Tankewol foar jo besite oan Nature.com. De browserferzje dy't jo brûke hat beheinde stipe foar CSS. Foar de bêste ûnderfining advisearje wy jo in bywurke browser te brûken (of kompatibiliteitsmodus yn Internet Explorer út te skeakeljen). Yn 'e tuskentiid, om trochgeande stipe te garandearjen, sille wy de side sûnder stilen en JavaScript werjaan.
Genfektoaren foar de behanneling fan cystyske fibrose-longsykte moatte rjochte wêze op 'e liedende luchtwegen, om't perifeare longtransduksje gjin terapeutysk foardiel biedt. De effisjinsje fan firale transduksje is direkt relatearre oan de ferbliuwstiid fan 'e fektor. Leveringsfloeistoffen lykas gendragers diffundearje lykwols natuerlik yn 'e alveoli tidens ynademing, en terapeutyske dieltsjes fan elke foarm wurde rap ferwidere troch mukosiliêr transport. It ferlingjen fan 'e ferbliuwstiid fan gendragers yn' e luchtwegen is wichtich, mar lestich te berikken. Gendrager-konjugearre magnetyske dieltsjes dy't nei it oerflak fan 'e luchtwegen kinne wurde rjochte, kinne regionale targeting ferbetterje. Fanwegen de útdagings fan in vivo-visualisaasje is it gedrach fan sokke lytse magnetyske dieltsjes op it luchtwei-oerflak yn 'e oanwêzigens fan in tapast magnetysk fjild min begrepen. It doel fan dizze stúdzje wie om synchrotronôfbylding te brûken om de in vivo-beweging fan in searje magnetyske dieltsjes yn 'e trachea fan anaesthesisearre rotten te visualisearjen om de dynamyk en patroanen fan yndividueel en bulktieltsjegedrach yn vivo te ûndersiikjen. Wy hawwe doe ek beoardiele oft de levering fan lentivirale magnetyske dieltsjes yn 'e oanwêzigens fan in magnetysk fjild de transduksje-effisjinsje yn' e rat soe ferheegje. trachea. Synchrotron-röntgenôfbylding lit it gedrach fan magnetyske dieltsjes sjen yn stasjonêre en bewegende magnetyske fjilden yn vitro en yn vivo. Dieltsjes kinne net maklik mei magneten oer it oerflak fan 'e libbene luchtwegen sleept wurde, mar tidens transport binne de ôfsettings konsintrearre yn it sichtfjild dêr't it magnetyske fjild it sterkst is. Transduksje-effisjinsje waard ek sechs kear ferhege doe't lentivirale magnetyske dieltsjes waarden levere yn 'e oanwêzigens fan in magnetysk fjild. Tegearre suggerearje dizze resultaten dat lentivirale magnetyske dieltsjes en magnetyske fjilden weardefolle oanpakken kinne wêze om genvektor-targeting te ferbetterjen en transduksjenivo's yn liedende luchtwegen yn vivo te ferheegjen.
Cystyske fibrose (CF) wurdt feroarsake troch fariaasje yn ien gen neamd de CF transmembraankonduktânsjeregulator (CFTR). It CFTR-proteïne is in ionkanaal dat oanwêzich is yn in protte epitheelzellen yn it heule lichem, ynklusyf de liedende luchtwegen, in wichtige plak fan CF-patogenese. CFTR-defekten liede ta abnormaal wettertransport, wêrtroch it luchtwei-oerflak útdroege wurdt en de djipte fan 'e luchtwei-oerflakfloeistoflaach (ASL) fermindere wurdt. Dit beheint ek it fermogen fan it mukosiliêre transportsysteem (MCT) om ynademe dieltsjes en patogenen út 'e luchtwegen te ferwiderjen. Us doel is om in lentivirale (LV) gentherapy te ûntwikkeljen om de juste kopy fan it CFTR-gen te leverjen en de sûnens fan ASL, MCT en longen te ferbetterjen, en om troch te gean mei it ûntwikkeljen fan nije technologyen dy't dizze parameters yn vivo kinne mjitte1.
LV-fektoaren binne ien fan 'e liedende kandidaten foar CF-luchtwei-gentherapy, benammen om't se it terapeutyske gen permanint yntegrearje kinne yn 'e basale sellen fan' e luchtwegen (luchtwei-stamzellen). Dit is wichtich om't se normale hydrataasje en slymferwidering kinne weromsette troch te differinsjearjen yn funksjonele gen-korrizjearre CF-assosjeare luchtwei-oerflaksellen, wat resulteart yn libbenslange foardielen. LV-fektoaren moatte rjochte wurde tsjin 'e liedende luchtwei, om't dit is wêr't CF-longsykte begjint. Levering fan 'e fektor djipper yn' e long kin resultearje yn alveolêre transduksje, mar dit hat gjin terapeutysk foardiel by CF. Floeistoffen lykas gendragers migrearje lykwols natuerlik nei de alveoli by ynademing nei levering3,4 en terapeutyske dieltsjes wurde rap yn 'e mûleholte ferwidere troch MCT. LV-transduksje-effisjinsje is direkt relatearre oan 'e tiid dat de fektor neist doelwitsellen bliuwt om sellulêre opname mooglik te meitsjen - de "ferbliuwstiid"5 - dy't maklik wurdt fermindere troch typyske regionale luchtstream, lykas koördinearre dieltsjes-slymfangst en MCT. Foar CF is it fermogen om de ferbliuwstiid fan 'e LV yn' e luchtwei te ferlingjen wichtich om hege nivo's fan transduksje yn dizze regio te berikken, mar is oant no ta in útdaging west.
