ขอบคุณที่เข้าชม Nature.com เบราว์เซอร์ที่คุณใช้อยู่มีการรองรับ CSS อย่างจำกัด เพื่อประสบการณ์การใช้งานที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันล่าสุด (หรือปิดโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าเว็บไซต์จะยังคงได้รับการสนับสนุนต่อไป เราจะแสดงเว็บไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
เวกเตอร์ยีนสำหรับการรักษาโรคปอดซิสติกไฟโบรซิสควรส่งไปยังทางเดินหายใจส่วนกลาง เนื่องจาก1การถ่ายทอดยีนไปยังปอดส่วนปลายไม่ให้ประโยชน์ในการรักษา ประสิทธิภาพการถ่ายทอดยีนด้วยไวรัสมีความสัมพันธ์โดยตรงกับระยะเวลาที่เวกเตอร์อยู่ในทางเดินหายใจ อย่างไรก็ตาม ของเหลวที่ใช้ในการนำส่ง เช่น ตัวนำยีน จะแพร่กระจายเข้าไปในถุงลมปอดตามธรรมชาติในระหว่างการหายใจเข้า และอนุภาคที่ใช้ในการรักษาไม่ว่าจะอยู่ในรูปแบบใดก็จะถูกกำจัดออกไปอย่างรวดเร็วโดยการขนส่งเมือกและขน การยืดระยะเวลาที่ตัวนำยีนอยู่ในทางเดินหายใจจึงมีความสำคัญแต่ทำได้ยาก อนุภาคแม่เหล็กที่เชื่อมต่อกับตัวนำยีนซึ่งสามารถส่งไปยังพื้นผิวของทางเดินหายใจได้จะช่วยปรับปรุงการกำหนดเป้าหมายเฉพาะบริเวณ เนื่องจากความท้าทายในการมองเห็นในร่างกาย พฤติกรรมของอนุภาคแม่เหล็กขนาดเล็กดังกล่าวบนพื้นผิวทางเดินหายใจเมื่อมีสนามแม่เหล็กภายนอกจึงยังไม่เป็นที่เข้าใจอย่างถ่องแท้ จุดประสงค์ของการศึกษาครั้งนี้คือการใช้การถ่ายภาพด้วยซินโครตรอนเพื่อแสดงภาพการเคลื่อนที่ของอนุภาคแม่เหล็กหลายชุดในหลอดลมของหนูทดลองที่ถูกวางยาสลบ เพื่อตรวจสอบพลวัตและรูปแบบของพฤติกรรมของอนุภาคแต่ละตัวและอนุภาคโดยรวมในร่างกาย จากนั้นเรายังประเมินด้วยว่าการนำส่งของเวกเตอร์ยีนนั้นมีประสิทธิภาพหรือไม่ อนุภาคแม่เหล็กของไวรัสเลนติในสภาวะที่มีสนามแม่เหล็กจะช่วยเพิ่มประสิทธิภาพการถ่ายทอดยีนในหลอดลมของหนู การถ่ายภาพด้วยรังสีเอกซ์ซินโครตรอนเผยให้เห็นพฤติกรรมของอนุภาคแม่เหล็กในสนามแม่เหล็กคงที่และเคลื่อนที่ทั้งในหลอดทดลองและในร่างกาย อนุภาคไม่สามารถถูกลากไปตามพื้นผิวของทางเดินหายใจที่มีชีวิตด้วยแม่เหล็กได้ง่าย แต่ในระหว่างการขนส่ง อนุภาคจะกระจุกตัวอยู่ในบริเวณที่สนามแม่เหล็กมีความแรงสูงสุด ประสิทธิภาพการถ่ายทอดยีนยังเพิ่มขึ้นถึงหกเท่าเมื่อส่งอนุภาคแม่เหล็กของไวรัสเลนติในสภาวะที่มีสนามแม่เหล็ก ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าอนุภาคแม่เหล็กของไวรัสเลนติและสนามแม่เหล็กอาจเป็นแนวทางที่มีคุณค่าในการปรับปรุงการกำหนดเป้าหมายของเวกเตอร์ยีนและเพิ่มระดับการถ่ายทอดยีนในทางเดินหายใจในร่างกาย
โรคซิสติกไฟบรosis (CF) เกิดจากความแปรปรวนในยีนตัวเดียวที่เรียกว่า CF transmembrane conductance regulator (CFTR) โปรตีน CFTR เป็นช่องไอออนที่มีอยู่ในเซลล์เยื่อบุผิวหลายแห่งทั่วร่างกาย รวมถึงทางเดินหายใจ ซึ่งเป็นบริเวณสำคัญของการเกิดโรค CF ความบกพร่องของ CFTR นำไปสู่การขนส่งน้ำที่ผิดปกติ ทำให้พื้นผิวทางเดินหายใจแห้งและลดความหนาของชั้นของเหลวบนพื้นผิวทางเดินหายใจ (ASL) นอกจากนี้ยังทำให้ความสามารถของระบบการขนส่งเมือกและขน (MCT) ในการกำจัดอนุภาคและเชื้อโรคที่สูดดมเข้าไปในทางเดินหายใจลดลง เป้าหมายของเราคือการพัฒนายีนบำบัดด้วยไวรัสเลนติ (LV) เพื่อส่งมอบสำเนาที่ถูกต้องของยีน CFTR และปรับปรุง ASL, MCT และสุขภาพปอด และเพื่อพัฒนาเทคโนโลยีใหม่ๆ ที่สามารถวัดพารามิเตอร์เหล่านี้ในร่างกายได้ต่อไป¹
เวกเตอร์ LV เป็นหนึ่งในตัวเลือกชั้นนำสำหรับการบำบัดยีนในทางเดินหายใจของโรค CF เนื่องจากสามารถรวมยีนบำบัดเข้ากับเซลล์ฐานของทางเดินหายใจ (เซลล์ต้นกำเนิดของทางเดินหายใจ) ได้อย่างถาวร ซึ่งมีความสำคัญเพราะสามารถฟื้นฟูความชุ่มชื้นและการกำจัดเสมหะให้เป็นปกติได้โดยการเปลี่ยนแปลงไปเป็นเซลล์ผิวทางเดินหายใจที่เกี่ยวข้องกับ CF ที่ได้รับการแก้ไขยีนอย่างมีประสิทธิภาพ ส่งผลให้เกิดประโยชน์ตลอดชีวิต เวกเตอร์ LV ควรถูกส่งไปยังทางเดินหายใจส่วนนำ เนื่องจากเป็นจุดเริ่มต้นของโรคปอด CF การส่งเวกเตอร์เข้าไปในปอดลึกเกินไปอาจส่งผลให้เกิดการถ่ายทอดยีนในถุงลม แต่ไม่มีประโยชน์ในการรักษา CF อย่างไรก็ตาม ของเหลว เช่น ตัวนำยีน จะเคลื่อนที่ไปยังถุงลมตามธรรมชาติเมื่อหายใจเข้าหลังจากส่ง3,4 และอนุภาคบำบัดจะถูกกำจัดอย่างรวดเร็วไปยังช่องปากโดย MCT ประสิทธิภาพการถ่ายทอดยีนของ LV เกี่ยวข้องโดยตรงกับระยะเวลาที่เวกเตอร์อยู่ใกล้กับเซลล์เป้าหมายเพื่อให้เซลล์ดูดซึมได้ – “เวลาคงอยู่”5 – ซึ่งลดลงได้ง่ายโดยการไหลเวียนของอากาศในบริเวณนั้นตามปกติ รวมถึงการดักจับอนุภาคและเสมหะที่ประสานกันด้วย สำหรับโรค CF ความสามารถในการยืดระยะเวลาที่ LV อยู่ภายในทางเดินหายใจนั้นมีความสำคัญต่อการบรรลุระดับการถ่ายทอดสัญญาณที่สูงในบริเวณนี้ แต่จนถึงขณะนี้ยังเป็นเรื่องที่ท้าทายอยู่
