Спасибо за посещение сайта Nature.com. Версия вашего браузера имеет ограниченную поддержку CSS. Для наилучшего взаимодействия с сайтом мы рекомендуем использовать обновлённую версию браузера (или отключить режим совместимости в Internet Explorer). В настоящее время, для обеспечения дальнейшей поддержки, мы будем отображать сайт без стилей и JavaScript.
Существует потребность в надежной системе in vitro, способной точно воспроизводить физиологическую среду сердца для тестирования лекарственных препаратов. Ограниченная доступность систем культивирования тканей человеческого сердца приводит к неточным интерпретациям эффектов лекарственных препаратов на сердце. В данной работе мы разработали модель культивирования тканей сердца (CTCM), которая электромеханически стимулирует срезы сердца и подвергает их физиологическому растяжению во время систолической и диастолической фаз сердечного цикла. После 12 дней культивирования этот подход частично улучшил жизнеспособность срезов сердца, но не полностью сохранил их структурную целостность. Поэтому после скрининга малых молекул мы обнаружили, что добавление 100 нМ трийодтиронина (T3) и 1 мкМ дексаметазона (Dex) в нашу среду поддерживало микроструктуру срезов в течение 12 дней. В сочетании с обработкой T3/Dex система CTCM поддерживала транскрипционные профили, жизнеспособность, метаболическую активность и структурную целостность на том же уровне, что и свежая ткань сердца, в течение 12 дней. Кроме того, чрезмерное растяжение сердечной ткани в культуре вызывает гипертрофическую сердечную сигнализацию, что свидетельствует о способности CTCM имитировать гипертрофические состояния, вызванные растяжением сердца. В заключение, CTCM может моделировать физиологию и патофизиологию сердца в культуре в течение длительных периодов времени, что позволяет проводить надежный скрининг лекарственных препаратов.
Перед клиническими исследованиями необходимы надежные системы in vitro, способные точно воспроизводить физиологическую среду человеческого сердца. Такие системы должны имитировать измененное механическое растяжение, частоту сердечных сокращений и электрофизиологические свойства. Модели на животных обычно используются в качестве платформы для скрининга физиологии сердца, однако их надежность в отражении эффектов лекарственных препаратов на человеческом сердце ограничена1,2. В конечном итоге, идеальная экспериментальная модель культуры сердечной ткани (CTCM) — это модель, обладающая высокой чувствительностью и специфичностью к различным терапевтическим и фармакологическим вмешательствам, точно воспроизводящая физиологию и патофизиологию человеческого сердца3. Отсутствие такой системы ограничивает открытие новых методов лечения сердечной недостаточности4,5 и привело к тому, что кардиотоксичность лекарственных препаратов стала одной из основных причин ухода с рынка6.
За последнее десятилетие восемь некардиоваскулярных препаратов были сняты с клинического применения из-за того, что они вызывают удлинение интервала QT, приводящее к желудочковым аритмиям и внезапной смерти7. Таким образом, возрастает потребность в надежных стратегиях доклинического скрининга для оценки эффективности и токсичности в отношении сердечно-сосудистой системы. Недавнее использование кардиомиоцитов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPS-CM), в скрининге лекарственных препаратов и тестировании токсичности частично решает эту проблему. Однако незрелая природа hiPS-CM и отсутствие многоклеточной сложности сердечной ткани являются основными ограничениями этого метода. Недавние исследования показали, что это ограничение может быть частично преодолено путем использования ранних hiPS-CM для формирования гидрогелей сердечной ткани вскоре после начала спонтанных сокращений и постепенного увеличения электрической стимуляции с течением времени. Однако этим микротканям hiPS-CM не хватает зрелых электрофизиологических и сократительных свойств взрослого миокарда. Кроме того, сердечная ткань человека имеет более сложную структуру, состоящую из гетерогенной смеси различных типов клеток, включая эндотелиальные клетки, нейроны и стромальные фибробласты, соединенные между собой специфическими наборами белков внеклеточного матрикса. Эта гетерогенность популяций некардиомиоцитов11,12,13 в сердце взрослого млекопитающего является серьезным препятствием для моделирования сердечной ткани с использованием отдельных типов клеток. Эти существенные ограничения подчеркивают важность разработки методов культивирования интактной миокардиальной ткани в физиологических и патологических условиях.
Культивированные тонкие (300 мкм) срезы человеческого сердца оказались многообещающей моделью интактного миокарда человека. Этот метод обеспечивает доступ к полной трехмерной многоклеточной системе, аналогичной ткани человеческого сердца. Однако до 2019 года использование культивированных срезов сердца было ограничено коротким (24 ч) периодом выживания культуры. Это связано с рядом факторов, включая отсутствие физико-механического растяжения, границу раздела воздух-жидкость и использование простых сред, не отвечающих потребностям сердечной ткани. В 2019 году несколько исследовательских групп продемонстрировали, что включение механических факторов в системы культивирования сердечной ткани может продлить срок культивирования, улучшить экспрессию сердечных клеток и имитировать патологию сердца. Два изящных исследования 17 и 18 показывают, что одноосная механическая нагрузка оказывает положительное влияние на фенотип сердца во время культивирования. Однако в этих исследованиях не использовалась динамическая трехмерная физико-механическая нагрузка сердечного цикла, поскольку срезы сердца нагружались либо изометрическими растягивающими силами 17, либо линейной ауксотонической нагрузкой 18. Эти методы растяжения тканей приводили к подавлению многих сердечных генов или к сверхэкспрессии генов, связанных с аномальными реакциями на растяжение. В частности, Питулис и др. 19 разработали динамическую культуральную ванну для срезов сердца для реконструкции сердечного цикла с использованием обратной связи от датчика силы и приводов натяжения. Хотя эта система позволяет более точно моделировать сердечный цикл in vitro, сложность и низкая производительность метода ограничивают его применение. В нашей лаборатории недавно была разработана упрощенная система культивирования с использованием электрической стимуляции и оптимизированной среды для поддержания жизнеспособности срезов свиной и человеческой сердечной ткани в течение до 6 дней20,21.
В данной рукописи мы описываем модель культивирования сердечной ткани (КТС), использующую срезы свиного сердца, которая включает гуморальные сигналы для воспроизведения трехмерной физиологии сердца и патофизиологического растяжения во время сердечного цикла. Эта КТС может повысить точность доклинического прогнозирования лекарственных препаратов до уровня, ранее недостижимого, предоставляя экономически эффективную, среднепроизводительную систему для исследования сердца, имитирующую физиологию/патофизиологию сердца млекопитающих для доклинических испытаний лекарственных препаратов.
Гемодинамические механические сигналы играют решающую роль в поддержании функции кардиомиоцитов in vitro 22,23,24. В данной работе мы разработали систему культивирования тканей (CTCM) (рис. 1a), которая может имитировать сердечную среду взрослого человека, вызывая как электрическую, так и механическую стимуляцию на физиологических частотах (1,2 Гц, 72 удара в минуту). Чтобы избежать чрезмерного растяжения ткани во время диастолы, для увеличения размера ткани на 25% использовалось устройство 3D-печати (рис. 1b). Электрическая стимуляция, создаваемая системой C-PACE, начиналась за 100 мс до систолы с помощью системы сбора данных, что позволяло полностью воспроизвести сердечный цикл. Система культивирования тканей использует программируемый пневматический привод (LB Engineering, Германия) для циклического расширения гибкой силиконовой мембраны, вызывая расширение срезов сердца в верхней камере. Система была подключена к внешней воздушной линии через датчик давления, что позволяло точно регулировать давление (± 1 мм рт. ст.) и время (± 1 мс) (рис. 1c).
a Прикрепите срез ткани к опорному кольцу диаметром 7 мм, показанному синим цветом, внутри культуральной камеры устройства. Культуральная камера отделена от воздушной камеры тонкой гибкой силиконовой мембраной. Поместите прокладку между каждой камерой для предотвращения утечек. Крышка устройства содержит графитовые электроды, обеспечивающие электрическую стимуляцию. b Схематическое изображение большого устройства для культивирования тканей, направляющего кольца и опорного кольца. Срезы ткани (коричневого цвета) помещаются на устройство увеличенного размера, при этом направляющее кольцо располагается в канавке на внешнем крае устройства. Используя направляющую, аккуратно поместите опорное кольцо, покрытое акриловым клеем для тканей, на срез сердечной ткани. c График, показывающий время электрической стимуляции в зависимости от давления в воздушной камере, управляемого программируемым пневматическим приводом (PPD). Для синхронизации электрической стимуляции с помощью датчиков давления использовалось устройство сбора данных. Когда давление в культуральной камере достигает установленного порогового значения, импульсный сигнал отправляется в C-PACE-EM для запуска электрической стимуляции. d Изображение четырех CTCM, размещенных на полке инкубатора. К одному устройству PPD через пневматическую цепь подключены четыре прибора, а в гемостатический клапан вставлены датчики давления для контроля давления в пневматической цепи. Каждое устройство содержит шесть срезов ткани.
