ/જૂથ વિવિધ ડુક્કરમાંથી).બે પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીની ટી-ટેસ્ટમાં કોઈપણ પરિમાણમાં કોઈ નોંધપાત્ર તફાવત જોવા મળ્યો નથી.f (લાલ) અને (વાદળી) વિદ્યુત ઉત્તેજના સાથે પેશી વિભાગોના પ્રતિનિધિ તાણ વિશ્લેષણ નિશાનો, સમાન વિભાગમાંથી પેશી વિભાગોના દસ પ્રાદેશિક વિસ્તારો.નીચેની પેનલ વિવિધ વિભાગોમાંથી દસ વિસ્તારોમાં વિદ્યુત ઉત્તેજના સાથે અને વગર પેશી વિભાગોમાં તાણમાં ટકાવારીના તફાવતનું પ્રમાણ દર્શાવે છે. (n = 8 સ્લાઇસેસ/વિવિધ ડુક્કરમાંથી જૂથ, બે પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીની ટી-ટેસ્ટ કરવામાં આવે છે; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 સ્લાઇસેસ/વિવિધ ડુક્કરમાંથી જૂથ, બે પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીની ટી-ટેસ્ટ કરવામાં આવે છે; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = અલગ-અલગ ડુક્કરમાંથી 8 વિભાગ/જૂથ, બે પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીની ટી-ટેસ્ટ; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；**p <0.0001，**p < 0.01,*p < 0.05）. （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；**p <0.0001，**p < 0.01,*p < 0.05）. (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 વિભાગ/જૂથ, વિવિધ ડુક્કરમાંથી, બે પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીની ટી-ટેસ્ટ; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).ભૂલ બાર સરેરાશ ± પ્રમાણભૂત વિચલન દર્શાવે છે.
અમારી અગાઉની સ્ટેટિક બાયોમિમેટિક હાર્ટ સ્લાઈસ કલ્ચર સિસ્ટમ [20, 21] માં, અમે વિદ્યુત ઉત્તેજના લાગુ કરીને અને મધ્યમ રચનાને ઑપ્ટિમાઇઝ કરીને 6 દિવસ સુધી હૃદયના ટુકડાઓની કાર્યક્ષમતા, કાર્ય અને માળખાકીય અખંડિતતા જાળવી રાખી હતી.જો કે, 10 દિવસ પછી, આ આંકડામાં તીવ્ર ઘટાડો થયો.અમે અમારી અગાઉની સ્ટેટિક બાયોમિમેટિક કલ્ચર સિસ્ટમ 20, 21 કંટ્રોલ કન્ડીશન (Ctrl) માં સંવર્ધિત વિભાગોનો સંદર્ભ લઈશું અને અમે અમારા અગાઉના ઑપ્ટિમાઇઝ કરેલ માધ્યમનો ઉપયોગ MC કંડીશન તરીકે અને એક સાથે મિકેનિકલ અને ઇલેક્ટ્રિકલ સ્ટીમ્યુલેશન (CTCM) હેઠળ કલ્ચર તરીકે કરીશું.કહેવાય છે.પ્રથમ, અમે નિર્ધારિત કર્યું કે વિદ્યુત ઉત્તેજના વિના યાંત્રિક ઉત્તેજના 6 દિવસ સુધી પેશીઓની સદ્ધરતા જાળવવા માટે અપૂરતી હતી (પૂરક ફિગ. 3a,b).રસપ્રદ વાત એ છે કે, STCM નો ઉપયોગ કરીને ફિઝિયો-મિકેનિકલ અને ઇલેક્ટ્રિકલ સ્ટીમ્યુલેશનની રજૂઆત સાથે, 12-દિવસના હૃદયના વિભાગોની કાર્યક્ષમતા MS શરતો હેઠળ તાજા હૃદયના વિભાગોમાં સમાન રહી, પરંતુ Ctrl શરતો હેઠળ નહીં, MTT વિશ્લેષણ (ફિગ. 1) દ્વારા બતાવ્યા પ્રમાણે.3a).આ સૂચવે છે કે યાંત્રિક ઉત્તેજના અને કાર્ડિયાક સાયકલનું સિમ્યુલેશન પેશીના વિભાગોને અમારી અગાઉની સ્ટેટિક કલ્ચર સિસ્ટમમાં નોંધાયેલા કરતાં બમણા લાંબા સમય માટે સક્ષમ રાખી શકે છે.જો કે, કાર્ડિયાક ટ્રોપોનિન T અને કોનેક્સિન 43 ની ઇમ્યુનોલેબલીંગ દ્વારા પેશી વિભાગોની માળખાકીય અખંડિતતાનું મૂલ્યાંકન દર્શાવે છે કે તે જ દિવસે નિયંત્રણો કરતા 12 દિવસે MC પેશીઓમાં connexin 43 અભિવ્યક્તિ નોંધપાત્ર રીતે વધારે હતી.જો કે, એકસમાન જોડાણ 43 અભિવ્યક્તિ અને Z-ડિસ્ક રચના સંપૂર્ણપણે જાળવવામાં આવી ન હતી (ફિગ. 3b).અમે કૃત્રિમ બુદ્ધિમત્તા (AI) ફ્રેમવર્કનો ઉપયોગ ટીશ્યુ સ્ટ્રક્ચરલ ઇન્ટિગ્રિટી 26, ટ્રોપોનિન-T અને connexin સ્ટેનિંગ પર આધારિત ઇમેજ-આધારિત ડીપ લર્નિંગ પાઇપલાઇનનો ઉપયોગ કરીને સ્થાનિકીકરણની મજબૂતાઈના સંદર્ભમાં હૃદયની સ્લાઇસેસની માળખાકીય અખંડિતતા અને ફ્લોરોસેન્સને આપમેળે માપવા માટે કરીએ છીએ.આ પદ્ધતિ સંદર્ભમાં વર્ણવ્યા મુજબ, સ્વચાલિત અને નિષ્પક્ષ રીતે કાર્ડિયાક પેશીઓની માળખાકીય અખંડિતતાને વિશ્વસનીય રીતે માપવા માટે કન્વોલ્યુશનલ ન્યુરલ નેટવર્ક (CNN) અને ડીપ લર્નિંગ ફ્રેમવર્કનો ઉપયોગ કરે છે.26. સ્ટેટિક કંટ્રોલ સેક્શનની સરખામણીમાં MC પેશીએ 0 દિવસની સરખામણીમાં સુધારેલ માળખાકીય સમાનતા દર્શાવી હતી.વધુમાં, મેસનના ટ્રાઇક્રોમ સ્ટેનિંગે સંસ્કૃતિના 12મા દિવસે (ફિગ. 3c) પર નિયંત્રણની સ્થિતિની સરખામણીમાં MS પરિસ્થિતિઓ હેઠળ ફાઇબ્રોસિસની નોંધપાત્ર રીતે ઓછી ટકાવારી જાહેર કરી.જ્યારે CTCM એ હૃદયના પેશી વિભાગોની કાર્યક્ષમતા 12મા દિવસે તાજા હૃદયની પેશીઓની સમાનતામાં વધારો કર્યો, તે હૃદયના વિભાગોની માળખાકીય અખંડિતતામાં નોંધપાત્ર સુધારો થયો નથી.
બાર ગ્રાફ 12 દિવસ માટે ફ્રેશ હાર્ટ સ્લાઈસ (D0) અથવા હાર્ટ સ્લાઈસ કલ્ચરની MTT સદ્ધરતાનું પ્રમાણ દર્શાવે છે, કાં તો સ્ટેટિક કલ્ચર (D12 Ctrl) અથવા CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 Ctrl), 12 (D12/VMC) પરીક્ષણ #s12 માંથી અલગ અલગ રીતે કરવામાં આવે છે; ##p <0.0001 D0 ની સરખામણીમાં અને **p <0.01 D12 Ctrl ની સરખામણીમાં). એક બાર ગ્રાફ 12 દિવસ માટે ફ્રેશ હાર્ટ સ્લાઈસ (D0) અથવા હાર્ટ સ્લાઈસ કલ્ચરની MTT સદ્ધરતાનું પ્રમાણ દર્શાવે છે ક્યાં તો સ્ટેટિક કલ્ચર (D12 Ctrl) અથવા CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl ), 12 (D12 Ctrl), 12 (D12/D12) ટેસ્ટ અલગ રીતે કરવામાં આવે છે; ###p <0.0001 D0 ની સરખામણીમાં અને **p <0.01 D12 Ctrl ની સરખામણીમાં).હિસ્ટોગ્રામ MTT ફ્રેશ હાર્ટ સેક્શન (D0) અથવા હાર્ટ સેક્શનની કલ્ચર 12 દિવસ માટે સ્ટેટિક કલ્ચર (D12 કંટ્રોલ) અથવા CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 કંટ્રોલ) ), 12 (D12 MC) અલગ-અલગ વિભાગોમાંથી એક-એક-વેએ ટેસ્ટ કરવામાં આવે છે.####p < 0,0001 по сравнению с D0 અને **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0.0001 D0 ની સરખામણીમાં અને **p <0.01 D12 Ctrl ની સરખામણીમાં). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(或新鲜心脏切片) 12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA，进行单向ANOVA，CD0p0#1#0p. l 相比,**p < 0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心的 中新鲜心的 中新鲜心的切片12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p <0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p.)હિસ્ટોગ્રામ તાજા હૃદયના વિભાગો (D0) અથવા હૃદયના વિભાગોમાં 12 દિવસ માટે સ્થિર કલ્ચર (D12 કંટ્રોલ) અથવા CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 નિયંત્રણ)), 12 (D12 MC) વિભાગો/જૂથમાં MTT સદ્ધરતાનું પ્રમાણ દર્શાવે છે.####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p <0.0001 D0 ની સરખામણીમાં, **p <0.01 D12 Ctrl ની સરખામણીમાં).b ટ્રોપોનિન-ટી (લીલો), કોનેક્સિન 43 (લાલ) અને DAPI (વાદળી) તાજા અલગ હૃદયના વિભાગોમાં (D0) અથવા હૃદયના વિભાગો સ્થિર પરિસ્થિતિઓ (Ctrl) અથવા CTCM શરતો (MC) હેઠળ 12 દિવસ માટે સંવર્ધિત) પ્રતિનિધિ ઇમ્યુનોફ્લોરોસેન્સ છબીઓ (ખાલી સ્કેલ = 100 µm). હૃદયની પેશી માળખાકીય અખંડિતતા (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) સ્લાઇસેસ/ગ્રુપ વિવિધ ડુક્કરનું આર્ટિફિશિયલ ઇન્ટેલિજન્સ પ્રમાણીકરણ, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ કરવામાં આવે છે; ####p < 0.0001 D0 અને D01 ની સરખામણીમાં C ***01 ની સરખામણીમાં. ***0*). હૃદયની પેશી માળખાકીય અખંડિતતા (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) સ્લાઇસેસ/ગ્રુપ વિવિધ ડુક્કરનું કૃત્રિમ બુદ્ધિ પ્રમાણીકરણ, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ કરવામાં આવે છે; ####p < 0.0001 D0 અને C ની સરખામણીમાં D0 અને D ***01 ની સરખામણીમાં <0.0001). Количественная оценка структурной целостности селостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5/5/15 (MC) х свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению Crl D12). કૃત્રિમ બુદ્ધિ (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) વિભાગો/જૂથો દ્વારા વિવિધ ડુક્કર દ્વારા કાર્ડિયાક પેશીઓની માળખાકીય અખંડિતતાનું પ્રમાણીકરણ, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું; ####p < 0.0001 vs. D0t0 ની સરખામણીમાં D01 અને D0 r ****1人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) સ્લાઇસેસ/ગ્રુપ દરેક અલગ-અલગ ડુક્કર, વન-વે.比,****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）.人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) સ્લાઇસેસ/ગ્રુપ દરેક અલગ-અલગ ડુક્કર, વન-વે.比,****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）. Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl/D05), (D12 Ctrl) й из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). કાર્ડિયાક ટીશ્યુ (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) વિભાગ/ગ્રુપ દરેક અલગ-અલગ ડુક્કરની માળખાકીય અખંડિતતાને માપવા માટે કૃત્રિમ બુદ્ધિમત્તા, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ; ####p<0.0001 vs .D0 C ની તુલનામાં D0r0 <1.***1. c પ્રતિનિધિ છબીઓ (ડાબે) અને મેસનના ટ્રાઇક્રોમ સ્ટેન (સ્કેલ બેર = 500 µm) (સ્કેલ બેર = 500 µm) (n = 10 સ્લાઇસેસ/ગ્રુપ પ્રત્યેક અલગ-અલગ ડુક્કરથી, વન-વે એનોવા ટેસ્ટ કરવામાં આવે છે; ####p. ***1 ની સરખામણીમાં C. ***1 0 અને D0 0 ની સરખામણીમાં C. આરએલ). c પ્રતિનિધિ છબીઓ (ડાબે) અને મેસનના ટ્રાઈક્રોમ સ્ટેન (સ્કેલ બેર = 500 µm) (સ્કેલ બેર = 500 µm) (n = 10 સ્લાઇસેસ/ગ્રુપ દરેક અલગ-અલગ ડુક્કરથી રંગાયેલા હૃદયના ટુકડાઓ માટે) (જમણે) અને પ્રમાણીકરણ (જમણે), વન-વે ANOVA ટેસ્ટ કરવામાં આવે છે; #### p. ***1 <0 ની સરખામણીમાં C. ***1 <1 0 ડી 0 ની સરખામણીમાં આરએલ). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красибатебаслева трихромным тия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний тест ANOVA; #### p < 0,0001 Dp0,0001 равнению с D12 Ctrl). c મેસનના ટ્રાઈક્રોમ સ્ટેન (અનકોટેડ સ્કેલ = 500 µm) (અનકોટેડ સ્કેલ = 500 µm) (n = 10 વિભાગો/જૂથ, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું; #### p < 0 .0001) ની તુલનામાં C. ***01 ની સરખામણીમાં D001. c 用મેસન 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度=0¼n0µm0片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比,***p < 0.001 丛1 C.D. સી 用 મેસન 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 量化 （右） 度度度带 裸尺度 裸带500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 એનોવા 测试 00测试） 0## 10D. ***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным (слева) км) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного , #1 нию с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c મેસનના ટ્રાઇક્રોમ સ્ટેન (ખાલી = 500 µm) (ખાલી = 500 µm) (n = 10 વિભાગો/જૂથ, દરેક અલગ-અલગ ડુક્કરમાંથી, ભિન્નતાના એક-માર્ગી વિશ્લેષણ દ્વારા ચકાસાયેલ ;### # p <0 ની સરખામણીમાં C ;### # p <0 0 ની સરખામણીમાં ;### # p <0. ***1. આરએલ).ભૂલ બાર સરેરાશ ± પ્રમાણભૂત વિચલન દર્શાવે છે.
