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Los vectores genéticos para el tratamiento de la enfermedad pulmonar por fibrosis quística deben dirigirse a las vías respiratorias conductoras porque la transducción pulmonar periférica no proporciona beneficio terapéutico. La eficiencia de la transducción viral está directamente relacionada con el tiempo de residencia del vector. Sin embargo, los fluidos de administración, como los portadores genéticos, se difunden naturalmente en los alvéolos durante la inspiración, y las partículas terapéuticas de cualquier forma se eliminan rápidamente por el transporte mucociliar. Prolongar el tiempo de residencia de los portadores genéticos en las vías respiratorias es importante pero difícil de lograr. Las partículas magnéticas conjugadas con portadores genéticos que pueden dirigirse a la superficie de las vías respiratorias pueden mejorar la focalización regional. Debido a los desafíos de la visualización in vivo, el comportamiento de estas pequeñas partículas magnéticas en la superficie de las vías respiratorias en presencia de un campo magnético aplicado es poco conocido. El objetivo de este estudio fue utilizar imágenes de sincrotrón para visualizar el movimiento in vivo de una serie de partículas magnéticas en la tráquea de ratas anestesiadas para examinar la dinámica y los patrones del comportamiento de partículas individuales y en conjunto in vivo. Luego también evaluamos si la administración de partículas magnéticas lentivirales en presencia de un campo magnético aumentaría la eficiencia de la transducción en las vías respiratorias. la tráquea de la rata. Las imágenes de rayos X de sincrotrón revelan el comportamiento de las partículas magnéticas en campos magnéticos estacionarios y en movimiento in vitro e in vivo. Las partículas no se pueden arrastrar fácilmente a lo largo de la superficie de las vías respiratorias vivas con imanes, pero durante el transporte, los depósitos se concentran en el campo de visión donde el campo magnético es más fuerte. La eficiencia de transducción también aumentó seis veces cuando las partículas magnéticas lentivirales se administraron en presencia de un campo magnético. En conjunto, estos resultados sugieren que las partículas magnéticas lentivirales y los campos magnéticos pueden ser enfoques valiosos para mejorar la focalización de los vectores genéticos y aumentar los niveles de transducción en las vías respiratorias conductoras in vivo.
La fibrosis quística (FQ) es causada por una variación en un solo gen llamado regulador de la conductancia transmembrana de la FQ (CFTR). La proteína CFTR es un canal iónico que está presente en muchas células epiteliales en todo el cuerpo, incluidas las vías respiratorias conductoras, un sitio importante de patogénesis de la FQ. Los defectos de CFTR conducen a un transporte anormal de agua, deshidratando la superficie de las vías respiratorias y reduciendo la profundidad de la capa de líquido de la superficie de las vías respiratorias (ASL). Esto también perjudica la capacidad del sistema de transporte mucociliar (MCT) para eliminar partículas y patógenos inhalados de las vías respiratorias. Nuestro objetivo es desarrollar una terapia génica lentiviral (LV) para administrar la copia correcta del gen CFTR y mejorar el ASL, el MCT y la salud pulmonar, y continuar desarrollando nuevas tecnologías capaces de medir estos parámetros in vivo1.
Los vectores LV son uno de los principales candidatos para la terapia génica de las vías respiratorias en la fibrosis quística (FQ), principalmente porque pueden integrar permanentemente el gen terapéutico en las células basales de las vías respiratorias (células madre de las vías respiratorias). Esto es importante porque pueden restaurar la hidratación normal y la eliminación de moco al diferenciarse en células superficiales de las vías respiratorias asociadas a la FQ con corrección génica funcional, lo que resulta en beneficios de por vida. Los vectores LV deben dirigirse contra las vías respiratorias conductoras, ya que es allí donde comienza la enfermedad pulmonar de la FQ. La administración del vector más profundamente en el pulmón puede resultar en transducción alveolar, pero esto no tiene beneficio terapéutico en la FQ. Sin embargo, los fluidos como los portadores de genes migran naturalmente a los alvéolos durante la inspiración después de la administración3,4 y las partículas terapéuticas se eliminan rápidamente en la cavidad oral por el transporte mucociliar (TMC). La eficiencia de la transducción de LV está directamente relacionada con el tiempo que el vector permanece junto a las células objetivo para permitir la captación celular (el "tiempo de residencia"5), que se reduce fácilmente por el flujo de aire regional típico, así como por la captura coordinada de moco de partículas y el TMC. Para la FQ, la capacidad de prolongar el tiempo de residencia del LV dentro de las vías respiratorias es importante para lograr altos niveles de La transducción en esta región ha resultado ser un desafío hasta el momento.
