Nature.com сайтад зочилсонд баярлалаа. Таны ашиглаж буй хөтчийн хувилбар нь CSS-г хязгаарлагдмал дэмждэг. Хамгийн сайн ашиглахын тулд бид танд шинэчилсэн хөтөч ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer дээр нийцтэй байдлын горимыг унтраах). Энэ хооронд үргэлжлүүлэн дэмжлэг үзүүлэхийн тулд бид сайтыг загвар болон JavaScript-гүй харуулах болно.
Уушигны цистик фиброзын эмчилгээнд зориулсан генийн векторууд нь амьсгалын замд чиглэгдэх ёстой, учир нь уушгины захын дамжуулалт нь эмчилгээний үр нөлөөг өгдөггүй. Вирусын дамжуулалтын үр ашиг нь векторын оршин суух хугацаатай шууд холбоотой байдаг. Гэсэн хэдий ч ген тээгч гэх мэт дамжуулагч шингэн нь амьсгалын үед цулцангийн хөндийд байгалийн жамаар тархаж, салст бүрхэвч нь тунгалаг байдаг. тээвэр.Амьсгалын замд генийн тээвэрлэгчдийн оршин суух хугацааг уртасгах нь чухал боловч хүрэхэд хэцүү байдаг.Амьсгалын замын гадаргуу руу чиглүүлэх боломжтой ген тээгч-коньюгат соронзон тоосонцор нь бүс нутгийн зорилтот байдлыг сайжруулж чадна.In vivo дүрслэлийн сорилтуудын улмаас ийм жижиг соронзон хэсгүүдийн амьсгалын замын гадаргуу дээрх зан төлөвийг энэ талбарт соронзтой ашиглахын тулд муу ашигласан. синхротрон дүрслэл нь мэдээгүйжүүлсэн хархны цагаан мөгөөрсөн хоолой дахь соронзон хэсгүүдийн цувралын in vivo хөдөлгөөнийг дүрслэн харуулах зорилгоор бие даасан болон бөөн бөөмийн зан үйлийн динамик, хэв маягийг in vivo-д судлах болно. Дараа нь соронзон орон байгаа үед лентивирусын соронзон бөөмсийг дамжуулах нь Рентген туяаны дамжуулалтын үр ашгийг нэмэгдүүлэх эсэхийг үнэлэв. in vitro болон in vivo нөхцөлд хөдөлгөөнгүй болон хөдөлж буй соронзон орон дахь соронзон хэсгүүдийн үйл ажиллагааг харуулдаг.Бөөмсүүдийг амьд амьсгалын замын гадаргуугийн дагуу соронзонгоор хялбархан чирэх боломжгүй боловч тээвэрлэлтийн явцад соронзон орон хамгийн хүчтэй байдаг харах талбарт хуримтлагддаг. Эдгээр үр дүн нь лентивирусын соронзон тоосонцор ба соронзон орон нь ген векторын зорилтыг сайжруулах, амьсгалын замыг in vivo дамжуулахад дамжуулалтын түвшинг нэмэгдүүлэх үнэ цэнэтэй арга байж болохыг харуулж байна.
Цистик фиброз (CF) нь CF трансмембран дамжуулагч зохицуулагч (CFTR) гэж нэрлэгддэг нэг генийн өөрчлөлтөөс үүсдэг. CFTR уураг нь CF эмгэг жамын гол хэсэг болох амьсгалын зам зэрэг биеийн бүх эпителийн эсүүдэд байдаг ионы суваг юм. (ASL) давхарга. Энэ нь мөн салст бүрхүүлийн тээвэрлэлтийн (MCT) системийн амьсгалын замаас амьсгалсан тоосонцор болон эмгэг төрүүлэгч бичил биетүүдийг цэвэрлэх чадварыг бууруулдаг. Бидний зорилго бол CFTR генийн зөв хуулбарыг хүргэх, ASL, MCT, уушгины эрүүл мэндийг сайжруулах, эдгээр шинэ технологиудыг үргэлжлүүлэн хөгжүүлэх лентивирус (LV) генийн эмчилгээг хөгжүүлэх явдал юм.
LV векторууд нь амьсгалын замын суурь эсүүд (амьсгалын замын үүдэл эс)-д эмчилгээний генийг байнга нэгтгэж чаддаг тул амьсгалын замын генийн эмчилгээнд тэргүүлэх нэр дэвшигчдийн нэг юм. Энэ нь амьсгалын замын үндсэн эсүүд (амьсгалын замын үүдэл эсүүд) функциональ ген болгон ялгаж хэвийн чийгшүүлэх, салст бүрхүүлийн цэвэршилтийг сэргээж, амьсгалын замын гадаргуугийн шууд дамжуулалтад шууд нөлөөлнө. Амьсгалын зам, учир нь эндээс уушигны CF өвчин эхэлдэг. Векторыг уушгины гүнд хүргэх нь цулцангийн дамжуулалтыг үүсгэж болох ч энэ нь CF-д эмчилгээний ач холбогдол өгөхгүй. Гэсэн хэдий ч ген тээгч гэх мэт шингэн нь төрсний дараа амьсгалын замаар цулцанд руу шилждэг3,4 ба эмчилгээний цэвэр тоосонцор MVL-д хурдан шилждэг. Үр ашиг нь эсийн шингээлтийг хангахын тулд вектор зорилтот эсийн хажууд байх хугацаатай шууд хамааралтай байдаг – “оршин суух хугацаа”5 – энэ нь ердийн бүс нутгийн агаарын урсгал, түүнчлэн зохицуулалттай бөөмсийн салиа барих, MCT зэргээр амархан буурдаг. CF-ийн хувьд амьсгалын замд LV-ийн оршин суух хугацааг уртасгах чадвар нь энэ бүс нутагт дамжуулалтын өндөр түвшинд хүрэхэд чухал ач холбогдолтой боловч өнөөг хүртэл үргэлжилсээр байна.
