გმადლობთ, რომ ეწვიეთ Nature.com-ს. თქვენს მიერ გამოყენებულ ბრაუზერის ვერსიას CSS-ის შეზღუდული მხარდაჭერა აქვს. საუკეთესო გამოცდილებისთვის გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში). ამასობაში, მხარდაჭერის უწყვეტი უზრუნველყოფის მიზნით, საიტს სტილებისა და JavaScript-ის გარეშე ვაჩვენებთ.
ფილტვის კისტოზური ფიბროზის დაავადების სამკურნალოდ გენის ვექტორები უნდა იყოს მიმართული გამტარი სასუნთქი გზებისკენ, რადგან პერიფერიული ფილტვის ტრანსდუქცია არ იძლევა თერაპიულ სარგებელს. ვირუსული ტრანსდუქციის ეფექტურობა პირდაპირ კავშირშია ვექტორის რეზიდენციის დროსთან. თუმცა, მიწოდების სითხეები, როგორიცაა გენის მატარებლები, ბუნებრივად დიფუზირდება ალვეოლებში ჩასუნთქვის დროს და ნებისმიერი ფორმის თერაპიული ნაწილაკები სწრაფად გამოიყოფა მუკოცილიარული ტრანსპორტით. გენის მატარებლების სასუნთქ გზებში რეზიდენციის დროის გახანგრძლივება მნიშვნელოვანია, მაგრამ რთული მისაღწევია. გენის მატარებელთან კონიუგირებული მაგნიტური ნაწილაკები, რომლებიც შეიძლება მიმართული იყოს სასუნთქი გზების ზედაპირზე, შეუძლიათ გააუმჯობესონ რეგიონალური დამიზნება. ინ ვივო ვიზუალიზაციის სირთულეების გამო, ასეთი მცირე მაგნიტური ნაწილაკების ქცევა სასუნთქი გზების ზედაპირზე გამოყენებული მაგნიტური ველის თანაარსებობისას ცუდად არის შესწავლილი. ამ კვლევის მიზანი იყო სინქროტრონული ვიზუალიზაციის გამოყენება ანესთეზირებული ვირთხების ტრაქეაში მაგნიტური ნაწილაკების სერიის ინ ვივო მოძრაობის ვიზუალიზაციისთვის, რათა შესწავლილიყო ინდივიდუალური და მოცულობითი ნაწილაკების ქცევის დინამიკა და ნიმუშები ინ ვივო. შემდეგ ჩვენ ასევე შევაფასეთ, გაზრდიდა თუ არა ლენტივირუსული მაგნიტური ნაწილაკების მიწოდება მაგნიტური ველის თანაარსებობისას ტრანსდუქციის ეფექტურობას ვირთხის ტრაქეაში. სინქროტრონული რენტგენოგრაფია ავლენს მაგნიტური ნაწილაკების ქცევას. ნაწილაკები უძრავ და მოძრავ მაგნიტურ ველებში in vitro და in vivo. ნაწილაკების მაგნიტებით ადვილად გადატანა ცოცხალი სასუნთქი გზების ზედაპირზე შეუძლებელია, მაგრამ ტრანსპორტირების დროს დეპოზიტები კონცენტრირდება ხედვის არეალში, სადაც მაგნიტური ველი ყველაზე ძლიერია. ტრანსდუქციის ეფექტურობა ასევე ექვსჯერ გაიზარდა, როდესაც ლენტივირუსული მაგნიტური ნაწილაკები მიწოდებული იქნა მაგნიტური ველის თანაარსებობით. ეს შდეგები ერთად მიუთითებს, რომ ლენტივირუსული მაგნიტური ნაწილაკები და მაგნიტური ველები შეიძლება იყოს ღირებული მიდგომები გენის ვექტორების დამიზნების გასაუმჯობესებლად და გამტარ სასუნთქ გზებში ტრანსდუქციის დონის გასაზრდელად in vivo.
კისტოზური ფიბროზი (CF) გამოწვეულია ერთი გენის ვარიაციით, რომელსაც CF ტრანსმემბრანული გამტარობის რეგულატორი (CFTR) ეწოდება. CFTR ცილა არის იონური არხი, რომელიც წარმოდგენილია სხეულის მრავალ ეპითელურ უჯრედში, მათ შორის გამტარ სასუნთქ გზებში, რაც CF პათოგენეზის ძირითადი ადგილია. CFTR დეფექტები იწვევს წყლის ტრანსპორტირების დარღვევას, სასუნთქი გზების ზედაპირის გაუწყლოებას და სასუნთქი გზების ზედაპირული სითხის (ASL) ფენის სიღრმის შემცირებას. ეს ასევე აფერხებს მუკოცილიარული ტრანსპორტის (MCT) სისტემის უნარს, მოაშოროს შესუნთქული ნაწილაკები და პათოგენები სასუნთქი გზებიდან. ჩვენი მიზანია შევიმუშაოთ ლენტივირუსული (LV) გენური თერაპია, რათა მივაწოდოთ CFTR გენის სწორი ასლი და გავაუმჯობესოთ ASL, MCT და ფილტვების ჯანმრთელობა, და გავაგრძელოთ ახალი ტექნოლოგიების შემუშავება, რომლებიც შეძლებენ ამ პარამეტრების გაზომვას in vivo1.
მარცხენა პარკუჭის ვექტორები CF სასუნთქი გზების გენური თერაპიის ერთ-ერთი წამყვანი კანდიდატია, ძირითადად იმიტომ, რომ მათ შეუძლიათ თერაპიული გენის მუდმივი ინტეგრირება სასუნთქი გზების ბაზალურ უჯრედებში (სასუნთქი გზების ღეროვანი უჯრედები). ეს მნიშვნელოვანია, რადგან მათ შეუძლიათ აღადგინონ ნორმალური ჰიდრატაცია და ლორწოს კლირენსი ფუნქციურ გენ-კორეგირებულ CF-ასოცირებულ სასუნთქი გზების ზედაპირულ უჯრედებად დიფერენციაციით, რაც იწვევს სიცოცხლის განმავლობაში სარგებელს. მარცხენა პარკუჭის ვექტორები მიმართული უნდა იყოს გამტარი სასუნთქი გზების წინააღმდეგ, რადგან სწორედ აქ იწყება CF ფილტვის დაავადება. ვექტორის ფილტვში უფრო ღრმად შეყვანამ შეიძლება გამოიწვიოს ალვეოლური ტრანსდუქცია, მაგრამ ამას არ აქვს თერაპიული სარგებელი CF-ის დროს. თუმცა, სითხეები, როგორიცაა გენის მატარებლები, ბუნებრივად მიგრირებენ ალვეოლებში ჩასუნთქვის შემდეგ3,4 და თერაპიული ნაწილაკები სწრაფად იწმინდება პირის ღრუში MCT-ის საშუალებით. მარცხენა პარკუჭის ტრანსდუქციის ეფექტურობა პირდაპირ კავშირშია იმ დროის ხანგრძლივობასთან, რომლის განმავლობაშიც ვექტორი რჩება სამიზნე უჯრედების გვერდით, რათა უზრუნველყოს უჯრედული შთანთქმა - „რეზიდენციის დრო“5 - რომელიც ადვილად მცირდება ტიპიური რეგიონალური ჰაერის ნაკადით, ასევე კოორდინირებული ნაწილაკების ლორწოს შეკავებით და MCT-ით. CF-ის შემთხვევაში, მარცხენა პარკუჭის სასუნთქ გზებში რეზიდენციის დროის გახანგრძლივების უნარი მნიშვნელოვანია ამ რეგიონში ტრანსდუქციის მაღალი დონის მისაღწევად, მაგრამ ჯერჯერობით ეს ასე არ არის. გამომწვევი.
