Hvala, ker ste obiskali Nature.com. Različica brskalnika, ki jo uporabljate, ima omejeno podporo za CSS. Za najboljšo izkušnjo priporočamo, da uporabite posodobljen brskalnik (ali izklopite način združljivosti v Internet Explorerju). Medtem bomo za zagotovitev nadaljnje podpore spletno mesto prikazali brez slogov in JavaScripta.
Genski vektorji za zdravljenje cistične fibroze pljuč bi morali ciljati na prevodne dihalne poti, ker periferna pljučna transdukcija ne zagotavlja terapevtske koristi. Učinkovitost virusne transdukcije je neposredno povezana s časom zadrževanja vektorja. Vendar pa dostavne tekočine, kot so nosilci genov, med vdihom naravno difundirajo v alveole, terapevtski delci katere koli oblike pa se hitro odstranijo z mukociliarnim transportom. Podaljšanje časa zadrževanja nosilcev genov v dihalnih poteh je pomembno, vendar težko dosegljivo. Magnetni delci, konjugirani z nosilci genov, ki jih je mogoče usmeriti na površino dihalnih poti, lahko izboljšajo regionalno ciljanje. Zaradi izzivov vizualizacije in vivo je obnašanje takšnih majhnih magnetnih delcev na površini dihalnih poti v prisotnosti uporabljenega magnetnega polja slabo razumljeno. Cilj te študije je bil uporabiti sinhrotronsko slikanje za vizualizacijo gibanja vrste magnetnih delcev v sapniku anesteziranih podgan in vivo, da bi preučili dinamiko in vzorce vedenja posameznih in skupnih delcev in vivo. Nato smo ocenili tudi, ali bi dostava lentivirusnih magnetnih delcev v prisotnosti magnetnega polja povečala učinkovitost transdukcije v sapniku podgan. Sinhrotronsko rentgensko slikanje razkriva Obnašanje magnetnih delcev v stacionarnih in gibljivih magnetnih poljih in vitro in in vivo. Delcev ni mogoče enostavno vleči po površini živih dihalnih poti z magneti, vendar se med transportom usedline koncentrirajo v vidnem polju, kjer je magnetno polje najmočnejše. Učinkovitost transdukcije se je prav tako povečala za šestkrat, ko so bili lentivirusni magnetni delci dostavljeni v prisotnosti magnetnega polja. Ti rezultati skupaj kažejo, da so lahko lentivirusni magnetni delci in magnetna polja dragoceni pristopi za izboljšanje ciljanja genskih vektorjev in povečanje ravni transdukcije v prevodnih dihalnih poteh in vivo.
Cistično fibrozo (CF) povzroča variacija v enem samem genu, imenovanem regulator transmembranske prevodnosti CF (CFTR). Beljakovina CFTR je ionski kanal, ki je prisoten v številnih epitelijskih celicah po telesu, vključno s prevodnimi dihalnimi potmi, ki so glavno mesto patogeneze CF. Okvare CFTR vodijo do nenormalnega transporta vode, dehidracije površine dihalnih poti in zmanjšanja globine plasti tekočine na površini dihalnih poti (ASL). To tudi poslabša sposobnost mukociliarnega transportnega sistema (MCT) za odstranjevanje vdihanih delcev in patogenov iz dihalnih poti. Naš cilj je razviti gensko terapijo z lentivirusom (LV), ki bo zagotovila pravilno kopijo gena CFTR in izboljšala zdravje ASL, MCT in pljuč, ter nadaljevati z razvojem novih tehnologij, ki lahko merijo te parametre in vivo1.
Vektorji levega prekata (LV) so eden vodilnih kandidatov za gensko terapijo dihalnih poti pri CF, predvsem zato, ker lahko trajno integrirajo terapevtski gen v bazalne celice dihalnih poti (matične celice dihalnih poti). To je pomembno, ker lahko obnovijo normalno hidracijo in čiščenje sluzi z diferenciacijo v funkcionalne gensko popravljene površinske celice dihalnih poti, povezane s CF, kar ima za posledico vseživljenjske koristi. Vektorji LV morajo biti usmerjeni proti prevodnim dihalnim potem, saj se tam začne pljučna bolezen pri CF. Vnos vektorja globlje v pljuča lahko povzroči alveolarno transdukcijo, vendar to pri CF nima terapevtske koristi. Vendar pa tekočine, kot so nosilci genov, po vdihu po dostavi naravno migrirajo v alveole3,4 in terapevtski delci se s pomočjo MCT hitro odstranijo v ustno votlino. Učinkovitost LV transdukcije je neposredno povezana s časom, ki ga vektor ostane ob ciljnih celicah, da omogoči celični privzem – »čas zadrževanja«5 – ki ga je mogoče zlahka zmanjšati s tipičnim regionalnim pretokom zraka, pa tudi s koordiniranim zajemanjem delcev sluzi in MCT. Pri CF je sposobnost podaljšanja časa zadrževanja LV znotraj dihalnih poti pomembna za doseganje visokih ravni transdukcije v tej regiji, vendar je bila doslej izziv.
