Nature.com தளத்திற்கு வருகை தந்ததற்கு நன்றி. நீங்கள் பயன்படுத்தும் உலாவியில் CSS-க்கான ஆதரவு குறைவாக உள்ளது. சிறந்த அனுபவத்தைப் பெற, மேம்படுத்தப்பட்ட உலாவியைப் பயன்படுத்துமாறு (அல்லது இன்டர்நெட் எக்ஸ்ப்ளோரரில் இணக்கப் பயன்முறையை அணைக்குமாறு) பரிந்துரைக்கிறோம். இதற்கிடையில், தொடர்ச்சியான ஆதரவை உறுதிசெய்யும் வகையில், நாங்கள் இந்தத் தளத்தை ஸ்டைல்கள் மற்றும் ஜாவாஸ்கிரிப்ட் இல்லாமல் காண்பிப்போம்.
சிஸ்டிக் ஃபைப்ரோஸிஸ் நுரையீரல் நோய்க்கான சிகிச்சையில் பயன்படுத்தப்படும் மரபணு கடத்திகள், சுவாசக் குழாய்களை இலக்காகக் கொள்ள வேண்டும், ஏனெனில் புற நுரையீரல் மரபணு மாற்றம் சிகிச்சை ரீதியான பலனை அளிப்பதில்லை. வைரஸ் மரபணு மாற்றத்தின் செயல்திறன், கடத்தி உடலில் தங்கும் நேரத்துடன் நேரடியாகத் தொடர்புடையது. இருப்பினும், மரபணு கடத்திகள் போன்ற விநியோகத் திரவங்கள், மூச்சு உள்ளிழுக்கும்போது இயற்கையாகவே காற்றுப்பைகளுக்குள் பரவுகின்றன, மேலும் எந்த வடிவத்திலான சிகிச்சைத் துகள்களும் சளி-சிலியரி கடத்தல் மூலம் விரைவாக வெளியேற்றப்படுகின்றன. சுவாசக் குழாய்களில் மரபணு கடத்திகள் தங்கும் நேரத்தை நீட்டிப்பது முக்கியமானது, ஆனால் அதை அடைவது கடினம். சுவாசக் குழாய்களின் மேற்பரப்பிற்கு செலுத்தப்படக்கூடிய, மரபணு கடத்தியுடன் இணைக்கப்பட்ட காந்தத் துகள்கள், பிராந்திய இலக்கு நிர்ணயத்தை மேம்படுத்த முடியும். உயிருள்ள உடலுக்குள் காட்சிப்படுத்துவதில் உள்ள சவால்கள் காரணமாக, செலுத்தப்பட்ட காந்தப்புலத்தின் முன்னிலையில் சுவாசக் குழாய் மேற்பரப்பில் அத்தகைய சிறிய காந்தத் துகள்களின் நடத்தை சரியாகப் புரிந்து கொள்ளப்படவில்லை. மயக்க மருந்து கொடுக்கப்பட்ட எலிகளின் மூச்சுக்குழாயில் உள்ள தொடர்ச்சியான காந்தத் துகள்களின் உயிருள்ள உடலுக்குள் நிகழும் இயக்கத்தைக் காட்சிப்படுத்த சின்க்ரோட்ரான் படமாக்கலைப் பயன்படுத்துவதும், உயிருள்ள உடலுக்குள் தனிப்பட்ட மற்றும் மொத்தத் துகள்களின் நடத்தையின் இயக்கவியல் மற்றும் வடிவங்களை ஆராய்வதும் இந்த ஆய்வின் நோக்கமாக இருந்தது. பின்னர், காந்தப்புலத்தின் முன்னிலையில் லென்டிவைரல் காந்தத் துகள்களை வழங்குவது மரபணு மாற்றத்தை அதிகரிக்குமா என்பதையும் நாங்கள் மதிப்பிட்டோம். எலியின் மூச்சுக்குழாயில் செயல்திறன். சின்க்ரோட்ரான் எக்ஸ்-கதிர் படமெடுத்தல், நிலையான மற்றும் நகரும் காந்தப்புலங்களில் காந்தத் துகள்களின் நடத்தையை ஆய்வகத்திலும் உயிருள்ள உடலிலும் வெளிப்படுத்துகிறது. காந்தங்களைக் கொண்டு உயிருள்ள சுவாசப்பாதையின் மேற்பரப்பில் துகள்களை எளிதில் இழுத்துச் செல்ல முடியாது, ஆனால் அவை கொண்டு செல்லப்படும்போது, ​​காந்தப்புலம் மிகவும் வலிமையாக இருக்கும் பார்வைப் புலத்தில் படிவுகள் குவிக்கப்படுகின்றன. ஒரு காந்தப்புலத்தின் முன்னிலையில் லென்டிவைரல் காந்தத் துகள்கள் செலுத்தப்பட்டபோது, ​​மரபணு மாற்ற செயல்திறனும் ஆறு மடங்கு அதிகரித்தது. ஒட்டுமொத்தமாக, இந்த முடிவுகள், லென்டிவைரல் காந்தத் துகள்கள் மற்றும் காந்தப்புலங்கள் ஆகியவை மரபணு கடத்தியின் இலக்கு நிர்ணயத்தை மேம்படுத்துவதற்கும், உயிருள்ள சுவாசப்பாதைகளில் மரபணு மாற்ற அளவை அதிகரிப்பதற்கும் மதிப்புமிக்க அணுகுமுறைகளாக இருக்கலாம் என்று பரிந்துரைக்கின்றன.
சிஸ்டிக் ஃபைப்ரோஸிஸ் (CF) என்பது CF டிரான்ஸ்மெம்பிரேன் கண்டக்டன்ஸ் ரெகுலேட்டர் (CFTR) எனப்படும் ஒற்றை மரபணுவில் ஏற்படும் மாறுபாட்டால் ஏற்படுகிறது. CFTR புரதம் என்பது ஒரு அயனி வழித்தடமாகும், இது CF நோயின் முக்கிய தோற்றுவாயான காற்றுப்பாதைகள் உட்பட, உடல் முழுவதும் உள்ள பல எபிதீலியல் செல்களில் காணப்படுகிறது. CFTR குறைபாடுகள் அசாதாரண நீர் போக்குவரத்திற்கு வழிவகுத்து, காற்றுப்பாதையின் மேற்பரப்பை வறட்சியடையச் செய்து, காற்றுப்பாதை மேற்பரப்பு திரவ (ASL) அடுக்கின் ஆழத்தைக் குறைக்கிறது. இது, உள்ளிழுக்கப்பட்ட துகள்கள் மற்றும் நோய்க்கிருமிகளை காற்றுப்பாதைகளிலிருந்து அகற்றும் மியூகோசிலியரி டிரான்ஸ்போர்ட் (MCT) அமைப்பின் திறனையும் பாதிக்கிறது. CFTR மரபணுவின் சரியான நகலை வழங்கி, ASL, MCT மற்றும் நுரையீரல் ஆரோக்கியத்தை மேம்படுத்துவதற்காக ஒரு லென்டிவைரல் (LV) மரபணு சிகிச்சையை உருவாக்குவதும், இந்த அளவுருக்களை உயிருள்ள உயிரினங்களில் அளவிடக்கூடிய புதிய தொழில்நுட்பங்களைத் தொடர்ந்து உருவாக்குவதும் எங்கள் நோக்கமாகும்.
LV வெக்டர்கள், CF சுவாசப்பாதை மரபணு சிகிச்சைக்கான முன்னணி தேர்வுகளில் ஒன்றாகும். முக்கியமாக, அவை சிகிச்சைக்கான மரபணுவை சுவாசப்பாதையின் அடித்தள செல்களில் (சுவாசப்பாதை ஸ்டெம் செல்கள்) நிரந்தரமாக ஒருங்கிணைக்க முடியும் என்பதே இதற்குக் காரணம். இது முக்கியமானது, ஏனெனில் அவை செயல்படும் மரபணு-திருத்தப்பட்ட CF-தொடர்புடைய சுவாசப்பாதை மேற்பரப்பு செல்களாக வேறுபடுவதன் மூலம் இயல்பான நீரேற்றம் மற்றும் சளி அகற்றுதலை மீட்டெடுக்க முடியும், இதன் விளைவாக வாழ்நாள் முழுவதும் நன்மைகள் கிடைக்கும். LV வெக்டர்கள் கடத்தும் சுவாசப்பாதையை நோக்கி செலுத்தப்பட வேண்டும், ஏனெனில் CF நுரையீரல் நோய் அங்கிருந்துதான் தொடங்குகிறது. வெக்டரை நுரையீரலின் ஆழத்திற்குள் செலுத்துவது ஆல்வியோலார் டிரான்ஸ்டக்ஷனுக்கு வழிவகுக்கலாம், ஆனால் இது CF-இல் எந்த சிகிச்சை நன்மையையும் அளிக்காது. இருப்பினும், மரபணு கேரியர்கள் போன்ற திரவங்கள், செலுத்தப்பட்ட பிறகு உள்ளிழுக்கும்போது இயற்கையாகவே ஆல்வியோலிக்கு இடம்பெயர்கின்றன3,4 மற்றும் சிகிச்சைக்கான துகள்கள் MCT மூலம் வாய்வழி குழிக்குள் விரைவாக அகற்றப்படுகின்றன. LV டிரான்ஸ்டக்ஷன் செயல்திறன், வெக்டர் இலக்கு செல்களுக்கு அருகில் இருந்து செல்லுலார் உட்கொள்ளலை அனுமதிக்கும் கால அளவோடு நேரடியாக தொடர்புடையது – இது "ரெசிடென்ஸ் டைம்"5 – இது வழக்கமான பிராந்திய காற்றோட்டம் மற்றும் ஒருங்கிணைந்த துகள் சளிப் பிடிப்பு மற்றும் MCT ஆகியவற்றால் எளிதில் குறைக்கப்படுகிறது. CF-ஐப் பொறுத்தவரை, சுவாசப்பாதைக்குள் LV-இன் ரெசிடென்ஸ் டைம்-ஐ நீட்டிக்கும் திறன் முக்கியமானது. இந்தப் பகுதியில் உயர் மட்ட மரபணு மாற்றத்தை அடைவது முக்கியமானது, ஆனால் இதுவரை அது சவாலாகவே இருந்து வருகிறது.
