Nature.com saýtyna gireniňiz üçin sag boluň. Ulanýan brauzeriňiziň wersiýasynda CSS üçin çäkli goldaw bar. Iň gowy tejribe üçin täzelenen brauzer ulanmagyňyzy maslahat berýäris (ýa-da Internet Explorer-de utgaşyklylyk režimini öçüriň). Şol bir wagtyň özünde, goldawy dowam etdirmegi üpjün etmek üçin saýty stillersiz we JavaScript-siz görkezeris.
Kistoz fibroz öýken keselini bejermek üçin gen wektorlary geçiriji dem alyş ýollaryna gönükdirilmelidir, sebäbi periferik öýken geçirişi terapewtiki peýda bermeýär. Wirus geçiriş netijeliligi wektoryň ýaşamak wagty bilen gönüden-göni baglanyşyklydyr. Şeýle-de bolsa, gen daşaýjylar ýaly dem alyş suwuklyklary dem alyş wagtynda alweolalara tebigy ýagdaýda ýaýraýar we islendik görnüşli terapewtiki bölejikler mukosiliar daşamak arkaly çalt arassalanýar. Gen daşaýjylaryň dem alyş ýollarynda ýaşamak wagtyny uzaltmak möhümdir, ýöne ony gazanmak kyn. Dem alyş ýollarynyň ýüzüne gönükdirilip bilinýän gen daşaýjy bilen birleşdirilen magnit bölejikleri sebitleýin nyşana almagy gowulandyryp biler. In vivo wizualizasiýa kynçylyklary sebäpli, ulanylýan magnit meýdanynyň barlygynda dem alyş ýollarynyň ýüzünde şeýle kiçi magnit bölejikleriniň hereketi gowy düşünilmeýär. Bu gözlegiň maksady in vivo aýratyn we göwrüm bölejikleriniň hereketiniň dinamikasyny we nusgalaryny öwrenmek üçin anesteziýa edilen syçanlaryň traheýasyndaky birnäçe magnit bölejikleriniň in vivo hereketini wizualizasiýa etmek üçin sinhrotron şekilini ulanmakdy. Soňra biz magnit meýdanynyň barlygynda lentiwirus magnit bölejikleriniň dem alyşynyň syçanlarda geçiriş netijeliligini ýokarlandyrjakdygyny ýa-da ýokarlandyrmajakdygyny hem seljerdik. traheýa. Sinhrotron rentgen suratlandyrmasy magnit bölejikleriniň hereketsiz we hereket edýän magnit meýdanlarynda in vitro we in vivo şertlerinde özüni alyp barşyny görkezýär. Bölejikleri magnitler bilen diri howa ýolunyň ýüzüne aňsatlyk bilen sürükläp bolmaýar, ýöne daşalýan mahalynda çökündiler magnit meýdanynyň iň güýçli bolan görüş meýdanynda jemlenýär. Lentiwirus magnit bölejikleri magnit meýdanynyň barlygynda berlende, geçirijilik netijeliligi hem alty esse ýokarlandy. Bu netijeler bilelikde lentiwirus magnit bölejikleriniň we magnit meýdanlarynyň gen wektorlarynyň nyşana alynmagyny gowulandyrmak we in vivo geçiriji howa ýollarynda geçirijilik derejesini ýokarlandyrmak üçin gymmatly çemeleşmeler bolup biljekdigini görkezýär.
Kistik fibroz (KF) KF transmembran geçirijilik düzgünleşdirijisi (KTR) diýlip atlandyrylýan ýeke-täk geniň üýtgemeginden ýüze çykýar. KTR belogy bedeniň ähli ýerinde, şol sanda KF patogeneziniň esasy ýeri bolan geçiriji howa ýollarynda ýerleşýän köp sanly epitelial öýjüklerde bar bolan ion kanalydyr. KTR kemçilikleri suwuň adatdan daşary daşalmagyna, howa ýollarynyň ýüzüniň guramagyna we howa ýollarynyň ýüzündäki suwuklygyň (ASL) gatlagynyň çuňlugynyň azalmagyna getirýär. Bu hem mukosiliar daşalma (MCT) ulgamynyň dem alyş ýollaryndan dem alnan bölejikleri we patogenleri arassalamak ukybyna zyýan ýetirýär. Maksadymyz KFTR geniniň dogry nusgasyny bermek we ASL, MCT we öýken saglygyny gowulandyrmak üçin lentiwirus (LV) gen terapiýasyny işläp düzmek, şeýle hem bu parametrleri in vivo1 ölçäp bilýän täze tehnologiýalary işläp düzmegi dowam etdirmekdir.
ÇV wektorlary CF howa ýollarynyň gen terapiýasynyň esasy dalaşgärleriniň biridir, esasan hem olar bejeriş geni howa ýollarynyň bazal öýjüklerine (dem alyş ýollarynyň kök öýjüklerine) hemişelik integrasiýa edip bilýärler. Bu möhümdir, sebäbi olar funksional gen düzedilen CF bilen baglanyşykly howa ýollarynyň ýüzündäki öýjüklere tapawutlanyp, kadaly gidratasiýany we nem arassalaýyşyny dikeldip bilýärler we bu ömürlik peýda getirýär. ÇV wektorlary geçiriji howa ýollaryna garşy gönükdirilmelidir, sebäbi CF öýken keseliniň başlanýan ýeri şu ýerde. Wektoryň öýkeniň has çuňlugyna eltilmegi alweolýar transduksiýa getirip biler, ýöne munuň CF-de bejeriş peýdasy ýok. Şeýle-de bolsa, gen daşaýjylary ýaly suwuklyklar, dogruşdan soň dem alnanda tebigy ýagdaýda alweolalara göçýär3,4 we bejeriş bölejikleri MCT arkaly agyz boşlugyna çalt arassalanýar. ÇV geçirijiliginiň netijeliligi, wektoryň öýjükleriň özleşdirilmegine mümkinçilik bermek üçin nyşana öýjükleriň ýanynda galýan wagtynyň uzynlygyna gönüden-göni baglydyr - "ýaşaýyş wagty"5 - bu adaty sebitleýin howa akymy, şeýle hem utgaşdyrylan bölejik nem tutulmagy we MCT bilen aňsatlyk bilen azaldylýar. ÇV üçin, ÇV-niň howa ýollarynda ýaşaýş wagtyny uzaltmak ukyby bu sebitde ýokary derejeli transduksiýa ýetmek üçin möhümdir, ýöne şeýle örän kyn boldy.