Da bi premagali to oviro, predlagamo, da bi lahko magnetni delci (MP) levega prekata (LV) pomagali na dva komplementarna načina. Prvič, magnetno jih je mogoče voditi na površino dihalnih poti, da se izboljša ciljanje in pomaga delcem nosilca genov, da se zadržijo v želenem območju dihalnih poti; in (ASL) da se premaknejo v celično plast 6. MP se pogosto uporabljajo kot ciljno usmerjena dostavna sredstva za zdravila, ko se vežejo na protitelesa, kemoterapevtska zdravila ali druge majhne molekule, ki se vežejo na celične membrane ali na ustrezne receptorje na celični površini in se kopičijo na mestih tumorja v prisotnosti statične elektrike. Magnetna polja za zdravljenje raka 7. Druge "hipertermalne" tehnike so namenjene segrevanju MP, ko so izpostavljeni nihajočim magnetnim poljem, s čimer uničijo tumorske celice. Načelo magnetne transfekcije, pri katerem se magnetno polje uporablja kot transfekcijsko sredstvo za izboljšanje prenosa DNK v celice, se pogosto uporablja in vitro z uporabo vrste nevirusnih in virusnih genskih vektorjev za težko transducirane celične linije. Učinkovitost LV magnetotransfekcije je bila ugotovljena z in vitro dostavo LV-MP v človeško bronhialno epitelijsko celično linijo v prisotnosti statičnega magnetnega polja, kar je povečalo učinkovitost transdukcije za 186-krat v primerjavi s samim LV vektorjem. LV-MP je bil uporabljen tudi pri in vitro modelu CF, kjer je magnetna transfekcija povečala LV transdukcijo v kulturah na vmesniku zrak-tekočina za 20-krat v prisotnosti sputuma CF10. Vendar pa je bila in vivo magnetotransfekcija organov deležna relativno malo pozornosti in je bila ocenjena le v nekaj študijah na živalih11,12,13,14,15, zlasti v pljuča16,17. Kljub temu so možnosti za magnetno transfekcijo pri zdravljenju pljuč pri CF jasne. Tan in sod. (2020) so navedli, da bo »študija dokaza o učinkovitem dovajanju magnetnih nanodelcev v pljuča utrla pot prihodnjim strategijam inhalacije CFTR za izboljšanje kliničnih izidov pri bolnikih s CF«6.
Obnašanje majhnih magnetnih delcev na površinah dihalnih poti v prisotnosti uporabljenega magnetnega polja je težko vizualizirati in preučevati, zato je slabo razumljeno. V drugih študijah smo razvili metodo faznokontrastnega rentgenskega slikanja (PB-PCXI) na osnovi sinhrotronskega širjenja za neinvazivno vizualizacijo in kvantificiranje drobnih sprememb in vivo v globini ASL18 in obnašanju MCT19,20 za neposredno merjenje hidratacije površine plinskega kanala in uporabo kot zgodnji kazalnik učinkovitosti zdravljenja. Poleg tega naša metoda ocenjevanja MCT uporablja delce s premerom 10–35 µm, sestavljene iz aluminijevega oksida ali stekla z visokim lomnim količnikom, kot označevalce MCT, vidne z uporabo PB-PCXI21. Obe tehniki sta primerni za vizualizacijo različnih vrst delcev, vključno z MP.
Zaradi visoke prostorske in časovne ločljivosti so naše tehnike analize ASL in MCT, ki temeljijo na PB-PCXI, zelo primerne za preučevanje dinamike in vzorcev obnašanja posameznih in razsutih delcev in vivo, kar nam pomaga razumeti in optimizirati tehnike dostave genov MP. Pristop, ki ga uporabljamo tukaj, izhaja iz naših študij z uporabo žarkovne linije SPring-8 BL20B2, v katerih smo vizualizirali gibanje tekočine po dostavi odmerka lažnega vektorja v nosne in pljučne dihalne poti miši, da bi lažje razložili neenakomerne vzorce izražanja genov, ki smo jih opazili v naših študijah odmerka nosilcev genov na živalih 3,4.
Cilj te študije je bil uporabiti sinhrotronski PB-PCXI za vizualizacijo gibanja vrste MP v sapniku živih podgan in vivo. Te slikovne študije PB-PCXI so bile zasnovane za testiranje vrste MP, jakosti magnetnega polja in lokacij, da bi ugotovili njihov vpliv na gibanje MP. Postavili smo hipotezo, da bi zunanje uporabljeno magnetno polje pomagalo dostavljenemu MP, da ostane ali se premakne na ciljno območje. Te študije so nam omogočile tudi identifikacijo konfiguracij magnetov, ki maksimizirajo število delcev, zadržanih v sapniku po odlaganju. V drugi seriji študij smo želeli uporabiti to optimalno konfiguracijo za prikaz vzorca transdukcije, ki izhaja iz in vivo dostave LV-MP v dihalne poti podgan, na podlagi predpostavke, da bi dostava LV-MP v kontekstu ciljanja dihalnih poti povzročila izboljšano učinkovitost LV transdukcije.
Vse študije na živalih so bile izvedene v skladu s protokoli, ki jih je odobrila Univerza v Adelaidi (M-2019-060 in M-2020-022) in Odbor za etiko pri sinhrotronskih živalih SPring-8. Poskusi so bili izvedeni v skladu s smernicami ARRIVE.
Vse rentgensko slikanje je bilo izvedeno na liniji snopa BL20XU na sinhrotronu SPring-8 na Japonskem z uporabo nastavitve, podobne tisti, ki je bila opisana prej21,22. Na kratko, eksperimentalna škatla je bila nameščena 245 m od sinhrotronskega shranjevalnega obroča. Za študije slikanja delcev se uporablja razdalja med vzorcem in detektorjem 0,6 m, za študije slikanja in vivo pa 0,3 m za ustvarjanje faznokontrastnih učinkov. Uporabljena je bila energija monokromatskega snopa 25 keV. Slike so bile zajete z uporabo visokoločljivostnega rentgenskega pretvornika (SPring-8 BM3), povezanega z detektorjem sCMOS. Pretvornik pretvarja rentgenske žarke v vidno svetlobo z uporabo 10 µm debelega scintilatorja (Gd3Al2Ga3O12), ki se nato usmeri v senzor sCMOS z uporabo mikroskopskega objektiva × 10 (NA 0,3). Detektor sCMOS je bil Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japonska) z velikostjo matrike 2048 × 2048 slikovnih pik in velikost surovega slikovnega piksla 6,5 ​​× 6,5 µm. Ta nastavitev omogoča učinkovito izotropno velikost slikovnega piksla 0,51 µm in vidno polje približno 1,1 mm × 1,1 mm. Izbrana je bila dolžina osvetlitve 100 ms, da se maksimizira razmerje signal/šum magnetnih delcev znotraj in zunaj dihalnih poti, hkrati pa se zmanjšajo artefakti gibanja, ki jih povzroča dihanje. Za študije in vivo je bil v pot rentgenskih žarkov nameščen hitri rentgenski zaklop, da se omeji odmerek sevanja z blokiranjem rentgenskega žarka med osvetlitvami.