Энэ саадыг даван туулахын тулд LV соронзон хэсгүүд (MPs) нь нэмэлт хоёр аргаар тусалж чадна гэж бид санал болгож байна. Нэгдүгээрт, тэдгээрийг амьсгалын замын гадаргуу руу соронзон аргаар чиглүүлж, зорилтот чиглэлийг сайжруулж, ген тээгч хэсгүүдийг хүссэн амьсгалын замын бүсэд байрлуулахад тусалдаг; ба ASL) эсийн давхаргад шилжих 6. МП нь эсрэгбие, хими эмчилгээний эм эсвэл бусад жижиг молекулуудтай холбогдож, эсийн мембранд наалддаг эсвэл эсийн гадаргуугийн холбогдох рецепторуудтай холбогдож, статик цахилгаантай үед хавдрын голомтод хуримтлагддаг эм дамжуулах хэрэгсэл болгон өргөнөөр ашигладаг. Хорт хавдрын эмчилгээнд зориулсан соронзон орон 7. Бусад "гипертермал" аргууд нь парламентын гишүүдийг хэлбэлздэг соронзон орны нөлөөлөлд өртөх үед халааж, улмаар хавдрын эсийг устгах зорилготой. Соронзон дамжуулалтын зарчим нь соронзон орон нь ДНХ-ийн эсэд шилжих шилжилтийг сайжруулахын тулд трансфекцийн бодис болгон ашигладаг бөгөөд энэ нь in vitrovirus болон генийн бус векторыг ихэвчлэн ашигладаг. Хөрвүүлэхэд хэцүү эсийн шугамууд. LV соронзон дамжуулалтын үр нөлөө нь тогтоогдсон бөгөөд LV-MPs-ийг хүний ​​гуурсан хоолойн хучуур эдийн эсийн шугамд статик соронзон орон байгаа нөхцөлд in vitro дамжуулснаар дамжуулалтын үр ашгийг дан LV вектортой харьцуулахад 186 дахин нэмэгдүүлсэн. LV-MP-ийг in vitroV дамжуулалтын загварт мөн LV соронзон дамжуулалтыг ашигласан. Цэрний цэр байгаа үед агаар-шингэний интерфэйсийн өсгөвөр 20 дахин нэмэгддэг10. Гэсэн хэдий ч in vivo эрхтэний соронзон дамжуулалт харьцангуй бага анхаарал хандуулж, зөвхөн цөөн тооны амьтдын судалгаанд үнэлэгдсэн байдаг11,12,13,14,15, ялангуяа уушгинд16,17. Гэсэн хэдий ч CF-ийн эмчилгээнд тодорхой боломжууд байдаг. al.(2020) "уушигны соронзон нано бөөмсийг үр ашигтай хүргэх тухай концепцийн судалгаа нь CF-тэй өвчтөнүүдийн эмнэлзүйн үр дүнг сайжруулахын тулд ирээдүйн CFTR амьсгалах стратегийн замыг нээх болно" гэж мэдэгджээ.
Хэрэглэсэн соронзон орон байгаа үед амьсгалын замын гадаргуу дээрх жижиг соронзон хэсгүүдийн үйлдлийг дүрслэн харуулах, судлахад хэцүү байдаг тул сайн ойлгогдохгүй байна. Бусад судалгаанд бид синхротрон тархалтад суурилсан фазын тодосгогч рентген дүрслэлийг (PB-PCXI) инвазив бус байдлаар дүрслэн харуулах, ASL190-ийн өөрчлөлт, MSL1901 минутын дотор шууд дүрслэх, хэмжих аргыг боловсруулсан. хийн сувгийн гадаргуугийн чийгшлийг хэмжиж, эмчилгээний үр дүнгийн эхний үзүүлэлт болгон ашигладаг. Үүнээс гадна, манай MCT үнэлгээний арга нь хөнгөн цагааны исэл эсвэл өндөр хугарлын индекс бүхий шилнээс бүрдэх 10-35 микрон диаметртэй тоосонцорыг PB-PCXI21 ашиглан харагдахуйц MCT маркер болгон ашигладаг. Хоёр төрлийн техник нь олон төрлийн бөөмсийг дүрслэн харуулахад тохиромжтой.
Орон зайн болон цаг хугацааны өндөр нарийвчлалтай учраас манай PB-PCXI-д суурилсан ASL болон MCT шинжилгээний арга нь дан болон бөөн бөөмийн зан үйлийн динамик, хэв маягийг in vivo-д судлахад маш тохиромжтой байдаг. Энэ арга нь MP генийг дамжуулах арга техникийг ойлгох, оновчтой болгоход тусалдаг. Бидний энд хэрэглэж буй арга нь SPring-8 BL20B2-ийн дамжуулалтын шингэнийг ашиглан хийсэн судалгаанаас үүдэлтэй. Хулганы уушигны амьсгалын замууд нь бидний ген тээгч тунгийн амьтдын судалгаагаар ажиглагдсан жигд бус генийн илэрхийллийн хэв маягийг тайлбарлахад туслах болно 3,4.
Энэхүү судалгааны зорилго нь PB-PCXI синхротроныг ашиглан амьд хархны цагаан мөгөөрсөн хоолой дахь парламентын гишүүдийн in vivo хөдөлгөөнийг дүрслэн харуулах явдал байв. Эдгээр PB-PCXI дүрслэлийн судалгаа нь MP-ийн хөдөлгөөнд үзүүлэх нөлөөллийг тодорхойлохын тулд олон тооны парламентын гишүүд, соронзон орны хүч, байршлыг турших зорилготой юм. Эдгээр судалгаанууд нь мөн хуримтлагдсаны дараа гуурсан хоолойд үлдэх хэсгүүдийн тоог нэмэгдүүлэх соронзон тохиргоог тодорхойлох боломжийг бидэнд олгосон. Хоёрдахь цуврал судалгаанд бид LV-MP-ийг хархны амьсгалын замд in vivo хүргэснээр LV-MP-ийг LV-ийн агаарын замд хүргэх нь сайжирна гэсэн таамаглал дээр үндэслэн энэхүү оновчтой тохиргоог ашиглахыг эрэлхийлсэн. дамжуулалтын үр ашиг.
Амьтны бүх судалгааг Аделаидын их сургууль (M-2019-060 ба M-2020-022) болон SPring-8 синхротрон амьтны ёс зүйн хорооноос баталсан протоколын дагуу хийсэн. Туршилтыг ARRIVE удирдамжийн дагуу хийсэн.
Бүх рентген дүрслэлийг Японы SPring-8 синхротрон дээрх BL20XU цацрагийн шугам дээр өмнө нь тайлбарласантай төстэй тохиргоог ашиглан хийсэн21,22. Товчхондоо туршилтын хайрцгийг синхротроны хадгалалтын цагирагнаас 245 м зайд байрлуулсан. Дээжээс илрүүлэгч хүртэлх 0.6 м-ийн зайг бөөмийн судалгаанд ашигладаг. фазын тодосгогч эффект үүсгэхийн тулд. 25 кВ-ын монохромат цацрагийн энергийг ашигласан. Зургийг sCMOS детектортой холбосон өндөр нарийвчлалтай рентген хөрвүүлэгч (SPring-8 BM3) ашиглан авсан. Хөрвүүлэгч нь 10 мкм зузаантай сцинтиллятор (Gd3Al2Ga) ашиглан рентген туяаг харагдах гэрэл болгон хувиргадаг. × 10 микроскопын объектив (NA 0.3). sCMOS илрүүлэгч нь 2048 × 2048 пикселийн массивын хэмжээ, 6.5 × 6.5 мкм-ийн түүхий пикселийн хэмжээ бүхий Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Япон) байв. Энэхүү тохиргоо нь тропикийн 5 µm хэмжээтэй, тропикийн 5 μм хэмжээтэй үр дүнтэй харагдах байдлыг харуулж байна. ойролцоогоор 1.1 мм × 1.1 мм. Амьсгалын замын доторх болон гаднах соронзон хэсгүүдийн дохио-дуу чимээний харьцааг нэмэгдүүлэхийн зэрэгцээ амьсгалаас үүдэлтэй хөдөлгөөний олдворыг багасгахын тулд 100 мс-ийн өртөлтийн уртыг сонгосон. In vivo судалгаанд рентген туяаны цацрагийг хязгаарлах замаар рентген туяаны замд хурдан рентген хаалт байрлуулсан.