અમે અનુમાન કર્યું છે કે સંસ્કૃતિ માધ્યમમાં નાના અણુઓ ઉમેરીને, કાર્ડિયોમાયોસાઇટ અખંડિતતા સુધારી શકાય છે અને CTCM સંસ્કૃતિ દરમિયાન ફાઇબ્રોસિસનો વિકાસ ઘટાડી શકાય છે.આથી અમે અમારી સ્ટેટિક કંટ્રોલ કલ્ચર 20,21નો ઉપયોગ કરીને નાના પરમાણુઓ માટે તપાસ કરી છે, કારણ કે નાની સંખ્યામાં ગૂંચવણભર્યા પરિબળો છે.આ સ્ક્રીન માટે Dexamethasone (Dex), triiodothyronine (T3), અને SB431542 (SB) પસંદ કરવામાં આવ્યા હતા.આ નાના અણુઓનો ઉપયોગ અગાઉ hiPSC-CM સંસ્કૃતિઓમાં સારકોમીર લંબાઈ, T-ટ્યુબ્યુલ્સ અને વહન વેગ વધારીને કાર્ડિયોમાયોસાઇટ્સની પરિપક્વતાને પ્રેરિત કરવા માટે કરવામાં આવ્યો છે.વધુમાં, ડેક્સ (એક ગ્લુકોકોર્ટિકોઇડ) અને એસબી બંને 29,30 બળતરાને દબાવવા માટે જાણીતા છે.તેથી, અમે પરીક્ષણ કર્યું કે શું એકનો સમાવેશ અથવા આ નાના અણુઓના સંયોજનથી હૃદયના વિભાગોની માળખાકીય અખંડિતતામાં સુધારો થશે.પ્રારંભિક તપાસ માટે, દરેક સંયોજનની માત્રા સામાન્ય રીતે સેલ કલ્ચર મોડલ્સ (1 μM Dex27, 100 nM T327, અને 2.5 μM SB31) માં ઉપયોગમાં લેવાતી સાંદ્રતાના આધારે પસંદ કરવામાં આવી હતી.12 દિવસની સંસ્કૃતિ પછી, T3 અને Dex ના સંયોજનથી શ્રેષ્ઠ કાર્ડિયોમાયોસાઇટ માળખાકીય અખંડિતતા અને ન્યૂનતમ તંતુમય રિમોડેલિંગ (પૂરક આંકડા 4 અને 5) માં પરિણમ્યું.વધુમાં, T3 અને Dexની આ સાંદ્રતાના બમણા અથવા બમણા ઉપયોગથી સામાન્ય સાંદ્રતાની સરખામણીમાં નુકસાનકારક અસરો પેદા થાય છે (પૂરક ફિગ. 6a,b).
પ્રારંભિક સ્ક્રીનીંગ પછી, અમે 4 કલ્ચર કંડીશન (આકૃતિ 4a) ની હેડ-ટુ-હેડ સરખામણી કરી: Ctrl: અમારા ઑપ્ટિમાઇઝ માધ્યમનો ઉપયોગ કરીને અમારી અગાઉ વર્ણવેલ સ્ટેટિક કલ્ચરમાં સંવર્ધિત હૃદય વિભાગો;20.21 TD: T3 અને Ctrl એ બુધવારે ડેક્સ ઉમેર્યું;MC: અમારા અગાઉના ઑપ્ટિમાઇઝ માધ્યમનો ઉપયોગ કરીને CTCMમાં હૃદયના વિભાગો સંવર્ધિત;અને MT: T3 અને Dex સાથે CTCM માધ્યમમાં ઉમેર્યું.ખેતીના 12 દિવસ પછી, એમએસ અને એમટી પેશીઓની કાર્યક્ષમતા એમટીટી એસે (ફિગ. 4બી) દ્વારા આકારણી કરાયેલ તાજી પેશીઓની જેમ જ રહી.રસપ્રદ વાત એ છે કે, T3 અને Dex ને ટ્રાન્સવેલ કલ્ચર (TD) માં ઉમેરવાથી Ctrl સ્થિતિની સરખામણીમાં સધ્ધરતામાં નોંધપાત્ર સુધારો થયો નથી, જે હૃદયના વિભાગોની સધ્ધરતા જાળવવામાં યાંત્રિક ઉત્તેજનાની મહત્વની ભૂમિકા દર્શાવે છે.
12 દિવસ માટે માધ્યમ પર યાંત્રિક ઉત્તેજના અને T3/Dex સપ્લિમેન્ટેશનની અસરોનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે વપરાતી ચાર સંસ્કૃતિની સ્થિતિને દર્શાવતો પ્રાયોગિક ડિઝાઇન ડાયાગ્રામ. b બાર ગ્રાફ તાજા હાર્ટ સ્લાઇસેસ (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD અને D12 MT), 12 (D12 pigs/MC માંથી અલગ-અલગ પરીક્ષણ કરવામાં આવે છે) 12 (D12 pigs, એક અલગ-અલગ પરીક્ષણ) ની તુલનામાં તમામ 4 સંસ્કૃતિ પરિસ્થિતિઓ (Ctrl, TD, MC અને MT) માં સંસ્કૃતિ પછીના 12 દિવસની સદ્ધરતાનું પ્રમાણ દર્શાવે છે. ##p <0.0001, ###p <0.001 D0 ની સરખામણીમાં અને **p <0.01 D12 Ctrl ની સરખામણીમાં). b બાર ગ્રાફ તાજા હાર્ટ સ્લાઇસેસ (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD અને D12 MT), 12 (D12 pigs/MC માંથી અલગ-અલગ પરીક્ષણ કરવામાં આવે છે) 12 (D12 pigs, એક અલગ-અલગ પરીક્ષણ) ની તુલનામાં તમામ 4 સંસ્કૃતિ પરિસ્થિતિઓ (Ctrl, TD, MC અને MT) માં સંસ્કૃતિ પછીના 12 દિવસની સદ્ધરતાનું પ્રમાણ દર્શાવે છે. ##p < 0.0001, ###p < 0.001 D0 ની સરખામણીમાં અને **p < 0.01 D12 ctrl ની સરખામણીમાં). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4, усенку 4 ટીડી, એમસી અને એમટી) й, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению сr2l b બાર ગ્રાફ ફ્રેશ હાર્ટ સેક્શન (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, અને D12 MT), 12 (D12 Ctrl, D12 TD, અને D12 MT), 12 (D12, 12-12, 12-12 વિભાગ #pgs, એક અલગ-એક વિભાગ #pgs, 12-એક-એક માંથી અલગ-અલગ D12; 0.0001, ###p < 0.001 વિ. D0 અને **p < 0.01 D12 Ctrl ની સરખામણીમાં). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片、D0) (n = 18 (D1l18) (D0)和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，###p <0.0D12 <0.0D0** 2 控制).b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (કોન્ટ્રોલ, TD, MC и MT) по сравнению со свежими (со свежими) 2 Ctrl, D12 TD અને D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,0,0,0001, ###p <0,0,0,0,0,0,00, по сравнению с контролем D12). b વિવિધ ડુક્કર 12 (D12 MC) વિભાગો/જૂથ, વન-વે ANOVA ટેસ્ટ, ##0p<#0p<#0p<#0p<#0p;#0p<#0p;#0p<#0p<##0p<#0p<#0p<##00p; 0, **p<0.01 વિ. નિયંત્રણ D12). c બાર ગ્રાફ તાજા હાર્ટ સ્લાઇસેસ (D0) (n = 6 સ્લાઇસેસ/વિવિધ ડુક્કરમાંથી જૂથની તુલનામાં તમામ 4 સંસ્કૃતિ પરિસ્થિતિઓ (Ctrl, TD, MC અને MT) માં સંસ્કૃતિ પછી 12 દિવસ પછી ગ્લુકોઝ પ્રવાહનું પ્રમાણ દર્શાવે છે, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ કરવામાં આવે છે; ###p <0.01 ની સરખામણીમાં C ***1 <0.01 અને D000 ની સરખામણીમાં ###p <1. ***1. ). c બાર ગ્રાફ તાજા હાર્ટ સ્લાઇસેસ (D0) (n = 6 સ્લાઇસેસ/વિવિધ ડુક્કરમાંથી જૂથની તુલનામાં તમામ 4 સંસ્કૃતિ પરિસ્થિતિઓ (Ctrl, TD, MC અને MT) માં સંસ્કૃતિ પછી 12 દિવસ પછી ગ્લુકોઝ પ્રવાહનું પ્રમાણ દર્શાવે છે, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ કરવામાં આવે છે; ###p <0.01 ની સરખામણીમાં C ***1 <0.01 અને D000 ની સરખામણીમાં ###p <1. ***1. ). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех , 4 усех , усех 4 усенкульвает количественную એમસી અને એમટી) по сравнению с D0 અને ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c હિસ્ટોગ્રામ તાજા હૃદયના વિભાગો (D0) (n = 6 વિભાગો/વિવિધ ડુક્કરમાંથી જૂથ, વન-વે ANOVA પરીક્ષણ કરવામાં ; D0 અને D0 r ની સરખામણીમાં C ***1 <0.001 ; ###p <0.001) ની સરખામણીમાં તમામ 4 સંસ્કૃતિ પરિસ્થિતિઓ (નિયંત્રણ, TD, MC અને MT) હેઠળ સંસ્કૃતિ પછીના 12 દિવસ પછી ગ્લુકોઝ પ્રવાહનું પ્રમાણ દર્શાવે છે. 4通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比 ， 与D0 相比 0.001 ， D0 相比 ， D0 0 0. ). C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 心脏 切片 切片 心脏 切片切片后 后 12 天 的 通量 定量 （ n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， 猪 猪单 ， ， 猪 猪单向执苯 # 0 ડી 0 # 曎0 相比, ***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования (для всех 4 , показывающая количественную) ટીડી, એમસી અને એમટી) 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c હિસ્ટોગ્રામ તાજા હૃદયના વિભાગો (D0) (n = 6 વિભાગો/જૂથ, વિવિધ ડુક્કરમાંથી, એકપક્ષીય ANOVA પરીક્ષણો કરવામાં આવ્યા હતા, D00, ***1 p <0.00 ની સરખામણીમાં D00, ***1 p <0.01) ની સરખામણીમાં તમામ 4 સંસ્કૃતિ સ્થિતિઓ (નિયંત્રણ, TD, MC અને MT) માટે સંસ્કૃતિ પછીના 12 દિવસ પર ગ્લુકોઝ પ્રવાહનું પ્રમાણ દર્શાવે છે.d તાજા (વાદળી), દિવસ 12 એમસી (લીલો) અને દિવસ 12 એમટી (લાલ) પેશીઓના તાણ વિશ્લેષણ પ્લોટ દસ પ્રાદેશિક પેશી વિભાગના બિંદુઓ પર (n = 4 સ્લાઇસેસ/જૂથ, વન-વે એનોવા ટેસ્ટ; જૂથો વચ્ચે કોઈ નોંધપાત્ર તફાવત ન હતો).e જ્વાળામુખી પ્લોટ 10-12 દિવસ માટે સ્થિર પરિસ્થિતિઓ (Ctrl) અથવા MT શરતો (MT) હેઠળ સંવર્ધિત હૃદય વિભાગોની તુલનામાં તાજા હૃદય વિભાગો (D0) માં અલગ રીતે વ્યક્ત જનીન દર્શાવે છે.f દરેક સંસ્કૃતિની પરિસ્થિતિઓ હેઠળ સંવર્ધિત હૃદયના વિભાગો માટે સારકોમીર જનીનોનો હીટમેપ.ભૂલ બાર સરેરાશ ± પ્રમાણભૂત વિચલન દર્શાવે છે.
ફેટી એસિડ ઓક્સિડેશનથી ગ્લાયકોલિસિસ તરફના સ્વિચ પર મેટાબોલિક અવલંબન એ કાર્ડિયોમાયોસાઇટ વિભિન્નતાની ઓળખ છે.અપરિપક્વ કાર્ડિયોમાયોસાઇટ્સ મુખ્યત્વે ATP ઉત્પાદન માટે ગ્લુકોઝનો ઉપયોગ કરે છે અને થોડા ક્રિસ્ટા 5,32 સાથે હાયપોપ્લાસ્ટિક મિટોકોન્ડ્રિયા ધરાવે છે.ગ્લુકોઝ ઉપયોગ વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે MC અને MT શરતો હેઠળ, ગ્લુકોઝનો ઉપયોગ દિવસ 0 પેશી (આકૃતિ 4c) જેવો જ હતો.જો કે, Ctrl નમૂનાઓએ તાજા પેશીઓની તુલનામાં ગ્લુકોઝના ઉપયોગમાં નોંધપાત્ર વધારો દર્શાવ્યો હતો.આ સૂચવે છે કે CTCM અને T3/Dex નું સંયોજન પેશીઓની કાર્યક્ષમતા વધારે છે અને 12-દિવસના સંસ્કારી હૃદય વિભાગોના મેટાબોલિક ફેનોટાઇપને સાચવે છે.વધુમાં, તાણ વિશ્લેષણ દર્શાવે છે કે તાણનું સ્તર તાજા હૃદયની પેશીઓમાં 12 દિવસ સુધી MT અને MS શરતો (ફિગ. 4d) હેઠળ સમાન રહ્યું છે.
