Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümünde CSS desteği sınırlıdır. En iyi deneyim için güncel bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da uyumluluk modunu kapatmanızı) öneririz. Bu arada, sürekli desteğin sağlanması için siteyi stiller ve JavaScript olmadan görüntüleyeceğiz.
Kistik fibroz akciğer hastalığının tedavisi için gen vektörleri, periferik akciğer transdüksiyonu terapötik fayda sağlamadığından, iletken hava yollarını hedef almalıdır. Viral transdüksiyon verimliliği doğrudan vektör kalış süresiyle ilgilidir. Bununla birlikte, gen taşıyıcıları gibi iletim sıvıları doğal olarak inspirasyon sırasında alveollere yayılır ve herhangi bir formdaki terapötik partiküller mukosiliyer taşıma ile hızla temizlenir. Gen taşıyıcılarının hava yollarındaki kalış süresinin uzatılması önemlidir ancak elde edilmesi zordur. Hava yollarının yüzeyine yönlendirilebilen gen taşıyıcısı konjuge manyetik partiküller bölgesel hedeflemeyi iyileştirebilir. İn vivo görselleştirmenin zorlukları nedeniyle, uygulanan bir manyetik alan varlığında hava yolu yüzeyindeki bu tür küçük manyetik partiküllerin davranışı yeterince anlaşılmamıştır. Bu çalışmanın amacı, anestezi uygulanmış sıçanların trakeasındaki bir dizi manyetik partikülün in vivo hareketini görselleştirmek için senkrotron görüntülemeyi kullanmak ve in vivo bireysel ve toplu partikül davranışının dinamiklerini ve modellerini incelemekti. Daha sonra, manyetik alan varlığında lentiviral manyetik partiküllerin iletiminin Sıçan trakeasında transdüksiyon verimliliğini artıracaktır. Senkrotron X-ışını görüntüleme, manyetik parçacıkların sabit ve hareketli manyetik alanlardaki davranışını in vitro ve in vivo olarak ortaya koymaktadır. Parçacıklar mıknatıslarla canlı hava yolunun yüzeyi boyunca kolayca sürüklenemezler, ancak taşıma sırasında birikintiler manyetik alanın en güçlü olduğu görüş alanında yoğunlaşır. Lentiviral manyetik parçacıklar bir manyetik alan varlığında verildiğinde transdüksiyon verimliliği altı kat artmıştır. Bu sonuçlar birlikte, lentiviral manyetik parçacıkların ve manyetik alanların gen vektörü hedeflemesini iyileştirmek ve in vivo olarak iletken hava yollarında transdüksiyon seviyelerini artırmak için değerli yaklaşımlar olabileceğini düşündürmektedir.
Kistik fibroz (KF), KF transmembran iletkenlik düzenleyicisi (CFTR) adı verilen tek bir gendeki varyasyondan kaynaklanır. CFTR proteini, KF patogenezinin önemli bir yeri olan iletken hava yolları da dahil olmak üzere vücuttaki birçok epitel hücrede bulunan bir iyon kanalıdır. CFTR defektleri anormal su taşınımına yol açarak hava yolu yüzeyinin susuz kalmasına ve hava yolu yüzey sıvısı (ASL) tabakasının derinliğinin azalmasına neden olur. Bu ayrıca mukosiliyer taşıma (MCT) sisteminin solunan parçacıkları ve patojenleri hava yollarından temizleme yeteneğini de bozar. Amacımız, CFTR geninin doğru kopyasını iletmek ve ASL, MCT ve akciğer sağlığını iyileştirmek için bir lentiviral (LV) gen tedavisi geliştirmek ve bu parametreleri in vivo ölçebilen yeni teknolojiler geliştirmeye devam etmektir1.
LV vektörleri, esas olarak terapötik geni kalıcı olarak hava yolu bazal hücrelerine (hava yolu kök hücreleri) entegre edebildikleri için KF hava yolu gen terapisi için önde gelen adaylardan biridir. Bu önemlidir çünkü fonksiyonel gen düzeltilmiş KF ile ilişkili hava yolu yüzey hücrelerine farklılaşarak normal hidrasyonu ve mukus temizliğini geri kazandırabilirler ve bu da ömür boyu faydalar sağlar. LV vektörleri, KF akciğer hastalığının başladığı yer olduğu için iletken hava yoluna yönlendirilmelidir. Vektörün akciğere daha derin bir şekilde iletilmesi alveoler transdüksiyona neden olabilir ancak bunun KF'de terapötik bir faydası yoktur. Bununla birlikte, gen taşıyıcıları gibi sıvılar, iletimden sonra inhalasyon sırasında doğal olarak alveollere göç eder3,4 ve terapötik parçacıklar MCT tarafından hızla ağız boşluğuna temizlenir. LV transdüksiyon verimliliği, vektörün hücresel alımına izin vermek için hedef hücrelerin yanında kaldığı süreyle doğrudan ilişkilidir - "ikamet süresi"5 - bu, tipik bölgesel hava akışı ve koordineli partikül mukus yakalama ve MCT ile kolayca azaltılabilir. KF için, LV'nin Bu bölgede yüksek düzeyde transdüksiyon elde etmek için hava yolunun açılması önemlidir, ancak şu ana kadar zorlu olmuştur.
