ขอขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.com เวอร์ชันเบราว์เซอร์ที่คุณใช้มีการรองรับ CSS อย่างจำกัด เพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดตแล้ว (หรือปิดโหมดการทำงานร่วมกันใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้มั่นใจว่ามีการรองรับอย่างต่อเนื่อง เราจะแสดงไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
ยีนเวกเตอร์สำหรับการรักษาโรคปอดจากโรคซีสต์ไฟบรซีสควรตั้งเป้าไปที่ทางเดินหายใจที่มีการนำไฟฟ้า เนื่องจากการถ่ายโอนสัญญาณไปยังปอดส่วนปลายไม่ได้ให้ประโยชน์ในการบำบัด ประสิทธิภาพการถ่ายโอนไวรัสเกี่ยวข้องโดยตรงกับเวลาที่เวกเตอร์อยู่ในอากาศ อย่างไรก็ตาม ของเหลวที่ส่งผ่าน เช่น ตัวพายีนจะแพร่กระจายไปยังถุงลมตามธรรมชาติในระหว่างการสูดดม และอนุภาคที่ใช้ในการรักษาในรูปแบบใดๆ ก็ตามจะถูกกำจัดออกอย่างรวดเร็วด้วยการขนส่งเมือก การยืดเวลาที่ตัวพายีนอยู่ในอากาศเป็นสิ่งสำคัญแต่ทำได้ยาก อนุภาคแม่เหล็กที่จับคู่ตัวพายีนซึ่งสามารถส่งไปยังพื้นผิวของทางเดินหายใจได้สามารถปรับปรุงการกำหนดเป้าหมายตามภูมิภาคได้ เนื่องจากความท้าทายในการมองเห็นในร่างกาย พฤติกรรมของอนุภาคแม่เหล็กขนาดเล็กดังกล่าวบนพื้นผิวทางเดินหายใจในที่ที่มีสนามแม่เหล็กที่ใช้จึงยังไม่เป็นที่เข้าใจดีนัก จุดมุ่งหมายของการศึกษานี้คือการใช้การถ่ายภาพซินโครตรอนเพื่อแสดงภาพการเคลื่อนที่ในร่างกายของอนุภาคแม่เหล็กชุดหนึ่งในหลอดลมของหนูที่ได้รับยาสลบ เพื่อตรวจสอบพลวัตและรูปแบบของพฤติกรรมของอนุภาคเดี่ยวและอนุภาคจำนวนมากในร่างกาย จากนั้น เราจึงประเมินด้วยว่า การนำส่งอนุภาคแม่เหล็กเลนติไวรัสในที่ที่มีสนามแม่เหล็กจะช่วยเพิ่มประสิทธิภาพการถ่ายโอนข้อมูลในหลอดลมของหนู การถ่ายภาพเอกซเรย์ซินโครตรอนเผยให้เห็นพฤติกรรมของอนุภาคแม่เหล็กในสนามแม่เหล็กคงที่และเคลื่อนที่ทั้งในหลอดทดลองและในร่างกาย ไม่สามารถลากอนุภาคไปตามพื้นผิวของทางเดินหายใจของสิ่งมีชีวิตได้อย่างง่ายดายด้วยแม่เหล็ก แต่ในระหว่างการขนส่ง ตะกอนจะกระจุกตัวอยู่ในระยะที่มองเห็นซึ่งสนามแม่เหล็กแรงที่สุด ประสิทธิภาพในการถ่ายโอนข้อมูลยังเพิ่มขึ้นหกเท่าเมื่อนำส่งอนุภาคแม่เหล็กเลนติไวรัสในที่ที่มีสนามแม่เหล็ก เมื่อนำส่งอนุภาคแม่เหล็กเลนติไวรัสในที่ที่มีสนามแม่เหล็ก ผลลัพธ์เหล่านี้ร่วมกันชี้ให้เห็นว่าอนุภาคแม่เหล็กเลนติไวรัสและสนามแม่เหล็กอาจเป็นแนวทางที่มีค่าในการปรับปรุงการกำหนดเป้าหมายยีนเวกเตอร์และเพิ่มระดับการถ่ายโอนข้อมูลในทางเดินหายใจที่มีตัวนำในร่างกาย
โรคซีสต์ไฟบรซีส (CF) เกิดจากการเปลี่ยนแปลงในยีนเดี่ยวที่เรียกว่าตัวควบคุมการนำไฟฟ้าทรานส์เมมเบรนของ CF (CFTR) โปรตีน CFTR เป็นช่องไอออนที่มีอยู่ในเซลล์เยื่อบุผิวจำนวนมากทั่วร่างกาย รวมทั้งทางเดินหายใจที่มีการนำไฟฟ้า ซึ่งเป็นบริเวณสำคัญของการเกิดโรค CF ข้อบกพร่องของ CFTR นำไปสู่การขนส่งน้ำที่ผิดปกติ ทำให้พื้นผิวทางเดินหายใจขาดน้ำ และความลึกของชั้นของเหลวบนพื้นผิวทางเดินหายใจ (ASL) ลดลง นอกจากนี้ยังส่งผลต่อความสามารถของระบบการขนส่งเมือก (MCT) ในการกำจัดอนุภาคและเชื้อโรคที่สูดดมเข้าไปในทางเดินหายใจ เป้าหมายของเราคือการพัฒนาการบำบัดด้วยยีนเลนติไวรัส (LV) เพื่อส่งมอบยีน CFTR สำเนาที่ถูกต้อง และปรับปรุง ASL, MCT และสุขภาพปอด และเพื่อพัฒนาเทคโนโลยีใหม่ๆ ที่สามารถวัดพารามิเตอร์เหล่านี้ได้ในร่างกายต่อไป1
เวกเตอร์ LV เป็นหนึ่งในผู้สมัครชั้นนำสำหรับยีนบำบัดทางเดินหายใจ CF เนื่องจากสามารถผสานยีนบำบัดเข้ากับเซลล์ฐานของทางเดินหายใจ (เซลล์ต้นกำเนิดของทางเดินหายใจ) ได้อย่างถาวร ซึ่งถือเป็นสิ่งสำคัญเนื่องจากสามารถฟื้นฟูการเติมน้ำและการกำจัดเมือกให้เป็นปกติได้โดยการแยกตัวเป็นเซลล์พื้นผิวทางเดินหายใจที่เกี่ยวข้องกับ CF ที่ได้รับการแก้ไขยีนที่ทำงานได้ ส่งผลให้มีประโยชน์ตลอดชีวิตเวกเตอร์ LV ควรมุ่งเป้าไปที่ทางเดินหายใจที่มีการนำไฟฟ้า เนื่องจากเป็นจุดเริ่มต้นของโรคปอด CF การส่งเวกเตอร์เข้าไปในปอดลึกขึ้นอาจส่งผลให้เกิดการถ่ายโอนสัญญาณไปยังถุงลม แต่สิ่งนี้ไม่มีประโยชน์ในการบำบัดใน CF อย่างไรก็ตาม ของเหลว เช่น ตัวพายีนจะอพยพไปยังถุงลมตามธรรมชาติเมื่อหายใจเข้าหลังจากส่ง3,4 และอนุภาคบำบัดจะถูกกำจัดออกอย่างรวดเร็วในช่องปากโดย MCT ประสิทธิภาพการถ่ายโอนสัญญาณ LV เกี่ยวข้องโดยตรงกับระยะเวลาที่เวกเตอร์อยู่ถัดจากเซลล์เป้าหมายเพื่อให้เซลล์ดูดซึมได้ ซึ่งก็คือ "ระยะเวลาที่เซลล์อยู่"5 ซึ่งลดลงได้ง่ายจากการไหลของอากาศในภูมิภาคทั่วไป รวมถึงอนุภาคที่ประสานกัน การจับเมือกและ MCT สำหรับ CF ความสามารถในการยืดระยะเวลาการคงอยู่ของ LV ในทางเดินหายใจเป็นสิ่งสำคัญเพื่อให้เกิดการถ่ายโอนระดับสูงในบริเวณนี้ แต่จนถึงขณะนี้ยังถือเป็นเรื่องท้าทาย