BL20XU дүрсний камер нь Биоаюулгүй байдлын 2-р түвшний гэрчилгээгүй тул LV зөөвөрлөгчийг SPring-8 PB-PCXI дүрслэлийн судалгаанд ашиглаагүй. Үүний оронд бид хоёр арилжааны нийлүүлэгчээс сайн шинж чанартай парламентын гишүүдийг сонгон авч, хэмжээ, материал, төмрийн концентраци, хэрэглээ зэргийг багтаасан бөгөөд шилний шилний шилний хөдөлгөөн, шилний шилний хөдөлгөөнд хэрхэн нөлөөлж байгааг ойлгох болно. амьд амьсгалын замд. гадаргуу дээр.MP-ийн хэмжээ нь 0.25-аас 18 мкм-ийн хооронд хэлбэлздэг бөгөөд янз бүрийн материалаар хийгдсэн байдаг (Хүснэгт 1-ийг харна уу), гэхдээ дээж бүрийн найрлага, түүний дотор МБ доторх соронзон хэсгүүдийн хэмжээ тодорхойгүй байна. Бидний өргөн хүрээтэй MCT судалгаан дээр үндэслэн 19, 20, 21, 23, 24, бид агаарын замд жижиг хэмжээтэй байх болно гэж найдаж байна. гадаргуу, тухайлбал, дараалсан хүрээг хасч, MP-ийн хөдөлгөөний илүү харагдах байдлыг харах боломжтой. 0.25 μм хэмжээтэй ганц МП нь дүрслэх төхөөрөмжийн нягтралаас бага боловч PB-PCXI нь тэдгээрийн эзлэхүүний тодосгогчийг болон шингэний дараа хуримтлагдсан гадаргуугийн шингэний хөдөлгөөнийг илрүүлэх төлөвтэй байна.
Хүснэгт 1 дэх MP тус бүрийн дээжийг 0.63 мм-ийн дотоод диаметр бүхий 20 мкл шилэн хялгасан судсанд (Drummond Microcaps, PA, USA) бэлтгэсэн. Корпускуляр хэсгүүд нь усанд байдаг бол CombiMag тоосонцор нь үйлдвэрлэгчийн тусгай шингэнд байдаг. Хоолой бүрийг хагас шингэнээр дүүргэж, дээжийг 1 μл дээр байрлуулна. (Зураг 1-ийг үзнэ үү). Шилэн хялгасан судсыг зургийн хайрцагт дээжийн үе шатанд хэвтээ байдлаар байрлуулж, шингэний ирмэгийг байрлуулав. 19 мм диаметртэй (28 мм урт) никель бүрхүүлийн газрын ховор неодим төмрийн бор (NdFeB) соронз (N35, кат. №. LM1652, Австралийн электроникийн соронзон) 1.17 Tesla-г тусад нь орчуулах шатанд холбосон. Зураг авах явцад байрлалаа алсаас өөрчилнө үү. Рентген туяаны зураг авалт нь соронзыг дээжээс ойролцоогоор 30 мм-ийн өндөрт байрлуулах үед эхэлж, дүрсийг секундэд 4 фрэймийн хурдаар авдаг. Дүрслэх явцад соронзыг шилэн капилляр хоолойд ойртуулж, дараа нь хуруу шилний гуурсан хоолойн дагуух эффектийн хүчийг үнэлнэ.
Дээжийн xy орчуулгын үе шатанд шилэн хялгасан судсан дахь MP дээжийг агуулсан in vitro дүрслэлийн тохиргоо. Рентген туяаны замыг улаан тасархай шугамаар тэмдэглэсэн.
УИХ-ын гишүүдийн in vitro харагдах байдлыг тогтоосны дараа тэдгээрийн нэг хэсгийг зэрлэг төрлийн эм альбино Wistar харханд (~12 долоо хоногтой, ~200 гр) амьдаар нь туршсан. 0.24 мг/кг медетомидин (Домитор®, Зеноак, Япон), 3.2 мг/кг мидазолам (Дормикум®, Япон, Астеллас4/кг) (Vetorphale®, Meiji Seika) Хархыг Pharma-ийн холимогоор, Япон) хэвлийн хөндийд тарьж мэдээгүйжүүлсэн. Мэдээ алдуулсны дараа гуурсан хоолойн орчмын үслэг хэсгийг авч, гуурсан хоолойн (ET; 16 Ga ivmobilizing cannula, Terumpimmade a) суулгаж дүрслэлд бэлтгэсэн. биеийн температурыг хадгалах дулааны уут агуулсан хавтан 22 .Дараа нь зураг 2a-д үзүүлсэн шиг рентген зураг дээрх цагаан мөгөөрсөн хоолойг хэвтээ байдлаар зэрэгцүүлэхийн тулд дүрслэлийн хайрцган дахь дээжийн орчуулгын шатанд бага зэрэг өнцгөөр наасан.
(a) SPring-8 дүрсний хайрцагт байгаа in vivo дүрслэлийн тохиргоонд рентген туяаны замыг улаан тасархай шугамаар тэмдэглэсэн байна.(b,c) Гуурсан хоолой дээрх соронзыг локалчлалыг хоёр тэгш өнцөгт суурилуулсан IP камер ашиглан алсаас гүйцэтгэсэн. Дэлгэцийн зургийн зүүн талд толгойг барьж буй утасны гогцоо харагдах ба ET хоолой дотор байрлуулна.
100 мкл шилэн тариур ашиглан алсын удирдлагатай тариурын насосны системийг (UMP2, World Precision Instruments, Сарасота, FL) PE10 хоолойд (OD 0.61 мм, ID 0.28 мм) 30 Га-ийн зүүгээр холбосон. Хоолойг бичил биетэнд оруулахдаа үзүүр зөв байрлалд байгаа эсэхийг баталгаажуулахын тулд хоолойг тэмдэглэнэ үү. Хоолойн үзүүрийг хүргэх гэж буй МП дээжинд дүрж байх үед тариурын бүлүүрийг татан авав. Дараа нь ачаалагдсан дамжуулах хоолойг дотоод хоолойд хийж, үзүүрийг бидний хүлээгдэж буй хэрэглэж буй соронзон орны хамгийн хүчтэй хэсэгт байрлуулав. Зураг авах ажиллагааг манай Arduino-д холбогдсон амьсгалын мэдрэгч ашиглан удирдсан. нээх/хаах, зураг авах)-ийг Powerlab болон LabChart (AD Instruments, Сидней, Австрали) ашиглан бүртгэсэн 22. Дүрс авах үед Хаалтад нэвтрэх боломжгүй үед хоёр IP камер (Panasonic BB-SC382) бие биенээсээ ойролцоогоор 90°-ийн зайд байрлуулж, хөгшрөлтийн үед соронзон хальсны байрлалыг хянахад ашигласан. хөдөлгөөнт олдворууд, түрлэгийн төгсгөлийн өндөрлөгийн үеэр амьсгал бүрт нэг дүрсийг авсан.
