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Los vectores genéticos para el tratamiento de la fibrosis quística pulmonar deben dirigirse a las vías respiratorias conductoras, ya que la transducción pulmonar periférica no proporciona un beneficio terapéutico. La eficiencia de la transducción viral está directamente relacionada con el tiempo de residencia del vector. Sin embargo, los fluidos de administración, como los transportadores de genes, se difunden naturalmente en los alvéolos durante la inspiración, y las partículas terapéuticas de cualquier forma se eliminan rápidamente mediante el transporte mucociliar. Prolongar el tiempo de residencia de los transportadores de genes en las vías respiratorias es importante, pero difícil de lograr. Las partículas magnéticas conjugadas con transportadores de genes que pueden dirigirse a la superficie de las vías respiratorias pueden mejorar la focalización regional. Debido a los desafíos de la visualización in vivo, el comportamiento de estas pequeñas partículas magnéticas en la superficie de las vías respiratorias en presencia de un campo magnético aplicado es poco conocido. El objetivo de este estudio fue utilizar imágenes de sincrotrón para visualizar el movimiento in vivo de una serie de partículas magnéticas en la tráquea de ratas anestesiadas para examinar la dinámica y los patrones del comportamiento individual y masivo de las partículas in vivo. Posteriormente, también evaluamos si la administración de partículas magnéticas lentivirales en presencia de un campo magnético aumentaría eficiencia de transducción en la tráquea de la rata. Las imágenes de rayos X de sincrotrón revelan el comportamiento de partículas magnéticas en campos magnéticos estacionarios y móviles in vitro e in vivo. Las partículas no se pueden arrastrar fácilmente a lo largo de la superficie de las vías respiratorias vivas con imanes, pero durante el transporte, los depósitos se concentran en el campo de visión donde el campo magnético es más fuerte. La eficiencia de transducción también se incrementó seis veces cuando se administraron partículas magnéticas lentivirales en presencia de un campo magnético. En conjunto, estos resultados sugieren que las partículas magnéticas lentivirales y los campos magnéticos pueden ser enfoques valiosos para mejorar la orientación del vector genético y aumentar los niveles de transducción en las vías respiratorias conductoras in vivo.
La fibrosis quística (FQ) es causada por la variación de un solo gen llamado regulador de conductancia transmembrana de FQ (CFTR). La proteína CFTR es un canal iónico que está presente en muchas células epiteliales en todo el cuerpo, incluidas las vías respiratorias conductoras, un sitio importante de patogénesis de la FQ. Los defectos de CFTR conducen a un transporte de agua anormal, deshidratando la superficie de las vías respiratorias y reduciendo la profundidad de la capa de líquido de la superficie de las vías respiratorias (ASL). Esto también afecta la capacidad del sistema de transporte mucociliar (MCT) para eliminar partículas inhaladas y patógenos de las vías respiratorias. Nuestro objetivo es desarrollar una terapia génica lentiviral (LV) para administrar la copia correcta del gen CFTR y mejorar la ASL, el MCT y la salud pulmonar, y continuar desarrollando nuevas tecnologías capaces de medir estos parámetros in vivo1.
Los vectores LV son uno de los principales candidatos para la terapia génica de las vías respiratorias en la fibrosis quística (FQ), principalmente porque pueden integrar permanentemente el gen terapéutico en las células basales de las vías respiratorias (células madre de las vías respiratorias). Esto es importante porque pueden restaurar la hidratación normal y la depuración del moco al diferenciarse en células superficiales de las vías respiratorias asociadas a la FQ con corrección genética funcional, lo que resulta en beneficios de por vida. Los vectores LV deben dirigirse contra la vía aérea conductora, ya que es aquí donde comienza la enfermedad pulmonar de la FQ. La administración del vector a mayor profundidad en el pulmón puede resultar en la transducción alveolar, pero esto no tiene ningún beneficio terapéutico en la FQ. Sin embargo, fluidos como los portadores de genes migran naturalmente a los alvéolos durante la inspiración después de la administración3,4 y las partículas terapéuticas se eliminan rápidamente en la cavidad oral mediante el MCT. La eficiencia de la transducción LV está directamente relacionada con el tiempo que el vector permanece junto a las células diana para permitir la captación celular (el "tiempo de residencia"5), que se reduce fácilmente mediante el flujo de aire regional típico, así como la captura coordinada de partículas en el moco y el MCT. En la FQ, la capacidad de prolongar el tiempo de residencia del LV dentro de la vía aérea es importante para lograrlo. Los niveles de transducción en esta región son altos, pero hasta ahora ha sido un desafío.
