Terima kasih kerana melawati Nature.com.Versi penyemak imbas yang anda gunakan mempunyai sokongan terhad untuk CSS.Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan agar anda menggunakan penyemak imbas yang dikemas kini (atau matikan mod keserasian dalam Internet Explorer).Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan memaparkan tapak tanpa gaya dan JavaScript.
Vektor gen untuk rawatan penyakit paru-paru cystic fibrosis harus menyasarkan saluran udara konduktor kerana transduksi paru-paru periferi tidak memberikan manfaat terapeutik. Kecekapan transduksi virus secara langsung berkaitan dengan masa tinggal vektor. Walau bagaimanapun, cecair penghantaran seperti pembawa gen secara semula jadi meresap ke dalam alveoli semasa inspirasi, dan zarah terapeutik dalam sebarang bentuk disingkirkan dengan cepat oleh mucociliary time transport carriers. adalah penting tetapi sukar untuk dicapai.Zarah magnet konjugasi pembawa gen yang boleh diarahkan ke permukaan saluran udara boleh meningkatkan penyasaran serantau. Disebabkan cabaran visualisasi in vivo, tingkah laku zarah magnet yang kecil pada permukaan saluran udara dengan kehadiran medan magnet yang digunakan kurang difahami. Matlamat kajian ini adalah untuk menggunakan pengimejan siri magnetik trachea dalam siri vivo. tikus yang dibius untuk mengkaji dinamik dan corak tingkah laku zarah individu dan pukal dalam vivo. Kami kemudian juga menilai sama ada penghantaran zarah magnet lentiviral dengan kehadiran medan magnet akan meningkatkan kecekapan transduksi dalam trakea tikus. Pengimejan sinar-X Synchrotron mendedahkan kelakuan zarah magnet dalam medan magnet yang pegun dan bergerak dalam vitro dan udara yang bergerak dengan mudah di dalam udara dengan P dra dan udara dalam vivo. magnet, tetapi semasa pengangkutan, mendapan tertumpu pada medan pandangan di mana medan magnet paling kuat. Kecekapan transduksi juga meningkat enam kali ganda apabila zarah magnet lentiviral dihantar dengan kehadiran medan magnet. Bersama-sama, keputusan ini mencadangkan bahawa zarah magnet lentiviral dan medan magnet mungkin merupakan pendekatan yang berharga untuk meningkatkan penyasaran vektor gen dan meningkatkan tahap transduksi dalam menjalankan saluran udara dalam vivo.
Fibrosis kistik (CF) disebabkan oleh variasi dalam gen tunggal yang dipanggil pengawal selia konduktans transmembran CF (CFTR). Protein CFTR ialah saluran ion yang terdapat dalam banyak sel epitelium di seluruh badan, termasuk saluran udara konduktor, tapak utama patogenesis CF. Kecacatan CFTR membawa kepada pengangkutan air yang tidak normal, menyahhidratkan permukaan saluran udara dan mengurangkan cecair permukaan saluran udara (lapisan ASL) ini. menjejaskan keupayaan sistem pengangkutan mukosiliari (MCT) untuk membersihkan zarah dan patogen yang disedut daripada saluran pernafasan. Matlamat kami adalah untuk membangunkan terapi gen lentiviral (LV) untuk menyampaikan salinan gen CFTR yang betul dan meningkatkan kesihatan ASL, MCT dan paru-paru, serta untuk terus membangunkan teknologi baharu yang mampu mengukur parameter ini dalam vivo1.
Vektor LV ialah salah satu calon utama untuk terapi gen saluran udara CF, terutamanya kerana mereka boleh menyepadukan gen terapeutik secara kekal ke dalam sel basal saluran udara (sel stem saluran pernafasan). Ini penting kerana ia boleh memulihkan penghidratan normal dan pembersihan lendir dengan membezakan ke dalam sel permukaan saluran udara berkaitan CF yang diperbetulkan secara gen berfungsi, yang mengakibatkan konduktor CF secara langsung memberi manfaat kepada penyakit CF ini, sebagai vektor seumur hidup. bermula.Penyampaian vektor lebih dalam ke dalam paru-paru boleh mengakibatkan transduksi alveolar, tetapi ini tidak mempunyai faedah terapeutik dalam CF. Walau bagaimanapun, cecair seperti pembawa gen secara semula jadi berhijrah ke alveoli apabila diilhamkan selepas penghantaran3,4 dan zarah terapeutik dikeluarkan dengan cepat ke dalam rongga mulut oleh transduksi MCT.LV – transduksi selular kepada masa yang sesuai untuk mengekalkan kecekapan sel pada masa berikutnya untuk mengekalkan tempoh sel sasaran untuk kekal pada masa berikutnya. masa”5 – yang mudah dikurangkan oleh aliran udara serantau yang tipikal serta penangkapan lendir zarah yang diselaraskan dan MCT. Bagi CF, keupayaan untuk memanjangkan masa tinggal LV dalam saluran udara adalah penting untuk mencapai tahap transduksi yang tinggi di rantau ini, tetapi setakat ini adalah mencabar.