Para superar este obstáculo, sugerimos que las partículas magnéticas de LV (MP) pueden ayudar de dos maneras complementarias. Primero, pueden ser guiadas magnéticamente a la superficie de las vías respiratorias para mejorar la focalización y ayudar a que las partículas portadoras de genes residan en la región deseada de las vías respiratorias; y ASL) para moverse a la capa celular 6. Las MP se han utilizado ampliamente como vehículos de administración dirigida de fármacos cuando se unen a anticuerpos, fármacos quimioterapéuticos u otras moléculas pequeñas que se adhieren a las membranas celulares o se unen a receptores relevantes de la superficie celular y se acumulan en los sitios tumorales en presencia de electricidad estática. Campos magnéticos para el tratamiento del cáncer 7. Otras técnicas “hipertérmicas” buscan calentar las MP cuando se exponen a campos magnéticos oscilantes, destruyendo así las células tumorales. El principio de la transfección magnética, en la que se utiliza un campo magnético como agente de transfección para mejorar la transferencia de ADN a las células, se usa comúnmente in vitro utilizando una variedad de vectores genéticos virales y no virales para líneas celulares difíciles de transducir. Se ha establecido la eficacia de la magnetotransfección con LV, con la administración in vitro de LV-MP a una línea celular epitelial bronquial humana en presencia de un campo magnético estático, aumentando la eficiencia de transducción en 186 veces en comparación con el vector LV solo. Las LV-MP también se han aplicado a un modelo de fibrosis quística in vitro, donde la transfección magnética aumentó la transducción de LV en cultivos de interfaz aire-líquido en 20 veces en presencia de esputo de fibrosis quística10. Sin embargo, la magnetotransfección in vivo de órganos ha recibido relativamente poca atención y solo se ha evaluado en unos pocos animales. estudios11,12,13,14,15, especialmente en los pulmones16,17. Sin embargo, las oportunidades para la transfección magnética en la terapia pulmonar de la FQ son claras. Tan et al. (2020) afirmaron que “un estudio de prueba de concepto de administración pulmonar eficiente de nanopartículas magnéticas allanará el camino para futuras estrategias de inhalación de CFTR para mejorar los resultados clínicos en pacientes con FQ”6.
El comportamiento de las pequeñas partículas magnéticas en las superficies de las vías respiratorias en presencia de un campo magnético aplicado es difícil de visualizar y estudiar, y por lo tanto, se comprende poco. En otros estudios, desarrollamos un método de imágenes de rayos X de contraste de fase basado en propagación de sincrotrón (PB-PCXI) para visualizar y cuantificar de forma no invasiva cambios mínimos in vivo en la profundidad de ASL18 y el comportamiento de MCT19,20 para medir directamente la hidratación de la superficie del canal de gas y se utiliza como un indicador temprano de la eficacia del tratamiento. Además, nuestro método de evaluación de MCT utiliza partículas de 10 a 35 µm de diámetro compuestas de alúmina o vidrio de alto índice de refracción como marcadores de MCT visibles mediante PB-PCXI21. Ambas técnicas son adecuadas para la visualización de una variedad de tipos de partículas, incluidas las MP.
Debido a su alta resolución espacial y temporal, nuestras técnicas de análisis ASL y MCT basadas en PB-PCXI son muy adecuadas para examinar la dinámica y los patrones del comportamiento de partículas individuales y en masa in vivo para ayudarnos a comprender y optimizar las técnicas de administración de genes MP. El enfoque que empleamos aquí se deriva de nuestros estudios utilizando la línea de luz SPring-8 BL20B2, en la que visualizamos el movimiento de fluidos después de la administración de una dosis de vector simulado en las vías respiratorias nasales y pulmonares de ratones para ayudar a explicar nuestros patrones de expresión genética no uniformes observados en nuestros estudios de animales con dosis de portador de genes 3,4.
El objetivo de este estudio fue utilizar el sincrotrón PB-PCXI para visualizar los movimientos in vivo de una serie de MP en la tráquea de ratas vivas. Estos estudios de imágenes PB-PCXI se diseñaron para probar una gama de MP, intensidades de campo magnético y ubicaciones para determinar su efecto en el movimiento de las MP. Planteamos la hipótesis de que un campo magnético aplicado externamente ayudaría a que la MP administrada permaneciera o se moviera hacia el área objetivo. Estos estudios también nos permitieron identificar configuraciones de imanes que maximizan la cantidad de partículas retenidas en la tráquea después de la deposición. En una segunda serie de estudios, buscamos utilizar esta configuración óptima para demostrar el patrón de transducción resultante de la administración in vivo de LV-MP a las vías respiratorias de la rata, basándonos en la suposición de que la administración de LV-MP en el contexto de la focalización de las vías respiratorias resultaría en una eficiencia de transducción LV mejorada.
Todos los estudios con animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por la Universidad de Adelaida (M-2019-060 y M-2020-022) y el Comité de Ética Animal del Sincrotrón SPring-8. Los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices ARRIVE.
Todas las imágenes de rayos X se obtuvieron en la línea de luz BL20XU del sincrotrón SPring-8 en Japón, utilizando una configuración similar a la descrita previamente21,22. En resumen, la caja experimental se ubicó a 245 m del anillo de almacenamiento del sincrotrón. Se utilizó una distancia entre la muestra y el detector de 0,6 m para estudios de imágenes de partículas y de 0,3 m para estudios de imágenes in vivo, con el fin de generar efectos de contraste de fase. Se empleó una energía de haz monocromático de 25 keV. Las imágenes se capturaron utilizando un convertidor de rayos X de alta resolución (SPring-8 BM3) acoplado a un detector sCMOS. El convertidor transforma los rayos X en luz visible mediante un centelleador de 10 µm de espesor (Gd3Al2Ga3O12), que luego se dirige a un sensor sCMOS mediante un objetivo de microscopio de ×10 (NA 0,3). El detector sCMOS utilizado fue un Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japón) con una matriz tamaño de 2048 × 2048 píxeles y un tamaño de píxel sin procesar de 6,5 × 6,5 µm. Esta configuración produce un tamaño de píxel isotrópico efectivo de 0,51 µm y un campo de visión de aproximadamente 1,1 mm × 1,1 mm. Se eligió una duración de exposición de 100 ms para maximizar la relación señal-ruido de las partículas magnéticas dentro y fuera de las vías respiratorias, minimizando al mismo tiempo los artefactos de movimiento inducidos por la respiración. Para los estudios in vivo, se colocó un obturador rápido de rayos X en la trayectoria de los rayos X para limitar la dosis de radiación bloqueando el haz de rayos X entre exposiciones.