ამ დაბრკოლების დასაძლევად, ჩვენ ვვარაუდობთ, რომ მარცხენა პარკუჭის მაგნიტური ნაწილაკები (MPs) შეიძლება ორი ურთიერთშემავსებელი გზით დაგვეხმაროს. პირველი, მათი მაგნიტურად მართვა შესაძლებელია სასუნთქი გზების ზედაპირზე, რათა გაუმჯობესდეს მიზანმიმართული მიზანმიმართულობა და დაეხმარონ გენის მატარებელ ნაწილაკებს სასურველ სასუნთქი გზების რეგიონში დარჩენაში; და ASL) უჯრედის მე-6 ფენაში გადასვლაში. MPs ფართოდ გამოიყენება, როგორც მიზანმიმართული წამლის მიწოდების საშუალებები, როდესაც ისინი უკავშირდებიან ანტისხეულებს, ქიმიოთერაპიულ პრეპარატებს ან სხვა მცირე მოლეკულებს, რომლებიც ემაგრებიან უჯრედის მემბრანებს ან უკავშირდებიან შესაბამის უჯრედის ზედაპირის რეცეპტორებს და გროვდებიან სიმსივნის ადგილებში სტატიკური ელექტროენერგიის თანაარსებობისას. მაგნიტური ველები კიბოს მკურნალობისთვის 7. სხვა „ჰიპერთერმული“ ტექნიკის მიზანია მიკროპლასტიკების გაცხელება, როდესაც ისინი ექვემდებარებიან რხევით მაგნიტურ ველებს, რითაც ანადგურებენ სიმსივნურ უჯრედებს. მაგნიტური ტრანსფექციის პრინციპი, რომლის დროსაც მაგნიტური ველი გამოიყენება ტრანსფექციის აგენტად დნმ-ის უჯრედებში გადაცემის გასაძლიერებლად, ხშირად გამოიყენება in vitro არავირუსული და ვირუსული გენის ვექტორების დიაპაზონის გამოყენებით ძნელად გადასატანი უჯრედული ხაზებისთვის. დადასტურებულია მარცხენა პარკუჭის მაგნიტოტრანსფექციის ეფექტურობა, სადაც LV-MP-ების in vitro მიწოდება ადამიანის ბრონქული ეპითელიუმის უჯრედულ ხაზში სტატიკური მაგნიტური ველის თანაარსებობით, ზრდის ტრანსდუქციის ეფექტურობას 186-ჯერ მხოლოდ LV ვექტორთან შედარებით. LV-MP ასევე გამოყენებულია in vitro CF მოდელში, სადაც მაგნიტურმა ტრანსფექციამ გაზარდა LV ტრანსდუქცია ჰაერ-თხევადი ინტერფეისის კულტურებში 20-ჯერ CF ნახველის თანაარსებობისას10. თუმცა, ორგანოების in vivo მაგნიტოტრანსფექციას შედარებით მცირე ყურადღება ექცევა და შეფასებულია მხოლოდ რამდენიმე ცხოველზე ჩატარებულ კვლევაში11,12,13,14,15, განსაკუთრებით ფილტვები16,17. მიუხედავად ამისა, ცისტური ფიბროზით დაავადებული ფილტვების თერაპიაში მაგნიტური ტრანსფექციის შესაძლებლობები აშკარაა. ტანმა და სხვ. (2020) განაცხადეს, რომ „მაგნიტური ნანონაწილაკების ფილტვის ეფექტური მიწოდების კონცეფციის დამადასტურებელი კვლევა გზას გაუხსნის CFTR-ის ინჰალაციის სამომავლო სტრატეგიებს, რათა გაუმჯობესდეს კლინიკური შედეგები ცისტური ფიბროზით დაავადებულ პაციენტებში“6.
სასუნთქი გზების ზედაპირებზე მცირე მაგნიტური ნაწილაკების ქცევა გამოყენებული მაგნიტური ველის არსებობისას ძნელია ვიზუალიზაციისა და შესწავლის, ამიტომ ცუდად არის გაგებული. სხვა კვლევებში, ჩვენ შევიმუშავეთ სინქროტრონულ გავრცელებაზე დაფუძნებული ფაზურ-კონტრასტულ რენტგენოგრაფიის (PB-PCXI) მეთოდი, რათა არაინვაზიურად ვიზუალიზებულიყო და რაოდენობრივად განესაზღვრათ ASL სიღრმის18 და MCT ქცევის19,20 მცირე in vivo ცვლილებები გაზის არხის ზედაპირის ჰიდრატაციის პირდაპირ გასაზომად და გამოყენებულიყო მკურნალობის ეფექტურობის ადრეულ ინდიკატორად. გარდა ამისა, ჩვენი MCT შეფასების მეთოდი იყენებს 10–35 µm დიამეტრის ნაწილაკებს, რომლებიც შედგება ალუმინის ოქსიდისგან ან მაღალი რეფრაქციული ინდექსის მინისგან, როგორც MCT მარკერები, რომლებიც ჩანს PB-PCXI21 გამოყენებით. ორივე ტექნიკა შესაფერისია ნაწილაკების სხვადასხვა ტიპის, მათ შორის MP-ის ვიზუალიზაციისთვის.
მაღალი სივრცითი და დროითი გარჩევადობის გამო, ჩვენი PB-PCXI-ზე დაფუძნებული ASL და MCT ანალიზის ტექნიკა კარგად შეეფერება ცალკეული და მოცულობითი ნაწილაკების ქცევის დინამიკისა და ნიმუშების შესწავლას in vivo, რაც დაგვეხმარება MP გენის მიწოდების ტექნიკის გაგებასა და ოპტიმიზაციაში. ჩვენს მიერ გამოყენებული მიდგომა გამომდინარეობს SPring-8 BL20B2 სხივური ხაზის გამოყენებით ჩატარებული კვლევებიდან, რომელშიც ჩვენ ვიზუალიზაცია გავუკეთეთ სითხის მოძრაობას თაგვების ცხვირის და ფილტვის სასუნთქ გზებში ვექტორული დოზის ფიქტიური მიწოდების შემდეგ, რათა აეხსნათ გენის მატარებლების დოზის ცხოველებზე ჩატარებულ კვლევებში დაფიქსირებული არაერთგვაროვანი გენის ექსპრესიის ნიმუშები 3,4.
ამ კვლევის მიზანი იყო სინქროტრონ PB-PCXI-ის გამოყენება ცოცხალი ვირთხების ტრაქეაში მიკროპლასტიკების სერიის in vivo მოძრაობების ვიზუალიზაციისთვის. ეს PB-PCXI ვიზუალიზაციის კვლევები შექმნილი იყო მიკროპლასტიკების დიაპაზონის, მაგნიტური ველის სიძლიერისა და მდებარეობის შესამოწმებლად, რათა დაედგინათ მათი გავლენა მიკროპლასტიკის მოძრაობაზე. ჩვენ გამოვთქვით ჰიპოთეზა, რომ გარედან გამოყენებული მაგნიტური ველი ხელს შეუწყობდა მიწოდებული მიკროპლასტიკის დარჩენას ან სამიზნე არეალში გადაადგილებას. ამ კვლევებმა ასევე საშუალება მოგვცა დაგვედგენინა მაგნიტის კონფიგურაციები, რომლებიც მაქსიმალურად ზრდის ტრაქეაში დალექვის შემდეგ შეკავებული ნაწილაკების რაოდენობას. კვლევების მეორე სერიაში ჩვენ ვცდილობდით გამოგვეყენებინა ეს ოპტიმალური კონფიგურაცია, რათა გვეჩვენებინა ტრანსდუქციის ნიმუში, რომელიც გამოწვეულია LV-MP-ების in vivo ვირთხის სასუნთქ გზებში მიწოდებით, იმ ვარაუდის საფუძველზე, რომ LV-MP-ების მიწოდება სასუნთქი გზების დამიზნების კონტექსტში გამოიწვევდა LV ტრანსდუქციის ეფექტურობის გაუმჯობესებას.
ცხოველებზე ჩატარებული ყველა კვლევა ჩატარდა ადელაიდას უნივერსიტეტის (M-2019-060 და M-2020-022) და SPring-8 სინქროტრონული ცხოველთა ეთიკის კომიტეტის მიერ დამტკიცებული პროტოკოლების შესაბამისად. ექსპერიმენტები ჩატარდა ARRIVE-ის სახელმძღვანელო პრინციპების შესაბამისად.
რენტგენის ყველა გამოსახულება ჩატარდა BL20XU სხივურ ხაზზე, SPring-8 სინქროტრონზე, იაპონიაში, ადრე აღწერილის მსგავსი კონფიგურაციის გამოყენებით21,22. მოკლედ, ექსპერიმენტული ყუთი მდებარეობდა სინქროტრონის შესანახი რგოლიდან 245 მეტრში. ნაწილაკების გამოსახულების კვლევებისთვის გამოყენებულია ნიმუშიდან დეტექტორამდე 0.6 მ მანძილი, ხოლო in vivo გამოსახულების კვლევებისთვის - 0.3 მ, ფაზური კონტრასტული ეფექტების გენერირებისთვის. გამოყენებული იქნა 25 კევ მონოქრომატული სხივის ენერგია. სურათები გადაღებულია მაღალი გარჩევადობის რენტგენის გადამყვანის (SPring-8 BM3) გამოყენებით, რომელიც დაკავშირებულია sCMOS დეტექტორთან. გადამყვანი გარდაქმნის რენტგენის სხივებს ხილულ სინათლედ 10 µm სისქის სცინტილატორის (Gd3Al2Ga3O12) გამოყენებით, რომელიც შემდეგ მიმართულია sCMOS სენსორზე × 10 მიკროსკოპის ობიექტივის (NA 0.3) გამოყენებით. sCMOS დეტექტორი იყო Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, იაპონია) მასივის ზომით 2048 × 2048 პიქსელი და პიქსელის ნედლი ზომა 6.5 × 6.5 µm. ეს კონფიგურაცია იძლევა 0.51 µm ეფექტურ იზოტროპულ პიქსელის ზომას და დაახლოებით 1.1 მმ × 1.1 მმ ხედვის არეს. სასუნთქი გზების შიგნით და გარეთ მაგნიტური ნაწილაკების სიგნალისა და ხმაურის თანაფარდობის მაქსიმიზაციისა და სუნთქვით გამოწვეული მოძრაობის არტეფაქტების მინიმიზაციის მიზნით, შეირჩა 100 ms ექსპოზიციის ხანგრძლივობა. In vivo კვლევებისთვის, რენტგენის სხივის ექსპოზიციებს შორის დაბლოკვით, რადიაციის დოზის შესამცირებლად რენტგენის სხივის სწრაფი ჩამკეტი განთავსდა რენტგენის გზაზე.
