Eskerrik asko Nature.com webgunea bisitatzeagatik. Erabiltzen ari zaren arakatzailearen bertsioak CSSrako laguntza mugatua du. Esperientzia onena lortzeko, arakatzaile eguneratua erabiltzea gomendatzen dizugu (edo Internet Explorer-en bateragarritasun modua desaktibatzea). Bitartean, laguntza jarraitua bermatzeko, gunea estilorik eta JavaScriptik gabe erakutsiko dugu.
Fibrosi kistikoaren biriketako gaixotasuna tratatzeko gene bektoreek eroapen-arnasbideak izan behar dituzte helburu, biriketako transdukzio periferikoak ez baitu onura terapeutikorik ematen. Birusen transdukzio-eraginkortasuna zuzenean lotuta dago bektoreen egoitza-denborarekin. Hala ere, gene-eramaileak bezalako banaketa-fluidoek naturalki sartzen dira albeoloetara inspirazioan zehar, eta edozein motatako partikula terapeutikoak azkar garbitzen dira garraio mukoziliarren bidez. Gene-eramaileen egoitza-denbora luzatzea garrantzitsua da, baina zaila da lortzea. Gene-eramaileekin konjugatutako partikula magnetikoek, arnasbideen gainazalera zuzendu daitezkeenak, eskualdeko helburuak hobetu ditzakete. In vivo bistaratzearen erronkengatik, ez da ondo ulertzen partikula magnetiko txiki horien portaera arnasbideen gainazalean aplikatutako eremu magnetiko baten aurrean. Ikerketa honen helburua sinkrotroi-irudiak erabiltzea izan zen arratoi anesteziatuen trakean partikula magnetikoen serie baten in vivo mugimendua bistaratzeko, in vivo partikula indibidualen eta partikulen portaeraren dinamika eta ereduak aztertzeko. Ondoren, eremu magnetiko baten aurrean partikula magnetiko lentibiralen banaketak arratoien trakean transdukzio-eraginkortasuna handituko lukeen ere ebaluatu genuen. Sinkrotroia X izpien bidezko irudiek partikula magnetikoen portaera agerian uzten dute eremu magnetiko geldikorretan eta mugikorretan in vitro eta in vivo. Partikulak ezin dira erraz arrastatu arnasbide bizidunen gainazalean zehar imanekin, baina garraioan zehar, gordailuak ikus-eremuan kontzentratzen dira, non eremu magnetikoa indartsuena den. Transdukzio-eraginkortasuna sei aldiz handitu zen lentibirusen partikula magnetikoak eremu magnetiko baten aurrean eman zirenean. Emaitza hauek guztiek iradokitzen dute lentibirusen partikula magnetikoak eta eremu magnetikoak balio handiko ikuspegiak izan daitezkeela gene-bektoreen norabidetzea hobetzeko eta transdukzio-mailak handitzeko arnasbide eroaleetan in vivo.
Fibrosi kistikoa (FK) CFTR (FK transmembranoaren konduktantzia-erreguladorea) izeneko gene bakar baten aldakuntzak eragiten du. CFTR proteina gorputzeko zelula epiteliale askotan dagoen ioi-kanal bat da, FK patogenesiaren gune nagusietako bat den eroapen-arnasbideetan barne. CFTR akatsek uraren garraio anormala eragiten dute, arnasbideen gainazala deshidratatuz eta arnasbideen gainazaleko likido (ASL) geruzaren sakonera murriztuz. Horrek garraio mukoziliar (MCT) sistemak arnastutako partikulak eta patogenoak arnasbideetatik kanporatzeko duen gaitasuna ere kaltetzen du. Gure helburua CFTR genearen kopia zuzena emateko eta ASL, MCT eta biriken osasuna hobetzeko lentibirus (LV) gene-terapia bat garatzea da, eta parametro horiek in vivo neurtzeko gai diren teknologia berriak garatzen jarraitzea1.
LV bektoreak FKren arnasbideetako gene-terapiarako hautagai nagusietako bat dira, batez ere gene terapeutikoa arnasbideetako zelula basaletan (arnasbideetako zelula amak) behin betiko integra dezaketelako. Garrantzitsua da hau, hidratazio normala eta mukiaren garbiketa berreskura ditzaketelako FKrekin lotutako arnasbideetako gainazaleko zelula funtzionaletan bereiziz, eta horrek bizitza osorako onurak ditu. LV bektoreak eroapen-arnasbidearen aurka zuzendu behar dira, hor hasten baita FKren biriketako gaixotasuna. Bektorea biriketan sakonago emateak albeoloen transdukzioa eragin dezake, baina horrek ez du onura terapeutikorik FKn. Hala ere, gene-eramaileak bezalako fluidoak naturalki migratzen dira albeoloetara, inspirazioan eman ondoren3,4, eta partikula terapeutikoak azkar garbitzen dira aho-barrunbean MCT bidez. LV transdukzio-eraginkortasuna zuzenean lotuta dago bektoreak zelulen ondoan irauten duen denborarekin, zelulen xurgapena ahalbidetzeko –“egoitza-denbora”5–, eta hori erraz murrizten da eskualdeko aire-fluxu tipikoarekin, baita partikula-mukiaren harrapaketa koordinatuarekin eta MCTrekin ere. FKn, LVren egoitza-denbora arnasbideetan luzatzeko gaitasuna garrantzitsua da eskualde honetan transdukzio-maila altuak lortzeko, baina orain arte erronka bat izan da.