Untuk mengatasi halangan ini, kami mencadangkan bahawa zarah magnetik LV (MP) boleh membantu dalam dua cara yang saling melengkapi. Pertama, ia boleh dipandu secara magnetik ke permukaan saluran udara untuk meningkatkan penyasaran dan membantu zarah pembawa gen berada di kawasan saluran udara yang dikehendaki; dan ASL) untuk berpindah ke lapisan sel 6.MP telah digunakan secara meluas sebagai kenderaan penghantaran dadah yang disasarkan apabila ia mengikat antibodi, ubat kemoterapi atau molekul kecil lain yang melekat pada membran sel atau mengikat pada reseptor permukaan sel yang berkaitan dan terkumpul di tapak tumor dengan kehadiran elektrik statik. Medan Magnetik untuk Rawatan Kanser 7. Teknik "hiperterma" lain bertujuan untuk memanaskan Ahli Parlimen apabila mereka terdedah kepada medan magnet berayun, dengan itu memusnahkan sel-sel tumor. Prinsip pemindahan magnet, di mana medan magnet digunakan sebagai agen pemindahan untuk meningkatkan pemindahan DNA ke sel, biasanya digunakan secara in vitro menggunakan julat garis-garis gen bukan virus dan virus yang berkesan. magnetotransfection telah diwujudkan, dengan penghantaran in vitro LV-MPs ke garisan sel epitelium bronkial manusia dengan kehadiran medan magnet statik, meningkatkan kecekapan transduksi sebanyak 186 kali ganda berbanding dengan vektor LV sahaja. LV-MP juga telah digunakan pada model CF in vitro, di mana pemindahan magnetik meningkatkan transduksi LV dalam kultur antara muka cecair udara dalam 20 kali ganda sptum. vivo magnetotransfection organ telah mendapat sedikit perhatian dan hanya dinilai dalam beberapa kajian haiwan11,12,13,14,15, terutamanya dalam paru-paru16,17. Walau bagaimanapun, peluang untuk pemindahan magnet dalam terapi paru-paru CF adalah jelas. Tan et al.(2020) menyatakan bahawa "kajian pembuktian nanopartikel paru-paru yang cekap pada masa hadapan akan melalui kaedah penghantaran magnetik yang cekap. Strategi penyedutan CFTR untuk meningkatkan hasil klinikal dalam pesakit CF”6.
Tingkah laku zarah magnet kecil pada permukaan saluran udara dengan kehadiran medan magnet yang digunakan adalah sukar untuk divisualisasikan dan dikaji, dan oleh itu kurang difahami. Dalam kajian lain, kami membangunkan kaedah pengimejan sinar-X kontras fasa (PB-PCXI) berasaskan synchrotron-propagation untuk memvisualisasikan secara bukan invasif dan mengukur perubahan minit dalam vivo secara langsung dalam tingkah laku permukaan ASL19, dan kedalaman gas MCT19, Can2. dan digunakan sebagai penunjuk awal keberkesanan rawatan. Selain itu, kaedah penilaian MCT kami menggunakan zarah diameter 10–35 µm yang terdiri daripada alumina atau kaca indeks biasan tinggi sebagai penanda MCT yang boleh dilihat menggunakan PB-PCXI21. Kedua-dua teknik ini sesuai untuk visualisasi julat jenis zarah, termasuk MP.
Disebabkan resolusi spatial dan temporalnya yang tinggi, teknik analisis ASL dan MCT berasaskan PB-PCXI kami sangat sesuai untuk mengkaji dinamik dan corak tingkah laku zarah tunggal dan pukal dalam vivo untuk membantu kami memahami dan mengoptimumkan teknik penghantaran gen MP. Pendekatan yang kami gunakan di sini berasal daripada kajian kami menggunakan SPring-8 BL20B2 yang mengikut pergerakan cecair penghantaran dan vektor sham, di mana kami memancarkan dos penghantaran dan vektor visual. saluran pernafasan pulmonari tikus untuk membantu menjelaskan corak ekspresi gen tidak seragam kami yang diperhatikan dalam kajian haiwan dos pembawa gen kami 3,4 .
Matlamat kajian ini adalah untuk menggunakan synchrotron PB-PCXI untuk memvisualisasikan pergerakan in vivo satu siri Ahli Parlimen dalam trakea tikus hidup. Kajian pengimejan PB-PCXI ini direka untuk menguji pelbagai Ahli Parlimen, kekuatan medan magnet dan lokasi untuk menentukan kesannya terhadap gerakan MP. Kami membuat hipotesis bahawa kajian pengimejan PB-PCXI ini akan membantu mengekalkan medan magnet sasaran yang digunakan secara luaran. kami untuk mengenal pasti konfigurasi magnet yang memaksimumkan bilangan zarah yang dikekalkan dalam trakea selepas pemendapan. Dalam siri kajian kedua, kami berusaha untuk menggunakan konfigurasi optimum ini untuk menunjukkan corak transduksi yang terhasil daripada penghantaran in vivo LV-MP ke saluran udara tikus, berdasarkan andaian bahawa penghantaran LV-MP dalam konteks penyasaran saluran pernafasan akan menghasilkan kecekapan transduksi LV.
Semua kajian haiwan dilakukan mengikut protokol yang diluluskan oleh Universiti Adelaide (M-2019-060 dan M-2020-022) dan Jawatankuasa Etika Haiwan Synchrotron SPring-8. Eksperimen telah dilakukan mengikut garis panduan ARRIVE.
Semua pengimejan sinar-X telah dilakukan pada garis pancaran BL20XU di penyegerakan SPring-8 di Jepun, menggunakan persediaan yang serupa dengan yang diterangkan sebelum ini21,22. Secara ringkas, kotak eksperimen terletak 245 m dari cincin storan synchrotron. Jarak sampel-ke-pengesan 0.6 m digunakan untuk kajian pengimejan fasa vivo0.3 m dan dalam pengimejan zarah kontras. kesan. Tenaga pancaran monokromatik sebanyak 25 keV telah digunakan. Imej telah ditangkap menggunakan penukar sinar-X resolusi tinggi (SPring-8 BM3) digandingkan dengan pengesan sCMOS. Penukar menukar sinar-X kepada cahaya boleh dilihat menggunakan scintilator tebal 10 µm (Gd3Al2Ga3O12 mikroskop kemudiannya disambungkan ke penderia mikroskop langsung Gd3Al2Ga3O12). (NA 0.3). Pengesan sCMOS ialah Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Jepun) dengan saiz tatasusunan 2048 × 2048 piksel dan saiz piksel mentah 6.5 × 6.5 µm. Persediaan ini menghasilkan saiz piksel isotropik berkesan 0.51 µm × 1. lebih kurang paparan panjang dan medan paparan panjang 1.1 mm. 100 ms dipilih untuk memaksimumkan nisbah isyarat kepada hingar zarah magnet di dalam dan di luar saluran udara sambil meminimumkan artifak gerakan yang disebabkan oleh pernafasan. Untuk kajian in vivo, pengatup sinar-X yang pantas diletakkan di laluan sinar-X untuk mengehadkan dos sinaran dengan menyekat pancaran sinar-X antara dedahan.
