Mèsi paske ou te vizite Nature.com. Vèsyon navigatè w ap itilize a gen yon sipò CSS limite. Pou pi bon eksperyans lan, nou rekòmande pou w itilize yon navigatè ki ajou (oswa dezaktive Mòd Konpatibilite nan Internet Explorer). Antretan, pou asire sipò kontinyèl, nou pral rann sit la san estil ak JavaScript.
Gen yon bezwen pou yon sistèm in vitro serye ki ka repwodui avèk presizyon anviwònman fizyolojik kè a pou tès dwòg. Disponibilite limite sistèm kilti tisi kè imen an mennen nan entèpretasyon ki pa egzat sou efè dwòg kadyak yo. La a, nou te devlope yon modèl kilti tisi kadyak (CTCM) ki estimile tranch kè elektwomekanikman epi ki sibi detire fizyolojik pandan faz sistolik ak dyastolik sik kadyak la. Apre 12 jou kilti, apwòch sa a te amelyore viabilite seksyon kè yo pasyèlman, men li pa t prezève entegrite estriktirèl yo nèt. Se poutèt sa, apre tès depistaj ti molekil, nou te jwenn ke adisyon 100 nM triyodotironin (T3) ak 1 μM deksametazon (Dex) nan medyòm nou an te kenbe mikwoestrikti seksyon yo pandan 12 jou. An konbinezon ak tretman T3/Dex, sistèm CTCM nan te kenbe pwofil transkripsyonèl, viabilite, aktivite metabolik, ak entegrite estriktirèl nan menm nivo ak tisi kè fre pandan 12 jou. Anplis de sa, twòp detire tisi kadyak la an kilti pwovoke siyalizasyon kadyak ipètrofik, sa ki bay prèv kapasite CTCM pou imite kondisyon ipètrofik ki pwovoke pa detire kadyak la. An konklizyon, CTCM ka modle fizyoloji ak patofizyoloji kè a an kilti sou long peryòd tan, sa ki pèmèt depistaj dwòg serye.
Anvan rechèch klinik, yo bezwen sistèm in vitro serye ki ka repwodui avèk presizyon anviwònman fizyolojik kè imen an. Sistèm sa yo ta dwe imite modifikasyon detire mekanik, batman kè, ak pwopriyete elektwofizyolojik. Modèl bèt yo souvan itilize kòm yon platfòm tès depistaj pou fizyoloji kadyak ak fyab limite nan reflete efè dwòg nan kè imen an1,2. Finalman, Modèl Eksperimantal Kilti Tisi Kadyak Ideyal la (CTCM) se yon modèl ki trè sansib ak espesifik pou divès entèvansyon terapetik ak famasi, ki repwodui avèk presizyon fizyoloji ak fizyopatoloji kè imen an3. Absans yon sistèm konsa limite dekouvèt nouvo tretman pou ensifizans kadyak4,5 e li te mennen nan kadyotoksisite dwòg kòm yon rezon prensipal pou kite mache a6.
Pandan dènye deseni a, uit medikaman ki pa kadyovaskilè yo te retire nan itilizasyon klinik paske yo lakòz pwolonjman entèval QT ki mennen nan aritmi ventrikilè ak lanmò sibit7. Kidonk, gen yon bezwen k ap ogmante pou estrateji depistaj preklinik serye pou evalye efikasite ak toksisite kadyovaskilè. Dènye itilizasyon kadyomyosit ki sòti nan selil souch pluripotans pwovoke pa moun (hiPS-CM) nan depistaj dwòg ak tès toksisite bay yon solisyon pasyèl pou pwoblèm sa a. Sepandan, nati imatur hiPS-CM yo ak mank konpleksite miltiselilè nan tisi kadyak la se gwo limitasyon metòd sa a. Etid resan yo montre ke limitasyon sa a ka simonte an pati lè yo itilize hiPS-CM bonè pou fòme idrojel tisi kadyak yon ti tan apre kòmansman kontraksyon espontane yo epi ogmante piti piti eksitasyon elektrik sou tan. Sepandan, mikwotisi hiPS-CM sa yo manke pwopriyete elektwofizyolojik ak kontraktil matirite myokad adilt la. Anplis de sa, tisi kadyak imen an gen yon estrikti ki pi konplèks, ki konpoze de yon melanj etewojèn diferan kalite selil, tankou selil andotelyal, newòn, ak fibroblas estwomal, ki konekte pa seri espesifik pwoteyin matris ekstraselilè. Eterogeneite popilasyon ki pa kardyomyosit11,12,13 nan kè mamifè adilt yo se yon gwo baryè pou modèl tisi kadyak la lè l sèvi avèk kalite selil endividyèl. Gwo limitasyon sa yo mete aksan sou enpòtans pou devlope metòd pou kiltive tisi myokad entak anba kondisyon fizyolojik ak patolojik.
Seksyon mens (300 µm) kiltive nan kè imen an te pwouve yo se yon modèl pwomètè nan myokad imen entak. Metòd sa a bay aksè a yon sistèm miltiselilè 3D konplè menm jan ak tisi kè imen an. Sepandan, jiska 2019, itilizasyon seksyon kè kiltive yo te limite pa siviv kilti a kout (24 èdtan). Sa a se akòz yon kantite faktè ki gen ladan mank de detire fizik-mekanik, koòdone lè-likid la, ak itilizasyon medya senp ki pa sipòte bezwen tisi kadyak la. An 2019, plizyè gwoup rechèch te demontre ke enkòporasyon faktè mekanik nan sistèm kilti tisi kadyak ka pwolonje lavi kilti a, amelyore ekspresyon kadyak, epi imite patoloji kadyak. De etid elegant 17 ak 18 montre ke chaj mekanik iniaksyal gen yon efè pozitif sou fenotip kadyak pandan kilti a. Sepandan, etid sa yo pa t itilize chaj fiziko-mekanik dinamik twa dimansyon sik kadyak la, piske seksyon kè yo te chaje swa ak fòs tansyon izometrik 17 oswa chaj auxotonik lineyè 18. Metòd sa yo pou lonje tisi yo te lakòz sipresyon anpil jèn kadyak oubyen twòp ekspresyon jèn ki asosye avèk repons lonje anòmal. Li enpòtan pou note ke Pitoulis et al. 19 te devlope yon beny kilti tranch kè dinamik pou rekonstriksyon sik kadyak la lè l sèvi avèk fidbak transducteur fòs ak kondwi tansyon. Malgre ke sistèm sa a pèmèt yon modèl sik kadyak in vitro ki pi egzak, konpleksite ak ti débit metòd la limite aplikasyon sistèm sa a. Laboratwa nou an fèk devlope yon sistèm kilti senplifye lè l sèvi avèk estimilasyon elektrik ak yon mwayen optimize pou kenbe viabilité seksyon tisi kè kochon ak moun pou jiska 6 jou20,21.
Nan maniskri aktyèl la, nou dekri yon modèl kilti tisi kadyak (CTCM) ki itilize seksyon kè kochon ki enkòpore siyal imoral pou rekapitul fizyoloji kadyak twa dimansyon ak distansyon patofizyolojik pandan sik kadyak la. CTCM sa a ka ogmante presizyon prediksyon dwòg pre-klinik nan yon nivo ki pa janm reyalize anvan lè li bay yon sistèm kadyak pri-efikas, nan mitan-debi ki imite fizyoloji/patfizyoloji kè mamifè a pou tès dwòg pre-klinik.
Siyal mekanik emodinamik yo jwe yon wòl enpòtan nan mentni fonksyon kadyomyosit in vitro 22,23,24. Nan maniskri aktyèl la, nou te devlope yon CTCM (Figi 1a) ki ka imite anviwònman kadyak granmoun nan pwovoke tou de estimilasyon elektrik ak mekanik nan frekans fizyolojik (1.2 Hz, 72 batman pa minit). Pou evite twòp detire tisi pandan dyastol, nou te itilize yon aparèy enprime 3D pou ogmante gwosè tisi a pa 25% (Fig. 1b). Stimilasyon elektrik pwovoke pa sistèm C-PACE a te kwonometre pou kòmanse 100 ms anvan sistol lè l sèvi avèk yon sistèm akizisyon done pou repwodui sik kadyak la nèt. Sistèm kilti tisi a itilize yon aktuateur pneumatik pwogramasyon (LB Engineering, Almay) pou elaji siklikman yon manbràn silikon fleksib pou lakòz ekspansyon tranch kè yo nan chanm anwo a. Sistèm nan te konekte ak yon liy lè ekstèn atravè yon transducteur presyon, sa ki te pèmèt ajiste presyon an (± 1 mmHg) ak tan an (± 1 ms) avèk presizyon (Fig. 1c).
a Kole seksyon tisi a nan bag sipò 7 mm lan, ki montre an ble, andedan chanm kilti aparèy la. Chanm kilti a separe ak chanm lè a pa yon manbràn silikon mens fleksib. Mete yon jwenti ant chak chanm pou anpeche flit. Kouvèti aparèy la gen elektwòd grafit ki bay estimilasyon elektrik. b Reprezantasyon eskematik gwo aparèy tisi a, bag gid la ak bag sipò a. Seksyon tisi yo (mawon) yo mete sou aparèy ki twò gwo a ak bag gid la mete nan rainur ki sou kwen ekstèn aparèy la. Sèvi ak gid la, mete ak anpil atansyon bag sipò a ki kouvri ak adezif akrilik tisi sou seksyon tisi kadyak la. c Grafik ki montre tan estimilasyon elektrik la kòm yon fonksyon presyon chanm lè a kontwole pa yon aktuateur pneumatik pwogramasyon (PPD). Yo te itilize yon aparèy akizisyon done pou senkronize estimilasyon elektrik la lè l sèvi avèk detèktè presyon. Lè presyon nan chanm kilti a rive nan papòt ki fikse a, yo voye yon siyal batman kè bay C-PACE-EM pou deklanche estimilasyon elektrik la. d Imaj kat CTCM yo mete sou yon etajè enkibatè. Kat aparèy konekte ak yon PPD atravè yon sikwi pneumatik, epi yo mete detèktè presyon nan valv emostatik la pou kontwole presyon nan sikwi pneumatik la. Chak aparèy gen sis seksyon tisi.
