Diolch i chi am ymweld â Nature.com. Mae gan y fersiwn porwr rydych chi'n ei ddefnyddio gefnogaeth gyfyngedig ar gyfer CSS. I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod chi'n defnyddio porwr wedi'i ddiweddaru (neu'n diffodd y modd cydnawsedd yn Internet Explorer). Yn y cyfamser, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, byddwn yn arddangos y wefan heb arddulliau a JavaScript.
Dylai fectorau genynnau ar gyfer trin clefyd yr ysgyfaint ffibrosis systig dargedu'r llwybrau anadlu dargludol oherwydd nad yw trawsgludiad ysgyfaint ymylol yn darparu budd therapiwtig. Mae effeithlonrwydd trawsgludiad firaol yn uniongyrchol gysylltiedig ag amser preswylio'r fector. Fodd bynnag, mae hylifau dosbarthu fel cludwyr genynnau yn tryledu'n naturiol i'r alfeoli yn ystod anadlu, ac mae gronynnau therapiwtig o unrhyw ffurf yn cael eu clirio'n gyflym trwy gludiant mwcociliary. Mae ymestyn amser preswylio cludwyr genynnau yn y llwybrau anadlu yn bwysig ond yn anodd ei gyflawni. Gall gronynnau magnetig cysylltiedig â chludwr genynnau y gellir eu cyfeirio at wyneb y llwybrau anadlu wella targedu rhanbarthol. Oherwydd heriau delweddu in vivo, mae ymddygiad gronynnau magnetig mor fach ar wyneb y llwybr anadlu ym mhresenoldeb maes magnetig cymhwysol wedi'i ddeall yn wael. Nod yr astudiaeth hon oedd defnyddio delweddu synchrotron i ddelweddu symudiad in vivo cyfres o ronynnau magnetig yn nhrachea llygod mawr wedi'u hanestheteiddio i archwilio dynameg a phatrymau ymddygiad gronynnau unigol a swmp in vivo. Yna fe wnaethom asesu hefyd a fyddai dosbarthu gronynnau magnetig lentiviral ym mhresenoldeb maes magnetig yn cynyddu effeithlonrwydd trawsgludiad yn y llygoden fawr. trachea.Mae delweddu pelydr-X synchrotron yn datgelu ymddygiad gronynnau magnetig mewn meysydd magnetig llonydd a symudol in vitro ac in vivo.Ni ellir llusgo gronynnau'n hawdd ar hyd wyneb y llwybr anadlu byw gyda magnetau, ond yn ystod cludiant, mae'r dyddodion wedi'u crynhoi yn y maes golygfa lle mae'r maes magnetig ar ei gryfaf.Cynyddwyd effeithlonrwydd trawsgludiad chwe gwaith hefyd pan ddanfonwyd gronynnau magnetig lentivirol ym mhresenoldeb maes magnetig.Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y gallai gronynnau magnetig lentivirol a meysydd magnetig fod yn ddulliau gwerthfawr i wella targedu fector genynnau a chynyddu lefelau trawsgludiad mewn llwybrau anadlu dargludol in vivo.
Mae ffibrosis systig (CF) yn cael ei achosi gan amrywiad mewn un genyn o'r enw'r rheolydd dargludedd trawsbilen CF (CFTR). Mae'r protein CFTR yn sianel ïon sy'n bresennol mewn llawer o gelloedd epithelaidd ledled y corff, gan gynnwys y llwybrau anadlu dargludol, prif safle pathogenesis CF. Mae diffygion CFTR yn arwain at gludiant dŵr annormal, gan ddadhydradu wyneb y llwybr anadlu a lleihau dyfnder haen hylif wyneb y llwybr anadlu (ASL). Mae hyn hefyd yn amharu ar allu'r system cludo mwcociliary (MCT) i glirio gronynnau a phathogenau a anadlir o'r llwybrau anadlu. Ein nod yw datblygu therapi genynnau lentiviral (LV) i gyflwyno'r copi cywir o'r genyn CFTR a gwella iechyd ASL, MCT, ac ysgyfaint, a pharhau i ddatblygu technolegau newydd sy'n gallu mesur y paramedrau hyn in vivo1.
Mae fectorau LV yn un o'r prif ymgeiswyr ar gyfer therapi genynnau llwybr anadlu CF, yn bennaf oherwydd gallant integreiddio'r genyn therapiwtig yn barhaol i gelloedd gwaelodol y llwybr anadlu (celloedd bonyn llwybr anadlu). Mae hyn yn bwysig oherwydd gallant adfer hydradiad arferol a chlirio mwcws trwy wahaniaethu i gelloedd arwyneb llwybr anadlu sy'n gysylltiedig â CF sy'n cael eu cywiro gan enynnau swyddogaethol, gan arwain at fuddion gydol oes. Dylid cyfeirio fectorau LV yn erbyn y llwybr anadlu dargludol, gan mai dyma lle mae clefyd yr ysgyfaint CF yn dechrau. Gall cyflwyno'r fector yn ddyfnach i'r ysgyfaint arwain at drawsgludiad alfeolaidd, ond nid oes gan hyn unrhyw fudd therapiwtig mewn CF. Fodd bynnag, mae hylifau fel cludwyr genynnau yn mudo'n naturiol i'r alfeoli ar ôl anadlu ar ôl cyflwyno3,4 ac mae gronynnau therapiwtig yn cael eu clirio'n gyflym i'r ceudod llafar gan MCT. Mae effeithlonrwydd trawsgludiad LV yn uniongyrchol gysylltiedig â hyd yr amser y mae'r fector yn aros wrth ymyl celloedd targed i ganiatáu amsugno cellog - yr "amser preswylio"5 - sy'n cael ei leihau'n hawdd gan lif aer rhanbarthol nodweddiadol yn ogystal â dal mwcws gronynnau cydlynol a MCT. Ar gyfer CF, mae'r gallu i ymestyn amser preswylio'r LV o fewn y llwybr anadlu yn bwysig i gyflawni lefelau uchel o drawsgludiad yn y rhanbarth hwn, ond hyd yn hyn mae wedi bod yn heriol.