Om dit obstakel te oerwinnen, stelle wy foar dat LV-magnetyske dieltsjes (MP's) op twa komplementêre manieren kinne helpe. Earst kinne se magnetysk nei it luchtwei-oerflak laat wurde om de targeting te ferbetterjen en de gendragerpartikels te helpen yn it winske luchtwei-gebiet te bliuwen; en ASL) om nei sellaach 6 te ferpleatsen. MP's binne breed brûkt as rjochte medisynleveringsmiddels as se bine oan antistoffen, gemoterapymiddels, of oare lytse molekulen dy't bine oan selmembranen of bine oan relevante sel-oerflakreceptors en opbouwe op tumorplakken yn 'e oanwêzigens fan statyske elektrisiteit. Magnetyske fjilden foar kankerbehanneling 7. Oare "hyperthermale" techniken binne bedoeld om MP's te ferwaarmjen as se bleatsteld wurde oan oscillearjende magnetyske fjilden, wêrtroch tumorsellen ferneatige wurde. It prinsipe fan magnetyske transfeksje, wêrby't in magnetysk fjild brûkt wurdt as in transfeksjemiddel om de oerdracht fan DNA nei sellen te ferbetterjen, wurdt faak yn vitro brûkt mei in ferskaat oan net-firale en firale genfektoren foar lestich te transducearjen sellinen. De effektiviteit fan LV-magnetotransfeksje is fêststeld, mei in vitro levering fan LV-MP's oan in minsklike bronchiale epitheelselline yn 'e oanwêzigens fan in statysk magnetysk fjild, wêrtroch't de transduksje-effisjinsje 186 kear ferhege wurdt yn ferliking mei allinich de LV-fektor. LV-MP is ek tapast op in in vitro CF-model, wêrby't magnetyske transfeksje LV-transduksje yn loft-floeistof-ynterface-kultueren 20 kear fergrutte yn 'e oanwêzigens fan CF-sputum10. Yn vivo magnetotransfeksje fan organen hat lykwols relatyf min omtinken krigen en is allinich evaluearre yn in pear bistûndersiken. stúdzjes11,12,13,14,15, benammen yn 'e longen16,17. Nettsjinsteande binne de kânsen foar magnetyske transfeksje yn CF-longterapy dúdlik. Tan et al. (2020) stelden dat "in proof-of-concept-stúdzje fan effisjinte magnetyske nanopartikel-pulmonale levering de wei sil baan foar takomstige CFTR-ynhalaasjestrategyen om klinyske útkomsten by CF-pasjinten te ferbetterjen"6.
It gedrach fan lytse magnetyske dieltsjes op luchtwei-oerflakken yn 'e oanwêzigens fan in oanbrocht magnetysk fjild is lestich te visualisearjen en te bestudearjen, en dêrom min begrepen. Yn oare stúdzjes hawwe wy in synchrotron-propagaasje-basearre faze-kontrast röntgenôfbylding (PB-PCXI) metoade ûntwikkele om net-invasive lytse in vivo feroarings yn ASL-djipte18 en MCT-gedrach19,20 te visualisearjen en te kwantifisearjen om direkt it hydrataasje fan it gaskanaaloerflak te mjitten en te brûken as in iere yndikator fan behannelingeffektiviteit. Derneist brûkt ús MCT-evaluaasjemetoade dieltsjes mei in diameter fan 10-35 µm besteande út aluminiumoxide of glês mei hege brekingsyndeks as MCT-markers dy't sichtber binne mei PB-PCXI21. Beide techniken binne geskikt foar fisualisaasje fan in ferskaat oan dieltsjetypen, ynklusyf MP.
Fanwegen syn hege romtlike en tydlike resolúsje binne ús PB-PCXI-basearre ASL- en MCT-analysetechniken tige geskikt foar it ûndersykjen fan 'e dynamyk en patroanen fan it gedrach fan ienige en bulkdieltsjes yn vivo om ús te helpen MP-genleveringstechniken te begripen en te optimalisearjen. De oanpak dy't wy hjir brûke is ôflaat fan ús stúdzjes mei de SPring-8 BL20B2-beamline, wêryn't wy floeistofbeweging visualisearren nei sham-fektordosislevering yn 'e nasale en pulmonale luchtwegen fan mûzen om ús net-uniforme genekspresjepatroanen te ferklearjen dy't waarnommen binne yn ús dierstúdzjes mei gendragerdosis 3,4.
It doel fan dizze stúdzje wie om de synchrotron PB-PCXI te brûken om de in vivo bewegingen fan in searje MP's yn 'e trachea fan libbene rotten te visualisearjen. Dizze PB-PCXI-ôfbyldingsstúdzjes wiene ûntworpen om in ferskaat oan MP's, magnetyske fjildsterkten en lokaasjes te testen om har effekt op MP-beweging te bepalen. Wy hawwe de hypoteze opsteld dat in ekstern tapast magnetysk fjild de levere MP soe helpe om te bliuwen of te bewegen yn it doelgebiet. Dizze stúdzjes hawwe ús ek tastien om magneetkonfiguraasjes te identifisearjen dy't it oantal dieltsjes dat yn 'e trachea nei de ôfsetting bewarre bliuwt maksimalisearje. Yn in twadde searje stúdzjes hawwe wy besocht dizze optimale konfiguraasje te brûken om it transduksjepatroan te demonstrearjen dat resulteart út in vivo levering fan LV-MP's oan 'e ratteluchtwei, basearre op 'e oanname dat de levering fan LV-MP's yn 'e kontekst fan luchtwei-targeting soe resultearje yn ferbettere LV-transduksje-effisjinsje.
Alle bistestúdzjes waarden útfierd neffens protokollen goedkard troch de Universiteit fan Adelaide (M-2019-060 en M-2020-022) en de SPring-8 Synchrotron Animal Ethics Committee. Eksperiminten waarden útfierd neffens ARRIVE-rjochtlinen.
Alle röntgenôfbylding waard útfierd by de BL20XU-beamline by de SPring-8 synchrotron yn Japan, mei in opset dy't fergelykber is mei dy earder beskreaun21,22. Koartsein, de eksperimintele doaze wie 245 m fan 'e synchrotronopslachring. In ôfstân fan 0,6 m tusken stekproef en detektor wurdt brûkt foar dieltsjeôfbyldingsstúdzjes en 0,3 m foar in vivo-ôfbyldingsstúdzjes om fazekontrasteffekten te generearjen. In monochromatyske strielenerzjy fan 25 keV waard brûkt. Ofbyldings waarden fêstlein mei in hege-resolúsje röntgenkonverter (SPring-8 BM3) keppele oan in sCMOS-detektor. De konverter konvertearret röntgenstrielen nei sichtber ljocht mei in 10 µm dikke scintillator (Gd3Al2Ga3O12), dy't dan nei in sCMOS-sensor rjochte wurdt mei in × 10 mikroskoopobjektyf (NA 0.3). De sCMOS-detektor wie Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) mei in arraygrutte fan 2048 × 2048 piksels en in rûge pikselgrutte fan 6,5 × 6,5 µm. Dizze opset jout in effektive isotropyske pikselgrutte fan 0,51 µm en in sichtfjild fan sawat 1,1 mm × 1,1 mm. In bleatstellingslingte fan 100 ms waard keazen om de signaal-lûdsferhâlding fan magnetyske dieltsjes binnen en bûten de luchtwegen te maksimalisearjen, wylst sykheljen-induzearre bewegingsartefakten minimalisearre waarden. Foar in vivo-stúdzjes waard in snelle röntgensluter yn it röntgenpaad pleatst om de strielingsdosis te beheinen troch de röntgenstriel tusken bleatstellings te blokkearjen.