El soporte LV no se utilizó en ningún estudio de imágenes SPring-8 PB-PCXI porque la cámara de imágenes BL20XU no cuenta con la certificación de Nivel 2 de Bioseguridad. En su lugar, seleccionamos una gama de micropartículas bien caracterizadas de dos proveedores comerciales, que abarcan una variedad de tamaños, materiales, concentraciones de hierro y aplicaciones, primero para comprender cómo los campos magnéticos afectan el movimiento de las micropartículas dentro de los capilares de vidrio y luego en las vías respiratorias vivas. en la superficie. Las MP varían en tamaño de 0,25 a 18 μm y están hechas de una variedad de materiales (ver Tabla 1), pero se desconoce la composición de cada muestra, incluido el tamaño de las partículas magnéticas dentro de la MP. Basándonos en nuestros extensos estudios de MCT 19, 20, 21, 23, 24, esperamos que se puedan ver MP tan pequeñas como 5 μm en la superficie de las vías respiratorias traqueales, por ejemplo, restando fotogramas consecutivos para ver una mayor visibilidad del movimiento de las MP. Una sola MP de 0,25 μm es más pequeña que la resolución del dispositivo de imágenes, pero se espera que PB-PCXI detecte su contraste de volumen y el movimiento del fluido superficial sobre el que se depositan después de la deposición.
Las muestras para cada MP de la Tabla 1 se prepararon en capilares de vidrio de 20 μl (Drummond Microcaps, PA, EE. UU.) con un diámetro interno de 0,63 mm. Las partículas corpusculares están disponibles en agua, mientras que las partículas CombiMag están disponibles en el fluido patentado del fabricante. Cada tubo se llenó hasta la mitad con líquido (aproximadamente 11 μl) y se colocó en el portamuestras (véase la Figura 1). Los capilares de vidrio se colocaron horizontalmente en la platina de la muestra en la caja de imagen, respectivamente, y se posicionaron los bordes del fluido. Un imán de neodimio-hierro-boro (NdFeB) de tierras raras con carcasa de níquel de 19 mm de diámetro (28 mm de longitud) (N35, n.º de cat. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) con una magnetización residual de 1,17 Tesla se acopló a una platina de traslación separada para lograr el cambio de posición remoto durante la adquisición de imágenes. La adquisición de imágenes de rayos X comienza cuando el imán se posiciona aproximadamente a 30 mm por encima de la muestra, y las imágenes se adquieren a una velocidad de 4 fotogramas por segundo. Segundo. Durante la toma de imágenes, el imán se acercó al tubo capilar de vidrio (a aproximadamente 1 mm de distancia) y luego se desplazó a lo largo del tubo para evaluar los efectos de la intensidad del campo y la posición.
Sistema de obtención de imágenes in vitro que contiene muestras de MP en capilares de vidrio sobre la platina de traslación xy de la muestra. La trayectoria del haz de rayos X está marcada con una línea discontinua roja.
Una vez establecida la visibilidad in vitro de las MP, un subconjunto de ellas se probó in vivo en ratas Wistar albinas hembras de tipo salvaje (~12 semanas de edad, ~200 g). 0,24 mg/kg de medetomidina (Domitor®, Zenoaq, Japón), 3,2 mg/kg de midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japón) y 4 mg/kg de butorfanol (Vetorphale®, Meiji Seika Pharma), Japón) Las ratas fueron anestesiadas con una mezcla de Pharma), Japón) mediante inyección intraperitoneal. Después de la anestesia, se prepararon para la obtención de imágenes retirando el pelaje alrededor de la tráquea, insertando un tubo endotraqueal (ET; cánula iv de 16 Ga, Terumo BCT) e inmovilizándolas en decúbito supino sobre una placa de imágenes hecha a medida que contenía una bolsa térmica para mantener la temperatura corporal 22. La placa de imágenes se fijó a la etapa de traslación de la muestra en la caja de imágenes en un ligero ángulo para alinear la tráquea horizontalmente en el campo de rayos X. imagen, como se muestra en la Figura 2a.
(a) Configuración de imágenes in vivo en la caja de imágenes SPring-8, la trayectoria del haz de rayos X está marcada con una línea discontinua roja. (b,c) La localización del imán en la tráquea se realizó de forma remota utilizando dos cámaras IP montadas ortogonalmente. En el lado izquierdo de la imagen de la pantalla, se puede ver el lazo de alambre que sostiene la cabeza y la cánula de administración en su lugar dentro del tubo endotraqueal.
Un sistema de bomba de jeringa controlado remotamente (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) que utiliza una jeringa de vidrio de 100 μl se conectó a un tubo PE10 (OD 0,61 mm, ID 0,28 mm) a través de una aguja de 30 Ga. Marque el tubo para asegurar que la punta esté en la posición correcta en la tráquea al insertar el tubo ET. Usando la microbomba, se retiró el émbolo de la jeringa mientras la punta del tubo estaba sumergida en la muestra MP que se iba a administrar. Luego, el tubo de administración cargado se insertó en el tubo endotraqueal, colocando la punta dentro de la parte más fuerte de nuestro campo magnético aplicado esperado. La adquisición de imágenes se controló usando un detector de respiración conectado a nuestra caja de temporización basada en Arduino, y todas las señales (por ejemplo, temperatura, respiración, apertura/cierre del obturador y adquisición de imágenes) se registraron usando Powerlab y LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22. Cuando la imagen Cuando el recinto era inaccesible, dos cámaras IP (Panasonic BB-SC382) se colocaron aproximadamente a estaban a 90° entre sí y se utilizaron para monitorear la posición del imán en relación con la tráquea durante la obtención de imágenes (Fig. 2b,c). Para minimizar los artefactos de movimiento, se adquirió una imagen por respiración durante la meseta del flujo al final de la espiración.