இந்தத் தடையைக் கடக்க, LV காந்தத் துகள்கள் (MPs) இரண்டு நிரப்பு வழிகளில் உதவக்கூடும் என்று நாங்கள் பரிந்துரைக்கிறோம். முதலாவதாக, இலக்கு நிர்ணயத்தை மேம்படுத்தவும், மரபணு கடத்தித் துகள்கள் விரும்பிய சுவாசப்பாதைப் பகுதியில் நிலைபெற உதவவும், அவற்றை சுவாசப்பாதையின் மேற்பரப்பிற்கு காந்தவியல் ரீதியாக வழிநடத்தலாம்; மற்றும் ASL) செல் அடுக்கு 6-க்கு நகர உதவலாம். நிலை மின்னூட்டத்தின் முன்னிலையில், செல் சவ்வுகளுடன் இணையும் அல்லது தொடர்புடைய செல் மேற்பரப்பு ஏற்பிகளுடன் பிணைக்கும் ஆன்டிபாடிகள், கீமோதெரபி மருந்துகள் அல்லது பிற சிறிய மூலக்கூறுகளுடன் பிணைந்து, கட்டி உள்ள இடங்களில் குவியும்போது, ​​MPs இலக்கு வைக்கப்பட்ட மருந்து விநியோக வாகனங்களாகப் பரவலாகப் பயன்படுத்தப்படுகின்றன. புற்றுநோய் சிகிச்சைக்கான காந்தப்புலங்கள் 7. மற்ற “ஹைப்பர்தெர்மல்” நுட்பங்கள், அலைவுறும் காந்தப்புலங்களுக்கு உட்படுத்தப்படும்போது MP-க்களை வெப்பப்படுத்தி, அதன் மூலம் கட்டி செல்களை அழிப்பதை நோக்கமாகக் கொண்டுள்ளன. செல்களுக்கு DNA-வின் பரிமாற்றத்தை மேம்படுத்துவதற்காக ஒரு காந்தப்புலத்தை டிரான்ஸ்ஃபெக்ஷன் முகவராகப் பயன்படுத்தும் காந்த டிரான்ஸ்ஃபெக்ஷன் கொள்கையானது, டிரான்ஸ்டியூஸ் செய்வதற்கு கடினமான செல் வரிசைகளுக்காக, பலவிதமான வைரஸ் அல்லாத மற்றும் வைரஸ் மரபணு வெக்டர்களைப் பயன்படுத்தி இன் விட்ரோவில் பொதுவாகப் பயன்படுத்தப்படுகிறது. LV காந்த டிரான்ஸ்ஃபெக்ஷனின் செயல்திறன் நிறுவப்பட்டுள்ளது; ஒரு நிலையான காந்தப்புலத்தின் முன்னிலையில், மனித மூச்சுக்குழாய் எபிதீலியல் செல் வரிசைக்கு இன் விட்ரோவில் LV-MP-க்களை வழங்குவது, LV வெக்டரை மட்டும் பயன்படுத்துவதை விட டிரான்ஸ்டக்ஷன் செயல்திறனை 186 மடங்கு அதிகரித்துள்ளது. LV-MP ஒரு இன் விட்ரோ CF மாதிரிக்கும் பயன்படுத்தப்பட்டுள்ளது, அங்கு CF சளியின் முன்னிலையில், காற்று-திரவ இடைமுக வளர்ப்புகளில் காந்த டிரான்ஸ்ஃபெக்ஷன் LV டிரான்ஸ்டக்ஷனை 20 மடங்கு அதிகரித்தது¹⁰. இருப்பினும், உறுப்புகளின் இன் விவோ காந்த டிரான்ஸ்ஃபெக்ஷன் ஒப்பீட்டளவில் குறைந்த கவனத்தையே பெற்றுள்ளது மற்றும் ஒரு சில விலங்குகளில் மட்டுமே மதிப்பீடு செய்யப்பட்டுள்ளது. ஆய்வுகள்11,12,13,14,15, குறிப்பாக நுரையீரலில்16,17. ஆயினும்கூட, CF நுரையீரல் சிகிச்சையில் காந்தப் பரிமாற்றத்திற்கான வாய்ப்புகள் தெளிவாக உள்ளன. டான் மற்றும் பலர் (2020) "திறமையான காந்த நானோ துகள் நுரையீரல் விநியோகத்தின் ஒரு கருத்தாக்கச் சான்று ஆய்வு, CF நோயாளிகளில் மருத்துவ விளைவுகளை மேம்படுத்துவதற்கான எதிர்கால CFTR உள்ளிழுத்தல் உத்திகளுக்கு வழி வகுக்கும்"6 என்று கூறியுள்ளனர்.
செலுத்தப்பட்ட காந்தப்புலத்தின் முன்னிலையில், சுவாசப்பாதை மேற்பரப்புகளில் உள்ள சிறிய காந்தத் துகள்களின் நடத்தையைக் காட்சிப்படுத்துவதும் ஆய்வு செய்வதும் கடினம், எனவே அது சரியாகப் புரிந்து கொள்ளப்படவில்லை. மற்ற ஆய்வுகளில், வாயுக் குழாய் மேற்பரப்பு நீரேற்றத்தை நேரடியாக அளவிடுவதற்கும், சிகிச்சை செயல்திறனின் ஆரம்பக் குறிகாட்டியாகப் பயன்படுத்துவதற்கும், ASL ஆழம்¹⁸ மற்றும் MCT நடத்தை¹⁹,²⁰ ஆகியவற்றில் ஏற்படும் மிகச்சிறிய உயிருள்ள மாற்றங்களை ஊடுருவல் இன்றி காட்சிப்படுத்தவும் அளவிடவும், நாங்கள் ஒரு சின்க்ரோட்ரான்-பரவல் அடிப்படையிலான கட்ட-மாறுபாடு எக்ஸ்-கதிர் படமாக்கல் (PB-PCXI) முறையை உருவாக்கினோம். கூடுதலாக, எங்கள் MCT மதிப்பீட்டு முறையானது, PB-PCXI²¹ மூலம் பார்க்கக்கூடிய MCT குறிப்பான்களாக, அலுமினா அல்லது உயர் ஒளிவிலகல் குறியீட்டுக் கண்ணாடியால் ஆன 10–35 µm விட்டம் கொண்ட துகள்களைப் பயன்படுத்துகிறது. இந்த இரண்டு நுட்பங்களும் MP உட்பட பல்வேறு வகையான துகள்களைக் காட்சிப்படுத்த ஏற்றவை.
அதன் உயர் இடஞ்சார்ந்த மற்றும் காலஞ்சார்ந்த தெளிவுத்திறன் காரணமாக, எங்களின் PB-PCXI-அடிப்படையிலான ASL மற்றும் MCT பகுப்பாய்வு நுட்பங்கள், MP மரபணு விநியோக நுட்பங்களைப் புரிந்துகொள்ளவும் மேம்படுத்தவும் எங்களுக்கு உதவும் வகையில், உயிருள்ள உயிரினங்களில் ஒற்றை மற்றும் மொத்தத் துகள்களின் நடத்தையின் இயக்கவியல் மற்றும் வடிவங்களை ஆராய்வதற்கு மிகவும் பொருத்தமானவை. நாங்கள் இங்கு பயன்படுத்தும் அணுகுமுறையானது, SPring-8 BL20B2 பீம்லைனைப் பயன்படுத்தி நாங்கள் மேற்கொண்ட ஆய்வுகளிலிருந்து பெறப்பட்டது. அந்த ஆய்வுகளில், எங்களின் மரபணு கடத்தி மருந்தளவு விலங்கு ஆய்வுகளில் 3,4 காணப்பட்ட சீரற்ற மரபணு வெளிப்பாட்டு வடிவங்களை விளக்க உதவும் வகையில், எலிகளின் மூக்கு மற்றும் நுரையீரல் காற்றுப்பாதைகளில் போலி வெக்டர் மருந்தளவு வழங்கப்பட்டதைத் தொடர்ந்து ஏற்படும் திரவ இயக்கத்தை நாங்கள் காட்சிப்படுத்தினோம்.
உயிருள்ள எலிகளின் மூச்சுக்குழாயில், தொடர்ச்சியான காந்தத் துகள்களின் (MPs) உயிருள்ள இயக்கங்களை சின்க்ரோட்ரான் PB-PCXI கருவியைப் பயன்படுத்தி காட்சிப்படுத்துவதே இந்த ஆய்வின் நோக்கமாக இருந்தது. இந்த PB-PCXI படமெடுப்பு ஆய்வுகள், காந்தத் துகள்களின் இயக்கத்தில் அவற்றின் விளைவைத் தீர்மானிக்க, பல்வேறு வகையான காந்தத் துகள்கள், காந்தப்புல வலிமைகள் மற்றும் இடங்களைச் சோதிக்கும் வகையில் வடிவமைக்கப்பட்டன. வெளிப்புறமாகப் பயன்படுத்தப்படும் ஒரு காந்தப்புலம், செலுத்தப்பட்ட காந்தத் துகள்கள் இலக்குப் பகுதியில் தங்குவதற்கோ அல்லது நகர்வதற்கோ உதவும் என்று நாங்கள் கருதுகோள் கொண்டோம். இந்த ஆய்வுகள், துகள்கள் படியவைக்கப்பட்ட பிறகு மூச்சுக்குழாயில் தக்கவைக்கப்படும் துகள்களின் எண்ணிக்கையை அதிகப்படுத்தும் காந்த உள்ளமைப்புகளை அடையாளம் காணவும் எங்களுக்கு உதவின. இரண்டாவது தொடர் ஆய்வுகளில், மூச்சுக்குழாயை இலக்காகக் கொண்டு இடது வென்ட்ரிக்கிள்-காந்தத் துகள்களை (LV-MPs) செலுத்துவது, மேம்பட்ட இடது வென்ட்ரிக்கிள் கடத்தல் செயல்திறனுக்கு வழிவகுக்கும் என்ற அனுமானத்தின் அடிப்படையில், இந்த உகந்த உள்ளமைப்பைப் பயன்படுத்தி, எலியின் சுவாசப்பாதைக்கு உயிருள்ள நிலையில் இடது வென்ட்ரிக்கிள்-காந்தத் துகள்களைச் செலுத்துவதால் ஏற்படும் கடத்தல் முறையை நிரூபிக்க முயன்றோம்.
அனைத்து விலங்கு ஆய்வுகளும் அடிலெய்டு பல்கலைக்கழகம் (M-2019-060 மற்றும் M-2020-022) மற்றும் ஸ்பிரிங்-8 சின்க்ரோட்ரான் விலங்கு நெறிமுறைக் குழு ஆகியவற்றால் அங்கீகரிக்கப்பட்ட நெறிமுறைகளின்படி மேற்கொள்ளப்பட்டன. பரிசோதனைகள் ARRIVE வழிகாட்டுதல்களின்படி செய்யப்பட்டன.
அனைத்து எக்ஸ்-கதிர் படமாக்கலும் ஜப்பானில் உள்ள SPring-8 சின்க்ரோட்ரானில் உள்ள BL20XU பீம்லைனில், முன்னர் விவரிக்கப்பட்டதைப் போன்ற ஒரு அமைப்பைப் பயன்படுத்தி நிகழ்த்தப்பட்டது21,22. சுருக்கமாக, சோதனைப் பெட்டியானது சின்க்ரோட்ரான் சேமிப்பு வளையத்திலிருந்து 245 மீ தொலைவில் அமைந்திருந்தது. துகள் படமாக்கல் ஆய்வுகளுக்கு 0.6 மீ மாதிரிக்கும் உணரிக்கும் இடையிலான தூரமும், கட்ட வேறுபாட்டு விளைவுகளை உருவாக்குவதற்காக உயிருள்ள உயிரினங்களுக்குள் செய்யப்படும் படமாக்கல் ஆய்வுகளுக்கு 0.3 மீ தூரமும் பயன்படுத்தப்பட்டது. 25 keV ஒற்றை நிறக் கற்றை ஆற்றல் பயன்படுத்தப்பட்டது. sCMOS உணரியுடன் இணைக்கப்பட்ட உயர்-தெளிவுத்திறன் எக்ஸ்-கதிர் மாற்றி (SPring-8 BM3) மூலம் படங்கள் பிடிக்கப்பட்டன. இந்த மாற்றி, 10 µm தடிமன் கொண்ட ஒரு ஸ்கின்டிலேட்டரைப் (Gd3Al2Ga3O12) பயன்படுத்தி எக்ஸ்-கதிர்களைக் கண்ணுக்குப் புலப்படும் ஒளியாக மாற்றுகிறது, பின்னர் அந்த ஒளி × 10 நுண்ணோக்கி லென்ஸைப் (NA 0.3) பயன்படுத்தி ஒரு sCMOS உணரிக்கு அனுப்பப்படுகிறது. பயன்படுத்தப்பட்ட sCMOS உணரி Orca-Flash4.0 (ஹமாமாட்சு ஃபோட்டோனிக்ஸ், ஜப்பான்) ஆகும். 2048 × 2048 பிக்சல்கள் கொண்ட அணி அளவு மற்றும் 6.5 × 6.5 µm மூல பிக்சல் அளவுடன், இந்த அமைப்பு 0.51 µm பயனுள்ள ஐசோட்ரோபிக் பிக்சல் அளவையும், தோராயமாக 1.1 மிமீ × 1.1 மிமீ பார்வைப் புலத்தையும் அளிக்கிறது. சுவாசத்தினால் ஏற்படும் அசைவுக் குறைபாடுகளைக் குறைக்கும் அதே வேளையில், சுவாசப்பாதைக்கு உள்ளேயும் வெளியேயும் உள்ள காந்தத் துகள்களின் சிக்னல்-டு-நாய்ஸ் விகிதத்தை அதிகரிக்க 100 மில்லி விநாடிகள் வெளிப்பாட்டுக் காலம் தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டது. உயிருள்ள உயிரினங்களில் செய்யப்படும் ஆய்வுகளுக்காக, வெளிப்பாடுகளுக்கு இடையில் எக்ஸ்-கதிர் கற்றையைத் தடுத்து, கதிர்வீச்சு அளவைக் கட்டுப்படுத்த, எக்ஸ்-கதிர் பாதையில் ஒரு வேகமான எக்ஸ்-கதிர் ஷட்டர் வைக்கப்பட்டது.