De LV-drager waard net brûkt yn SPring-8 PB-PCXI-ôfbyldingsstúdzjes, om't de BL20XU-ôfbyldingskeamer net Biosafety Level 2-sertifisearre is. Ynstee dêrfan hawwe wy in oanbod fan goed karakterisearre MP's selektearre fan twa kommersjele leveransiers - dy't in ferskaat oan maten, materialen, izerkonsintraasjes en tapassingen dekke - earst om te begripen hoe't magnetyske fjilden ynfloed hawwe op MP-beweging binnen glêzen kapillaren, en dan yn libbene luchtwegen. op it oerflak. MP's fariearje yn grutte fan 0,25 oant 18 μm en binne makke fan in ferskaat oan materialen (sjoch tabel 1), mar de gearstalling fan elk stekproef, ynklusyf de grutte fan 'e magnetyske dieltsjes yn' e MP, is ûnbekend. Op basis fan ús wiidweidige MCT-stúdzjes 19, 20, 21, 23, 24, ferwachtsje wy dat MP's sa lyts as 5 μm te sjen binne op it tracheale luchtwei-oerflak, bygelyks troch opienfolgjende frames te subtrahearjen om ferbettere sichtberens fan MP-beweging te sjen. In inkele MP fan 0,25 μm is lytser as de resolúsje fan it ôfbyldingsapparaat, mar PB-PCXI wurdt ferwachte har folumekontrast en de beweging fan 'e oerflakfloeistof wêrop se nei ôfsetting wurde ôfset, te detektearjen.
Samples foar elke MP yn Tabel 1 waarden taret yn 20 μl glêzen kapillaren (Drummond Microcaps, PA, FS) mei in binnendiameter fan 0,63 mm. Korpuskulêre dieltsjes binne beskikber yn wetter, wylst CombiMag-dieltsjes beskikber binne yn 'e proprietêre floeistof fan' e fabrikant. Elke buis is heal fol mei floeistof (sawat 11 μl) en pleatst op 'e samplehâlder (sjoch figuer 1). De glêzen kapillaren waarden horizontaal pleatst op it samplestadium yn 'e ôfbyldingsdoaze, en posysjonearre de rânen fan' e floeistof. In 19 mm diameter (28 mm lang) nikkel-skel seldsume ierde neodymium izer boor (NdFeB) magneet (N35, kat. nr. LM1652, Jaycar Electronics, Austraalje) mei in oerbleaune magnetisaasje fan 1,17 Tesla waard befestige oan in aparte oersettingsstadium om syn posysje op ôfstân te feroarjen tidens ôfbylding. Röntgenôfbyldingswinning begjint as de magneet sawat 30 mm boppe it sample pleatst is, en ôfbyldings wurde krigen mei in snelheid fan 4 frames per sekonde. Tidens ôfbylding waard de magneet ticht by de glêzen kapillêrbuis brocht (sawat 1 mm fuort) en dan lâns de buis ferpleatst om de effekten fan fjildsterkte en posysje te beoardieljen.
In vitro-ôfbyldingsopstelling mei MP-samples yn glêzen kapillaren op it xy-oersettingsstadium fan it sample. It paad fan 'e röntgenstriel is markearre mei in reade stippele line.
Sadree't de in vitro sichtberens fan MP's fêststeld wie, waard in subset dêrfan in vivo test yn wild-type froulike albino Wistar-rotten (~12 wiken âld, ~200 g). 0,24 mg/kg medetomidine (Domitor®, Zenoaq, Japan), 3,2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) en 4 mg/kg butorphanol (Vetorphale®, Meiji Seika). Rotten waarden anaesthesia mei in mingsel fan Pharma (Japan) troch intraperitoneale ynjeksje. Nei anaesthesia waarden se taret op ôfbylding troch de pels om 'e trachea te ferwiderjen, in endotracheale buis (ET; 16 Ga iv-kanule, Terumo BCT) yn te foegjen en se yn 'e rêch te immobilisearjen op in oanpaste ôfbyldingsplaat mei in termyske tas om lichemstemperatuer 22 te behâlden. De ôfbyldingsplaat waard doe ûnder in lichte hoeke oan it stekproeftranslaasjestadium yn 'e ôfbyldingsdoaze befestige om de trachea horizontaal út te rjochtsjen yn 'e röntgenôfbylding, lykas werjûn yn figuer. 2a.
(a) Yn vivo-ôfbyldingsopstelling yn 'e SPring-8-ôfbyldingsdoaze, it paad fan 'e röntgenstriel is markearre mei in reade stippele line. (b, c) Magneetlokalisaasje op 'e trachea waard op ôfstân útfierd mei twa ortogonaal monteard IP-kamera's. Oan 'e linkerkant fan it skermôfbylding is de triedlus te sjen dy't de holle hâldt, en de leveringskanule op syn plak yn 'e ET-buis.
In op ôfstân bestjoerber spuitpompsysteem (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) mei in glêzen spuit fan 100 μl waard ferbûn mei in PE10-slang (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) fia in 30 Ga-naald. Markearje de buis om te soargjen dat de tip yn 'e juste posysje yn' e trachea is by it ynfoegjen fan 'e ET-buis. Mei de mikropomp waard de spuitplunjer weromlutsen wylst de tip fan 'e buis ûnderdompele waard yn it MP-monster dat levere wurde moast. De laden leveringsbuis waard doe ynfoege yn 'e endotracheale buis, wêrby't de tip binnen it sterkste diel fan ús ferwachte tapaste magnetyske fjild pleatst waard. Ofbyldingsakwisysje waard kontroleare mei in respiraasjedetektor ferbûn mei ús Arduino-basearre timingbox, en alle sinjalen (bygelyks temperatuer, respiraasje, iepening/sluting fan sluter en ôfbyldingsakwisysje) waarden opnommen mei Powerlab en LabChart (AD Instruments, Sydney, Austraalje) 22. By it meitsjen fan ôfbyldings Doe't de behuizing net tagonklik wie, waarden twa IP-kamera's (Panasonic BB-SC382) ûnder in hoeke fan sawat 90° ten opsichte fan elkoar pleatst en waarden brûkt om de posysje fan 'e ... te kontrolearjen. magneet relatyf oan 'e trachea tidens ôfbylding (Fig. 2b, c). Om bewegingsartefakten te minimalisearjen, waard ien ôfbylding per azem krigen tidens it plateau fan 'e ein-tijstream.