Bu engeli aşmak için, LV manyetik parçacıklarının (MP'ler) iki tamamlayıcı şekilde yardımcı olabileceğini öne sürüyoruz. Birincisi, hedeflemeyi iyileştirmek ve gen taşıyıcı parçacıkların istenen hava yolu bölgesinde yerleşmesine yardımcı olmak için hava yolu yüzeyine manyetik olarak yönlendirilebilirler; ve ASL) hücre katmanına hareket edebilirler 6. MP'ler, antikorlara, kemoterapötik ilaçlara veya hücre zarlarına bağlanan veya ilgili hücre yüzeyi reseptörlerine bağlanan ve statik elektrik varlığında tümör bölgelerinde biriken diğer küçük moleküllere bağlandıklarında hedefli ilaç taşıma araçları olarak yaygın şekilde kullanılmıştır. Kanser Tedavisinde Manyetik Alanlar 7. Diğer "hipertermal" teknikler, MP'leri salınımlı manyetik alanlara maruz kaldıklarında ısıtmayı ve böylece tümör hücrelerini yok etmeyi amaçlar. Manyetik alanın, DNA'nın hücrelere transferini artırmak için bir transfeksiyon ajanı olarak kullanıldığı manyetik transfeksiyon ilkesi, genellikle transdüksiyonu zor hücre hatları için bir dizi viral olmayan ve viral gen vektörü kullanılarak in vitro kullanılır. LV manyetotransfeksiyonunun etkinliği, statik bir manyetik alan varlığında bir insan bronşiyal epitel hücre hattına LV-MP'lerin in vitro iletilmesiyle, transdüksiyon verimliliğini tek başına LV vektörüne kıyasla 186 kat artırarak belirlenmiştir. LV-MP ayrıca, manyetik transfeksiyonun CF balgamı varlığında hava-sıvı arayüz kültürlerinde LV transdüksiyonunu 20 kat artırdığı bir in vitro CF modeline de uygulanmıştır10. Bununla birlikte, organların in vivo manyetotransfeksiyonu nispeten az ilgi görmüştür ve yalnızca birkaç hayvanda değerlendirilmiştir çalışmalar11,12,13,14,15, özellikle akciğerlerde16,17. Bununla birlikte, Kistik Fibroz akciğer tedavisinde manyetik transfeksiyon fırsatları açıktır. Tan ve ark. (2020), "etkili manyetik nanopartikül pulmoner iletiminin kanıta dayalı bir çalışmasının, Kistik Fibroz hastalarında klinik sonuçları iyileştirmek için gelecekteki CFTR inhalasyon stratejilerinin önünü açacağını" belirtmiştir6.
Hava yolu yüzeylerindeki küçük manyetik parçacıkların uygulanan bir manyetik alan varlığındaki davranışını görselleştirmek ve incelemek zordur ve bu nedenle yeterince anlaşılmamıştır. Diğer çalışmalarda, ASL derinliğindeki18 ve MCT davranışındaki19,20 dakika in vivo değişiklikleri noninvaziv olarak görselleştirmek ve ölçmek için senkrotron yayılım tabanlı faz kontrastlı X-ışını görüntüleme (PB-PCXI) yöntemini geliştirdik ve doğrudan gaz kanalı yüzey hidrasyonunu ölçmek ve tedavi etkinliğinin erken bir göstergesi olarak kullandık. Ek olarak, MCT değerlendirme yöntemimiz, PB-PCXI21 kullanılarak görülebilen MCT belirteçleri olarak alümina veya yüksek kırılma indeksli camdan oluşan 10–35 µm çapındaki parçacıkları kullanır. Her iki teknik de MP dahil olmak üzere çeşitli parçacık tiplerinin görselleştirilmesi için uygundur.
Yüksek mekansal ve zamansal çözünürlüğü nedeniyle, PB-PCXI tabanlı ASL ve MCT analiz tekniklerimiz, MP gen iletim tekniklerini anlamamıza ve optimize etmemize yardımcı olmak için tek ve toplu parçacık davranışının dinamiklerini ve modellerini canlı olarak incelemek için oldukça uygundur. Burada kullandığımız yaklaşım, farelerin burun ve akciğer hava yollarına sahte vektör dozu iletimi sonrasında sıvı hareketini görselleştirdiğimiz SPring-8 BL20B2 ışın hattını kullanarak yaptığımız çalışmalardan türetilmiştir ve bu, gen taşıyıcı doz hayvan çalışmalarımızda gözlemlenen düzensiz gen ifadesi modellerini açıklamaya yardımcı olmaktadır3,4.
Bu çalışmanın amacı, canlı sıçanların trakeasındaki bir dizi MP'nin in vivo hareketlerini görselleştirmek için senkrotron PB-PCXI'i kullanmaktı. Bu PB-PCXI görüntüleme çalışmaları, MP hareketi üzerindeki etkilerini belirlemek için bir dizi MP'yi, manyetik alan şiddetini ve yerini test etmek üzere tasarlandı. Dışarıdan uygulanan bir manyetik alanın, iletilen MP'nin hedef bölgede kalmasına veya oraya hareket etmesine yardımcı olacağı hipotezini öne sürdük. Bu çalışmalar ayrıca, biriktirme işleminden sonra trakeada tutulan parçacık sayısını en üst düzeye çıkaran mıknatıs konfigürasyonlarını belirlememize olanak sağladı. İkinci bir dizi çalışmada, LV-MP'lerin solunum yolu hedeflemesi bağlamında iletilmesinin LV transdüksiyon verimliliğinin artmasıyla sonuçlanacağı varsayımına dayanarak, LV-MP'lerin sıçan hava yoluna in vivo iletilmesinden kaynaklanan transdüksiyon örüntüsünü göstermek için bu optimum konfigürasyonu kullanmaya çalıştık.
Tüm hayvan çalışmaları Adelaide Üniversitesi (M-2019-060 ve M-2020-022) ve SPring-8 Synchrotron Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanan protokollere göre gerçekleştirildi. Deneyler ARRIVE yönergelerine göre gerçekleştirildi.
Tüm X-ışını görüntülemeleri, daha önce açıklananlara benzer bir kurulum kullanılarak Japonya'daki SPring-8 senkrotronunda BL20XU ışın hattında gerçekleştirildi21,22.Kısaca, deney kutusu senkrotron depolama halkasından 245 m uzaklıktaydı.Parçacık görüntüleme çalışmaları için 0,6 m'lik bir numune-dedektör mesafesi ve faz kontrastı etkileri oluşturmak için in vivo görüntüleme çalışmaları için 0,3 m'lik bir mesafe kullanıldı.25 keV'luk tek renkli bir ışın enerjisi kullanıldı.Görüntüler, bir sCMOS dedektörüne bağlı yüksek çözünürlüklü bir X-ışını dönüştürücü (SPring-8 BM3) kullanılarak yakalandı.Dönüştürücü, X-ışınlarını 10 µm kalınlığında bir sintilatör (Gd3Al2Ga3O12) kullanarak görünür ışığa dönüştürür ve daha sonra bir × 10 mikroskop objektifi (NA 0,3) kullanılarak bir sCMOS sensörüne yönlendirilir.sCMOS dedektörü Orca-Flash4.0'dı (Hamamatsu Photonics, Japonya) 2048 × 2048 piksel dizi boyutuna ve 6,5 × 6,5 µm ham piksel boyutuna sahip. Bu kurulum, 0,51 µm'lik etkili izotropik piksel boyutu ve yaklaşık 1,1 mm × 1,1 mm'lik bir görüş alanı sağlar. Solunum kaynaklı hareket eserlerini en aza indirirken, hava yolunun içindeki ve dışındaki manyetik parçacıkların sinyal-gürültü oranını en üst düzeye çıkarmak için 100 ms'lik bir pozlama uzunluğu seçildi. İn vivo çalışmalar için, pozlamalar arasında X-ışını demetini bloke ederek radyasyon dozunu sınırlamak için X-ışını yoluna hızlı bir X-ışını deklanşörü yerleştirildi.