Соронзыг хоёр дахь шатанд бэхэлсэн бөгөөд энэ нь дүрс зургийн орон сууцны гаднаас алсаас байрладаг. Соронзны янз бүрийн байрлал, тохиргоог туршсан бөгөөд үүнд: Гуурсан хоолойн дээр ойролцоогоор 30 ° өнцгөөр суурилуулсан (тохиргоог 2a, 3a-р зурагт үзүүлсэн); нэг соронз нь амьтны дээгүүр, нөгөө нь доор, шонгуудыг татахаар тохируулсан (Зураг 3б); нэг соронзыг амьтны дээгүүр, нөгөөг нь доош нь няцаах шонтой (Зураг 3в); ба гуурсан хоолойн дээр ба перпендикуляр нэг соронз (Зураг 3d). Амьтан ба соронзыг тохируулж, турших MP-ийг тариурын шахуургад ачаалсны дараа зураг авах явцдаа 50 мкл тунг 4 мкл/сек хурдтайгаар хийнэ. Дараа нь соронзыг зурган дээр нааш цааш хөдөлгөж, эсвэл хажуу тийш шилжүүлнэ.
In vivo дүрслэлд зориулсан соронзны тохиргоо (a) гуурсан хоолойн дээгүүр ойролцоогоор 30° өнцгөөр байрлах ганц соронз, (б) татах зориулалттай хоёр соронз, (в) няцаах хоёр соронз, (г) гуурсан хоолойн дээр болон перпендикуляр ганц соронз. баруун талаас гарсан. Соронз нь амьсгалын замын уртын дагуу эсвэл рентген туяаны чиглэлд гуурсан хоолойн дээгүүр зүүн ба баруун тийш хөдөлдөг.
Бид мөн амьсгалын замд байгаа тоосонцоруудын харагдах байдал, зан төлөвийг тодорхойлохыг эрэлхийлсэн, амьсгалын замын болон зүрхний хөдөлгөөнийг төөрөгдүүлэхгүй байх үед. Иймд дүрслэх хугацааны төгсгөлд пентобарбиталыг хэтрүүлэн хэрэглэсний улмаас амьтдыг хүнээр устгасан (Сомнопентил, Питман-Мур, Вашингтон Кроссинг, АНУ; нэг удаа амьсгаадалтад 65 мг/кг амьтдыг үлдээсэн). зүрхний цохилт зогссон, дүрслэх үйл явц давтагдаж, хэрэв амьсгалын замын гадаргуу дээр МП харагдахгүй бол MP-ийн нэмэлт тунг нэмнэ.
Олж авсан зургуудыг хавтгай ба харанхуй талбарт засч, дараа нь MATLAB (R2020a, The Mathworks) дээр бичсэн тусгай скрипт ашиглан кино болгон (секундэд 20 кадр; амьсгалын давтамжаас хамааран 15-25 × хэвийн хурд) цуглуулсан.
LV генийн вектор дамжуулах бүх судалгааг Аделаидын Их Сургуулийн Амьтны лабораторийн судалгааны төвд хийсэн бөгөөд соронзон орон байгаа үед LV-MP дамжуулалт нь in vivo генийн шилжилтийг сайжруулж чадах эсэхийг үнэлэхийн тулд SPring-8 туршилтын үр дүнг ашиглахыг зорьсон. МП ба соронзон орны нөлөөг үнэлэхийн тулд хоёр бүлэг амьтдыг эмчилсэн: нэг бүлэгт LV-ийн генийн векторын хяналтын бүлэг, нөгөө бүлэгт LV-MP-ийн хяналтын бүлэг, хүлээн авсан бусад LV-MP бүлэгт LV-MP-ийн хяналтын бүлэг өгсөн. соронзгүй.
LV генийн векторуудыг өмнө тайлбарласан аргуудыг ашиглан үүсгэсэн 25, 26 . LacZ вектор нь MPSV дэмжигч (LV-LacZ) -аар удирддаг цөмийн-локалчлагдсан бета-галактозидазын генийг илэрхийлдэг бөгөөд энэ нь хөрвүүлсэн эсүүдэд цэнхэр урвалын бүтээгдэхүүн үүсгэдэг, уушигны эдийн фронтод харагдах ба эсийн өсгөвөрийн хэсгүүдийг гар аргаар тоолох замаар гүйцэтгэсэн. Титрийг TU/ml-ээр тооцоолохын тулд гемоцитометр бүхий LacZ эерэг эсийг тээвэрлэгчийг -80 ° C-т крио-нэвчилтэнд хадгалж, хэрэглэхийн өмнө гэсгээж, CombiMag-д 1: 1 харьцаатай хольж, хүргэхээс өмнө дор хаяж 30 минутын турш мөсөн дээр өсгөвөрлөнө.
Ердийн Sprague Dawley харх (n = 3/бүлэг, ~2-3) 0.4 мг/кг медетомидин (Домитор, Илиум, Австрали) ба 60 мг/кг кетамин (Илиум, Австрали) холимогоор хэвлийн хөндийд мэдээ алдуулалт хийсэн) тарилга ба мэс заслын бус аргаар амны хөндийн гуурсан хоолойг баталгаажуулна. Амьсгалын замын эдэд LV дамжуулалтыг хүлээн авдаг бөгөөд бидний өмнө тайлбарласан механик цочролын протоколыг ашиглан гуурсан хоолойн гадаргууг утсан сагсаар тэнхлэгийн дагуу үрж (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) дараа нь LVT28 аюулгүй байдлын аргаар LVTracheal-ийн аюулгүй байдлыг хангасан. Цочролын дараа 10 минутын дараа.
Энэ туршилтанд ашигласан соронзон орон нь in vivo рентген зураглалын судалгаатай ижил төстэй байдлаар тохируулагдсан бөгөөд ижил соронзыг нэрэх стент хавчаар ашиглан гуурсан хоолойн дээр байрлуулсан (Зураг 4). 50 мкл (2 × 25 мкл) LV-MP-ийг цагаан мөгөөрсөн хоолойд (н = A3 μл хэмжээтэй) LV-MP-ийг өмнө нь тодорхойлсон хоолойд (n = A3-ийн хяналтын гель агуулсан) оруулав. бүлэг (n = 3 амьтан) соронзон ашиглахгүйгээр ижил LV-MPs хүлээн авсан. Судсаар хийж дууссаны дараа ET хоолойноос сувгийг салгаж, амьтныг гадагшлуулна. Соронзон 10 минутын турш байрандаа үлдэж, дараа нь түүнийг арилгана. Хархнууд мелоксикамын арьсан доорх тунг (1 мл/кг) авав. 1 мг/кг атимазол гидрохлорид (Антиседан, Зоетис, Австрали). Хархыг дулаацуулж, мэдээ алдуулалтаас бүрэн эдгэртэл нь ажиглав.