I oresgyn y rhwystr hwn, rydym yn awgrymu y gallai gronynnau magnetig LV (MPs) helpu mewn dwy ffordd gyflenwol. Yn gyntaf, gellir eu tywys yn fagnetig i wyneb y llwybr anadlu i wella targedu a helpu'r gronynnau cludwr genynnau i fyw yn rhanbarth y llwybr anadlu dymunol; ac ASL) i symud i haen gell 6. Defnyddiwyd MPs yn helaeth fel cerbydau dosbarthu cyffuriau wedi'u targedu pan fyddant yn rhwymo i wrthgyrff, cyffuriau cemotherapiwtig, neu foleciwlau bach eraill sy'n glynu wrth bilenni celloedd neu'n rhwymo i dderbynyddion wyneb celloedd perthnasol ac yn cronni mewn safleoedd tiwmor ym mhresenoldeb trydan statig. Meysydd Magnetig ar gyfer Trin Canser 7. Mae technegau "hyperthermol" eraill yn anelu at gynhesu MPs pan fyddant yn agored i feysydd magnetig osgiliadol, a thrwy hynny ddinistrio celloedd tiwmor. Defnyddir egwyddor trawsffurfiad magnetig, lle defnyddir maes magnetig fel asiant trawsffurfiad i wella trosglwyddo DNA i gelloedd, yn gyffredin in vitro gan ddefnyddio ystod o fectorau genynnau anfeirysol a firaol ar gyfer llinellau celloedd anodd eu trawsffurfio. Mae effeithiolrwydd magneto-drawsnewidiad LV wedi'i sefydlu, gyda danfoniad LV-MPs in vitro i linell gelloedd epithelaidd bronciol dynol ym mhresenoldeb maes magnetig statig, gan gynyddu effeithlonrwydd trawsffurfiad 186 gwaith o'i gymharu â fector LV yn unig. Mae LV-MP hefyd wedi'i gymhwyso i fodel CF in vitro, lle cynyddodd trawsffurfiad magnetig drawsffurfiad LV mewn diwylliannau rhyngwyneb aer-hylif 20 gwaith ym mhresenoldeb crachboer CF10. Fodd bynnag, mae magneto-drawsnewidiad organau in vivo wedi derbyn cymharol ychydig o sylw a dim ond mewn ychydig o anifeiliaid y mae wedi'i werthuso. astudiaethau11,12,13,14,15, yn enwedig yn yr ysgyfaint16,17. Serch hynny, mae'r cyfleoedd ar gyfer trawsffectiad magnetig mewn therapi ysgyfaint CF yn glir. Nododd Tan et al.(2020) y bydd "astudiaeth brawf-o-gysyniad o gyflenwi nanoronynnau magnetig effeithlon i'r ysgyfaint yn paratoi'r ffordd ar gyfer strategaethau anadlu CFTR yn y dyfodol i wella canlyniadau clinigol mewn cleifion CF"6.
Mae ymddygiad gronynnau magnetig bach ar arwynebau llwybrau anadlu ym mhresenoldeb maes magnetig cymhwysol yn anodd ei ddelweddu a'i astudio, ac felly mae wedi'i ddeall yn wael. Mewn astudiaethau eraill, fe wnaethom ddatblygu dull delweddu pelydr-X cyferbyniad cyfnod yn seiliedig ar ymlediad synchrotron (PB-PCXI) i ddelweddu a meintioli newidiadau bach in vivo mewn dyfnder ASL18 ac ymddygiad MCT19,20 yn anfewnwthiol i fesur hydradiad wyneb Camlas nwy yn uniongyrchol a'i ddefnyddio fel dangosydd cynnar o effeithiolrwydd triniaeth. Yn ogystal, mae ein dull gwerthuso MCT yn defnyddio gronynnau 10–35 µm mewn diamedr sy'n cynnwys alwmina neu wydr mynegai plygiannol uchel fel marcwyr MCT sy'n weladwy gan ddefnyddio PB-PCXI21. Mae'r ddau dechneg yn addas ar gyfer delweddu ystod o fathau o ronynnau, gan gynnwys MP.
Oherwydd ei benderfyniad gofodol ac amserol uchel, mae ein technegau dadansoddi ASL ac MCT sy'n seiliedig ar PB-PCXI yn addas iawn ar gyfer archwilio dynameg a phatrymau ymddygiad gronynnau sengl a swmp in vivo i'n helpu i ddeall ac optimeiddio technegau cyflwyno genynnau MP. Mae'r dull a ddefnyddiwn yma yn deillio o'n hastudiaethau gan ddefnyddio llinell drawst SPring-8 BL20B2, lle gwnaethom ddelweddu symudiad hylif yn dilyn cyflwyno dos fector ffug i lwybrau anadlu trwynol ac ysgyfeiniol llygod i helpu i egluro ein patrymau mynegiant genynnau anghyson a welwyd yn ein hastudiaethau anifeiliaid dos cludwr genynnau 3,4.
Nod yr astudiaeth hon oedd defnyddio'r synchrotron PB-PCXI i ddelweddu symudiadau in vivo cyfres o MPs yn nhrachea llygod mawr byw. Cynlluniwyd yr astudiaethau delweddu PB-PCXI hyn i brofi ystod o MPs, cryfderau maes magnetig, a lleoliadau i bennu eu heffaith ar symudiad MP. Gwnaethom ragdybio y byddai maes magnetig a gymhwysir yn allanol yn helpu'r MP a ddanfonir i aros neu symud i'r ardal darged. Roedd yr astudiaethau hyn hefyd yn caniatáu inni nodi cyfluniadau magnet sy'n cynyddu nifer y gronynnau a gedwir yn y trachea ar ôl dyddodiad. Mewn ail gyfres o astudiaethau, fe geisiom ddefnyddio'r cyfluniad gorau posibl hwn i ddangos y patrwm trawsgludiad sy'n deillio o ddanfon in vivo LV-MPs i'r llwybr anadlu llygod mawr, yn seiliedig ar y dybiaeth y byddai danfon LV-MPs yng nghyd-destun targedu'r llwybr anadlu yn arwain at effeithlonrwydd trawsgludiad LV gwell.
Perfformiwyd yr holl astudiaethau anifeiliaid yn unol â phrotocolau a gymeradwywyd gan Brifysgol Adelaide (M-2019-060 ac M-2020-022) a Phwyllgor Moeseg Anifeiliaid Synchrotron SPring-8. Perfformiwyd arbrofion yn unol â chanllawiau ARRIVE.
Perfformiwyd yr holl ddelweddu pelydr-X ar drawslin BL20XU yn y synchrotron SPring-8 yn Japan, gan ddefnyddio gosodiad tebyg i'r un a ddisgrifiwyd yn flaenorol21,22.Yn gryno, roedd y blwch arbrofol wedi'i leoli 245 m o'r cylch storio synchrotron.Defnyddir pellter o 0.6 m rhwng y sampl a'r synhwyrydd ar gyfer astudiaethau delweddu gronynnau a 0.3 m ar gyfer astudiaethau delweddu in vivo i gynhyrchu effeithiau cyferbyniad cyfnod.Defnyddiwyd egni trawst monocromatig o 25 keV.Cipiwyd delweddau gan ddefnyddio trawsnewidydd pelydr-X cydraniad uchel (SPring-8 BM3) wedi'i gyplysu â synhwyrydd sCMOS.Mae'r trawsnewidydd yn trosi pelydrau-X yn olau gweladwy gan ddefnyddio scintillator 10 µm o drwch (Gd3Al2Ga3O12), sydd wedyn yn cael ei gyfeirio at synhwyrydd sCMOS gan ddefnyddio amcan microsgop × 10 (NA 0.3).Y synhwyrydd sCMOS oedd Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Japan) gyda maint arae o 2048 × 2048 picsel a maint picsel crai o 6.5 × 6.5 µm. Mae'r gosodiad hwn yn cynhyrchu maint picsel isotropig effeithiol o 0.51 µm a maes golygfa o tua 1.1 mm × 1.1 mm. Dewiswyd hyd amlygiad o 100 ms i wneud y mwyaf o'r gymhareb signal-i-sŵn o ronynnau magnetig y tu mewn a'r tu allan i'r llwybr anadlu wrth leihau arteffactau symudiad a achosir gan anadlu. Ar gyfer astudiaethau in vivo, gosodwyd caead pelydr-X cyflym yn llwybr y pelydr-X i gyfyngu ar ddos ​​​​ymbelydredd trwy rwystro'r trawst pelydr-X rhwng amlygiadau.