მარცხენა პარკუჭის მატარებელი არ იქნა გამოყენებული SPring-8 PB-PCXI ვიზუალიზაციის არცერთ კვლევაში, რადგან BL20XU ვიზუალიზაციის კამერა არ არის ბიოუსაფრთხოების მე-2 დონის სერტიფიცირებული. ამის ნაცვლად, ჩვენ შევარჩიეთ კარგად დახასიათებული მიკროპლასტიკების დიაპაზონი ორი კომერციული მომწოდებლისგან - რომლებიც მოიცავდა ზომების, მასალების, რკინის კონცენტრაციებისა და გამოყენების სხვადასხვა სპექტრს - თავდაპირველად იმის გასაგებად, თუ როგორ მოქმედებს მაგნიტური ველები მიკროპლასტიკების მოძრაობაზე მინის კაპილარებში და შემდეგ ცოცხალ სასუნთქ გზებში. ზედაპირზე. MP-ები ზომით მერყეობს 0.25-დან 18 მკმ-მდე და დამზადებულია სხვადასხვა მასალისგან (იხ. ცხრილი 1), მაგრამ თითოეული ნიმუშის შემადგენლობა, მათ შორის MP-ში არსებული მაგნიტური ნაწილაკების ზომა, უცნობია. ჩვენი ვრცელი MCT კვლევების 19, 20, 21, 23, 24 საფუძველზე, ჩვენ ვვარაუდობთ, რომ ტრაქეის სასუნთქი გზების ზედაპირზე 5 მკმ-მდე პატარა MP-ების დანახვა შესაძლებელია, მაგალითად, MP მოძრაობის გაუმჯობესებული ხილვადობის სანახავად თანმიმდევრული კადრების გამოკლებით. ერთი 0.25 მკმ ზომის MP უფრო მცირეა, ვიდრე გამოსახულების მოწყობილობის გარჩევადობა, მაგრამ PB-PCXI, სავარაუდოდ, აღმოაჩენს მათ მოცულობით კონტრასტს და იმ ზედაპირული სითხის მოძრაობას, რომელზეც ისინი დეპონირდება დეპონირების შემდეგ.
ცხრილში 1 მოცემული თითოეული MP-ის ნიმუშები მომზადდა 20 μl მინის კაპილარებში (Drummond Microcaps, PA, აშშ), რომელთა შიდა დიამეტრი 0.63 მმ-ია. კორპუსკულური ნაწილაკები ხელმისაწვდომია წყალში, ხოლო CombiMag ნაწილაკები ხელმისაწვდომია მწარმოებლის საკუთრების სითხეში. თითოეული მილი ნახევრად სავსეა სითხით (დაახლოებით 11 μl) და მოთავსებულია ნიმუშის დამჭერზე (იხ. სურათი 1). მინის კაპილარები ჰორიზონტალურად განთავსდა ნიმუშის სცენაზე გამოსახულების ყუთში, შესაბამისად, და განლაგდა სითხის კიდეები. 19 მმ დიამეტრის (28 მმ სიგრძის) ნიკელის გარსის იშვიათმიწა ნეოდიმიუმის რკინის ბორის (NdFeB) მაგნიტი (N35, კატ. ნომერი LM1652, Jaycar Electronics, ავსტრალია) 1.17 ტესლა ნარჩენი მაგნიტიზაციით მიმაგრებული იყო ცალკეულ ტრანსლაციის სცენაზე, რათა მიღწეულიყო მისი პოზიციის დისტანციურად შეცვლა გამოსახულების მიღების დროს. რენტგენის გამოსახულების მიღება იწყება მაშინ, როდესაც მაგნიტი განლაგებულია ნიმუშიდან დაახლოებით 30 მმ-ით ზემოთ და გამოსახულებები მიიღება წამში 4 კადრი სიჩქარით. გამოსახულების მიღების დროს, მაგნიტი მიუახლოვდა შუშის კაპილარული მილი (დაახლოებით 1 მმ დაშორებით) და შემდეგ გადაადგილებული მილის გასწვრივ ველის სიძლიერისა და პოზიციის ეფექტების შესაფასებლად.
ინ ვიტრო ვიზუალიზაციის მოწყობილობა, რომელიც შეიცავს MP ნიმუშებს მინის კაპილარებში, ნიმუშის xy ტრანსლაციის ეტაპზე. რენტგენის სხივის გზა აღნიშნულია წითელი წყვეტილი ხაზით.
მას შემდეგ, რაც მიკროპლასტიკების in vitro ხილვადობა დადგინდა, მათი ქვეჯგუფი in vivo გამოსცადეს ველური ტიპის მდედრ ალბინოს Wistar ვირთხებში (~12 კვირის, ~200 გ). 0.24 მგ/კგ მედეტომიდინი (Domitor®, Zenoaq, იაპონია), 3.2 მგ/კგ მიდაზოლამი (Dormicum®, Astellas Pharma, იაპონია) და 4 მგ/კგ ბუტორფანოლი (Vetorphale®, Meiji Seika). ვირთხებს ანესთეზია ჩაუტარდათ Pharma-ს (იაპონია) ნარევით ინტრაპერიტონეალური ინექციით. ანესთეზიის შემდეგ, ისინი მომზადდნენ ვიზუალიზაციისთვის ტრაქეის გარშემო ბეწვის მოცილებით, ენდოტრაქეული მილის (ET; 16 Ga iv კანულა, Terumo BCT) ჩასმით და სხეულის ტემპერატურის შესანარჩუნებლად სპეციალურად დამზადებულ ვიზუალიზაციის ფირფიტაზე ზურგზე დამაგრებით, რომელიც შეიცავდა თერმულ ტომარას 22. შემდეგ ვიზუალიზაციის ფირფიტა მცირე კუთხით მიმაგრებული იყო ვიზუალიზაციის ყუთში ნიმუშის ტრანსლაციის სცენაზე, რათა რენტგენის გამოსახულებაზე ტრაქეა ჰორიზონტალურად გასწორებულიყო, როგორც ეს ნაჩვენებია ნახაზ 2ა-ზე.
(ა) SPring-8 გამოსახულების ყუთში in vivo გამოსახულების მოწყობა, რენტგენის სხივის გზა აღნიშნულია წითელი წყვეტილი ხაზით. (ბ, გ) ტრაქეაზე მაგნიტის ლოკალიზაცია განხორციელდა დისტანციურად, ორი ორთოგონალურად დამონტაჟებული IP კამერის გამოყენებით. ეკრანის გამოსახულების მარცხენა მხარეს ჩანს თავის დამჭერი მავთულის მარყუჟი და მიწოდების კანულა ET მილში.
დისტანციურად მართვადი შპრიცის ტუმბოს სისტემა (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL), რომელიც იყენებდა 100 μl შუშის შპრიცს, დაკავშირებული იყო PE10 მილთან (OD 0.61 მმ, ID 0.28 მმ) 30 Ga ნემსის საშუალებით. მონიშნეთ მილი, რათა დარწმუნდეთ, რომ წვერი სწორ მდგომარეობაშია ტრაქეაში ET მილის შეყვანისას. მიკროტუმბოს გამოყენებით, შპრიცის დგუში ამოიღეს, სანამ მილის წვერი ჩაეფლო შესაყვან MP ნიმუშში. დატვირთული შესაყვანი მილი შემდეგ ჩასვეს ენდოტრაქეულ მილში, წვერი კი ჩვენი მოსალოდნელი გამოყენებული მაგნიტური ველის ყველაზე ძლიერ ნაწილში მოათავსეს. გამოსახულების მიღება კონტროლდებოდა ჩვენს Arduino-ზე დაფუძნებულ დროის ყუთთან დაკავშირებული სუნთქვის დეტექტორის გამოყენებით და ყველა სიგნალი (მაგ. ტემპერატურა, სუნთქვა, ჩამკეტის გაღება/დახურვა და გამოსახულების მიღება) ჩაიწერა Powerlab-ისა და LabChart-ის (AD Instruments, სიდნეი, ავსტრალია) 22 გამოყენებით. როდესაც კორპუსი მიუწვდომელი იყო, ორი IP კამერა (Panasonic BB-SC382) განთავსებული იყო დაახლოებით 90°-იანი კუთხით ერთმანეთთან მიმართებაში და გამოყენებული იყო. ვიზუალიზაციის დროს მაგნიტის ტრაქეასთან მიმართებაში პოზიციის მონიტორინგისთვის (სურ. 2ბ, გ). მოძრაობის არტეფაქტების მინიმიზაციის მიზნით, საბოლოო მოქცევის პლატოს დროს თითოეული ჩასუნთქვისას ერთი გამოსახულება იქნა მიღებული.