Oztopo hau gainditzeko, iradokitzen dugu LV partikula magnetikoek (MP) bi modu osagarritan lagun dezaketela. Lehenik eta behin, magnetikoki gidatu daitezke arnasbideen gainazalera bideratzea hobetzeko eta gene-garraiatzaile partikulak nahi den arnasbideen eskualdean egoten laguntzeko; eta ASL) 6. zelula geruzara mugitzen. MP-ak asko erabili dira sendagaiak emateko ibilgailu gisa, antigorputzetara, kimioterapia-drogara edo zelula-mintzei itsasten zaizkien beste molekula txiki batzuetara lotzen direnean edo zelula-gainazaleko hartzaile garrantzitsuei lotzen zaizkienean eta tumore-guneetan pilatzen direnean elektrizitate estatikoaren aurrean. Minbiziaren Tratamendurako Eremu Magnetikoak 7. Beste teknika "hipertermal" batzuek MPak berotzea dute helburu eremu magnetiko oszilagarrien eraginpean daudenean, eta horrela tumore-zelulak suntsitzen dituzte. Transfekzio magnetikoaren printzipioa, non eremu magnetiko bat transfekzio-agente gisa erabiltzen den DNAren transferentzia hobetzeko zeluletara, in vitro erabiltzen da ohikoa transdukzio zailak diren zelula-lerroetarako gene-bektore ez-biral eta biral sorta bat erabiliz. LV magnetotransfekzioaren eraginkortasuna frogatu da, LV-MPak in vitro gizakien bronkio-epitelioko zelula-lerro batera emanez eremu magnetiko estatiko baten aurrean, transdukzio-eraginkortasuna 186 aldiz handituz LV bektorearekin bakarrik alderatuta. LV-MPa in vitro CF eredu batean ere aplikatu da, non transfekzio magnetikoak LV transdukzioa 20 aldiz handitu zuen aire-likido interfazearen kulturetan CF karkaxa aurrean10. Hala ere, organoen in vivo magnetotransfekzioak arreta gutxi jaso du eta animalia-ikerketa gutxitan ebaluatu da11,12,13,14,15, batez ere... birikak16,17. Hala ere, transfekzio magnetikoaren aukerak argiak dira FK biriketako terapian. Tan et al.-ek (2020) adierazi zuten "nanopartikula magnetikoen bidezko biriketako administrazio eraginkorraren kontzeptu-proba azterketa batek bidea zabalduko duela etorkizuneko CFTR inhalazio estrategietarako, FK gaixoen emaitza klinikoak hobetzeko"6.
Aplikatutako eremu magnetiko baten aurrean aire-bideen gainazaletan partikula magnetiko txikien portaera zaila da bistaratzea eta aztertzea, eta, beraz, gaizki ulertzen da. Beste ikerketa batzuetan, sinkrotroi-hedapenean oinarritutako fase-kontraste X izpien irudigintza (PB-PCXI) metodo bat garatu genuen ASL sakoneran18 eta MCT portaeran19,20 in vivo aldaketa txikiak modu ez-inbaditzailean bistaratzeko eta kuantifikatzeko, gas-kanalaren gainazalaren hidratazioa zuzenean neurtzeko eta tratamenduaren eraginkortasunaren adierazle goiztiar gisa erabiltzeko. Horrez gain, gure MCT ebaluazio-metodoak 10-35 µm-ko diametroko partikulak erabiltzen ditu aluminaz edo errefrakzio-indize handiko beiraz osatutako MCT markatzaile gisa, PB-PCXI erabiliz ikusgai daudenak21. Bi teknikak egokiak dira hainbat partikula mota bistaratzeko, MP barne.
Bere bereizmen espazial eta tenporal handiari esker, gure PB-PCXI oinarritutako ASL eta MCT analisi teknikak oso egokiak dira in vivo partikula bakarreko eta partikula masiboen portaeraren dinamika eta ereduak aztertzeko, MP geneen administrazio teknikak ulertzen eta optimizatzen laguntzeko. Hemen erabiltzen dugun ikuspegia SPring-8 BL20B2 habe-lerroa erabiliz egindako ikerketetatik dator, non fluidoen mugimendua bistaratu genuen saguen sudur eta biriketako arnasbideetan bektore dosi faltsuaren administrazioaren ondoren, gure gene eramaile dosi animalien ikerketetan behatutako geneen adierazpen eredu ez-uniformeak azaltzen laguntzeko 3,4.
Ikerketa honen helburua PB-PCXI sinkrotroia erabiltzea izan zen arratoi bizidunen trakean MP serie baten in vivo mugimenduak bistaratzeko. PB-PCXI irudi-azterketa hauek MP sorta bat, eremu magnetikoen intentsitatea eta kokapenak probatzeko diseinatu ziren, MP mugimenduan duten eragina zehazteko. Hipotesia egin genuen kanpotik aplikatutako eremu magnetiko batek emandako MP-ari helburu-eremuan mantentzen edo mugitzen lagunduko ziola. Azterketa hauek, gainera, trakean metatu ondoren atxikitako partikula kopurua maximizatzen duten iman-konfigurazioak identifikatzeko aukera eman ziguten. Bigarren ikerketa-serie batean, konfigurazio optimo hau erabili nahi izan genuen arratoien arnasbideetara LV-MP-ak in vivo ematearen ondoriozko transdukzio-eredua erakusteko, arnasbideen helburuak lortzeko testuinguruan LV-MP-ak emateak LV transdukzio-eraginkortasuna hobetuko lukeela suposatuz.
Animaliekin egindako ikerketa guztiak Adelaidako Unibertsitateak (M-2019-060 eta M-2020-022) eta SPring-8 Sinkrotroi Animalien Etika Batzordeak onartutako protokoloen arabera egin ziren. Esperimentuak ARRIVE jarraibideen arabera egin ziren.
X izpien irudi guztiak Japoniako SPring-8 sinkrotroian dagoen BL20XU izpi-lerroan egin ziren, aurretik deskribatutakoaren antzeko konfigurazio bat erabiliz21,22. Laburbilduz, kutxa esperimentala sinkrotroiaren biltegiratze-eraztunetik 245 m-ra zegoen. Laginaren eta detektagailuaren arteko distantzia 0,6 m-koa erabiltzen da partikulen irudi-azterketetarako eta 0,3 m-koa in vivo irudi-azterketetarako, fase-kontraste efektuak sortzeko. 25 keV-ko energia monokromatikoa erabili zen. Irudiak bereizmen handiko X izpien bihurgailu bat (SPring-8 BM3) erabiliz hartu ziren, sCMOS detektagailu bati akoplatuta. Bihurgailuak X izpiak argi ikusgai bihurtzen ditu 10 µm-ko lodierako zintilagailu bat (Gd3Al2Ga3O12) erabiliz, eta ondoren sCMOS sentsore batera zuzentzen da × 10 mikroskopio objektibo bat (NA 0.3) erabiliz. sCMOS detektagailua Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japonia) izan zen, matrizearen tamainarekin... 2048 × 2048 pixel eta 6,5 ​​× 6,5 µm-ko pixel gordinaren tamaina. Konfigurazio honek 0,51 µm-ko pixel isotropiko eraginkor baten tamaina eta gutxi gorabehera 1,1 mm × 1,1 mm-ko ikus-eremua ematen ditu. 100 ms-ko esposizio-luzera aukeratu zen arnasbidearen barruko eta kanpoko partikula magnetikoen seinale-zarata erlazioa maximizatzeko, arnasketak eragindako mugimendu-artefaktuak minimizatzeko. In vivo ikerketetarako, X izpien obturadore azkar bat jarri zen X izpien bidean erradiazio-dosia mugatzeko, X izpien izpia esposizioen artean blokeatuz.