Bu päsgelçilikden geçmek üçin, biz LV magnit bölejikleriniň (MP) iki goşmaça usulda kömek edip biljekdigini çaklaýarys. Birinjiden, olar nyşana almagy gowulandyrmak we gen daşaýjy bölejikleriň islenýän dem alyş ýollary sebitinde ýerleşmegine kömek etmek üçin dem alyş ýollarynyň ýüzüne magnit arkaly gönükdirilip bilner; we ASL) öýjük gatlagyna 6-njy gatlaga geçmek üçin. MP-ler antitelalara, himioterapewtik dermanlara ýa-da öýjük membranalaryna birikýän ýa-da degişli öýjük ýüzüniň reseptorlaryna birikýän we statik elektrikiň barlygynda şiş ýerlerinde toplanýan beýleki kiçi molekulalara birikende, nyşana derman eltiji ulag hökmünde giňden ulanylýar. Rak keselini bejermek üçin magnit meýdanlary 7. Beýleki "gipertermiki" usullar MP-leri ters magnit meýdanlaryna sezewar edilende gyzdyrmagy we şeýdip şiş öýjüklerini ýok etmegi maksat edinýär. DNK-nyň öýjüklere geçirilmegini güýçlendirmek üçin magnit meýdanynyň transfeksiya serişdesi hökmünde ulanylýan magnit transfeksiya prinsipi, transduksiýasy kyn öýjük liniýalary üçin wirus däl we wirus gen wektorlarynyň toplumyny ulanyp, in vitro ulanylýar. LV-MP-leriň statik magnit meýdanynyň barlygynda adam bronhial epitelial öýjük liniýasyna in vitro berilmegi bilen LV-MP-leriň diňe LV wektory bilen deňeşdirilende transduksiýanyň netijeliligini 186 esse artdyrýan LV-MP in vitro CF modeline hem ulanyldy, bu ýerde magnit transfeksiyasy CF balgamynyň barlygynda howa-suwuklyk serhet medeniýetlerinde LV transduksiýasyny 20 esse artdyrdy10. Şeýle-de bolsa, organlaryň in vivo magnit transfeksiyasyna az üns berildi we diňe birnäçe haýwanda baha berildi. barlaglar11,12,13,14,15, esasanam öýkenlerde16,17. Şeýle-de bolsa, KF öýken terapiýasynda magnit transfeksiyasynyň mümkinçilikleri aýdyňdyr. Tan we beýlekiler (2020) "netijeli magnit nanopartikullaryň öýken eltilmeginiň konsepsiýasynyň subutnamasy boýunça barlag KF näsaglarynda kliniki netijeleri gowulandyrmak üçin geljekki KFTR dem alyş strategiýalary üçin ýol açar"6 diýip bellediler.
Ulanylýan magnit meýdanynyň barlygynda howa ýollarynyň ýüzündäki kiçi magnit bölejikleriniň özüni alyp barşyny göz öňüne getirmek we öwrenmek kyn, şonuň üçin hem ol gowy düşünilmeýär. Beýleki gözleglerde biz gaz kanalynyň ýüzüniň gidratasiýasyny gönüden-göni ölçemek üçin ASL çuňlugynda18 we MCT özüni alyp barşynda19,20 inwaziw däl görnüşde göz öňüne getirmek we mukdar taýdan kesgitlemek üçin sinhrotron ýaýrama esasynda fazaly kontrastly rentgen şekilleme (PB-PCXI) usulyny işläp düzdik we bejerginiň netijeliliginiň irki görkezijisi hökmünde ulanyldy. Mundan başga-da, biziň MCT bahalandyrma usulymyz PB-PCXI21 ulanyp görünýän MCT markerleri hökmünde alýumin oksidinden ýa-da ýokary refraksiýa görkezijili aýnadan düzülen 10–35 µm diametrli bölejikleri ulanýar. Iki usul hem MP bilen birlikde dürli bölejik görnüşlerini göz öňüne getirmek üçin amatlydyr.
Ýokary giňişlik we wagt çözgüdi sebäpli, PB-PCXI esasyndaky ASL we MCT analiz usullarymyz MP genini eltmek usullaryny düşünmäge we optimizirlemäge kömek etmek üçin in vivo ýeke we göwrümli bölejikleriň hereketiniň dinamikasyny we nusgalaryny öwrenmek üçin örän amatlydyr. Bu ýerde ulanýan usulymyz SPring-8 BL20B2 şöhle liniýasyny ulanmak arkaly geçiren barlaglarymyzdan gelip çykýar, onda biz gen daşaýjy dozasynyň haýwan barlaglarymyzda synlanan deň däl gen ekspresiýa nusgalaryny düşündirmek üçin syçanlaryň burun we öýken dem alyş ýollaryna ýalan wektor dozasynyň berilmeginden soň suwuklygyň hereketini görselleşdirdik 3,4.
Bu gözlegiň maksady diri syçanlaryň traheýasyndaky MP-leriň in vivo hereketlerini wizuallaşdyrmak üçin sinhrotron PB-PCXI ulanmakdy. Bu PB-PCXI surat barlaglary MP-leriň dürli görnüşlerini, magnit meýdanynyň güýjüni we ýerleşýän ýerlerini synagdan geçirmek we MP hereketine täsirini kesgitlemek üçin niýetlenipdir. Biz daşarky ulanylýan magnit meýdanynyň berlen MP-niň maksatly sebitde galmagyna ýa-da hereket etmegine kömek etjekdigini çakladyk. Bu barlaglar, şeýle hem, çökündiden soň traheýada saklanýan bölejikleriň sanyny iň ýokary derejä çykarýan magnit konfigurasiýalaryny kesgitlemäge mümkinçilik berdi. Ikinji gözleg tapgyrynda, howa ýollaryny nyşana almak kontekstinde LV-MP-leriň berilmeginiň LV transduksiýa netijeliliginiň ýokarlanmagyna getirjekdigi baradaky çaklama esasynda, LV-MP-leriň in vivo syçan howa ýollaryna berilmeginden gelip çykýan transduksiýa nusgasyny görkezmek üçin bu optimal konfigurasiýany ulanmaga synanyşdyk.
Haýwanlar boýunça geçirilen ähli barlaglar Adelaida Uniwersiteti (M-2019-060 we M-2020-022) we SPring-8 Sinxrotron Haýwan Etikasy Komiteti tarapyndan tassyklanan protokollara laýyklykda geçirildi. Synaglar ARRIVE görkezmelerine laýyklykda geçirildi.
Ähli rentgen suratlary Ýaponiýadaky SPring-8 sinkrotronyndaky BL20XU şöhle liniýasynda, öň beýan edilen gurluşa meňzeş gurluş ulanylyp ýerine ýetirildi21,22. Gysgaça aýdylanda, synag gutusy sinkrotron saklaýyş halkasyndan 245 m uzaklykda ýerleşýärdi. Faza kontrast effektlerini döretmek üçin bölejikleri suratlandyrmak barlaglary üçin 0,6 m nusgadan detektora çenli aralyk we in vivo suratlandyrmak barlaglary üçin 0,3 m ulanylýar. 25 keV monohromatik şöhle energiýasy ulanyldy. Suratlar sCMOS detektoryna birikdirilen ýokary çözgütli rentgen konwertory (SPring-8 BM3) arkaly alyndy. Konwertor rentgen şöhlelerini görünýän ýagtylyga 10 µm galyňlykdaky sintillýator (Gd3Al2Ga3O12) ulanyp öwürýär, soňra ol × 10 mikroskop obýektiwi (NA 0.3) ulanyp sCMOS sensoryna gönükdirilýär. sCMOS detektory Orca-Flash4.0 (Hamamatsu Photonics, Ýaponiýa) bolup, massiw ölçegi ... 2048 × 2048 piksel we çig piksel ölçegi 6.5 × 6.5 µm. Bu gurluş 0.51 µm netijeli izotrop piksel ölçegini we takmynan 1.1 mm × 1.1 mm görüş meýdanyny berýär. Dem alyş arkaly döreýän hereket artefaktlaryny azaltmak bilen birlikde, dem alyş ýolunyň içinde we daşynda magnit bölejikleriniň signal-şowhun gatnaşygyny iň ýokary derejä çykarmak üçin 100 ms ekspozisiýa uzynlygy saýlanyldy. In vivo barlaglar üçin, ekspozisiýalaryň arasynda rentgen şöhlesini blokirlemek arkaly radiasiýa dozasyny çäklendirmek üçin rentgen ýoluna çalt rentgen örtügi goýuldy.