LV taşıyıcısı, BL20XU görüntüleme odası Biyogüvenlik Seviyesi 2 sertifikalı olmadığından hiçbir SPring-8 PB-PCXI görüntüleme çalışmasında kullanılmadı. Bunun yerine, önce manyetik alanların cam kılcal damarlar içindeki ve ardından canlı hava yollarındaki MP hareketini nasıl etkilediğini anlamak için iki ticari tedarikçiden çeşitli boyutlar, malzemeler, demir konsantrasyonları ve uygulamaları kapsayan iyi karakterize edilmiş bir dizi MP seçtik. Yüzeyde.MP'ler 0,25 ila 18 μm arasında değişen boyutlardadır ve çeşitli malzemelerden yapılırlar (bkz. Tablo 1), ancak MP içindeki manyetik parçacıkların boyutu da dahil olmak üzere her bir numunenin bileşimi bilinmemektedir.Kapsamlı MCT çalışmalarımıza dayanarak 19, 20, 21, 23, 24, örneğin ardışık kareleri çıkararak MP hareketinin daha iyi görünürlüğünü görmek suretiyle trakeal hava yolu yüzeyinde 5 μm kadar küçük MP'lerin görülebileceğini bekliyoruz.0,25 μm boyutundaki tek bir MP, görüntüleme cihazının çözünürlüğünden daha küçüktür, ancak PB-PCXI'nin hacim kontrastını ve biriktirildikten sonra biriktirildikleri yüzey sıvısının hareketini algılaması beklenmektedir.
Tablo 1'deki her MP için örnekler, 0,63 mm iç çapa sahip 20 μl cam kılcallarda (Drummond Microcaps, PA, ABD) hazırlandı.Kırmızı parçacıklar suda bulunurken, CombiMag parçacıkları üreticinin tescilli sıvısında bulunur.Her tüp yarı yarıya sıvı ile doldurulur (yaklaşık 11 μl) ve örnek tutucuya yerleştirilir (bkz. Şekil 1).Cam kılcallar sırasıyla görüntüleme kutusundaki örnek aşamasına yatay olarak yerleştirildi ve sıvının kenarları konumlandırıldı.1,17 Tesla kalıntı mıknatıslanmaya sahip 19 mm çapında (28 mm uzunluğunda) nikel kabuklu nadir toprak neodim demir bor (NdFeB) mıknatıs (N35, kat. no. LM1652, Jaycar Electronics, Avustralya) ayrı bir çeviri aşamasına bağlanarak görüntüleme sırasında konumunu uzaktan değiştirebilir.X-ışını görüntü edinimi, mıknatıs örnekten yaklaşık 30 mm yukarıya yerleştirildiğinde başlar ve görüntüler saniyede 4 kare hızında elde edilir. Görüntüleme sırasında mıknatıs, cam kılcal tüpe yaklaştırılır (yaklaşık 1 mm uzaklıkta) ve daha sonra alan şiddeti ve pozisyonun etkilerini değerlendirmek için tüp boyunca çevrilir.
Numune xy translasyon aşamasında cam kılcallarda MP numuneleri içeren in vitro görüntüleme düzeneği. X-ışını demetinin yolu kırmızı kesik çizgi ile işaretlenmiştir.
MP'lerin in vitro görünürlüğü sağlandıktan sonra, bunların bir alt kümesi vahşi tip dişi albino Wistar sıçanlarında (~12 haftalık, ~200 g) in vivo olarak test edildi. 0,24 mg/kg medetomidin (Domitor®, Zenoaq, Japonya), 3,2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japonya) ve 4 mg/kg butorfanol (Vetorphale®, Meiji Seika) Sıçanlar, intraperitoneal enjeksiyonla bir Pharma), Japonya) karışımı ile anestezi altına alındı. Anesteziden sonra, trakea etrafındaki kürk çıkarılarak, bir endotrakeal tüp (ET; 16 Ga iv kanül, Terumo BCT) yerleştirilerek ve vücut sıcaklığını korumak için termal bir torba içeren özel yapım bir görüntüleme plakası üzerinde sırtüstü hareketsiz hale getirilerek görüntüleme için hazırlandı 22 . Görüntüleme plakası daha sonra, trakeayı yatay olarak hizalamak için görüntüleme kutusundaki örnek çeviri aşamasına hafif bir açıyla takıldı Şekil 2a'da gösterildiği gibi X-ışını görüntüsü.
(a) SPring-8 görüntüleme kutusundaki canlı görüntüleme kurulumunda, X-ışını ışınının yolu kırmızı kesik çizgiyle işaretlenmiştir. (b,c) Trakeadaki mıknatıs lokalizasyonu, ortogonal olarak monte edilmiş iki IP kamera kullanılarak uzaktan gerçekleştirildi. Ekran görüntüsünün sol tarafında, başı tutan tel halka ve ET tüpü içindeki yerinde bulunan iletim kanülü görülebilir.
Uzaktan kumandalı bir şırınga pompası sistemi (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL), 100 μl cam şırınga kullanılarak 30 Ga iğne aracılığıyla PE10 tüpüne (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) bağlandı. ET tüpünü yerleştirirken ucun trakeada doğru konumda olduğundan emin olmak için tüpü işaretleyin. Mikro pompayı kullanarak, tüpün ucu verilecek MP örneğine daldırılırken şırınga pistonu geri çekildi. Yüklenen verme tüpü daha sonra endotrakeal tüpe yerleştirildi ve ucu beklenen uygulanan manyetik alanımızın en güçlü kısmına yerleştirildi. Görüntü edinimi, Arduino tabanlı zamanlama kutumuza bağlı bir solunum dedektörü kullanılarak kontrol edildi ve tüm sinyaller (örneğin sıcaklık, solunum, deklanşör açma/kapama ve görüntü edinimi) Powerlab ve LabChart (AD Instruments, Sidney, Avustralya) kullanılarak kaydedildi 22. Görüntüleme sırasında Muhafaza erişilemez olduğunda, iki IP kamera (Panasonic BB-SC382) birbirlerine yaklaşık 90° açıyla yerleştirildi ve görüntüleme sırasında mıknatısın trakeaya göre konumunu izlemek için kullanıldı (Şekil 2b,c). Hareket artefaktlarını en aza indirmek için, gelgit sonu akış platosu sırasında her nefes için bir görüntü alındı.