In magneet is befestige oan in twadde stadium dat op ôfstân fan bûten de ôfbyldingshúsfesting pleatst wurde kin. Ferskate magneetposysjes en konfiguraasjes waarden test, ynklusyf: monteard ûnder in hoeke fan sawat 30° boppe de trachea (konfiguraasjes werjûn yn ôfbyldings 2a en 3a); ien magneet boppe it bist en de oare hjirûnder, mei poalen ynsteld om oan te lûken (ôfbylding 3b); ien magneet boppe it bist en de oare hjirûnder, mei de poalen ynsteld om ôf te kearen (ôfbylding 3c); en ien magneet boppe en loodrecht op 'e trachea (ôfbylding 3d). Sadree't it bist en de magneet konfigurearre binne en de te testen MP yn 'e spuitpomp laden is, leverje in dosis fan 50 μl mei in snelheid fan 4 μl/sek wylst ôfbyldings makke wurde. De magneet wurdt dan hinne en wer lâns of lateraal oer de trachea ferpleatst, wylst ôfbyldings trochgean wurde makke.
Magneetkonfiguraasje foar in vivo-ôfbylding (a) in inkele magneet boppe de trachea ûnder in hoeke fan sawat 30°, (b) twa magneten ynsteld om oan te lûken, (c) twa magneten ynsteld om ôf te kearen, (d) in inkele magneet boppe en loodrecht yn 'e trachea. De waarnimmer seach fan 'e mûle nei ûnderen nei de longen troch de trachea, en de röntgenstriel gie troch de linkerkant fan 'e rat en ferliet de rjochterkant. De magneet wurdt of lâns de lingte fan 'e luchtwei beweecht of links en rjochts boppe de trachea yn 'e rjochting fan 'e röntgenstriel.
Wy hawwe ek besocht de sichtberens en it gedrach fan dieltsjes yn 'e luchtwegen te bepalen yn 'e ôfwêzigens fan betiizjende sykheljen en hertbeweging. Dêrom waarden bisten oan 'e ein fan 'e ôfbyldingsperioade op in humane manier fermoarde foar in oerdoasis fan pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, Feriene Steaten; ~65 mg/kg ip). Guon bisten waarden op it ôfbyldingsplatfoarm litten, en doe't it sykheljen en de hertslach stopten, waard it ôfbyldingsproses werhelle, wêrby't in ekstra doasis MP tafoege waard as der gjin MP sichtber wie op it oerflak fan 'e luchtwegen.
De krigen ôfbyldings waarden korrizjearre foar flakfjild en tsjusterfjild en doe gearstald ta in film (20 frames per sekonde; 15-25 × normale snelheid ôfhinklik fan sykheljensfrekwinsje) mei in oanpast skript skreaun yn MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Alle stúdzjes oer LV-genvektorlevering waarden útfierd by de Laboratory Animal Research Facility oan 'e Universiteit fan Adelaide en hiene as doel de resultaten fan it SPring-8-eksperimint te brûken om te beoardieljen oft LV-MP-levering yn 'e oanwêzigens fan in magnetysk fjild de genoerdracht yn vivo koe ferbetterje. Om de effekten fan MP en magnetysk fjild te beoardieljen, waarden twa groepen bisten behannele: ien groep krige LV-MP mei in magneet pleatst, en de oare groep krige in kontrôlegroep mei LV-MP sûnder magneet.
LV-genfektoren waarden generearre mei earder beskreaune metoaden 25, 26. De LacZ-fektor ekspressearret it kearn-lokalisearre beta-galaktosidase-gen dat oandreaun wurdt troch de konstitutive MPSV-promotor (LV-LacZ), dy't in blau reaksjeprodukt produseart yn transdûsearre sellen, sichtber yn longweefselfronten en weefselseksjes. Titraasje waard útfierd yn selkulturen troch it oantal LacZ-positive sellen mei de hân te tellen mei in hemocytometer om de titer yn TU/ml te berekkenjen. Dragers wurde kryopreservearre by -80 °C, ûntdooid foar gebrûk, en bûn oan CombiMag troch te mingen yn in 1:1-ferhâlding en teminsten 30 minuten op iis te ynkubearjen foar levering.
Normale Sprague Dawley-rotten (n = 3/groep, ~2-3 waarden intraperitoneaal anaesthesisearre mei in mingsel fan 0,4 mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Austraalje) en 60 mg/kg ketamine (Ilium, Austraalje) (moanne-âlde) ip) ynjeksje en net-sjirurgyske orale kanylaasje mei in 16 Ga iv-kanyl. Om te soargjen dat it tracheale luchtweiweefsel LV-transduksje ûntfangt, waard it kondisjonearre mei ús earder beskreaun meganyske perturbaasjeprotokol, wêrby't it tracheale luchtwei-oerflak axiaal wreef waard mei in triedkoer (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, FS) 30 s28. Tracheale administraasje fan LV-MP waard doe útfierd yn in biologyske feiligenskabinet sawat 10 minuten nei perturbaasje.
It magnetyske fjild dat yn dit eksperimint brûkt waard, waard op in fergelykbere manier konfigurearre as de yn vivo röntgenôfbyldingsstúdzje, mei deselde magneten dy't boppe de trachea hâlden waarden mei help fan destillaasjestentklips (figuer 4). In folume fan 50 μl (2 × 25 μl aliquots) fan LV-MP waard yn 'e trachea (n = 3 bisten) levere mei in pipette mei in geltip lykas earder beskreaun. In kontrôlegroep (n = 3 bisten) krige deselde LV-MP's sûnder gebrûk fan in magneet. Nei't de ynfúzje foltôge is, wurdt de kanyle út 'e ET-buis helle en wurdt it bist ekstubearre. De magneet bliuwt 10 minuten op syn plak, dan wurdt er fuorthelle. Rotten krigen in subkutane doasis meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Austraalje) folge troch omkearing fan anaesthesia troch ip-ynjeksje fan 1 mg/kg atipamazolhydrochloride (Antisedan, Zoetis, Austraalje). Rotten waarden waarm hâlden en kontroleare oant se folslein hersteld wiene fan anaesthesia.