કાર્ડિયાક સ્લાઈસ ટીશ્યુના વૈશ્વિક ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ લેન્ડસ્કેપ પર CTCM અને T3/Dex ની એકંદર અસરનું વિશ્લેષણ કરવા માટે, અમે ચારેય અલગ-અલગ કલ્ચર પરિસ્થિતિઓ (પૂરક ડેટા 1)માંથી કાર્ડિયાક સ્લાઈસ પર RNAseq કર્યું.રસપ્રદ વાત એ છે કે, MT વિભાગોએ 13,642 જનીનોમાંથી માત્ર 16 અલગ અલગ રીતે દર્શાવ્યા સાથે તાજા હૃદયની પેશીઓ સાથે ઉચ્ચ ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ સમાનતા દર્શાવી હતી.જો કે, અમે અગાઉ બતાવ્યું તેમ, Ctrl સ્લાઇસેસ સંસ્કૃતિમાં 10-12 દિવસ પછી 1229 વિભિન્ન રીતે વ્યક્ત જનીનો દર્શાવે છે (ફિગ. 4e).હૃદય અને ફાઈબ્રોબ્લાસ્ટ જનીનોના qRT-PCR દ્વારા આ ડેટાની પુષ્ટિ કરવામાં આવી હતી (પૂરક ફિગ. 7a-c).રસપ્રદ વાત એ છે કે, Ctrl વિભાગોએ કાર્ડિયાક અને કોષ ચક્ર જનીનોનું ડાઉનરેગ્યુલેશન અને બળતરા જનીન પ્રોગ્રામ્સનું સક્રિયકરણ દર્શાવ્યું હતું.આ ડેટા સૂચવે છે કે વિભિન્નતા, જે સામાન્ય રીતે લાંબા ગાળાના સંવર્ધન પછી થાય છે, તે સંપૂર્ણપણે MT શરતો (પૂરક ફિગ. 8a,b) હેઠળ ઓછી થાય છે.સારકોમેરે જનીનોના કાળજીપૂર્વક અભ્યાસે દર્શાવ્યું હતું કે માત્ર MT પરિસ્થિતિઓમાં જ સારકોમેરે (ફિગ. 4f) અને આયન ચેનલ (પૂરક ફિગ. 9) ને એન્કોડ કરતા જનીનો સાચવવામાં આવે છે, જે તેમને Ctrl, TD અને MC શરતો હેઠળ દમનથી બચાવે છે.આ ડેટા દર્શાવે છે કે યાંત્રિક અને હ્યુમરલ સ્ટીમ્યુલેશન (T3/Dex) ના સંયોજન સાથે, હૃદયના ટુકડા ટ્રાન્સક્રિપ્ટોમ સંસ્કૃતિમાં 12 દિવસ પછી હૃદયના તાજા ટુકડા જેવા જ રહી શકે છે.
આ ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ તારણો એ હકીકત દ્વારા સમર્થિત છે કે હૃદયના વિભાગોમાં કાર્ડિયોમાયોસાઇટ્સની માળખાકીય અખંડિતતા MT શરતો હેઠળ 12 દિવસ માટે શ્રેષ્ઠ રીતે સાચવવામાં આવે છે, જેમ કે અખંડ અને સ્થાનિક જોડાણ 43 (ફિગ. 5a) દ્વારા દર્શાવવામાં આવ્યું છે.વધુમાં, MT શરતો હેઠળ હૃદયના વિભાગોમાં ફાઇબ્રોસિસ નોંધપાત્ર રીતે Ctrl ની સરખામણીમાં અને હૃદયના તાજા વિભાગો (ફિગ. 5b) ની સરખામણીમાં નોંધપાત્ર રીતે ઘટાડો થયો હતો.આ ડેટા દર્શાવે છે કે યાંત્રિક ઉત્તેજના અને T3/Dex સારવારનું સંયોજન સંસ્કૃતિમાં હૃદયના વિભાગોમાં કાર્ડિયાક સ્ટ્રક્ચરને અસરકારક રીતે સાચવે છે.
ટ્રોપોનિન-ટી (લીલો), કોનેક્સિન 43 (લાલ), અને DAPI (વાદળી) ની પ્રતિનિધિત્વ ઇમ્યુનોફ્લોરેસેન્સ છબીઓ તાજા અલગ હૃદય વિભાગો (D0) માં અથવા ચારેય હૃદય વિભાગની સંસ્કૃતિની સ્થિતિમાં 12 દિવસ માટે સંવર્ધિત (સ્કેલ બાર = 100 µm).). હાર્ટ ટિશ્યુ સ્ટ્રક્ચરલ ઇન્ટિગ્રિટી (n = 7 (D0 અને D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC અને D12 MT) સ્લાઇસેસ/જૂથનું આર્ટિફિશિયલ ઇન્ટેલિજન્સ ક્વોન્ટિફિકેશન, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ કરવામાં આવે છે; ####p < 0.00 અને ***1 ની સરખામણીમાં <*0.00 અને ***1. D12 Ctrl ની સરખામણીમાં 01). હાર્ટ ટિશ્યુ સ્ટ્રક્ચરલ ઇન્ટિગ્રિટી (n = 7 (D0 અને D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC અને D12 MT) સ્લાઇસેસ/જૂથનું આર્ટિફિશિયલ ઇન્ટેલિજન્સ ક્વોન્ટિફિકેશન, એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ કરવામાં આવે છે; #### p <0.00 અને ***1 ની સરખામણીમાં <*0.00 અને ***1. D12 Ctrl ની સરખામણીમાં 01). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 અને D12 Ctrl12MT), DMCTD12 MT12 резов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,01 D*01, 0,01 2 Ctrl). આર્ટિફિશિયલ ઇન્ટેલિજન્સ (n = 7 (D0 અને D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC અને D12 MT) વિભાગો/જૂથનો ઉપયોગ કરીને હૃદયની પેશીઓની માળખાકીય અખંડિતતાનું પ્રમાણીકરણ, વિવિધ ડુક્કરમાંથી એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ કરવામાં આવ્યું; #### p < 0.0001 ની સરખામણીમાં ****0p. D12 Ctrl ની સરખામણીમાં).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比，或****p < 0.0001 Ct.对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td （5 （d12 td 、 d12 mc 12 mc智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p < 0.0001 与D0 和*p < 0.05 相比 0.05相比).એક-માર્ગી ANOVA પરીક્ષણ સાથે વિવિધ ડુક્કર (n = 7 (D0 અને D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC અને D12 MT) વિભાગો/જૂથ) માં કૃત્રિમ બુદ્ધિનો ઉપયોગ કરીને કાર્ડિયાક પેશીઓની માળખાકીય અખંડિતતાનું પ્રમાણીકરણ;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 અને *p < 0,05 અથવા ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 D0 ની સરખામણીમાં અને *p < 0.05 અથવા ****p < 0.0001 D12 Ctrl ની સરખામણીમાં). b મેસનના ટ્રાઇક્રોમ સ્ટેન (સ્કેલ બાર = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, અને D12 MC), 9 (D12 MT) સ્લાઇસેસથી ડાઘવાળા હૃદયની સ્લાઇસેસ માટે પ્રતિનિધિની છબીઓ અને પ્રમાણીકરણ, 9 (D12 MT) સ્લાઇસેસ ##pgs/group માંથી અલગ અલગ છે. 0001 D0 ની સરખામણીમાં અને ***p < 0.001, અથવા ****p < 0.0001 D12 Ctrl ની સરખામણીમાં). b મેસનના ટ્રાઇક્રોમ સ્ટેન (સ્કેલ બાર = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, અને D12 MC), 9 (D12 MT) સ્લાઇસેસથી ડાઘવાળા હૃદયની સ્લાઇસેસ માટે પ્રતિનિધિની છબીઓ અને પ્રમાણીકરણ, 9 (D12 MT) સ્લાઇસેસ ##pgs/group માંથી અલગ અલગ છે. 0001 D0 ની સરખામણીમાં અને ***p < 0.001, અથવા ****p < 0.0001 D12 Ctrl ની સરખામણીમાં). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (=0масбаня( 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD અને D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группу от разных свиней, выполняется односторонний односторонний тест #0п01юсю1; D0 અને ***p < 0,001 અથવા ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b મેસનના ટ્રાઇક્રોમ સ્ટેન (સ્કેલ બાર = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD અને D12 MC), 9 (D12 MT) વિભાગો/જૂથ અલગ-અલગ ડુક્કરમાંથી 9 (D12 MT) વિભાગો/જૂથ સાથે ડાઘવાળા હૃદયના વિભાગોની પ્રતિનિધિ છબીઓ અને પ્રમાણીકરણ. 0 અને ***p < 0.001 અથવા ****p < 0.0001 વિ. D12 Ctrl). b 用મેસન 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺=500 µm）（n = 10D10D1和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p <0.001** <0.00*或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b 用 મેસન 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm） 1 d0d0d 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；方差分析、 001,或****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）. b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная =10Dn) Ctrl, D12 TD અને D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / группы, один- способ ANOVA; ####p < 0,0001 по <срав0, ***p <срав0, ***0p <сравиней **** 0001 по сравнению с D12 Ctrl). b મેસનના ટ્રાઇક્રોમ (સ્કેલ બાર = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD અને D12 MC), 9 (D12 MT) વિભાગો વિવિધ ડુક્કર/જૂથના 9 (D12 MT) વિભાગો સાથે ડાઘવાળા હૃદયના ભાગોની પ્રતિનિધિ છબીઓ અને પ્રમાણીકરણ. .001 અથવા ****p < 0.0001 D12 Ctrl ની સરખામણીમાં).ભૂલ બાર સરેરાશ ± પ્રમાણભૂત વિચલન દર્શાવે છે.
છેલ્લે, કાર્ડિયાક હાઇપરટ્રોફીની નકલ કરવા માટે CTCMની ક્ષમતાનું મૂલ્યાંકન કાર્ડિયાક ટિશ્યુ સ્ટ્રેચ વધારીને કરવામાં આવ્યું હતું.CTCM માં, પીક એર ચેમ્બરનું દબાણ 80 mmHg થી વધીને 80 mmHg થયું છે.કલા.(સામાન્ય સ્ટ્રેચ) 140 mmHg આર્ટ સુધી.(ફિગ. 6a).આ સ્ટ્રેચ (ફિગ. 6b) માં 32% વધારાને અનુરૂપ છે, જે અગાઉ હાયપરટ્રોફીમાં જોવા મળતી સરકોમેર લંબાઈ હાંસલ કરવા માટે હૃદયના વિભાગો માટે જરૂરી અનુરૂપ ટકાવારી સ્ટ્રેચ તરીકે દર્શાવવામાં આવ્યું હતું.સંકોચન અને છૂટછાટ દરમિયાન હૃદયની પેશીઓનો ખેંચાણ અને વેગ સંસ્કૃતિના છ દિવસ (ફિગ. 6c) દરમિયાન સ્થિર રહે છે.MT સ્થિતિઓમાંથી કાર્ડિયાક પેશી છ દિવસ માટે સામાન્ય ખેંચાણ (MT (સામાન્ય)) અથવા ઓવરસ્ટ્રેચ સ્થિતિ (MT (OS)) ને આધિન હતી.પહેલેથી જ સંસ્કૃતિમાં ચાર દિવસ પછી, હાઇપરટ્રોફિક બાયોમાર્કર NT-ProBNP MT (ઓએસ) સ્થિતિમાં MT (સામાન્ય) પરિસ્થિતિઓ (ફિગ. 7a) ની તુલનામાં માધ્યમમાં નોંધપાત્ર રીતે એલિવેટેડ હતું.વધુમાં, છ દિવસના સંવર્ધન પછી, MT (OS) (ફિગ. 7b) માં કોષનું કદ MT હૃદય (સામાન્ય) ના વિભાગોની તુલનામાં નોંધપાત્ર રીતે વધ્યું.વધુમાં, NFATC4 ન્યુક્લિયર ટ્રાન્સલોકેશન વધુ પડતા ખેંચાયેલા પેશીઓમાં નોંધપાત્ર રીતે વધ્યું હતું (ફિગ. 7c).આ પરિણામો હાઈપરડિસ્ટેન્શન પછી પેથોલોજીકલ રિમોડેલિંગના પ્રગતિશીલ વિકાસને દર્શાવે છે અને CTCM ઉપકરણનો ઉપયોગ સ્ટ્રેચ-પ્રેરિત કાર્ડિયાક હાયપરટ્રોફી સિગ્નલિંગનો અભ્યાસ કરવા માટે પ્લેટફોર્મ તરીકે થઈ શકે તે ખ્યાલને સમર્થન આપે છે.
એર ચેમ્બર પ્રેશર, ફ્લુઇડ ચેમ્બર પ્રેશર અને ટીશ્યુ ચળવળના માપના પ્રતિનિધિ નિશાનો પુષ્ટિ કરે છે કે ચેમ્બર દબાણ પ્રવાહી ચેમ્બરના દબાણમાં ફેરફાર કરે છે, જે પેશીના ટુકડાને અનુરૂપ હિલચાલનું કારણ બને છે.b સામાન્ય રીતે ખેંચાયેલા (નારંગી) અને વધારે પડતા (વાદળી) પેશી વિભાગો માટે પ્રતિનિધિ સ્ટ્રેચ ટકાવારી અને સ્ટ્રેચ રેટ વક્ર.c બાર ગ્રાફ ચક્ર સમય દર્શાવે છે (n = 19 સ્લાઇસેસ પ્રતિ જૂથ, વિવિધ ડુક્કરમાંથી), સંકોચન સમય (n = 18-19 સ્લાઇસેસ પ્રતિ જૂથ, વિવિધ ડુક્કરમાંથી), છૂટછાટનો સમય (n = 19 સ્લાઇસેસ પ્રતિ જૂથ, વિવિધ ડુક્કરમાંથી) ), પેશીઓની હિલચાલનું કંપનવિસ્તાર (n = 14 સ્લાઇસેસ, વિવિધ પિગ્સ/ગ્રુપમાંથી n = 14 સ્લાઇસેસ, વિવિધ ડુક્કરમાંથી) es/જૂથ, વિવિધ ડુક્કરમાંથી) અને પીક રિલેક્સેશન રેટ (n = 14 (D0), 15 (D6) ) વિભાગો/જૂથો) વિવિધ ડુક્કરમાંથી), બે પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીની ટી-ટેસ્ટમાં કોઈપણ પરિમાણમાં કોઈ નોંધપાત્ર તફાવત જોવા મળ્યો નથી, જે દર્શાવે છે કે ઓવરવોલ્ટેજ સાથે સંસ્કૃતિના 6 દિવસ દરમિયાન આ પરિમાણો સ્થિર રહ્યા હતા.ભૂલ બાર સરેરાશ ± પ્રમાણભૂત વિચલન દર્શાવે છે.
