Nature.com сайтад зочилсонд баярлалаа. Таны ашиглаж буй хөтчийн хувилбар нь хязгаарлагдмал CSS дэмжлэгтэй. Хамгийн сайн туршлагын тулд бид танд шинэчлэгдсэн хөтчийг ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer дээр нийцтэй байдлын горимыг идэвхгүй болгох). Энэ хооронд бид сайтыг хэв маяг болон JavaScriptгүйгээр үзүүлэх болно.
Эмийн шинжилгээнд зориулж зүрхний физиологийн орчныг үнэн зөв хуулбарлах найдвартай in vitro систем шаардлагатай байна. Хүний зүрхний эдийн өсгөврийн системийн хязгаарлагдмал хүртээмж нь зүрхний эмийн нөлөөг буруу тайлбарлахад хүргэсэн. Энд бид зүрхний мөчлөгийн систолын болон диастолын үе шатанд зүрхний зүсмэлүүдийг цахилгаан механикаар өдөөж, физиологийн суналтад ордог зүрхний эдийн өсгөврийн загварыг (CTCM) боловсруулсан. 12 хоногийн өсгөврийн дараа энэ арга нь зүрхний хэсгүүдийн амьдрах чадварыг хэсэгчлэн сайжруулсан боловч бүтцийн бүрэн бүтэн байдлыг бүрэн хадгалж чадаагүй. Тиймээс жижиг молекулын скрининг хийсний дараа бид 100 нМ триодотиронин (T3) болон 1 μM дексаметазон (Dex)-ийг бидний тэжээлт орчинд нэмэхэд хэсгүүдийн бичил бүтцийг 12 хоногийн турш хадгалж байгааг тогтоосон. T3/Dex эмчилгээтэй хослуулан CTCM систем нь транскрипцийн профайл, амьдрах чадвар, бодисын солилцооны идэвхжил, бүтцийн бүрэн бүтэн байдлыг 12 хоногийн турш шинэ зүрхний эдтэй ижил түвшинд хадгалсан. Үүнээс гадна, өсгөвөрт зүрхний эдийг хэт их сунгах нь зүрхний гипертрофик дохиоллыг өдөөж, зүрхний суналтаас үүдэлтэй гипертрофик нөхцлийг дуурайх CTCM-ийн чадварыг нотлох баримт болдог. Эцэст нь хэлэхэд, CTCM нь өсгөвөрт зүрхний физиологи, эмгэг жамыг удаан хугацааны турш загварчилж, эмийн найдвартай скрининг хийх боломжийг олгодог.
Эмнэлзүйн судалгаанаас өмнө хүний ​​зүрхний физиологийн орчныг үнэн зөв хуулбарлах чадвартай найдвартай in vitro системүүд шаардлагатай. Ийм системүүд өөрчлөгдсөн механик суналт, зүрхний цохилт, электрофизиологийн шинж чанарыг дуурайлган хийх ёстой. Амьтны загваруудыг зүрхний физиологийн скрининг платформ болгон түгээмэл ашигладаг бөгөөд хүний ​​зүрхэнд эмийн нөлөөг тусгахад найдвартай байдал хязгаарлагдмал байдаг1,2. Эцсийн эцэст, зүрхний эдийн өсгөврийн хамгийн тохиромжтой туршилтын загвар (CTCM) нь хүний ​​зүрхний физиологи, эмгэг жамыг үнэн зөв хуулбарладаг, янз бүрийн эмчилгээний болон фармакологийн оролцоонд өндөр мэдрэмжтэй, өвөрмөц загвар юм3. Ийм систем байхгүй байгаа нь зүрхний дутагдлын шинэ эмчилгээний нээлтийг хязгаарлаж байна4,5 бөгөөд эмийн зүрхний хордлого нь зах зээлээс гарах гол шалтгаан болсон6.
Сүүлийн арван жилийн хугацаанд зүрх судасны бус найман эмийг QT интервалыг уртасгаж, ховдлын хэм алдагдал, гэнэтийн үхэлд хүргэдэг тул эмнэлзүйн хэрэглээнээс хассан7. Тиймээс зүрх судасны үр нөлөө, хоруу чанарыг үнэлэх найдвартай клиникийн өмнөх скрининг стратегийн хэрэгцээ нэмэгдэж байна. Хүний өдөөгдсөн плюрипотент үүдэл эсээс гаралтай кардиомиоцит (hiPS-CM)-ийг эмийн скрининг болон хоруу чанарын шинжилгээнд саяхан ашиглаж байгаа нь энэ асуудлыг хэсэгчлэн шийдвэрлэх боломжийг олгож байна. Гэсэн хэдий ч hiPS-CM-ийн төлөвшөөгүй шинж чанар, зүрхний эдийн олон эсийн нарийн төвөгтэй байдал дутагдалтай байгаа нь энэ аргын гол хязгаарлалт юм. Сүүлийн үеийн судалгаагаар аяндаа агшилт эхэлснээс хойш удалгүй зүрхний эдийн гидрогелийг үүсгэхийн тулд эрт үеийн hiPS-CM-ийг ашиглан цахилгаан өдөөлтийг аажмаар нэмэгдүүлснээр энэхүү хязгаарлалтыг хэсэгчлэн даван туулж болохыг харуулсан. Гэсэн хэдий ч эдгээр hiPS-CM бичил эдүүд нь насанд хүрсэн миокардийн боловсорсон электрофизиологийн болон агшилтын шинж чанаргүй байдаг. Үүнээс гадна, хүний ​​зүрхний эд нь илүү нарийн төвөгтэй бүтэцтэй бөгөөд эндотел эс, мэдрэлийн эс, стромын фибробласт зэрэг янз бүрийн эсийн төрлүүдийн гетероген хольцоос бүрдэх бөгөөд эсийн гаднах матрицын уургуудын тодорхой багцаар холбогддог. Насанд хүрсэн хөхтөн амьтдын зүрхэнд зүрхний бус популяцийн11,12,13 энэхүү гетероген чанар нь бие даасан эсийн төрлийг ашиглан зүрхний эдийг загварчлахад гол саад болдог. Эдгээр гол хязгаарлалтууд нь физиологийн болон эмгэг судлалын нөхцөлд бүрэн бүтэн миокардийн эдийг өсгөвөрлөх аргуудыг боловсруулахын ач холбогдлыг онцолж байна.
Хүний зүрхний нимгэн (300 µм) хэсгүүдийг өсгөвөрлөсөн нь хүний ​​миокардийн бүрэн бүтэн байдлын ирээдүйтэй загвар болох нь батлагдсан. Энэ арга нь хүний ​​зүрхний эдтэй төстэй бүрэн 3 хэмжээст олон эсийн системд нэвтрэх боломжийг олгодог. Гэсэн хэдий ч 2019 он хүртэл өсгөвөрлөсөн зүрхний хэсгүүдийг ашиглах нь богино (24 цаг) өсгөврийн амьдрах хугацаанаас шалтгаалан хязгаарлагдмал байсан. Энэ нь физик-механик суналтын дутагдал, агаар-шингэний интерфейс, зүрхний эдийн хэрэгцээг дэмждэггүй энгийн орчин ашиглах зэрэг хэд хэдэн хүчин зүйлээс шалтгаалсан. 2019 онд хэд хэдэн судалгааны бүлгүүд зүрхний эдийн өсгөврийн системд механик хүчин зүйлсийг оруулах нь өсгөврийн ашиглалтын хугацааг уртасгаж, зүрхний илэрхийлэлийг сайжруулж, зүрхний эмгэгийг дуурайж чадна гэдгийг харуулсан. Хоёр дэгжин судалгаа 17 ба 18 нь нэг тэнхлэгтэй механик ачаалал нь өсгөврийн үед зүрхний фенотипт эерэг нөлөө үзүүлдэг болохыг харуулж байна. Гэсэн хэдий ч эдгээр судалгаанууд зүрхний хэсгүүдийг изометрийн суналтын хүч 17 эсвэл шугаман ауксотоник ачаалал 18-аар ачаалсан тул зүрхний мөчлөгийн динамик гурван хэмжээст физик-механик ачааллыг ашиглаагүй болно. Эд эсийг сунгах эдгээр аргууд нь олон зүрхний генийг дарангуйлах эсвэл хэвийн бус суналтын хариу урвалтай холбоотой генийн хэт их илэрхийлэлд хүргэсэн. Питулис нар 19 нь хүчний дамжуулагчийн хариу үйлдэл болон хурцадмал хөтчийг ашиглан зүрхний мөчлөгийг сэргээн босгох динамик зүрхний зүсмэлийн өсгөврийн банн боловсруулсан нь анхаарал татаж байна. Энэхүү систем нь in vitro зүрхний мөчлөгийн загварчлалыг илүү нарийвчлалтай хийх боломжийг олгодог боловч аргын нарийн төвөгтэй байдал, бага нэвтрүүлэх чадвар нь энэ системийн хэрэглээг хязгаарладаг. Манай лаборатори саяхан гахайн болон хүний ​​зүрхний эдийн хэсгүүдийн амьдрах чадварыг 6 хүртэл хоног хадгалахын тулд цахилгаан өдөөлт болон оновчтой орчин ашиглан хялбаршуулсан өсгөврийн системийг боловсруулсан20,21.
Одоогийн гар бичмэлд бид зүрхний мөчлөгийн үед гурван хэмжээст зүрхний физиологи болон эмгэг физиологийн тэлэлтийг давтан дүрслэхийн тулд гахайн зүрхний хэсгүүдийг ашиглан зүрхний эдийн өсгөврийн загварыг (CTCM) тайлбарлаж байна. Энэхүү CTCM нь эмнэлзүйн өмнөх эмийн шинжилгээнд зориулж хөхтөн амьтдын зүрхний физиологи/эмгэг судлалыг дуурайлган өртөг хэмнэлттэй, дунд зэргийн хүчин чадалтай зүрхний системийг бий болгосноор эмнэлзүйн өмнөх эмийн таамаглалын нарийвчлалыг өмнө нь хэзээ ч байгаагүй түвшинд хүртэл нэмэгдүүлэх боломжтой.
Гемодинамик механик дохио нь in vitro 22,23,24 нөхцөлд кардиомиоцитын үйл ажиллагааг хадгалахад чухал үүрэг гүйцэтгэдэг. Одоогийн гар бичмэлд бид насанд хүрэгчдийн зүрхний орчныг дуурайж, физиологийн давтамжтайгаар (1.2 Гц, минутанд 72 цохилт) цахилгаан болон механик өдөөлтийг өдөөж чаддаг CTCM (Зураг 1a) боловсруулсан. Диастолын үед эд эсийн хэт их сунахаас зайлсхийхийн тулд эдийн хэмжээг 25%-иар нэмэгдүүлэхийн тулд 3D хэвлэх төхөөрөмжийг ашигласан (Зураг 1b). C-PACE системээр өдөөгдсөн цахилгаан хэмнэлийг зүрхний мөчлөгийг бүрэн хуулбарлахын тулд өгөгдөл цуглуулах системийг ашиглан систолын өмнө 100 мс эхлэхээр цагласан. Эд эсийн өсгөврийн систем нь програмчлагдах хийн идэвхжүүлэгч (LB Engineering, Герман) ашиглан дээд камерт зүрхний зүсмэлүүдийг тэлэхийн тулд уян хатан силикон мембраныг мөчлөгөөр тэлдэг. Системийг даралтын дамжуулагчаар дамжуулан гадаад агаарын шугамд холбосон бөгөөд энэ нь даралтыг (± 1 мм м.у.б) болон хугацааг (± 1 мс) нарийн тохируулах боломжтой болгосон (Зураг 1c).
a Төхөөрөмжийн өсгөврийн камер дотор цэнхэр өнгөөр ​​харуулсан 7 мм-ийн тулгуур цагирагт эдийн хэсгийг бэхлэнэ. Өсгөврийн камер нь агаарын камераас нимгэн уян хатан силикон мембранаар тусгаарлагдсан. Алдагдал гарахаас сэргийлж камер бүрийн хооронд жийргэвч байрлуулна. Төхөөрөмжийн таг нь цахилгаан өдөөлтийг хангадаг бал чулуун электродуудыг агуулдаг. b Том эдийн төхөөрөмж, чиглүүлэгч цагираг болон тулгуур цагирагны схемийн дүрслэл. Эдийн хэсгүүдийг (бор) хэт том төхөөрөмж дээр байрлуулж, чиглүүлэгч цагиргийг төхөөрөмжийн гадна талын ирмэг дээрх ховилд байрлуулна. Хөтөчийг ашиглан эдийн нийлэг цавуугаар бүрсэн тулгуур цагиргийг зүрхний эдийн хэсэг дээр болгоомжтой байрлуулна. c Программчлагдах хийн хөдөлгүүр (PPD)-ээр хянагддаг агаарын камерын даралтын функц болгон цахилгаан өдөөлтийн хугацааг харуулсан график. Даралтын мэдрэгч ашиглан цахилгаан өдөөлтийг синхрончлохын тулд өгөгдөл цуглуулах төхөөрөмжийг ашигласан. Өсгөврийн камер дахь даралт тогтоосон босго хэмжээнд хүрэхэд цахилгаан өдөөлтийг идэвхжүүлэхийн тулд импульсийн дохиог C-PACE-EM руу илгээнэ. d Инкубаторын тавиур дээр байрлуулсан дөрвөн CTCM-ийн зураг. Дөрвөн төхөөрөмжийг нэг PPD-д хийн хэлхээгээр холбосон бөгөөд хийн хэлхээний даралтыг хянахын тулд даралт мэдрэгчийг цус тогтоох хавхлагад оруулсан. Төхөөрөмж бүр зургаан эдийн хэсэгтэй.