Биологийн аюулгүйн шүүгээнд LV-MP хүргэх төхөөрөмж. ET хоолойн цайвар саарал Luer зангилаа амнаас цухуйсан харагдах ба зурагт үзүүлсэн соруурын гель үзүүрийг ET хоолойгоор дамжуулан гуурсан хоолой руу хүссэн гүнд оруулж байна.
LV-MP тунг хийх процедурын дараа долоо хоногийн дараа амьтдыг 100% CO2-ээр амьсгалж, LacZ-ийн илрэлийг манай стандарт X-gal эмчилгээг ашиглан үнэлэв. Дотор хоолойн суулгацаас үүссэн механик гэмтэл, шингэнийг шинжилгээнд оруулаагүй байхын тулд гуурсан хоолойн хамгийн мөгөөрс бүхий гурван цагиргийг арилгасан. Гуурсан хоолой бүрийг уртын дагуу таслан, уртын дагуу хоёр судал үүсгэсэн. силикон резин агуулсан (Sylgard, Dow Inc) гэрлийн гадаргууг дүрслэхийн тулд Minutien зүү (Fine Science Tools) ашиглан. Хөрвүүлсэн эсийн тархалт, хэв маягийг Nikon микроскоп (SMZ1500) ашиглан DigiLite камер болон TCapture программ хангамж (Tucsen Photonics, accluinding the magicification) ашиглан урд талын зургаар баталгаажуулсан. гуурсан хоолойн өргөний хамгийн дээд тохиргоо), гуурсан хоолойн бүхэл бүтэн уртыг алхам алхмаар дүрсэлж, дүрс тус бүрийг хангалттай давхцуулж, дүрсийг "оёх" боломжтой болгоно. Дараа нь цагаан мөгөөрсөн хоолой бүрээс авсан зургуудыг Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) ашиглан нэг нийлмэл зураг болгон цуглуулсан. Амьтан бүрийн цагаан мөгөөрсөн хоолойн хэмжээг 0.35 < Өнгө < 0.58, Ханалт > 0.15, Утга < 0.7 гэсэн тохиргоог ашиглан өмнө тайлбарласны дагуу автоматжуулсан MATLAB скрипт (R2020a, MathWorks) ашиглан хэмжсэн. Эд эсийн контурыг мөшгих замаар GIMP2-ийн дарааллаар GIMP2-д зориулсан маскыг гараар үүсгэсэн. эд эсийн хэсгийг тодорхойлж, гуурсан хоолойн эдийн гаднаас ямар нэгэн хуурамч илрүүлэлтээс сэргийлнэ. Амьтан бүрээс авсан бүх нийлмэл зургийн будсан хэсгүүдийг нэгтгэн тухайн амьтны нийт будсан талбайг үүсгэсэн. Дараа нь будагдсан хэсгийг маскны нийт талбайд хувааж, хэвийн болгосон хэсгийг үүсгэв.
Гуурсан хоолой бүрийг парафинд шингээж, 5 μм зүсэлт хийсэн. Хэсэгүүдийг 5 минутын турш саармаг улаан өнгөөр ​​будаж, Nikon Eclipse E400 микроскоп, DS-Fi3 камер болон NIS элементийн бичлэгийн программ хангамж (хувилбар 5.20.00) ашиглан зургийг авсан.
Бүх статистик шинжилгээг GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) дээр хийсэн. Статистикийн ач холбогдлыг p ≤ 0.05 гэж тогтоосон. Хэвийн байдлыг Шапиро-Вилкийн тестээр шалгаж, LacZ будгийн ялгааг хосгүй t-тест ашиглан үнэлэв.
Хүснэгт 1-д тодорхойлсон зургаан МП-г PCXI ашиглан шалгаж үзэгдэх байдлыг Хүснэгт 2-т тайлбарлав. Хоёр полистирол MP (MP1 ба MP2; 18 μм ба 0.25 μм тус тус) PCXI-д харагдахгүй байсан ч үлдсэн дээжийг таних боломжтой (Жишээ нь MP45MP1-д үзүүлэв). Fe3O4; 0.25 μm ба 0.9 μm) бага зэрэг харагдаж байна. Туршилтанд орсон хамгийн жижиг тоосонцорыг агуулсан боловч MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) нь хамгийн тод харагдаж байсан. CombiMag бүтээгдэхүүн MP6 нь соронзон хальсыг илрүүлэхэд хэцүү байдаг. Капилляртай параллель. Соронзууд хялгасан судаснаасаа холдох үед бөөмс урт утаснууд болж сунасан боловч соронз ойртож, соронзон орны хүч нэмэгдэхийн хэрээр бөөмсүүд хялгасан судасны дээд гадаргуу руу шилжих үед бөөмийн утаснууд богиноссон (Нэмэлт видео S1: MP4-ийг үзнэ үү), гадаргуугаас соронзыг салгах үед бөөмийн хэмжээ нэмэгдэж байна. хялгасан судас, талбайн хүч буурч, парламентын гишүүд нь хялгасан судасны дээд гадаргуугаас урт утаснууд болж өөрчлөгддөг (Нэмэлт видео S2:MP4-ийг үзнэ үү). Соронзон хөдөлгөөн зогссоны дараа хэсгүүд тэнцвэрийн байрлалд хүрсний дараа хэсэг хугацааны дараа хөдөлсөөр байна. МП нь шилжилтийн явцад шингэний дээд гадаргуу руу болон түүнээс холдох үед капиллярын дээд гадаргуугаас соронзлогддог.
PCXI-ийн дагуу MP-ийн харагдах байдал нь дээжийн хооронд ихээхэн ялгаатай байна.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ба (г) MP6. Энд үзүүлсэн бүх зургийг капилляраас шууд 10 мм-ийн зайд байрлах соронзоор авсан. Илэрхий том тойрог нь хялгасан судсанд хавчуулагдсан агаарын бөмбөлгүүд бөгөөд энэ нь хамгийн хар, цагаан өнгийн хайрцгийн хар, цагаан өнгийн ирмэгийн ялгааг хамгийн тод харуулж байна. томруулалт.Бүх зураг дээрх соронзон схемийн диаметр нь масштабтай биш бөгөөд зурагт үзүүлсэнээс ойролцоогоор 100 дахин том болохыг анхаарна уу.