Используя один пневматический привод, мы смогли управлять четырьмя устройствами CTCM, каждое из которых могло вмещать шесть срезов ткани (рис. 1d). В CTCM давление воздуха в воздушной камере преобразуется в синхронное давление в жидкостной камере и вызывает физиологическое расширение среза сердца (рис. 2a и дополнительное видео 1). Оценка растяжения ткани при давлении 80 мм рт. ст. показала растяжение срезов ткани на 25% (рис. 2b). Было показано, что этот процент растяжения соответствует физиологической длине саркомера 2,2–2,3 мкм для нормальной сократительной способности среза сердца17,19,25. Движение ткани оценивалось с использованием пользовательских настроек камеры (дополнительный рисунок 1). Амплитуда и скорость движения ткани (рис. 2c, d) соответствовали растяжению во время сердечного цикла и времени во время систолы и диастолы (рис. 2b). Растяжение и скорость сердечной ткани во время сокращения и расслабления оставались постоянными в течение 12 дней в культуре (рис. 2f). Для оценки влияния электрической стимуляции на сократительную способность в культуре мы разработали метод определения активной деформации с использованием алгоритма затенения (дополнительный рис. 2a,b) и смогли различить деформации с электрической стимуляцией и без нее. Тот же участок сердца (рис. 2f). В подвижной области разреза (R6-9) напряжение во время электрической стимуляции было на 20% выше, чем в отсутствие электрической стимуляции, что указывает на вклад электрической стимуляции в сократительную функцию.
(a) Типичные графики изменения давления в воздушной камере, давления в жидкостной камере и измерений движения ткани подтверждают, что изменение давления в камере приводит к изменению давления в жидкостной камере, вызывая соответствующее движение среза ткани. b) Типичные графики процентного растяжения (синий) срезов ткани, соответствующие процентному растяжению (оранжевый). c) Измеренное движение среза сердца соответствует измеренной скорости движения. (d) Типичные траектории циклического движения (синяя линия) и скорости (оранжевая пунктирная линия) в срезе сердца. e) Количественная оценка времени цикла (n = 19 срезов на группу, от разных свиней), времени сокращения (n = 19 срезов на группу), времени расслабления (n = 19 срезов на группу, от разных свиней), движения ткани (n = 25 срезов/группа от разных свиней), пиковой систолической скорости (n = 24 (D0), 25 (D12) срезов/группа от разных свиней) и пиковой скорости расслабления (n = 24 (D0), 25 (D12) срезов/группа от разных свиней). Двусторонний t-тест Стьюдента не выявил значимых различий ни по одному из параметров. f Репрезентативные графики анализа деформации срезов ткани с электрической стимуляцией (красный) и без нее (синий), десять региональных областей срезов ткани из одного и того же участка. На нижних панелях показана количественная оценка процентной разницы деформации в срезах ткани с электрической стимуляцией и без нее в десяти областях из разных участков. (n = 8 срезов/группа от разных свиней, проведен двухсторонний t-тест Стьюдента; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группа от разных свиней, проведен двухсторонний t-тест Стьюдента; ****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу от разных свиней, проведен двусторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). (n = 8 образцов/группа от разных свиней, двухсторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05). （n = 8 片/组, 来自不同的猪, 进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). （n = 8 片/组, 来自不同的猪, 进行双尾学生t 检验；****p < 0,0001, **p < 0,01, *p < 0,05). (n = 8 срезов/группу, от разных свиней, двусторонние критерии Стьюдента; ****p <0,0001, **p <0,01, *p <0,05). (n = 8 образцов/группа, от разных свиней, двухсторонний t-критерий Стьюдента; ****p<0,0001, **p<0,01, *p<0,05).Показаны средние значения ± стандартное отклонение.
В нашей предыдущей статической биомиметической системе культивирования срезов сердца [20, 21] мы поддерживали жизнеспособность, функцию и структурную целостность срезов сердца в течение 6 дней, применяя электрическую стимуляцию и оптимизируя состав среды. Однако через 10 дней эти показатели резко снизились. Мы будем ссылаться на срезы, культивированные в нашей предыдущей статической биомиметической системе культивирования [20, 21], в контрольных условиях (Ctrl), а в качестве условий MC будем использовать нашу ранее оптимизированную среду, а также культивирование при одновременной механической и электрической стимуляции (CTCM). Во-первых, мы определили, что механической стимуляции без электрической стимуляции недостаточно для поддержания жизнеспособности ткани в течение 6 дней (дополнительный рис. 3a,b). Интересно, что при введении физиомеханической и электрической стимуляции с использованием STCM жизнеспособность 12-дневных срезов сердца оставалась такой же, как и у свежих срезов сердца в условиях MS, но не в условиях Ctrl, как показано анализом MTT (рис. 1). 3a). Это позволяет предположить, что механическая стимуляция и имитация сердечного цикла могут поддерживать жизнеспособность срезов ткани в два раза дольше, чем сообщалось в нашей предыдущей системе статической культуры. Однако оценка структурной целостности срезов ткани с помощью иммуномечения сердечного тропонина Т и коннексина 43 показала, что экспрессия коннексина 43 была значительно выше в тканях MC на 12-й день, чем в контрольных образцах в тот же день. Тем не менее, равномерная экспрессия коннексина 43 и образование Z-дисков не были полностью сохранены (рис. 3b). Мы используем систему искусственного интеллекта (ИИ) для количественной оценки структурной целостности ткани26, основанную на глубоком обучении на основе изображений с использованием окрашивания тропонином-Т и коннексином43, для автоматической количественной оценки структурной целостности и флуоресценции срезов сердца с точки зрения силы локализации. Этот метод использует сверточную нейронную сеть (CNN) и систему глубокого обучения для надежной количественной оценки структурной целостности сердечной ткани автоматизированным и непредвзятым образом, как описано в ссылке. 26. Ткань MC продемонстрировала улучшенное структурное сходство с нулевым днем ​​по сравнению со статическими контрольными срезами. Кроме того, окрашивание по Массону выявило значительно меньший процент фиброза в условиях MS по сравнению с контрольными условиями на 12-й день культивирования (рис. 3c). Хотя CTCM повысил жизнеспособность срезов сердечной ткани на 12-й день до уровня, аналогичного свежей сердечной ткани, он не привел к значительному улучшению структурной целостности срезов сердца.
a) Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности MTT свежих срезов сердца (D0) или срезов сердца, культивируемых в течение 12 дней либо в статической культуре (D12 Ctrl), либо в CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) срезов/группа от разных свиней, проведен однофакторный дисперсионный анализ; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). a) Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности MTT свежих срезов сердца (D0) или срезов сердца, культивируемых в течение 12 дней либо в статической культуре (D12 Ctrl), либо в CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl), 12 (D12 MC) срезов/группа от разных свиней, проведен однофакторный дисперсионный анализ; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl).На гистограмме показана количественная оценка жизнеспособности свежих срезов сердца, выращенных методом МТТ (D0), или культуры срезов сердца в течение 12 дней либо в статической культуре (контроль D12), либо в культуре CTCM (контроль D12) (n = 18 (D0), 15 (контроль D12)), по 12 (контроль D12) срезов в каждой группе от разных свиней; проведен однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA);####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0)或心脏切片培养12, MTT (活力的量化), 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组, 进行单向ANOVA测试；与D0 相比，####p < 0,0001, 与D12 Ctrl 相比,**p < 0,01)。 a 条形图显示在静态培养(D12 Ctrl) 或CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl) 中新鲜心脏切片(D0) ，来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组,进行单向ANOVA 测试；与D0 相比，####p < 0,0001，与D12 Ctrl相比，**p。)Гистограмма, показывающая количественную оценку жизнеспособности MTT в свежих срезах сердца (D0) или срезах сердца, культивированных в течение 12 дней в статической культуре (D12 контроль) или CTCM (D12 MC) (n = 18 (D0), 15 (D12 контроль)), 12 (D12 MC) срезов/группа от разных свиней, однофакторный дисперсионный анализ;####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). ####p < 0,0001 по сравнению с D0, **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl).b) Тропонин-Т (зеленый), коннексин 43 (красный) и DAPI (синий) в свежевыделенных срезах сердца (D0) или срезах сердца, культивированных в статических условиях (Ctrl) или в условиях CTCM (MC) в течение 12 дней) на репрезентативных изображениях иммунофлуоресценции (масштаб пустого изображения = 100 мкм). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов в каждой группе от разных свиней, проведен однофакторный дисперсионный анализ; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов в каждой группе от разных свиней, проведен однофакторный дисперсионный анализ; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Количественная оценка структурной цепи сердца сердечной ткани искусственным интеллектом (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится однофакторный тест ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проведен однофакторный дисперсионный анализ; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl).人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп, каждый из разных свиней, однофакторный тест ANOVA;####p < 0,0001 与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。人工智能量化心脏组织结构完整性（n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезы/группа каждого из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001与D0相比，****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 Искусственный интеллект для количественной оценки структурной сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) срезов/групп каждой из разных свиней, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001 vs. D0 Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Искусственный интеллект для количественной оценки структурной целостности сердечной ткани (n = 7 (D0), 7 (D12 Ctrl), 5 (D12 MC) участков/группы для разных свиней, однофакторный дисперсионный анализ; ####p<0,0001 по сравнению с D0. Для сравнения ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). c. Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштаб без обертки = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа от разных свиней, проведен однофакторный дисперсионный анализ; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c. Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштаб без шкалы = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа от разных свиней, проведен однофакторный дисперсионный анализ; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштаб без покрытий = 500 мкм) (n = 10 срезов/группу от разных свиней, эффективность одностороннего теста ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c. Репрезентативные изображения (слева) и количественная оценка (справа) срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (непокрытая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа от разных свиней, проведен однофакторный дисперсионный анализ; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c 用Masson三色染料染色的心脏切片的代表性图像（左）和量化（右）（裸尺度= 500 мкм）（n = 10 个切片/组，每组来自不同的猪，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 C 用 mason 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 （左 左） 量化 （右） 裸尺度 裸尺度 裸尺度裸尺度 = 500 мкм） （n = 10 个 切片 组 每 组 来自 不同 猪 , 进行 单向 单向 Anova 测试；#### p < 0,0001 与D0 相比，***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (чистая шкала = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждая от другой свиньи, протестировано с помощью однофакторного дисперсионного анализа ;### #p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c. Репрезентативные изображения (слева) и количественный анализ (справа) срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (пустой образец = 500 мкм) (n = 10 срезов/группа, каждый от отдельной свиньи, проверено с помощью однофакторного дисперсионного анализа; ### # p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl).Показаны средние значения ± стандартное отклонение.