Ганц хийн хөдөлгүүр ашиглан бид 4 CTCM төхөөрөмжийг хянах боломжтой байсан бөгөөд эдгээр нь тус бүр нь 6 эдийн хэсгийг багтаах боломжтой байсан (Зураг 1d). CTCM-д агаарын камер дахь агаарын даралт нь шингэний камер дахь синхрон даралт болж хувирч, зүрхний зүсмэлийн физиологийн тэлэлтийг өдөөдөг (Зураг 2a болон Нэмэлт Кино 1). 80 мм м.у.б-д эдийн суналтыг үнэлэхэд эдийн хэсгүүд 25%-иар сунасан болохыг харуулсан (Зураг 2b). Энэ хувийн суналт нь зүрхний хэсгийн хэвийн агшилтын хувьд 2.2-2.3 мкм физиологийн саркомерын урттай тохирч байгааг харуулсан17,19,25. Эдийн хөдөлгөөнийг өөрчлөн тохируулсан камерын тохиргоог ашиглан үнэлсэн (Нэмэлт Зураг 1). Эдийн хөдөлгөөний далайц ба хурд (Зураг 2c, d) нь зүрхний мөчлөгийн үеийн суналт болон систол ба диастолын үеийн хугацаатай тохирч байсан (Зураг 2b). Агшилт ба сулралын үед зүрхний эдийн суналт ба хурд нь өсгөвөрт 12 хоногийн турш тогтмол хэвээр байв (Зураг 2f). Өсгөвөрлөх явцад агшилтад цахилгаан өдөөлтийн нөлөөг үнэлэхийн тулд бид сүүдэрлэх алгоритм ашиглан идэвхтэй деформацийг тодорхойлох аргыг боловсруулсан (Нэмэлт Зураг 2a,b) бөгөөд цахилгаан өдөөлттэй болон цахилгаан өдөөлтгүй деформацийг ялгаж чадсан. Зүрхний ижил хэсэг (Зураг 2f). Зүсэлтийн хөдлөх хэсэгт (R6-9) цахилгаан өдөөлтийн үед хүчдэл нь цахилгаан өдөөлт байхгүй үеийнхээс 20% -иар өндөр байсан нь цахилгаан өдөөлт нь агшилтын үйл ажиллагаанд хувь нэмэр оруулж байгааг харуулж байна.
Агаарын камерын даралт, шингэний камерын даралт, эдийн хөдөлгөөний хэмжилтийн төлөөллийн ул мөр нь камерын даралт нь шингэний камерын даралтыг өөрчилж, эдийн зүсмэлийн харгалзах хөдөлгөөнийг үүсгэдэг болохыг баталж байна. b Суналтын хувьтай (улбар шар) тохирч буй эдийн хэсгүүдийн суналтын хувь (цэнхэр)-ийн төлөөллийн ул мөр (цэнхэр). c Зүрхний зүсмэлийн хэмжсэн хөдөлгөөн нь хөдөлгөөний хэмжсэн хурдтай нийцдэг. (d) Зүрхний зүсмэл дэх мөчлөгийн хөдөлгөөн (цэнхэр шугам) ба хурд (улбар шар цэгтэй шугам)-ийн төлөөллийн траекторууд. e Циклийн хугацаа (бүлэг тус бүрт n = 19 зүсмэл, өөр өөр гахайгаас), агшилтын хугацаа (бүлэг тус бүрт n = 19 зүсмэл, өөр өөр гахайгаас), сулрах хугацаа (бүлэг тус бүрт n = 19 зүсмэл, өөр өөр гахайгаас), эдийн хөдөлгөөн (n = 25). зүсмэлүүд)/бүлэг, оргил систолын хурд (n = 24(D0), өөр өөр гахайгаас 25(D12) зүсмэл/бүлэг) болон оргил сулрах хурд (n=24(D0), өөр өөр гахайгаас 25(D12) зүсмэл/бүлэг)-ийн тоон үзүүлэлт. Хоёр сүүлт Оюутны t-тест нь ямар ч параметрт мэдэгдэхүйц ялгаа гараагүй. f Цахилгаан өдөөлттэй (улаан) болон (цэнхэр) эдийн хэсгүүдийн төлөөллийн омгийн шинжилгээний ул мөр, ижил хэсгээс авсан эдийн хэсгүүдийн арван бүс нутгийн хэсэг. Доод самбарууд нь өөр өөр хэсгүүдээс авсан арван хэсэгт цахилгаан өдөөлттэй болон цахилгаан өдөөлтгүй эдийн хэсгүүдийн омгийн хувийн зөрүүний тоон үзүүлэлтийг харуулж байна. (n = өөр өөр гахайнаас авсан 8 зүсэм/бүлэг, Хоёр сүүлт оюутны t-тестийг хийсэн; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = өөр өөр гахайнаас авсан 8 зүсэм/бүлэг, Хоёр сүүлт оюутны t-тестийг хийсэн; ****p < 0.0001, **p < 0.01, *p < 0.05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проводится двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = өөр өөр гахайнуудаас авсан 8 хэсэг/бүлэг, хоёр сүүлт Стьютрийн t-тест; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05). （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*5）0. （n = 8 片/组，来自不同的猪，进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001，**p < 0,01，*5）0. (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, хоёр талын шалгуур Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 хэсэг/бүлэг, өөр өөр гахайнаас, хоёр сүүлт Стьютрийн t-тест; ****p<0.0001, **p<0.01, *p<0.05).Алдааны мөрүүд нь дундаж ± стандарт хазайлтыг илэрхийлнэ.
Өмнөх статик биомиметик зүрхний зүсмэлийн өсгөврийн системд [20, 21] бид цахилгаан өдөөлтийг ашиглан, орчны найрлагыг оновчтой болгосноор зүрхний зүсмэлийн амьдрах чадвар, үйл ажиллагаа, бүтцийн бүрэн бүтэн байдлыг 6 хоногийн турш хадгалсан. Гэсэн хэдий ч 10 хоногийн дараа эдгээр үзүүлэлтүүд огцом буурсан. Бид өмнөх статик биомиметик өсгөврийн систем 20, 21 хяналтын нөхцөлд (Ctrl) өсгөвөрлөсөн хэсгүүдийг дурдах бөгөөд өмнө нь оновчтой болгосон орчингоо MC нөхцөл, нэгэн зэрэг механик болон цахилгаан өдөөлт (CTCM) дор өсгөвөрлөх байдлаар ашиглах болно. Нэгдүгээрт, бид цахилгаан өдөөлтгүйгээр механик өдөөлт нь эдийн амьдрах чадварыг 6 хоногийн турш хадгалахад хангалтгүй болохыг тогтоосон (Нэмэлт Зураг 3a, b). Сонирхолтой нь, STCM ашиглан физик-механик болон цахилгаан өдөөлтийг нэвтрүүлснээр 12 хоногийн зүрхний зүсмэлийн амьдрах чадвар нь MS нөхцөлд шинэ зүрхний зүсмэлүүдтэй адил хэвээр байсан боловч MTT шинжилгээгээр харуулсны дагуу Ctrl нөхцөлд биш байв (Зураг 1). 3a). Энэ нь зүрхний мөчлөгийн механик өдөөлт болон симуляци нь эдийн хэсгүүдийг өмнөх статик өсгөврийн системд мэдээлснээс хоёр дахин удаан амьдрах чадвартай байлгаж чадна гэдгийг харуулж байна. Гэсэн хэдий ч зүрхний тропонин Т болон коннексин 43-ыг дархлаа тэмдэглэгээгээр эдийн хэсгүүдийн бүтцийн бүрэн бүтэн байдлыг үнэлэхэд 12 дахь өдөр MC эдэд коннексин 43-ийн илэрхийлэл нь хяналтын бүлгийнхээс 12 дахь өдөр мэдэгдэхүйц өндөр байсан нь тогтоогдсон. Гэсэн хэдий ч коннексин 43-ийн жигд илэрхийлэл болон Z-диск үүсэх нь бүрэн хадгалагдаагүй (Зураг 3b). Бид эдийн бүтцийн бүрэн бүтэн байдлыг тоон үзүүлэлтээр илэрхийлэхийн тулд хиймэл оюун ухаан (AI) хүрээг ашигладаг26, тропонин-Т болон коннексин будалт43 дээр суурилсан дүрс дээр суурилсан гүнзгий сургалтын хоолойг ашиглан зүрхний зүсмэлүүдийн бүтцийн бүрэн бүтэн байдал болон флуоресценцийг байршлын хүчээр автоматаар тоон үзүүлэлтээр тодорхойлдог. Энэ арга нь лавлагаанд дурдсанчлан зүрхний эдийн бүтцийн бүрэн бүтэн байдлыг автоматжуулсан, шударга байдлаар найдвартай тоон үзүүлэлтээр илэрхийлэхийн тулд Convolutional Neural Network (CNN) болон гүнзгий сургалтын хүрээг ашигладаг. 26. MC эд нь статик хяналтын хэсгүүдтэй харьцуулахад 0 дахь өдөртэй харьцуулахад бүтцийн ижил төстэй байдал сайжирсан. Үүнээс гадна, Массоны трихром будалтаар өсгөврийн 12 дахь өдөр хяналтын нөхцөлтэй харьцуулахад MS нөхцөлд фиброзын хувь мэдэгдэхүйц бага байгааг тогтоосон (Зураг 3c). CTCM нь 12 дахь өдөр зүрхний эдийн хэсгүүдийн амьдрах чадварыг шинэ зүрхний эдийнхтэй төстэй түвшинд хүртэл нэмэгдүүлсэн боловч зүрхний хэсгүүдийн бүтцийн бүрэн бүтэн байдлыг мэдэгдэхүйц сайжруулаагүй.