เพื่อเอาชนะอุปสรรคนี้ เราขอแนะนำว่าอนุภาคแม่เหล็ก LV (MPs) อาจช่วยได้ในสองวิธีที่เสริมกัน ประการแรก อนุภาคแม่เหล็กเหล่านี้สามารถนำทางไปยังพื้นผิวทางเดินหายใจด้วยแม่เหล็กเพื่อปรับปรุงการกำหนดเป้าหมายและช่วยให้อนุภาคตัวพายีนอยู่ในบริเวณทางเดินหายใจที่ต้องการได้ และ ASL) เพื่อเคลื่อนไปที่ชั้นเซลล์ 6 MPs ถูกใช้กันอย่างแพร่หลายในฐานะพาหนะนำส่งยาแบบกำหนดเป้าหมายเมื่อจับกับแอนติบอดี ยาเคมีบำบัด หรือโมเลกุลขนาดเล็กอื่นๆ ที่จับกับเยื่อหุ้มเซลล์ หรือจับกับตัวรับบนพื้นผิวเซลล์ที่เกี่ยวข้อง และสะสมที่บริเวณเนื้องอกในสภาวะที่มีไฟฟ้าสถิตย์ สนามแม่เหล็กสำหรับการรักษามะเร็ง 7. เทคนิค "ไฮเปอร์เทอร์มอล" อื่นๆ มุ่งหวังที่จะให้ MP ร้อนขึ้นเมื่อสัมผัสกับสนามแม่เหล็กที่แกว่งไปมา จึงทำลายเซลล์เนื้องอกได้ หลักการของการถ่ายยีนด้วยแม่เหล็ก ซึ่งใช้สนามแม่เหล็กเป็นตัวแทนการถ่ายยีนเพื่อเพิ่มการถ่ายโอน DNA ไปยังเซลล์ มักใช้ในหลอดทดลองโดยใช้เวกเตอร์ยีนที่ไม่ใช่ไวรัสและไวรัสสำหรับสายเซลล์ที่ถ่ายยีนได้ยาก ประสิทธิภาพของการถ่ายโอนแมกนีโตรไฟต์ LV ได้รับการพิสูจน์แล้ว โดยการส่ง LV-MP ในหลอดทดลองไปยังสายเซลล์เยื่อบุหลอดลมของมนุษย์ในสภาพที่มีสนามแม่เหล็กคงที่ ทำให้ประสิทธิภาพการถ่ายโอนเพิ่มขึ้น 186 เท่าเมื่อเทียบกับการใช้เวกเตอร์ LV เพียงอย่างเดียว LV-MP ยังถูกนำไปใช้กับแบบจำลอง CF ในหลอดทดลอง ซึ่งการถ่ายยีนด้วยแม่เหล็กจะเพิ่มการถ่ายโอน LV ในวัฒนธรรมอินเทอร์เฟซอากาศ-ของเหลว 20 เท่าในกรณีที่มีเสมหะ CF10 อย่างไรก็ตาม การถ่ายโอนแมกนีโตรไฟต์ในร่างกายของอวัยวะได้รับความสนใจค่อนข้างน้อย และมีการประเมินในสัตว์เพียงไม่กี่ตัวเท่านั้น การศึกษา11,12,13,14,15 โดยเฉพาะในปอด16,17 อย่างไรก็ตาม โอกาสของการถ่ายยีนด้วยแม่เหล็กในการบำบัดปอดจาก CF นั้นชัดเจน Tan et al.(2020) กล่าวว่า “การศึกษาแนวคิดการพิสูจน์ประสิทธิภาพในการส่งอนุภาคแม่เหล็กนาโนไปยังปอดอย่างมีประสิทธิภาพจะปูทางไปสู่กลยุทธ์การสูดดม CFTR ในอนาคตเพื่อปรับปรุงผลลัพธ์ทางคลินิกในผู้ป่วย CF”6
พฤติกรรมของอนุภาคแม่เหล็กขนาดเล็กบนพื้นผิวทางเดินหายใจเมื่อมีสนามแม่เหล็กเข้ามาเกี่ยวข้องนั้นยากที่จะมองเห็นและศึกษา และด้วยเหตุนี้จึงเข้าใจได้น้อย ในการศึกษาวิจัยอื่น ๆ เราได้พัฒนาวิธีถ่ายภาพรังสีเอกซ์แบบคอนทราสต์เฟสโดยอาศัยการแพร่กระจายซินโครตรอน (PB-PCXI) เพื่อสร้างภาพและวัดการเปลี่ยนแปลงเล็กน้อยในร่างกายแบบไม่รุกรานในความลึก ASL18 และพฤติกรรม MCT19,20 เพื่อวัดความชื้นของพื้นผิวท่อลมโดยตรง และใช้เป็นตัวบ่งชี้ประสิทธิผลของการรักษาในระยะเริ่มต้น นอกจากนี้ วิธีการประเมิน MCT ของเรายังใช้อนุภาคที่มีเส้นผ่านศูนย์กลาง 10–35 ไมโครเมตรที่ประกอบด้วยอะลูมินาหรือแก้วที่มีดัชนีหักเหแสงสูงเป็นเครื่องหมาย MCT ที่มองเห็นได้โดยใช้ PB-PCXI21 ทั้งสองเทคนิคนี้เหมาะสำหรับการสร้างภาพอนุภาคหลายประเภท รวมทั้ง MP
เนื่องจากความละเอียดเชิงพื้นที่และเวลาสูง เทคนิคการวิเคราะห์ ASL และ MCT ตาม PB-PCXI ของเราจึงเหมาะอย่างยิ่งสำหรับการตรวจสอบพลวัตและรูปแบบของพฤติกรรมของอนุภาคเดี่ยวและอนุภาคจำนวนมากในร่างกาย เพื่อช่วยให้เราเข้าใจและปรับเทคนิคการส่งยีน MP ให้เหมาะสม วิธีการที่เราใช้ที่นี่ได้มาจากการศึกษาของเราโดยใช้บีมไลน์ SPring-8 BL20B2 ซึ่งเราสร้างภาพการเคลื่อนที่ของของไหลภายหลังการส่งปริมาณเวกเตอร์หลอกเข้าไปในทางเดินหายใจทางจมูกและปอดของหนู เพื่อช่วยอธิบายรูปแบบการแสดงออกของยีนที่ไม่สม่ำเสมอที่สังเกตได้ในการศึกษาสัตว์ที่ได้รับปริมาณยีนพาหะของเรา 3,4
วัตถุประสงค์ของการศึกษานี้คือการใช้ซินโครตรอน PB-PCXI เพื่อแสดงภาพการเคลื่อนไหวของ MP ชุดหนึ่งในหลอดลมของหนูที่มีชีวิต การศึกษาการสร้างภาพ PB-PCXI เหล่านี้ได้รับการออกแบบมาเพื่อทดสอบ MP หลากหลายประเภท ความเข้มข้นของสนามแม่เหล็ก และตำแหน่ง เพื่อพิจารณาผลกระทบต่อการเคลื่อนไหวของ MP เราตั้งสมมติฐานว่าสนามแม่เหล็กที่ใช้จากภายนอกจะช่วยให้ MP ที่ส่งไปอยู่หรือเคลื่อนไปยังบริเวณเป้าหมายได้ การศึกษาเหล่านี้ยังช่วยให้เราระบุการกำหนดค่าของแม่เหล็กที่เพิ่มจำนวนอนุภาคที่คงอยู่ในหลอดลมหลังการสะสมให้สูงสุด ในการศึกษาชุดที่สอง เราพยายามใช้การกำหนดค่าที่เหมาะสมที่สุดนี้เพื่อแสดงรูปแบบการถ่ายโอนสัญญาณที่เกิดจากการส่งสัญญาณ LV-MP ในร่างกายไปยังทางเดินหายใจของหนู โดยอาศัยสมมติฐานที่ว่า การส่งผ่าน LV-MP ในบริบทของการกำหนดเป้าหมายทางเดินหายใจจะส่งผลให้ประสิทธิภาพการถ่ายโอน LV เพิ่มขึ้น
การศึกษาในสัตว์ทั้งหมดดำเนินการตามโปรโตคอลที่ได้รับการอนุมัติจากมหาวิทยาลัยแอดิเลด (M-2019-060 และ M-2020-022) และคณะกรรมการจริยธรรมสัตว์ SPring-8 Synchrotron การทดลองดำเนินการตามแนวทาง ARRIVE
การถ่ายภาพด้วยรังสีเอกซ์ทั้งหมดดำเนินการที่ลำแสง BL20XU ที่ซินโครตรอน SPring-8 ในญี่ปุ่น โดยใช้การตั้งค่าที่คล้ายกับที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้21,22โดยย่อ กล่องทดลองตั้งอยู่ห่างจากวงแหวนเก็บซินโครตรอน 245 ม. ระยะห่างระหว่างตัวอย่างกับเครื่องตรวจจับ 0.6 ม. ใช้สำหรับการศึกษาการถ่ายภาพอนุภาค และ 0.3 ม. สำหรับการศึกษาการถ่ายภาพในร่างกาย เพื่อสร้างเอฟเฟกต์คอนทราสต์เฟส ใช้พลังงานลำแสงสีเดียว 25 keV ภาพถูกถ่ายโดยใช้ตัวแปลงรังสีเอกซ์ความละเอียดสูง (SPring-8 BM3) ที่เชื่อมต่อกับเครื่องตรวจจับ sCMOS ตัวแปลงจะแปลงรังสีเอกซ์เป็นแสงที่มองเห็นได้โดยใช้สารประกายแสงหนา 10 µm (Gd3Al2Ga3O12) จากนั้นจึงส่งไปยังเซ็นเซอร์ sCMOS โดยใช้เลนส์วัตถุกล้องจุลทรรศน์ × 10 (NA 0.3) เครื่องตรวจจับ sCMOS คือ Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics ประเทศญี่ปุ่น) ที่มี ขนาดอาร์เรย์ 2048 × 2048 พิกเซลและขนาดพิกเซลดิบ 6.5 × 6.5 µm การตั้งค่านี้ให้ขนาดพิกเซลไอโซทรอปิกที่มีประสิทธิภาพ 0.51 µm และระยะมองเห็นประมาณ 1.1 มม. × 1.1 มม. เลือกระยะเวลาการเปิดรับแสง 100 มิลลิวินาทีเพื่อเพิ่มอัตราส่วนสัญญาณต่อสัญญาณรบกวนของอนุภาคแม่เหล็กภายในและภายนอกทางเดินหายใจให้สูงสุดพร้อมลดอาตีแฟกต์การเคลื่อนไหวที่เกิดจากการหายใจให้เหลือน้อยที่สุด สำหรับการศึกษาในร่างกาย ชัตเตอร์เอกซเรย์แบบเร็วถูกวางไว้ในเส้นทางเอกซเรย์เพื่อจำกัดปริมาณรังสีโดยการบล็อกลำแสงเอกซเรย์ระหว่างการเปิดรับแสง
