Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümü CSS için sınırlı desteğe sahiptir. En iyi deneyim için, güncel bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da uyumluluk modunu kapatmanızı) öneririz. Bu arada, desteğin devamını sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan görüntüleyeceğiz.
Kistik fibrozis akciğer hastalığının tedavisinde kullanılan gen vektörleri, periferik akciğer transdüksiyonunun terapötik fayda sağlamaması nedeniyle, iletici hava yollarını hedeflemelidir. Viral transdüksiyon verimliliği, vektörün kalış süresiyle doğrudan ilişkilidir. Bununla birlikte, gen taşıyıcıları gibi taşıyıcı sıvılar, inspirasyon sırasında doğal olarak alveollere yayılır ve her türlü terapötik partikül, mukosiliyer transport yoluyla hızla temizlenir. Gen taşıyıcılarının hava yollarındaki kalış süresini uzatmak önemlidir, ancak başarılması zordur. Hava yollarının yüzeyine yönlendirilebilen gen taşıyıcıya bağlı manyetik partiküller, bölgesel hedeflemeyi iyileştirebilir. İn vivo görselleştirmenin zorlukları nedeniyle, bu tür küçük manyetik partiküllerin hava yolu yüzeyinde uygulanan bir manyetik alan varlığındaki davranışı yeterince anlaşılmamıştır. Bu çalışmanın amacı, anestezi altındaki sıçanların trakeasında bir dizi manyetik partikülün in vivo hareketini görselleştirmek ve bireysel ve toplu partikül davranışının dinamiklerini ve modellerini incelemek için senkrotron görüntüleme kullanmaktı. Daha sonra, manyetik alan varlığında lentiviral manyetik partiküllerin iletiminin artıp artmayacağını da değerlendirdik. Sıçan trakeasında transdüksiyon verimliliği. Senkrotron X-ışını görüntüleme, manyetik parçacıkların in vitro ve in vivo olarak sabit ve hareketli manyetik alanlardaki davranışını ortaya koymaktadır. Parçacıklar, mıknatıslarla canlı hava yolunun yüzeyinde kolayca sürüklenemez, ancak taşıma sırasında birikintiler, manyetik alanın en güçlü olduğu görüş alanında yoğunlaşır. Lentiviral manyetik parçacıklar manyetik alan varlığında verildiğinde transdüksiyon verimliliği de altı kat artmıştır. Bu sonuçlar, lentiviral manyetik parçacıkların ve manyetik alanların, in vivo olarak iletken hava yollarında gen vektör hedeflemesini iyileştirmek ve transdüksiyon seviyelerini artırmak için değerli yaklaşımlar olabileceğini göstermektedir.
Kistik fibrozis (KF), CF transmembran iletkenlik düzenleyici (CFTR) adı verilen tek bir gendeki varyasyondan kaynaklanır. CFTR proteini, KF patogenezinin ana bölgelerinden biri olan hava yolları da dahil olmak üzere vücuttaki birçok epitel hücrede bulunan bir iyon kanalıdır. CFTR kusurları, anormal su taşınmasına yol açarak hava yolu yüzeyini kurutur ve hava yolu yüzey sıvısı (ASL) tabakasının derinliğini azaltır. Bu durum ayrıca mukosiliyer taşıma (MCT) sisteminin solunan partikülleri ve patojenleri hava yollarından temizleme yeteneğini de bozar. Amacımız, CFTR geninin doğru kopyasını iletmek ve ASL, MCT ve akciğer sağlığını iyileştirmek için bir lentiviral (LV) gen terapisi geliştirmek ve bu parametreleri in vivo olarak ölçebilen yeni teknolojiler geliştirmeye devam etmektir.
LV vektörleri, özellikle terapötik geni hava yolu bazal hücrelerine (hava yolu kök hücreleri) kalıcı olarak entegre edebilmeleri nedeniyle, CF hava yolu gen terapisi için önde gelen adaylardan biridir. Bu önemlidir çünkü fonksiyonel gen düzeltilmiş CF ile ilişkili hava yolu yüzey hücrelerine farklılaşarak normal hidrasyonu ve mukus temizliğini geri kazandırabilir ve ömür boyu fayda sağlayabilirler. LV vektörleri, CF akciğer hastalığının başladığı yer olan iletici hava yoluna yönlendirilmelidir. Vektörün akciğerin daha derinlerine verilmesi alveoler transdüksiyona neden olabilir, ancak bunun CF'de terapötik bir faydası yoktur. Bununla birlikte, gen taşıyıcıları gibi sıvılar, verildikten sonra inspirasyon üzerine doğal olarak alveollere göç eder3,4 ve terapötik partiküller MCT ile hızla ağız boşluğuna temizlenir. LV transdüksiyon verimliliği, vektörün hücresel alımı sağlamak için hedef hücrelerin yanında kaldığı süreyle doğrudan ilişkilidir – “kalma süresi”5 – bu süre, tipik bölgesel hava akışı ve koordineli partikül mukus yakalama ve MCT ile kolayca azaltılabilir. CF için, LV'nin hava yolu içindeki kalma süresini uzatma yeteneği önemlidir. Bu bölgede yüksek düzeyde transdüksiyon elde etmek önemlidir, ancak şimdiye kadar bu zorlu olmuştur.
Bu engeli aşmak için, LV manyetik parçacıklarının (MP'ler) iki tamamlayıcı şekilde yardımcı olabileceğini öne sürüyoruz. Birincisi, hedeflemeyi iyileştirmek ve gen taşıyıcı parçacıkların istenen hava yolu bölgesinde kalmasına yardımcı olmak için manyetik olarak hava yolu yüzeyine yönlendirilebilirler; ve ASL) hücre katmanı 6'ya hareket edebilirler. MP'ler, antikorlara, kemoterapötik ilaçlara veya hücre zarlarına bağlanan veya ilgili hücre yüzey reseptörlerine bağlanan ve statik elektrik varlığında tümör bölgelerinde biriken diğer küçük moleküllere bağlandıklarında, hedefli ilaç dağıtım araçları olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Kanser Tedavisinde Manyetik Alanlar 7. Diğer “hipertermal” teknikler, MP'ler salınım yapan manyetik alanlara maruz kaldıklarında onları ısıtarak tümör hücrelerini yok etmeyi amaçlar. Manyetik alanın, DNA'nın hücrelere aktarımını artırmak için bir transkripsiyon ajanı olarak kullanıldığı manyetik transkripsiyon prensibi, transdüksiyonu zor hücre hatları için çeşitli viral olmayan ve viral gen vektörleri kullanılarak in vitro olarak yaygın olarak kullanılır. LV manyetik transkripsiyonunun etkinliği, statik bir manyetik alan varlığında insan bronşiyal epitel hücre hattına LV-MP'lerin in vitro olarak verilmesiyle kanıtlanmıştır; bu da transdüksiyon verimliliğini yalnızca LV vektörüne kıyasla 186 kat artırmıştır. LV-MP ayrıca in vitro bir CF modeline de uygulanmıştır; burada manyetik transkripsiyon, CF balgamı varlığında hava-sıvı arayüzü kültürlerinde LV transdüksiyonunu 20 kat artırmıştır.10 Bununla birlikte, organların in vivo manyetik transkripsiyonu nispeten az ilgi görmüş ve yalnızca birkaç hayvanda değerlendirilmiştir. Çalışmalar11,12,13,14,15, özellikle akciğerlerde16,17. Bununla birlikte, CF akciğer tedavisinde manyetik transkripsiyonun sunduğu fırsatlar açıktır. Tan ve ark. (2020), “etkin manyetik nanopartikül pulmoner dağıtımının kavramsal bir kanıtı çalışmasının, CF hastalarında klinik sonuçları iyileştirmek için gelecekteki CFTR inhalasyon stratejilerinin yolunu açacağını” belirtmiştir6.