მაგნიტი მიმაგრებულია მეორე საფეხურზე, რომლის განთავსებაც შესაძლებელია გამოსახულების მიმღები კორპუსის გარედან მოშორებით. შემოწმდა მაგნიტის სხვადასხვა პოზიცია და კონფიგურაცია, მათ შორის: დამონტაჟებულია ტრაქეის ზემოთ დაახლოებით 30°-იანი კუთხით (კონფიგურაციები ნაჩვენებია ნახაზებზე 2ა და 3ა); ერთი მაგნიტი ცხოველის ზემოთ და მეორე ქვემოთ, პოლუსებით დაყენებული მიზიდულობის მიმართულებით (სურათი 3ბ); ერთი მაგნიტი ცხოველის ზემოთ და მეორე ქვემოთ, პოლუსებით დაყენებული განზიდულობის მიმართულებით (სურათი 3გ); და ერთი მაგნიტი ტრაქეის ზემოთ და პერპენდიკულარულად (სურათი 3დ). ცხოველისა და მაგნიტის კონფიგურაციის შემდეგ და შესამოწმებელი მიკროპლასტიკური ნივთიერება ჩაიტვირთება შპრიცის ტუმბოში, სურათების მიღებისას მიეწოდება 50 μl დოზა 4 μl/წმ სიჩქარით. შემდეგ მაგნიტი მოძრაობს წინ და უკან ტრაქეის გასწვრივ ან გვერდით, სურათების მიღების გაგრძელებისას.
მაგნიტის კონფიგურაცია in vivo ვიზუალიზაციისთვის (ა) ერთი მაგნიტი ტრაქეის ზემოთ დაახლოებით 30°-იანი კუთხით, (ბ) ორი მაგნიტი მიზიდვისთვის, (გ) ორი მაგნიტი განზიდვისთვის, (დ) ერთი მაგნიტი ტრაქეის ზემოთ და პერპენდიკულარულად. დამკვირვებელი პირიდან ფილტვებისკენ იყურებოდა ტრაქეის გავლით, რენტგენის სხივი გაიარა ვირთხის მარცხენა მხარეს და გავიდა მარჯვენა მხრიდან. მაგნიტი ან მოძრაობს სასუნთქი გზების გასწვრივ, ან მარცხნივ და მარჯვნივ ტრაქეის ზემოთ რენტგენის სხივის მიმართულებით.
ჩვენ ასევე ვცდილობდით გაგვერკვია ნაწილაკების ხილვადობა და ქცევა სასუნთქ გზებში სუნთქვისა და გულის მოძრაობის არარსებობის შემთხვევაში. ამიტომ, ვიზუალიზაციის პერიოდის ბოლოს, ცხოველები ჰუმანურად დაიხოცნენ პენტობარბიტალის დოზის გადაჭარბების გამო (სომნოპენტილი, პიტმან-მური, ვაშინგტონ კროსინგი, აშშ; ~65 მგ/კგ ი/პ). ზოგიერთი ცხოველი დარჩა ვიზუალიზაციის პლატფორმაზე და სუნთქვისა და გულისცემის შეწყვეტის შემდეგ, ვიზუალიზაციის პროცესი განმეორდა, მიკროპლასტიკის დამატებითი დოზის დამატებით, თუ მიკროპლასტიკი სასუნთქი გზების ზედაპირზე არ ჩანდა.
მიღებული სურათები ბრტყელი და მუქი ველის კორექციას გაუკეთეს და შემდეგ MATLAB-ში (R2020a, The Mathworks) დაწერილი საკუთარი სკრიპტის გამოყენებით ფილმად (წამში 20 კადრი; 15-25 × ნორმალური სიჩქარე, სუნთქვის სიხშირის მიხედვით).
LV გენის ვექტორის მიწოდების ყველა კვლევა ჩატარდა ადელაიდას უნივერსიტეტის ლაბორატორიული ცხოველების კვლევის ცენტრში და მიზნად ისახავდა SPring-8 ექსპერიმენტის შედეგების გამოყენებას იმის შესაფასებლად, შეეძლო თუ არა LV-MP მიწოდებას მაგნიტური ველის თანაარსებობისას გენის გადაცემა in vivo. MP-ის და მაგნიტური ველის ეფექტების შესაფასებლად, მკურნალობა ჩაუტარდა ცხოველთა ორ ჯგუფს: ერთ ჯგუფს მიეცა LV-MP მაგნიტით, ხოლო მეორე ჯგუფს - LV-MP მაგნიტის გარეშე.
LV გენის ვექტორები გენერირებული იქნა ადრე აღწერილი მეთოდების გამოყენებით25,26. LacZ ვექტორი გამოხატავს ბირთვში ლოკალიზებულ ბეტა-გალაქტოზიდაზას გენს, რომელსაც მართავს კონსტიტუციური MPSV პრომოუტერი (LV-LacZ), რომელიც წარმოქმნის ლურჯ რეაქციის პროდუქტს ტრანსდუცირებულ უჯრედებში, რომელიც ჩანს ფილტვის ქსოვილის ფრონტებსა და ქსოვილის კვეთებში. ტიტრაცია ჩატარდა უჯრედულ კულტურებში LacZ დადებითი უჯრედების რაოდენობის ხელით დათვლით ჰემოციტომეტრით, ტიტრის TU/მლ-ში გამოსათვლელად. მატარებლები კრიოკონსერვირებულია -80°C-ზე, გამოყენებამდე გალღობილია და უკავშირდება CombiMag-ს 1:1 თანაფარდობით შერევით და ყინულზე ინკუბაციით მიწოდებამდე მინიმუმ 30 წუთის განმავლობაში.
ნორმალურ სპრეგ-დოულის ვირთხებს (n = 3/ჯგუფი, ~2-3) ჩაუტარდათ ინტრაპერიტონეალური ანესთეზია 0.4 მგ/კგ მედეტომიდინის (Domitor, Ilium, ავსტრალია) და 60 მგ/კგ კეტამინის (Ilium, ავსტრალია) (თვიანი) იპ) ნარევით და არაქირურგიული ორალური კანულირებით 16 Ga ინტრავენური კანულით. იმისათვის, რომ ტრაქეის სასუნთქი გზების ქსოვილი მიეღო მარცხენა პარკუჭის ტრანსდუქციას, ის კონდიცირებული იყო ჩვენს მიერ ადრე აღწერილი მექანიკური პერტურბაციის პროტოკოლის გამოყენებით, რომლის დროსაც ტრაქეის სასუნთქი გზების ზედაპირი ღერძულად იხეხებოდა მავთულის კალათით (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, აშშ) 30 s28. შემდეგ LV-MP-ის ტრაქეული შეყვანა ჩატარდა ბიოლოგიური უსაფრთხოების კაბინეტში პერტურბაციიდან დაახლოებით 10 წუთის შემდეგ.
ამ ექსპერიმენტში გამოყენებული მაგნიტური ველი კონფიგურირებული იყო in vivo რენტგენის კვლევის მსგავსად, იგივე მაგნიტებით, რომლებიც ტრაქეის ზემოთ იყო დამაგრებული დისტილაციის სტენტის კლიპების გამოყენებით (სურათი 4). ტრაქეაში (n = 3 ცხოველი) შეიყვანეს LV-MP-ის 50 μl მოცულობა (2 × 25 μl ალიკვოტები) გელის წვერის შემცველი პიპეტის გამოყენებით, როგორც ეს ადრე იყო აღწერილი. საკონტროლო ჯგუფმა (n = 3 ცხოველი) მიიღო იგივე LV-MP მაგნიტის გამოყენების გარეშე. ინფუზიის დასრულების შემდეგ, კანულა ამოღებულია ET მილიდან და ცხოველი ექსტუბირებულია. მაგნიტი ადგილზე რჩება 10 წუთის განმავლობაში, შემდეგ კი ამოღებულია. ვირთხებს მიიღეს მელოქსიკამის კანქვეშა დოზა (1 მლ/კგ) (Ilium, ავსტრალია), რასაც მოჰყვა ანესთეზიის შექცევა 1 მგ/კგ ატიპამაზოლის ჰიდროქლორიდის (Antisedan, Zoetis, ავსტრალია) იპ-ინტრავენური ინექციით. ვირთხებს თბილად ინახავდნენ და აკვირდებოდნენ ანესთეზიიდან სრულ გამოჯანმრთელებამდე.