Para superar este obstáculo, sugerimos que las partículas magnéticas (MP) del VI pueden ayudar de dos maneras complementarias. En primer lugar, pueden guiarse magnéticamente hacia la superficie de las vías respiratorias para mejorar la orientación y ayudar a que las partículas portadoras de genes residan en la región de las vías respiratorias deseada; y ASL) para moverse a la capa celular 6. Las MP se han utilizado ampliamente como vehículos de administración de fármacos dirigidos cuando se unen a anticuerpos, fármacos quimioterapéuticos u otras moléculas pequeñas que se adhieren a las membranas celulares o se unen a receptores de la superficie celular relevantes y se acumulan en los sitios del tumor en presencia de electricidad estática. Campos magnéticos para el tratamiento del cáncer 7. Otras técnicas "hipertérmicas" buscan calentar las MP cuando se exponen a campos magnéticos oscilantes, destruyendo así las células tumorales. El principio de la transfección magnética, en el que se utiliza un campo magnético como agente de transfección para mejorar la transferencia de ADN a las células, se utiliza comúnmente in vitro utilizando una gama de vectores génicos no virales y virales para líneas celulares difíciles de transducir. Se ha demostrado la eficacia de la magnetotransfección del VI, con la administración in vitro de MP-VI a una línea celular epitelial bronquial humana en presencia de un campo magnético estático, lo que aumenta la eficiencia de la transducción 186 veces en comparación con el vector VI solo. La MP-VI también se ha aplicado a un modelo de fibrosis quística in vitro, donde la transfección magnética aumentó la transducción del VI en cultivos de interfaz aire-líquido 20 veces en presencia de esputo de fibrosis quística10. Sin embargo, la magnetotransfección in vivo de órganos ha recibido relativamente poca atención y solo se ha evaluado en unos pocos animales. estudios11,12,13,14,15, especialmente en los pulmones16,17. Sin embargo, las oportunidades para la transfección magnética en la terapia pulmonar de la FQ son claras. Tan et al. (2020) afirmaron que "un estudio de prueba de concepto de la administración pulmonar eficiente de nanopartículas magnéticas allanará el camino para futuras estrategias de inhalación de CFTR para mejorar los resultados clínicos en pacientes con FQ"6.
El comportamiento de pequeñas partículas magnéticas en las superficies de las vías respiratorias en presencia de un campo magnético aplicado es difícil de visualizar y estudiar, y por lo tanto poco comprendido. En otros estudios, desarrollamos un método de imágenes de rayos X de contraste de fase basado en propagación de sincrotrón (PB-PCXI) para visualizar y cuantificar de forma no invasiva los cambios in vivo diminutos en la profundidad del ASL18 y el comportamiento de MCT19,20 para medir directamente la hidratación de la superficie del canal de gas y se utiliza como un indicador temprano de la eficacia del tratamiento. Además, nuestro método de evaluación de MCT utiliza partículas de 10 a 35 µm de diámetro compuestas de alúmina o vidrio de alto índice de refracción como marcadores de MCT visibles utilizando PB-PCXI21. Ambas técnicas son adecuadas para la visualización de una variedad de tipos de partículas, incluida la MP.
Debido a su alta resolución espacial y temporal, nuestras técnicas de análisis ASL y MCT basadas en PB-PCXI son adecuadas para examinar la dinámica y los patrones de comportamiento de partículas individuales y en masa in vivo para ayudarnos a comprender y optimizar las técnicas de administración de genes MP. El enfoque que empleamos aquí se deriva de nuestros estudios que utilizan la línea de luz SPring-8 BL20B2, en la que visualizamos el movimiento del fluido después de la administración de una dosis simulada del vector en las vías respiratorias nasales y pulmonares de ratones para ayudar a explicar nuestros patrones de expresión génica no uniforme observados en nuestros estudios en animales sobre dosis de portadores de genes 3,4.
El objetivo de este estudio fue utilizar el sincrotrón PB-PCXI para visualizar los movimientos in vivo de una serie de MP en la tráquea de ratas vivas. Estos estudios de imágenes PB-PCXI fueron diseñados para probar un rango de MP, intensidades de campo magnético y ubicaciones para determinar su efecto en el movimiento de MP. Planteamos la hipótesis de que un campo magnético aplicado externamente ayudaría a que las MP administradas permanecieran o se movieran al área objetivo. Estos estudios también nos permitieron identificar configuraciones de imanes que maximizan la cantidad de partículas retenidas en la tráquea después de la deposición. En una segunda serie de estudios, buscamos utilizar esta configuración óptima para demostrar el patrón de transducción resultante de la administración in vivo de LV-MP a las vías respiratorias de la rata, basándonos en el supuesto de que la administración de LV-MP en el contexto de la orientación de las vías respiratorias resultaría en una mejor eficiencia de transducción del LV.
Todos los estudios con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por la Universidad de Adelaida (M-2019-060 y M-2020-022) y el Comité de Ética Animal del Sincrotrón SPring-8. Los experimentos se realizaron de acuerdo con las pautas ARRIVE.
Todas las imágenes de rayos X se obtuvieron en la línea de luz BL20XU del sincrotrón SPring-8 en Japón, utilizando una configuración similar a la descrita previamente21,22. Brevemente, la caja experimental se ubicó a 245 m del anillo de almacenamiento del sincrotrón. Se utiliza una distancia de muestra a detector de 0,6 m para estudios de imágenes de partículas y de 0,3 m para estudios de imágenes in vivo para generar efectos de contraste de fase. Se utilizó una energía de haz monocromático de 25 keV. Las imágenes se capturaron utilizando un convertidor de rayos X de alta resolución (SPring-8 BM3) acoplado a un detector sCMOS. El convertidor convierte los rayos X en luz visible mediante un centelleador de 10 µm de espesor (Gd₃Al₂Ga₃O₂), que luego se dirige a un sensor sCMOS con un objetivo de microscopio × 10 (NA 0,3). El detector sCMOS fue Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japón). con un tamaño de matriz de 2048 × 2048 píxeles y un tamaño de píxel sin procesar de 6,5 × 6,5 µm. Esta configuración produce un tamaño de píxel isótropo efectivo de 0,51 µm y un campo de visión de aproximadamente 1,1 mm × 1,1 mm. Se eligió una longitud de exposición de 100 ms para maximizar la relación señal-ruido de las partículas magnéticas dentro y fuera de las vías respiratorias mientras se minimizan los artefactos de movimiento inducidos por la respiración. Para los estudios in vivo, se colocó un obturador de rayos X rápido en la trayectoria de rayos X para limitar la dosis de radiación al bloquear el haz de rayos X entre exposiciones.