LV-MP-ôfleveringsapparaat yn in biologyske feiligenskast. De ljochtgrize Luer-hub fan 'e ET-buis kin út 'e mûle stekke sjoen wurde en de gelpunt fan 'e pipette dy't op 'e ôfbylding te sjen is, wurdt troch de ET-buis oant de winske djipte yn 'e trachea ynbrocht.
Ien wike nei de LV-MP-dosearringsproseduere waarden de bisten op in humane manier fermoarde troch 100% CO2-ynhalaasje en waard de LacZ-ekspresje beoardiele mei ús standert X-gal-behanneling. De trije meast kaudale kraakbeenringen waarden fuorthelle om te soargjen dat meganyske skea of ​​floeistofbehâld fan it pleatsen fan in endotracheale buis net yn 'e analyze opnommen waard. Elke trachea waard yn 'e lingterjochting trochsnien om twa helten te meitsjen foar analyze, en se waarden yn in skûtel mei silikonrubber (Sylgard, Dow Inc) monteard mei in Minutien-naald (Fine Science Tools) om it luminale oerflak te visualisearjen. De ferdieling en it patroan fan transdûsearre sellen waarden befêstige troch frontale fotografy mei in Nikon-mikroskoop (SMZ1500) mei in DigiLite-kamera en TCapture-software (Tucsen Photonics, Sina). Ofbyldings waarden krigen mei 20x fergrutting (ynklusyf de heechste ynstelling foar de folsleine breedte fan 'e trachea), wêrby't de folsleine lingte fan 'e trachea stap foar stap ôfbylde waard, wêrtroch genôch oerlaap tusken elke ôfbylding garandearre waard om "oaninoar naaie" fan ôfbyldings mooglik te meitsjen. Ofbyldings fan elke trachea waarden doe gearstald ta in inkele gearstalde ôfbylding mei de Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) mei in planêr bewegingsalgoritme. LacZ-ekspresjegebieten yn gearstalde ôfbyldings fan 'e trachea fan elk bist waarden kwantifisearre mei in automatisearre MATLAB-skript (R2020a, MathWorks) lykas earder beskreaun, mei ynstellings fan 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15, en Value < 0.7. Troch de kontoeren fan it weefsel te folgjen, waard in masker mei de hân generearre yn GIMP v2.10.24 foar elke gearstalde ôfbylding om it weefselgebiet te identifisearjen en falske deteksjes fan bûten it tracheale weefsel te foarkommen. De kleurde gebieten fan alle gearstalde ôfbyldings fan elk bist waarden opteld om it totale kleurde gebiet foar dat bist te generearjen. It kleurde gebiet waard doe dield troch it totale maskergebiet om it normalisearre gebiet te generearjen.
Elke trachea waard ynbêde yn paraffine en seksjes fan 5 μm waarden ôfsnien. De seksjes waarden 5 minuten tsjinkleurd mei neutraal fluch read en ôfbyldings waarden makke mei in Nikon Eclipse E400-mikroskoop, DS-Fi3-kamera en NIS-elemintopnamesoftware (ferzje 5.20.00).
Alle statistyske analyses waarden útfierd yn GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Statistyske betsjutting waard ynsteld op p ≤ 0.05. Normaliteit waard ferifiearre mei de Shapiro-Wilk-test, en ferskillen yn LacZ-kleuring waarden beoardiele mei de ûnpare t-test.
De seis MP's dy't yn Tabel 1 beskreaun binne, waarden ûndersocht mei PCXI, en de sichtberens wurdt beskreaun yn Tabel 2. Twa polystyreen MP's (MP1 en MP2; respektivelik 18 μm en 0,25 μm) wiene net sichtber ûnder PCXI, mar de rest fan 'e samples wiene identifisearber (foarbylden wurde werjûn yn Figuer 5). MP3 en MP4 (10-15% Fe3O4; respektivelik 0,25 μm en 0,9 μm) binne swak sichtber. Hoewol it guon fan 'e lytste testte dieltsjes befettet, wie MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) it meast útsprutsen. It CombiMag-produkt MP6 is lestich te spotten. Yn alle gefallen waard ús fermogen om MP te detektearjen signifikant ferbettere troch de magneet parallel oan it kapillêr hinne en wer te ferpleatsen. Doe't de magneten fan it kapillêr wei beweegden, útwreiden de dieltsjes har yn lange snaren, mar doe't de magneten tichterby kamen en de magnetyske fjildsterkte tanommen, waarden de dieltsjesnaren koarter doe't de dieltsjes nei it boppeflak fan it kapillêr migrearren (sjoch Oanfoljende Fideo S1: MP4), wêrtroch't de dieltsjetichtens fan it oerflak. Omkeard, as de magneet út it kapillêr fuorthelle wurdt, nimt de fjildsterkte ôf en de MP's wurde opnij rangearre yn lange snaren dy't útstekke fan it boppeste oerflak fan it kapillêr (sjoch Oanfoljende Fideo S2: MP4). Nei't de magneet ophâldt mei bewegen, bliuwe de dieltsjes in koarte tiid bewege nei't se de lykwichtsposysje berikt hawwe. As de MP nei en fan it boppeste oerflak fan it kapillêr beweecht, slepe de magnetyske dieltsjes typysk it pún troch de floeistof.
De sichtberens fan MP ûnder PCXI ferskilt signifikant tusken samples. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 en (d) MP6. Alle ôfbyldings dy't hjir werjûn wurde, binne makke mei in magneet dy't sawat 10 mm direkt boppe de kapillêr leit. De dúdlike grutte sirkels binne luchtbellen dy't yn 'e kapillêr fongen binne, en litte dúdlik de swart-wite rânekenmerken fan fazekontrastôfbylding sjen. It reade fak befettet de kontrastferbetterjende fergrutting. Tink derom dat de diameters fan 'e magneetskema's yn alle figueren net op skaal binne en sawat 100 kear grutter binne as werjûn.