LV-MP მიწოდების მოწყობილობა ბიოლოგიური უსაფრთხოების კაბინეტში. ჩანს ET მილის ღია ნაცრისფერი ლუერის კერა პირიდან ამოწეული და სურათზე ნაჩვენები პიპეტის გელის წვერი ET მილის გავლით სასურველ სიღრმეზეა შეყვანილი ტრაქეაში.
LV-MP დოზირების პროცედურიდან ერთი კვირის შემდეგ, ცხოველები ჰუმანურად დაიხოცნენ 100%-იანი CO2 ინჰალაციით და LacZ-ის ექსპრესია შეფასდა ჩვენი სტანდარტული X-gal მკურნალობის გამოყენებით. სამი ყველაზე კაუდალური ხრტილოვანი რგოლი ამოიღეს იმის უზრუნველსაყოფად, რომ ენდოტრაქეული მილის განთავსებით გამოწვეული ნებისმიერი მექანიკური დაზიანება ან სითხის შეკავება არ შესულიყო ანალიზში. თითოეული ტრაქეა გრძივად გაიჭრა ანალიზისთვის ორი ნახევრის შესაქმნელად და ისინი მოათავსეს სილიკონის რეზინის შემცველ ჭურჭელში (Sylgard, Dow Inc) Minutien ნემსის (Fine Science Tools) გამოყენებით, სანათურის ზედაპირის ვიზუალიზაციისთვის. ტრანსდუცირებული უჯრედების განაწილება და ნიმუში დადასტურდა ფრონტალური ფოტოგრაფიით Nikon მიკროსკოპის (SMZ1500) გამოყენებით, DigiLite კამერით და TCapture პროგრამული უზრუნველყოფით (Tucsen Photonics, China). სურათები მიღებული იქნა 20x გადიდებით (მათ შორის ტრაქეის სრული სიგანის ყველაზე მაღალი პარამეტრით), ტრაქეის მთელი სიგრძის ეტაპობრივად გამოსახვით, რაც უზრუნველყოფდა თითოეულ სურათს შორის საკმარის გადაფარვას გამოსახულების „შეერთებისთვის“. თითოეული ტრაქეიდან მიღებული სურათები შემდეგ გაერთიანდა ერთ კომპოზიტურ სურათად გამოყენებით. Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) იყენებს ბრტყელი მოძრაობის ალგორითმს. თითოეული ცხოველის ტრაქეის კომპოზიტურ სურათებში LacZ ექსპრესიის არეალი განისაზღვრა ავტომატიზირებული MATLAB სკრიპტის (R2020a, MathWorks) გამოყენებით, როგორც ადრე იყო აღწერილი, 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15 და Value < 0.7 პარამეტრების გამოყენებით. ქსოვილის კონტურების დახაზვით, GIMP v2.10.24-ში ხელით შეიქმნა ნიღაბი თითოეული კომპოზიტური სურათისთვის, რათა იდენტიფიცირებულიყო ქსოვილის არე და თავიდან აცილებულიყო ტრაქეის ქსოვილის გარედან ნებისმიერი ცრუ აღმოჩენა. თითოეული ცხოველის ყველა კომპოზიტური სურათიდან შეღებილი არეალი შეჯამდა ამ ცხოველისთვის შეღებილი მთლიანი ფართობის მისაღებად. შემდეგ შეღებილი ფართობი გაიყო ნიღბის მთლიან ფართობზე ნორმალიზებული ფართობის მისაღებად.
თითოეული ტრაქეა პარაფინში იყო ჩადგმული და 5 μm სისქის კვეთები ამოიჭრა. კვეთები 5 წუთის განმავლობაში ნეიტრალური სწრაფი წითელი საღებავით შეღებილი იყო და სურათები მიღებული იყო Nikon Eclipse E400 მიკროსკოპის, DS-Fi3 კამერის და NIS ელემენტების აღმდგენი პროგრამული უზრუნველყოფის (ვერსია 5.20.00) გამოყენებით.
ყველა სტატისტიკური ანალიზი ჩატარდა GraphPad Prism v9-ში (GraphPad Software, Inc.). სტატისტიკური მნიშვნელოვნება დადგინდა p ≤ 0.05-ზე. ნორმალობა დადასტურდა შაპირო-ვილკის ტესტის გამოყენებით, ხოლო LacZ შეღებვის განსხვავებები შეფასდა შეუწყვილებელი t-ტესტის გამოყენებით.
ცხრილში 1 აღწერილი ექვსი მიკროპოლიმერული ნაერთი შემოწმდა PCXI-ის გამოყენებით და ხილვადობა აღწერილია ცხრილში 2. ორი პოლისტიროლის მიკროპოლიმერული ნაერთი (MP1 და MP2; შესაბამისად, 18 მკმ და 0.25 მკმ) PCXI-ის ქვეშ არ იყო ხილული, მაგრამ დანარჩენი ნიმუშები იდენტიფიცირებადი იყო (მაგალითები ნაჩვენებია ნახაზ 5-ში). MP3 და MP4 (შესაბამისად, 10-15% Fe3O4; 0.25 მკმ და 0.9 მკმ) სუსტად ჩანს. მიუხედავად იმისა, რომ შეიცავდა ზოგიერთ ყველაზე პატარა ნაწილაკს, MP5 (98% Fe3O4; 0.25 მკმ) ყველაზე მკვეთრად გამოირჩეოდა. CombiMag პროდუქტი MP6 ძნელი შესამჩნევია. ყველა შემთხვევაში, მიკროპოლიმერული ნაერთის აღმოჩენის ჩვენი უნარი მნიშვნელოვნად გაუმჯობესდა მაგნიტის კაპილართან პარალელურად წინ და უკან გადაადგილებით. როდესაც მაგნიტები კაპილარიდან შორდებოდნენ, ნაწილაკები გრძელ სტრიქონებად იშლებოდა, მაგრამ როდესაც მაგნიტები მიუახლოვდებოდნენ და მაგნიტური ველის სიძლიერე იზრდებოდა, ნაწილაკების სტრიქონები დამოკლდებოდა, რადგან ნაწილაკები კაპილარის ზედა ზედაპირისკენ მიგრირებდნენ (იხილეთ დამატებითი ვიდეო S1: MP4), რაც ზრდიდა The-ს. ზედაპირის ნაწილაკების სიმკვრივე. პირიქით, როდესაც მაგნიტი კაპილარიდან ამოღებულია, ველის სიძლიერე მცირდება და მიკროპლასტიკური ნაწილაკები კაპილარის ზედა ზედაპირიდან გამომავალ გრძელ სტრიქონებად გადალაგდებიან (იხილეთ დამატებითი ვიდეო S2:MP4). მაგნიტის მოძრაობის შეწყვეტის შემდეგ, ნაწილაკები წონასწორობის მდგომარეობის მიღწევის შემდეგ მცირე ხნით აგრძელებენ მოძრაობას. როდესაც მიკროპლასტიკური ნაწილაკი კაპილარის ზედა ზედაპირისკენ და მისგან მოშორებით მოძრაობს, მაგნიტური ნაწილაკები, როგორც წესი, ნამსხვრევებს სითხეში გადაათრევენ.
PCXI-ის ქვეშ MP-ის ხილვადობა მნიშვნელოვნად განსხვავდება ნიმუშებს შორის. (ა) MP3, (ბ) MP4, (გ) MP5 და (დ) MP6. აქ ნაჩვენები ყველა სურათი გადაღებულია მაგნიტით, რომელიც მდებარეობს კაპილარის ზემოთ დაახლოებით 10 მმ-ით. აშკარა დიდი წრეები კაპილარებში ჩარჩენილი ჰაერის ბუშტებია, რაც ნათლად აჩვენებს ფაზური კონტრასტული გამოსახულების შავ-თეთრ კიდის მახასიათებლებს. წითელი ჩარჩო შეიცავს კონტრასტის გამაძლიერებელ გადიდებას. გაითვალისწინეთ, რომ ყველა ფიგურაში მაგნიტის სქემების დიამეტრები არ არის მასშტაბური და დაახლოებით 100-ჯერ აღემატება ნაჩვენებს.