Uygulanan manyetik alanın varlığında hava yolu yüzeylerindeki küçük manyetik parçacıkların davranışı görselleştirilmesi ve incelenmesi zor olduğundan, yeterince anlaşılmamıştır. Diğer çalışmalarda, ASL derinliğindeki18 ve MCT davranışındaki19,20 küçük in vivo değişiklikleri invaziv olmayan bir şekilde görselleştirmek ve nicelleştirmek için senkrotron yayılımına dayalı faz kontrastlı X-ışını görüntüleme (PB-PCXI) yöntemini geliştirdik; bu yöntem, gaz kanalı yüzey hidrasyonunu doğrudan ölçmek ve tedavi etkinliğinin erken bir göstergesi olarak kullanılmaktadır. Ek olarak, MCT değerlendirme yöntemimiz, PB-PCXI21 kullanılarak görülebilen MCT işaretleyicileri olarak alümina veya yüksek kırılma indisine sahip camdan oluşan 10-35 µm çapındaki parçacıkları kullanmaktadır. Her iki teknik de MP dahil olmak üzere çeşitli parçacık tiplerinin görselleştirilmesi için uygundur.
Yüksek uzamsal ve zamansal çözünürlüğü nedeniyle, PB-PCXI tabanlı ASL ve MCT analiz tekniklerimiz, MP gen iletim tekniklerini anlamamıza ve optimize etmemize yardımcı olmak için, in vivo tek ve toplu parçacık davranışının dinamiklerini ve modellerini incelemek için oldukça uygundur. Burada kullandığımız yaklaşım, SPring-8 BL20B2 ışın hattını kullanarak yaptığımız çalışmalardan türetilmiştir; bu çalışmalarda, gen taşıyıcı doz hayvan çalışmalarımızda gözlemlenen düzensiz gen ekspresyon modellerini açıklamak için farelerin burun ve akciğer hava yollarına sahte vektör dozu verilmesinin ardından sıvı hareketini görselleştirdik 3,4.
Bu çalışmanın amacı, canlı sıçanların trakeasında bir dizi mikropartikülün (MP) in vivo hareketlerini görselleştirmek için senkrotron PB-PCXI'yi kullanmaktı. Bu PB-PCXI görüntüleme çalışmaları, MP hareketine etkilerini belirlemek için çeşitli MP'leri, manyetik alan güçlerini ve konumlarını test etmek üzere tasarlandı. Dışarıdan uygulanan bir manyetik alanın, verilen MP'nin hedef bölgede kalmasına veya hareket etmesine yardımcı olacağını varsaydık. Bu çalışmalar ayrıca, çökelme sonrasında trakeada tutulan parçacık sayısını en üst düzeye çıkaran mıknatıs konfigürasyonlarını belirlememizi sağladı. İkinci bir çalışma serisinde, LV-MP'lerin hava yolu hedeflemesi bağlamında verilmesinin LV transdüksiyon verimliliğini artıracağı varsayımına dayanarak, bu optimal konfigürasyonu kullanarak sıçan hava yoluna in vivo olarak verilmesinden kaynaklanan transdüksiyon modelini göstermeyi amaçladık.
Tüm hayvan çalışmaları, Adelaide Üniversitesi (M-2019-060 ve M-2020-022) ve SPring-8 Senkrotron Hayvan Etiği Komitesi tarafından onaylanan protokollere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Deneyler, ARRIVE yönergelerine göre yapılmıştır.
Tüm X-ışını görüntüleme işlemleri, daha önce açıklananlara benzer bir düzenek kullanılarak Japonya'daki SPring-8 senkrotronundaki BL20XU ışın hattında gerçekleştirildi.21,22 Kısaca, deney kutusu senkrotron depolama halkasından 245 m uzaklıkta yer alıyordu. Parçacık görüntüleme çalışmaları için 0,6 m, in vivo görüntüleme çalışmaları için ise faz kontrast etkileri oluşturmak amacıyla 0,3 m'lik bir örnek-dedektör mesafesi kullanıldı. 25 keV'lik monokromatik bir ışın enerjisi kullanıldı. Görüntüler, bir sCMOS dedektörüne bağlı yüksek çözünürlüklü bir X-ışını dönüştürücü (SPring-8 BM3) kullanılarak yakalandı. Dönüştürücü, 10 µm kalınlığında bir sintilatör (Gd3Al2Ga3O12) kullanarak X-ışınlarını görünür ışığa dönüştürür ve bu ışık daha sonra ×10 mikroskop objektifi (NA 0,3) kullanılarak bir sCMOS sensörüne yönlendirilir. sCMOS dedektörü, Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japonya) idi. 2048 × 2048 piksel boyutunda bir dizi ve 6,5 × 6,5 µm'lik ham piksel boyutu kullanılmıştır. Bu kurulum, 0,51 µm'lik etkili bir izotropik piksel boyutu ve yaklaşık 1,1 mm × 1,1 mm'lik bir görüş alanı sağlar. Solunum kaynaklı hareket artefaktlarını en aza indirirken, hava yolunun içindeki ve dışındaki manyetik parçacıkların sinyal-gürültü oranını en üst düzeye çıkarmak için 100 ms'lik bir pozlama süresi seçilmiştir. İn vivo çalışmalar için, pozlamalar arasında X-ışını ışınını engelleyerek radyasyon dozunu sınırlamak amacıyla X-ışını yoluna hızlı bir X-ışını perdesi yerleştirilmiştir.