SPring-8 PB-PCXI படமெடுப்பு ஆய்வுகள் எதிலும் LV கேரியர் பயன்படுத்தப்படவில்லை, ஏனெனில் BL20XU படமெடுப்பு அறைக்கு உயிரியல் பாதுகாப்பு நிலை 2 சான்றிதழ் வழங்கப்படவில்லை. அதற்குப் பதிலாக, கண்ணாடி நுண்குழாய்களுக்குள் காந்தப்புலங்கள் மைக்ரோபிளாஸ்டிக் இயக்கத்தை எவ்வாறு பாதிக்கின்றன என்பதை முதலில் புரிந்துகொள்வதற்காகவும், பின்னர் உயிருள்ள காற்றுப்பாதைகளில் அவற்றைப் புரிந்துகொள்வதற்காகவும், இரண்டு வணிக வழங்குநர்களிடமிருந்து பல்வேறு அளவுகள், பொருட்கள், இரும்புச் செறிவுகள் மற்றும் பயன்பாடுகளை உள்ளடக்கிய, நன்கு வகைப்படுத்தப்பட்ட மைக்ரோபிளாஸ்டிக்குகளின் ஒரு தொகுப்பை நாங்கள் தேர்ந்தெடுத்தோம். மேற்பரப்பில். காந்தத் துகள்கள் (MPs) 0.25 முதல் 18 μm வரையிலான அளவுகளில் உள்ளன மற்றும் பல்வேறு பொருட்களால் ஆனவை (அட்டவணை 1-ஐப் பார்க்கவும்), ஆனால் ஒவ்வொரு மாதிரியின் கலவையும், காந்தத் துகள்களுக்குள் உள்ள காந்தத் துகள்களின் அளவு உட்பட, அறியப்படவில்லை. எங்களின் விரிவான MCT ஆய்வுகள் 19, 20, 21, 23, 24-இன் அடிப்படையில், 5 μm அளவுள்ள சிறிய காந்தத் துகள்களைக் கூட மூச்சுக்குழாய் காற்றுப்பாதையின் மேற்பரப்பில் காண முடியும் என்று நாங்கள் எதிர்பார்க்கிறோம்; எடுத்துக்காட்டாக, காந்தத் துகள்களின் இயக்கத்தின் மேம்பட்ட பார்வையைப் பெற, அடுத்தடுத்த பிரேம்களைக் கழிப்பதன் மூலம் இதைக் காணலாம். ஒரு 0.25 μm அளவுள்ள காந்தத் துகள், படமெடுக்கும் கருவியின் பிரிதிறனை விடச் சிறியது, ஆனால் PB-PCXI அவற்றின் கன அளவு வேறுபாட்டையும், அவை படிந்த பிறகு மேற்பரப்புத் திரவத்தின் இயக்கத்தையும் கண்டறியும் என்று எதிர்பார்க்கப்படுகிறது.
அட்டவணை 1-இல் உள்ள ஒவ்வொரு MP-க்கான மாதிரிகளும், 0.63 மிமீ உள்விட்டம் கொண்ட 20 μl கண்ணாடி நுண்குழாய்களில் (டிரம்மாண்ட் மைக்ரோகேப்ஸ், PA, USA) தயாரிக்கப்பட்டன. துகள் துகள்கள் நீரில் கிடைக்கின்றன, அதேசமயம் காம்பிமேக் துகள்கள் உற்பத்தியாளரின் தனியுரிம திரவத்தில் கிடைக்கின்றன. ஒவ்வொரு குழாயும் திரவத்தால் பாதியளவு (சுமார் 11 μl) நிரப்பப்பட்டு, மாதிரி தாங்கியில் வைக்கப்பட்டது (படம் 1-ஐப் பார்க்கவும்). கண்ணாடி நுண்குழாய்கள், இமேஜிங் பெட்டியில் உள்ள மாதிரி மேடையில் கிடைமட்டமாக வைக்கப்பட்டு, திரவத்தின் விளிம்புகளில் நிலைநிறுத்தப்பட்டன. இமேஜிங்கின் போது அதன் நிலையைத் தொலைவிலிருந்து மாற்றுவதற்காக, 1.17 டெஸ்லா எஞ்சிய காந்தமாக்கல் கொண்ட 19 மிமீ விட்டம் (28 மிமீ நீளம்) கொண்ட நிக்கல் உறை அரிய புவி நியோடைமியம் இரும்பு போரான் (NdFeB) காந்தம் (N35, பட்டியல் எண். LM1652, ஜேக்கார் எலக்ட்ரானிக்ஸ், ஆஸ்திரேலியா) ஒரு தனி நகர்வு மேடையில் இணைக்கப்பட்டது. காந்தம் மாதிரிக்கு மேலே சுமார் 30 மிமீ உயரத்தில் நிலைநிறுத்தப்படும்போது எக்ஸ்-கதிர் படமெடுத்தல் தொடங்குகிறது, மேலும் படங்கள் ஒரு குறிப்பிட்ட விகிதத்தில் பெறப்படுகின்றன. வினாடிக்கு 4 பிரேம்கள் என்ற அளவில். படமெடுக்கும்போது, ​​காந்தப்புல வலிமை மற்றும் நிலையின் விளைவுகளை மதிப்பிடுவதற்காக, காந்தம் கண்ணாடி நுண்குழாய்க்கு அருகில் (சுமார் 1 மிமீ தொலைவில்) கொண்டுவரப்பட்டு, பின்னர் குழாய் நெடுகிலும் நகர்த்தப்பட்டது.
மாதிரி xy நகர்வு மேடையின் மீது, கண்ணாடி நுண்குழாய்களில் MP மாதிரிகளைக் கொண்ட இன் விட்ரோ படமெடுக்கும் அமைப்பு. எக்ஸ்-கதிர் கற்றையின் பாதை ஒரு சிவப்பு புள்ளியிட்ட கோட்டால் குறிக்கப்பட்டுள்ளது.
MP-களின் இன் விட்ரோ புலப்படுதன்மை நிறுவப்பட்டவுடன், அவற்றின் ஒரு துணைக்குழு காட்டு வகை பெண் அல்பினோ விஸ்டார் எலிகளில் (~12 வார வயது, ~200 கிராம்) இன் விவோவில் சோதிக்கப்பட்டது. 0.24 மி.கி/கி.கி மெடெடோமிடின் (டோமிட்டர்®, ஜெனோவாக், ஜப்பான்), 3.2 மி.கி/கி.கி மிடாசோலம் (டார்மிகம்®, அஸ்டெல்லாஸ் பார்மா, ஜப்பான்) மற்றும் 4 மி.கி/கி.கி புட்டோர்பனால் (வெட்டோர்பேல்®, மெய்ஜி செய்கா) ஆகியவற்றின் கலவையைக் கொண்டு எலிகளுக்கு வயிற்றுக்குள்ளான ஊசி மூலம் மயக்க மருந்து கொடுக்கப்பட்டது. மயக்க மருந்துக்குப் பிறகு, மூச்சுக்குழாயைச் சுற்றியுள்ள உரோமத்தை அகற்றி, ஒரு எண்டோட்ராக்கியல் குழாயைச் (ET; 16 Ga iv கேனுலா, டெருமோ BCT) செருகி, உடல் வெப்பநிலையைப் பராமரிக்க வெப்பப் பை கொண்ட பிரத்யேகமாக உருவாக்கப்பட்ட இமேஜிங் தட்டில் அவற்றை மல்லாக்கப் படுக்க வைத்து இமேஜிங்கிற்குத் தயார்ப்படுத்தப்பட்டன. பின்னர், மூச்சுக்குழாயை கிடைமட்டமாக சீரமைப்பதற்காக, இமேஜிங் தட்டு இமேஜிங் பெட்டியில் உள்ள மாதிரி நகர்த்தும் மேடையுடன் ஒரு சிறிய கோணத்தில் இணைக்கப்பட்டது. படம் 2a-வில் காட்டப்பட்டுள்ளபடி, எக்ஸ்-ரே படத்தில்.
(அ) ​​ஸ்பிரிங்-8 இமேஜிங் பெட்டியில் உள்ள இன் விவோ இமேஜிங் அமைப்பில், எக்ஸ்-கதிர் கற்றையின் பாதை ஒரு சிவப்பு புள்ளியிட்ட கோட்டால் குறிக்கப்பட்டுள்ளது. (ஆ, இ) செங்குத்தாக பொருத்தப்பட்ட இரண்டு IP கேமராக்களைப் பயன்படுத்தி, மூச்சுக்குழாயில் காந்தத்தின் இருப்பிடத்தை தொலைவிலிருந்து கண்டறியப்பட்டது. திரைப் படத்தின் இடது பக்கத்தில், தலையைப் பிடித்திருக்கும் கம்பி வளையத்தையும், ET குழாயினுள் பொருத்தப்பட்டிருக்கும் டெலிவரி கேனுலாவையும் காணலாம்.