Соронзыг капиллярын дээд хэсгийн дагуу зүүн, баруун тийш хөрвүүлэх үед МП утаснуудын өнцөг нь соронзтой таарч өөрчлөгддөг (Зураг 6-г үз), ингэснээр соронзон орны шугамууд тодорхойлогдоно. MP3-5-ын хувьд хөвч нь босго өнцөгт хүрсний дараа бөөмс нь хялгасан судасны дээд гадаргуугийн дагуу чирэгддэг. Энэ нь ихэвчлэн соронзон орны том бүлэгт ойртдог. хамгийн хүчтэй (Нэмэлт видео S3:MP5-ыг үзнэ үү). Энэ нь ялангуяа капиллярын төгсгөлд ойртсон дүрслэл хийх үед тод илэрдэг бөгөөд энэ нь УИХ-ын гишүүдийг шингэн-агаарын интерфейс дээр нэгтгэж, төвлөрүүлэхэд хүргэдэг. MP3-5-аас ялгахад илүү хэцүү байсан MP6 дахь хэсгүүд нь соронзон хальсны дагуу хөдөлж, хялгасан судас доторх хэсгүүдийг салгахад чирэгдсэнгүй. (Нэмэлт видео S4: MP6-г үзнэ үү). Зарим тохиолдолд соронзон орныг дүрслэх газраас хол зайд хөдөлгөж хэрэглэсэн соронзон орныг багасгах үед үлдсэн парламентын гишүүд утсанд үлдэхийн зэрэгцээ таталцлын нөлөөгөөр хоолойн доод гадаргуу руу аажим доошилдог (Нэмэлт видео S5: MP3-ыг үзнэ үү).
Соронзыг капилляраас баруун тийш хөрвүүлэх үед MP утасны өнцөг өөрчлөгддөг.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 ба (г) MP6. Улаан хайрцагт тодосгогчийг нэмэгдүүлэх томруулдаг. Нэмэлт видеонууд нь бөөмийн чухал бүтэц, эдгээр статик зургуудад харагдахгүй динамик мэдээллийг илчлэх тул мэдээллийн чанартай гэдгийг анхаарна уу.
Соронзыг гуурсан хоолойн дагуу нааш цааш аажуухан хөдөлгөх нь in vivo нарийн төвөгтэй хөдөлгөөний хүрээнд MP-ийн дүрслэлийг хөнгөвчилдөг болохыг бидний туршилт харуулсан. Полистирол бөмбөлгүүдийг (MP1 ба MP2) хялгасан судсанд харагдахгүй байсан тул in vivo туршилтыг хийгээгүй. Үлдсэн дөрвөн МП тус бүрийг гуурсан хоолойн урт тэнхлэгээс дээш 0°-ийн урттай өнцөгт байрлуулсан соронзтойгоор in vivo туршсан. босоо (Зураг 2b, 3a-г харна уу), учир нь энэ нь MP гинжийг уртасгаж, соронзны тохиргоо дууссанаас илүү үр дүнтэй байсан. MP3, MP4, MP6 нь амьд амьтдын цагаан мөгөөрсөн хоолойд илрээгүй. Амьтдыг хүний ​​гараар устгасны дараа хархны амьсгалын замыг дүрслэн үзэхэд тоосонцор үл үзэгдэх хэвээр үлдэж, хамгийн их хэмжээний төмрийн агууламж нэмэгдэж, төмрийн агууламж өндөртэй байсан. зөвхөн харагдахуйц тоосонцор тул МП-ийн in vivo зан төлөвийг үнэлэх, тодорхойлоход ашигласан.
Гуурсан хоолойн дээр соронз байрлуулснаар олон хүн харааны талбарт төвлөрдөггүй ч бүгд биш. Гуурсан хоолойд орж буй тоосонцор нь хүний ​​тахил өргөсөн амьтдад хамгийн сайн ажиглагддаг.Зураг 7 ба нэмэлт видео S6: MP5 нь соронзон хальсны гадаргуу дээрх бөөмсийг хурдан соронзон барьж, тэгшилж байгааг харуулж байна. цагаан мөгөөрсөн хоолой.МП төрсний дараа гуурсан хоолойн дагуу илүү алслагдсан хэсгийг хайхад зарим парламентын гишүүд карина руу ойртож байгаа нь соронзон орны хүч нь шингэний процессын явцад соронзон орны хамгийн их хүчтэй бүсээр дамждаг тул бүх гишүүдийг цуглуулж, хадгалахад хангалтгүй байсан гэж үзэж байна.Гэсэн хэдий ч төрсний дараах үеийн МП-ын концентраци илүү өндөр байсан нь зурагт үзүүлсэн агаарын замын олон бүсэд хэрэглэж буй соронзон орны соронзон орон хэвээр байгааг харуулж байна. хамгийн өндөр байсан.
Саяхан устгасан хархны цагаан мөгөөрсөн хоолойд (a) болон (b)-ийн зургуудыг дүрсэлсэн талбайн дээр байрлуулсан соронзтой. Зурагт авсан хэсэг нь мөгөөрсний хоёр цагирагийн хооронд байрладаг. МП-ийг хүргэхээс өмнө амьсгалын замд тодорхой хэмжээний шингэн байдаг. Улаан хайрцагт тодосгогчийг нэмэгдүүлэх томруулалтыг агуулна. Эдгээр зургуудыг видео бичлэгийн 6-р хэсэгт үзүүлэв.
Гуурсан хоолойн дагуух соронзыг in vivo болгон хөрвүүлснээр МП гинж амьсгалын замын гадаргуу доторх өнцгийг хялгасан судсанд харагдахтай төстэй байдлаар өөрчлөхөд хүргэсэн (Зураг 8 ба Нэмэлт видео S7:MP5-ыг үзнэ үү). Гэвч бидний судалгаагаар парламентын гишүүдийг амьд амьсгалын замын гадаргуугийн дагуу хялгасан судастай адил чирэх боломжгүй байсан. Зарим тохиолдолд зүүн, баруун тийшээ баруун тийшээ хөдөлдөг. Соронзыг гуурсан хоолойн дагуу уртааш нь хөдөлгөхөд бөөмийн хэлхээ нь гадаргуугийн шингэний давхаргын гүнийг өөрчилдөг болохыг олж мэдсэн бөгөөд соронзыг шууд дээгүүр хөдөлгөж, бөөмийн утас босоо байрлалд эргүүлэхэд өргөсдөг (Нэмэлт видео S7-г үзнэ үү). : MP5 at 0:09, баруун доод хэсэг). Соронзыг гуурсан хоолойн дээд хэсэгт хажуу тийш (өөрөөр хэлбэл, гуурсан хоолойн уртын дагуу биш амьтны зүүн эсвэл баруун талд) хөрвүүлэх үед хөдөлгөөний онцлог шинж чанар өөрчлөгдсөн. Бөөмүүд хөдөлж байх үед тодорхой харагдаж байсан ч гуурсан хоолойноос соронзыг салгахад бөөмийн үзүүрүүд (видео үзэмж) болж хувирав. S8:MP5, 0:08-аас эхэлнэ). Энэ нь шилэн хялгасан судсанд хэрэглэсэн соронзон орны дор бидний ажигласан MP-ийн зан төлөвтэй нийцэж байна.