BL20XU surat kamerasy Biohowpsuzlyk derejesi 2-nji derejede sertifikatlaşdyrylmadyklygy sebäpli, LV daşaýjysy hiç bir SPring-8 PB-PCXI surat barlaglarynda ulanylmady. Munuň ýerine, magnit meýdanlarynyň aýna kapillýarlarynyň içinde, soňra bolsa diri howa ýollarynda MP hereketine nähili täsir edýändigini düşünmek üçin iki sany täjirçilik üpjün edijisinden dürli ölçegleri, materiallary, demir konsentrasiýalaryny we ulanylyşlaryny öz içine alýan gowy häsiýetlendirilen MP-leriň toplumyny saýladyk. ýüzünde. MP-leriň ölçegleri 0,25-den 18 μm-e çenli bolup, dürli materiallardan ýasalýar (1-nji tablisa serediň), ýöne her bir nusganyň düzümi, şol sanda MP-niň içindeki magnit bölejikleriniň ölçegi belli däl. Giňişleýin MCT barlaglarymyza esaslanyp 19, 20, 21, 23, 24, traheýanyň howa ýollarynyň ýüzünde 5 μm ýaly kiçi MP-leriň, mysal üçin, MP hereketiniň has gowy görünmegini görmek üçin yzygiderli kadrlary aýyrmak arkaly görünýändigini çaklaýarys. 0,25 μm ölçegli ýeke MP suratlandyryş enjamynyň çözgüdinden kiçi, ýöne PB-PCXI-niň olaryň göwrüm kontrastyny ​​we çökündiden soň çökündi bolan ýüz suwuklygynyň hereketini anyklamagyna garaşylýar.
1-nji tablisadaky her bir MP üçin nusgalar içki diametri 0,63 mm bolan 20 μl aýna kapillýarlarynda (Drummond Microcaps, PA, ABŞ) taýýarlanyldy. Korpuskulýar bölejikler suwda, CombiMag bölejikleri bolsa öndürijiň hususy suwuklygynda bar. Her bir turba ýarym suwuklyk bilen dolduryldy (takmynan 11 μl) we nusga saklaýjysyna goýuldy (1-nji surata serediň). Aýna kapillýarlary degişlilikde surat gutusyndaky nusga tapgyrynda gorizontal ýerleşdirildi we suwuklygyň gyralary ýerleşdirildi. 19 mm diametrli (28 mm uzynlykdaky) nikel gabykly seýrek ýer neodim demir bor (NdFeB) magniti (N35, kategoriýa № LM1652, Jaycar Electronics, Awstraliýa) suratlandyryş wagtynda onuň ýerleşýän ýerini uzakdan üýtgetmek üçin aýratyn terjime tapgyryna berkidildi. Rentgen suratlaryny almak magnit nusganyň üstünde takmynan 30 mm ýerleşýän wagty başlaýar we suratlar sekuntda 4 kadr tizliginde alynýar. Suratlandyryş wagtynda magnit ýakynlaşdyryldy. aýna kapillýar turbany (takmynan 1 mm uzaklykda) we soňra meýdan güýjüniň we ýerleşişiniň täsirlerini bahalandyrmak üçin turba boýunça süýşürildi.
XY nusga terjime tapgyrynda aýna kapillýarlarynda MP nusgalaryny öz içine alýan in vitro suratlandyryş gurluşy. Rentgen şöhlesiniň ýoly gyzyl punktir çyzyk bilen bellenen.
MP-leriň in vitro görünmegi kesgitlenensoň, olaryň bir bölegi ýabany görnüşli urkaçy albinos Wistar syçanlarynda (~12 hepdelik, ~200 g) in vivo synagdan geçirildi. 0,24 mg/kg medetomidin (Domitor®, Zenoaq, Ýaponiýa), 3,2 mg/kg midazolam (Dormicum®, Astellas Pharma, Ýaponiýa) we 4 mg/kg butorfanol (Vetorphale®, Meiji Seika) syçanlaryna Pharma (Japan) garyn boşlugyna inýeksiýa arkaly narkoz berildi. Narkozdan soň, olar traheýanyň töweregindäki tüýleri aýyrmak, endotraheal turbany (ET; 16 Ga iv kanýulasy, Terumo BCT) goýmak we beden temperaturasyny saklamak üçin termal halta saklaýan ýörite ýasalan surat plastinkasynda olary hereketsiz goýmak arkaly surat üçin taýýarlanyldy 22. Soňra surat plastinkasy surat gutusyndaky nusga terjime tapgyryna rentgen suratynda traheýany gorizontal taýdan deňleşdirmek üçin kiçijik burç bilen berkidildi, 2a-njy suratda görkezilişi ýaly.
(a) SPring-8 suratlandyryş gutusyndaky in vivo suratlandyryş gurnamasynda rentgen şöhlesiniň ýoly gyzyl punktir çyzyk bilen bellenilýär.(b,c) Traheýada magnitiň ýerleşişi iki sany dik duran IP kamera arkaly uzakdan ýerine ýetirildi. Ekrandaky şekiliň çep tarapynda kelläni saklaýan sim halkasy we ET turbasynyň içinde ýerleşdirilen kanýula görünýär.
100 μl aýna şpris ulanyp, uzakdan dolandyrylýan şpris nasos ulgamy (UMP2, World Precision Instruments, Sarasota, FL) 30 Ga iňňe arkaly PE10 turbasyna (OD 0.61 mm, ID 0.28 mm) birikdirildi. ET turbasyny goýanda, ujunyň traheýada dogry ýagdaýda bolmagyna göz ýetirmek üçin turbany belläň. Mikronasos ulanyp, şpris porşeni çekildi, turbanyň ujuny bolsa MP nusgasyna batyrdylar. Soňra ýüklenen eltme turbasy endotraheal turbasyna girizildi we ujuny garaşylýan magnit meýdanymyzyň iň güýçli bölegine ýerleşdirdi. Surat almak Arduino esasly wagt gutusyna birikdirilen dem alyş detektory arkaly dolandyryldy we ähli signallar (meselem, temperatura, dem alyş, perde açylmagy/ýapylmagy we surat almak) Powerlab we LabChart (AD Instruments, Sidneý, Awstraliýa) 22 ulanyp ýazylyp alyndy. Surat alnanda. Gap elýetersiz bolanda, iki sany IP kamera (Panasonic BB-SC382) biri-birine takmynan 90° burçda ýerleşdirildi we ulanyldy. suratlandyryş wagtynda magnitiň traheýa bilen deňeşdirilende ýerleşýän ýerini gözegçilikde saklamak üçin (2b, c surat). Hereket artefaktlaryny azaltmak üçin, gelgit akymynyň soňky platosynda her dem alyş üçin bir surat alyndy.