100 μl கண்ணாடி சிரிஞ்சைப் பயன்படுத்தும் ஒரு ரிமோட்-கண்ட்ரோல்டு சிரிஞ்ச் பம்ப் சிஸ்டம் (UMP2, வேர்ல்ட் பிரசிஷன் இன்ஸ்ட்ரூமென்ட்ஸ், சரசோட்டா, FL), 30 Ga ஊசி வழியாக PE10 குழாயுடன் (வெளி விட்டம் 0.61 மிமீ, உள் விட்டம் 0.28 மிமீ) இணைக்கப்பட்டது. ET குழாயைச் செருகும்போது, ​​அதன் முனை மூச்சுக்குழாயில் சரியான நிலையில் இருப்பதை உறுதிசெய்ய, குழாயில் குறிக்கவும். மைக்ரோபம்பைப் பயன்படுத்தி, குழாயின் முனை செலுத்தப்பட வேண்டிய MP மாதிரியில் மூழ்கியிருக்கும்போது, ​​சிரிஞ்ச் பிளஞ்சர் பின்வாங்கப்பட்டது. பின்னர், ஏற்றப்பட்ட விநியோகக் குழாய் எண்டோட்ராக்கியல் குழாயில் செருகப்பட்டது, அதன் முனை நாம் எதிர்பார்க்கும் பயன்படுத்தப்பட்ட காந்தப்புலத்தின் வலிமையான பகுதிக்குள் வைக்கப்பட்டது. நமது ஆர்டுயினோ அடிப்படையிலான டைமிங் பாக்ஸுடன் இணைக்கப்பட்ட ஒரு சுவாச உணரியைப் பயன்படுத்தி படமெடுத்தல் கட்டுப்படுத்தப்பட்டது, மேலும் அனைத்து சமிக்ஞைகளும் (எ.கா. வெப்பநிலை, சுவாசம், ஷட்டர் திறத்தல்/மூடுதல் மற்றும் படமெடுத்தல்) பவர்லேப் மற்றும் லேப்சார்ட் (AD இன்ஸ்ட்ரூமென்ட்ஸ், சிட்னி, ஆஸ்திரேலியா) 22 ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்தி பதிவு செய்யப்பட்டன. படமெடுக்கும்போது, ​​உறை அணுக முடியாத நிலையில், இரண்டு IP கேமராக்கள் பயன்படுத்தப்பட்டன. (பானாசோனிக் BB-SC382) கருவிகள் ஒன்றுக்கொன்று சுமார் 90° கோணத்தில் நிலைநிறுத்தப்பட்டு, படமெடுக்கும் போது மூச்சுக்குழாயைப் பொறுத்து காந்தத்தின் நிலையைக் கண்காணிக்கப் பயன்படுத்தப்பட்டன (படம் 2b,c). அசைவுக் குறைபாடுகளைக் குறைப்பதற்காக, இறுதி-மூச்சு ஓட்டச் சமநிலையின் போது ஒவ்வொரு சுவாசத்திற்கும் ஒரு படம் எடுக்கப்பட்டது.
படமெடுக்கும் உறைக்கு வெளியே இருந்து தொலைவில் வைக்கக்கூடிய ஒரு இரண்டாம் நிலையுடன் ஒரு காந்தம் இணைக்கப்பட்டுள்ளது. பல்வேறு காந்த நிலைகள் மற்றும் உள்ளமைவுகள் சோதிக்கப்பட்டன, அவற்றுள்: மூச்சுக்குழாயின் மேலே சுமார் 30° கோணத்தில் பொருத்துதல் (படம் 2a மற்றும் 3a-வில் காட்டப்பட்டுள்ள உள்ளமைவுகள்); விலங்கின் மேலே ஒரு காந்தமும், கீழே மற்றொன்றும், துருவங்கள் ஈர்க்கும் வகையில் அமைக்கப்பட்டிருத்தல் (படம் 3b); விலங்கின் மேலே ஒரு காந்தமும், கீழே மற்றொன்றும், துருவங்கள் விலக்கும் வகையில் அமைக்கப்பட்டிருத்தல் (படம் 3c); மற்றும் மூச்சுக்குழாயின் மேலே செங்குத்தாக ஒரு காந்தம் (படம் 3d). விலங்கும் காந்தமும் உள்ளமைக்கப்பட்டு, சோதிக்கப்பட வேண்டிய MP ஊசி பம்பில் ஏற்றப்பட்டவுடன், படங்களை எடுத்துக்கொண்டே 50 μl அளவை வினாடிக்கு 4 μl என்ற விகிதத்தில் செலுத்தவும். பின்னர், படங்களைத் தொடர்ந்து எடுத்துக்கொண்டே, காந்தம் மூச்சுக்குழாயின் குறுக்கே அல்லது பக்கவாட்டில் முன்னும் பின்னுமாக நகர்த்தப்படுகிறது.
உயிருள்ள திசுக்களில் படமெடுப்பதற்கான காந்த அமைப்பு (அ) மூச்சுக்குழாயின் மேலே சுமார் 30° கோணத்தில் ஒரு ஒற்றைக் காந்தம், (ஆ) ஈர்க்கும் வகையில் அமைக்கப்பட்ட இரண்டு காந்தங்கள், (இ) விலக்கும் வகையில் அமைக்கப்பட்ட இரண்டு காந்தங்கள், (ஈ) மூச்சுக்குழாயின் மேலே செங்குத்தாக ஒரு ஒற்றைக் காந்தம். உற்றுநோக்குபவர் வாயிலிருந்து மூச்சுக்குழாய் வழியாக நுரையீரல்களைப் பார்த்தார், மேலும் எக்ஸ்-கதிர் கற்றையானது எலியின் இடது பக்கத்தின் வழியாகச் சென்று வலது பக்கத்தில் வெளியேறியது. காந்தமானது சுவாசப்பாதையின் நீளத்திற்கு இணையாகவோ அல்லது எக்ஸ்-கதிர் கற்றையின் திசையில் மூச்சுக்குழாயின் மேலே இடது மற்றும் வலதுபுறமாகவோ நகர்த்தப்படுகிறது.
குழப்பத்தை ஏற்படுத்தும் சுவாசம் மற்றும் இதய அசைவு இல்லாத நிலையில், சுவாசப்பாதைகளில் துகள்களின் தெரிவுநிலை மற்றும் நடத்தையைத் தீர்மானிக்கவும் நாங்கள் முயன்றோம். எனவே, படமெடுக்கும் காலத்தின் முடிவில், பென்டோபார்பிட்டால் (சோம்னோபென்டில், பிட்மேன்-மூர், வாஷிங்டன் கிராசிங், அமெரிக்கா; ~65 மி.கி/கி.கி ஐ.பி) அதிக அளவில் கொடுக்கப்பட்டதால், விலங்குகள் மனிதாபிமான முறையில் கொல்லப்பட்டன. சில விலங்குகள் படமெடுக்கும் தளத்திலேயே விடப்பட்டன, மேலும் சுவாசம் மற்றும் இதயத் துடிப்பு நின்றவுடன், சுவாசப்பாதையின் மேற்பரப்பில் MP எதுவும் தெரியவில்லை என்றால், கூடுதலாக MP மருந்தளவு சேர்க்கப்பட்டு, படமெடுக்கும் செயல்முறை மீண்டும் செய்யப்பட்டது.
பெறப்பட்ட படங்கள், பிளாட்-ஃபீல்ட் மற்றும் டார்க்-ஃபீல்ட் திருத்தம் செய்யப்பட்டு, பின்னர் மேட்லேபில் (R2020a, தி மேத்வொர்க்ஸ்) எழுதப்பட்ட ஒரு பிரத்யேக ஸ்கிரிப்டைப் பயன்படுத்தி ஒரு காணொளியாக (வினாடிக்கு 20 பிரேம்கள்; சுவாச விகிதத்தைப் பொறுத்து இயல்பான வேகத்தை விட 15-25 மடங்கு) தொகுக்கப்பட்டன.
அனைத்து LV மரபணு கடத்தி விநியோக ஆய்வுகளும் அடிலெய்டு பல்கலைக்கழகத்தின் ஆய்வக விலங்கு ஆராய்ச்சி மையத்தில் நடத்தப்பட்டன. காந்தப்புலத்தின் முன்னிலையில் LV-MP விநியோகம், உயிருள்ள உயிரினங்களில் மரபணுப் பரிமாற்றத்தை மேம்படுத்துமா என்பதை மதிப்பிடுவதற்கு, SPring-8 சோதனையின் முடிவுகளைப் பயன்படுத்துவதே இந்த ஆய்வுகளின் நோக்கமாக இருந்தது. MP மற்றும் காந்தப்புலத்தின் விளைவுகளை மதிப்பிடுவதற்காக, இரண்டு விலங்குக் குழுக்களுக்கு சிகிச்சை அளிக்கப்பட்டது: ஒரு குழுவிற்கு காந்தம் பொருத்தப்பட்ட LV-MP வழங்கப்பட்டது, மற்ற குழுவிற்கு காந்தம் இல்லாத LV-MP கொண்ட ஒரு கட்டுப்பாட்டுக் குழு வழங்கப்பட்டது.
முன்னர் விவரிக்கப்பட்ட முறைகளைப் பயன்படுத்தி LV மரபணு வெக்டர்கள் உருவாக்கப்பட்டன 25, 26. LacZ வெக்டர், நிலையான MPSV ஊக்குவிப்பானால் (LV-LacZ) இயக்கப்படும் உட்கருவில் அமைந்த பீட்டா-கேலக்டோசிடேஸ் மரபணுவை வெளிப்படுத்துகிறது. இது மாற்றப்பட்ட செல்களில் ஒரு நீல நிற வினை விளைபொருளை உருவாக்குகிறது, இது நுரையீரல் திசு முகப்புகள் மற்றும் திசுப் பிரிவுகளில் தெரியும். செல் வளர்ப்புகளில், ஹீமோசைட்டோமீட்டரைப் பயன்படுத்தி LacZ நேர்மறை செல்களின் எண்ணிக்கையை கைமுறையாக எண்ணி, TU/ml இல் டைட்டரைக் கணக்கிட டைட்ரேஷன் செய்யப்பட்டது. கேரியர்கள் -80 °C இல் உறைநிலையில் பாதுகாக்கப்படுகின்றன, பயன்பாட்டிற்கு முன் உருக வைக்கப்படுகின்றன, மேலும் 1:1 விகிதத்தில் கலந்து, விநியோகத்திற்கு குறைந்தது 30 நிமிடங்களுக்கு முன் பனிக்கட்டியில் வைத்து காம்பிமேக்குடன் பிணைக்கப்படுகின்றன.
சாதாரண ஸ்ப்ராக் டாவ்லி எலிகள் (n = 3/குழு, சுமார் 2-3 எலிகளுக்கு 0.4 மி.கி/கி.கி மெடெடோமிடின் (டோமிட்டர், இலியம், ஆஸ்திரேலியா) மற்றும் 60 மி.கி/கி.கி கெட்டமைன் (இலியம், ஆஸ்திரேலியா) ஆகியவற்றின் கலவையைக் கொண்டு வயிற்றுக்குள்ளாக மயக்க மருந்து கொடுக்கப்பட்டது (ஒரு மாத வயதுடையவை) மற்றும் 16 Ga நரம்புவழி குழாய் மூலம் அறுவை சிகிச்சையற்ற வாய்வழி குழாய் செருகல் செய்யப்பட்டது. மூச்சுக்குழாய் காற்றுவழி திசு LV டிரான்ஸ்டக்ஷனைப் பெறுவதை உறுதிசெய்ய, அது நாங்கள் முன்பு விவரித்த இயந்திர இடையூறு நெறிமுறையைப் பயன்படுத்தி தயார் செய்யப்பட்டது, இதில் மூச்சுக்குழாய் காற்றுவழி மேற்பரப்பு ஒரு கம்பி கூடையால் (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, குக் மெடிக்கல், அமெரிக்கா) 30 வி 28 வினாடிகளுக்கு அச்சுவழியாகத் தேய்க்கப்பட்டது. பின்னர், இடையூறு ஏற்பட்ட சுமார் 10 நிமிடங்களுக்குப் பிறகு, ஒரு உயிரியல் பாதுகாப்பு அறையில் மூச்சுக்குழாய் வழியாக LV-MP செலுத்தப்பட்டது.
