Nature.com сайтад зочилсонд баярлалаа. Таны ашиглаж буй хөтчийн хувилбар нь CSS-ийн дэмжлэг хязгаарлагдмал байна. Хамгийн сайн туршлагын тулд бид танд шинэчлэгдсэн хөтчийг ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer дээр нийцтэй байдлын горимыг унтраах). Энэ хооронд бид үргэлжлүүлэн дэмжлэг үзүүлэхийн тулд сайтыг хэв маяг болон JavaScriptгүйгээр харуулах болно.
Цистик фиброзын уушгины өвчнийг эмчлэх генийн векторууд нь дамжуулагч амьсгалын замыг чиглүүлэх ёстой, учир нь захын уушгины дамжуулалт нь эмчилгээний үр дүнг өгдөггүй. Вирусын дамжуулалтын үр ашиг нь векторын оршин тогтнох хугацаатай шууд холбоотой. Гэсэн хэдий ч генийн тээвэрлэгч гэх мэт хүргэх шингэнүүд нь амьсгалах үед цулцан руу байгалийн жамаар тархдаг бөгөөд ямар ч хэлбэрийн эмчилгээний хэсгүүд салст бүрхүүлийн тээвэрлэлтээр хурдан цэвэрлэгддэг. Амьсгалын замд генийн тээвэрлэгчдийн оршин тогтнох хугацааг уртасгах нь чухал боловч хэрэгжүүлэхэд хэцүү. Амьсгалын замын гадаргуу руу чиглүүлж болох генийн тээвэрлэгчтэй холбогдсон соронзон хэсгүүд нь бүс нутгийн зорилтот түвшинг сайжруулж чадна. In vivo дүрслэлийн бэрхшээлээс шалтгаалан хэрэглэсэн соронзон орны дэргэд амьсгалын замын гадаргуу дээрх ийм жижиг соронзон хэсгүүдийн зан төлөвийг сайн ойлгодоггүй. Энэхүү судалгааны зорилго нь мэдээ алдуулалтанд орсон хархны мөгөөрсөн хоолой дахь цуврал соронзон хэсгүүдийн in vivo хөдөлгөөнийг дүрслэн харуулахын тулд синхротрон дүрслэлийг ашиглан in vivo бие даасан болон их хэмжээний бөөмийн зан төлөвийн динамик болон хэв маягийг судлах явдал байв. Дараа нь бид соронзон орны дэргэд лентивирусын соронзон хэсгүүдийг хүргэх нь харханд дамжуулалтын үр ашгийг нэмэгдүүлэх эсэхийг үнэлсэн. Мөгөөрсөн хоолой. Синхротрон рентген зураг нь in vitro болон in vivo нөхцөлд хөдөлгөөнгүй болон хөдөлж буй соронзон орон дахь соронзон бөөмсийн зан төлөвийг харуулдаг. Бөөмсийг амьд амьсгалын замын гадаргуу дээр соронзоор амархан чирж болохгүй, гэхдээ тээвэрлэлтийн явцад тунадас нь соронзон орон хамгийн хүчтэй байдаг харах талбарт төвлөрдөг. Лентивирусын соронзон бөөмсийг соронзон орон байгаа үед хүргэхэд дамжуулалтын үр ашиг зургаа дахин нэмэгдсэн. Эдгээр үр дүнгүүд нь лентивирусын соронзон бөөмс болон соронзон орон нь генийн векторын онилох чадварыг сайжруулах, in vivo дамжуулагч амьсгалын замд дамжуулалтын түвшинг нэмэгдүүлэх үнэ цэнэтэй арга байж болохыг харуулж байна.
Цистик фиброз (CF) нь CF трансмембран дамжуулалтын зохицуулагч (CFTR) гэж нэрлэгддэг ганц генийн өөрчлөлтөөс үүдэлтэй байдаг. CFTR уураг нь CF эмгэг жамын гол хэсэг болох дамжуулагч амьсгалын зам зэрэг биеийн олон хучуур эдийн эсүүдэд байдаг ионы суваг юм. CFTR-ийн согог нь усны тээвэрлэлтийг хэвийн бус болгож, амьсгалын замын гадаргууг хатааж, амьсгалын замын гадаргуугийн шингэний (ASL) давхаргын гүнийг бууруулдаг. Энэ нь мөн салст бүрхүүлийн тээвэрлэлтийн (MCT) системийн амьсгалын замаас орж буй бөөмс болон эмгэг төрүүлэгчдийг цэвэрлэх чадварыг бууруулдаг. Бидний зорилго бол CFTR генийн зөв хуулбарыг хүргэх, ASL, MCT, уушгины эрүүл мэндийг сайжруулах лентивирусын (LV) генийн эмчилгээг хөгжүүлэх, мөн эдгээр параметрүүдийг in vivo1-д хэмжих чадвартай шинэ технологийг хөгжүүлэхийг үргэлжлүүлэх явдал юм.
Зүүн ховдлын векторууд нь CF амьсгалын замын генийн эмчилгээний тэргүүлэх нэр дэвшигчдийн нэг бөгөөд голчлон эмчилгээний генийг амьсгалын замын суурь эсүүд (амьсгалын үүдэл эсүүд)-д байнга нэгтгэж чаддаг. Энэ нь чухал ач холбогдолтой, учир нь тэдгээр нь генээр зассан CF-тэй холбоотой амьсгалын замын гадаргуугийн эсүүд болж ялгаран хэвийн чийгшил, салстын цэвэрлэгээг сэргээж, насан туршийн ашиг тусыг өгдөг. Зүүн ховдлын векторууд нь CF уушгины өвчин эхэлдэг тул дамжуулагч амьсгалын замын эсрэг чиглэгдэх ёстой. Векторыг уушгинд илүү гүн хүргэх нь цулцангийн дамжуулалтад хүргэж болзошгүй боловч энэ нь CF-д эмчилгээний ашиг тусгүй. Гэсэн хэдий ч генийн тээвэрлэгч зэрэг шингэнүүд нь төрсний дараа амьсгалахад цулцан руу байгалийн жамаар шилжиж, эмчилгээний хэсгүүд нь MCT-ээр амны хөндий рүү хурдан цэвэрлэгддэг. Зүүн ховдлын дамжуулалтын үр ашиг нь вектор нь эсийн шингээлтийг хангахын тулд зорилтот эсүүдийн хажууд байх хугацаатай шууд холбоотой - "оршин суух хугацаа"5 - энэ нь ердийн бүс нутгийн агаарын урсгал, түүнчлэн зохицсон хэсгүүдийн салстын баригдалт болон MCT-ээр амархан буурдаг. Зүүн ховдлын хувьд, энэ бүс нутагт өндөр түвшний дамжуулалт хийхэд Зүүн ховдлын амьсгалын замд байх хугацааг уртасгах чадвар нь чухал боловч хол сорилттой тулгарсан.