BL20XU görüntüleme odası Biyogüvenlik Seviye 2 sertifikasına sahip olmadığı için, LV taşıyıcı hiçbir SPring-8 PB-PCXI görüntüleme çalışmasında kullanılmamıştır. Bunun yerine, öncelikle manyetik alanların MP hareketini cam kılcal damarlar içinde ve daha sonra canlı solunum yollarında nasıl etkilediğini anlamak için, iki ticari tedarikçiden çeşitli boyutlar, malzemeler, demir konsantrasyonları ve uygulamaları kapsayan, iyi karakterize edilmiş bir dizi MP seçtik. Yüzeyde. MP'ler 0,25 ila 18 μm arasında değişen boyutlardadır ve çeşitli malzemelerden yapılmıştır (bkz. Tablo 1), ancak MP içindeki manyetik parçacıkların boyutu da dahil olmak üzere her numunenin bileşimi bilinmemektedir. Kapsamlı MCT çalışmalarımıza dayanarak 19, 20, 21, 23, 24, örneğin MP hareketinin daha iyi görünürlüğünü sağlamak için ardışık kareleri çıkararak trakeal hava yolu yüzeyinde 5 μm kadar küçük MP'lerin görülebileceğini tahmin ediyoruz. Tek bir 0,25 μm boyutundaki MP, görüntüleme cihazının çözünürlüğünden daha küçüktür, ancak PB-PCXI'nin hacim kontrastlarını ve biriktikten sonra biriktikleri yüzey sıvısının hareketini tespit etmesi beklenmektedir.
Tablo 1'deki her bir MP için numuneler, iç çapı 0,63 mm olan 20 μl'lik cam kılcal borularda (Drummond Microcaps, PA, ABD) hazırlandı. Korpusküler parçacıklar suda, CombiMag parçacıkları ise üreticinin özel sıvısında mevcuttur. Her tüp, sıvı ile yarıya kadar doldurulur (yaklaşık 11 μl) ve numune tutucuya yerleştirilir (bkz. Şekil 1). Cam kılcal borular, görüntüleme kutusundaki numune tablasına yatay olarak yerleştirilir ve sıvının kenarları konumlandırılır. 1,17 Tesla artık manyetizasyona sahip 19 mm çapında (28 mm uzunluğunda) nikel kabuklu nadir toprak neodim demir bor (NdFeB) mıknatıs (N35, katalog no. LM1652, Jaycar Electronics, Avustralya), görüntüleme sırasında konumunu uzaktan değiştirmek için ayrı bir çeviri tablasına takıldı. X-ışını görüntüleme, mıknatıs numunenin yaklaşık 30 mm yukarısına yerleştirildiğinde başlar ve görüntüler şu şekilde alınır: Saniyede 4 kare hızında. Görüntüleme sırasında, mıknatıs cam kılcal tüpe yaklaştırıldı (yaklaşık 1 mm uzakta) ve ardından alan şiddeti ve konumun etkilerini değerlendirmek için tüp boyunca hareket ettirildi.
Numune xy hareket tablası üzerinde cam kılcal borularda MP numuneleri içeren in vitro görüntüleme düzeneği. X-ışını demetinin yolu kırmızı kesikli çizgiyle işaretlenmiştir.
MP'lerin in vitro görünürlüğü sağlandıktan sonra, bunların bir alt kümesi, vahşi tip dişi albino Wistar sıçanlarında (~12 haftalık, ~200 g) in vivo olarak test edildi. 0,24 mg/kg medetomidin (Domitor®, Zenoaq, Japonya), 3,2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japonya) ve 4 mg/kg butorfanol (Vetorphale®, Meiji Seika Pharma, Japonya) karışımı ile sıçanlar intraperitoneal enjeksiyon yoluyla anestezi altına alındı. Anesteziden sonra, trakea çevresindeki tüyler çıkarılarak, bir endotrakeal tüp (ET; 16 Ga iv kanül, Terumo BCT) yerleştirilerek ve vücut sıcaklığını korumak için termal bir torba içeren özel yapım bir görüntüleme plakasına sırtüstü yatırılarak görüntüleme için hazırlandılar. Görüntüleme plakası daha sonra trakeayı yatay olarak hizalamak için görüntüleme kutusundaki örnek çeviri aşamasına hafif bir açıyla takıldı. Şekil 2a'da gösterildiği gibi röntgen görüntüsü.
(a) SPring-8 görüntüleme kutusundaki in vivo görüntüleme kurulumu, X-ışını demetinin yolu kırmızı kesikli çizgiyle işaretlenmiştir. (b,c) Trakeadaki mıknatıs lokalizasyonu, birbirine dik olarak monte edilmiş iki IP kamera kullanılarak uzaktan gerçekleştirilmiştir. Ekran görüntüsünün sol tarafında, başı tutan tel halka ve ET tüpü içindeki uygulama kanülü görülebilir.
100 μl'lik cam şırınga kullanan uzaktan kumandalı bir şırınga pompa sistemi (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL), 30 Ga iğne vasıtasıyla PE10 tüpüne (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) bağlandı. ET tüpü yerleştirilirken ucun trakeada doğru konumda olduğundan emin olmak için tüp işaretlendi. Mikropompa kullanılarak, tüpün ucu verilecek MP örneğine daldırılmış haldeyken şırınga pistonu geri çekildi. Daha sonra, yüklenmiş dağıtım tüpü, ucu beklenen uygulanan manyetik alanın en güçlü kısmına yerleştirilerek endotrakeal tüpe yerleştirildi. Görüntü alımı, Arduino tabanlı zamanlama kutumuza bağlı bir solunum dedektörü kullanılarak kontrol edildi ve tüm sinyaller (örneğin sıcaklık, solunum, deklanşör açma/kapama ve görüntü alımı) Powerlab ve LabChart (AD Instruments, Sydney, Avustralya) 22 kullanılarak kaydedildi. Görüntüleme sırasında, muhafazaya erişilemediğinde, iki IP kamera (Panasonic BB-SC382) kullanıldı. Birbirlerine yaklaşık 90° açıyla yerleştirilmişlerdi ve görüntüleme sırasında mıknatısın trakeaya göre konumunu izlemek için kullanıldılar (Şekil 2b,c). Hareket kaynaklı bozulmaları en aza indirmek için, solunum sonu akış platosu sırasında her nefeste bir görüntü alındı.