இந்தச் சோதனையில் பயன்படுத்தப்பட்ட காந்தப்புலம், இன் விவோ எக்ஸ்-ரே இமேஜிங் ஆய்வைப் போலவே கட்டமைக்கப்பட்டது. இதில், அதே காந்தங்கள் டிஸ்டிலேஷன் ஸ்டென்ட் கிளிப்களைப் பயன்படுத்தி மூச்சுக்குழாயின் மேலே பொருத்தப்பட்டன (படம் 4). முன்னர் விவரிக்கப்பட்டபடி, ஜெல் முனை கொண்ட ஒரு பிப்பெட்டைப் பயன்படுத்தி, 50 μl அளவுள்ள (2 × 25 μl அளவுகள்) LV-MP மூச்சுக்குழாயினுள் செலுத்தப்பட்டது (n = 3 விலங்குகள்). ஒரு கட்டுப்பாட்டுக் குழுவிற்கு (n = 3 விலங்குகள்) காந்தம் பயன்படுத்தப்படாமல் அதே LV-MP-கள் வழங்கப்பட்டன. உட்செலுத்துதல் முடிந்த பிறகு, ET குழாயிலிருந்து கேனுலா அகற்றப்பட்டு, விலங்கின் சுவாசக்குழாய் அகற்றப்பட்டது. காந்தம் 10 நிமிடங்களுக்கு அதே இடத்தில் வைக்கப்பட்டு, பின்னர் அகற்றப்பட்டது. எலிகளுக்கு தோலடி வழியாக மெலோக்ஸிகாம் (1 ml/kg) (இலியம், ஆஸ்திரேலியா) வழங்கப்பட்டது. அதனைத் தொடர்ந்து, 1 mg/kg அடிபமாசோல் ஹைட்ரோகுளோரைடு (ஆன்டிசிடான், சோயெடிஸ், ஆஸ்திரேலியா) வயிற்றுக்குள்ளான ஊசி மூலம் செலுத்தப்பட்டு மயக்கநிலை மீட்கப்பட்டது. எலிகள் முழுமையாக மீளும் வரை கதகதப்பாக வைக்கப்பட்டு கண்காணிக்கப்பட்டன. மயக்க மருந்து.
உயிரியல் பாதுகாப்பு பெட்டகத்தில் உள்ள LV-MP செலுத்தும் சாதனம். ET குழாயின் வெளிர் சாம்பல் நிற லூயர் ஹப் வாயிலிருந்து வெளியே நீட்டிக்கொண்டிருப்பதைக் காணலாம். மேலும், படத்தில் காட்டப்பட்டுள்ள பிப்பெட்டின் ஜெல் முனையானது, ET குழாய் வழியாக மூச்சுக்குழாயினுள் விரும்பிய ஆழத்திற்குச் செருகப்பட்டுள்ளது.
LV-MP மருந்தளிப்பு செயல்முறைக்கு ஒரு வாரம் கழித்து, விலங்குகள் 100% CO2 உள்ளிழுத்தல் மூலம் மனிதாபிமான முறையில் கொல்லப்பட்டன, மேலும் எங்களின் நிலையான X-gal சிகிச்சையைப் பயன்படுத்தி LacZ வெளிப்பாடு மதிப்பிடப்பட்டது. எண்டோட்ராக்கியல் குழாய் பொருத்துதலால் ஏற்படும் எந்தவொரு இயந்திர சேதமும் அல்லது திரவத் தேக்கமும் பகுப்பாய்வில் சேர்க்கப்படவில்லை என்பதை உறுதி செய்வதற்காக, வால் பகுதியின் கடைசியில் உள்ள மூன்று குருத்தெலும்பு வளையங்கள் அகற்றப்பட்டன. பகுப்பாய்விற்காக ஒவ்வொரு மூச்சுக்குழலும் நீளவாக்கில் இரண்டு பாதிகளாக வெட்டப்பட்டது, மேலும் உள்ளக மேற்பரப்பைக் காண்பதற்காக, மினூஷியன் ஊசியைப் (ஃபைன் சயின்ஸ் டூல்ஸ்) பயன்படுத்தி சிலிக்கான் ரப்பர் (சில்கார்ட், டவ் இன்க்) கொண்ட ஒரு தட்டில் அவை பொருத்தப்பட்டன. டிஜிலைட் கேமரா மற்றும் TCapture மென்பொருளுடன் (டக்ஸன் ஃபோட்டோனிக்ஸ், சீனா) கூடிய நிகான் நுண்ணோக்கியைப் (SMZ1500) பயன்படுத்தி முன்பக்கப் புகைப்படம் எடுத்தல் மூலம் மாற்றப்பட்ட செல்களின் பரவல் மற்றும் அமைப்பு உறுதி செய்யப்பட்டது. படங்கள் 20x உருப்பெருக்கத்தில் (மூச்சுக்குழலின் முழு அகலத்திற்கான மிக உயர்ந்த அமைப்பு உட்பட) பெறப்பட்டன, மூச்சுக்குழலின் முழு நீளமும் படிப்படியாகப் படம்பிடிக்கப்பட்டது, ஒவ்வொரு படத்திற்கும் இடையில் போதுமான ஒன்றுடன் ஒன்று பொருந்துவதை உறுதிசெய்து, படப்பிடிப்பை அனுமதித்தது. ஒவ்வொரு மூச்சுக்குழலின் படங்களும், ஒரு தள இயக்க நெறிமுறையைப் பயன்படுத்தி, இமேஜ் காம்போசிட் எடிட்டர் v2.0.3 (மைக்ரோசாஃப்ட் ரிசர்ச்) மூலம் ஒரே கூட்டுப் படமாக ஒன்றிணைக்கப்பட்டன. ஒவ்வொரு விலங்கின் மூச்சுக்குழல் கூட்டுப் படங்களில் உள்ள LacZ வெளிப்பாட்டுப் பகுதிகள், முன்பு விவரிக்கப்பட்டபடி, 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15, மற்றும் Value < 0.7 ஆகிய அமைப்புகளைப் பயன்படுத்தி, ஒரு தானியங்கு MATLAB ஸ்கிரிப்ட் (R2020a, MathWorks) மூலம் அளவிடப்பட்டன. திசுவின் வெளிப்புறக் கோடுகளை வரைவதன் மூலம், திசுப் பகுதியைக் கண்டறிவதற்கும், மூச்சுக்குழல் திசுவிற்கு வெளியே இருந்து வரும் தவறான கண்டறிதல்களைத் தடுப்பதற்கும், ஒவ்வொரு கூட்டுப் படத்திற்கும் GIMP v2.10.24-இல் கைமுறையாக ஒரு முகமூடி உருவாக்கப்பட்டது. ஒவ்வொரு விலங்கின் அனைத்து கூட்டுப் படங்களிலிருந்தும் கறை படிந்த பகுதிகள் கூட்டப்பட்டு, அந்த விலங்கிற்கான மொத்த கறை படிந்த பகுதி உருவாக்கப்பட்டது. பின்னர், கறை படிந்த பகுதி மொத்த முகமூடிப் பகுதியால் வகுக்கப்பட்டு, இயல்பாக்கப்பட்ட பகுதி உருவாக்கப்பட்டது.
ஒவ்வொரு மூச்சுக்குழாயும் பாரஃபினில் பதிக்கப்பட்டு, 5 μm தடிமன் கொண்ட துண்டுகள் வெட்டப்பட்டன. அந்தத் துண்டுகளுக்கு 5 நிமிடங்களுக்கு நியூட்ரல் ஃபாஸ்ட் ரெட் கொண்டு எதிர்சாயமிடப்பட்டு, நிகான் எக்லிப்ஸ் E400 நுண்ணோக்கி, DS-Fi3 கேமரா மற்றும் NIS எலிமென்ட் கேப்சர் மென்பொருள் (பதிப்பு 5.20.00) ஆகியவற்றைப் பயன்படுத்திப் படங்கள் எடுக்கப்பட்டன.
அனைத்து புள்ளிவிவரப் பகுப்பாய்வுகளும் GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) இல் மேற்கொள்ளப்பட்டன. புள்ளிவிவர முக்கியத்துவம் p ≤ 0.05 என நிர்ணயிக்கப்பட்டது. ஷாபிரோ-வில்க் சோதனையைப் பயன்படுத்தி இயல்புநிலை சரிபார்க்கப்பட்டது, மேலும் இணை அற்ற t-சோதனையைப் பயன்படுத்தி LacZ சாயமேற்றத்தில் உள்ள வேறுபாடுகள் மதிப்பிடப்பட்டன.
அட்டவணை 1-இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ள ஆறு நுண்துகள்களும் PCXI-ஐப் பயன்படுத்தி ஆய்வு செய்யப்பட்டன, மேலும் அவற்றின் புலப்படும் தன்மை அட்டவணை 2-இல் விவரிக்கப்பட்டுள்ளது. இரண்டு பாலிஸ்டிரீன் நுண்துகள்கள் (MP1 மற்றும் MP2; முறையே 18 μm மற்றும் 0.25 μm) PCXI-இன் கீழ் புலப்படவில்லை, ஆனால் மீதமுள்ள மாதிரிகள் அடையாளம் காணக்கூடியவையாக இருந்தன (எடுத்துக்காட்டுகள் படம் 5-இல் காட்டப்பட்டுள்ளன). MP3 மற்றும் MP4 (10-15% Fe3O4; முறையே 0.25 μm மற்றும் 0.9 μm) மங்கலாகப் புலப்படுகின்றன. சோதிக்கப்பட்ட மிகச்சிறிய துகள்களில் சிலவற்றைக் கொண்டிருந்தாலும், MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) மிகவும் தெளிவாகத் தெரிந்தது. காம்பிமேக் தயாரிப்பான MP6-ஐக் கண்டறிவது கடினம். எல்லா நிகழ்வுகளிலும், நுண்குழாய்க்கு இணையாக காந்தத்தை முன்னும் பின்னுமாக நகர்த்துவதன் மூலம் நுண்துகள்களைக் கண்டறியும் நமது திறன் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் மேம்படுத்தப்பட்டது. காந்தங்கள் நுண்குழாயிலிருந்து விலகிச் சென்றபோது, ​​துகள்கள் நீண்ட சரங்களாக விரிந்தன, ஆனால் காந்தங்கள் நெருங்கி வந்து காந்தப்புல வலிமை அதிகரித்தபோது, ​​துகள் சரங்கள் சுருங்கின. துகள்கள் நுண்குழாயின் மேல் மேற்பரப்பை நோக்கி நகர்ந்து (துணை காணொளி S1: MP4-ஐப் பார்க்கவும்), மேற்பரப்பின் துகள் அடர்த்தியை அதிகரித்தன. இதற்கு நேர்மாறாக, நுண்குழாயிலிருந்து காந்தம் அகற்றப்படும்போது, ​​புல வலிமை குறைந்து, நுண்துகள்கள் நுண்குழாயின் மேல் மேற்பரப்பிலிருந்து நீண்டு செல்லும் நீண்ட சரங்களாக மறுசீரமைக்கப்படுகின்றன (துணை காணொளி S2: MP4-ஐப் பார்க்கவும்). காந்தம் நகர்வதை நிறுத்திய பிறகு, துகள்கள் சமநிலை நிலையை அடைந்து சிறிது நேரத்திற்குத் தொடர்ந்து நகர்கின்றன. நுண்துகள்கள் நுண்குழாயின் மேல் மேற்பரப்பை நோக்கியும் அதிலிருந்து விலகியும் நகரும்போது, ​​காந்தத் துகள்கள் பொதுவாக சிதைவுகளை திரவத்தின் வழியே இழுத்துச் செல்கின்றன.