Мы предположили, что добавление малых молекул в культуральную среду может улучшить целостность кардиомиоцитов и снизить развитие фиброза во время культивирования кардиомиоцитов. Поэтому мы провели скрининг малых молекул, используя наши статические контрольные культуры20,21, из-за небольшого количества мешающих факторов. Для этого скрининга были выбраны дексаметазон (Dex), трийодтиронин (T3) и SB431542 (SB). Эти малые молекулы ранее использовались в культурах кардиомиоцитов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSC-CM), для индукции созревания кардиомиоцитов путем увеличения длины саркомеров, Т-трубочек и скорости проведения. Кроме того, известно, что как Dex (глюкокортикоид), так и SB подавляют воспаление29,30. Поэтому мы проверили, улучшит ли включение одной или нескольких из этих малых молекул структурную целостность срезов сердца. Для первоначального скрининга доза каждого соединения была выбрана на основе концентраций, обычно используемых в моделях клеточных культур (1 мкМ Dex27, 100 нМ T327 и 2,5 мкМ SB31). После 12 дней культивирования комбинация T3 и Dex привела к оптимальной структурной целостности кардиомиоцитов и минимальному фиброзному ремоделированию (дополнительные рисунки 4 и 5). Кроме того, использование удвоенных или вдвое больших концентраций T3 и Dex привело к неблагоприятным последствиям по сравнению с нормальными концентрациями (дополнительный рисунок 6a,b).
После первоначального скрининга мы провели прямое сравнение 4 условий культивирования (рис. 4a): Ctrl: срезы сердца, культивированные в ранее описанной нами статической культуре с использованием оптимизированной среды; TD: T3 и Ctrl с добавлением Dex в среду; MC: срезы сердца, культивированные в CTCM с использованием ранее оптимизированной среды; и MT: CTCM с добавлением T3 и Dex в среду. После 12 дней культивирования жизнеспособность тканей MS и MT оставалась такой же, как и у свежих тканей, оцененная с помощью анализа MTT (рис. 4b). Интересно, что добавление T3 и Dex в трансвелл-культуры (TD) не привело к значительному улучшению жизнеспособности по сравнению с условиями Ctrl, что указывает на важную роль механической стимуляции в поддержании жизнеспособности срезов сердца.
a. Схема экспериментального дизайна, изображающая четыре условия культивирования, использованные для оценки влияния механической стимуляции и добавления T3/Dex в среду в течение 12 дней. b. Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (Ctrl, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группа от разных свиней, проведен однофакторный дисперсионный анализ; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b. Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (Ctrl, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группа от разных свиней, проведен однофакторный дисперсионный анализ; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 ctrl). b Гистограмма показывает несколько показателей устойчивости через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению с последними срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/групп от разных свиней, проводится односторонний тест ANOVA; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b. Гистограмма показывает количественную оценку жизнеспособности через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), 12 (D12 MC) срезов/группа от разных свиней, однофакторный дисперсионный анализ; ####p < 0,0001, ###p < 0,001 по сравнению с D0 и **p < 0,01 по сравнению с D12 Ctrl). b 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) (n = 18 (D0)、15 (D12 Ctrl、D12 TD)和D12 MT), 来自不同猪的12 (D12 MC) 切片/组,进行单向ANOVA 测试；####p < 0,0001,###p < 0,001 与D0相比，**p < 0,01 与D12控制).b 4 12 (D12 MC) б Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению с последними срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней 12 (D12 MC) срезы/группы, односторонний тест ANOVA; ####p <0,0001, ###p <0,001 по сравнению с D0, **p <0,01 по сравнению с контролем D12). b. Гистограмма, показывающая все 4 условия культивирования (контроль, TD, MC и MT) в сравнении со свежими срезами сердца (D0) (n = 18 (D0), 15 (D12 Ctrl, D12 TD и D12 MT), от разных свиней, 12 (D12 MC) срезов/группа, однофакторный дисперсионный анализ; ####p<0.0001, ###p<0.001 по сравнению с D0, **p<0.01 по сравнению с контролем D12). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (Ctrl, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа от разных свиней, проведен однофакторный дисперсионный анализ; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (Ctrl, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа от разных свиней, проведен однофакторный дисперсионный анализ; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Гистограмма показывает несколько показанных показателей глюкозы через 12 дней после культивирования во всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению с последними резами сердца (D0) (n = 6 срезов/групп от разных свиней, одностороннее выполнение теста ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c Гистограмма показывает количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования при всех 4 условиях культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа от разных свиней, проведен однофакторный дисперсионный анализ; ###p < 0,001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 по сравнению с D12 Ctrl). c 条形图显示所有4 种培养条件（Ctrl、TD、MC 和MT）与新鲜心脏切片(D0) 相比，培养后12天的葡萄糖通量定量(n = 6 片/组,来自不同猪,单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001,与D0相比,***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 C 条形图 显示 所有 4 种 条件 （（ctrl 、 td 、 mc 和 mt） 新鲜 心脏 切片 切片 切片 相比 ,培养 后 后 12 天 的 通量 定量 （n = 6 片/组 ， 来自 猪 ， ， ， ， ， ， ， ， 猪猪单向执行ANOVA 测试；###p < 0,001, 与D0 相比,***p < 0,001 与D12 Ctrl 相比）。 c Гистограмма, показывающая количественную оценку уровня глюкозы через 12 дней после культивирования для всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению с последними срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/групп, от разных свиней, односторонние. Были проведены тесты ANOVA; ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с Д12 (контроль). c Гистограмма, показывающая количественную оценку потока глюкозы через 12 дней после культивирования для всех 4 условий культивирования (контроль, TD, MC и MT) по сравнению со свежими срезами сердца (D0) (n = 6 срезов/группа, от разных свиней, одностороннее культивирование). Где проводились тесты ANOVA, ###p < 0,001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 по сравнению с D12 (контроль).d. Диаграммы анализа штаммов свежих (синий), 12-дневных MC (зеленый) и 12-дневных MT (красный) тканей в десяти региональных точках среза ткани (n = 4 среза/группа, однофакторный дисперсионный анализ; существенной разницы между группами не было). e. Вулканическая диаграмма, показывающая дифференциально экспрессируемые гены в свежих срезах сердца (D0) по сравнению со срезами сердца, культивированными в статических условиях (Ctrl) или в условиях MT (MT) в течение 10-12 дней. f. Тепловая карта генов саркомеров для срезов сердца, культивированных в каждом из условий культивирования. Погрешности представлены как среднее значение ± стандартное отклонение.
Метаболическая зависимость от перехода от окисления жирных кислот к гликолизу является характерным признаком дедифференциации кардиомиоцитов. Незрелые кардиомиоциты преимущественно используют глюкозу для производства АТФ и имеют гипопластические митохондрии с небольшим количеством крист5,32. Анализ утилизации глюкозы показал, что в условиях MC и MT утилизация глюкозы была аналогична таковой в тканях нулевого дня (рис. 4c). Однако в контрольных образцах наблюдалось значительное увеличение утилизации глюкозы по сравнению со свежей тканью. Это указывает на то, что комбинация CTCM и T3/Dex повышает жизнеспособность ткани и сохраняет метаболический фенотип 12-дневных культивируемых срезов сердца. Кроме того, анализ деформации показал, что уровни деформации оставались такими же, как в свежей ткани сердца в течение 12 дней в условиях MT и MS (рис. 4d).