Lè nou te itilize yon sèl aktuateur pneumatik, nou te kapab kontwole 4 aparèy CTCM, chak nan yo te kapab kenbe 6 seksyon tisi (Fig. 1d). Nan CTCM, presyon lè a nan chanm lè a konvèti an presyon senkron nan chanm likid la epi li pwovoke ekspansyon fizyolojik tranch kè a (Figi 2a ak Fim Siplemantè 1). Evalyasyon detire tisi a 80 mm Hg. Art. te montre yon detire seksyon tisi yo pa 25% (Fig. 2b). Yo te montre pousantaj detire sa a koresponn ak yon longè sarkomè fizyolojik 2.2–2.3 µm pou kontraktilite seksyon kadyak nòmal17,19,25. Yo te evalye mouvman tisi a lè l sèvi avèk paramèt kamera pèsonalize (Figi Siplemantè 1). Anplitid ak vitès mouvman tisi a (Fig. 2c, d) koresponn ak detire pandan sik kadyak la ak tan pandan sistole ak dyastole (Fig. 2b). Detire ak vitès tisi kadyak pandan kontraksyon ak relaksasyon te rete konstan pandan 12 jou nan kilti a (Fig. 2f). Pou evalye efè estimilasyon elektrik sou kontraktilite pandan kilti a, nou te devlope yon metòd pou detèmine defòmite aktif lè l sèvi avèk yon algorithm lonbraj (Fig. siplemantè 2a,b) epi nou te kapab distenge ant defòmite avèk ak san estimilasyon elektrik. Menm seksyon kè a (Fig. 2f). Nan rejyon mobil koupe a (R6-9), vòltaj la pandan estimilasyon elektrik la te 20% pi wo pase san estimilasyon elektrik, sa ki endike kontribisyon estimilasyon elektrik nan fonksyon kontraktil la.
Tras reprezantatif mezi presyon chanm lè, presyon chanm likid, ak mouvman tisi konfime ke presyon chanm chanje presyon chanm likid, sa ki lakòz yon mouvman korespondan nan tranch tisi a. b Tras reprezantatif pousantaj detire (ble) seksyon tisi ki koresponn ak pousantaj detire (zoranj). c Mouvman mezire nan tranch kadyak la konsistan avèk vitès mouvman mezire a. (d) Trajektwa reprezantatif mouvman siklik (liy ble) ak vitès (liy pwentiye zoranj) nan yon tranch kè a. e Kantifikasyon tan sik (n = 19 tranch pa gwoup, ki soti nan diferan kochon), tan kontraksyon (n = 19 tranch pa gwoup), tan relaksasyon (n = 19 tranch pa gwoup, ki soti nan diferan kochon), mouvman tisi (n = 25 ). tranch)/gwoup ki soti nan diferan kochon), vitès sistolik pik (n = 24(D0), 25(D12) tranch/gwoup ki soti nan diferan kochon) ak to relaksasyon pik (n=24(D0), 25(D12) tranch/gwoup ki soti nan diferan kochon). Tès t Student bilateral pa t montre okenn diferans siyifikatif nan okenn paramèt. Tras analiz reprezantatif souch nan seksyon tisi avèk (wouj) ak san (ble) estimilasyon elektrik, dis zòn rejyonal nan seksyon tisi ki soti nan menm seksyon an. Panno anba yo montre kantifikasyon diferans pousantaj nan souch nan seksyon tisi avèk ak san estimilasyon elektrik nan dis zòn ki soti nan diferan seksyon. (n = 8 tranch/gwoup ki soti nan diferan kochon, yo fè tès t Student bilateral; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 tranch/gwoup ki soti nan diferan kochon, yo fè tès t Student bilateral; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; *****p<0,1,00,<0,0,**p). (n = 8 seksyon/gwoup ki soti nan diferan kochon, tès t Student bilateral; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.01，*p < 0.0001， （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0.0001，**p < 0.01，*p < 0.01，*p < 0.0001， (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонний критерий Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *5). (n = 8 seksyon/gwoup, ki soti nan diferan kochon, tès t Student bilateral; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Ba erè yo reprezante mwayèn ± devyasyon estanda a.
Nan sistèm kilti tranch kè biomimetik estatik nou an [20, 21], nou te kenbe viabilité, fonksyon, ak entegrite estriktirèl tranch kè yo pandan 6 jou lè nou te aplike estimilasyon elektrik epi optimize konpozisyon medyòm nan. Sepandan, apre 10 jou, figi sa yo te bese rapidman. Nou pral refere a seksyon kiltive nan sistèm kilti biomimetik estatik 20, 21 kondisyon kontwòl (Ctrl) anvan nou an epi nou pral itilize medyòm nou te optimize anvan an kòm kondisyon MC ak kilti anba estimilasyon mekanik ak elektrik similtane (CTCM). yo rele . Premyèman, nou te detèmine ke estimilasyon mekanik san estimilasyon elektrik pa t ase pou kenbe viabilité tisi pandan 6 jou (Fig. siplemantè 3a,b). Sa ki enteresan, avèk entwodiksyon estimilasyon fizyo-mekanik ak elektrik lè l sèvi avèk STCM, viabilité seksyon kè 12 jou yo te rete menm jan ak nan seksyon kè fre anba kondisyon MS, men pa anba kondisyon Ctrl, jan analiz MTT montre (Fig. 1). 3a). Sa sijere ke estimilasyon mekanik ak simulation sik kadyak la ka kenbe seksyon tisi yo viab pou de fwa pi lontan pase sa yo rapòte nan sistèm kilti estatik anvan nou an. Sepandan, evalyasyon entegrite estriktirèl seksyon tisi yo pa imunomarkaj troponin T kadyak ak koneksin 43 te montre ke ekspresyon koneksin 43 te siyifikativman pi wo nan tisi MC nan jou 12 pase nan kontwòl yo nan menm jou a. Sepandan, ekspresyon inifòm koneksin 43 ak fòmasyon disk Z pa te konplètman konsève (Fig. 3b). Nou itilize yon kad entèlijans atifisyèl (IA) pou mezire entegrite estriktirèl tisi26, yon tiyo aprantisaj pwofon ki baze sou imaj ki baze sou koloran troponin-T ak koneksin43 pou otomatikman mezire entegrite estriktirèl ak fliyoresans tranch kè yo an tèm de fòs lokalizasyon. Metòd sa a itilize yon Rezo Neyron Konvolisyonèl (CNN) ak yon kad aprantisaj pwofon pou mezire entegrite estriktirèl tisi kadyak la yon fason otomatize ak san patipri, jan sa dekri nan referans lan.26. Tisi MC te montre yon amelyorasyon nan resanblans estriktirèl ak jou 0 konpare ak seksyon kontwòl estatik yo. Anplis de sa, koloran trichrome Masson an te revele yon pousantaj fibwoz siyifikativman pi ba anba kondisyon MS konpare ak kondisyon kontwòl yo nan jou 12 kilti a (Fig. 3c). Malgre ke CTCM te ogmante viabilite seksyon tisi kè yo nan 12yèm jou a nan yon nivo menm jan ak tisi kè fre, li pa t amelyore entegrite estriktirèl seksyon kè yo yon fason siyifikatif.
Yon graf ba montre kantifikasyon viabilite MTT tranch kè fre (D0) oubyen kilti tranch kè pandan 12 jou swa nan kilti estatik (D12 Ctrl) oubyen nan CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) tranch/gwoup ki soti nan diferan kochon, yo fè yon sèl tès ANOVA; ####p < 0.0001 konpare ak D0 ak **p < 0.01 konpare ak D12 Ctrl). Yon graf ba montre kantifikasyon viabilite MTT tranch kè fre (D0) oubyen kilti tranch kè pandan 12 jou swa nan kilti estatik (D12 Ctrl) oubyen nan CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) tranch/gwoup ki soti nan diferan kochon, yo fè yon sèl tès ANOVA; ####p < 0.0001 konpare ak D0 ak **p < 0.01 konpare ak D12 Ctrl).Istogram nan montre kantifikasyon viabilite seksyon kè fre MTT (D0) oubyen kilti seksyon kè pandan 12 jou swa nan kilti estatik (kontwòl D12) oubyen CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontwòl D12). ) , 12 (D12 MC) seksyon/gwoup ki soti nan diferan kochon, yo fè yon tès ANOVA yon sèl chemen;####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 konpare ak D0 ak **p < 0.01 konpare ak D12 Ctrl). yon 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片(D0)或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组衑化)测试；与D0 相比，####p <0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p <0.01)。 yon 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切)片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p <， 0.000012 C相比，**p。)istogram ki montre kantifikasyon viyabilite MTT nan seksyon kè fre (D0) oubyen seksyon kè kiltive pandan 12 jou nan kilti estatik (kontwòl D12) oubyen CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (kontwòl D12)), 12 (D12 MC) seksyon/gwoup ki soti nan diferan kochon, tès ANOVA yon sèl chemen;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0.0001 konpare ak D0, **p < 0.01 konpare ak D12 Ctrl).b Troponin-T (vèt), koneksin 43 (wouj) ak DAPI (ble) nan seksyon kè ki fèk izole (D0) oswa seksyon kè ki kiltive anba kondisyon estatik (Ctrl) oswa kondisyon CTCM (MC) pandan 12 jou) nan imaj imunofluoresans reprezantatif (echèl vid = 100 µm). Kantifikasyon entegrite estriktirèl tisi kè a pa entèlijans atifisyèl (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranch/gwoup chak soti nan diferan kochon, tès ANOVA yon sèl chemen fèt; ####p < 0.0001 konpare ak D0 ak ****p < 0.0001 konpare ak D12 Ctrl). Kantifikasyon entegrite estriktirèl tisi kè a pa entèlijans atifisyèl (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranch/gwoup chak soti nan diferan kochon, tès ANOVA yon sèl chemen fèt; ####p < 0.0001 konpare ak D0 ak ****p < 0.0001 konpare ak D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (D02), 577 (D1), C = 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA ####p < 0,0001 проводится однофакторный тест ANOVA; 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Kantifikasyon entegrite estriktirèl tisi kadyak la pa entèlijans atifisyèl (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seksyon/gwoup ki soti nan diferan kochon, tès ANOVA yon sèl chemen ki fèt; ####p < 0.0001 vs. ak D0 ak ****p < 0.0001 konpare ak D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranch/gwoup chak nan diferan kochon, yon sèl-fason ANOVA tès <1 0 人#0##0p0 ;相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) tranch/gwoup chak nan diferan kochon, yon sèl-fason ANOVA tès <0###0p0;与D0相比，****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткан (D12), =77н (D12), (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001 vs. сравнению с D12 Ctrl). Entèlijans atifisyèl pou mezire entegrite estriktirèl tisi kadyak la (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) seksyon/gwoup chak kochon diferan, tès ANOVA yon sèl chemen; ####p<0.0001 vs .D0 Pou konparezon ****p < 0.0001 konpare ak D12 Ctrl). c Imaj reprezantatif (agoch) ak kantifikasyon (adwat) pou tranch kè ki kolore ak koloran trichrome Masson (Echèl toutouni = 500 µm) (n = 10 tranch/gwoup chak soti nan diferan kochon, yo fè tès ANOVA yon sèl chemen; ####p < 0.0001 konpare ak D0 ak ***p < 0.001 konpare ak D12 Ctrl). c Imaj reprezantatif (agoch) ak kantifikasyon (adwat) pou tranch kè ki kolore ak koloran trichrome Masson (Echèl toutouni = 500 µm) (n = 10 tranch/gwoup chak ki soti nan kochon diferan, yo fè tès ANOVA yon sèl chemen; #### p < 0.0001 konpare ak D0 ak ***p < 0.001 konpare ak D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, онкраш трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разнынх разни выполняется односторонний тест ANOVA #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по; сравнению с D12 Ctrl). c Imaj reprezantatif (agoch) ak kantifikasyon (adwat) seksyon kè ki te kolore ak koloran trichrome Masson (echèl san kouch = 500 µm) (n = 10 seksyon/gwoup ki soti nan diferan kochon, tès ANOVA yon sèl chemen ki te fèt; #### p < 0.0001 konpare ak D0 ak ***p < 0.001 konpare ak D12 Ctrl). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸將的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺（裸尺（10µ=（裸尺）个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 相比 ，D0***比 ，D1 比 ，D1相比）。 C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 尺度 尺度裸尺度 = 500 µm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 吕向 向 向### 君###nova 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, онкраш трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от другой другой протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Imaj reprezantatif (agoch) ak kantifikasyon (adwat) seksyon kè ki te kolore ak koloran trichrome Masson an (vid = 500 µm) (n = 10 seksyon/gwoup, chak soti nan yon kochon diferan, teste pa analiz varyans yon sèl chemen ;### # p < 0.0001 konpare ak D0, ***p < 0.001 konpare ak D12 Ctrl).Ba erè yo reprezante mwayèn ± devyasyon estanda a.