Энэ саадыг даван туулахын тулд зүүн ховдлын соронзон бөөмс (ЗХБ) нь хоёр нэмэлт аргаар тусалж чадна гэж бид үзэж байна. Нэгдүгээрт, тэдгээрийг соронзон байдлаар амьсгалын замын гадаргуу руу чиглүүлж, зорилтот түвшинг сайжруулж, генийн тээвэрлэгч бөөмсийг хүссэн амьсгалын замын хэсэгт байрлуулахад нь туслах; мөн ASL) эсийн давхарга 6 руу шилжихэд тусалдаг. ЗХБ-ийг эсийн мембранд наалддаг эсвэл эсийн гадаргуугийн рецепторуудтай холбогддог эсрэгбие, хими эмчилгээний эм эсвэл бусад жижиг молекулуудтай холбогдож, статик цахилгаан байгаа үед хавдрын хэсэгт хуримтлагдах үед зорилтот эм хүргэх хэрэгсэл болгон өргөн ашигладаг. Хорт хавдрын эмчилгээний соронзон орон 7. Бусад "гипертермаль" аргууд нь хэлбэлзэлтэй соронзон оронтой тулгарах үед MP-ийг халаах, улмаар хавдрын эсийг устгах зорилготой. Соронзон орон нь эсэд ДНХ-ийн дамжуулалтыг сайжруулахын тулд трансфекцийн бодис болгон ашигладаг соронзон трансфекцийн зарчмыг ихэвчлэн вирусгүй болон вирусын генийн векторуудыг ашиглан in vitro нөхцөлд ашигладаг бөгөөд трансдюци хийхэд хэцүү эсийн шугамд ашигладаг. LV-MP-ийг статик соронзон орон байгаа үед хүний ​​гуурсан хоолойн хучуур эдийн эсийн шугамд in vitro хэлбэрээр хүргэх замаар LV-MP-ийн үр нөлөөг тогтоосон бөгөөд зөвхөн LV вектортой харьцуулахад трансдюкцийн үр ашгийг 186 дахин нэмэгдүүлдэг. LV-MP-ийг мөн in vitro CF загварт хэрэглэсэн бөгөөд соронзон трансфекц нь CF цэр байгаа үед агаар-шингэний интерфэйсийн өсгөвөрт LV трансдюкцийг 20 дахин нэмэгдүүлдэг10. Гэсэн хэдий ч эрхтнүүдийн in vivo соронзон трансфекц харьцангуй бага анхаарал хандуулсан бөгөөд цөөн хэдэн амьтанд л үнэлсэн. судалгаанууд11,12,13,14,15, ялангуяа уушгинд16,17. Гэсэн хэдий ч CF уушгины эмчилгээнд соронзон трансфекцийн боломжууд тодорхой байна. Тан нар (2020) "үр дүнтэй соронзон нано хэсгүүдийн уушгины хүргэлтийн концепцийн нотолгоотой судалгаа нь CFTR амьсгалын замын ирээдүйн стратегийн замыг нээж, CF өвчтөнүүдийн эмнэлзүйн үр дүнг сайжруулах болно" гэж мэдэгджээ.6.
Хэрэглэсэн соронзон орны дэргэд амьсгалын замын гадаргуу дээрх жижиг соронзон бөөмсийн зан төлөвийг дүрслэн харуулах, судлахад хэцүү тул муу ойлгогддог. Бусад судалгаануудад бид хийн сувгийн гадаргуугийн чийгшлийг шууд хэмжих зорилгоор ASL гүн18 болон MCT зан төлөв19,20-ийн жижиг in vivo өөрчлөлтийг инвазив бус байдлаар дүрслэн харуулах, тоон үзүүлэлтээр илэрхийлэх синхротрон тархалт дээр суурилсан фазын тодосгогч рентген дүрслэл (PB-PCXI) аргыг боловсруулсан бөгөөд эмчилгээний үр дүнгийн эрт үеийн үзүүлэлт болгон ашигласан. Нэмж дурдахад, бидний MCT үнэлгээний арга нь PB-PCXI21 ашиглан харагдахуйц MCT маркер болгон хөнгөнцагааны исэл эсвэл өндөр хугарлын индекстэй шилнээс бүрдсэн 10-35 мкм диаметртэй бөөмсийг ашигладаг. Хоёр арга хоёулаа MP зэрэг олон төрлийн бөөмсийг дүрслэн харуулахад тохиромжтой.
Орон зайн болон цаг хугацааны өндөр нягтралтай тул бидний PB-PCXI дээр суурилсан ASL болон MCT шинжилгээний аргууд нь MP генийн хүргэлтийн техникийг ойлгож, оновчтой болгоход туслах зорилгоор in vivo нөхцөлд дан болон их хэмжээний бөөмсийн зан үйлийн динамик болон хэв маягийг судлахад тохиромжтой. Бидний энд ашиглаж буй арга барил нь SPring-8 BL20B2 цацрагийн шугамыг ашиглан хийсэн судалгаанаас үүдэлтэй бөгөөд бид генийн тээвэрлэгч тунгийн амьтны судалгаанд ажиглагдсан жигд бус генийн илэрхийлэлийн хэв маягийг тайлбарлахад туслах зорилгоор хулганы хамар болон уушгины амьсгалын замд хуурамч векторын тунг хүргэсний дараа шингэний хөдөлгөөнийг дүрслэн харуулсан. 3,4.
Энэхүү судалгааны зорилго нь амьд хархнуудын мөгөөрсөн хоолой дахь цуврал MP-ийн in vivo хөдөлгөөнийг дүрслэхэд синхротрон PB-PCXI ашиглах явдал байв. Эдгээр PB-PCXI дүрслэлийн судалгааг MP-ийн хөдөлгөөнд үзүүлэх нөлөөг тодорхойлохын тулд MP-ийн хүрээ, соронзон орны хүч чадал, байршлыг турших зорилгоор бүтээсэн. Бид гаднаас хэрэглэсэн соронзон орон нь хүргэгдсэн MP-ийг зорилтот хэсэгт үлдэх эсвэл хөдлөхөд тусална гэж таамагласан. Эдгээр судалгаанууд нь тунадасны дараа мөгөөрсөн хоолойд үлдсэн хэсгүүдийн тоог хамгийн их байлгах соронзон тохиргоог тодорхойлох боломжийг бидэнд олгосон. Хоёр дахь цуврал судалгаанд бид LV-MP-ийг хархны амьсгалын замд in vivo хүргэснээс үүссэн дамжуулалтын хэв маягийг харуулахын тулд энэхүү оновчтой тохиргоог ашиглахыг эрэлхийлсэн бөгөөд энэ нь амьсгалын замыг чиглүүлэх хүрээнд LV-MP-ийг хүргэх нь LV дамжуулалтын үр ашгийг сайжруулна гэсэн таамаглалд үндэслэсэн.
Бүх амьтны судалгааг Аделаидын Их Сургууль (M-2019-060 ба M-2020-022) болон SPring-8 Синхротроны Амьтны Ёс зүйн Хорооноос баталсан протоколуудын дагуу гүйцэтгэсэн. Туршилтуудыг ARRIVE удирдамжийн дагуу гүйцэтгэсэн.
Бүх рентген дүрслэлийг Японы SPring-8 синхротроны BL20XU цацрагийн шугам дээр өмнө нь тайлбарласантай төстэй тохиргоог ашиглан хийсэн21,22. Товчхондоо, туршилтын хайрцгийг синхротроны хадгалах цагирагнаас 245 м зайд байрлуулсан. Фазын контраст эффект үүсгэхийн тулд бөөмсийн дүрслэлийн судалгаанд дээжээс детектор хүртэлх зайг 0.6 м, in vivo дүрслэлийн судалгаанд 0.3 м ашигладаг. 25 кэВ монохромат цацрагийн энерги ашигласан. Зургийг sCMOS детектортой холбогдсон өндөр нарийвчлалтай рентген хөрвүүлэгч (SPring-8 BM3) ашиглан авсан. Хөрвүүлэгч нь 10 µм зузаантай сцинтиллятор (Gd3Al2Ga3O12) ашиглан рентген туяаг харагдах гэрэл болгон хувиргадаг бөгөөд дараа нь × 10 микроскопын объектив (NA 0.3) ашиглан sCMOS мэдрэгч рүү чиглүүлдэг. sCMOS детектор нь Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Япон) байсан бөгөөд массивын хэмжээтэй... 2048 × 2048 пиксел ба түүхий пикселийн хэмжээ 6.5 × 6.5 µm. Энэхүү тохиргоо нь 0.51 µм үр дүнтэй изотроп пикселийн хэмжээ, ойролцоогоор 1.1 мм × 1.1 мм харах талбарыг өгдөг. Амьсгалын замаар өдөөгдсөн хөдөлгөөний гажуудлыг багасгахын зэрэгцээ амьсгалын замын дотор болон гадна талын соронзон бөөмсийн дохио-шуугианы харьцааг хамгийн их байлгахын тулд 100 мс өртөлтийн уртыг сонгосон. In vivo судалгааны хувьд рентген туяаг өртөлтийн хооронд хааж цацрагийн тунг хязгаарлахын тулд рентген туяаны замд хурдан рентген хаалт байрлуулсан.