Для анализа общего влияния CTCM и T3/Dex на глобальный транскрипционный ландшафт ткани срезов сердца мы провели секвенирование РНК на срезах сердца из всех четырех различных условий культивирования (дополнительные данные 1). Интересно, что срезы MT показали высокое транскрипционное сходство со свежей тканью сердца, при этом из 13 642 генов дифференциально экспрессировались только 16. Однако, как мы показали ранее, в контрольных срезах после 10–12 дней культивирования наблюдалось 1229 дифференциально экспрессирующихся генов (рис. 4e). Эти данные были подтверждены количественной ПЦР в реальном времени генов сердца и фибробластов (дополнительные рис. 7a-c). Интересно, что в контрольных срезах наблюдалось снижение экспрессии генов сердца и клеточного цикла, а также активация программ воспалительных генов. Эти данные свидетельствуют о том, что дедифференциация, которая обычно происходит после длительного культивирования, полностью ослабляется в условиях MT (дополнительные рис. 8a,b). Тщательное изучение генов саркомера показало, что только в условиях MT сохраняются гены, кодирующие саркомер (рис. 4f) и ионный канал (дополнительный рис. 9), что защищает их от подавления в условиях Ctrl, TD и MC. Эти данные демонстрируют, что при сочетании механической и гуморальной стимуляции (T3/Dex) транскриптом срезов сердца может оставаться аналогичным транскриптому свежих срезов сердца после 12 дней культивирования.
Эти результаты транскрипционного анализа подтверждаются тем фактом, что структурная целостность кардиомиоцитов в срезах сердца лучше всего сохраняется в условиях механической стимуляции в течение 12 дней, что подтверждается наличием интактного и локализованного коннексина 43 (рис. 5а). Кроме того, фиброз в срезах сердца в условиях механической стимуляции был значительно снижен по сравнению с контрольной группой и аналогичен фиброзу в свежих срезах сердца (рис. 5б). Эти данные демонстрируют, что сочетание механической стимуляции и обработки Т3/дексаметазоном эффективно сохраняет структуру сердца в культивируемых срезах.
a. Репрезентативные изображения иммунофлуоресценции тропонина-Т (зеленый), коннексина 43 (красный) и DAPI (синий) в свежевыделенных срезах сердца (D0) или культивированных в течение 12 дней во всех четырех условиях культивирования срезов сердца (масштабная линейка = 100 мкм). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезов/группа от разных свиней, проведен однофакторный дисперсионный анализ; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05, или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезов/группа от разных свиней, проведен однофакторный дисперсионный анализ; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05, или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Количественная оценка структурной ДНК ткани сердца с помощью искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) срезов/групп от разных свиней, проведенный однофакторный тест ANOVA; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). Количественная оценка структурной целостности ткани сердца с использованием искусственного интеллекта (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) участков/групп от разных свиней, проведен однофакторный дисперсионный анализ; #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl).对不同猪的心脏组织结构完整性（n = 7（D0 和D12 Ctrl）、5（D12 TD、D12 MC 和D12 MT）切片/组）进行人工智能量化，进行单向ANOVA 测试；#### p < 0,0001 与D0 和*p < 0,05 相比, 或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。对 不同 猪 的 心脏 结构 完整性 （n = 7 （d0 和 d12 ctrl） （5 （d12 td 、 d12 mc 和 d12 mt） 组）相比，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。Количественная оценка структурной целостности сердечной ткани с использованием искусственного интеллекта на разных свиньях (n = 7 (D0 и D12 Ctrl), 5 (D12 TD, D12 MC и D12 MT) участков/группа) с помощью однофакторного дисперсионного анализа;#### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). #### p < 0,0001 по сравнению с D0 и *p < 0,05 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b) Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группа от разных свиней, проведен однофакторный дисперсионный анализ; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b) Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группа от разных свиней, проведен однофакторный дисперсионный анализ; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромным красителем Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группы от разных свиней, результаты одностороннего теста ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b) Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов/группа от разных свиней, проведен однофакторный дисперсионный анализ; ####p < 0,0001 по сравнению с D0 и ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b Массон 三色染料染色的心脏切片的代表性图像和量化（比例尺= 500 мкм）（n = 10（D0、D12 Ctrl、D12 TD 和D12 MC），来自不同猪的9 个（D12 MT）切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b 用 Masson 三 色 染料 的 心脏 切片 的 代表性 和 量化 （比例 尺 尺 尺 = 500 мкм） （n = 10 （d0 、 d12 ctrl, d12 td и d12 mc） 来自 不同 的 9 个 d12 mt 切片 切片 切片 切片 切片 不同 片 切片 切片фото 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片 切片/组，进行单因素方差分析；####p < 0,0001与D0 相比，***p < 0,001，或****p < 0,0001 与D12 Ctrl 相比）。 b Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней / групп, одно- метод ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl). b) Репрезентативные изображения и количественная оценка срезов сердца, окрашенных трихромом Массона (масштабная линейка = 500 мкм) (n = 10 (D0, D12 Ctrl, D12 TD и D12 MC), 9 (D12 MT) срезов от разных свиней/группы, один метод ANOVA; ####p < 0,0001 по сравнению с D0, ***p < 0,001 или ****p < 0,0001 по сравнению с D12 Ctrl).Показаны средние значения ± стандартное отклонение.
Наконец, способность CTCM имитировать гипертрофию сердца оценивалась путем увеличения растяжения сердечной ткани. В CTCM пиковое давление в воздушной камере увеличивалось с 80 мм рт. ст. до 80 мм рт. ст. (нормальное растяжение) до 140 мм рт. ст. (рис. 6а). Это соответствует увеличению растяжения на 32% (рис. 6б), что ранее было показано как соответствующий процент растяжения, необходимый для достижения срезами сердца длины саркомера, аналогичной той, которая наблюдается при гипертрофии. Растяжение и скорость сердечной ткани во время сокращения и расслабления оставались постоянными в течение шести дней культивирования (рис. 6с). Сердечная ткань в условиях MT подвергалась нормальному растяжению (MT (Normal)) или перерастяжению (MT (OS)) в течение шести дней. Уже через четыре дня культивирования уровень гипертрофического биомаркера NT-ProBNP значительно повышался в среде в условиях MT (OS) по сравнению с условиями MT (normal) (рис. 7а). Кроме того, после шести дней культивирования размер клеток в MT (OS) (рис. 7b) значительно увеличился по сравнению с участками сердца MT (норма). Также значительно увеличилась ядерная транслокация NFATC4 в перерастянутых тканях (рис. 7c). Эти результаты показывают прогрессирующее развитие патологического ремоделирования после гиперрастяжения и подтверждают концепцию, согласно которой устройство CTCM может использоваться в качестве платформы для изучения сигналов, вызывающих гипертрофию сердца, индуцированную растяжением.
Типичные графики давления в воздушной камере, давления в жидкостной камере и измерений движения ткани подтверждают, что изменение давления в камере приводит к изменению давления в жидкостной камере, вызывая соответствующее движение среза ткани. b Типичные кривые процента растяжения и скорости растяжения для нормально растянутых (оранжевый) и перерастянутых (синий) срезов ткани. c Гистограмма, показывающая время цикла (n = 19 срезов на группу, от разных свиней), время сокращения (n = 18-19 срезов на группу, от разных свиней), время расслабления (n = 19 срезов на группу, от разных свиней), амплитуду движения ткани (n = 14 срезов/группа, от разных свиней), пиковую систолическую скорость (n = 14 срезов/группа, от разных свиней) и пиковую скорость расслабления (n = 14 (D0), 15 (D6)) срезов/групп) от разных свиней. Двусторонний t-критерий Стьюдента показал отсутствие значимых различий по любому параметру, что указывает на то, что эти параметры оставались постоянными в течение 6 дней культивирования с перенапряжением. Показаны средние значения ± стандартное отклонение.