Nosilec LV ni bil uporabljen v nobeni slikovni študiji SPring-8 PB-PCXI, ker slikovna komora BL20XU ni certificirana za biološko varnostno raven 2. Namesto tega smo izbrali vrsto dobro okarakteriziranih mikroplastov dveh komercialnih dobaviteljev – ki pokrivajo vrsto velikosti, materialov, koncentracij železa in aplikacij – najprej da bi razumeli, kako magnetna polja vplivajo na gibanje mikroplastov znotraj steklenih kapilar in nato v živih dihalnih poteh. na površini. Velikosti mikrodelcev se gibljejo od 0,25 do 18 μm in so izdelani iz različnih materialov (glej tabelo 1), vendar sestava vsakega vzorca, vključno z velikostjo magnetnih delcev znotraj mikrodelcev, ni znana. Na podlagi naših obsežnih študij MCT 19, 20, 21, 23, 24 pričakujemo, da bodo na površini dihalnih poti sapnika vidni mikrodelci velikosti do 5 μm, na primer z odštevanjem zaporednih sličic, da bi videli izboljšano vidljivost gibanja mikrodelcev. Posamezen mikrodelec velikosti 0,25 μm je manjši od ločljivosti slikovne naprave, vendar naj bi PB-PCXI zaznal njihov volumski kontrast in gibanje površinske tekočine, na katero se odložijo po odlaganju.
Vzorci za vsak MP v tabeli 1 so bili pripravljeni v 20 μl steklenih kapilarah (Drummond Microcaps, PA, ZDA) z notranjim premerom 0,63 mm. Korpuskularni delci so na voljo v vodi, medtem ko so delci CombiMag na voljo v proizvajalčevi lastniški tekočini. Vsaka cev je do polovice napolnjena s tekočino (približno 11 μl) in postavljena na držalo za vzorce (glej sliko 1). Steklene kapilare so bile vodoravno postavljene na mizico za vzorec v slikovni škatli in postavljene ob robove tekočine. Magnet s premerom 19 mm (dolžina 28 mm) iz nikljeve lupine, redkih zemelj, neodima, železa, bora (NdFeB) (N35, kat. št. LM1652, Jaycar Electronics, Avstralija) s preostalo magnetizacijo 1,17 Tesla je bil pritrjen na ločeno premično mizico, da se je med slikanjem lahko daljinsko spreminjal njegov položaj. Pridobivanje rentgenskih slik se začne, ko je magnet nameščen približno 30 mm nad vzorcem, slike pa se pridobivajo s hitrostjo 4 sličic na sekundo. Med slikanjem je bil magnet približan vzorcu. stekleno kapilarno cevko (približno 1 mm stran) in nato premaknjeno vzdolž cevi, da se ocenijo učinki jakosti polja in položaja.
In vitro slikalnica z vzorci MP v steklenih kapilarah na stopnji xy translacije vzorca. Pot rentgenskega žarka je označena z rdečo črtkano črto.
Ko je bila ugotovljena in vitro vidnost mikroplastičnih proteinov (MP), je bila podskupina le-teh testirana in vivo na divjih samicah albino podgan Wistar (starih ~12 tednov, ~200 g). Podgane so anestezirali z mešanico 0,24 mg/kg medetomidina (Domitor®, Zenoaq, Japonska), 3,2 mg/kg midazolama (Dormicum®, Astellas Pharma, Japonska) in 4 mg/kg butorfanola (Vetorphale®, Meiji Seika) z intraperitonealno injekcijo. Po anesteziji so jih pripravili na slikanje tako, da so jim odstranili dlako okoli sapnika, vstavili endotrahealno cev (ET; 16 Ga iv kanila, Terumo BCT) in jih imobilizirali na hrbtu na posebej izdelani slikovni plošči, ki je vsebovala termično vrečko za vzdrževanje telesne temperature 22. Slikovno ploščo so nato pod rahlim kotom pritrdili na oder za prevajanje vzorca v slikovni škatli, da so sapnik na rentgenski sliki vodoravno poravnali, kot je prikazano na sliki. 2a.
(a) Nastavitev slikanja in vivo v slikovni škatli SPring-8, pot rentgenskega žarka je označena z rdečo črtkano črto. (b, c) Lokalizacija magneta na sapniku je bila izvedena na daljavo z uporabo dveh ortogonalno nameščenih IP kamer. Na levi strani slike zaslona je vidna žična zanka, ki drži glavo, in dostavna kanila, nameščena znotraj ET cevi.