BL20XU дүрслэлийн камер нь Биоаюулгүй байдлын 2-р түвшний гэрчилгээ аваагүй тул LV зөөгчийг SPring-8 PB-PCXI дүрслэлийн судалгаанд ашиглаагүй. Үүний оронд бид хоёр арилжааны нийлүүлэгчээс янз бүрийн хэмжээ, материал, төмрийн агууламж, хэрэглээг хамарсан сайн шинж чанартай MP-үүдийг сонгосон бөгөөд эхлээд соронзон орон нь шилэн хялгасан судаснууд доторх MP хөдөлгөөнд, дараа нь амьд амьсгалын замд хэрхэн нөлөөлдөг болохыг ойлгохын тулд сонгосон. гадаргуу дээр. MP-үүд нь 0.25-18 μм хэмжээтэй бөгөөд янз бүрийн материалаар хийгдсэн байдаг (Хүснэгт 1-ийг үзнэ үү), гэхдээ дээж бүрийн найрлага, түүний дотор MP доторх соронзон бөөмсийн хэмжээ тодорхойгүй байна. Бидний өргөн хүрээтэй MCT судалгаанууд 19, 20, 21, 23, 24 дээр үндэслэн бид 5 μм хүртэлх жижиг MP-үүдийг гуурсан хоолойн амьсгалын замын гадаргуу дээр харж болно гэж үзэж байна, жишээлбэл, MP хөдөлгөөний харагдах байдлыг сайжруулахын тулд дараалсан кадрыг хасвал. Нэг 0.25 μм хэмжээтэй MP нь дүрслэх төхөөрөмжийн нягтралаас бага боловч PB-PCXI нь тэдгээрийн эзлэхүүний ялгаа болон тэдгээрийг хуримтлуулсны дараа хуримтлагдсан гадаргуугийн шингэний хөдөлгөөнийг илрүүлнэ гэж найдаж байна.
Хүснэгт 1-т үзүүлсэн MP бүрийн дээжийг 0.63 мм дотоод диаметртэй 20 мкл шилэн хялгасан судсанд (Drummond Microcaps, PA, АНУ) бэлтгэсэн. Корпускуляр хэсгүүдийг усанд, CombiMag хэсгүүдийг үйлдвэрлэгчийн өмчийн шингэнд авах боломжтой. Хоолой бүрийг хагас шингэнээр дүүргэж (ойролцоогоор 11 мкл) дээжийн тавиур дээр байрлуулсан (Зураг 1-ийг үзнэ үү). Шилэн хялгасан судсыг дүрслэлийн хайрцагт дээжийн шатанд хэвтээ байрлуулж, шингэний ирмэгийг байрлуулсан. 19 мм диаметртэй (28 мм урт) никель бүрхүүлтэй ховор шороон неодим төмрийн бор (NdFeB) соронз (N35, кат. дугаар LM1652, Jaycar Electronics, Австрали)-г дүрслэлийн явцад алсаас байрлалыг нь өөрчлөхийн тулд тусдаа орчуулгын шатанд холбосон. Рентген зураг авах нь соронзыг дээжээс ойролцоогоор 30 мм зайд байрлуулсан үед эхэлж, зургийг секундэд 4 кадр хурдтайгаар авдаг. Дүрслэл хийх явцад соронзыг ойртуулсан. шилэн хялгасан судасны хоолойг (ойролцоогоор 1 мм зайд) оруулж, дараа нь талбайн хүч чадал болон байрлалын нөлөөллийг үнэлэхийн тулд хоолойн дагуу шилжүүлнэ.
Дээжийн xy орчуулгын үе шатанд шилэн хялгасан судаснуудад MP дээж агуулсан in vitro дүрслэлийн тохиргоо. Рентген туяаны замыг улаан тасархай шугамаар тэмдэглэсэн.
MP-ийн in vitro харагдах байдал тогтоогдсоны дараа тэдгээрийн нэг хэсгийг зэрлэг хэлбэрийн эмэгчин альбинос Вистар харханд (~12 долоо хоногтой, ~200 гр) in vivo туршсан. 0.24 мг/кг медетомидин (Domitor®, Zenoaq, Япон), 3.2 мг/кг мидазолам (Dormicum®, Astellas Pharma, Япон) болон 4 мг/кг буторфанол (Vetorphale®, Meiji Seika) хархнуудад Pharma (Japan)-ийн холимогоор хэвлийн хөндийд тарьж мэдээ алдуулалт хийсэн. Мэдээ алдуулалтын дараа тэдгээрийг дүрслэлд бэлтгэсэн бөгөөд цагаан мөгөөрсөн хоолойн эргэн тойрон дахь үсийг авч, эндотрахеал хоолой (ET; 16 Ga iv канюля, Terumo BCT) оруулж, биеийн температурыг хадгалахын тулд дулааны уут бүхий захиалгаар хийсэн дүрслэлийн хавтан дээр хэвтээ байрлалд нь байрлуулж хөдөлгөөнгүй болгосон. Дараа нь дүрслэлийн хавтанг дүрслэлийн хайрцагт байгаа дээжийн орчуулгын шатанд бага зэрэг өнцгөөр бэхэлсэн бөгөөд ингэснээр рентген зураг дээр цагаан мөгөөрсөн хоолойг хэвтээ байрлалд байрлуулсан. Зураг 2a-д үзүүлсэн шиг.
(a) SPring-8 дүрслэлийн хайрцагт in vivo дүрслэлийн тохиргоонд рентген туяаны замыг улаан тасархай шугамаар тэмдэглэсэн.(b,c) Мөгөөрсөн хоолой дээрх соронзон байршлыг хоёр ортогональ суурилуулсан IP камер ашиглан алсаас гүйцэтгэсэн. Дэлгэцийн зургийн зүүн талд толгойг барьж буй утсан гогцоо, мөн ET хоолой дотор байрлах хүргэлтийн канюлийг харж болно.
100 мкл шилэн тариур ашиглан алсын удирдлагатай тариурын шахуургын систем (UMP2, World Precision Instruments, Сарасота, Флорида)-г 30 Ga зүүгээр PE10 хоолойд (OD 0.61 мм, ID 0.28 мм) холбосон. ET хоолойг оруулах үед үзүүр нь цагаан мөгөөрсөн хоолойд зөв байрлалд байгаа эсэхийг шалгахын тулд хоолойг тэмдэглэнэ үү. Микро насос ашиглан тариурын поршенийг татаж, хоолойн үзүүрийг хүргэх MP дээжинд дүрнэ. Дараа нь ачаалагдсан хүргэлтийн хоолойг эндотрахеал хоолойд оруулж, үзүүрийг бидний хүлээгдэж буй соронзон орны хамгийн хүчтэй хэсэгт байрлуулна. Зураг авах ажиллагааг Arduino дээр суурилсан цаг хугацааны хайрцагт холбогдсон амьсгалын мэдрэгч ашиглан хянаж, бүх дохиог (жишээ нь температур, амьсгал, хаалт нээх/хаах болон зураг авах) Powerlab болон LabChart (AD Instruments, Сидней, Австрали) ашиглан бүртгэсэн. 22. Зураг авах үед. Хавтанцар хүрэх боломжгүй үед хоёр IP камер (Panasonic BB-SC382)-ийг бие биенээсээ ойролцоогоор 90° өнцгөөр байрлуулж, ашигласан. дүрслэл хийх явцад мөгөөрсөн хоолойтой харьцуулахад соронзонгийн байрлалыг хянах (Зураг 2b,c). Хөдөлгөөний гажуудлыг багасгахын тулд түрлэгийн төгсгөлийн урсгалын тэгшитгэлийн үед амьсгал бүрт нэг зураг авсан.
