Terima kasih kerana melayari Nature.com. Versi pelayar yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad. Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan anda menggunakan pelayar yang dikemas kini (atau mematikan mod keserasian dalam Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan memaparkan laman web tanpa gaya dan JavaScript.
Vektor gen untuk rawatan penyakit paru-paru fibrosis sistik harus menyasarkan saluran udara pengalir kerana transduksi paru-paru periferal tidak memberikan manfaat terapeutik. Kecekapan transduksi virus secara langsung berkaitan dengan masa kediaman vektor. Walau bagaimanapun, cecair penghantaran seperti pembawa gen secara semula jadi meresap ke dalam alveoli semasa inspirasi, dan zarah terapeutik dalam apa jua bentuk dibersihkan dengan cepat oleh pengangkutan mukosiliari. Memanjangkan masa kediaman pembawa gen dalam saluran udara adalah penting tetapi sukar dicapai. Zarah magnet konjugasi pembawa gen yang boleh diarahkan ke permukaan saluran udara boleh meningkatkan penargetan serantau. Disebabkan oleh cabaran visualisasi in vivo, tingkah laku zarah magnet kecil sedemikian pada permukaan saluran udara dengan kehadiran medan magnet yang dikenakan kurang difahami. Tujuan kajian ini adalah untuk menggunakan pengimejan sinkrotron untuk menggambarkan gerakan in vivo siri zarah magnet dalam trakea tikus yang dibius untuk memeriksa dinamik dan corak tingkah laku zarah individu dan pukal secara in vivo. Kami kemudian juga menilai sama ada penghantaran zarah magnet lentiviral dengan kehadiran medan magnet akan meningkatkan kecekapan transduksi dalam trakea tikus. Sinar-X Sinkotron Pengimejan mendedahkan kelakuan zarah magnet dalam medan magnet pegun dan bergerak secara in vitro dan in vivo. Zarah tidak boleh diseret dengan mudah di sepanjang permukaan saluran udara hidup dengan magnet, tetapi semasa pengangkutan, deposit tertumpu pada medan pandangan di mana medan magnet paling kuat. Kecekapan transduksi juga meningkat enam kali ganda apabila zarah magnet lentiviral dihantar dengan kehadiran medan magnet. Secara keseluruhannya, keputusan ini menunjukkan bahawa zarah magnet lentiviral dan medan magnet mungkin merupakan pendekatan yang berharga untuk meningkatkan penargetan vektor gen dan meningkatkan tahap transduksi dalam pengaliran saluran udara secara in vivo.
Fibrosis sistik (CF) disebabkan oleh variasi dalam gen tunggal yang dipanggil pengatur kekonduksian transmembran CF (CFTR). Protein CFTR ialah saluran ion yang terdapat dalam banyak sel epitelium di seluruh badan, termasuk saluran udara pengalir, tapak utama patogenesis CF. Kecacatan CFTR menyebabkan pengangkutan air yang tidak normal, mengeringkan permukaan saluran udara dan mengurangkan kedalaman lapisan cecair permukaan saluran udara (ASL). Ini juga menjejaskan keupayaan sistem pengangkutan mukosiliari (MCT) untuk membersihkan zarah dan patogen yang disedut daripada saluran udara. Matlamat kami adalah untuk membangunkan terapi gen lentiviral (LV) untuk memberikan salinan gen CFTR yang betul dan meningkatkan kesihatan ASL, MCT dan paru-paru, serta terus membangunkan teknologi baharu yang mampu mengukur parameter ini secara in vivo1.
Vektor LV adalah salah satu calon utama untuk terapi gen saluran udara CF, terutamanya kerana ia boleh mengintegrasikan gen terapeutik secara kekal ke dalam sel basal saluran udara (sel stem saluran udara). Ini penting kerana ia boleh memulihkan penghidratan dan pembersihan mukus yang normal dengan membezakannya menjadi sel permukaan saluran udara yang berkaitan dengan CF yang dibetulkan gen berfungsi, menghasilkan manfaat sepanjang hayat. Vektor LV harus diarahkan terhadap saluran udara pengalir, kerana di sinilah penyakit paru-paru CF bermula. Penghantaran vektor lebih dalam ke dalam paru-paru boleh mengakibatkan transduksi alveolar, tetapi ini tidak mempunyai manfaat terapeutik dalam CF. Walau bagaimanapun, cecair seperti pembawa gen secara semula jadi berhijrah ke alveoli semasa inspirasi selepas penghantaran3,4 dan zarah terapeutik cepat dibersihkan ke dalam rongga mulut oleh MCT. Kecekapan transduksi LV secara langsung berkaitan dengan tempoh masa vektor kekal di sebelah sel sasaran untuk membolehkan pengambilan selular – "masa kediaman"5 – yang mudah dikurangkan oleh aliran udara serantau yang biasa serta penangkapan mukus zarah yang diselaraskan dan MCT. Bagi CF, keupayaan untuk memanjangkan masa kediaman LV dalam saluran udara adalah penting untuk mencapai tahap transduksi yang tinggi di rantau ini, tetapi setakat ini mencabar.