Баган график нь шинэхэн зүрхний зүсмэлүүд (D0) эсвэл зүрхний зүсмэлүүдийн өсгөврийн MTT амьдрах чадварыг 12 хоногийн турш статик өсгөвөрт (D12 Ctrl) эсвэл CTCM (D12 MC)-д (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) зүсмэл/бүлэгт өөр өөр гахайнаас авсан, нэг чиглэлд ANOVA тест хийсэн; ####p < 0.0001 D0-тэй харьцуулахад ба **p < 0.01 D12 Ctrl-тэй харьцуулахад) тоон үзүүлэлтийг харуулж байна. Баган график нь шинэхэн зүрхний зүсмэлүүд (D0) эсвэл зүрхний зүсмэлүүдийн өсгөврийн MTT амьдрах чадварыг 12 хоногийн турш статик өсгөвөрт (D12 Ctrl) эсвэл CTCM (D12 MC)-д (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) зүсмэл/бүлэгт өөр өөр гахайнаас авсан, нэг чиглэлд ANOVA тест хийсэн; ####p < 0.0001 D0-тэй харьцуулахад ба **p < 0.01 D12 Ctrl-тэй харьцуулахад) тоон үзүүлэлтийг харуулж байна.Гистограмм нь MTT шинэ зүрхний зүслэг (D0)-ийн амьдрах чадварыг тоон үзүүлэлтээр харуулсан эсвэл зүрхний зүслэгийг статик өсгөвөр (D12 хяналт) эсвэл CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 хяналт). ), 12 (D12 MC) зүслэг/бүлэгт 12 хоногийн турш өөр өөр гахайнаас авсан бөгөөд нэг талын ANOVA тестийг гүйцэтгэсэн;####p < 0,0001 по сравнению с D0 ба **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < D0-тэй харьцуулахад 0.0001 ба **p < D12 Ctrl-тэй харьцуулахад 0.01). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切(D12)片或心脏切片培养12 天的MTT 活力的量化)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，切片/组，卛运测试；与D0 相比，####p < 0.0001，与D12 Ctrl 相比，**p < 0.01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切(D12)片，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0.0tr与1D相比，**p。)Шинэ зүрхний зүсэлт (D0) эсвэл статик өсгөвөрт (D12 хяналт) эсвэл CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 хяналт)), 12 (D12 MC) зүсэлт/бүлэгт 12 хоногийн турш өсгөвөрлөсөн зүрхний зүсэлтүүдэд MTT амьдрах чадварыг тоон үзүүлэлтээр харуулсан гистограмм, нэг талын ANOVA тест;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < D0-тэй харьцуулахад 0.0001, **p < D12-тэй харьцуулахад 0.01 Ctrl).b Тропонин-Т (ногоон), коннексин 43 (улаан) болон DAPI (цэнхэр)-ийг шинээр тусгаарлагдсан зүрхний хэсгүүдэд (D0) эсвэл зүрхний хэсгүүдэд статик нөхцөлд (Ctrl) эсвэл CTCM нөхцөлд (MC) 12 хоногийн турш өсгөвөрлөсөн) төлөөллийн иммунофлуоресценцийн дүрслэлд (хоосон масштаб = 100 µm). Зүрхний эдийн бүтцийн бүрэн бүтэн байдлыг хиймэл оюун ухаанаар тоон үзүүлэлтээр тодорхойлсон (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) өөр өөр гахайнаас тус бүр зүсмэл/бүлэглэсэн, нэг талын ANOVA тест хийсэн; ####p < 0.0001 нь D0-тэй харьцуулахад, ****p < 0.0001 нь D12 Ctrl-тэй харьцуулахад). Зүрхний эдийн бүтцийн бүрэн бүтэн байдлыг хиймэл оюун ухаанаар тоон үзүүлэлтээр тодорхойлсон (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) өөр өөр гахайнаас тус бүр зүсмэл/бүлэг, нэг талын ANOVA тест хийсэн; ####p < 0.0001 нь D0-тэй харьцуулахад, ****p < 0.0001 нь D12 Ctrl-тэй харьцуулахад). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп нь янз бүрийн свиней, проводится однофакторный тест ANOVA проводится < ##0#p; #0#0 ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Хиймэл оюун ухаанаар зүрхний эдийн бүтцийн бүрэн бүтэн байдлыг тоон үзүүлэлтээр тодорхойлох (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) өөр өөр гахайнаас авсан хэсэг/бүлэг, нэг талын ANOVA тест хийгдсэн; ####p < 0.0001 vs. D0 ба ****p < 0.0001 нь D12 Ctrl-тэй харьцуулахад).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) өөр өөр гахайн зүсмэлүүд/бүлэг тус бүр, нэг талын ANOVA тест #0#Dp <0.0;相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) өөр өөр гахайн зүсмэлүүд/бүлэг тус бүр, нэг талын ANOVA тест ##01;#01;与D0相比，****p < 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/группу каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; #,#0#0ля vs. < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Зүрхний эдийн бүтцийн бүрэн бүтэн байдлыг тоон үзүүлэлтээр илэрхийлэх хиймэл оюун ухаан (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) өөр өөр гахайнуудын хэсэг/бүлэг тус бүр, нэг талын ANOVA тест; ####p<0.0001 vs.D0 Харьцуулахын тулд ****p < 0.0001 нь D12 Ctrl-тэй харьцуулахад). c Массоны трихром будгаар будсан зүрхний зүсмэлүүдийн төлөөллийн зураг (зүүн талд) болон тоон үзүүлэлт (баруун талд) (өөр өөр гахайгаас авсан n = 10 зүсмэл/бүлэг тус бүр, нэг талын ANOVA тест хийгдсэн; ####p < 0.0001 D0-тэй харьцуулахад ба ***p < 0.001 D12 Ctrl-тэй харьцуулахад). c Массоны трихром будгаар будсан зүрхний зүсмэлүүдийн төлөөллийн зураг (зүүн талд) болон тоон үзүүлэлт (баруун талд) (өөр өөр гахайнаас авсан n = 10 зүсмэл/бүлэг тус бүр, нэг талын ANOVA тест хийгдсэн; #### D0-тэй харьцуулахад p < 0.0001 ба D12 Ctrl-тэй харьцуулахад ***p < 0.001). в Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытия = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, выпностний тест A # #; 0,0001 по сравнению с D0 ба ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Массоны трихром будгаар будсан зүрхний хэсгүүдийн төлөөллийн зураг (зүүн) болон тоон үзүүлэлт (баруун) (өөр өөр гахайнаас авсан n = 10 хэсэг/бүлэг, нэг талын ANOVA тест хийгдсэн; #### D0-тэй харьцуулахад p < 0.0001, D12 Ctrl-тэй харьцуулахад ***p < 0.001). c 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸（右）（裸=專0µ强（裸=尺强10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 ， 每组来自不同的猪， Ctrl 相比）. C 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度度裸尺度 = 500 μm） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 ， 进行 单向 单向 单向 # # p 0.0001 与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）. в Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждий от другой свиньоны свиньи, потеснических протестых) анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Массоны трихром будгаар будсан зүрхний хэсгүүдийн төлөөллийн зургууд (зүүн талд) болон тоон үзүүлэлт (баруун талд) (хоосон = 500 µм) (n = 10 хэсэг/бүлэг, тус бүр нь өөр өөр гахайгаас авсан, нэг талын дисперсийн шинжилгээгээр туршсан;### # p < 0.0001 нь D0-тэй харьцуулахад, ***p < 0.001 нь D12 Ctrl-тэй харьцуулахад).Алдааны мөрүүд нь дундаж ± стандарт хазайлтыг илэрхийлнэ.
Бид өсгөврийн орчинд жижиг молекулуудыг нэмснээр CTCM өсгөврийн үед кардиомиоцитын бүрэн бүтэн байдлыг сайжруулж, фиброзын хөгжлийг бууруулж болно гэж таамагласан. Тиймээс бид цөөн тооны төөрөгдүүлэгч хүчин зүйлсийн улмаас статик хяналтын өсгөврөө ашиглан жижиг молекулуудыг илрүүлсэн20,21. Энэхүү шинжилгээнд дексаметазон (Dex), триодотиронин (T3), SB431542 (SB)-ийг сонгосон. Эдгээр жижиг молекулуудыг өмнө нь hiPSC-CM өсгөвөрт саркомерын урт, Т-гуурс, дамжуулалтын хурдыг нэмэгдүүлэх замаар кардиомиоцитын боловсорч гүйцэхийг өдөөхөд ашиглаж байсан. Үүнээс гадна, Dex (глюкокортикоид) болон SB хоёулаа үрэвслийг дарангуйлдаг нь мэдэгдэж байна29,30. Тиймээс бид эдгээр жижиг молекулуудын аль нэгийг эсвэл тэдгээрийн хослолыг оруулах нь зүрхний хэсгүүдийн бүтцийн бүрэн бүтэн байдлыг сайжруулах эсэхийг туршсан. Анхны шинжилгээнд нэгдэл бүрийн тунг эсийн өсгөврийн загварт түгээмэл хэрэглэгддэг концентраци (1 μM Dex27, 100 nM T327, болон 2.5 μM SB31) дээр үндэслэн сонгосон. 12 хоногийн өсгөврийн дараа Т3 болон Дексийг хослуулан хэрэглэснээр кардиомиоцитын бүтцийн оновчтой бүрэн бүтэн байдал, фиброз өөрчлөлт хамгийн бага түвшинд хүрсэн (Нэмэлт Зураг 4 ба 5). Үүнээс гадна, эдгээр концентрацийг хоёр дахин ихэсгэх нь хэвийн концентрацитай харьцуулахад хортой нөлөө үзүүлсэн (Нэмэлт Зураг 6a, b).
Анхны скрининг хийсний дараа бид 4 өсгөврийн нөхцөлийг нүүр тулан харьцуулсан (Зураг 4a): Ctrl: бидний өмнө нь тодорхойлсон статик өсгөвөрт бидний оновчтой орчин ашиглан өсгөвөрлөсөн зүрхний хэсгүүд; 20.21 TD: Лхагва гарагт T3 ба Ctrl s Dex нэмсэн; MC: бидний өмнө нь оновчтой орчин ашиглан CTCM-д өсгөвөрлөсөн зүрхний хэсгүүд; болон MT: Т3 ба Dex-ийг орчинд нэмсэн CTCM. 12 хоногийн өсгөвөрлөлтийн дараа MS ба MT эдүүдийн амьдрах чадвар MTT шинжилгээгээр үнэлэгдсэн шинэ эдүүдтэй ижил хэвээр байв (Зураг 4b). Сонирхолтой нь, трансвелл өсгөвөрт (TD) T3 ба Dex нэмэх нь Ctrl нөхцөлтэй харьцуулахад амьдрах чадвар мэдэгдэхүйц сайжраагүй бөгөөд энэ нь зүрхний хэсгүүдийн амьдрах чадварыг хадгалахад механик өдөөлт чухал үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг харуулж байна.
12 хоногийн турш орчинд механик өдөөлт болон T3/Dex нэмэлт тэжээлийн нөлөөг үнэлэхэд ашигласан дөрвөн өсгөврийн нөхцлийг дүрсэлсэн туршилтын дизайны диаграмм. b Баган график нь өсгөвөрлөсний дараах 4 нөхцөлд (Ctrl, TD, MC, болон MT) 12 хоногийн амьдрах чадварыг шинэхэн зүрхний зүсмэлүүд (D0)-тэй харьцуулсан тоон үзүүлэлтийг харуулж байна (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD болон D12 MT), 12 (D12 MC) зүсмэл/бүлэг, нэг талын ANOVA тест хийгдсэн; ####p < 0.0001, ###p < D0-тэй харьцуулахад 0.001 болон **p < 0.01 D12 Ctrl-тэй харьцуулахад). b Баган график нь өсгөвөрлөсний дараах 4 нөхцөлд (Ctrl, TD, MC, болон MT) 12 хоногийн амьдрах чадварыг шинэхэн зүрхний зүсмэлүүд (D0)-тэй харьцуулсан тоон үзүүлэлтийг харуулж байна (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD болон D12 MT), 12 (D12 MC) зүсмэл/бүлэг, нэг талын ANOVA тест хийгдсэн; ####p < 0.0001, ###p < D0-тэй харьцуулахад 0.001 ба **p < D12 ctrl-тэй харьцуулахад 0.01). b Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней дараа культивирование всех 4 условиях культивирование (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 12), (D0,12), TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группу от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 сравнению D2). b Баган график нь өсгөвөрлөсний дараах 12 хоногийн хугацаанд (хяналтын, TD, MC, болон MT) бүх 4 өсгөвөрийн нөхцөлд амьдрах чадварыг шинэ зүрхний зүсэлттэй (D0) харьцуулсан тоон үзүүлэлтийг харуулж байна (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD, болон D12 MT), 12 (D12 MC) өөр өөр гахайнаас авсан хэсэг/бүлэг, нэг талын ANOVA тест; ####p < 0.0001, ###p < 0.001 vs. D0 ба **p < 0.01 vs. D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D12Dl)) TD 和D12 MT)，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组，进行单向ANOVA 测试；####p < 0.0001；####p < 0.0001Ｘ#0.0.0.相比，**p < 0.01 与D12控制）。b 4 12 (D12 MC) b Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD ба D12 MT), MC12 разных срезы/группа, односторонний тест ANOVA ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b Шинэхэн зүрхний зүслэгүүдтэй (D0) харьцуулсан бүх 4 өсгөврийн нөхцөл (хяналтын, TD, MC болон MT)-ийг харуулсан гистограмм (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD болон D12 MT), өөр өөр гахайнаас авсан 12 (D12 MC) зүслэг/бүлэг, нэг талын ANOVA тест; ####p<0.0001, ###p<0.001 vs. D0, **p<0.01 vs. хяналтын D12). c Баган график нь өсгөвөрлөсний дараах 12 хоногийн глюкозын урсгалын тоон үзүүлэлтийг бүх 4 өсгөвөрийн нөхцөлд (Ctrl, TD, MC, болон MT) шинэ зүрхний зүсмэлүүдтэй (D0) харьцуулсан байдлыг харуулж байна (n = 6 зүсмэл/бүлэг, нэг талын ANOVA тестийг хийсэн; ###p < 0.001, D0-тэй харьцуулахад, ***p < 0.001, D12 Ctrl-тэй харьцуулахад). c Баган график нь өсгөвөрлөсний дараах 12 хоногийн глюкозын урсгалын тоон үзүүлэлтийг бүх 4 өсгөвөрийн нөхцөлд (Ctrl, TD, MC, болон MT) шинэ зүрхний зүсмэлүүдтэй (D0) харьцуулсан байдлыг харуулж байна (n = 6 зүсмэл/бүлэг, нэг талын ANOVA тестийг хийсэн; ###p < 0.001, D0-тэй харьцуулахад, ***p < 0.001, D12 Ctrl-тэй харьцуулахад). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы cherez 12 дней дараа культивирование всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезовын, 6-р хэсэг). Выполняется тест ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0 ба ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Гистограмм нь өсгөвөрлөсний дараах 12 хоногийн глюкозын урсгалын тоон үзүүлэлтийг бүх 4 өсгөвөрийн нөхцөлд (хяналтын, TD, MC болон MT) шинэ зүрхний зүслэгүүдтэй (D0) харьцуулсан болно (n = 6 зүслэг/бүлэг, нэг талын ANOVA тест хийгдсэн; ###p < 0.001 D0-тэй харьцуулахад ба ***p < 0.001 D12 Ctrl-тэй харьцуулахад). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比1）天的葡萄糖通量定量（n = 6 片/组，来自不同猪，单向执行ANOVA 测试；##01；###p < 0.相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 切片 切片 创片， 培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ，猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0.001，与D0 相比，***p < 0.001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней дараа культивирование для всех 4 условий культивирование (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n =, срупвины г) односторонний Были проведены тесты ANOVA ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль). c Гистограмм нь өсгөвөрлөсний дараах 12 хоногийн глюкозын урсгалын тоон үзүүлэлтийг бүх 4 өсгөвөрийн нөхцөлд (хяналтын, TD, MC, болон MT) зүрхний шинэ зүсэлттэй (D0) харьцуулсан (n = 6 зүсэлт/бүлэг, өөр өөр гахайнаас авсан, нэг талын). ANOVA шинжилгээг хийсэн, ###p < 0.001 D0-тэй харьцуулахад, ***p < 0.001 D12 (хяналтын)-тэй харьцуулахад.d Арван бүс нутгийн эдийн зүсэлтийн цэгт (n = 4 зүсмэл/бүлэг, нэг талын ANOVA тест; бүлгүүдийн хооронд мэдэгдэхүйц ялгаа байгаагүй) шинэхэн (цэнхэр), 12 дахь өдрийн MC (ногоон) болон 12 дахь өдрийн MT (улаан) эдүүдийн омгийн шинжилгээний графикууд. e 10-12 хоногийн турш статик нөхцөлд (Ctrl) эсвэл MT нөхцөлд (MT) өсгөвөрлөсөн зүрхний хэсгүүдтэй харьцуулахад шинэхэн зүрхний хэсгүүдэд (D0) ялгаатай илэрхийлэгдсэн генийг харуулсан галт уулын график. f Өсгөвөрлөлтийн нөхцөл тус бүрт өсгөвөрлөсөн зүрхний хэсгүүдийн саркомер генийн дулааны зураг. Алдааны мөрүүд нь дундаж ± стандарт хазайлтыг илэрхийлнэ.