Ni ddefnyddiwyd y cludwr LV mewn unrhyw astudiaethau delweddu SPring-8 PB-PCXI oherwydd nad yw siambr delweddu BL20XU wedi'i hardystio Lefel Bioddiogelwch 2. Yn lle hynny, dewiswyd ystod o MPs wedi'u nodweddu'n dda gan ddau gyflenwr masnachol—yn cwmpasu ystod o feintiau, deunyddiau, crynodiadau haearn, a chymwysiadau—yn gyntaf i ddeall sut mae meysydd magnetig yn effeithio ar symudiad MP o fewn capilarïau gwydr, ac yna mewn llwybrau anadlu byw. ar yr wyneb.Mae maint MPs yn amrywio o 0.25 i 18 μm ac maent wedi'u gwneud o amrywiaeth o ddefnyddiau (gweler Tabl 1), ond nid yw cyfansoddiad pob sampl, gan gynnwys maint y gronynnau magnetig o fewn yr MP, yn hysbys.Yn seiliedig ar ein hastudiaethau MCT helaeth 19, 20, 21, 23, 24, rydym yn disgwyl y gellir gweld MPs mor fach â 5 μm ar wyneb y llwybr anadlu tracheal, er enghraifft trwy dynnu fframiau olynol i weld gwelededd gwell o symudiad MP.Mae MP sengl o faint 0.25 μm yn llai na datrysiad y ddyfais delweddu, ond disgwylir i PB-PCXI ganfod eu cyferbyniad cyfaint a symudiad yr hylif arwyneb y maent yn cael eu dyddodi arno ar ôl dyddodi.
Paratowyd samplau ar gyfer pob MP yn Nhabl 1 mewn capilarïau gwydr 20 μl (Drummond Microcaps, PA, UDA) gyda diamedr mewnol o 0.63 mm. Mae gronynnau corpwswlaidd ar gael mewn dŵr, tra bod gronynnau CombiMag ar gael yn hylif perchnogol y gwneuthurwr. Mae pob tiwb wedi'i hanner llenwi â hylif (tua 11 μl) a'i osod ar y deiliad sampl (gweler Ffigur 1). Gosodwyd y capilarïau gwydr yn llorweddol ar lwyfan y sampl yn y blwch delweddu, yn y drefn honno, a gosodwyd ymylon yr hylif. Atodwyd magnet cragen nicel 19 mm mewn diamedr (28 mm o hyd) neodymiwm haearn boron (NdFeB) (N35, rhif cat. LM1652, Jaycar Electronics, Awstralia) gyda magneteiddio gweddilliol o 1.17 Tesla i lwyfan cyfieithu ar wahân i gyflawni newid ei safle o bell yn ystod delweddu. Mae caffael delwedd pelydr-X yn dechrau pan fydd y magnet wedi'i leoli tua 30 mm uwchben y sampl, a chaffaelir delweddau ar gyfradd o 4 ffrâm yr eiliad. Yn ystod delweddu, cafodd y magnet ei... wedi'i ddwyn yn agos at y tiwb capilari gwydr (tua 1 mm i ffwrdd) ac yna'i drosglwyddo ar hyd y tiwb i asesu effeithiau cryfder a safle'r maes.
Gosodiad delweddu in vitro sy'n cynnwys samplau MP mewn capilarïau gwydr ar lwyfan cyfieithu xy y sampl. Mae llwybr y trawst pelydr-X wedi'i farcio â llinell goch doredig.
Unwaith y sefydlwyd gwelededd in vitro MPs, profwyd is-set ohonynt in vivo mewn llygod mawr albino Wistar benywaidd gwyllt (~12 wythnos oed, ~200 g). 0.24 mg/kg medetomidine (Domitor®, Zenoaq, Japan), 3.2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Japan) a 4 mg/kg butorphanol (Vetorphale®, Meiji Seika). Anesthetwyd y llygod mawr gyda chymysgedd o Pharma (Japan) trwy bigiad mewngyhyrol. Ar ôl anesthesia, cawsant eu paratoi ar gyfer delweddu trwy dynnu'r ffwr o amgylch y trachea, mewnosod tiwb endotracheal (ET; cannula iv 16 Ga, Terumo BCT) a'u gosod yn sownd ar blât delweddu wedi'i wneud yn arbennig yn cynnwys bag thermol i gynnal tymheredd y corff 22. Yna atodwyd y plât delweddu i'r llwyfan cyfieithu sampl yn y blwch delweddu ar ongl fach i alinio'r trachea yn llorweddol yn y ddelwedd pelydr-X, fel y dangosir yn Ffigur. 2a.
(a) Gosodiad delweddu in vivo yn y blwch delweddu SPring-8, mae llwybr y trawst pelydr-X wedi'i farcio â llinell goch doredig. (b,c) Perfformiwyd lleoleiddio magnet ar y trachea o bell gan ddefnyddio dau gamera IP wedi'u gosod yn orthogonal. Ar ochr chwith delwedd y sgrin, gellir gweld y ddolen wifren sy'n dal y pen, a'r cannula dosbarthu yn ei le o fewn y tiwb ET.
Cysylltwyd system bwmp chwistrell a reolir o bell (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) gan ddefnyddio chwistrell wydr 100 μl â thiwb PE10 (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) trwy nodwydd 30 Ga. Marciwch y tiwb i sicrhau bod y domen yn y safle cywir yn y trachea wrth fewnosod y tiwb ET. Gan ddefnyddio'r microbwmp, tynnwyd plwncwr y chwistrell yn ôl tra bod blaen y tiwb wedi'i drochi yn y sampl MP i'w gyflwyno. Yna mewnosodwyd y tiwb cyflwyno wedi'i lwytho i'r tiwb endotracheal, gan osod y domen o fewn rhan gryfaf ein maes magnetig cymhwysol disgwyliedig. Rheolwyd caffael delweddau gan ddefnyddio synhwyrydd resbiradol wedi'i gysylltu â'n blwch amseru seiliedig ar Arduino, a chofnodwyd yr holl signalau (e.e. tymheredd, resbiradol, agor/cau caead a chaffael delweddau) gan ddefnyddio Powerlab a LabChart (AD Instruments, Sydney, Awstralia) 22. Wrth ddelweddu Pan nad oedd modd cyrraedd y lloc, gosodwyd dau gamera IP (Panasonic BB-SC382) tua 90° i'w gilydd a'u defnyddio i fonitro safle'r magnet o'i gymharu â'r trachea yn ystod delweddu (Ffig. 2b,c). Er mwyn lleihau arteffactau symudiad, caffaelwyd un ddelwedd fesul anadl yn ystod y llwyfandir llif llanw diwedd.