როდესაც მაგნიტი კაპილარის ზედა ნაწილში მარცხნივ და მარჯვნივ გადაადგილდება, MP სიმის კუთხე იცვლება მაგნიტთან გასასწორებლად (იხ. სურათი 6), რითაც მაგნიტური ველის ხაზები გამოიკვეთება. MP3-5-ის შემთხვევაში, მას შემდეგ, რაც აკორდი ზღურბლის კუთხეს მიაღწევს, ნაწილაკები კაპილარის ზედა ზედაპირზე გადაადგილდებიან. ეს ხშირად იწვევს MP-ების უფრო დიდ ჯგუფებად დაჯგუფებას იმ ადგილას, სადაც მაგნიტური ველი ყველაზე ძლიერია (იხ. დამატებითი ვიდეო S3:MP5). ეს განსაკუთრებით აშკარაა კაპილარის ბოლოსთან ახლოს გამოსახულების მიღებისას, რაც იწვევს MP-ების აგრეგირებას და კონცენტრირებას სითხე-ჰაერის ინტერფეისზე. MP6-ში ნაწილაკები, რომელთა გარჩევა უფრო რთული იყო, ვიდრე MP3-5, არ გადაადგილებულა მაგნიტის კაპილარის გასწვრივ გადაადგილებისას, მაგრამ MP სიმები დისოცირდებოდა, რის შედეგადაც ნაწილაკები ხედვის არეალში რჩებოდა (იხ. დამატებითი ვიდეო S4:MP6). ზოგიერთ შემთხვევაში, როდესაც გამოყენებული მაგნიტური ველი შემცირდა მაგნიტის გამოსახულების ადგილიდან დიდი მანძილის გადაადგილებით, დარჩენილი MP-ები ნელ-ნელა დაეშვა მილის ქვედა ზედაპირზე გრავიტაციის გზით, სიმში დარჩენის პარალელურად (იხ. დამატებითი ვიდეო S5: MP3).
MP სიმის კუთხე იცვლება, როდესაც მაგნიტი კაპილარის ზემოთ მარჯვნივ გადაინაცვლებს. (ა) MP3, (ბ) MP4, (გ) MP5 და (დ) MP6. წითელ ჩარჩოში მოცემულია კონტრასტის გამაძლიერებელი გადიდება. გაითვალისწინეთ, რომ დამატებითი ვიდეოები ინფორმაციული ხასიათისაა, რადგან ისინი ავლენენ ნაწილაკების მნიშვნელოვან სტრუქტურას და დინამიურ ინფორმაციას, რომლის ვიზუალიზაციაც ამ სტატიკურ სურათებში შეუძლებელია.
ჩვენმა ტესტებმა აჩვენა, რომ მაგნიტის წინ და უკან ნელი მოძრაობა ტრაქეის გასწვრივ ხელს უწყობს მიკროპლასტიკური ოქსიდის ვიზუალიზაციას in vivo რთული მოძრაობის კონტექსტში. In vivo ტესტირება არ ჩატარებულა, რადგან პოლისტიროლის მძივები (MP1 და MP2) კაპილარში არ ჩანდა. დარჩენილი ოთხი მიკროპლასტიკური ოქსიდიდან თითოეული გამოიცადა in vivo მაგნიტის გრძელი ღერძით, რომელიც კონფიგურირებული იყო ტრაქეის ზემოთ, ვერტიკალურთან მიმართებაში დაახლოებით 30°-იანი კუთხით (იხ. სურათები 2b და 3a), რადგან ამან გამოიწვია მიკროპლასტიკური ოქსიდის უფრო გრძელი ჯაჭვები და უფრო ეფექტური იყო, ვიდრე მაგნიტის კონფიგურაციით დასრულებული. MP3, MP4 და MP6 არ აღმოჩნდა არცერთი ცოცხალი ცხოველის ტრაქეაში. როდესაც ვირთხის სასუნთქი გზები გამოიკვლიეს ცხოველების ჰუმანური სიკვდილის შემდეგ, ნაწილაკები უხილავი დარჩა მაშინაც კი, როდესაც დამატებითი მოცულობა დაემატა შპრიცის ტუმბოს გამოყენებით. MP5-ს ჰქონდა რკინის ოქსიდის ყველაზე მაღალი შემცველობა და იყო ერთადერთი ხილული ნაწილაკი და, შესაბამისად, გამოიყენებოდა მიკროპლასტიკური ოქსიდის in vivo ქცევის შესაფასებლად და დასახასიათებლად.
მიკროპლასტიკური მიკროსკოპის მიწოდების დროს ტრაქეაზე მაგნიტის მოთავსების შედეგად, მიკროპლასტიკური მიკროსკოპის მრავალი, მაგრამ არა ყველა, კონცენტრირება მოხდა მხედველობის არეში. ტრაქეაში შემავალი ნაწილაკები საუკეთესოდ შეინიშნება ჰუმანურად დასჯილ ცხოველებში. სურათი 7 და დამატებითი ვიდეო S6: MP5 აჩვენებს ნაწილაკების სწრაფ მაგნიტურ დაჭერას და განლაგებას ვენტრალური ტრაქეის ზედაპირზე, რაც მიუთითებს, რომ მიკროპლასტიკური მიკროსკოპის მიმაგრება შესაძლებელია ტრაქეის სასურველ რეგიონებში. მიკროპლასტიკური მიკროსკოპის მიწოდების შემდეგ ტრაქეის უფრო დისტალურად ძიებისას, ზოგიერთი მიკროპლასტიკური მიკროსკოპი აღმოჩნდა კისერთან უფრო ახლოს, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ მაგნიტური ველის სიძლიერე არასაკმარისი იყო ყველა მიკროპლასტიკური მიკროსკოპის შესაგროვებლად და შესანარჩუნებლად, რადგან ისინი სითხის პროცესში მაქსიმალური მაგნიტური ველის სიძლიერის რეგიონის გავლით შეჰყავდათ. მიუხედავად ამისა, მშობიარობის შემდგომი მიკროპლასტიკური მიკროსკოპის კონცენტრაციები უფრო მაღალი იყო გამოსახული არეალის გარშემო, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ ბევრი მიკროპლასტიკური მიკროსკოპი რჩებოდა სასუნთქი გზების რეგიონებში, სადაც გამოყენებული მაგნიტური ველის სიძლიერე ყველაზე მაღალი იყო.
გამოსახულებები (ა) ახლახან ევთანაზირებული ვირთხის ტრაქეაში MP5-ის შეყვანამდე და (ბ) შეყვანის შემდეგ, მაგნიტი განთავსებულია უშუალოდ გამოსახულების არეალის ზემოთ. გამოსახული არე მდებარეობს ორ ხრტილოვან რგოლს შორის. MP5-ის შეყვანამდე სასუნთქ გზებში არის გარკვეული სითხე. წითელი ველი შეიცავს კონტრასტის გამაძლიერებელ გადიდებას. ეს გამოსახულებები აღებულია დამატებით ვიდეო S6:MP5-ში ნაჩვენები ვიდეოდან.
მაგნიტის ტრაქეის გასწვრივ in vivo გადატანამ გამოიწვია მიკროელემენტების ჯაჭვის კუთხის შეცვლა სასუნთქი გზების ზედაპირზე კაპილარების მსგავსად (იხილეთ სურათი 8 და დამატებითი ვიდეო S7:MP5). თუმცა, ჩვენს კვლევაში, მიკროელემენტების გადატანა ცოცხალი სასუნთქი გზების ზედაპირზე შეუძლებელი იყო, როგორც ეს კაპილარების შემთხვევაში შეიძლებოდა. ზოგიერთ შემთხვევაში, მიკროელემენტების ჯაჭვი გრძელდება მაგნიტის მარცხნივ და მარჯვნივ გადაადგილებისას. საინტერესოა, რომ ჩვენ ასევე აღმოვაჩინეთ, რომ ნაწილაკების ჯაჭვი, როგორც ჩანს, ცვლის ზედაპირული სითხის ფენის სიღრმეს, როდესაც მაგნიტი გრძივად მოძრაობს ტრაქეის გასწვრივ და ფართოვდება, როდესაც მაგნიტი პირდაპირ ზემოთ მოძრაობს და ნაწილაკების ჯაჭვი ვერტიკალურ მდგომარეობაში ბრუნავს (იხილეთ დამატებითი ვიდეო S7). : MP5 0:09-ზე, ქვედა მარჯვენა კუთხე). მოძრაობის დამახასიათებელი ნიმუში შეიცვალა, როდესაც მაგნიტი ტრაქეის ზედა ნაწილზე ლატერალურად გადაიტანეს (ანუ ცხოველის მარცხნივ ან მარჯვნივ და არა ტრაქეის გასწვრივ). ნაწილაკები მოძრაობისას კვლავ მკაფიოდ ჩანდა, მაგრამ როდესაც მაგნიტი ტრაქეიდან მოიხსნა, ნაწილაკების სტრიქონების წვერები ხილული გახდა (იხილეთ დამატებითი ვიდეო S8:MP5, დაწყებული 0:08-დან). ეს შეესაბამება MP-ის ქცევას, რომელიც ჩვენ დავაკვირდით მინის კაპილარში გამოყენებული მაგნიტური ველის ქვეშ.
მაგალითად, სურათები, რომლებიც ასახავს MP5-ს ცოცხალი ანესთეზირებული ვირთხის ტრაქეაში. (ა) მაგნიტი გამოიყენება ტრაქეის ზემოთ და მარცხნივ გამოსახულების მისაღებად, შემდეგ (ბ) მაგნიტის მარჯვნივ გადაადგილების შემდეგ. წითელი ველი შეიცავს კონტრასტის გამაძლიერებელ გადიდებას. ეს სურათები აღებულია დამატებით ვიდეო S7:MP5-ში ნაჩვენები ვიდეოდან.