Pembawa LV tidak digunakan dalam mana-mana kajian pengimejan SPring-8 PB-PCXI kerana kebuk pengimejan BL20XU tidak diperakui Tahap Biokeselamatan 2. Sebaliknya, kami memilih rangkaian Ahli Parlimen yang dicirikan dengan baik daripada dua pembekal komersial—merangkumi pelbagai saiz, bahan, kepekatan besi dan aplikasi—mula-mula untuk memahami pergerakan MP dan medan magnet dalam kapilari hidup. pada permukaan.MP bersaiz dari 0.25 hingga 18 μm dan diperbuat daripada pelbagai bahan (lihat Jadual 1), tetapi komposisi setiap sampel, termasuk saiz zarah magnet dalam MP, tidak diketahui. Berdasarkan kajian MCT kami yang meluas 19, 20, 21, 23, 24, kami menjangkakan bahawa MPs sekecil trem, contohnya 5 μm udara boleh dilihat pada permukaan trem. menolak bingkai berturut-turut untuk melihat keterlihatan dipertingkatkan gerakan MP. Satu MP bersaiz 0.25 μm adalah lebih kecil daripada resolusi peranti pengimejan, tetapi PB-PCXI dijangka dapat mengesan kontras volumnya dan gerakan cecair permukaan di mana ia dimendapkan selepas pemendapan.
Sampel bagi setiap MP dalam Jadual 1 telah disediakan dalam kapilari kaca 20 μl (Drummond Microcaps, PA, USA) dengan diameter dalam 0.63 mm. Zarah korpuskular boleh didapati dalam air, manakala zarah CombiMag tersedia dalam cecair proprietari pengeluar. Setiap tiub diisi separuh dengan cecair (kira-kira 11 μl gelas) dan (lihat pada pemegang sampel gelas) dan (lihat 11 μl botol). diletakkan secara mendatar pada peringkat sampel dalam kotak pengimejan, masing-masing, dan letakkan tepi bendalir. Magnet nikel berdiameter 19 mm (28 mm panjang) kulit nikel nadir bumi neodymium iron boron (NdFeB) (N35, kucing no. LM1652, Jaycar Electronics, Australia) dengan pemmagnetan sisa yang disambungkan pada peringkat jauh Tesla pada tahap penterjemahan 1.17 a. pengimejan.Pemerolehan imej sinar-X bermula apabila magnet diletakkan kira-kira 30 mm di atas sampel, dan imej diperoleh pada kadar 4 bingkai sesaat. Semasa pengimejan, magnet dibawa rapat dengan tiub kapilari kaca (kira-kira 1 mm jauhnya) dan kemudian diterjemahkan di sepanjang tiub untuk menilai kesan kekuatan medan dan kedudukan.
Persediaan pengimejan in vitro yang mengandungi sampel MP dalam kapilari kaca pada peringkat terjemahan xy sampel. Laluan pancaran X-ray ditandai dengan garis putus-putus merah.
Setelah keterlihatan in vitro Ahli Parlimen diwujudkan, subset daripada mereka telah diuji secara in vivo dalam tikus Wistar albino betina jenis liar (~12 minggu, ~200 g).0.24 mg/kg medetomidine (Domitor®, Zenoaq, Jepun), 3.2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellor phanol Pharma, Jepun) dan jitor phanol (Vkg) Seika) Tikus telah dibius dengan campuran Pharma), Jepun) dengan suntikan intraperitoneal.Selepas bius, mereka disediakan untuk pengimejan dengan membuang bulu di sekeliling trakea, memasukkan tiub endotrakeal (ET; 16 Ga iv kanula, Terumo BCT) dan melumpuhkan mereka terlentang di atas plat pengimejan terma2 yang dibuat khas pada plat pengimejan suhu2 yang dibuat khas. dilampirkan pada peringkat terjemahan sampel dalam kotak pengimejan pada sudut sedikit untuk menjajarkan trakea secara mendatar dalam imej sinar-X, seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 2a.
(a) Persediaan pengimejan in vivo dalam kotak pengimejan SPring-8, laluan pancaran sinar-X ditandakan dengan garis putus-putus merah.(b,c) Penyetempatan magnet pada trakea dilakukan dari jauh menggunakan dua kamera IP yang dipasang secara ortogon. Di sebelah kiri imej skrin, gelung wayar yang memegang kepala boleh dilihat di tempatnya, dan penghantaran dalam tiub ET dapat dilihat.
Sistem pam picagari kawalan jauh (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) menggunakan picagari kaca 100 μl telah disambungkan ke tiub PE10 (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) melalui jarum 30 Ga. Tandai tiub untuk memastikan bahawa hujungnya berada dalam kedudukan yang betul dalam tiub ET semasa memasukkan tiub ET. ditarik balik semasa hujung tiub direndam dalam sampel MP untuk dihantar. Tiub penghantaran yang dimuatkan kemudiannya dimasukkan ke dalam tiub endotrakeal, meletakkan hujung dalam bahagian terkuat medan magnet terpakai yang kami jangkakan. Pemerolehan imej dikawal menggunakan pengesan pernafasan yang disambungkan ke kotak pemasaan berasaskan Arduino kami, dan semua isyarat (cth. (AD Instruments, Sydney, Australia) 22. Apabila pengimejan Apabila kepungan tidak boleh diakses, dua kamera IP (Panasonic BB-SC382) diletakkan pada kira-kira 90° antara satu sama lain dan digunakan untuk memantau kedudukan magnet berbanding trakea semasa pengimejan (Gamb. 2b,c). Untuk meminimumkan artifak pergerakan plat penghujung imej telah diperolehi, satu artifak pergerakan plat hujung nafas.