ไม่ได้ใช้ตัวพา LV ในการศึกษาการถ่ายภาพ SPring-8 PB-PCXI เนื่องจากห้องถ่ายภาพ BL20XU ไม่ได้รับการรับรองระดับความปลอดภัยทางชีวภาพ 2 แทนที่จะทำเช่นนั้น เราได้เลือก MP ที่มีลักษณะเฉพาะชัดเจนจากซัพพลายเออร์เชิงพาณิชย์สองราย ซึ่งครอบคลุมขนาด วัสดุ ความเข้มข้นของเหล็ก และการใช้งานที่หลากหลาย โดยก่อนอื่นเพื่อทำความเข้าใจว่าสนามแม่เหล็กส่งผลต่อการเคลื่อนที่ของ MP ภายในเส้นเลือดฝอยแก้วอย่างไร จากนั้นจึงทำในทางเดินหายใจของสิ่งมีชีวิต บนพื้นผิว MP มีขนาดตั้งแต่ 0.25 ถึง 18 μm และทำจากวัสดุหลากหลายชนิด (ดูตารางที่ 1) แต่ส่วนประกอบของแต่ละตัวอย่าง รวมถึงขนาดของอนุภาคแม่เหล็กภายใน MP นั้นยังไม่เป็นที่ทราบแน่ชัด จากการศึกษา MCT อย่างละเอียดของเรา 19, 20, 21, 23, 24 เราคาดว่า MP ที่มีขนาดเล็กถึง 5 μm สามารถมองเห็นได้บนพื้นผิวทางเดินหายใจของหลอดลม เช่น โดยการลบเฟรมที่ต่อเนื่องกันเพื่อดูความชัดเจนของการเคลื่อนไหวของ MP ที่ชัดเจนขึ้น MP ที่มีขนาด 0.25 μm เพียงอันเดียวมีขนาดเล็กกว่าความละเอียดของอุปกรณ์สร้างภาพ แต่คาดว่า PB-PCXI จะตรวจจับคอนทราสต์ของปริมาตรและการเคลื่อนไหวของของเหลวบนพื้นผิวที่ MP ถูกสะสมไว้หลังจากการสะสม
ตัวอย่างสำหรับ MP แต่ละตัวในตารางที่ 1 ได้รับการเตรียมในหลอดเลือดฝอยแก้วขนาด 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) ที่มีเส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 0.63 มม. อนุภาคเม็ดเลือดมีอยู่ในน้ำ ในขณะที่อนุภาค CombiMag มีอยู่ในตัวของเหลวเฉพาะของผู้ผลิต หลอดแก้วแต่ละหลอดบรรจุของเหลวไว้ครึ่งหลอด (ประมาณ 11 μl) และวางไว้บนที่ยึดตัวอย่าง (ดูรูปที่ 1) หลอดเลือดฝอยแก้วถูกวางในแนวนอนบนแท่นตัวอย่างในกล่องถ่ายภาพตามลำดับ และวางในตำแหน่งขอบของของเหลว แม่เหล็กนีโอไดเมียมเหล็กโบรอน (NdFeB) เปลือกนิกเกิลเส้นผ่านศูนย์กลาง 19 มม. (ยาว 28 มม.) (N35, รหัสสินค้า LM1652, Jaycar Electronics, ออสเตรเลีย) ที่มีค่าแม่เหล็กตกค้างที่ 1.17 เทสลา ถูกแนบเข้ากับแท่นแปลแยกต่างหากเพื่อเปลี่ยนตำแหน่งจากระยะไกลระหว่างการถ่ายภาพ การรับภาพเอกซเรย์เริ่มต้นเมื่อวางแม่เหล็กไว้เหนือตัวอย่างประมาณ 30 มม. และถ่ายภาพ ได้รับการจับภาพด้วยอัตรา 4 เฟรมต่อวินาที ในระหว่างการถ่ายภาพ แม่เหล็กจะถูกนำไปใกล้กับท่อแก้วแคปิลลารี (ห่างออกไปประมาณ 1 มม.) จากนั้นจึงเคลื่อนไปตามท่อเพื่อประเมินผลของความเข้มของสนามและตำแหน่ง
การตั้งค่าการถ่ายภาพในหลอดทดลองที่มีตัวอย่าง MP ในหลอดเลือดฝอยแก้วบนขั้นการแปล xy ของตัวอย่าง เส้นทางของลำแสงเอกซ์เรย์จะถูกทำเครื่องหมายด้วยเส้นประสีแดง
ไทย หลังจากที่ได้มีการสร้างการมองเห็น MP ในหลอดทดลองแล้ว กลุ่มย่อยของ MP เหล่านั้นก็ได้รับการทดสอบในร่างกายในหนูวิสตาร์เผือกเพศเมียแบบป่า (อายุ ~12 สัปดาห์ ประมาณ 200 กรัม) เมเดโทมิดีน 0.24 มก./กก. (Domitor®, Zenoaq, ญี่ปุ่น) มิดาโซแลม 3.2 มก./กก. (Dormicum®, Astellas Pharma, ญี่ปุ่น) และบูทอร์ฟานอล 4 มก./กก. (Vetorphale®, Meiji Seika) หนูถูกวางยาสลบด้วยส่วนผสมของ Pharma) ญี่ปุ่น) โดยการฉีดเข้าช่องท้อง หลังจากวางยาสลบแล้ว หนูจะถูกเตรียมสำหรับการถ่ายภาพโดยการเอาขนที่อยู่รอบๆ หลอดลมออก ใส่ท่อช่วยหายใจ (ET; เข็มเจาะน้ำเกลือ 16 Ga, Terumo BCT) และทำให้เคลื่อนไหวไม่ได้บนแผ่นถ่ายภาพที่ทำขึ้นเป็นพิเศษซึ่งมีถุงเก็บความร้อนเพื่อรักษาอุณหภูมิร่างกาย 22 จากนั้นจึงติดแผ่นถ่ายภาพเข้ากับแท่นเคลื่อนย้ายตัวอย่างในกล่องถ่ายภาพโดยเอียงเล็กน้อย จัดตำแหน่งหลอดลมให้เป็นแนวนอนในภาพเอกซเรย์ ดังที่แสดงในรูปที่ 2 ก
(ก) การตั้งค่าการถ่ายภาพในร่างกายในกล่องถ่ายภาพ SPring-8 เส้นทางของลำแสงเอกซ์เรย์จะถูกทำเครื่องหมายด้วยเส้นประสีแดง (ข, ค) การระบุตำแหน่งแม่เหล็กบนหลอดลมทำได้จากระยะไกลโดยใช้กล้อง IP ที่ติดตั้งในแนวตั้งฉากสองตัว ที่ด้านซ้ายของภาพบนหน้าจอ จะมองเห็นห่วงลวดที่ยึดศีรษะ และเข็มส่งที่อยู่ในตำแหน่งภายในท่อ ET
ระบบปั๊มฉีดยาควบคุมระยะไกล (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) โดยใช้เข็มฉีดยาแก้วขนาด 100 μl เชื่อมต่อกับท่อ PE10 (เส้นผ่านศูนย์กลางภายนอก 0.61 มม. เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 0.28 มม.) ผ่านเข็มขนาด 30 Ga ทำเครื่องหมายท่อเพื่อให้แน่ใจว่าปลายท่ออยู่ในตำแหน่งที่ถูกต้องในหลอดลมเมื่อใส่ท่อ ET ใช้ไมโครปั๊มเพื่อดึงลูกสูบของเข็มฉีดยาออกในขณะที่จุ่มปลายท่อลงในตัวอย่าง MP ที่จะส่ง จากนั้นจึงใส่ท่อส่งที่มีของเหลวบรรจุอยู่เข้าไปในท่อช่วยหายใจ โดยวางปลายท่อไว้ในส่วนที่แรงที่สุดของสนามแม่เหล็กที่เราคาดว่าจะใช้ การรับภาพถูกควบคุมโดยใช้เครื่องตรวจจับการหายใจที่เชื่อมต่อกับกล่องจับเวลาที่ใช้ Arduino และสัญญาณทั้งหมด (เช่น อุณหภูมิ การหายใจ การเปิด/ปิดชัตเตอร์ และการรับภาพ) จะถูกบันทึกโดยใช้ Powerlab และ LabChart (AD Instruments, ซิดนีย์, ออสเตรเลีย) 22. เมื่อทำการถ่ายภาพ เมื่อไม่สามารถเข้าถึงกล่องได้ กล้อง IP สองตัว (Panasonic BB-SC382) ถูกวางในมุมประมาณ 90° ต่อกัน และใช้ในการตรวจสอบตำแหน่งของแม่เหล็กที่สัมพันธ์กับหลอดลมระหว่างการถ่ายภาพ (รูปที่ 2b,c) เพื่อลดสิ่งแปลกปลอมจากการเคลื่อนไหว จึงได้ภาพหนึ่งภาพต่อลมหายใจระหว่างช่วงที่กระแสน้ำขึ้นลงสิ้นสุด