Görüntüleme yuvasının dışından uzaktan yerleştirilebilen ikinci bir aşamaya bir mıknatıs bağlanır. Çeşitli mıknatıs konumları ve yapılandırmaları test edildi, bunlar şunları içerir: Trakeanın yaklaşık 30° açıyla yukarısına monte edilmiş (yapılandırmalar Şekil 2a ve 3a'da gösterilmiştir); bir mıknatıs hayvanın üstünde diğeri altında, kutuplar çekici olacak şekilde ayarlanmış (Şekil 3b); bir mıknatıs hayvanın üstünde diğeri altında, kutuplar itici olacak şekilde ayarlanmış (Şekil 3c); ve bir mıknatıs trakeanın üstünde ve ona dik olacak şekilde (Şekil 3d). Hayvan ve mıknatıs yapılandırıldıktan ve test edilecek MP şırınga pompasına yüklendikten sonra, görüntü elde ederken 4 μl/sn hızında 50 μl doz verin. Daha sonra mıknatıs görüntü elde etmeye devam ederken trakea boyunca ileri geri veya yanal olarak hareket ettirilir.
Canlı görüntüleme için mıknatıs konfigürasyonu (a) trakeanın üzerinde yaklaşık 30° açıyla tek bir mıknatıs, (b) çekmek üzere ayarlanmış iki mıknatıs, (c) itmek üzere ayarlanmış iki mıknatıs, (d) trakeanın üzerinde ve dik bir mıknatıs. Gözlemci, trakeadan ağızdan akciğerlere doğru baktı ve X-ışını demeti sıçanın sol tarafından geçerek sağ tarafından çıktı. Mıknatıs, hava yolu boyunca veya X-ışını demeti yönünde trakeanın üzerinde sola ve sağa hareket ettirilir.
Ayrıca, solunum ve kalp hareketinde karışıklığa yol açan bir durum olmadığında hava yollarındaki parçacıkların görünürlüğünü ve davranışını belirlemeye çalıştık. Bu nedenle, görüntüleme periyodunun sonunda hayvanlar pentobarbital aşırı dozundan (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, ABD; ~65 mg/kg ip) dolayı insanca bir şekilde öldürüldü. Bazı hayvanlar görüntüleme platformunda bırakıldı ve solunum ve kalp atışı durduğunda, hava yolu yüzeyinde MP görünmüyorsa ek bir MP dozu eklenerek görüntüleme işlemi tekrarlandı.
Elde edilen görüntüler düz alan ve karanlık alan düzeltmeleri yapılarak MATLAB'da (R2020a, The Mathworks) yazılmış özel bir betik kullanılarak bir filme (saniyede 20 kare; solunum hızına bağlı olarak normal hızın 15-25 katı) dönüştürüldü.
Tüm LV gen vektörü iletim çalışmaları, Adelaide Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Araştırma Tesisinde yürütülmüş olup, SPring-8 deneyinin sonuçlarını kullanarak manyetik alan varlığında LV-MP iletiminin in vivo gen transferini artırıp artıramayacağını değerlendirmeyi amaçlamıştır. MP ve manyetik alanın etkilerini değerlendirmek için iki grup hayvan tedavi edilmiştir: Bir gruba mıknatıs yerleştirilmiş LV-MP verilirken, diğer gruba mıknatıs olmadan LV-MP içeren bir kontrol grubu verilmiştir.
LV gen vektörleri daha önce açıklanan yöntemler kullanılarak üretildi 25, 26. LacZ vektörü, transdüksiyonlu hücrelerde akciğer dokusu cephelerinde ve doku kesitlerinde görülebilen mavi bir reaksiyon ürünü üreten, yapısal MPSV promotörü (LV-LacZ) tarafından yönlendirilen nükleer-lokalize beta-galaktozidaz genini ifade eder. Titrasyon, hücre kültürlerinde, titreyi TU/ml olarak hesaplamak için bir hemositometre ile LacZ pozitif hücrelerin sayısını manuel olarak sayarak gerçekleştirildi. Taşıyıcılar -80 °C'de kriyoprezervasyona tabi tutulur, kullanımdan önce çözülür ve 1:1 oranında karıştırılarak ve teslimattan önce en az 30 dakika buz üzerinde inkübe edilerek CombiMag'e bağlanır.
Normal Sprague Dawley sıçanları (n = 3/grup, ~2-3, 0,4 mg/kg medetomidin (Domitor, Ilium, Avustralya) ve 60 mg/kg ketamin (Ilium, Avustralya) karışımı ile intraperitoneal olarak anestezi altına alındı) aylık) ip) enjeksiyon ve 16 Ga iv kanül ile cerrahi olmayan oral kanülasyon. Trakeal hava yolu dokusunun LV transdüksiyonunu aldığından emin olmak için, daha önce açıklanan mekanik bozulma protokolümüz kullanılarak şartlandırıldı, bu protokolde trakeal hava yolu yüzeyi bir tel sepet (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, ABD) ile aksiyel olarak ovuluyordu) 30 saniye28. LV-MP'nin trakeal uygulaması daha sonra bozulmadan yaklaşık 10 dakika sonra biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirildi.
Bu deneyde kullanılan manyetik alan, aynı mıknatısların damıtma stent klipsleri kullanılarak trakea üzerinde tutulmasıyla in vivo X-ışını görüntüleme çalışmasına benzer şekilde yapılandırılmıştır (Şekil 4). 50 μl hacimli (2 × 25 μl alikot) LV-MP, daha önce açıklandığı gibi jel uçlu bir pipet kullanılarak trakeaya (n = 3 hayvan) verildi. Bir kontrol grubu (n = 3 hayvan), mıknatıs kullanılmadan aynı LV-MP'leri aldı. İnfüzyon tamamlandıktan sonra, kanül ET tüpünden çıkarılır ve hayvan ekstübe edilir. Mıknatıs 10 dakika yerinde kalır, sonra çıkarılır. Sıçanlara subkutan dozda meloksikam (1 ml/kg) (Ilium, Avustralya) verildi ve ardından 1 mg/kg atipamazol hidroklorürün (Antisedan, Zoetis, Avustralya) ip enjeksiyonuyla anestezi tersine çevrildi. Sıçanlar tam olarak iyileşene kadar sıcak tutuldu ve izlendi. anesteziden.