Nou te fè ipotèz ke lè nou ajoute ti molekil nan mwayen kilti a, nou te ka amelyore entegrite kadyomyosit yo epi redwi devlopman fibwoz pandan kilti CTCM. Se poutèt sa, nou te fè tès depistaj pou ti molekil lè nou te itilize kilti kontwòl estatik nou yo20,21 akòz ti kantite faktè konfizyon yo. Deksametazon (Dex), triyodotironin (T3), ak SB431542 (SB) te chwazi pou tès depistaj sa a. Ti molekil sa yo te deja itilize nan kilti hiPSC-CM pou pwovoke matirasyon kadyomyosit yo lè yo ogmante longè sarkomè, tib T, ak vitès kondiksyon. Anplis de sa, ni Dex (yon glikokortikoyid) ni SB yo konnen pou siprime enflamasyon29,30. Se poutèt sa, nou te teste si enklizyon youn oswa yon konbinezon ti molekil sa yo ta amelyore entegrite estriktirèl seksyon kè yo. Pou tès depistaj inisyal la, nou te chwazi dòz chak konpoze a dapre konsantrasyon yo souvan itilize nan modèl kilti selilè yo (1 μM Dex27, 100 nM T327, ak 2.5 μM SB31). Apre 12 jou kilti, konbinezon T3 ak Dex la te bay yon entegrite estriktirèl kadyomyosit optimal ak yon remodèlaj fibrou minimòm (Figi Siplemantè 4 ak 5). Anplis de sa, itilizasyon doub oswa doub konsantrasyon T3 ak Dex sa yo te pwodui efè danjere konpare ak konsantrasyon nòmal yo (Figi Siplemantè 6a,b).
Apre premye tès depistaj la, nou te fè yon konparezon dirèk ant 4 kondisyon kilti (Figi 4a): Ctrl: seksyon kè kiltive nan kilti estatik nou te dekri deja a lè l sèvi avèk mwayen optimize nou an; 20.21 TD: T3 ak Ctrl s te ajoute Dex mèkredi; MC: seksyon kè kiltive nan CTCM lè l sèvi avèk mwayen optimize nou an deja; ak MT: CTCM ak T3 ak Dex ajoute nan mwayen an. Apre 12 jou kiltivasyon, viabilité tisi MS ak MT yo te rete menm jan ak nan tisi fre yo evalye pa tès MTT (Fig. 4b). Sa ki enteresan, adisyon T3 ak Dex nan kilti transwell (TD) yo pa t lakòz yon amelyorasyon siyifikatif nan viabilité konpare ak kondisyon Ctrl yo, sa ki endike yon wòl enpòtan nan estimilasyon mekanik nan mentni viabilité seksyon kè yo.
Yon dyagram konsepsyon eksperimantal ki montre kat kondisyon kilti yo itilize pou evalye efè estimilasyon mekanik ak sipleman T3/Dex sou yon mwayen pandan 12 jou. b Grafik ba a montre kantifikasyon viabilite 12 jou apre kilti a nan tout 4 kondisyon kilti yo (Ctrl, TD, MC, ak MT) konpare ak tranch kè fre (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ak D12 MT), 12 (D12 MC) tranch/gwoup ki soti nan diferan kochon, yo fè tès ANOVA yon sèl chemen; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 konpare ak D0 ak **p < 0.01 konpare ak D12 Ctrl). b Grafik ba a montre kantifikasyon viyabilite 12 jou apre kilti a nan tout 4 kondisyon kilti yo (Ctrl, TD, MC, ak MT) konpare ak tranch kè fre (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ak D12 MT), 12 (D12 MC) tranch/gwoup ki soti nan diferan kochon, yo fè tès ANOVA yon sèl chemen; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 konpare ak D0 ak **p < 0.01 konpare ak D12 ctrl). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней посленку кулрез всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами срезами серезами сероль (TD, MC и MT) (D1) (D1) (D1) (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b Grafik ba a montre kantifikasyon viyabilite 12 jou apre kilti a nan tout 4 kondisyon kilti yo (kontwòl, TD, MC, ak MT) konpare ak seksyon kè fre (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, ak D12 MT), 12 (D12 MC) seksyon/gwoup ki soti nan diferan kochon, tès ANOVA yon sèl chemen; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 vs. D0 ak **p < 0.01 konpare ak D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (CD12)、D12(D12)、 TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001，##01，0##01，相比，**p < 0.01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнения сравнения сравнения сравнения сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группа, одннос#тороднос и D12 MT <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Istogram ki montre tout 4 kondisyon kilti yo (kontwòl, TD, MC ak MT) konpare ak seksyon kè fre (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ak D12 MT), ki soti nan diferan kochon 12 (D12 MC) seksyon/gwoup, tès ANOVA yon sèl chemen; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. kontwòl D12). c Grafik ba a montre kantifikasyon koule glikoz 12 jou apre kilti a nan tout 4 kondisyon kilti yo (Ctrl, TD, MC, ak MT) konpare ak tranch kè fre (D0) (n = 6 tranch/gwoup ki soti nan diferan kochon, yo fè tès ANOVA yon sèl chemen; ###p < 0.001, konpare ak D0 ak ***p < 0.001 konpare ak D12 Ctrl). c Grafik ba a montre kantifikasyon koule glikoz 12 jou apre kilti a nan tout 4 kondisyon kilti yo (Ctrl, TD, MC, ak MT) konpare ak tranch kè fre (D0) (n = 6 tranch/gwoup ki soti nan diferan kochon, yo fè tès ANOVA yon sèl chemen; ###p < 0.001, konpare ak D0 ak ***p < 0.001 konpare ak D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после кульвта кульвозо потока 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца = (D0 гопсрения) от разных свиней, односторонний Выполняется тест ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). Istogram c a montre kantifikasyon koule glikoz 12 jou apre kilti a anba tout 4 kondisyon kilti yo (kontwòl, TD, MC ak MT) konpare ak seksyon kè fre (D0) (n = 6 seksyon/gwoup ki soti nan diferan kochon, tès ANOVA yon sèl chemen fèt; ###p < 0.001 konpare ak D0 ak ***p < 0.001 konpare ak D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 盌柯12）天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；###与P < 0.0.0.相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切縇片培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， ， ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней послади венную оценку всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердц (n = D60) срезов/группа, от разных свиней, односторонний Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Istogram ki montre kantifikasyon flux glikoz 12 jou apre kilti a pou tout 4 kondisyon kilti yo (kontwòl, TD, MC, ak MT) konpare ak seksyon kè fre (D0) (n = 6 seksyon/gwoup, ki soti nan diferan kochon, inilateral. Ki kote tès ANOVA yo te fèt, ###p < 0.001 konpare ak D0, ***p < 0.001 konpare ak D12 (kontwòl).d Graf analiz souch tisi fre (ble), tisi MC 12 jou a (vèt), ak tisi MT 12 jou a (wouj) nan dis pwen seksyon tisi rejyonal (n = 4 tranch/gwoup, tès ANOVA yon sèl chemen; pa te gen okenn diferans siyifikatif ant gwoup yo). e Graf vòlkan ki montre jèn ki eksprime yon fason diferan nan seksyon kè fre (D0) konpare ak seksyon kè ki kiltive anba kondisyon estatik (Ctrl) oswa anba kondisyon MT (MT) pandan 10-12 jou. f Kat chalè jèn sarkomè pou seksyon kè ki kiltive anba chak kondisyon kilti yo. Ba erè yo reprezante mwayèn ± devyasyon estanda a.