แม่เหล็กจะติดอยู่กับขั้นที่สองซึ่งสามารถวางไว้ภายนอกกล่องถ่ายภาพได้ไกลจากตำแหน่งที่กำหนด มีการทดสอบตำแหน่งและการกำหนดค่าของแม่เหล็กต่างๆ รวมถึง: ติดตั้งที่มุมประมาณ 30° เหนือหลอดลม (การกำหนดค่าที่แสดงในรูปที่ 2a และ 3a); แม่เหล็กอันหนึ่งอยู่เหนือสัตว์และอีกอันอยู่ด้านล่าง โดยตั้งขั้วให้ดึงดูด (รูปที่ 3b); แม่เหล็กอันหนึ่งอยู่เหนือสัตว์และอีกอันอยู่ด้านล่าง โดยตั้งขั้วให้ผลักกัน (รูปที่ 3c); และแม่เหล็กอีกอันหนึ่งอยู่เหนือและตั้งฉากกับหลอดลม (รูปที่ 3d) เมื่อกำหนดค่าสัตว์และแม่เหล็กแล้ว และโหลด MP ที่ต้องการทดสอบเข้าไปในปั๊มฉีดแล้ว ให้ส่งปริมาณยา 50 μl ด้วยอัตรา 4 μl/วินาทีในขณะที่รับภาพ จากนั้นแม่เหล็กจะถูกเลื่อนไปมาตามหรือด้านข้างข้ามหลอดลมในขณะที่ยังคงรับภาพต่อไป
การกำหนดค่าแม่เหล็กสำหรับการถ่ายภาพในร่างกาย (ก) แม่เหล็กชิ้นเดียวเหนือหลอดลมในมุมประมาณ 30° (ข) แม่เหล็กสองชิ้นตั้งค่าให้ดึงดูด (ค) แม่เหล็กสองชิ้นตั้งค่าให้ผลัก (ง) แม่เหล็กชิ้นเดียวอยู่เหนือและตั้งฉากในหลอดลม ผู้สังเกตมองลงมาจากปากไปที่ปอดผ่านหลอดลม และลำแสงเอกซ์เรย์ผ่านด้านซ้ายของหนูและออกทางด้านขวา แม่เหล็กจะเคลื่อนที่ไปตามความยาวของทางเดินหายใจหรือไปทางซ้ายและขวาเหนือหลอดลมในทิศทางของลำแสงเอกซ์เรย์
นอกจากนี้ เรายังพยายามที่จะกำหนดความชัดเจนและพฤติกรรมของอนุภาคในทางเดินหายใจในกรณีที่ไม่มีการหายใจและการเคลื่อนไหวของหัวใจที่ทำให้เกิดความสับสน ดังนั้น เมื่อสิ้นสุดช่วงเวลาการถ่ายภาพ สัตว์จะถูกฆ่าอย่างมีมนุษยธรรมเนื่องจากได้รับเพนโทบาร์บิทัลเกินขนาด (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 มก./กก. ip) สัตว์บางตัวถูกทิ้งไว้บนแพลตฟอร์มการถ่ายภาพ และเมื่อการหายใจและการเต้นของหัวใจหยุดลง กระบวนการถ่ายภาพก็จะทำซ้ำ โดยเพิ่มปริมาณ MP เพิ่มเติมหากไม่สามารถมองเห็น MP บนพื้นผิวทางเดินหายใจ
ภาพที่ได้รับได้รับการแก้ไขแบบภาพแบนและภาพมืด จากนั้นจึงประกอบเป็นภาพยนตร์ (20 เฟรมต่อวินาที; 15-25 เท่าของความเร็วปกติ ขึ้นอยู่กับอัตราการหายใจ) โดยใช้สคริปต์ที่กำหนดเองที่เขียนใน MATLAB (R2020a, The Mathworks)
การศึกษาการส่งมอบยีนเวกเตอร์ LV ทั้งหมดดำเนินการที่ศูนย์วิจัยสัตว์ทดลองแห่งมหาวิทยาลัยอเดเลด และมีจุดมุ่งหมายเพื่อใช้ผลการทดลอง SPring-8 ในการประเมินว่าการส่งมอบ LV-MP เมื่อมีสนามแม่เหล็กจะช่วยเพิ่มการถ่ายโอนยีนในร่างกายได้หรือไม่ เพื่อประเมินผลของ MP และสนามแม่เหล็ก สัตว์สองกลุ่มได้รับการรักษา โดยกลุ่มหนึ่งได้รับ LV-MP โดยวางแม่เหล็กไว้ และอีกกลุ่มหนึ่งได้รับกลุ่มควบคุมที่มี LV-MP โดยไม่ได้ใช้แม่เหล็ก
เวกเตอร์ยีน LV ถูกสร้างขึ้นโดยใช้กรรมวิธีที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ 25, 26 เวกเตอร์ LacZ แสดงยีนเบตา-กาแลกโตซิเดสที่อยู่ในนิวเคลียสซึ่งควบคุมโดยโปรโมเตอร์ MPSV ที่เกิดขึ้นเอง (LV-LacZ) ซึ่งสร้างผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาสีน้ำเงินในเซลล์ที่ถูกถ่ายทอด ซึ่งมองเห็นได้ที่ด้านหน้าของเนื้อเยื่อปอดและส่วนของเนื้อเยื่อ การไทเทอร์ดำเนินการในวัฒนธรรมเซลล์โดยการนับจำนวนเซลล์ที่มี LacZ ในเชิงบวกด้วยมือด้วยเครื่องเฮโมไซโตมิเตอร์เพื่อคำนวณไทเทอร์ในหน่วย TU/มล. ตัวพาจะถูกแช่แข็งที่ -80 °C ละลายก่อนใช้งาน และผูกเข้ากับ CombiMag โดยการผสมในอัตราส่วน 1:1 และฟักบนน้ำแข็งอย่างน้อย 30 นาทีก่อนส่งมอบ
หนู Sprague Dawley ปกติ (n = 3 ต่อกลุ่ม ประมาณ 2-3 ตัวถูกวางยาสลบเข้าช่องท้องด้วยยาผสมเมเดโทมิดีน 0.4 มก./กก. (Domitor, Ilium, ออสเตรเลีย) และเคตามีน 60 มก./กก. (Ilium, ออสเตรเลีย) อายุ 1 เดือน ฉีดเข้าช่องท้อง และใส่ท่อช่วยหายใจแบบไม่ต้องผ่าตัดด้วยเข็มสอด 16 Ga ทางเส้นเลือด เพื่อให้แน่ใจว่าเนื้อเยื่อทางเดินหายใจของหลอดลมได้รับการถ่ายทอดสัญญาณ LV เราจึงปรับสภาพเนื้อเยื่อโดยใช้โปรโตคอลการรบกวนทางกลตามที่ได้อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ โดยจะถูพื้นผิวทางเดินหายใจของหลอดลมตามแนวแกนด้วยตะกร้าลวด (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, สหรัฐอเมริกา) 30 วินาที 28 จากนั้นจึงให้ LV-MP ทางหลอดลมในตู้เก็บสารอันตรายทางชีวภาพประมาณ 10 นาทีหลังจากการรบกวน
สนามแม่เหล็กที่ใช้ในการทดลองนี้ถูกกำหนดค่าในลักษณะที่คล้ายกับการศึกษาการถ่ายภาพด้วยรังสีเอกซ์ในร่างกาย โดยใช้แม่เหล็กชนิดเดียวกันถือไว้เหนือหลอดลมโดยใช้คลิปสเตนต์กลั่น (รูปที่ 4) ปริมาตร 50 μl (ส่วนย่อย 2 × 25 μl) ของ LV-MP ถูกส่งเข้าไปในหลอดลม (n = 3 สัตว์) โดยใช้ปิเปตที่มีปลายเจลตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ กลุ่มควบคุม (n = 3 สัตว์) ได้รับ LV-MP เดียวกันโดยไม่ใช้แม่เหล็ก หลังจากการฉีดเสร็จสิ้น ให้ถอดเข็มออกจากท่อ ET และถอดท่อช่วยหายใจของสัตว์ แม่เหล็กจะอยู่ในตำแหน่งนั้นเป็นเวลา 10 นาที จากนั้นจึงนำออก หนูได้รับเมโลซิแคม (1 มล./กก.) ใต้ผิวหนัง (Ilium, ออสเตรเลีย) ตามด้วยการย้อนกลับการดมยาสลบโดยการฉีดอะติพามาโซลไฮโดรคลอไรด์ 1 มก./กก. เข้าทางช่องท้อง (Antisedan, Zoetis, ออสเตรเลีย) หนูได้รับความอบอุ่นและเฝ้าติดตาม จนกว่าจะหายดีจากยาสลบ