Magnit suratlandyryş korpusynyň daşyndan uzakdan ýerleşdirilip bilinýän ikinji basgançaga berkidildi. Dürli magnitleriň ýerleşýän ýerleri we konfigurasiýalary synagdan geçirildi, şol sanda: Traheýanyň üstünde takmynan 30° burç bilen oturdyldy (konfigurasiýalar 2a we 3a suratlarynda görkezilen); bir magnit haýwanyň üstünde, beýlekisi aşakda, polýuslary özüne çekmek üçin oturdyldy (3b surat); bir magnit haýwanyň üstünde, beýlekisi aşakda, polýuslary yzyna serpikdirmek üçin oturdyldy (3c surat); we bir magnit traheýanyň üstünde we oňa perpendikulýar (3d surat). Haýwan we magnit gurnalandan we synagdan geçiriljek MP şpris nasosyna ýüklenilenden soň, suratlary alýan wagtyňyz 4 μl/sek tizlikde 50 μl doza beriň. Soňra magnit suratlary alýan wagtyňyz traheýanyň ugrunda ýa-da gapdalynda öňe we yza hereketlendirilýär.
In vivo suratlandyryş üçin magnit konfigurasiýasy (a) traheýanyň üstünde takmynan 30° burçda ýerleşýän ýeke magnit, (b) özüne çekmek üçin goýlan iki magnit, (c) iteklemek üçin goýlan iki magnit, (d) traheýanyň üstünde we perpendikulýar bolan ýeke magnit. Synçy agyzdan traheýa arkaly öýkenlere aşak seretdi we rentgen şöhlesi syçanyň çep tarapyndan geçip, sag tarapyndan çykdy. Magnit ýa dem alyş ýolunyň uzynlygy boýunça ýa-da rentgen şöhlesiniň ugry boýunça traheýanyň üstünde çepe we sag tarapa hereket edýär.
Şeýle hem, dem alyş we ýürek hereketi bolmadyk ýagdaýynda dem alyş ýollaryndaky bölejikleriň görünmegini we özüni alyp barşyny kesgitlemäge synanyşdyk. Şonuň üçin, suratlandyryş döwrüniň ahyrynda haýwanlar pentobarbitalyň artykmaç dozasy sebäpli ynsanperwerlik bilen öldürildi (Somnopentil, Pitman-Moore, Waşington Krossing, ABŞ; ~65 mg/kg ip). Käbir haýwanlar suratlandyryş platformasynda galdyryldy we dem alyş we ýürek urşuny bes edenden soň, suratlandyryş prosesi gaýtalandy, eger dem alyş ýollarynyň ýüzünde MP görünmese, goşmaça MP dozasy goşuldy.
Alnan suratlar tekiz we garaňky meýdanlarda düzedildi we soňra MATLAB-da ýazylan ýörite skript arkaly (R2020a, The Mathworks) filme ýygnaldy (sekuntda 20 kadr; dem alyş tizligine baglylykda 15-25 × adaty tizlik).
LV gen wektorlarynyň eltip berilmegi boýunça ähli barlaglar Adelaida uniwersitetiniň haýwan barlaghanasynda geçirildi we SPring-8 tejribesiniň netijelerini magnit meýdanynyň barlygynda LV-MP eltip bermegiň in vivo gen geçişini güýçlendirip biljekdigini ýa-da güýçlendirmejekdigini bahalandyrmak üçin ulanmak maksady bilen geçirildi. MP-niň we magnit meýdanynyň täsirlerini bahalandyrmak üçin iki topar haýwan bejerildi: bir topara magnit goýlan LV-MP berildi, beýleki topara bolsa magnitsiz LV-MP bolan gözegçilik topary berildi.
LV gen wektorlary öň beýan edilen usullar 25, 26 arkaly döredildi. LacZ wektory, öýken dokumasynyň öň taraplarynda we dokuma böleklerinde görünýän, transduksiýa edilen öýjüklerde gök reaksiýa önümini öndürýän konstitutiw MPSV promotory (LV-LacZ) tarapyndan hereketlendirilýän ýadro-lokal beta-galaktozidaza genini beýan edýär. Titrleme öýjük medeniýetlerinde LacZ pozitiw öýjükleriniň sanyny gemositometr bilen el bilen sanap, titri TU/ml-de hasaplamak arkaly geçirildi. Daşaýjylar -80 °C-de kriokonserwasiýa edilýär, ulanmazdan öň eredilýär we 1:1 gatnaşykda garyşdyrylyp we ibermezden öň azyndan 30 minutlap buzda inkubasiýa edilip, CombiMag-a baglanýar.
Adaty Sprague Dawley syçanlaryna (n = 3/topar, ~2-3) 0,4 mg/kg medetomidin (Domitor, Ilium, Awstraliýa) we 60 mg/kg ketamin (Ilium, Awstraliýa) aýlyk) ip) inýeksiýasynyň garyndysy bilen garyn boşlugyna anesteziýa berildi we 16 Ga damardan kanül bilen hirurgiki däl agyz boşlugyna kanülasiýa edildi. Traheýanyň howa ýollarynyň dokumasynyň sol gabyk geçirijiligini kabul etmegini üpjün etmek üçin, ol öň beýan edilen mehaniki perturbasiýa protokolymyz arkaly şertlendirildi, onda traheýanyň howa ýollarynyň ýüzü sim sebet bilen ok boýunça sürtüldi (N-Circle, Nitinol Tipless Stone Extractor NTSE-022115) -UDH, Cook Medical, ABŞ) 30 s28. Soňra traheýa sol gabyk-MP perturbasiýadan takmynan 10 minut soň biologik howpsuzlyk şkafynda traheýa berildi.
Bu tejribede ulanylan magnit meýdany in vivo rentgen suratlandyryş barlagyna meňzeş usulda düzüldi, şol bir magnitler distillýasiýa stent kliplerini ulanyp traheýanyň üstünde saklandy (4-nji surat). Öň beýan edilişi ýaly, gel ujy bolan pipetka arkaly traheýa 50 μl göwrümde (2 × 25 μl alikwotlar) LV-MP berildi (n = 3 haýwan). Gözegçilik topary (n = 3 haýwan) magnit ulanmazdan şol bir LV-MP-leri aldy. Infuzion tamamlanandan soň, kanül ET turbasyndan aýrylýar we haýwan ekstubasiýa edilýär. Magnit 10 minutlap ýerinde galýar, soňra aýrylýar. Syçanlar deri astyna meloksikam dozasyny (1 ml/kg) aldy (Ilium, Awstraliýa), soňra bolsa 1 mg/kg atipamazol gidrohloridiniň (Antisedan, Zoetis, Awstraliýa) ip inýeksiýasy arkaly anesteziýanyň yzyna gaýtarylmagy bilen amala aşyryldy. Syçanlar anesteziýadan doly sagalýança ýyly saklandy we gözegçilik edildi.