LV garraiatzailea ez zen SPring-8 PB-PCXI irudi-azterketetan erabili, BL20XU irudi-ganberak ez duelako 2. Biosegurtasun Mailako ziurtagiririk. Horren ordez, bi hornitzaile komertzialengandik ondo karakterizatutako MP sorta bat hautatu genuen —tamaina, material, burdin kontzentrazio eta aplikazio sorta bat hartzen dutenak—, lehenik eremu magnetikoek beirazko kapilarretan MP mugimenduan nola eragiten duten ulertzeko, eta gero arnasbide bizidunetan. gainazalean.MP-ek 0,25 eta 18 μm arteko tamaina dute eta hainbat materialez eginda daude (ikus 1. taula), baina lagin bakoitzaren osaera, MP-aren barruko partikula magnetikoen tamaina barne, ezezaguna da.Gure MCT ikerketa zabaletan oinarrituta 19, 20, 21, 23, 24, 5 μm-ko MP-ak trakeako arnasbidearen gainazalean ikus daitezkeela espero dugu, adibidez, MP-aren mugimenduaren ikusgarritasun hobea ikusteko fotograma jarraiak kenduz.0,25 μm-ko tamainako MP bakarra irudi-gailuaren bereizmena baino txikiagoa da, baina PB-PCXI-k haien bolumen-kontrastea eta metatu ondoren metatzen diren gainazaleko fluidoaren mugimendua detektatzea espero da.
1. taulan agertzen diren MP bakoitzerako laginak 20 μl-ko beirazko kapilarretan prestatu ziren (Drummond Microcaps, PA, AEB), 0,63 mm-ko barne-diametroarekin. Korpuskular partikulak uretan daude eskuragarri, eta CombiMag partikulak fabrikatzailearen fluido propioan. Hodi bakoitza erdizka betetzen da likidoz (gutxi gorabehera 11 μl) eta lagin-euskarrian jartzen da (ikus 1. irudia). Beirazko kapilarrak horizontalki jarri ziren irudi-kutxako lagin-plataforman, hurrenez hurren, eta fluidoaren ertzetan kokatu ziren. 19 mm-ko diametroko (28 mm luzeko) nikel-oskola lur arraroen neodimio burdin boro (NdFeB) iman bat (N35, LM1652 kat. zk., Jaycar Electronics, Australia), 1,17 Tesla-ko hondar-magnetizazioarekin, translazio-plataforma bereizi batera lotu zen, irudiak hartzen diren bitartean bere posizioa urrunetik aldatzeko. X izpien irudien eskuratzea imanak laginaren gainetik 30 mm inguru kokatzen direnean hasten da, eta irudiak segundoko 4 fotogramako abiaduran lortzen dira. Irudiak hartzen diren bitartean, imanak... beirazko kapilar hodiaren ondoan (1 mm ingurura) eta gero hodiaren zehar mugitu eremu-indarraren eta posizioaren efektuak ebaluatzeko.
In vitro irudigintza konfigurazioa, laginaren xy translazio-etaparen beirazko kapilarretan MP laginak dituena. X izpien izpien bidea marra gorri eten batekin markatuta dago.
MP-en in vitro ikusgarritasuna ezarri ondoren, azpimultzo bat in vivo probatu zen Wistar arratoi albino eme basatietan (~12 aste, ~200 g). 0,24 mg/kg medetomidina (Domitor®, Zenoaq, Japonia), 3,2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japonia) eta 4 mg/kg butorfanol (Vetorphale®, Meiji Seika). Arratoiak (Pharma, Japonia) nahasketa batekin anestesiatu ziren intraperitonealki injekzio bidez. Anestesiaren ondoren, irudiak hartzeko prestatu ziren trakearen inguruko ilea kenduz, hodi endotrakeal bat (ET; 16 Ga iv kanula, Terumo BCT) sartuz eta gorputzaren tenperatura mantentzeko poltsa termiko bat zuen irudi-plaka pertsonalizatu batean etzanda immobilizatuz. Ondoren, irudi-plaka irudi-kutxako laginaren translazio-etaparekin lotu zen angelu txiki batean, trakea horizontalki X izpien irudian lerrokatzeko, irudian ikusten den bezala. 2a.
(a) SPring-8 irudi-kutxan in vivo irudien konfigurazioan, X izpien izpiaren bidea marra gorri eten batekin markatuta dago. (b,c) Imanaren lokalizazioa trakean urrunetik egin zen ortogonalki muntatutako bi IP kamera erabiliz. Pantailaren irudiaren ezkerreko aldean, burua eusten duen alanbre-begizta ikus daiteke, eta banaketa-kanula ET hodiaren barruan.
Urrutiko aginte bidezko xiringa-ponpa sistema bat (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL), 100 μl-ko beirazko xiringa bat erabiliz, PE10 hodi batera (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) konektatu zen 30 Ga-ko orratz baten bidez. Markatu hodia punta trakean posizio egokian dagoela ziurtatzeko ET hodia sartzerakoan. Mikroponpa erabiliz, xiringaren enboloa atera zen hodiaren punta MP laginaren barruan murgilduta zegoen bitartean. Kargatutako entrega-hodia endotrakeal hodian sartu zen, punta aplikatutako eremu magnetikoaren zatirik indartsuenean jarriz. Irudien eskurapena gure Arduino oinarritutako denbora-kutxara konektatutako arnasketa-detektagailu bat erabiliz kontrolatu zen, eta seinale guztiak (adibidez, tenperatura, arnasketa, obturadorea ireki/itxi eta irudien eskurapena) Powerlab eta LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) erabiliz grabatu ziren 22. Irudiak hartzerakoan, itxitura eskuraezina zenean, bi IP kamera (Panasonic BB-SC382) elkarrengandik 90° ingurura kokatu ziren eta imanaren posizioa kontrolatzeko erabili ziren. trakeara irudigintzan zehar (2b eta 2c irudiak). Mugimendu-artefaktuak minimizatzeko, arnasketa bakoitzeko irudi bat eskuratu zen itsasgora amaierako fluxu-lautadan zehar.