เพื่อเอาชนะอุปสรรคนี้ เราขอเสนอแนะว่าอนุภาคแม่เหล็ก LV (MPs) อาจช่วยได้ในสองวิธีที่เสริมกัน ประการแรก อนุภาคเหล่านี้สามารถถูกนำทางด้วยสนามแม่เหล็กไปยังพื้นผิวทางเดินหายใจเพื่อปรับปรุงการกำหนดเป้าหมายและช่วยให้อนุภาคพาหะนำส่งยีนอยู่ในบริเวณทางเดินหายใจที่ต้องการ และประการที่สอง MPs ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในฐานะพาหะนำส่งยาแบบกำหนดเป้าหมายเมื่อพวกมันจับกับแอนติบอดี ยาเคมีบำบัด หรือโมเลกุลขนาดเล็กอื่นๆ ที่ยึดติดกับเยื่อหุ้มเซลล์หรือจับกับตัวรับบนพื้นผิวเซลล์ที่เกี่ยวข้องและสะสมอยู่ที่บริเวณเนื้องอกเมื่อมีไฟฟ้าสถิต สนามแม่เหล็กสำหรับการรักษามะเร็ง 7. เทคนิค “ไฮเปอร์เทอร์มอล” อื่นๆ มีเป้าหมายเพื่อเพิ่มความร้อนให้กับ MP เมื่อสัมผัสกับสนามแม่เหล็กที่สั่นไหว ซึ่งจะทำลายเซลล์มะเร็ง หลักการของการถ่ายทอดทางพันธุกรรมด้วยสนามแม่เหล็ก ซึ่งใช้สนามแม่เหล็กเป็นตัวนำการถ่ายทอดทางพันธุกรรมเพื่อเพิ่มการถ่ายโอน DNA ไปยังเซลล์ มักใช้ในหลอดทดลองโดยใช้เวกเตอร์ยีนที่ไม่ใช่ไวรัสและไวรัสหลายชนิดสำหรับเซลล์ที่ถ่ายทอดทางพันธุกรรมได้ยาก ประสิทธิภาพของการถ่ายทอดทางพันธุกรรมด้วยสนามแม่เหล็ก LV ได้รับการพิสูจน์แล้ว โดยการส่ง LV-MP ในหลอดทดลองไปยังเซลล์เยื่อบุผิวหลอดลมของมนุษย์ในที่ที่มีสนามแม่เหล็กคงที่ ช่วยเพิ่มประสิทธิภาพการถ่ายทอดทางพันธุกรรมได้ถึง 186 เท่าเมื่อเทียบกับเวกเตอร์ LV เพียงอย่างเดียว LV-MP ยังถูกนำไปใช้กับแบบจำลอง CF ในหลอดทดลอง ซึ่งการถ่ายทอดทางพันธุกรรมด้วยสนามแม่เหล็กช่วยเพิ่มการถ่ายทอดทางพันธุกรรมของ LV ในการเพาะเลี้ยงแบบอินเตอร์เฟซอากาศ-ของเหลวได้ถึง 20 เท่าเมื่อมีเสมหะ CF อยู่ด้วย10 อย่างไรก็ตาม การถ่ายทอดทางพันธุกรรมด้วยสนามแม่เหล็กในอวัยวะในร่างกายได้รับความสนใจค่อนข้างน้อยและได้รับการประเมินในสัตว์เพียงไม่กี่ตัวเท่านั้น การศึกษา11,12,13,14,15 โดยเฉพาะในปอด16,17 อย่างไรก็ตาม โอกาสสำหรับการถ่ายทอดทางแม่เหล็กในการบำบัดปอด CF นั้นชัดเจน Tan et al.(2020) ระบุว่า “การศึกษาเพื่อพิสูจน์แนวคิดของการส่งอนุภาคนาโนแม่เหล็กไปยังปอดอย่างมีประสิทธิภาพจะปูทางไปสู่กลยุทธ์การสูดดม CFTR ในอนาคตเพื่อปรับปรุงผลลัพธ์ทางคลินิกในผู้ป่วย CF”6
พฤติกรรมของอนุภาคแม่เหล็กขนาดเล็กบนพื้นผิวทางเดินหายใจเมื่อมีสนามแม่เหล็กกระทำนั้นยากที่จะมองเห็นและศึกษา จึงทำให้เข้าใจได้ไม่ดีนัก ในการศึกษาอื่นๆ เราได้พัฒนาวิธีการสร้างภาพเอกซเรย์คอนทราสต์เฟสโดยใช้การแพร่กระจายของซินโครตรอน (PB-PCXI) เพื่อให้สามารถมองเห็นและวัดปริมาณการเปลี่ยนแปลงเล็กน้อยในร่างกายของความลึกของ ASL18 และพฤติกรรมของ MCT19,20 โดยไม่รุกราน เพื่อวัดความชุ่มชื้นของพื้นผิวท่อก๊าซโดยตรง และใช้เป็นตัวบ่งชี้เบื้องต้นของประสิทธิภาพการรักษา นอกจากนี้ วิธีการประเมิน MCT ของเราใช้อนุภาคขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 10–35 µm ที่ประกอบด้วยอะลูมินาหรือแก้วที่มีดัชนีหักเหสูงเป็นเครื่องหมาย MCT ที่มองเห็นได้โดยใช้ PB-PCXI21 เทคนิคทั้งสองนี้เหมาะสมสำหรับการมองเห็นอนุภาคหลายประเภท รวมถึง MP ด้วย
เนื่องจากมีความละเอียดเชิงพื้นที่และเวลาสูง เทคนิคการวิเคราะห์ ASL และ MCT ที่ใช้ PB-PCXI ของเราจึงเหมาะสมอย่างยิ่งสำหรับการตรวจสอบพลวัตและรูปแบบของพฤติกรรมอนุภาคเดี่ยวและอนุภาคจำนวนมากในร่างกาย เพื่อช่วยให้เราเข้าใจและเพิ่มประสิทธิภาพเทคนิคการส่งยีน MP แนวทางที่เราใช้ในที่นี้ได้มาจากงานวิจัยของเราที่ใช้ลำแสง SPring-8 BL20B2 ซึ่งเราได้แสดงภาพการเคลื่อนที่ของของเหลวหลังจากการส่งเวกเตอร์หลอกเข้าไปในทางเดินหายใจจมูกและปอดของหนู เพื่อช่วยอธิบายรูปแบบการแสดงออกของยีนที่ไม่สม่ำเสมอที่สังเกตได้ในงานวิจัยสัตว์ทดลองเกี่ยวกับปริมาณตัวนำยีนของเรา 3,4
จุดมุ่งหมายของการศึกษาครั้งนี้คือการใช้ซินโครตรอน PB-PCXI เพื่อแสดงภาพการเคลื่อนที่ของอนุภาคไมโครพาร์ติเคิล (MP) ในหลอดลมของหนูทดลองที่มีชีวิต การศึกษาภาพ PB-PCXI เหล่านี้ได้รับการออกแบบมาเพื่อทดสอบอนุภาค MP หลายชนิด ความแรงของสนามแม่เหล็ก และตำแหน่งต่างๆ เพื่อพิจารณาผลกระทบต่อการเคลื่อนที่ของอนุภาค MP เราตั้งสมมติฐานว่าสนามแม่เหล็กที่ใช้จากภายนอกจะช่วยให้อนุภาค MP ที่ส่งเข้าไปคงอยู่หรือเคลื่อนที่ไปยังบริเวณเป้าหมาย การศึกษาเหล่านี้ยังช่วยให้เราสามารถระบุการจัดเรียงแม่เหล็กที่เพิ่มจำนวนอนุภาคที่คงอยู่ในหลอดลมหลังจากการวางตำแหน่งให้มากที่สุด ในการศึกษาชุดที่สอง เราพยายามใช้การจัดเรียงที่เหมาะสมที่สุดนี้เพื่อแสดงรูปแบบการถ่ายทอดสัญญาณที่เกิดจากการส่งอนุภาค LV-MP ไปยังทางเดินหายใจของหนูทดลองในร่างกาย โดยอยู่บนสมมติฐานว่าการส่งอนุภาค LV-MP ในบริบทของการกำหนดเป้าหมายทางเดินหายใจจะส่งผลให้ประสิทธิภาพการถ่ายทอดสัญญาณ LV ดีขึ้น
การศึกษาเกี่ยวกับสัตว์ทั้งหมดดำเนินการตามระเบียบที่ได้รับการอนุมัติจากมหาวิทยาลัยแอดิเลด (M-2019-060 และ M-2020-022) และคณะกรรมการจริยธรรมการใช้สัตว์ของ SPring-8 Synchrotron การทดลองดำเนินการตามแนวทาง ARRIVE
การถ่ายภาพด้วยรังสีเอกซ์ทั้งหมดดำเนินการที่ลำแสง BL20XU ที่ซินโครตรอน SPring-8 ในประเทศญี่ปุ่น โดยใช้การตั้งค่าที่คล้ายกับที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้21,22 โดยสรุป กล่องทดลองตั้งอยู่ห่างจากวงแหวนเก็บประจุของซินโครตรอน 245 เมตร ระยะห่างระหว่างตัวอย่างกับตัวตรวจจับ 0.6 เมตรใช้สำหรับการศึกษาการถ่ายภาพอนุภาค และ 0.3 เมตรสำหรับการศึกษาการถ่ายภาพในร่างกายเพื่อสร้างเอฟเฟกต์ความแตกต่างของเฟส ใช้พลังงานลำแสงโมโนโครมาติก 25 keV ภาพถูกบันทึกโดยใช้ตัวแปลงรังสีเอกซ์ความละเอียดสูง (SPring-8 BM3) ที่เชื่อมต่อกับตัวตรวจจับ sCMOS ตัวแปลงจะแปลงรังสีเอกซ์เป็นแสงที่มองเห็นได้โดยใช้สารเรืองแสงหนา 10 µm (Gd3Al2Ga3O12) จากนั้นส่งไปยังเซ็นเซอร์ sCMOS โดยใช้เลนส์ไมโครสโคป × 10 (NA 0.3) ตัวตรวจจับ sCMOS คือ Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, ประเทศญี่ปุ่น) ที่มีขนาดอาร์เรย์ ภาพมีความละเอียด 2048 × 2048 พิกเซล และขนาดพิกเซลดิบ 6.5 × 6.5 ไมโครเมตร การตั้งค่านี้ให้ขนาดพิกเซลแบบไอโซโทรปิกที่มีประสิทธิภาพ 0.51 ไมโครเมตร และขอบเขตการมองเห็นประมาณ 1.1 มม. × 1.1 มม. เลือกความยาวการเปิดรับแสง 100 มิลลิวินาที เพื่อเพิ่มอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนของอนุภาคแม่เหล็กภายในและภายนอกทางเดินหายใจให้สูงสุด ในขณะที่ลดสิ่งรบกวนจากการเคลื่อนไหวที่เกิดจากการหายใจให้น้อยที่สุด สำหรับการศึกษาในร่างกายจริง ได้ติดตั้งชัตเตอร์เอ็กซ์เรย์ความเร็วสูงไว้ในเส้นทางของรังสีเอ็กซ์เพื่อจำกัดปริมาณรังสีโดยการปิดกั้นลำแสงเอ็กซ์เรย์ระหว่างการเปิดรับแสงแต่ละครั้ง