Biologik howpsuzlyk şkafyndaky LV-MP eltme enjamy. ET turbasynyň açyk çal reňkli Luer merkezi agyzdan çykyp durandygyny görmek bolýar we suratda görkezilen pipetkanyň gel ujy ET turbasy arkaly traheýa gerek bolan çuňluga girizilýär.
LV-MP dozalama prosedurasyndan bir hepde soň, haýwanlar 100% CO2 dem alyşy bilen ynsanperwerlik bilen öldürildi we LacZ ekspresiýasy standart X-gal bejergisi arkaly bahalandyryldy. Endotraheal turbanyň ýerleşdirilmeginden gelip çykýan islendik mehaniki zeperlenmeleriň ýa-da suwuklygyň saklanmagynyň analize goşulmaýandygyny üpjün etmek üçin üç sany kaudal iň kekirdegi halkasy aýryldy. Analiz üçin iki ýarym döretmek üçin her traheýa uzynlyk boýunça kesildi we olar lüminal ýüzüni görselleşdirmek üçin Minutien iňňesi (Fine Science Tools) ulanyp silikon kauçukly tabakda (Sylgard, Dow Inc) oturdyldy. Ötürülen öýjükleriň paýlanyşy we şekili DigiLite kamerasy we TCapture programma üpjünçiligi (Tucsen Photonics, Hytaý) bilen Nikon mikroskopy (SMZ1500) ulanyp frontal surat çekmek arkaly tassyklanyldy. Suratlar 20 esse ulaldyşda (traheýanyň doly giňligi üçin iň ýokary sazlamany goşmak bilen) alyndy, traheýanyň tutuş uzynlygy ädimme-ädim suratlandyryldy, bu bolsa suratyň "tikilmegini" üpjün etmek üçin her bir suratyň arasynda ýeterlik derejede gabat gelmegi üpjün edýär. Suratlardan her bir traheýa soňra tekiz hereket algoritmini ulanyp, Image Composite Editor v2.0.3 (Microsoft Research) ulanyp ýeke-täk kompozit surata ýygnaldy. Her bir haýwanyň traheýasynyň kompozit suratlaryndaky LacZ ekspresiýa meýdanlary öň beýan edilişi ýaly, 0.35 < Hue < 0.58, Saturation > 0.15 we Value < 0.7 sazlamalaryny ulanyp, awtomatlaşdyrylan MATLAB skripti (R2020a, MathWorks) arkaly sanlaşdyryldy. Dokumanyň konturlaryny yzarlamak arkaly, dokumanyň meýdanyny kesgitlemek we traheýa dokumasynyň daşyndan ýalňyş anyklamalaryň öňüni almak üçin her bir kompozit surat üçin GIMP v2.10.24-de el bilen maska ​​döredildi. Her bir haýwanyň ähli kompozit suratlaryndaky boýalan ýerler şol haýwan üçin umumy boýalan meýdany döretmek üçin jemlendi. Soňra boýalan meýdan umumy maska ​​meýdanyna bölünip, normallaşdyrylan meýdan döredildi.
Her bir traheýa parafine goýuldy we 5 μm bölekler kesildi. Bölekler 5 minutlap neýtral çalt gyzyl reňk bilen boýaldy we suratlar Nikon Eclipse E400 mikroskopy, DS-Fi3 kamerasy we NIS elementlerini surata düşürmek üçin programma üpjünçiligi (5.20.00 wersiýasy) arkaly alyndy.
Ähli statistik seljermeler GraphPad Prism v9 (GraphPad Software, Inc.) programmasynda geçirildi. Statistik ähmiýetlilik p ≤ 0.05 derejesinde kesgitlenildi. Normallyk Şapiro-Wilk synagy arkaly tassyklanyldy we LacZ boýagyndaky tapawutlar jübütsiz t-testi arkaly bahalandyryldy.
1-nji tablisada beýan edilen alty MP PCXI ulanylyp barlandy we görünmegi 2-nji tablisada beýan edilýär. PCXI-niň aşagynda iki sany polistirol MP (MP1 we MP2; degişlilikde 18 μm we 0.25 μm) görünmeýärdi, ýöne galan nusgalar anyklanyp bilýärdi (mysallar 5-nji suratda görkezilen). MP3 we MP4 (degişlilikde 10-15% Fe3O4; degişlilikde 0.25 μm we 0.9 μm) gowşak görünýär. Synag edilen iň kiçi bölejikleriň käbirini öz içine alsa-da, MP5 (98% Fe3O4; 0.25 μm) iň aýdyň boldy. CombiMag önümi MP6-ny tapmak kyn. Ähli ýagdaýlarda, magniti kapillýara parallel öňe we yza geçirmek arkaly MP-ni anyklamak ukybymyz ep-esli ýokarlandy. Magnitler kapillýardan uzaklaşanda, bölejikler uzyn sapaklar görnüşinde uzaldy, ýöne magnitler ýakynlaşanda we magnit meýdanynyň güýji artanda, bölejikler kapillýaryň ýokarky ýüzüne tarap hereket edende, bölejikler sapaklary gysgaldy (Goşmaça wideo S1-e serediň: MP4), ýüzüň bölejikleriniň dykyzlygyny ýokarlandyrýar. Tersine, magnit kapillýardan aýrylanda, meýdanyň güýji peselýär we MP-ler kapillýaryň ýokarky ýüzünden uzalyp gidýän uzyn sapaklara öwrülýär (Goşmaça wideo S2:MP4-e serediň). Magnit hereket etmegini bes edenden soň, bölejikler deňagramly ýagdaýa ýetenden soň gysga wagtlap hereket etmegini dowam etdirýärler. MP kapillýaryň ýokarky ýüzüne tarap we ondan uzaklaşanda, magnit bölejikleri adatça galyndylary suwuklygyň içinden süýräp geçirýärler.
PCXI-däki MP-niň görünmegi nusgalaryň arasynda düýpli üýtgeýär.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 we (d) MP6. Bu ýerde görkezilen ähli suratlar kapillýaryň üstünde takmynan 10 mm ýerleşýän magnit bilen düşürildi. Görünýän uly tegelekler kapillýarlarda gabalan howa köpürjikleri bolup, fazaly kontrastly suratlandyryşyň gara we ak gyra aýratynlyklaryny aýdyň görkezýär. Gyzyl gutuda kontrasty güýçlendirýän ulaldyş bar. Ähli suratlardaky magnit shemalarynyň diametrleriniň ölçeklendirilmeli däldigini we görkezilenden takmynan 100 esse ulydygyny belläň.