Magnet dipasang pada peringkat kedua yang boleh terletak jauh dari luar perumah pengimejan. Pelbagai kedudukan dan konfigurasi magnet telah diuji, termasuk: Dipasang pada sudut kira-kira 30° di atas trakea (konfigurasi ditunjukkan dalam Rajah 2a dan 3a); satu magnet di atas haiwan dan satu lagi di bawah, dengan kutub ditetapkan untuk menarik (Rajah 3b); satu magnet di atas haiwan dan satu lagi di bawah, dengan kutub ditetapkan untuk menolak (Rajah 3c); dan satu magnet di atas dan berserenjang dengan trakea (Rajah 3d).Setelah haiwan dan magnet dikonfigurasikan dan MP yang akan diuji dimuatkan ke dalam pam picagari, hantarkan dos 50 μl pada kadar 4 μl/saat sambil memperoleh imej. Magnet kemudiannya digerakkan ke sana ke mari bersama-sama atau melintasi trakea sambil meneruskan imej.
Konfigurasi magnet untuk pengimejan in vivo (a) magnet tunggal di atas trakea pada sudut kira-kira 30°, (b) dua magnet ditetapkan untuk menarik, (c) dua magnet ditetapkan untuk menangkis, (d) magnet tunggal di atas dan berserenjang di trakea. Pemerhati melihat ke bawah dari mulut ke paru-paru melalui trakea, dan pancaran sisi X-ray ke kiri melalui sinar-X. magnet sama ada digerakkan sepanjang saluran udara atau kiri dan kanan di atas trakea ke arah pancaran sinar-X.
Kami juga berusaha untuk menentukan keterlihatan dan kelakuan zarah dalam saluran udara tanpa ketiadaan pernafasan yang membingungkan dan gerakan jantung.Oleh itu, pada penghujung tempoh pengimejan, haiwan dibunuh secara manusiawi untuk dos berlebihan pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, Amerika Syarikat; ~ 65 mg/kg ip, dan beberapa haiwan pengimejan dihentikan pada platform pernafasan dan jantung sekali dihentikan). proses diulang, menambah dos tambahan MP jika tiada MP kelihatan pada permukaan saluran udara.
Imej yang diperoleh adalah medan rata dan medan gelap dibetulkan dan kemudian dipasang menjadi filem (20 bingkai sesaat; 15-25 × kelajuan normal bergantung pada kadar pernafasan) menggunakan skrip tersuai yang ditulis dalam MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Semua kajian penghantaran vektor gen LV telah dijalankan di Fasiliti Penyelidikan Haiwan Makmal di Universiti Adelaide dan bertujuan untuk menggunakan keputusan eksperimen SPring-8 untuk menilai sama ada penghantaran LV-MP dengan kehadiran medan magnet boleh meningkatkan pemindahan gen dalam vivo. Untuk menilai kesan MP dan medan magnet, dua kumpulan haiwan telah dirawat: satu kumpulan diberi LV-MP dengan magnet diletakkan kumpulan tanpa magnet, dan kumpulan lain menerima magnet tanpa magnet.
Vektor gen LV dijana menggunakan kaedah yang diterangkan sebelum ini 25, 26 .Vektor LacZ mengekspresikan gen beta-galactosidase setempat nuklear yang didorong oleh promoter MPSV konstitutif (LV-LacZ), yang menghasilkan produk tindak balas biru dalam sel transduksi, boleh dilihat pada bahagian hadapan tisu paru-paru dan bahagian tisu. Titrasi dilakukan dalam kultur sel Laccy positif dengan pengiraan bilangan sel secara manual dengan pengiraan sel-sel hemometer Laccy positif. titer dalam TU/ml. Pembawa dipelihara pada -80 °C, dicairkan sebelum digunakan, dan diikat pada CombiMag dengan mencampurkan pada nisbah 1:1 dan mengeram pada ais selama sekurang-kurangnya 30 minit sebelum penghantaran.
Tikus Sprague Dawley biasa (n = 3/kumpulan, ~2-3 telah dibius secara intraperitoneal dengan campuran 0.4 mg/kg medetomidine (Domitor, Ilium, Australia) dan 60 mg/kg ketamin (Ilium, Australia) bulan) ip) suntikan dan kanulasi oral tanpa pembedahan dengan 16 Ga iv untuk memastikan transnulasi saluran udara 16 Ga iv dapat menerima tisu transnulasi. ia telah dikondisikan menggunakan protokol gangguan mekanikal yang telah diterangkan sebelum ini, di mana permukaan saluran pernafasan trakea digosok secara paksi dengan bakul dawai (N-Circle, Pengekstrak Batu Tanpa Tip Nitinol NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, USA) 30 s28.Pentadbiran trakea LV-MP kemudiannya dilakukan dalam kabinet keselamatan perturbologi kira-kira 10 minit selepas itu.
Medan magnet yang digunakan dalam eksperimen ini telah dikonfigurasikan dengan cara yang sama dengan kajian pengimejan sinar-X in vivo, dengan magnet yang sama dipegang di atas trakea menggunakan klip stent penyulingan (Rajah 4). Isipadu 50 μl (2 × 25 μl aliquot) LV-MP dihantar ke dalam trakea (n = 3 haiwan kawalan yang diterangkan a) 3 haiwan) menerima LV-MP yang sama tanpa menggunakan magnet. Selepas infusi selesai, kanula dikeluarkan dari tiub ET dan haiwan itu diekstubasi. Magnet kekal di tempatnya selama 10 minit, kemudian ia dikeluarkan. Tikus menerima dos subkutaneus meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Australia) diikuti dengan pembalikan suntikan hidropam1zol mg/kgklorozol dengan anestesia. (Antisedan, Zoetis, Australia). Tikus disimpan dalam keadaan hangat dan dipantau sehingga pulih sepenuhnya daripada bius.