ไม่ได้ใช้ตัวนำ LV ในการศึกษาการถ่ายภาพ SPring-8 PB-PCXI ใดๆ เนื่องจากห้องถ่ายภาพ BL20XU ไม่ได้รับการรับรองระดับความปลอดภัยทางชีวภาพระดับ 2 ดังนั้นเราจึงเลือกไมโครพาร์ติเคิล (MP) ที่มีคุณสมบัติเฉพาะจากผู้จำหน่ายเชิงพาณิชย์สองราย ซึ่งครอบคลุมขนาด วัสดุ ความเข้มข้นของเหล็ก และการใช้งานที่หลากหลาย เพื่อทำความเข้าใจก่อนว่าสนามแม่เหล็กส่งผลต่อการเคลื่อนที่ของ MP ภายในหลอดแก้วอย่างไร จากนั้นจึงศึกษาในทางเดินหายใจของสิ่งมีชีวิต บนพื้นผิว อนุภาคแม่เหล็ก (MPs) มีขนาดตั้งแต่ 0.25 ถึง 18 ไมโครเมตร และทำจากวัสดุหลากหลายชนิด (ดูตารางที่ 1) แต่ส่วนประกอบของแต่ละตัวอย่าง รวมถึงขนาดของอนุภาคแม่เหล็กภายใน MP นั้นยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด จากการศึกษา MCT อย่างกว้างขวางของเรา 19, 20, 21, 23, 24 เราคาดว่าอนุภาคแม่เหล็กที่มีขนาดเล็กถึง 5 ไมโครเมตรสามารถมองเห็นได้บนพื้นผิวทางเดินหายใจของหลอดลม ตัวอย่างเช่น โดยการลบเฟรมที่ต่อเนื่องกันเพื่อดูการเคลื่อนที่ของ MP ที่ชัดเจนยิ่งขึ้น อนุภาคแม่เหล็กขนาด 0.25 ไมโครเมตรเพียงอนุภาคเดียวมีขนาดเล็กกว่าความละเอียดของอุปกรณ์ถ่ายภาพ แต่คาดว่า PB-PCXI จะสามารถตรวจจับความแตกต่างของปริมาตรและการเคลื่อนที่ของของเหลวบนพื้นผิวที่อนุภาคแม่เหล็กถูกวางลงหลังจากที่ถูกวางลงแล้ว
ตัวอย่างสำหรับ MP แต่ละชนิดในตารางที่ 1 ถูกเตรียมในหลอดแก้วขนาด 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) ที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 0.63 มม. อนุภาคแบบคอร์ปัสคูลาร์มีจำหน่ายในน้ำ ในขณะที่อนุภาค CombiMag มีจำหน่ายในของเหลวสูตรเฉพาะของผู้ผลิต หลอดแต่ละหลอดบรรจุของเหลวครึ่งหนึ่ง (ประมาณ 11 μl) และวางบนที่วางตัวอย่าง (ดูรูปที่ 1) หลอดแก้วถูกวางในแนวนอนบนแท่นวางตัวอย่างในกล่องถ่ายภาพ และวางขอบของของเหลวให้ตรงกัน แม่เหล็กนีโอไดเมียมเหล็กโบรอน (NdFeB) เปลือกนิกเกิลขนาดเส้นผ่านศูนย์กลาง 19 มม. (ยาว 28 มม.) (N35, หมายเลขแคตตาล็อก LM1652, Jaycar Electronics, ออสเตรเลีย) ที่มีค่าการเหนี่ยวนำแม่เหล็กตกค้าง 1.17 เทสลา ถูกติดตั้งบนแท่นเลื่อนแยกต่างหากเพื่อให้สามารถเปลี่ยนตำแหน่งจากระยะไกลได้ในระหว่างการถ่ายภาพ การถ่ายภาพเอกซเรย์เริ่มต้นเมื่อแม่เหล็กอยู่เหนือตัวอย่างประมาณ 30 มม. และภาพจะถูกบันทึกที่ อัตราการถ่ายภาพ 4 เฟรมต่อวินาที ในระหว่างการถ่ายภาพ แม่เหล็กถูกนำมาใกล้กับหลอดแก้วขนาดเล็ก (ห่างประมาณ 1 มิลลิเมตร) จากนั้นจึงเลื่อนไปตามหลอดเพื่อประเมินผลกระทบของความแรงสนามและตำแหน่ง
ชุดอุปกรณ์ถ่ายภาพในหลอดทดลองที่บรรจุตัวอย่าง MP ในหลอดแก้วขนาดเล็กบนแท่นเลื่อนตัวอย่าง xy เส้นทางของลำแสงเอ็กซ์เรย์ถูกทำเครื่องหมายด้วยเส้นประสีแดง
เมื่อยืนยันการมองเห็นของ MP ในหลอดทดลองแล้ว จึงนำ MP บางส่วนไปทดสอบในร่างกายของหนูขาว Wistar เพศเมียสายพันธุ์ป่า (อายุประมาณ 12 สัปดาห์ น้ำหนักประมาณ 200 กรัม) โดยให้ยา medetomidine 0.24 มก./กก. (Domitor®, Zenoaq, ญี่ปุ่น), midazolam 3.2 มก./กก. (Dormicum®, Astellas Pharma, ญี่ปุ่น) และ butorphanol 4 มก./กก. (Vetorphale®, Meiji Seika) หนูถูกวางยาสลบด้วยส่วนผสมของยาเหล่านี้โดยการฉีดเข้าช่องท้อง หลังจากวางยาสลบแล้ว หนูจะถูกเตรียมสำหรับการถ่ายภาพโดยการกำจัดขนรอบหลอดลม ใส่ท่อช่วยหายใจ (ET; เข็มฉีดยา 16 Ga iv cannula, Terumo BCT) และตรึงหนูให้นอนหงายบนแผ่นถ่ายภาพที่ทำขึ้นเองซึ่งมีถุงเก็บความร้อนเพื่อรักษาอุณหภูมิร่างกาย 22 จากนั้นจึงติดแผ่นถ่ายภาพเข้ากับแท่นเลื่อนตัวอย่างในกล่องถ่ายภาพในมุมเล็กน้อยเพื่อจัดแนว หลอดลมอยู่ในแนวนอนในภาพเอกซเรย์ ดังแสดงในรูปที่ 2a
(a) การจัดวางอุปกรณ์ถ่ายภาพในร่างกายในกล่องถ่ายภาพ SPring-8 โดยเส้นทางของลำแสงเอ็กซ์เรย์ถูกทำเครื่องหมายด้วยเส้นประสีแดง (b,c) การระบุตำแหน่งแม่เหล็กบนหลอดลมทำได้จากระยะไกลโดยใช้กล้อง IP สองตัวที่ติดตั้งในแนวตั้งฉาก ในภาพด้านซ้ายของหน้าจอ จะเห็นลวดที่ยึดศีรษะไว้ และท่อส่งยาที่อยู่ในตำแหน่งภายในท่อช่วยหายใจ
ระบบปั๊มฉีดแบบควบคุมระยะไกล (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) โดยใช้กระบอกฉีดยาแก้วขนาด 100 μl เชื่อมต่อกับท่อ PE10 (เส้นผ่านศูนย์กลางภายนอก 0.61 มม., เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 0.28 มม.) ผ่านเข็มขนาด 30 Ga ทำเครื่องหมายที่ท่อเพื่อให้แน่ใจว่าปลายอยู่ในตำแหน่งที่ถูกต้องในหลอดลมเมื่อใส่ท่อช่วยหายใจ ใช้ไมโครปั๊มดึงลูกสูบของกระบอกฉีดยาลงในขณะที่ปลายท่อจุ่มอยู่ในตัวอย่าง MP ที่จะส่ง จากนั้นใส่ท่อส่งที่บรรจุแล้วเข้าไปในท่อช่วยหายใจ โดยวางปลายท่อไว้ภายในส่วนที่แรงที่สุดของสนามแม่เหล็กที่คาดว่าจะใช้ การเก็บภาพถูกควบคุมโดยใช้เครื่องตรวจจับการหายใจที่เชื่อมต่อกับกล่องจับเวลาแบบ Arduino ของเรา และสัญญาณทั้งหมด (เช่น อุณหภูมิ การหายใจ การเปิด/ปิดชัตเตอร์ และการเก็บภาพ) ถูกบันทึกโดยใช้ Powerlab และ LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22 เมื่อไม่สามารถเข้าถึงบริเวณที่ครอบได้ กล้อง IP สองตัว (Panasonic) BB-SC382 ถูกจัดวางให้ทำมุมประมาณ 90° ต่อกัน และใช้ในการตรวจสอบตำแหน่งของแม่เหล็กเทียบกับหลอดลมระหว่างการถ่ายภาพ (รูปที่ 2b,c) เพื่อลดสิ่งรบกวนจากการเคลื่อนไหว จึงทำการถ่ายภาพหนึ่งภาพต่อการหายใจหนึ่งครั้งในช่วงที่อัตราการไหลของลมหายใจออกคงที่