PCXI-இன் கீழ் MP-இன் புலப்படும்தன்மை மாதிரிகளுக்கு இடையில் கணிசமாக வேறுபடுகிறது. (அ) MP3, (ஆ) MP4, (இ) MP5 மற்றும் (ஈ) MP6. இங்கு காட்டப்பட்டுள்ள அனைத்துப் படங்களும் நுண்குழாய்க்கு நேர் மேலே சுமார் 10 மிமீ தொலைவில் அமைந்துள்ள ஒரு காந்தத்தைக் கொண்டு எடுக்கப்பட்டன. வெளிப்படையாகத் தெரியும் பெரிய வட்டங்கள் நுண்குழாய்களில் சிக்கியுள்ள காற்றுக்குமிழ்கள் ஆகும், இவை கட்ட வேறுபாட்டுப் படமாக்கலின் கருப்பு மற்றும் வெள்ளை விளிம்பு அம்சங்களைத் தெளிவாகக் காட்டுகின்றன. சிவப்புப் பெட்டியானது வேறுபாட்டை அதிகரிக்கும் உருப்பெருக்கத்தைக் கொண்டுள்ளது. அனைத்துப் படங்களிலும் உள்ள காந்த வரைபடங்களின் விட்டங்கள் சரியான அளவில் இல்லை என்பதையும், அவை காட்டப்பட்டுள்ளதை விட சுமார் 100 மடங்கு பெரியவை என்பதையும் கவனிக்கவும்.
நுண்குழாயின் மேற்புறத்தில் காந்தம் இடது மற்றும் வலதுபுறமாக நகர்த்தப்படும்போது, ​​MP சரத்தின் கோணம் காந்தத்துடன் நேர்கோட்டில் அமையுமாறு மாறுகிறது (படம் 6-ஐப் பார்க்கவும்), இதன் மூலம் காந்தப்புலக் கோடுகள் வரையறுக்கப்படுகின்றன. MP3-5-ஐப் பொறுத்தவரை, நாண் ஒரு வரம்புக் கோணத்தை அடைந்த பிறகு, துகள்கள் நுண்குழாயின் மேல் மேற்பரப்பில் இழுக்கப்படுகின்றன. இது பெரும்பாலும் காந்தப்புலம் மிகவும் வலிமையாக இருக்கும் இடத்திற்கு அருகில் MP-கள் பெரிய குழுக்களாக ஒன்றுகூடுவதற்கு வழிவகுக்கிறது (துணை காணொளி S3:MP5-ஐப் பார்க்கவும்). நுண்குழாயின் முனைக்கு அருகில் படமெடுக்கும்போதும் இது குறிப்பாகத் தெளிவாகத் தெரிகிறது, இது MP-கள் திரவ-காற்று இடைமுகத்தில் ஒன்றுசேர்ந்து குவிவதற்குக் காரணமாகிறது. MP3-5-ஐ விட வேறுபடுத்திக் காண்பது மிகவும் கடினமாக இருந்த MP6-இல் உள்ள துகள்கள், காந்தம் நுண்குழாயில் நகர்ந்தபோது இழுக்கப்படவில்லை, ஆனால் MP சரங்கள் பிரிந்து, துகள்களைப் பார்வைப் புலத்தில் விட்டுச் சென்றன (துணை காணொளி S4:MP6-ஐப் பார்க்கவும்). சில சந்தர்ப்பங்களில், படமெடுக்கும் இடத்திலிருந்து காந்தத்தை அதிக தூரம் நகர்த்துவதன் மூலம் செலுத்தப்பட்ட காந்தப்புலம் குறைக்கப்பட்டபோது, ​​மீதமுள்ள MP-கள் சரத்திலேயே இருந்துகொண்டு, புவியீர்ப்பு விசையால் குழாயின் கீழ் மேற்பரப்பிற்கு மெதுவாக இறங்கின (துணை காணொளி S5-ஐப் பார்க்கவும்). MP3).
நுண்குழாயின் மேலே காந்தம் வலப்புறமாக நகர்த்தப்படும்போது MP சரத்தின் கோணம் மாறுகிறது. (அ) MP3, (ஆ) MP4, (இ) MP5 மற்றும் (ஈ) MP6. சிவப்புப் பெட்டியில் மாறுபாட்டை அதிகரிக்கும் உருப்பெருக்கம் உள்ளது. இந்த நிலையான படங்களில் காண முடியாத முக்கியமான துகள் அமைப்பு மற்றும் இயக்கவியல் தகவல்களை துணை வீடியோக்கள் வெளிப்படுத்துவதால், அவை பயனுள்ளவையாக இருக்கின்றன என்பதைக் கவனிக்கவும்.
மூச்சுக்குழாயின் வழியே காந்தத்தை மெதுவாக முன்னும் பின்னுமாக நகர்த்துவது, உயிருள்ள உயிரினத்தில் (in vivo) நிகழும் சிக்கலான இயக்கத்தின் பின்னணியில் நுண்துகள்களைக் (MP) காட்சிப்படுத்த உதவுகிறது என்பதை எங்கள் சோதனைகள் காட்டின. பாலிஸ்டிரீன் மணிகள் (MP1 மற்றும் MP2) நுண்குழாயில் தெரியாததால், உயிருள்ள உயிரினத்தில் சோதனை செய்யப்படவில்லை. மீதமுள்ள நான்கு நுண்துகள்களும், காந்தத்தின் நீண்ட அச்சு மூச்சுக்குழாயின் மேலே, செங்குத்திலிருந்து சுமார் 30° கோணத்தில் இருக்கும்படி வைத்து உயிருள்ள உயிரினத்தில் சோதிக்கப்பட்டன (படம் 2b மற்றும் 3a-ஐப் பார்க்கவும்). ஏனெனில் இது நீண்ட நுண்துகள் சங்கிலிகளை உருவாக்கியதுடன், காந்தம் நிறுத்தப்பட்ட அமைப்பை விட அதிக செயல்திறன் மிக்கதாகவும் இருந்தது. MP3, MP4 மற்றும் MP6 ஆகியவை எந்தவொரு உயிருள்ள விலங்குகளின் மூச்சுக்குழாயிலும் கண்டறியப்படவில்லை. விலங்குகள் மனிதாபிமான முறையில் கொல்லப்பட்ட பிறகு, அவற்றின் சுவாசப்பாதைகள் படம்பிடிக்கப்பட்டபோது, ​​ஒரு சிரிஞ்ச் பம்ப் மூலம் கூடுதல் கனஅளவு சேர்க்கப்பட்ட போதிலும், துகள்கள் கண்ணுக்குத் தெரியாமல் இருந்தன. MP5 அதிகபட்ச இரும்பு ஆக்சைடு உள்ளடக்கத்தைக் கொண்டிருந்தது மற்றும் கண்ணுக்குத் தெரிந்த ஒரே துகளாக இருந்தது. எனவே, நுண்துகள்களின் உயிருள்ள உயிரினத்திலான (in vivo) நடத்தையை மதிப்பிடுவதற்கும் வகைப்படுத்துவதற்கும் இது பயன்படுத்தப்பட்டது.
MP செலுத்தப்படும்போது மூச்சுக்குழாயின் மீது காந்தத்தை வைப்பதால், அனைத்து MP-களும் அல்லாமல், பல MP-கள் பார்வைப் புலத்தில் குவிந்தன. மூச்சுக்குழாய்க்குள் நுழையும் துகள்கள், மனிதாபிமான முறையில் பலியிடப்பட்ட விலங்குகளில் சிறப்பாகக் காணப்படுகின்றன. படம் 7 மற்றும் துணை வீடியோ S6: MP5, வயிற்றுப்புற மூச்சுக்குழாயின் மேற்பரப்பில் துகள்கள் விரைவாகக் காந்தத்தால் பிடிக்கப்பட்டு சீரமைக்கப்படுவதைக் காட்டுகிறது, இது MP-களை மூச்சுக்குழாயின் விரும்பிய பகுதிகளுக்கு இயக்க முடியும் என்பதைக் குறிக்கிறது. MP செலுத்தப்பட்ட பிறகு மூச்சுக்குழாயின் தொலைதூரப் பகுதிகளில் தேடும்போது, ​​சில MP-கள் காரினாவிற்கு அருகில் காணப்பட்டன. திரவச் செயல்முறையின் போது அதிகபட்ச காந்தப்புல வலிமை கொண்ட பகுதி வழியாக அவை செலுத்தப்பட்டதால், அனைத்து MP-களையும் சேகரித்துத் தக்கவைக்க காந்தப்புல வலிமை போதுமானதாக இல்லை என்பதை இது உணர்த்துகிறது. இருப்பினும், படம் பிடிக்கப்பட்ட பகுதியைச் சுற்றி பிரசவத்திற்குப் பிந்தைய MP செறிவுகள் அதிகமாக இருந்தன. இது, பயன்படுத்தப்பட்ட காந்தப்புல வலிமை மிக அதிகமாக இருந்த காற்றுவழிப் பகுதிகளில் பல MP-கள் தங்கியிருந்தன என்பதைக் குறிக்கிறது.
சமீபத்தில் கருணைக்கொலை செய்யப்பட்ட ஒரு எலியின் மூச்சுக்குழாயில் MP5 செலுத்தப்படுவதற்கு (a) முன்பும், (b) பின்பும் எடுக்கப்பட்ட படங்கள். இதில் காந்தம் படமெடுக்கும் பகுதிக்கு நேர் மேலே நிலைநிறுத்தப்பட்டுள்ளது. படமெடுக்கப்பட்ட பகுதி இரண்டு குருத்தெலும்பு வளையங்களுக்கு இடையில் அமைந்துள்ளது. MP செலுத்தப்படுவதற்கு முன்பு, சுவாசப்பாதையில் சிறிதளவு திரவம் உள்ளது. சிவப்புப் பெட்டியில் மாறுபாட்டை அதிகரிக்கும் உருப்பெருக்கம் உள்ளது. இந்தப் படங்கள் துணை வீடியோ S6:MP5-இல் காட்டப்பட்டுள்ள வீடியோவிலிருந்து எடுக்கப்பட்டவை.
உயிருள்ள மூச்சுக்குழாயின் வழியே காந்தத்தை நகர்த்தும்போது, ​​நுண்குழாய்களில் காணப்படுவதைப் போலவே, காற்றுப்பாதையின் மேற்பரப்பிற்குள் MP சங்கிலியின் கோணம் மாறியது (படம் 8 மற்றும் துணை காணொளி S7:MP5-ஐப் பார்க்கவும்). இருப்பினும், எங்கள் ஆய்வில், நுண்குழாய்களில் செய்ய முடிவதைப் போல, உயிருள்ள காற்றுப்பாதையின் மேற்பரப்பில் MP-களை இழுத்துச் செல்ல முடியவில்லை. சில சமயங்களில், காந்தம் இடமும் வலமும் நகரும்போது MP சங்கிலி நீளமாகிறது. சுவாரஸ்யமாக, காந்தத்தை மூச்சுக்குழாயின் வழியே நீளவாக்கில் நகர்த்தும்போது துகள் சரம் மேற்பரப்பு திரவ அடுக்கின் ஆழத்தை மாற்றுவதாகவும், காந்தத்தை நேராக தலைக்கு மேல் நகர்த்தி துகள் சரத்தை செங்குத்து நிலைக்குச் சுழற்றும்போது அது விரிவடைவதாகவும் நாங்கள் கண்டறிந்தோம் (துணை காணொளி S7-ஐப் பார்க்கவும்). : MP5, 0:09-இல், கீழ் வலதுபுறம்). காந்தத்தை மூச்சுக்குழாயின் மேற்புறத்தில் பக்கவாட்டாக (அதாவது, மூச்சுக்குழாயின் நீளவாக்கில் செல்வதற்குப் பதிலாக விலங்கின் இடது அல்லது வலதுபுறமாக) நகர்த்தியபோது, ​​இயக்கத்தின் சிறப்பியல்பு முறை மாறியது. துகள்கள் நகரும்போது அவை தெளிவாகத் தெரிந்தன, ஆனால் காந்தம் மூச்சுக்குழாயிலிருந்து அகற்றப்பட்டபோது, ​​துகள் சரங்களின் முனைகள் தெரிய ஆரம்பித்தன (துணை வீடியோ S8:MP5-ஐப் பார்க்கவும், 0:08-இல் தொடங்குகிறது). இது, ஒரு கண்ணாடி நுண்குழாயில் செலுத்தப்பட்ட காந்தப்புலத்தின் கீழ் நாங்கள் கவனித்த MP நடத்தையுடன் ஒத்துப்போகிறது.