Iman bat bigarren etapa bati lotuta dago, irudi-etxebizitzaren kanpoaldetik urrun koka daitekeena. Imanaren hainbat posizio eta konfigurazio probatu ziren, besteak beste: trakearen gainetik 30° inguruko angeluan muntatuta (2a eta 3a irudietan erakusten diren konfigurazioak); iman bat animaliaren gainean eta bestea behean, poloak erakartzeko konfiguratuta (3b irudia); iman bat animaliaren gainean eta bestea behean, poloak uxatzeko konfiguratuta (3c irudia); eta iman bat trakearen gainean eta perpendikularrean (3d irudia). Animalia eta imanak konfiguratu ondoren eta probatu beharreko MP xiringa-ponpan kargatu ondoren, eman 50 μl-ko dosia 4 μl/seg-ko abiaduran irudiak lortzen diren bitartean. Ondoren, imanak aurrera eta atzera mugitzen dira trakearen zehar edo alboetan zehar irudiak lortzen jarraitzen duten bitartean.
In vivo irudiak egiteko imanaren konfigurazioa (a) iman bakarra trakearen gainean 30° inguruko angeluan, (b) erakartzeko konfiguratutako bi iman, (c) uxatzeko konfiguratutako bi iman, (d) iman bakarra trakearen gainean eta perpendikularrean. Behatzaileak ahotik behera begiratu zuen biriketara trakearen bidez, eta X izpien izpia arratoiaren ezkerreko aldetik igaro eta eskuineko aldetik irten zen. Imana arnasbidearen luzeran zehar mugitzen da edo trakearen gainetik ezkerrera eta eskuinera X izpien izpiaren norabidean.
Arnasketa eta bihotz-mugimendu nahasgarririk ezean, arnasbideetan partikulen ikusgarritasuna eta portaera zehaztea ere bilatu genuen. Beraz, irudi-aldiaren amaieran, animaliak modu humanitarioan hil ziren pentobarbital gaindosiagatik (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, AEB; ~65 mg/kg ip). Animalia batzuk irudi-plataforman utzi ziren, eta arnasketa eta bihotz-taupadak gelditu ondoren, irudi-prozesua errepikatu zen, MP dosi gehigarri bat gehituz arnasbideen gainazalean MPrik ikusten ez bazen.
Eskuratutako irudiak eremu lauan eta eremu ilunean zuzendu ziren eta ondoren film batean muntatu ziren (20 fotograma segundoko; 15-25 × abiadura normala, arnasketa-maiztasunaren arabera), MATLABen idatzitako script pertsonalizatu bat erabiliz (R2020a, The Mathworks).
LV gene bektoreen administrazio-azterketa guztiak Adelaida Unibertsitateko Laborategiko Animalien Ikerketa Instalazioan egin ziren, eta SPring-8 esperimentuaren emaitzak erabiltzea zuten helburu, eremu magnetiko baten aurrean LV-MP administrazioak in vivo geneen transferentzia hobetu zezakeen ebaluatzeko. MP-ren eta eremu magnetikoaren efektuak ebaluatzeko, bi animalia talde tratatu ziren: talde bati LV-MP eman zitzaion iman bat jarrita, eta beste taldeak kontrol-talde bat jaso zuen imanik gabeko LV-MPrekin.
LV gene bektoreak aurretik deskribatutako metodoak erabiliz sortu ziren 25, 26. LacZ bektoreak MPSV sustatzaile konstitutiboak (LV-LacZ) bultzatutako beta-galaktosidasa gene lokalizatua adierazten du, eta honek erreakzio-produktu urdin bat sortzen du transduzitutako zeluletan, biriketako ehunen aurrealdeetan eta ehunen ataletan ikusgai. Zelula-kulturetan titrazioa egin zen LacZ zelula positiboen kopurua eskuz zenbatuz hemozitometro batekin, titrazioa TU/ml-tan kalkulatzeko. Eramaileak -80 °C-tan kriokontserbatu ziren, erabili aurretik desizoztu eta CombiMag-era lotu ziren 1:1 proportzioan nahastuz eta izotzean inkubatuz gutxienez 30 minutuz entregatu aurretik.
Sprague Dawley arratoi normalak (n = 3/taldea, ~2-3 intraperitonealki anesteziatu ziren 0,4 mg/kg medetomidina (Domitor, Ilium, Australia) eta 60 mg/kg ketamina (Ilium, Australia) nahasketa batekin (hilabetekoak) ip) injekzio eta ahoko kanulazio ez-kirurgikoarekin 16 Ga-ko iv kanula batekin. Trakeako aire-bideetako ehunak LV transdukzioa jasotzen duela ziurtatzeko, aurretik deskribatutako perturbazio mekanikoaren protokoloa erabiliz baldintzatu zen, non trakeako aire-bideetako gainazala axialki igurtzi zen alanbrezko saski batekin (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, AEB) 30 s28. LV-MP-ren trakeako administrazioa segurtasun biologikoko kabina batean egin zen perturbazioaren ondorengo 10 minutu inguru.
Esperimentu honetan erabilitako eremu magnetikoa in vivo X izpien irudigintzako ikerketaren antzera konfiguratu zen, iman berdinak trakearen gainean eutsiz destilazio-stent klipak erabiliz (4. irudia). LV-MP-ren 50 μl-ko bolumen bat (2 × 25 μl-ko alikuotak) trakeara eraman zen (n = 3 animalia) gel-punta zuen pipeta bat erabiliz, aurretik deskribatu bezala. Kontrol-talde batek (n = 3 animalia) LV-MP berdinak jaso zituen imanik erabili gabe. Infusioa amaitutakoan, kanula ET hoditik ateratzen da eta animalia estutu egiten da. Imana 10 minutuz geratzen da bere lekuan, eta gero kentzen da. Arratoiek meloxicam (1 ml/kg) dosi azalpekoa jaso zuten (Ilium, Australia), eta ondoren anestesia alderantzikatu zen 1 mg/kg atipamazol hidrokloruro ip injekzio bidez (Antisedan, Zoetis, Australia). Arratoiak bero mantendu eta anestesiatik guztiz sendatu arte kontrolatu ziren.