MT નોર્મલ સ્ટ્રેચ (નોર્મ) અથવા ઓવરસ્ટ્રેચિંગ (OS) શરતો (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, અને D4 MTOS) હેઠળ સંવર્ધિત હાર્ટ સ્લાઇસેસમાંથી કલ્ચર મીડિયામાં NT-ProBNP સાંદ્રતાનું બાર ગ્રાફ પ્રમાણીકરણ. સામાન્ય ખેંચાણ સુધી). MT નોર્મલ સ્ટ્રેચ (નોર્મ) અથવા ઓવરસ્ટ્રેચિંગ (OS) શરતો (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, અને D4 MTOS) હેઠળ સંવર્ધિત હાર્ટ સ્લાઇસમાંથી કલ્ચર મીડિયામાં NT-ProBNP સાંદ્રતાનું બાર ગ્રાફ પરિમાણ. સામાન્ય ખેંચાણની તુલનામાં).સામાન્ય MT સ્ટ્રેચ (નોર્મ) અથવા ઓવર સ્ટ્રેચ (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, અને D4) ની શરતો હેઠળ સંવર્ધિત હૃદયના સ્લાઇસેસમાંથી સંસ્કૃતિ માધ્યમમાં NT-ProBNP સાંદ્રતાનો ક્વોન્ટિટેટિવ ​​હિસ્ટોગ્રામ.**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 સામાન્ય સ્ટ્રેચની સરખામણીમાં). a 在MT 正常拉伸(નોર્મ) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP 浓度離 叡離MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析＋有減中0p0 ). MT નોર્મલ સ્ટ્રેચ (નોર્મ) અથવા ઓવર સ્ટ્રેચ (OS) શરતો (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) હેઠળ વિવિધ 猪的切片猪的切片湄湄湄滥則片માંથી હૃદયના ટુકડાઓમાં NT-ProBNP સાંદ્રતાનું પ્રમાણ发发动; **સામાન્ય સ્ટ્રેચિંગ સાથે સરખામણી, p < 0.01).સામાન્ય MT સ્ટ્રેચ (નોર્મ) અથવા ઓવર સ્ટ્રેચ (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) અને D4 MTOS) સ્લાઇસેસ/જૂથ બે અલગ-અલગ ડુક્કરમાંથી અલગ-અલગ રીતે,**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p <0.01 સામાન્ય સ્ટ્રેચની સરખામણીમાં). b ટ્રોપોનિન-T અને WGA (ડાબે) અને સેલ સાઇઝ ક્વોન્ટિફિકેશન (જમણે) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) કોષો/જૂથ 10 અલગ-અલગ ડુક્કરમાંથી 10 અલગ-અલગ સ્લાઇસેસ, બે પૂંછડીવાળા સ્ટુડન્ટની સરખામણીમાં ટ્રોપોનિન-T અને WGA (ડાબે) વડે રંગાયેલા હૃદયની સ્લાઇસેસ માટેની પ્રતિનિધિ છબીઓ. b ટ્રોપોનિન-T અને WGA (ડાબે) અને સેલ સાઇઝ ક્વોન્ટિફિકેશન (જમણે) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) કોષો/જૂથ 10 અલગ-અલગ ડુક્કરમાંથી 10 અલગ અલગ સ્લાઇસેસ, બે પૂંછડીવાળા સ્ટુડન્ટની સરખામણીમાં બે પૂંછડીવાળા સ્લાઇસેસ માટે પ્રતિનિધી છબીઓ (ડાબે) અને કોષનું કદ. b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественного (срезов сердца) MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводится хвостовой хвостовой t-критерий , ***0p0p019 ению с нормальным растяжением). b ટ્રોપોનિન-T અને AZP (ડાબે) અને સેલ સાઇઝ ક્વોન્ટિફિકેશન (જમણે) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) કોષો/જૂથના 10 અલગ-અલગ વિભાગોમાંથી ટ્રોપોનિન-T અને AZP (ડાબે) વડે રંગાયેલા હૃદયના વિભાગોની પ્રતિનિધિ છબીઓ, બે પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીની સરખામણી કરવામાં આવી હતી. b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的心脏切片的心脏切片的代表性图n=3MT来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t**. 01). b કેલ્કેરીન-T અને WGA (ડાબે) અને કોષનું કદ (જમણે) (n = 330 (D6 MTOS), 10 અલગ-અલગ સ્લાઇસેસમાંથી 369 (D6 MTNorm)) કોષો/组，两方法有 સામાન્ય પરીક્ષણ સાથે સ્ટેન કરેલા હૃદયની સ્લાઇસેસની પ્રતિનિધિ છબીઓ* p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная оценка размева (36MT), 369 (D6 એમટીનોર્મ) стяжением). b ટ્રોપોનિન-T અને AZP (ડાબે) થી ડાઘવાળા હૃદયના વિભાગોની પ્રતિનિધિ છબીઓ અને કોષના કદનું પ્રમાણીકરણ (જમણે) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) વિવિધ ડુક્કરના 10 જુદા જુદા વિભાગોમાંથી) કોષો/જૂથ, બે પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થી માપદંડ;****p < 0.0001 સામાન્ય તાણની તુલનામાં). c દિવસ 0 અને દિવસ 6 MTOS હૃદય સ્લાઇસેસ માટે ટ્રોપોનિન-T અને NFATC4 માટે ઇમ્યુનોલેબલવાળી પ્રતિનિધિ છબીઓ અને NFATC4 ના CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) સ્લાઇસેસ/જૂથના મધ્યવર્તી સ્થાનાંતરણની માત્રા અલગ-અલગ ડુક્કર દ્વારા કરવામાં આવે છે. c દિવસ 0 અને દિવસ 6 MTOS હૃદય સ્લાઇસેસ માટે ટ્રોપોનિન-T અને NFATC4 માટે ઇમ્યુનોલેબલ કરેલ પ્રતિનિધી છબીઓ અને NFATC4 ના CMs (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) સ્લાઇસેસ/જૂથના મધ્યવર્તી સ્થાનાંતરણનું પ્રમાણીકરણ વિવિધ ડુક્કરમાંથી બે વિદ્યાર્થી દ્વારા કરવામાં આવે છે. c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 din MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, и Nцображения для срезов сердца FATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/группу от разных свиней , выполняется двусторонний , * t c 0 અને 6 દિવસના MTOS પર હૃદયના વિભાગો માટેની પ્રતિનિધિ છબીઓ, ટ્રોપોનિન-T અને NFATC4 માટે ઇમ્યુનોલેબલવાળી, અને કેવર્નસ કોશિકાઓના ન્યુક્લિયસમાં NFATC4 ટ્રાન્સલોકેશનનું પ્રમાણીકરણ (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) સ્લાઇસેસ/જૂથ બે અલગ-અલગ ડુક્કરવાળા વિદ્યાર્થીઓ દ્વારા કરવામાં આવે છે;*p <0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS 心脏切片的代表的代表的片的代表性图像，代表性图像，代表的代表的片的代表性图像，代表性图像，代表易位至CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS) 切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p <.0. c કેલ્કેનિન-T અને NFATC4 ઇમ્યુનોલેબલિંગ 第0天和第6天MTOS હૃદયના ટુકડા, અને NFATC4 વિવિધ NFATC4 易位至CM સેલ ન્યુક્લિયસની માત્રા 化 (n = 4 (D0) 化 (n = 4 (D0) 滶燶) (D0) 化 (n = 4)间双尾学生et 电影；*p < 0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS પર 0 અને 6 તારીખે в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, два- хвостатый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c વિવિધ પિગ (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) સ્લાઇસેસ/જૂથ, 2-pcriter. * સ્ટુડન્ટ્સ માંથી CM ના ન્યુક્લિયસમાં ટ્રોપોનિન-T અને NFATC4 ઇમ્યુનોલોબેલિંગ અને NFATC4 ટ્રાન્સલોકેશનના પ્રમાણીકરણ માટે 0 અને 6 દિવસે MTOS હૃદયના ટુકડાઓની પ્રતિનિધિ છબીઓ.ભૂલ બાર સરેરાશ ± પ્રમાણભૂત વિચલન દર્શાવે છે.
ટ્રાન્સલેશનલ કાર્ડિયોવેસ્ક્યુલર રિસર્ચ માટે સેલ્યુલર મોડલ્સની જરૂર છે જે કાર્ડિયાક વાતાવરણને સચોટ રીતે પ્રજનન કરે છે.આ અભ્યાસમાં, એક CTCM ઉપકરણ વિકસાવવામાં આવ્યું હતું અને લાક્ષણિકતા કે જે હૃદયના અલ્ટ્રાથિન વિભાગોને ઉત્તેજિત કરી શકે છે.CTCM સિસ્ટમમાં શારીરિક રીતે સમન્વયિત ઇલેક્ટ્રોમિકેનિકલ ઉત્તેજના અને T3 અને ડેક્સ પ્રવાહી સંવર્ધનનો સમાવેશ થાય છે.જ્યારે પોર્સિન હૃદયના વિભાગો આ પરિબળોના સંપર્કમાં આવ્યા હતા, ત્યારે તેમની કાર્યક્ષમતા, માળખાકીય અખંડિતતા, ચયાપચયની પ્રવૃત્તિ અને ટ્રાન્સક્રિપ્શનલ અભિવ્યક્તિ 12 દિવસની સંસ્કૃતિ પછી તાજા હૃદયની પેશીઓની જેમ જ રહી હતી.વધુમાં, કાર્ડિયાક પેશીના અતિશય ખેંચાણથી હાયપરએક્સટેન્શનને કારણે હૃદયની હાયપરટ્રોફી થઈ શકે છે.એકંદરે, આ પરિણામો સામાન્ય કાર્ડિયાક ફેનોટાઇપ જાળવવામાં શારીરિક સંસ્કૃતિની સ્થિતિની નિર્ણાયક ભૂમિકાને સમર્થન આપે છે અને ડ્રગ સ્ક્રીનીંગ માટે એક પ્લેટફોર્મ પૂરું પાડે છે.
ઘણા પરિબળો કાર્ડિયોમાયોસાઇટ્સના કાર્ય અને અસ્તિત્વ માટે શ્રેષ્ઠ વાતાવરણ બનાવવા માટે ફાળો આપે છે.આમાંના સૌથી સ્પષ્ટ પરિબળો (1) આંતરકોષીય ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ, (2) ઇલેક્ટ્રોમિકેનિકલ ઉત્તેજના, (3) હ્યુમરલ પરિબળો અને (4) મેટાબોલિક સબસ્ટ્રેટ સાથે સંબંધિત છે.ફિઝિયોલોજિકલ સેલ-ટુ-સેલ ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ માટે એક્સ્ટ્રા સેલ્યુલર મેટ્રિક્સ દ્વારા સપોર્ટેડ બહુવિધ સેલ પ્રકારના જટિલ ત્રિ-પરિમાણીય નેટવર્કની જરૂર છે.આવા જટિલ સેલ્યુલર ક્રિયાપ્રતિક્રિયાઓ વ્યક્તિગત કોષના પ્રકારોની સહ-સંસ્કૃતિ દ્વારા વિટ્રોમાં પુનઃનિર્માણ કરવી મુશ્કેલ છે, પરંતુ હૃદયના વિભાગોની ઓર્ગેનોટાઇપિક પ્રકૃતિનો ઉપયોગ કરીને સરળતાથી પ્રાપ્ત કરી શકાય છે.
કાર્ડિયાક ફેનોટાઇપ 33,34,35 જાળવવા માટે કાર્ડિયોમાયોસાઇટ્સનું યાંત્રિક ખેંચાણ અને વિદ્યુત ઉત્તેજના મહત્વપૂર્ણ છે.જ્યારે યાંત્રિક ઉત્તેજનાનો વ્યાપકપણે hiPSC-CM કન્ડીશનીંગ અને પરિપક્વતા માટે ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો છે, ત્યારે કેટલાક ભવ્ય અભ્યાસોએ તાજેતરમાં અક્ષીય લોડિંગનો ઉપયોગ કરીને સંસ્કૃતિમાં હૃદયના ટુકડાના યાંત્રિક ઉત્તેજનનો પ્રયાસ કર્યો છે.આ અભ્યાસો દર્શાવે છે કે 2D અક્ષીય યાંત્રિક લોડિંગ સંસ્કૃતિ દરમિયાન હૃદયના ફેનોટાઇપ પર હકારાત્મક અસર કરે છે.આ અભ્યાસોમાં, હૃદયના ભાગો કાં તો આઇસોમેટ્રિક ટેન્સાઇલ ફોર્સ17, રેખીય ઓક્સોટોનિક લોડિંગ18 સાથે લોડ કરવામાં આવ્યા હતા અથવા ફોર્સ ટ્રાન્સડ્યુસર ફીડબેક અને ટેન્શન ડ્રાઇવ્સનો ઉપયોગ કરીને કાર્ડિયાક ચક્રને ફરીથી બનાવવામાં આવ્યું હતું.જો કે, આ પદ્ધતિઓ પર્યાવરણીય ઑપ્ટિમાઇઝેશન વિના અક્ષીય પેશીના સ્ટ્રેચનો ઉપયોગ કરે છે, જેના પરિણામે ઘણા કાર્ડિયાક જનીનોનું દમન થાય છે અથવા અસામાન્ય સ્ટ્રેચ રિસ્પોન્સ સાથે સંકળાયેલા જનીનોની વધુ પડતી અભિવ્યક્તિ થાય છે.અહીં વર્ણવેલ CTCM 3D ઇલેક્ટ્રોમિકેનિકલ ઉત્તેજના પ્રદાન કરે છે જે ચક્ર સમય અને શારીરિક ખેંચાણ (25% સ્ટ્રેચ, 40% સિસ્ટોલ, 60% ડાયસ્ટોલ અને 72 ધબકારા પ્રતિ મિનિટ)ના સંદર્ભમાં કુદરતી કાર્ડિયાક ચક્રની નકલ કરે છે.જો કે આ ત્રિ-પરિમાણીય યાંત્રિક ઉત્તેજના એકલા પેશીની અખંડિતતા જાળવવા માટે પૂરતી નથી, ટીશ્યુની સધ્ધરતા, કાર્ય અને અખંડિતતા જાળવવા માટે T3/Dex નો ઉપયોગ કરીને હ્યુમરલ અને યાંત્રિક ઉત્તેજનાનું સંયોજન જરૂરી છે.