El portador LV no se utilizó en ningún estudio de imágenes SPring-8 PB-PCXI porque la cámara de imágenes BL20XU no cuenta con certificación de nivel 2 de bioseguridad. En su lugar, seleccionamos una gama de MP bien caracterizados de dos proveedores comerciales (que abarcan una variedad de tamaños, materiales, concentraciones de hierro y aplicaciones), primero para comprender cómo los campos magnéticos afectan el movimiento de MP dentro de capilares de vidrio y, luego, en vías respiratorias vivas. en la superficie. Los MP varían en tamaño de 0,25 a 18 μm y están hechos de una variedad de materiales (ver Tabla 1), pero se desconoce la composición de cada muestra, incluido el tamaño de las partículas magnéticas dentro del MP. Con base en nuestros amplios estudios de MCT 19, 20, 21, 23, 24, esperamos que se puedan ver MP tan pequeños como 5 μm en la superficie de la vía aérea traqueal, por ejemplo, restando cuadros consecutivos para ver una visibilidad mejorada del movimiento del MP. Un solo MP de 0,25 μm es más pequeño que la resolución del dispositivo de imágenes, pero se espera que PB-PCXI detecte su contraste de volumen y el movimiento del fluido de la superficie en el que se depositan después de la deposición.
Las muestras para cada MP en la Tabla 1 se prepararon en capilares de vidrio de 20 μl (Drummond Microcaps, PA, EE. UU.) con un diámetro interno de 0,63 mm. Las partículas corpusculares están disponibles en agua, mientras que las partículas CombiMag están disponibles en el fluido patentado del fabricante. Cada tubo se llena hasta la mitad con líquido (aproximadamente 11 μl) y se coloca en el portamuestras (consulte la Figura 1). Los capilares de vidrio se colocaron horizontalmente en la platina de muestra en la caja de imágenes, respectivamente, y posicionaron los bordes del fluido. Un imán de neodimio, hierro y boro (NdFeB) de tierras raras con carcasa de níquel de 19 mm de diámetro (28 mm de largo) (N35, n.º de cat. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) con una magnetización residual de 1,17 Tesla se conectó a una platina de traslación separada para lograr cambiar su posición de forma remota durante la obtención de imágenes. La adquisición de imágenes de rayos X comienza cuando el imán se coloca aproximadamente a 30 mm por encima de la muestra y las imágenes se adquieren a una velocidad de 4 cuadros por segundo. Durante la obtención de imágenes, el imán se acercó al tubo capilar de vidrio (a aproximadamente 1 mm de distancia) y luego se trasladó a lo largo del tubo para evaluar los efectos de la intensidad y la posición del campo.
Configuración de imágenes in vitro que contiene muestras de MP en capilares de vidrio en la platina de traslación xy de la muestra. La trayectoria del haz de rayos X está marcada con una línea discontinua roja.
Una vez establecida la visibilidad in vitro de las MP, se probó un subconjunto de ellas in vivo en ratas albinas Wistar hembra de tipo salvaje (~12 semanas de edad, ~200 g). 0,24 mg/kg de medetomidina (Domitor®, Zenoaq, Japón), 3,2 mg/kg de midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japón) y 4 mg/kg de butorfanol (Vetorphale®, Meiji Seika). Las ratas se anestesiaron con una mezcla de Pharma), Japón) mediante inyección intraperitoneal. Después de la anestesia, se prepararon para la obtención de imágenes retirando el pelaje alrededor de la tráquea, insertando un tubo endotraqueal (TE; cánula intravenosa de 16 Ga, Terumo BCT) e inmovilizándolas en decúbito supino sobre una placa de imágenes hecha a medida que contenía una bolsa térmica para mantener la temperatura corporal 22. A continuación, la placa de imágenes se adjuntó a la platina de traducción de la muestra en la caja de imágenes en un ligero ángulo para alinear la tráquea horizontalmente en el Imagen de rayos X, como se muestra en la Figura 2a.
(a) Configuración de imágenes in vivo en la caja de imágenes SPring-8, la trayectoria del haz de rayos X está marcada con una línea discontinua roja. (b, c) La localización del imán en la tráquea se realizó de forma remota utilizando dos cámaras IP montadas ortogonalmente. En el lado izquierdo de la imagen de la pantalla, se puede ver el lazo de alambre que sostiene la cabeza y la cánula de administración en su lugar dentro del tubo ET.
Un sistema de bomba de jeringa con control remoto (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) que utiliza una jeringa de vidrio de 100 μl se conectó a un tubo PE10 (DE 0,61 mm, DI 0,28 mm) a través de una aguja de 30 Ga. Marque el tubo para asegurarse de que la punta esté en la posición correcta en la tráquea al insertar el tubo ET. Usando la microbomba, se retiró el émbolo de la jeringa mientras la punta del tubo estaba sumergida en la muestra de MP que se iba a administrar. Luego, el tubo de administración cargado se insertó en el tubo endotraqueal, colocando la punta dentro de la parte más fuerte de nuestro campo magnético aplicado esperado. La adquisición de imágenes se controló utilizando un detector de respiración conectado a nuestra caja de sincronización basada en Arduino, y todas las señales (por ejemplo, temperatura, respiración, apertura/cierre del obturador y adquisición de imágenes) se registraron utilizando Powerlab y LabChart (AD Instruments, Sídney, Australia) 22. Al obtener imágenes Cuando el gabinete era inaccesible, se utilizaron dos cámaras IP (Panasonic BB-SC382) Se colocaron aproximadamente a 90° entre sí y se usaron para monitorear la posición del imán con respecto a la tráquea durante la obtención de imágenes (Fig. 2b,c). Para minimizar los artefactos de movimiento, se adquirió una imagen por respiración durante la meseta del flujo de final de marea.