Se coloca un imán en una segunda etapa que se puede ubicar de forma remota desde fuera de la carcasa de imágenes. Se probaron varias posiciones y configuraciones del imán, incluyendo: montado en un ángulo de aproximadamente 30° por encima de la tráquea (configuraciones mostradas en las Figuras 2a y 3a); un imán por encima del animal y el otro por debajo, con los polos configurados para atraer (Figura 3b); un imán por encima del animal y el otro por debajo, con los polos configurados para repeler (Figura 3c); y un imán por encima y perpendicular a la tráquea (Figura 3d). Una vez que el animal y el imán están configurados y el MP a probar se carga en la bomba de jeringa, se administra una dosis de 50 μl a una velocidad de 4 μl/seg mientras se adquieren imágenes. Luego, el imán se mueve hacia adelante y hacia atrás a lo largo o lateralmente a través de la tráquea mientras se continúa adquiriendo imágenes.
Configuración del imán para imágenes in vivo (a) un solo imán sobre la tráquea en un ángulo de aproximadamente 30°, (b) dos imanes configurados para atraer, (c) dos imanes configurados para repeler, (d) un solo imán sobre y perpendicular a la tráquea. El observador miró hacia abajo desde la boca hasta los pulmones a través de la tráquea, y el haz de rayos X pasó por el lado izquierdo de la rata y salió por el lado derecho. El imán se mueve a lo largo de la vía aérea o hacia la izquierda y hacia la derecha sobre la tráquea en la dirección del haz de rayos X.
También buscamos determinar la visibilidad y el comportamiento de las partículas en las vías respiratorias en ausencia de la respiración y el movimiento cardíaco que pudieran interferir. Por lo tanto, al final del período de imágenes, los animales fueron sacrificados humanitariamente por sobredosis de pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, EE. UU.; ~65 mg/kg ip). Algunos animales se dejaron en la plataforma de imágenes y, una vez que cesaron la respiración y los latidos del corazón, se repitió el proceso de imágenes, agregando una dosis adicional de MP si no se observaba MP en la superficie de las vías respiratorias.
Las imágenes adquiridas se corrigieron mediante corrección de campo plano y campo oscuro, y luego se ensamblaron en una película (20 fotogramas por segundo; 15-25 veces la velocidad normal dependiendo de la frecuencia respiratoria) utilizando un script personalizado escrito en MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Todos los estudios de administración de vectores génicos LV se llevaron a cabo en el Laboratorio de Investigación de Animales de la Universidad de Adelaida y tuvieron como objetivo utilizar los resultados del experimento SPring-8 para evaluar si la administración de LV-MP en presencia de un campo magnético podría mejorar la transferencia génica in vivo. Para evaluar los efectos de MP y el campo magnético, se trataron dos grupos de animales: a un grupo se le administró LV-MP con un imán colocado, y el otro grupo recibió un grupo de control con LV-MP sin imán.
Los vectores genéticos LV se generaron utilizando métodos descritos previamente 25, 26. El vector LacZ expresa el gen de la beta-galactosidasa localizada en el núcleo, impulsado por el promotor constitutivo MPSV (LV-LacZ), que produce un producto de reacción azul en las células transducidas, visible en los frentes de tejido pulmonar y en las secciones de tejido. La titulación se realizó en cultivos celulares contando manualmente el número de células positivas para LacZ con un hemocitómetro para calcular el título en TU/ml. Los portadores se crioconservan a -80 °C, se descongelan antes de su uso y se unen a CombiMag mezclándolos en una proporción 1:1 e incubándolos en hielo durante al menos 30 minutos antes de su administración.
Se anestesiaron ratas Sprague Dawley normales (n = 3/grupo, ~2-3 meses de edad) inyección intraperitoneal de una mezcla de 0,4 mg/kg de medetomidina (Domitor, Ilium, Australia) y 60 mg/kg de ketamina (Ilium, Australia) ip) y canulación oral no quirúrgica con una cánula iv de 16 Ga. Para asegurar que el tejido de las vías respiratorias traqueales reciba transducción de LV, se acondicionó utilizando nuestro protocolo de perturbación mecánica descrito previamente, en el que la superficie de las vías respiratorias traqueales se frotó axialmente con una cesta de alambre (N-Circle, extractor de piedras sin punta de nitinol NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, EE. UU.) 30 s28. La administración traqueal de LV-MP se realizó luego en una cabina de seguridad biológica aproximadamente 10 minutos después de la perturbación.
El campo magnético utilizado en este experimento se configuró de manera similar al estudio de imágenes de rayos X in vivo, con los mismos imanes sostenidos sobre la tráquea mediante clips de stent de destilación (Figura 4). Se administró un volumen de 50 μl (2 alícuotas de 25 μl) de LV-MP en la tráquea (n = 3 animales) utilizando una pipeta con punta de gel como se describió previamente. Un grupo de control (n = 3 animales) recibió los mismos LV-MP sin el uso de un imán. Una vez completada la infusión, se retira la cánula del tubo endotraqueal y se extuba al animal. El imán permanece en su lugar durante 10 minutos y luego se retira. Las ratas recibieron una dosis subcutánea de meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australia) seguida de la reversión de la anestesia mediante inyección intraperitoneal de 1 mg/kg de clorhidrato de atipamazol (Antisedan, Zoetis, Australia). Las ratas se mantuvieron calientes y se monitorizaron hasta su completa recuperación. anestesia.