อุปกรณ์ส่งมอบ LV-MP ในตู้ความปลอดภัยทางชีวภาพ สามารถมองเห็นดุมลูเออร์สีเทาอ่อนของหลอด ET ยื่นออกมาจากปาก และปลายเจลของปิเปตที่แสดงในภาพจะถูกสอดผ่านหลอด ET ไปยังความลึกที่ต้องการในหลอดลม
หนึ่งสัปดาห์หลังจากขั้นตอนการให้ยา LV-MP สัตว์ต่างๆ ถูกฆ่าอย่างมีมนุษยธรรมโดยการสูดดม CO2 100% และการแสดงออกของ LacZ จะถูกประเมินโดยใช้การรักษา X-gal มาตรฐานของเรา วงแหวนกระดูกอ่อนส่วนท้ายสามวงถูกถอดออกเพื่อให้แน่ใจว่าความเสียหายทางกลหรือการกักเก็บของเหลวใดๆ จากการวางท่อช่วยหายใจจะไม่รวมอยู่ในผลการวิเคราะห์ หลอดลมแต่ละหลอดถูกตัดตามยาวเพื่อสร้างสองส่วนสำหรับการวิเคราะห์ และติดตั้งไว้ในจานที่มียางซิลิโคน (Sylgard, Dow Inc) โดยใช้เข็ม Minutien (Fine Science Tools) เพื่อสร้างภาพพื้นผิวลูเมน การกระจายและรูปแบบของเซลล์ที่ถูกถ่ายทอดได้รับการยืนยันโดยการถ่ายภาพด้านหน้าโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ Nikon (SMZ1500) พร้อมกล้อง DigiLite และซอฟต์แวร์ TCapture (Tucsen Photonics, จีน) ภาพถูกถ่ายด้วยกำลังขยาย 20 เท่า (รวมถึงการตั้งค่าสูงสุดสำหรับความกว้างทั้งหมดของหลอดลม) โดยถ่ายภาพหลอดลมทั้งหมดทีละขั้นตอนเพื่อให้แน่ใจว่ามีการทับซ้อนกันเพียงพอ ระหว่างภาพแต่ละภาพเพื่อให้สามารถ "เย็บ" ภาพได้ จากนั้นภาพจากหลอดลมแต่ละหลอดจะถูกประกอบเป็นภาพผสมเดียวโดยใช้ Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) โดยใช้อัลกอริทึมการเคลื่อนที่ในระนาบ พื้นที่แสดงออก LacZ ในภาพผสมของหลอดลมจากสัตว์แต่ละตัวถูกวัดปริมาณโดยใช้สคริปต์ MATLAB อัตโนมัติ (R2020a, MathWorks) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ โดยใช้การตั้งค่า 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15 และ Value < 0.7 โดยการติดตามเส้นขอบของเนื้อเยื่อ มาสก์จะถูกสร้างขึ้นด้วยตนเองใน GIMP v2.10.24 สำหรับภาพผสมแต่ละภาพ เพื่อระบุพื้นที่เนื้อเยื่อและป้องกันการตรวจจับที่ผิดพลาดจากภายนอกเนื้อเยื่อหลอดลม พื้นที่ที่ย้อมสีจากภาพผสมทั้งหมดจากสัตว์แต่ละตัวจะถูกสรุปเพื่อสร้างพื้นที่ย้อมสีทั้งหมดสำหรับสัตว์ตัวนั้น จากนั้นพื้นที่ย้อมสีจะถูกหารด้วยพื้นที่มาสก์ทั้งหมดเพื่อสร้างพื้นที่ที่ทำให้เป็นมาตรฐาน
แต่ละหลอดลมถูกฝังในพาราฟินและตัดส่วนที่หนา 5 ไมโครเมตรออก ส่วนต่างๆ ถูกย้อมทับด้วยสีกลางสีแดงเร็วเป็นเวลา 5 นาที และถ่ายภาพโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ Nikon Eclipse E400, กล้อง DS-Fi3 และซอฟต์แวร์บันทึกองค์ประกอบ NIS (เวอร์ชัน 5.20.00)
การวิเคราะห์ทางสถิติทั้งหมดดำเนินการใน GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) ความสำคัญทางสถิติถูกกำหนดที่ p ≤ 0.05 ความเป็นปกติได้รับการตรวจยืนยันโดยใช้การทดสอบ Shapiro-Wilk และความแตกต่างในการย้อม LacZ ได้รับการประเมินโดยใช้การทดสอบ t ที่ไม่จับคู่
MP ทั้งหกตัวที่อธิบายไว้ในตารางที่ 1 ได้รับการตรวจสอบโดยใช้ PCXI และความสามารถในการมองเห็นได้อธิบายไว้ในตารางที่ 2 MP โพลีสไตรีนสองตัว (MP1 และ MP2; 18 μm และ 0.25 μm ตามลำดับ) ไม่สามารถมองเห็นได้ภายใต้ PCXI แต่ตัวอย่างที่เหลือสามารถระบุได้ (ตัวอย่างแสดงในรูปที่ 5) MP3 และ MP4 (10-15% Fe3O4; 0.25 μm และ 0.9 μm ตามลำดับ) สามารถมองเห็นได้เลือนลางแม้ว่าจะมีอนุภาคที่เล็กที่สุดบางส่วนที่ทดสอบ แต่ MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) เป็นอนุภาคที่เด่นชัดที่สุดผลิตภัณฑ์ CombiMag MP6 นั้นยากที่จะระบุได้ในทุกกรณี ความสามารถของเราในการตรวจจับ MP ได้รับการปรับปรุงอย่างมีนัยสำคัญโดยการย้ายแม่เหล็กไปมาขนานกับเส้นเลือดฝอย เมื่อแม่เหล็กเคลื่อนออกจากเส้นเลือดฝอย อนุภาคจะขยายออกเป็นสายยาว แต่เมื่อแม่เหล็กเข้ามาใกล้และความเข้มของสนามแม่เหล็กเพิ่มขึ้น อนุภาค สายแม่เหล็กจะสั้นลงเมื่ออนุภาคเคลื่อนที่ไปยังพื้นผิวด้านบนของเส้นเลือดฝอย (ดูวิดีโอเสริม S1: MP4) ทำให้ความหนาแน่นของอนุภาคบนพื้นผิวเพิ่มขึ้น ในทางกลับกัน เมื่อแม่เหล็กถูกนำออกจากเส้นเลือดฝอย ความเข้มของสนามจะลดลง และ MP จะจัดเรียงใหม่เป็นสายแม่เหล็กยาวๆ ที่ทอดยาวจากพื้นผิวด้านบนของเส้นเลือดฝอย (ดูวิดีโอเสริม S2: MP4) หลังจากแม่เหล็กหยุดเคลื่อนที่ อนุภาคจะยังคงเคลื่อนที่ต่อไปอีกชั่วครู่หลังจากไปถึงตำแหน่งสมดุล ขณะที่ MP เคลื่อนที่เข้าและออกจากพื้นผิวด้านบนของเส้นเลือดฝอย อนุภาคแม่เหล็กมักจะลากเศษวัสดุผ่านของเหลว
ความสามารถในการมองเห็นของ MP ภายใต้ PCXI แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่างตัวอย่าง (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 และ (d) MP6 รูปภาพทั้งหมดที่แสดงที่นี่ถ่ายโดยใช้แม่เหล็กซึ่งอยู่ห่างจากเส้นเลือดฝอยโดยตรงประมาณ 10 มม. วงกลมขนาดใหญ่ที่เห็นได้ชัดคือฟองอากาศที่ติดอยู่ในเส้นเลือดฝอย ซึ่งแสดงให้เห็นคุณลักษณะของขอบสีดำและสีขาวของการถ่ายภาพแบบคอนทราสต์เฟสได้อย่างชัดเจน กล่องสีแดงประกอบด้วยการขยายภาพที่เพิ่มคอนทราสต์ โปรดทราบว่าเส้นผ่านศูนย์กลางของแผนผังแม่เหล็กในรูปทั้งหมดไม่ใช่มาตราส่วนและมีขนาดใหญ่กว่าที่แสดงไว้ประมาณ 100 เท่า