แม่เหล็กถูกติดตั้งไว้ที่ขั้นตอนที่สองซึ่งสามารถวางไว้ห่างจากภายนอกตัวเรือนการถ่ายภาพได้ มีการทดสอบตำแหน่งและการกำหนดค่าแม่เหล็กหลายแบบ รวมถึง: ติดตั้งทำมุมประมาณ 30° เหนือหลอดลม (แสดงในรูปที่ 2a และ 3a); แม่เหล็กหนึ่งอันอยู่เหนือสัตว์และอีกอันอยู่ด้านล่าง โดยตั้งขั้วให้ดึงดูดกัน (รูปที่ 3b); แม่เหล็กหนึ่งอันอยู่เหนือสัตว์และอีกอันอยู่ด้านล่าง โดยตั้งขั้วให้ผลักกัน (รูปที่ 3c); และแม่เหล็กหนึ่งอันอยู่เหนือและตั้งฉากกับหลอดลม (รูปที่ 3d) เมื่อตั้งค่าสัตว์และแม่เหล็กแล้ว และใส่ MP ที่จะทดสอบลงในปั๊มฉีดแล้ว ให้ฉีดปริมาณ 50 μl ในอัตรา 4 μl/วินาที พร้อมกับบันทึกภาพ จากนั้นให้เลื่อนแม่เหล็กไปมาตามแนวหรือขวางหลอดลมในขณะที่ยังคงบันทึกภาพต่อไป
การจัดวางแม่เหล็กสำหรับการถ่ายภาพในร่างกาย (a) แม่เหล็กเดี่ยวอยู่เหนือหลอดลมทำมุมประมาณ 30° (b) แม่เหล็กสองตัวตั้งให้ดึงดูดกัน (c) แม่เหล็กสองตัวตั้งให้ผลักกัน (d) แม่เหล็กเดี่ยวอยู่เหนือและตั้งฉากกับหลอดลม ผู้สังเกตการณ์มองลงมาจากปากไปยังปอดผ่านหลอดลม และลำแสงเอ็กซ์เรย์ผ่านด้านซ้ายของหนูและออกทางด้านขวา แม่เหล็กจะถูกเลื่อนไปตามความยาวของทางเดินหายใจหรือซ้ายและขวาเหนือหลอดลมในทิศทางของลำแสงเอ็กซ์เรย์
นอกจากนี้ เรายังต้องการตรวจสอบการมองเห็นและพฤติกรรมของอนุภาคในทางเดินหายใจโดยปราศจากการหายใจและการเคลื่อนไหวของหัวใจที่อาจรบกวน ดังนั้น เมื่อสิ้นสุดระยะเวลาการถ่ายภาพ สัตว์ทดลองจะถูกฆ่าอย่างมีมนุษยธรรมด้วยการให้ยาเพนโทบาร์บิทัลเกินขนาด (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ประมาณ 65 มก./กก. ฉีดเข้าทางช่องท้อง) สัตว์ทดลองบางตัวถูกทิ้งไว้บนแท่นถ่ายภาพ และเมื่อการหายใจและการเต้นของหัวใจหยุดลง กระบวนการถ่ายภาพจะถูกทำซ้ำ โดยเพิ่มปริมาณ MP เพิ่มเติมหากไม่พบ MP บนพื้นผิวทางเดินหายใจ
ภาพที่ได้มานั้นได้รับการแก้ไขความผิดเพี้ยนของภาพพื้นหลังและภาพมืด จากนั้นจึงนำมาประกอบเป็นวิดีโอ (20 เฟรมต่อวินาที; ความเร็ว 15-25 เท่าของความเร็วปกติ ขึ้นอยู่กับอัตราการหายใจ) โดยใช้สคริปต์ที่เขียนขึ้นเองใน MATLAB (R2020a, The Mathworks)
การศึกษาทั้งหมดเกี่ยวกับการนำส่งยีนเวกเตอร์ LV ดำเนินการที่ศูนย์วิจัยสัตว์ทดลอง มหาวิทยาลัยแอดิเลด โดยมีเป้าหมายเพื่อใช้ผลการทดลอง SPring-8 ในการประเมินว่าการนำส่ง LV-MP ในสภาวะที่มีสนามแม่เหล็กสามารถเพิ่มประสิทธิภาพการถ่ายทอดยีนในร่างกายได้หรือไม่ เพื่อประเมินผลของ MP และสนามแม่เหล็ก จึงได้ทำการทดลองกับสัตว์สองกลุ่ม กลุ่มหนึ่งได้รับ LV-MP โดยวางแม่เหล็กไว้ และอีกกลุ่มหนึ่งได้รับ LV-MP เป็นกลุ่มควบคุมโดยไม่มีแม่เหล็ก
เวกเตอร์ยีน LV ถูกสร้างขึ้นโดยใช้วิธีการที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 25, 26 เวกเตอร์ LacZ แสดงออกยีนเบต้า-กาแลคโตซิเดสที่อยู่ภายในนิวเคลียสซึ่งถูกควบคุมโดยโปรโมเตอร์ MPSV แบบคงที่ (LV-LacZ) ซึ่งสร้างผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาสีน้ำเงินในเซลล์ที่ถูกถ่ายทอด สามารถมองเห็นได้ในส่วนหน้าของเนื้อเยื่อปอดและส่วนตัดของเนื้อเยื่อ การหาค่าไทเตอร์ทำได้โดยการนับจำนวนเซลล์ LacZ ที่เป็นบวกด้วยตนเองโดยใช้ฮีโมไซโตมิเตอร์ในเซลล์เพาะเลี้ยงเพื่อคำนวณค่าไทเตอร์ในหน่วย TU/ml ตัวพาจะถูกแช่แข็งที่ -80 °C ละลายก่อนใช้งาน และจับกับ CombiMag โดยการผสมในอัตราส่วน 1:1 และบ่มบนน้ำแข็งอย่างน้อย 30 นาทีก่อนส่งมอบ
หนูแรทสายพันธุ์ Sprague Dawley ปกติ (n = 3/กลุ่ม อายุประมาณ 2-3 เดือน) ได้รับการวางยาสลบโดยการฉีดเข้าช่องท้องด้วยส่วนผสมของเมเดโทมิดีน 0.4 มก./กก. (Domitor, Ilium, Australia) และคีตามีน 60 มก./กก. (Ilium, Australia) และใส่ท่อช่วยหายใจทางปากแบบไม่ผ่าตัดด้วยท่อช่วยหายใจขนาด 16 Ga เพื่อให้แน่ใจว่าเนื้อเยื่อทางเดินหายใจของหลอดลมได้รับการถ่ายทอดสัญญาณ LV จึงทำการปรับสภาพโดยใช้โปรโตคอลการรบกวนทางกลที่เราได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ โดยถูพื้นผิวทางเดินหายใจของหลอดลมตามแนวแกนด้วยตะกร้าลวด (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) เป็นเวลา 30 วินาที28 จากนั้นจึงทำการให้ LV-MP ทางหลอดลมในตู้ชีวความปลอดภัยประมาณ 10 นาทีหลังจากการรบกวน
สนามแม่เหล็กที่ใช้ในการทดลองนี้ถูกจัดเรียงในลักษณะเดียวกับการศึกษาการถ่ายภาพรังสีเอกซ์ในร่างกาย โดยใช้แม่เหล็กชนิดเดียวกันวางไว้เหนือหลอดลมโดยใช้คลิปหนีบท่อกลั่น (รูปที่ 4) ฉีด LV-MP ปริมาตร 50 ไมโครลิตร (แบ่งเป็น 2 ส่วน ส่วนละ 25 ไมโครลิตร) เข้าไปในหลอดลม (สัตว์ทดลอง 3 ตัว) โดยใช้ปิเปตที่มีปลายเจลตามที่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ กลุ่มควบคุม (สัตว์ทดลอง 3 ตัว) ได้รับ LV-MP ชนิดเดียวกันโดยไม่ใช้แม่เหล็ก หลังจากฉีดเสร็จแล้ว จะถอดสายสวนออกจากท่อช่วยหายใจและถอดท่อช่วยหายใจออกจากสัตว์ทดลอง แม่เหล็กจะคงอยู่ในตำแหน่งเดิมเป็นเวลา 10 นาที จากนั้นจึงนำออก หนูทดลองได้รับยาเมโลซิแคมใต้ผิวหนัง (1 มล./กก.) (Ilium, ออสเตรเลีย) ตามด้วยการให้ยาแก้ฤทธิ์ยาสลบโดยการฉีดอะติพามาโซลไฮโดรคลอไรด์ 1 มก./กก. ทางช่องท้อง (Antisedan, Zoetis, ออสเตรเลีย) หนูทดลองจะถูกรักษาให้อบอุ่นและเฝ้าสังเกตจนกว่าจะฟื้นตัวเต็มที่ จากการวางยาสลบ