Dispositivo de administración de LV-MP en una cabina de seguridad biológica. Se puede observar el conector Luer gris claro del tubo endotraqueal sobresaliendo de la boca, y la punta de gel de la pipeta que se muestra en la imagen se inserta a través del tubo endotraqueal hasta la profundidad deseada en la tráquea.
Una semana después del procedimiento de dosificación de LV-MP, los animales fueron sacrificados humanitariamente mediante inhalación de CO2 al 100% y se evaluó la expresión de LacZ utilizando nuestro tratamiento estándar con X-gal. Se eliminaron los tres anillos cartilaginosos más caudales para asegurar que cualquier daño mecánico o retención de líquido por la colocación del tubo endotraqueal no se incluyera en el análisis. Cada tráquea se cortó longitudinalmente para crear dos mitades para el análisis, y se montaron en una placa que contenía caucho de silicona (Sylgard, Dow Inc) utilizando una aguja Minutien (Fine Science Tools) para visualizar la superficie luminal. La distribución y el patrón de las células transducidas se confirmaron mediante fotografía frontal utilizando un microscopio Nikon (SMZ1500) con una cámara DigiLite y el software TCapture (Tucsen Photonics, China). Las imágenes se adquirieron con un aumento de 20x (incluida la configuración más alta para todo el ancho de la tráquea), con toda la longitud de la tráquea fotografiada paso a paso, asegurando una superposición suficiente entre cada imagen para permitir la "unión" de imágenes. Las imágenes de cada tráquea fueron Luego se ensamblaron en una sola imagen compuesta usando el Editor de composición de imágenes v2.0.3 (Microsoft Research) utilizando un algoritmo de movimiento planar. Las áreas de expresión de LacZ en imágenes compuestas de la tráquea de cada animal se cuantificaron usando un script MATLAB automatizado (R2020a, MathWorks) como se describió anteriormente, usando configuraciones de 0.35 < Tono < 0.58, Saturación > 0.15 y Valor < 0.7. Al trazar los contornos del tejido, se generó manualmente una máscara en GIMP v2.10.24 para cada imagen compuesta con el fin de identificar el área del tejido y evitar cualquier detección falsa fuera del tejido traqueal. Las áreas teñidas de todas las imágenes compuestas de cada animal se sumaron para generar el área teñida total para ese animal. Luego el área teñida se dividió por el área total de la máscara para generar el área normalizada.
Cada tráquea se incluyó en parafina y se cortaron secciones de 5 μm. Las secciones se tiñeron con rojo rápido neutro durante 5 minutos y las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio Nikon Eclipse E400, una cámara DS-Fi3 y el software de captura NIS element (versión 5.20.00).
Todos los análisis estadísticos se realizaron en GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). La significación estadística se estableció en p ≤ 0,05. La normalidad se verificó mediante la prueba de Shapiro-Wilk y las diferencias en la tinción de LacZ se evaluaron mediante la prueba t no pareada.
Las seis MP descritas en la Tabla 1 se examinaron utilizando PCXI, y la visibilidad se describe en la Tabla 2. Dos MP de poliestireno (MP1 y MP2; 18 μm y 0,25 μm, respectivamente) no fueron visibles bajo PCXI, pero el resto de las muestras fueron identificables (ejemplos se muestran en la Figura 5). MP3 y MP4 (10-15% Fe3O4; 0,25 μm y 0,9 μm, respectivamente) son débilmente visibles. Aunque contiene algunas de las partículas más pequeñas probadas, MP5 (98% Fe3O4; 0,25 μm) fue la más pronunciada. El producto CombiMag MP6 es difícil de detectar. En todos los casos, nuestra capacidad para detectar MP mejoró significativamente al mover el imán hacia adelante y hacia atrás paralelamente al capilar. Cuando los imanes se alejaron del capilar, las partículas se extendieron en largas cadenas, pero a medida que los imanes se acercaron y la intensidad del campo magnético aumentó, las cadenas de partículas se acortaron. Las partículas migraron hacia la superficie superior del capilar (ver video complementario S1: MP4), aumentando la densidad de partículas de la superficie. Por el contrario, cuando se retira el imán del capilar, la intensidad del campo disminuye y las MP se reorganizan en largas cadenas que se extienden desde la superficie superior del capilar (ver video complementario S2: MP4). Después de que el imán deja de moverse, las partículas continúan moviéndose durante un breve tiempo después de alcanzar la posición de equilibrio. A medida que la MP se mueve hacia y desde la superficie superior del capilar, las partículas magnéticas normalmente arrastran los residuos a través del fluido.
La visibilidad de MP bajo PCXI varía significativamente entre muestras. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 y (d) MP6. Todas las imágenes que se muestran aquí se tomaron con un imán ubicado aproximadamente a 10 mm directamente encima del capilar. Los círculos grandes aparentes son burbujas de aire atrapadas en los capilares, que muestran claramente las características de borde en blanco y negro de la imagen de contraste de fase. El recuadro rojo contiene la ampliación de mejora de contraste. Tenga en cuenta que los diámetros de los esquemas del imán en todas las figuras no están a escala y son aproximadamente 100 veces mayores de lo que se muestra.