Амьд мэдээгүйжүүлсэн хархны цагаан мөгөөрсөн хоолойд MP5-ыг харуулсан жишээ зураг.(a) Соронзыг гуурсан хоолойн дээр болон зүүн талд, дараа нь (б) соронзыг баруун тийш шилжүүлсний дараа зураг авахад ашигладаг. Улаан хайрцагт тодосгогчийг нэмэгдүүлэх томруулдаг. Эдгээр зургууд нь нэмэлт видео S7:MP5-д үзүүлсэн видеоноос авсан болно.
Хоёр туйлыг гуурсан хоолойн дээгүүр болон доор хойд-өмнөд чиглүүлэн тохируулах үед (өөрөөр хэлбэл татах; Зураг. 3b) МП хөвчүүд урт гарч, гуурсан хоолойн нурууны гадаргуу дээр биш гуурсан хоолойн хажуугийн хананд байрласан байв (Нэмэлт видео S9:MP5-ыг үзнэ үү). Гэсэн хэдий ч мөгөөрсөн хоолойн гадарга дээр бөөмсийн өндөр концентраци илэрсэнгүй. хос соронзтой төхөөрөмж ашиглах үед шингэн нийлүүлсний дараа энэ нь ихэвчлэн нэг соронзтой төхөөрөмж ашиглах үед тохиолддог. Дараа нь нэг соронзыг туйлуудыг эргүүлэхээр тохируулсан үед (Зураг 3c) хүргэсний дараа харах талбарт харагдах бөөмсийн тоо нэмэгдэхгүй байсан. Хос соронзны тохиргооны аль алиныг нь тохируулах нь соронз эсвэл түлхэх хүч ихтэй тул соронзны хүч ихтэй тул хэцүү байдаг. Дараа нь тохиргоог амьсгалын замтай параллель, гэхдээ 90 градусын өнцгөөр амьсгалын замаар дамждаг нэг соронз болгон өөрчилсөн бөгөөд ингэснээр талбайн шугамууд гуурсан хоолойн ханыг ortogonaally гаталж байна (Зураг 3d), энэ чиглэл нь хажуугийн хананд бөөмийн бөөгнөрөл ажиглагдаж болох эсэхийг тодорхойлох зорилготой .Гэхдээ энэ тохиргоонд эдгээрийн бүх соронзон хөдөлгөөн эсвэл тодорхойлогдох хөдөлгөөн байхгүй. Нэг соронз, 30 градусын чиг баримжааны тохиргоог (Зураг 3a) in vivo генийн тээвэрлэгчийг судлах зорилгоор сонгосон.
Амьтныг хүнээр хөнөөсөн даруйд дахин дахин дүрсийг нь авах үед эд эсийг будилуулсан хөдөлгөөн байхгүй байсан нь соронзны хөрвүүлэх хөдөлгөөнтэй уялдуулан тунгалаг завсрын талбарт жижиг хэсгүүдийн нарийн, богино шугамыг ялгах боломжтой болсон. Гэсэн хэдий ч MP6 бөөмсийн оршихуй, хөдөлгөөнийг тодорхой харж чадахгүй байна.
LV-LacZ титр нь 1.8 × 108 TU/ml байсан бөгөөд CombiMag MP (MP6) -тай 1: 1 харьцаатай холилдсоны дараа амьтдад 50 мкл гуурсан хоолойн тунгаар 9 × 107 TU/ml LV тээврийн хэрэгсэл (өөрөөр хэлбэл 4.5 × 106 TU/харх) авсан. ).Эдгээр судалгаанд хөдөлмөрийн үед соронзыг хөрвүүлэхийн оронд соронзон орон байхгүй үед LV дамжуулалтыг (a) вектор дамжуулалттай харьцуулахад сайжруулж, (б) төвлөрч болох эсэхийг тодорхойлохын тулд соронзыг нэг байрлалд тогтоов.
Соронзон байгаа эсэх, CombiMag-ийг LV вектортой хослуулан хэрэглэх нь манай стандарт LV вектор дамжуулах протоколын адил амьтны эрүүл мэндэд сөрөг нөлөө үзүүлээгүй. Механик цочролд өртсөн гуурсан хоолойн урд талын зураг (Нэмэлт зураг 1) нь амьтдын бүлэгт LV-MP-тэй харьцах үед дамжуулалтын түвшин мэдэгдэхүйц өндөр байгааг харуулж байна. Хяналтын бүлэгт бага хэмжээний хөх өнгийн LacZ будалт илэрсэн (Зураг 9б). Х-Галаар будагдсан хэвийн талбайн хэмжээг тодорхойлоход соронзон орон байгаа нөхцөлд LV-MP-ийг хэрэглэснээр ойролцоогоор 6 дахин сайжирсныг харуулсан (Зураг 9c).
Жишээ нь гуурсан хоолойн дамжуулалтыг LV-MP (a) соронзон орон болон (б) соронзон байхгүй үед харуулсан нийлмэл зураг. (в) Соронзон ашиглах үед гуурсан хоолойн доторх хэвийн LacZ дамжуулалтын талбайн статистикийн ач холбогдолтой сайжруулалт (*p = 0.029, t-тест, бүлэг бүрт n = ± EM).
Төвийг сахисан хурдан улаан будсан хэсгүүдэд (нэмэлт зураг 2-т үзүүлсэн жишээ) өмнө мэдээлсэнтэй ижил төстэй загвар, байршилд байгаа LacZ-ээр будсан эсүүдийг харуулав.
Амьсгалын замын генийн эмчилгээний гол сорилт бол тээвэрлэгчийн тоосонцорыг сонирхож буй бүс нутгуудад үнэн зөв байршуулах, агаарын урсгал болон салстыг идэвхтэй цэвэрлэх үед хөдөлгөөнт уушгинд дамжуулалтын үр ашгийг өндөр түвшинд хүргэх явдал хэвээр байна. Амьсгалын замын амьсгалын замын өвчнийг эмчлэхэд зориулагдсан LV тээгчдийн хувьд тээвэрлэгчийн тоосонцорыг амьсгалын замын дотор байрлах хугацааг уртасгах нь чухал юм. Трансдукцийг сайжруулахын тулд соронзон орныг ашиглах нь энгийн, зардал багатай, хүргэх нутагшуулалт, үр ашгийг нэмэгдүүлэх, инкубацийн хугацааг богиносгож, тээвэрлэгчийн тун бага байх боломжтой тул электропораци гэх мэт ген дамжуулах бусад аргуудтай харьцуулахад давуу талтай юм. Амьсгалын замд генийн илэрхийлэлийн түвшинг нэмэгдүүлэхийн тулд энэ аргыг in vivo-д ашиглах боломж бодитойгоор нотлогдоогүй байна.