Görüntüleme muhafazasının dışından uzaktan konumlandırılabilen ikinci bir aşamaya bir mıknatıs takılır. Çeşitli mıknatıs konumları ve konfigürasyonları test edildi, bunlar arasında şunlar yer almaktadır: Trakeanın yaklaşık 30° üzerinde bir açıyla monte edilmiş (Şekil 2a ve 3a'da gösterilen konfigürasyonlar); bir mıknatıs hayvanın üstünde, diğeri altında, kutupları çekme yönünde ayarlanmış (Şekil 3b); bir mıknatıs hayvanın üstünde, diğeri altında, kutupları itme yönünde ayarlanmış (Şekil 3c); ve bir mıknatıs trakeanın üstünde ve ona dik (Şekil 3d). Hayvan ve mıknatıs yapılandırıldıktan ve test edilecek MP şırınga pompasına yüklendikten sonra, görüntüler alınırken 4 μl/sn hızında 50 μl'lik bir doz verilir. Daha sonra, görüntüler alınmaya devam edilirken mıknatıs trakea boyunca veya yanal olarak ileri geri hareket ettirilir.
Canlı görüntüleme için mıknatıs konfigürasyonu (a) trakeanın üzerinde yaklaşık 30° açıyla tek bir mıknatıs, (b) çekme yönünde ayarlanmış iki mıknatıs, (c) itme yönünde ayarlanmış iki mıknatıs, (d) trakeanın üzerinde ve dik olarak yerleştirilmiş tek bir mıknatıs. Gözlemci ağızdan akciğerlere doğru trakeadan aşağıya baktı ve X-ışını demeti sıçanın sol tarafından geçerek sağ tarafından çıktı. Mıknatıs ya hava yolunun uzunluğu boyunca ya da trakeanın üzerinde X-ışını demeti yönünde sola ve sağa hareket ettirilir.
Ayrıca, solunum ve kalp hareketinin karıştırıcı etkisinin olmadığı durumlarda, hava yollarındaki partiküllerin görünürlüğünü ve davranışını belirlemeyi amaçladık. Bu nedenle, görüntüleme süresinin sonunda, hayvanlar pentobarbital aşırı dozuna (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, ABD; ~65 mg/kg ip) maruz bırakılarak insancıl bir şekilde öldürüldü. Bazı hayvanlar görüntüleme platformunda bırakıldı ve solunum ve kalp atışı durduktan sonra, hava yolu yüzeyinde MP görünmüyorsa ek bir MP dozu eklenerek görüntüleme işlemi tekrarlandı.
Elde edilen görüntüler düz alan ve karanlık alan düzeltmelerinden geçirildikten sonra, MATLAB'de (R2020a, The Mathworks) yazılmış özel bir komut dosyası kullanılarak bir film haline getirildi (saniyede 20 kare; solunum hızına bağlı olarak normal hızın 15-25 katı).
Tüm LV gen vektörü uygulama çalışmaları, Adelaide Üniversitesi Laboratuvar Hayvan Araştırma Tesisi'nde gerçekleştirildi ve SPring-8 deneyinin sonuçlarını kullanarak, manyetik alan varlığında LV-MP uygulamasının in vivo gen transferini artırıp artırmayacağını değerlendirmeyi amaçladı. MP ve manyetik alanın etkilerini değerlendirmek için iki hayvan grubu kullanıldı: bir gruba mıknatıs yerleştirilmiş LV-MP verildi, diğer gruba ise mıknatıssız LV-MP içeren kontrol grubu uygulandı.
LV gen vektörleri daha önce açıklanan yöntemler kullanılarak oluşturuldu 25, 26. LacZ vektörü, konstitütif MPSV promotörü (LV-LacZ) tarafından yönlendirilen nükleer lokalize beta-galaktosidaz genini ifade eder ve transdüksiyonlu hücrelerde akciğer dokusu önlerinde ve doku kesitlerinde görülebilen mavi bir reaksiyon ürünü üretir. Titrasyon, hücre kültürlerinde LacZ pozitif hücre sayısının hemositometre ile manuel olarak sayılması ve titrenin TU/ml cinsinden hesaplanmasıyla gerçekleştirildi. Taşıyıcılar -80 °C'de dondurularak saklanır, kullanımdan önce çözülür ve 1:1 oranında karıştırılarak ve teslimattan önce en az 30 dakika buz üzerinde inkübe edilerek CombiMag'e bağlanır.
Normal Sprague Dawley sıçanları (n = 3/grup, ~2-3 aylık) intraperitoneal olarak 0,4 mg/kg medetomidin (Domitor, Ilium, Avustralya) ve 60 mg/kg ketamin (Ilium, Avustralya) karışımı ile anestezi altına alındı ​​(ip) enjeksiyonu ve 16 Ga iv kanül ile cerrahi olmayan oral kanülasyon uygulandı. Trakeal hava yolu dokusunun LV transdüksiyonunu almasını sağlamak için, daha önce tanımladığımız mekanik pertürbasyon protokolü kullanılarak şartlandırıldı; bu protokolde trakeal hava yolu yüzeyi, bir tel sepet (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, ABD) ile eksenel olarak 30 saniye 28 dakika ovuldu. Daha sonra, pertürbasyondan yaklaşık 10 dakika sonra biyolojik güvenlik kabininde trakeal LV-MP uygulaması gerçekleştirildi.
Bu deneyde kullanılan manyetik alan, in vivo X-ışını görüntüleme çalışmasına benzer şekilde, aynı mıknatıslar damıtma stent klipsleri kullanılarak trakeanın üzerinde tutularak yapılandırılmıştır (Şekil 4). Daha önce açıklandığı gibi, jel uçlu bir pipet kullanılarak trakeaya 50 μl hacminde (2 × 25 μl alikot) LV-MP verilmiştir (n = 3 hayvan). Kontrol grubu (n = 3 hayvan) aynı LV-MP'leri mıknatıs kullanılmadan almıştır. İnfüzyon tamamlandıktan sonra, kanül ET tüpünden çıkarılır ve hayvan ekstübe edilir. Mıknatıs 10 dakika boyunca yerinde kalır, ardından çıkarılır. Sıçanlara subkutan meloksikam (1 ml/kg) (Ilium, Avustralya) dozu verilmiş, ardından anestezi, intraperitoneal enjeksiyon yoluyla 1 mg/kg atipamazol hidroklorür (Antisedan, Zoetis, Avustralya) ile tersine çevrilmiştir. Sıçanlar sıcak tutulmuş ve anesteziden tamamen iyileşene kadar izlenmiştir.