Sistem daljinsko vodene brizgalne črpalke (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) z uporabo 100 μl steklene brizge je bil priključen na cev PE10 (zunanji premer 0,61 mm, notranji premer 0,28 mm) preko igle 30 Ga. Cev označite, da zagotovite, da je konica v pravilnem položaju v sapniku pri vstavljanju ET cevi. Z mikročrpalko je bil bat brizge izvlečen, medtem ko je bila konica cevke potopljena v vzorec MP, ki ga je bilo treba dostaviti. Napolnjena dovajalna cev je bila nato vstavljena v endotrahealno cev, pri čemer je bila konica postavljena v najmočnejši del našega pričakovanega uporabljenega magnetnega polja. Pridobivanje slik je bilo nadzorovano z detektorjem dihanja, priključenim na našo časovno enoto na osnovi Arduina, vsi signali (npr. temperatura, dihanje, odpiranje/zapiranje zaklopa in zajem slike) pa so bili posneti z uporabo Powerlab in LabChart (AD Instruments, Sydney, Avstralija) 22. Pri slikanju Ko ohišje ni bilo dostopno, sta bili dve IP-kameri (Panasonic BB-SC382) nameščeni približno 90° druga na drugo in sta bili uporabljeni za spremljanje položaja magneta glede na... v sapnik med slikanjem (slika 2b,c). Za zmanjšanje artefaktov gibanja je bila med platojem končnega plimovanja posneta ena slika na vdih.
Magnet je pritrjen na drugo stopnjo, ki jo je mogoče namestiti oddaljeno od ohišja za slikanje. Preizkušeni so bili različni položaji in konfiguracije magneta, vključno z: nameščen pod kotom približno 30° nad sapnikom (konfiguracije so prikazane na slikah 2a in 3a); en magnet nad živaljo in drugi spodaj, s poli, nastavljenimi na privlačnost (slika 3b); en magnet nad živaljo in drugi spodaj, s poli, nastavljenimi na odbojnost (slika 3c); in en magnet nad in pravokotno na sapnik (slika 3d). Ko sta žival in magnet konfigurirana in je MP, ki ga je treba testirati, naložen v črpalko brizge, se med zajemanjem slik dovaja odmerek 50 μl s hitrostjo 4 μl/s. Magnet se nato premika naprej in nazaj vzdolž ali bočno čez sapnik, medtem ko se nadaljuje zajemanje slik.
Konfiguracija magneta za slikanje in vivo (a) en sam magnet nad sapnikom pod kotom približno 30°, (b) dva magneta, nastavljena za privlačenje, (c) dva magneta, nastavljena za odbijanje, (d) en sam magnet nad sapnikom in pravokotno v njem. Opazovalec je gledal navzdol od ust do pljuč skozi sapnik, rentgenski žarek pa je šel skozi levo stran podgane in izstopil na desni strani. Magnet se premika vzdolž dihalne poti ali levo in desno nad sapnikom v smeri rentgenskega žarka.
Prav tako smo želeli ugotoviti vidnost in obnašanje delcev v dihalnih poteh brez motečega dihanja in srčnega ritma. Zato so bile živali na koncu obdobja slikanja humano usmrtjene zaradi prevelikega odmerka pentobarbitala (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, ZDA; ~65 mg/kg ip). Nekatere živali so ostale na slikovni platformi in ko sta dihanje in srčni utrip prenehala, smo postopek slikanja ponovili, pri čemer smo dodali dodaten odmerek MP, če MP na površini dihalnih poti ni bil viden.
Pridobljene slike so bile popravljene za ravno in temno polje ter nato sestavljene v film (20 sličic na sekundo; 15–25 × normalna hitrost, odvisno od frekvence dihanja) z uporabo skripta po meri, napisanega v MATLAB-u (R2020a, The Mathworks).
Vse študije o dajanju vektorjev genov LV so bile izvedene v laboratoriju za raziskave živali na Univerzi v Adelaidi, njihov cilj pa je bil uporabiti rezultate poskusa SPring-8 za oceno, ali lahko dajanje LV-MP v prisotnosti magnetnega polja poveča prenos genov in vivo. Za oceno učinkov MP in magnetnega polja sta bili zdravljeni dve skupini živali: ena skupina je prejela LV-MP z nameščenim magnetom, druga skupina pa kontrolno skupino z LV-MP brez magneta.
Vektorji genov LV so bili ustvarjeni z uporabo prej opisanih metod 25, 26. Vektor LacZ izraža jedrno lokaliziran gen beta-galaktozidaze, ki ga poganja konstitutivni promotor MPSV (LV-LacZ), ki v transduciranih celicah proizvaja moder reakcijski produkt, viden na sprednjih straneh pljučnega tkiva in tkivnih rezinah. Titracija je bila izvedena v celičnih kulturah z ročnim štetjem števila pozitivnih celic LacZ s hemocitometrom za izračun titra v TU/ml. Nosilci so kriokonzervirani pri -80 °C, pred uporabo odmrznjeni in vezani na CombiMag z mešanjem v razmerju 1:1 in inkubacijo na ledu vsaj 30 minut pred dostavo.
Normalne podgane Sprague Dawley (n = 3/skupina, ~2-3) so bile anestezirane intraperitonealno z mešanico 0,4 mg/kg medetomidina (Domitor, Ilium, Avstralija) in 60 mg/kg ketamina (Ilium, Avstralija), stare en mesec, z ip injekcijo in nekirurško oralno kanilacijo z 16 Ga iv kanilo. Da bi zagotovili, da tkivo sapnika prejme LV transdukcijo, smo ga kondicionirali z našim prej opisanim protokolom mehanskih motenj, pri katerem smo površino sapnika dihalnih poti aksialno drgnili z žično košaro (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, ZDA) 30 s28. Trahealno dajanje LV-MP je bilo nato izvedeno v biološko varnostni omari približno 10 minut po motnji.
Magnetno polje, uporabljeno v tem poskusu, je bilo konfigurirano na podoben način kot v študiji rentgenskega slikanja in vivo, z istimi magneti, ki so bili nameščeni nad sapnikom z destilacijskimi stentnimi sponkami (slika 4). 50 μl volumna (2 × 25 μl alikvota) LV-MP je bil dostavljen v sapnik (n = 3 živali) z uporabo pipete z gelsko konico, kot je bilo opisano prej. Kontrolna skupina (n = 3 živali) je prejela enake LV-MP brez uporabe magneta. Po končani infuziji se kanila odstrani iz ET cevi in ​​žival se ekstubira. Magnet ostane na mestu 10 minut, nato se odstrani. Podgane so prejele subkutani odmerek meloksikama (1 ml/kg) (Ilium, Avstralija), ki mu je sledila razveljavitev anestezije z ip injekcijo 1 mg/kg atipamazol hidroklorida (Antisedan, Zoetis, Avstralija). Podgane so bile na toplem in so bile spremljane do popolnega okrevanja po anesteziji.