Magnit kapillýaryň ýokarky bölegi boýunça çepe we saga süýşürilende, MP siminiň burçy magnit bilen deňleşýär (6-njy surata serediň), şeýlelik bilen magnit meýdanynyň çyzyklaryny görkezýär. MP3-5 üçin, akkord bosaga burça ýetenden soň, bölejikler kapillýaryň ýokarky ýüzü boýunça süýräp gidýär. Bu köplenç MP-leriň magnit meýdanynyň iň güýçli bolan ýerine golaý has uly toparlara jemlenmegine getirýär (Goşmaça wideo S3:MP5-e serediň). Bu, kapillýaryň ujuna golaý surat çekilende hem aýdyň görünýär, bu bolsa MP-leriň suwuklyk-howa serhedinde jemlenmegine we toplanmagyna sebäp bolýar. MP6-daky MP3-5-den has tapawutlandyrmak kyn bolan bölejikler, magnit kapillýar boýunça hereket edende süýräp gitmedi, ýöne MP simleri bölünip, bölejikleri görüş meýdanynda galdyrdy (Goşmaça wideo S4:MP6-a serediň). Käbir ýagdaýlarda, magniti surat çekilen ýerden uzak aralyga süýşürmek bilen ulanylýan magnit meýdany azaldylanda, galan MP-ler simde galyp, agratiw güýç bilen turbanyň aşaky ýüzüne ýuwaş-ýuwaşdan düşdi (Goşmaça wideo S5: MP3-e serediň).
MP siminiň burçy magnit kapillýaryň ýokarsynda sag tarapa geçirilende üýtgeýär.(a) MP3, (b) MP4, (c) MP5 we (d) MP6. Gyzyl gutuda kontrasty güýçlendirýän ulaldyş bar. Goşmaça wideolaryň maglumatlydygyny belläň, sebäbi olar bu statik suratlarda göz öňüne getirip bolmaýan möhüm bölejikleriň gurluşyny we dinamiki maglumatlary açyp görkezýär.
Synaglarymyz magnitiň traheýa boýunça haýal öňe-yza hereket etmeginiň in vivo çylşyrymly hereket şertlerinde MP-niň wizualizasiýasyny ýeňilleşdirýändigini görkezdi. Polistirol munçuklary (MP1 we MP2) kapillýarda görünmeýändigi üçin in vivo synag geçirilmedi. Galan dört MP-niň her biri magnitiň uzyn okunyň traheýanyň üstünde wertikal tarapyna takmynan 30° burç bilen gurnalmagy bilen in vivo synag edildi (2b we 3a suratlaryna serediň), sebäbi bu MP zynjyrlarynyň has uzyn bolmagyna getirdi we magnit konfigurasiýasynyň tamamlanmagyndan has netijeli boldy. MP3, MP4 we MP6 hiç bir diri haýwanyň traheýasynda ýüze çykarylmady. Haýwanlar adamkärçilikli öldürilenden soň syçan howa ýollary suratlandyrylanda, şpris nasosy arkaly goşmaça göwrüm goşulanda hem bölejikler görünmeýärdi. MP5 iň ýokary demir oksidiniň mukdaryna eýe boldy we görünýän ýeke-täk bölejik boldy we şonuň üçin MP-niň in vivo özüni alyp barşyny bahalandyrmak we häsiýetlendirmek üçin ulanyldy.
MP-niň traheýanyň üstüne goýulmagy MP-niň köpüsiniň, ýöne hemmesiniň däl-de, görüş meýdanynda jemlenmegine getirdi. Traheýa girýän bölejikler ynsanperwerlik bilen gurban edilen haýwanlarda has gowy syn edilýär. 7-nji surat we goşmaça wideo S6: MP5 ventral traheýanyň ýüzünde bölejikleriň çalt magnit tutulmagyny we deňleşdirilmegini görkezýär, bu bolsa MP-leriň traheýanyň islenýän sebitlerine gönükdirilip bilinjekdigini görkezýär. MP-niň getirilmeginden soň traheýanyň ugrunda has uzak aralykda gözleg geçirilende, käbir MP-ler karina golaý tapyldy, bu bolsa magnit meýdanynyň güýjüniň ähli MP-leri ýygnamak we saklamak üçin ýeterlik däldigini görkezýär, sebäbi olar suwuklyk prosesinde iň ýokary magnit meýdanynyň güýji sebitinden geçirilýärdi. Şeýle-de bolsa, çaga dogurandan soňky MP konsentrasiýalary surat çekilen sebitiň töwereginde has ýokary boldy, bu bolsa köp MP-leriň ulanylýan magnit meýdanynyň güýjüniň iň ýokary bolan howa ýollarynyň sebitlerinde galandygyny görkezýär.
Ýaňy-ýakynda ewtanaziýany geçiren syçanyň traheýasyna MP5-iň (a) we (b) eltilmeginden öňki we soňky suratlar, magnit surat zolagynyň göni üstünde ýerleşýär. Surat çekilen ýer iki kekirdegiň halkasynyň arasynda ýerleşýär. MP eltilmeginden öň, dem alyş ýollarynda biraz suwuklyk bar. Gyzyl gutuda kontrasty güýçlendirýän ulaldyş bar. Bu suratlar Goşmaça S6:MP5 wideosynda görkezilen wideodan alyndy.
Magniti in vivo traheýa boýunça geçirmek MP zynjyrynyň howa ýollarynyň ýüzündäki burçuny kapilýarlarda görülýän ýaly üýtgetmegine sebäp boldy (8-nji surata we Goşmaça wideo S7:MP5-e serediň). Şeýle-de bolsa, biziň gözlegimizde MP-leri diri howa ýollarynyň ýüzü boýunça kapilýarlarda bolşy ýaly süýräp bolmady. Käbir ýagdaýlarda, magnit çepe we saga hereket edende MP zynjyry has uzalar. Gyzykly tarapy, magnit traheýa boýunça uzynlygyna hereket edende bölejikleriň sapagynyň ýüz suwuklyk gatlagynyň çuňlugyny üýtgedýän ýaly görünýändigini we magnit gönüden-göni ýokarda hereket edende we bölejikleriň sapagy dik ýagdaýa öwrülende giňelýändigini hem anykladyk (Goşmaça wideo S7-e serediň). : MP5 0:09-da, aşaky sag tarapda). Magnit traheýanyň ýokarky böleginde gapdal tarapa (ýagny traheýanyň uzynlygy boýunça däl-de, haýwanyň çep ýa-da sag tarapyna) geçirilende hereketiň häsiýetli görnüşi üýtgedi. Bölejikler hereket edende henizem aýdyň görünýärdi, ýöne magnit traheýadan aýrylanda, bölejikleriň zynjyrlarynyň uçlary görünýärdi (Goşmaça wideo S8:MP5-e serediň, 0:08-den başlap). Bu, aýna kapillýarda ulanylýan magnit meýdanynyň aşagynda syn eden MP-niň hereketine gabat gelýär.