A medida que el imán se traslada de izquierda a derecha a lo largo de la parte superior del capilar, el ángulo de la cadena de MP cambia para alinearse con el imán (véase la Figura 6), delineando así las líneas del campo magnético. Para MP3-5, después de que la cuerda alcanza un ángulo umbral, las partículas son arrastradas a lo largo de la superficie superior del capilar. Esto a menudo da como resultado que las MP se agrupen en grupos más grandes cerca de donde el campo magnético es más fuerte (véase el vídeo complementario S3:MP5). Esto también es particularmente evidente cuando se toman imágenes cerca del extremo del capilar, lo que hace que las MP se agreguen y se concentren en la interfaz fluido-aire. Las partículas en MP6, que fueron más difíciles de discernir que MP3-5, no fueron arrastradas a medida que el imán se movía a lo largo del capilar, pero las cadenas de MP se disociaron, dejando las partículas en el campo de visión (véase el vídeo complementario S4:MP6). En algunos casos, cuando el campo magnético aplicado se redujo moviendo el imán a una gran distancia de la ubicación de la imagen, cualquier MP restante descendió lentamente a la superficie inferior del tubo por gravedad mientras permanecía en la cadena (véase el vídeo complementario S5: MP3).
El ángulo de la cadena MP cambia a medida que el imán se traslada hacia la derecha por encima del capilar. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 y (d) MP6. El recuadro rojo contiene la ampliación que mejora el contraste. Tenga en cuenta que los vídeos complementarios son informativos, ya que revelan información dinámica y de la estructura de partículas importantes que no se pueden visualizar en estas imágenes estáticas.
Nuestras pruebas demostraron que mover el imán lentamente hacia adelante y hacia atrás a lo largo de la tráquea facilita la visualización de MP en el contexto de un movimiento complejo in vivo. No se realizaron pruebas in vivo ya que las perlas de poliestireno (MP1 y MP2) no eran visibles en el capilar. Cada uno de los cuatro MP restantes se probó in vivo con el eje largo del imán configurado sobre la tráquea en un ángulo de aproximadamente 30° con respecto a la vertical (ver Figuras 2b y 3a), ya que esto resultó en cadenas de MP más largas y fue más efectivo que la configuración del imán terminada. MP3, MP4 y MP6 no se detectaron en la tráquea de ningún animal vivo. Cuando se obtuvieron imágenes de las vías respiratorias de la rata después de que los animales fueron sacrificados humanitariamente, las partículas permanecieron invisibles incluso cuando se agregó volumen adicional usando una bomba de jeringa. MP5 tenía el contenido más alto de óxido de hierro y fue la única partícula visible, y por lo tanto se utilizó para evaluar y caracterizar el comportamiento in vivo de MP.
Al colocar el imán sobre la tráquea durante la administración de MP, se logró que muchas, pero no todas, las MP se concentraran en el campo de visión. Las partículas que ingresan a la tráquea se observan mejor en animales sacrificados humanitariamente. La Figura 7 y el Video Suplementario S6: MP5 muestran la captura magnética rápida y la alineación de partículas en la superficie de la tráquea ventral, lo que indica que las MP pueden dirigirse a las regiones deseadas de la tráquea. Al buscar más distalmente a lo largo de la tráquea después de la administración de MP, se encontraron algunas MP más cerca de la carina, lo que sugiere que la fuerza del campo magnético fue insuficiente para recolectar y retener todas las MP, ya que fueron administradas a través de la región de máxima fuerza del campo magnético durante el proceso de fluidos. Sin embargo, las concentraciones de MP posparto fueron más altas alrededor del área de imagen, lo que sugiere que muchas MP permanecieron en las regiones de las vías respiratorias donde la fuerza del campo magnético aplicado fue más alta.
Imágenes de (a) antes y (b) después de la administración de MP5 en la tráquea de una rata recientemente eutanasiada con el imán posicionado directamente sobre el área de imagen. El área de imagen se encuentra entre los dos anillos de cartílago. Antes de la administración de MP, hay algo de líquido en las vías respiratorias. El recuadro rojo contiene la ampliación con mejora de contraste. Estas imágenes provienen del video que se muestra en el video suplementario S6:MP5.
Al desplazar el imán a lo largo de la tráquea in vivo, la cadena de MP cambió de ángulo dentro de la superficie de las vías respiratorias de manera similar a como se observa en los capilares (véase la Figura 8 y el vídeo complementario S7:MP5). Sin embargo, en nuestro estudio, las MP no pudieron ser arrastradas a lo largo de la superficie de las vías respiratorias vivas como sí lo hicieron con los capilares. En algunos casos, la cadena de MP se alargará a medida que el imán se mueva hacia la izquierda y hacia la derecha. Curiosamente, también descubrimos que la cadena de partículas parece cambiar la profundidad de la capa de fluido superficial cuando el imán se mueve longitudinalmente a lo largo de la tráquea, y se expande cuando el imán se mueve directamente por encima y la cadena de partículas gira a una posición vertical (véase el vídeo complementario S7). : MP5 en 0:09, abajo a la derecha). El patrón característico de movimiento cambió cuando el imán se trasladó lateralmente por la parte superior de la tráquea (es decir, a la izquierda o a la derecha del animal en lugar de a lo largo de la tráquea). Las partículas seguían siendo claramente visibles mientras se movían, pero cuando se retiró el imán de la tráquea, las puntas de las cadenas de partículas se hicieron visibles (véase el vídeo complementario S8:MP5, a partir de 0:08). Esto es consistente con el comportamiento de MP que observamos bajo un campo magnético aplicado en un capilar de vidrio.