Untuk mengatasi halangan ini, kami mencadangkan agar zarah magnet LV (MP) dapat membantu dalam dua cara yang saling melengkapi. Pertama, ia dapat dipandu secara magnet ke permukaan saluran udara untuk meningkatkan penyasaran dan membantu zarah pembawa gen berada di kawasan saluran udara yang diinginkan; dan ASL) untuk bergerak ke lapisan sel 6. MP telah digunakan secara meluas sebagai kenderaan penghantaran ubat yang disasarkan apabila ia mengikat antibodi, ubat kemoterapi, atau molekul kecil lain yang melekat pada membran sel atau mengikat pada reseptor permukaan sel yang berkaitan dan terkumpul di tapak tumor dengan kehadiran elektrik statik. Medan Magnet untuk Rawatan Kanser 7. Teknik "hiperterma" lain bertujuan untuk memanaskan MP apabila ia terdedah kepada medan magnet yang berayun, sekali gus memusnahkan sel tumor. Prinsip transfeksi magnetik, di mana medan magnet digunakan sebagai agen transfeksi untuk meningkatkan pemindahan DNA ke sel, biasanya digunakan secara in vitro menggunakan pelbagai vektor gen bukan virus dan virus untuk garisan sel yang sukar ditransduksi. Keberkesanan magnetotransfeksi LV telah terbukti, dengan penghantaran in vitro LV-MP ke garisan sel epitelium bronkial manusia dengan kehadiran medan magnet statik, meningkatkan kecekapan transduksi sebanyak 186 kali ganda berbanding vektor LV sahaja. LV-MP juga telah digunakan pada model CF in vitro, di mana transfeksi magnetik meningkatkan transduksi LV dalam kultur antara muka udara-cecair sebanyak 20 kali ganda dengan kehadiran sputum CF10. Walau bagaimanapun, magnetotransfeksi organ in vivo telah menerima sedikit perhatian dan hanya dinilai dalam beberapa kajian haiwan11,12,13,14,15, terutamanya dalam paru-paru16,17.Walau bagaimanapun, peluang untuk transfeksi magnetik dalam terapi paru-paru CF adalah jelas.Tan et al.(2020) menyatakan bahawa “kajian bukti konsep penghantaran nanopartikel magnetik pulmonari yang cekap akan membuka jalan untuk strategi penyedutan CFTR masa depan untuk meningkatkan hasil klinikal dalam pesakit CF”6.
Tingkah laku zarah magnet kecil pada permukaan saluran udara dengan kehadiran medan magnet yang dikenakan adalah sukar untuk divisualisasikan dan dikaji, dan oleh itu kurang difahami. Dalam kajian lain, kami membangunkan kaedah pengimejan sinar-X kontras fasa berasaskan perambatan sinkrotron (PB-PCXI) untuk memvisualisasikan dan mengukur secara tidak invasif perubahan in vivo minit dalam kedalaman ASL18 dan tingkah laku MCT19,20 untuk mengukur secara langsung penghidratan permukaan Terusan gas dan digunakan sebagai penunjuk awal keberkesanan rawatan. Di samping itu, kaedah penilaian MCT kami menggunakan zarah berdiameter 10–35 µm yang terdiri daripada alumina atau kaca indeks biasan tinggi sebagai penanda MCT yang boleh dilihat menggunakan PB-PCXI21. Kedua-dua teknik ini sesuai untuk visualisasi pelbagai jenis zarah, termasuk MP.
Disebabkan resolusi spatial dan temporalnya yang tinggi, teknik analisis ASL dan MCT berasaskan PB-PCXI kami sangat sesuai untuk mengkaji dinamik dan corak tingkah laku zarah tunggal dan pukal secara in vivo bagi membantu kami memahami dan mengoptimumkan teknik penghantaran gen MP. Pendekatan yang kami gunakan di sini berasal daripada kajian kami menggunakan beamline SPring-8 BL20B2, di mana kami menggambarkan pergerakan bendalir berikutan penghantaran dos vektor palsu ke dalam saluran udara hidung dan pulmonari tikus untuk membantu menjelaskan corak ekspresi gen tidak seragam yang diperhatikan dalam kajian haiwan dos pembawa gen kami 3,4.
Tujuan kajian ini adalah untuk menggunakan sinkrotron PB-PCXI untuk menggambarkan pergerakan in vivo bagi satu siri MP dalam trakea tikus hidup. Kajian pengimejan PB-PCXI ini direka bentuk untuk menguji pelbagai MP, kekuatan medan magnet dan lokasi bagi menentukan kesannya terhadap pergerakan MP. Kami membuat hipotesis bahawa medan magnet yang dikenakan secara luaran akan membantu MP yang dihantar kekal atau bergerak ke kawasan sasaran. Kajian ini juga membolehkan kami mengenal pasti konfigurasi magnet yang memaksimumkan bilangan zarah yang tertahan dalam trakea selepas pemendapan. Dalam siri kajian kedua, kami berusaha untuk menggunakan konfigurasi optimum ini untuk menunjukkan corak transduksi yang terhasil daripada penghantaran in vivo LV-MP ke saluran udara tikus, berdasarkan andaian bahawa penghantaran LV-MP dalam konteks penargetan saluran udara akan menghasilkan kecekapan transduksi LV yang lebih baik.
Semua kajian haiwan telah dijalankan mengikut protokol yang diluluskan oleh Universiti Adelaide (M-2019-060 dan M-2020-022) dan Jawatankuasa Etika Haiwan Synchrotron SPring-8. Eksperimen telah dijalankan mengikut garis panduan ARRIVE.
Semua pengimejan sinar-X telah dilakukan pada garisan pancaran BL20XU di sinkrotron SPring-8 di Jepun, menggunakan persediaan yang serupa dengan yang diterangkan sebelum ini21,22. Secara ringkasnya, kotak eksperimen terletak 245 m dari cincin penyimpanan sinkrotron. Jarak sampel ke pengesan 0.6 m digunakan untuk kajian pengimejan zarah dan 0.3 m untuk kajian pengimejan in vivo untuk menghasilkan kesan kontras fasa. Tenaga pancaran monokromatik 25 keV telah digunakan. Imej telah ditangkap menggunakan penukar sinar-X resolusi tinggi (SPring-8 BM3) yang digandingkan dengan pengesan sCMOS. Penukar menukar sinar-X kepada cahaya nampak menggunakan sintilator setebal 10 µm (Gd3Al2Ga3O12), yang kemudiannya diarahkan kepada sensor sCMOS menggunakan objektif mikroskop × 10 (NA 0.3). Pengesan sCMOS ialah Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Jepun) dengan saiz tatasusunan 2048 × 2048 piksel dan saiz piksel mentah 6.5 × 6.5 µm. Persediaan ini menghasilkan saiz piksel isotropik berkesan 0.51 µm dan medan pandangan kira-kira 1.1 mm × 1.1 mm. Panjang pendedahan 100 ms telah dipilih untuk memaksimumkan nisbah isyarat-ke-hingar zarah magnet di dalam dan di luar saluran udara sambil meminimumkan artifak gerakan yang disebabkan oleh pernafasan. Untuk kajian in vivo, pengatup sinar-X pantas diletakkan di laluan sinar-X untuk mengehadkan dos sinaran dengan menyekat pancaran sinar-X antara pendedahan.