Peranti penghantaran LV-MP dalam kabinet keselamatan biologi. Hab Luer kelabu muda tiub ET boleh dilihat terkeluar dari mulut dan hujung gel pipet yang ditunjukkan dalam gambar dimasukkan melalui tiub ET ke kedalaman yang dikehendaki ke dalam trakea.
Seminggu selepas prosedur dos LV-MP, haiwan dibunuh secara manusia melalui penyedutan CO2 100% dan ekspresi LacZ dinilai menggunakan rawatan X-gal standard kami. Tiga gelang paling bercabang ekor telah dikeluarkan untuk memastikan bahawa sebarang kerosakan mekanikal atau pengekalan cecair daripada penempatan tiub endotrakeal tidak termasuk dalam analisis. Setiap trakea dipotong secara membujur untuk dianalisis, dalam dua ia dipotong secara membujur untuk membuat silikon. (Sylgard, Dow Inc) menggunakan jarum Minutien (Alat Sains Halus) untuk memvisualisasikan permukaan luminal. Taburan dan corak sel transduksi telah disahkan oleh fotografi hadapan menggunakan mikroskop Nikon (SMZ1500) dengan kamera DigiLite dan perisian TCapture (Tucsen Photonics, China).Imej diperolehi pada penetapan 20x penuh (termasuk pembesaran trache penuh) panjang trakea yang diimej langkah demi langkah, memastikan pertindihan yang mencukupi antara setiap imej untuk membolehkan imej "jahitan". Imej daripada setiap trakea kemudiannya dipasang ke dalam imej komposit tunggal menggunakan Editor Komposit Imej v2.0.3 (Microsoft Research) menggunakan algoritma gerakan satah. Kawasan ekspresi LacZ dalam imej komposit MAT haiwan telah ditrakea secara automatik daripada setiap skrip MAT haiwan yang telah ditrakea. (R2020a, MathWorks) seperti yang diterangkan sebelum ini, menggunakan tetapan 0.35 < Hue < 0.58, Ketepuan > 0.15, dan Nilai < 0.7. Dengan mengesan kontur tisu, topeng dijana secara manual dalam GIMP v2.10.24 untuk setiap imej komposit untuk mengelakkan sebarang kawasan pengesanan tisu palsu dari luar dan dari luar. imej komposit daripada setiap haiwan dijumlahkan untuk menjana jumlah kawasan bernoda bagi haiwan tersebut. Kawasan bernoda kemudiannya dibahagikan dengan jumlah kawasan topeng untuk menjana kawasan ternormal.
Setiap trakea dibenamkan dalam parafin dan bahagian 5 μm dipotong. Bahagian telah diwarnakan balas dengan merah cepat neutral selama 5 minit dan imej diperoleh menggunakan mikroskop Nikon Eclipse E400, kamera DS-Fi3 dan perisian penangkapan elemen NIS (versi 5.20.00).
Semua analisis statistik dilakukan dalam GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Kepentingan statistik ditetapkan pada p ≤ 0.05. Normaliti telah disahkan menggunakan ujian Shapiro-Wilk, dan perbezaan dalam pewarnaan LacZ dinilai menggunakan ujian-t tidak berpasangan.
Enam Ahli Parlimen yang diterangkan dalam Jadual 1 telah diperiksa menggunakan PCXI, dan keterlihatan diterangkan dalam Jadual 2. Dua MP polistirena (MP1 dan MP2; 18 μm dan 0.25 μm, masing-masing) tidak kelihatan di bawah PCXI, tetapi sampel selebihnya boleh dikenal pasti (contoh ditunjukkan dalam Rajah 1MP3-O1 % 5). 0.25 μm dan 0.9 μm, masing-masing) kelihatan samar-samar. Walaupun mengandungi beberapa zarah terkecil yang diuji, MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) adalah yang paling ketara. Produk CombiMag MP6 sukar dikesan. Dalam semua kes, keupayaan kami untuk mengesan magnet parapillary. transW. dipertingkatkan dengan ketara oleh MP6. magnet bergerak menjauhi kapilari, zarah dilanjutkan dalam rentetan panjang, tetapi apabila magnet semakin dekat dan kekuatan medan magnet meningkat, rentetan zarah dipendekkan apabila zarah berhijrah ke arah permukaan atas kapilari (lihat Video Tambahan S1: MP4), meningkatkan Ketumpatan zarah permukaan. Sebaliknya, apabila magnet dikeluarkan dari kapilari dan rentetan medan panjang rentetan permukaan berkurangan ke permukaan MP yang panjang. kapilari (lihat Video Tambahan S2:MP4).Selepas magnet berhenti bergerak, zarah terus bergerak untuk masa yang singkat selepas mencapai kedudukan keseimbangan. Apabila MP bergerak ke arah dan menjauhi permukaan atas kapilari, zarah magnet biasanya menyeret serpihan melalui bendalir.
Keterlihatan MP di bawah PCXI berbeza dengan ketara antara sampel.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 dan (d) MP6. Semua imej yang ditunjukkan di sini diambil dengan magnet yang terletak kira-kira 10 mm betul-betul di atas kapilari. Bulatan besar yang ketara adalah gelembung udara yang terperangkap dalam kapilari, menunjukkan dengan jelas ciri tepi kotak hitam dan putih kontras fasa kontras merah. pembesaran.Perhatikan bahawa diameter skema magnet dalam semua rajah tidak mengikut skala dan lebih kurang 100 kali lebih besar daripada yang ditunjukkan.