Mae magnet ynghlwm wrth ail lwyfan y gellir ei leoli o bell o'r tu allan i'r tai delweddu. Profwyd amrywiol safleoedd a chyfluniadau magnet, gan gynnwys: Wedi'i osod ar ongl o tua 30° uwchben y trachea (dangosir y ffurfweddiadau yn Ffigurau 2a a 3a); un magnet uwchben yr anifail a'r llall isod, gyda'r polion wedi'u gosod i ddenu (Ffigur 3b); un magnet uwchben yr anifail a'r llall isod, gyda'r polion wedi'u gosod i wrthyrru (Ffigur 3c); ac un magnet uwchben ac yn berpendicwlar i'r trachea (Ffigur 3d). Unwaith y bydd yr anifail a'r magnet wedi'u ffurfweddu a bod yr MP i'w brofi wedi'i lwytho i'r pwmp chwistrell, darparwch ddos ​​o 50 μl ar gyfradd o 4 μl/eiliad wrth gaffael delweddau. Yna caiff y magnet ei symud yn ôl ac ymlaen ar hyd neu'n ochrol ar draws y trachea wrth barhau i gaffael delweddau.
Cyfluniad magnet ar gyfer delweddu in vivo (a) un magnet uwchben y tracea ar ongl o tua 30°, (b) dau fagnet wedi'u gosod i ddenu, (c) dau fagnet wedi'u gosod i wrthyrru, (d) un magnet uwchben ac yn berpendicwlar yn y tracea. Edrychodd yr arsylwr i lawr o'r geg i'r ysgyfaint trwy'r tracea, a phasiodd y trawst pelydr-X trwy ochr chwith y llygoden fawr ac allan o'r ochr dde. Mae'r magnet naill ai'n cael ei symud ar hyd y llwybr anadlu neu i'r chwith ac i'r dde uwchben y tracea i gyfeiriad y trawst pelydr-X.
Fe geisiom hefyd bennu gwelededd ac ymddygiad gronynnau yn y llwybrau anadlu yn absenoldeb anadlu dryslyd a symudiad cardiaidd. Felly, ar ddiwedd y cyfnod delweddu, lladdwyd anifeiliaid yn drugarog am orddos pentobarbital (Somnopentil, Pitman-Moore, Washington Crossing, UDA; ~65 mg/kg ip). Gadawyd rhai anifeiliaid ar y platfform delweddu, ac unwaith y stopiodd yr anadlu a'r curiad calon, ailadroddwyd y broses ddelweddu, gan ychwanegu dos ychwanegol o MP os nad oedd MP yn weladwy ar wyneb y llwybr anadlu.
Cywirwyd y delweddau a gafwyd ar gyfer maes gwastad a maes tywyll ac yna cawsant eu cydosod yn ffilm (20 ffrâm yr eiliad; 15-25 × cyflymder arferol yn dibynnu ar y gyfradd resbiradol) gan ddefnyddio sgript arferol a ysgrifennwyd yn MATLAB (R2020a, The Mathworks).
Cynhaliwyd pob astudiaeth cyflwyno fector genynnau LV yng Nghyfleuster Ymchwil Anifeiliaid Labordy Prifysgol Adelaide a'r nod oedd defnyddio canlyniadau'r arbrawf SPring-8 i asesu a allai cyflwyno LV-MP ym mhresenoldeb maes magnetig wella trosglwyddo genynnau in vivo. I asesu effeithiau MP a maes magnetig, cafodd dau grŵp o anifeiliaid eu trin: rhoddwyd LV-MP gyda magnet wedi'i osod i un grŵp, a derbyniodd y grŵp arall grŵp rheoli gyda LV-MP heb fagnet.
Cynhyrchwyd fectorau genynnau LV gan ddefnyddio dulliau a ddisgrifiwyd yn flaenorol 25, 26. Mae'r fector LacZ yn mynegi'r genyn beta-galactosidase niwclear-leoledig a yrrir gan yr hyrwyddwr MPSV cyfansoddol (LV-LacZ), sy'n cynhyrchu cynnyrch adwaith glas mewn celloedd wedi'u trawsdwyso, sy'n weladwy mewn blaenau meinwe'r ysgyfaint ac adrannau meinwe. Perfformiwyd titradiad mewn diwylliannau celloedd trwy gyfrif nifer y celloedd LacZ positif â llaw gyda hemocytomedr i gyfrifo'r titer mewn TU/ml. Caiff cludwyr eu rhewi-gadw ar -80 °C, eu dadmer cyn eu defnyddio, a'u rhwymo i CombiMag trwy gymysgu ar gymhareb 1:1 a'u magu ar rew am o leiaf 30 munud cyn eu danfon.
Cafodd llygod mawr Sprague Dawley normal (n = 3/grŵp, ~2-3 eu hanestheteiddio'n fewnberitoneol gyda chymysgedd o 0.4 mg/kg o medetomidine (Domitor, Ilium, Awstralia) a 60 mg/kg o ketamine (Ilium, Awstralia) (mis oed) pigiad ip) a chanwleiddio geneuol heb lawdriniaeth gyda chanwla iv 16 Ga. Er mwyn sicrhau bod meinwe'r llwybr anadlu tracheal yn derbyn trawsdwythiad LV, cafodd ei gyflyru gan ddefnyddio ein protocol aflonyddwch mecanyddol a ddisgrifiwyd yn flaenorol, lle cafodd wyneb y llwybr anadlu tracheal ei rwbio'n echelinol â basged weiren (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, UDA) 30 eiliad 28. Yna perfformiwyd gweinyddiaeth tracheal o LV-MP mewn cabinet diogelwch biolegol tua 10 munud ar ôl yr aflonyddwch.
Cafodd y maes magnetig a ddefnyddiwyd yn yr arbrawf hwn ei ffurfweddu mewn modd tebyg i'r astudiaeth delweddu pelydr-X in vivo, gyda'r un magnetau'n cael eu dal uwchben y trachea gan ddefnyddio clipiau stent distyllu (Ffigur 4). Cyflwynwyd cyfaint o 50 μl (2 × 25 μl o aliquots) o LV-MP i'r trachea (n = 3 anifail) gan ddefnyddio piped yn cynnwys blaen gel fel y disgrifiwyd yn flaenorol. Derbyniodd grŵp rheoli (n = 3 anifail) yr un LV-MPs heb ddefnyddio magnet. Ar ôl i'r trwyth gael ei gwblhau, tynnir y cannula o'r tiwb ET a chaiff yr anifail ei dynnu allan o'r tiwb. Mae'r magnet yn aros yn ei le am 10 munud, yna caiff ei dynnu. Derbyniodd llygod mawr ddos ​​isgroenol o meloxicam (1 ml/kg) (Ilium, Awstralia) ac yna gwrthdroi'r anesthesia trwy bigiad ip o 1 mg/kg o atipamazole hydroclorid (Antisedan, Zoetis, Awstralia). Cadwyd llygod mawr yn gynnes a'u monitro nes iddynt wella'n llwyr o'r anesthesia.