LV-MP emateko gailua segurtasun biologikoko kabina batean. ET hodiaren Luer ardatz gris argia ahotik irteten ikus daiteke eta irudian agertzen den pipetaren gel punta ET hoditik sartzen da trakean nahi den sakonerara arte.
LV-MP dosifikazio prozeduraren ondorengo astebetean, animaliak modu humanitarioan hil ziren % 100eko CO2 arnastuz, eta LacZ espresioa gure X-gal tratamendu estandarra erabiliz ebaluatu zen. Hiru eraztun kartilaginotsuenak kendu ziren, endotrakeako hodiaren kokapenetik eratorritako kalte mekanikorik edo fluidoen atxikipenik ez zedin analisian sartu ziurtatzeko. Trakea bakoitza luzetara moztu zen bi erdi sortzeko analisietarako, eta silikonazko kautxua zuen plater batean muntatu ziren (Sylgard, Dow Inc), Minutien orratz bat (Fine Science Tools) erabiliz, gainazal luminala bistaratzeko. Transduzitutako zelulen banaketa eta eredua argazki frontalen bidez baieztatu ziren, Nikon mikroskopio bat (SMZ1500) erabiliz, DigiLite kamera batekin eta TCapture softwarearekin (Tucsen Photonics, Txina). Irudiak 20x handitzean eskuratu ziren (trakearen zabalera osoko ezarpen handiena barne), trakearen luzera osoa pausoz pauso irudikatuz, irudi bakoitzaren arteko gainjartze nahikoa bermatuz irudiak "josteko" aukera emateko. Ondoren, trakea bakoitzeko irudiak muntatu ziren. Irudi konposatu bakarrean Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) erabiliz, mugimendu planar algoritmo bat erabiliz. Animalia bakoitzaren trakearen irudi konposatuetan LacZ espresio eremuak MATLAB script automatizatu bat (R2020a, MathWorks) erabiliz kuantifikatu ziren, aurretik deskribatu bezala, 0,35 < Tonua < 0,58, Saturazioa > 0,15 eta Balioa < 0,7 ezarpenak erabiliz. Ehunaren konturak trazatuz, eskuz maskara bat sortu zen GIMP v2.10.24-n irudi konposatu bakoitzerako, ehunaren eremua identifikatzeko eta trakeako ehunaren kanpoaldeko detekzio faltsuak saihesteko. Animalia bakoitzaren irudi konposatu guztietako eremu tindatuak batu ziren animalia horren eremu tindatu osoa sortzeko. Ondoren, eremu tindatua maskararen azalera osoarekin zatitu zen eremu normalizatua sortzeko.
Trakea bakoitza parafinan txertatu zen eta 5 μm-ko sekzioak moztu ziren. Sekzioak gorri neutro azkarrarekin kontra-tindu ziren 5 minutuz eta irudiak Nikon Eclipse E400 mikroskopio bat, DS-Fi3 kamera eta NIS elementuen harrapaketa softwarea (5.20.00 bertsioa) erabiliz eskuratu ziren.
Analisi estatistiko guztiak GraphPad Prism v9-n (GraphPad Software, Inc.) egin ziren. Garrantzi estatistikoa p ≤ 0,05ean ezarri zen. Normaltasuna Shapiro-Wilk testa erabiliz egiaztatu zen, eta LacZ tindaketaren desberdintasunak t-test parekatu gabea erabiliz ebaluatu ziren.
1. taulan deskribatutako sei MP-ak PCXI erabiliz aztertu ziren, eta ikusgarritasuna 2. taulan deskribatzen da. Bi poliestirenozko MP (MP1 eta MP2; 18 μm eta 0,25 μm, hurrenez hurren) ez ziren ikusten PCXI-pean, baina gainerako laginak identifikagarriak ziren (adibideak 5. irudian erakusten dira). MP3 eta MP4 (% 10-15 Fe3O4; 0,25 μm eta 0,9 μm, hurrenez hurren) ahulki ikusten dira. Probatutako partikula txikienetako batzuk baditu ere, MP5 (% 98 Fe3O4; 0,25 μm) izan zen nabarmenena. CombiMag produktua den MP6 zaila da ikusten. Kasu guztietan, MP detektatzeko dugun gaitasuna nabarmen hobetu zen imanak kapilarrearekiko paraleloan aurrera eta atzera mugituz. Imanak kapilarretik urrundu zirenean, partikulak kate luzeetan luzatu ziren, baina imanak hurbildu eta eremu magnetikoaren indarra handitu ahala, partikula-kateak laburtu egin ziren partikulak kapilarraren goiko gainazalera migratzen ziren heinean (ikus bideo osagarria). S1: MP4), gainazaleko partikulen dentsitatea handituz. Alderantziz, imanak kapilarretik kentzen direnean, eremu-indarra gutxitzen da eta MP-ak kapilarraren goiko gainazaletik hedatzen diren kate luzeetan berrantolatzen dira (ikus S2:MP4 bideo osagarria). Imanak mugitzeari uzten dionean, partikulak mugitzen jarraitzen dute denbora labur batez oreka-posiziora iritsi ondoren. MP-a kapilarraren goiko gainazalera hurbildu eta urrundu ahala, partikula magnetikoek hondakinak fluidoan zehar arrastaka eramaten dituzte normalean.
PCXI pean MP-ren ikusgarritasuna nabarmen aldatzen da laginen artean.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 eta (d) MP6. Hemen erakusten diren irudi guztiak kapilarraren gainetik 10 mm ingurura kokatutako iman batekin atera ziren. Itxurazko zirkulu handiak kapilarretan harrapatutako aire burbuilak dira, fase-kontrastearen irudien ertz zuri-beltzeko ezaugarriak argi erakusten dituztenak. Kutxa gorriak kontraste-hobekuntza handitzea dauka. Kontuan izan irudi guztietako iman-eskemen diametroak ez daudela eskalan eta erakusten dena baino 100 aldiz handiagoak direla gutxi gorabehera.