Pembawa LV tidak digunakan dalam mana-mana kajian pengimejan SPring-8 PB-PCXI kerana ruang pengimejan BL20XU tidak diperakui Tahap Biokeselamatan 2. Sebaliknya, kami memilih pelbagai MP yang dicirikan dengan baik daripada dua pembekal komersial—meliputi pelbagai saiz, bahan, kepekatan besi dan aplikasi—terlebih dahulu untuk memahami bagaimana medan magnet mempengaruhi gerakan MP dalam kapilari kaca, dan kemudian dalam saluran udara hidup. di permukaan. MP mempunyai saiz antara 0.25 hingga 18 μm dan diperbuat daripada pelbagai bahan (lihat Jadual 1), tetapi komposisi setiap sampel, termasuk saiz zarah magnet dalam MP, tidak diketahui. Berdasarkan kajian MCT kami yang meluas 19, 20, 21, 23, 24, kami menjangkakan bahawa MP sekecil 5 μm boleh dilihat pada permukaan saluran udara trakea, contohnya dengan menolak bingkai berturut-turut untuk melihat keterlihatan gerakan MP yang dipertingkatkan. MP bersaiz 0.25 μm tunggal adalah lebih kecil daripada resolusi peranti pengimejan, tetapi PB-PCXI dijangka dapat mengesan kontras isipadu dan gerakan bendalir permukaan tempat ia dimendapkan selepas pemendapan.
Sampel untuk setiap MP dalam Jadual 1 disediakan dalam kapilari kaca 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) dengan diameter dalaman 0.63 mm. Zarah korpuskular terdapat dalam air, manakala zarah CombiMag terdapat dalam bendalir proprietari pengeluar. Setiap tiub diisi separuh dengan cecair (kira-kira 11 μl) dan diletakkan pada pemegang sampel (lihat Rajah 1). Kapilari kaca diletakkan secara mendatar di atas peringkat sampel dalam kotak pengimejan, masing-masing, dan meletakkan tepi bendalir. Magnet boron besi neodymium (NdFeB) nadir bumi berdiameter 19 mm (28 mm panjang) cangkerang nikel (N35, no. kat. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) dengan kemagnetan baki 1.17 Tesla telah dilekatkan pada peringkat terjemahan berasingan untuk mencapai Perubahan kedudukannya dari jauh semasa pengimejan. Pemerolehan imej sinar-X bermula apabila magnet diletakkan kira-kira 30 mm di atas sampel, dan imej diperoleh pada kadar 4 bingkai sesaat. Semasa pengimejan, magnet dibawa dekat dengan tiub kapilari kaca. (kira-kira 1 mm jauhnya) dan kemudian diterjemahkan di sepanjang tiub untuk menilai kesan kekuatan medan dan kedudukan.
Persediaan pengimejan in vitro yang mengandungi sampel MP dalam kapilari kaca pada peringkat terjemahan xy sampel. Laluan pancaran sinar-X ditanda dengan garis putus-putus merah.
Sebaik sahaja keterlihatan in vitro MP telah ditentukan, sebahagian daripadanya telah diuji secara in vivo pada tikus Wistar albino betina jenis liar (~12 minggu, ~200 g). 0.24 mg/kg medetomidin (Domitor®, Zenoaq, Jepun), 3.2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Jepun) dan 4 mg/kg butorphanol (Vetorphale®, Meiji Seika). Tikus telah dibius dengan campuran Pharma), Jepun) melalui suntikan intraperitoneal. Selepas anestesia, mereka disediakan untuk pengimejan dengan menanggalkan bulu di sekeliling trakea, memasukkan tiub endotrakeal (ET; 16 Ga iv kanula, Terumo BCT) dan melumpuhkan mereka terlentang pada plat pengimejan buatan khas yang mengandungi beg haba untuk mengekalkan suhu badan 22. Plat pengimejan kemudiannya dilekatkan pada peringkat terjemahan sampel dalam kotak pengimejan pada sudut yang sedikit untuk menyelaraskan trakea secara mendatar dalam imej sinar-X, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2a.
(a) Persediaan pengimejan in vivo dalam kotak pengimejan SPring-8, laluan pancaran sinar-X ditanda dengan garis putus-putus merah. (b,c) Penyetempatan magnet pada trakea dilakukan dari jauh menggunakan dua kamera IP yang dipasang secara ortogon. Di sebelah kiri imej skrin, gelung dawai yang memegang kepala boleh dilihat, dan kanula penghantaran di tempatnya di dalam tiub ET.
Sistem pam picagari kawalan jauh (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) menggunakan picagari kaca 100 μl telah disambungkan ke tiub PE10 (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) melalui jarum 30 Ga. Tandakan tiub untuk memastikan hujungnya berada di kedudukan yang betul dalam trakea semasa memasukkan tiub ET. Menggunakan pam mikro, pelocok picagari ditarik balik sementara hujung tiub direndam dalam sampel MP yang akan dihantar. Tiub penghantaran yang dimuatkan kemudiannya dimasukkan ke dalam tiub endotrakea, meletakkan hujungnya di bahagian terkuat medan magnet yang dijangkakan. Pemerolehan imej dikawal menggunakan pengesan respirasi yang disambungkan ke kotak pemasaan berasaskan Arduino kami, dan semua isyarat (cth. suhu, respirasi, pembukaan/penutupan pengatup dan pemerolehan imej) telah dirakam menggunakan Powerlab dan LabChart (AD Instruments, Sydney, Australia) 22. Semasa pengimejan Apabila penutup tidak boleh diakses, dua kamera IP (Panasonic BB-SC382) diletakkan pada kira-kira 90° antara satu sama lain dan digunakan untuk memantau kedudukan magnet relatif kepada trakea semasa pengimejan (Rajah 2b,c). Untuk meminimumkan artifak gerakan, satu imej telah diperolehi setiap nafas semasa dataran aliran pasang surut akhir.