Apabila magnet diterjemah ke kiri dan ke kanan di sepanjang bahagian atas kapilari, sudut rentetan MP berubah untuk diselaraskan dengan magnet (lihat Rajah 6), sekali gus menggambarkan garis medan magnet. Untuk MP3-5, selepas kord mencapai sudut ambang, zarah diseret di sepanjang permukaan atas kapilari. Ini selalunya mengakibatkan MP berkumpulan ke dalam kumpulan medan magnet yang lebih besar hampir kepada kumpulan tambahan magnet yang lebih besar. S3:MP5).Ini juga amat ketara apabila pengimejan berhampiran dengan hujung kapilari, yang menyebabkan ahli parlimen berkumpul dan menumpukan perhatian pada antara muka bendalir-udara. Zarah dalam MP6, yang lebih sukar untuk dibezakan daripada MP3-5, tidak diseret semasa magnet bergerak di sepanjang kapilari, tetapi rentetan MP tercerai dalam medan tambahan S4, meninggalkan sebahagian daripada paparan SMP6 (lihat zarah tambahan S4). kes, apabila medan magnet yang digunakan dikurangkan dengan menggerakkan magnet pada jarak yang jauh dari lokasi pengimejan, mana-mana Ahli Parlimen yang tinggal perlahan-lahan turun ke permukaan bawah tiub dengan graviti sambil kekal dalam rentetan (lihat Video Tambahan S5: MP3).
Sudut rentetan MP berubah apabila magnet diterjemahkan ke kanan di atas kapilari.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 dan (d) MP6.Kotak merah mengandungi pembesaran mempertingkatkan kontras.Perhatikan bahawa video tambahan adalah bermaklumat kerana ia mendedahkan struktur zarah penting dan maklumat dinamik yang tidak dapat digambarkan dalam imej statik ini.
Ujian kami menunjukkan bahawa menggerakkan magnet secara perlahan-lahan ke depan dan ke belakang di sepanjang trakea memudahkan visualisasi MP dalam konteks pergerakan kompleks dalam vivo. Ujian in vivo tidak dilakukan kerana manik polistirena (MP1 dan MP2) tidak kelihatan dalam kapilari. Setiap baki empat MP telah diuji dalam vivo dengan paksi panjang magnet dikonfigurasikan di atas trakea 3° dan dikonfigurasikan pada sudut tegak 3°b. 3a), kerana ini menghasilkan rantai MP yang lebih panjang dan lebih berkesan daripada konfigurasi magnet yang ditamatkan. MP3, MP4 dan MP6 tidak dikesan dalam trakea mana-mana haiwan hidup. Apabila saluran udara tikus diimej selepas haiwan dibunuh secara manusia, zarah-zarah tersebut kekal tidak kelihatan walaupun isipadu tambahan ditambah menggunakan pam picagari dan oleh itu, MP5 mempunyai kandungan yang paling tinggi, dan oleh itu hanya kandungan zat besi yang boleh dilihat. tingkah laku vivo MP.
Meletakkan magnet di atas trakea semasa penghantaran MP menyebabkan ramai, tetapi tidak semua, Ahli Parlimen tertumpu pada bidang pandangan. Zarah-zarah yang memasuki trakea paling baik diperhatikan dalam haiwan yang dikorbankan secara manusiawi. Rajah 7 dan Video Tambahan S6: MP5 menunjukkan tangkapan magnet pantas dan penjajaran zarah pada permukaan trakea ventral yang diingini, menunjukkan bahawa kawasan trakea ventral diingini. mencari lebih jauh di sepanjang trakea selepas penghantaran MP, beberapa Ahli Parlimen ditemui lebih dekat dengan carina, menunjukkan bahawa kekuatan medan magnet tidak mencukupi untuk mengumpul dan mengekalkan semua Ahli Parlimen, kerana mereka dihantar melalui kawasan kekuatan medan magnet maksimum semasa proses bendalir. Walau bagaimanapun, kepekatan MP selepas bersalin lebih tinggi di sekitar kawasan yang diimej, menunjukkan bahawa banyak ahli Parlimen kekal di kawasan kekuatan medan magnet yang paling tinggi.
Imej daripada (a) sebelum dan (b) selepas penghantaran MP5 ke dalam trakea tikus yang baru dieuthanakan dengan kedudukan magnet betul-betul di atas kawasan pengimejan. Kawasan yang diimej terletak di antara dua gelang rawan. Sebelum penghantaran MP, terdapat sedikit cecair dalam saluran pernafasan. Kotak merah mengandungi pembesaran yang meningkatkan kontras. Imej ini adalah daripada video S6 Tambahan:
Menterjemahkan magnet di sepanjang trakea dalam vivo menyebabkan rantai MP menukar sudut dalam permukaan saluran udara dengan cara yang sama seperti yang dilihat dalam kapilari (lihat Rajah 8 dan Video Tambahan S7:MP5). Walau bagaimanapun, dalam kajian kami, Ahli Parlimen tidak boleh diseret sepanjang permukaan saluran pernafasan seperti yang boleh dilakukan dengan kapilari. Dalam beberapa kes, rantai MP akan bergerak lebih panjang ke kiri dan ke kanan. rentetan zarah kelihatan mengubah kedalaman lapisan bendalir permukaan apabila magnet digerakkan secara membujur sepanjang trakea, dan mengembang apabila magnet digerakkan terus ke atas dan rentetan zarah diputar ke kedudukan menegak (lihat Video Tambahan S7). : MP5 pada 0:09, bawah kanan). Corak ciri pergerakan berubah apabila magnet diterjemah merentasi bahagian atas trakea secara menyamping (iaitu, ke kiri atau kanan haiwan dan bukannya sepanjang trakea). Zarah-zarah masih kelihatan dengan jelas semasa ia bergerak, tetapi apabila magnet dikeluarkan dari trakea, hujung rentetan zarah menjadi kelihatan pada S:8MP5 ini. konsisten dengan tingkah laku MP yang kami perhatikan di bawah medan magnet yang digunakan dalam kapilari kaca.
Contoh imej yang menunjukkan MP5 dalam trakea tikus bius hidup.(a) Magnet digunakan untuk memperoleh imej di atas dan di sebelah kiri trakea, kemudian (b) selepas magnet dialihkan ke kanan. Kotak merah mengandungi pembesaran yang meningkatkan kontras. Imej ini adalah daripada video yang ditunjukkan dalam Video Tambahan S7:MP5.