Дүрслэлийн гэрээс гаднаас алсаас байрлуулж болох хоёр дахь шатанд соронз бэхлэгдсэн. Соронзонгийн янз бүрийн байрлал болон тохиргоог туршсан бөгөөд үүнд: Мөгөөрсөн хоолойноос ойролцоогоор 30° өнцгөөр суурилуулсан (2a ба 3a-р зурагт үзүүлсэн тохиргоо); нэг соронз нь амьтны дээр, нөгөө нь доор, туйлуудаа татахаар тохируулсан (Зураг 3b); нэг соронз нь амьтны дээр, нөгөө нь доор, туйлуудаа түлхэхээр тохируулсан (Зураг 3c); мөн нэг соронз нь мөгөөрсөн хоолойн дээр ба перпендикуляр (Зураг 3d). Амьтан болон соронзыг тохируулж, турших MP-ийг тариурын шахуургад ачаалсны дараа дүрс авах явцдаа 50 мкл тунг 4 мкл/сек хурдтайгаар өгнө. Дараа нь соронзыг дүрс авах явцдаа мөгөөрсөн хоолойгоор урагш хойш эсвэл хажуу тийш хөдөлгөнө.
Амьд дүрслэлд зориулсан соронзон тохиргоо (a) цагаан мөгөөрсөн хоолойн дээгүүр ойролцоогоор 30° өнцгөөр байрлах ганц соронз, (b) татахаар тохируулсан хоёр соронз, (c) түлхэхээр тохируулсан хоёр соронз, (d) цагаан мөгөөрсөн хоолойн дээгүүр болон перпендикуляр байрлах ганц соронз. Ажиглагч амнаас цагаан мөгөөрсөн хоолойгоор дамжин уушги руу доош харсан бөгөөд рентген туяа нь хархны зүүн талаас дамжин баруун талаас гарсан. Соронз нь амьсгалын замын дагуу эсвэл рентген туяаны чиглэлд цагаан мөгөөрсөн хоолойн дээгүүр зүүн ба баруун тийш хөдөлдөг.
Мөн бид амьсгал болон зүрхний хөдөлгөөнд саад учруулахгүй байх үед амьсгалын зам дахь бөөмсийн харагдах байдал болон зан төлөвийг тодорхойлохыг эрэлхийлсэн. Тиймээс дүрслэлийн хугацааны төгсгөлд пентобарбиталыг хэтрүүлэн хэрэглэсний улмаас амьтдыг хүнлэг байдлаар алсан (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, USA; ~65 мг/кг ip). Зарим амьтдыг дүрслэлийн тавцан дээр үлдээсэн бөгөөд амьсгал болон зүрхний цохилт зогссоны дараа дүрслэлийн процессыг давтаж, амьсгалын замын гадаргуу дээр MP харагдахгүй бол MP-ийн нэмэлт тунг нэмсэн.
Олж авсан зургуудыг хавтгай болон бараан талбарт засаж, дараа нь MATLAB (R2020a, The Mathworks) дээр бичигдсэн захиалгат скрипт ашиглан кино болгон угсарсан (секундэд 20 кадр; амьсгалын хурдаас хамаарч хэвийн хурд 15-25 ×).
LV генийн векторын хүргэлтийн бүх судалгааг Аделаидын Их Сургуулийн Лабораторийн Амьтны Судалгааны Байгууллагад хийсэн бөгөөд SPring-8 туршилтын үр дүнг ашиглан соронзон орон байгаа үед LV-MP хүргэлт нь in vivo генийн дамжуулалтыг сайжруулж чадах эсэхийг үнэлэх зорилготой байв. MP болон соронзон орны нөлөөллийг үнэлэхийн тулд хоёр бүлэг амьтдыг эмчилсэн: нэг бүлэгт соронз байрлуулсан LV-MP өгсөн бол нөгөө бүлэгт соронзгүй LV-MP бүхий хяналтын бүлэг өгсөн.
LV генийн векторуудыг өмнө нь тайлбарласан аргууд 25, 26 ашиглан үүсгэсэн. LacZ вектор нь уушгины эдийн урд хэсэг болон эдийн хэсгүүдэд харагдахуйц трансдукцийн эсүүдэд цэнхэр урвалын бүтээгдэхүүн үүсгэдэг MPSV промотор (LV-LacZ)-ээр удирддаг цөмд байрласан бета-галактозидаза генийг илэрхийлдэг. Титрлэлтийг эсийн өсгөвөрт LacZ эерэг эсийн тоог гемоцитометрээр гараар тоолж, титрийг TU/мл-ээр тооцоолсон. Тээгчдийг -80 °C-д крио хадгалж, хэрэглэхийн өмнө гэсгээж, CombiMag-тай холбож, 1:1 харьцаатай хольж, хүргэхээс өмнө дор хаяж 30 минутын турш мөсөн дээр инкубацалдаг.
Хэвийн Спрэг Доули хархнууд (n = 3/бүлэг, ~2-3)-ыг хэвлийн дотор 0.4 мг/кг медетомидин (Домитор, Илиум, Австрали) болон 60 мг/кг кетамин (Илиум, Австрали) нэг сартай) ип) тарилга болон мэс заслын бус амаар 16 Га судсаар канюляци хийсэн. Мөгөөрсөн хоолойн амьсгалын замын эд нь зүүн ховдлын дамжуулалтыг хүлээн авахыг баталгаажуулахын тулд өмнө нь тайлбарласан механик цочролын протоколыг ашиглан нөхцөлдүүлсэн бөгөөд үүний дагуу гуурсан хоолойн амьсгалын замын гадаргууг утсан сагсаар (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, АНУ) 30 секундын турш тэнхлэгийн дагуу үрсэн. Дараа нь LV-MP-ийг гуурсан хоолойд цочролоос хойш ойролцоогоор 10 минутын дараа биологийн аюулгүйн шүүгээнд хийсэн.
Энэхүү туршилтад ашигласан соронзон орон нь in vivo рентген дүрслэлийн судалгаатай төстэй байдлаар тохируулагдсан бөгөөд нэрэх стент хавчаар ашиглан цагаан мөгөөрсөн хоолойн дээгүүр ижил соронзуудыг байрлуулсан (Зураг 4). Өмнө нь тайлбарласны дагуу гель үзүүртэй пипетк ашиглан 50 мкл эзэлхүүнтэй (2 × 25 мкл аликвот) LV-MP-г цагаан мөгөөрсөн хоолой руу (n = 3 амьтан) оруулсан. Хяналтын бүлэг (n = 3 амьтан) соронз ашиглахгүйгээр ижил LV-MP-г авсан. Дусааж дууссаны дараа канюлийг ET хоолойноос гаргаж, амьтныг гадагшлуулдаг. Соронзыг 10 минутын турш байрандаа байлгаж, дараа нь авдаг. Харханд арьсан дор мелоксикам (1 мл/кг) тунгаар (Илиум, Австрали) өгч, дараа нь 1 мг/кг атипамазол гидрохлорид (Antisedan, Zoetis, Австрали) тарьж мэдээ алдуулалтыг буцаан хэрэглэсэн. Мэдээ алдуулалтаас бүрэн эдгэртэл хархыг дулаан байлгаж, хянаж байсан.