อุปกรณ์ส่งยา LV-MP ในตู้ชีวความปลอดภัย จะเห็นหัวต่อ Luer สีเทาอ่อนของท่อช่วยหายใจยื่นออกมาจากปาก และปลายเจลของปิเปตที่แสดงในภาพถูกสอดเข้าไปในท่อช่วยหายใจจนถึงระดับความลึกที่ต้องการในหลอดลม
หนึ่งสัปดาห์หลังจากการให้ยา LV-MP สัตว์ทดลองถูกฆ่าอย่างมีมนุษยธรรมโดยการสูดดมก๊าซ CO2 100% และประเมินการแสดงออกของ LacZ โดยใช้การรักษา X-gal มาตรฐานของเรา กระดูกอ่อนสามวงสุดท้ายที่อยู่ด้านท้ายสุดถูกนำออกเพื่อให้แน่ใจว่าความเสียหายทางกลหรือการกักเก็บของเหลวจากการใส่ท่อช่วยหายใจจะไม่รวมอยู่ในการวิเคราะห์ หลอดลมแต่ละอันถูกตัดตามยาวเพื่อสร้างสองส่วนสำหรับการวิเคราะห์ และถูกติดตั้งในจานที่มีซิลิโคนยาง (Sylgard, Dow Inc) โดยใช้เข็ม Minutien (Fine Science Tools) เพื่อให้เห็นพื้นผิวภายใน การกระจายและรูปแบบของเซลล์ที่ได้รับการถ่ายทอดได้รับการยืนยันโดยการถ่ายภาพด้านหน้าโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ Nikon (SMZ1500) พร้อมกล้อง DigiLite และซอฟต์แวร์ TCapture (Tucsen Photonics, ประเทศจีน) ภาพถูกถ่ายที่กำลังขยาย 20 เท่า (รวมถึงการตั้งค่าสูงสุดสำหรับความกว้างทั้งหมดของหลอดลม) โดยถ่ายภาพหลอดลมตลอดความยาวทีละขั้นตอน เพื่อให้แน่ใจว่ามีการทับซ้อนกันเพียงพอระหว่างแต่ละภาพ เพื่อให้สามารถ "ต่อภาพ" ได้ จากนั้นจึงนำภาพจากหลอดลมแต่ละอันมาประกอบกันเป็นภาพเดียวโดยใช้โปรแกรม Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) โดยใช้ขั้นตอนวิธีเคลื่อนที่แบบระนาบ พื้นที่การแสดงออกของ LacZ ในภาพผสมของหลอดลมจากสัตว์แต่ละตัวถูกวัดปริมาณโดยใช้สคริปต์ MATLAB อัตโนมัติ (R2020a, MathWorks) ตามที่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ โดยใช้การตั้งค่า 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15 และ Value < 0.7 โดยการลากเส้นขอบของเนื้อเยื่อ สร้างมาสก์ด้วยตนเองใน GIMP v2.10.24 สำหรับภาพผสมแต่ละภาพเพื่อระบุพื้นที่เนื้อเยื่อและป้องกันการตรวจจับผิดพลาดจากภายนอกเนื้อเยื่อหลอดลม พื้นที่ที่ย้อมสีจากภาพผสมทั้งหมดจากสัตว์แต่ละตัวถูกรวมเข้าด้วยกันเพื่อสร้างพื้นที่ที่ย้อมสีทั้งหมดสำหรับสัตว์ตัวนั้น จากนั้นจึงหารพื้นที่ที่ย้อมสีด้วยพื้นที่มาสก์ทั้งหมดเพื่อสร้างพื้นที่ที่ปรับให้เป็นมาตรฐาน
หลอดลมแต่ละอันถูกฝังในพาราฟินและตัดเป็นชิ้นส่วนขนาด 5 ไมโครเมตร ชิ้นส่วนถูกย้อมสีด้วยสีแดงนิวทรัลฟาสต์เรดเป็นเวลา 5 นาที และบันทึกภาพโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ Nikon Eclipse E400 กล้อง DS-Fi3 และซอฟต์แวร์จับภาพ NIS element (เวอร์ชัน 5.20.00)
การวิเคราะห์ทางสถิติทั้งหมดดำเนินการในโปรแกรม GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) กำหนดระดับนัยสำคัญทางสถิติไว้ที่ p ≤ 0.05 ตรวจสอบความปกติของข้อมูลโดยใช้การทดสอบ Shapiro-Wilk และประเมินความแตกต่างของการย้อมสี LacZ โดยใช้การทดสอบ t-test แบบไม่จับคู่
ไมโครพาร์ติเคิล (MP) ทั้งหกชนิดที่อธิบายไว้ในตารางที่ 1 ได้รับการตรวจสอบโดยใช้ PCXI และความสามารถในการมองเห็นได้อธิบายไว้ในตารางที่ 2 ไมโครพาร์ติเคิลโพลีสไตรีนสองชนิด (MP1 และ MP2; 18 μm และ 0.25 μm ตามลำดับ) ไม่สามารถมองเห็นได้ภายใต้ PCXI แต่ตัวอย่างที่เหลือสามารถระบุได้ (ตัวอย่างแสดงในรูปที่ 5) MP3 และ MP4 (10-15% Fe3O4; 0.25 μm และ 0.9 μm ตามลำดับ) สามารถมองเห็นได้จางๆ แม้ว่าจะมีอนุภาคขนาดเล็กที่สุดที่ทดสอบ แต่ MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) ก็เด่นชัดที่สุด ผลิตภัณฑ์ CombiMag MP6 นั้นยากที่จะมองเห็น ในทุกกรณี ความสามารถในการตรวจจับ MP ของเราได้รับการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญโดยการเลื่อนแม่เหล็กไปมาขนานกับหลอดแคปิลลารี เมื่อแม่เหล็กเคลื่อนออกห่างจากหลอดแคปิลลารี อนุภาคจะยืดออกเป็นสายยาว แต่เมื่อแม่เหล็กเข้าใกล้มากขึ้นและความแรงของสนามแม่เหล็กเพิ่มขึ้น สายอนุภาคก็จะสั้นลง อนุภาคแม่เหล็กจะสั้นลงเมื่อเคลื่อนที่ไปยังพื้นผิวด้านบนของหลอดแคปิลลารี (ดูวิดีโอเสริม S1: MP4) ทำให้ความหนาแน่นของอนุภาคบนพื้นผิวเพิ่มขึ้น ในทางกลับกัน เมื่อนำแม่เหล็กออกจากหลอดแคปิลลารี ความแรงของสนามแม่เหล็กจะลดลง และอนุภาคแม่เหล็กจะเรียงตัวใหม่เป็นสายยาวที่ยื่นออกมาจากพื้นผิวด้านบนของหลอดแคปิลลารี (ดูวิดีโอเสริม S2: MP4) หลังจากที่แม่เหล็กหยุดเคลื่อนที่ อนุภาคจะยังคงเคลื่อนที่ต่อไปอีกช่วงเวลาสั้นๆ หลังจากถึงตำแหน่งสมดุล ขณะที่อนุภาคแม่เหล็กเคลื่อนที่เข้าและออกจากพื้นผิวด้านบนของหลอดแคปิลลารี อนุภาคแม่เหล็กมักจะลากเศษสิ่งสกปรกผ่านของเหลว