Satu magnet dilekatkan pada peringkat kedua yang boleh diletakkan dari jauh dari luar perumah pengimejan. Pelbagai kedudukan dan konfigurasi magnet telah diuji, termasuk: Dipasang pada sudut kira-kira 30° di atas trakea (konfigurasi ditunjukkan dalam Rajah 2a dan 3a); satu magnet di atas haiwan dan satu lagi di bawah, dengan kutub ditetapkan untuk menarik (Rajah 3b); satu magnet di atas haiwan dan satu lagi di bawah, dengan kutub ditetapkan untuk menolak (Rajah 3c); dan satu magnet di atas dan serenjang dengan trakea (Rajah 3d). Setelah haiwan dan magnet dikonfigurasikan dan MP yang hendak diuji dimuatkan ke dalam pam picagari, berikan dos 50 μl pada kadar 4 μl/saat sambil memperoleh imej. Magnet kemudian digerakkan ke hadapan dan ke belakang di sepanjang atau ke sisi merentasi trakea sambil terus memperoleh imej.
Konfigurasi magnet untuk pengimejan in vivo (a) magnet tunggal di atas trakea pada sudut kira-kira 30°, (b) dua magnet yang ditetapkan untuk menarik, (c) dua magnet yang ditetapkan untuk menolak, (d) magnet tunggal di atas dan berserenjang dalam trakea. Pemerhati melihat ke bawah dari mulut ke paru-paru melalui trakea, dan pancaran sinar-X melalui bahagian kiri tikus dan keluar dari bahagian kanan. Magnet sama ada digerakkan di sepanjang saluran udara atau ke kiri dan kanan di atas trakea ke arah pancaran sinar-X.
Kami juga berusaha untuk menentukan keterlihatan dan tingkah laku zarah dalam saluran pernafasan tanpa sebarang gangguan pernafasan dan pergerakan jantung. Oleh itu, pada akhir tempoh pengimejan, haiwan dibunuh secara berperikemanusiaan kerana overdosis pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, Amerika Syarikat; ~65 mg/kg ip). Sesetengah haiwan ditinggalkan di atas platform pengimejan, dan sebaik sahaja pernafasan dan degupan jantung berhenti, proses pengimejan diulang, dengan menambah dos MP tambahan jika tiada MP yang kelihatan pada permukaan saluran pernafasan.
Imej yang diperoleh telah dibetulkan medan rata dan medan gelap dan kemudian dipasang menjadi filem (20 bingkai sesaat; 15-25 × kelajuan normal bergantung pada kadar pernafasan) menggunakan skrip tersuai yang ditulis dalam MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Semua kajian penghantaran vektor gen LV telah dijalankan di Kemudahan Penyelidikan Haiwan Makmal di Universiti Adelaide dan bertujuan untuk menggunakan keputusan eksperimen SPring-8 bagi menilai sama ada penghantaran LV-MP dengan kehadiran medan magnet boleh meningkatkan pemindahan gen secara in vivo. Untuk menilai kesan MP dan medan magnet, dua kumpulan haiwan telah dirawat: satu kumpulan diberi LV-MP dengan magnet diletakkan, dan kumpulan yang satu lagi menerima kumpulan kawalan dengan LV-MP tanpa magnet.
Vektor gen LV dijana menggunakan kaedah 25, 26 yang diterangkan sebelum ini. Vektor LacZ mengekspresikan gen beta-galaktosidase setempat nuklear yang dipacu oleh promoter MPSV konstitutif (LV-LacZ), yang menghasilkan produk tindak balas biru dalam sel yang ditransduksi, yang boleh dilihat di bahagian hadapan tisu paru-paru dan bahagian tisu. Titrasi dilakukan dalam kultur sel dengan mengira bilangan sel positif LacZ secara manual dengan hemositometer untuk mengira titer dalam TU/ml. Pembawa dikeringkan pada -80 °C, dicairkan sebelum digunakan dan diikat pada CombiMag dengan mencampurkan pada nisbah 1:1 dan mengeram di atas ais selama sekurang-kurangnya 30 minit sebelum penghantaran.
Tikus Sprague Dawley normal (n = 3/kumpulan, ~2-3 telah dibius secara intraperitoneal dengan campuran 0.4 mg/kg medetomidin (Domitor, Ilium, Australia) dan 60 mg/kg ketamin (Ilium, Australia) (bulan) suntikan ip) dan kanulasi oral tanpa pembedahan dengan kanula 16 Ga iv. Untuk memastikan tisu saluran udara trakea menerima transduksi LV, ia telah dikondisikan menggunakan protokol perturbasi mekanikal yang telah diterangkan sebelum ini, di mana permukaan saluran udara trakea digosok secara aksial dengan bakul dawai (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s28. Pentadbiran LV-MP secara trakea kemudiannya dilakukan dalam kabinet keselamatan biologi kira-kira 10 minit selepas perturbasi.
Medan magnet yang digunakan dalam eksperimen ini dikonfigurasikan dengan cara yang serupa dengan kajian pengimejan sinar-X in vivo, dengan magnet yang sama dipegang di atas trakea menggunakan klip stent penyulingan (Rajah 4). Isipadu 50 μl (2 × 25 μl alikuot) LV-MP telah dimasukkan ke dalam trakea (n = 3 haiwan) menggunakan pipet yang mengandungi hujung gel seperti yang diterangkan sebelum ini. Kumpulan kawalan (n = 3 haiwan) menerima LV-MP yang sama tanpa menggunakan magnet. Selepas infusi selesai, kanula dikeluarkan dari tiub ET dan haiwan tersebut diekstubasi. Magnet kekal di tempatnya selama 10 minit, kemudian ia dikeluarkan. Tikus menerima dos meloxicam subkutaneus (1 ml/kg) (Ilium, Australia) diikuti dengan pembalikan anestesia dengan suntikan ip 1 mg/kg atipamazole hidroklorida (Antisedan, Zoetis, Australia). Tikus dijaga agar sentiasa panas dan dipantau sehingga pulih sepenuhnya daripada anestesia.