Biyolojik güvenlik kabininde LV-MP uygulama cihazı. Resimde görülen ET tüpünün açık gri Luer bağlantı noktası ağızdan dışarı doğru çıkıntı yaparken, pipetin jel ucu ET tüpünden geçirilerek trakeaya istenen derinliğe kadar yerleştiriliyor.
LV-MP dozlama işleminden bir hafta sonra, hayvanlar %100 CO2 inhalasyonu ile insancıl bir şekilde öldürüldü ve LacZ ekspresyonu standart X-gal tedavimiz kullanılarak değerlendirildi. Endotrakeal tüp yerleştirilmesinden kaynaklanan herhangi bir mekanik hasar veya sıvı tutulumunun analize dahil edilmemesini sağlamak için en kuyruktaki üç kıkırdak halkası çıkarıldı. Her trakea, analiz için ikiye ayrılacak şekilde uzunlamasına kesildi ve lümen yüzeyini görselleştirmek için bir Minutien iğnesi (Fine Science Tools) kullanılarak silikon kauçuk (Sylgard, Dow Inc) içeren bir kaba yerleştirildi. Transdüksiyonlu hücrelerin dağılımı ve paterni, bir Nikon mikroskobu (SMZ1500) ve DigiLite kamera ile TCapture yazılımı (Tucsen Photonics, Çin) kullanılarak önden fotoğraf çekimi ile doğrulandı. Görüntüler, trakeanın tüm uzunluğu adım adım görüntülenerek, her görüntü arasında yeterli örtüşme sağlanacak şekilde, 20x büyütmede (trakeanın tam genişliği için en yüksek ayar dahil) elde edildi. “Birleştirme”. Her trakeadan alınan görüntüler daha sonra, düzlemsel hareket algoritması kullanılarak Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) ile tek bir bileşik görüntüde birleştirildi. Her hayvandan alınan trakeanın bileşik görüntülerindeki LacZ ekspresyon alanları, daha önce açıklandığı gibi, 0,35 < Ton < 0,58, Doygunluk > 0,15 ve Değer < 0,7 ayarları kullanılarak otomatik bir MATLAB komut dosyası (R2020a, MathWorks) kullanılarak nicelendirildi. Doku konturları izlenerek, doku alanını tanımlamak ve trakea dokusunun dışından herhangi bir yanlış tespiti önlemek için her bileşik görüntü için GIMP v2.10.24'te manuel olarak bir maske oluşturuldu. Her hayvandan alınan tüm bileşik görüntülerdeki boyalı alanlar, o hayvan için toplam boyalı alanı oluşturmak üzere toplandı. Boyalı alan daha sonra toplam maske alanına bölünerek normalize edilmiş alan oluşturuldu.
Her bir trakea parafine gömüldü ve 5 μm kalınlığında kesitler alındı. Kesitler 5 dakika boyunca nötr hızlı kırmızı ile karşı boyandı ve görüntüler Nikon Eclipse E400 mikroskobu, DS-Fi3 kamera ve NIS element yakalama yazılımı (sürüm 5.20.00) kullanılarak elde edildi.
Tüm istatistiksel analizler GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) programında gerçekleştirildi. İstatistiksel anlamlılık düzeyi p ≤ 0,05 olarak belirlendi. Normallik Shapiro-Wilk testi ile doğrulandı ve LacZ boyamasındaki farklılıklar eşleştirilmemiş t-testi kullanılarak değerlendirildi.
Tablo 1'de açıklanan altı mikroparçacık (MP), PCXI kullanılarak incelenmiş ve görünürlükleri Tablo 2'de açıklanmıştır. İki polistiren mikroparçacık (MP1 ve MP2; sırasıyla 18 μm ve 0,25 μm) PCXI altında görünür değildi, ancak diğer numuneler tanımlanabilir durumdaydı (örnekler Şekil 5'te gösterilmiştir). MP3 ve MP4 (%10-15 Fe3O4; sırasıyla 0,25 μm ve 0,9 μm) hafifçe görülebilir. Test edilen en küçük parçacıklardan bazılarını içermesine rağmen, MP5 (%98 Fe3O4; 0,25 μm) en belirgin olanıydı. CombiMag ürünü MP6'yı tespit etmek zordur. Tüm durumlarda, mıknatısı kılcal boruya paralel olarak ileri geri hareket ettirerek mikroparçacıkları tespit etme yeteneğimiz önemli ölçüde arttı. Mıknatıslar kılcal borudan uzaklaştığında, parçacıklar uzun diziler halinde uzandı, ancak mıknatıslar yaklaştıkça ve manyetik alan şiddeti arttıkça, parçacıklar Parçacıklar kılcal damarın üst yüzeyine doğru hareket ettikçe teller kısalır (bkz. Ek Video S1: MP4), bu da yüzeydeki parçacık yoğunluğunu artırır. Tersine, mıknatıs kılcal damardan çıkarıldığında, alan şiddeti azalır ve MP'ler kılcal damarın üst yüzeyinden uzanan uzun teller halinde yeniden düzenlenir (bkz. Ek Video S2: MP4). Mıknatıs hareket etmeyi bıraktıktan sonra, parçacıklar denge konumuna ulaştıktan sonra kısa bir süre daha hareket etmeye devam eder. MP kılcal damarın üst yüzeyine doğru ve ondan uzaklaşırken, manyetik parçacıklar tipik olarak kalıntıları sıvının içinden sürükler.
PCXI altında MP'nin görünürlüğü örnekler arasında önemli ölçüde değişmektedir. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ve (d) MP6. Burada gösterilen tüm görüntüler, kılcal damarın yaklaşık 10 mm doğrudan üzerinde bulunan bir mıknatısla çekilmiştir. Görünürdeki büyük daireler, kılcal damarlarda hapsolmuş hava kabarcıklarıdır ve faz kontrast görüntülemenin siyah beyaz kenar özelliklerini açıkça göstermektedir. Kırmızı kutu, kontrastı artırıcı büyütmeyi içermektedir. Tüm şekillerdeki mıknatıs şemalarının çaplarının ölçekli olmadığını ve gösterilenden yaklaşık 100 kat daha büyük olduğunu unutmayın.