Se conecta un imán a una segunda etapa que puede ubicarse de forma remota desde el exterior de la carcasa de imágenes. Se probaron varias posiciones y configuraciones de imanes, que incluyen: montado en un ángulo de aproximadamente 30° por encima de la tráquea (configuraciones que se muestran en las Figuras 2a y 3a); un imán por encima del animal y el otro por debajo, con los polos configurados para atraer (Figura 3b); un imán por encima del animal y el otro por debajo, con los polos configurados para repeler (Figura 3c); y un imán por encima y perpendicular a la tráquea (Figura 3d). Una vez que el animal y el imán están configurados y el MP que se va a probar está cargado en la bomba de jeringa, administre una dosis de 50 μl a una velocidad de 4 μl/s mientras adquiere imágenes. Luego, el imán se mueve hacia adelante y hacia atrás a lo largo o lateralmente a través de la tráquea mientras continúa adquiriendo imágenes.
Configuración magnética para la obtención de imágenes in vivo (a) un solo imán encima de la tráquea en un ángulo de aproximadamente 30°, (b) dos imanes configurados para atraer, (c) dos imanes configurados para repeler, (d) un solo imán encima y perpendicular a la tráquea. El observador miró hacia abajo desde la boca hasta los pulmones a través de la tráquea, y el haz de rayos X pasó por el lado izquierdo de la rata y salió por el lado derecho. El imán se mueve a lo largo de la vía aérea o hacia la izquierda y la derecha por encima de la tráquea en la dirección del haz de rayos X.
También buscamos determinar la visibilidad y el comportamiento de las partículas en las vías respiratorias en ausencia de respiración y movimiento cardíaco que confundieran. Por lo tanto, al final del período de obtención de imágenes, los animales fueron sacrificados humanitariamente por sobredosis de pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, EE. UU.; ~65 mg/kg ip). Algunos animales se dejaron en la plataforma de obtención de imágenes y, una vez que se detuvieron la respiración y los latidos del corazón, se repitió el proceso de obtención de imágenes, agregando una dosis adicional de MP si no se veía MP en la superficie de las vías respiratorias.
Las imágenes adquiridas se corrigieron en campo plano y campo oscuro y luego se ensamblaron en una película (20 cuadros por segundo; 15-25 × velocidad normal dependiendo de la frecuencia respiratoria) utilizando un script personalizado escrito en MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Todos los estudios de administración de vectores genéticos LV se llevaron a cabo en el Centro de Investigación con Animales de Laboratorio de la Universidad de Adelaida y tuvieron como objetivo utilizar los resultados del experimento SPring-8 para evaluar si la administración de LV-MP en presencia de un campo magnético podría mejorar la transferencia de genes in vivo. Para evaluar los efectos de MP y el campo magnético, se trataron dos grupos de animales: a un grupo se le administró LV-MP con un imán colocado y el otro grupo recibió un grupo de control con LV-MP sin imán.
Los vectores del gen LV se generaron utilizando métodos descritos previamente 25, 26. El vector LacZ expresa el gen beta-galactosidasa localizado en el núcleo impulsado por el promotor constitutivo MPSV (LV-LacZ), que produce un producto de reacción azul en las células transducidas, visible en los frentes de tejido pulmonar y secciones de tejido. La titulación se realizó en cultivos celulares contando manualmente el número de células positivas a LacZ con un hemocitómetro para calcular el título en TU/ml. Los portadores se criopreservan a -80 °C, se descongelan antes de su uso y se unen a CombiMag mezclando en una proporción de 1:1 e incubando en hielo durante al menos 30 minutos antes de la administración.
Ratas Sprague Dawley normales (n = 3/grupo, ~2-3 fueron anestesiadas intraperitonealmente con una mezcla de 0,4 mg/kg de medetomidina (Domitor, Ilium, Australia) y 60 mg/kg de ketamina (Ilium, Australia) de un mes de edad) ip) inyección y canulación oral no quirúrgica con una cánula iv de 16 Ga. Para asegurar que el tejido de las vías respiratorias traqueales reciba transducción LV, se acondicionó utilizando nuestro protocolo de perturbación mecánica descrito previamente, en el que la superficie de las vías respiratorias traqueales se frotó axialmente con una canasta de alambre (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, EE. UU.) 30 s28. Luego, se realizó la administración traqueal de LV-MP en una cabina de seguridad biológica aproximadamente 10 minutos después de la perturbación.
El campo magnético utilizado en este experimento se configuró de manera similar al estudio de imágenes de rayos X in vivo, con los mismos imanes colocados sobre la tráquea mediante clips de stent de destilación (Figura 4). Se administró un volumen de 50 μl (2 alícuotas de 25 μl) de LV-MP en la tráquea (n = 3 animales) utilizando una pipeta que contenía una punta de gel como se describió anteriormente. Un grupo de control (n = 3 animales) recibió las mismas LV-MP sin el uso de un imán. Una vez completada la infusión, se retira la cánula del tubo endotraqueal y se extuba al animal. El imán permanece en su lugar durante 10 minutos y luego se retira. Las ratas recibieron una dosis subcutánea de meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australia) seguida de la reversión de la anestesia mediante una inyección ip de 1 mg/kg de hidrocloruro de atipamazol (Antisedan, Zoetis, Australia). Las ratas se mantuvieron calientes y se monitorearon hasta la completa recuperación de la anestesia.