Apabila kedua-dua kutub dikonfigurasikan dalam orientasi utara-selatan di atas dan di bawah trakea (iaitu menarik; Rajah 3b), kord MP kelihatan lebih panjang dan terletak pada dinding sisi trakea dan bukannya pada permukaan trakea dorsal (lihat Video Tambahan S9:MP5). Walau bagaimanapun, kepekatan zarah yang tinggi pada satu lokasi dorsala tidak dikesan (iaitu) apabila bendalir dorsala dikesan selepas satu permukaan trakea (iaitu) penghantaran. peranti dwi-magnet telah digunakan, yang biasanya berlaku apabila peranti magnet tunggal digunakan. Kemudian apabila satu magnet dikonfigurasikan untuk menangkis kutub diterbalikkan (Rajah 3c), bilangan zarah yang boleh dilihat dalam medan pandangan tidak kelihatan meningkat selepas penghantaran. Persediaan kedua-dua konfigurasi dwi-magnet adalah mencabar disebabkan oleh kekuatan medan magnet yang tinggi, yang kemudiannya telah ditukar kepada persediaan medan magnet yang tinggi. ke saluran udara tetapi melalui saluran udara pada 90 darjah supaya garis medan melintasi dinding trakea secara ortogon (Gamb. 3d), orientasi yang direka untuk menentukan sama ada pengagregatan zarah pada dinding sisi boleh diperhatikan. Walau bagaimanapun, dalam konfigurasi ini, tiada pergerakan pengumpulan MP atau pergerakan konfigurasi magnet yang boleh dikenal pasti. 3a) telah dipilih untuk kajian pembawa gen vivo.
Apabila haiwan itu diimej berulang kali sejurus selepas pembunuhan berperikemanusiaan, ketiadaan gerakan tisu yang mengelirukan bermakna garis zarah yang lebih halus dan lebih pendek dapat dilihat dalam medan interchondral yang jelas, "goyang" selaras dengan gerakan translasi magnet. Namun begitu, masih tidak dapat melihat dengan jelas kehadiran dan pergerakan zarah MP6.
Titer LV-LacZ ialah 1.8 × 108 TU/ml, dan selepas pencampuran 1:1 dengan CombiMag MP (MP6), haiwan menerima dos trakea 50 μl kenderaan LV 9 × 107 TU/ml (iaitu 4.5 × 106 TU/tikus). ).Dalam kajian ini, bukannya menterjemah magnet semasa bersalin, kami membetulkan magnet dalam satu kedudukan untuk menentukan sama ada transduksi LV (a) boleh dipertingkatkan berbanding penghantaran vektor tanpa adanya medan magnet, dan (b) boleh difokuskan Sel-sel saluran udara ditransduksi ke kawasan sasaran magnetik saluran pernafasan atas.
Kehadiran magnet dan penggunaan CombiMag digabungkan dengan vektor LV nampaknya tidak mempunyai kesan buruk terhadap kesihatan haiwan, begitu juga dengan protokol penghantaran vektor LV standard kami. Imej hadapan kawasan trakea yang mengalami gangguan mekanikal (Tambahan Rajah 1) menunjukkan bahawa terdapat tahap transduksi yang jauh lebih tinggi dalam kumpulan haiwan yang dirawat dengan LV-MP. pewarnaan terdapat dalam kumpulan kawalan (Rajah 9b). Kuantifikasi kawasan bernoda X-Gal yang dinormalkan menunjukkan bahawa pentadbiran LV-MP dengan kehadiran medan magnet menghasilkan peningkatan kira-kira 6 kali ganda (Rajah 9c).
Contoh imej komposit yang menunjukkan transduksi trakea oleh LV-MP (a) dengan kehadiran medan magnet dan (b) tanpa ketiadaan magnet.(c) Peningkatan ketara secara statistik dalam kawasan transduksi LacZ ternormal dalam trakea apabila menggunakan magnet (*p = 0.029, ujian-t, n = 3 setiap kumpulan, min ± SEM).
Bahagian bernoda merah cepat neutral (contoh ditunjukkan dalam Rajah Tambahan 2) menunjukkan sel bernoda LacZ hadir dalam corak dan lokasi yang sama seperti yang dilaporkan sebelum ini.
Cabaran utama untuk terapi gen saluran pernafasan kekal sebagai penyetempatan tepat zarah pembawa ke kawasan yang diminati dan mencapai tahap kecekapan transduksi yang tinggi dalam paru-paru yang bergerak dengan adanya aliran udara dan pelepasan lendir aktif. Bagi pembawa LV yang direka untuk merawat penyakit saluran pernafasan CF, meningkatkan masa tinggal zarah pembawa dalam saluran udara pengalir telah menjadi matlamat yang sukar difahami sehingga kini oleh medan magnet yang sukar difahami oleh Castellani. transduksi mempunyai kelebihan berbanding kaedah penghantaran gen lain seperti elektroporasi, kerana ia boleh menggabungkan kesederhanaan, keberkesanan kos, penyetempatan penghantaran, peningkatan kecekapan, dan masa inkubasi yang lebih pendek, dan mungkin dos pembawa yang lebih kecil10. Walau bagaimanapun, pemendapan in vivo dan tingkah laku zarah magnet dalam saluran udara di bawah pengaruh daya magnet luaran untuk ekspresi vivo sebenarnya tidak pernah diterangkan, tiada kebolehpercayaan kaedah vivo yang dipertingkatkan. dalam saluran udara hidup yang utuh.