પુખ્ત વયના હૃદયના ફિનોટાઇપને મોડ્યુલેટ કરવામાં રમૂજી પરિબળો મહત્વપૂર્ણ ભૂમિકા ભજવે છે.આ HiPS-CM અભ્યાસમાં પ્રકાશિત કરવામાં આવ્યું હતું જેમાં કોષ પરિપક્વતાને વેગ આપવા માટે સંસ્કૃતિ મીડિયામાં T3 અને Dex ઉમેરવામાં આવ્યા હતા.T3 કોષ પટલમાં એમિનો એસિડ, શર્કરા અને કેલ્શિયમના પરિવહનને પ્રભાવિત કરી શકે છે36.વધુમાં, T3 MHC-α અભિવ્યક્તિ અને MHC-β ડાઉનરેગ્યુલેશનને પ્રોત્સાહન આપે છે, ગર્ભના સીએમમાં ​​ધીમા ટ્વિચ માયોફિબ્રિલ્સની તુલનામાં પરિપક્વ કાર્ડિયોમાયોસાઇટ્સમાં ઝડપી ટ્વિચ માયોફિબ્રિલ્સની રચનાને પ્રોત્સાહન આપે છે.હાઈપોથાઈરોઈડના દર્દીઓમાં T3 ની ઉણપના પરિણામે માયોફિબ્રિલર બેન્ડની ખોટ થાય છે અને સ્વર વિકાસના દરમાં ઘટાડો થાય છે37.ડેક્સ ગ્લુકોકોર્ટિકોઇડ રીસેપ્ટર્સ પર કાર્ય કરે છે અને અલગ પરફ્યુઝ્ડ હૃદયમાં મ્યોકાર્ડિયલ સંકોચનને વધારવા માટે દર્શાવવામાં આવ્યું છે;38 આ સુધારો કેલ્શિયમ ડિપોઝિટ-ડ્રિવન એન્ટ્રી (SOCE) 39,40 પરની અસર સાથે સંબંધિત હોવાનું માનવામાં આવે છે.વધુમાં, ડેક્સ તેના રીસેપ્ટર્સ સાથે જોડાય છે, જે વ્યાપક અંતઃકોશિક પ્રતિભાવનું કારણ બને છે જે રોગપ્રતિકારક કાર્ય અને બળતરાને દબાવી દે છે30.
અમારા પરિણામો દર્શાવે છે કે ભૌતિક મિકેનિકલ સ્ટીમ્યુલેશન (MS) એ Ctrl ની તુલનામાં એકંદર સંસ્કૃતિ પ્રદર્શનમાં સુધારો કર્યો છે, પરંતુ સંસ્કૃતિમાં 12 દિવસ સુધી સધ્ધરતા, માળખાકીય અખંડિતતા અને કાર્ડિયાક અભિવ્યક્તિ જાળવવામાં નિષ્ફળ ગયા છે.Ctrl ની તુલનામાં, CTCM (MT) સંસ્કૃતિઓમાં T3 અને Dex ઉમેરવાથી કાર્યક્ષમતામાં સુધારો થયો છે અને 12 દિવસ સુધી તાજા હૃદયની પેશીઓ સાથે સમાન ટ્રાન્સક્રિપ્શન પ્રોફાઇલ્સ, માળખાકીય અખંડિતતા અને મેટાબોલિક પ્રવૃત્તિ જાળવી રાખવામાં આવી છે.વધુમાં, ટીશ્યુ સ્ટ્રેચની ડિગ્રીને નિયંત્રિત કરીને, STCMનો ઉપયોગ કરીને એક હાઇપરએક્સટેન્શન-પ્રેરિત કાર્ડિયાક હાઇપરટ્રોફી મોડલ બનાવવામાં આવ્યું હતું, જે STCM સિસ્ટમની વૈવિધ્યતાને દર્શાવે છે.એ નોંધવું જોઈએ કે કાર્ડિયાક રિમોડેલિંગ અને ફાઈબ્રોસિસમાં સામાન્ય રીતે અખંડ અવયવોનો સમાવેશ થાય છે જેમના ફરતા કોષો યોગ્ય સાયટોકાઈન્સ તેમજ ફેગોસાયટોસિસ અને અન્ય રિમોડેલિંગ પરિબળો પ્રદાન કરી શકે છે, તેમ છતાં હૃદયના વિભાગો તણાવ અને આઘાતના પ્રતિભાવમાં ફાઈબ્રોટિક પ્રક્રિયાની નકલ કરી શકે છે.myofibroblasts માં.આ અગાઉ આ કાર્ડિયાક સ્લાઈસ મોડેલમાં મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું છે.એ નોંધવું જોઈએ કે ટેકીકાર્ડિયા, બ્રેડીકાર્ડિયા અને યાંત્રિક રુધિરાભિસરણ સપોર્ટ (મિકેનિકલ અનલોડેડ હાર્ટ) જેવી ઘણી પરિસ્થિતિઓનું અનુકરણ કરવા દબાણ/વિદ્યુત કંપનવિસ્તાર અને આવર્તન બદલીને CTCM પરિમાણોને મોડ્યુલેટ કરી શકાય છે.આ સિસ્ટમને દવા પરીક્ષણ માટે માધ્યમ થ્રુપુટ બનાવે છે.અતિશય પરિશ્રમ-પ્રેરિત કાર્ડિયાક હાઇપરટ્રોફીનું મોડેલ બનાવવાની CTCMની ક્ષમતા વ્યક્તિગત ઉપચાર માટે આ સિસ્ટમનું પરીક્ષણ કરવાનો માર્ગ મોકળો કરે છે.નિષ્કર્ષમાં, વર્તમાન અભ્યાસ દર્શાવે છે કે યાંત્રિક ખેંચાણ અને હ્યુમરલ ઉત્તેજના કાર્ડિયાક પેશી વિભાગોની સંસ્કૃતિ જાળવવા માટે મહત્વપૂર્ણ છે.
જો કે અહીં પ્રસ્તુત ડેટા સૂચવે છે કે CTCM અખંડ મ્યોકાર્ડિયમના મોડેલિંગ માટે ખૂબ જ આશાસ્પદ પ્લેટફોર્મ છે, આ સંસ્કૃતિ પદ્ધતિમાં કેટલીક મર્યાદાઓ છે.CTCM સંસ્કૃતિની મુખ્ય મર્યાદા એ છે કે તે સ્લાઇસેસ પર સતત ગતિશીલ યાંત્રિક તાણ લાદે છે, જે દરેક ચક્ર દરમિયાન કાર્ડિયાક સ્લાઇસ સંકોચનને સક્રિયપણે મોનિટર કરવાની ક્ષમતાને અટકાવે છે.વધુમાં, કાર્ડિયાક વિભાગો (7 મીમી) ના નાના કદના કારણે, પરંપરાગત બળ સેન્સર્સનો ઉપયોગ કરીને સંસ્કૃતિ પ્રણાલીની બહાર સિસ્ટોલિક કાર્યનું મૂલ્યાંકન કરવાની ક્ષમતા મર્યાદિત છે.વર્તમાન હસ્તપ્રતમાં, અમે સંકોચન કાર્યના સૂચક તરીકે ઓપ્ટિકલ વોલ્ટેજનું મૂલ્યાંકન કરીને આ મર્યાદાને આંશિક રીતે દૂર કરીએ છીએ.જો કે, આ મર્યાદાને વધુ કાર્યની જરૂર પડશે અને ભવિષ્યમાં સંસ્કૃતિમાં હૃદયના ટુકડાઓના કાર્યના ઓપ્ટિકલ મોનિટરિંગ માટેની પદ્ધતિઓ રજૂ કરીને સંબોધવામાં આવી શકે છે, જેમ કે કેલ્શિયમ અને વોલ્ટેજ-સંવેદનશીલ રંગોનો ઉપયોગ કરીને ઓપ્ટિકલ મેપિંગ.સીટીસીએમની બીજી મર્યાદા એ છે કે કાર્યકારી મોડલ શારીરિક તાણ (પ્રીલોડ અને આફ્ટરલોડ) સાથે ચાલાકી કરતું નથી.સીટીસીએમમાં, ખૂબ મોટી પેશીઓમાં ડાયસ્ટોલ (સંપૂર્ણ ખેંચાણ) અને સિસ્ટોલ (વિદ્યુત ઉત્તેજના દરમિયાન સંકોચનની લંબાઈ) માં 25% શારીરિક ખેંચાણનું પુનઃઉત્પાદન કરવા માટે વિરુદ્ધ દિશામાં દબાણ પ્રેરિત કરવામાં આવ્યું હતું.આ મર્યાદાને ભવિષ્યની CTCM ડિઝાઇનમાં બંને બાજુથી કાર્ડિયાક ટિશ્યુ પર પૂરતા દબાણ દ્વારા અને હૃદયના ચેમ્બરમાં બનતા ચોક્કસ દબાણ-વોલ્યુમ સંબંધોને લાગુ કરીને દૂર કરવી જોઈએ.
આ હસ્તપ્રતમાં નોંધાયેલ ઓવરસ્ટ્રેચ-પ્રેરિત રિમોડેલિંગ હાયપરટ્રોફિક હાઇપરસ્ટ્રેચ સિગ્નલોની નકલ કરવા માટે મર્યાદિત છે.આમ, આ મોડેલ સ્ટ્રેચ-પ્રેરિત હાઇપરટ્રોફિક સિગ્નલિંગના અભ્યાસમાં હ્યુમરલ અથવા ન્યુરલ પરિબળો (જે આ સિસ્ટમમાં અસ્તિત્વમાં નથી) ની જરૂરિયાત વિના મદદ કરી શકે છે.CTCM ની બહુવિધતા વધારવા માટે વધુ અભ્યાસની જરૂર છે, ઉદાહરણ તરીકે, રોગપ્રતિકારક કોશિકાઓ સાથે સહ-સંસ્કૃતિ, પ્લાઝ્મા હ્યુમરલ પરિબળોનું પરિભ્રમણ, અને ચેતાકોષીય કોષો સાથે સહ-સંવર્ધન જ્યારે CTCM સાથે રોગ મોડેલિંગની શક્યતાઓને સુધારશે.
આ અભ્યાસમાં તેર ડુક્કરનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.તમામ પ્રાણી પ્રક્રિયાઓ સંસ્થાકીય માર્ગદર્શિકા અનુસાર કરવામાં આવી હતી અને યુનિવર્સિટી ઓફ લુઇસવિલે સંસ્થાકીય પશુ સંભાળ અને ઉપયોગ સમિતિ દ્વારા મંજૂર કરવામાં આવી હતી.એઓર્ટિક કમાનને ક્લેમ્પ્ડ કરવામાં આવ્યું હતું અને હૃદયને 1 L જંતુરહિત કાર્ડિયોપ્લેજિયા (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL હેપરિન, pH 7 સુધી) સાથે પરફ્યુઝ કરવામાં આવ્યું હતું; હૃદયને બરફના ઠંડા કાર્ડિયોપ્લેજિક સોલ્યુશનમાં સાચવવામાં આવ્યાં હતાં જ્યાં સુધી બરફ પર લેબમાં લઈ જવામાં ન આવે જે સામાન્ય રીતે <10 મિનિટ હોય છે. હૃદયને બરફના ઠંડા કાર્ડિયોપ્લેજિક સોલ્યુશનમાં સાચવવામાં આવ્યાં હતાં જ્યાં સુધી બરફ પર લેબમાં લઈ જવામાં ન આવે જે સામાન્ય રીતે <10 મિનિટ હોય છે. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. બરફ પર પ્રયોગશાળામાં પરિવહન થાય ત્યાં સુધી હૃદયને બરફના ઠંડા કાર્ડિયોપ્લેજિક દ્રાવણમાં સંગ્રહિત કરવામાં આવે છે, જે સામાન્ય રીતે <10 મિનિટ લે છે.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室,通常<10分钟.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室,通常<10分钟. Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 min. બરફ પર લેબોરેટરીમાં પરિવહન થાય ત્યાં સુધી હૃદયને બરફ કાર્ડિયોપ્લેજિયા પર રાખો, સામાન્ય રીતે <10 મિનિટ.
CTCM ઉપકરણ સોલિડવર્ક્સ કમ્પ્યુટર-એઇડેડ ડિઝાઇન (CAD) સોફ્ટવેરમાં વિકસાવવામાં આવ્યું હતું.કલ્ચર ચેમ્બર, ડિવાઈડર અને એર ચેમ્બર CNC ક્લિયર એક્રેલિક પ્લાસ્ટિકના બનેલા છે.7mm વ્યાસની બેક-અપ રિંગ મધ્યમાં ઉચ્ચ ઘનતા પોલિઇથિલિન (HDPE) થી બનેલી છે અને નીચે મીડિયાને સીલ કરવા માટે ઉપયોગમાં લેવાતા સિલિકોન ઓ-રિંગને સમાવવા માટે ઓ-રિંગ ગ્રુવ ધરાવે છે.પાતળી સિલિકા મેમ્બ્રેન કલ્ચર ચેમ્બરને સેપરેશન પ્લેટથી અલગ કરે છે.સિલિકોન મેમ્બ્રેન 0.02″ જાડા સિલિકોન શીટમાંથી લેસર કાપવામાં આવે છે અને તેની કઠિનતા 35A છે.નીચે અને ઉપરના સિલિકોન ગાસ્કેટ્સ 1/16″ જાડા સિલિકોન શીટમાંથી લેસર કટ છે અને તેની કઠિનતા 50A છે.316L સ્ટેનલેસ સ્ટીલ સ્ક્રૂ અને વિંગ નટ્સનો ઉપયોગ બ્લોકને બાંધવા અને હવાચુસ્ત સીલ બનાવવા માટે થાય છે.