Imanak kapilarraren goialdean ezker-eskuin mugitzen diren heinean, MP katearen angelua aldatzen da imanarekin lerrokatzeko (ikus 6. irudia), eta horrela eremu magnetikoaren lerroak markatuz. MP3-5 kasuan, kordak atalase-angelu batera iritsi ondoren, partikulak kapilarraren goiko gainazalean zehar arrastaka eramaten dira. Horrek askotan MPak talde handiagoetan biltzen ditu eremu magnetikoa indartsuena den tokitik gertu (ikus S3:MP5 bideo osagarria). Hau bereziki agerikoa da kapilar muturretik gertu irudiak ateratzean, eta horrek MPak fluido-aire interfazean elkartu eta kontzentratzea eragiten du. MP6-ko partikulak, MP3-5 baino zailagoak zirenak hautemateko, ez ziren arrastaka eramaten imanak kapilarrean zehar mugitzen zen heinean, baina MP kateak disoziatu egin ziren, partikulak ikus-eremuan utziz (ikus S4:MP6 bideo osagarria). Kasu batzuetan, aplikatutako eremu magnetikoa murriztu zenean imanak irudi-kokapenetik distantzia handira mugituz, geratzen ziren MPak poliki-poliki jaisten ziren hodiaren beheko gainazalera grabitatearen bidez, katean geratzen ziren bitartean (ikus S5:MP3 bideo osagarria).
MP katearen angelua aldatu egiten da imanak kapilarraren gainetik eskuinera mugitzen den heinean. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 eta (d) MP6. Kutxa gorriak kontrastea hobetzeko handitzea dauka. Kontuan izan bideo osagarriak informatiboak direla, irudi estatiko hauetan bistaratu ezin diren partikulen egitura eta informazio dinamiko garrantzitsua erakusten baitute.
Gure probek erakutsi zuten imanak trakean poliki-poliki aurrera eta atzera mugitzeak MPren bistaratzea errazten duela in vivo mugimendu konplexuen testuinguruan. In vivo probak ez ziren egin, poliestirenozko aleak (MP1 eta MP2) ez baitziren ikusten kapilarrean. Gainerako lau MP bakoitza in vivo probatu zen, imanaren ardatz luzea trakearen gainean konfiguratuta, bertikalarekiko 30° inguruko angeluan (ikus 2b eta 3a irudiak), horrek MP kate luzeagoak eragin baitzituen eta imanaren konfigurazioa amaituta baino eraginkorragoa baitzen. MP3, MP4 eta MP6 ez ziren detektatu animalia bizidunen trakean. Animaliak modu humanitarioan hil ondoren arratoien arnasbideak irudikatu zirenean, partikulak ikusezin mantendu ziren xiringa-ponpa bat erabiliz bolumen gehigarria gehitu arren. MP5-ak burdin oxido eduki handiena zuen eta partikula ikusgai bakarra zen, eta, beraz, MPren in vivo portaera ebaluatu eta karakterizatzeko erabili zen.
MP eman bitartean imanak trakearen gainean jartzeak MP asko, baina ez guztiak, ikus-eremuan kontzentratzea eragin zuen. Trakeara sartzen diren partikulak hobekien ikusten dira modu humanitarioan sakrifikatutako animalietan. 7. irudia eta S6 bideo osagarria: MP5-ak partikulen harrapaketa magnetiko azkarra eta lerrokatze-prozesua trakea bentralaren gainazalean erakusten du, eta horrek adierazten du MP-ak trakearen nahi diren eskualdeetara zuzendu daitezkeela. MP eman ondoren trakean zehar distalkiago bilatzean, MP batzuk karinatik gertuago aurkitu ziren, eta horrek iradokitzen du eremu magnetikoaren indarra ez zela nahikoa MP guztiak biltzeko eta atxikitzeko, fluido-prozesuan zehar eremu magnetikoaren indar maximoaren eskualdetik eman baitziren. Hala ere, erditze osteko MP kontzentrazioak handiagoak ziren irudikatutako eremuaren inguruan, eta horrek iradokitzen du MP asko aplikatutako eremu magnetikoaren indarra handiena zen arnasbideetako eskualdeetan geratzen zirela.
(a) irudiak, MP5 arratoi berri baten trakean sartu aurretik eta (b) irudiak, imanak irudi-eremuaren gainean kokatuta dituela. Irudi-eremua bi kartilago-eraztunen artean dago. MP eman aurretik, fluido pixka bat dago arnasbidean. Kutxa gorriak kontrastea hobetzeko handitzea dauka. Irudi hauek S6:MP5 bideo osagarrian erakusten den bideokoak dira.
In vivo imanak trakean zehar mugitzeak MP kateak arnasbidearen gainazalean angelua aldatzea eragin zuen, kapilarretan ikusten den antzera (ikus 8. irudia eta S7 bideo osagarria:MP5). Hala ere, gure ikerketan, MPak ezin ziren arnasbide bizidunaren gainazalean zehar arrastatu, kapilarretan egin zezaketen bezala. Kasu batzuetan, MP katea luzeagoa izango da imanak ezker eta eskuin mugitzen den heinean. Interesgarria da, halaber, ikusi dugula partikula-kateak gainazaleko fluido-geruzaren sakonera aldatzen duela imanak trakean zehar luzetara mugitzen direnean, eta zabaldu egiten dela imanak zuzenean gainean mugitzen direnean eta partikula-katea posizio bertikal batera biratzen denean (ikus S7 bideo osagarria). : MP5 0:09an, behean eskuinean). Mugimendu-eredu bereizgarria aldatu egiten zen imanak trakearen goialdean zehar alboetara mugitzen zirenean (hau da, animaliaren ezkerrera edo eskuinera, trakearen luzeran zehar baino). Partikulak argi ikusten ziren oraindik mugitzen ziren heinean, baina imanak trakeatik kentzean, partikula-kateen puntak ikusten ziren (ikus S8:MP5 bideo osagarria, 0:08tik aurrera). Hori bat dator beirazko kapilare batean eremu magnetiko aplikatu baten pean ikusi genuen MP portaerarekin.