உயிருள்ள, மயக்க மருந்து கொடுக்கப்பட்ட எலியின் மூச்சுக்குழாயில் MP5 இருப்பதைக் காட்டும் எடுத்துக்காட்டுப் படங்கள். (அ) மூச்சுக்குழாயின் மேலே மற்றும் இடதுபுறத்தில் படங்களைப் பெற காந்தம் பயன்படுத்தப்படுகிறது, பின்னர் (ஆ) காந்தம் வலதுபுறம் நகர்த்தப்பட்ட பிறகு. சிவப்புப் பெட்டியில் மாறுபாட்டை அதிகரிக்கும் உருப்பெருக்கம் உள்ளது. இந்தப் படங்கள் துணை வீடியோ S7:MP5-இல் காட்டப்பட்டுள்ள வீடியோவிலிருந்து எடுக்கப்பட்டவை.
மூச்சுக்குழாயின் மேலும் கீழும் இரண்டு துருவங்களும் வடக்கு-தெற்கு நோக்குநிலையில் அமைக்கப்பட்டபோது (அதாவது ஈர்க்கும் வகையில்; படம் 3b), MP நாண்கள் நீளமாகத் தோன்றின, மேலும் அவை மூச்சுக்குழாயின் முதுகுப்புற மேற்பரப்பில் இல்லாமல், அதன் பக்கச் சுவரில் அமைந்திருந்தன (துணை வீடியோ S9:MP5-ஐப் பார்க்கவும்). இருப்பினும், இரட்டை-காந்த சாதனம் பயன்படுத்தப்பட்டபோது, ​​திரவம் செலுத்தப்பட்ட பிறகு ஒரே இடத்தில் (அதாவது, மூச்சுக்குழாயின் முதுகுப்புற மேற்பரப்பில்) துகள்களின் அதிக செறிவு கண்டறியப்படவில்லை; இது பொதுவாக ஒற்றை-காந்த சாதனம் பயன்படுத்தப்படும்போது நிகழ்கிறது. பின்னர், ஒரு காந்தம் துருவங்களை தலைகீழாக விலக்குமாறு அமைக்கப்பட்டபோது (படம் 3c), திரவம் செலுத்தப்பட்ட பிறகு பார்வைப் புலத்தில் தெரியும் துகள்களின் எண்ணிக்கை அதிகரித்ததாகத் தெரியவில்லை. காந்தங்களை முறையே இழுக்கும் அல்லது தள்ளும் உயர் காந்தப்புல வலிமைகள் காரணமாக, இரண்டு இரட்டை-காந்த உள்ளமைப்புகளின் அமைப்பும் சவாலானது. பின்னர், காற்றுப்பாதைக்கு இணையாகவும், ஆனால் காற்றுப்பாதை வழியாக 90 டிகிரி கோணத்தில் செல்லும் ஒற்றைக் காந்தமாக இந்த அமைப்பு மாற்றப்பட்டது, இதனால் புலக் கோடுகள் மூச்சுக்குழாய் சுவரை செங்குத்தாகக் கடந்தன (படம் 3d), இது ஒரு நோக்குநிலையாகும். பக்கச் சுவரில் துகள் திரட்சியைக் காண முடியுமா என்பதைத் தீர்மானிக்க இது வடிவமைக்கப்பட்டது. இருப்பினும், இந்த உள்ளமைவில், MP திரட்சியின் அடையாளம் காணக்கூடிய நகர்வோ அல்லது காந்தத்தின் நகர்வோ இல்லை. இந்த முடிவுகள் அனைத்தின் அடிப்படையிலும், உயிருள்ள உயிரினங்களில் மரபணு கடத்தி ஆய்வுகளுக்காக ஒற்றைக் காந்தம் கொண்ட, 30-டிகிரி நோக்குநிலை உள்ளமைவு (படம் 3a) தேர்ந்தெடுக்கப்பட்டது.
மனிதாபிமான முறையில் கொல்லப்பட்ட உடனேயே அந்த விலங்கு மீண்டும் மீண்டும் படமெடுக்கப்பட்டபோது, ​​குழப்பத்தை ஏற்படுத்தும் திசு அசைவுகள் இல்லாததால், காந்தத்தின் நேர்கோட்டு இயக்கத்திற்கு ஏற்ப "தள்ளாடும்" மெல்லிய மற்றும் குறுகிய துகள் கோடுகளைத் தெளிவான குருத்தெலும்புகளுக்கு இடையேயான புலத்தில் வேறுபடுத்தி அறிய முடிந்தது. இருப்பினும், MP6 துகள்களின் இருப்பையும் இயக்கத்தையும் இன்னும் தெளிவாகக் காண முடியவில்லை.
LV-LacZ டைட்டர் 1.8 × 10⁸ TU/ml ஆக இருந்தது, மேலும் CombiMag MP (MP6) உடன் 1:1 விகிதத்தில் கலந்த பிறகு, விலங்குகளுக்கு 50 μl மூச்சுக்குழாய் வழியாக 9 × 10⁷ TU/ml LV வெஹிக்கிள் (அதாவது 4.5 × 10⁶ TU/எலி) மருந்தளவு வழங்கப்பட்டது. இந்த ஆய்வுகளில், பிரசவத்தின் போது காந்தத்தை நகர்த்துவதற்குப் பதிலாக, காந்தப்புலம் இல்லாத நிலையில் வெக்டர் டெலிவரியுடன் ஒப்பிடும்போது LV டிரான்ஸ்டக்ஷன் (அ) மேம்படுத்தப்பட முடியுமா, மற்றும் (ஆ) ஒருமுகப்படுத்தப்பட முடியுமா என்பதைத் தீர்மானிக்க, நாங்கள் காந்தத்தை ஒரே நிலையில் நிலைநிறுத்தினோம். காற்றுவழி செல்கள் மேல் காற்றுவழியின் காந்த இலக்குப் பகுதிகளுக்கு டிரான்ஸ்டக்ஷன் செய்யப்படுகின்றன.
எங்களின் வழக்கமான LV வெக்டர் வழங்கும் நெறிமுறையைப் போலவே, காந்தங்களின் இருப்பு மற்றும் LV வெக்டர்களுடன் இணைந்து காம்பிமேக் (CombiMag) பயன்பாடு ஆகியவை விலங்குகளின் ஆரோக்கியத்தில் பாதகமான விளைவுகளை ஏற்படுத்தவில்லை. இயந்திர ரீதியான இடையூறுக்கு உட்படுத்தப்பட்ட மூச்சுக்குழாய் பகுதியின் முன்பக்கப் படங்கள் (துணைப் படம் 1), காந்தம் இருந்தபோது LV-MP மூலம் சிகிச்சை அளிக்கப்பட்ட விலங்குகளின் குழுவில் டிரான்ஸ்டக்ஷன் கணிசமாக அதிக அளவில் இருந்ததைக் காட்டின (படம் 9a). கட்டுப்பாட்டுக் குழுவில் மிகக் குறைந்த அளவிலான நீல நிற LacZ கறை மட்டுமே காணப்பட்டது (படம் 9b). இயல்பாக்கப்பட்ட X-Gal கறை படிந்த பகுதிகளின் அளவீடு, காந்தப்புலத்தின் முன்னிலையில் LV-MP வழங்குவது தோராயமாக 6 மடங்கு மேம்பாட்டை ஏற்படுத்தியதைக் காட்டியது (படம் 9c).
LV-MP மூலம் மூச்சுக்குழாயில் ஏற்படும் மரபணு மாற்றத்தைக் காட்டும் எடுத்துக்காட்டு கூட்டுப் படங்கள்: (a) காந்தப்புலத்தின் முன்னிலையிலும் (b) காந்தம் இல்லாத நிலையிலும். (c) காந்தத்தைப் பயன்படுத்தும்போது மூச்சுக்குழாயினுள் உள்ள இயல்பாக்கப்பட்ட LacZ மரபணு மாற்றப் பரப்பில் புள்ளிவிவரப்படி குறிப்பிடத்தக்க முன்னேற்றம் (*p = 0.029, t-சோதனை, ஒவ்வொரு குழுவிற்கும் n = 3, சராசரி ± SEM).
நடுநிலை ஃபாஸ்ட் ரெட் சாயமேற்றப்பட்ட பிரிவுகள் (துணைப் படம் 2-இல் காட்டப்பட்டுள்ள எடுத்துக்காட்டு), முன்பு அறிவிக்கப்பட்டதைப் போன்றே ஒத்த வடிவத்திலும் இடத்திலும் LacZ சாயமேற்றப்பட்ட செல்கள் இருப்பதைக் காட்டின.
காற்று ஓட்டம் மற்றும் தீவிரமான சளி அகற்றல் இருக்கும்போது, ​​இயங்கும் நுரையீரலில் கடத்தித் துகள்களை விரும்பிய பகுதிகளுக்குத் துல்லியமாகக் கொண்டு சேர்ப்பதும், உயர் மட்ட மரபணு மாற்றத் திறனை அடைவதும் காற்றுவழி மரபணு சிகிச்சைக்கான ஒரு முக்கிய சவாலாக உள்ளது. சிஸ்டிக் ஃபைப்ரோசிஸ் (CF) காற்றுவழி நோய்க்கு சிகிச்சையளிக்க வடிவமைக்கப்பட்ட LV கடத்திகளைப் பொறுத்தவரை, கடத்தும் காற்றுவழிகளுக்குள் கடத்தித் துகள்களின் தங்கும் நேரத்தை அதிகரிப்பது இதுவரை அடைய முடியாத ஒரு இலக்காகவே இருந்து வருகிறது. காஸ்டெல்லானி மற்றும் குழுவினரால் சுட்டிக்காட்டப்பட்டபடி, மரபணு மாற்றத்தை மேம்படுத்த காந்தப்புலங்களைப் பயன்படுத்துவது, எலக்ட்ரோபோரேஷன் போன்ற பிற மரபணு விநியோக முறைகளுடன் ஒப்பிடும்போது நன்மைகளைக் கொண்டுள்ளது. ஏனெனில் இது எளிமை, செலவுத் திறன், விநியோகத்தின் இடவமைவு, அதிகரித்த செயல்திறன், குறைந்த அடைகாக்கும் நேரம் மற்றும் ஒருவேளை சிறிய கடத்தி அளவு ஆகியவற்றை ஒருங்கிணைக்க முடியும்¹⁰. இருப்பினும், வெளிப்புற காந்த விசைகளின் செல்வாக்கின் கீழ் காற்றுவழிகளில் காந்தத் துகள்களின் உயிருள்ள படிவு மற்றும் நடத்தை இதுவரை விவரிக்கப்படவில்லை, மேலும் சேதமடையாத உயிருள்ள காற்றுவழிகளில் மரபணு வெளிப்பாட்டு அளவுகளை அதிகரிக்க இந்த முறையின் சாத்தியக்கூறு உயிருள்ள உடலுக்குள் நிரூபிக்கப்படவில்லை.