એક સમર્પિત પ્રિન્ટેડ સર્કિટ બોર્ડ (PCB) C-PACE-EM સિસ્ટમ સાથે સંકલિત કરવા માટે રચાયેલ છે.પીસીબી પર સ્વિસ મશીન કનેક્ટર સોકેટ્સ ગ્રેફાઇટ ઇલેક્ટ્રોડ્સ સાથે સિલ્વર-પ્લેટેડ કોપર વાયર અને બ્રોન્ઝ 0-60 સ્ક્રૂ દ્વારા ઇલેક્ટ્રોડ્સમાં સ્ક્રૂ કરવામાં આવે છે.પ્રિન્ટેડ સર્કિટ બોર્ડ 3D પ્રિન્ટરના કવરમાં મૂકવામાં આવે છે.
CTCM ઉપકરણ પ્રોગ્રામેબલ ન્યુમેટિક એક્ટ્યુએટર (PPD) દ્વારા નિયંત્રિત થાય છે જે કાર્ડિયાક સાયકલ જેવું જ નિયંત્રિત રુધિરાભિસરણ દબાણ બનાવે છે.જેમ જેમ એર ચેમ્બરની અંદર દબાણ વધે છે તેમ, લવચીક સિલિકોન પટલ ઉપરની તરફ વિસ્તરે છે, પેશીના સ્થળની નીચે માધ્યમને દબાણ કરે છે.ત્યારબાદ પેશીનો વિસ્તાર પ્રવાહીના આ નિકાલ દ્વારા ખેંચવામાં આવશે, ડાયસ્ટોલ દરમિયાન હૃદયના શારીરિક વિસ્તરણની નકલ કરશે.છૂટછાટની ટોચ પર, ગ્રેફાઇટ ઇલેક્ટ્રોડ્સ દ્વારા વિદ્યુત ઉત્તેજના લાગુ કરવામાં આવી હતી, જેણે હવાના ચેમ્બરમાં દબાણ ઘટાડ્યું હતું અને પેશી વિભાગોનું સંકોચન કર્યું હતું.પાઇપની અંદર હવા સિસ્ટમમાં દબાણ શોધવા માટે પ્રેશર સેન્સર સાથે હિમોસ્ટેટિક વાલ્વ છે.પ્રેશર સેન્સર દ્વારા અનુભવાયેલું દબાણ લેપટોપ સાથે જોડાયેલા ડેટા કલેક્ટર પર લાગુ થાય છે.આ ગેસ ચેમ્બરની અંદરના દબાણનું સતત નિરીક્ષણ કરવાની મંજૂરી આપે છે.જ્યારે મહત્તમ ચેમ્બર દબાણ (સ્ટાન્ડર્ડ 80 mmHg, 140 mmHg OS) પર પહોંચી ગયું હતું, ત્યારે ડેટા એક્વિઝિશન ડિવાઇસને C-PACE-EM સિસ્ટમને 2 ms માટે બાયફાસિક વોલ્ટેજ સિગ્નલ જનરેટ કરવા માટે સિગ્નલ મોકલવાનો આદેશ આપવામાં આવ્યો હતો, જે 4 V પર સેટ છે.
હૃદયના વિભાગો મેળવવામાં આવ્યા હતા અને 6 કુવાઓમાં સંસ્કૃતિની સ્થિતિ નીચે મુજબ કરવામાં આવી હતી: કાપણી કરેલા હૃદયને ટ્રાન્સફર વેસલમાંથી ઠંડા (4° સે.) કાર્ડિયોપ્લેજિયા ધરાવતી ટ્રેમાં સ્થાનાંતરિત કરો.ડાબા વેન્ટ્રિકલને જંતુરહિત બ્લેડથી અલગ કરવામાં આવ્યું હતું અને તેને 1-2 સેમી 3 ના ટુકડાઓમાં કાપવામાં આવ્યું હતું.આ ટીશ્યુ બ્લોક્સ ટીશ્યુ એડહેસિવ સાથે ટીશ્યુ સપોર્ટ સાથે જોડાયેલા હતા અને ટાયરોડના સોલ્યુશન અને સતત ઓક્સિજનયુક્ત (3 g/L 2,3-butanedione monooxime (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g), m.6M-4m.4 (m.6m.4) m.4m. lucose (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml 1 M દ્રાવણ), 1.8 mM CaCl2 ( 1.8 ml 1 M ઉકેલ), 1 L ddH2O સુધી).વાઇબ્રેટિંગ માઇક્રોટોમ 80 Hz ની આવર્તન પર 300 µm જાડા સ્લાઇસેસ, 2 mm ની આડી કંપન કંપનવિસ્તાર અને 0.03 mm/s ના એડવાન્સ રેટ પર સેટ કરવામાં આવ્યું હતું.સોલ્યુશનને ઠંડુ રાખવા માટે ટીશ્યુ બાથ બરફથી ઘેરાયેલું હતું અને તાપમાન 4 ડિગ્રી સેલ્સિયસ જાળવવામાં આવ્યું હતું.એક કલ્ચર પ્લેટ માટે પૂરતા ભાગો ન મળે ત્યાં સુધી પેશીના ભાગોને માઇક્રોટોમ બાથમાંથી બરફ પર સતત ઓક્સિજનયુક્ત ટાયરોડ સોલ્યુશન ધરાવતા ઇન્ક્યુબેશન બાથમાં સ્થાનાંતરિત કરો.ટ્રાન્સવેલ કલ્ચર માટે, પેશીના વિભાગોને જંતુરહિત 6 મીમી પહોળા પોલીયુરેથીન સપોર્ટ સાથે જોડવામાં આવ્યા હતા અને 6 મિલી ઑપ્ટિમાઇઝ્ડ માધ્યમમાં મૂકવામાં આવ્યા હતા (199 માધ્યમ, 1x આઇટીએસ પૂરક, 10% એફબીએસ, 5 એનજી/એમએલ વીઇજીએફ, 10 એનજી/એમએલ એફજીએફ-આલ્કલાઇન અને એન્ટિબાયોટિક-2).વિદ્યુત ઉત્તેજના (10 V, આવર્તન 1.2 Hz) સી-પેસ દ્વારા પેશી વિભાગો પર લાગુ કરવામાં આવી હતી.TD શરતો માટે, તાજા T3 અને Dex દરેક મધ્યમ ફેરફાર પર 100 nM અને 1 μM પર ઉમેરવામાં આવ્યા હતા.દિવસમાં 3 વખત રિપ્લેસમેન્ટ પહેલાં માધ્યમ ઓક્સિજનથી સંતૃપ્ત થાય છે.37°C અને 5% CO2 પર ઇન્ક્યુબેટરમાં ટીશ્યુ સેક્શનનું સંવર્ધન કરવામાં આવ્યું હતું.
સીટીસીએમ કલ્ચર માટે, પેટ્રી ડિશમાં પેટ્રી ડિશમાં કસ્ટમ-મેઇડ 3D પ્રિન્ટર પર પેશીના વિભાગો મૂકવામાં આવ્યા હતા જેમાં ફેરફાર કરેલ ટાયરોડનું સોલ્યુશન હતું.ઉપકરણને સપોર્ટ રિંગના વિસ્તારના 25% દ્વારા હૃદયના ટુકડાના કદને વધારવા માટે ડિઝાઇન કરવામાં આવ્યું છે.આ એટલા માટે કરવામાં આવે છે કે ટાયરોડના દ્રાવણમાંથી માધ્યમમાં સ્થાનાંતરિત થયા પછી અને ડાયસ્ટોલ દરમિયાન હૃદયના ભાગો ખેંચાતા નથી.હિસ્ટોએક્રીલિક ગુંદરનો ઉપયોગ કરીને, 300 µm જાડા વિભાગોને 7 મીમી વ્યાસની સપોર્ટ રિંગ પર નિશ્ચિત કરવામાં આવ્યા હતા.ટીશ્યુ સેક્શનને સપોર્ટ રીંગમાં જોડ્યા પછી, વધારાના ટીશ્યુ સેક્શનને કાપી નાખો અને જોડાયેલ પેશી સેક્શનને પાછા ટાયરોડ સોલ્યુશનના બાથમાં બરફ (4°C) પર મૂકો જ્યાં સુધી એક ઉપકરણ માટે પૂરતા ભાગો તૈયાર ન થઈ જાય.બધા ઉપકરણોનો કુલ પ્રોસેસિંગ સમય 2 કલાકથી વધુ ન હોવો જોઈએ.6 ટીશ્યુ સેક્શનને તેમના સપોર્ટ રિંગ્સ સાથે જોડ્યા પછી, CTCM ડિવાઇસ એસેમ્બલ કરવામાં આવ્યું હતું.સીટીસીએમ કલ્ચર ચેમ્બર 21 મિલી પ્રી-ઓક્સિજનયુક્ત માધ્યમથી પહેલાથી ભરેલું છે.પેશીના ભાગોને કલ્ચર ચેમ્બરમાં સ્થાનાંતરિત કરો અને પીપેટ વડે કોઈપણ હવાના પરપોટાને કાળજીપૂર્વક દૂર કરો.ત્યારબાદ પેશી વિભાગને છિદ્રમાં લઈ જવામાં આવે છે અને ધીમેધીમે તેને સ્થાને દબાવવામાં આવે છે.છેલ્લે, ઉપકરણ પર ઇલેક્ટ્રોડ કેપ મૂકો અને ઉપકરણને ઇન્ક્યુબેટરમાં સ્થાનાંતરિત કરો.પછી CTCM ને એર ટ્યુબ અને C-PACE-EM સિસ્ટમ સાથે જોડો.ન્યુમેટિક એક્ટ્યુએટર ખુલે છે અને એર વાલ્વ CTCM ખોલે છે.C-PACE-EM સિસ્ટમ 2 ms માટે બાયફાસિક પેસિંગ દરમિયાન 1.2 Hz પર 4 V પહોંચાડવા માટે ગોઠવવામાં આવી હતી.ઇલેક્ટ્રોડ્સ પર ગ્રેફાઇટના સંચયને ટાળવા માટે દિવસમાં બે વાર માધ્યમ બદલવામાં આવતું હતું અને દિવસમાં એકવાર ઇલેક્ટ્રોડ્સ બદલવામાં આવતા હતા.જો જરૂરી હોય તો, તેમની નીચે પડેલા કોઈપણ હવાના પરપોટાને બહાર કાઢવા માટે તેમના સંસ્કૃતિના કુવાઓમાંથી પેશીના ભાગોને દૂર કરી શકાય છે.MT સારવાર શરતો માટે, T3/Dex 100 nM T3 અને 1 μM ડેક્સ સાથે દરેક માધ્યમ ફેરફાર સાથે તાજી ઉમેરવામાં આવ્યું હતું.CTCM ઉપકરણોને ઇન્ક્યુબેટરમાં 37°C અને 5% CO2 પર સંવર્ધન કરવામાં આવ્યું હતું.
હૃદયના ટુકડાઓના ખેંચાયેલા માર્ગો મેળવવા માટે, એક ખાસ કેમેરા સિસ્ટમ વિકસાવવામાં આવી હતી.એક SLR કેમેરા (કેનન રિબેલ T7i, Canon, Tokyo, Japan) નો ઉપયોગ Navitar Zoom 7000 18-108mm મેક્રો લેન્સ (Navitar, San Francisco, CA) સાથે કરવામાં આવ્યો હતો.માધ્યમને તાજા માધ્યમથી બદલ્યા પછી ઓરડાના તાપમાને વિઝ્યુલાઇઝેશન કરવામાં આવ્યું હતું.કૅમેરા 51°ના ખૂણા પર સ્થિત છે અને વિડિયો 30 ફ્રેમ પ્રતિ સેકન્ડ પર રેકોર્ડ કરવામાં આવે છે.સૌપ્રથમ, ઓપન સોર્સ સોફ્ટવેર (MUSCLEMOTION43) નો ઉપયોગ ઇમેજ-J સાથે હૃદયના ટુકડાઓની ગતિને માપવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.અવાજ ટાળવા માટે ધબકારાવાળા હૃદયના ટુકડા માટે રસ ધરાવતા વિસ્તારોને વ્યાખ્યાયિત કરવા માટે MATLAB (મેથવર્કસ, નેટિક, MA, USA) નો ઉપયોગ કરીને માસ્ક બનાવવામાં આવ્યો હતો.મેન્યુઅલી વિભાજિત માસ્ક ફ્રેમ ક્રમમાં બધી છબીઓ પર લાગુ થાય છે અને પછી MUSCLEMOTION પ્લગ-ઇન પર પસાર થાય છે.સંદર્ભ ફ્રેમની તુલનામાં તેની હિલચાલને માપવા માટે સ્નાયુ ગતિ દરેક ફ્રેમમાં પિક્સેલ્સની સરેરાશ તીવ્રતાનો ઉપયોગ કરે છે.ડેટા રેકોર્ડ કરવામાં આવ્યો હતો, ફિલ્ટર કરવામાં આવ્યો હતો અને તેનો ઉપયોગ ચક્રના સમયને માપવા અને કાર્ડિયાક ચક્ર દરમિયાન પેશીઓના ખેંચાણનું મૂલ્યાંકન કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો.રેકોર્ડ કરેલ વિડિયોને ફર્સ્ટ-ઓર્ડર ઝીરો-ફેઝ ડિજિટલ ફિલ્ટરનો ઉપયોગ કરીને પોસ્ટ-પ્રોસેસ કરવામાં આવ્યો હતો.ટીશ્યુ સ્ટ્રેચ (પીક-ટુ-પીક) ને માપવા માટે, રેકોર્ડ કરેલ સિગ્નલમાં શિખરો અને ચાટ વચ્ચે તફાવત કરવા માટે પીક-ટુ-પીક વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.વધુમાં, સિગ્નલ ડ્રિફ્ટને દૂર કરવા માટે 6ઠ્ઠા ક્રમના બહુપદીનો ઉપયોગ કરીને ડિટ્રેન્ડિંગ કરવામાં આવે છે.વૈશ્વિક પેશી ગતિ, ચક્ર સમય, આરામનો સમય અને સંકોચન સમય (પૂરક પ્રોગ્રામ કોડ 44) નક્કી કરવા માટે MATLAB માં પ્રોગ્રામ કોડ વિકસાવવામાં આવ્યો હતો.