Dispositivo de administración LV-MP en una cabina de seguridad biológica. Se puede ver el conector Luer gris claro del tubo ET sobresaliendo de la boca y la punta de gel de la pipeta que se muestra en la imagen se inserta a través del tubo ET hasta la profundidad deseada en la tráquea.
Una semana después del procedimiento de dosificación de LV-MP, los animales fueron sacrificados humanitariamente mediante inhalación de CO2 al 100 % y se evaluó la expresión de LacZ con nuestro tratamiento estándar X-gal. Se retiraron los tres anillos cartilaginosos caudales para garantizar que cualquier daño mecánico o retención de líquidos por la colocación del tubo endotraqueal no se incluyera en el análisis. Cada tráquea se cortó longitudinalmente para crear dos mitades para su análisis, y se montaron en una placa con goma de silicona (Sylgard, Dow Inc) utilizando una aguja Minutien (Fine Science Tools) para visualizar la superficie luminal. La distribución y el patrón de las células transducidas se confirmaron mediante fotografía frontal con un microscopio Nikon (SMZ1500) con una cámara DigiLite y el software TCapture (Tucsen Photonics, China). Las imágenes se adquirieron con un aumento de 20x (incluido el ajuste más alto para el ancho completo de la tráquea), con toda la longitud de la tráquea fotografiada paso a paso, asegurando una superposición suficiente entre cada imagen para permitir la "unión" de imágenes. Imágenes de cada Las tráqueas se ensamblaron luego en una sola imagen compuesta utilizando el Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) utilizando un algoritmo de movimiento planar. Las áreas de expresión de LacZ en imágenes compuestas de la tráquea de cada animal se cuantificaron utilizando un script automatizado de MATLAB (R2020a, MathWorks) como se describió anteriormente, utilizando configuraciones de 0,35 < Tono < 0,58, Saturación > 0,15 y Valor < 0,7. Al rastrear los contornos del tejido, se generó manualmente una máscara en GIMP v2.10.24 para cada imagen compuesta con el fin de identificar el área de tejido y evitar detecciones falsas desde fuera del tejido traqueal. Las áreas teñidas de todas las imágenes compuestas de cada animal se sumaron para generar el área teñida total para ese animal. Luego, el área teñida se dividió por el área total de la máscara para generar el área normalizada.
Cada tráquea se incluyó en parafina y se cortaron secciones de 5 μm. Las secciones se contratiñeron con rojo rápido neutro durante 5 minutos y las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio Nikon Eclipse E400, una cámara DS-Fi3 y el software de captura de elementos NIS (versión 5.20.00).
Todos los análisis estadísticos se realizaron en GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). La significancia estadística se estableció en p ≤ 0,05. La normalidad se verificó mediante la prueba de Shapiro-Wilk y las diferencias en la tinción de LacZ se evaluaron mediante la prueba t no pareada.
Las seis MP descritas en la Tabla 1 se examinaron con PCXI, y su visibilidad se describe en la Tabla 2. Dos MP de poliestireno (MP1 y MP2; 18 μm y 0,25 μm, respectivamente) no fueron visibles con PCXI, pero el resto de las muestras fueron identificables (se muestran ejemplos en la Figura 5). MP3 y MP4 (10-15 % Fe₃O₃; 0,25 μm y 0,9 μm, respectivamente) son apenas visibles. Aunque contiene algunas de las partículas más pequeñas analizadas, MP5 (98 % Fe₃O₃; 0,25 μm) fue la más pronunciada. El producto CombiMag MP6 es difícil de detectar. En todos los casos, nuestra capacidad para detectar MP mejoró significativamente al mover el imán de un lado a otro en paralelo al capilar. Cuando los imanes se alejaron del capilar, las partículas se extendieron en largas cadenas, pero a medida que los imanes se acercaron y la intensidad del campo magnético aumentó, las cadenas de partículas... se acorta a medida que las partículas migran hacia la superficie superior del capilar (ver video complementario S1: MP4), lo que aumenta la densidad de partículas de la superficie. Por el contrario, cuando se retira el imán del capilar, la intensidad del campo disminuye y las MP se reorganizan en largas cadenas que se extienden desde la superficie superior del capilar (ver video complementario S2: MP4). Después de que el imán deja de moverse, las partículas continúan moviéndose durante un corto tiempo después de alcanzar la posición de equilibrio. A medida que las MP se mueven hacia y desde la superficie superior del capilar, las partículas magnéticas generalmente arrastran los desechos a través del fluido.
La visibilidad de MP bajo PCXI varía significativamente entre muestras. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 y (d) MP6. Todas las imágenes que se muestran aquí se tomaron con un imán ubicado aproximadamente a 10 mm directamente sobre el capilar. Los círculos grandes aparentes son burbujas de aire atrapadas en los capilares, que muestran claramente las características del borde blanco y negro de las imágenes de contraste de fase. El cuadro rojo contiene la ampliación de mejora de contraste. Tenga en cuenta que los diámetros de los esquemas del imán en todas las figuras no están a escala y son aproximadamente 100 veces más grandes que los que se muestran.