Mıknatıs kılcal borunun üst kısmında sola ve sağa hareket ettirildiğinde, MP dizisinin açısı mıknatısla hizalanacak şekilde değişir (Şekil 6'ya bakınız), böylece manyetik alan çizgileri belirlenir. MP3-5 için, kiriş eşik bir açıya ulaştıktan sonra, parçacıklar kılcal borunun üst yüzeyi boyunca sürüklenir. Bu genellikle MP'lerin manyetik alanın en güçlü olduğu yere yakın daha büyük gruplar halinde kümelenmesine neden olur (Ek Video S3:MP5'e bakınız). Bu, özellikle kılcal borunun ucuna yakın görüntüleme yapıldığında belirgindir; bu da MP'lerin sıvı-hava arayüzünde bir araya gelmesine ve yoğunlaşmasına neden olur. MP3-5'ten daha zor ayırt edilebilen MP6'daki parçacıklar, mıknatıs kılcal boru boyunca hareket ederken sürüklenmedi, ancak MP dizileri ayrışarak parçacıkları görüş alanında bıraktı (Ek Video S4:MP6'ya bakınız). Bazı durumlarda, uygulanan manyetik alan, mıknatısı görüntüleme konumundan büyük bir mesafeye hareket ettirerek azaltıldığında, kalan MP'ler yerçekimiyle yavaşça tüpün alt yüzeyine inerken görüş alanında kaldılar. (Ek Video S5: MP3'e bakınız).
Mıknatıs kılcal borunun üzerinde sağa doğru hareket ettirildikçe MP dizisinin açısı değişir. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ve (d) MP6. Kırmızı kutu, kontrastı artıran büyütmeyi içerir. Ek videoların, bu statik görüntülerde görselleştirilemeyen önemli parçacık yapısı ve dinamik bilgileri ortaya koyduğu için bilgilendirici olduğunu unutmayın.
Testlerimiz, mıknatısı trakea boyunca yavaşça ileri geri hareket ettirmenin, MP'nin karmaşık hareket bağlamında in vivo olarak görüntülenmesini kolaylaştırdığını gösterdi. Polistiren boncuklar (MP1 ve MP2) kılcal damarda görünmediği için in vivo test yapılmadı. Geri kalan dört MP'nin her biri, mıknatısın uzun ekseni trakeanın üzerinde dikeye yaklaşık 30° açıyla yapılandırılarak in vivo olarak test edildi (bkz. Şekil 2b ve 3a), çünkü bu daha uzun MP zincirlerine yol açtı ve mıknatısın sonlandırılmış konfigürasyonundan daha etkiliydi. MP3, MP4 ve MP6, hiçbir canlı hayvanın trakeasında tespit edilmedi. Hayvanlar insancıl bir şekilde öldürüldükten sonra sıçan hava yolları görüntülendiğinde, parçacıklar şırınga pompası kullanılarak ek hacim eklendiğinde bile görünmez kaldı. MP5 en yüksek demir oksit içeriğine sahipti ve tek görünür parçacıktı, bu nedenle MP'nin in vivo davranışını değerlendirmek ve karakterize etmek için kullanıldı.
MP iletimi sırasında mıknatısın trakea üzerine yerleştirilmesi, MP'lerin çoğunun, ancak hepsinin değil, görüş alanında yoğunlaşmasına neden oldu. Trakeaya giren parçacıklar, insancıl bir şekilde kurban edilen hayvanlarda en iyi şekilde gözlemlenir. Şekil 7 ve Ek Video S6: MP5, ventral trakeanın yüzeyinde parçacıkların hızlı manyetik yakalanmasını ve hizalanmasını göstererek, MP'lerin trakeanın istenen bölgelerine yönlendirilebileceğini göstermektedir. MP iletiminden sonra trakea boyunca daha distalde arama yapıldığında, bazı MP'lerin karinaya daha yakın olduğu bulundu; bu da manyetik alan gücünün, sıvı işlemi sırasında maksimum manyetik alan gücü bölgesinden iletildikleri için tüm MP'leri toplamak ve tutmak için yetersiz olduğunu düşündürmektedir. Bununla birlikte, doğum sonrası MP konsantrasyonları görüntülenen alanın çevresinde daha yüksekti; bu da birçok MP'nin uygulanan manyetik alan gücünün en yüksek olduğu hava yolu bölgelerinde kaldığını göstermektedir.
(a) MP5'in yakın zamanda ötenazi uygulanan bir sıçanın trakeasına verilmesinden önce ve (b) sonra çekilen görüntüler, mıknatıs doğrudan görüntüleme alanının üzerine yerleştirilmiştir. Görüntülenen alan iki kıkırdak halkası arasında yer almaktadır. MP5 verilmeden önce hava yolunda bir miktar sıvı bulunmaktadır. Kırmızı kutu, kontrastı artırıcı büyütmeyi içermektedir. Bu görüntüler, Ek Video S6:MP5'te gösterilen videodan alınmıştır.
Canlı organizmada trakea boyunca mıknatısın hareket ettirilmesi, MP zincirinin hava yolu yüzeyinde kılcal damarlarda görülenlere benzer şekilde açı değiştirmesine neden oldu (bkz. Şekil 8 ve Ek Video S7:MP5). Bununla birlikte, çalışmamızda, MP'ler kılcal damarlarda olduğu gibi canlı hava yolunun yüzeyi boyunca sürüklenemedi. Bazı durumlarda, mıknatıs sola ve sağa hareket ettikçe MP zinciri uzamaktadır. İlginç bir şekilde, mıknatıs trakea boyunca uzunlamasına hareket ettirildiğinde parçacık zincirinin yüzey sıvı tabakasının derinliğini değiştirdiğini ve mıknatıs doğrudan başın üzerine hareket ettirildiğinde ve parçacık zinciri dikey bir konuma döndürüldüğünde genişlediğini de bulduk (bkz. Ek Video S7). (MP5, 0:09'da, sağ altta). Mıknatıs trakeanın üst kısmından yanal olarak (yani trakeanın uzunluğu boyunca değil, hayvanın soluna veya sağına doğru) hareket ettirildiğinde karakteristik hareket modeli değişti. Parçacıklar hareket ederken hala açıkça görülebiliyordu, ancak mıknatıs trakeadan çıkarıldığında, parçacık dizilerinin uçları görünür hale geldi (Ek Video S8:MP5, 0:08'den itibaren). Bu, bir cam kılcal boruda uygulanan manyetik alan altında gözlemlediğimiz MP davranışı ile tutarlıdır.
Anestezi uygulanmış canlı bir sıçanın trakeasında MP5'i gösteren örnek görüntüler. (a) Mıknatıs, trakeanın üstünde ve solunda görüntü almak için kullanılır, daha sonra (b) mıknatıs sağa doğru hareket ettirildikten sonra. Kırmızı kutu, kontrastı artırıcı büyütmeyi içerir. Bu görüntüler, Ek Video S7:MP5'te gösterilen videodan alınmıştır.