a. Гистограмма, показывающая количественную оценку концентрации NT-ProBNP в культуральной среде срезов сердца, культивируемых в условиях нормального растяжения (Norm) или чрезмерного растяжения (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm и D4 MTOS) среза/группа от разных свиней. Проведен двухфакторный дисперсионный анализ; **p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). a. Гистограмма, показывающая количественную оценку концентрации NT-ProBNP в культуральной среде срезов сердца, культивируемых в условиях нормального растяжения (Norm) или чрезмерного растяжения (OS) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm и D4 MTOS) среза/группа от разных свиней. Проведен двухфакторный дисперсионный анализ; **p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением).Количественная гистограмма концентрации NT-ProBNP в культуральной среде срезов сердца, культивированных в условиях нормального растяжения МТ (норма) или перерастяжения (перерастяжение) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm и D4 MTOS) срезов/группы от разных свиней, проведен двухфакторный дисперсионный анализ;**p < 0,01 по сравнению с нормальным питанием). **p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). a 在MT 正常拉伸(Norm) 或过度拉伸(OS) 条件下培养的心脏切片培养基中NT-ProBNP浓度的条形图量化（n = 4 (D2 MTNorm)、3（D2 MTOS、D4 MTNorm 和D4 MTOS）来自不同猪的切片/组，进行双向方差分析；**与正常拉伸相比,p < 0,01). a Количественная оценка концентрации NT-ProBNP в срезах сердца, культивированных в условиях нормального растяжения (норма) или перерастяжения (OS) MT (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm和D4 MTOS) из разных猪的切片/组，可以双向方方发发动 **по сравнению с нормальным растяжением, p <0,01).Гистограмма. Количественная оценка концентраций NT-ProBNP в срезах сердца, культивируемых в условиях нормального растяжения микротрубочек (норма) или чрезмерного растяжения (ЧР) (n = 4 (D2 MTNorm), 3 (D2 MTOS, D4 MTNorm) и D4 MTOS) срезов/группа от разных свиней, двухфакторный дисперсионный анализ;**p < 0,01 по сравнению с нормальным питанием). **p < 0,01 по сравнению с нормальным растяжением). b) Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и WGA (слева), и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группа из 10 разных срезов от разных свиней, проведен двухсторонний t-тест Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b) Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и WGA (слева), и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группа из 10 разных срезов от разных свиней. Проведен двухсторонний t-тест Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным растяжением). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и произвольного изменения размера клетки (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/групп из 10 разных срезов от разных свиней, два- проводятся хвостовой t-критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным определением. b) Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева), и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) клеток/группа из 10 различных срезов от разных свиней, был проведен двухсторонний t-тест Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным штаммом). b 用肌钙蛋白-T 和WGA（左）和细胞大小量化（右）染色的心脏切片的代表性图像（n = 330（D6 MTOS），来自不同猪的10 个不同切片的369（D6 MTNorm）细胞/组, 两进行有尾学生t 检验；与正常拉伸相比，****p < 0,0001）。 b) Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных калькареином-Т и WGA (слева), и размер клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 из 10 разных срезов (D6 MTNorm)). Клетки/группа, t-критерий для оценки размера клеток; по сравнению с нормальным растяжением, ****p < 0,0001). b Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева) и количественная величина размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней Клетки/группы, двузначные критерии Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным методом). b) Репрезентативные изображения срезов сердца, окрашенных тропонином-Т и АЗП (слева), и количественная оценка размера клеток (справа) (n = 330 (D6 MTOS), 369 (D6 MTNorm) из 10 различных срезов от разных свиней). Клетки/группа, двусторонний критерий Стьюдента; ****p < 0,0001 по сравнению с нормальным штаммом). c. Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0-й и 6-й день, иммуномеченных тропонином-Т и NFATC4, и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кардиомиоцитов (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) среза/группа от разных свиней, проведен двухсторонний t-тест Стьюдента; *p < 0,05). c. Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0-й и 6-й день, иммуномеченных тропонином-Т и NFATC4, и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кардиомиоцитов (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) среза/группа от разных свиней, проведен двухсторонний t-тест Стьюдента; *p < 0,05). c Репрезентативные изображения для срезов сердца 0 и 6 дней MTOS, иммуномеченых для тропонина-Т и NFATC4, а также количественная оценка транслокации NFATC4 в ядра кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срезов/групп от разных свиней, показатели двустороннего t-критерия Стьюдента; *p < 0,05). c) Репрезентативные изображения срезов сердца на 0 и 6 день после начала менструального цикла, иммуномеченных тропонином-Т и NFATC4, и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядре кавернозных клеток (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) среза/группа от разных свиней), проведенный двухсторонний t-тест Стьюдента; *p < 0,05). c 用于肌钙蛋白-T 和NFATC4 免疫标记的第0 天和第6 天MTOS NFATC4 CM 细胞核的量化（n = 4 (D0)、3 (D6 MTOS)切片/组, 进行双尾学生t 检验；*p < 0,05)。 c Репрезентативные изображения срезов сердца кальканина-Т и NFATC4, иммуномеченных 第0天和第6天MTOS, и NFATC4 из разных NFATC4 «количество ядер клеток CM» (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) 切礼/组,时间双尾学生et电影；*p < 0,05). c Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномаркировки тропонином-Т и NFATC4 и количественная оценка транслокации NFATC4 в ядре CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) срез/группа, двуххвостый t-критерий Стьюдента; *p < 0,05). c. Репрезентативные изображения срезов сердца MTOS на 0 и 6 день для иммуномечения тропонина-Т и NFATC4, а также количественная оценка транслокации NFATC4 в ядре CM от разных свиней (n = 4 (D0), 3 (D6 MTOS) среза/группа, двусторонний t-критерий Стьюдента; *p < 0,05).Показаны средние значения ± стандартное отклонение.
Трансляционные исследования сердечно-сосудистой системы требуют клеточных моделей, точно воспроизводящих сердечную среду. В данном исследовании было разработано и охарактеризовано устройство CTCM, способное стимулировать ультратонкие срезы сердца. Система CTCM включает физиологически синхронизированную электромеханическую стимуляцию и обогащение жидкости Т3 и Дексаметазоном. При воздействии этих факторов на срезы свиного сердца их жизнеспособность, структурная целостность, метаболическая активность и транскрипционная экспрессия оставались такими же, как и в свежей сердечной ткани после 12 дней культивирования. Кроме того, чрезмерное растяжение сердечной ткани может вызвать гипертрофию сердца, вызванную перерастяжением. В целом, эти результаты подтверждают критическую роль физиологических условий культивирования в поддержании нормального сердечного фенотипа и предоставляют платформу для скрининга лекарственных препаратов.
Многие факторы способствуют созданию оптимальной среды для функционирования и выживания кардиомиоцитов. Наиболее очевидные из этих факторов связаны с (1) межклеточными взаимодействиями, (2) электромеханической стимуляцией, (3) гуморальными факторами и (4) метаболическими субстратами. Физиологические межклеточные взаимодействия требуют сложных трехмерных сетей из множества типов клеток, поддерживаемых внеклеточным матриксом. Такие сложные клеточные взаимодействия трудно реконструировать in vitro путем совместного культивирования отдельных типов клеток, но их легко достичь, используя органотипическую природу срезов сердца.
Механическое растяжение и электрическая стимуляция кардиомиоцитов имеют решающее значение для поддержания сердечного фенотипа33,34,35. Хотя механическая стимуляция широко используется для подготовки и созревания кардиомиоцитов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (hiPSC-CM), в нескольких недавних элегантных исследованиях была предпринята попытка механической стимуляции срезов сердца в культуре с использованием одноосной нагрузки. Эти исследования показывают, что двумерная одноосная механическая нагрузка оказывает положительное влияние на фенотип сердца во время культивирования. В этих исследованиях срезы сердца либо нагружались изометрическими растягивающими силами17, линейной ауксотонической нагрузкой18, либо сердечный цикл воссоздавался с помощью обратной связи от силового датчика и приводов натяжения. Однако эти методы используют одноосное растяжение ткани без оптимизации окружающей среды, что приводит к подавлению многих сердечных генов или сверхэкспрессии генов, связанных с аномальными реакциями на растяжение. Описанная здесь КТ-механическая стимуляция обеспечивает трехмерный электромеханический стимул, имитирующий естественный сердечный цикл с точки зрения времени цикла и физиологического растяжения (25% растяжения, 40% систолы, 60% диастолы и 72 удара в минуту). Хотя одной лишь этой трехмерной механической стимуляции недостаточно для поддержания целостности тканей, для адекватного поддержания жизнеспособности, функции и целостности тканей необходима комбинация гуморальной и механической стимуляции с использованием T3/Dex.
Гуморальные факторы играют важную роль в модулировании фенотипа сердца у взрослых. Это было показано в исследованиях HiPS-CM, в которых Т3 и Дексаметазон добавляли в культуральную среду для ускорения созревания клеток. Т3 может влиять на транспорт аминокислот, сахаров и кальция через клеточные мембраны36. Кроме того, Т3 способствует экспрессии MHC-α и снижению экспрессии MHC-β, способствуя образованию быстросокращающихся миофибрилл в зрелых кардиомиоцитах по сравнению с медленносокращающимися миофибриллами в фетальных кардиомиоцитах. Дефицит Т3 у пациентов с гипотиреозом приводит к потере миофибриллярных полос и снижению скорости развития тонуса37. Дексаметазон действует на глюкокортикоидные рецепторы и, как было показано, увеличивает сократительную способность миокарда в изолированных перфузированных сердцах38; считается, что это улучшение связано с влиянием на кальций-зависимый вход (SOCE)39,40. Кроме того, Дексаметазон связывается со своими рецепторами, вызывая широкий внутриклеточный ответ, который подавляет иммунную функцию и воспаление30.