A medida que el imán se desplaza a izquierda y derecha a lo largo de la parte superior del capilar, el ángulo de la cuerda de partículas magnéticas cambia para alinearse con el imán (véase la Figura 6), delineando así las líneas del campo magnético. En el caso del MP3-5, una vez que la cuerda alcanza un ángulo umbral, las partículas son arrastradas a lo largo de la superficie superior del capilar. Esto suele provocar que las partículas magnéticas se agrupen en grupos más grandes cerca de donde el campo magnético es más intenso (véase el vídeo complementario S3:MP5). Esto también es particularmente evidente al obtener imágenes cerca del extremo del capilar, lo que provoca que las partículas magnéticas se agreguen y concentren en la interfaz fluido-aire. Las partículas en el MP6, que eran más difíciles de discernir que en el MP3-5, no fueron arrastradas a medida que el imán se desplazaba a lo largo del capilar, sino que las cuerdas de partículas magnéticas se disociaron, dejando las partículas en el campo de visión (véase el vídeo complementario S4:MP6). En algunos casos, al reducir el campo magnético aplicado desplazando el imán a una gran distancia de la ubicación de la imagen, las partículas magnéticas restantes descendieron lentamente a la superficie inferior del tubo por gravedad, permaneciendo en la cuerda (véase el vídeo complementario). S5:MP3).
El ángulo de la cuerda MP cambia a medida que el imán se traslada hacia la derecha por encima del capilar. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 y (d) MP6. El cuadro rojo contiene la ampliación que mejora el contraste. Tenga en cuenta que los videos complementarios son informativos ya que revelan una estructura de partículas importante e información dinámica que no se puede visualizar en estas imágenes estáticas.
Nuestras pruebas demostraron que mover el imán lentamente hacia adelante y hacia atrás a lo largo de la tráquea facilita la visualización de MP en el contexto del movimiento complejo in vivo. No se realizaron pruebas in vivo ya que las perlas de poliestireno (MP1 y MP2) no eran visibles en el capilar. Cada uno de los cuatro MP restantes se probó in vivo con el eje largo del imán configurado sobre la tráquea en un ángulo de aproximadamente 30° con respecto a la vertical (ver Figuras 2b y 3a), ya que esto resultó en cadenas de MP más largas y fue más efectivo que la configuración del imán terminado. MP3, MP4 y MP6 no se detectaron en la tráquea de ningún animal vivo. Cuando se tomaron imágenes de las vías respiratorias de las ratas después de que los animales fueron sacrificados humanitariamente, las partículas permanecieron invisibles incluso cuando se agregó volumen adicional usando una bomba de jeringa. MP5 tuvo el mayor contenido de óxido de hierro y fue la única partícula visible, y por lo tanto se utilizó para evaluar y caracterizar el comportamiento in vivo de MP.
La colocación del imán sobre la tráquea durante la administración de MP resultó en que muchas, pero no todas, las MP se concentraran en el campo de visión. Las partículas que ingresan a la tráquea se observan mejor en animales sacrificados humanitariamente. La Figura 7 y el video complementario S6: MP5 muestran una rápida captura magnética y alineación de partículas en la superficie de la tráquea ventral, lo que indica que las MP se pueden dirigir a las regiones deseadas de la tráquea. Al buscar más distalmente a lo largo de la tráquea después de la administración de MP, se encontraron algunas MP más cerca de la carina, lo que sugiere que la intensidad del campo magnético fue insuficiente para recolectar y retener todas las MP, ya que se administraron a través de la región de máxima intensidad de campo magnético durante el proceso del fluido. Sin embargo, las concentraciones de MP posparto fueron más altas alrededor del área fotografiada, lo que sugiere que muchas MP permanecieron en las regiones de las vías respiratorias donde la intensidad del campo magnético aplicado fue mayor.
Imágenes de (a) antes y (b) después de la administración de MP5 en la tráquea de una rata recientemente sacrificada con el imán posicionado directamente sobre el área de la imagen. El área fotografiada se encuentra entre los dos anillos de cartílago. Antes de la administración de MP5, hay algo de líquido en las vías respiratorias. El cuadro rojo contiene la ampliación para mejorar el contraste. Estas imágenes son del video que se muestra en el video complementario S6:MP5.
La traducción del imán a lo largo de la tráquea in vivo provocó que la cadena de MP cambiara el ángulo dentro de la superficie de la vía aérea de una manera similar a la observada en los capilares (ver Figura 8 y Video complementario S7:MP5). Sin embargo, en nuestro estudio, las MP no pudieron ser arrastradas a lo largo de la superficie de la vía aérea viva como sí pudieron con los capilares. En algunos casos, la cadena de MP se alargará a medida que el imán se mueve de izquierda a derecha. Curiosamente, también descubrimos que la cadena de partículas parece cambiar la profundidad de la capa de fluido superficial cuando el imán se mueve longitudinalmente a lo largo de la tráquea, y se expande cuando el imán se mueve directamente sobre la cabeza y la cadena de partículas gira a una posición vertical (ver Video complementario S7). :MP5 a las 0:09, abajo a la derecha). El patrón característico de movimiento cambió cuando el imán se trasladó a través de la parte superior de la tráquea lateralmente (es decir, a la izquierda o derecha del animal en lugar de a lo largo de la tráquea). Las partículas todavía eran claramente visibles mientras se movían, pero cuando se retiró el imán de la tráquea, las puntas de las cadenas de partículas se hicieron visibles (ver video complementario S8:MP5, a partir de las 0:08). Esto es consistente con el comportamiento de MP que observamos bajo un campo magnético aplicado en un capilar de vidrio.