İki kutup trakeanın üstünde ve altında kuzey-güney yöneliminde (yani çekici; Şekil 3b) yapılandırıldığında, MP kirişleri daha uzun göründü ve trakeanın sırt yüzeyinde değil, trakeanın yan duvarında yer aldı (Ek Video S9:MP5'e bakınız). Bununla birlikte, çift mıknatıslı bir cihaz kullanıldığında, sıvı iletiminden sonra tek bir konumda (yani trakeanın sırt yüzeyinde) yüksek konsantrasyonlarda partikül tespit edilmedi; bu durum tipik olarak tek mıknatıslı bir cihaz kullanıldığında meydana gelir. Daha sonra, bir mıknatıs kutupları ters yönde itecek şekilde yapılandırıldığında (Şekil 3c), iletimden sonra görüş alanında görünen partikül sayısında artış görülmedi. Her iki çift mıknatıslı yapılandırmanın kurulumu, mıknatısları sırasıyla çeken veya iten yüksek manyetik alan şiddetleri nedeniyle zordur. Kurulum daha sonra, hava yoluna paralel ancak hava yolundan 90 derece açıyla geçen tek bir mıknatısa değiştirildi, böylece alan çizgileri trakea duvarını dik olarak kesti. (Şekil 3d), yan duvarda parçacık agregasyonunun gözlemlenip gözlemlenemeyeceğini belirlemek için tasarlanmış bir yönelimdir. Bununla birlikte, bu konfigürasyonda, MP birikiminin veya mıknatıs hareketinin tanımlanabilir bir hareketi yoktu. Tüm bu sonuçlara dayanarak, in vivo gen taşıyıcı çalışmaları için tek mıknatıslı, 30 derecelik bir yönelim konfigürasyonu (Şekil 3a) seçildi.
Hayvanın insancıl bir şekilde öldürülmesinin hemen ardından tekrar tekrar görüntülenmesinde, karıştırıcı doku hareketinin olmaması, net interkondral alanda daha ince ve daha kısa parçacık çizgilerinin ayırt edilebileceği anlamına geliyordu; bu çizgiler, mıknatısın öteleme hareketiyle uyumlu olarak "titreşimli" bir şekilde hareket ediyordu. Bununla birlikte, MP6 parçacıklarının varlığı ve hareketi hala net bir şekilde görülemiyor.
LV-LacZ titresi 1,8 × 10⁸ TU/ml idi ve CombiMag MP (MP6) ile 1:1 karıştırıldıktan sonra hayvanlara 9 × 10⁷ TU/ml LV taşıyıcısının 50 μl'lik trakeal dozu (yani 4,5 × 10⁶ TU/sıçan) verildi. Bu çalışmalarda, doğum sırasında mıknatısı hareket ettirmek yerine, LV transdüksiyonunun (a) manyetik alan yokluğunda vektör iletimine kıyasla iyileştirilip iyileştirilemeyeceğini ve (b) hava yolu hücrelerinin üst hava yolunun manyetik hedef bölgelerine odaklanıp odaklanamayacağını belirlemek için mıknatısı tek bir pozisyonda sabitledik.
Mıknatısların varlığı ve CombiMag'ın LV vektörleriyle birlikte kullanımı, standart LV vektör uygulama protokolümüzde olduğu gibi hayvan sağlığı üzerinde olumsuz bir etkiye sahip görünmedi. Mekanik bozulmaya maruz kalan trakea bölgesinin ön görüntüleri (Ek Şekil 1), mıknatıs mevcut olduğunda LV-MP ile tedavi edilen hayvan grubunda önemli ölçüde daha yüksek transdüksiyon seviyeleri olduğunu gösterdi (Şekil 9a). Kontrol grubunda sadece az miktarda mavi LacZ boyaması mevcuttu (Şekil 9b). Normalleştirilmiş X-Gal boyalı alanların nicelendirilmesi, manyetik alan varlığında LV-MP uygulamasının yaklaşık 6 katlık bir iyileşme sağladığını gösterdi (Şekil 9c).
LV-MP tarafından trakeal transdüksiyonu gösteren örnek kompozit görüntüler (a) manyetik alan varlığında ve (b) manyetik alan yokluğunda. (c) Manyetik alan kullanıldığında trakea içindeki normalize edilmiş LacZ transdüksiyon alanında istatistiksel olarak anlamlı iyileşme (*p = 0,029, t-testi, grup başına n = 3, ortalama ± SEM).
Nötr hızlı kırmızı ile boyanmış kesitlerde (Ek Şekil 2'de gösterilen örnekte olduğu gibi), LacZ ile boyanmış hücrelerin daha önce bildirildiği gibi benzer bir düzende ve konumda bulunduğu görüldü.
Hava yolu gen terapisi için en önemli zorluklardan biri, taşıyıcı parçacıkların ilgi duyulan bölgelere doğru şekilde lokalize edilmesi ve hava akışı ve aktif mukus temizliğinin olduğu hareketli akciğerde yüksek transdüksiyon verimliliğine ulaşılmasıdır. Kistik fibrozlu hava yolu hastalığını tedavi etmek için tasarlanmış LV taşıyıcıları için, taşıyıcı parçacıkların iletken hava yollarında kalma süresinin artırılması bugüne kadar ulaşılması zor bir hedef olmuştur. Castellani ve ark. tarafından belirtildiği gibi, transdüksiyonu iyileştirmek için manyetik alanların kullanımı, basitlik, maliyet etkinliği, dağıtım lokalizasyonu, artan verimlilik ve daha kısa inkübasyon süreleri ve muhtemelen daha küçük bir taşıyıcı dozu birleştirebildiği için elektroporasyon gibi diğer gen iletim yöntemlerine kıyasla avantajlara sahiptir.10 Bununla birlikte, dış manyetik kuvvetlerin etkisi altında hava yollarında manyetik parçacıkların in vivo birikimi ve davranışı hiçbir zaman tanımlanmamıştır ve bu yöntemin, sağlam canlı hava yollarında gen ekspresyon seviyelerini artırmak için in vivo uygulanabilirliği de gösterilmemiştir.
Laboratuvar ortamında gerçekleştirdiğimiz senkrotron PCXI deneylerimiz, polistiren MP hariç test ettiğimiz tüm parçacıkların kullandığımız görüntüleme düzeneğinde görülebildiğini gösterdi. Manyetik alan varlığında, MP'ler uzunlukları parçacık türü ve manyetik alan şiddetiyle (yani mıknatısın yakınlığı ve hareketiyle) ilişkili olan teller oluşturur. Şekil 10'da gösterildiği gibi, gözlemlediğimiz teller, her bir parçacığın mıknatıslanması ve kendi yerel manyetik alanını oluşturması nedeniyle oluşur. Bu ayrı alanlar, diğer benzer parçacıkların bir araya gelmesine ve bağlanmasına neden olur; bu da diğer parçacıkların yerel çekici ve itici kuvvetlerinden kaynaklanan yerel kuvvetler nedeniyle grup halinde tel benzeri hareketlere yol açar.