Naprava za dovajanje LV-MP v biološko varnostni omarici. Svetlo siv Luerjev nastavek ET cevi je viden, kako štrli iz ustja, gel konica pipete, prikazana na sliki, pa se vstavi skozi ET cev do želene globine v sapnik.
En teden po postopku odmerjanja LV-MP so bile živali humano usmrtjene z vdihavanjem 100 % CO2, izražanje LacZ pa je bilo ocenjeno z našim standardnim zdravljenjem z X-gal. Trije najbolj kaudalni hrustančni obroči so bili odstranjeni, da se zagotovi, da v analizo niso bile vključene morebitne mehanske poškodbe ali zadrževanje tekočine zaradi namestitve endotrahealne cevi. Vsaka sapnica je bila vzdolžno prerezana, da so nastale dve polovici za analizo, in ju je bilo z iglo Minutien (Fine Science Tools) nameščeno v posodo s silikonsko gumo (Sylgard, Dow Inc) za vizualizacijo luminalne površine. Porazdelitev in vzorec transduciranih celic sta bila potrjena s frontalno fotografijo z uporabo Nikonovega mikroskopa (SMZ1500) s kamero DigiLite in programsko opremo TCapture (Tucsen Photonics, Kitajska). Slike so bile pridobljene pri 20-kratni povečavi (vključno z najvišjo nastavitvijo za celotno širino sapnice), pri čemer je bila celotna dolžina sapnice posneta korak za korakom, pri čemer je bilo zagotovljeno zadostno prekrivanje med posameznimi slikami, da se je omogočilo "sestavljanje" slik. Slike iz vsake sapnice so bile nato združene v eno samo sliko. Sestavljena slika z uporabo urejevalnika Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) z uporabo algoritma planarnega gibanja. Področja izražanja LacZ v sestavljenih slikah sapnika vsake živali so bila kvantificirana z uporabo avtomatiziranega skripta MATLAB (R2020a, MathWorks), kot je bilo opisano prej, z nastavitvami 0,35 < Hue < 0,58, Saturation > 0,15 in Value < 0,7. Z sledenjem kontur tkiva je bila v programu GIMP v2.10.24 ročno ustvarjena maska ​​za vsako sestavljeno sliko, da bi se identificiralo območje tkiva in preprečile morebitne lažne detekcije zunaj tkiva sapnika. Obarvana območja iz vseh sestavljenih slik vsake živali so bila sešteta, da se je ustvarilo skupno obarvano območje za to žival. Obarvano območje je bilo nato deljeno s skupno površino maske, da se je ustvarilo normalizirano območje.
Vsaka sapnica je bila vdelana v parafin in izrezani so bili 5 μm debeli rezini. Rezine so bile 5 minut kontrastno obarvane z nevtralno hitro rdečo barvo, slike pa so bile pridobljene z mikroskopom Nikon Eclipse E400, kamero DS-Fi3 in programsko opremo za zajem elementov NIS (različica 5.20.00).
Vse statistične analize so bile izvedene v programu GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Statistična značilnost je bila določena na p ≤ 0,05. Normalnost je bila preverjena s Shapiro-Wilkovim testom, razlike v barvanju LacZ pa so bile ocenjene z neparnim t-testom.
Šest MP, opisanih v tabeli 1, je bilo pregledanih z uporabo PCXI, vidnost pa je opisana v tabeli 2. Dva polistirenska MP (MP1 in MP2; 18 μm oziroma 0,25 μm) pod PCXI nista bila vidna, preostali vzorci pa so bili prepoznavni (primeri so prikazani na sliki 5). MP3 in MP4 (10–15 % Fe3O4; 0,25 μm oziroma 0,9 μm) sta rahlo vidna. Čeprav vsebujeta nekatere najmanjše testirane delce, je bil MP5 (98 % Fe3O4; 0,25 μm) najbolj izrazit. Izdelek CombiMag MP6 je težko opaziti. V vseh primerih se je naša sposobnost zaznavanja MP znatno izboljšala s premikom magneta naprej in nazaj vzporedno s kapilaro. Ko so se magneti oddaljili od kapilare, so se delci raztegnili v dolgih nizih, ko pa so se magneti približali in se je jakost magnetnega polja povečala, so se nizi delcev skrajšali, ko so se delci premikali proti zgornji površini kapilare (glejte dodatni video S1: MP4), kar je povečalo... Gostota delcev na površini. Nasprotno, ko magnet odstranimo iz kapilare, se jakost polja zmanjša in mikročipni delci se prerazporedijo v dolge nize, ki segajo od zgornje površine kapilare (glejte dodatni video S2:MP4). Ko se magnet preneha premikati, se delci še kratek čas po dosegu ravnotežnega položaja premikajo naprej. Ko se mikročipni delci premikajo proti zgornji površini kapilare in stran od nje, magnetni delci običajno vlečejo delce skozi tekočino.
Vidljivost MP pod PCXI se med vzorci znatno razlikuje. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 in (d) MP6. Vse prikazane slike so bile posnete z magnetom, ki se nahaja približno 10 mm neposredno nad kapilaro. Navidezni veliki krogi so zračni mehurčki, ujeti v kapilarah, ki jasno kažejo črno-bele robne značilnosti faznokontrastnega slikanja. Rdeči okvirček vsebuje povečavo za izboljšanje kontrasta. Upoštevajte, da premeri magnetnih shem na vseh slikah niso v merilu in so približno 100-krat večji od prikazanih.