Dyfais dosbarthu LV-MP mewn cabinet diogelwch biolegol. Gellir gweld canolbwynt Luer llwyd golau'r tiwb ET yn ymwthio allan o'r geg a mewnosodir blaen gel y piped a ddangosir yn y llun trwy'r tiwb ET i'r dyfnder a ddymunir i'r trachea.
Wythnos ar ôl y weithdrefn dosio LV-MP, lladdwyd yr anifeiliaid yn drugarog trwy anadlu 100% o CO2 ac aseswyd mynegiant LacZ gan ddefnyddio ein triniaeth safonol X-gal. Tynnwyd y tri chylch mwyaf cartilaginous cynffonog i sicrhau nad oedd unrhyw ddifrod mecanyddol na chadw hylif o osod tiwb endotracheal wedi'i gynnwys yn y dadansoddiad. Torrwyd pob trachea yn hydredol i greu dwy hanner ar gyfer dadansoddi, a chawsant eu gosod mewn dysgl yn cynnwys rwber silicon (Sylgard, Dow Inc) gan ddefnyddio nodwydd Minutien (Fine Science Tools) i ddelweddu'r wyneb luminal. Cadarnhawyd dosbarthiad a phatrwm celloedd trawsdwysedig trwy ffotograffiaeth flaenol gan ddefnyddio microsgop Nikon (SMZ1500) gyda chamera DigiLite a meddalwedd TCapture (Tucsen Photonics, Tsieina). Cafwyd delweddau ar chwyddiad 20x (gan gynnwys y gosodiad uchaf ar gyfer lled llawn y trachea), gyda hyd cyfan y trachea wedi'i ddelweddu gam wrth gam, gan sicrhau digon o orgyffwrdd rhwng pob delwedd i ganiatáu "pwytho" delweddau. Yna casglwyd delweddau o bob trachea i mewn delwedd gyfansawdd sengl gan ddefnyddio'r Golygydd Cyfansawdd Delweddau v2.0.3 (Microsoft Research) gan ddefnyddio algorithm symudiad planar. Mesurwyd ardaloedd mynegiant LacZ mewn delweddau cyfansawdd o'r trachea o bob anifail gan ddefnyddio sgript MATLAB awtomataidd (R2020a, MathWorks) fel y disgrifiwyd yn flaenorol, gan ddefnyddio gosodiadau o 0.35 < Lliw < 0.58, Dirlawnder > 0.15, a Gwerth < 0.7. Trwy olrhain cyfuchliniau'r meinwe, cynhyrchwyd mwgwd â llaw yn GIMP v2.10.24 ar gyfer pob delwedd gyfansawdd er mwyn nodi ardal y meinwe ac atal unrhyw ganfyddiadau ffug o'r tu allan i feinwe'r trachea. Crynhwyd yr ardaloedd wedi'u staenio o bob delwedd gyfansawdd o bob anifail i gynhyrchu cyfanswm yr ardal wedi'i staenio ar gyfer yr anifail hwnnw. Yna rhannwyd yr ardal wedi'i staenio â chyfanswm ardal y mwgwd i gynhyrchu'r ardal wedi'i normaleiddio.
Mewnosodwyd pob trachea mewn paraffin a thorrwyd adrannau 5 μm. Cafodd adrannau eu gwrthliwio â choch cyflym niwtral am 5 munud a chafwyd delweddau gan ddefnyddio microsgop Nikon Eclipse E400, camera DS-Fi3 a meddalwedd cipio elfennau NIS (fersiwn 5.20.00).
Perfformiwyd yr holl ddadansoddiadau ystadegol yn GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.). Gosodwyd arwyddocâd ystadegol ar p ≤ 0.05. Gwiriwyd normalrwydd gan ddefnyddio prawf Shapiro-Wilk, ac aseswyd gwahaniaethau mewn staenio LacZ gan ddefnyddio'r prawf-t heb ei baru.
Archwiliwyd y chwe MP a ddisgrifir yn Nhabl 1 gan ddefnyddio PCXI, a disgrifir y gwelededd yn Nhabl 2. Nid oedd dau MP polystyren (MP1 ac MP2; 18 μm a 0.25 μm, yn y drefn honno) yn weladwy o dan PCXI, ond roedd gweddill y samplau yn adnabyddadwy (dangosir enghreifftiau yn Ffigur 5). Mae MP3 ac MP4 (10-15% Fe3O4; 0.25 μm a 0.9 μm, yn y drefn honno) yn weladwy'n wan. Er eu bod yn cynnwys rhai o'r gronynnau lleiaf a brofwyd, MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) oedd yr un mwyaf amlwg. Mae'n anodd gweld cynnyrch CombiMag MP6. Ym mhob achos, gwellwyd ein gallu i ganfod MP yn sylweddol trwy gyfieithu'r magnet yn ôl ac ymlaen yn gyfochrog â'r capilari. Pan symudodd y magnetau i ffwrdd o'r capilari, ymestynnodd y gronynnau mewn llinynnau hir, ond wrth i'r magnetau agosáu a chynyddu cryfder y maes magnetig, byrhaodd llinynnau'r gronynnau wrth i'r gronynnau fudo tuag at wyneb uchaf y capilari (gweler Fideo Atodol S1: MP4), gan gynyddu'r dwysedd gronynnau'r wyneb. I'r gwrthwyneb, pan gaiff y magnet ei dynnu o'r capilari, mae cryfder y maes yn lleihau ac mae'r gronynnau magnetig yn aildrefnu'n llinynnau hir sy'n ymestyn o wyneb uchaf y capilari (gweler Fideo Atodol S2:MP4). Ar ôl i'r magnet roi'r gorau i symud, mae'r gronynnau'n parhau i symud am gyfnod byr ar ôl cyrraedd y safle cydbwysedd. Wrth i'r gronyn magnetig symud tuag at ac i ffwrdd o wyneb uchaf y capilari, mae'r gronynnau magnetig fel arfer yn llusgo'r malurion trwy'r hylif.
Mae gwelededd MP o dan PCXI yn amrywio'n sylweddol rhwng samplau. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 a (d) MP6. Tynnwyd yr holl ddelweddau a ddangosir yma gyda magnet wedi'i leoli tua 10 mm yn uniongyrchol uwchben y capilarïau. Swigod aer sydd wedi'u dal yn y capilarïau yw'r cylchoedd mawr amlwg, gan ddangos nodweddion ymyl du a gwyn delweddu cyferbyniad cyfnod yn glir. Mae'r blwch coch yn cynnwys y chwyddiad sy'n gwella cyferbyniad. Sylwch nad yw diamedrau'r sgematigau magnet ym mhob ffigur i raddfa ac maent tua 100 gwaith yn fwy nag a ddangosir.