Biyolojik güvenlik kabini içerisinde LV-MP iletim cihazı. ET tüpünün açık gri renkli Luer göbeği ağızdan dışarı doğru çıkıntı yapmış şekilde görülmekte ve resimde görülen pipetin jel ucu ET tüpü içerisinden istenilen derinliğe kadar trakeaya sokulmaktadır.
LV-MP dozlama prosedüründen bir hafta sonra, hayvanlar %100 CO2 inhalasyonuyla insani bir şekilde öldürüldü ve LacZ ekspresyonu standart X-gal tedavimiz kullanılarak değerlendirildi. Analizde endotrakeal tüp yerleşiminden kaynaklanan herhangi bir mekanik hasar veya sıvı tutulumunun dahil edilmediğinden emin olmak için en kaudal üç kıkırdak halka çıkarıldı. Her trakea, analiz için iki yarı oluşturmak üzere uzunlamasına kesildi ve lüminal yüzeyi görselleştirmek için bir Minutien iğnesi (Fine Science Tools) kullanılarak silikon kauçuk içeren bir tabağa (Sylgard, Dow Inc) yerleştirildi. Transdüksiyonlu hücrelerin dağılımı ve deseni, DigiLite kamera ve TCapture yazılımı (Tucsen Photonics, Çin) ile Nikon mikroskop (SMZ1500) kullanılarak frontal fotoğrafçılıkla doğrulandı. Görüntüler 20x büyütmede (trakeanın tüm genişliği için en yüksek ayar dahil) elde edildi ve trakeanın tüm uzunluğu adım adım görüntülendi ve her görüntü arasında görüntü oluşturmaya izin verecek yeterli örtüşme sağlandı "dikiş". Her bir trakeadan alınan görüntüler daha sonra düzlemsel hareket algoritması kullanan Görüntü Bileşik Düzenleyicisi v2.0.3 (Microsoft Research) kullanılarak tek bir bileşik görüntüde birleştirildi. Her bir hayvandan alınan trakea bileşik görüntülerindeki LacZ ekspresyon alanları, daha önce açıklandığı gibi, 0,35 < Renk Tonu < 0,58, Doygunluk > 0,15 ve Değer < 0,7 ayarları kullanılarak otomatik bir MATLAB betiği (R2020a, MathWorks) kullanılarak ölçüldü. Dokunun konturları izlenerek, doku alanını belirlemek ve trakea dokusunun dışından herhangi bir yanlış tespit yapılmasını önlemek için her bir bileşik görüntü için GIMP v2.10.24'te manuel olarak bir maske oluşturuldu. Her bir hayvandan alınan tüm bileşik görüntülerdeki boyanmış alanlar, o hayvan için toplam boyanmış alanı oluşturmak için toplandı. Daha sonra boyanmış alan, normalize edilmiş alanı oluşturmak için toplam maske alanına bölündü.
Her trakea parafine gömüldü ve 5 μm'lik kesitler alındı. Kesitler nötral hızlı kırmızı ile 5 dakika boyunca karşı boyandı ve görüntüler Nikon Eclipse E400 mikroskobu, DS-Fi3 kamera ve NIS element yakalama yazılımı (sürüm 5.20.00) kullanılarak elde edildi.
Tüm istatistiksel analizler GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) programında gerçekleştirildi. İstatistiksel anlamlılık p ≤ 0,05 olarak belirlendi. Normallik Shapiro-Wilk testi kullanılarak doğrulandı ve LacZ boyamasındaki farklılıklar eşleştirilmemiş t-testi kullanılarak değerlendirildi.
Tablo 1'de açıklanan altı MP, PCXI kullanılarak incelendi ve görünürlük Tablo 2'de açıklanmıştır. İki polistiren MP (MP1 ve MP2; sırasıyla 18 μm ve 0,25 μm) PCXI altında görünür değildi, ancak örneklerin geri kalanı tanımlanabilirdi (örnekler Şekil 5'te gösterilmiştir). MP3 ve MP4 (%10-15 Fe3O4; sırasıyla 0,25 μm ve 0,9 μm) hafifçe görülebilir. Test edilen en küçük parçacıklardan bazılarını içermesine rağmen, MP5 (%98 Fe3O4; 0,25 μm) en belirgin olanıydı. CombiMag ürünü MP6'yı tespit etmek zordur. Her durumda, mıknatısı kılcal damara paralel olarak ileri geri hareket ettirerek MP'yi tespit etme yeteneğimiz önemli ölçüde arttı. Mıknatıslar kılcal damardan uzaklaştığında, parçacıklar uzun diziler halinde uzadı, ancak mıknatıslar yaklaştıkça ve manyetik alan gücü Arttıkça, parçacıklar kılcalın üst yüzeyine doğru hareket ettikçe parçacık dizileri kısaldı (bkz. Ek Video S1: MP4), yüzeyin parçacık yoğunluğu arttı. Tersine, mıknatıs kılcaldan çıkarıldığında, alan şiddeti azalır ve MP'ler kılcalın üst yüzeyinden uzanan uzun diziler halinde yeniden düzenlenir (bkz. Ek Video S2: MP4). Mıknatıs hareket etmeyi bıraktıktan sonra, parçacıklar denge konumuna ulaştıktan sonra kısa bir süre daha hareket etmeye devam eder. MP kılcalın üst yüzeyine doğru ve ondan uzağa hareket ettikçe, manyetik parçacıklar genellikle döküntüleri sıvı boyunca sürükler.
MP'nin PCXI altında görünürlüğü örnekler arasında önemli ölçüde değişir. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ve (d) MP6. Burada gösterilen tüm görüntüler, kılcal damarın yaklaşık 10 mm hemen üzerinde bulunan bir mıknatısla çekilmiştir. Görünen büyük daireler, kılcal damarlarda sıkışmış hava kabarcıklarıdır ve faz kontrast görüntülemenin siyah ve beyaz kenar özelliklerini açıkça göstermektedir. Kırmızı kutu, kontrastı artıran büyütmeyi içerir. Tüm şekillerdeki mıknatıs şemalarının çaplarının ölçekli olmadığını ve gösterilenden yaklaşık 100 kat daha büyük olduğunu unutmayın.