Depandans metabolik sou chanjman soti nan oksidasyon asid gra pou ale nan glikoliz se yon mak distenktif nan dediferansyasyon kadyomyosit. Kadyomyosit ki poko matirite yo itilize prensipalman glikoz pou pwodiksyon ATP epi yo gen mitokondri ipoplastik ak kèk krista5,32. Analiz itilizasyon glikoz yo te montre ke anba kondisyon MC ak MT, itilizasyon glikoz la te sanble ak sa ki te nan tisi jou 0 yo (Figi 4c). Sepandan, echantiyon Ctrl yo te montre yon ogmantasyon siyifikatif nan itilizasyon glikoz konpare ak tisi fre. Sa endike ke konbinezon CTCM ak T3/Dex amelyore viabilité tisi yo epi prezève fenotip metabolik seksyon kè ki te kiltive pandan 12 jou yo. Anplis de sa, analiz souch la te montre ke nivo souch yo te rete menm jan ak nan tisi kè fre pandan 12 jou anba kondisyon MT ak MS (Fig. 4d).
Pou analize enpak jeneral CTCM ak T3/Dex sou peyizaj transkripsyon mondyal tisi tranch kadyak la, nou te fè RNAseq sou tranch kadyak ki soti nan kat kondisyon kilti diferan yo (Done Siplemantè 1). Sa ki enteresan, seksyon MT yo te montre yon gwo resanblans transkripsyonèl ak tisi kè fre a, ak sèlman 16 ki te eksprime diferansyèlman sou 13,642 jèn. Sepandan, jan nou te montre pi bonè, tranch Ctrl yo te montre 1229 jèn ki te eksprime diferansyèlman apre 10-12 jou nan kilti (Fig. 4e). Done sa yo te konfime pa qRT-PCR jèn kè ak fibroblas (Fig. Siplemantè 7a-c). Sa ki enteresan, seksyon Ctrl yo te montre yon diminisyon nan jèn kadyak ak sik selilè ak aktivasyon pwogram jèn enflamatwa. Done sa yo sijere ke dediferansyasyon, ki nòmalman rive apre kiltivasyon alontèm, konplètman atenye anba kondisyon MT (Fig. Siplemantè 8a,b). Yon etid apwofondi sou jèn sarkomè yo te montre ke se sèlman anba kondisyon MT ke jèn ki kode sarkomè a (Fig. 4f) ak kanal iyon an (Fig. Siplemantè 9) yo prezève, sa ki pwoteje yo kont sipresyon anba kondisyon Ctrl, TD, ak MC. Done sa yo demontre ke avèk yon konbinezon estimilasyon mekanik ak imoral (T3/Dex), transkriptòm tranch kè a ka rete menm jan ak tranch kè fre apre 12 jou nan kilti.
Rezilta transkripsyon sa yo apiye pa lefèt ke entegrite estriktirèl kadyomyosit yo nan seksyon kè yo pi byen konsève anba kondisyon MT pandan 12 jou, jan koneksin 43 entak ak lokalize a montre (Fig. 5a). Anplis de sa, fibwoz nan seksyon kè yo anba kondisyon MT te siyifikativman redwi konpare ak Ctrl e menm jan ak seksyon kè fre yo (Fig. 5b). Done sa yo demontre ke konbinezon estimilasyon mekanik ak tretman T3/Dex la efektivman prezève estrikti kadyak la nan seksyon kè yo an kilti.
Imaj imunofluoresans reprezantatif troponin-T (vèt), koneksin 43 (wouj), ak DAPI (ble) nan seksyon kè ki fèk izole (D0) oubyen kiltive pandan 12 jou nan tout kat kondisyon kilti seksyon kè yo (ba echèl = 100 µm). Kantifikasyon entegrite estriktirèl tisi kè a pa entèlijans atifisyèl (n = 7 (D0 ak D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ak D12 MT) tranch/gwoup ki soti nan diferan kochon, tès ANOVA yon sèl chemen an fèt; ####p < 0.0001 konpare ak D0 ak *p < 0.05, oubyen ****p < 0.0001 konpare ak D12 Ctrl). Kantifikasyon entegrite estriktirèl tisi kè a pa entèlijans atifisyèl (n = 7 (D0 ak D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ak D12 MT) tranch/gwoup ki soti nan diferan kochon, yo fè yon tès ANOVA yon sèl chemen; #### p < 0.0001 konpare ak D0 ak *p < 0.05, oubyen ****p < 0.0001 konpare ak D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного = 72 (D01) Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезов/группу от разных свиней, проведен однофакторный тест ANOVA <1 #,#0#0; сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Kantifikasyon entegrite estriktirèl tisi kè a lè l sèvi avèk entèlijans atifisyèl (n = 7 (D0 ak D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ak D12 MT) seksyon/gwoup ki soti nan diferan kochon, tès ANOVA yon sèl chemen ki fèt; #### p < 0.0001 konpare ak D0 ak *p < 0.05 oubyen ****p < 0.0001 konpare ak D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*p （ 0.0001 与D0 和*p （ 0.5*p （ 0. 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc （12 （mc）人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ########## p < 0.0001 与D0 和*p ， 我**** p < 0.05 或**** p < 0.05 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。Kantifikasyon entegrite estriktirèl tisi kadyak la lè l sèvi avèk entèlijans atifisyèl nan diferan kochon (n = 7 (D0 ak D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ak D12 MT) seksyon/gwoup) avèk yon tès ANOVA yon sèl chemen;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0.0001 konpare ak D0 ak *p < 0.05 oubyen ****p < 0.0001 konpare ak D12 Ctrl). b Imaj reprezantatif ak kantifikasyon pou tranch kè ki te kolore ak koloran trichrome Masson an (Ba echèl = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, ak D12 MC), 9 (D12 MT) tranch/gwoup ki soti nan diferan kochon, yo te fè tès ANOVA yon sèl chemen; ####p < 0.0001 konpare ak D0 ak ***p < 0.001, oubyen ****p < 0.0001 konpare ak D12 Ctrl). b Imaj reprezantatif ak kantifikasyon pou tranch kè ki te kolore ak koloran trichrome Masson an (Ba echèl = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, ak D12 MC), 9 (D12 MT) tranch/gwoup ki soti nan diferan kochon, yo te fè tès ANOVA yon sèl chemen; ####p < 0.0001 konpare ak D0 ak ***p < 0.001, oubyen ****p < 0.0001 konpare ak D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных трашенных трашенных траственная Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/групапу срезов/групапу, срезов/групапу выполняется односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p <; 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Imaj reprezantatif ak kantifikasyon seksyon kè ki te kolore ak koloran trichrome Masson an (ba echèl = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ak D12 MC), 9 (D12 MT) seksyon/gwoup ki soti nan diferan kochon, fè ANOVA yon sèl chemen; ####p < 0.0001 vs. D0 ak ***p < 0.001 oubyen ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 µm）㼈D12010（D12010 Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单单同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单单同素方#单同猪的9<0#0.与D0 相比，***p <0.001，或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 µm = 500 µm 10 µm （ 10 µm d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.000p < 0.00 方差分析； <0.001，或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трашенных тросихная оценка срезов сердца (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных сразных свинедипы способ ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001; по сравнению с D12 Ctrl). b Imaj reprezantatif ak kantifikasyon seksyon kè ki te kolore ak trichrome Masson an (ba echèl = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ak D12 MC), 9 (D12 MT) seksyon ki soti nan diferan kochon/gwoup, yon metòd ANOVA; ####p < 0.0001 konpare ak D0, ***p < 0.001 oswa ****p < 0.0001 konpare ak D12 Ctrl).Ba erè yo reprezante mwayèn ± devyasyon estanda a.
Finalman, yo te evalye kapasite CTCM pou imite ipètwofi kadyak la lè yo te ogmante detire tisi kadyak la. Nan CTCM, presyon pik chanm lè a te ogmante soti nan 80 mmHg pou rive nan 80 mmHg. Art. (detire nòmal) jiska 140 mmHg Art. (Fig. 6a). Sa koresponn ak yon ogmantasyon 32% nan detire (Fig. 6b), ki te deja montre kòm pousantaj detire korespondan ki nesesè pou seksyon kè yo reyalize yon longè sarkomè menm jan ak sa yo wè nan ipètwofi. Detire ak vitès tisi kadyak pandan kontraksyon ak relaksasyon te rete konstan pandan sis jou kilti (Fig. 6c). Tisi kadyak ki soti nan kondisyon MT te sibi detire nòmal (MT (Nòmal)) oswa kondisyon surdetire (MT (OS)) pandan sis jou. Deja apre kat jou nan kilti, byomarkè ipètwofik NT-ProBNP la te siyifikativman ogmante nan medyòm nan anba kondisyon MT (OS) konpare ak kondisyon MT (nòmal) (Fig. 7a). Anplis de sa, apre sis jou kiltivasyon, gwosè selil nan MT (OS) (Fig. 7b) ogmante anpil konpare ak seksyon kè MT (nòmal). Anplis de sa, translokasyon nikleyè NFATC4 te ogmante anpil nan tisi ki twò detire (Fig. 7c). Rezilta sa yo montre devlopman pwogresif remodelasyon patolojik apre ipèdistansyon epi sipòte konsèp ke aparèy CTCM a ka itilize kòm yon platfòm pou etidye siyalizasyon ipètrofi kadyak pwovoke pa detire.
Tras reprezantatif mezi presyon chanm lè, presyon chanm likid, ak mouvman tisi konfime ke presyon chanm chanje presyon chanm likid, sa ki lakòz yon mouvman korespondan nan tranch tisi a. b Koub pousantaj detire ak vitès detire reprezantatif pou seksyon tisi ki nòmalman detire (zoranj) ak twò detire (ble). c Grafik ba ki montre tan sik la (n = 19 tranch pa gwoup, ki soti nan diferan kochon), tan kontraksyon (n = 18-19 tranch pa gwoup, ki soti nan diferan kochon), tan relaksasyon (n = 19 tranch pa gwoup, ki soti nan diferan kochon)), anplitid mouvman tisi a (n = 14 tranch/gwoup, ki soti nan diferan kochon), vitès sistolik pik (n = 14 tranch/gwoup, ki soti nan diferan kochon) ak vitès relaksasyon pik (n = 14 (D0), 15 (D6)) seksyon/gwoup) ki soti nan diferan kochon), tès t Student bilateral pa montre okenn diferans siyifikatif nan okenn paramèt, sa ki endike ke paramèt sa yo te rete konstan pandan 6 jou kilti ak survòltaj. Ba erè yo reprezante mwayèn ± devyasyon estanda a.