Imágenes de ejemplo que muestran MP5 en la tráquea de una rata anestesiada viva. (a) El imán se utiliza para adquirir imágenes arriba y a la izquierda de la tráquea, luego (b) después de que el imán se mueve hacia la derecha. El recuadro rojo contiene la ampliación de contraste. Estas imágenes son del vídeo que se muestra en el vídeo complementario S7:MP5.
Cuando los dos polos se configuraron en una orientación norte-sur por encima y por debajo de la tráquea (es decir, atrayéndose; Fig. 3b), las cuerdas MP parecían más largas y se ubicaban en la pared lateral de la tráquea en lugar de en la superficie traqueal dorsal (véase el vídeo complementario S9:MP5). Sin embargo, no se detectaron altas concentraciones de partículas en una sola ubicación (es decir, la superficie dorsal de la tráquea) después de la administración de fluido cuando se utilizó un dispositivo de doble imán, lo que suele ocurrir cuando se utiliza un dispositivo de un solo imán. Luego, cuando un imán se configuró para repeler los polos invertidos (Fig. 3c), el número de partículas visibles en el campo de visión no pareció aumentar después de la administración. La configuración de ambas configuraciones de doble imán es un desafío debido a las altas intensidades del campo magnético que atraen o empujan los imanes, respectivamente. La configuración se cambió entonces a un solo imán paralelo a la vía aérea pero que la atravesaba a 90 grados, de modo que las líneas de campo cruzaban la pared traqueal ortogonalmente (Fig. 3d), una orientación diseñada para determinar si Se pudo observar la agregación de partículas en la pared lateral. Sin embargo, en esta configuración, no hubo movimiento identificable de acumulación de MP ni movimiento del imán. Con base en todos estos resultados, se eligió una configuración de orientación de 30 grados con un solo imán (Figura 3a) para estudios de portadores de genes in vivo.
Cuando se obtuvieron imágenes del animal repetidamente inmediatamente después de la eutanasia humanitaria, la ausencia de movimiento tisular que pudiera interferir permitió discernir líneas de partículas más finas y cortas en el campo intercondral claro, con un movimiento ondulatorio acorde con el movimiento de traslación del imán. Sin embargo, aún no se puede observar claramente la presencia y el movimiento de las partículas MP6.
El título de LV-LacZ fue de 1,8 × 10⁸ TU/ml, y después de mezclar 1:1 con CombiMag MP (MP6), los animales recibieron una dosis traqueal de 50 μl de 9 × 10⁷ TU/ml de vehículo LV (es decir, 4,5 × 10⁶ TU/rata). En estos estudios, en lugar de trasladar el imán durante el parto, fijamos el imán en una posición para determinar si la transducción de LV (a) podría mejorarse en comparación con la administración del vector en ausencia de un campo magnético, y (b) podría enfocarse. Las células de las vías respiratorias se transducen a regiones objetivo magnéticas de las vías respiratorias superiores.
La presencia de imanes y el uso de CombiMag combinado con vectores LV no parecieron tener efectos adversos en la salud animal, al igual que nuestro protocolo estándar de administración de vectores LV. Las imágenes frontales de la región traqueal sometida a perturbación mecánica (Figura suplementaria 1) indicaron que hubo niveles significativamente más altos de transducción en el grupo de animales tratados con LV-MP cuando el imán estaba presente (Figura 9a). Solo una pequeña cantidad de tinción azul de LacZ estuvo presente en el grupo de control (Figura 9b). La cuantificación de las áreas teñidas con X-Gal normalizadas mostró que la administración de LV-MP en presencia de un campo magnético produjo una mejora de aproximadamente 6 veces (Figura 9c).
Ejemplos de imágenes compuestas que muestran la transducción traqueal por LV-MP (a) en presencia de un campo magnético y (b) en ausencia de un imán. (c) Mejora estadísticamente significativa en el área de transducción LacZ normalizada dentro de la tráquea cuando se utiliza el imán (*p = 0,029, prueba t, n = 3 por grupo, media ± SEM).
Las secciones teñidas con rojo rápido neutro (ejemplo mostrado en la Figura suplementaria 2) mostraron células teñidas con LacZ presentes en un patrón y ubicación similares a los reportados previamente.
Un desafío clave para la terapia génica de las vías respiratorias sigue siendo la localización precisa de las partículas portadoras en las regiones de interés y el logro de altos niveles de eficiencia de transducción en el pulmón en movimiento en presencia de flujo de aire y eliminación activa de moco. Para los portadores LV diseñados para tratar la enfermedad de las vías respiratorias de la fibrosis quística, aumentar el tiempo de residencia de las partículas portadoras dentro de las vías respiratorias conductoras ha sido un objetivo hasta ahora difícil de alcanzar. Como señalan Castellani et al., el uso de campos magnéticos para mejorar la transducción tiene ventajas en comparación con otros métodos de administración de genes, como la electroporación, ya que puede combinar simplicidad, rentabilidad, localización de la administración, mayor eficiencia y tiempos de incubación más cortos, y posiblemente una dosis de portador más pequeña10. Sin embargo, la deposición y el comportamiento in vivo de las partículas magnéticas en las vías respiratorias bajo la influencia de fuerzas magnéticas externas nunca se han descrito, ni se ha demostrado realmente la viabilidad de este método in vivo para mejorar los niveles de expresión génica en vías respiratorias vivas intactas.