Peranti penghantaran LV-MP dalam kabinet keselamatan biologi. Hab Luer kelabu muda pada tiub ET boleh dilihat terkeluar dari mulut dan hujung gel pipet yang ditunjukkan dalam gambar dimasukkan melalui tiub ET ke kedalaman yang dikehendaki ke dalam trakea.
Seminggu selepas prosedur dos LV-MP, haiwan dibunuh secara manusiawi melalui penyedutan CO2 100% dan ekspresi LacZ dinilai menggunakan rawatan X-gal standard kami. Tiga cincin paling rawan kaudal telah dikeluarkan untuk memastikan sebarang kerosakan mekanikal atau pengekalan cecair daripada penempatan tiub endotrakeal tidak dimasukkan dalam analisis. Setiap trakea dipotong secara membujur untuk menghasilkan dua bahagian untuk dianalisis, dan ia dipasang dalam piring yang mengandungi getah silikon (Sylgard, Dow Inc) menggunakan jarum Minutien (Fine Science Tools) untuk menggambarkan permukaan luminal. Taburan dan corak sel yang ditransduksi telah disahkan oleh fotografi hadapan menggunakan mikroskop Nikon (SMZ1500) dengan kamera DigiLite dan perisian TCapture (Tucsen Photonics, China). Imej diperoleh pada pembesaran 20x (termasuk tetapan tertinggi untuk lebar penuh trakea), dengan keseluruhan panjang trakea diimejkan langkah demi langkah, memastikan pertindihan yang mencukupi antara setiap imej untuk membolehkan "jahitan" imej. Imej daripada setiap trakea telah kemudian dipasang menjadi imej komposit tunggal menggunakan Editor Komposit Imej v2.0.3 (Microsoft Research) menggunakan algoritma gerakan planar. Kawasan ekspresi LacZ dalam imej komposit trakea daripada setiap haiwan telah diukur menggunakan skrip MATLAB automatik (R2020a, MathWorks) seperti yang diterangkan sebelum ini, menggunakan tetapan 0.35 < Hue < 0.58, Ketepuan > 0.15 dan Nilai < 0.7. Dengan menjejaki kontur tisu, topeng telah dijana secara manual dalam GIMP v2.10.24 untuk setiap imej komposit untuk mengenal pasti kawasan tisu dan mencegah sebarang pengesanan palsu dari luar tisu trakea. Kawasan yang diwarnakan daripada semua imej komposit daripada setiap haiwan telah dijumlahkan untuk menjana jumlah kawasan yang diwarnakan untuk haiwan tersebut. Kawasan yang diwarnakan kemudiannya dibahagikan dengan jumlah kawasan topeng untuk menjana kawasan yang dinormalisasi.
Setiap trakea dibenamkan dalam parafin dan bahagian 5 μm dipotong. Bahagian-bahagian tersebut diwarnakan semula dengan warna merah neutral selama 5 minit dan imej diperoleh menggunakan mikroskop Nikon Eclipse E400, kamera DS-Fi3 dan perisian penangkapan elemen NIS (versi 5.20.00).
Semua analisis statistik telah dijalankan dalam GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Kepentingan statistik telah ditetapkan pada p ≤ 0.05. Normaliti telah disahkan menggunakan ujian Shapiro-Wilk, dan perbezaan dalam pewarnaan LacZ telah dinilai menggunakan ujian-t tidak berpasangan.
Enam MP yang diterangkan dalam Jadual 1 telah diperiksa menggunakan PCXI, dan keterlihatannya diterangkan dalam Jadual 2. Dua MP polistirena (MP1 dan MP2; masing-masing 18 μm dan 0.25 μm) tidak kelihatan di bawah PCXI, tetapi sampel yang lain dapat dikenal pasti (contoh ditunjukkan dalam Rajah 5). MP3 dan MP4 (masing-masing 10-15% Fe3O4; 0.25 μm dan 0.9 μm) samar-samar kelihatan. Walaupun mengandungi beberapa zarah terkecil yang diuji, MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) adalah yang paling ketara. Produk CombiMag MP6 sukar dikesan. Dalam semua kes, keupayaan kami untuk mengesan MP dipertingkatkan dengan ketara dengan menterjemahkan magnet ke depan dan ke belakang selari dengan kapilari. Apabila magnet bergerak menjauhi kapilari, zarah-zarah memanjang dalam tali panjang, tetapi apabila magnet semakin dekat dan kekuatan medan magnet meningkat, tali zarah memendek apabila zarah-zarah berhijrah ke arah permukaan atas kapilari (lihat Video Tambahan S1: MP4), meningkatkan The ketumpatan zarah permukaan. Sebaliknya, apabila magnet dikeluarkan dari kapilari, kekuatan medan berkurangan dan MP disusun semula menjadi tali panjang yang memanjang dari permukaan atas kapilari (lihat Video Tambahan S2:MP4). Selepas magnet berhenti bergerak, zarah terus bergerak untuk masa yang singkat selepas mencapai kedudukan keseimbangan. Apabila MP bergerak ke arah dan menjauhi permukaan atas kapilari, zarah magnet biasanya menyeret serpihan melalui bendalir.
Keterlihatan MP di bawah PCXI berbeza dengan ketara antara sampel. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 dan (d) MP6. Semua imej yang ditunjukkan di sini diambil dengan magnet yang terletak kira-kira 10 mm betul-betul di atas kapilari. Bulatan besar yang kelihatan ialah gelembung udara yang terperangkap dalam kapilari, dengan jelas menunjukkan ciri tepi hitam putih pengimejan kontras fasa. Kotak merah mengandungi pembesaran peningkatan kontras. Ambil perhatian bahawa diameter skema magnet dalam semua rajah tidak mengikut skala dan kira-kira 100 kali lebih besar daripada yang ditunjukkan.