Yon kantifikasyon graf ba nan konsantrasyon NT-ProBNP nan medya kilti ki soti nan tranch kè kiltive anba kondisyon elongasyon nòmal MT (Norm) oswa elongasyon twòp (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ak D4 MTOS) tranch/gwoup ki soti nan diferan kochon, Yo fè yon ANOVA de-fason; **p < 0.01 konpare ak elongasyon nòmal). Yon kantifikasyon graf ba nan konsantrasyon NT-ProBNP nan medya kilti ki soti nan tranch kè kiltive anba kondisyon elongasyon nòmal MT (Norm) oswa elongasyon twòp (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ak D4 MTOS) tranch/gwoup ki soti nan diferan kochon, Yo fè yon ANOVA de-fason; **p < 0.01 konpare ak elongasyon nòmal).Istogram kantitatif konsantrasyon NT-ProBNP nan mwayen kilti ki soti nan tranch kè ki te kiltive anba kondisyon detire MT nòmal (nòm) oswa detire twòp (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ak D4).MTOS) tranch/gwoup ki soti nan diferan kochon, analiz varyans de faktè te fèt;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 konpare ak detire nòmal). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0.01） Kantifikasyon konsantrasyon NT-ProBNP nan tranch kè kiltive nan kondisyon MT nòmal detire (Norm) oswa overstretch (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) soti nan diferan猪的切片/组，可以双向方方发发动 **konpare ak etann nòmal, p <0.01).Kantifikasyon istogram konsantrasyon NT-ProBNP nan tranch kè kiltive anba kondisyon detire MT nòmal (nòm) oswa detire twòp (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) ak D4 MTOS) tranch/gwoup ki soti nan diferan kochon, analiz varyans bidireksyonèl;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **p < 0.01 konpare ak detire nòmal). b Imaj reprezantatif pou tranch kè ki kolore ak troponin-T ak WGA (agoch) ak kantifikasyon gwosè selil (adwat) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) selil/gwoup ki soti nan 10 tranch diferan ki soti nan kochon diferan, yo fè tès t Student bilateral; ****p < 0.0001 konpare ak elongasyon nòmal). b Imaj reprezantatif pou tranch kè ki kolore ak troponin-T ak WGA (agoch) ak kantifikasyon gwosè selil (adwat) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) selil/gwoup ki soti nan 10 tranch diferan ki soti nan kochon diferan, Yo fè tès t Student bilateral; ****p < 0.0001 konpare ak elongasyon nòmal). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слестова) и АЗП (слестова) определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группу из 10 разных срезных срезных срезных срезных срезных срезных два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению; с нормальным растяжением). b Imaj reprezantatif seksyon kè ki te kolore avèk troponin-T ak AZP (agoch) ak kantifikasyon gwosè selil (adwat) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) selil/gwoup ki soti nan 10 seksyon diferan ki soti nan kochon diferan, yo te fè tès t Student bilateral; ****p < 0.0001 konpare ak souch nòmal la). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表倧左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性30（ MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾学生t检验；与正常拉伸相比，****p <0.0001）。 b Imaj reprezantatif tranch kè ki gen koulè kalkarein-T ak WGA (agoch) ak gwosè selil (adwat) (n = 330 (D6 MTOS), 369 ki soti nan 10 tranch diferan (D6 MTNorm)) Selil/mòso, tès t; konpare ak elongasyon nòmal, ****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слестова) ичнтативные оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разныей разныей Клетки/группа, двусторонние критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным; dezòd). b Imaj reprezantatif seksyon kè ki kolore avèk troponin-T ak AZP (agoch) ak kantifikasyon gwosè selil (adwat) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) ki soti nan 10 seksyon diferan ki soti nan kochon diferan) Selil/gwoup, kritè bilateral t Student; ****p < 0.0001 konpare ak souch nòmal). c Imaj reprezantatif pou jou 0 ak jou 6 tranch kè MTOS ki make ak imunotipalite pou troponin-T ak NFATC4 ak kantifikasyon translokasyon NFATC4 nan nwayo CM yo (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) tranch/gwoup ki soti nan diferan kochon, yo fè tès t Student bilateral; *p < 0.05). c Imaj reprezantatif pou jou 0 ak jou 6 tranch kè MTOS ki make ak imunotiza pou troponin-T ak NFATC4 ak kantifikasyon translokasyon NFATC4 nan nwayo CM yo (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) tranch/gwoup ki soti nan diferan kochon, Yo te fè tès t Student bilateral; *p < 0.05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропон, инFA для трозентативные количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезоров/горнозных клеток свиней , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента *p < 0,05). c Imaj reprezantatif pou seksyon kè a 0 ak 6 jou MTOS, imunomake pou troponin-T ak NFATC4, ak kantifikasyon translokasyon NFATC4 nan nwayo selil kavènè yo (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) tranch/gwoup ki soti nan diferan kochon) te fè tès t Student bilateral; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化 （D06 = M4 (D0) 、（D06切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p <0.05)。 c Imaj reprezantatif kalcanin-T ak NFATC4 imunolabeling 第0天和第6天MTOS tranch kè, ak NFATC4 ki soti nan diferan NFATC4 易位至CM nwayo selil 的kantite化 (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS,)时间双尾学生et 电影；*p <0.05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тромповки тром поТТи количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезных/груственней t-критерий Стьюдента *p <0,05). c Imaj reprezantatif tranch kè MTOS nan jou 0 ak 6 pou imuno-makaj troponin-T ak NFATC4 ak kantifikasyon translokasyon NFATC4 nan nwayo CM ki soti nan diferan kochon (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) tranch/gwoup, kritè t bilateral Student; *p < 0.05).Ba erè yo reprezante mwayèn ± devyasyon estanda.
Rechèch kadyovaskilè translasyonèl mande modèl selilè ki repwodui anviwònman kadyak la avèk presizyon. Nan etid sa a, yo te devlope epi karakterize yon aparèy CTCM ki ka estimile seksyon ultra mens nan kè a. Sistèm CTCM a gen ladan l estimilasyon elektwomekanik senkronize fizyolojikman ak anrichisman likid T3 ak Dex. Lè seksyon kè kochon yo te ekspoze a faktè sa yo, viabilité yo, entegrite estriktirèl yo, aktivite metabolik yo, ak ekspresyon transkripsyonèl yo te rete menm jan ak nan tisi kè fre apre 12 jou kilti. Anplis de sa, twòp detireman tisi kadyak la ka lakòz ipètwofi kè a ki koze pa ipèekstansyon. An jeneral, rezilta sa yo sipòte wòl kritik kondisyon kilti fizyolojik yo nan kenbe yon fenotip kadyak nòmal epi bay yon platfòm pou tès depistaj dwòg.
Anpil faktè kontribye nan kreye yon anviwònman optimal pou fonksyònman ak siviv kadyomyosit yo. Faktè ki pi evidan nan sa yo gen rapò ak (1) entèraksyon entèselilè, (2) estimilasyon elektwomekanik, (3) faktè imoral, ak (4) substrats metabolik. Entèraksyon fizyolojik selil-a-selil mande pou rezo konplèks twa dimansyon ki gen plizyè kalite selil sipòte pa yon matris ekstraselilè. Entèraksyon selilè konplèks sa yo difisil pou rekonstwi in vitro pa ko-kilti kalite selil endividyèl yo, men yo ka fasil pou reyalize lè l sèvi avèk nati òganotipik seksyon kè yo.
Detireman mekanik ak estimilasyon elektrik kadyomyosit yo enpòtan pou kenbe fenotip kadyak la33,34,35. Pandan ke yo te lajman itilize estimilasyon mekanik pou kondisyone ak matirite hiPSC-CM, plizyè etid elegant te fèk eseye estimilasyon mekanik tranch kè an kilti lè l sèvi avèk chaj iniaksyal. Etid sa yo montre ke chaj mekanik iniaksyal 2D gen yon efè pozitif sou fenotip kè a pandan kilti a. Nan etid sa yo, yo te swa chaje seksyon kè a ak fòs tansyon izometrik17, chaj auxotonik lineyè18, oswa yo te rkree sik kadyak la lè l sèvi avèk fidbak transducteur fòs ak kondwi tansyon. Sepandan, metòd sa yo itilize detireman tisi iniaksyal san optimize anviwònman an, sa ki lakòz sipresyon anpil jèn kadyak oswa surekspresyon jèn ki asosye ak repons detireman anòmal. CTCM ki dekri isit la bay yon estimilis elektwomekanik 3D ki imite sik kadyak natirèl la an tèm de tan sik ak detireman fizyolojik (25% detireman, 40% sistole, 60% dyastole, ak 72 batman pa minit). Malgre ke estimilasyon mekanik twa dimansyon sa a poukont li pa sifi pou kenbe entegrite tisi yo, yon konbinezon estimilasyon imoral ak mekanik lè l sèvi avèk T3/Dex nesesè pou kenbe viabilité, fonksyon ak entegrite tisi yo yon fason ki apwopriye.
Faktè imoral yo jwe yon wòl enpòtan nan modilasyon fenotip kè adilt la. Sa te mete aksan sou li nan etid HiPS-CM kote yo te ajoute T3 ak Dex nan medya kilti pou akselere matirasyon selil yo. T3 ka enfliyanse transpò asid amine, sik ak kalsyòm atravè manbràn selilè yo36. Anplis de sa, T3 ankouraje ekspresyon MHC-α ak diminisyon MHC-β, sa ki ankouraje fòmasyon myofibril kontraksyon rapid nan kadyomyosit matirite konpare ak myofibril kontraksyon dousman nan CM fetal la. Defisyans T3 nan pasyan ipotiroidyen lakòz pèt bann myofibrilè ak yon rediksyon nan to devlopman ton37. Dex aji sou reseptè glikokortikoyid epi li te montre li ogmante kontraktilite myokad nan kè izole ki gen pèfizyon;38 yo panse amelyorasyon sa a gen rapò ak efè a sou antre kondwi pa depo kalsyòm (SOCE)39,40. Anplis de sa, Dex mare ak reseptè li yo, sa ki lakòz yon repons entraselulè laj ki siprime fonksyon iminitè ak enflamasyon30.