Mıknatıs kılcalın üst kısmı boyunca sola ve sağa doğru çevrildikçe, MP dizisinin açısı mıknatısla hizalanacak şekilde değişir (bkz. Şekil 6), böylece manyetik alan çizgileri belirlenir. MP3-5 için, akor bir eşik açısına ulaştıktan sonra, parçacıklar kılcalın üst yüzeyi boyunca sürüklenir. Bu genellikle MP'lerin manyetik alanın en güçlü olduğu yere yakın daha büyük gruplar halinde kümelenmesiyle sonuçlanır (bkz. Ek Video S3: MP5). Bu ayrıca, MP'lerin sıvı-hava arayüzünde toplanmasına ve yoğunlaşmasına neden olan kılcal uca yakın görüntüleme yapıldığında özellikle belirgindir. MP3-5'ten ayırt edilmesi daha zor olan MP6'daki parçacıklar, mıknatıs kılcal boyunca hareket ettikçe sürüklenmedi, ancak MP dizileri ayrıştı ve parçacıkları görüş alanında bıraktı (bkz. Ek Video S4: MP6). Bazı durumlarda, uygulanan manyetik alan, mıknatısı görüntüleme konumundan büyük bir mesafeye taşıyarak azaltıldığında, kalan MP'ler yerçekimiyle yavaşça tüpün alt yüzeyine indi (Ek Video S5: MP3'e bakınız) dizgede kalırken.
MP dizisinin açısı, mıknatıs kılcalın hemen üstünde sağa doğru çevrildikçe değişir. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ve (d) MP6. Kırmızı kutu kontrastı artıran büyütmeyi içerir. Ek videoların bilgilendirici olduğunu, çünkü bu statik görüntülerde görselleştirilemeyen önemli parçacık yapısı ve dinamik bilgileri ortaya çıkardığını unutmayın.
Testlerimiz, mıknatısın trakea boyunca yavaşça ileri geri hareket ettirilmesinin, MP'nin vivo'daki karmaşık hareket bağlamında görüntülenmesini kolaylaştırdığını gösterdi. Polistiren boncuklar (MP1 ve MP2) kılcal damarlarda görünmediğinden vivo testi yapılmadı. Kalan dört MP'nin her biri, mıknatısın uzun ekseni trakeanın üzerinde dikeye göre yaklaşık 30° açıyla yapılandırılarak vivo'da test edildi (bkz. Şekil 2b ve 3a), çünkü bu daha uzun MP zincirleriyle sonuçlandı ve mıknatıs yapılandırmasının sonlanmasından daha etkiliydi. MP3, MP4 ve MP6 hiçbir canlı hayvanın trakeasında tespit edilmedi. Hayvanlar insanca öldürüldükten sonra sıçan hava yolları görüntülendiğinde, bir şırınga pompası kullanılarak ek hacim eklendiğinde bile parçacıklar görünmez kaldı. MP5 en yüksek demir oksit içeriğine sahipti ve tek görünür parçacıktı ve bu nedenle MP'nin vivo davranışını değerlendirmek ve karakterize etmek için kullanıldı.
MP iletimi sırasında mıknatısın trakea üzerine yerleştirilmesi, görüş alanında birçok MP'nin yoğunlaşmasına neden oldu, ancak hepsi değil. Trakeaya giren parçacıklar en iyi şekilde insanca kurban edilen hayvanlarda gözlemlenebilir. Şekil 7 ve Ek Video S6: MP5, ventral trakea yüzeyinde parçacıkların hızlı manyetik yakalanmasını ve hizalanmasını göstererek, MP'lerin trakeanın istenen bölgelerine yönlendirilebileceğini göstermektedir. MP iletimi sonrasında trakea boyunca daha distalde arama yapıldığında, bazı MP'ler karinaya daha yakın bulundu, bu da sıvı süreci sırasında maksimum manyetik alan gücü bölgesinden iletildikleri için manyetik alan gücünün tüm MP'leri toplamak ve tutmak için yetersiz olduğunu düşündürmektedir. Bununla birlikte, doğum sonrası MP konsantrasyonları görüntülenen alanın etrafında daha yüksekti, bu da uygulanan manyetik alan gücünün en yüksek olduğu hava yolu bölgelerinde birçok MP kaldığını düşündürmektedir.
(a) Yakın zamanda ötanazi uygulanmış bir sıçanın trakeasına doğrudan görüntüleme alanının üstüne yerleştirilen mıknatısla MP5 verilmesinden önce ve (b) sonra alınan görüntüler. Görüntülenen alan iki kıkırdak halkası arasında yer almaktadır. MP verilmesinden önce hava yolunda bir miktar sıvı vardır. Kırmızı kutu kontrastı artıran büyütmeyi içerir. Bu görüntüler Ek Video S6: MP5'te gösterilen videodan alınmıştır.
Mıknatısın trakea boyunca canlıda çevrilmesi, MP zincirinin kılcal damarlarda görülenlere benzer bir şekilde hava yolu yüzeyindeki açısını değiştirmesine neden oldu (bkz. Şekil 8 ve Ek Video S7: MP5). Ancak, çalışmamızda MP'ler kılcal damarlarda olduğu gibi canlı hava yolunun yüzeyi boyunca sürüklenemedi. Bazı durumlarda, mıknatıs sola ve sağa hareket ettikçe MP zinciri uzar. İlginç bir şekilde, mıknatıs trakea boyunca uzunlamasına hareket ettirildiğinde parçacık dizisinin yüzey sıvı tabakasının derinliğini değiştirdiğini ve mıknatıs doğrudan başın üzerine getirildiğinde ve parçacık dizisi dikey bir konuma döndürüldüğünde genişlediğini de bulduk (bkz. Ek Video S7). : MP5, 0:09'da, sağ altta). Mıknatıs trakeanın üstünden yanal olarak (yani trakeanın uzunluğu boyunca değil, hayvanın soluna veya sağına) çevrildiğinde hareketin karakteristik deseni değişti. Parçacıklar hareket ederken hala açıkça görülebiliyordu, ancak mıknatıs trakeadan çıkarıldığında parçacık dizilerinin uçları görünür hale geldi (bkz. Ek Video S8: MP5, 0:08'de başlıyor). Bu, cam bir kılcalda uygulanan manyetik alan altında gözlemlediğimiz MP davranışıyla tutarlıdır.
Canlı anestezi uygulanmış bir sıçanın trakeasında MP5'i gösteren örnek görüntüler. (a) Mıknatıs, trakenin üstünde ve solunda görüntü elde etmek için kullanılır, ardından (b) mıknatıs sağa hareket ettirilir. Kırmızı kutu, kontrastı artıran büyütmeyi içerir. Bu görüntüler, Ek Video S7: MP5'te gösterilen videodan alınmıştır.