ขณะที่แม่เหล็กเคลื่อนที่ไปทางซ้ายและขวาตามด้านบนของเส้นเลือดฝอย มุมของสาย MP จะเปลี่ยนไปเพื่อจัดตำแหน่งให้ตรงกับแม่เหล็ก (ดูรูปที่ 6) จึงทำให้สามารถระบุเส้นสนามแม่เหล็กได้ สำหรับ MP3-5 หลังจากที่คอร์ดไปถึงมุมขีดจำกัด อนุภาคจะถูกดึงไปตามพื้นผิวด้านบนของเส้นเลือดฝอย ซึ่งมักจะส่งผลให้ MP รวมตัวกันเป็นกลุ่มใหญ่ขึ้นใกล้กับจุดที่สนามแม่เหล็กแรงที่สุด (ดูวิดีโอเสริม S3:MP5) สิ่งนี้ยังเห็นได้ชัดโดยเฉพาะเมื่อถ่ายภาพใกล้กับปลายเส้นเลือดฝอย ซึ่งทำให้ MP รวมตัวกันและรวมตัวกันที่อินเทอร์เฟซของไหล-อากาศ อนุภาคใน MP6 ซึ่งแยกแยะได้ยากกว่า MP3-5 จะไม่ถูกดึงขณะที่แม่เหล็กเคลื่อนที่ไปตามเส้นเลือดฝอย แต่สาย MP จะแยกตัวออก ทำให้อนุภาคอยู่ในระยะการมองเห็น (ดูวิดีโอเสริม S4:MP6) ในบางกรณี เมื่อสนามแม่เหล็กที่ใช้ลดลงโดยการขยับแม่เหล็กออกไปไกลจากตำแหน่งถ่ายภาพ MP ที่เหลือจะค่อยๆ ลงมาที่พื้นผิวด้านล่างของท่อโดยแรงโน้มถ่วงในขณะที่ยังคงอยู่ ในสตริง (ดูวิดีโอเสริม S5: MP3)
มุมของสาย MP จะเปลี่ยนไปเมื่อแม่เหล็กถูกเลื่อนไปทางขวาเหนือเส้นเลือดฝอย (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 และ (d) MP6 กล่องสีแดงประกอบด้วยการขยายภาพที่เพิ่มความคมชัด โปรดทราบว่าวิดีโอเสริมนั้นให้ข้อมูลที่เป็นประโยชน์ เนื่องจากวิดีโอดังกล่าวเผยให้เห็นโครงสร้างอนุภาคที่สำคัญและข้อมูลไดนามิกที่ไม่สามารถมองเห็นได้ในภาพนิ่งเหล่านี้
การทดสอบของเราแสดงให้เห็นว่าการเคลื่อนแม่เหล็กไปมาอย่างช้าๆ ตามหลอดลมช่วยให้มองเห็น MP ได้ง่ายขึ้นในบริบทของการเคลื่อนไหวที่ซับซ้อนในร่างกาย การทดสอบในร่างกายไม่ได้ดำเนินการเนื่องจากไม่สามารถมองเห็นลูกปัดโพลีสไตรีน (MP1 และ MP2) ในเส้นเลือดฝอยได้ MP ที่เหลืออีกสี่ชิ้นได้รับการทดสอบในร่างกายโดยมีแกนยาวของแม่เหล็กที่ตั้งอยู่เหนือหลอดลมในมุมประมาณ 30° จากแนวตั้ง (ดูรูปที่ 2b และ 3a) ซึ่งส่งผลให้มีโซ่ MP ที่ยาวขึ้นและมีประสิทธิภาพมากกว่าการกำหนดค่าแม่เหล็กที่ยุติลง MP3, MP4 และ MP6 ไม่ตรวจพบในหลอดลมของสัตว์มีชีวิตใดๆ เมื่อถ่ายภาพทางเดินหายใจของหนูหลังจากที่สัตว์ถูกฆ่าอย่างมีมนุษยธรรม อนุภาคเหล่านี้ยังคงมองไม่เห็นแม้ว่าจะเพิ่มปริมาตรโดยใช้ปั๊มฉีดยา MP5 มีปริมาณออกไซด์ของเหล็กสูงสุดและเป็นอนุภาคที่มองเห็นได้เพียงชิ้นเดียว ดังนั้นจึงใช้ประเมินและกำหนดลักษณะพฤติกรรมของ MP ในร่างกาย
การวางแม่เหล็กไว้เหนือหลอดลมขณะส่ง MP ส่งผลให้ MP จำนวนมากรวมอยู่ในระยะมองเห็น แต่ไม่ใช่ทั้งหมด อนุภาคที่เข้าไปในหลอดลมจะสังเกตเห็นได้ดีที่สุดในสัตว์ที่ถูกสังเวยโดยไม่ทารุณ รูปที่ 7 และวิดีโอเสริม S6: MP5 แสดงการจับแม่เหล็กอย่างรวดเร็วและการจัดตำแหน่งของอนุภาคบนพื้นผิวของหลอดลมด้านท้อง ซึ่งบ่งชี้ว่า MP สามารถมุ่งไปที่บริเวณที่ต้องการของหลอดลมได้ เมื่อค้นหาในบริเวณที่ห่างออกไปตามหลอดลมหลังส่ง MP พบว่า MP บางส่วนอยู่ใกล้กับ carina มากกว่า ซึ่งบ่งชี้ว่าความแรงของสนามแม่เหล็กไม่เพียงพอที่จะรวบรวมและรักษา MP ทั้งหมดไว้ เนื่องจาก MP ถูกส่งผ่านบริเวณที่มีความเข้มของสนามแม่เหล็กสูงสุดในระหว่างกระบวนการของไหล อย่างไรก็ตาม ความเข้มข้นของ MP หลังคลอดจะสูงขึ้นรอบๆ บริเวณที่ถ่ายภาพ ซึ่งบ่งชี้ว่า MP จำนวนมากยังคงอยู่ในบริเวณทางเดินหายใจซึ่งมีความเข้มของสนามแม่เหล็กที่ใช้สูงที่สุด
ภาพจาก (ก) ก่อนและ (ข) หลังการส่ง MP5 เข้าไปในหลอดลมของหนูที่เพิ่งถูกุณหกรรม โดยมีแม่เหล็กวางอยู่เหนือบริเวณการถ่ายภาพโดยตรง บริเวณที่ถ่ายภาพได้นั้นอยู่ระหว่างวงแหวนกระดูกอ่อนทั้งสองวง ก่อนที่จะส่ง MP จะมีของเหลวบางส่วนอยู่ในทางเดินหายใจ กล่องสีแดงประกอบด้วยภาพขยายที่ช่วยเพิ่มความคมชัด ภาพเหล่านี้มาจากวิดีโอที่แสดงในวิดีโอเสริม S6: MP5
การเคลื่อนที่ของแม่เหล็กไปตามหลอดลมในร่างกายทำให้โซ่ MP เปลี่ยนมุมภายในพื้นผิวทางเดินหายใจในลักษณะเดียวกับที่พบในหลอดเลือดฝอย (ดูรูปที่ 8 และวิดีโอเสริม S7: MP5) อย่างไรก็ตาม ในการศึกษาของเรา MP ไม่สามารถถูกดึงไปตามพื้นผิวทางเดินหายใจของสิ่งมีชีวิตได้ เช่นเดียวกับที่เกิดขึ้นกับหลอดเลือดฝอย ในบางกรณี โซ่ MP จะยาวขึ้นเมื่อแม่เหล็กเคลื่อนที่ไปทางซ้ายและขวา ที่น่าสนใจคือ เราพบว่าสตริงของอนุภาคดูเหมือนจะเปลี่ยนความลึกของชั้นของเหลวบนพื้นผิวเมื่อแม่เหล็กเคลื่อนที่ตามยาวไปตามหลอดลม และขยายตัวเมื่อแม่เหล็กเคลื่อนที่ไปเหนือศีรษะโดยตรงและสตริงของอนุภาคหมุนไปยังตำแหน่งแนวตั้ง (ดูวิดีโอเสริม S7) :MP5 ที่เวลา 0:09 ด้านล่างขวา) รูปแบบการเคลื่อนที่ที่เป็นลักษณะเฉพาะเปลี่ยนไปเมื่อแม่เหล็กถูกเลื่อนผ่านด้านบนของหลอดลมไปในด้านข้าง (นั่นคือ ไปทางซ้ายหรือขวาของสัตว์ มากกว่าที่จะไปตามความยาวของหลอดลม) อนุภาคยังคงมองเห็นได้ชัดเจนในขณะที่เคลื่อนที่ แต่เมื่อนำแม่เหล็กออกจากหลอดลม ปลายของสายอนุภาคก็จะมองเห็นได้ (ดูวิดีโอเสริม S8:MP5 เริ่มต้นที่เวลา 0:08) ซึ่งสอดคล้องกับพฤติกรรมของ MP ที่เราสังเกตได้ภายใต้สนามแม่เหล็กที่ใช้ในหลอดเลือดฝอยแก้ว