Diri anesteziýa edilen syçanyň traheýasyndaky MP5-i görkezýän mysal suratlar.(a) Magnit traheýanyň ýokarsynda we çepinde, soňra bolsa magnit sag tarapa süýşürilenden soň (b) suratlary almak üçin ulanylýar. Gyzyl gutuda kontrasty güýçlendirýän ulaldyş bar. Bu suratlar Goşmaça S7:MP5 wideosynda görkezilen wideodan alyndy.
Iki polýus traheýanyň ýokarsynda we aşagynda demirgazyk-günorta ugurda konfigurirlenende (ýagny özüne çekiji; 3b-nji surat), MP akkordlary has uzyn görünýärdi we traheýanyň dorsal ýüzünde däl-de, onuň gapdal diwarynda ýerleşýärdi (Goşmaça wideo S9:MP5-e serediň). Şeýle-de bolsa, iki magnitli enjam ulanylanda, suwuklyk berlenden soň, bir ýerde (ýagny traheýanyň dorsal ýüzünde) bölejikleriň ýokary konsentrasiýalary anyklanmady, bu adatça bir magnitli enjam ulanylanda bolýar. Soňra bir magnit polýuslary yzyna serpikdirmek üçin konfigurirlenende (3c-nji surat), görüş meýdanynda görünýän bölejikleriň sany berlenden soň artmady. Iki magnitli konfigurasiýalaryň ikisiniň hem konfigurasiýasyny gurnamak, degişlilikde magnitleri çekýän ýa-da itekleýän ýokary magnit meýdan güýçleri sebäpli kyn. Soňra gurnama howa ýoly bilen parallel, ýöne howa ýoly arkaly 90 gradusda geçýän ýeke magnite üýtgedildi, şonuň üçin meýdan çyzyklary traheýanyň diwaryny ortogonal kesdi (3d-nji surat), bu ugur gapdal diwardaky bölejikleriň agregasiýasynyň synlanyp bilinjekdigini ýa-da bilinmejekdigini kesgitlemek üçin niýetlenendir. Şeýle-de bolsa, bu konfigurasiýada MP toplanmagynyň ýa-da magnitiň hereketiniň anyklanyp bilinýän hereketi bolmady. Bu netijeleriň ählisine esaslanyp, in vivo gen daşaýjy barlaglary üçin bir magnitli, 30 graduslyk ugur konfigurasiýasy (3a-njy surat) saýlanyldy.
Haýwan adamkärçilikli öldürilenden soň derrew gaýta-gaýta suratlandyrylanda, dokumalaryň hereketiniň ýoklugy, magnitiň translýasiýa hereketine laýyklykda "titreýän" aýdyň interkondral meýdanda has inçe we gysga bölejikleriň çyzyklaryny görüp boljakdygyny aňladýardy. Şeýle-de bolsa, MP6 bölejikleriniň bardygyny we hereketini henizem aýdyň görüp bolmaýar.
LV-LacZ titri 1,8 × 108 TU/ml boldy we CombiMag MP (MP6) bilen 1:1 garyşdyrylandan soň, haýwanlara 9 × 107 TU/ml LV ulagynyň 50 μl traheýa dozasy berildi (ýagny 4,5 × 106 TU/syçan). Bu barlaglarda, doguryş wagtynda magniti göçürmegiň ýerine, magniti bir ýagdaýda berkitdik, şonuň üçin LV geçirijiliginiň (a) magnit meýdany ýok wagty wektor iberişine garanyňda gowulanyp biljekdigini we (b) fokuslanyp biljekdigini anykladyk. Dem alyş ýollarynyň öýjükleri ýokarky dem alyş ýollarynyň magnit nyşana sebitlerine geçirilýär.
Magnitleriň bolmagy we CombiMag-yň LV wektorlary bilen utgaşdyrylyp ulanylmagy, standart LV wektorlaryny ibermek protokolymyz ýaly, haýwanlaryň saglygyna ýaramaz täsir etmeýän ýalydy. Mehaniki täsire sezewar edilen traheýa sebitiniň öňki suratlary (Goşmaça 1-nji surat) magnit bar bolanda LV-MP bilen bejerilen haýwanlaryň toparynda transduksiýanyň has ýokary derejesiniň bardygyny görkezdi (9a surat). Gözegçilik toparynda diňe az mukdarda gök LacZ boýagy bardy (9b surat). Normallaşdyrylan X-Gal boýalan ýerleriň mukdaryny kesgitlemek, magnit meýdanynyň barlygynda LV-MP-niň ulanylmagynyň takmynan 6 esse gowulaşandygyny görkezdi (9c surat).
Magnit meýdanynyň barlygynda LV-MP (a) we magnit ýoklugynda (b) traheýanyň transduksiýasyny görkezýän mysal kompozit suratlar.(c) Magnit ulanylanda traheýanyň içinde normallaşdyrylan LacZ transduksiýa meýdanynda statistik taýdan möhüm gowulaşma (*p = 0.029, t-test, her topar üçin n = 3, ortaça ± SEM).
Neýtral çalt gyzyl reňkli bölekler (mysal üçin 2-nji goşmaça suratda görkezilen) öň habar berlişi ýaly meňzeş görnüşde we ýerde LacZ bilen reňklenen öýjükleri görkezdi.
Howa ýollary gen terapiýasy üçin esasy kynçylyk, howa akymynyň we işjeň mukus arassalaýyşynyň bolmagynda daşaýjy bölejikleriň gyzyklanma sebitlerine takyk ýerleşmegi we hereket edýän öýkende ýokary derejeli transduksiýa netijeliligine ýetmek bolmagynda galýar. KF howa ýollarynyň keselini bejermek üçin niýetlenen LV daşaýjylary üçin, daşaýjy bölejikleriň geçiriji howa ýollarynda galmak wagtyny köpeltmek şu wagta çenli kyn maksat bolup gelýärdi. Kastellani we beýlekileriň belleýşi ýaly, transduksiýany gowulandyrmak üçin magnit meýdanlaryny ulanmagyň elektroporasiýa ýaly beýleki gen eltme usullary bilen deňeşdirilende artykmaçlyklary bar, sebäbi ol ýönekeýligi, çykdajy taýdan netijeliligi, eltme lokalizasiýasyny, netijeliligiň ýokarlanmagyny we inkubasiýa wagtyny gysgaltmagy, şeýle hem, mümkin, daşaýjy dozasyny has az ulanmagy birleşdirip biler10. Şeýle-de bolsa, daşarky magnit güýçleriniň täsiri astynda howa ýollarynda magnit bölejikleriniň in vivo çökündisi we özüni alyp barşy hiç haçan beýan edilmedi, şeýle hem bu usulyň diri howa ýollarynda gen ekspresiýa derejesini ýokarlandyrmak üçin in vivo mümkinçiligi görkezilmedi.