Imágenes de ejemplo que muestran MP5 en la tráquea de una rata anestesiada viva. (a) Se utiliza el imán para adquirir imágenes arriba y a la izquierda de la tráquea, luego (b) después de que el imán se mueve hacia la derecha. El cuadro rojo contiene la ampliación que mejora el contraste. Estas imágenes son del video que se muestra en el video complementario S7: MP5.
Cuando los dos polos se configuraron en una orientación norte-sur por encima y por debajo de la tráquea (es decir, atrayendo; Fig. 3b), las cuerdas MP parecían más largas y se ubicaban en la pared lateral de la tráquea en lugar de en la superficie traqueal dorsal (ver Video complementario S9:MP5). Sin embargo, no se detectaron altas concentraciones de partículas en una sola ubicación (es decir, la superficie dorsal de la tráquea) después de la administración de líquido cuando se utilizó un dispositivo de doble imán, lo que suele ocurrir cuando se utiliza un dispositivo de un solo imán. Luego, cuando se configuró un imán para repeler los polos invertidos (Fig. 3c), la cantidad de partículas visibles en el campo de visión no pareció aumentar después de la administración. La configuración de ambas configuraciones de doble imán es desafiante debido a las altas intensidades del campo magnético que atraen o empujan los imanes, respectivamente. Luego, la configuración se cambió a un solo imán paralelo a la vía aérea, pero que la atraviesa a 90 grados para que las líneas de campo cruzaran la pared traqueal ortogonalmente (Fig. 3d), una orientación diseñada para determinar si se podía observar agregación de partículas en la pared lateral. Sin embargo, en esta configuración, no hubo un movimiento identificable de acumulación de MP o movimiento del imán. Con base en todos estos resultados, se eligió una configuración de orientación de 30 grados con un solo imán (Figura 3a) para los estudios de portadores de genes in vivo.
Al tomar imágenes repetidas del animal inmediatamente después de la matanza humanitaria, la ausencia de movimiento tisular que pudiera confundir el campo intercondral permitió distinguir líneas de partículas más finas y cortas, que se desplazaban con el movimiento de traslación del imán. Sin embargo, aún no se puede apreciar con claridad la presencia ni el movimiento de las partículas MP6.
El título de LV-LacZ fue 1,8 × 108 TU/ml, y después de mezclar 1:1 con CombiMag MP (MP6), los animales recibieron una dosis traqueal de 50 μl de vehículo LV de 9 × 107 TU/ml (es decir, 4,5 × 106 TU/rata). ). En estos estudios, en lugar de trasladar el imán durante el parto, fijamos el imán en una posición para determinar si la transducción LV (a) podría mejorarse en comparación con la administración del vector en ausencia de un campo magnético, y (b) podría enfocarse Las células de las vías respiratorias se transducen a regiones objetivo magnéticas de las vías respiratorias superiores.
La presencia de imanes y el uso de CombiMag combinado con vectores LV no parecieron tener efectos adversos en la salud animal, al igual que nuestro protocolo estándar de administración de vectores LV. Las imágenes frontales de la región traqueal sometida a perturbación mecánica (Fig. 1 suplementaria) indicaron que hubo niveles significativamente más altos de transducción en el grupo de animales tratados con LV-MP cuando el imán estaba presente (Fig. 9a). Solo una pequeña cantidad de tinción azul LacZ estaba presente en el grupo control (Fig. 9b). La cuantificación de áreas teñidas con X-Gal normalizadas mostró que la administración de LV-MP en presencia de un campo magnético produjo una mejora de aproximadamente 6 veces (Fig. 9c).
Ejemplo de imágenes compuestas que muestran la transducción traqueal por LV-MP (a) en presencia de un campo magnético y (b) en ausencia de un imán. (c) Mejora estadísticamente significativa en el área de transducción LacZ normalizada dentro de la tráquea cuando se utiliza el imán (*p = 0,029, prueba t, n = 3 por grupo, media ± SEM).
Las secciones teñidas con rojo rápido neutro (ejemplo mostrado en la Figura 2 complementaria) mostraron células teñidas con LacZ presentes en un patrón y ubicación similares a los informados previamente.
Un desafío clave para la terapia génica de las vías respiratorias sigue siendo la localización precisa de las partículas portadoras en las regiones de interés y el logro de altos niveles de eficiencia de transducción en el pulmón en movimiento en presencia de flujo de aire y depuración activa de moco. Para los portadores del VI diseñados para tratar la enfermedad de las vías respiratorias por fibrosis quística, aumentar el tiempo de residencia de las partículas portadoras dentro de las vías respiratorias conductoras ha sido un objetivo hasta ahora difícil de alcanzar. Como señalan Castellani et al., el uso de campos magnéticos para mejorar la transducción tiene ventajas en comparación con otros métodos de administración de genes, como la electroporación, ya que puede combinar simplicidad, rentabilidad, localización de la administración, mayor eficiencia y tiempos de incubación más cortos, y posiblemente una dosis portadora más pequeña10. Sin embargo, la deposición in vivo y el comportamiento de partículas magnéticas en las vías respiratorias bajo la influencia de fuerzas magnéticas externas nunca se han descrito, ni tampoco se ha demostrado realmente la viabilidad de este método in vivo para mejorar los niveles de expresión génica en vías respiratorias vivas intactas.