Тосны хүчлийн исэлдэлтээс гликолиз руу шилжихээс бодисын солилцооны хамаарал нь кардиомиоцитын дифференциалжилтын шинж тэмдэг юм. Дутуу төлөвшсөн кардиомиоцитууд нь голчлон глюкозыг ATP үйлдвэрлэхэд ашигладаг бөгөөд цөөн тооны кристтай гипопластик митохондритай байдаг5,32. Глюкозын ашиглалтын шинжилгээгээр MC болон MT нөхцөлд глюкозын ашиглалт 0 өдрийн эдтэй төстэй байсан (Зураг 4c). Гэсэн хэдий ч Ctrl дээжүүд шинэхэн эдтэй харьцуулахад глюкозын ашиглалт мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн болохыг харуулсан. Энэ нь CTCM болон T3/Dex-ийн хослол нь эдийн амьдрах чадварыг сайжруулж, 12 хоногийн өсгөвөрлөсөн зүрхний хэсгүүдийн бодисын солилцооны фенотипийг хадгалдаг болохыг харуулж байна. Үүнээс гадна, омгийн шинжилгээгээр омгийн түвшин MT болон MS нөхцөлд 12 хоногийн турш шинэхэн зүрхний эдтэй ижил хэвээр байгааг харуулсан (Зураг 4d).
Зүрхний зүсмэл эдийн дэлхийн транскрипцийн ландшафтад CTCM болон T3/Dex-ийн нийт нөлөөллийг шинжлэхийн тулд бид дөрвөн өөр өсгөврийн нөхцөл байдлаас зүрхний зүсмэлүүд дээр RNAseq хийсэн (Нэмэлт мэдээлэл 1). Сонирхолтой нь, MT хэсгүүд нь шинэхэн зүрхний эдтэй транскрипцийн өндөр ижил төстэй байдлыг харуулсан бөгөөд 13,642 генээс зөвхөн 16 нь ялгаатай илэрхийлэгдсэн байна. Гэсэн хэдий ч бидний өмнө нь харуулсанчлан, Ctrl зүсмэлүүд нь өсгөвөрт 10-12 хоногийн дараа 1229 ялгаатай илэрхийлэгдсэн генийг харуулсан (Зураг 4e). Эдгээр өгөгдлийг зүрх ба фибробласт генийн qRT-PCR-ээр баталгаажуулсан (Нэмэлт зураг 7a-c). Сонирхолтой нь, Ctrl хэсгүүд нь зүрх ба эсийн мөчлөгийн генийн бууралт, үрэвслийн генийн хөтөлбөрийн идэвхжлийг харуулсан. Эдгээр өгөгдөл нь удаан хугацааны өсгөврийн дараа ихэвчлэн тохиолддог дедифференциаци нь MT нөхцөлд бүрэн сулардаг болохыг харуулж байна (Нэмэлт зураг 8a, b). Саркомерын генийг нарийвчлан судалснаар зөвхөн MT нөхцөлд саркомер (Зураг 4f) болон ионы сувгийг (Нэмэлт Зураг 9) кодчилдог генүүд хадгалагдаж, Ctrl, TD, болон MC нөхцөлд дарангуйллаас хамгаалдаг болохыг харуулсан. Эдгээр өгөгдөл нь механик болон гуморал өдөөлт (T3/Dex)-ийн хослолоор зүрхний зүсмэлийн транскриптом нь өсгөвөрт 12 хоногийн дараа шинэхэн зүрхний зүсмэлүүдтэй төстэй хэвээр үлдэж болохыг харуулж байна.
Эдгээр транскрипцийн олдворуудыг зүрхний хэсгүүдэд кардиомиоцитын бүтцийн бүрэн бүтэн байдал нь MT нөхцөлд 12 хоногийн турш хамгийн сайн хадгалагддаг болохыг бүрэн бүтэн, орон нутгийн коннексин 43-аар харуулсан (Зураг 5a). Үүнээс гадна, MT нөхцөлд зүрхний хэсгүүдэд фиброз нь Ctrl-тэй харьцуулахад мэдэгдэхүйц буурсан бөгөөд шинэ зүрхний хэсгүүдтэй төстэй байсан (Зураг 5b). Эдгээр өгөгдөл нь механик өдөөлт болон T3/Dex эмчилгээний хослол нь өсгөвөрт зүрхний хэсгүүдэд зүрхний бүтцийг үр дүнтэй хадгалдаг болохыг харуулж байна.
a Шинээр тусгаарлагдсан зүрхний хэсгүүдэд (D0) эсвэл зүрхний дөрвөн хэсгийн бүх өсгөврийн нөхцөлд 12 хоногийн турш өсгөвөрлөсөн тропонин-Т (ногоон), коннексин 43 (улаан) болон DAPI (цэнхэр)-ийн төлөөллийн иммунофлуоресценцийн дүрслэл (масштабын баар = 100 µm). Зүрхний эдийн бүтцийн бүрэн бүтэн байдлыг хиймэл оюун ухаанаар тоон үзүүлэлтээр тодорхойлсон (n = 7 (D0 ба D12 Ctrl), өөр өөр гахайнаас авсан 5 (D12 TD, D12 MC ба D12 MT) зүсмэл/бүлэг, нэг талын ANOVA тест хийгдсэн; ####p < 0.0001 нь D0 ба *p < 0.05-тай харьцуулахад, эсвэл ****p < 0.0001 нь D12 Ctrl-тэй харьцуулахад). Зүрхний эдийн бүтцийн бүрэн бүтэн байдлыг хиймэл оюун ухаанаар тоон үзүүлэлтээр тодорхойлсон (n = 7 (D0 ба D12 Ctrl), өөр өөр гахайнаас авсан 5 (D12 TD, D12 MC ба D12 MT) зүсмэл/бүлэг, нэг талын ANOVA тест хийгдсэн; #### D0 ба *p < 0.05-тай харьцуулахад p < 0.0001, эсвэл D12 Ctrl-тай харьцуулахад ****p < 0.0001). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с помощью искусственного интеллект (n = 7 (D0 ба D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ба D12 MT) срезов/группу нь разных свиней, проведент A# # FA; #NOVA; 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 эсвэл ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Хиймэл оюун ухаан (n = 7 (D0 ба D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ба D12 MT) өөр өөр гахайнаас авсан хэсэг/бүлэг ашиглан зүрхний эдийн бүтцийн бүрэн бүтэн байдлыг тоон үзүүлэлтээр тодорхойлсон, нэг талын ANOVA тест хийгдсэн; #### D0-тэй харьцуулахад p < 0.0001 ба *p < 0.05 эсвэл D12 Ctrl-тэй харьцуулахад ****p < 0.0001).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0.0001 与D0 和*5 p <0.）切片0.0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12，d12 mc 弉 对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7人工 智能量 化 进行 单向 单向 单向 测试 ； ######### p < 0.0001 与D0 和明*p < 0.05p 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。Нэг талын ANOVA тест ашиглан янз бүрийн гахайд (n = 7 (D0 ба D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC ба D12 MT) хэсэг/бүлэг) хиймэл оюун ухаан ашиглан зүрхний эдийн бүтцийн бүрэн бүтэн байдлыг тоон үзүүлэлтээр тодорхойлох;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 эсвэл ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### D0-тэй харьцуулахад p < 0.0001 ба *p < 0.05 эсвэл ****p < 0.0001 нь D12 Ctrl-тэй харьцуулахад). b Массоны трихром будгаар будсан зүрхний зүсмэлүүдийн төлөөллийн зураг болон тоон үзүүлэлт (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, ба D12 MC), өөр өөр гахайнаас авсан 9 (D12 MT) зүсмэл/бүлэг, нэг талын ANOVA тест хийгдсэн; ####p < 0.0001 нь D0 ба ***p < 0.001-тэй харьцуулахад, эсвэл ****p < 0.0001 нь D12 Ctrl-тэй харьцуулахад). b Массоны трихром будгаар будсан зүрхний зүсмэлүүдийн төлөөллийн зураг болон тоон үзүүлэлт (Scale bar = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD, ба D12 MC), өөр өөр гахайнаас авсан 9 (D12 MT) зүсмэл/бүлэг, нэг талын ANOVA тест хийгдсэн; ####p < 0.0001 нь D0 ба ***p < 0.001-тэй харьцуулахад, эсвэл ****p < 0.0001 нь D12 Ctrl-тэй харьцуулахад). б Репрезентативные изображения ба количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT резпуразг2), 9 (с) свиней, выполняется односторонний тест ANOVA ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 эсвэл ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Массоны трихром будгаар будсан зүрхний хэсгүүдийн төлөөллийн зураг болон тоон үзүүлэлт (масштабын шугам = 500 µm) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ба D12 MC), өөр өөр гахайнаас авсан 9 (D12 MT) хэсэг/бүлэг, нэг талын ANOVA-тай харьцуулсан; ####p < 0.0001 vs. D0 ба ***p < 0.001 эсвэл ****p < 0.0001 vs. D12 Ctrl). b 用Masson 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 μm）1！D2D Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差）0#p#0#p.与D0 相比，***p < 0.001，或****p <0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 （（（0dn = d12 ctrl 、 d12 td 和 d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0.0001 与D0 相比，***p <0.0001 0.0001 与D12 Ctrl 相比）。 б Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD ба D12 MC), 9 (D12 оценка срезов, групп) способ ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 эсвэл ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Массоны трихромоор будсан зүрхний хэсгүүдийн төлөөллийн зураг болон тоон үзүүлэлт (масштабын шугам = 500 µм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD болон D12 MC), өөр өөр гахай/бүлгээс авсан 9 (D12 MT) хэсгүүд, нэг ANOVA арга; ####p < 0.0001 нь D0-тэй харьцуулахад, ***p < 0.001 эсвэл ****p < 0.0001 нь D12 Ctrl-тэй харьцуулахад).Алдааны мөрүүд нь дундаж ± стандарт хазайлтыг илэрхийлнэ.
Эцэст нь зүрхний эдийн суналтыг нэмэгдүүлэх замаар CTCM-ийн зүрхний гипертрофийг дуурайх чадварыг үнэлсэн. CTCM-д агаарын камерын оргил даралт 80 мм м.у.б-ээс 80 мм м.у.б хүртэл (хэвийн суналт) 140 мм м.у.б хүртэл нэмэгдсэн (Зураг 6a). Энэ нь суналтын 32%-иар нэмэгдсэнтэй тохирч байна (Зураг 6b), үүнийг өмнө нь гипертрофитой төстэй саркомерын уртыг авахын тулд зүрхний хэсгүүдэд шаардлагатай харгалзах хувийн суналт гэж харуулсан. Агшилт ба сулралын үед зүрхний эдийн суналт ба хурд нь зургаан өдрийн өсгөврийн үеэр тогтмол хэвээр байв (Зураг 6c). MT-ийн нөхцөлд үүссэн зүрхний эдийг зургаан өдрийн турш хэвийн суналт (MT (Хэвийн)) эсвэл хэт суналтын нөхцөлд (MT (OS)) оруулсан. Өсгөвөрт дөрвөн өдрийн дараа гипертрофик биомаркер NT-ProBNP нь MT (Хэвийн) нөхцөлд харьцуулахад MT (OS) нөхцөлд орчинд мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн (Зураг 7a). Үүнээс гадна, зургаан өдрийн өсгөврийн дараа MT (OS) (Зураг 7b) дахь эсийн хэмжээ нь MT зүрхний хэсгүүдтэй харьцуулахад (хэвийн) мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн. Үүнээс гадна, хэт сунасан эдэд NFATC4 цөмийн транслокаци мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн (Зураг 7c). Эдгээр үр дүнгүүд нь хэт сунасны дараа эмгэг өөрчлөлтийн дэвшилтэт хөгжлийг харуулж байгаа бөгөөд CTCM төхөөрөмжийг суналтаас үүдэлтэй зүрхний гипертрофи дохиоллыг судлах платформ болгон ашиглаж болно гэсэн ойлголтыг дэмжиж байна.