Apabila magnet ditranslasikan ke kiri dan kanan di sepanjang bahagian atas kapilari, sudut tali MP berubah untuk sejajar dengan magnet (lihat Rajah 6), sekali gus menggambarkan garisan medan magnet. Bagi MP3-5, selepas kord mencapai sudut ambang, zarah-zarah diseret di sepanjang permukaan atas kapilari. Ini selalunya mengakibatkan MP berkelompok kepada kumpulan yang lebih besar berhampiran tempat medan magnet paling kuat (lihat Video Tambahan S3:MP5). Ini juga amat jelas apabila pengimejan berhampiran hujung kapilari, yang menyebabkan MP beragregat dan tertumpu pada antara muka bendalir-udara. Zarah-zarah dalam MP6, yang lebih sukar untuk dibezakan daripada MP3-5, tidak diseret semasa magnet bergerak di sepanjang kapilari, tetapi tali MP terpisah, meninggalkan zarah dalam medan pandangan (lihat Video Tambahan S4:MP6). Dalam beberapa kes, apabila medan magnet yang dikenakan dikurangkan dengan menggerakkan magnet pada jarak yang jauh dari lokasi pengimejan, mana-mana MP yang tinggal perlahan-lahan turun ke permukaan bawah tiub oleh graviti sambil kekal dalam tali (lihat Video Tambahan S5: MP3).
Sudut tali MP berubah apabila magnet diterjemahkan ke kanan di atas kapilari.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 dan (d) MP6. Kotak merah mengandungi pembesaran peningkatan kontras. Ambil perhatian bahawa video tambahan adalah bermaklumat kerana ia mendedahkan struktur zarah penting dan maklumat dinamik yang tidak dapat divisualisasikan dalam imej statik ini.
Ujian kami menunjukkan bahawa menggerakkan magnet secara perlahan ke depan dan ke belakang di sepanjang trakea memudahkan visualisasi MP dalam konteks pergerakan kompleks secara in vivo. Ujian in vivo tidak dilakukan kerana manik polistirena (MP1 dan MP2) tidak kelihatan dalam kapilari. Setiap daripada empat MP yang tinggal diuji secara in vivo dengan paksi panjang magnet yang dikonfigurasikan di atas trakea pada sudut kira-kira 30° ke menegak (lihat Rajah 2b dan 3a), kerana ini menghasilkan rantai MP yang lebih panjang dan lebih berkesan daripada konfigurasi magnet yang ditamatkan. MP3, MP4 dan MP6 tidak dikesan dalam trakea mana-mana haiwan hidup. Apabila saluran pernafasan tikus diimejkan selepas haiwan dibunuh secara berperikemanusiaan, zarah-zarah tersebut kekal tidak kelihatan walaupun isipadu tambahan ditambah menggunakan pam picagari. MP5 mempunyai kandungan oksida besi tertinggi dan merupakan satu-satunya zarah yang kelihatan, dan oleh itu digunakan untuk menilai dan mencirikan tingkah laku in vivo MP.
Meletakkan magnet di atas trakea semasa penghantaran MP mengakibatkan banyak, tetapi bukan semua, MP tertumpu dalam medan pandangan. Zarah yang memasuki trakea paling baik diperhatikan pada haiwan yang dikorbankan secara manusiawi. Rajah 7 dan Video Tambahan S6: MP5 menunjukkan penangkapan dan penjajaran magnet yang pantas pada permukaan trakea ventral, menunjukkan bahawa MP boleh diarahkan ke kawasan trakea yang dikehendaki. Apabila mencari lebih distal di sepanjang trakea selepas penghantaran MP, beberapa MP ditemui lebih dekat dengan carina, menunjukkan bahawa kekuatan medan magnet tidak mencukupi untuk mengumpul dan mengekalkan semua MP, kerana ia dihantar melalui kawasan kekuatan medan magnet maksimum semasa proses bendalir. Walau bagaimanapun, kepekatan MP selepas bersalin adalah lebih tinggi di sekitar kawasan yang diimejkan, menunjukkan bahawa banyak MP kekal di kawasan saluran udara di mana kekuatan medan magnet yang dikenakan adalah tertinggi.
Imej daripada (a) sebelum dan (b) selepas penghantaran MP5 ke dalam trakea tikus yang baru dimatikan dengan magnet diletakkan betul-betul di atas kawasan pengimejan. Kawasan yang diimejkan terletak di antara dua cincin rawan. Sebelum penghantaran MP, terdapat sedikit cecair di saluran udara. Kotak merah mengandungi pembesaran peningkatan kontras. Imej-imej ini adalah daripada video yang ditunjukkan dalam Video Tambahan S6:MP5.
Menterjemahkan magnet di sepanjang trakea secara in vivo menyebabkan rantai MP berubah sudut dalam permukaan saluran udara dengan cara yang serupa dengan yang dilihat dalam kapilari (lihat Rajah 8 dan Video Tambahan S7:MP5). Walau bagaimanapun, dalam kajian kami, MP tidak boleh diseret di sepanjang permukaan saluran udara hidup seperti yang boleh dilakukan dengan kapilari. Dalam beberapa kes, rantai MP akan menjadi lebih panjang apabila magnet bergerak ke kiri dan ke kanan. Menariknya, kami juga mendapati bahawa rentetan zarah kelihatan mengubah kedalaman lapisan bendalir permukaan apabila magnet digerakkan secara membujur di sepanjang trakea, dan mengembang apabila magnet digerakkan terus ke atas dan rentetan zarah diputar ke kedudukan menegak (lihat Video Tambahan S7). : MP5 pada 0:09, kanan bawah). Corak pergerakan ciri berubah apabila magnet diterjemahkan merentasi bahagian atas trakea secara lateral (iaitu, ke kiri atau kanan haiwan dan bukannya di sepanjang trakea). Zarah-zarah masih kelihatan jelas semasa ia bergerak, tetapi apabila magnet dikeluarkan dari trakea, hujung tali zarah menjadi kelihatan (lihat Video Tambahan S8:MP5, bermula pada 0:08). Ini selaras dengan tingkah laku MP yang kami perhatikan di bawah medan magnet yang dikenakan dalam kapilari kaca.
Contoh imej yang menunjukkan MP5 dalam trakea tikus hidup yang dibius. (a) Magnet digunakan untuk memperoleh imej di atas dan di sebelah kiri trakea, kemudian (b) selepas magnet digerakkan ke kanan. Kotak merah mengandungi pembesaran peningkatan kontras. Imej-imej ini adalah daripada video yang ditunjukkan dalam Video Tambahan S7:MP5.