Наши результаты показывают, что физическая механическая стимуляция (МС) улучшила общие показатели культивирования по сравнению с контрольной группой (Ctrl), но не смогла сохранить жизнеспособность, структурную целостность и экспрессию сердечных клеток в течение 12 дней культивирования. По сравнению с Ctrl, добавление Т3 и Дексаметазона (Дексаметазон) к культурам CTCM (MT) улучшило жизнеспособность и сохранило аналогичные профили транскрипции, структурную целостность и метаболическую активность со свежей сердечной тканью в течение 12 дней. Кроме того, путем контроля степени растяжения ткани была создана модель гиперэкстензионной гипертрофии сердца с использованием STCM, что иллюстрирует универсальность системы STCM. Следует отметить, что, хотя ремоделирование и фиброз сердца обычно затрагивают неповрежденные органы, циркулирующие клетки которых могут обеспечивать соответствующие цитокины, а также фагоцитоз и другие факторы ремоделирования, участки сердца все еще могут имитировать фибротический процесс в ответ на стресс и травму. В миофибробласты. Это было ранее оценено в данной модели срезов сердца. Следует отметить, что параметры КТКМ можно модулировать, изменяя амплитуду и частоту давления/электрического воздействия, для имитации многих состояний, таких как тахикардия, брадикардия и механическая поддержка кровообращения (механическая разгрузка сердца). Это делает систему среднепроизводительной для тестирования лекарственных препаратов. Способность КТКМ моделировать вызванную перенапряжением гипертрофию сердца открывает путь для тестирования этой системы в целях персонализированной терапии. В заключение, настоящее исследование демонстрирует, что механическое растяжение и гуморальная стимуляция имеют решающее значение для поддержания культуры срезов сердечной ткани.
Хотя представленные здесь данные свидетельствуют о том, что CTCM является очень перспективной платформой для моделирования интактного миокарда, этот метод культивирования имеет некоторые ограничения. Основное ограничение культивирования CTCM заключается в том, что оно создает непрерывные динамические механические напряжения на срезах, что исключает возможность активного мониторинга сокращений сердечных срезов в течение каждого цикла. Кроме того, из-за малого размера сердечных срезов (7 мм) возможность оценки систолической функции вне культуральных систем с использованием традиционных датчиков силы ограничена. В данной работе мы частично преодолеваем это ограничение, оценивая оптическое напряжение как индикатор сократительной функции. Однако это ограничение потребует дальнейших исследований и может быть устранено в будущем путем внедрения методов оптического мониторинга функции сердечных срезов в культуре, таких как оптическое картирование с использованием кальций- и вольтаж-чувствительных красителей. Еще одним ограничением CTCM является то, что рабочая модель не манипулирует физиологическим напряжением (предварительной и постнагрузкой). В КТ-микростимуляции давление создавалось в противоположных направлениях для воспроизведения 25% физиологического растяжения в диастоле (полное растяжение) и систоле (длительность сокращения во время электрической стимуляции) в очень больших тканях. Это ограничение должно быть устранено в будущих конструкциях КТ-микростимуляции путем адекватного давления на сердечную ткань с обеих сторон и путем применения точных соотношений давления и объема, которые наблюдаются в камерах сердца.
Описанное в данной рукописи ремоделирование, вызванное чрезмерным растяжением, ограничивается имитацией гипертрофических сигналов, возникающих при гиперрастяжении. Таким образом, эта модель может помочь в изучении гипертрофической сигнализации, вызванной растяжением, без необходимости использования гуморальных или нейронных факторов (которые отсутствуют в этой системе). Необходимы дальнейшие исследования для увеличения кратности КТМ, например, совместное культивирование с иммунными клетками, циркулирующими плазменными гуморальными факторами и иннервацией при совместном культивировании с нейронными клетками улучшит возможности моделирования заболеваний с помощью КТМ.
В этом исследовании было использовано тринадцать свиней. Все процедуры с животными проводились в соответствии с институциональными рекомендациями и были одобрены Комитетом по этике использования животных Университета Луисвилла. Аортальная дуга была пережата, и сердце перфузировали 1 л стерильной кардиоплегии (110 мМ NaCl, 1,2 мМ CaCl2, 16 мМ KCl, 16 мМ MgCl2, 10 мМ NaHCO3, 5 Ед/мл гепарина, pH до 7,4); Сердца хранились в ледяном кардиопротекторном растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает менее 10 минут. Сердца хранились в ледяном кардиопротекторном растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает менее 10 минут. сердцеили в ледяном сердцеплеге, хранят раствор для транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает <10 мин. Сердца хранились в ледяном кардиопротекторном растворе до транспортировки в лабораторию на льду, что обычно занимает менее 10 минут.将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10 分钟。将心脏保存在冰冷的心脏停搏液中,直到冰上运送到实验室,通常<10 分钟。 Держите сердце в ледяной кардиоплегии до транспортировки в лабораторию на льду, обычно <10 мин. Сердца следует хранить в охлажденном состоянии для обеспечения кардиоплегии до транспортировки в лабораторию, обычно менее 10 минут.
Устройство CTCM было разработано в системе автоматизированного проектирования (САПР) SolidWorks. Камеры для культивирования, перегородки и воздушные камеры изготовлены из прозрачного акрилового пластика, обработанного на станке с ЧПУ. Опорное кольцо диаметром 7 мм изготовлено из полиэтилена высокой плотности (HDPE) в центре и имеет канавку для уплотнительного кольца, в которую вставляется силиконовое уплотнительное кольцо, используемое для герметизации питательной среды под ним. Тонкая кремниевая мембрана отделяет камеру для культивирования от разделительной пластины. Силиконовая мембрана вырезана лазером из силиконового листа толщиной 0,02 дюйма и имеет твердость 35A. Нижняя и верхняя силиконовые прокладки вырезаны лазером из силиконового листа толщиной 1/16 дюйма и имеют твердость 50A. Для крепления блока и создания герметичного уплотнения используются винты и гайки-барашки из нержавеющей стали 316L.
Для интеграции с системой C-PACE-EM разработана специальная печатная плата (PCB). Разъемы швейцарского типа на печатной плате соединены с графитовыми электродами с помощью посеребренных медных проводов и бронзовых винтов 0-60, ввинченных в электроды. Печатная плата размещается в крышке 3D-принтера.
Устройство CTCM управляется программируемым пневматическим приводом (PPD), который создает контролируемое циркуляционное давление, аналогичное сердечному циклу. По мере увеличения давления внутри воздушной камеры гибкая силиконовая мембрана расширяется вверх, выталкивая среду под участок ткани. Затем область ткани растягивается за счет этого выталкивания жидкости, имитируя физиологическое расширение сердца во время диастолы. В пик расслабления применялась электрическая стимуляция через графитовые электроды, которая снижала давление в воздушной камере и вызывала сокращение участков ткани. Внутри трубки находится гемостатический клапан с датчиком давления для определения давления в воздушной системе. Давление, измеренное датчиком давления, подается на сборщик данных, подключенный к ноутбуку. Это позволяет непрерывно контролировать давление внутри газовой камеры. Когда было достигнуто максимальное давление в камере (стандартное 80 мм рт. ст., 140 мм рт. ст. при измерении в операционном поле), устройству сбора данных было дано указание отправить сигнал в систему C-PACE-EM для генерации двухфазного напряжения длительностью 2 мс, установленного на 4 В.
Были получены срезы сердца, и условия культивирования в 6 лунках были следующими: собранные сердца перенесли из сосуда для переноса в лоток, содержащий холодную (4°C) кардиоплигию. Левый желудочек был выделен стерильным лезвием и разрезан на кусочки размером 1-2 см³. Эти тканевые блоки были прикреплены к тканевым подложкам с помощью тканевого клея и помещены в вибрационную микротомную ванну для тканей, содержащую раствор Тирода и постоянно оксигенированную (3 г/л 2,3-бутандион монооксима (BDM), 140 мМ NaCl (8,18 г)), 6 мМ KCl (0,447 г), 10 мМ D-глюкозы (1,86 г), 10 мМ HEPES (2,38 г), 1 мМ MgCl₂ (1 мл 1 М раствора), 1,8 мМ CaCl₂ (1,8 мл 1 М раствора), до 1 л дистиллированной воды). Вибрационный микротом был настроен на нарезку срезов толщиной 300 мкм с частотой 80 Гц, амплитудой горизонтальной вибрации 2 мм и скоростью продвижения 0,03 мм/с. Ванна для тканей была окружена льдом для охлаждения раствора, и температура поддерживалась на уровне 4°C. Перенос срезов тканей из ванны микротома в инкубационную ванну, содержащую постоянно оксигенированный раствор Тирода на льду, осуществлялся до получения достаточного количества срезов для одной культуральной чашки. Для трансвелл-культур срезы тканей прикрепляли к стерильным полиуретановым подложкам шириной 6 мм и помещали в 6 мл оптимизированной среды (среда 199, 1x добавка ITS, 10% FBS, 5 нг/мл VEGF, 10 нг/мл FGF-щелочной и 2X антибиотик-противогрибковый). Электрическая стимуляция (10 В, частота 1,2 Гц) подавалась на срезы тканей через устройство C-Pace. В условиях TD при каждой замене среды добавляли свежий Т3 и Дексаметазон в концентрациях 100 нМ и 1 мкМ соответственно. Перед заменой среду 3 раза в день насыщали кислородом. Срезы тканей культивировали в инкубаторе при 37°C и 5% CO2.