Rezilta nou yo endike ke estimilasyon mekanik fizik (MS) amelyore pèfòmans jeneral kilti a konpare ak Ctrl, men li pa t rive kenbe viabilité, entegrite estriktirèl, ak ekspresyon kadyak pandan 12 jou nan kilti. Konpare ak Ctrl, adisyon T3 ak Dex nan kilti CTCM (MT) yo amelyore viabilité epi li kenbe pwofil transkripsyon, entegrite estriktirèl, ak aktivite metabolik menm jan ak tisi kè fre pandan 12 jou. Anplis de sa, lè yo kontwole degre detire tisi a, yo te kreye yon modèl ipètwofi kadyak pwovoke pa ipèekstansyon lè l sèvi avèk STCM, ki ilistre adaptabilite sistèm STCM lan. Li ta dwe note ke byenke remodelasyon kadyak ak fibwoz anjeneral enplike ògàn entak ke selil sikile yo ka bay sitokin ki apwopriye yo ansanm ak fagositoz ak lòt faktè remodelasyon, seksyon nan kè a ka toujou imite pwosesis fibwoz la an repons a estrès ak chòk nan myofibroblas. Sa a te deja evalye nan modèl tranch kadyak sa a. Li ta dwe note ke paramèt CTCM yo ka module lè yo chanje presyon/anplitid elektrik ak frekans pou simile anpil kondisyon tankou takikardi, bradikardi, ak sipò sikilatwa mekanik (kè mekanikman dechaje). Sa fè sistèm nan yon mwayen pou teste dwòg. Kapasite CTCM pou modle ipètwofi kadyak ki pwovoke pa twòp efò louvri wout la pou teste sistèm sa a pou terapi pèsonalize. An konklizyon, etid sa a demontre ke detire mekanik ak estimilasyon imoral yo enpòtan pou kenbe kilti seksyon tisi kadyak yo.
Malgre done yo prezante isit la sijere ke CTCM se yon platfòm trè pwomèt pou modèl myokad entak, metòd kilti sa a gen kèk limitasyon. Prensipal limitasyon kilti CTCM a se ke li enpoze estrès mekanik dinamik kontinyèl sou tranch yo, sa ki anpeche kapasite pou kontwole aktivman kontraksyon tranch kadyak yo pandan chak sik. Anplis de sa, akòz ti gwosè seksyon kadyak yo (7 mm), kapasite pou evalye fonksyon sistolik deyò sistèm kilti yo lè l sèvi avèk detèktè fòs tradisyonèl yo limite. Nan maniskri aktyèl la, nou simonte limitasyon sa a pasyèlman lè nou evalye vòltaj optik kòm yon endikatè fonksyon kontraktil. Sepandan, limitasyon sa a ap mande plis travay epi yo ka adrese li nan lavni lè nou entwodui metòd pou siveyans optik fonksyon tranch kè yo nan kilti, tankou map optik lè l sèvi avèk lank sansib a kalsyòm ak vòltaj. Yon lòt limitasyon CTCM a se ke modèl k ap travay la pa manipile estrès fizyolojik (prechaj ak aprechaj). Nan CTCM, presyon te pwovoke nan direksyon opoze pou repwodui 25% detire fizyolojik nan dyastol (detire konplè) ak sistol (longè kontraksyon pandan estimilasyon elektrik) nan tisi ki trè gwo. Yo ta dwe retire limitasyon sa a nan pwochen konsepsyon CTCM yo lè yo mete yon presyon adekwa sou tisi kadyak la nan tou de bò yo epi lè yo aplike relasyon presyon-volim egzak ki fèt nan chanm kè a.
Remodelaj pwovoke pa detireman twòp ki rapòte nan maniskri sa a limite a imite siyal detireman ipètrofik yo. Kidonk, modèl sa a ka ede nan etid siyal ipètrofik pwovoke pa detireman san yo pa bezwen faktè imoral oswa newòn (ki pa egziste nan sistèm sa a). Plis etid nesesè pou ogmante miltiplikasyon CTCM, pa egzanp, ko-kiltire ak selil iminitè, faktè imoral plasma sikile, ak inèvasyon lè ko-kilti ak selil newòn pral amelyore posiblite modèl maladi ak CTCM.
Yo te itilize trèz kochon nan etid sa a. Yo te fè tout pwosedi sou bèt yo an akò avèk direktiv enstitisyonèl yo epi Komite Swen ak Itilizasyon Animal Enstitisyonèl Inivèsite Louisville la te apwouve yo. Yo te klampe vout aortik la epi yo te fè pèfizyon nan kè a avèk 1 L kadyopleji esteril (110 mM NaCl, 1.2 mM CaCl2, 16 mM KCl, 16 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3, 5 U/mL eparin, pH jiska 7.4); Kè yo te konsève nan yon solisyon kadyoplejik frèt tankou glas jiskaske yo te transpòte yo nan laboratwa a sou glas, ki anjeneral pran mwens pase 10 minit. Kè yo te konsève nan yon solisyon kadyoplejik frèt tankou glas jiskaske yo te transpòte yo nan laboratwa a sou glas, ki anjeneral pran mwens pase 10 minit. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом растворе до транспортировки в лабораторию на, лчдорию на, лчдировки занимает <10 мин. Kè yo te konsève nan yon solisyon kadyoplejik frèt tankou glas jiskaske yo te transpòte yo nan laboratwa a sou glas, ki anjeneral pran mwens pase 10 minit.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10分钟 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10. Kenbe kè yo sou glas (kadyopleji) jiskaske yo transpòte yo nan laboratwa a sou glas, anjeneral <10 min.
Aparèy CTCM a te devlope nan lojisyèl konsepsyon asisté pa òdinatè (DAO) SolidWorks. Chanm kilti yo, divizè yo ak chanm lè yo fèt ak plastik acrylic transparan CNC. Bag sipò 7mm dyamèt la fèt ak polietilèn dansite segondè (HDPE) nan sant la epi li gen yon rainur o-ring pou akomode o-ring silikon ki itilize pou sele medya ki anba a. Yon manbràn silica mens separe chanm kilti a ak plak separasyon an. Manbràn silikon an koupe lazè nan yon fèy silikon 0.02″ epesè epi li gen yon dite 35A. Joint silikon anba ak anwo yo koupe lazè nan yon fèy silikon 1/16″ epesè epi yo gen yon dite 50A. Vis asye pur 316L ak nwa zèl yo itilize pou fikse blòk la epi kreye yon sele ki byen fèmen.
Yo fè yon sikwi enprime (PCB) dedye pou entegre ak sistèm C-PACE-EM lan. Yo konekte priz konektè machin swis yo sou PCB a ak elektwòd grafit yo pa fil kwiv plake ajan ak vis bwonz 0-60 ki vise nan elektwòd yo. Yo mete sikwi enprime a nan kouvèti enprimant 3D a.
Aparèy CTCM a kontwole pa yon aktuateur pneumatik pwogramab (PPD) ki kreye yon presyon sikilatwa kontwole menm jan ak yon sik kadyak. Pandan presyon ki andedan chanm lè a ap ogmante, manbràn silikon fleksib la ap elaji anlè, sa ki fòse medyòm nan anba sit tisi a. Zòn tisi a pral lonje pa ekspilsyon likid sa a, pou imite ekspansyon fizyolojik kè a pandan dyastol la. Nan pik relaksasyon an, yo te aplike yon estimilasyon elektrik atravè elektwòd grafit, sa ki te diminye presyon ki nan chanm lè a epi ki te lakòz kontraksyon seksyon tisi yo. Anndan tiyo a gen yon valv emostatik ak yon detèktè presyon pou detekte presyon ki nan sistèm lè a. Presyon detèktè presyon an detekte a aplike nan yon kolektè done ki konekte ak laptop la. Sa pèmèt siveyans kontinyèl presyon ki andedan chanm gaz la. Lè presyon maksimòm chanm lan te rive (estanda 80 mmHg, 140 mmHg OS), yo te bay aparèy akizisyon done a lòd pou voye yon siyal bay sistèm C-PACE-EM lan pou jenere yon siyal vòltaj bifazik pandan 2 ms, mete sou 4 V.
Yo te jwenn seksyon kè yo epi yo te fè kondisyon kilti nan 6 pi yo jan sa a: Transfere kè yo te kolekte yo soti nan veso transfè a nan yon plato ki gen kadyopleji frèt (4°C). Yo te izole vantrikil gòch la ak yon lam esteril epi yo te koupe l an moso 1-2 cm3. Yo te tache blòk tisi sa yo ak sipò tisi ak adezif tisi epi yo te mete yo nan yon beny tisi mikwotòm ki vibre ki gen solisyon Tyrode epi ki oksijene kontinyèlman (3 g/L 2,3-butanedyon monooksim (BDM), 140 mM NaCl (8.18 g) . ), 6 mM KCl (0.447 g), 10 mM D-glikoz (1.86 g), 10 mM HEPES (2.38 g), 1 mM MgCl2 (1 ml solisyon 1 M), 1.8 mM CaCl2 (1.8 ml solisyon 1 M), jiska 1 L ddH2O). Mikwotòm ki vibre a te konfigire pou koupe tranch 300 µm epesè nan yon frekans 80 Hz, yon anplitid vibrasyon orizontal 2 mm, ak yon vitès avansman 0.03 mm/s. Beny tisi a te antoure ak glas pou kenbe solisyon an fre epi tanperati a te kenbe nan 4°C. Transfere seksyon tisi yo soti nan beny mikwotòm nan nan yon beny enkubasyon ki gen solisyon Tyrode oksijene kontinyèlman sou glas jiskaske yo jwenn ase seksyon pou yon plak kilti. Pou kilti transwell, seksyon tisi yo te tache ak sipò an poliyiretàn esteril 6 mm lajè epi yo te mete yo nan 6 ml medyòm optimize (medyòm 199, 1x sipleman ITS, 10% FBS, 5 ng/ml VEGF, 10 ng/ml FGF-alkalin ak 2X antibyotik-antifonjik). Yo te aplike estimilasyon elektrik (10 V, frekans 1.2 Hz) sou seksyon tisi yo atravè C-Pace la. Pou kondisyon TD, yo te ajoute T3 ak Dex fre nan 100 nM ak 1 μM nan chak chanjman medyòm. Yo satire milye a ak oksijèn anvan yo ranplase li 3 fwa pa jou. Yo te kiltive seksyon tisi yo nan yon enkibatè a 37°C ak 5% CO2.