İki kutup, trakeanın üstünde ve altında kuzey-güney yönünde yapılandırıldığında (yani çekici; Şekil 3b), MP akorları daha uzun göründü ve dorsal trakeal yüzey yerine trakeanın yan duvarında yer aldı (bkz. Ek Video S9:MP5). Ancak, tek bir konumdaki (yani, trakeanın dorsal yüzeyi) yüksek partikül konsantrasyonları, genellikle tek mıknatıslı bir cihaz kullanıldığında meydana gelen çift mıknatıslı bir cihaz kullanıldığında sıvı verildikten sonra tespit edilmedi. Daha sonra, bir mıknatıs kutupları ters itecek şekilde yapılandırıldığında (Şekil 3c), görüş alanında görünen partikül sayısı verildikten sonra artmadı. Her iki çift mıknatıslı yapılandırmanın kurulumu, mıknatısları sırasıyla çeken veya iten yüksek manyetik alan kuvvetleri nedeniyle zordur. Kurulum daha sonra hava yoluna paralel ancak hava yolundan 90 derecelik açıyla geçen tek bir mıknatısa değiştirildi, böylece alan çizgileri trakea duvarını ortogonal olarak geçti (Şekil 3d), yan duvarda partikül agregasyonunun gözlemlenip gözlemlenemeyeceğini belirlemek için tasarlanmış bir yönelim. Ancak, bu konfigürasyonda, MP birikiminin veya mıknatıs hareketinin tanımlanabilir bir hareketi yoktu. Tüm bu sonuçlara dayanarak, in vivo gen taşıyıcı çalışmaları için tek mıknatıslı, 30 derecelik bir yönelim konfigürasyonu (Şekil 3a) seçildi.
Hayvan, insani öldürmeden hemen sonra tekrar tekrar görüntülendiğinde, kafa karıştırıcı doku hareketinin yokluğu, mıknatısın öteleme hareketiyle uyumlu olarak "titreyen" net interkondral alanda daha ince ve daha kısa parçacık çizgilerinin ayırt edilebileceği anlamına geliyordu. Yine de, MP6 parçacıklarının varlığını ve hareketini hala net bir şekilde göremiyoruz.
LV-LacZ titresi 1,8 × 108 TU/ml idi ve CombiMag MP (MP6) ile 1:1 karıştırmadan sonra, hayvanlara 9 × 107 TU/ml LV taşıyıcısının 50 μl trakeal dozu verildi (yani 4,5 × 106 TU/sıçan). Bu çalışmalarda, doğum sırasında mıknatısı çevirmek yerine, mıknatısı bir pozisyonda sabitleyerek LV transdüksiyonunun (a) manyetik alan yokluğunda vektör iletimine kıyasla iyileştirilip iyileştirilemeyeceğini ve (b) odaklanıp odaklanamayacağını belirledik. Hava yolu hücreleri, üst hava yolunun manyetik hedef bölgelerine transdüksiyon edilir.
Mıknatısların varlığı ve CombiMag'in LV vektörleriyle birlikte kullanımı, standart LV vektör iletim protokolümüzde olduğu gibi, hayvan sağlığı üzerinde olumsuz etkilere sahip görünmemektedir. Mekanik bozulmaya maruz bırakılan trakea bölgesinin frontal görüntüleri (Ek Şekil 1), mıknatıs mevcut olduğunda LV-MP ile tedavi edilen hayvan grubunda önemli ölçüde daha yüksek transdüksiyon seviyeleri olduğunu göstermiştir (Şekil 9a). Kontrol grubunda yalnızca az miktarda mavi LacZ boyaması mevcuttu (Şekil 9b). Normalize edilmiş X-Gal boyalı alanların kantifikasyonu, manyetik alan varlığında LV-MP uygulamasının yaklaşık 6 kat iyileşme sağladığını göstermiştir (Şekil 9c).
(a) Manyetik alan varlığında ve (b) mıknatıs yokluğunda LV-MP ile trakeal transdüksiyonu gösteren örnek kompozit görüntüler. (c) Mıknatıs kullanıldığında trakea içindeki normalize edilmiş LacZ transdüksiyon alanında istatistiksel olarak anlamlı iyileşme (*p = 0,029, t-testi, grup başına n = 3, ortalama ± SEM).
Nötr hızlı kırmızıya boyanmış kesitler (örnek Ek Şekil 2'de gösterilmiştir) LacZ ile boyanmış hücrelerin daha önce bildirildiği gibi benzer bir düzende ve konumda bulunduğunu göstermiştir.
Hava yolu gen terapisi için temel bir zorluk, taşıyıcı parçacıkların ilgi duyulan bölgelere doğru şekilde yerleştirilmesi ve hava akımı ve aktif mukus temizliği varlığında hareket eden akciğerde yüksek düzeyde transdüksiyon verimliliği elde edilmesidir. Kistik fibroz hava yolu hastalığını tedavi etmek için tasarlanan sol ventrikül (LV) taşıyıcıları için, taşıyıcı parçacıkların iletken hava yolları içindeki kalış süresini artırmak şimdiye kadar ulaşılması zor bir hedef olmuştur. Castellani ve ark. tarafından belirtildiği gibi, transdüksiyonu iyileştirmek için manyetik alanların kullanılması, elektroporasyon gibi diğer gen iletim yöntemlerine kıyasla avantajlara sahiptir, çünkü basitlik, maliyet etkinliği, iletim lokalizasyonu, artan verimlilik ve daha kısa inkübasyon süreleri ve muhtemelen daha küçük bir taşıyıcı dozu bir araya getirebilir10. Bununla birlikte, dış manyetik kuvvetlerin etkisi altında hava yollarında manyetik parçacıkların in vivo birikimi ve davranışı hiçbir zaman tanımlanmamıştır ve bu yöntemin sağlam canlı hava yollarında gen ekspresyon seviyelerini artırmak için in vivo uygulanabilirliği aslında gösterilmemiştir.
In vitro senkrotron PCXI deneylerimiz, polistiren MP hariç, test ettiğimiz tüm parçacıkların kullandığımız görüntüleme düzeneğinde görünür olduğunu gösterdi. Bir manyetik alanın varlığında, MP'ler uzunlukları parçacık türü ve manyetik alan şiddetiyle (yani mıknatısın yakınlığı ve hareketi) ilişkili olan diziler oluşturur. Şekil 10'da gösterildiği gibi, gözlemlediğimiz diziler, her bir parçacığın manyetize edilmesi ve kendi yerel manyetik alanını oluşturması nedeniyle oluşur. Bu ayrı alanlar, diğer benzer parçacıkların bir araya gelmesine ve bağlanmasına neden olur ve diğer parçacıkların yerel çekici ve itici kuvvetlerinden kaynaklanan yerel kuvvetler nedeniyle grup dizisi benzeri hareketler oluşur.