As de magneet nei lofts en rjochts lâns de boppekant fan it kapillêr ferskowe wurdt, feroaret de hoeke fan 'e MP-string om yn oerienstimming te wêzen mei de magneet (sjoch figuer 6), wêrtroch't de magnetyske fjildlinen ôfbylde wurde. Foar MP3-5, nei't de akkoard in drompelhoeke berikt, wurde de dieltsjes lâns it boppeflak fan it kapillêr sleept. Dit resulteart faak yn MP's dy't klusterje yn gruttere groepen tichtby wêr't it magnetyske fjild it sterkst is (sjoch oanfoljende fideo S3: MP5). Dit is ek foaral dúdlik by ôfbylding tichtby it kapillêr ein, wêrtroch't MP's aggregearje en konsintrearje by de floeistof-loft-ynterface. Dieltsjes yn MP6, dy't dreger te ûnderskieden wiene as MP3-5, waarden net sleept doe't de magneet lâns it kapillêr beweecht, mar de MP-strings dissosiearren, wêrtroch't de dieltsjes yn it sichtfjild bleaunen (sjoch oanfoljende fideo S4: MP6). Yn guon gefallen, doe't it tapaste magnetyske fjild waard fermindere troch de magneet in grutte ôfstân fan 'e ôfbyldingslokaasje te ferpleatsen, sakken alle oerbleaune MP's stadich nei it ûnderflak fan 'e buis troch swiertekrêft, wylst se yn 'e string bleaunen (sjoch oanfoljende fideo S5: MP3).
De hoeke fan 'e MP-snaar feroaret as de magneet nei rjochts oerset wurdt boppe de kapillêr. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 en (d) MP6. It reade fak befettet de kontrastferbetterjende fergrutting. Tink derom dat de oanfoljende fideo's ynformatyf binne, om't se wichtige dieltsjestruktuer en dynamyske ynformaasje iepenbierje dy't net visualisearre wurde kin yn dizze statyske ôfbyldings.
Us testen lieten sjen dat it stadich hinne en wer bewegen fan 'e magneet lâns de trachea de fisualisaasje fan MP yn 'e kontekst fan komplekse beweging yn vivo fasilitearret. Yn vivo-testen waarden net útfierd, om't polystyreenkralen (MP1 en MP2) net sichtber wiene yn 'e kapillêr. Elk fan 'e oerbleaune fjouwer MP's waarden yn vivo testen mei de lange as fan 'e magneet konfigurearre boppe de trachea ûnder in hoeke fan sawat 30° mei de fertikale (sjoch figueren 2b en 3a), om't dit resultearre yn langere MP-keatlingen en effektiver wie as de konfiguraasje fan 'e magneet dy't beëinige wie. MP3, MP4 en MP6 waarden net ûntdutsen yn 'e trachea fan libbene bisten. Doe't de luchtwegen fan 'e ratten waarden ôfbylde nei't de bisten op in humane manier fermoarde wiene, bleauwen de dieltsjes ûnsichtber, sels doe't ekstra folume waard tafoege mei in spuitpomp. MP5 hie it heechste izeroksidegehalte en wie it ienige sichtbere dieltsje, en waard dêrom brûkt om it yn vivo gedrach fan MP te beoardieljen en te karakterisearjen.
It pleatsen fan 'e magneet oer de trachea tidens MP-levering resultearre yn in protte, mar net alle, MP's dy't konsintrearre wiene yn it sichtfjild. Dieltsjes dy't de trachea yngeane, wurde it bêste waarnommen yn bisten dy't op minsklike wize opoffere binne. Figuer 7 en Oanfoljende Fideo S6: MP5 lit rappe magnetyske fêstlizzen en ôfstimming fan dieltsjes op it oerflak fan 'e ventrale trachea sjen, wat oanjout dat MP's nei winske regio's fan 'e trachea rjochte wurde kinne. By it sykjen fierder distaal lâns de trachea nei MP-levering, waarden guon MP's tichter by de carina fûn, wat suggerearret dat de magnetyske fjildsterkte net genôch wie om alle MP's te sammeljen en te behâlden, om't se troch it gebiet fan maksimale magnetyske fjildsterkte waarden levere tidens it floeistofproses. Nettsjinsteande wiene postpartum MP-konsintraasjes heger om it ôfbylde gebiet hinne, wat suggerearret dat in protte MP's yn 'e luchtweiregio's bleaunen wêr't de tapaste magnetyske fjildsterkte it heechst wie.
Ofbyldings fan (a) foar en (b) nei it leverjen fan MP5 yn 'e trachea fan in koartlyn euthanasearre rat mei de magneet direkt boppe it ôfbyldingsgebiet pleatst. It ôfbyldingsgebiet leit tusken de twa kraakbeenringen. Foar it leverjen fan MP is der wat floeistof yn 'e luchtwegen. It reade fak befettet de kontrastfersterkende fergrutting. Dizze ôfbyldings binne fan 'e fideo dy't te sjen is yn Supplementary Video S6:MP5.
It oersetten fan 'e magneet lâns de trachea yn vivo soarge derfoar dat de MP-keten fan hoeke feroare binnen it luchtwei-oerflak op in manier dy't fergelykber is mei dy sjoen yn kapillaren (sjoch figuer 8 en oanfoljende fideo S7: MP5). Yn ús stúdzje koene MP's lykwols net lâns it oerflak fan 'e libbene luchtwei sleept wurde lykas se koene mei kapillaren. Yn guon gefallen sil de MP-keten langer wurde as de magneet nei lofts en rjochts beweecht. Nijsgjirrich is dat wy ek fûnen dat de dieltsjesstring de djipte fan 'e oerflakfloeistoflaach liket te feroarjen as de magneet yn 'e lingterjochting lâns de trachea beweecht wurdt, en útwreidet as de magneet direkt boppe de holle beweecht wurdt en de dieltsjesstring nei in fertikale posysje draaid wurdt (sjoch oanfoljende fideo S7). : MP5 om 0:09, rjochtsûnder). It karakteristike bewegingspatroan feroare doe't de magneet oer de boppekant fan 'e trachea lateraal ferpleatst waard (dat is, nei lofts of rjochts fan it bist ynstee fan lâns de lingte fan 'e trachea). De dieltsjes wiene noch dúdlik sichtber doe't se beweegden, mar doe't de magneet út 'e trachea fuorthelle waard, waarden de punten fan 'e dieltsjesstringen sichtber (sjoch Oanfoljende Fideo S8: MP5, begjinnend by 0:08). Dit komt oerien mei it MP-gedrach dat wy waarnommen hawwe ûnder in tapast magnetysk fjild yn in glêzen kapillêr.
Foarbyldôfbyldings dy't MP5 sjen litte yn 'e trachea fan in libbene, ûnder narcose set rat. (a) De magneet wurdt brûkt om ôfbyldings boppe en links fan 'e trachea te meitsjen, dan (b) nei't de magneet nei rjochts ferpleatst is. It reade fak befettet de kontrastferbetterjende fergrutting. Dizze ôfbyldings binne fan 'e fideo dy't te sjen is yn Supplementary Video S7:MP5.