როდესაც ორი პოლუსი კონფიგურირებული იყო ჩრდილოეთ-სამხრეთის ორიენტაციით ტრაქეის ზემოთ და ქვემოთ (ანუ მიზიდულობა; სურ. 3ბ), MP აკორდები უფრო გრძელი ჩანდა და განლაგებული იყო ტრაქეის გვერდით კედელზე და არა ტრაქეის დორსალურ ზედაპირზე (იხილეთ დამატებითი ვიდეო S9:MP5). თუმცა, ნაწილაკების მაღალი კონცენტრაცია ერთ ადგილას (ანუ ტრაქეის დორსალურ ზედაპირზე) არ დაფიქსირებულა სითხის მიწოდების შემდეგ, როდესაც გამოიყენებოდა ორმაგი მაგნიტიანი მოწყობილობა, რაც ჩვეულებრივ ხდება ერთმაგნიტური მოწყობილობის გამოყენებისას. შემდეგ, როდესაც ერთი მაგნიტი კონფიგურირებული იყო პოლუსების შებრუნებული მოსაგერიებლად (სურ. 3გ), ხედვის არეალში ხილული ნაწილაკების რაოდენობა, როგორც ჩანს, არ გაიზარდა მიწოდების შემდეგ. ორივე ორმაგი მაგნიტიანი კონფიგურაციის დაყენება რთულია მაღალი მაგნიტური ველის სიძლიერის გამო, რომელიც შესაბამისად იზიდავს ან უბიძგებს მაგნიტებს. შემდეგ კონფიგურაცია შეიცვალა ერთი მაგნიტით, რომელიც პარალელურად იყო სასუნთქი გზების, მაგრამ გადიოდა სასუნთქ გზებში 90 გრადუსით ისე, რომ ველის ხაზები კვეთდა ტრაქეის კედელს ორთოგონალურად (სურ. 3დ), ორიენტაცია შექმნილია იმის დასადგენად, შეიძლებოდა თუ არა ნაწილაკების აგრეგაციის დაკვირვება გვერდით კედელზე. თუმცა, ამ კონფიგურაციაში იყო მიკროპლასტიკის დაგროვების ან მაგნიტის მოძრაობის იდენტიფიცირებადი მოძრაობა არ დაფიქსირებულა. ყველა ამ შედეგის საფუძველზე, in vivo გენის მატარებლის კვლევებისთვის შეირჩა ერთმაგნიტიანი, 30 გრადუსიანი ორიენტაციის კონფიგურაცია (სურათი 3ა).
როდესაც ცხოველი ჰუმანური მოკვლისთანავე განმეორებით გადაიღეს, ქსოვილის მოძრაობის არარსებობის გამო, მკაფიო ქონდროვან ველში შესაძლებელი გახდა ნაწილაკების უფრო წვრილი და მოკლე ხაზების გარჩევა, რომლებიც მაგნიტის ტრანსლაციურ მოძრაობასთან „მერყევი“ იყო. მიუხედავად ამისა, MP6 ნაწილაკების არსებობა და მოძრაობა მაინც ნათლად არ ჩანს.
LV-LacZ ტიტრი იყო 1.8 × 108 TU/მლ და CombiMag MP-თან (MP6) 1:1 შერევის შემდეგ, ცხოველებმა მიიღეს 50 μl ტრაქეალური დოზა 9 × 107 TU/მლ LV გამხსნელით (ანუ 4.5 × 106 TU/ვირთხა). ამ კვლევებში, მშობიარობის დროს მაგნიტის გადატანის ნაცვლად, ჩვენ მაგნიტი ერთ პოზიციაზე დავაფიქსირეთ, რათა დაგვედგინა, შეიძლებოდა თუ არა LV ტრანსდუქციის გაუმჯობესება (ა) ვექტორულ მიწოდებასთან შედარებით მაგნიტური ველის არარსებობის შემთხვევაში და (ბ) შესაძლებელი იქნებოდა თუ არა მისი ფოკუსირება. სასუნთქი გზების უჯრედები ტრანსდუცირდება ზედა სასუნთქი გზების მაგნიტურ სამიზნე რეგიონებში.
მაგნიტების არსებობას და CombiMag-ის LV ვექტორებთან კომბინაციაში გამოყენებას, როგორც ჩანს, არ მოუხდენია უარყოფითი გავლენა ცხოველის ჯანმრთელობაზე, ისევე როგორც ჩვენს სტანდარტულ LV ვექტორების მიწოდების პროტოკოლს. მექანიკური დარღვევის ქვეშ მყოფი ტრაქეის რეგიონის შუბლის სურათები (დამატებითი სურ. 1) მიუთითებდა, რომ LV-MP-ით დამუშავებულ ცხოველთა ჯგუფში, როდესაც მაგნიტი იყო წარმოდგენილი, ტრანსდუქციის მნიშვნელოვნად მაღალი დონე იყო (სურ. 9ა). საკონტროლო ჯგუფში მხოლოდ მცირე რაოდენობით ლურჯი LacZ შეღებვა იყო წარმოდგენილი (სურ. 9ბ). ნორმალიზებული X-Gal შეღებილი უბნების რაოდენობრივმა განსაზღვრამ აჩვენა, რომ LV-MP-ის შეყვანამ მაგნიტური ველის თანაარსებობისას დაახლოებით 6-ჯერადი გაუმჯობესება გამოიწვია (სურ. 9გ).
LV-MP-ის მიერ ტრაქეის ტრანსდუქციის მაგალითები (ა) მაგნიტური ველის თანაარსებობისას და (ბ) მაგნიტის არარსებობისას. (გ) მაგნიტის გამოყენებისას ტრაქეაში LacZ ტრანსდუქციის ნორმალიზებული არეალის სტატისტიკურად მნიშვნელოვანი გაუმჯობესება (*p = 0.029, t-ტესტი, n = 3 ჯგუფზე, საშუალო ± SEM).
ნეიტრალური, სწრაფად წითლად შეღებილი მონაკვეთები (მაგალითი ნაჩვენებია დამატებით სურათ 2-ში) აჩვენებდა LacZ-შეღებილ უჯრედებს, რომლებიც წარმოდგენილი იყო მსგავსი ნიმუშითა და მდებარეობით, როგორც ადრე იყო აღწერილი.
სასუნთქი გზების გენური თერაპიის მთავარ გამოწვევად რჩება მატარებელი ნაწილაკების ზუსტი ლოკალიზაცია საინტერესო რეგიონებში და ტრანსდუქციის ეფექტურობის მაღალი დონის მიღწევა მოძრავ ფილტვში ჰაერის ნაკადის და აქტიური ლორწოს კლირენსის არსებობისას. მარცხენა პარკუჭის მატარებლებისთვის, რომლებიც შექმნილია კისტოზური ფიბროზის სასუნთქი გზების დაავადების სამკურნალოდ, მატარებელი ნაწილაკების გამტარ სასუნთქ გზებში ყოფნის დროის გაზრდა აქამდე მიუწვდომელი მიზანი იყო. როგორც კასტელანი და სხვები აღნიშნავენ, ტრანსდუქციის გასაუმჯობესებლად მაგნიტური ველების გამოყენებას უპირატესობები აქვს გენის მიწოდების სხვა მეთოდებთან შედარებით, როგორიცაა ელექტროპორაცია, რადგან მას შეუძლია გააერთიანოს სიმარტივე, ეკონომიურობა, მიწოდების ლოკალიზაცია, გაზრდილი ეფექტურობა და ინკუბაციის უფრო მოკლე დრო და შესაძლოა მატარებლის უფრო მცირე დოზა10. თუმცა, მაგნიტური ნაწილაკების in vivo დეპონირება და ქცევა სასუნთქ გზებში გარე მაგნიტური ძალების გავლენის ქვეშ არასდროს ყოფილა აღწერილი და არც ამ მეთოდის in vivo გამოყენების შესაძლებლობაა ნაჩვენები გენის ექსპრესიის დონის გასაზრდელად ინტაქტურ ცოცხალ სასუნთქ გზებში.
ჩვენმა in vitro სინქროტრონულმა PCXI ექსპერიმენტებმა აჩვენა, რომ ჩვენს მიერ გამოკვლეული ყველა ნაწილაკი, პოლისტიროლის MP-ის გარდა, ხილული იყო ჩვენს მიერ გამოყენებულ ვიზუალიზაციის სისტემაში. მაგნიტური ველის არსებობისას, MP-ები ქმნიან სიმებს, რომელთა სიგრძე დაკავშირებულია ნაწილაკის ტიპთან და მაგნიტური ველის სიძლიერესთან (ანუ მაგნიტის სიახლოვესთან და მოძრაობასთან). როგორც ნაჩვენებია ნახაზ 10-ში, ჩვენს მიერ დაკვირვებული სიმები წარმოიქმნება თითოეული ცალკეული ნაწილაკის მაგნიტიზაციისა და საკუთარი ლოკალური მაგნიტური ველის ინდუცირების გამო. ეს ცალკეული ველები იწვევს სხვა მსგავსი ნაწილაკების აგრეგირებას და შეერთებას, ჯგუფური სიმის მსგავსი მოძრაობებით, სხვა ნაწილაკების ადგილობრივი მიზიდულობისა და განზიდვის ძალებიდან გამომდინარე ადგილობრივი ძალების გამო.