Ko se magnet premika levo in desno vzdolž vrha kapilare, se kot MP strune spremeni, da se poravna z magnetom (glej sliko 6), s čimer se začrtajo linije magnetnega polja. Pri MP3-5, ko tetiva doseže prag kota, delce vleče vzdolž zgornje površine kapilare. To pogosto povzroči, da se MP združijo v večje skupine blizu mesta, kjer je magnetno polje najmočnejše (glej dodatni video S3:MP5). To je še posebej očitno pri slikanju blizu konca kapilare, zaradi česar se MP združijo in koncentrirajo na vmesniku tekočina-zrak. Delci v MP6, ki jih je bilo težje razločiti kot MP3-5, niso bili vlečeni, ko se je magnet premikal vzdolž kapilare, vendar so se MP strune disociirale, delci pa so ostali v vidnem polju (glej dodatni video S4:MP6). V nekaterih primerih, ko se je uporabljeno magnetno polje zmanjšalo s premikanjem magneta na veliko razdaljo od mesta slikanja, so se vsi preostali MP počasi spustili na spodnjo površino cevi zaradi gravitacije, medtem ko so ostali v struni (glej dodatni video S5: MP3).
Kot MP niza se spreminja, ko se magnet premakne v desno nad kapilaro. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 in (d) MP6. Rdeči okvirček vsebuje povečavo za izboljšanje kontrasta. Upoštevajte, da so dodatni videoposnetki informativni, saj razkrivajo pomembne informacije o strukturi delcev in dinamičnih informacijah, ki jih na teh statičnih slikah ni mogoče prikazati.
Naši testi so pokazali, da počasno premikanje magneta naprej in nazaj vzdolž sapnika olajša vizualizacijo MP v kontekstu kompleksnega gibanja in vivo. Testiranje in vivo ni bilo izvedeno, ker polistirenske kroglice (MP1 in MP2) v kapilari niso bile vidne. Vsak od preostalih štirih MP je bil testiran in vivo z dolgo osjo magneta, konfigurirano nad sapnikom pod kotom približno 30° glede na navpičnico (glej sliki 2b in 3a), saj je to povzročilo daljše verige MP in je bilo učinkovitejše od konfiguracije, ki je bila prekinjena z magnetom. MP3, MP4 in MP6 niso bili zaznani v sapniku nobene žive živali. Ko so bile dihalne poti podgan posnete po humani usmrtitvi živali, so delci ostali nevidni, tudi ko je bil dodan dodaten volumen z brizgalno črpalko. MP5 je imel najvišjo vsebnost železovega oksida in je bil edini vidni delec, zato je bil uporabljen za oceno in karakterizacijo vedenja MP in vivo.
Postavitev magneta nad sapnik med dovajanjem MP je povzročila, da so se številni, vendar ne vsi, MP koncentrirali v vidnem polju. Delce, ki vstopajo v sapnik, je najbolje opaziti pri humano žrtvovanih živalih. Slika 7 in dodatni video S6: MP5 prikazuje hiter magnetni zajem in poravnavo delcev na površini ventralne sapnice, kar kaže, da je mogoče MP usmeriti v želena področja sapnice. Pri iskanju bolj distalno vzdolž sapnice po dovajanju MP so bili nekateri MP najdeni bližje karini, kar kaže na to, da jakost magnetnega polja ni bila zadostna za zbiranje in zadrževanje vseh MP, saj so bili med tekočinskim procesom dostavljeni skozi območje največje jakosti magnetnega polja. Kljub temu so bile poporodne koncentracije MP višje okoli posnetega območja, kar kaže na to, da je veliko MP ostalo v območjih dihalnih poti, kjer je bila uporabljena jakost magnetnega polja najvišja.
Slike iz (a) pred in (b) po vstavitvi MP5 v sapnik nedavno evtanazirane podgane z magnetom, nameščenim neposredno nad območjem slikanja. Posneto območje se nahaja med dvema hrustančnima obročema. Pred vstavitvijo MP je v dihalnih poteh nekaj tekočine. Rdeči okvirček vsebuje povečavo za izboljšanje kontrasta. Te slike so iz videoposnetka, prikazanega v dodatnem videoposnetku S6:MP5.
Premikanje magneta vzdolž sapnika je in vivo povzročilo, da je veriga mikrodelcev (MP) spremenila kot znotraj površine dihalnih poti na podoben način kot v kapilarah (glej sliko 8 in dodatni video S7:MP5). Vendar pa v naši študiji MP-jev ni bilo mogoče vleči vzdolž površine živih dihalnih poti, kot bi jih lahko s kapilarami. V nekaterih primerih se veriga MP podaljša, ko se magnet premika levo in desno. Zanimivo je, da smo ugotovili tudi, da se zdi, da niz delcev spreminja globino površinske plasti tekočine, ko se magnet premika vzdolžno vzdolž sapnika, in se razširi, ko se magnet premika neposredno nad glavo in se niz delcev zavrti v navpičen položaj (glej dodatni video S7). : MP5 ob 0:09, spodaj desno). Značilen vzorec gibanja se je spremenil, ko je bil magnet premaknjen čez vrh sapnika lateralno (torej levo ali desno od živali in ne vzdolž dolžine sapnika). Delci so bili med premikanjem še vedno jasno vidni, ko pa je bil magnet odstranjen iz sapnika, so konice nizov delcev postale vidne (glejte dodatni video S8:MP5, ki se začne pri 0:08). To je skladno z vedenjem MP, ki smo ga opazovali pod vplivom magnetnega polja v stekleni kapilari.