การมองเห็น MP ภายใต้ PCXI แตกต่างกันอย่างมากระหว่างตัวอย่าง (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 และ (d) MP6 ภาพทั้งหมดที่แสดงในที่นี้ถ่ายด้วยแม่เหล็กที่อยู่เหนือหลอดแคปิลลารีโดยตรงประมาณ 10 มม. วงกลมขนาดใหญ่ที่ปรากฏคือฟองอากาศที่ติดอยู่ในหลอดแคปิลลารี ซึ่งแสดงให้เห็นลักษณะขอบสีดำและสีขาวของการถ่ายภาพคอนทราสต์เฟสอย่างชัดเจน กรอบสีแดงประกอบด้วยการขยายภาพเพื่อเพิ่มความคมชัด โปรดทราบว่าเส้นผ่านศูนย์กลางของแผนภาพแม่เหล็กในภาพทั้งหมดไม่ได้แสดงตามสเกลจริงและมีขนาดใหญ่กว่าที่แสดงประมาณ 100 เท่า
เมื่อเลื่อนแม่เหล็กไปทางซ้ายและขวาตามด้านบนของหลอดแคปิลลารี มุมของสาย MP จะเปลี่ยนไปเพื่อให้ตรงกับแม่เหล็ก (ดูรูปที่ 6) ทำให้เห็นเส้นสนามแม่เหล็กได้ชัดเจนขึ้น สำหรับ MP3-5 หลังจากที่คอร์ดถึงมุมเกณฑ์ อนุภาคจะถูกลากไปตามพื้นผิวด้านบนของหลอดแคปิลลารี ซึ่งมักส่งผลให้ MP รวมตัวกันเป็นกลุ่มใหญ่ขึ้นใกล้กับบริเวณที่สนามแม่เหล็กแรงที่สุด (ดูวิดีโอเสริม S3:MP5) สิ่งนี้เห็นได้ชัดเจนเป็นพิเศษเมื่อถ่ายภาพใกล้กับปลายหลอดแคปิลลารี ซึ่งทำให้ MP รวมตัวกันและกระจุกตัวอยู่ที่ส่วนต่อประสานระหว่างของเหลวกับอากาศ อนุภาคใน MP6 ซึ่งยากต่อการแยกแยะมากกว่า MP3-5 ไม่ได้ถูกลากไปพร้อมกับการเคลื่อนที่ของแม่เหล็กไปตามหลอดแคปิลลารี แต่สาย MP จะแยกตัวออก ทำให้เหลืออนุภาคอยู่ในบริเวณที่มองเห็น (ดูวิดีโอเสริม S4:MP6) ในบางกรณี เมื่อลดสนามแม่เหล็กที่ใช้โดยการเคลื่อนแม่เหล็กออกไปไกลจากตำแหน่งการถ่ายภาพ MP ที่เหลืออยู่จะค่อยๆ ตกลงสู่พื้นผิวด้านล่างของหลอดด้วยแรงโน้มถ่วงในขณะที่ยังคงอยู่ในสาย (ดูวิดีโอเสริม S5: MP3)
มุมของเส้น MP เปลี่ยนไปเมื่อเลื่อนแม่เหล็กไปทางขวาเหนือหลอดแคปิลลารี (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 และ (d) MP6 กรอบสีแดงประกอบด้วยภาพขยายเพื่อเพิ่มความคมชัด โปรดทราบว่าวิดีโอเสริมมีข้อมูลที่เป็นประโยชน์ เนื่องจากเผยให้เห็นโครงสร้างอนุภาคและข้อมูลไดนามิกที่สำคัญซึ่งไม่สามารถมองเห็นได้ในภาพนิ่งเหล่านี้
การทดสอบของเราแสดงให้เห็นว่า การเคลื่อนแม่เหล็กไปมาอย่างช้าๆ ตามหลอดลม ช่วยให้มองเห็น MP ในบริบทของการเคลื่อนไหวที่ซับซ้อนในร่างกายได้ง่ายขึ้น การทดสอบในร่างกายไม่ได้ดำเนินการ เนื่องจากลูกปัดโพลีสไตรีน (MP1 และ MP2) มองไม่เห็นในเส้นเลือดฝอย MP ที่เหลืออีกสี่ตัวได้รับการทดสอบในร่างกาย โดยจัดวางแกนยาวของแม่เหล็กไว้เหนือหลอดลมในมุมประมาณ 30° กับแนวตั้ง (ดูรูปที่ 2b และ 3a) เนื่องจากส่งผลให้สายโซ่ MP ยาวขึ้นและมีประสิทธิภาพมากกว่าการจัดวางแม่เหล็กแบบปลายสุด MP3, MP4 และ MP6 ไม่ถูกตรวจพบในหลอดลมของสัตว์มีชีวิตใดๆ เมื่อถ่ายภาพทางเดินหายใจของหนูหลังจากที่สัตว์ถูกฆ่าอย่างมีมนุษยธรรมแล้ว อนุภาคยังคงมองไม่เห็นแม้ว่าจะเพิ่มปริมาตรเพิ่มเติมโดยใช้ปั๊มฉีด MP5 มีปริมาณเหล็กออกไซด์สูงสุดและเป็นอนุภาคเดียวที่มองเห็นได้ ดังนั้นจึงใช้เพื่อประเมินและกำหนดลักษณะพฤติกรรมของ MP ในร่างกาย
การวางแม่เหล็กไว้เหนือหลอดลมระหว่างการคลอด MP ส่งผลให้ MP จำนวนมาก แต่ไม่ใช่ทั้งหมด กระจุกตัวอยู่ในบริเวณที่มองเห็นได้ อนุภาคที่เข้าสู่หลอดลมนั้นสังเกตได้ดีที่สุดในสัตว์ที่ถูกฆ่าอย่างมีมนุษยธรรม รูปที่ 7 และวิดีโอเสริม S6: MP5 แสดงให้เห็นถึงการจับและการเรียงตัวของอนุภาคบนพื้นผิวของหลอดลมส่วนท้องอย่างรวดเร็วด้วยสนามแม่เหล็ก ซึ่งบ่งชี้ว่าสามารถนำ MP ไปยังบริเวณที่ต้องการของหลอดลมได้ เมื่อค้นหาบริเวณที่อยู่ไกลออกไปตามหลอดลมหลังจากคลอด MP แล้ว พบว่า MP บางส่วนอยู่ใกล้กับกระดูกอ่อนหลอดลมมากขึ้น ซึ่งบ่งชี้ว่าความแรงของสนามแม่เหล็กไม่เพียงพอที่จะรวบรวมและกักเก็บ MP ทั้งหมด เนื่องจาก MP ถูกส่งผ่านบริเวณที่มีความแรงของสนามแม่เหล็กสูงสุดในระหว่างกระบวนการของเหลว อย่างไรก็ตาม ความเข้มข้นของ MP หลังคลอดนั้นสูงกว่าบริเวณที่ถ่ายภาพ ซึ่งบ่งชี้ว่า MP จำนวนมากยังคงอยู่ในบริเวณทางเดินหายใจที่ความแรงของสนามแม่เหล็กที่ใช้สูงที่สุด
ภาพจาก (ก) ก่อนและ (ข) หลังการส่ง MP5 เข้าไปในหลอดลมของหนูที่เพิ่งถูกทำการุณยฆาต โดยวางแม่เหล็กไว้เหนือบริเวณที่ถ่ายภาพโดยตรง บริเวณที่ถ่ายภาพอยู่ระหว่างกระดูกอ่อนสองวง ก่อนการส่ง MP5 จะมีของเหลวอยู่ในทางเดินหายใจ กรอบสีแดงแสดงภาพขยายเพื่อเพิ่มความคมชัด ภาพเหล่านี้มาจากวิดีโอที่แสดงในวิดีโอเสริม S6:MP5
การเคลื่อนแม่เหล็กไปตามหลอดลมในร่างกายทำให้สาย MP เปลี่ยนมุมภายในพื้นผิวทางเดินหายใจในลักษณะที่คล้ายกับที่พบในเส้นเลือดฝอย (ดูรูปที่ 8 และวิดีโอเสริม S7:MP5) อย่างไรก็ตาม ในการศึกษาของเรา ไม่สามารถลาก MP ไปตามพื้นผิวของทางเดินหายใจที่มีชีวิตได้เหมือนกับที่เกิดขึ้นในเส้นเลือดฝอย ในบางกรณี สาย MP จะยาวขึ้นเมื่อแม่เหล็กเคลื่อนไปทางซ้ายและขวา ที่น่าสนใจคือ เรายังพบว่าสายอนุภาคดูเหมือนจะเปลี่ยนความลึกของชั้นของเหลวบนพื้นผิวเมื่อแม่เหล็กเคลื่อนไปตามแนวยาวของหลอดลม และขยายตัวเมื่อแม่เหล็กเคลื่อนไปอยู่เหนือศีรษะโดยตรงและสายอนุภาคหมุนไปอยู่ในตำแหน่งแนวตั้ง (ดูวิดีโอเสริม S7) (MP5 ที่ 0:09 มุมล่างขวา) รูปแบบการเคลื่อนที่ที่เป็นลักษณะเฉพาะเปลี่ยนไปเมื่อเลื่อนแม่เหล็กไปตามส่วนบนของหลอดลมในแนวด้านข้าง (นั่นคือ ไปทางซ้ายหรือขวาของสัตว์ แทนที่จะไปตามความยาวของหลอดลม) อนุภาคยังคงมองเห็นได้ชัดเจนขณะเคลื่อนที่ แต่เมื่อนำแม่เหล็กออกจากหลอดลม ปลายของสายอนุภาคก็ปรากฏให้เห็น (ดูวิดีโอเสริม S8:MP5 เริ่มต้นที่ 0:08) ซึ่งสอดคล้องกับพฤติกรรมของ MP ที่เราสังเกตเห็นภายใต้สนามแม่เหล็กที่ใช้ในหลอดแก้วขนาดเล็ก