MP5 arratoi anesteziatu bizi baten trakean erakusten duten irudien adibideak. (a) Imanak trakearen gainean eta ezkerrean dauden irudiak lortzeko erabiltzen da, eta gero (b) imanak eskuinera mugitu ondoren. Kutxa gorriak kontrastea hobetzeko handitzea dauka. Irudi hauek S7:MP5 bideo osagarrian erakusten den bideokoak dira.
Bi poloak trakearen gainean eta azpian iparralde-hego orientazioan konfiguratuta zeudenean (hau da, erakarriz; 3b irudia), MP kordak luzeagoak ziruditen eta trakearen alboko horman kokatuta zeuden, trakearen gainazal dortsalean baino (ikus S9:MP5 bideo osagarria). Hala ere, partikula kontzentrazio altuak kokapen bakarrean (hau da, trakearen gainazal dortsalean) ez ziren detektatu fluidoen administrazioaren ondoren, iman bikoitzeko gailu bat erabili zenean, eta hori gertatzen da normalean iman bakarreko gailu bat erabiltzen denean. Ondoren, iman bat poloak alderantziz uxatzeko konfiguratu zenean (3c irudia), ikus-eremuan ikusgai zeuden partikula kopurua ez zen handitu administrazioaren ondoren. Bi iman bikoitzeko konfigurazioen konfigurazioa erronka bat da, imanak tiratzen edo bultzatzen dituzten eremu magnetikoen indar handiengatik, hurrenez hurren. Ondoren, konfigurazioa iman bakar batera aldatu zen, arnasbidearekiko paraleloan, baina arnasbidetik 90 gradutan igarotzen zena, eremu-lerroek trakearen horma ortogonalki zeharkatzeko (3d irudia), alboko horman partikula-agregazioa ikus zitekeen zehazteko diseinatutako orientazio bat. Hala ere, honetan... konfigurazioan, ez zen MP metaketaren edo imanaren mugimendu identifikagarririk egon. Emaitza hauetan guztietan oinarrituta, iman bakarreko 30 graduko orientazio konfigurazioa (3a irudia) aukeratu zen in vivo gene eramaileen ikerketetarako.
Animalia behin eta berriz irudikatu zutenean hilketa gizatiarra egin ondoren, ehunen mugimendu nahasgarririk ez zegoenez, partikula-lerro finagoak eta laburragoak hauteman zitezkeen eremu interkondral garbian, imanaren translazio-higidurarekin bat etorriz "dardarka". Hala ere, oraindik ezin dira argi ikusi MP6 partikulen presentzia eta mugimendua.
LV-LacZ titulua 1,8 × 108 TU/ml izan zen, eta CombiMag MP (MP6)-rekin 1:1 nahastu ondoren, animaliek 50 μl-ko 9 × 107 TU/ml LV ibilgailuaren dosi trakeala jaso zuten (hau da, 4,5 × 106 TU/arratoi). Ikerketa hauetan, erditzean imana mugitu beharrean, imana posizio batean finkatu genuen LV transdukzioa (a) eremu magnetikorik gabe bektorearen administrazioarekin alderatuta hobetu zitekeen ala ez zehazteko, eta (b) fokatu zitekeen ala ez. Arnasbideetako zelulak goiko arnasbideetako eskualde magnetikoetara transduzitzen dira.
Imanen presentziak eta CombiMag LV bektoreekin konbinatuta erabiltzeak ez zirudien animalien osasunean eragin kaltegarririk izan zutenik, gure LV bektoreen administrazio protokolo estandarrak bezala. Trakea eskualdearen perturbazio mekanikoaren menpeko irudi frontalek (1. irudi osagarria) adierazi zuten transdukzio maila nabarmen handiagoak zeudela LV-MP-rekin tratatutako animalien taldean imanak zeudenean (9a irudia). LacZ urdin tindaketa kantitate txiki bat baino ez zegoen kontrol taldean (9b irudia). Normalizatutako X-Gal tindatutako eremuen kuantifikazioak erakutsi zuen LV-MP eremu magnetiko baten aurrean administratzeak gutxi gorabehera 6 aldizko hobekuntza eragin zuela (9c irudia).
LV-MP bidezko trakea-transdukzioa erakusten duten irudi konposatuen adibideak (a) eremu magnetiko baten aurrean eta (b) imanik ezean. (c) Trakearen barruko LacZ transdukzio-eremu normalizatuaren hobekuntza estatistikoki esanguratsua imanak erabiltzean (*p = 0,029, t-test, n = 3 taldeko, batez bestekoa ± SEM).
Gorri tindatutako atal neutro azkarrek (2. irudi osagarrian erakusten den adibidea) LacZ-z tindatutako zelulak aurretik jakinarazitako antzeko eredu eta kokapenean erakutsi zituzten.
Airebideetako gene-terapiaren erronka nagusietako bat garraiatzaile-partikulak intereseko eskualdeetan zehatz-mehatz kokatzea eta transdukzio-eraginkortasun maila altuak lortzea da, mugitzen ari den birikan, aire-fluxuaren eta muki-garbiketa aktiboaren aurrean. FKren airebideetako gaixotasuna tratatzeko diseinatutako LV eramaileentzat, garraiatzaile-partikulak eroapen-airebideetan bizitzeko denbora handitzea orain arte helburu urruna izan da. Castellani et al.-ek adierazi bezala, eremu magnetikoak erabiltzeak transdukzioa hobetzeko abantailak ditu beste gene-emate metodo batzuekin alderatuta, hala nola elektroporazioa, sinpletasuna, kostu-eraginkortasuna, emate-lokalizazioa, eraginkortasun handiagoa eta inkubazio-denbora laburragoak konbina ditzakeelako, eta, agian, garraiatzaile-dosi txikiagoa10. Hala ere, ez da inoiz deskribatu kanpoko indar magnetikoen eraginpean airebideetan partikula magnetikoen in vivo metaketa eta portaera, ezta metodo honen bideragarritasuna in vivo frogatu ere bizirik dauden airebideetan gene-adierazpen mailak hobetzeko.