Pou kilti CTCM yo, yo te mete seksyon tisi yo sou yon enprimant 3D ki fèt espesyalman nan yon bwat Petri ki gen solisyon Tyrode modifye. Aparèy la fèt pou ogmante gwosè tranch kè a pa 25% nan sifas bag sipò a. Sa fèt pou seksyon kè yo pa detire apre yo fin transfere yo soti nan solisyon Tyrode a nan medyòm nan epi pandan dyastol la. Lè l sèvi avèk lakòl istoakrilik, yo te fikse seksyon 300 µm epesè sou yon bag sipò 7 mm an dyamèt. Apre yo fin tache seksyon tisi yo nan bag sipò a, koupe seksyon tisi anplis yo epi mete seksyon tisi ki tache yo tounen nan beny solisyon Tyrode sou glas (4°C) jiskaske yo prepare ase seksyon pou yon aparèy. Tan total pwosesis pou tout aparèy yo pa ta dwe depase 2 èdtan. Apre yo fin tache 6 seksyon tisi nan bag sipò yo, yo te rasanble aparèy CTCM la. Chanm kilti CTCM lan deja ranpli ak 21 ml medyòm pre-oksijene. Transfere seksyon tisi yo nan chanm kilti a epi retire ak anpil atansyon nenpòt bul lè ak yon pipèt. Apre sa, yo gide seksyon tisi a nan twou a epi yo peze l dousman pou l mete l nan plas li. Finalman, mete bouchon elektwòd la sou aparèy la epi transfere aparèy la nan enkibatè a. Apre sa, konekte CTCM a ak tib lè a ak sistèm C-PACE-EM lan. Aktuatè pneumatik la ouvri epi valv lè a ouvri CTCM a. Sistèm C-PACE-EM lan te configuré pou bay 4 V a 1.2 Hz pandan stimulasyon bifazik pou 2 ms. Yo te chanje medyòm nan de fwa pa jou epi yo te chanje elektwòd yo yon fwa pa jou pou evite akimilasyon grafit sou elektwòd yo. Si sa nesesè, yo ka retire seksyon tisi yo nan pi kilti yo pou chase nenpòt bul lè ki ta ka tonbe anba yo. Pou kondisyon tretman MT, yo te ajoute T3/Dex fre ak chak chanjman medyòm ak 100 nM T3 ak 1 μM Dex. Aparèy CTCM yo te kiltive nan yon enkibatè a 37°C ak 5% CO2.
Pou jwenn trajektwa tranch kè yo ki lonje, yo te devlope yon sistèm kamera espesyal. Yo te itilize yon kamera SLR (Canon Rebel T7i, Canon, Tokyo, Japon) avèk yon lantiy makro Navitar Zoom 7000 18-108mm (Navitar, San Francisco, CA). Yo te fè vizyalizasyon an nan tanperati chanm apre yo te fin ranplase mwayen an ak yon mwayen fre. Yo pozisyone kamera a nan yon ang 51° epi yo anrejistre videyo a 30 imaj pa segonn. Premyèman, yo te itilize lojisyèl sous ouvè (MUSCLEMOTION43) avèk Image-J pou mezire mouvman tranch kè yo. Yo te kreye mask la lè l sèvi avèk MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) pou defini rejyon enterè pou tranch kè ki bat pou evite bri. Yo aplike mask segmante manyèlman sou tout imaj nan yon sekans imaj epi answit yo pase yo nan plug-in MUSCLEMOTION an. Muscle Motion itilize entansite mwayèn pixel yo nan chak imaj pou mezire mouvman li an relasyon ak imaj referans lan. Yo te anrejistre done yo, filtre yo epi itilize yo pou mezire tan sik la epi evalye elongasyon tisi pandan sik kadyak la. Videyo anrejistre a te trete apre lè l sèvi avèk yon filtè dijital premye lòd faz zewo. Pou mezire elongasyon tisi a (pik a pik), yo te fè yon analiz pik a pik pou distenge ant pik ak kre nan siyal anrejistre a. Anplis de sa, yo te retire tandans lan lè l sèvi avèk yon polinòm 6yèm lòd pou elimine derive siyal la. Yo te devlope kòd pwogram nan MATLAB pou detèmine mouvman tisi global la, tan sik la, tan relaksasyon an, ak tan kontraksyon an (Kòd Pwogram Siplemantè 44).
Pou analiz deformation, lè l sèvi avèk menm videyo yo te kreye pou evalyasyon detire mekanik, nou te premye trase de imaj ki reprezante pik mouvman (pwen mouvman ki pi wo (anwo) ak ki pi ba (anba)) dapre lojisyèl MUSCLEMOTION an. Apre sa, nou te segmante rejyon tisi yo epi nou te aplike yon fòm algorithm lonbraj sou tisi segmante a (Fig. Siplemantè 2a). Tisi segmante a te divize an dis sou-sifas, epi nou te kalkile estrès sou chak sifas lè l sèvi avèk ekwasyon sa a: Deformation = (Sup-Sdown)/Sdown, kote Sup ak Sdown se distans fòm nan soti nan lonbraj anwo ak anba twal la, respektivman (Fig. Siplemantè .2b).
Seksyon kè yo te fikse nan 4% paraformaldeyid pandan 48 èdtan. Tisi fiks yo te dezidrate nan 10% ak 20% sikwoz pandan 1 èdtan, answit nan 30% sikwoz pandan lannwit lan. Apre sa, seksyon yo te enkli nan konpoze tanperati koupe optimal (konpoze OCT) epi piti piti konjele nan yon beny izopentan/glas sèk. Sere blòk enklizyon OCT yo a -80 °C jiskaske yo separe. Lam yo te prepare kòm seksyon ki gen yon epesè 8 μm.
Pou retire OCT nan seksyon kè yo, chofe lam yo sou yon blòk chofaj a 95 °C pandan 5 minit. Ajoute 1 ml PBS nan chak lam epi enkube pandan 30 minit nan tanperati chanm, answit penetre seksyon yo lè w mete 0.1% Triton-X nan PBS pandan 15 minit nan tanperati chanm. Pou anpeche antikò ki pa espesifik mare ak echantiyon an, ajoute 1 ml solisyon 3% BSA nan lam yo epi enkube pandan 1 èdtan nan tanperati chanm. Apre sa, yo te retire BSA a epi yo te lave lam yo ak PBS. Make chak echantiyon ak yon kreyon. Yo te ajoute antikò prensipal yo (dilye 1:200 nan 1% BSA) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) ak troponin-T (Thermo Scientific; #MA5-12960) pandan 90 minit, answit antikò segondè yo (dilye 1:200 nan 1% BSA) kont Alexa Fluor 488 sourit (Thermo Scientific; #A16079), kont Alexa Fluor 594 lapen (Thermo Scientific; #T6391) pandan 90 minit anplis. Yo te lave 3 fwa ak PBS. Pou distenge koloran sib la ak background nan, nou te itilize sèlman antikò segondè a kòm yon kontwòl. Finalman, yo te ajoute koloran nikleyè DAPI epi yo te mete lam yo nan yon vectashield (Vector Laboratories) epi yo te sele yo ak vèni zong. (agrandisman -x) ak yon mikwoskòp Keyence ak yon agrandisman 40x.
Yo te itilize WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) a 5 μg/ml nan PBS pou koloran WGA epi yo te aplike li sou seksyon fiks yo pandan 30 minit nan tanperati chanm. Apre sa, yo te lave lam yo ak PBS epi yo te ajoute Sudan black nan chak lam epi yo te enkube yo pandan 30 minit. Apre sa, yo te lave lam yo ak PBS epi yo te ajoute medyòm enklizyon vectashield la. Yo te vizyalize lam yo sou yon mikwoskòp Keyence ak yon agrandisman 40x.
Yo te retire OCT a nan echantiyon yo jan sa dekri pi wo a. Apre yo fin retire OCT a, plonje lam yo nan solisyon Bouin nan pandan tout lannwit lan. Apre sa, yo te rense lam yo ak dlo distile pandan 1 èdtan epi yo te mete yo nan yon solisyon Bibrich ak asid aloès fuchsin pandan 10 minit. Apre sa, yo te lave lam yo ak dlo distile epi yo te mete yo nan yon solisyon 5% fosfomolybdenum/5% asid fosfotungstik pandan 10 minit. San rense yo, transfere lam yo dirèkteman nan solisyon ble anilin lan pandan 15 minit. Apre sa, yo te lave lam yo ak dlo distile epi yo te mete yo nan yon solisyon asid asetik 1% pandan 2 minit. Yo te seche lam yo nan etanòl 200 N epi yo te transfere yo nan ksilèn. Yo te vizyalize lam ki te kolore yo lè l sèvi avèk yon mikwoskòp Keyence ak yon objektif 10x. Yo te mezire pousantaj zòn fibwoz la lè l sèvi avèk lojisyèl Keyence Analyzer.
Tès Viabilite Selil CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), nimewo katalòg V13154, dapre pwotokòl manifakti a avèk kèk modifikasyon. An patikilye, yo te itilize yon pwenson chirijikal ki gen yon dyamèt 6 mm pou asire gwosè tisi inifòm pandan analiz MTT a. Tisi yo te plake endividyèlman nan pi yon plak 12 pi ki gen substrat MTT dapre pwotokòl manifakti a. Seksyon yo enkube a 37°C pandan 3 èdtan epi tisi vivan an metabolize substrat MTT a pou fòme yon konpoze formazan koulè mov. Ranplase solisyon MTT a ak 1 ml DMSO epi enkube a 37 °C pandan 15 minit pou ekstrè formazan koulè mov nan seksyon kè yo. Echantiyon yo te delye 1:10 nan DMSO nan plak 96 pi ki gen yon fon klè epi entansite koulè mov la te mezire a 570 nm lè l sèvi avèk yon lektè plak Cytation (BioTek). Lekti yo te nòmalize ak pwa chak tranch kè a.