Биологийн аюулгүйн шүүгээнд байрлах LV-MP хүргэлтийн төхөөрөмж. ET гуурсны цайвар саарал өнгийн Люэр төв нь амнаас цухуйж байгааг харж болох бөгөөд зурагт үзүүлсэн пипеткийн гель үзүүрийг ET гуурсаар дамжуулан мөгөөрсөн хоолой руу хүссэн гүнд оруулна.
LV-MP тунгийн процедурын дараа нэг долоо хоногийн дараа амьтдыг 100% CO2 амьсгалаар хүнлэг байдлаар алж, LacZ-ийн экспрессийг бидний стандарт X-gal эмчилгээг ашиглан үнэлсэн. Эндотрахеал гуурс байрлуулснаас үүссэн механик гэмтэл эсвэл шингэн хуримтлалыг шинжилгээнд оруулаагүй эсэхийг баталгаажуулахын тулд хамгийн сүүлд мөгөөрсний гурван цагиргийг авч хаясан. Мөгөөрсөн хоолой бүрийг шинжилгээнд зориулж хоёр хагас болгохын тулд уртааш нь зүсэж, люминан гадаргууг дүрслэхийн тулд Minutien зүү (Fine Science Tools) ашиглан силикон резин агуулсан саванд (Sylgard, Dow Inc) суурилуулсан. Трансдукцлагдсан эсийн тархалт болон хэв маягийг DigiLite камер болон TCapture програм хангамж (Tucsen Photonics, Хятад) ашиглан Nikon микроскоп (SMZ1500) ашиглан урд талын гэрэл зургаар баталгаажуулсан. Зургийг 20 дахин томруулалтаар (мөгөөрсөн хоолойн бүтэн өргөний хамгийн өндөр тохиргоог оруулаад) авсан бөгөөд мөгөөрсөн хоолойн бүх уртыг алхам алхмаар дүрсэлсэн бөгөөд энэ нь зургийг "оёх" боломжийг олгохын тулд зураг бүрийн хооронд хангалттай давхцал байгааг баталгаажуулсан. Зурагнууд Дараа нь цагаан мөгөөрсөн хоолой бүрийг хавтгай хөдөлгөөний алгоритм ашиглан Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) ашиглан нэг нийлмэл зураг болгон угсарсан. Амьтан бүрийн цагаан мөгөөрсөн хоолойн нийлмэл зураг дахь LacZ илэрхийллийн талбайг өмнө нь тайлбарласны дагуу 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15, болон Value < 0.7 гэсэн тохиргоог ашиглан автоматжуулсан MATLAB скрипт (R2020a, MathWorks) ашиглан тоон үзүүлэлтээр тодорхойлсон. Эд эсийн хэлбэрийг мөрдөх замаар эдийн хэсгийг тодорхойлж, цагаан мөгөөрсөн хоолойн эд эсийн гаднаас хуурамч илрүүлэлтээс урьдчилан сэргийлэхийн тулд GIMP v2.10.24 дээр нийлмэл зураг бүрийн маскыг гараар үүсгэсэн. Амьтан бүрийн бүх нийлмэл зургаас будсан талбайг нэгтгэн тухайн амьтны нийт будсан талбайг гаргаж авсан. Дараа нь будсан талбайг маскны нийт талбайд хувааж хэвийн болгосон талбайг үүсгэсэн.
Мөгөөрсөн хоолой бүрийг парафинд хийж, 5 мкм зүсэлт хийсэн. Зүсэлтүүдийг 5 минутын турш төвийг сахисан хурдан улаанаар будсан бөгөөд зургийг Nikon Eclipse E400 микроскоп, DS-Fi3 камер болон NIS элементийн зураг авах програм хангамж (5.20.00 хувилбар) ашиглан авсан.
Бүх статистикийн шинжилгээг GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) дээр хийсэн. Статистикийн ач холбогдлыг p ≤ 0.05 гэж тогтоосон. Хэвийн байдлыг Шапиро-Вилкийн тест ашиглан баталгаажуулсан бөгөөд LacZ будалтын зөрүүг хосгүй t-тест ашиглан үнэлсэн.
Хүснэгт 1-т тайлбарласан зургаан MP-ийг PCXI ашиглан шалгасан бөгөөд харагдах байдлыг Хүснэгт 2-т тайлбарласан болно. PCXI-ийн доор хоёр полистирол MP (MP1 ба MP2; тус тус 18 μм ба 0.25 μм) харагдахгүй байсан ч үлдсэн дээжийг таних боломжтой байсан (жишээг Зураг 5-д үзүүлэв). MP3 ба MP4 (тус тус 10-15% Fe3O4; 0.25 μм ба 0.9 μм) нь бүдэг харагдаж байна. Туршилтын хамгийн жижиг хэсгүүдийн заримыг агуулсан боловч MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μм) нь хамгийн тод харагдаж байв. CombiMag бүтээгдэхүүн MP6 нь илрүүлэхэд хэцүү. Бүх тохиолдолд соронзыг капилляртай параллель урагш хойш хөрвүүлснээр MP илрүүлэх чадвар маань мэдэгдэхүйц сайжирсан. Соронзууд капилляраас холдоход хэсгүүд урт утсаар сунасан боловч соронз ойртож, соронзон орны хүч нэмэгдэхийн хэрээр хэсгүүд капиллярын дээд гадаргуу руу шилжих үед хэсгүүдийн утас богиноссон (Нэмэлт видео S1-ийг үзнэ үү: MP4), гадаргуугийн бөөмийн нягтралыг нэмэгдүүлдэг. Үүний эсрэгээр, соронзыг капилляраас салгахад талбайн хүч буурч, MP нь капиллярын дээд гадаргуугаас сунасан урт утас болж өөрчлөгддөг (Нэмэлт видео S2:MP4-г үзнэ үү). Соронз хөдлөхөө больсны дараа бөөмс тэнцвэрийн байрлалд хүрсний дараа богино хугацаанд хөдөлсөөр байна. MP нь капиллярын дээд гадаргуу руу чиглэн болон түүнээс холдох үед соронзон бөөмс нь хог хаягдлыг шингэнээр чирдэг.
PCXI доорх MP-ийн харагдах байдал нь дээжүүдийн хооронд мэдэгдэхүйц ялгаатай байна.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 болон (d) MP6. Энд үзүүлсэн бүх зургийг хялгасан судасны дээгүүр ойролцоогоор 10 мм зайд байрлах соронзоор авсан. Илэрхий том тойргууд нь хялгасан судасны дотор гацсан агаарын бөмбөлөг бөгөөд фазын контраст дүрслэлийн хар цагаан ирмэгийн онцлогийг тодорхой харуулж байна. Улаан хайрцаг нь контрастыг сайжруулдаг томруулалтыг агуулж байна. Бүх зураг дээрх соронзон схемийн диаметрүүд нь масштабтай биш бөгөөд харуулснаас ойролцоогоор 100 дахин том болохыг анхаарна уу.