நாங்கள் பயன்படுத்திய பிம்பமாக்கல் அமைப்பில், பாலிஸ்டிரீன் MP-ஐத் தவிர, நாங்கள் சோதித்த அனைத்துத் துகள்களும் காணப்பட்டன என்பதை எங்களின் இன் விட்ரோ சின்க்ரோட்ரான் PCXI சோதனைகள் காட்டின. ஒரு காந்தப்புலத்தின் முன்னிலையில், MP-கள் சரங்களை உருவாக்குகின்றன; அவற்றின் நீளங்கள் துகள் வகை மற்றும் காந்தப்புல வலிமையுடன் (அதாவது காந்தத்தின் அருகாமை மற்றும் இயக்கம்) தொடர்புடையவை. படம் 10-இல் காட்டப்பட்டுள்ளபடி, நாம் காணும் சரங்கள், ஒவ்வொரு தனித்தனித் துகளும் காந்தமாக்கப்பட்டு, அதன் சொந்த உள்ளூர் காந்தப்புலத்தைத் தூண்டுவதால் உருவாகின்றன. இந்தத் தனித்தனிப் புலங்கள், மற்ற ஒத்த துகள்களை ஒன்றுசேர்ந்து இணைக்கச் செய்கின்றன; மற்ற துகள்களின் உள்ளூர் ஈர்ப்பு மற்றும் விலக்கு விசைகளால் ஏற்படும் உள்ளூர் விசைகளின் காரணமாக, குழுச் சரம் போன்ற இயக்கங்கள் நிகழ்கின்றன.
(a,b) திரவம் நிரப்பப்பட்ட நுண்குழாய்களுக்குள் உருவாக்கப்பட்ட துகள் தொடர்களையும் மற்றும் (c,d) காற்று நிரப்பப்பட்ட மூச்சுக்குழாயையும் காட்டும் வரைபடம். நுண்குழாய்களும் மூச்சுக்குழாயும் சரியான அளவீட்டின்படி வரையப்படவில்லை என்பதைக் கவனிக்கவும். (a) பலகத்தில், சரங்களாக அமைக்கப்பட்ட Fe3O4 துகள்களைக் கொண்ட MP பற்றிய விளக்கமும் உள்ளது.
நுண்குழாயின் மீது காந்தம் நகர்த்தப்பட்டபோது, ​​Fe3O4 கொண்ட MP3-5-க்கான துகள் சரத்தின் கோணம் ஒரு முக்கியமான வரம்பை எட்டியது. அதன் பிறகு, துகள் சரம் அதன் அசல் நிலையில் நிலைத்திருக்காமல், காந்தத்தின் மேற்பரப்பு வழியாக ஒரு புதிய நிலைக்கு நகர்ந்தது. கண்ணாடி நுண்குழாயின் மேற்பரப்பு இந்த இயக்கத்தை அனுமதிக்கும் அளவுக்கு மென்மையாக இருப்பதால் இந்த விளைவு ஏற்பட வாய்ப்புள்ளது. சுவாரஸ்யமாக, MP6 (CombiMag) இந்த வழியில் செயல்படவில்லை. ஒருவேளை அதன் துகள்கள் சிறியதாக இருந்ததாலோ, வெவ்வேறு பூச்சுகள் அல்லது மேற்பரப்பு மின்னூட்டங்களைக் கொண்டிருந்ததாலோ, அல்லது ஒரு பிரத்யேக கடத்தித் திரவம் அவற்றின் நகரும் திறனைப் பாதித்ததாலோ இது நிகழ்ந்திருக்கலாம். CombiMag துகள்களின் பிம்ப மாறுபாடும் பலவீனமாக உள்ளது. இது, திரவமும் துகள்களும் ஒரே மாதிரியான அடர்த்தியைக் கொண்டிருக்கலாம் என்பதையும், அதனால் அவை எளிதில் ஒன்றையொன்று நோக்கி நகர முடியாது என்பதையும் சுட்டிக்காட்டுகிறது. காந்தம் மிக வேகமாக நகர்ந்தால் துகள்கள் சிக்கிக்கொள்ளவும் கூடும். இது, காந்தப்புல வலிமையால் திரவத்தில் உள்ள துகள்களுக்கு இடையேயான உராய்வை எப்போதும் கடக்க முடியாது என்பதைக் குறிக்கிறது. எனவே, காந்தப்புல வலிமையும், காந்தத்திற்கும் இலக்குப் பகுதிக்கும் இடையேயான தூரமும் மிகவும் முக்கியமானவை என்பதில் ஆச்சரியமில்லை. ஒட்டுமொத்தமாக, இந்த முடிவுகள், இலக்குப் பகுதி வழியாகப் பாயும் பல நுண்துகள்களை (MPs) காந்தங்களால் பிடிக்க முடியும் என்றாலும், அது சாத்தியமில்லை என்பதையும் சுட்டிக்காட்டுகின்றன. மூச்சுக்குழாயின் மேற்பரப்பில் காம்பிமேக் துகள்களை நகர்த்துவதற்கு காந்தங்களை நம்பலாம். எனவே, உயிருள்ள உடலினுள் செய்யப்படும் LV-MP ஆய்வுகள், சுவாசப்பாதை அமைப்பின் குறிப்பிட்ட பகுதிகளை பௌதீக ரீதியாகக் குறிவைக்க நிலையான காந்தப்புலங்களைப் பயன்படுத்த வேண்டும் என்று நாங்கள் முடிவு செய்கிறோம்.
துகள்கள் உடலுக்குள் செலுத்தப்படும்போது, ​​சிக்கலான, அசையும் உடல் திசுக்களின் பின்னணியில் அவற்றை அடையாளம் காண்பது கடினம். ஆனால், மூச்சுக்குழாயின் மேலே காந்தத்தை கிடைமட்டமாக நகர்த்தி MP இழைகளை "அசைப்பதன்" மூலம் அவற்றைக் கண்டறியும் திறன் மேம்படுத்தப்பட்டது. நேரடிப் படமெடுத்தல் சாத்தியம் என்றாலும், விலங்கு மனிதாபிமான முறையில் கொல்லப்பட்ட பின்னரே துகள்களின் இயக்கத்தைப் பிரித்தறிவது எளிதாகிறது. படமெடுக்கும் பகுதிக்கு மேலே காந்தம் நிலைநிறுத்தப்பட்டபோது, ​​MP செறிவுகள் பொதுவாக இந்த இடத்தில் மிக அதிகமாக இருந்தன, இருப்பினும் சில துகள்கள் வழக்கமாக மூச்சுக்குழாயின் மேலும் தொலைவில் காணப்பட்டன. ஆய்வக ஆய்வுகளுக்கு மாறாக, காந்தத்தை நகர்த்துவதன் மூலம் துகள்களை மூச்சுக்குழாயின் வழியே இழுத்துச் செல்ல முடியாது. இந்தக் கண்டுபிடிப்பு, மூச்சுக்குழாயின் மேற்பரப்பைப் பூசும் சளியானது பொதுவாக உள்ளிழுக்கப்பட்ட துகள்களை எவ்வாறு செயலாக்குகிறது என்பதோடு ஒத்துப்போகிறது; அது அவற்றைச் சளியில் சிக்க வைத்து, பின்னர் சளி-சிலியரி அகற்றும் பொறிமுறையால் வெளியேற்றுகிறது.
மூச்சுக்குழாயின் மேலும் கீழும் காந்தங்களை ஈர்ப்பதற்காகப் பயன்படுத்துவது (படம் 3b), ஒரு புள்ளியில் அதிக அளவில் குவிந்திருக்கும் காந்தப்புலத்திற்குப் பதிலாக, மிகவும் சீரான காந்தப்புலத்தை ஏற்படுத்தக்கூடும் என்றும், இது துகள்களின் மிகவும் சீரான பரவலுக்கு வழிவகுக்கும் என்றும் நாங்கள் கருதுகோள் கொண்டோம். இருப்பினும், எங்கள் ஆரம்பகட்ட ஆய்வில் இந்தக் கருதுகோளை ஆதரிப்பதற்கான தெளிவான சான்றுகள் எதுவும் கிடைக்கவில்லை. அதேபோல், ஒரு ஜோடி காந்தங்களை விலக்குமாறு அமைப்பதும் (படம் 3c), படமெடுக்கப்பட்ட பகுதியில் அதிக துகள்கள் படிவதற்கு வழிவகுக்கவில்லை. இந்த இரண்டு கண்டுபிடிப்புகளும், இரட்டைக் காந்த அமைப்பு MP இலக்குவைப்பின் உள்ளூர் கட்டுப்பாட்டை குறிப்பிடத்தக்க அளவில் மேம்படுத்தவில்லை என்பதையும், அதன் விளைவாக ஏற்படும் வலுவான காந்த விசைகளை அமைப்பது கடினம் என்பதையும் நிரூபிக்கின்றன, இது இந்த அணுகுமுறையை நடைமுறைக்குக் குறைவானதாக ஆக்குகிறது. இதேபோல், காந்தத்தை மூச்சுக்குழாயின் மேலும் அதன் வழியாகச் செலுத்துவதும் (படம் 3d), படமெடுக்கப்பட்ட பகுதியில் தக்கவைக்கப்பட்ட துகள்களின் எண்ணிக்கையை அதிகரிக்கவில்லை. இந்த மாற்று அமைப்புகளில் சில வெற்றிகரமாக இல்லாமல் இருக்கலாம், ஏனெனில் அவை படிவுப் பகுதிக்குள் குறைந்த காந்தப்புல வலிமைகளை ஏற்படுத்துகின்றன. எனவே, ஒற்றை 30-டிகிரி கோண காந்த அமைப்பு (படம் 3a) உயிருள்ள உடலுக்குள் சோதனை செய்வதற்கு எளிதான மற்றும் மிகவும் திறமையான முறையாகக் கருதப்படுகிறது.
LV-MP ஆய்வில், LV வெக்டர்கள் CombiMag உடன் இணைக்கப்பட்டு, காந்தப்புலத்தின் முன்னிலையில் இயற்பியல் இடையூறுக்குப் பிறகு செலுத்தப்பட்டபோது, ​​கட்டுப்பாட்டுக் குழுக்களுடன் ஒப்பிடுகையில் மூச்சுக்குழாயில் மரபணுப் பரிமாற்ற அளவுகள் குறிப்பிடத்தக்க அளவில் அதிகரித்திருந்தன என்பது தெரியவந்தது. சின்க்ரோட்ரான் இமேஜிங் ஆய்வுகள் மற்றும் LacZ முடிவுகளின் அடிப்படையில், காந்தப்புலமானது LV-ஐ மூச்சுக்குழாயினுள் பாதுகாத்து, உடனடியாக நுரையீரலின் ஆழத்திற்குள் ஊடுருவிய வெக்டர் துகள்களின் எண்ணிக்கையைக் குறைத்தது என்பது தெளிவாகத் தெரிந்தது. இத்தகைய இலக்கு நிர்ணய மேம்பாடுகள், செலுத்தப்பட்ட டைட்டர்கள், இலக்கற்ற மரபணுப் பரிமாற்றம், அழற்சி மற்றும் நோயெதிர்ப்பு பக்க விளைவுகள், மற்றும் மரபணு கடத்திச் செலவுகள் ஆகியவற்றைக் குறைக்கும் அதே வேளையில், அதிக செயல்திறனுக்கு வழிவகுக்கக்கூடும். முக்கியமாக, உற்பத்தியாளரின் கூற்றுப்படி, CombiMag-ஐ மற்ற மரபணுப் பரிமாற்ற முறைகளுடன், AAV போன்ற பிற வைரல் வெக்டர்கள் மற்றும் நியூக்ளிக் அமிலங்கள் உட்பட, இணைந்து பயன்படுத்தலாம்.