Агаарын камерын даралт, шингэний камерын даралт, эдийн хөдөлгөөний хэмжилтийн төлөөллийн ул мөр нь камерын даралт нь шингэний камерын даралтыг өөрчилж, эдийн зүсмэлийн харгалзах хөдөлгөөнийг үүсгэдэг болохыг баталж байна. b Хэвийн сунасан (улбар шар) болон хэт сунасан (цэнхэр) эдийн хэсгүүдийн төлөөллийн суналтын хувь ба суналтын хурдны муруй. c Циклийн хугацаа (бүлэг тус бүрт n = 19 зүсэм, өөр өөр гахайгаас), агшилтын хугацаа (бүлэг тус бүрт n = 18-19 зүсэм, өөр өөр гахайгаас), сулрах хугацаа (бүлэг тус бүрт n = 19 зүсэм, өөр өөр гахайгаас), эдийн хөдөлгөөний далайц (бүлэг тус бүрт n = 14 зүсэм, өөр өөр гахайгаас), систолын оргил хурд (бүлэг тус бүрт n = 14 зүсэм, өөр өөр гахайгаас) болон сулрах оргил хурд (бүлэг тус бүрт n = 14 (D0), 15 (D6)), хоёр сүүлт Стьютдийн t-тест нь ямар ч параметрт мэдэгдэхүйц ялгаа гараагүй бөгөөд эдгээр параметрүүд хэт хүчдэлтэй 6 хоногийн өсгөврийн явцад тогтмол хэвээр байгааг харуулж байна. Алдааны баарууд нь дундаж ± стандарт хазайлтыг илэрхийлнэ.
a Өөр өөр гахайнаас MT хэвийн суналт (Norm) эсвэл хэт суналт (OS) нөхцөлд (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, болон D4 MTOS) зүсмэл/бүлэгт өсгөвөрлөсөн зүрхний зүсмэлүүдээс өсгөвөрийн орчин дахь NT-ProBNP-ийн концентрацийг баганан графикаар тоон үзүүлэлтээр харуулав. Хоёр талын ANOVA хийсэн; **хэвийн суналттай харьцуулахад p < 0.01). a Өөр өөр гахайнаас MT хэвийн суналт (Norm) эсвэл хэт суналт (OS) нөхцөлд (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, болон D4 MTOS) зүсмэл/бүлэгт өсгөвөрлөсөн зүрхний зүсмэлүүдээс өсгөвөрийн орчин дахь NT-ProBNP-ийн концентрацийг баганан графикаар тоон үзүүлэлтээр харуулав. Хоёр талын ANOVA гүйцэтгэсэн; **хэвийн суналттай харьцуулахад p < 0.01).Хэвийн MT суналт (норм) эсвэл хэт суналт (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm, ба D4).MTOS) зүсмэл/бүлэг нөхцөлд өөр өөр гахайнаас өсгөвөрлөсөн зүрхний зүсмэлүүдээс авсан өсгөвөрийн орчин дахь NT-ProBNP-ийн концентрацийн тоон гистограммыг ашиглан дисперсийн хоёр хүчин зүйлийн шинжилгээг хийсэн;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **хэвийн суналттай харьцуулахад p < 0.01). a 在MT 正常拉伸(Норм) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比，p < 0.01 a MT хэвийн сунгах (Норм) эсвэл хэт сунах (OS) нөхцөлд (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) өөр өөр зүрхний зүсмэлүүд дэх NT-ProBNP концентрацийн тоон үзүүлэлт.猪的切片/组，可以双向方方发发动; **хэвийн суналттай харьцуулахад, p <0.01).гистограмм Хэвийн MT суналт (норм) эсвэл хэт суналт (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) болон D4 MTOS) зүсмэл/бүлэг нөхцөлд өөр өөр гахайнаас өсгөвөрлөсөн зүрхний зүсмэлүүд дэх NT-ProBNP концентрацийг тоон үзүүлэлтээр тодорхойлох, дисперсийн хоёр талын шинжилгээ;**p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). **хэвийн суналттай харьцуулахад p < 0.01). b Тропонин-Т ба WGA-аар будсан зүрхний зүсмэлүүдийн төлөөллийн зураг (зүүн талд) болон эсийн хэмжээг тоон үзүүлэлтээр (баруун талд) (n = 330 (D6 MTOS), өөр өөр гахайн 10 өөр зүсмэлээс авсан 369 (D6 MTNorm) эс/бүлэг, Хоёр сүүлт Оюутны t-тестийг хийсэн; хэвийн суналттай харьцуулахад ****p < 0.0001). b Тропонин-Т ба WGA-аар будсан зүрхний зүсмэлүүдийн төлөөллийн зургууд (зүүн талд) болон эсийн хэмжээг тоон үзүүлэлтээр (баруун талд) (n = 330 (D6 MTOS), өөр өөр гахайн 10 өөр зүсмэлээс авсан 369 (D6 MTNorm) эс/бүлэг, Хоёр сүүлт Оюутны t-тестийг хийсэн; хэвийн суналттай харьцуулахад ****p < 0.0001). b Reprezentativnıe изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) ба количественного определения размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) сразовны клеток/групп два- проводится хвостовой t-критерий Стьюдента ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Тропонин-Т ба AZP-ээр будсан зүрхний хэсгүүдийн төлөөллийн зураг (зүүн талд) болон эсийн хэмжээний тоон үзүүлэлт (баруун талд) (n = 330 (D6 MTOS), өөр өөр гахайн 10 өөр хэсгээс авсан 369 (D6 MTNorm) эс/бүлэг, хоёр сүүлт Стьютний т-тестийг хийсэн; хэвийн омогтой харьцуулахад ****p < 0.0001). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的心脏切片的代表切片的代表切片的代表往式开MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组，两进行有尾t学检验；与正常拉伸相比，****p < 0.0001）。 b Калькареин-Т болон WGA-аар будсан зүрхний зүсмэлүүдийн төлөөллийн зураг (зүүн талд) болон эсийн хэмжээ (баруун талд) (n = 330 (D6 MTOS), 10 өөр зүсмэлээс 369 (D6 MTNorm)) Эсүүд/Эдгээр эсүүд, жишээлбэл, хэвийн суналттай харьцуулахад, ****p < 0.0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) ба количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) 10 различовын, двусторонние шалгуур Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Тропонин-Т ба AZP-ээр будсан зүрхний хэсгүүдийн төлөөллийн зураг (зүүн талд) болон эсийн хэмжээг тоон үзүүлэлтээр илэрхийлэх (баруун талд) (өөр өөр гахайнуудаас авсан 10 өөр хэсгээс авсан n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm)) Эс/бүлэг, хоёр сүүлт шалгуур Стьюдентын t; ****p < 0.0001 хэвийн омогтой харьцуулахад). c Тропонин-Т болон NFATC4-ээр дархлаажуулсан MTOS зүрхний зүсмэлүүдийн 0 болон 6 дахь өдрийн төлөөллийн зургууд болон NFATC4-ийг CM-ийн цөм рүү шилжүүлэх тоон үзүүлэлт (n = 4 (D0), өөр өөр гахайнаас авсан 3 (D6 MTOS) зүсмэл/бүлэг, Хоёр сүүлт Оюутны t-тест хийгдсэн; *p < 0.05). c Тропонин-Т болон NFATC4-ийн дархлаатай шошготой MTOS зүрхний зүсмэлүүдийн 0 болон 6 дахь өдрийн төлөөллийн зургууд болон NFATC4-ийг CM-ийн цөмд шилжүүлэх тоон үзүүлэлт (n = 4 (D0), өөр өөр гахайнаас авсан 3 (D6 MTOS) зүсмэл/бүлэг, Хоёр сүүлт Оюутны t-тест хийгдсэн; *p < 0.05). в Срезов сердца 0 ба 6 дней MTOS, тропонина-Т ба NFATC4-ийн иммуномеченых, ба NFATC4-ийн яадра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D0), 3 (D0), 3 (D) срезовын системд хамаарах иммуномечены төлөөлөл. , выполняется двусторонний t-критерий Стьюдента *p < 0,05); c 0 ба 6 дахь MTOS-д зүрхний зүсэлтийн төлөөллийн зургууд, тропонин-T болон NFATC4-ийн дархлаа тэмдэглэгээтэй, мөн агуйн эсийн цөмд NFATC4 транслокацийг тоон үзүүлэлтээр тодорхойлсон (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) зүсмэл/бүлэг нь өөр өөр гахайнаас авсан) хоёр сүүлт Стьютний т-тестээр гүйцэтгэсэн; *p < 0.05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS心脏切片的代表性图像，以及来自不同猪的NFATC4 易位至CM 细胞核的量化（D (MT4（0) =切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0.05)。 c Өөр өөр NFATC4 易位至CM эсийн цөмөөс авсан калканин-Т ба NFATC4 иммунолабелинг 第0天和第6天MTOS зүрхний зүсмэлүүдийн төлөөллийн зураг.时间双尾学生et 电影；*p < 0.05). в Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 ба 6 день нь иммуномаркировки тропонином-Т болон NFATC4 болон количественная оценка транслокации NFATC4 болон ядра CM нь янз бүрийн свиней (n = 4 (D0), 3 (D6/MTOS), д6 (D6/MTOS) t-критерий Стьюдента *p < 0,05). c Тропонин-Т ба NFATC4 дархлаа тэмдэглэгээ хийх MTOS зүрхний зүсмэлүүдийн 0 ба 6 дахь өдрийн төлөөллийн зургууд болон өөр өөр гахайнуудаас авсан CM-ийн цөмд NFATC4 транслокацийг тоон үзүүлэлтээр тодорхойлох (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) зүсмэл/бүлэг, хоёр сүүлт t-шалгуур) Оюутных; *p < 0.05).Алдааны мөрүүд нь дундаж ± стандарт хазайлтыг илэрхийлнэ.
Зүрх судасны трансляцийн судалгаанд зүрхний орчныг үнэн зөв хуулбарлах эсийн загварууд шаардлагатай. Энэхүү судалгаанд зүрхний хэт нимгэн хэсгүүдийг өдөөж чадах CTCM төхөөрөмжийг боловсруулж, тодорхойлсон. CTCM систем нь физиологийн хувьд синхрончлогдсон цахилгаан механик өдөөлт болон T3 ба Dex шингэнийг баяжуулахыг агуулдаг. Гахайн зүрхний хэсгүүдэд эдгээр хүчин зүйлүүдэд өртөхөд тэдгээрийн амьдрах чадвар, бүтцийн бүрэн бүтэн байдал, бодисын солилцооны идэвхжил, транскрипцийн илэрхийлэл нь 12 хоногийн өсгөврийн дараа шинэхэн зүрхний эдтэй адил хэвээр байв. Үүнээс гадна зүрхний эдийг хэт их сунгах нь гипер суналтын улмаас зүрхний гипертрофи үүсгэж болзошгүй юм. Ерөнхийдөө эдгээр үр дүнгүүд нь зүрхний хэвийн фенотипийг хадгалахад физиологийн өсгөврийн нөхцөл байдлын чухал үүргийг дэмжиж, эмийн шинжилгээ хийх платформ болж өгдөг.
Кардиомиоцитын үйл ажиллагаа, амьд үлдэх оновчтой орчныг бүрдүүлэхэд олон хүчин зүйл нөлөөлдөг. Эдгээр хүчин зүйлсийн хамгийн тод нь (1) эс хоорондын харилцан үйлчлэл, (2) цахилгаан механик өдөөлт, (3) чийгшлийн хүчин зүйлс, (4) бодисын солилцооны субстратуудтай холбоотой юм. Физиологийн эс хоорондын харилцан үйлчлэл нь эсийн гаднах матрицаар дэмжигдсэн олон төрлийн эсийн нарийн төвөгтэй гурван хэмжээст сүлжээг шаарддаг. Ийм нарийн төвөгтэй эсийн харилцан үйлчлэлийг in vitro нөхцөлд бие даасан эсийн төрлүүдийг хамтран өсгөвөрлөх замаар сэргээхэд хэцүү боловч зүрхний хэсгүүдийн органотип шинж чанарыг ашиглан хялбархан хийж болно.
Зүрхний фенотипийг хадгалахын тулд кардиомиоцитын механик суналт болон цахилгаан өдөөлт чухал үүрэгтэй33,34,35. Механик өдөөлтийг hiPSC-CM-ийн нөхцөл байдал болон боловсорч гүйцэхэд өргөн ашиглаж байгаа ч саяхан хэд хэдэн дэгжин судалгаагаар нэг тэнхлэгт ачаалал ашиглан өсгөвөрт зүрхний зүсмэлүүдийг механик өдөөлт хийхийг оролдсон. Эдгээр судалгаагаар 2 хэмжээст нэг тэнхлэгт механик ачаалал нь өсгөвөрлөлтийн үед зүрхний фенотипт эерэг нөлөө үзүүлдэг болохыг харуулж байна. Эдгээр судалгаанд зүрхний хэсгүүдийг изометрийн суналтын хүчээр17, шугаман ауксотоник ачаалал18 ачаалсан эсвэл зүрхний мөчлөгийг хүчний дамжуулагчийн санал хүсэлт болон хурцадмал хөтлөлт ашиглан дахин бүтээсэн. Гэсэн хэдий ч эдгээр аргууд нь хүрээлэн буй орчны оновчлолгүйгээр нэг тэнхлэгт эдийн суналтыг ашигладаг бөгөөд энэ нь олон зүрхний генийг дарангуйлах эсвэл хэвийн бус суналтын хариу үйлдэлтэй холбоотой генийг хэт их илэрхийлэхэд хүргэдэг. Энд тайлбарласан CTCM нь мөчлөгийн хугацаа болон физиологийн суналтын хувьд (25% суналт, 40% систол, 60% диастол, минутанд 72 цохилт) зүрхний байгалийн мөчлөгийг дуурайдаг 3 хэмжээст цахилгаан механик өдөөлтийг өгдөг. Хэдийгээр энэхүү гурван хэмжээст механик өдөөлт нь дангаараа эдийн бүрэн бүтэн байдлыг хадгалахад хангалтгүй боловч эдийн амьдрах чадвар, үйл ажиллагаа, бүрэн бүтэн байдлыг хангалттай байлгахын тулд T3/Dex ашиглан хошног болон механик өдөөлтийг хослуулан хэрэглэх шаардлагатай.