ภาพตัวอย่างที่แสดง MP5 ในหลอดลมของหนูที่ได้รับยาสลบขณะยังมีชีวิต (a) ใช้แม่เหล็กในการจับภาพด้านบนและด้านซ้ายของหลอดลม จากนั้น (b) เลื่อนแม่เหล็กไปทางขวาหลังจากเลื่อนไปทางขวาแล้ว กล่องสีแดงประกอบด้วยภาพขยายที่เพิ่มความคมชัด ภาพเหล่านี้มาจากวิดีโอที่แสดงในวิดีโอเสริม S7: MP5
เมื่อขั้วทั้งสองถูกกำหนดค่าในทิศทางเหนือ-ใต้เหนือและใต้เหนือและใต้ของหลอดลม (กล่าวคือ ดึงดูด รูปที่ 3b) คอร์ด MP จะยาวขึ้นและอยู่ที่ผนังด้านข้างของหลอดลมแทนที่จะอยู่บนพื้นผิวด้านหลังของหลอดลม (ดูวิดีโอเสริม S9:MP5) อย่างไรก็ตาม ความเข้มข้นสูงของอนุภาคในตำแหน่งเดียว (กล่าวคือ พื้นผิวด้านหลังของหลอดลม) ไม่ถูกตรวจพบหลังจากส่งของเหลวเมื่อใช้เครื่องแม่เหล็กคู่ ซึ่งโดยทั่วไปจะเกิดขึ้นเมื่อใช้เครื่องแม่เหล็กเดี่ยว จากนั้นเมื่อกำหนดค่าแม่เหล็กหนึ่งอันให้ผลักขั้วที่กลับด้าน (รูปที่ 3c) จำนวนของอนุภาคที่มองเห็นได้ในสนามภาพจะไม่ปรากฏขึ้นว่าเพิ่มขึ้นหลังจากส่ง การตั้งค่าของการกำหนดค่าแม่เหล็กคู่ทั้งสองแบบเป็นเรื่องท้าทายเนื่องจากความแรงของสนามแม่เหล็กสูงที่ดึงหรือผลักแม่เหล็กตามลำดับ การตั้งค่าจึงเปลี่ยนเป็นแม่เหล็กเดี่ยวขนานกับทางเดินหายใจแต่ผ่านทางเดินหายใจที่ 90 องศาเพื่อให้เส้นสนามแม่เหล็กข้ามผนังหลอดลม ในแนวตั้งฉาก (รูปที่ 3d) การวางแนวที่ออกแบบมาเพื่อตรวจสอบว่าสามารถสังเกตเห็นการรวมตัวของอนุภาคบนผนังด้านข้างได้หรือไม่ อย่างไรก็ตาม ในการกำหนดค่านี้ ไม่มีการระบุการเคลื่อนตัวของการสะสม MP หรือการเคลื่อนที่ของแม่เหล็กได้ จากผลลัพธ์ทั้งหมดนี้ จึงเลือกการกำหนดค่าการวางแนวแม่เหล็กเดี่ยว 30 องศา (รูปที่ 3a) สำหรับการศึกษาตัวพายีนในร่างกาย
เมื่อถ่ายภาพสัตว์ซ้ำๆ ทันทีหลังจากการฆ่าอย่างมีมนุษยธรรม การไม่มีการเคลื่อนไหวของเนื้อเยื่อที่ทำให้เกิดความสับสน หมายความว่าสามารถแยกแยะเส้นอนุภาคที่ละเอียดกว่าและสั้นกว่าได้ในบริเวณอินเตอร์กระดูกอ่อนที่ชัดเจน "สั่นคลอน" สอดคล้องกับการเคลื่อนที่ของแม่เหล็ก อย่างไรก็ตาม ยังคงไม่สามารถมองเห็นการมีอยู่และการเคลื่อนที่ของอนุภาค MP6 ได้อย่างชัดเจน
ค่าไทเตอร์ LV-LacZ อยู่ที่ 1.8 × 108 TU/ml และหลังจากผสม CombiMag MP (MP6) ในอัตราส่วน 1:1 แล้ว สัตว์จะได้รับยา LV ขนาด 50 μl จำนวน 9 × 107 TU/ml (นั่นคือ 4.5 × 106 TU/หนู) ในการศึกษานี้ แทนที่จะเคลื่อนย้ายแม่เหล็กในระหว่างการคลอดบุตร เราตรึงแม่เหล็กไว้ในตำแหน่งหนึ่งเพื่อพิจารณาว่าการเคลื่อนย้าย LV (a) สามารถปรับปรุงได้เมื่อเทียบกับการส่งเวกเตอร์ในกรณีที่ไม่มีสนามแม่เหล็กหรือไม่ และ (b) สามารถโฟกัสได้หรือไม่ เซลล์ทางเดินหายใจถูกถ่ายโอนไปยังบริเวณเป้าหมายที่เป็นแม่เหล็กของทางเดินหายใจส่วนบน
การมีอยู่ของแม่เหล็กและการใช้ CombiMag ร่วมกับเวกเตอร์ LV ดูเหมือนจะไม่มีผลเสียต่อสุขภาพของสัตว์ เช่นเดียวกับโปรโตคอลการส่งมอบเวกเตอร์ LV มาตรฐานของเรา ภาพด้านหน้าของบริเวณหลอดลมที่ได้รับการรบกวนทางกล (รูปเสริมที่ 1) แสดงให้เห็นว่าระดับการถ่ายโอนสัญญาณสูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในกลุ่มสัตว์ที่ได้รับการรักษาด้วย LV-MP เมื่อมีแม่เหล็กอยู่ (รูปที่ 9a) มีการย้อม LacZ สีน้ำเงินเพียงเล็กน้อยในกลุ่มควบคุม (รูปที่ 9b) การวัดปริมาณพื้นที่ที่ย้อม X-Gal จนเป็นมาตรฐานแสดงให้เห็นว่าการให้ LV-MP เมื่อมีสนามแม่เหล็กจะทำให้ดีขึ้นประมาณ 6 เท่า (รูปที่ 9c)
ตัวอย่างภาพประกอบที่แสดงการถ่ายทอดสัญญาณผ่านหลอดลมโดย LV-MP (ก) ในกรณีที่มีสนามแม่เหล็ก และ (ข) ในกรณีที่ไม่มีแม่เหล็ก (ค) การปรับปรุงที่สำคัญทางสถิติในพื้นที่การถ่ายทอดสัญญาณ LacZ ที่ปรับมาตรฐานภายในหลอดลมเมื่อใช้แม่เหล็ก (*p = 0.029, การทดสอบ t, n = 3 ต่อกลุ่ม, ค่าเฉลี่ย ± SEM)
ส่วนที่ย้อมสีแดงสดแบบเป็นกลาง (ตัวอย่างแสดงในรูปเสริม 2) แสดงให้เห็นเซลล์ที่ย้อม LacZ ที่มีรูปแบบและตำแหน่งคล้ายกับที่รายงานไว้ก่อนหน้านี้
ความท้าทายที่สำคัญสำหรับการบำบัดด้วยยีนทางเดินหายใจยังคงเป็นการระบุตำแหน่งของอนุภาคพาหะไปยังบริเวณที่สนใจได้อย่างแม่นยำและการบรรลุประสิทธิภาพในการถ่ายโอนระดับสูงในปอดที่เคลื่อนไหวเมื่อมีการไหลของอากาศและการชำระล้างเมือกที่กำลังทำงาน สำหรับพาหะปอด LV ที่ออกแบบมาเพื่อรักษาโรคทางเดินหายใจ CF การเพิ่มระยะเวลาที่อนุภาคพาหะอยู่ในทางเดินหายใจที่มีตัวนำไฟฟ้าเป็นเป้าหมายที่ยากจะบรรลุได้ ดังที่ Castellani et al. ชี้ให้เห็น การใช้สนามแม่เหล็กเพื่อปรับปรุงการถ่ายโอนมีข้อได้เปรียบเมื่อเทียบกับวิธีการนำส่งยีนอื่นๆ เช่น การใช้ไฟฟ้าในการขนส่ง เนื่องจากสามารถผสมผสานความเรียบง่าย ความคุ้มทุน การระบุตำแหน่งของการนำส่ง ประสิทธิภาพที่เพิ่มขึ้น เวลาในการฟักตัวที่สั้นลง และอาจมีปริมาณยาพาหะที่น้อยลง10 อย่างไรก็ตาม การสะสมและพฤติกรรมของอนุภาคแม่เหล็กในทางเดินหายใจภายใต้อิทธิพลของแรงแม่เหล็กภายนอกในร่างกายไม่เคยได้รับการอธิบาย และยังไม่มีการแสดงความเป็นไปได้ของวิธีการนี้ในร่างกายจริงในการเพิ่มระดับการแสดงออกของยีนในทางเดินหายใจที่มีชีวิตที่สมบูรณ์