Wrth i'r magnet gael ei gyfieithu i'r chwith ac i'r dde ar hyd brig y capilarï, mae ongl y llinyn MP yn newid i alinio â'r magnet (gweler Ffigur 6), gan amlinellu'r llinellau maes magnetig. Ar gyfer MP3-5, ar ôl i'r cord gyrraedd ongl trothwy, mae'r gronynnau'n cael eu llusgo ar hyd wyneb uchaf y capilarï. Yn aml, mae hyn yn arwain at MPs yn clystyru i grwpiau mwy yn agos at ble mae'r maes magnetig ar ei gryfaf (gweler Fideo Atodol S3:MP5). Mae hyn hefyd yn arbennig o amlwg wrth ddelweddu'n agos at ben y capilarï, sy'n achosi i MPs agregu a chrynodiad ar y rhyngwyneb hylif-aer. Ni chafodd gronynnau yn MP6, a oedd yn anoddach i'w canfod nag MP3-5, eu llusgo wrth i'r magnet symud ar hyd y capilarï, ond dadunodd y llinynnau MP, gan adael y gronynnau yn y maes golygfa (gweler Fideo Atodol S4:MP6). Mewn rhai achosion, pan gafodd y maes magnetig a gymhwyswyd ei leihau trwy symud y magnet bellter mawr o'r lleoliad delweddu, disgynnodd unrhyw MPs sy'n weddill yn araf i wyneb gwaelod y tiwb trwy ddisgyrchiant tra'n aros yn y llinyn (gweler Fideo Atodol S5: MP3).
Mae ongl y llinyn MP yn newid wrth i'r magnet gael ei gyfieithu i'r dde uwchben y capilar. (a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 a (d) MP6. Mae'r blwch coch yn cynnwys y chwyddiad sy'n gwella cyferbyniad. Sylwch fod y fideos atodol yn addysgiadol gan eu bod yn datgelu strwythur gronynnau pwysig a gwybodaeth ddeinamig na ellir ei delweddu yn y delweddau statig hyn.
Dangosodd ein profion fod symud y magnet yn araf yn ôl ac ymlaen ar hyd y trachea yn hwyluso delweddu MP yng nghyd-destun symudiad cymhleth in vivo. Ni pherfformiwyd profion in vivo gan nad oedd gleiniau polystyren (MP1 ac MP2) yn weladwy yn y capilari. Profwyd pob un o'r pedwar MP sy'n weddill in vivo gydag echel hir y magnet wedi'i ffurfweddu uwchben y trachea ar ongl o tua 30° i'r fertigol (gweler Ffigurau 2b a 3a), gan fod hyn yn arwain at gadwyni MP hirach ac roedd yn fwy effeithiol na'r ffurfweddiad magnet wedi'i derfynu. Ni chanfuwyd MP3, MP4 ac MP6 yn nhrachea unrhyw anifeiliaid byw. Pan ddelweddwyd llwybrau anadlu'r llygod mawr ar ôl i'r anifeiliaid gael eu lladd yn drugarog, arhosodd y gronynnau'n anweledig hyd yn oed pan ychwanegwyd cyfaint ychwanegol gan ddefnyddio pwmp chwistrell. MP5 oedd â'r cynnwys ocsid haearn uchaf ac ef oedd yr unig ronyn gweladwy, ac felly fe'i defnyddiwyd i asesu a nodweddu ymddygiad in vivo MP.
Arweiniodd gosod y magnet dros y tracea yn ystod esgor yr MP at lawer, ond nid pob un, o MPau yn cael eu crynhoi yn y maes golygfa.Mae gronynnau sy'n mynd i mewn i'r tracea orau i'w gweld mewn anifeiliaid a aberthwyd yn drugarog.Mae Ffigur 7 a Fideo Atodol S6: MP5 yn dangos dal magnetig cyflym ac alinio gronynnau ar wyneb y tracea fentrol, sy'n dangos y gellir cyfeirio MPau i ranbarthau dymunol o'r tracea.Wrth chwilio'n fwy distal ar hyd y tracea ar ôl esgor yr MP, canfuwyd rhai MPau yn agosach at y carina, gan awgrymu nad oedd cryfder y maes magnetig yn ddigonol i gasglu a chadw'r holl MPau, gan iddynt gael eu danfon trwy'r rhanbarth o gryfder maes magnetig mwyaf yn ystod y broses hylif.Serch hynny, roedd crynodiadau MP ôl-enedigol yn uwch o amgylch yr ardal a ddelweddwyd, gan awgrymu bod llawer o MPau yn aros yn rhanbarthau'r llwybrau anadlu lle'r oedd cryfder y maes magnetig a gymhwyswyd ar ei uchaf.
Delweddau o (a) cyn a (b) ar ôl cyflwyno MP5 i dracea llygoden fawr a gafodd ei difa'n ddiweddar gyda'r magnet wedi'i osod yn uniongyrchol uwchben yr ardal ddelweddu. Mae'r ardal a ddelweddwyd wedi'i lleoli rhwng y ddau gylch cartilag. Cyn cyflwyno MP, mae rhywfaint o hylif yn y llwybr anadlu. Mae'r blwch coch yn cynnwys y chwyddiad sy'n gwella cyferbyniad. Mae'r delweddau hyn o'r fideo a ddangosir yn Fideo Atodol S6:MP5.
Achosodd trosglwyddo'r magnet ar hyd y trachea in vivo i'r gadwyn MP newid ongl o fewn wyneb y llwybr anadlu mewn modd tebyg i'r hyn a welir mewn capilarïau (gweler Ffigur 8 a Fideo Atodol S7:MP5). Fodd bynnag, yn ein hastudiaeth ni, ni ellid llusgo MPs ar hyd wyneb y llwybr anadlu byw fel y gallent gyda chapilarïau. Mewn rhai achosion, bydd y gadwyn MP yn mynd yn hirach wrth i'r magnet symud i'r chwith a'r dde. Yn ddiddorol, gwelsom hefyd fod y llinyn gronynnau'n ymddangos i newid dyfnder yr haen hylif arwyneb pan symudir y magnet yn hydredol ar hyd y trachea, ac yn ehangu pan symudir y magnet yn uniongyrchol uwchben a chylchdroi'r llinyn gronynnau i safle fertigol (gweler Fideo Atodol S7). : MP5 am 0:09, gwaelod ar y dde). Newidiodd y patrwm nodweddiadol o symudiad pan gafodd y magnet ei gyfieithu ar draws brig y tracea yn ochrol (hynny yw, i'r chwith neu'r dde o'r anifail yn hytrach nag ar hyd y tracea). Roedd y gronynnau'n dal yn weladwy'n glir wrth iddynt symud, ond pan gafodd y magnet ei dynnu o'r tracea, daeth blaenau llinynnau'r gronynnau'n weladwy (gweler Fideo Atodol S8:MP5, gan ddechrau am 0:08). Mae hyn yn gyson â'r ymddygiad MP a welsom o dan faes magnetig cymhwysol mewn capilar gwydr.
Delweddau enghreifftiol yn dangos MP5 yn nhrachea llygoden fawr fyw wedi'i hanestheteiddio. (a) Defnyddir y magnet i gael delweddau uwchben ac i'r chwith o'r trachea, yna (b) ar ôl i'r magnet gael ei symud i'r dde. Mae'r blwch coch yn cynnwys y chwyddiad sy'n gwella cyferbyniad. Mae'r delweddau hyn o'r fideo a ddangosir yn Fideo Atodol S7:MP5.