Nuestros experimentos in vitro con sincrotrón PCXI mostraron que todas las partículas que probamos, con la excepción del poliestireno MP, eran visibles en la configuración de imágenes que utilizamos. En presencia de un campo magnético, los MP forman cuerdas cuyas longitudes están relacionadas con el tipo de partícula y la intensidad del campo magnético (es decir, la proximidad y el movimiento del imán). Como se muestra en la Figura 10, las cuerdas que observamos se forman debido a que cada partícula individual está magnetizada e induce su propio campo magnético local. Estos campos separados hacen que otras partículas similares se agreguen y se conecten, con movimientos grupales similares a cuerdas debido a las fuerzas locales de las fuerzas atractivas y repulsivas locales de otras partículas.
Esquema que muestra (a,b) trenes de partículas generados dentro de capilares llenos de líquido y (c,d) tráquea llena de aire. Nótese que los capilares y la tráquea no están dibujados a escala. El panel (a) también contiene una descripción del MP, que contiene partículas de Fe3O4 dispuestas en cuerdas.
Cuando el imán se movió por encima del capilar, el ángulo de la cadena de partículas alcanzó un umbral crítico para MP3-5 que contenía Fe3O4, después de lo cual la cadena de partículas ya no permaneció en la posición original, sino que se movió a lo largo de la superficie a una nueva posición. Es probable que este efecto ocurra porque la superficie del capilar de vidrio es lo suficientemente lisa como para permitir que ocurra este movimiento. Curiosamente, MP6 (CombiMag) no se comportó de esta manera, posiblemente porque las partículas eran más pequeñas, tenían diferentes recubrimientos o cargas superficiales, o un fluido portador patentado afectó su capacidad de movimiento. El contraste de imagen de las partículas CombiMag también es más débil, lo que sugiere que el fluido y las partículas pueden tener densidades similares y, por lo tanto, no moverse fácilmente entre sí. Las partículas también pueden atascarse si el imán se mueve demasiado rápido, lo que indica que la intensidad del campo magnético no siempre puede superar la fricción entre las partículas en el fluido, lo que sugiere que quizás no sea sorprendente que la intensidad del campo magnético y la distancia entre el imán y el área objetivo sean muy importantes. En conjunto, estos resultados también sugieren que, si bien los imanes pueden capturar muchos MP que fluyen a través del área objetivo, es Es poco probable que se pueda confiar en los imanes para mover partículas CombiMag a lo largo de la superficie de la tráquea. Por lo tanto, concluimos que los estudios de LV-MP in vivo deben utilizar campos magnéticos estáticos para apuntar físicamente a regiones específicas del árbol de las vías respiratorias.
Cuando las partículas se liberan en el cuerpo, son difíciles de identificar en el contexto del tejido corporal complejo en movimiento, pero la capacidad de detectarlas se mejoró al trasladar el imán horizontalmente sobre la tráquea para "mover" las cuerdas de MP. Aunque es posible obtener imágenes en vivo, es más fácil discernir el movimiento de las partículas una vez que el animal ha sido sacrificado humanitariamente. Las concentraciones de MP fueron generalmente más altas en esta ubicación cuando el imán se colocó sobre el área de imagen, aunque algunas partículas generalmente se encontraron más adelante en la tráquea. A diferencia de los estudios in vitro, las partículas no se pueden arrastrar a lo largo de la tráquea al trasladar el imán. Este hallazgo es consistente con la forma en que el moco que recubre la superficie de la tráquea generalmente procesa las partículas inhaladas, atrapándolas en el moco y posteriormente eliminándolas mediante el mecanismo de depuración mucociliar.
Planteamos la hipótesis de que el uso de imanes para la atracción por encima y por debajo de la tráquea (Fig. 3b) podría resultar en un campo magnético más uniforme, en lugar de un campo magnético altamente concentrado en un punto, lo que potencialmente llevaría a una distribución más uniforme de partículas. Sin embargo, nuestro estudio preliminar no encontró evidencia clara que sustente esta hipótesis. Asimismo, configurar un par de imanes para repeler (Fig. 3c) no resultó en una mayor deposición de partículas en el área fotografiada. Estos dos hallazgos demuestran que la configuración de doble imán no mejora significativamente el control local de la focalización de las partículas magnéticas y que las fuertes fuerzas magnéticas resultantes son difíciles de configurar, lo que hace que este enfoque sea menos práctico. De igual manera, orientar el imán por encima y a través de la tráquea (Fig. 3d) tampoco aumentó la cantidad de partículas retenidas en el área fotografiada. Algunas de estas configuraciones alternativas pueden no ser exitosas porque resultan en menores intensidades de campo magnético dentro del área de deposición. Por lo tanto, la configuración de un solo imán con un ángulo de 30 grados (Figura 3a) se considera el método más fácil y eficiente para pruebas in vivo.
El estudio LV-MP mostró que cuando los vectores LV se combinaron con CombiMag y se administraron después de una perturbación física en presencia de un campo magnético, los niveles de transducción aumentaron significativamente en la tráquea en comparación con los controles. Con base en los estudios de imágenes de sincrotrón y los resultados de LacZ, el campo magnético aparentemente pudo preservar el LV dentro de la tráquea y reducir la cantidad de partículas del vector que penetraron inmediatamente en profundidad en el pulmón. Dichas mejoras en la focalización pueden conducir a una mayor eficacia al tiempo que reducen los títulos administrados, la transducción fuera del objetivo, los efectos secundarios inflamatorios e inmunes y los costos del transportador de genes. Es importante destacar que, según el fabricante, CombiMag se puede utilizar junto con otros métodos de transferencia genética, incluidos otros vectores virales (como AAV) y ácidos nucleicos.