તાણ વિશ્લેષણ માટે, મિકેનિકલ સ્ટ્રેચ એસેસમેન્ટ માટે બનાવેલ સમાન વિડિઓઝનો ઉપયોગ કરીને, અમે MUSCLEMOTION સૉફ્ટવેર અનુસાર ગતિ શિખરો (ઉચ્ચતમ (ઉચ્ચ) અને સૌથી નીચા (નીચલા) ગતિ બિંદુઓ) રજૂ કરતી બે છબીઓ પ્રથમ શોધી કાઢી.અમે પછી પેશીના પ્રદેશોને વિભાજિત કર્યા અને વિભાજિત પેશી પર શેડિંગ અલ્ગોરિધમનું સ્વરૂપ લાગુ કર્યું (પૂરક ફિગ. 2a).ત્યારબાદ વિભાજિત પેશીને દસ ઉપસપાટીઓમાં વિભાજિત કરવામાં આવી હતી, અને દરેક સપાટી પરના તાણની ગણતરી નીચેના સમીકરણનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવી હતી: સ્ટ્રેન = (Sup-Sdown)/Sdown, જ્યાં Sup અને Sdown એ અનુક્રમે ફેબ્રિકના ઉપરના અને નીચેના પડછાયાઓથી આકારનું અંતર છે (પૂરક ફિગ. .2b).
હૃદયના ભાગોને 48 કલાક માટે 4% પેરાફોર્માલ્ડીહાઇડમાં નિશ્ચિત કરવામાં આવ્યા હતા.સ્થિર પેશીઓને 1 કલાક માટે 10% અને 20% સુક્રોઝમાં નિર્જલીકૃત કરવામાં આવી હતી, પછી રાતોરાત 30% સુક્રોઝમાં.ત્યારપછી વિભાગોને ઓપ્ટીમમ કટીંગ ટેમ્પરેચર કમ્પાઉન્ડ (ઓસીટી કમ્પાઉન્ડ)માં એમ્બેડ કરવામાં આવ્યા હતા અને ધીમે ધીમે આઈસોપેન્ટેન/ડ્રાય આઈસ બાથમાં સ્થિર કરવામાં આવ્યા હતા.OCT એમ્બેડિંગ બ્લોક્સને અલગ ન થાય ત્યાં સુધી -80 °C પર સ્ટોર કરો.સ્લાઇડ્સ 8 μm ની જાડાઈ સાથે વિભાગો તરીકે તૈયાર કરવામાં આવી હતી.
હૃદયના વિભાગોમાંથી OCT દૂર કરવા માટે, સ્લાઇડ્સને હીટિંગ બ્લોક પર 95 °C પર 5 મિનિટ માટે ગરમ કરો.દરેક સ્લાઇડમાં 1 મિલી પીબીએસ ઉમેરો અને ઓરડાના તાપમાને 30 મિનિટ માટે સેવન કરો, પછી ઓરડાના તાપમાને 15 મિનિટ માટે પીબીએસમાં 0.1% ટ્રાઇટોન-એક્સ સેટ કરીને વિભાગો પરમીટ કરો.બિન-વિશિષ્ટ એન્ટિબોડીઝને નમૂના સાથે જોડતા અટકાવવા માટે, સ્લાઇડ્સમાં 3% BSA સોલ્યુશનનું 1 મિલી ઉમેરો અને ઓરડાના તાપમાને 1 કલાક માટે સેવન કરો.પછી BSA દૂર કરવામાં આવી હતી અને સ્લાઇડ્સ પીબીએસ સાથે ધોવાઇ હતી.દરેક નમૂનાને પેંસિલથી ચિહ્નિત કરો.પ્રાથમિક એન્ટિબોડીઝ (1% BSA માં 1:200 પાતળું) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) અને ટ્રોપોનિન-T (થર્મો સાયન્ટિફિક; #MA5-12960) 90 મિનિટમાં ઉમેરવામાં આવ્યા હતા, પછી એલેક્સા (બીએસએ 2000%) માં બીજા 1% એન્ટિબોડીઝનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો. Fluor 488 (થર્મો સાયન્ટિફિક; #A16079), સસલા સામે એલેક્સા ફ્લોર 594 (થર્મો સાયન્ટિફિક; #T6391) વધારાની 90 મિનિટ માટે PBS સાથે 3 વખત ધોવાઇ, પૃષ્ઠભૂમિમાંથી લક્ષ્ય સ્ટેનિંગને અલગ પાડવા માટે, અમે નિયંત્રણ તરીકે માત્ર ગૌણ એન્ટિબોડીનો ઉપયોગ કર્યો. અંતે, ન્યુક્લિયર VPI અને VDA (VINDEL) સ્થાને ઉમેરવામાં આવ્યા હતા. પ્રયોગશાળાઓ) અને નેઇલ પોલીશ વડે સીલ કરેલ. -x મેગ્નિફિકેશન) અને 40x મેગ્નિફિકેશન સાથે કીએન્સ માઇક્રોસ્કોપ.
WGA-Alexa Fluor 555 (થર્મો સાયન્ટિફિક; #W32464) PBS માં 5 μg/ml પર ડબલ્યુજીએ સ્ટેનિંગ માટે વપરાય છે અને ઓરડાના તાપમાને 30 મિનિટ માટે નિશ્ચિત વિભાગો પર લાગુ કરવામાં આવ્યું હતું.પછી સ્લાઇડ્સને પીબીએસથી ધોવાઇ હતી અને દરેક સ્લાઇડમાં સુદાન બ્લેક ઉમેરવામાં આવ્યું હતું અને 30 મિનિટ સુધી તેને ઉકાળવામાં આવ્યું હતું.પછી સ્લાઇડ્સને પીબીએસ વડે ધોવાઇ હતી અને વેકટાશિલ્ડ એમ્બેડિંગ માધ્યમ ઉમેરવામાં આવ્યું હતું.સ્લાઇડ્સ 40x મેગ્નિફિકેશન પર કીએન્સ માઇક્રોસ્કોપ પર વિઝ્યુઅલાઈઝ કરવામાં આવી હતી.
ઉપર વર્ણવ્યા મુજબ નમૂનાઓમાંથી OCT દૂર કરવામાં આવ્યું હતું.OCT દૂર કર્યા પછી, સ્લાઇડ્સને બોઈનના સોલ્યુશનમાં રાતોરાત નિમજ્જિત કરો.પછી સ્લાઇડ્સને 1 કલાક માટે નિસ્યંદિત પાણીથી ધોઈ નાખવામાં આવી અને પછી 10 મિનિટ માટે બિબ્રિચ એલો એસિડ ફ્યુચિન સોલ્યુશનમાં મૂકવામાં આવી.પછી સ્લાઇડ્સને નિસ્યંદિત પાણીથી ધોવાઇ અને 5% ફોસ્ફોમોલિબ્ડેનમ/5% ફોસ્ફોટંગસ્ટિક એસિડના દ્રાવણમાં 10 મિનિટ માટે મૂકવામાં આવી.કોગળા કર્યા વિના, સ્લાઇડ્સને 15 મિનિટ માટે સીધા જ એનિલિન બ્લુ સોલ્યુશનમાં સ્થાનાંતરિત કરો.પછી સ્લાઇડ્સ નિસ્યંદિત પાણીથી ધોવાઇ અને 1% એસિટિક એસિડના દ્રાવણમાં 2 મિનિટ માટે મૂકવામાં આવી.સ્લાઇડ્સને 200 N ઇથેનોલમાં સૂકવીને xylene માં ટ્રાન્સફર કરવામાં આવી હતી.સ્ટેઇન્ડ સ્લાઇડ્સ 10x ઉદ્દેશ્ય સાથે કીએન્સ માઇક્રોસ્કોપનો ઉપયોગ કરીને વિઝ્યુઅલાઈઝ કરવામાં આવી હતી.કીએન્સ વિશ્લેષક સોફ્ટવેરનો ઉપયોગ કરીને ફાઇબ્રોસિસ વિસ્તારની ટકાવારીનું પ્રમાણ નક્કી કરવામાં આવ્યું હતું.
કેટલાક ફેરફારો સાથે ઉત્પાદકના પ્રોટોકોલ અનુસાર CyQUANT™ MTT સેલ વાયેબિલિટી એસે (Invitrogen, Carlsbad, CA), કેટલોગ નંબર V13154.ખાસ કરીને, MTT વિશ્લેષણ દરમિયાન સમાન પેશીના કદની ખાતરી કરવા માટે 6 મીમીના વ્યાસ સાથે સર્જીકલ પંચનો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.ઉત્પાદકના પ્રોટોકોલ અનુસાર MTT સબસ્ટ્રેટ ધરાવતી 12-વેલ પ્લેટના કુવાઓમાં પેશીઓને વ્યક્તિગત રીતે પ્લેટેડ કરવામાં આવી હતી.વિભાગોને 37 ° સે. તાપમાને 3 કલાક માટે ઉકાળવામાં આવે છે અને જીવંત પેશી MTT સબસ્ટ્રેટને જાંબલી ફોર્મઝાન સંયોજન બનાવવા માટે ચયાપચય કરે છે.MTT સોલ્યુશનને 1 ml DMSO વડે બદલો અને 37 °C પર 15 મિનિટ માટે હ્રદયના ભાગોમાંથી જાંબલી ફોર્માઝાન કાઢવા માટે પકાવો.નમૂનાઓ 1:10 DMSO માં 96-વેલ ક્લિયર બોટમ પ્લેટ્સમાં અને જાંબલી રંગની તીવ્રતા 570 nm પર સાયટેશન પ્લેટ રીડર (બાયોટેક) નો ઉપયોગ કરીને માપવામાં આવી હતી.હૃદયના દરેક સ્લાઇસના વજન માટે વાંચન સામાન્ય કરવામાં આવ્યું હતું.
અગાઉ વર્ણવ્યા મુજબ ગ્લુકોઝના ઉપયોગની તપાસ માટે હાર્ટ સ્લાઇસ મીડિયાને 1 μCi/ml [5-3H]-ગ્લુકોઝ (મોરાવેક બાયોકેમિકલ્સ, બ્રેઆ, CA, USA) ધરાવતા મીડિયા સાથે બદલવામાં આવ્યું હતું.ઇન્ક્યુબેશનના 4 કલાક પછી, 0.2 N HCl ના 100 μl ધરાવતી ખુલ્લી માઇક્રોસેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબમાં 100 μl માધ્યમ ઉમેરો.પછી ટ્યુબને 37°C પર 72 કલાક માટે [3H]2O નું બાષ્પીભવન કરવા માટે 500 μl dH2O ધરાવતી સિન્ટિલેશન ટ્યુબમાં મૂકવામાં આવી હતી.પછી સિન્ટિલેશન ટ્યુબમાંથી માઇક્રોસેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબને દૂર કરો અને 10 મિલી સિન્ટિલેશન પ્રવાહી ઉમેરો.ટ્રાઇ-કાર્બ 2900TR લિક્વિડ સિન્ટિલેશન વિશ્લેષક (પેકાર્ડ બાયોસાયન્સ કંપની, મેરીડેન, સીટી, યુએસએ) નો ઉપયોગ કરીને સિન્ટિલેશન ગણતરીઓ કરવામાં આવી હતી.ત્યારબાદ ગ્લુકોઝના ઉપયોગની ગણતરી [5-3H]-ગ્લુકોઝની ચોક્કસ પ્રવૃત્તિ, અપૂર્ણ સંતુલન અને પૃષ્ઠભૂમિ, [5-3H]-લેબલ વગરના ગ્લુકોઝમાં મંદન, અને સિન્ટિલેશન કાઉન્ટર કાર્યક્ષમતાને ધ્યાનમાં રાખીને કરવામાં આવી હતી.ડેટાને હૃદયના વિભાગોના સમૂહમાં સામાન્ય કરવામાં આવે છે.