სქემატური გამოსახულება, რომელიც ასახავს (ა,ბ) სითხით სავსე კაპილარებში წარმოქმნილ ნაწილაკების ხაზებს და (გ,დ) ჰაერით სავსე ტრაქეას. გაითვალისწინეთ, რომ კაპილარები და ტრაქეა მასშტაბურად არ არის დახატული. პანელი (ა) ასევე შეიცავს MP-ის აღწერას, რომელიც შეიცავს ძაფებად განლაგებულ Fe3O4 ნაწილაკებს.
როდესაც მაგნიტი კაპილარზე მაღლა გადაიტანეს, ნაწილაკების სიმის კუთხემ Fe3O4 შემცველი MP3-5-ისთვის კრიტიკულ ზღვარს მიაღწია, რის შემდეგაც ნაწილაკების სიმი აღარ რჩებოდა საწყის პოზიციაში, არამედ ზედაპირის გასწვრივ ახალ პოზიციაზე გადაადგილდა. მაგნიტი. ეს ეფექტი, სავარაუდოდ, იმიტომ ხდება, რომ მინის კაპილარული ზედაპირი საკმარისად გლუვია ამ მოძრაობისთვის. საინტერესოა, რომ MP6 (CombiMag) ასე არ იქცეოდა, შესაძლოა იმიტომ, რომ ნაწილაკები უფრო პატარა იყო, ჰქონდათ განსხვავებული საფარი ან ზედაპირული მუხტები, ან საკუთარი მატარებელი სითხე გავლენას ახდენდა მათ გადაადგილების უნარზე. CombiMag ნაწილაკების გამოსახულების კონტრასტი ასევე უფრო სუსტია, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ სითხეს და ნაწილაკებს შეიძლება ჰქონდეთ მსგავსი სიმკვრივე და შესაბამისად, ადვილად არ მოძრაობდნენ ერთმანეთისკენ. ნაწილაკები ასევე შეიძლება გაიჭედოს, თუ მაგნიტი ძალიან სწრაფად მოძრაობს, რაც მიუთითებს იმაზე, რომ მაგნიტური ველის სიძლიერე ყოველთვის ვერ გადალახავს სითხეში ნაწილაკებს შორის ხახუნს, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ შესაძლოა გასაკვირი არ არის, რომ მაგნიტური ველის სიძლიერე და მაგნიტსა და სამიზნე არეალს შორის მანძილი ძალიან მნიშვნელოვანია. ერთად აღებული, ეს შედეგები ასევე მიუთითებს, რომ მიუხედავად იმისა, რომ მაგნიტებს შეუძლიათ სამიზნე არეალში გამავალი მრავალი MP-ის დაჭერა, ნაკლებად სავარაუდოა, რომ მაგნიტებზე დაყრდნობა... CombiMag ნაწილაკების ტრაქეის ზედაპირის გასწვრივ გადატანა. შესაბამისად, ჩვენ ვასკვნით, რომ in vivo LV-MP კვლევებმა უნდა გამოიყენონ სტატიკური მაგნიტური ველები სასუნთქი გზების ხის კონკრეტული რეგიონების ფიზიკურად დასამიზნებლად.
როდესაც ნაწილაკები ორგანიზმში მოხვდება, მათი იდენტიფიცირება რთული მოძრავი ქსოვილის კონტექსტში რთულია, მაგრამ მათი აღმოჩენის შესაძლებლობა გაუმჯობესდა მაგნიტის ჰორიზონტალურად ტრაქეის ზემოთ გადაადგილებით, რათა მიკროელემენტების სიმები „ამოძრავებულიყო“. მიუხედავად იმისა, რომ ცოცხალი ვიზუალიზაცია შესაძლებელია, ნაწილაკების მოძრაობის გარჩევა უფრო ადვილია ცხოველის ჰუმანური სიკვდილის შემდეგ. მიკროელემენტების კონცენტრაცია, როგორც წესი, ყველაზე მაღალი იყო ამ ადგილას, როდესაც მაგნიტი ვიზუალიზაციის არეალის ზემოთ იყო განთავსებული, თუმცა ზოგიერთი ნაწილაკი, როგორც წესი, ტრაქეის უფრო შორს გვხვდებოდა. ინ ვიტრო კვლევებისგან განსხვავებით, მაგნიტის გადაადგილებით ნაწილაკები ტრაქეის გასწვრივ ვერ გადაადგილდება. ეს დასკვნა შეესაბამება იმას, თუ როგორ ამუშავებს ტრაქეის ზედაპირის დამფარავი ლორწო, როგორც წესი, შესუნთქულ ნაწილაკებს, იჭერს მათ ლორწოში და შემდგომში იწმინდება მუკოცილიარული კლირენსის მექანიზმით.
ჩვენ გამოვთქვით ჰიპოთეზა, რომ ტრაქეის ზემოთ და ქვემოთ მიზიდვისთვის მაგნიტების გამოყენებამ (სურ. 3ბ) შესაძლოა გამოიწვიოს უფრო ერთგვაროვანი მაგნიტური ველი, ვიდრე მაგნიტური ველი, რომელიც ერთ წერტილში ძლიერ კონცენტრირებულია, რაც პოტენციურად იწვევს ნაწილაკების უფრო ერთგვაროვან განაწილებას. თუმცა, ჩვენმა წინასწარმა კვლევამ ვერ მოიძებნა მკაფიო მტკიცებულება ამ ჰიპოთეზის დასადასტურებლად. ანალოგიურად, მაგნიტების წყვილის კონფიგურაციამ მოგერიებისთვის (სურ. 3გ) არ გამოიწვია ნაწილაკების მეტი დეპონირება გამოსახულების მიდამოში. ეს ორი დასკვნა აჩვენებს, რომ ორმაგი მაგნიტის დაყენება მნიშვნელოვნად არ აუმჯობესებს მიკრომაგნიტური ნაწილაკების დამიზნების ადგილობრივ კონტროლს და რომ შედეგად მიღებული ძლიერი მაგნიტური ძალების კონფიგურაცია რთულია, რაც ამ მიდგომას ნაკლებად პრაქტიკულს ხდის. ანალოგიურად, მაგნიტის ტრაქეის ზემოთ და მის გავლით ორიენტაციამ (სურ. 3დ) ასევე არ გაზარდა გამოსახულების მიდამოში შეკავებული ნაწილაკების რაოდენობა. ზოგიერთი ამ ალტერნატიული კონფიგურაცია შეიძლება არ იყოს წარმატებული, რადგან ისინი იწვევს მაგნიტური ველის დაბალ სიძლიერეს დეპონირების არეალში. ამიტომ, ერთი 30 გრადუსიანი კუთხის მაგნიტის კონფიგურაცია (სურათი 3ა) ითვლება in vivo ტესტირების უმარტივეს და ყველაზე ეფექტურ მეთოდად.
LV-MP კვლევამ აჩვენა, რომ როდესაც LV ვექტორები კომბინირებული იყო CombiMag-თან და მიწოდებული იყო ფიზიკური დარღვევის შემდეგ მაგნიტური ველის თანაარსებობისას, ტრანსდუქციის დონე მნიშვნელოვნად გაიზარდა ტრაქეაში საკონტროლო ჯგუფთან შედარებით. სინქროტრონული ვიზუალიზაციის კვლევებისა და LacZ შედეგების საფუძველზე, მაგნიტურ ველს, როგორც ჩანს, შეეძლო LV-ის შენარჩუნება ტრაქეაში და შეემცირებინა ვექტორული ნაწილაკების რაოდენობა, რომლებიც მყისიერად აღწევდნენ ფილტვებში ღრმად. ასეთი მიზანმიმართული გაუმჯობესება შეიძლება გამოიწვიოს უფრო მაღალი ეფექტურობა, ამავდროულად შეამციროს მიწოდებული ტიტრები, სამიზნედან გადახრილი ტრანსდუქცია, ანთებითი და იმუნური გვერდითი მოვლენები და გენის მატარებლის ხარჯები. მნიშვნელოვანია, რომ მწარმოებლის თქმით, CombiMag-ის გამოყენება შესაძლებელია სხვა გენის გადაცემის მეთოდებთან ერთად, მათ შორის სხვა ვირუსულ ვექტორებთან (მაგალითად, AAV) და ნუკლეინის მჟავებთან ერთად.