Pan ffurfiwyd y ddau begwn mewn cyfeiriad gogledd-de uwchben ac islaw'r trachea (h.y. denu; Ffig. 3b), roedd y cordiau MP yn ymddangos yn hirach ac wedi'u lleoli ar wal ochr y trachea yn hytrach nag ar wyneb dorsal y trachea (gweler Fideo Atodol S9:MP5). Fodd bynnag, ni chanfuwyd crynodiadau uchel o ronynnau mewn un lleoliad (h.y., wyneb dorsal y trachea) ar ôl cyflwyno hylif pan ddefnyddiwyd dyfais deuol-fagnet, sy'n digwydd fel arfer pan ddefnyddir dyfais un-fagnet. Yna pan ffurfiwyd un magnet i wrthyrru'r polion wedi'u gwrthdroi (Ffig. 3c), nid oedd nifer y gronynnau a weladwy yn y maes golygfa yn ymddangos i gynyddu ar ôl eu cyflwyno. Mae gosod y ddau gyfluniad deuol-fagnet yn heriol oherwydd y cryfderau maes magnetig uchel sy'n tynnu neu'n gwthio'r magnetau, yn y drefn honno. Yna newidiwyd y gosodiad i un magnet yn gyfochrog â'r llwybr anadlu ond yn mynd trwy'r llwybr anadlu ar 90 gradd fel bod y llinellau maes yn croesi wal y trachea yn orthogonal (Ffig. 3d), cyfeiriadedd a gynlluniwyd i benderfynu a ellid gweld agregu gronynnau ar y wal ochr. Fodd bynnag, yn gyda'r cyfluniad hwn, nid oedd unrhyw symudiad adnabyddadwy o gronni MP na symudiad magnet. Yn seiliedig ar yr holl ganlyniadau hyn, dewiswyd cyfluniad un magnet, cyfeiriadedd 30 gradd (Ffigur 3a) ar gyfer astudiaethau cludwr genynnau in vivo.
Pan gafodd yr anifail ei ddelweddu dro ar ôl tro yn syth ar ôl ei ladd yn ddynol, roedd absenoldeb symudiad meinwe dryslyd yn golygu y gellid canfod llinellau gronynnau mwy manwl a byrrach yn y maes rhynggondral clir, yn "sigledig" yn unol â symudiad cyfieithiadol y magnet. Serch hynny, ni ellir gweld presenoldeb a symudiad gronynnau MP6 yn glir o hyd.
Roedd titer LV-LacZ yn 1.8 × 108 TU/ml, ac ar ôl cymysgu 1:1 gyda CombiMag MP (MP6), derbyniodd yr anifeiliaid ddos ​​tracheal o 50 μl o gerbyd LV 9 × 107 TU/ml (h.y. 4.5 × 106 TU/llygoden fawr). Yn yr astudiaethau hyn, yn lle cyfieithu'r magnet yn ystod y cyfnod esgor, fe wnaethom osod y magnet mewn un safle i benderfynu a ellid gwella trawsgludiad LV (a) o'i gymharu â chyflenwi fector yn absenoldeb maes magnetig, a (b) a ellid canolbwyntio. Caiff celloedd y llwybr anadlu eu trawsgludo i ranbarthau targed magnetig y llwybr anadlu uchaf.
Nid oedd yn ymddangos bod presenoldeb magnetau a defnyddio CombiMag ynghyd â fectorau LV wedi cael effeithiau andwyol ar iechyd anifeiliaid, fel y gwnaeth ein protocol safonol ar gyfer cyflwyno fector LV. Dangosodd delweddau blaen o'r rhanbarth tracheal a oedd yn destun aflonyddwch mecanyddol (Ffig. Atodol 1) fod lefelau trawsgludiad sylweddol uwch yn y grŵp o anifeiliaid a gafodd eu trin â LV-MP pan oedd y magnet yn bresennol (Ffig. 9a). Dim ond ychydig bach o staenio LacZ glas oedd yn bresennol yn y grŵp rheoli (Ffig. 9b). Dangosodd meintioli ardaloedd wedi'u staenio X-Gal wedi'u normaleiddio fod gweinyddu LV-MP ym mhresenoldeb maes magnetig wedi cynhyrchu gwelliant tua 6 gwaith (Ffig. 9c).
Delweddau cyfansawdd enghreifftiol yn dangos trawsgludiad tracheal gan LV-MP (a) ym mhresenoldeb maes magnetig a (b) yn absenoldeb magnet. (c) Gwelliant ystadegol arwyddocaol yn ardal drawsgludiad LacZ wedi'i normaleiddio o fewn y trachea wrth ddefnyddio'r magnet (*p = 0.029, prawf-t, n = 3 fesul grŵp, cymedr ± SEM).
Dangosodd adrannau wedi'u lliwio'n goch cyflym niwtral (enghraifft a ddangosir yn Ffig. Atodol 2) gelloedd wedi'u lliwio â LacZ yn bresennol mewn patrwm a lleoliad tebyg i'r hyn a adroddwyd yn flaenorol.
Mae lleoli gronynnau cludwr yn gywir i ranbarthau o ddiddordeb a chyflawni lefelau uchel o effeithlonrwydd trawsdwythiad yn yr ysgyfaint symudol ym mhresenoldeb llif aer a chlirio mwcws gweithredol yn parhau i fod yn her allweddol i therapi genynnau anadlu. Ar gyfer cludwyr LV a gynlluniwyd i drin clefyd anadlu CF, mae cynyddu amser preswylio gronynnau cludwr o fewn y llwybrau anadlu dargludol wedi bod yn nod anodd ei anwybyddu hyd yn hyn. Fel y nodwyd gan Castellani et al., mae defnyddio meysydd magnetig i wella trawsdwythiad yn cynnig manteision o'i gymharu â dulliau cyflwyno genynnau eraill fel electroporation, gan y gall gyfuno symlrwydd, cost-effeithiolrwydd, lleoli cyflwyno, effeithlonrwydd cynyddol, ac amseroedd deori byrrach, ac o bosibl dos cludwr llai10. Fodd bynnag, ni ddisgrifiwyd dyddodiad in vivo ac ymddygiad gronynnau magnetig yn y llwybrau anadlu o dan ddylanwad grymoedd magnetig allanol erioed, ac nid yw hyfywedd y dull hwn wedi'i ddangos in vivo i wella lefelau mynegiant genynnau mewn llwybrau anadlu byw cyfan.