(a,b) Sıvı dolu kılcal damarlar ve (c,d) hava dolu trakea içinde oluşan parçacık dizilerini gösteren şema. Kılcal damarlar ve trakeaların ölçekli olarak çizilmediğine dikkat edin. (a) Paneli ayrıca, diziler halinde düzenlenmiş Fe3O4 parçacıklarını içeren MP'nin bir tanımını da içerir.
Mıknatıs kılcal damarın üzerine hareket ettirildiğinde, parçacık dizisinin açısı Fe3O4 içeren MP3-5 için kritik bir eşiğe ulaştı, bundan sonra parçacık dizisi artık orijinal konumunda kalmadı, ancak yüzey boyunca yeni bir konuma hareket etti. mıknatıs. Bu etkinin, cam kılcal yüzeyin bu hareketin gerçekleşmesine izin verecek kadar pürüzsüz olması nedeniyle meydana gelmesi muhtemeldir. İlginçtir ki, MP6 (CombiMag) bu şekilde davranmadı, muhtemelen parçacıklar daha küçük olduğu, farklı kaplamalara veya yüzey yüklerine sahip olduğu veya tescilli bir taşıyıcı sıvının hareket kabiliyetlerini etkilediği için. CombiMag parçacıklarının görüntü kontrastı da daha zayıftır, bu da sıvının ve parçacıkların benzer yoğunluklara sahip olabileceğini ve bu nedenle birbirlerine doğru kolayca hareket edemediğini düşündürmektedir. Parçacıklar ayrıca mıknatıs çok hızlı hareket ederse sıkışabilir, bu da manyetik alan kuvvetinin sıvıdaki parçacıklar arasındaki sürtünmeyi her zaman aşamayacağını gösterir, bu da belki de manyetik alan kuvvetinin ve mıknatıs ile hedef alan arasındaki mesafenin Çok önemli olması şaşırtıcı değildir. Bir arada ele alındığında, bu sonuçlar ayrıca, mıknatısların akan birçok MP'yi yakalayabilmesine rağmen, Hedef bölge göz önüne alındığında, CombiMag parçacıklarının trakea yüzeyi boyunca hareket etmesi için mıknatıslara güvenilmesinin pek mümkün olmadığı sonucuna varıyoruz. Bu nedenle, in vivo LV-MP çalışmalarının hava yolu ağacının belirli bölgelerini fiziksel olarak hedeflemek için statik manyetik alanlardan yararlanması gerektiği sonucuna vardık.
Parçacıklar vücuda verildiğinde, bunları hareket eden karmaşık vücut dokusu bağlamında tanımlamak zordur, ancak bunları tespit etme yeteneği, mıknatısın trakeanın üzerinde yatay olarak çevrilmesi ve MP tellerinin "oynatılması" ile geliştirilmiştir. Canlı görüntüleme mümkün olsa da, hayvan insanca öldürüldükten sonra parçacık hareketini ayırt etmek daha kolaydır. Mıknatıs görüntüleme alanının üzerinde konumlandırıldığında MP konsantrasyonları genellikle bu konumda en yüksekti, ancak bazı parçacıklar genellikle trakea boyunca daha ileride bulundu. İn vitro çalışmaların aksine, parçacıklar mıknatıs çevrilerek trakea boyunca sürüklenemez. Bu bulgu, trakea yüzeyini kaplayan mukusun genellikle solunan parçacıkları nasıl işlediği, bunları mukus içinde nasıl hapsettiği ve daha sonra mukosiliyer temizleme mekanizması tarafından nasıl temizlendiği ile tutarlıdır.
Trakeanın üstünde ve altında çekim için mıknatıs kullanımının (Şekil 3b) bir noktada oldukça yoğunlaşmış bir manyetik alan yerine daha düzgün bir manyetik alanla sonuçlanabileceği ve potansiyel olarak daha düzgün bir parçacık dağılımına yol açabileceği hipotezini öne sürdük. Ancak, ön çalışmamız bu hipotezi destekleyecek net bir kanıt bulamadı. Benzer şekilde, bir çift mıknatısı itecek şekilde yapılandırmak (Şekil 3c), görüntülenen alanda daha fazla parçacık birikmesiyle sonuçlanmadı. Bu iki bulgu, çift mıknatıs kurulumunun MP hedeflemesinin yerel kontrolünü önemli ölçüde iyileştirmediğini ve ortaya çıkan güçlü manyetik kuvvetlerin yapılandırılmasının zor olduğunu ve bu yaklaşımın daha az pratik olduğunu göstermektedir. Benzer şekilde, mıknatısı trakeanın üstünde ve içinden yönlendirmek (Şekil 3d) de görüntülenen alanda tutulan parçacık sayısını artırmadı. Bu alternatif yapılandırmalardan bazıları, biriktirme alanı içinde daha düşük manyetik alan güçleriyle sonuçlandığı için başarılı olmayabilir. Bu nedenle, tek 30 derece açılı mıknatıs yapılandırması (Şekil 3a) en kolay ve en in vivo testler için etkili bir yöntem.
LV-MP çalışması, LV vektörleri CombiMag ile birleştirildiğinde ve manyetik alan varlığında fiziksel bozulmadan sonra verildiğinde, trakeadaki transdüksiyon seviyelerinin kontrollerle karşılaştırıldığında önemli ölçüde arttığını göstermiştir. Senkrotron görüntüleme çalışmaları ve LacZ sonuçlarına göre, manyetik alan görünüşe göre LV'yi trakea içinde koruyabilmiş ve akciğerin derinliklerine hemen nüfuz eden vektör parçacıklarının sayısını azaltabilmiştir. Bu tür hedefleme iyileştirmeleri, verilen titreleri, hedef dışı transdüksiyonu, inflamatuar ve immün yan etkileri ve gen taşıyıcı maliyetlerini azaltırken daha yüksek etkinliğe yol açabilir. Üreticiye göre önemli olarak CombiMag, diğer viral vektörler (AAV gibi) ve nükleik asitler dahil olmak üzere diğer gen transfer yöntemleriyle birlikte kullanılabilir.