Eksperimen in vitro synchrotron PCXI kami menunjukkan bahawa semua zarah yang kami uji, kecuali polistirena MP, boleh dilihat dalam persediaan pengimejan yang kami gunakan. Dengan adanya medan magnet, MP membentuk rentetan yang panjangnya berkaitan dengan jenis zarah dan kekuatan medan magnet (iaitu kedekatan dan pergerakan magnet). medan.Medan berasingan ini menyebabkan zarah lain yang serupa berkumpul dan bersambung, dengan gerakan seperti rentetan kumpulan disebabkan oleh daya tempatan daripada daya tarikan tempatan dan daya tolakan zarah lain.
Skema menunjukkan (a,b) kereta api zarah yang dijana di dalam kapilari berisi bendalir dan (c,d) trakea berisi udara.Perhatikan bahawa kapilari dan trakea tidak dilukis mengikut skala.Panel (a) juga mengandungi perihalan MP, yang mengandungi zarah Fe3O4 yang disusun dalam rentetan.
Apabila magnet digerakkan di atas kapilari, sudut rentetan zarah mencapai ambang kritikal untuk MP3-5 yang mengandungi Fe3O4, selepas itu rentetan zarah tidak lagi kekal dalam kedudukan asal, tetapi bergerak di sepanjang permukaan ke kedudukan baru.magnet.Kesan ini berkemungkinan berlaku kerana permukaan kapilari kaca cukup licin untuk membolehkan pergerakan ini berlaku. Menariknya, cara ini adalah tidak, MP6SibHab (beserta Magnet). lebih kecil, mempunyai salutan atau cas permukaan yang berbeza, atau bendalir pembawa proprietari menjejaskan keupayaan mereka untuk bergerak. Kontras imej zarah CombiMag juga lebih lemah, menunjukkan bahawa bendalir dan zarah mungkin mempunyai ketumpatan yang sama dan oleh itu tidak mudah bergerak ke arah satu sama lain. Zarah juga boleh tersekat jika magnet bergerak terlalu cepat, menunjukkan bahawa kekuatan medan magnet tidak selalu dapat mengatasi geseran di antara bendalir, yang mungkin tidak dapat mengatasi kekuatan medan magnet. kekuatan medan magnet dan jarak antara magnet dan kawasan sasaran Sangat penting.Secara bersama-sama, keputusan ini juga mencadangkan bahawa, sementara magnet boleh menangkap banyak Ahli Parlimen yang mengalir melalui kawasan sasaran, tidak mungkin magnet boleh dipercayai untuk menggerakkan zarah CombiMag di sepanjang permukaan trakea.Oleh itu, kami menyimpulkan bahawa kajian in vivo LV-MP harus menggunakan kawasan magnet sasaran khusus udara statik.
Apabila zarah dihantar dalam badan, ia sukar dikenal pasti dalam konteks tisu badan bergerak yang kompleks, tetapi keupayaan untuk mengesannya telah dipertingkatkan dengan menterjemah magnet secara mendatar di atas trakea untuk "menggoyangkan" rentetan MP. Walaupun pengimejan secara langsung boleh dilakukan, adalah lebih mudah untuk membezakan pergerakan zarah setelah haiwan itu dibunuh secara manusiawi. Kepekatan MP secara amnya adalah paling tinggi di sepanjang lokasi magnet di lokasi ini, walaupun beberapa kepekatan zarah biasanya lebih tinggi di lokasi ini apabila magnet berada di atas lokasi ini. trakea.Berbeza dengan kajian in vitro, zarah tidak boleh diseret sepanjang trakea dengan menterjemah magnet. Penemuan ini konsisten dengan bagaimana lendir yang melapisi permukaan trakea lazimnya memproses zarah yang disedut, memerangkapnya dalam lendir dan seterusnya dibersihkan oleh mekanisme pembersihan mukosiliari.
Kami membuat hipotesis bahawa penggunaan magnet untuk tarikan di atas dan di bawah trakea (Rajah 3b) mungkin menghasilkan medan magnet yang lebih seragam, dan bukannya medan magnet yang sangat tertumpu pada satu titik, yang berpotensi membawa kepada pengedaran zarah yang lebih seragam. Walau bagaimanapun, kajian awal kami tidak menemui bukti yang jelas untuk menyokong hipotesis ini. Begitu juga, mengkonfigurasi sepasang magnet tidak menghasilkan lebih banyak magnet (3) pemendapan dalam kawasan yang diimej. Kedua-dua penemuan ini menunjukkan bahawa persediaan dwi-magnet tidak meningkatkan kawalan tempatan ke atas penyasaran MP dengan ketara, dan bahawa daya magnet kuat yang terhasil sukar untuk dikonfigurasikan, menjadikan pendekatan ini kurang praktikal. Begitu juga, mengorientasikan magnet di atas dan melalui trakea (Rajah 3d) juga tidak meningkatkan bilangan zarah yang dikekalkan dalam medan magnet yang diimejkan mungkin lebih rendah kerana ia mungkin tidak menghasilkan konfigurasi medan magnet yang lebih rendah kerana ia mungkin tidak berjaya dalam konfigurasi medan magnet ini. dalam kawasan pemendapan.Oleh itu, konfigurasi magnet sudut 30 darjah tunggal (Rajah 3a) dianggap kaedah yang paling mudah dan paling berkesan untuk ujian in vivo.
Kajian LV-MP menunjukkan bahawa apabila vektor LV digabungkan dengan CombiMag dan dihantar selepas gangguan fizikal dengan kehadiran medan magnet, tahap transduksi meningkat dengan ketara dalam trakea berbanding dengan kawalan. Berdasarkan kajian pengimejan synchrotron dan keputusan LacZ, medan magnet nampaknya dapat mengekalkan LV dalam trakea dan mengurangkan bilangan vektor sasaran yang menembusi dengan serta-merta. membawa kepada keberkesanan yang lebih tinggi sambil mengurangkan titer yang dihantar, transduksi luar sasaran, kesan sampingan keradangan dan imun, dan kos pembawa gen.Yang penting, menurut pengilang, CombiMag boleh digunakan bersama dengan kaedah pemindahan gen lain, termasuk dengan vektor virus lain (seperti AAV) dan asid nukleik.