Dangosodd ein harbrofion synchrotron PCXI in vitro fod yr holl ronynnau a brofwyd gennym, ac eithrio polystyren MP, yn weladwy yn y gosodiad delweddu a ddefnyddiwyd gennym. Ym mhresenoldeb maes magnetig, mae MPs yn ffurfio llinynnau y mae eu hyd yn gysylltiedig â math y gronyn a chryfder y maes magnetig (h.y. agosrwydd a symudiad y magnet). Fel y dangosir yn Ffigur 10, mae'r llinynnau a welwn yn cael eu ffurfio oherwydd bod pob gronyn unigol yn cael ei fagneteiddio ac yn ysgogi ei faes magnetig lleol ei hun. Mae'r meysydd ar wahân hyn yn achosi i ronynnau tebyg eraill agregu a chysylltu, gyda symudiadau grŵp tebyg i linynnau oherwydd grymoedd lleol o rymoedd deniadol a gwrthyrrol lleol gronynnau eraill.
Cynllun sy'n dangos (a,b) trenau gronynnau a gynhyrchwyd y tu mewn i gapilarïau llawn hylif a (c,d) trachea llawn aer. Sylwch nad yw'r capilarïau a'r trachea wedi'u llunio i raddfa. Mae panel (a) hefyd yn cynnwys disgrifiad o'r MP, sy'n cynnwys gronynnau Fe3O4 wedi'u trefnu mewn llinynnau.
Pan symudwyd y magnet uwchben y capilar, cyrhaeddodd ongl y llinyn gronynnau drothwy critigol ar gyfer MP3-5 yn cynnwys Fe3O4, ac ar ôl hynny ni arhosodd y llinyn gronynnau yn y safle gwreiddiol mwyach, ond symudodd ar hyd yr wyneb i safle newydd.magnet.Mae'n debygol y bydd yr effaith hon yn digwydd oherwydd bod wyneb y capilar gwydr yn ddigon llyfn i ganiatáu i'r symudiad hwn ddigwydd.Yn ddiddorol, ni ymddwynodd MP6 (CombiMag) fel hyn, o bosibl oherwydd bod y gronynnau'n llai, bod ganddynt haenau neu wefrau arwyneb gwahanol, neu fod hylif cludwr perchnogol wedi effeithio ar eu gallu i symud.Mae cyferbyniad delwedd gronynnau CombiMag hefyd yn wannach, gan awgrymu y gallai fod gan yr hylif a'r gronynnau ddwyseddau tebyg ac felly ddim yn symud yn hawdd tuag at ei gilydd.Gall gronynnau hefyd fynd yn sownd os yw'r magnet yn symud yn rhy gyflym, gan ddangos na all cryfder y maes magnetig oresgyn y ffrithiant rhwng gronynnau yn yr hylif bob amser, gan awgrymu efallai nad yw'n syndod bod cryfder y maes magnetig a'r pellter rhwng y magnet a'r ardal darged yn bwysig iawn.Gyda'i gilydd, mae'r canlyniadau hyn hefyd yn awgrymu, er y gall magnetau ddal llawer o MPs sy'n llifo trwy'r ardal darged, ei bod yn annhebygol y gellir dibynnu ar fagnetau i symud. Gronynnau CombiMag ar hyd wyneb y trachea. Felly, rydym yn dod i'r casgliad y dylai astudiaethau LV-MP in vivo ddefnyddio meysydd magnetig statig i dargedu rhanbarthau penodol o goeden y llwybr anadlu yn gorfforol.
Pan gaiff gronynnau eu danfon i'r corff, maent yn anodd eu hadnabod yng nghyd-destun meinwe gymhleth y corff sy'n symud, ond gwellwyd y gallu i'w canfod trwy gyfieithu'r magnet yn llorweddol uwchben y tracea i "siglo" llinynnau'r MP. Er bod delweddu byw yn bosibl, mae'n haws canfod symudiad gronynnau ar ôl i'r anifail gael ei ladd yn drugarog. Yn gyffredinol, roedd crynodiadau MP ar eu huchaf yn y lleoliad hwn pan oedd y magnet wedi'i osod uwchben yr ardal ddelweddu, er bod rhai gronynnau fel arfer yn cael eu canfod ymhellach ar hyd y tracea. Mewn cyferbyniad ag astudiaethau in vitro, ni ellir llusgo gronynnau ar hyd y tracea trwy gyfieithu'r magnet. Mae'r canfyddiad hwn yn gyson â sut mae'r mwcws sy'n gorchuddio wyneb y tracea fel arfer yn prosesu gronynnau a anadlir, gan eu trapio yn y mwcws ac yna'n cael eu clirio gan y mecanwaith clirio mwcociliary.
Fe wnaethon ni ragdybio y gallai defnyddio magnetau ar gyfer atyniad uwchben ac islaw'r trachea (Ffig. 3b) arwain at faes magnetig mwy unffurf, yn hytrach na maes magnetig sydd wedi'i grynhoi'n fawr ar un adeg, a allai arwain at ddosbarthiad mwy unffurf o ronynnau. Fodd bynnag, ni chanfu ein hastudiaeth ragarweiniol dystiolaeth glir i gefnogi'r ddamcaniaeth hon. Yn yr un modd, ni arweiniodd ffurfweddu pâr o fagnetau i wrthyrru (Ffig. 3c) at fwy o ddyddodiad gronynnau yn yr ardal a ddelweddwyd. Mae'r ddau ganfyddiad hyn yn dangos nad yw'r drefniant deuol-fagnet yn gwella rheolaeth leol dros dargedu MP yn sylweddol, a bod y grymoedd magnetig cryf sy'n deillio o hyn yn anodd eu ffurfweddu, gan wneud y dull hwn yn llai ymarferol. Yn yr un modd, ni wnaeth cyfeirio'r magnet uwchben a thrwy'r trachea (Ffig. 3d) gynyddu nifer y gronynnau a gedwir yn yr ardal a ddelweddwyd chwaith. Efallai na fydd rhai o'r ffurfweddiadau amgen hyn yn llwyddiannus oherwydd eu bod yn arwain at gryfderau maes magnetig is o fewn yr ardal ddyddodiad. Felly, ystyrir mai'r ffurfweddiad magnet ongl 30 gradd sengl (Ffigwr 3a) yw'r dull hawsaf a mwyaf effeithlon ar gyfer profi in vivo.
Dangosodd yr astudiaeth LV-MP, pan gyfunwyd fectorau LV â CombiMag a'u danfon ar ôl aflonyddwch corfforol ym mhresenoldeb maes magnetig, fod lefelau trawsgludiad wedi cynyddu'n sylweddol yn y trachea o'i gymharu â rheolyddion. Yn seiliedig ar astudiaethau delweddu synchrotron a chanlyniadau LacZ, mae'n ymddangos bod y maes magnetig yn gallu cadw'r LV o fewn y trachea a lleihau nifer y gronynnau fector a dreiddiodd yn ddwfn i'r ysgyfaint ar unwaith. Gall gwelliannau targedu o'r fath arwain at effeithiolrwydd uwch wrth leihau titrau a ddanfonwyd, trawsgludiad oddi ar y targed, sgîl-effeithiau llidiol ac imiwnedd, a chostau cludwyr genynnau. Yn bwysig, yn ôl y gwneuthurwr, gellir defnyddio CombiMag ar y cyd â dulliau trosglwyddo genynnau eraill, gan gynnwys gyda fectorau firaol eraill (megis AAV) ac asidau niwclëig.