Соронз нь капилляр судасны дээд хэсэгт зүүн ба баруун тийш шилжих үед MP утасны өнцөг нь соронзтой зэрэгцэн өөрчлөгддөг (Зураг 6-г үзнэ үү), ингэснээр соронзон орны шугамыг тодорхойлдог. MP3-5-ын хувьд хөвч босго өнцөгт хүрсний дараа бөөмс нь капилляр судасны дээд гадаргуу дагуу чирэгддэг. Энэ нь ихэвчлэн MP нь соронзон орон хамгийн хүчтэй байгаа газрын ойролцоо том бүлгүүдэд бөөгнөрдөг (Нэмэлт видео S3:MP5-г үзнэ үү). Энэ нь капилляр судасны төгсгөлд ойрхон дүрслэх үед онцгой тод илэрдэг бөгөөд энэ нь MP-ийг шингэн-агаарын интерфейс дээр нэгтгэж, төвлөрүүлдэг. MP3-5-аас ялгахад илүү хэцүү MP6 дахь бөөмс нь соронз нь капилляр судасны дагуу хөдлөхөд чирэгдээгүй боловч MP утасны хэсгүүд задарч, бөөмсийг харах талбарт үлдээсэн (Нэмэлт видео S4:MP6-г үзнэ үү). Зарим тохиолдолд соронзыг дүрслэх байршлаас хол зайд хөдөлгөснөөр хэрэглэсэн соронзон орон буурсан үед үлдсэн MP нь таталцлын хүчээр хоолойн доод гадаргуу руу аажмаар бууж, утсаар үлдсэн (Нэмэлт видео S5: MP3-г үзнэ үү).
Соронз нь хялгасан судасны дээгүүр баруун тийш шилжихэд MP утасны өнцөг өөрчлөгддөг.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 болон (d) MP6. Улаан хайрцагт тодосгогчийг нэмэгдүүлэх томруулалт багтсан болно. Нэмэлт видеонууд нь эдгээр статик дүрслэлд дүрслэх боломжгүй чухал бөөмийн бүтэц болон динамик мэдээллийг илчилдэг тул мэдээлэл сайтай гэдгийг анхаарна уу.
Бидний туршилтаар соронзыг мөгөөрсөн хоолойгоор аажмаар урагш хойш хөдөлгөх нь in vivo цогц хөдөлгөөний нөхцөлд MP-ийг дүрслэхэд дөхөм болохыг харуулсан. Полистирол бөмбөлгүүд (MP1 ба MP2) нь капиллярд харагдахгүй байсан тул in vivo туршилтыг хийгээгүй. Үлдсэн дөрвөн MP тус бүрийг соронзонгийн урт тэнхлэгийг мөгөөрсөн хоолойн дээгүүр босоо чиглэлд 30° орчим өнцгөөр тохируулан in vivo туршсан (2b ба 3a зургийг үзнэ үү), учир нь энэ нь MP гинжийг урт болгож, соронзон тохиргоог дуусгавар болгосноос илүү үр дүнтэй байв. MP3, MP4 ба MP6 нь амьд амьтдын мөгөөрсөн хоолойд илрээгүй. Амьтдыг хүнлэг аргаар алсаны дараа хархны амьсгалын замыг дүрслэхэд тариурын шахуурга ашиглан нэмэлт эзэлхүүн нэмсэн ч хэсгүүд нь үл үзэгдэх хэвээр байв. MP5 нь хамгийн өндөр төмрийн ислийн агууламжтай бөгөөд цорын ганц харагдах бөөм байсан тул MP-ийн in vivo зан төлөвийг үнэлэх, тодорхойлоход ашигласан.
MP хүргэлтийн үед цагаан мөгөөрсөн хоолой дээр соронз байрлуулснаар олон MP нь харах талбарт төвлөрсөн боловч бүгд биш байв. Цагаан мөгөөрсөн хоолой руу орж буй хэсгүүдийг хүнлэгээр золиосолсон амьтдад хамгийн сайн ажигладаг. Зураг 7 болон нэмэлт видео S6: MP5 нь ховдлын цагаан мөгөөрсөн хоолойн гадаргуу дээрх хэсгүүдийг хурдан соронзон барьж авах, тэгшлэхийг харуулж байгаа бөгөөд энэ нь MP-ийг цагаан мөгөөрсөн хоолойн хүссэн хэсгүүд рүү чиглүүлж болохыг харуулж байна. MP хүргэлтийн дараа цагаан мөгөөрсөн хоолойн дагуу илүү алслагдсан хэсгийг хайхад зарим MP нь каринатай ойрхон олдсон нь шингэний процессын үед хамгийн их соронзон орны хүч чадлын бүсээр дамжин хүргэгдсэн тул соронзон орны хүч чадал нь бүх MP-ийг цуглуулж, хадгалахад хангалтгүй байгааг харуулж байна. Гэсэн хэдий ч төрсний дараах MP-ийн концентраци нь дүрслэгдсэн хэсгийн эргэн тойронд өндөр байсан нь олон MP нь хэрэглэсэн соронзон орны хүч чадал хамгийн өндөр байсан амьсгалын замын хэсгүүдэд үлдсэнийг харуулж байна.
Саяхан эвтанази хийлгэсэн хархны мөгөөрсөн хоолойд MP5 оруулахаас өмнөх болон (b) дараах зургууд, соронзыг дүрслэлийн хэсгийн дээгүүр байрлуулсан. Дүрслэл авсан хэсэг нь хоёр мөгөөрсний цагиргийн хооронд байрладаг. MP хүргэхээс өмнө амьсгалын замд шингэн байдаг. Улаан хайрцагт тодосгогчийг нэмэгдүүлэх томруулалт байдаг. Эдгээр зургууд нь S6:MP5 нэмэлт видеонд үзүүлсэн видеоноос авсан болно.
Соронзыг мөгөөрсөн хоолойгоор дамжуулан амьд орчинд шилжүүлэх нь MP гинжийг амьсгалын замын гадаргуу доторх өнцгийг хялгасан судаснуудад харагддагтай төстэй байдлаар өөрчлөхөд хүргэсэн (Зураг 8 болон Нэмэлт видео S7:MP5-г үзнэ үү). Гэсэн хэдий ч бидний судалгаагаар MP-ийг хялгасан судаснуудтай адил амьд амьсгалын замын гадаргуу дээр чирж болохгүй байсан. Зарим тохиолдолд соронз зүүн ба баруун тийш хөдлөхөд MP гинж уртсах болно. Сонирхолтой нь, бид соронзыг мөгөөрсөн хоолойгоор уртааш хөдөлгөхөд бөөмийн утас нь гадаргуугийн шингэний давхаргын гүнийг өөрчилдөг бөгөөд соронзыг шууд дээш хөдөлгөж, бөөмийн утас босоо байрлалд эргүүлэхэд тэлдэг болохыг олж мэдсэн (Нэмэлт видео S7-г үзнэ үү). : MP5 нь 0:09 цагт, баруун доод хэсэгт). Соронзыг цагаан мөгөөрсөн хоолойн дээд хэсэгт хажуу тийш (өөрөөр хэлбэл цагаан мөгөөрсөн хоолойн уртын дагуу биш харин амьтны зүүн эсвэл баруун талд) шилжүүлэхэд хөдөлгөөний онцлог хэв маяг өөрчлөгдсөн. Бөөмс хөдлөх үед тодорхой харагдаж байсан ч соронзыг цагаан мөгөөрсөн хоолойноос салгахад бөөмсийн утасны үзүүрүүд харагдаж эхэлсэн (0:08-аас эхлэн S8:MP5 нэмэлт видеог үзнэ үү). Энэ нь шилэн капилляр дахь соронзон орны нөлөөн дор бидний ажигласан MP-ийн зан төлөвтэй нийцэж байна.
Амьд мэдээ алдуулалт хийсэн хархны цагаан мөгөөрсөн хоолойд MP5 байгааг харуулсан жишээ зургууд. (a) Соронзыг цагаан мөгөөрсөн хоолойн дээр болон зүүн талд, дараа нь (b) соронзыг баруун тийш шилжүүлсний дараа авахад ашигладаг. Улаан хайрцагт тодосгогч томруулалт багтсан болно. Эдгээр зургууд нь S7:MP5 нэмэлт видеонд үзүүлсэн видеоноос авсан болно.