Primeri slik, ki prikazujejo MP5 v sapniku žive anestezirane podgane. (a) Magnet se uporablja za zajemanje slik nad in levo od sapnika, nato (b) po tem, ko se magnet premakne v desno. Rdeči okvirček vsebuje povečavo za izboljšanje kontrasta. Te slike so iz videoposnetka, prikazanega v dodatnem videoposnetku S7:MP5.
Ko sta bila dva pola konfigurirana v severno-južni orientaciji nad in pod sapnikom (tj. privlačna; slika 3b), so se MP akordi zdeli daljši in so se nahajali na stranski steni sapnika in ne na hrbtni površini sapnika (glejte dodatni video S9:MP5). Vendar pa visoke koncentracije delcev na enem mestu (tj. hrbtni površini sapnika) niso bile zaznane po dovajanju tekočine, ko je bila uporabljena naprava z dvema magnetoma, kar se običajno zgodi pri uporabi naprave z enim magnetom. Ko je bil nato en magnet konfiguriran za odbijanje obrnjenih polov (slika 3c), se število delcev, vidnih v vidnem polju, po dovajanju ni povečalo. Nastavitev obeh konfiguracij z dvema magnetoma je zahtevna zaradi visokih jakosti magnetnega polja, ki magnete vleče oziroma potiska. Nastavitev je bila nato spremenjena v en sam magnet, ki je vzporeden z dihalno potjo, vendar poteka skozi dihalno pot pod kotom 90 stopinj, tako da so poljske linije pravokotno prečkale steno sapnika (slika 3d), kar je orientacija, zasnovana za ugotavljanje, ali je mogoče opaziti agregacijo delcev na stranski steni. Vendar pa je bila v tej konfiguraciji ... Ni bilo opaziti nobenega prepoznavnega gibanja kopičenja MP ali gibanja magneta. Na podlagi vseh teh rezultatov je bila za študije genskih nosilcev in vivo izbrana konfiguracija z enim magnetom in 30-stopinjsko orientacijo (slika 3a).
Ko so žival takoj po humani usmrtitvi večkrat slikali, je odsotnost motečega gibanja tkiva pomenila, da je bilo v jasnem interhondralnem polju mogoče razločiti finejše in krajše linije delcev, ki so se "mahale" v skladu s translacijskim gibanjem magneta. Kljub temu še vedno ni mogoče jasno videti prisotnosti in gibanja delcev MP6.
Titer LV-LacZ je bil 1,8 × 108 TU/ml, po mešanju 1:1 s CombiMag MP (MP6) pa so živali prejele 50 μl trahealni odmerek 9 × 107 TU/ml LV nosilca (tj. 4,5 × 106 TU/podgano). V teh študijah smo magnet med porodom namesto premikanja fiksirali v enem položaju, da bi ugotovili, ali bi se lahko LV transdukcija (a) izboljšala v primerjavi z vektorsko dostavo v odsotnosti magnetnega polja in ali bi se lahko (b) osredotočila. Celice dihalnih poti se transducirajo v magnetna ciljna območja zgornjih dihalnih poti.
Prisotnost magnetov in uporaba CombiMag v kombinaciji z LV vektorji nista imela negativnih učinkov na zdravje živali, tako kot naš standardni protokol za dajanje LV vektorjev. Frontalne slike trahealne regije, izpostavljene mehanskim motnjam (dodatna slika 1), so pokazale, da so bile v skupini živali, zdravljenih z LV-MP, bistveno višje ravni transdukcije, ko je bil prisoten magnet (slika 9a). V kontrolni skupini je bila prisotna le majhna količina modrega LacZ obarvanja (slika 9b). Kvantifikacija normaliziranih območij, obarvanih z X-Gal, je pokazala, da je dajanje LV-MP v prisotnosti magnetnega polja povzročilo približno 6-kratno izboljšanje (slika 9c).
Primer sestavljenih slik, ki prikazujejo trahealno transdukcijo z LV-MP (a) v prisotnosti magnetnega polja in (b) v odsotnosti magneta. (c) Statistično značilno izboljšanje normaliziranega območja LacZ transdukcije znotraj sapnika pri uporabi magneta (*p = 0,029, t-test, n = 3 na skupino, povprečje ± SEM).
Nevtralno hitro rdeče obarvani odseki (primer prikazan na dodatni sliki 2) so pokazali, da so celice, obarvane z LacZ, prisotne v podobnem vzorcu in na podobni lokaciji, kot je bilo opisano prej.
Ključni izziv za gensko terapijo dihalnih poti ostaja natančna lokalizacija nosilnih delcev na območja zanimanja in doseganje visoke ravni učinkovitosti transdukcije v gibljivih pljučih ob prisotnosti pretoka zraka in aktivnega čiščenja sluzi. Za nosilce LV, zasnovane za zdravljenje dihalnih poti s cistično fibrozo, je bilo povečanje časa zadrževanja nosilnih delcev v prevodnih dihalnih poteh doslej nedosegljiv cilj. Kot so poudarili Castellani in sod., ima uporaba magnetnih polj za izboljšanje transdukcije prednosti v primerjavi z drugimi metodami dostave genov, kot je elektroporacija, saj lahko združuje preprostost, stroškovno učinkovitost, lokalizacijo dostave, večjo učinkovitost in krajše inkubacijske čase ter morda manjši odmerek nosilca10. Vendar pa odlaganje in obnašanje magnetnih delcev v dihalnih poteh in vivo pod vplivom zunanjih magnetnih sil še nikoli ni bilo opisano, niti ni bila dejansko dokazana izvedljivost te metode in vivo za povečanje ravni izražanja genov v nepoškodovanih živih dihalnih poteh.