ภาพตัวอย่างแสดง MP5 ในหลอดลมของหนูทดลองที่ยังมีชีวิตอยู่และได้รับการวางยาสลบ (a) ใช้แม่เหล็กในการถ่ายภาพเหนือและด้านซ้ายของหลอดลม จากนั้น (b) หลังจากเลื่อนแม่เหล็กไปทางขวา กรอบสีแดงแสดงการขยายภาพเพื่อเพิ่มความคมชัด ภาพเหล่านี้มาจากวิดีโอที่แสดงในวิดีโอเสริม S7:MP5
เมื่อขั้วแม่เหล็กทั้งสองถูกจัดวางในแนวเหนือ-ใต้ เหนือและใต้หลอดลม (เช่น ดึงดูดกัน; รูปที่ 3b) เส้นใย MP จะดูยาวขึ้นและอยู่บนผนังด้านข้างของหลอดลมแทนที่จะอยู่บนพื้นผิวด้านหลังของหลอดลม (ดูวิดีโอเสริม S9:MP5) อย่างไรก็ตาม ไม่พบอนุภาคที่มีความเข้มข้นสูงในตำแหน่งเดียว (เช่น พื้นผิวด้านหลังของหลอดลม) หลังจากการให้ของเหลวเมื่อใช้อุปกรณ์แม่เหล็กคู่ ซึ่งโดยทั่วไปจะเกิดขึ้นเมื่อใช้อุปกรณ์แม่เหล็กเดี่ยว จากนั้นเมื่อจัดวางแม่เหล็กตัวหนึ่งให้ผลักกันโดยสลับขั้ว (รูปที่ 3c) จำนวนอนุภาคที่มองเห็นได้ในบริเวณที่มองเห็นดูเหมือนจะไม่เพิ่มขึ้นหลังจากการให้ของเหลว การตั้งค่าการกำหนดค่าแม่เหล็กคู่ทั้งสองแบบนั้นมีความท้าทายเนื่องจากความแรงของสนามแม่เหล็กสูงที่ดึงหรือผลักแม่เหล็กตามลำดับ จากนั้นจึงเปลี่ยนการตั้งค่าเป็นแม่เหล็กเดี่ยวขนานกับทางเดินหายใจ แต่ผ่านทางเดินหายใจที่มุม 90 องศา เพื่อให้เส้นสนามแม่เหล็กตัดกับผนังหลอดลม ในแนวตั้งฉาก (รูปที่ 3d) ซึ่งเป็นทิศทางที่ออกแบบมาเพื่อตรวจสอบว่าสามารถสังเกตการรวมตัวของอนุภาคบนผนังด้านข้างได้หรือไม่ อย่างไรก็ตาม ในการกำหนดค่านี้ ไม่พบการเคลื่อนที่ของการสะสมของ MP หรือการเคลื่อนที่ของแม่เหล็กที่สามารถระบุได้ จากผลลัพธ์ทั้งหมดนี้ จึงเลือกการกำหนดค่าแม่เหล็กเดี่ยวในมุม 30 องศา (รูปที่ 3a) สำหรับการศึกษาตัวนำยีนในร่างกาย
เมื่อทำการถ่ายภาพสัตว์ซ้ำๆ ทันทีหลังจากทำการุณยฆาต การที่ไม่มีการเคลื่อนไหวของเนื้อเยื่อที่อาจรบกวน ทำให้สามารถมองเห็นเส้นอนุภาคที่ละเอียดและสั้นกว่าได้ในบริเวณระหว่างกระดูกอ่อนที่ชัดเจน โดยมีลักษณะ "สั่นไหว" ไปตามการเคลื่อนที่ของแม่เหล็ก อย่างไรก็ตาม ก็ยังไม่สามารถมองเห็นการปรากฏและการเคลื่อนที่ของอนุภาค MP6 ได้อย่างชัดเจน
ความเข้มข้นของ LV-LacZ คือ 1.8 × 10⁸ TU/ml และหลังจากผสมกับ CombiMag MP (MP6) ในอัตราส่วน 1:1 สัตว์ทดลองได้รับยา LV vehicle ปริมาณ 50 μl ทางหลอดลม ความเข้มข้น 9 × 10⁷ TU/ml (เช่น 4.5 × 10⁶ TU/หนู) ในการศึกษาเหล่านี้ แทนที่จะเคลื่อนย้ายแม่เหล็กในระหว่างการคลอด เราได้ตรึงแม่เหล็กไว้ในตำแหน่งเดียวเพื่อตรวจสอบว่าการถ่ายทอด LV (ก) สามารถปรับปรุงได้เมื่อเทียบกับการส่งเวกเตอร์ในกรณีที่ไม่มีสนามแม่เหล็ก และ (ข) สามารถโฟกัสเซลล์ทางเดินหายใจไปยังบริเวณเป้าหมายแม่เหล็กของทางเดินหายใจส่วนบนได้หรือไม่
การมีอยู่ของแม่เหล็กและการใช้ CombiMag ร่วมกับเวกเตอร์ LV ดูเหมือนจะไม่มีผลเสียต่อสุขภาพของสัตว์ เช่นเดียวกับโปรโตคอลการส่งเวกเตอร์ LV มาตรฐานของเรา ภาพด้านหน้าของบริเวณหลอดลมที่ถูกรบกวนทางกล (ภาพประกอบเพิ่มเติมที่ 1) แสดงให้เห็นว่ามีระดับการถ่ายทอดสัญญาณที่สูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่มสัตว์ที่ได้รับการรักษาด้วย LV-MP เมื่อมีแม่เหล็กอยู่ (รูปที่ 9a) มีเพียงปริมาณเล็กน้อยของการย้อมสี LacZ สีน้ำเงินในกลุ่มควบคุม (รูปที่ 9b) การวัดปริมาณพื้นที่ที่ย้อมด้วย X-Gal ที่ทำให้เป็นมาตรฐานแสดงให้เห็นว่าการให้ LV-MP ในขณะที่มีสนามแม่เหล็กทำให้เกิดการปรับปรุงประมาณ 6 เท่า (รูปที่ 9c)
ภาพประกอบตัวอย่างแสดงการถ่ายทอดสัญญาณของหลอดลมโดย LV-MP (a) ในสภาวะที่มีสนามแม่เหล็ก และ (b) ในสภาวะที่ไม่มีสนามแม่เหล็ก (c) พบว่ามีการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติในพื้นที่การถ่ายทอดสัญญาณ LacZ ที่เป็นมาตรฐานภายในหลอดลมเมื่อใช้สนามแม่เหล็ก (*p = 0.029, การทดสอบ t, n = 3 ต่อกลุ่ม, ค่าเฉลี่ย ± ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน)
ส่วนตัดที่ย้อมด้วยสีแดงฟาสต์กลาง (ตัวอย่างแสดงในรูปที่ 2 ในเอกสารประกอบ) แสดงให้เห็นว่าเซลล์ที่ย้อมด้วย LacZ ปรากฏอยู่ในรูปแบบและตำแหน่งที่คล้ายคลึงกับที่เคยรายงานไว้ก่อนหน้านี้
ความท้าทายสำคัญสำหรับการบำบัดยีนในทางเดินหายใจยังคงอยู่ที่การกำหนดตำแหน่งที่แม่นยำของอนุภาคพาหะไปยังบริเวณที่สนใจ และการบรรลุประสิทธิภาพการถ่ายทอดยีนในระดับสูงในปอดที่เคลื่อนไหวในขณะที่มีการไหลเวียนของอากาศและการกำจัดเสมหะอย่างมีประสิทธิภาพ สำหรับพาหะ LV ที่ออกแบบมาเพื่อรักษาโรคทางเดินหายใจ CF การเพิ่มระยะเวลาการคงอยู่ของอนุภาคพาหะภายในทางเดินหายใจเป็นเป้าหมายที่ยากจะบรรลุมาจนถึงปัจจุบัน ดังที่ Castellani และคณะได้ชี้ให้เห็น การใช้สนามแม่เหล็กเพื่อปรับปรุงการถ่ายทอดยีนมีข้อดีเมื่อเทียบกับวิธีการส่งยีนอื่นๆ เช่น อิเล็กโทรโพเรชัน เนื่องจากสามารถรวมความเรียบง่าย ประหยัดค่าใช้จ่าย การกำหนดตำแหน่งการส่ง การเพิ่มประสิทธิภาพ และระยะเวลาการบ่มที่สั้นลง และอาจใช้ปริมาณพาหะที่น้อยลง¹⁰ อย่างไรก็ตาม การตกตะกอนและการทำงานของอนุภาคแม่เหล็กในทางเดินหายใจในร่างกายภายใต้อิทธิพลของแรงแม่เหล็กภายนอกยังไม่เคยมีการอธิบายมาก่อน และความเป็นไปได้ของวิธีการนี้ยังไม่ได้รับการพิสูจน์ในร่างกายเพื่อเพิ่มระดับการแสดงออกของยีนในทางเดินหายใจที่มีชีวิตอย่างสมบูรณ์