Apabila kedua-dua kutub dikonfigurasikan dalam orientasi utara-selatan di atas dan di bawah trakea (iaitu menarik; Rajah 3b), kord MP kelihatan lebih panjang dan terletak di dinding sisi trakea dan bukannya pada permukaan trakea dorsal (lihat Video Tambahan S9:MP5). Walau bagaimanapun, kepekatan zarah yang tinggi di satu lokasi (iaitu, permukaan dorsal trakea) tidak dikesan selepas penghantaran bendalir apabila peranti dwi-magnet digunakan, yang biasanya berlaku apabila peranti magnet tunggal digunakan. Kemudian apabila satu magnet dikonfigurasikan untuk menolak kutub yang diterbalikkan (Rajah 3c), bilangan zarah yang kelihatan dalam medan pandangan tidak kelihatan meningkat selepas penghantaran. Persediaan kedua-dua konfigurasi dwi-magnet adalah mencabar kerana kekuatan medan magnet yang tinggi yang menarik atau menolak magnet, masing-masing. Persediaan kemudiannya ditukar kepada magnet tunggal selari dengan saluran udara tetapi melalui saluran udara pada 90 darjah supaya garis medan melintasi dinding trakea secara ortogon (Rajah 3d), orientasi yang direka untuk menentukan sama ada pengagregatan zarah pada dinding sisi boleh diperhatikan. Walau bagaimanapun, dalam Dalam konfigurasi ini, tiada pergerakan pengumpulan MP atau pergerakan magnet yang dapat dikenal pasti. Berdasarkan semua keputusan ini, konfigurasi orientasi 30 darjah magnet tunggal (Rajah 3a) telah dipilih untuk kajian pembawa gen in vivo.
Apabila haiwan itu diimejkan berulang kali sejurus selepas pembunuhan berperikemanusiaan, ketiadaan pergerakan tisu yang mengelirukan bermakna garisan zarah yang lebih halus dan pendek dapat dilihat dalam medan antara kondral yang jelas, "goyah" sejajar dengan pergerakan translasi magnet. Walau bagaimanapun, masih tidak dapat melihat dengan jelas kehadiran dan pergerakan zarah MP6.
Titer LV-LacZ ialah 1.8 × 108 TU/ml, dan selepas pencampuran 1:1 dengan CombiMag MP (MP6), haiwan menerima dos trakea 50 μl sebanyak 9 × 107 TU/ml kenderaan LV (iaitu 4.5 × 106 TU/tikus). Dalam kajian ini, daripada menterjemahkan magnet semasa bersalin, kami menetapkan magnet pada satu kedudukan untuk menentukan sama ada transduksi LV (a) boleh diperbaiki berbanding penghantaran vektor jika tiada medan magnet, dan (b) boleh difokuskan. Sel saluran udara ditransduksi ke kawasan sasaran magnet pada saluran udara atas.
Kehadiran magnet dan penggunaan CombiMag yang digabungkan dengan vektor LV nampaknya tidak memberi kesan buruk terhadap kesihatan haiwan, begitu juga protokol penghantaran vektor LV standard kami. Imej hadapan kawasan trakea yang tertakluk kepada gangguan mekanikal (Rajah Tambahan 1) menunjukkan bahawa terdapat tahap transduksi yang jauh lebih tinggi dalam kumpulan haiwan yang dirawat dengan LV-MP apabila magnet hadir (Rajah 9a). Hanya sedikit pewarnaan LacZ biru yang terdapat dalam kumpulan kawalan (Rajah 9b). Kuantifikasi kawasan berwarna X-Gal yang dinormalisasi menunjukkan bahawa pemberian LV-MP dengan kehadiran medan magnet menghasilkan peningkatan kira-kira 6 kali ganda (Rajah 9c).
Contoh imej komposit yang menunjukkan transduksi trakea oleh LV-MP (a) dengan kehadiran medan magnet dan (b) tanpa magnet. (c) Peningkatan yang ketara secara statistik dalam kawasan transduksi LacZ yang dinormalisasi dalam trakea apabila menggunakan magnet (*p = 0.029, ujian-t, n = 3 setiap kumpulan, min ± SEM).
Bahagian berwarna merah neutral yang cepat (contoh yang ditunjukkan dalam Rajah Tambahan 2) menunjukkan sel berwarna LacZ hadir dalam corak dan lokasi yang serupa seperti yang dilaporkan sebelum ini.
Cabaran utama untuk terapi gen saluran udara masih merupakan penyetempatan zarah pembawa yang tepat ke kawasan yang diminati dan mencapai tahap kecekapan transduksi yang tinggi dalam paru-paru yang bergerak dengan kehadiran aliran udara dan pembersihan mukus aktif. Bagi pembawa LV yang direka untuk merawat penyakit saluran udara CF, meningkatkan masa kediaman zarah pembawa dalam saluran udara pengalir telah menjadi matlamat yang sukar difahami sehingga kini. Seperti yang ditunjukkan oleh Castellani et al., penggunaan medan magnet untuk meningkatkan transduksi mempunyai kelebihan berbanding kaedah penghantaran gen lain seperti elektroporasi, kerana ia boleh menggabungkan kesederhanaan, keberkesanan kos, penyetempatan penghantaran, peningkatan kecekapan dan masa pengeraman yang lebih pendek, dan mungkin dos pembawa yang lebih kecil10. Walau bagaimanapun, pemendapan dan tingkah laku zarah magnet in vivo dalam saluran udara di bawah pengaruh daya magnet luaran tidak pernah diterangkan, dan sebenarnya tidak dapat dilaksanakan kaedah ini telah ditunjukkan secara in vivo untuk meningkatkan tahap ekspresi gen dalam saluran udara hidup yang utuh.