Naši sinhrotronski poskusi PCXI in vitro so pokazali, da so bili vsi delci, ki smo jih testirali, z izjemo polistirenskega MP, vidni v slikovni nastavitvi, ki smo jo uporabili. V prisotnosti magnetnega polja MP tvorijo strune, katerih dolžine so povezane z vrsto delca in jakostjo magnetnega polja (tj. bližino in gibanjem magneta). Kot je prikazano na sliki 10, strune, ki jih opazujemo, nastanejo zaradi magnetizacije vsakega posameznega delca, ki inducira svoje lokalno magnetno polje. Ta ločena polja povzročajo, da se drugi podobni delci združujejo in povezujejo, s skupinskimi gibi, podobnimi strunam, zaradi lokalnih sil lokalnih privlačnih in odbojnih sil drugih delcev.
Shematski prikaz (a, b) nizov delcev, ki nastanejo znotraj kapilar, napolnjenih s tekočino, in (c, d) sapnika, napolnjenega z zrakom. Upoštevajte, da kapilare in sapnik niso narisani v merilu. Slika (a) vsebuje tudi opis MP, ki vsebuje delce Fe3O4, razporejene v nize.
Ko se je magnet premaknil nad kapilaro, je kot niza delcev dosegel kritični prag za MP3-5, ki vsebuje Fe3O4, po katerem niz delcev ni več ostal v prvotnem položaju, temveč se je premaknil vzdolž površine v nov položaj. magnet. Ta učinek se verjetno pojavi, ker je površina steklene kapilare dovolj gladka, da omogoča to gibanje. Zanimivo je, da se MP6 (CombiMag) ni obnašal tako, verjetno zato, ker so bili delci manjši, so imeli različne prevleke ali površinske naboje ali pa je lastniška nosilna tekočina vplivala na njihovo sposobnost gibanja. Kontrast slike delcev CombiMag je prav tako šibkejši, kar kaže na to, da imajo tekočina in delci lahko podobne gostote in se zato ne premikajo zlahka drug proti drugemu. Delci se lahko zataknejo tudi, če se magnet premika prehitro, kar kaže na to, da jakost magnetnega polja ne more vedno premagati trenja med delci v tekočini, kar nakazuje, da morda ni presenetljivo, da sta jakost magnetnega polja in razdalja med magnetom in ciljnim območjem zelo pomembni. Skupaj ti rezultati kažejo tudi, da čeprav lahko magneti ujamejo veliko MP, ki tečejo skozi ciljno območje, je malo verjetno, da se je mogoče zanašati na magnete, da se premaknejo. Delci CombiMag vzdolž površine sapnika. Zato sklepamo, da bi morale študije LV-MP in vivo uporabljati statična magnetna polja za fizično ciljanje specifičnih področij dihalnih poti.
Ko delce dostavimo v telo, jih je v kontekstu kompleksnega gibajočega se telesnega tkiva težko prepoznati, vendar je bila sposobnost njihovega zaznavanja izboljšana s horizontalnim premikanjem magneta nad sapnikom, da se "premikajo" niti mikroplastike. Čeprav je slikanje v živo mogoče, je gibanje delcev lažje zaznati, ko je žival humano ubita. Koncentracije mikroplastike so bile na tem mestu običajno najvišje, ko je bil magnet nameščen nad območjem slikanja, čeprav so bili nekateri delci običajno najdeni dlje vzdolž sapnika. V nasprotju s študijami in vitro delcev ni mogoče vleči vzdolž sapnika s premikanjem magneta. Ta ugotovitev je skladna s tem, kako sluz, ki prekriva površino sapnika, običajno predeluje vdihane delce, jih ujame v sluz in jih nato odstrani mehanizem mukociliarnega čiščenja.
Postavili smo hipotezo, da bi uporaba magnetov za privlačenje nad in pod sapnikom (slika 3b) lahko povzročila bolj enakomerno magnetno polje, namesto magnetnega polja, ki je visoko koncentrirano na eni točki, kar bi lahko vodilo do bolj enakomerne porazdelitve delcev. Vendar naša predhodna študija ni našla jasnih dokazov, ki bi podpirali to hipotezo. Prav tako konfiguracija para magnetov za odbijanje (slika 3c) ni povzročila večjega odlaganja delcev na posnetem območju. Ti dve ugotovitvi kažeta, da dvojna magnetna postavitev ne izboljša bistveno lokalnega nadzora ciljanja MP in da je nastale močne magnetne sile težko konfigurirati, zaradi česar je ta pristop manj praktičen. Podobno tudi orientacija magneta nad in skozi sapnik (slika 3d) ni povečala števila delcev, zadržanih na posnetem območju. Nekatere od teh alternativnih konfiguracij morda niso uspešne, ker povzročijo nižje jakosti magnetnega polja znotraj območja odlaganja. Zato se konfiguracija z enim samim 30-stopinjskim magnetom (slika 3a) šteje za najlažjo in najučinkovitejšo metodo za testiranje in vivo.
Študija LV-MP je pokazala, da so se ravni transdukcije v sapniku v primerjavi s kontrolno skupino znatno povečale, ko so bili vektorji LV kombinirani s CombiMagom in dostavljeni po fizični motnji v prisotnosti magnetnega polja. Na podlagi sinhrotronskih slikovnih študij in rezultatov LacZ je bilo magnetno polje očitno sposobno ohraniti LV znotraj sapnika in zmanjšati število vektorskih delcev, ki so takoj prodrli globoko v pljuča. Takšne izboljšave ciljanja lahko vodijo do večje učinkovitosti, hkrati pa zmanjšajo dostavljene titre, transdukcijo izven tarče, vnetne in imunske stranske učinke ter stroške nosilcev genov. Pomembno je, da se po navedbah proizvajalca CombiMag lahko uporablja v povezavi z drugimi metodami prenosa genov, vključno z drugimi virusnimi vektorji (kot je AAV) in nukleinskimi kislinami.