การทดลอง PCXI ในหลอดทดลองด้วยซินโครตรอนของเราแสดงให้เห็นว่าอนุภาคทั้งหมดที่เราทดสอบ ยกเว้นโพลีสไตรีน MP สามารถมองเห็นได้ในระบบการถ่ายภาพที่เราใช้ ในสภาวะที่มีสนามแม่เหล็ก MP จะก่อตัวเป็นสายที่มีความยาวสัมพันธ์กับชนิดของอนุภาคและความแรงของสนามแม่เหล็ก (เช่น ความใกล้ชิดและการเคลื่อนที่ของแม่เหล็ก) ดังแสดงในรูปที่ 10 สายที่เราสังเกตเห็นนั้นเกิดขึ้นเนื่องจากอนุภาคแต่ละตัวถูกทำให้เป็นแม่เหล็กและเหนี่ยวนำให้เกิดสนามแม่เหล็กเฉพาะที่ของตัวเอง สนามแม่เหล็กที่แยกจากกันเหล่านี้ทำให้เกิดการรวมตัวและเชื่อมต่อกันของอนุภาคที่คล้ายกัน โดยมีการเคลื่อนที่แบบกลุ่มคล้ายสายเนื่องจากแรงเฉพาะที่จากแรงดึงดูดและแรงผลักเฉพาะที่ของอนุภาคอื่นๆ
แผนภาพแสดง (a,b) กลุ่มอนุภาคที่เกิดขึ้นภายในหลอดเลือดฝอยที่เต็มไปด้วยของเหลว และ (c,d) หลอดลมที่เต็มไปด้วยอากาศ โปรดสังเกตว่าหลอดเลือดฝอยและหลอดลมไม่ได้วาดตามสเกลจริง แผง (a) ยังมีคำอธิบายของ MP ซึ่งประกอบด้วยอนุภาค Fe3O4 ที่เรียงตัวเป็นเส้น
เมื่อเคลื่อนแม่เหล็กไปเหนือหลอดแคปิลลารี มุมของสายอนุภาคจะถึงเกณฑ์วิกฤตสำหรับ MP3-5 ที่มี Fe3O4 หลังจากนั้นสายอนุภาคจะไม่คงอยู่ที่ตำแหน่งเดิมอีกต่อไป แต่จะเคลื่อนที่ไปตามพื้นผิวไปยังตำแหน่งใหม่ ปรากฏการณ์นี้มีแนวโน้มที่จะเกิดขึ้นเนื่องจากพื้นผิวของหลอดแคปิลลารีแก้วเรียบพอที่จะทำให้เกิดการเคลื่อนที่นี้ได้ ที่น่าสนใจคือ MP6 (CombiMag) ไม่ได้แสดงพฤติกรรมเช่นนี้ อาจเป็นเพราะอนุภาคมีขนาดเล็กกว่า มีการเคลือบหรือประจุบนพื้นผิวที่แตกต่างกัน หรือของเหลวตัวนำที่เป็นกรรมสิทธิ์ส่งผลต่อความสามารถในการเคลื่อนที่ของอนุภาค ความคมชัดของภาพของอนุภาค CombiMag ก็อ่อนกว่าเช่นกัน ซึ่งบ่งชี้ว่าของเหลวและอนุภาคอาจมีความหนาแน่นใกล้เคียงกันและดังนั้นจึงไม่เคลื่อนที่เข้าหากันได้ง่าย อนุภาคอาจติดอยู่ได้หากแม่เหล็กเคลื่อนที่เร็วเกินไป ซึ่งบ่งชี้ว่าความแรงของสนามแม่เหล็กไม่สามารถเอาชนะแรงเสียดทานระหว่างอนุภาคในของเหลวได้เสมอไป ซึ่งอาจไม่ใช่เรื่องน่าแปลกใจที่ความแรงของสนามแม่เหล็กและระยะห่างระหว่างแม่เหล็กกับบริเวณเป้าหมายมีความสำคัญมาก โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์เหล่านี้ยังชี้ให้เห็นว่า ในขณะที่แม่เหล็กสามารถจับ MP จำนวนมากที่ไหลผ่านได้ เนื่องจากบริเวณเป้าหมายนั้น เป็นไปได้ยากที่จะใช้แม่เหล็กในการเคลื่อนย้ายอนุภาค CombiMag ไปตามพื้นผิวของหลอดลม ดังนั้น เราจึงสรุปได้ว่า การศึกษา LV-MP ในร่างกายควรใช้สนามแม่เหล็กสถิตเพื่อกำหนดเป้าหมายไปยังบริเวณเฉพาะของทางเดินหายใจ
เมื่ออนุภาคถูกส่งเข้าไปในร่างกาย การระบุอนุภาคเหล่านั้นทำได้ยากในบริบทของเนื้อเยื่อร่างกายที่เคลื่อนไหวซับซ้อน แต่ความสามารถในการตรวจจับอนุภาคได้รับการปรับปรุงให้ดีขึ้นโดยการเลื่อนแม่เหล็กในแนวนอนเหนือหลอดลมเพื่อ "ขยับ" เส้นใยของไมโครพาร์ติเคิล แม้ว่าการถ่ายภาพขณะมีชีวิตจะทำได้ แต่การแยกแยะการเคลื่อนที่ของอนุภาคจะง่ายกว่าเมื่อสัตว์ถูกฆ่าอย่างมีมนุษยธรรมแล้ว ความเข้มข้นของไมโครพาร์ติเคิลโดยทั่วไปจะสูงที่สุด ณ ตำแหน่งนี้เมื่อวางแม่เหล็กไว้เหนือบริเวณที่ถ่ายภาพ แม้ว่าโดยปกติแล้วจะพบอนุภาคบางส่วนอยู่ไกลออกไปตามหลอดลมก็ตาม ในทางตรงกันข้ามกับการศึกษาในหลอดทดลอง อนุภาคไม่สามารถถูกลากไปตามหลอดลมได้โดยการเลื่อนแม่เหล็ก ผลการค้นหานี้สอดคล้องกับวิธีการที่เมือกที่เคลือบผิวของหลอดลมประมวลผลอนุภาคที่สูดดมเข้าไป โดยดักจับอนุภาคเหล่านั้นไว้ในเมือกและถูกกำจัดออกไปในภายหลังโดยกลไกการกำจัดเมือกด้วยขนซีเลีย
เราตั้งสมมติฐานว่าการใช้แม่เหล็กเพื่อดึงดูดทั้งด้านบนและด้านล่างของหลอดลม (รูปที่ 3b) อาจส่งผลให้สนามแม่เหล็กมีความสม่ำเสมอมากขึ้น แทนที่จะเป็นสนามแม่เหล็กที่มีความเข้มข้นสูง ณ จุดใดจุดหนึ่ง ซึ่งอาจนำไปสู่การกระจายตัวของอนุภาคที่สม่ำเสมอยิ่งขึ้น อย่างไรก็ตาม การศึกษาเบื้องต้นของเราไม่พบหลักฐานที่ชัดเจนเพื่อสนับสนุนสมมติฐานนี้ ในทำนองเดียวกัน การจัดเรียงแม่เหล็กคู่หนึ่งให้ผลักกัน (รูปที่ 3c) ก็ไม่ได้ส่งผลให้มีการสะสมของอนุภาคในบริเวณที่ถ่ายภาพมากขึ้น ผลการค้นพบทั้งสองนี้แสดงให้เห็นว่าการตั้งค่าแม่เหล็กคู่ไม่ได้ช่วยปรับปรุงการควบคุมการกำหนดเป้าหมายของ MP ในระดับท้องถิ่นอย่างมีนัยสำคัญ และแรงแม่เหล็กที่เกิดขึ้นนั้นยากต่อการกำหนดค่า ทำให้วิธีการนี้ไม่ค่อยได้ผลในทางปฏิบัติ ในทำนองเดียวกัน การวางแนวแม่เหล็กเหนือและผ่านหลอดลม (รูปที่ 3d) ก็ไม่ได้เพิ่มจำนวนอนุภาคที่คงอยู่ในบริเวณที่ถ่ายภาพเช่นกัน การกำหนดค่าทางเลือกบางอย่างอาจไม่ประสบความสำเร็จเนื่องจากส่งผลให้ความแรงของสนามแม่เหล็กในบริเวณการสะสมลดลง ดังนั้น การกำหนดค่าแม่เหล็กเดี่ยวที่ทำมุม 30 องศา (รูปที่ 3a) จึงถูกพิจารณา เป็นวิธีที่ง่ายและมีประสิทธิภาพที่สุดสำหรับการทดสอบในร่างกาย (in vivo testing)
การศึกษา LV-MP แสดงให้เห็นว่า เมื่อเวกเตอร์ LV ถูกรวมเข้ากับ CombiMag และส่งเข้าไปหลังจากมีการรบกวนทางกายภาพในขณะที่มีสนามแม่เหล็ก ระดับการถ่ายทอดยีนจะเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในหลอดลมเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม จากการศึกษาภาพซินโครตรอนและผลลัพธ์ของ LacZ เห็นได้ชัดว่าสนามแม่เหล็กสามารถรักษา LV ให้อยู่ภายในหลอดลมและลดจำนวนอนุภาคเวกเตอร์ที่แทรกซึมลึกเข้าไปในปอดได้ทันที การปรับปรุงการกำหนดเป้าหมายดังกล่าวอาจนำไปสู่ประสิทธิภาพที่สูงขึ้นในขณะที่ลดปริมาณการส่งมอบ การถ่ายทอดยีนนอกเป้าหมาย ผลข้างเคียงจากการอักเสบและภูมิคุ้มกัน และต้นทุนของตัวนำส่งยีน ที่สำคัญ ตามที่ผู้ผลิตระบุ CombiMag สามารถใช้ร่วมกับวิธีการถ่ายทอดยีนอื่นๆ ได้ รวมถึงเวกเตอร์ไวรัสอื่นๆ (เช่น AAV) และกรดนิวคลีอิก