ટ્રિઝોલમાં પેશીના એકરૂપીકરણ પછી, ઉત્પાદકના પ્રોટોકોલ અનુસાર Qiagen miRNeasy માઇક્રો કિટ #210874 નો ઉપયોગ કરીને આરએનએને હૃદયના ભાગોમાંથી અલગ કરવામાં આવ્યું હતું.RNAsec લાઇબ્રેરી તૈયારી, ક્રમ અને ડેટા વિશ્લેષણ નીચે પ્રમાણે કરવામાં આવ્યું હતું:
RNA લાઇબ્રેરીની તૈયારી માટે પ્રારંભિક સામગ્રી તરીકે પ્રતિ નમૂના 1 μg RNA નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.ઉત્પાદકની ભલામણોને અનુસરીને NEBNext UltraTM RNA લાઇબ્રેરી પ્રિપેરેશન કિટ ફોર ઇલુમિના (NEB, USA) નો ઉપયોગ કરીને સિક્વન્સિંગ લાઇબ્રેરીઓ જનરેટ કરવામાં આવી હતી અને દરેક નમૂના માટે એટ્રિબ્યુટ સિક્વન્સમાં ઇન્ડેક્સ કોડ ઉમેરવામાં આવ્યા હતા.સંક્ષિપ્તમાં, એમઆરએનએ પોલી-ટી ઓલિગોન્યુક્લિયોટાઇડ્સ સાથે જોડાયેલા ચુંબકીય માળખાનો ઉપયોગ કરીને કુલ આરએનએમાંથી શુદ્ધ કરવામાં આવ્યું હતું.NEB નેક્સ્ટ ફર્સ્ટ સ્ટ્રેન્ડ સિન્થેસિસ રિએક્શન બફર (5X) માં ઊંચા તાપમાને દ્વિભાષી કેશનનો ઉપયોગ કરીને ફ્રેગમેન્ટેશન હાથ ધરવામાં આવે છે.પ્રથમ સ્ટ્રાન્ડ cDNA રેન્ડમ હેક્સામર પ્રાઈમર અને M-MuLV રિવર્સ ટ્રાન્સક્રિપ્ટેસ (RNase H-) નો ઉપયોગ કરીને સંશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું.બીજા સ્ટ્રાન્ડ cDNA પછી DNA પોલિમરેઝ I અને RNase H નો ઉપયોગ કરીને સંશ્લેષણ કરવામાં આવે છે. બાકીના ઓવરહેંગ્સ એક્સોન્યુક્લીઝ/પોલિમરેઝ પ્રવૃત્તિ દ્વારા બ્લન્ટ એન્ડમાં રૂપાંતરિત થાય છે.DNA ફ્રેગમેન્ટના 3′ છેડાને એડિનિલેશન કર્યા પછી, તેને વર્ણસંકરીકરણ માટે તૈયાર કરવા માટે હેરપિન લૂપ સ્ટ્રક્ચર સાથે NEBNext એડેપ્ટર જોડવામાં આવે છે.પસંદગીની લંબાઈના cDNA ટુકડાઓની પસંદગી માટે 150-200 bp.AMPure XP સિસ્ટમ (બેકમેન કોલ્ટર, બેવર્લી, યુએસએ) નો ઉપયોગ કરીને પુસ્તકાલયના ટુકડાને શુદ્ધ કરવામાં આવ્યા હતા.પછી, 3 μl USER એન્ઝાઇમ (NEB, USA) કદ-પસંદ કરેલ cDNA સાથે એડેપ્ટર સાથે બંધાયેલો 37°C પર 15 મિનિટ માટે અને પછી PCR પહેલાં 95°C પર 5 મિનિટ માટે ઉપયોગમાં લેવાયો હતો.પીસીઆર પછી ફ્યુઝન હાઈ-ફિડેલિટી ડીએનએ પોલિમરેઝ, યુનિવર્સલ પીસીઆર પ્રાઈમર્સ અને ઈન્ડેક્સ (એક્સ) પ્રાઈમરનો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું.અંતે, પીસીઆર ઉત્પાદનો શુદ્ધ કરવામાં આવ્યા હતા (AMPure XP સિસ્ટમ) અને લાઇબ્રેરી ગુણવત્તાનું મૂલ્યાંકન એજિલેન્ટ બાયોએનાલાઇઝર 2100 સિસ્ટમ પર કરવામાં આવ્યું હતું.સીડીએનએ લાઇબ્રેરી પછી નોવાસેક સિક્વન્સરનો ઉપયોગ કરીને ક્રમબદ્ધ કરવામાં આવી હતી.CASAVA બેઝ કૉલિંગનો ઉપયોગ કરીને ઇલુમિનામાંથી કાચી ઇમેજ ફાઇલોને કાચા વાંચવામાં રૂપાંતરિત કરવામાં આવી હતી.કાચો ડેટા FASTQ(fq) ફોર્મેટ ફાઇલોમાં સંગ્રહિત થાય છે જેમાં રીડ સિક્વન્સ અને અનુરૂપ આધાર ગુણો હોય છે.Sscrofa11.1 સંદર્ભ જીનોમ સાથે ફિલ્ટર કરેલ સિક્વન્સીંગ રીડને મેચ કરવા માટે HISAT2 પસંદ કરો.સામાન્ય રીતે, HISAT2 કોઈપણ કદના જીનોમને સપોર્ટ કરે છે, જેમાં 4 બિલિયન બેઝ કરતા મોટા જીનોમનો સમાવેશ થાય છે અને મોટાભાગના પરિમાણો માટે ડિફોલ્ટ મૂલ્યો સેટ કરવામાં આવે છે.RNA Seq ડેટામાંથી સ્પ્લિસિંગ રીડને અસરકારક રીતે HISAT2 નો ઉપયોગ કરીને સંરેખિત કરી શકાય છે, જે હાલમાં ઉપલબ્ધ સૌથી ઝડપી સિસ્ટમ છે, અન્ય કોઈપણ પદ્ધતિ કરતાં સમાન અથવા વધુ સારી ચોકસાઈ સાથે.
ટ્રાંસ્ક્રિપ્ટ્સની વિપુલતા સીધી જનીન અભિવ્યક્તિના સ્તરને પ્રતિબિંબિત કરે છે.જનીન અભિવ્યક્તિ સ્તરનું મૂલ્યાંકન જીનોમ અથવા એક્સોન્સ સાથે સંકળાયેલ ટ્રાન્સક્રિપ્ટ્સની વિપુલતા (ક્રમ ગણતરી) દ્વારા કરવામાં આવે છે.વાંચનની સંખ્યા જનીન અભિવ્યક્તિ સ્તર, જનીન લંબાઈ અને અનુક્રમની ઊંડાઈના પ્રમાણસર છે.FPKM (લિખિયન બેઝ જોડી દીઠ અનુક્રમિત ટ્રાંસ્ક્રિપ્ટના હજાર બેઝ જોડીના ટુકડાઓ)ની ગણતરી કરવામાં આવી હતી અને DESeq2 પેકેજનો ઉપયોગ કરીને વિભેદક અભિવ્યક્તિના P-મૂલ્યો નક્કી કરવામાં આવ્યા હતા.પછી અમે બિલ્ટ-ઇન R-ફંક્શન "p.adjust" ના આધારે બેન્જામિન-હોચબર્ગ પદ્ધતિ9 નો ઉપયોગ કરીને દરેક P મૂલ્ય માટે ખોટા શોધ દર (FDR) ની ગણતરી કરી.
થર્મો (થર્મો, બિલાડી નં. 11756050) ના સુપરસ્ક્રીપ્ટ IV વિલો માસ્ટર મિક્સનો ઉપયોગ કરીને હૃદયના વિભાગોમાંથી અલગ કરાયેલ આરએનએને 200 ng/μl ની સાંદ્રતા પર cDNA માં રૂપાંતરિત કરવામાં આવ્યું હતું.ક્વોન્ટિટેટિવ ​​RT-PCR એપ્લાઇડ બાયોસિસ્ટમ્સ એન્ડુરા પ્લેટ માઇક્રોએમ્પ 384-વેલ પારદર્શક પ્રતિક્રિયા પ્લેટ (થર્મો, કેટ. નંબર 4483319) અને માઇક્રોએમ્પ ઓપ્ટિકલ એડહેસિવ (થર્મો, કેટ. નંબર 4311971) નો ઉપયોગ કરીને કરવામાં આવ્યું હતું.પ્રતિક્રિયા મિશ્રણમાં 5 µl ટાકમેન ફાસ્ટ એડવાન્સ્ડ માસ્ટર મિક્સ (થર્મો, કેટ # 4444557), 0.5 µl તકમેન પ્રાઈમર અને 3.5 µl H2O પ્રતિ કૂવા મિશ્રિત થાય છે.સ્ટાન્ડર્ડ qPCR ચક્રો ચલાવવામાં આવ્યા હતા અને CT મૂલ્યો એપ્લાઇડ બાયોસિસ્ટમ્સ ક્વોન્ટસ્ટુડિયો 5 રીઅલ-ટાઇમ પીસીઆર ઇન્સ્ટ્રુમેન્ટ (384-વેલ મોડ્યુલ; ઉત્પાદન # A28135) નો ઉપયોગ કરીને માપવામાં આવ્યા હતા.Taqman પ્રાઈમર્સ થર્મો (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss0810188_m1), RGL1 (Ss081m1), RGL1 (Ss086m1) 8_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss042415) ના નમૂનાના ઘરના સામાન્ય મૂલ્યો હતા. e GAPDH.
ઉત્પાદકના પ્રોટોકોલ અનુસાર NT-ProBNP કીટ (ડુક્કર) (બિલાડી નંબર MBS2086979, માયબાયોસોર્સ) નો ઉપયોગ કરીને NT-ProBNP ના મીડિયા પ્રકાશનનું મૂલ્યાંકન કરવામાં આવ્યું હતું.સંક્ષિપ્તમાં, દરેક નમૂનાના 250 μl અને ધોરણ દરેક કૂવામાં ડુપ્લિકેટમાં ઉમેરવામાં આવ્યા હતા.નમૂના ઉમેર્યા પછી તરત જ, દરેક કૂવામાં 50 µl Assay Reagent A ઉમેરો.ધીમેધીમે પ્લેટને હલાવો અને સીલંટ સાથે સીલ કરો.પછી ગોળીઓ 1 કલાક માટે 37 ડિગ્રી સેલ્સિયસ પર ઉકાળવામાં આવી હતી.પછી સોલ્યુશનને એસ્પિરેટ કરો અને 1X વોશ સોલ્યુશનના 350 µl વડે 4 વખત કૂવાને ધોઈ લો, દરેક વખતે 1-2 મિનિટ માટે વોશ સોલ્યુશનને ઉકાળો.પછી કૂવા દીઠ 100 µl એસે રીએજન્ટ B ઉમેરો અને પ્લેટ સીલંટ વડે સીલ કરો.ટેબ્લેટને હળવાશથી હલાવવામાં આવી હતી અને 37 ° સે પર 30 મિનિટ માટે ઉકાળવામાં આવી હતી.સોલ્યુશનને એસ્પિરેટ કરો અને 1X વોશ સોલ્યુશનના 350 µl વડે 5 વખત કુવાઓને ધોઈ લો.દરેક કૂવામાં 90 µl સબસ્ટ્રેટ સોલ્યુશન ઉમેરો અને પ્લેટને સીલ કરો.પ્લેટને 37°C પર 10-20 મિનિટ માટે ઉકાળો.દરેક કૂવામાં 50 µl સ્ટોપ સોલ્યુશન ઉમેરો.પ્લેટને તરત જ 450 nm પર સેટેશન (બાયોટેક) પ્લેટ રીડરનો ઉપયોગ કરીને માપવામાં આવી હતી.
જૂથ કદ પસંદ કરવા માટે પાવર વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું જે 5% પ્રકાર I ભૂલ દર સાથે પરિમાણમાં 10% સંપૂર્ણ ફેરફાર શોધવા માટે >80% પાવર પ્રદાન કરશે. જૂથ કદ પસંદ કરવા માટે પાવર વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું જે 5% પ્રકાર I ભૂલ દર સાથે પરિમાણમાં 10% સંપૂર્ણ ફેરફાર શોધવા માટે >80% પાવર પ્રદાન કરશે. અનાલિઝ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружемения 10% абнаружения с 5% частотой ошибок типа I. જૂથ કદ પસંદ કરવા માટે પાવર વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું જે 5% પ્રકાર I ભૂલ દર સાથે 10% સંપૂર્ણ પરિમાણ ફેરફાર શોધવા માટે >80% પાવર પ્રદાન કરશે.进行功效分析以选择将提供 > 80％功效以检测参数中10进行功效分析以选择将提供 > 80％功效以检测参数中10 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощности для обнаружения 10% етров и 5% частоты ошибок типа I. જૂથ કદ પસંદ કરવા માટે પાવર વિશ્લેષણ કરવામાં આવ્યું હતું જે 10% સંપૂર્ણ પરિમાણ ફેરફાર અને 5% પ્રકાર I ભૂલ દર શોધવા માટે >80% પાવર પ્રદાન કરશે.પ્રયોગ પહેલાં ટીશ્યુ વિભાગો રેન્ડમલી પસંદ કરવામાં આવ્યા હતા.તમામ વિશ્લેષણ કન્ડિશન બ્લાઇન્ડ હતા અને તમામ ડેટાનું પૃથ્થકરણ કર્યા પછી જ નમૂનાઓ ડીકોડ કરવામાં આવ્યા હતા.ગ્રાફપેડ પ્રિઝમ સોફ્ટવેર (સાન ડિએગો, CA) નો ઉપયોગ તમામ આંકડાકીય વિશ્લેષણ કરવા માટે કરવામાં આવ્યો હતો. તમામ આંકડાઓ માટે, p-મૂલ્યો <0.05 મૂલ્યો પર નોંધપાત્ર ગણવામાં આવતા હતા. તમામ આંકડાઓ માટે, p-મૂલ્યોને <0.05 મૂલ્યો પર નોંધપાત્ર ગણવામાં આવતા હતા. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. તમામ આંકડાઓ માટે, p-મૂલ્યોને <0.05 મૂલ્યો પર નોંધપાત્ર ગણવામાં આવતા હતા.对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的.对于所有统计数据,p 值在值<0.05 时被认为是显着的. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. તમામ આંકડાઓ માટે, p-મૂલ્યોને <0.05 મૂલ્યો પર નોંધપાત્ર ગણવામાં આવતા હતા.બે પૂંછડીવાળા વિદ્યાર્થીની ટી-ટેસ્ટ ડેટા પર માત્ર 2 સરખામણીઓ સાથે કરવામાં આવી હતી.બહુવિધ જૂથો વચ્ચે મહત્વ નક્કી કરવા માટે એક-માર્ગી અથવા દ્વિ-માર્ગી ANOVA નો ઉપયોગ કરવામાં આવ્યો હતો.પોસ્ટ હોક પરીક્ષણો કરતી વખતે, તુકીનું કરેક્શન બહુવિધ સરખામણીઓ માટે લાગુ કરવામાં આવ્યું હતું.પદ્ધતિઓ વિભાગમાં વર્ણવ્યા મુજબ FDR અને p.adjust ની ગણતરી કરતી વખતે RNAsec ડેટામાં વિશેષ આંકડાકીય વિચારણાઓ હોય છે.
અભ્યાસ ડિઝાઇન પર વધુ માહિતી માટે, આ લેખ સાથે જોડાયેલ નેચર રિસર્ચ રિપોર્ટ અમૂર્ત જુઓ.