Хоёр туйлыг цагаан мөгөөрсөн хоолойн дээр ба доор хойд-өмнөд чиглэлд (өөрөөр хэлбэл татах; Зураг 3b) тохируулах үед MP хөвчүүд илүү урт харагдаж, нурууны цагаан мөгөөрсөн хоолойн гадаргуу дээр биш харин цагаан мөгөөрсөн хоолойн хажуугийн хананд байрладаг байв (Нэмэлт видео S9:MP5-г үзнэ үү). Гэсэн хэдий ч хос соронзон төхөөрөмж ашиглах үед шингэн хүргэсний дараа нэг байршилд (өөрөөр хэлбэл цагаан мөгөөрсөн хоолойн нурууны гадаргуу) өндөр концентраци илрээгүй бөгөөд энэ нь ихэвчлэн нэг соронзон төхөөрөмж ашиглах үед тохиолддог. Дараа нь нэг соронзыг туйлуудыг түлхэхээр тохируулах үед (Зураг 3c), харааны талбарт харагдах бөөмсийн тоо хүргэлтийн дараа нэмэгдээгүй бололтой. Соронзыг тус тус татах эсвэл түлхэх өндөр соронзон орны хүчнээс шалтгаалан хоёр хос соронзон тохиргооны тохиргоо нь хүндрэлтэй байдаг. Дараа нь тохиргоог амьсгалын замтай параллель боловч амьсгалын замаар 90 градусаар дамжин өнгөрөх ганц соронз болгон өөрчилсөн тул талбайн шугамууд нь цагаан мөгөөрсөн хоолойн ханыг ортогональ байдлаар огтлолцсон (Зураг 3d), энэ чиглэл нь хажуугийн ханан дээрх бөөмсийн агрегацийг ажиглаж болох эсэхийг тодорхойлох зорилготой юм. Гэсэн хэдий ч энэ тохиргоонд MP хуримтлал эсвэл соронзон хөдөлгөөний тодорхойлогдох хөдөлгөөн байгаагүй. Эдгээр бүх үр дүнд үндэслэн in vivo генийн тээвэрлэгчийн судалгаанд зориулж дан соронзон, 30 градусын чиглэлийн тохиргоог (Зураг 3a) сонгосон.
Амьтныг хүнлэг аллагын дараа шууд дахин дахин дүрслэхэд эдийн хөдөлгөөнийг төөрөгдүүлээгүй тул соронзонгийн шилжилт хөдөлгөөнтэй зэрэгцэн "сажруулж" байгаа тунгалаг хондраль талбарт илүү нарийн, богино бөөмсийн шугамыг ялгаж болно гэсэн үг юм. Гэсэн хэдий ч MP6 бөөмсийн байгаа байдал болон хөдөлгөөнийг тодорхой харж чадахгүй хэвээр байна.
LV-LacZ титр нь 1.8 × 108 TU/мл байсан бөгөөд CombiMag MP (MP6)-тай 1:1 харьцаатай хольсны дараа амьтад 9 × 107 TU/мл LV тээврийн хэрэгслийн 50 мкл гуурсан хоолойн тунг (өөрөөр хэлбэл 4.5 × 106 TU/харх) авсан. ). Эдгээр судалгаанд төрөлтийн үед соронзыг шилжүүлэхийн оронд бид соронзыг нэг байрлалд бэхэлсэн бөгөөд ингэснээр LV дамжуулалтыг (а) соронзон орон байхгүй үед векторын дамжуулалттай харьцуулахад сайжруулж болох эсэх, (б) төвлөрч болох эсэхийг тодорхойлсон. Амьсгалын замын эсүүд нь дээд амьсгалын замын соронзон зорилтот бүсүүд рүү дамжуулагддаг.
Соронзон байгаа эсэх болон CombiMag-ийг зүүн ховдлын векторуудтай хослуулан хэрэглэх нь амьтны эрүүл мэндэд сөргөөр нөлөөлөөгүй бөгөөд бидний стандарт зүүн ховдлын векторын хүргэлтийн протокол ч мөн адил байв. Механик өөрчлөлтөд өртсөн гуурсан хоолойн хэсгийн урд талын зургууд (Нэмэлт Зураг 1) нь соронз байгаа үед LV-MP-ээр эмчилсэн амьтдын бүлэгт дамжуулалтын түвшин мэдэгдэхүйц өндөр байгааг харуулж байна (Зураг 9a). Хяналтын бүлэгт бага хэмжээний цэнхэр LacZ будалт байсан (Зураг 9b). Хэвийн болгосон X-Gal будсан хэсгүүдийн тоон үзүүлэлтээр LV-MP-ийг соронзон орон байгаа үед хэрэглэхэд ойролцоогоор 6 дахин сайжирсан болохыг харуулсан (Зураг 9c).
Соронзон орон байгаа үед (a) болон соронз байхгүй үед (b) LV-MP-ээр мөгөөрсөн хоолойн дамжуулалтыг харуулсан нийлмэл зургийн жишээ. (c) Соронз ашиглах үед мөгөөрсөн хоолой доторх хэвийн болсон LacZ дамжуулалтын талбайд статистикийн хувьд мэдэгдэхүйц сайжралт ажиглагдсан (*p = 0.029, t-тест, бүлэг тус бүрт n = 3, дундаж ± SEM).
Саармаг хурдан улаанаар будсан хэсгүүд (жишээг Нэмэлт Зураг 2-т үзүүлэв) нь өмнө нь мэдээлснээр ижил төстэй хэв маяг, байршилд LacZ-ээр будсан эсүүд байгааг харуулав.
Амьсгалын замын генийн эмчилгээний гол бэрхшээл нь сонирхлын бүсэд тээвэрлэгч бөөмсийг зөв байрлуулах, агаарын урсгал болон идэвхтэй салст цэвэрлэгээний үед хөдөлж буй уушгинд өндөр түвшний дамжуулалтын үр ашгийг хангах явдал хэвээр байна. CF амьсгалын замын өвчнийг эмчлэх зориулалттай зүүн ховдлын тээвэрлэгчдийн хувьд дамжуулагч бөөмсийг дамжуулагч амьсгалын замд байлгах хугацааг нэмэгдүүлэх нь өнөөг хүртэл тодорхойгүй зорилго байсаар ирсэн. Кастеллани болон бусад хүмүүсийн онцолсончлон, дамжуулалтыг сайжруулахын тулд соронзон орон ашиглах нь электропораци зэрэг бусад генийн дамжуулалтын аргуудтай харьцуулахад давуу талтай бөгөөд энэ нь энгийн байдал, өртөг хэмнэлт, дамжуулалтын байршил, үр ашгийг нэмэгдүүлэх, инкубацийн хугацааг богиносгох, магадгүй тээвэрлэгчийн тунг багасгах боломжийг хослуулж чаддаг10. Гэсэн хэдий ч гадны соронзон хүчний нөлөөн дор амьсгалын замд соронзон бөөмсийн in vivo тунадасжилт болон зан төлөвийг хэзээ ч тайлбарлаагүй бөгөөд энэ аргыг бүрэн бүтэн амьд амьсгалын замд генийн илэрхийлэлийн түвшинг нэмэгдүүлэх in vivo-ийн хэрэгжих боломжийг нотлоогүй байна.