Doe't de twa poalen yn in noard-súd-oriïntaasje boppe en ûnder de trachea konfigurearre wiene (d.w.s. oanlûkend; Fig. 3b), liken de MP-akkoarden langer en wiene se op 'e sydwand fan' e trachea pleatst ynstee fan op it dorsale tracheale oerflak (sjoch Oanfoljende Fideo S9: MP5). Hege konsintraasjes dieltsjes op ien lokaasje (d.w.s. it dorsale oerflak fan 'e trachea) waarden lykwols net ûntdutsen nei floeistoflevering doe't in dûbelmagneetapparaat waard brûkt, wat typysk foarkomt as in ienmagneetapparaat wurdt brûkt. Doe't ien magneet konfigurearre waard om de omkearde poalen ôf te kearen (Fig. 3c), like it oantal dieltsjes dat sichtber wie yn it sichtfjild net ta te nimmen nei levering. De opset fan beide dûbelmagneetkonfiguraasjes is útdaagjend fanwegen de hege magnetyske fjildsterkten dy't de magneten respektivelik lûke of drukke. De opset waard doe feroare nei in inkele magneet parallel oan 'e luchtwei, mar dy't 90 graden troch de luchtwei giet, sadat de fjildlinen de tracheale muorre ortogonaal krústen (Fig. 3d), in oriïntaasje ûntworpen om te bepalen oft dieltsjesaggregaasje op 'e sydwand waarnommen wurde koe. Yn dizze konfiguraasje wie der gjin identifisearbere beweging fan MP-akkumulaasje of magneetbeweging. Op basis fan al dizze resultaten waard in konfiguraasje mei ien magneet en in oriïntaasje fan 30 graden (figuer 3a) keazen foar yn vivo-gendragerstúdzjes.
Doe't it bist direkt nei it deadzjen op minsklike wize werhelle ôfbyldings makke waard, betsjutte de ôfwêzigens fan betiizjende weefselbeweging dat finer en koartere dieltsjeslinen te ûnderskieden wiene yn it dúdlike ynterchondrale fjild, "wibbelich" yn oerienstimming mei de translaasjebeweging fan 'e magneet. Dochs kin de oanwêzigens en beweging fan MP6-dieltsjes noch altyd net dúdlik sjoen wurde.
De LV-LacZ-titer wie 1,8 × 108 TU/ml, en nei 1:1 mingen mei CombiMag MP (MP6) krigen de bisten in tracheale dosis fan 50 μl fan 9 × 107 TU/ml LV-medium (d.w.s. 4,5 × 106 TU/rat). Yn dizze stúdzjes hawwe wy, ynstee fan de magneet te ferpleatsen tidens de befalling, de magneet yn ien posysje fêstmakke om te bepalen oft LV-transduksje (a) ferbettere wurde koe yn ferliking mei fektorlevering yn 'e ôfwêzigens fan in magnetysk fjild, en (b) rjochte wurde koene. Luchtwegsellen wurde transdusearre nei magnetyske doelgebieten fan 'e boppeste luchtwegen.
De oanwêzigens fan magneten en it gebrûk fan CombiMag yn kombinaasje mei LV-fektoren liken gjin negative effekten te hawwen op 'e sûnens fan bisten, lykas ús standert LV-fektorleveringsprotokol ek die. Frontale ôfbyldings fan 'e tracheale regio ûnderwurpen oan meganyske perturbaasje (Oanfoljende Fig. 1) joegen oan dat d'r signifikant hegere nivo's fan transduksje wiene yn 'e groep bisten behannele mei LV-MP doe't de magneet oanwêzich wie (Fig. 9a). Allinnich in lytse hoemannichte blauwe LacZ-kleuring wie oanwêzich yn 'e kontrôlegroep (Fig. 9b). Kwantifikaasje fan normalisearre X-Gal-kleurde gebieten liet sjen dat administraasje fan LV-MP yn 'e oanwêzigens fan in magnetysk fjild in sawat 6-fâldige ferbettering produsearre (Fig. 9c).
Foarbyld gearstalde ôfbyldings dy't tracheale transduksje sjen litte troch LV-MP (a) yn 'e oanwêzigens fan in magnetysk fjild en (b) yn 'e ôfwêzigens fan in magneet. (c) Statistysk signifikante ferbettering yn normalisearre LacZ-transduksjegebiet binnen de trachea by gebrûk fan 'e magneet (*p = 0.029, t-test, n = 3 per groep, gemiddelde ± SEM).
Neutraal fluch readkleurde seksjes (foarbyld werjûn yn Oanfoljende Fig. 2) lieten LacZ-kleurde sellen sjen oanwêzich yn in ferlykber patroan en lokaasje as earder rapportearre.
In wichtige útdaging foar gentherapy foar de luchtwegen bliuwt de krekte lokalisaasje fan dragerpartikels nei regio's fan belang en it berikken fan hege nivo's fan transduksje-effisjinsje yn 'e bewegende long yn' e oanwêzigens fan luchtstream en aktive slymferwidering. Foar LV-dragers ûntworpen om CF-luchtweisykte te behanneljen, is it ferheegjen fan 'e ferbliuwstiid fan dragerpartikels yn' e liedende luchtwegen in oant no ta ûntwykber doel west. Lykas oanjûn troch Castellani et al., hat it gebrûk fan magnetyske fjilden om transduksje te ferbetterjen foardielen yn ferliking mei oare genleveringsmetoaden lykas elektroporaasje, om't it ienfâld, kosten-effektiviteit, leveringslokalisaasje, ferhege effisjinsje en koartere ynkubaasjetiden kin kombinearje, en mooglik in lytsere dragerdosis10. De in vivo-ôfsetting en gedrach fan magnetyske dieltsjes yn 'e luchtwegen ûnder ynfloed fan eksterne magnetyske krêften is lykwols nea beskreaun, en de mooglikheid fan dizze metoade is ek net yn vivo oantoand om genekspresjenivo's yn yntakte libbene luchtwegen te ferbetterjen.