Для культивирования клеток сердца методом КТКМ срезы ткани помещали на изготовленный на заказ 3D-принтер в чашку Петри, содержащую модифицированный раствор Тирода. Устройство предназначено для увеличения размера среза сердца на 25% площади опорного кольца. Это делается для того, чтобы срезы сердца не растягивались после переноса из раствора Тирода в среду и во время диастолы. С помощью гистоакрилового клея срезы толщиной 300 мкм фиксировали на опорном кольце диаметром 7 мм. После прикрепления срезов ткани к опорному кольцу отрезали излишки ткани и помещали прикрепленные срезы обратно в ванну с раствором Тирода на льду (4°C) до тех пор, пока не будет подготовлено достаточное количество срезов для одного устройства. Общее время обработки для всех устройств не должно превышать 2 часов. После прикрепления 6 срезов ткани к опорным кольцам устройство КТКМ собирали. Камеру для культивирования клеток КТКМ предварительно заполняли 21 мл предварительно оксигенированной среды. Перенесите срезы ткани в камеру для культивирования и аккуратно удалите все пузырьки воздуха пипеткой. Затем срез ткани вставьте в отверстие и осторожно прижмите. Наконец, наденьте колпачок на электрод и перенесите устройство в инкубатор. Затем подключите CTCM к воздушной трубке и системе C-PACE-EM. Пневматический привод откроется, и воздушный клапан откроет CTCM. Система C-PACE-EM была настроена на подачу 4 В при 1,2 Гц во время двухфазной стимуляции в течение 2 мс. Среду меняли дважды в день, а электроды — один раз в день, чтобы избежать накопления графита на электродах. При необходимости срезы ткани можно извлечь из лунок для культивирования, чтобы удалить любые пузырьки воздуха, которые могли попасть под них. Для условий обработки MT Т3/Дексаметазон добавляли свежим при каждой замене среды, при этом концентрация Т3 составляла 100 нМ, а Дексаметазона — 1 мкМ. Устройства CTCM культивировали в инкубаторе при 37°C и 5% CO2.
Для получения растянутых траекторий срезов сердца была разработана специальная система камер. Использовалась зеркальная фотокамера (Canon Rebel T7i, Canon, Токио, Япония) с макрообъективом Navitar Zoom 7000 18-108 мм (Navitar, Сан-Франциско, Калифорния). Визуализация проводилась при комнатной температуре после замены среды на свежую. Камера располагалась под углом 51°, а видео записывалось со скоростью 30 кадров в секунду. Сначала для количественной оценки движения срезов сердца использовалось программное обеспечение с открытым исходным кодом (MUSCLEMOTION43) и Image-J. Маска была создана с помощью MATLAB (MathWorks, Натик, Массачусетс, США) для определения областей интереса для срезов сокращающегося сердца, чтобы избежать шума. Сегментированные вручную маски применялись ко всем изображениям в последовательности кадров, а затем передавались в плагин MUSCLEMOTION. Muscle Motion использует среднюю интенсивность пикселей в каждом кадре для количественной оценки его движения относительно опорного кадра. Данные были записаны, отфильтрованы и использованы для количественной оценки времени цикла и оценки растяжения ткани во время сердечного цикла. Записанное видео было обработано с помощью цифрового фильтра первого порядка с нулевой фазой. Для количественной оценки растяжения ткани (от пика до пика) был выполнен анализ от пика до пика, чтобы различить пики и впадины в записанном сигнале. Кроме того, для устранения дрейфа сигнала была выполнена детрендировка с использованием полинома 6-го порядка. Был разработан программный код на MATLAB для определения глобального движения ткани, времени цикла, времени релаксации и времени сокращения (дополнительный программный код 44).
Для анализа деформации, используя те же видеозаписи, что и для оценки механического растяжения, мы сначала обвели два изображения, представляющие пики движения (самую высокую (верхнюю) и самую низкую (нижнюю) точки движения) в соответствии с программным обеспечением MUSCLEMOTION. Затем мы сегментировали области ткани и применили к сегментированной ткани алгоритм затенения (дополнительный рис. 2a). Сегментированная ткань была разделена на десять подповерхностей, и напряжение на каждой поверхности рассчитывалось по следующей формуле: Деформация = (Sup-Sdown)/Sdown, где Sup и Sdown — расстояния фигуры от верхней и нижней тени ткани соответственно (дополнительный рис. 2b).
Срезы сердца фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 48 часов. Фиксированные ткани обезвоживали в 10% и 20% растворе сахарозы в течение 1 часа, затем в 30% растворе сахарозы в течение ночи. После этого срезы заливали в среду для оптимальной температуры резки (OCT-компаунд) и постепенно замораживали в ванне из изопентана/сухого льда. Блоки для заливки OCT хранили при -80 °C до разделения. Препараты готовили в виде срезов толщиной 8 мкм.
Для удаления ОКТ из срезов сердца, нагрейте предметные стекла на нагревательном блоке при 95 °C в течение 5 минут. Добавьте 1 мл PBS на каждое предметное стекло и инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре, затем пропитайте срезы, поместив 0,1% раствор Тритона-X в PBS на 15 минут при комнатной температуре. Чтобы предотвратить связывание неспецифических антител с образцом, добавьте 1 мл 3% раствора БСА на предметные стекла и инкубируйте в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем БСА удаляют, и предметные стекла промывают PBS. Отметьте каждый образец карандашом. Первичные антитела (разведенные 1:200 в 1% BSA) (коннексин 43 (Abcam; #AB11370), NFATC4 (Abcam; #AB99431) и тропонин-Т (Thermo Scientific; #MA5-12960)) добавляли в течение 90 минут, затем вторичные антитела (разведенные 1:200 в 1% BSA) против мышиного Alexa Fluor 488 (Thermo Scientific; #A16079) и против кроличьего Alexa Fluor 594 (Thermo Scientific; #T6391) добавляли еще на 90 минут. После этого образцы промывали 3 раза фосфатно-солевым буфером (PBS). Для различения окрашивания целевых участков от фонового мы использовали только вторичные антитела в качестве контроля. Наконец, добавляли ядерный краситель DAPI, предметные стекла помещали в Vectashield (Vector Laboratories) и запечатывали лаком для ногтей. (-x увеличение) и микроскоп Keyence с 40-кратным увеличением.
Для окрашивания WGA использовали WGA-Alexa Fluor 555 (Thermo Scientific; #W32464) в концентрации 5 мкг/мл в PBS, нанося на фиксированные срезы на 30 минут при комнатной температуре. Затем предметные стекла промывали PBS, на каждый предметный слайд добавляли Судан черный и инкубировали в течение 30 минут. После этого предметные стекла промывали PBS и добавляли среду для заливки Vectashield. Препараты визуализировали на микроскопе Keyence при 40-кратном увеличении.
ОКТ удаляли из образцов, как описано выше. После удаления ОКТ предметные стекла погружали в раствор Буэна на ночь. Затем предметные стекла промывали дистиллированной водой в течение 1 часа, после чего помещали в раствор фуксина алоэ Бибриха на 10 минут. Затем предметные стекла промывали дистиллированной водой и помещали в раствор 5% фосфомолибдена/5% фосфорновольфрамовой кислоты на 10 минут. Не промывая, предметные стекла переносили непосредственно в раствор анилинового синего на 15 минут. Затем предметные стекла промывали дистиллированной водой и помещали в 1% раствор уксусной кислоты на 2 минуты. Предметные стекла высушивали в 200 N этаноле и переносили в ксилол. Окрашенные предметные стекла визуализировали с помощью микроскопа Keyence с объективом 10x. Процент площади фиброза количественно определяли с помощью программного обеспечения Keyence Analyzer.
Анализ жизнеспособности клеток CyQUANT™ MTT (Invitrogen, Carlsbad, CA), каталожный номер V13154, проводился в соответствии с протоколом производителя с некоторыми модификациями. В частности, для обеспечения однородного размера ткани во время анализа MTT использовался хирургический пробойник диаметром 6 мм. Ткани индивидуально помещали в лунки 12-луночного планшета, содержащего субстрат MTT, в соответствии с протоколом производителя. Срезы инкубировали при 37°C в течение 3 часов, и живая ткань метаболизировала субстрат MTT с образованием пурпурного формазана. Раствор MTT заменяли 1 мл ДМСО и инкубировали при 37°C в течение 15 минут для экстракции пурпурного формазана из срезов сердца. Образцы разбавляли в соотношении 1:10 в ДМСО в 96-луночных планшетах с прозрачным дном, и интенсивность пурпурного цвета измеряли при 570 нм с помощью планшетного ридера Cytation (BioTek). Показания нормировали по весу каждого среза сердца.
Для анализа утилизации глюкозы среду для срезов сердца заменили на среду, содержащую 1 мкКи/мл [5-3H]-глюкозы (Moravek Biochemicals, Brea, CA, USA), как описано ранее. После 4 часов инкубации в открытую микроцентрифужную пробирку, содержащую 100 мкл 0,2 N HCl, добавили 100 мкл среды. Затем пробирку поместили в сцинтилляционную пробирку, содержащую 500 мкл дистиллированной воды, для испарения [3H]2O в течение 72 часов при 37°C. После этого микроцентрифужную пробирку извлекли из сцинтилляционной пробирки и добавили 10 мл сцинтилляционной жидкости. Сцинтилляционные измерения проводили с помощью жидкостного сцинтилляционного анализатора Tri-Carb 2900TR (Packard Bioscience Company, Meriden, CT, USA). Затем была рассчитана утилизация глюкозы с учетом удельной активности [5-3H]-глюкозы, неполного равновесия и фонового излучения, разбавления [5-3H]-глюкозы немеченой глюкозой, а также эффективности сцинтилляционного счетчика. Данные нормализованы по массе срезов сердца.