Бидний in vitro синхротрон PCXI туршилтууд нь полистирол MP-ээс бусад бүх бөөмс бидний ашигласан дүрслэлийн тохиргоонд харагдаж байгааг харуулсан. Соронзон орон байгаа үед MP нь бөөмийн төрөл болон соронзон орны хүч чадалтай (өөрөөр хэлбэл соронзонгийн ойр байдал ба хөдөлгөөн) холбоотой урттай утаснуудыг үүсгэдэг. Зураг 10-т үзүүлсэнчлэн бидний ажигласан утаснууд нь бие даасан бөөм бүр соронзон болж, өөрийн гэсэн орон нутгийн соронзон оронг өдөөснөөр үүсдэг. Эдгээр тусдаа талбарууд нь бусад ижил төстэй бөөмсийг нэгтгэж, холбоход хүргэдэг бөгөөд бусад бөөмсийн орон нутгийн татах хүч ба түлхэлтийн хүчний улмаас бүлгийн утас шиг хөдөлгөөн үүсдэг.
Шингэнээр дүүрсэн хялгасан судаснууд болон (c, d) агаараар дүүрсэн цагаан мөгөөрсөн хоолойн дотор үүссэн бөөмсийн цувааг (a, b) харуулсан схем. Капилляр болон цагаан мөгөөрсөн хоолойг масштабаар зураагүй болохыг анхаарна уу. (a) самбарт мөн утас хэлбэрээр байрлуулсан Fe3O4 бөөмс агуулсан MP-ийн тодорхойлолтыг оруулсан болно.
Соронзыг капиллярын дээгүүр хөдөлгөхөд бөөмсийн цувааны өнцөг нь Fe3O4 агуулсан MP3-5-ын хувьд чухал босго хэмжээнд хүрсэн бөгөөд үүний дараа бөөмсийн цуваа анхны байрлалдаа байхаа больж, харин гадаргуугийн дагуу шинэ байрлал руу шилжсэн. соронз. Энэ нөлөө нь шилэн капиллярын гадаргуу нь энэ хөдөлгөөнийг хийх хангалттай гөлгөр тул үүсэх магадлалтай. Сонирхолтой нь, MP6 (CombiMag) нь ийм байдлаар ажиллаагүй, магадгүй бөөмс нь жижиг, өөр өөр бүрхүүлтэй эсвэл гадаргуугийн цэнэгтэй, эсвэл өмчийн тээвэрлэгч шингэн нь тэдний хөдлөх чадварт нөлөөлсөн байж магадгүй юм. CombiMag бөөмсийн зургийн ялгаа нь мөн сул байгаа нь шингэн ба бөөмс нь ижил нягтралтай байж болох тул бие бие рүүгээ амархан хөдөлдөггүйг харуулж байна. Соронз хэт хурдан хөдөлвөл бөөмс гацаж магадгүй бөгөөд энэ нь соронзон орны хүч нь шингэн дэх бөөмсийн хоорондох үрэлтийг үргэлж даван туулж чадахгүй байгааг харуулж байгаа бөгөөд соронзон орны хүч чадал ба соронз ба зорилтот хэсгийн хоорондох зай маш чухал гэдгийг харуулж байна. Эдгээр үр дүнгүүдийг нэгтгэн үзвэл соронз нь зорилтот хэсгээр урсаж буй олон MP-ийг барьж чаддаг ч соронзонд найдаж болохгүй гэдгийг харуулж байна. CombiMag бөөмсийг мөгөөрсөн хоолойн гадаргуу дагуу хөдөлгөнө. Тиймээс бид in vivo LV-MP судалгаанууд нь амьсгалын замын модны тодорхой хэсгүүдийг физик байдлаар чиглүүлэхийн тулд статик соронзон орон ашиглах ёстой гэж дүгнэж байна.
Бөөмс биед ороход нарийн төвөгтэй хөдөлж буй биеийн эд эсийн нөхцөлд тодорхойлоход хэцүү байдаг ч соронзыг мөгөөрсөн хоолойн дээгүүр хэвтээ чиглэлд шилжүүлж, MP утсыг "хөдөлгөснөөр" илрүүлэх чадварыг сайжруулсан. Шууд дүрслэл хийх боломжтой ч амьтныг хүнлэг байдлаар хөнөөсний дараа бөөмсийн хөдөлгөөнийг ялгахад илүү хялбар байдаг. Соронзыг дүрслэлийн талбайн дээгүүр байрлуулах үед MP-ийн концентраци энэ газарт ерөнхийдөө хамгийн өндөр байсан ч зарим бөөмс нь ихэвчлэн мөгөөрсөн хоолойн дагуу байрладаг байв. In vitro судалгаанаас ялгаатай нь соронзыг шилжүүлснээр бөөмсийг мөгөөрсөн хоолойгоор чирж болохгүй. Энэхүү олдвор нь мөгөөрсөн хоолойн гадаргууг бүрхсэн салиа нь амьсгалсан бөөмсийг хэрхэн боловсруулж, салстад барьж, улмаар салст бүрхүүлийн цэвэрлэгээний механизмаар хэрхэн цэвэрлэдэгтэй нийцэж байна.
Бид мөгөөрсөн хоолойн дээгүүр болон доор таталцлын соронз ашиглах нь (Зураг 3b) нэг цэг дээр өндөр төвлөрсөн соронзон орны оронд илүү жигд соронзон орон үүсгэж, бөөмсийн илүү жигд тархалтад хүргэж болзошгүй гэж таамагласан. Гэсэн хэдий ч бидний урьдчилсан судалгаагаар энэ таамаглалыг дэмжих тодорхой нотолгоо олдсонгүй. Үүнтэй адилаар, түлхэхийн тулд хос соронзыг тохируулах нь (Зураг 3c) дүрслэгдсэн хэсэгт бөөмийн хуримтлал нэмэгдэхэд хүргэсэнгүй. Эдгээр хоёр олдвор нь хос соронзон тохиргоо нь MP-ийн онилох орон нутгийн хяналтыг мэдэгдэхүйц сайжруулдаггүй бөгөөд үүнээс үүдэлтэй хүчтэй соронзон хүчийг тохируулахад хэцүү тул энэ аргыг практик биш болгодог болохыг харуулж байна. Үүнтэй адил соронзыг мөгөөрсөн хоолойн дээгүүр болон түүгээр чиглүүлэх нь (Зураг 3d) дүрслэгдсэн хэсэгт хадгалагдсан бөөмсийн тоог нэмэгдүүлээгүй. Эдгээр өөр тохиргоонуудын зарим нь тунадасны хэсэгт соронзон орны хүчийг бууруулдаг тул амжилттай биш байж магадгүй юм. Тиймээс 30 градусын өнцгийн ганц соронзон тохиргоог (Зураг 3a) in vivo туршилтын хамгийн хялбар бөгөөд хамгийн үр дүнтэй арга гэж үздэг.
LV-MP судалгаагаар LV векторуудыг CombiMag-тай хослуулан соронзон орны дэргэд физик өөрчлөлтийн дараа хүргэхэд хяналтын бүлэгтэй харьцуулахад цагаан мөгөөрсөн хоолойд дамжуулалтын түвшин мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн болохыг харуулсан. Синхротроны дүрслэлийн судалгаа болон LacZ-ийн үр дүнд үндэслэн соронзон орон нь цагаан мөгөөрсөн хоолой дотор LV-г хадгалж, уушгинд гүн нэвтэрсэн векторын хэсгүүдийн тоог бууруулж чадсан бололтой. Ийм чиглүүлэлтийн сайжруулалт нь хүргэгдсэн титр, зорилтот бус дамжуулалт, үрэвсэл, дархлааны гаж нөлөө, генийн тээвэрлэгчийн зардлыг бууруулахын зэрэгцээ үр ашгийг дээшлүүлэхэд хүргэж болзошгүй юм. Үйлдвэрлэгчийн мэдээлснээр CombiMag-ийг бусад генийн дамжуулалтын аргуудтай хамт, түүний дотор бусад вирусын векторууд (жишээлбэл, AAV) болон нуклейн хүчилтэй хамт ашиглаж болно.