Насанд хүрэгчдийн зүрхний фенотипийг зохицуулахад гуморал хүчин зүйлс чухал үүрэг гүйцэтгэдэг. Үүнийг эсийн боловсорч гүйцэхийг хурдасгахын тулд өсгөврийн орчинд Т3 болон Дексийг нэмсэн HiPS-CM судалгаанд онцолсон болно. Т3 нь эсийн мембранаар дамжин амин хүчил, сахар, кальцийн тээвэрлэлтэд нөлөөлж болзошгүй36. Үүнээс гадна, Т3 нь MHC-α экспресс болон MHC-β-ийн бууралтыг дэмжиж, ургийн CM-д удаан агших миофибриллтэй харьцуулахад боловсорсон кардиомиоцитуудад хурдан татагдах миофибрилл үүсэхийг дэмждэг. Бамбай булчирхайн үйл ажиллагаа буурсан өвчтөнүүдэд Т3 дутагдал нь миофибрилл тууз алдагдаж, ая үүсэх хурд буурахад хүргэдэг37. Декс нь глюкокортикоид рецепторуудад үйлчилдэг бөгөөд тусгаарлагдсан перфузитай зүрхэнд миокардийн агшилтыг нэмэгдүүлдэг болох нь батлагдсан;38 энэхүү сайжруулалт нь кальцийн хуримтлалд суурилсан оролт (SOCE)-д үзүүлэх нөлөөтэй холбоотой гэж үздэг39,40. Үүнээс гадна, Декс нь рецепторуудтайгаа холбогдож, дархлааны үйл ажиллагаа болон үрэвслийг дарангуйлдаг өргөн хүрээтэй эсийн доторх хариу урвалыг үүсгэдэг30.
Бидний үр дүнгээс харахад физик механик өдөөлт (MS) нь Ctrl-тэй харьцуулахад өсгөврийн ерөнхий гүйцэтгэлийг сайжруулсан боловч өсгөврийн явцад 12 хоногийн турш амьдрах чадвар, бүтцийн бүрэн бүтэн байдал, зүрхний илэрхийлэлийг хадгалж чадаагүй байна. Ctrl-тэй харьцуулахад CTCM (MT) өсгөвөрт T3 болон Dex нэмэх нь амьдрах чадварыг сайжруулж, 12 хоногийн турш шинэ зүрхний эдтэй ижил төстэй транскрипцийн профайл, бүтцийн бүрэн бүтэн байдал, бодисын солилцооны идэвхийг хадгалсан. Үүнээс гадна, эдийн суналтын түвшинг хянах замаар STCM ашиглан гиперсуналтын улмаас үүссэн зүрхний гипертрофийн загварыг бүтээсэн бөгөөд энэ нь STCM системийн олон талт байдлыг харуулсан. Зүрхний өөрчлөлт ба фиброз нь ихэвчлэн цусны эргэлтийн эсүүд нь зохих цитокин, түүнчлэн фагоцитоз болон бусад өөрчлөлтийн хүчин зүйлсийг хангаж чаддаг бүрэн эрхтнүүдийг хамардаг боловч зүрхний хэсгүүд нь стресс, гэмтлийн хариуд фиброз процессыг дуурайж чаддаг гэдгийг тэмдэглэх нь зүйтэй. миофибробластууд руу. Үүнийг өмнө нь зүрхний зүсмэлийн загварт үнэлсэн. Тахикарди, брадикарди, механик цусны эргэлтийн дэмжлэг (механик ачаалалгүй зүрх) зэрэг олон нөхцлийг дуурайлган CTCM параметрүүдийг даралт/цахилгаан далайц, давтамжийг өөрчлөх замаар өөрчилж болно гэдгийг тэмдэглэх нь зүйтэй. Энэ нь системийг эмийн шинжилгээнд дундаж хүчин чадалтай болгодог. Хэт ачааллаас үүдэлтэй зүрхний гипертрофийг загварчлах CTCM чадвар нь энэхүү системийг хувь хүнд тохирсон эмчилгээнд турших замыг нээж өгдөг. Эцэст нь хэлэхэд, энэхүү судалгаагаар механик суналт болон хошногын өдөөлт нь зүрхний эдийн хэсгүүдийн өсгөврийг хадгалахад чухал үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг харуулж байна.
Энд үзүүлсэн өгөгдөл нь CTCM нь бүрэн бүтэн миокардийг загварчлах маш ирээдүйтэй платформ гэдгийг харуулж байгаа боловч энэхүү өсгөврийн арга нь зарим хязгаарлалттай. CTCM өсгөврийн гол хязгаарлалт нь зүсмэлүүдэд тасралтгүй динамик механик стресс үүсгэдэг бөгөөд энэ нь мөчлөг бүрийн үед зүрхний зүсмэлийн агшилтыг идэвхтэй хянах боломжийг олгодоггүй явдал юм. Үүнээс гадна, зүрхний хэсгүүдийн жижиг хэмжээ (7 мм)-ээс шалтгаалан уламжлалт хүчний мэдрэгч ашиглан өсгөврийн системээс гадуур систолын үйл ажиллагааг үнэлэх чадвар хязгаарлагдмал байдаг. Одоогийн гар бичмэлд бид оптик хүчдэлийг агшилтын үйл ажиллагааны үзүүлэлт болгон үнэлснээр энэ хязгаарлалтыг хэсэгчлэн даван туулсан. Гэсэн хэдий ч энэ хязгаарлалт нь цаашид ажиллах шаардлагатай бөгөөд ирээдүйд кальци болон хүчдэлд мэдрэмтгий будагч бодис ашиглан оптик зураглал хийх зэрэг өсгөврийн үед зүрхний зүсмэлийн үйл ажиллагааг оптик хянах аргуудыг нэвтрүүлснээр шийдвэрлэгдэж магадгүй юм. CTCM-ийн өөр нэг хязгаарлалт нь ажлын загвар нь физиологийн стрессийг (урьдчилсан ачаалал ба дараах ачааллыг) зохицуулдаггүй явдал юм. CTCM-д маш том эдэд диастол (бүрэн суналт) болон систол (цахилгаан өдөөлтийн үед агшилтын урт)-д 25% физиологийн суналтыг бий болгохын тулд эсрэг чиглэлд даралтыг өдөөсөн. Энэхүү хязгаарлалтыг ирээдүйн CTCM загваруудад зүрхний эдэд хоёр талаас хангалттай даралт өгөх, мөн зүрхний тасалгаануудад үүсдэг даралт-эзэлхүүний яг нарийн хамаарлыг хэрэгжүүлэх замаар арилгах хэрэгтэй.
Энэхүү гар бичмэлд дурдсан хэт суналтаас үүдэлтэй өөрчлөлт нь гипертрофик гипер суналтын дохиог дуурайлган хязгаарлагддаг. Тиймээс энэхүү загвар нь шингэний болон мэдрэлийн хүчин зүйлс (энэ системд байдаггүй) шаардлагагүйгээр суналтаас үүдэлтэй гипертрофик дохиоллыг судлахад тусалж чадна. CTCM-ийн олон талт байдлыг нэмэгдүүлэхийн тулд цаашид судалгаа хийх шаардлагатай байна, жишээлбэл, дархлааны эсүүдтэй хамт өсгөвөрлөх, цусны эргэлтийн шингэний хүчин зүйлс, мэдрэлийн эсүүдтэй хамт өсгөвөрлөх үед иннерваци хийх нь CTCM-ээр өвчний загварчлалын боломжийг сайжруулна.
Энэхүү судалгаанд арван гурван гахай ашигласан. Амьтны бүх процедурыг байгууллагын удирдамжийн дагуу гүйцэтгэсэн бөгөөд Луисвиллийн Их Сургуулийн Амьтныг арчлах, ашиглах хорооноос баталсан. Аортын нуман хаалгыг хавчаараар бэхлээд зүрхэнд 1 литр ариутгасан кардиоплеги (110 мМ NaCl, 1.2 мМ CaCl2, 16 мМ KCl, 16 мМ MgCl2, 10 мМ NaHCO3, 5 U/мл гепарин, рН нь 7.4 хүртэл)-аар нэвт шингэлсэн; Зүрхийг мөстэй хүйтэн кардиоплегик уусмалд хадгалж, лабораторид мөсөн дээр тээвэрлэх хүртэл хадгалсан бөгөөд энэ нь ихэвчлэн <10 минут үргэлжилдэг. Зүрхийг мөстэй хүйтэн кардиоплегик уусмалд хадгалж, лабораторид мөсөн дээр тээвэрлэх хүртэл хадгалсан бөгөөд энэ нь ихэвчлэн <10 минут үргэлжилдэг. сердца хранили в ледяном кардиоплегическом расстворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. Зүрхийг мөстэй хүйтэн кардиоплегик уусмалд хадгалж, лабораторид мөсөн дээр тээвэрлэсэн бөгөөд энэ нь ихэвчлэн <10 минут үргэлжилдэг.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10刂钟将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中，直到冰上运送到实验室，通常<10刂钟 Держите сердца в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Кардиоплегийн үед зүрхийг мөсөн дээр, ихэвчлэн <10 минут, лабораторид хүргэх хүртэл байлгана.
CTCM төхөөрөмжийг SolidWorks компьютерийн тусламжтай дизайн (CAD) програм хангамж дээр боловсруулсан. Өсгөвөрлөх камер, хуваагч болон агаарын камерууд нь CNC тунгалаг нийлэг хуванцараар хийгдсэн. 7 мм диаметртэй нөөц цагираг нь төв хэсэгтээ өндөр нягтралтай полиэтилен (HDPE)-ээр хийгдсэн бөгөөд доорх орчныг битүүмжлэхэд ашигладаг силикон цагирагыг байрлуулахын тулд O-цагирагтай ховилтой. Нимгэн цахиурын мембран нь өсгөвөрлөх камерыг тусгаарлах хавтангаас тусгаарладаг. Силикон мембраныг 0.02 инчийн зузаантай силикон хуудаснаас лазераар зүссэн бөгөөд 35А хатуулагтай. Доод ба дээд силикон жийргэвчийг 1/16 инчийн зузаантай силикон хуудаснаас лазераар зүссэн бөгөөд 50А хатуулагтай. Блокийг бэхлэх, агаар нэвтрэхгүй битүүмжлэл үүсгэхийн тулд 316L зэвэрдэггүй ган эрэг болон далавчны самар ашигладаг.
Тусгай хэвлэмэл хэлхээний самбар (PCB)-г C-PACE-EM системтэй нэгтгэхээр зохион бүтээсэн. Хэвлэмэл хэлхээний самбар дээрх Швейцарийн машины холбогч залгууруудыг мөнгөн бүрсэн зэс утас болон электродуудад шургуулсан хүрэл 0-60 боолтоор бал чулуун электродуудтай холбосон. Хэвлэмэл хэлхээний самбарыг 3D хэвлэгчийн таганд байрлуулсан.
CTCM төхөөрөмжийг зүрхний мөчлөгтэй төстэй хяналттай цусны эргэлтийн даралтыг бий болгодог програмчлагдах хийн идэвхжүүлэгч (PPD) удирддаг. Агаарын камер доторх даралт нэмэгдэхийн хэрээр уян хатан силикон мембран дээшээ тэлж, орчныг эдийн хэсгийн доор шахдаг. Дараа нь эдийн хэсэг нь шингэний энэхүү гадагшлуулалтаар сунаж, диастолын үед зүрхний физиологийн тэлэлтийг дуурайдаг. Амрах оргил үед графит электродоор дамжуулан цахилгаан өдөөлтийг хэрэглэсэн бөгөөд энэ нь агаарын камер дахь даралтыг бууруулж, эдийн хэсгүүдийн агшилтыг үүсгэсэн. Хоолойн дотор агаарын систем дэх даралтыг илрүүлэх даралтын мэдрэгч бүхий гемостатик хавхлага байдаг. Даралтын мэдрэгчээр мэдэрсэн даралтыг зөөврийн компьютерт холбогдсон өгөгдөл цуглуулагчид өгдөг. Энэ нь хийн камер доторх даралтыг тасралтгүй хянах боломжийг олгодог. Хамгийн их камерны даралтад (стандарт 80 мм м.у.б, 140 мм м.у.б OS) хүрэхэд өгөгдөл цуглуулах төхөөрөмжид C-PACE-EM систем рүү дохио илгээж, 4 В-д тохируулсан 2 мс-ийн турш хоёр фазын хүчдэлийн дохио үүсгэхийг тушаасан.