การทดลองซินโครตรอน PCXI ในหลอดทดลองของเราแสดงให้เห็นว่าอนุภาคทั้งหมดที่เราทดสอบ ยกเว้นโพลีสไตรีน MP สามารถมองเห็นได้ในการตั้งค่าการถ่ายภาพที่เราใช้ ในที่ที่มีสนามแม่เหล็ก MP จะรวมตัวกันเป็นเส้นซึ่งความยาวจะสัมพันธ์กับประเภทของอนุภาคและความแรงของสนามแม่เหล็ก (เช่น ความใกล้ชิดและการเคลื่อนที่ของแม่เหล็ก) ดังที่แสดงในรูปที่ 10 เส้นที่เราสังเกตได้นั้นเกิดขึ้นเนื่องจากแต่ละอนุภาคถูกทำให้เป็นแม่เหล็กและเหนี่ยวนำให้เกิดสนามแม่เหล็กในบริเวณของตัวเอง สนามแม่เหล็กที่แยกจากกันเหล่านี้ทำให้อนุภาคที่คล้ายคลึงกันอื่นๆ รวมตัวกันและเชื่อมต่อกัน โดยมีการเคลื่อนไหวคล้ายเส้นกลุ่มเนื่องจากแรงในท้องถิ่นจากแรงดึงดูดและผลักกันในบริเวณของอนุภาคอื่น
แผนผังแสดง (a,b) ชุดอนุภาคที่เกิดขึ้นภายในหลอดเลือดฝอยที่เต็มไปด้วยของเหลว และ (c,d) หลอดลมที่เต็มไปด้วยอากาศ โปรดทราบว่าหลอดเลือดฝอยและหลอดลมไม่ได้ถูกวาดตามมาตราส่วน แผง (a) ยังมีคำอธิบายของ MP ซึ่งประกอบด้วยอนุภาค Fe3O4 ที่จัดเรียงเป็นเส้น
เมื่อแม่เหล็กเคลื่อนที่ไปเหนือเส้นเลือดฝอย มุมของสตริงอนุภาคจะไปถึงเกณฑ์วิกฤตสำหรับ MP3-5 ที่มี Fe3O4 หลังจากนั้น สตริงอนุภาคจะไม่คงอยู่ในตำแหน่งเดิมอีกต่อไป แต่จะเคลื่อนที่ไปตามพื้นผิวไปยังตำแหน่งใหม่ แม่เหล็ก ผลกระทบนี้มีแนวโน้มที่จะเกิดขึ้นได้เนื่องจากพื้นผิวเส้นเลือดฝอยของแก้วนั้นเรียบเพียงพอที่จะให้การเคลื่อนไหวนี้เกิดขึ้นได้ ที่น่าสนใจคือ MP6 (CombiMag) ไม่ได้มีพฤติกรรมเช่นนี้ อาจเป็นเพราะอนุภาคมีขนาดเล็กกว่า มีการเคลือบหรือประจุบนพื้นผิวที่ต่างกัน หรือของเหลวพาหะที่เป็นกรรมสิทธิ์ส่งผลต่อความสามารถในการเคลื่อนที่ของอนุภาค ความคมชัดของภาพของอนุภาค CombiMag ก็อ่อนกว่าด้วย ซึ่งบ่งชี้ว่าของเหลวและอนุภาคอาจมีความหนาแน่นใกล้เคียงกันและไม่สามารถเคลื่อนที่เข้าหากันได้ง่าย อนุภาคยังสามารถติดอยู่ได้หากแม่เหล็กเคลื่อนที่เร็วเกินไป ซึ่งบ่งชี้ว่าความแรงของสนามแม่เหล็กไม่สามารถเอาชนะแรงเสียดทานระหว่างอนุภาคในของเหลวได้เสมอไป ซึ่งบ่งชี้ว่าอาจไม่น่าแปลกใจที่ความแรงของสนามแม่เหล็กและระยะห่างระหว่างแม่เหล็กกับพื้นที่เป้าหมายมีความสำคัญมาก เมื่อนำมารวมกัน ผลลัพธ์เหล่านี้ยังชี้ให้เห็นด้วยว่า แม้ว่าแม่เหล็กจะสามารถจับ MP ได้หลายตัว แต่ เมื่อไหลผ่านบริเวณเป้าหมาย ไม่น่าจะเป็นไปได้ที่จะพึ่งแม่เหล็กในการเคลื่อนย้ายอนุภาค CombiMag ไปตามพื้นผิวของหลอดลม ดังนั้น เราจึงสรุปได้ว่าการศึกษา LV-MP ในร่างกายควรใช้สนามแม่เหล็กคงที่เพื่อกำหนดเป้าหมายบริเวณเฉพาะของทางเดินหายใจทางกายภาพ
เมื่อมีการนำอนุภาคเข้าสู่ร่างกาย อนุภาคเหล่านี้จะระบุได้ยากในบริบทของเนื้อเยื่อร่างกายที่เคลื่อนไหวซับซ้อน แต่ความสามารถในการตรวจจับอนุภาคเหล่านี้ได้รับการปรับปรุงโดยการแปลตำแหน่งของแม่เหล็กในแนวนอนเหนือหลอดลมเพื่อ "สั่น" สาย MP แม้ว่าจะสามารถถ่ายภาพสดได้ แต่ก็ง่ายกว่าที่จะแยกแยะการเคลื่อนที่ของอนุภาคเมื่อสัตว์ถูกฆ่าอย่างมีมนุษยธรรมแล้ว โดยทั่วไปแล้ว ความเข้มข้นของ MP จะสูงที่สุดที่ตำแหน่งนี้เมื่อแม่เหล็กถูกวางไว้เหนือบริเวณที่สร้างภาพ แม้ว่าโดยปกติแล้วจะพบอนุภาคบางส่วนที่อยู่ไกลออกไปตามหลอดลม ซึ่งแตกต่างจากการศึกษาในหลอดทดลอง อนุภาคไม่สามารถถูกลากไปตามหลอดลมโดยการแปลตำแหน่งของแม่เหล็ก การค้นพบนี้สอดคล้องกับวิธีที่เมือกที่เคลือบผิวหลอดลมโดยทั่วไปจะประมวลผลอนุภาคที่สูดดมเข้าไป โดยกักเก็บอนุภาคเหล่านั้นไว้ในเมือก แล้วจึงถูกกำจัดออกโดยกลไกการกำจัดเมือกและขน
เราตั้งสมมติฐานว่าการใช้แม่เหล็กเพื่อดึงดูดเหนือและใต้หลอดลม (รูปที่ 3b) อาจทำให้เกิดสนามแม่เหล็กที่มีความสม่ำเสมอมากกว่าสนามแม่เหล็กที่มีความเข้มข้นสูงในจุดใดจุดหนึ่ง ซึ่งอาจทำให้อนุภาคกระจายตัวสม่ำเสมอมากขึ้น อย่างไรก็ตาม การศึกษาเบื้องต้นของเราไม่พบหลักฐานชัดเจนที่สนับสนุนสมมติฐานนี้ ในทำนองเดียวกัน การกำหนดค่าแม่เหล็กคู่หนึ่งให้ผลักกัน (รูปที่ 3c) ไม่ได้ส่งผลให้มีการสะสมของอนุภาคมากขึ้นในพื้นที่ที่ถ่ายภาพ ผลการค้นพบทั้งสองนี้แสดงให้เห็นว่าการตั้งค่าแม่เหล็กคู่ไม่ได้ปรับปรุงการควบคุมเป้าหมาย MP ในพื้นที่อย่างมีนัยสำคัญ และแรงแม่เหล็กอันแข็งแกร่งที่เกิดขึ้นนั้นยากต่อการกำหนดค่า ทำให้แนวทางนี้ใช้งานได้จริงน้อยลง ในทำนองเดียวกัน การวางแม่เหล็กไว้เหนือและผ่านหลอดลม (รูปที่ 3d) ก็ไม่ได้เพิ่มจำนวนอนุภาคที่คงอยู่ในพื้นที่ถ่ายภาพเช่นกัน การกำหนดค่าทางเลือกเหล่านี้บางรูปแบบอาจไม่ประสบความสำเร็จเนื่องจากส่งผลให้ความเข้มของสนามแม่เหล็กภายในพื้นที่การสะสมลดลง ดังนั้น การกำหนดค่าแม่เหล็กมุม 30 องศาเดี่ยว (รูปที่ 3a) ถือเป็นวิธีที่ง่ายและมีประสิทธิภาพที่สุดสำหรับการทดสอบในร่างกาย
การศึกษา LV-MP แสดงให้เห็นว่าเมื่อเวกเตอร์ LV ถูกผสมกับ CombiMag และส่งมอบหลังจากการรบกวนทางกายภาพในสภาพที่มีสนามแม่เหล็ก ระดับการถ่ายโอนสัญญาณจะเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญในหลอดลมเมื่อเทียบกับกลุ่มควบคุม จากการศึกษาการถ่ายภาพซินโครตรอนและผล LacZ พบว่าสนามแม่เหล็กสามารถรักษา LV ไว้ในหลอดลมได้อย่างเห็นได้ชัด และลดจำนวนอนุภาคเวกเตอร์ที่ทะลุเข้าไปในปอดโดยตรง การปรับปรุงการกำหนดเป้าหมายดังกล่าวอาจนำไปสู่ประสิทธิภาพที่สูงขึ้น ในขณะที่ลดไทเตอร์ที่ส่งมอบ การถ่ายโอนสัญญาณนอกเป้าหมาย ผลข้างเคียงจากการอักเสบและภูมิคุ้มกัน และต้นทุนของตัวพายีน ที่สำคัญ ตามที่ผู้ผลิตระบุ CombiMag สามารถใช้ร่วมกับวิธีการถ่ายโอนยีนอื่นๆ ได้ รวมถึงกับเวกเตอร์ไวรัสอื่นๆ (เช่น AAV) และกรดนิวคลีอิก