Gure in vitro sinkrotroi PCXI esperimentuek erakutsi zuten probatu genituen partikula guztiak, poliestirenozko MP izan ezik, ikusgai zirela erabilitako irudi-konfigurazioan. Eremu magnetiko baten aurrean, MP-ek sokak eratzen dituzte, eta haien luzera partikula motaren eta eremu magnetikoaren intentsitatearen (hau da, imanaren hurbiltasuna eta mugimendua) araberakoa da. 10. irudian erakusten den bezala, behatzen ditugun sokak partikula bakoitza magnetizatuta dagoelako eta bere tokiko eremu magnetikoa eragiten duelako sortzen dira. Eremu bereizi hauek antzeko beste partikula batzuk elkartzea eta konektatzea eragiten dute, beste partikulen tokiko erakarpen- eta aldarapen-indarren ondoriozko talde-soken antzeko mugimenduekin.
(a,b) fluidoz betetako kapilarretan sortutako partikula-trenak eta (c,d) airez betetako trakea erakusten dituen eskema. Kontuan izan kapilarrak eta trakea ez daudela eskalan marraztuta. (a) panelak MP-aren deskribapena ere badu, eta honek Fe3O4 partikulak ditu kateetan antolatuta.
Imana kapilarraren gainetik mugitu zenean, partikula-katearen angeluak Fe3O4 duen MP3-5-erako atalase kritiko batera iritsi zen, eta ondoren partikula-katea ez zen jatorrizko posizioan geratu, baizik eta gainazalean zehar mugitu zen posizio berri batera. Efektu hau gerta liteke beirazko kapilarraren gainazala mugimendu hori gertatzeko bezain leuna delako. Interesgarria da, MP6-k (CombiMag) ez zuela horrela jokatu, agian partikulak txikiagoak zirelako, estaldura edo gainazaleko karga desberdinak zituztelako edo garraiatzaile-fluido jabedun batek mugitzeko gaitasunean eragin zuelako. CombiMag partikulen irudi-kontrastea ere ahulagoa da, eta horrek iradokitzen du fluidoak eta partikulek dentsitate antzekoak izan ditzaketela eta, beraz, ez direla erraz mugitzen elkarrengana. Partikulak itsatsita gera daitezke imana azkarregi mugitzen bada, eta horrek adierazten du eremu magnetikoaren indarrak ezin duela beti gainditu fluidoko partikulen arteko marruskadura, eta horrek iradokitzen du agian ez dela harritzekoa eremu magnetikoaren indarra eta imanaren eta helburu-eremuaren arteko distantzia oso garrantzitsuak izatea. Emaitza hauek guztiek iradokitzen dute, halaber, imanek helburu-eremutik igarotzen diren MP asko harrapatu ditzaketen arren, ez dela litekeena imanak mugitzeko fidatzea. CombiMag partikulak trakearen gainazalean zehar. Beraz, ondorioztatzen dugu in vivo LV-MP ikerketek eremu magnetiko estatikoak erabili beharko lituzketela arnasbideetako zuhaitzaren eskualde espezifikoak fisikoki helburu hartzeko.
Partikulak gorputzean sartzen direnean, zailak dira identifikatzen gorputz-ehun konplexu mugikorren testuinguruan, baina horiek detektatzeko gaitasuna hobetu egin zen imanak trakearen gainetik horizontalki mugituz MP hariak "mugitzeko". Irudi zuzenak posible diren arren, errazagoa da partikulen mugimendua hautematea animalia modu humanitarioan hil ondoren. MP kontzentrazioak, oro har, toki honetan izan ziren altuenak imanak irudi-eremuaren gainetik kokatuta zegoenean, nahiz eta partikula batzuk trakean aurrerago aurkitu ohi ziren. In vitro ikerketekin alderatuta, partikulak ezin dira trakean zehar arrastatu imanak mugituz. Aurkikuntza hau bat dator trakearen gainazala estaltzen duen mukiak arnastutako partikulak nola prozesatzen dituen normalean, mukian harrapatuz eta ondoren mukoziliar bidezko garbiketa-mekanismoaren bidez garbituz.
Hipotesia egin genuen trakearen gainetik eta azpitik erakartzeko imanak erabiltzeak (3b irudia) eremu magnetiko uniformeagoa sor zezakeela, puntu batean oso kontzentratutako eremu magnetiko baten ordez, eta horrek partikulen banaketa uniformeagoa ekar dezakeela. Hala ere, gure aurretiazko ikerketak ez zuen hipotesi hau babesteko froga argirik aurkitu. Era berean, iman pare bat uxatzeko konfiguratzeak (3c irudia) ez zuen partikula gehiago metatzea eragin irudikatutako eremuan. Bi aurkikuntza hauek erakusten dute iman bikoitzeko konfigurazioak ez duela nabarmen hobetzen MP bideratzearen tokiko kontrola, eta ondoriozko indar magnetiko sendoak zailak direla konfiguratzen, eta horrek ikuspegi hau gutxiago praktikoa bihurtzen du. Era berean, imanak trakearen gainetik eta zehar orientatzeak (3d irudia) ere ez zuen handitu irudikatutako eremuan atxikitako partikula kopurua. Konfigurazio alternatibo horietako batzuk ez dira arrakastatsuak izango, metatze-eremuan eremu magnetikoen indar txikiagoak eragiten baitituzte. Beraz, 30 graduko angelu bakarreko iman konfigurazioa (3a irudia) in vivo probak egiteko metodorik errazena eta eraginkorrena dela uste da.
LV-MP ikerketak erakutsi zuen LV bektoreak CombiMag-ekin konbinatu eta eremu magnetiko baten aurrean perturbazio fisikoaren ondoren eman zirenean, transdukzio-mailak nabarmen handitu zirela trakean kontrol-taldearekin alderatuta. Sinkrotroi-irudiaren ikerketetan eta LacZ-ren emaitzetan oinarrituta, badirudi eremu magnetikoak LV trakean gordetzea eta biriketan berehala sakon sartzen ziren bektore-partikula kopurua murriztea lortu zuela. Bideratzeko hobekuntza horiek eraginkortasun handiagoa ekar dezakete, aldi berean emandako tituluak, helburutik kanpoko transdukzioa, hanturazko eta immunitate-albo-ondorioak eta gene-eramaileen kostuak murrizten dituzten bitartean. Garrantzitsua da, fabrikatzailearen arabera, CombiMag beste gene-transferentzia metodo batzuekin batera erabil daitekeela, beste bektore biral batzuekin (AAV bezalakoekin) eta azido nukleikoekin barne.