In vitro sinhrotron PCXI tejribelerimiz, polistirol MP-den başga, synagdan geçiren ähli bölejiklerimiziň ulanan surat gurluşymyzda görünýändigini görkezdi. Magnit meýdanynyň barlygynda, MP-ler uzynlygy bölejikleriň görnüşine we magnit meýdanynyň güýjüne (ýagny magnitiň ýakynlygyna we hereketine) bagly bolan sapaklary emele getirýär. 10-njy suratda görkezilişi ýaly, synlaýan sapaklarymyz her bir aýratyn bölejigiň magnitlenip, öz ýerli magnit meýdanyny döretmegi sebäpli emele gelýär. Bu aýry-aýry meýdanlar beýleki meňzeş bölejikleriň agregasiýasyna we birleşmegine sebäp bolýar, beýleki bölejikleriň ýerli özüne çekiji we itekleýji güýçlerinden ýerli güýçler sebäpli topar sapaklary ýaly hereketler bolýar.
(a, b) suwuklyk bilen doldurylan kapillýarlaryň we (c, d) howa bilen doldurylan traheýanyň içinde emele gelýän bölejikleriň gatnawlaryny görkezýän shema. Kapilýarlaryň we traheýanyň ölçeg boýunça çekilmedigine üns beriň. (a) panelde şeýle hem Fe3O4 bölejiklerini öz içine alýan MP-niň düşündirişi bar, ol bolsa setirlerde ýerleşdirilen.
Magnit kapillýaryň üstünden geçirilende, bölejikleriň sapagynyň burçy Fe3O4 saklaýan MP3-5 üçin möhüm derejä ýetdi, şondan soň bölejikleriň sapagy asyl ýagdaýynda galman, ýer boýunça täze ýagdaýa geçdi. magnit. Bu täsiriň ýüze çykmagy mümkin, sebäbi aýna kapillýaryň ýüzi bu hereketiň bolmagyna mümkinçilik berýän derejede tekiz. Gyzykly tarapy, MP6 (CombiMag) şeýle hereket etmedi, sebäbi bölejikler has kiçi, dürli örtükleri ýa-da ýerüsti zarýadlary bardy ýa-da hususy daşaýjy suwuklyk olaryň hereket etmek ukybyna täsir etdi. CombiMag bölejikleriniň surat kontrasty hem gowşak, bu bolsa suwuklygyň we bölejikleriň meňzeş dykyzlyklara eýe bolup biljekdigini we şonuň üçin birek-birege aňsatlyk bilen hereket etmejekdigini görkezýär. Magnit gaty çalt hereket etse, bölejikler hem ýapyşyp biler, bu bolsa magnit meýdanynyň güýjüniň suwuklykdaky bölejikleriň arasyndaky sürtülmäni hemişe ýeňip bilmeýändigini görkezýär, belki-de magnit meýdanynyň güýjüniň we magnit bilen nyşana meýdanynyň arasyndaky aralygyň örän möhümdigini görkezýär. Jemi alnanda, bu netijeler magnitleriň nyşana meýdanyndan akýan köp MP-leri tutup bilýändigine garamazdan, magnitlere bil baglap boljakdygynyň mümkin däldigini görkezýär. CombiMag bölejiklerini traheýanyň ýüzü boýunça hereketlendirýär. Şonuň üçin, biz in vivo LV-MP barlaglarynyň howa ýoly agajynyň belli bir sebitlerini fiziki taýdan nyşana almak üçin statik magnit meýdanlaryny ulanmalydygy barada netijä geldik.
Bölejikler bedene getirilende, olary çylşyrymly hereket edýän beden dokumalary kontekstinde kesgitlemek kyn, ýöne olary anyklamak ukyby magniti traheýanyň ýokarsyna gorizontal ýagdaýda geçirmek arkaly MP simlerini "hereketlendirmek" arkaly ýokarlandyryldy. Janly surat çekmek mümkin bolsa-da, haýwan adamkärçilikli öldürilenden soň bölejikleriň hereketini anyklamak has aňsat. Magnit surat çekmek zolagynyň ýokarsynda ýerleşýän mahaly MP konsentrasiýalary bu ýerde, adatça, iň ýokary boldy, ýöne käbir bölejikler adatça traheýanyň ugrunda tapylýardy. In vitro barlaglardan tapawutlylykda, magniti geçirmek arkaly bölejikleri traheýanyň boýunça süýräp bolmaýar. Bu açyş traheýanyň ýüzüni örtýän nemiň adatça dem alýan bölejikleri nähili işläp, olary nemde saklaýandygy we soňra nemli-silli arassalaýyş mehanizmi arkaly nähili arassalaýandygy bilen gabat gelýär.
Biz traheýanyň ýokarsynda we aşagynda özüne çekiji magnitleriň ulanylmagynyň (3b-nji surat) bir nokada ýokary derejede jemlenen magnit meýdanynyň däl-de, has deň magnit meýdanynyň döremegine getirip biljekdigini we bölejikleriň has deň paýlanmagyna getirip biljekdigini çakladyk. Şeýle-de bolsa, deslapky gözlegimiz bu gipotezany goldaýan aýdyň subutnama tapmady. Şeýle hem, bir jübüt magniti yzyna serpikdirmek üçin konfigurirlemek (3c-nji surat) surat çekilen ýerde bölejikleriň has köp çökmegine getirmedi. Bu iki netije iki magnit gurluşynyň MP nyşana almagynyň ýerli gözegçiligini düýpli gowulandyrmaýandygyny we netijede dörän güýçli magnit güýçleriniň konfigurirlemegiň kyndygyny, bu çemeleşmäni has az amaly edýändigini görkezýär. Şonuň ýaly-da, magniti traheýanyň ýokarsynda we içinden gönükdirmek (3d-nji surat) hem surat çekilen ýerde saklanýan bölejikleriň sanyny köpeltmedi. Bu alternatiw konfigurasiýalaryň käbiri üstünlikli bolmazlygy mümkin, sebäbi olar çökündi meýdanynda magnit meýdanynyň güýjüniň peselmegine getirýär. Şonuň üçin, ýeke-täk 30 graduslyk burçly magnit konfigurasiýasy (3a-njy surat) in vivo synag üçin iň aňsat we iň netijeli usul hasaplanýar.
LV-MP barlagy, LV wektorlarynyň CombiMag bilen birleşdirilip, magnit meýdanynyň gatnaşmagynda fiziki täsirden soň berlende, traheýada transduksiýa derejesiniň gözegçilik toparyna garanyňda ep-esli ýokarlanandygyny görkezdi. Sinhrotron surat barlaglaryna we LacZ netijelerine esaslanyp, magnit meýdany LV-ni traheýanyň içinde saklap, öýkeniň içine derrew aralaşan wektor bölejikleriniň sanyny azaltmaga ukyplydy. Şeýle nyşana alyş gowulandyrmalary, berlen titrleri, nyşanadan daşary transduksiýany, iltihaply we immun täsirlerini we gen daşaýjy çykdajylaryny azaldyp, has ýokary netijelilige getirip biler. Öndürijiniň aýtmagyna görä, iň esasy zat, CombiMag beýleki gen geçiş usullary, şol sanda beýleki wirus wektorlary (meselem, AAV) we nuklein kislotalary bilen bilelikde ulanylyp bilner.