(a,b) Sıvı dolu kılcal damarların içinde oluşan parçacık dizilerini ve (c,d) hava dolu trakeayı gösteren şematik. Kılcal damarların ve trakeanın ölçekli çizilmediğine dikkat edin. (a) paneli ayrıca, diziler halinde düzenlenmiş Fe3O4 parçacıkları içeren MP'nin bir açıklamasını da içermektedir.
Mıknatıs kılcal borunun üzerine hareket ettirildiğinde, Fe3O4 içeren MP3-5 için parçacık dizisinin açısı kritik bir eşiğe ulaştıktan sonra, parçacık dizisi artık orijinal konumunda kalmadı, yüzey boyunca yeni bir konuma hareket etti. Bu etki, cam kılcal boru yüzeyinin bu hareketin gerçekleşmesine izin verecek kadar pürüzsüz olmasından kaynaklanıyor olabilir. İlginç bir şekilde, MP6 (CombiMag) bu şekilde davranmadı; bunun nedeni muhtemelen parçacıkların daha küçük olması, farklı kaplamalara veya yüzey yüklerine sahip olması veya özel bir taşıyıcı sıvının hareket etme yeteneklerini etkilemesidir. CombiMag parçacıklarının görüntü kontrastı da daha zayıftır; bu da sıvının ve parçacıkların benzer yoğunluklara sahip olabileceğini ve bu nedenle birbirlerine doğru kolayca hareket edemeyebileceğini düşündürmektedir. Parçacıklar ayrıca mıknatıs çok hızlı hareket ederse sıkışabilir; bu da manyetik alan gücünün her zaman sıvıdaki parçacıklar arasındaki sürtünmeyi aşamadığını gösterir ve bu nedenle manyetik alan gücünün ve mıknatıs ile hedef alan arasındaki mesafenin çok önemli olmasının şaşırtıcı olmadığını düşündürmektedir. Birlikte ele alındığında, bu sonuçlar ayrıca, mıknatısların hedef boyunca akan birçok MP'yi yakalayabildiğini, ancak aynı zamanda Bu bölgede, CombiMag parçacıklarını trakeanın yüzeyi boyunca hareket ettirmek için mıknatıslara güvenilebileceği olasılığı düşüktür. Bu nedenle, in vivo LV-MP çalışmalarında, hava yolu ağacının belirli bölgelerini fiziksel olarak hedeflemek için statik manyetik alanların kullanılması gerektiği sonucuna varıyoruz.
Vücuda iletilen parçacıklar, karmaşık ve hareketli vücut dokusu bağlamında tanımlanmaları zordur, ancak MP ipliklerini "titreştirmek" için mıknatısı trakeanın üzerinde yatay olarak hareket ettirerek tespit etme yeteneği artırılmıştır. Canlı görüntüleme mümkün olsa da, hayvan insancıl bir şekilde öldürüldükten sonra parçacık hareketini ayırt etmek daha kolaydır. MP konsantrasyonları, mıknatıs görüntüleme alanının üzerinde konumlandırıldığında genellikle bu bölgede en yüksek seviyedeydi, ancak bazı parçacıklar genellikle trakeanın daha ilerisinde de bulunuyordu. İn vitro çalışmalardan farklı olarak, mıknatısı hareket ettirerek parçacıklar trakea boyunca sürüklenemez. Bu bulgu, trakeanın yüzeyini kaplayan mukusun solunan parçacıkları tipik olarak nasıl işlediği, onları mukusta hapsettiği ve daha sonra mukosiliyer temizleme mekanizmasıyla temizlediğiyle tutarlıdır.
Trakeanın üstünde ve altında çekim için mıknatısların kullanılmasının (Şekil 3b), tek bir noktada yoğunlaşmış bir manyetik alan yerine daha homojen bir manyetik alan oluşturabileceği ve potansiyel olarak parçacıkların daha homojen bir dağılımına yol açabileceği hipotezini öne sürdük. Bununla birlikte, ön çalışmamız bu hipotezi destekleyecek net bir kanıt bulamadı. Benzer şekilde, itme için bir çift mıknatısın yapılandırılması (Şekil 3c), görüntülenen alanda daha fazla parçacık birikimine yol açmadı. Bu iki bulgu, çift mıknatıs kurulumunun MP hedeflemesinin yerel kontrolünü önemli ölçüde iyileştirmediğini ve ortaya çıkan güçlü manyetik kuvvetlerin yapılandırılmasının zor olduğunu, bu yaklaşımı daha az pratik hale getirdiğini göstermektedir. Benzer şekilde, mıknatısı trakeanın üstüne ve içinden yönlendirmek (Şekil 3d) de görüntülenen alanda tutulan parçacık sayısını artırmadı. Bu alternatif konfigürasyonlardan bazılarının, birikim alanında daha düşük manyetik alan şiddetlerine yol açması nedeniyle başarılı olmayabileceği düşünülmektedir. Bu nedenle, tek 30 derecelik açılı mıknatıs konfigürasyonu (Şekil 3a), en kolay ve en verimli yöntem olarak kabul edilmektedir. canlı organizmada test.
LV-MP çalışması, LV vektörlerinin CombiMag ile birleştirilip manyetik alan varlığında fiziksel bir bozulma sonrasında verildiğinde, trakeadaki transdüksiyon seviyelerinin kontrollere kıyasla önemli ölçüde arttığını göstermiştir. Senkrotron görüntüleme çalışmaları ve LacZ sonuçlarına dayanarak, manyetik alanın LV'yi trakea içinde koruyabildiği ve akciğerin derinliklerine hemen nüfuz eden vektör parçacıklarının sayısını azaltabildiği görülmüştür. Bu tür hedefleme iyileştirmeleri, verilen titreleri, hedef dışı transdüksiyonu, inflamatuar ve immün yan etkileri ve gen taşıyıcı maliyetlerini azaltırken daha yüksek etkinliğe yol açabilir. Önemli olarak, üreticiye göre CombiMag, diğer viral vektörler (AAV gibi) ve nükleik asitler de dahil olmak üzere diğer gen transfer yöntemleriyle birlikte kullanılabilir.