Зүрхний зүслэгүүдийг авч, 6 нүхэнд өсгөврийн нөхцөлийг дараах байдлаар гүйцэтгэсэн: Хурааж авсан зүрхийг шилжүүлэх савнаас хүйтэн (4°C) кардиоплеги агуулсан тавиур руу шилжүүлнэ. Зүүн ховдолыг ариутгасан ирээр тусгаарлаж, 1-2 см3 хэмжээтэй хэсэг болгон хуваана. Эдгээр эдийн блокуудыг эдийн наалдамхай бодисоор эдийн тулгуурт бэхлээд Тиродын уусмал агуулсан чичиргээт микротом эдийн ваннд хийж, тасралтгүй хүчилтөрөгчөөр баяжуулна (3 г/л 2,3-бутандион монооксим (BDM), 140 мМ NaCl (8.18 г) ), 6 мМ KCl (0.447 г), 10 мМ D-глюкоз (1.86 г), 10 мМ HEPES (2.38 г), 1 мМ MgCl2 (1 мл 1 М уусмал), 1.8 мМ CaCl2 (1.8 мл 1 М уусмал), 1 л ddH2O хүртэл). Чичиргээт микротомыг 80 Гц давтамжтай, 2 мм хэвтээ чичиргээний далайцтай, 0.03 мм/с урагшлах хурдтайгаар 300 мкм зузаантай зүсмэлүүдийг зүсэхээр тохируулсан. Уусмалыг сэрүүн байлгахын тулд эд эсийн ванныг мөсөөр хүрээлж, температурыг 4°C-д хадгалсан. Нэг өсгөврийн хавтан дээр хангалттай хэсэг гартал микротом ваннаас эд эсийн хэсгүүдийг мөсөн дээр тасралтгүй хүчилтөрөгчөөр баяжуулсан Тиродын уусмал агуулсан инкубацийн ванн руу шилжүүлнэ. Трансвелл өсгөврийн хувьд эд эсийн хэсгүүдийг ариутгасан 6 мм өргөн полиуретан тулгуурт бэхлээд 6 мл оновчтой орчинд (199 тэжээл, 1x ITS нэмэлт, 10% FBS, 5 нг/мл VEGF, 10 нг/мл FGF-шүлтлэг болон 2X антибиотик-мөөгөнцрийн эсрэг) байрлуулсан. C-Pace-ээр дамжуулан эдийн хэсгүүдэд цахилгаан өдөөлт (10 В, давтамж 1.2 Гц) хэрэглэсэн. TD нөхцөлд шинэхэн T3 болон Dex-ийг орчин солих бүрт 100 нМ ба 1 μM-д нэмсэн. Орчныг өдөрт 3 удаа солихоос өмнө хүчилтөрөгчөөр ханасан байна. Эдийн хэсгүүдийг 37°C температурт, 5% CO2-т инкубаторт өсгөвөрлөв.
CTCM өсгөврийн хувьд эдийн хэсгүүдийг өөрчилсөн Тиродын уусмал агуулсан Петрийн аяганд захиалгаар хийсэн 3D хэвлэгч дээр байрлуулсан. Төхөөрөмж нь зүрхний зүсмэлийн хэмжээг тулгуур цагирагны талбайн 25%-иар нэмэгдүүлэх зориулалттай. Үүнийг Тиродын уусмалаас орчинд шилжүүлсний дараа болон диастолын үед зүрхний хэсгүүд сунахгүйн тулд хийдэг. Гистоакрилийн цавуу ашиглан 300 мкм зузаантай хэсгүүдийг 7 мм диаметртэй тулгуур цагираг дээр бэхэлсэн. Эдийн хэсгүүдийг тулгуур цагирагт бэхлэсний дараа илүүдэл эдийн хэсгүүдийг тасдаж, нэг төхөөрөмжид хангалттай хэсгүүд бэлтгэгдэх хүртэл хавсаргасан эдийн хэсгүүдийг мөсөн дээр (4°C) Тиродын уусмалын ваннд буцааж хийнэ. Бүх төхөөрөмжийн нийт боловсруулалтын хугацаа 2 цагаас хэтрэхгүй байх ёстой. 6 эдийн хэсгийг тулгуур цагирагтаа бэхэлсний дараа CTCM төхөөрөмжийг угсарсан. CTCM өсгөврийн камерыг 21 мл урьдчилан хүчилтөрөгчөөр дүүргэсэн орчингоор урьдчилан дүүргэсэн. Эдийн хэсгүүдийг өсгөврийн камер руу шилжүүлж, агаарын бөмбөлгийг пипеткээр болгоомжтой арилгана. Дараа нь эдийн хэсгийг нүх рүү чиглүүлж, зөөлөн дарна. Эцэст нь электродын тагийг төхөөрөмж дээр байрлуулж, төхөөрөмжийг инкубаторт шилжүүлнэ. Дараа нь CTCM-ийг агаарын хоолой болон C-PACE-EM системд холбоно. Хийн хөдөлгүүр нээгдэж, агаарын хавхлага нь CTCM-ийг нээнэ. C-PACE-EM системийг хоёр фазын хэмнэлтийн үед 1.2 Гц давтамжтайгаар 4 В хүчдэл өгөхөөр тохируулсан бөгөөд 2 мс-ийн турш хоёр фазын хэмнэлттэй байна. Электродууд дээр бал чулуу хуримтлагдахаас зайлсхийхийн тулд тэжээлийн орчинг өдөрт хоёр удаа, электродуудыг өдөрт нэг удаа сольсон. Шаардлагатай бол доор нь унасан агаарын бөмбөлгийг гадагшлуулахын тулд эдийн хэсгүүдийг өсгөврийн худгаас нь салгаж болно. MT эмчилгээний нөхцөлд тэжээлийн орчин солих бүрт T3/Dex-ийг 100 нМ T3 болон 1 μM Dex-ээр шинээр нэмж оруулсан. CTCM төхөөрөмжүүдийг 37°C температурт болон 5% CO2-т инкубаторт өсгөвөрлөв.
Зүрхний зүсмэлүүдийн сунгасан траекторийг авахын тулд тусгай камерын системийг боловсруулсан. Navitar Zoom 7000 18-108мм макро линзтэй (Navitar, Сан Франциско, Калифорни) SLR камер (Canon Rebel T7i, Canon, Токио, Япон) ашигласан. Орчныг шинэ орчноор сольсны дараа өрөөний температурт дүрслэлийг хийсэн. Камерыг 51° өнцгөөр байрлуулж, секундэд 30 кадраар видео бичлэг хийдэг. Эхлээд зүрхний зүсмэлүүдийн хөдөлгөөнийг тоон үзүүлэлтээр илэрхийлэхийн тулд нээлттэй эхийн програм хангамж (MUSCLEMOTION43)-ийг Image-J ашиглан ашигласан. Дуу чимээнээс зайлсхийхийн тулд зүрхний зүсмэлүүдийн цохилтын сонирхлын бүсийг тодорхойлохын тулд маскыг MATLAB (MathWorks, Natick, MA, USA) ашиглан бүтээсэн. Гараар сегментчилсэн маскуудыг кадрын дарааллын бүх зурагт хэрэглэж, дараа нь MUSCLEMOTION залгаас руу дамжуулдаг. Muscle Motion нь кадр бүрийн пикселийн дундаж эрчимийг ашиглан лавлагаа кадртай харьцуулахад хөдөлгөөнийг нь тоон үзүүлэлтээр илэрхийлдэг. Өгөгдлийг бичиж, шүүж, мөчлөгийн хугацааг тоон үзүүлэлтээр тодорхойлох, зүрхний мөчлөгийн үед эдийн суналтыг үнэлэхэд ашигласан. Бичсэн видеог нэгдүгээр эрэмбийн тэг фазын дижитал шүүлтүүр ашиглан боловсруулсан. Эдийн суналтыг (оргилоос оргил хүртэл) тоон үзүүлэлтээр тодорхойлохын тулд бичигдсэн дохионы оргил ба намыг ялгахын тулд оргилоос оргил хүртэлх шинжилгээг хийсэн. Үүнээс гадна, дохионы шилжилтийг арилгахын тулд 6-р эрэмбийн олон гишүүнтийг ашиглан чиг хандлагыг бууруулах ажлыг гүйцэтгэдэг. Дэлхийн эдийн хөдөлгөөн, мөчлөгийн хугацаа, сулрах хугацаа, агшилтын хугацааг тодорхойлохын тулд MATLAB дээр програмын кодыг боловсруулсан (Нэмэлт програмын код 44).
Механик суналтын үнэлгээнд зориулж бүтээсэн ижил видео бичлэгүүдийг ашиглан омог шинжилгээний хувьд бид эхлээд MUSCLEMOTION програм хангамжийн дагуу хөдөлгөөний оргилуудыг (хөдөлгөөний хамгийн өндөр (дээд) ба хамгийн бага (доод) цэгүүд) төлөөлсөн хоёр зургийг мөрдсөн. Дараа нь бид эдийн хэсгүүдийг сегментчилж, сегментчилсэн эдэд сүүдэрлэх алгоритмын хэлбэрийг хэрэглэсэн (Нэмэлт Зураг 2a). Сегментчилсэн эдийг дараа нь арван доод давхаргад хувааж, гадаргуу дээрх стрессийг дараах тэгшитгэлийг ашиглан тооцоолсон: Оомог = (Дээд-Доош)/Доош, энд Доош ба Доош нь даавууны дээд ба доод сүүдрээс хэлбэрийн зайг тус тус тооцоолсон (Нэмэлт Зураг 2b).
Зүрхний хэсгүүдийг 4%-ийн параформальдегидэд 48 цагийн турш бэхэлсэн. Бие даасан эдийг 10% ба 20%-ийн сахарозонд 1 цагийн турш хатааж, дараа нь 30%-ийн сахарозонд шөнийн турш хадгалсан. Дараа нь хэсгүүдийг оновчтой зүсэлтийн температурын нэгдэлд (OCT нэгдэл) хийж, изопентан/хуурай мөсний ваннд аажмаар хөлдөөсөн. OCT суулгацын блокуудыг салгах хүртэл -80 °C-д хадгална. Слайдуудыг 8 μм зузаантай хэсгүүд болгон бэлтгэсэн.
Зүрхний хэсгүүдээс OCT-г авахын тулд слайдуудыг 95°C-д халаах блок дээр 5 минут халаана. Слайд бүрт 1 мл PBS нэмээд өрөөний температурт 30 минут инкубаци хийж, дараа нь PBS-д 0.1% Triton-X-ийг өрөөний температурт 15 минут байлгаж хэсгүүдийг нэвт шингээнэ. Өвөрмөц бус эсрэгбие нь дээжинд холбогдохоос урьдчилан сэргийлэхийн тулд слайдуудад 1 мл 3% BSA уусмал нэмж, өрөөний температурт 1 цаг инкубаци хийнэ. Дараа нь BSA-г авч, слайдуудыг PBS-ээр угаана. Дээж бүрийг харандаагаар тэмдэглэнэ. Анхдагч эсрэгбие (1% BSA-д 1:200 шингэлсэн) (connexin 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) болон тропонин-T (Thermo Scientific; #MA5-12960)-ийг 90 минутын турш нэмж, дараа нь хулганы Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079)-ийн эсрэг хоёрдогч эсрэгбие (1% BSA-д 1:200 шингэлсэн), туулайн Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391)-ийн эсрэг нэмэлт 90 минутын турш нэмж оруулав. Бай будалтыг дэвсгэрээс ялгахын тулд бид зөвхөн хоёрдогч эсрэгбиеийг хяналтын хэлбэрээр ашигласан. Эцэст нь DAPI цөмийн будгийг нэмж, слайдуудыг vectashield (Vector Laboratories)-д байрлуулж, хумсны будагтай битүүмжилсэн. -x томруулалт) болон 40 дахин томруулалттай Keyence микроскопоор битүүмжилсэн.
WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464)-ийг PBS-д 5 мкг/мл-ийн уусмалаар WGA будалтанд ашиглаж, тасалгааны температурт 30 минутын турш тогтмол хэсгүүдэд түрхсэн. Дараа нь слайдуудыг PBS-ээр угааж, слайд бүрт Суданы хар өнгийг нэмж, 30 минутын турш инкубацид хийсэн. Дараа нь слайдуудыг PBS-ээр угааж, векташиелд суулгах тэжээлийг нэмсэн. Слайдыг Кейнсийн микроскопоор 40 дахин томруулалтаар дүрсэлсэн.
Дээр дурдсанчлан дээжээс OCT-г авсан. OCT-г авсны дараа слайдуудыг Буины уусмалд нэг шөнийн турш дүрнэ. Дараа нь слайдуудыг нэрмэл усаар 1 цагийн турш зайлж, дараа нь Бибрих зуун настын хүчлийн фуксин уусмалд 10 минут байлгана. Дараа нь слайдуудыг нэрмэл усаар угааж, 5% фосфомолибден/5% фосфовольфрамын хүчлийн уусмалд 10 минут байлгана. Угаалгүйгээр слайдуудыг анилин цэнхэр уусмал руу шууд 15 минутын турш шилжүүлнэ. Дараа нь слайдуудыг нэрмэл усаар угааж, 1% цууны хүчлийн уусмалд 2 минутын турш байрлуулна. Слайдыг 200 N этанолд хатааж, ксилол руу шилжүүлнэ. Будсан слайдуудыг 10 дахин томруулсан объектив бүхий Кейнсийн микроскоп ашиглан дүрслэн харуулсан. Фиброзын талбайн хувийг Кейнсийн анализатор програм хангамж ашиглан тоон үзүүлэлтээр тодорхойлсон.