Бидний хийсэн in vitro синхротрон PCXI туршилтууд нь бидний ашигласан дүрслэлийн тохиргоонд полистирол МП-ээс бусад бүх бөөмс харагдаж байгааг харуулсан. Соронзон орон байгаа үед парламентын хэсгүүд нь бөөмийн төрөл болон соронзон орны хүчээс (өөрөөр хэлбэл, соронзон орны ойрын байдал, хөдөлгөөнтэй холбоотой) утас үүсгэдэг (зураг 10). бие даасан бөөмс бүр соронздож, өөрийн орон нутгийн соронзон орныг өдөөдөг. Эдгээр салангид талбарууд нь бусад ижил төстэй хэсгүүдийг нэгтгэж, холбоход хүргэдэг бөгөөд бусад бөөмсийн орон нутгийн татах, түлхэх хүчнээс үүдэлтэй орон нутгийн хүчний нөлөөгөөр бүлэг утас шиг хөдөлгөөн хийдэг.
Шингэнээр дүүрсэн хялгасан судас болон (c,d) агаараар дүүрсэн гуурсан хоолойн дотор үүссэн бөөмийн цувааг (a,b) бүдүүвчээр үзүүлэв. Капилляр болон гуурсан хоолой нь масштабаар татагддаггүйг анхаарна уу. (a) самбарт мөн утаснуудад байрлуулсан Fe3O4 тоосонцорыг агуулсан MP-ийн тайлбарыг агуулна.
Соронзыг хялгасан судас дээгүүр хөдөлгөхөд бөөмийн хэлхээний өнцөг Fe3O4 агуулсан MP3-5-ын хувьд эгзэгтэй босгонд хүрсэн бөгөөд үүний дараа бөөмийн утас анхны байрлалдаа байхаа больж, гадаргуугийн дагуу шинэ байрлал руу шилжсэн. соронзон. Шилэн хялгасан судасны гадаргуу нь энэ хөдөлгөөнийг явуулахад хангалттай гөлгөр байдаг тул ийм нөлөө гарч болзошгүй юм. Магадгүй бөөмс нь жижиг, өөр өөр бүрхүүлтэй эсвэл гадаргуугийн цэнэгтэй, эсвэл зөөвөрлөгч шингэн нь тэдний хөдлөх чадварт нөлөөлсөн байж магадгүй юм. CombiMag бөөмсийн дүрсний тодосгогч нь мөн сул байгаа нь шингэн болон бөөмс нь ижил нягттай тул бие бие рүүгээ амархан хөдөлдөггүйг харуулж байна. Соронзон хүч нь хэтэрхий хурдан хөдөлж чадахгүй бол бөөмсүүд нь соронзон орон үргэлж гацаж болзошгүй. Шингэн дэх хэсгүүдийн хоорондох үрэлтийг даван туулах нь соронзон орны хүч ба соронз ба зорилтот талбайн хоорондох зай маш чухал байдаг нь гайхах зүйл биш байж магадгүй юм. Эдгээр үр дүнг нэгтгэн авч үзвэл, соронзон нь зорилтот бүсээр урсаж буй олон парламентын гишүүнийг барьж чаддаг хэдий ч, соронзон хэсгүүдийн гадаргуугийн дагуу хөдөлгөхөд соронзонд найдаж болохгүй гэдгийг харуулж байна. in vivo LV-MP судалгаанд амьсгалын замын модны тодорхой хэсгийг физикийн хувьд чиглүүлэхийн тулд статик соронзон орныг ашиглах ёстой гэж дүгнэсэн.
Бие махбодид тоосонцор орж ирэхэд биеийн нарийн төвөгтэй хөдөлгөөнт эд эсийн нөхцөлд тэдгээрийг тодорхойлоход хэцүү байдаг ч гуурсан хоолойн дээрх соронзыг хэвтээ чиглэлд хөрвүүлэн МП-ийн утсыг "сэлбэх" замаар тэдгээрийг илрүүлэх чадварыг сайжруулсан. Хэдийгээр амьд дүрслэл хийх боломжтой ч амьтныг хүний ​​гараар устгасны дараа бөөмийн хөдөлгөөнийг ялгахад хялбар байдаг. талбайн хэсэг боловч зарим тоосонцор ихэвчлэн гуурсан хоолойн дагуу олддог. In vitro судалгаанаас ялгаатай нь тоосонцорыг соронзоор хөрвүүлэх замаар гуурсан хоолойн дагуу чирэх боломжгүй. Энэ дүгнэлт нь гуурсан хоолойн гадаргууг бүрхсэн салиа нь амьсгалсан тоосонцорыг хэрхэн боловсруулж, салст бүрхэвчинд барьж, улмаар салст бүрхэвчээр цэвэршдэгтэй нийцэж байна.
Гуурсан хоолойн дээр ба доор татах соронзыг ашиглах нь (Зураг 3б) нэг цэгт өндөр төвлөрч буй соронзон орон биш, харин илүү жигд соронзон орон үүсгэж, бөөмсийн жигд тархалтад хүргэж болзошгүй гэж бид таамагласан. Гэсэн хэдий ч бидний урьдчилсан судалгаагаар энэ таамаглалыг батлах тодорхой нотолгоог олж чадаагүй байна. 3c) зураг авсан хэсэгт илүү бөөмийн хуримтлал үүсгээгүй. Эдгээр хоёр дүгнэлт нь хос соронзтой тохируулга нь MP-ийн зорилтот орон нутгийн хяналтыг төдийлөн сайжруулдаггүй бөгөөд үүнээс үүдэн бий болох хүчтэй соронзон хүчийг тохируулахад хүндрэлтэй байгаа нь энэ аргыг практикт багатай болгодог болохыг харуулж байна. Үүний нэгэн адил соронзыг дээш болон гуурсан хоолойгоор чиглүүлэх нь (Зураг 3) Талбай.Эдгээр өөр тохиргоонуудын зарим нь тунадасны бүсэд соронзон орны хүч багасдаг тул амжилтгүй байж магадгүй.Тиймээс 30 градусын өнцөгт соронзны нэг тохиргоо (Зураг 3а) нь in vivo туршилтын хамгийн хялбар бөгөөд хамгийн үр дүнтэй арга гэж тооцогддог.
LV-MP судалгаагаар LV векторуудыг CombiMag-тай нэгтгэж, соронзон орны дэргэд физик цочролын дараа хүргэх үед трахей дахь дамжуулалтын түвшин хяналттай харьцуулахад мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн байна. Синхротрон дүрслэлийн судалгаа болон LacZ-ийн үр дүнд үндэслэн соронзон орон нь LV векторын гүн дэх тоосонцорыг тэр дор нь хадгалж, трахейны гүн дэх тоосонцорыг багасгаж чадсан нь илт харагдаж байна. Уушиг. Ийм зорилтот сайжруулалт нь дамжуулагдсан титр, зорилтот бус дамжуулалт, үрэвслийн болон дархлааны гаж нөлөө, генийн тээвэрлэгчийн зардлыг бууруулахын зэрэгцээ өндөр үр дүнтэй байдалд хүргэж болзошгүй юм. Үйлдвэрлэгчийн үзэж байгаагаар CombiMag-ийг ген дамжуулах бусад аргуудтай, түүний дотор вирусын бусад векторууд (цөмийн хүчил болон) зэрэгтэй хамт хэрэглэж болно.