После гомогенизации тканей в растворе Trizol РНК выделяли из срезов сердца с использованием набора Qiagen miRNeasy Micro Kit #210874 в соответствии с протоколом производителя. Подготовка библиотеки РНКsec, секвенирование и анализ данных проводились следующим образом:
В качестве исходного материала для подготовки библиотеки РНК использовали 1 мкг РНК на образец. Библиотеки для секвенирования создавали с помощью набора NEBNext UltraTM RNA Library Preparation Kit for Illumina (NEB, США) в соответствии с рекомендациями производителя, и к последовательностям атрибутов для каждого образца добавляли индексные коды. Вкратце, мРНК очищали от общей РНК с помощью магнитных шариков, к которым были прикреплены поли-Т олигонуклеотиды. Фрагментацию проводили с использованием двухвалентных катионов при высокой температуре в буфере NEBNext First Strand Synthesis Reaction Buffer (5X). Синтез первой цепи кДНК проводили с использованием случайных гексамерных праймеров и обратной транскриптазы M-MuLV (РНКаза H-). Затем синтезировали вторую цепь кДНК с использованием ДНК-полимеразы I и РНКазы H. Оставшиеся выступающие концы превращали в тупые концы с помощью экзонуклеазной/полимеразной активности. После аденилирования 3'-конца фрагмента ДНК к нему присоединяют адаптер NEBNext со структурой шпильки для подготовки к гибридизации. Для отбора фрагментов кДНК предпочтительной длины 150-200 п.н. фрагменты библиотеки очищали с помощью системы AMPure XP (Beckman Coulter, Беверли, США). Затем 3 мкл фермента USER (NEB, США) с отобранной по размеру кДНК, лигированной с адаптером, использовали в течение 15 минут при 37°C, а затем в течение 5 минут при 95°C перед ПЦР. ПЦР проводили с использованием высокоточной ДНК-полимеразы Phusion, универсальных ПЦР-праймеров и индексных (X) праймеров. Наконец, продукты ПЦР очищали (система AMPure XP), а качество библиотеки оценивали на системе Agilent Bioanalyzer 2100. Затем библиотеку кДНК секвенировали с помощью секвенатора Novaseq. Исходные файлы изображений от Illumina были преобразованы в исходные риды с помощью CASAVA Base Calling. Исходные данные хранятся в файлах формата FASTQ (fq), содержащих последовательности ридов и соответствующие им значения качества оснований. Для сопоставления отфильтрованных ридов секвенирования с референсным геномом Sscrofa11.1 был выбран HISAT2. В целом, HISAT2 поддерживает геномы любого размера, включая геномы размером более 4 миллиардов оснований, и для большинства параметров установлены значения по умолчанию. Риды сплайсинга из данных РНК-секвенирования могут быть эффективно выровнены с помощью HISAT2, самой быстрой из доступных в настоящее время систем, с той же или более высокой точностью, чем любой другой метод.
Количество транскриптов напрямую отражает уровень экспрессии генов. Уровни экспрессии генов оцениваются по количеству транскриптов (количеству секвенированных последовательностей), связанных с геномом или экзонами. Количество прочтений пропорционально уровням экспрессии генов, длине гена и глубине секвенирования. Были рассчитаны значения FPKM (фрагменты на тысячу пар оснований секвенированного транскрипта на миллион пар оснований), а значения P для дифференциальной экспрессии были определены с помощью пакета DESeq2. Затем мы рассчитали частоту ложных обнаружений (FDR) для каждого значения P, используя метод Бенджамини-Хохберга⁹ на основе встроенной функции R «p.adjust».
РНК, выделенная из срезов сердца, была преобразована в кДНК в концентрации 200 нг/мкл с использованием SuperScript IV Vilo Master mix от Thermo (Thermo, кат. № 11756050). Количественная ОТ-ПЦР проводилась с использованием прозрачной реакционной пластины Applied Biosystems Endura Plate Microamp на 384 лунки (Thermo, кат. № 4483319) и оптического адгезива microamp (Thermo, кат. № 4311971). Реакционная смесь состояла из 5 мкл Taqman Fast Advanced Master mix (Thermo, кат. № 4444557), 0,5 мкл праймера Taqman и 3,5 мкл H2O, смешанных в каждой лунке. Были проведены стандартные циклы количественной ПЦР, а значения CT измерялись с помощью прибора для ПЦР в реальном времени Applied Biosystems Quantstudio 5 (модуль на 384 лунки; артикул A28135). Праймеры Taqman были приобретены у компании Thermo (GAPDH (Ss03375629_u1), PARP12 (Ss06908795_m1), PKDCC (Ss06903874_m1), CYGB (Ss06900188_m1), RGL1 (Ss06868890_m1), ACTN1 (Ss01009508_mH), GATA4 (Ss03383805_u1), GJA1 (Ss03374839_u1), COL1A2 (Ss03375009_u1 ), COL3A1 (Ss04323794_m1), ACTA2 (Ss04245588_m1)). Значения CT всех образцов были нормализованы относительно гена домашнего хозяйства GAPDH.
Высвобождение NT-ProBNP из культуральной среды оценивали с использованием набора NT-ProBNP (для свиней) (кат. № MBS2086979, MyBioSource) в соответствии с протоколом производителя. Кратко, в каждую лунку добавляли по 250 мкл каждого образца и стандарта в двух повторах. Сразу после добавления образца в каждую лунку добавляли 50 мкл реагента A. Планшет осторожно встряхивали и запечатывали герметиком. Затем таблетки инкубировали при 37°C в течение 1 часа. После этого раствор отсасывали и промывали лунки 4 раза по 350 мкл 1X промывочного раствора, инкубируя промывочный раствор в течение 1-2 минут каждый раз. Затем добавляли по 100 мкл реагента B в каждую лунку и запечатывали герметиком для планшета. Таблетку осторожно встряхивали и инкубировали при 37°C в течение 30 минут. Отберите раствор и промойте лунки 5 раз 350 мкл 1X промывочного раствора. Добавьте 90 мкл раствора субстрата в каждую лунку и закройте планшет. Инкубируйте планшет при 37°C в течение 10-20 минут. Добавьте 50 мкл стоп-раствора в каждую лунку. Планшет немедленно измерили с помощью планшетного ридера Cytation (BioTek), настроенного на 450 нм.
Для выбора размеров групп, обеспечивающих мощность более 80% для обнаружения 10% абсолютного изменения параметра при уровне ошибки первого рода 5%, был проведен анализ мощности. Для выбора размеров групп, обеспечивающих мощность более 80% для обнаружения 10% абсолютного изменения параметра при уровне ошибки первого рода 5%, был проведен анализ мощности. Анализ производительности был выполнен для выбора размеров групп, которые обесценивают >80% производительности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметра с 5% ошибок типа I. Был проведен анализ мощности для выбора размеров групп, обеспечивающих мощность более 80% для обнаружения 10% абсолютного изменения параметра при уровне ошибки первого рода 5%.进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。进行功效分析以选择将提供> 80％功效以检测参数中10％绝对变化和5％I型错误率的组大小。 Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, который оказался > 80% мощности для обнаружения 10% абсолютного изменения параметров и 5% частоты ошибок типа I. Был проведен анализ мощности для выбора размера группы, обеспечивающего мощность более 80% для обнаружения 10% абсолютного изменения параметра и 5% вероятности ошибки первого рода.Перед началом эксперимента образцы тканей отбирались случайным образом. Все анализы проводились вслепую, без учета условий эксперимента, и образцы расшифровывались только после анализа всех данных. Для выполнения всех статистических анализов использовалось программное обеспечение GraphPad Prism (Сан-Диего, Калифорния). Для всех статистических показателей p-значения считались статистически значимыми при значениях <0,05. Для всех статистических показателей p-значения считались статистически значимыми при значениях <0,05. Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Для всех статистических показателей p-значения считались статистически значимыми при значениях <0,05.对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。对于所有统计数据，p 值在值<0,05 时被认为是显着的。 Для всей статистики p-значения считались значимыми при значениях <0,05. Для всех статистических показателей p-значения считались статистически значимыми при значениях <0,05.Для данных, содержащих только 2 сравнения, был проведен двухсторонний t-тест Стьюдента. Для определения значимости различий между несколькими группами использовался однофакторный или двухфакторный дисперсионный анализ (ANOVA). При проведении апостериорных тестов применялась поправка Тьюки для учета множественных сравнений. Данные RNAsec имеют особые статистические особенности при расчете FDR и p.adjust, как описано в разделе «Методы».
Более подробную информацию о методологии исследования можно найти в аннотации к статье в журнале Nature Research Report, ссылка на которую приведена в этой статье.