CyQUANT™ MTT эсийн амьдрах чадварын шинжилгээ (Invitrogen, Carlsbad, CA), каталогийн дугаар V13154, үйлдвэрлэгчийн протоколын дагуу зарим өөрчлөлттэй. Ялангуяа MTT шинжилгээний явцад эдийн жигд хэмжээг хангахын тулд 6 мм диаметртэй мэс заслын цоолтуур ашигласан. Эдийг үйлдвэрлэгчийн протоколын дагуу MTT субстрат агуулсан 12 нүхтэй хавтангийн нүхэнд тус тусад нь байрлуулсан. Хэсгүүдийг 37°C-д 3 цагийн турш инкубацид оруулж, амьд эд нь MTT субстратыг нил ягаан формазан нэгдэл үүсгэн метаболизмд оруулдаг. MTT уусмалыг 1 мл DMSO-оор сольж, зүрхний хэсгүүдээс нил ягаан формазан гаргаж авахын тулд 37°C-д 15 минут инкубацид оруулна. Дээжийг 96 нүхтэй тунгалаг ёроолтой хавтангуудад DMSO-д 1:10 харьцаатай шингэлж, нил ягаан өнгөний эрчмийг 570 нм-т Cytation хавтан уншигч (BioTek) ашиглан хэмжсэн. Уншилтыг зүрхний зүсмэл бүрийн жинд тохируулан хэвийн болгосон.
Зүрхний зүсмэл орчныг өмнө нь тайлбарласны дагуу глюкозын ашиглалтын шинжилгээнд зориулж 1 μCi/мл [5-3H]-глюкоз (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA) агуулсан орчингоор сольсон. 4 цагийн турш инкубацийн дараа 100 µл 0.2 N HCl агуулсан нээлттэй микроцентрифугийн хоолойд 100 µл орчин нэмнэ. Дараа нь хоолойг 500 µл dH2O агуулсан сцинтилляцийн хоолойд хийж [3H]2O-г 37°C-д 72 цагийн турш ууршуулна. Дараа нь микроцентрифугийн хоолойг сцинтилляцийн хоолойноос гаргаж аваад 10 мл сцинтилляцийн шингэн нэмнэ. Сцинтилляцийн тооллогыг Tri-Carb 2900TR шингэн сцинтилляцийн анализатор (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA) ашиглан гүйцэтгэсэн. Дараа нь глюкозын хэрэглээг [5-3H]-глюкозын өвөрмөц идэвхжил, бүрэн бус тэнцвэрт байдал болон суурь, [5-3H]-г шошгогүй глюкоз болгон шингэлэх, сцинтилляцийн эсрэг үр ашгийг харгалзан тооцоолсон. Өгөгдлийг зүрхний хэсгүүдийн масстай хэвийн болгосон.
Тризолд эд эсийг нэгэн төрлийн болгосны дараа үйлдвэрлэгчийн протоколын дагуу Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 ашиглан зүрхний хэсгүүдээс РНХ-г ялгаж авсан. RNAsec номын санг бэлтгэх, дараалал тогтоох, өгөгдлийн шинжилгээг дараах байдлаар гүйцэтгэсэн:
РНХ-ийн санг бэлтгэхэд дээж тус бүрт 1 мкг РНХ ашигласан. Үйлдвэрлэгчийн зөвлөмжийн дагуу Illumina-д зориулсан NEBNext UltraTM РНХ-ийн номын сан бэлтгэх хэрэгсэл (NEB, АНУ) ашиглан дарааллын номын сангуудыг үүсгэсэн бөгөөд дээж бүрийн шинж чанарын дараалалд индекс кодуудыг нэмсэн. Товчхондоо, mRNA-г поли-Т олигонуклеотидтой холбогдсон соронзон бөмбөлгүүдийг ашиглан нийт РНХ-ээс цэвэршүүлсэн. NEBNext First Strand Sinthesis Reaction Buffer (5X)-д өндөр температурт хоёр валенттай катионуудыг ашиглан фрагментация хийдэг. Эхний хэлхээний кДНХ-г санамсаргүй гексамер праймер болон M-MuLV урвуу транскриптаза (RNase H-) ашиглан нийлэгжүүлсэн. Дараа нь хоёр дахь хэлхээний кДНХ-г ДНХ полимераза I болон RNase H ашиглан нийлэгжүүлдэг. Үлдсэн хэт хэсгүүдийг экзонуклеаза/полимеразын идэвхжилээр мохоо төгсгөл болгон хувиргадаг. ДНХ-ийн хэлтэрхийн 3' төгсгөлийг аденилжүүлсний дараа эрлийзжүүлэхэд бэлтгэхийн тулд үсний хавчаартай гогцоо бүтэцтэй NEBNext адаптерийг холбодог. 150-200 бп урттай кДНХ-ийн хэсгүүдийг сонгохын тулд номын сангийн хэсгүүдийг AMPure XP систем (Бекман Коултер, Беверли, АНУ) ашиглан цэвэршүүлсэн. Дараа нь PCR-ийн өмнө адаптераар холбосон хэмжээтэй кДНХ бүхий 3 мкл USER фермент (NEB, АНУ)-ийг 37°C-д 15 минут, дараа нь 95°C-д 5 минут ашигласан. Дараа нь PCR-ийг Phusion High-Fidelity ДНХ полимераза, универсал PCR праймер, болон Index (X) праймер ашиглан гүйцэтгэсэн. Эцэст нь PCR бүтээгдэхүүнийг цэвэршүүлж (AMPure XP систем), номын сангийн чанарыг Agilent Bioanalyzer 2100 систем дээр үнэлсэн. Дараа нь кДНХ-ийн санг Novaseq дарааллын төхөөрөмж ашиглан дараалалд оруулсан. Illumina-аас авсан түүхий зургийн файлуудыг CASAVA Base Calling ашиглан түүхий уншилт болгон хөрвүүлсэн. Түүхий өгөгдлийг уншилтын дараалал болон харгалзах үндсэн чанарыг агуулсан FASTQ(fq) форматын файлуудад хадгалдаг. Шүүлтүүртэй дарааллын уншилтыг Sscrofa11.1 лавлагаа геномтой тохируулахын тулд HISAT2-г сонгоно уу. Ерөнхийдөө HISAT2 нь 4 тэрбум баазаас том геномуудыг оролцуулан ямар ч хэмжээтэй геномыг дэмждэг бөгөөд ихэнх параметрүүдэд анхдагч утгыг тохируулдаг. РНХ-ийн дарааллын өгөгдлөөс залгах уншилтыг одоогоор хамгийн хурдан систем болох HISAT2 ашиглан бусад аргуудтай ижил эсвэл илүү нарийвчлалтайгаар үр дүнтэй уялдуулж болно.
Транскрипцийн элбэг дэлбэг байдал нь генийн илэрхийлэлийн түвшинг шууд тусгадаг. Генийн илэрхийллийн түвшинг геном эсвэл экзонтой холбоотой транскрипцийн элбэг дэлбэг байдал (дарааллын тоо)-оор үнэлдэг. Уншлагын тоо нь генийн илэрхийллийн түвшин, генийн урт, дарааллын гүнтэй пропорциональ байна. FPKM (сая суурь хос тутамд дараалсан транскрипцийн мянган суурь хос тутамд ногдох хэлтэрхий)-ийг тооцоолж, дифференциал илэрхийллийн P-утгыг DESeq2 багц ашиглан тодорхойлсон. Дараа нь бид суурилуулсан R-функц болох "p.adjust" дээр үндэслэн Бенжамини-Хохбергийн аргыг9 ашиглан P утга бүрийн хуурамч нээлтийн түвшинг (FDR) тооцоолсон.
Зүрхний хэсгүүдээс ялгасан РНХ-г Thermo (Thermo, cat. no. 11756050)-ийн SuperScript IV Vilo Master mix ашиглан 200 нг/мкл концентрацитайгаар кДНХ болгон хувиргасан. Тоон RT-PCR-ийг Applied Biosystems Endura Plate Microamp 384 худагтай тунгалаг урвалын хавтан (Thermo, cat. no. 4483319) болон микроампер оптик цавуу (Thermo, cat. no. 4311971) ашиглан гүйцэтгэсэн. Урвалын холимог нь 5 µl Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, cat # 4444557), 0.5 µl Taqman Primer болон худаг тус бүрт 3.5 µl H2O холимогоос бүрдсэн. Стандарт qPCR циклийг ажиллуулж, CT утгыг Applied Biosystems Quantstudio 5 бодит цагийн PCR багаж (384 худагтай модуль; бүтээгдэхүүн # A28135) ашиглан хэмжсэн. Такманы праймеруудыг Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1)-ээс худалдан авсан. Бүх дээжийн CT утгыг GAPDH гэрийн ажил эрхлэлтийн генд хэвийн болгосон.
NT-ProBNP-ийн хэвлэл мэдээллийн хэрэгслээр гарсан хувилбарыг үйлдвэрлэгчийн протоколын дагуу NT-ProBNP иж бүрдэл (гахай) (Ангилал № MBS2086979, MyBioSource) ашиглан үнэлсэн. Товчхондоо, дээж болон стандарт тус бүрээс 250 µл-ийг худаг бүрт давхардсан байдлаар нэмсэн. Дээжийг нэмсний дараа шууд худаг бүрт 50 µл А шинжилгээний урвалж нэмнэ. Хавтанг зөөлөн сэгсэрч, чигжээсээр битүүмжилнэ. Дараа нь шахмалуудыг 37°C-д 1 цагийн турш инкубацид оруулна. Дараа нь уусмалыг соруулж, худгуудыг 350 µл 1X угаалгын уусмалаар 4 удаа угааж, угаах уусмалыг тус бүр 1-2 минут инкубацид оруулна. Дараа нь худаг бүрт 100 µл В шинжилгээний урвалж нэмж, хавтангийн чигжээсээр битүүмжилнэ. Шахмалыг зөөлөн сэгсэрч, 37°C-д 30 минутын турш инкубацид оруулна. Уусмалыг соруулж, худгуудыг 350 µл 1X угаалгын уусмалаар 5 удаа угаана. Худаг бүрт 90 µл субстратын уусмал нэмж, хавтанг битүүмжилнэ. Хавтанг 37°C-д 10-20 минут инкубацлана. Худаг бүрт 50 µл Stop уусмал нэмнэ. Хавтанг 450 нм-д суурилуулсан Cytation (BioTek) хавтан уншигч ашиглан нэн даруй хэмжсэн.
Параметрийн 10%-ийн үнэмлэхүй өөрчлөлтийг илрүүлэх 80%-иас дээш чадлын бүлгийг сонгохын тулд чадлын шинжилгээг хийсэн бөгөөд энэ нь 5%-ийн I хэлбэрийн алдааны түвшинтэй байна. Параметрийн 10%-ийн үнэмлэхүй өөрчлөлтийг илрүүлэх 80%-иас дээш чадлын бүлгийг сонгохын тулд чадлын шинжилгээг хийсэн бөгөөд энэ нь 5%-ийн I хэлбэрийн алдааны түвшинтэй байна. Анализ мощности был выполнен для выбора размеров групп, которые обеспечат >80% мощности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметра с 5% частотой ошибок төрөл I. I хэлбэрийн алдааны түвшин 5%, абсолют параметрийн өөрчлөлтийг 10%-иар илрүүлэх >80%-ийн чадал өгөх бүлгийн хэмжээг сонгохын тулд чадлын шинжилгээ хийсэн.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Выбора размера группын хувьд боломжтой анализ хийх боломжтой, 10% абсолютного задралын параметров ба 5% частоты ошибок төрлийн I-ийн хувьд > 80% мощности. 10%-ийн абсолют параметрийн өөрчлөлт болон 5%-ийн I хэлбэрийн алдааны түвшинг илрүүлэхийн тулд >80%-ийн чадал өгөх бүлгийн хэмжээг сонгохын тулд чадлын шинжилгээ хийсэн.Туршилтын өмнө эдийн хэсгүүдийг санамсаргүй байдлаар сонгосон. Бүх шинжилгээг нөхцөлт бус аргаар хийсэн бөгөөд дээжийг бүх өгөгдлийг шинжилсний дараа л декодлосон. Бүх статистик шинжилгээг хийхэд GraphPad Prism програм хангамж (Сан Диего, Калифорни) ашигласан. Бүх статистикийн хувьд p-утгыг <0.05 утгатай үед ач холбогдолтой гэж үзсэн. Бүх статистикийн хувьд p-утгыг <0.05 утгатай үед ач холбогдолтой гэж үзсэн. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Бүх статистикийн хувьд p-утгыг <0.05 утгатай үед ач холбогдолтой гэж үзсэн.对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0.05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Бүх статистикийн хувьд p-утгыг <0.05 утгатай үед ач холбогдолтой гэж үзсэн.Хоёр талт Оюутны t-тестийг өгөгдөл дээр зөвхөн 2 харьцуулалттайгаар гүйцэтгэсэн. Олон бүлгийн хоорондох ач холбогдлыг тодорхойлохын тулд нэг талт эсвэл хоёр талт ANOVA ашигласан. Post hoc тест хийхдээ олон харьцуулалтыг харгалзан Тукигийн залруулгыг ашигласан. Арга зүйн хэсэгт тайлбарласны дагуу FDR болон p.adjust-ийг тооцоолохдоо RNAsec өгөгдөл нь тусгай статистикийн ач холбогдолтой байдаг.
Судалгааны дизайны талаар дэлгэрэнгүй мэдээллийг энэ нийтлэлтэй холбоотой Байгалийн судалгааны тайлангийн товч агуулгыг үзнэ үү.