Eksperimen PCXI sinkrotron in vitro kami menunjukkan bahawa semua zarah yang kami uji, kecuali polistirena MP, dapat dilihat dalam persediaan pengimejan yang kami gunakan. Dengan kehadiran medan magnet, MP membentuk rentetan yang panjangnya berkaitan dengan jenis zarah dan kekuatan medan magnet (iaitu jarak dan gerakan magnet). Seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 10, rentetan yang kami perhatikan terbentuk kerana setiap zarah individu dimagnetkan dan mendorong medan magnet tempatannya sendiri. Medan berasingan ini menyebabkan zarah lain yang serupa mengagregat dan bersambung, dengan gerakan seperti rentetan berkumpulan disebabkan oleh daya tempatan daripada daya tarikan dan tolakan tempatan zarah lain.
Skematik menunjukkan (a,b) tren zarah yang dihasilkan di dalam kapilari berisi bendalir dan (c,d) trakea berisi udara. Perhatikan bahawa kapilari dan trakea tidak dilukis mengikut skala. Panel (a) juga mengandungi penerangan tentang MP, yang mengandungi zarah Fe3O4 yang disusun dalam rentetan.
Apabila magnet digerakkan di atas kapilari, sudut rentetan zarah mencapai ambang kritikal untuk MP3-5 yang mengandungi Fe3O4, selepas itu rentetan zarah tidak lagi kekal pada kedudukan asal, tetapi bergerak di sepanjang permukaan ke kedudukan baharu. Magnet. Kesan ini mungkin berlaku kerana permukaan kapilari kaca cukup licin untuk membolehkan pergerakan ini berlaku. Menariknya, MP6 (CombiMag) tidak bertindak seperti ini, mungkin kerana zarah lebih kecil, mempunyai salutan atau cas permukaan yang berbeza, atau bendalir pembawa proprietari menjejaskan keupayaannya untuk bergerak. Kontras imej zarah CombiMag juga lebih lemah, menunjukkan bahawa bendalir dan zarah mungkin mempunyai ketumpatan yang sama dan oleh itu tidak mudah bergerak ke arah satu sama lain. Zarah juga boleh tersekat jika magnet bergerak terlalu pantas, menunjukkan bahawa kekuatan medan magnet tidak selalu dapat mengatasi geseran antara zarah dalam bendalir, menunjukkan bahawa mungkin tidak menghairankan bahawa kekuatan medan magnet dan jarak antara magnet dan kawasan sasaran sangat penting. Secara keseluruhan, keputusan ini juga menunjukkan bahawa, walaupun magnet boleh menangkap banyak MP yang mengalir melalui kawasan sasaran, magnet tidak mungkin boleh diandalkan. untuk menggerakkan zarah CombiMag di sepanjang permukaan trakea. Oleh itu, kami menyimpulkan bahawa kajian LV-MP in vivo harus menggunakan medan magnet statik untuk menyasarkan kawasan tertentu pada pokok saluran udara secara fizikal.
Apabila zarah dihantar ke dalam badan, ia sukar dikenal pasti dalam konteks tisu badan yang bergerak kompleks, tetapi keupayaan untuk mengesannya dipertingkatkan dengan menterjemahkan magnet secara mendatar di atas trakea untuk "menggoyangkan" tali MP. Walaupun pengimejan secara langsung adalah mungkin, adalah lebih mudah untuk membezakan pergerakan zarah sebaik sahaja haiwan itu dibunuh secara berperikemanusiaan. Kepekatan MP pada amnya tertinggi di lokasi ini apabila magnet diletakkan di atas kawasan pengimejan, walaupun beberapa zarah biasanya ditemui lebih jauh di sepanjang trakea. Berbeza dengan kajian in vitro, zarah tidak boleh diseret di sepanjang trakea dengan menterjemahkan magnet. Penemuan ini selaras dengan bagaimana lendir yang menyaluti permukaan trakea biasanya memproses zarah yang disedut, memerangkapnya dalam lendir dan seterusnya dibersihkan oleh mekanisme pembersihan mukosiliari.
Kami membuat hipotesis bahawa penggunaan magnet untuk tarikan di atas dan di bawah trakea (Rajah 3b) mungkin menghasilkan medan magnet yang lebih seragam, bukannya medan magnet yang sangat tertumpu pada satu titik, yang berpotensi membawa kepada taburan zarah yang lebih seragam. Walau bagaimanapun, kajian awal kami tidak menemui bukti yang jelas untuk menyokong hipotesis ini. Begitu juga, mengkonfigurasi sepasang magnet untuk menolak (Rajah 3c) tidak menghasilkan lebih banyak pemendapan zarah di kawasan yang diimejkan. Kedua-dua penemuan ini menunjukkan bahawa persediaan dwi-magnet tidak meningkatkan kawalan tempatan penargetan MP dengan ketara, dan daya magnet kuat yang terhasil sukar dikonfigurasikan, menjadikan pendekatan ini kurang praktikal. Begitu juga, mengorientasikan magnet di atas dan melalui trakea (Rajah 3d) juga tidak meningkatkan bilangan zarah yang tersimpan di kawasan yang diimejkan. Sebahagian daripada konfigurasi alternatif ini mungkin tidak berjaya kerana ia menghasilkan kekuatan medan magnet yang lebih rendah dalam kawasan pemendapan. Oleh itu, konfigurasi magnet sudut 30 darjah tunggal (Rajah 3a) dianggap sebagai kaedah yang paling mudah dan paling cekap untuk ujian in vivo.
Kajian LV-MP menunjukkan bahawa apabila vektor LV digabungkan dengan CombiMag dan dihantar selepas gangguan fizikal dengan kehadiran medan magnet, tahap transduksi meningkat dengan ketara dalam trakea berbanding kawalan. Berdasarkan kajian pengimejan sinkrotron dan keputusan LacZ, medan magnet nampaknya dapat memelihara LV dalam trakea dan mengurangkan bilangan zarah vektor yang segera menembusi jauh ke dalam paru-paru. Penambahbaikan penargetan sedemikian boleh membawa kepada keberkesanan yang lebih tinggi sambil mengurangkan titer yang dihantar, transduksi luar sasaran, kesan sampingan keradangan dan imun, dan kos pembawa gen. Yang penting, menurut pengilang, CombiMag boleh digunakan bersama dengan kaedah pemindahan gen lain, termasuk dengan vektor virus lain (seperti AAV) dan asid nukleik.