Nuestros experimentos in vitro con PCXI de sincrotrón demostraron que todas las partículas que analizamos, con la excepción de las micropartículas de poliestireno, eran visibles en el sistema de imagen que utilizamos. En presencia de un campo magnético, las micropartículas forman cadenas cuyas longitudes están relacionadas con el tipo de partícula y la intensidad del campo magnético (es decir, la proximidad y el movimiento del imán). Como se muestra en la Figura 10, las cadenas que observamos se forman debido a que cada partícula individual se magnetiza e induce su propio campo magnético local. Estos campos separados provocan que otras partículas similares se agreguen y se conecten, con movimientos grupales similares a cadenas debido a las fuerzas locales de atracción y repulsión de otras partículas.
Esquema que muestra (a,b) trenes de partículas generados dentro de capilares llenos de fluido y (c,d) tráquea llena de aire. Tenga en cuenta que los capilares y la tráquea no están dibujados a escala. El panel (a) también contiene una descripción del MP, que contiene partículas de Fe3O4 dispuestas en cadenas.
Cuando el imán se movió por encima del capilar, el ángulo de la cadena de partículas alcanzó un umbral crítico para MP3-5 que contiene Fe3O4, después del cual la cadena de partículas ya no permaneció en la posición original, sino que se movió a lo largo de la superficie a una nueva posición. Es probable que este efecto ocurra porque la superficie del capilar de vidrio es lo suficientemente lisa como para permitir que ocurra este movimiento. Curiosamente, MP6 (CombiMag) no se comportó de esta manera, posiblemente porque las partículas eran más pequeñas, tenían diferentes recubrimientos o cargas superficiales, o un fluido portador patentado afectó su capacidad de moverse. El contraste de imagen de las partículas de CombiMag también es más débil, lo que sugiere que el fluido y las partículas pueden tener densidades similares y, por lo tanto, no moverse fácilmente una hacia la otra. Las partículas también pueden atascarse si el imán se mueve demasiado rápido, lo que indica que la fuerza del campo magnético no siempre puede superar la fricción entre las partículas en el fluido, lo que sugiere que tal vez no sea sorprendente que la fuerza del campo magnético y la distancia entre el imán y el área objetivo sean muy importantes. En conjunto, estos resultados también sugieren que, si bien los imanes pueden capturar muchas MP que fluyen a través del área objetivo, es poco probable que Se puede confiar en los imanes para mover las partículas de CombiMag a lo largo de la superficie de la tráquea. Por lo tanto, concluimos que los estudios de LV-MP in vivo deberían utilizar campos magnéticos estáticos para dirigirse físicamente a regiones específicas del árbol de las vías respiratorias.
Cuando las partículas se introducen en el cuerpo, son difíciles de identificar en el contexto de los complejos tejidos corporales en movimiento, pero la capacidad de detectarlas mejoró al desplazar el imán horizontalmente por encima de la tráquea para "mover" las cadenas de MP. Aunque es posible obtener imágenes en vivo, es más fácil discernir el movimiento de las partículas una vez que el animal ha sido sacrificado humanitariamente. Las concentraciones de MP fueron generalmente más altas en esta ubicación cuando el imán se colocó por encima del área de imagen, aunque algunas partículas se encontraron generalmente más adelante en la tráquea. A diferencia de los estudios in vitro, las partículas no pueden ser arrastradas a lo largo de la tráquea al desplazar el imán. Este hallazgo es consistente con la forma en que el moco que recubre la superficie de la tráquea procesa típicamente las partículas inhaladas, atrapándolas en el moco y posteriormente eliminadas por el mecanismo de aclaramiento mucociliar.
Planteamos la hipótesis de que el uso de imanes para la atracción por encima y por debajo de la tráquea (Fig. 3b) podría resultar en un campo magnético más uniforme, en lugar de un campo magnético altamente concentrado en un punto, lo que potencialmente conduciría a una distribución más uniforme de las partículas. Sin embargo, nuestro estudio preliminar no encontró evidencia clara que respalde esta hipótesis. De igual manera, configurar un par de imanes para repelerse (Fig. 3c) no resultó en una mayor deposición de partículas en el área de imagen. Estos dos hallazgos demuestran que la configuración de doble imán no mejora significativamente el control local de la focalización de MP, y que las fuertes fuerzas magnéticas resultantes son difíciles de configurar, lo que hace que este enfoque sea menos práctico. De manera similar, orientar el imán por encima y a través de la tráquea (Fig. 3d) tampoco aumentó la cantidad de partículas retenidas en el área de imagen. Algunas de estas configuraciones alternativas pueden no tener éxito porque resultan en intensidades de campo magnético más bajas dentro del área de deposición. Por lo tanto, la configuración de un solo imán con un ángulo de 30 grados (Figura 3a) se considera el método más fácil y eficiente para estudios in vivo. pruebas.
El estudio LV-MP demostró que, al combinar vectores LV con CombiMag y administrarlos tras una perturbación física en presencia de un campo magnético, los niveles de transducción aumentaron significativamente en la tráquea en comparación con los controles. Según los estudios de imágenes de sincrotrón y los resultados de LacZ, el campo magnético aparentemente pudo preservar el LV dentro de la tráquea y reducir la cantidad de partículas vectoriales que penetraron inmediatamente en las profundidades del pulmón. Estas mejoras en la focalización pueden conducir a una mayor eficacia, al tiempo que reducen los títulos administrados, la transducción fuera del objetivo, los efectos secundarios inflamatorios e inmunitarios y los costos del vector genético. Es importante destacar que, según el fabricante, CombiMag puede utilizarse junto con otros métodos de transferencia genética, incluidos otros vectores virales (como AAV) y ácidos nucleicos.