Us in vitro synchrotron PCXI-eksperiminten lieten sjen dat alle dieltsjes dy't wy testen, mei útsûndering fan polystyreen MP, sichtber wiene yn 'e ôfbyldingsopstelling dy't wy brûkten. Yn 'e oanwêzigens fan in magnetysk fjild foarmje MP's snaren wêrfan de lingten relatearre binne oan it dieltsjetype en de magnetyske fjildsterkte (d.w.s. de tichtbyens en beweging fan 'e magneet). Lykas te sjen is yn figuer 10, wurde de snaren dy't wy observearje foarme trochdat elk yndividueel dieltsje magnetisearre wurdt en syn eigen lokale magnetyske fjild opwekket. Dizze aparte fjilden feroarsaakje dat oare ferlykbere dieltsjes aggregearje en ferbine, mei groepsnaar-achtige bewegingen troch lokale krêften fan 'e lokale oantreklike en ôfstjittende krêften fan oare dieltsjes.
Skematysk diagram dat (a, b) dieltsjetreinen sjen lit dy't generearre binne yn floeistoffolle kapillaren en (c, d) loftfolle trachea. Tink derom dat de kapillaren en trachea net op skaal tekene binne. Paneel (a) befettet ek in beskriuwing fan 'e MP, dy't Fe3O4-dieltsjes befettet dy't yn snaren arranzjearre binne.
Doe't de magneet boppe it kapillêr ferpleatst waard, berikte de hoeke fan 'e dieltsjesstring in krityske drompel foar MP3-5 mei Fe3O4, wêrnei't de dieltsjesstring net langer yn 'e oarspronklike posysje bleau, mar lâns it oerflak nei in nije posysje ferpleatst waard.magneet.Dit effekt sil wierskynlik foarkomme om't it oerflak fan it glêzen kapillêr glêd genôch is om dizze beweging mooglik te meitsjen.Ynteressant is dat MP6 (CombiMag) him net sa gedroech, mooglik om't de dieltsjes lytser wiene, ferskillende coatings of oerflakladingen hiene, of in eigen dragerfloeistof har fermogen om te bewegen beynfloede.It byldkontrast fan CombiMag-dieltsjes is ek swakker, wat suggerearret dat de floeistof en dieltsjes ferlykbere tichtheden kinne hawwe en dêrom net maklik nei elkoar ta bewege.Dieltsjes kinne ek fêstkomme as de magneet te hurd beweecht, wat oanjout dat de magnetyske fjildsterkte de wriuwing tusken dieltsjes yn 'e floeistof net altyd oerwinne kin, wat suggerearret dat it miskien net ferrassend is dat de magnetyske fjildsterkte en de ôfstân tusken de magneet en it doelgebiet tige wichtich binne.Tegearre suggerearje dizze resultaten ek dat, hoewol magneten in protte MP's kinne fange dy't troch it doelgebiet streame, it net wierskynlik is dat der op magneten fertroud wurde kin om te bewegen. CombiMag-dieltsjes lâns it oerflak fan 'e trachea. Dêrom konkludearje wy dat yn vivo LV-MP-stúdzjes statyske magnetyske fjilden brûke moatte om spesifike regio's fan 'e luchtweibeam fysyk te rjochtsjen.
As dieltsjes yn it lichem ôflevere wurde, binne se lestich te identifisearjen yn 'e kontekst fan kompleks bewegend lichemsweefsel, mar it fermogen om se te detektearjen waard ferbettere troch de magneet horizontaal boppe de trachea te ferpleatsen om de MP-snaren te "wikkeljen". Hoewol live ôfbylding mooglik is, is it makliker om dieltsjebeweging te ûnderskieden as it bist op in humane wize fermoarde is. MP-konsintraasjes wiene oer it algemien it heechst op dizze lokaasje doe't de magneet boppe it ôfbyldingsgebiet pleatst wie, hoewol guon dieltsjes meastentiids fierder lâns de trachea fûn waarden. Yn tsjinstelling ta in vitro-stúdzjes kinne dieltsjes net lâns de trachea sleept wurde troch de magneet te ferpleatsen. Dizze fynst komt oerien mei hoe't it slym dat it oerflak fan 'e trachea bedekt typysk ynademe dieltsjes ferwurket, se yn it slym fangt en dêrnei ferwidere wurdt troch it mukosiliêre klaringmeganisme.
Wy hawwe de hypoteze opsteld dat it gebrûk fan magneten foar oanlûking boppe en ûnder de trachea (Fig. 3b) kin resultearje yn in mear unifoarm magnetysk fjild, ynstee fan in magnetysk fjild dat op ien punt tige konsintrearre is, wat potinsjeel kin liede ta in mear unifoarme ferdieling fan dieltsjes. Us foarriedige stúdzje fûn lykwols gjin dúdlik bewiis om dizze hypoteze te stypjen. Likegoed resultearre it konfigurearjen fan in pear magneten om ôf te drukken (Fig. 3c) net yn mear dieltsjeôfsetting yn it ôfbylde gebiet. Dizze twa befiningen litte sjen dat de dûbele magneetopstelling de lokale kontrôle fan MP-targeting net signifikant ferbetteret, en dat de resultearjende sterke magnetyske krêften lestich te konfigurearjen binne, wêrtroch dizze oanpak minder praktysk is. Likegoed fergrutte it oriïntearjen fan 'e magneet boppe en troch de trachea (Fig. 3d) ek it oantal dieltsjes dat yn it ôfbylde gebiet bewarre bleau net. Guon fan dizze alternative konfiguraasjes binne miskien net suksesfol, om't se resultearje yn legere magnetyske fjildsterkten binnen it ôfsettingsgebiet. Dêrom wurdt de ienige 30-graden hoekemagneetkonfiguraasje (Figuer 3a) beskôge as de maklikste en effisjintste metoade foar in vivo-testen.
De LV-MP-stúdzje liet sjen dat doe't LV-fektorren waarden kombineare mei CombiMag en levere waarden nei fysike perturbaasje yn 'e oanwêzigens fan in magnetysk fjild, de transduksjenivo's yn 'e trachea signifikant ferhege wiene yn ferliking mei kontrôles. Op basis fan 'e synchrotronôfbyldingsstúdzjes en LacZ-resultaten koe it magnetyske fjild blykber de LV yn 'e trachea behâlde en it oantal fektorpartikels ferminderje dy't direkt djip yn 'e long penetrearren. Sokke ferbetteringen yn targeting kinne liede ta hegere effektiviteit, wylst levere titers, off-target transduksje, inflammatoire en ymmúnside-effekten, en kosten fan gendragers wurde fermindere. Wichtich is dat, neffens de fabrikant, CombiMag kin wurde brûkt yn kombinaasje mei oare genoerdrachtmetoaden, ynklusyf mei oare firale fektoren (lykas AAV) en nukleïnesoeren.