Yo te ranplase medya tranch kè a ak yon medya ki gen 1 μCi/ml [5-3H]-glikoz (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) pou tès itilizasyon glikoz jan yo te dekri deja. Apre 4 èdtan enkubasyon, ajoute 100 µl medya nan yon tib mikwosantrifij ouvè ki gen 100 µl 0.2 N HCl. Apre sa, yo te mete tib la nan yon tib sintilasyon ki gen 500 μl dH2O pou evapore [3H]2O pandan 72 èdtan a 37°C. Apre sa, retire tib mikwosantrifij la nan tib sintilasyon an epi ajoute 10 ml likid sintilasyon. Yo te fè kontaj sintilasyon yo lè l sèvi avèk yon analizè sintilasyon likid Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). Apre sa, yo te kalkile itilizasyon glikoz la lè yo te pran an kont aktivite espesifik [5-3H]-glikoz, ekilib enkonplè ak background, dilisyon [5-3H]-an glikoz san make, ak efikasite kontè sintilasyon an. Done yo te normalize anrapò ak mas seksyon kè a.
Apre omojenizasyon tisi nan Trizol, ARN te izole nan seksyon kè yo lè l sèvi avèk Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 la dapre pwotokòl manifakti a. Preparasyon bibliyotèk RNAsec la, sekansaj la ak analiz done yo te fèt jan sa a:
Yo te itilize 1 μg ARN pou chak echantiyon kòm materyèl depa pou preparasyon bibliyotèk ARN lan. Yo te pwodui bibliyotèk sekans yo lè l sèvi avèk Twous Preparasyon Bibliyotèk ARN NEBNext UltraTM pou Illumina (NEB, USA) swivan rekòmandasyon manifakti a, epi yo te ajoute kòd endèks nan sekans atribi yo pou chak echantiyon. An brèf, yo te pirifye ARNm nan ARN total la lè l sèvi avèk pèl mayetik ki tache ak oligonikleotid poli-T. Yo te fè fragmantasyon an lè l sèvi avèk kasyon divalan nan tanperati ki wo nan NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). Yo te sentetize ADNc premye branch lan lè l sèvi avèk primè egzamè o aza ak transkriptaz envès M-MuLV (RNase H-). Apre sa, yo sentetize ADNc dezyèm branch lan lè l sèvi avèk ADN polimeraz I ak RNase H. Yo konvèti rès ki depase yo an bout mou pa aktivite ègzonukleaz/polimeraz. Apre adenilasyon bout 3′ fragman ADN lan, yo tache yon Adaptè NEBNext ak yon estrikti bouk an zepeng cheve sou li pou prepare l pou ibridasyon. Pou seleksyon fragman ADNc ki gen longè 150-200 bp pi pito. Yo te pirifye fragman bibliyotèk yo lè l sèvi avèk sistèm AMPure XP (Beckman Coulter, Beverly, USA). Apre sa, yo te itilize 3 μl USER Enzyme (NEB, USA) avèk ADNc chwazi selon gwosè a ki lye avèk yon adaptè pandan 15 minit a 37°C epi answit pandan 5 minit a 95°C anvan PCR. Yo te fè PCR a lè l sèvi avèk Phusion High-Fidelity DNA polymerase, primè PCR inivèsèl, ak primè Index (X). Finalman, yo te pirifye pwodwi PCR yo (sistèm AMPure XP) epi yo te evalye kalite bibliyotèk la sou yon sistèm Agilent Bioanalyzer 2100. Yo te sekansye bibliyotèk ADNc a lè l sèvi avèk yon sekansè Novaseq. Yo te konvèti fichye imaj kri ki soti nan Illumina an lekti kri lè l sèvi avèk CASAVA Base Calling. Done kri yo estoke nan fichye fòma FASTQ(fq) ki genyen sekans lekti ak kalite baz korespondan yo. Chwazi HISAT2 pou fè lekti sekans filtre yo matche ak jenòm referans Sscrofa11.1 la. An jeneral, HISAT2 sipòte jènòm tout gwosè, tankou jènòm ki pi gwo pase 4 milya baz, epi valè pa defo yo fikse pou pifò paramèt yo. Lekti épissage ki soti nan done RNA Seq yo ka aliyen avèk efikasite lè l sèvi avèk HISAT2, sistèm ki pi rapid ki disponib kounye a, avèk menm presizyon oswa pi bon pase nenpòt lòt metòd.
Abondans transkripsyon yo reflete dirèkteman nivo ekspresyon jèn yo. Nivo ekspresyon jèn yo evalye pa abondans transkripsyon yo (konte sekans) ki asosye avèk jenòm lan oswa ègzon yo. Kantite lekti yo pwopòsyonèl ak nivo ekspresyon jèn yo, longè jèn nan, ak pwofondè sekans lan. FPKM (fragman pou chak mil pè baz transkripsyon sekansye pou chak milyon pè baz) yo te kalkile epi valè P ekspresyon diferansyèl yo te detèmine lè l sèvi avèk pake DESeq2 la. Apre sa, nou te kalkile to fo dekouvèt (FDR) pou chak valè P lè l sèvi avèk metòd Benjamini-Hochberg9 ki baze sou fonksyon R entegre "p.adjust" la.
ARN ki te izole nan seksyon kè yo te konvèti an ADNc nan yon konsantrasyon 200 ng/μl lè l sèvi avèk melanj SuperScript IV Vilo Master ki soti nan Thermo (Thermo, nimewo katalòg 11756050). RT-PCR kantitatif la te fèt lè l sèvi avèk yon plak reyaksyon transparan Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384-well (Thermo, nimewo katalòg 4483319) ak yon adezif optik microamp (Thermo, nimewo katalòg 4311971). Melanj reyaksyon an te konpoze de 5 µl melanj Taqman Fast Advanced Master (Thermo, nimewo katalòg 4444557), 0.5 µl Taqman Primer ak 3.5 µl H2O melanje pou chak pi. Sik qPCR estanda yo te fèt epi valè CT yo te mezire lè l sèvi avèk yon enstriman PCR an tan reyèl Applied Biosystems Quantstudio 5 (modil 384-well; nimewo pwodwi A28135). Yo te achte primè Taqman yo nan Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1). Valè CT tout echantiyon yo te nòmalize parapò ak jèn jesyon GAPDH la.
Yo te evalye liberasyon NT-ProBNP nan medya a lè l sèvi avèk twous NT-ProBNP (kochon) (Nimewo Katalòg MBS2086979, MyBioSource) dapre pwotokòl manifakti a. An brèf, yo te ajoute 250 µl nan chak echantiyon ak estanda an doub nan chak pi. Touswit apre yo fin ajoute echantiyon an, ajoute 50 µl Reyajan Tès A nan chak pi. Souke plak la dousman epi sele l ak pwodui selan. Apre sa, yo te enkube grenn yo a 37°C pandan 1 èdtan. Apre sa, aspire solisyon an epi lave pi yo 4 fwa ak 350 µl solisyon lave 1X, enkube solisyon lave a pandan 1-2 minit chak fwa. Apre sa, ajoute 100 µl Reyajan Tès B pou chak pi epi sele l ak pwodui selan plak la. Yo te souke grenn nan dousman epi enkube l a 37°C pandan 30 minit. Aspire solisyon an epi lave pi yo 5 fwa ak 350 µl solisyon lave 1X. Ajoute 90 µl solisyon substrat nan chak pi epi sele plak la. Enkube plak la a 37°C pandan 10-20 minit. Ajoute 50 µl Solisyon Arè nan chak pi. Yo te mezire plak la imedyatman lè l sèvi avèk yon lektè plak Cytation (BioTek) ki mete a 450 nm.
Yo te fè analiz puisans pou chwazi gwosè gwoup ki pral bay plis pase 80% puisans pou detekte yon chanjman absoli 10% nan paramèt la ak yon to erè Tip I 5%. Yo te fè analiz puisans pou chwazi gwosè gwoup ki pral bay yon puisans >80% pou detekte yon chanjman absoli 10% nan paramèt la ak yon to erè Tip I 5%. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощносто беспечат 10% абсолютного изменения параметра с 5% частотой ошибок типа I. Yo te fè yon analiz puisans pou chwazi gwosè gwoup ki ta bay plis pase 80% puisans pou detekte 10% chanjman paramèt absoli ak yon to erè Tip I 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который обеспечил бы > 80% мощнлос обнаружения 10% абсолютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Yo te fè yon analiz puisans pou chwazi yon gwosè gwoup ki ta bay plis pase 80% puisans pou detekte 10% chanjman paramèt absoli ak 5% to erè tip I.Yo te chwazi seksyon tisi yo owaza anvan eksperyans lan. Tout analiz yo te fèt san yo pa kontwole kondisyon an epi yo te dekode echantiyon yo sèlman apre yo te fin analize tout done yo. Yo te itilize lojisyèl GraphPad Prism (San Diego, CA) pou fè tout analiz estatistik yo. Pou tout estatistik yo, valè p yo te konsidere kòm siyifikatif nan valè <0.05. Pou tout estatistik yo, valè p yo te konsidere kòm siyifikatif nan valè ki <0.05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Pou tout estatistik yo, valè p yo te konsidere kòm siyifikatif nan valè ki <0.05.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Pou tout estatistik yo, valè p yo te konsidere kòm siyifikatif nan valè ki <0.05.Yo te fè tès t Student bilateral sou done yo ak sèlman 2 konparezon. Yo te itilize ANOVA yon sèl chemen oswa de chemen pou detèmine siyifikasyon ant plizyè gwoup. Lè y ap fè tès post hoc, yo te aplike koreksyon Tukey a pou pran an kont plizyè konparezon. Done RNAsec yo gen konsiderasyon estatistik espesyal lè y ap kalkile FDR ak p.adjust jan sa dekri nan seksyon Metòd yo.
Pou plis enfòmasyon sou konsepsyon etid la, gade rezime Rapò Rechèch sou Lanati ki lye ak atik sa a.